CN110770254B - 新的抗c-MET抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种特异性结合至人肝细胞生长因子受体(c‑Met)的新抗体或其抗原结合片段，以及用于预防或治疗癌症的组合物，其中所述抗体甚至以其极少量展示优异的癌细胞增殖抑制活性及显著优异的抗癌活性，由此有效地预防或治疗癌症。

Description

新的抗c-MET抗体及其用途
技术领域
本发明涉及一种特异性结合至人类肝细胞生长因子受体(c-Met)的抗体或其抗原结合片段，以及包含其的用于预防或治疗癌症的组合物。
背景技术
受体酪氨酸激酶(RTK)在细胞生长、分化、新血管生成、组织恢复等中充当重要调节剂。除了此类一般生理学过程以外，某些RTK的异常表现与许多种类的癌症的出现及进展相关。因此，此类RTK已视为用于癌症治疗的有前景的药物靶标。
肝细胞生长因子受体(HGFR；c-Met)(一种RTK)是关于已知为分散因子的肝细胞生长因子(HGF/SF)的细胞表面上的受体(Laird AD等人,Expert.Opin.Investig.Drugs 12:51-64(2003))。通过HGF的异常c-Met活化(代表性致癌机理中之一)已知与肿瘤增殖、细胞凋亡抑制、新血管生成、侵入、转移等相关(Bottaro DP等人,Science 251:802-804(1991),Day RM等人,Oncogene 18:3399-3406(1999))。且此外，据报导，通过c-Met突变和扩增的异常c-Met活化与诸如肺癌、结肠癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌等各种癌症相关，并且也与肿瘤侵袭性增加及其不利预后有关(Lefebvre J等人,FASEB J 26:1387-1399(2012)，Liu X等人,Trends Mol Med 16:37-45(2010)，Smolen GA等人,Proc Natl Acad Sci USA 103:2316-2321(2006)，Foveau B等人,Mol Biol Cell 20:2495-2507(2009))。
因此，c-Met作为用于治疗此类各种癌症的靶标抗原已引起许多注意，且已进行了各种方法以抑制c-Met的表达及活性。作为迄今为止已知的c-Met特异性小分子酪氨酸激酶抑制剂，存在提瓦替尼(Tivantinib)(ArQule)、INC280(Novartis)、AMG337(Amgen)等。并且，已研发出里乐木单抗(Rilotumumab)(Amgen)、费拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)(AVEPPharmaceuticals)、HuL2G7(Galaxy Biotech)等作为HGF特异性单克隆抗体，其为c-Met的配体。此外，作为靶向c-Met的拮抗剂单克隆抗体，存在着研发的临床III期中的Genentech的奥那组单抗(Onartuzumab)(WO 2006/015371)、临床II期中的Lilly的艾米贝珠单抗(Emibetuzumab)(WO 2010/059654)、研发的临床I期中的SAIT-301(US 2014154251)、ABT-700(Wang J等人,BMC Cancer.16:105-118(2016))等。奥那组单抗为衍生自二价单克隆抗体(5D5)的单价拮抗性抗体，其作为药剂作用于c-Met(Mark Merchant,等人,Proc NatlAcad Sci U S A.110(32):E2987-E299(2013))。因此，已研发关于c-Met的各种药物，但c-Met与如上文所述的各种癌症的出现及进展相关，因此不断地驱动用于研发能够通过靶向c-Met而治疗癌症的新型治疗剂的持续性需求。
发明内容
技术问题
本发明人已研发了以高亲和力结合至c-Met的新的抗c-Met抗体，并且还已鉴定了此类抗c-Met抗体、其嵌合体以及人源化及亲和力经优化的抗体显著抑制肿瘤细胞的增殖且具有优异的抗癌效果，因此已完成了本发明。
问题的解决方案
本发明的一个目的是提供一种特异性结合至肝细胞生长因子受体(c-Met)的抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一个目的是提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体、具有引入其中的所述表达载体的宿主细胞、使用所述宿主细胞产生抗体或其抗原结合片段的方法。
本发明的又一个目的是提供一种包含所述抗体或其抗原结合片段的用于检测c-Met的组合物、包含所述组合物的用于检测的试剂盒，以及使用所述试剂盒检测c-Met抗原的方法。
本发明的再一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物。
发明的效果
特异性结合至肝细胞生长因子受体(c-Met)的本发明抗体或其抗原结合片段具有新的序列，且甚至以其极少量展示了优异的癌细胞增殖抑制活性和显著优异的抗癌活性，由此有效地预防或治疗诸如癌症的疾病。
附图简要说明
图1显示了对本发明的杂交瘤c-Met抗体的肿瘤细胞增殖抑制活性的体外测试的结果。
图2显示了用于表达独立转录组以进行scFv展示的载体的示意图。
图3显示了通过本发明的hu8C4亲和力经优化的抗体分析肿瘤细胞增殖抑制活性的结果。
图4显示了通过本发明的双特异性抗体分析肿瘤细胞增殖抑制活性的结果。
图5显示了通过本发明的双特异性抗体分析肿瘤细胞增殖抑制活性的结果。
图6显示了在U-87 MG(成胶质细胞瘤)、NCI-H292(NSCLC)、NCI-H1648(NSCLC)及NCI-H596(NSCLC)细胞系中，本发明的双特异性抗体和组合疗法之间的肿瘤细胞增殖抑制活性的比较结果。
图7显示了在LS174T(结肠)、BT20(TNBC)及KP4(胰脏)细胞系中，本发明的双特异性抗体和组合疗法之间的肿瘤细胞增殖抑制活性的比较结果。
图8显示了在HCC827(NSCLC)及NCI-H596(NSCLC)细胞系中，本发明的双特异性抗体与组合疗法之间的肿瘤细胞增殖抑制活性的比较结果。
图9显示了通过ELISA方法测量本发明的抗c-Met抗体及双特异性抗体对于各种c-Met及EGFR抗原的结合能力的结果。
图10显示了在NCI-H820(NSCLC)细胞系中，测量由本发明的双特异性抗体降低受体水平的效果的结果。
图11显示了在NCI-H820(NSCLC)细胞系中，测量由本发明的抗c-Met抗体及双特异性抗体抑制c-Met及EGFR磷酸化的结果。
图12显示了在U-87 MG(成胶质细胞瘤)细胞异种移植模型中，测量本发明的双特异性抗体的抗癌效果的结果。
图13显示了在NCI-H820(NSCLC)细胞异种移植模型中，测量本发明的双特异性抗体的抗癌效果的结果。
图14显示了在NCI-H2170(NSCLC)细胞系中，通过本发明的抗c-Met抗体和抗HER2抗体以组合疗法治疗，分析肿瘤细胞增殖抑制活性的结果。
图15显示了在NCI-H2170(NSCLC)细胞异种移植模型中，测量用本发明的抗c-Met抗体和抗HER2抗体进行的组合疗法的抗癌效果的结果。
图16显示了在NCI-H596(NSCLC)细胞异种移植模型中，测量本发明的双特异性抗体的抗癌效果的结果。
图17显示了在EBC-1(NSCLC)细胞异种移植模型中，测量本发明的双特异性抗体的抗癌效果的结果。
图18显示了在用双特异性抗体(hu8C4×帕妥木单抗scFv)等处理HCC827细胞系之后所测量的指示细胞表面上的c-Met量的结果。
图19显示了在用双特异性抗体(hu8C4×帕妥木单抗scFv)等处理HCC827细胞系之后所测量的指示细胞表面上的EGFR量的结果。
图20显示了在三级结构中通过氢-氘交换质谱法(HDX-MS)所分析的指示双特异性抗体的表位的结果。
本发明的最佳实施方式
在下文中，将如下更详细地描述本发明。同时，在本发明中所公开的各描述及实施例也可分别应用于其他描述及实施例。换言之，在本发明中所公开的各种要素的所有组合在本发明的范围内。此外，本发明的范围可不受下文详细描述限制。
为实现上述目标，本发明的一个方面提供了特异性结合至肝细胞生长因子受体(c-Met)的抗体或其抗原结合片段。
特异性结合至c-Met的本发明抗体或其抗原结合片段以高亲和力结合至c-Met以抑制其表达或活性，因此显示了优异的肿瘤细胞增殖抑制活性，以使得抗体单独或与常规的药学上可接受的载体、其他抗癌药物、抗癌佐剂等一起可有价值地用作预防或治疗癌症的抗癌组合物。
在本发明中，术语“抗体”是指作为用于特异性识别抗原的受体的蛋白质分子，其包含在免疫学上与特定抗原具有反应性的免疫球蛋白分子，其中其实例可包含单克隆抗体、多克隆抗体、全长抗体及抗体片段全部。此外，术语可包含二价分子或双特异性分子(例如双特异性抗体)、双抗体、三链抗体或四链抗体。
在本发明中，术语“单克隆抗体”是指获自实质上相同的抗体群体的单分子组合物的抗体分子，其中此类单克隆抗体显示了针对特定表位的单一结合特异性及亲和力。在本发明中，术语“全长抗体”具有含有两个全长轻链及两个全长重链的结构，其中每条轻链通过二硫键连接至重链。重链的恒定区具有伽玛(γ)、米欧(μ)、阿尔法(α)、德耳塔(δ)及伊普西隆(ε)类型，且也具有伽玛1(γ1)、伽玛2(γ2)、伽玛3(γ3)、伽玛4(γ4)、阿尔法1(α1)及阿尔法2(α2)作为亚类。轻链的恒定区具有卡帕(κ)及拉姆达(λ)类型。IgG包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4作为亚型。
在本发明中，术语“片段”、“抗体片段”及“抗原结合片段”是指具有抗体的抗原结合功能的本发明抗体的任何片段，其中此类术语可彼此互换使用。示例性抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等，但不限于此。
所述Fab具有含有轻链和重链的可变区、轻链的恒定区及重链的第一恒定区(CH1结构域)的结构，且还具有一个抗原结合位点。抗体分子的抗原结合片段或抗体片段意指具有抗原结合功能的片段，且Fab'与Fab不同之处在于前者具有在重链CH1结构域的C端中具有一个或多个半胱胺酸残基的铰链区。F(ab')2抗体以使得Fab'的铰链区的半胱胺酸残基形成二硫键的方式产生。Fv为仅具有重链可变区及轻链可变区的最小抗体片段，其中用于产生Fv片段的重组技术公开于PCT国际专利公开申请WO 88/10649、WO 88/106630、WO 88/07085、WO 88/07086、WO 88/09344等中。双链Fv以使得重链可变区及轻链可变区通过非共价键彼此连接的方式形成，而单链Fv以使得重链可变区及单链可变区通常通过共价键经由肽接头彼此连接或直接在C端中连接的方式形成，因此形成类似于如双链Fv中所示的二聚体的结构。此类抗体片段可通过使用蛋白质水解酶获得(例如，Fab可通过由木瓜蛋白酶进行全抗体的限制性消化而获得，且F(ab')2片段可通过由胃蛋白酶进行全抗体的消化获得)，或可通过基因重组技术产生，但不限于此。
特别地，在本发明中，可提供的特异性结合至c-Met的抗体是：
(a)包含以下的抗体：轻链可变区，其包含由SEQ ID NO:1表示的轻链CDR1、由SEQID NO:2表示的轻链CDR2、由SEQ ID NO:3表示的轻链CDR3；及重链可变区，其包含由SEQ IDNO:7表示的重链CDR1、由SEQ ID NO:8表示的重链CDR2和由SEQ ID NO:9表示的重链CDR3；
(b)包含以下的抗体：轻链可变区，其包含由SEQ ID NO:4表示的轻链CDR1、由SEQID NO:5表示的轻链CDR2、由SEQ ID NO:6表示的轻链CDR3；及重链可变区，其包含由SEQ IDNO:10表示的重链CDR1、由SEQ ID NO:11表示的重链CDR2及由SEQ ID NO:12表示的重链CDR3；或
(c)其亲和力经优化的抗体。
在本发明中，术语“重链”可包含全长重链及其片段两者，所述片段包含具有氨基酸序列(其具有足以赋予对抗原的特异性的可变区序列)的可变区结构域VH，以及三个恒定区结构域CH1、CH2及CH3。此外，在本发明中，术语“轻链”可包含全长轻链及其片段两者，所述片段包含具有氨基酸序列(其具有足以赋予对抗原的特异性的可变区序列)的可变区结构域VL，以及恒定区结构域CL。
在本发明中，抗体可包含自小鼠产生的小鼠抗体及其突变体两者，其中亲本抗体的氨基酸序列的一部分经取代、添加和/或缺失以提高抗体的亲和力、免疫性等。作为实例，突变体可包含嵌合抗体、人源化抗体、亲和力经优化的抗体等，但不限于此。在本发明中，突变体概括地指抗体，其中亲本抗体的CDR氨基酸序列的一部分在具有与亲本抗体的CDR相同的CDR或靶向与亲本抗体的表位相同的表位的条件下突变(经取代、添加或缺失)。此类突变体可由本领域技术人员以适当方式调整，以便在保持对相同表位的结合力的范围内提高抗体的亲和力、免疫性等。
换言之，在特异性识别c-Met的范围内，本发明抗体或其抗原结合片段可包含本文中所描述的抗c-Met抗体的序列以及其生物学等同物。例如，可在抗体的氨基酸序列中作出额外变化，以便进一步提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学特征。例如，此类变化包含抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷、大小等进行此类氨基酸突变。通过分析氨基酸侧链取代基的大小、形状及类型，可看出精氨酸、赖氨酸及组氨酸皆为正电荷残基；丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸具有相似大小；且苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸具有相似形状。因此，基于此类考虑，可看出精氨酸、赖氨酸及组氨酸；丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸为生物学功能等同物。
在本发明中，术语“嵌合抗体“是以使得小鼠抗体的可变区与人类抗体(其与小鼠抗体相比引起大大改良的免疫反应)的恒定区重组的方式形成的抗体。
在本发明中，术语“人源化抗体”是指这样的方式形成的抗体，即，使得衍生自除人类外的其他物种的抗体的蛋白质序列经修饰，以类似于自人类天然产生的抗体突变体的蛋白质序列。例如，人源化抗体可通过经由使衍生自小鼠的CDR与衍生自人类抗体的FR重组制备人源化可变区且随后通过使该CDR与优选的人类抗体的恒定区重组来制备。然而，简单的CDR移植仅产生人源化抗体的低亲和力，因此，认为可能影响CDR的三维结构的若干关键FR氨基酸残基可提高与小鼠抗体的那些氨基酸残基的亲和力，从而达到与原始小鼠抗体的亲和力相同的水平。
在本发明中，术语“亲和力经优化的抗体”，其为以使得特定抗体的CDR序列的一部分经取代、添加或缺失的方式形成的突变体，其意指在结合至与该特定抗体的表位相同的表位时，对抗原具有更佳结合亲和力的抗体。特别地，本发明的亲和力经优化的抗体是指结合至与以下的表位相同的表位的突变型抗体：(a)包含以下的抗体：轻链可变区，其包含由SEQ ID NO:1表示的轻链CDR1、由SEQ ID NO:2表示的轻链CDR2、由SEQ ID NO:3表示的轻链CDR3；及重链可变区，其包含由SEQ ID NO:7表示的重链CDR1、由SEQ ID NO:8表示的重链CDR2、由SEQ ID NO:9表示的重链CDR3；或(b)包含以下的抗体：轻链可变区，其包含由SEQID NO:4表示的轻链CDR1、由SEQ ID NO:5表示的轻链CDR2、由SEQ ID NO:6表示的轻链CDR3；及重链可变区，其包含由SEQ ID NO:10表示的重链CDR1、由SEQ ID NO:11表示的重链CDR2、由SEQ ID NO:12表示的重链CDR3。本领域普通技术人员可通过使用基于特定轻链及重链CDR序列的已知技术制备亲和力经优化的抗体。例如，本发明的亲和力经优化的抗体可经由噬菌体展示制备。在本发明中，术语“噬菌体展示”是指一种在噬菌体上，例如在纤维状噬菌体颗粒表面上将突变型多肽展示为具有外壳蛋白的至少一部分的融合蛋白的技术。噬菌体展示的用途在于其以随机化蛋白质突变体的较大文库为目标，因此实时且有效率地对以高亲和力结合至靶标抗原的序列进行分类的事实。在噬菌体上展示肽及蛋白质的文库已用于筛选数百万多肽，以便发现具有特异性结合特征的多肽。
在本发明的一个示例性实施方案中，其限制条件可为，抗体为包含以下的抗体：(a)由SEQ ID NO:13表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:15表示的重链可变区；或(b)由SEQID NO:14表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:16表示的重链可变区。作为实例，其限制条件可为，所述抗体为包含以下的抗体：(a)通过由SEQ ID NO:17表示的核苷酸编码的轻链可变区，及通过由SEQ ID NO:19表示的核苷酸编码的重链可变区；或(b)通过由SEQ ID NO:18表示的核苷酸编码的轻链可变区，及通过由SEQ ID NO:20表示的核苷酸编码的重链可变区，但不限于此。
根据本发明的一个特定实施方案，杂交瘤细胞群获自小鼠，其中人类c-Met Sema结构域/Fc融合蛋白是抗原，特异性结合至c-Met的抗c-Met抗体通过用ELISA分析法使用c-Met/His融合蛋白作为抗原筛选而选自该抗原。所选抗体及其嵌合抗体具有肿瘤细胞增殖抑制活性，其与市售已知LY2875358及OA-5D5(表3及图1)同等优异或比其更优异，因此极其有价值地用于预防或治疗癌症。
在本发明的另一例示性实施方案中，其限制条件可为，抗体包含：
(a)由SEQ ID NO:21表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:23表示的重链可变区；(b)由SEQ ID NO:22表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:24表示的重链可变区；(c)由SEQ IDNO:29表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:31表示的重链可变区；或(d)由SEQ ID NO:30表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:32表示的重链可变区。作为实例，其限制条件可为，抗体为包含以下的抗体：(a)通过由SEQ ID NO:25表示的核苷酸编码的轻链可变区及通过由SEQ IDNO:27表示的核苷酸编码的重链可变区；(b)通过由SEQ ID NO:26表示的核苷酸编码的轻链可变区及通过由SEQ ID NO:28表示的核苷酸编码的重链可变区；(c)通过由SEQ ID NO:33表示的核苷酸编码的轻链可变区及通过由SEQ ID NO:35表示的核苷酸编码的重链可变区；或(d)通过由SEQ ID NO:34表示的核苷酸编码的轻链可变区及通过由SEQ ID NO:36表示的核苷酸编码的重链可变区，但不限于此。此外，其限制条件可为，抗体包含由SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:44中之一表示的铰链区。
在本发明的一个特定实施方案中，制备包含经由噬菌体展示选择所获得的抗体的CDR的人源化抗体，且鉴定出此类抗体显示类似于本发明嵌合体抗体的抗癌活性的抗癌活性(实施例2及3)。此外，在本发明的另一特定实施方案中，根据铰链区序列，评估抗体的肿瘤细胞增殖抑制活性，且鉴定出大部分肿瘤细胞的增殖被有效抑制，即使根据铰链序列的差异，活性有略微差异(表7)。
在本发明的另一示例性实施方案中，其限制条件可为，人源化抗体的亲和力经优化的抗体为一种抗体，其中在该抗体中一个或多个氨基酸序列由包含以下的抗体取代：包含由SEQ ID NO:1表示的轻链CDR1、由SEQ ID NO:2表示的轻链CDR2、由SEQ ID NO:3表示的轻链CDR3的轻链可变区，及包含由SEQ ID NO:7表示的重链CDR1、由SEQ ID NO:8表示的重链CDR2、由SEQ ID NO:9表示的重链CDR3的重链可变区，但不限于此，且其中，(i)轻链CDR1的第1位置中的G经A、E、K、L、N、R、S、V或W取代；其第2位置中的A经C、G、I、P、S、T或V取代；其第3位置中的S经G、M、N、P、Q、R、S或T取代；其第4位置中的E经A、D、F、G、H、K、M、Q、R、S、T或V取代；其第5位置中的N经A、D、E、G、K、L、P、Q、R、S、T或V取代；其第6位置中的I经A、F、L、M、Q、R、S、T或V取代；其第7位置中的Y经F、H、R或V取代；或其第8位置中的G经D、F、H、M、N、R、S、T或V取代；(ii)轻链CDR2的第1位置中的G经D、F、H、K、P、Q、S、V或Y取代；其第3位置中的T经Q取代；或其第4位置中的N经G取代；(iii)轻链CDR3的第1位置中的Q经E、G、I、M或N取代；其第2位置中的N经A、D、E、H、L、Q、S或T取代；其第3位置中的V经I、L、M、N、Q、S或T取代；其第4位置中的L经F、H、I、M、R、S、V、W或Y取代；其第5位置中的S经C、D、E、F、G、H、K、L、N、Q、R、T、V或Y取代；其第6位置中的S经D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、T、V或Y取代；其第7位置中的P经A、D、E、G、N、Q、S或V取代；其第8位置中的Y经E、F、L、M或Q取代；或其第9位置中的T经D、F、G、I、L、N、S、V、W或Y取代；(iv)重链CDR1的第1位置中的D经G或Q取代；其第2位置中的Y经Q取代；或其第4位置中的I经A或Q取代；(v)重链CDR2的第3位置中的F经D、E、W或Y取代；其第5位置中的G经D、H或Y取代；其第6位置中的S经F、P、W或Y取代；其第7位置中的G经A、F、L、N或T取代；其第8位置中的N经F、P、S、T或Y取代；其第9位置中的T经A、D、E、F、G、H、L、P、S或V取代；其第10位置中的H经A、D、F、M、R、S、T、V、W或Y取代；其第11位置中的F经G、H、I、L、M、N、P、Q、V或Y取代；其第12位置中的S经A、D、G、H、I、L、P、T或V取代；其第13位置中的A经D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V或Y取代；其第14位置中的R经A、E、G、H、L、N、P、Q、S、W或Y取代；其第15位置中的F经D、E、G、L、M、P、R、S、V或W取代；其第16位置中的K经A、E、F、G、H、L、R、S、T、V或Y取代；或其第17位置中的G经E、F、H、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W取代；或(vi)重链CDR3的第1位置中的G经E、F、H、N、Q、V或W取代；其第2位置中的D经E取代；其第3位置中的Y经L、Q、T或V取代；其第4位置中的G经W取代；其第5位置中的F经L或Y取代；其第6位置中的L经Q、S或Y取代；或其第7位置中的Y经C、L、M、N或Q取代。在本文中，其限制条件可为轻链CDR1包含0至5个取代，轻链CDR2包含0至1个取代，轻链CDR3包含0至7个取代，重链CDR1包含0至1个取代，重链CDR2包含0至11个取代，且重链CDR3包含0至6个取代。
特别地，在本发明的再又一示例性实施方案中，其限制条件可为，亲和力经优化的抗体包含：轻链可变区，其包含由SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:229至SEQ ID NO:268中的任一个表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:182至SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:227及SEQ ID NO:228中的任一个表示的轻链CDR2；由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:142至SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:191至SEQ ID NO:226及SEQ ID NO:269至SEQ ID NO:301中的任一个表示的轻链CDR3；及重链可变区，其包含由SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:112中的任一个表示的重链CDR1；由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:54至SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:118至SEQ ID NO:141中的任一个表示的重链CDR2；由SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:113至SEQ ID NO:117中的任一个表示的重链CDR3，更特别地，包含由SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:306至SEQ ID NO:311中的任一个表示的轻链可变区，及由SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:302至SEQ ID NO:305中的任一个表示的重链可变区，且更加特别地包含：(a)由SEQ ID NO:21表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:302表示的重链可变区；(b)由SEQ ID NO:21表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:305表示的重链可变区；(c)由SEQ ID NO:310表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:23表示的重链可变区；(d)由SEQ ID NO:308表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:305表示的重链可变区；(e)由SEQ ID NO:306表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:303表示的重链可变区；(f)由SEQ IDNO:307表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:304表示的重链可变区；(g)由SEQ ID NO:308表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:304表示的重链可变区；(h)由SEQ ID NO:309表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:304表示的重链可变区；(i)由SEQ ID NO:311表示的轻链可变区及由SEQ ID NO:304表示的重链可变区；或(j)由SEQ ID NO:306表示的轻链可变区及由SEQID NO:302表示的重链可变区，但不限于此。
在本发明的一个特定实施方案中，竞争选择法用于选择具有比人源化抗体更高的亲和力的抗体，因此获得多种亲和力经优化的抗体(表8至10及12)。亲和力经优化的抗体具有比人源化抗体优异4.3至28.5倍的肿瘤细胞增殖抑制作用(表11、13及图3)。
在本发明中，其限制条件可为，抗体是除了特异性结合至c-Met以外还进一步特异性结合至表皮生长因子受体(EGFR)的抗体或其抗原结合片段。
已知EGFR(ErbB酪氨酸激酶之一)在包含非小细胞肺癌的许多表皮细胞肿瘤中异常活化，造成细胞增殖、侵入、转移及血管生成，且提高细胞存活率。将作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂的吉非替尼(Gefitinib)(易瑞莎(Iressa))、埃罗替尼(elotinib)(厄洛替尼(Tarceva))及奥希替尼(osimertinib)(泰瑞沙(Tagrisso))用作代表性肺癌治疗剂；且将作为EGFR靶抗体的西妥昔单抗(cetuximab)(爱必妥(Erbitux))及帕尼单抗(panitumumab)(帕妥木单抗(帕妥木单抗))用作结肠癌治疗剂(Yewale C等人,Biomaterials.2013 34(34):8690-707(2013)，Deric L.Wheeler等人,Nature Reviews Clinical Oncology 7,493-507(2010))。
此类EGFR靶标治疗剂在治疗之前及之后一年产生抗性，其中c-Met扩增、突变及HGF诱发的活化已知为抗性的关键机理(Simona Corso Cancer Discovery 3:978-992(2013),Curtis R Chong等人,Nature Medicine 19,1389-1400(2013))。此外，据报导EGFR及c-Met同时表达在各种肿瘤细胞中，其中，在抑制EGFR后，c-Met被活化，由此迅速产生EGFR TKI的抗性(Engelman,J.A.,等人,Science,316:1039-43(2007))。
基于此类机理，仅用c-Met靶标药物进行的单一治疗及与EGFR靶标药物一起进行的组合治疗现已处于临床试验，但其作为治疗剂的功效尚未验证，并且需要研发用于c-Met相关的癌性肿瘤的治疗剂，其已知为抗性的关键原因。因此，本发明人已基于上述抗体制备c-Met/EGFR双特异性抗体。所述双特异性抗体不仅有效地抑制肿瘤细胞的增殖，其对现有EGFR治疗剂具有抗性，且还针对肿瘤细胞显示了优异的增殖抑制活性，因此有价值地用于治疗诸如经由各种机理c-Met介导的癌症的疾病。
限制条件可为，双特异性抗体以使得特异性结合至EGFR的抗体或其抗原结合片段连接至c-Met特异性抗体的一个轻链端或重链端(例如，连接至重链C端，但不限于此)的方式形成。
限制条件可为，特异性结合至EGFR的结合片段为Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
在本发明的一个示例性实施方案中，限制条件可为，Fv为scFv片段，其中scFv片段通过能够将scFv片段连接至c-Met抗体的一个轻链端或重链端的连接体连接。在本发明的一个示例性实施方案中，特异性结合至EGFR的抗体进一步通过用由SEQ ID NO:312表示的连接体连接来制备。
限制条件可为，EGFR scFv片段是能够特异性结合至EGFR的本领域已知的EGFRscFv，其中，例如，有爱必妥、帕妥木单抗、耐昔妥珠单抗(Portrazza)、TheraCIM等，但不限于此。
在本发明的一个示例性实施方案中，限制条件可为，EGFR scFv为爱必妥或帕妥木单抗scFv片段，特别地，EGFR scFv包含由SEQ ID NO:313或SEQ ID NO:314表示的氨基酸序列，其中帕妥木单抗scFv包含由SEQ ID NO:315表示的氨基酸序列，但不限于此。
根据本发明的一个特定实施方案，作为鉴定双特异性抗体的肿瘤细胞增殖抑制活性的结果，鉴定出抗体具有比hu8C4经优化的抗体更佳的肿瘤活性抑制功效(表16及17及图4、5、16及17)。特别地，鉴定出本发明抗体甚至对NCI-H292及NCI-H1648细胞系也具有优异的细胞增殖抑制作用，其中c-Met及EGFR正常表达(表17及19及图6)。基于此类结果，可看出本发明抗体的抗癌效果不受c-Met表达异常或存在或不存在c-Met突变等的特定限制。
此外，鉴定出本发明的双特异性抗体具有比两种抗体的组合治疗更佳的肿瘤细胞增殖抑制能力(表18至21及图6至8)。此外，作为鉴定本发明的双特异性抗体对抗原及信号转导材料的活性的效果的结果，鉴定出本发明的双特异性抗体具有比单独抗体更佳的信号转导抑制功效(图11)。
限制条件可为，本发明抗体或其抗原结合片段结合至由选自由SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333和/或SEQ ID NO:334表示的群的氨基酸序列表示的表位区。基于特定抗体(参考抗体)制备的亲和力经优化的抗体表征为，相对于参考抗体，与可变区的轻链及重链CDR序列具有高同源性，因此结合至与参考抗体相同的表位区，以使得此类亲和力经优化的抗体可享有全部生物学特征(诸如药学机理以及由结合位点、特异性及抗体引起的药学功效)，且与参考抗体相比，其展示了对结合亲和力的更佳的效果。
表位区分别指，例如来自参考c-Met抗原(SEQ ID NO:335)的N端的第321至第329位置中的YVSKPGAQL(SEQ ID NO:331)、第333至第341位置中的IGASLNDDI(SEQ ID NO:332)、第366至第372位置中的PIKYVND(SEQ ID NO:333)及第464至第474位置中的QVVVSRSGPST(SEQ ID NO:334)，其中具有结合至其的本发明的抗体或其抗原结合片段的c-Met抗原序列包含部分突变(取代、添加或缺失)，或结合抗原以c-Met片段、前体或亚型的形式存在，因此其结合位点或序列可相应地略微变化。尽管如此，基于参考c-Met抗原的表位序列信息，本领域普通技术人员仍可清晰指明本发明抗原或其抗原结合片段结合的位置及序列。
在本发明的一个特定实施方案中，鉴定出本发明的双特异性抗体hu8C4×帕妥木单抗scFv结合至人c-Met sema结构域β链的4个表位区Y321-L329(SEQ ID NO:331)、I333-I341(SEQ ID NO:332)、P366-D372(SEQ ID NO:333)及Q464-S474(SEQ ID NO:334)(表28)。
本发明的“特异性结合至c-Met的抗体或其抗原结合片段”是指以1×10-7M或更小的KD结合至人c-Met的抗体或抗原结合片段。限制条件可为，抗体或其抗原结合片段以例如5×10-8M或更小的KD，1×10-8M或更小的KD，5×10-9M或更小的KD，或1×10-9M或更小的KD结合至人c-Met，但不限于此。
在本发明的一个特定实施方案中，通过鉴定hu8C4、hu8C4 AH71及hu8C4×帕妥木单抗scFv对c-Met ECD的结合亲和力，从而鉴定出KD值分别为3.173×10-10、9.993×10-11及2.78×10-10，直接鉴定出本发明抗体或其抗原结合片段对c-Met抗原具有高的结合亲和力(表22)。鉴定出本发明抗体或其抗原结合片段对食蟹猕猴(一种猿)的c-Met抗原具有交叉反应性(表22)，但不与来源于其他动物(例如啮齿动物)的抗原结合(图9)。此外，鉴定出本发明抗体或其抗原结合片段不与除c-Met外的细胞表面上的其他受体结合(表24)。因此，由以上结果可看出，本发明抗体或其抗原结合片段显示对人和猴的c-Met抗原的结合特异性。
如本文所用，术语“结合常数(Kon)”是指特定抗体-抗原相互作用的结合比率，且术语“解离常数(Koff)”是指特定抗体-抗原相互作用的解离比率。此外，在本发明中，术语“对抗原的亲和力(KD)”是将Koff:Kon之比(即，Koff/Kon)表示为摩尔浓度(M)的亲和力。限制条件可为，抗体的KD值通过使用本领域中广泛建立的方法来测量。例如，作为一种用于测量抗体的KD值的方法，其可通过使用BiocoreTM系统的表面等离振子共振分析提供，但不限于此。
本发明的另一方面提供了用于产生编码抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体、具有引入其中的表达载体的宿主细胞、使用该宿主细胞的抗体或其抗原结合片段的方法。
该抗体及其抗原结合片段诸如上述抗体及其抗原结合片段。
如本文所用，术语“核酸分子”具有全面包含DNA及RNA分子的含义，其中核苷酸(核酸分子中的基本组分单位)不仅包含天然核苷酸，还包含类似物，其中糖或碱基部分被修饰(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman及Peyman,ChemicalReviews,(1990)90:543-584)。用于编码本发明的重链及轻链可变区的核酸分子序列可被修饰，其中修饰包含核苷酸的添加、缺失或非保守或保守取代。
应当理解，本发明的核酸分子还包含与前述核苷酸序列呈现实质同一性的核苷酸序列。在本发明中，在以最相对应的方式将本发明的前述核苷酸序列与任何其他序列进行比对并通过本领域常规使用的算法分析所比对的序列的情况下，实质同一性是指呈现最低80％同源性，特别是最低90％同源性，更特别地最低95％同源性的核苷酸序列。
如本文所用，术语“载体”，其为用于在宿主细胞中表达靶基因的工具，包含质粒载体、黏粒载体及病毒载体，诸如噬菌体载体、腺病毒载体、反转录病毒载体及腺相关病毒，特别是质粒载体，但不限于此。
在本发明的载体中，限制条件可为，编码轻链可变区的核酸分子和编码重链可变区的核酸分子与启动子可操作地连接。
在本发明中，术语“可操作地连接”是指在核酸表达调节序列(例如启动子、信号序列或转录调节因子结合位点中的阵列)与其他核酸序列之间功能性结合，因此调节序列控制其他核酸序列的转录和/或解码。
本发明的重组载体系统可经由本领域已知的各种方法构建。例如，此类详细方法公开于Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)中，该文献以引用的方式并入本文中。
本发明的载体通常可构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。此外，本发明的载体可以以原核细胞或真核细胞为宿主的方式构建。
例如，如果本发明的载体为表达载体且原核细胞为宿主，则通常包含能够进行转录的强力启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子、T7启动子等)、用于开始解码的核糖体结合位点及转录/解码终止序列。如果大肠杆菌(例如HB101、BL21、DH5α等)用作宿主细胞，则大肠杆菌色氨酸生物合成路径的启动子及操纵子部分(Yanofsky,C.,J.Bacteriol.,(1984)158:1018-1024)和噬菌体λ的左侧启动子(pLλ启动子，Herskowitz,I.及Hagen,D.,Ann.Rev.Genet.,(1980)14:399-445)可用作调节部分。若芽孢杆菌(Bacillus sp.)用作宿主细胞，则苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的毒素蛋白基因的启动子(Appl.Environ.Microbiol.(1998)64:3932-3938；Mol.Gen.Genet.(1996)250:734-741)或可在芽孢杆菌中表达的任何启动子可用作调节部分。
同时，本发明的重组载体可通过操纵本领域常用的质粒(例如，pCL、pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pUC19等)、噬菌体(例如，λgt4·λB、λ-Charon、λΔz1、M13等)或病毒(例如SV40等)来制备。
同时，如果本发明的载体为表达载体且真核细胞为宿主，则可使用衍生自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红素启动子及人肌酸启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫罗尼病毒启动子、艾司坦-巴尔(Epstein-barr)病毒(EBV)启动子及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子)，其中它们通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。特别地，本发明的重组载体包含CMV启动子。
本发明的重组载体可与其他序列融合，以便于精制自其中表达的抗体。作为融合序列的实例，存在谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)、6x His(六聚组氨酸；Quiagen，USA)等。此外，由本发明载体表达的蛋白质为抗体，因此所表达的抗体可易于经由蛋白A柱等纯化，而不需要用于精制的额外序列。
同时，本发明的重组载体包含本领域中常规使用的抗生素抗性基因作为选择标记，其中其可包含例如氨苄青霉素(ampicillin)、庆大霉素(gentamicin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、氯霉素、链霉素、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素、新霉素及四环素的抗性基因。
作为表达本发明抗体的载体，可存在其中轻链和重链同时在一个载体中表达的载体系统，和其中轻链和重链分别在单独的载体中表达的系统。在后一种情况下，可将两个载体例如经由共转化或靶向转化引入宿主细胞中。共转化是一种用于在将编码轻链及重链的各载体DNA同时引入宿主细胞中之后选择表达轻链及重链两者的细胞的方法。靶向转化是一种用于选择用包含轻(或重)链的载体转化的细胞并再次用包含重(或轻)链的载体转化所选择的细胞以最终选择表达轻链及重链两者的细胞的方法。
只要它们能够稳定且连续地克隆并表达本发明的载体，即可使用本领域已知的任何宿主细胞，其中此类宿主细胞可包含芽孢杆菌菌株，诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及苏云金芽孢杆菌；及原核宿主细胞，诸如链霉菌(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)(例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌(Staphylococcus)(例如肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus))，但不限于此。
作为载体的适合真核宿主细胞，可存在霉菌，诸如曲霉菌属(Aspergillusspecies)；酵母，诸如毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)；及红面包霉菌(Neurospora crassa)；其他低级真核细胞、高级真核细胞，诸如来源于昆虫的细胞及来源于植物或哺乳动物的细胞。
特别地，宿主细胞可为COS7细胞(猴肾细胞)、NS0细胞、SP2/0、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、W138、幼仓鼠肾(BHK)细胞、MDCK、骨髓瘤细胞系、HuT 78细胞或293细胞，更特别地为CHO细胞，但不限于此。
在本发明中，“转化”和/或“转染”至宿主细胞中可通过根据本领域已知的宿主细胞选择适合标准技术执行，包含将核酸引入生物体、细胞、组织或器官中的任何方法。方法包含电穿孔；胞质融合；磷酸钙(CaPO4)沉淀；氯化钙(CaCl2)沉淀；使用碳化硅纤维搅动；农杆菌介导的转化；PEG、硫酸葡聚糖、脂质转染胺、脱水/抑制介导的转化等，但不限于此。
在本发明中，使用宿主细胞产生抗体或其抗原结合片段的方法可尤其包含以下步骤：(a)培养用本发明的重组载体转化的宿主细胞；及(b)在宿主细胞中表达抗c-Met抗体或其抗原结合片段。
在制备上述抗体中，经转化的宿主细胞的培养可在适当培养基中并在本领域已知的培养条件下进行。本领域技术人员可根据所选菌株容易地调整此类培养方法。此类培养方法公开于各种文献(例如，James M.Lee,Biochemical Engineering,Prentice-HallInternational Editions,138-176)中。根据细胞生长类型，细胞培养分为悬浮培养及贴壁培养，且根据培养方法分为批式培养、补料批式培养及连续培养。培养中使用的培养基必须适当满足特定菌株的要求。
在培养动物细胞时，培养基包含各种碳源、氮源及微量元素成分。可用的碳源的实例可包含碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉及纤维素；脂肪，诸如大豆油、葵花油、蓖麻油及椰子油；脂肪酸，诸如棕榈酸、硬脂酸及亚麻油酸；醇，诸如丙三醇及乙醇；及有机酸，诸如乙酸，其中此类碳源可单独或以组合形式使用。
可用于本发明中的氮源可包含例如有机氮源，诸如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(CSL)及大豆-小麦；及无机氮源，诸如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵，其中此类氮源可单独或以组合形式使用。作为磷源，培养基可包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及与其相对应的含钠盐。此外，培养基可包含金属盐，诸如硫酸镁或硫酸铁。此外，培养基可包含氨基酸、维生素、适当的前体等。
在培养期间，以适当方式将诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸及硫酸的化合物添加至培养产物中，以调节培养产物的pH。此外，在培养期间，可通过使用诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂抑制气泡形成。此外，将氧或含氧气体(例如空气)注入培养产物以便维持培养产物的有氧状态。培养产物的温度通常为20℃至45℃，优选25℃至40℃。
产生方法可进一步包含以下步骤：(c)收集在宿主细胞中表达的抗c-Met抗体或其抗原结合片段。通过培养经转化的宿主细胞获得的抗体可在非纯化状态下使用，或通过使用各种常规方法，例如透析、盐沉淀、层析等，进一步以高纯度在纯化状态下使用。除了那些方法，最常使用的是使用层析的方法，其中根据抗体特征、培养方法等，柱的类型及顺序可选自离子交换层析法、大小排阻层析法、亲和力层析法等。
本发明的另一方面提供了包含抗体或其抗原结合片段的用于检测c-Met的组合物、包含该组合物的用于检测的试剂盒，以及使用该试剂盒检测c-Met抗体的方法。
用于检测c-Met的组合物及包含该组合物的试剂盒以使得特异性结合至c-Met的抗体或其抗原结合片段与标本样本接触的方式形成抗原-抗体复合物，从而有效地检测c-Met。
如本文所用，术语“抗原-抗体复合物”是指c-Met与用于识别c-Met的抗体之间的缀合物，以便鉴定样本中表达c-Met的肿瘤或癌细胞。
使用检测c-Met的组合物和使用包含该组合物的试剂盒定量c-Met抗原的方法可通过鉴定抗原-抗体复合物的形成来进行，其中鉴定抗原-抗体复合物的形成可通过以下执行：酶免疫测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫荧光法、免疫组织化学染色、流式细胞术、免疫细胞化学、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、补体结合测定、蛋白芯片法等，但不限于此。ELISA包含各种ELISA方法，诸如使用用于识别与固体支持物附着的抗原的经标记抗体的直接ELISA；使用用于识别抗体(用于识别与固体支持物附着的抗原)复合物中的捕获抗体的经标记二级抗体的间接ELISA；使用用于识别抗体及与固体支持物附着的抗原的复合物中的抗原的另一经标记抗体的直接夹心ELISA；使用用于与另一抗体(用于识别抗体及与固体支持物附着的抗原的复合物中的抗原，且随后识别此类抗体等)反应的经标记二级抗体的间接夹心ELISA。
作为用于定性或定量地使抗原-抗体复合物的形成可测量的标记物，存在着酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒、氧化还原分子、放射性同位素等，但未必限于此。作为酶，存在β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶及GDP酶、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶及荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶、β-内酰胺酶等，但不限于此。
本发明的另一方面提供了包含本发明抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗癌症的组合物。
本发明的另一方面提供了用于预防或治疗癌症的方法，包含向处于发展癌症的危险中或患有癌症的个体施用包含本发明抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤。
本发明的再又一方面提供了关于包含本发明抗体或其抗原结合片段的组合物的癌症治疗的用途及制备抗癌药物的用途。
所述抗体及其抗原结合片段诸如上述抗体及其抗原结合片段。
本发明抗体或其抗原结合片段能够以高亲和力单独结合至c-Met或结合至c-Met和EGFR的组合，以抑制癌细胞生长，使得抗体单独或与常规药学上可接受的载体组合可用于治疗、预防和诊断过度增殖疾病，诸如癌症。
在本发明中，术语“预防”是指通过施用本发明组合物预防或推迟诸如癌症等疾病发生或复发的所有作用，且术语“治疗”是指抑制诸如癌症的疾病的发展、减轻癌症或消除癌症。
限制条件可为，癌症(一种应用本发明组合物的疾病)特别是肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、成胶质细胞瘤、胰腺癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫内膜瘤、唾液腺肿瘤或甲状腺癌，更特别是肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、成胶质细胞瘤、胰腺癌、头颈癌、乳腺癌，并且更特别是肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、成胶质细胞瘤、胰腺癌、头颈癌，但不限于此。在本发明中，限制条件可为，癌症是一种特别由c-Met过度表达、扩增、突变或活化引起的癌症，但不限于此。换言之，包含本发明抗体或其结合片段的组合物对所有癌性肿瘤的增殖均具有抑制作用，而与c-Met的异常表达或突变无关，使得本发明的药物用途不受c-Met的表达方面或突变的存在或不存在限制。
组合物可以是药物组合物、准药物组合物和保健食品组合物的形式。
用于预防或治疗癌症的本发明组合物可进一步包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是常规用于制备制剂的药学上可接受的载体，包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯啶酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等，但不限于此。除了这些成分以外，用于预防或治疗癌症的本发明组合物可进一步包含润滑剂、保湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。适合的药学上可接受的载体及制剂详细地描述于Remington's Pharmaceutical Sciences(第19版,1995)中。
本发明组合物可口服或肠胃外施用，其中肠胃外施用可通过静脉内输注、皮下输注、肌内注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠施用等进行。在口服施用期间，蛋白质或肽被消化，因此口服组合物可以以这样的方式配制，即，其活性药物被包衣或被保护免于在胃中分解。本发明组合物可通过预定的装置施用，活性物质可通过该装置移动到靶细胞中。
用于预防或治疗癌症的本发明组合物的适合剂量取决于如配制方法、施用类型、患者的年龄、重量、性别、疾病状况、食物、施用时间、施用路径、排泄速度及反应敏感性的此类因素而改变，其中一般熟练的医生可容易地确定和开出用于所需治疗或预防的有效剂量。根据本发明的示例性实施方案，本发明的药物组合物的日剂量可为0.001-100mg/kg或更高。在本说明书中，术语“药物有效剂量”是指足以治疗、预防及诊断诸如癌症的疾病的量。
可根据本领域技术人员容易进行的适于本发明的方法，通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂，将用于预防或治疗癌症的本发明组合物配制成制剂，使得此类组合物可以单剂量形式制备或通过嵌入多剂量容器中来制备。此时，剂型可以是油或水介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式，或是提取物、粉末、栓剂、粉末状药物、颗粒、片剂或胶囊的形式，且可进一步包含分散剂或稳定剂。
本发明组合物可作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，且可与常规治疗剂依序或同时施用。
本发明抗体或其抗原结合片段可以以这样的方式用于治疗癌症，即，其以抗体治疗剂(功能性分子)和双特异性抗体治疗剂(功能性分子)缀合物的形式体内注射，所述抗体治疗剂和双特异性抗体治疗剂缀合物如上所述。用于将药物靶向至特异性靶标位点的适当的和合乎需要的各种条件报道于文献中，例如Trouet等人,Plenum Press,New York andLondon,(1982)19-30。
根据本发明的一个特定实施方案，作为鉴定本发明组合物在异种移植小鼠模型中预防或治疗癌症的抗肿瘤活性的结果，鉴定出其肿瘤活性抑制功效与对照组相比显著优异(图12和13)。
本发明组合物中所包含的抗体或其抗原结合片段所靶向的c-Met是在癌细胞表面上表达的分子，因此其可以以使得功能性分子进一步与本发明抗体结合或与其组合施用的方式用于c-Met相关癌症的预防、治疗和诊断。功能性分子可包含化学物质、放射性核素、免疫治疗剂、细胞因子、趋化因子、毒素、生物药剂、酶抑制剂等。
能够与本发明抗体或其片段偶联产生抗体药物缀合物(ADC)的功能性分子可以是化学物质、细胞因子或趋化因子，但不限于此。例如，化学物质可为抗癌药物，特定言之，阿维菌素(acivicin)、阿柔比星(aclarubicin)、阿考达唑(acodazole)、降真香碱(acronycine)、阿多来新(adozelesin)、丙氨菌素(alanosine)、阿地介白素(aldesleukin)、别嘌醇钠(allopurinol sodium)、六甲蜜胺(altretamine)、胺格鲁米特(aminoglutethimide)、胺萘非特(amonafide)、安普利近(ampligen)、安吖啶(amsacrine)、雄激素、胺癸叮(anguidine)、甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)、亮胺酸溶肉瘤素(asaley)、天冬酰胺酶(asparaginase)、5-氮胞苷、硫唑嘌呤(azathioprine)、卡介苗(bacillus calmette-guerin；BCG)、贝克氏抗叶酸剂(Baker's antifol)、β-2-二氧硫鸟苷、比生群HCl(bisantrene HCl)、硫酸博莱霉素(bleomycin sulfate)、白消安(busulfan)、丁硫氨酸亚砜亚胺(buthionine sulfoximine)、BWA773U82、BW502U83/HCl、BW7U85甲磺酸盐、赛瑞酰胺(ceracemide)、卡贝替姆(carbetimer)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯喹恶啉-磺酰胺(chloroquinoxalin-sulfonamide)、氯脲霉素(chlorozotocin)、色霉素A3(chromomycin A3)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、皮质类固醇、微小棒状杆菌(corynebacteriumparvum)、CPT-11、克立那托(crisnatol)、环胞苷、环磷酰胺、阿糖胞苷、色他巴(cytembena)、顺丁烯二酸达比斯(dabis maleate)、达喀尔巴嗪(decarbazine)、放线菌素、道诺霉素HCl(daunorubicin HCl)、脱氧鸟苷(deazauridine)、右雷佐生(dexrazoxane)、双去水半乳糖醇、地吖醌(diaziquone)、二溴卫矛醇(dibromodulcitol)、膜海鞘素B、氨基甲酸二乙基二硫酯、二乙醇醛(diglycoaldehyde)、二氢-5-氮胞苷、多柔比星(doxorubicin)、棘霉素、依达曲沙(dedatrexate)、依地福新(edelfosine)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、艾略特氏溶液(Elliot's solution)、依沙芦星(elsamitrucin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、磷酸雌莫司汀(estramustine phosphate)、雌激素、依他硝唑(etanidazole)、伊索弗斯(ethiophos)、依托泊苷(etoposide)、法倔唑(fadrazole)、法扎拉滨(fazarabine)、芬维A胺(fenretinide)、非格司亭(filgrastim)、非那雄胺(finasteride)、黄酮乙酸、氟尿苷(floxuridine)、磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)、5'-氟脲嘧啶(5'-fluorouracil)、全氟碳TM、氟他胺(flutamide)、硝酸镓、吉西他滨(gemcitabine)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、海普法姆(hepsulfam)、六亚甲基双乙酰胺、高粗榧碱、硫酸肼、4-羟雄甾烯二酮、羟基尿素、伊达比星HCl(idarubicinHCl)、异环磷酰胺、4-甘薯黑斑酶醇(4-ipomeanole)、异丙铂(iproplatin)、异维甲酸、亚叶酸钙、乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、左旋咪唑(levamisol)、脂质道诺霉素、脂质体捕获多柔比星、洛莫司汀(lomustine)、氯尼达明(lonidamine)、美登素(maytansine)、盐酸氮芥、美法仑(melphalan)、美诺立尔(menogaril)、美巴酮(merbarone)、6-巯基嘌呤、美司钠(mesna)、卡介苗的甲醇提取物、甲胺喋呤(methotrexate)、N-甲基甲酰胺、米非司酮(mifepristone)、米托胍腙(mitoguazone)、丝裂霉素-C、米托坦(mitotane)、盐酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)、单核球/巨噬细胞群落刺激因子、纳比隆(nabilone)、萘氧啶(nafoxidine)、新抑癌蛋白、醋酸奥曲肽(octreotide acetate)、奥马铂(ormaplatin)、奥赛力铂(oxaliplatin)、紫杉醇、N-膦乙酰基-L-天冬氨酸(pala)、喷司他丁(pentostatin)、哌嗪二酮(piperazinedione)、哌泊溴烷(pipobroman)、吡柔比星(pirarubicin)、吡曲克辛(piritrexim)、盐酸吡罗蒽醌(piroxantrone hydrochloride)、PIXY-321、普卡霉素(plicamycin)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、泼尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、孕激素、吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)、雷佐生(razoxane)、沙格司亭(sargramostim)、司莫司汀(semustine)、锗螺胺(spirogermanium)、螺莫司汀(spiromustine)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、磺氯苯脲(sulofenur)、苏拉明钠(suramin sodium)、他莫昔芬(tamoxifen)、克癌易(taxorere)、喃氟啶(tegafur)、替尼泊苷(teniposide)、对苯二甲酰胺(terephthalamidine)、替罗昔隆(teroxirone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、胸苷注射、噻唑呋林(tiazofurin)、拓朴替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、维甲酸(tretinoin)、盐酸三氟吡啦嗪(trifluoperazine hydrochloride)、曲氟尿苷(trifluridine)、曲美沙特(trimetrexate)、肿瘤坏死因子(TNF)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、硫酸长春碱(vinblastin sulfate)、硫酸长春新碱(vincristinesulfate)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春利定(vinzolidine)、Yoshi 864、佐柔比星(zorubicin)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、依托泊苷、美法仑、泰索帝(taxotere)、紫杉醇及其混合物，但不限于此。
本发明的实施方式
在下文中，将经由实施例更详细地描述本发明。以下实施例仅出于更详细地说明本发明的目的而提供。因此，根据本发明的目的，本领域技术人员显而易知实施例并不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1.制备用于产生c-Met特异性抗体的杂交瘤细胞及鉴定其肿瘤细胞增殖抑制活性
(1)制备及选择用于产生针对c-Met蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系
将人c-Met Sema结构域/Fc融合蛋白(自身产生的)作为抗原腹膜内注射至小鼠中，以便获得经由动物免疫产生杂交瘤细胞系所需的免疫小鼠。经由ELISA分析方法使用人c-Met/His融合蛋白作为抗原进行筛选，以便从杂交瘤细胞群中选择出只对c-Met蛋白特异性应答的杂交瘤细胞。
(2)c-Met抗体
从所选的杂交瘤细胞系获得的小鼠抗体的轻链和重链CDR氨基酸序列分别示于表1和2中。
[表1]
杂交瘤轻链CDR
Figure BDA0002296115610000251
[表2]
杂交瘤重链CDR
Figure BDA0002296115610000252
(3)杂交瘤c-Met抗体的活体外肿瘤细胞增殖抑制活性
关于从杂交瘤细胞系获得的c-Met特异性小鼠抗体以及通过将抗体与人重链及轻链恒定区融合而制备的嵌合抗体，在人成胶质细胞瘤细胞系U-87 MG和人胃癌细胞系MKN45中测试肿瘤细胞增殖抑制活性。
特别地，将U-87 MG细胞(ATCC,#HTB14)稀释在含有10％(v/v)FBS、100U/500ml青霉素及100μg/500ml链霉素(Invitrogen,#15140-122)的培养基EMEM(ATCC,#30-2003)中，其后将所得细胞以2.5×103个细胞的浓度添加100μl至96孔板的各孔中，使得培养板在37℃、95％RH及5％(v/v)CO2条件下培养18-24小时。从各孔移除细胞培养基，其后将含有2％(v/v)FBS的EMEM培养基以100μl添加至各孔中，并且将以2×终浓度(100nM)制备的抗体以1/10的比率连续稀释，使得所得细胞以每种抗体六个浓度(即，200nM、20nM、2nM、200pM、20pM及2pM)添加100μl至各孔中。随后，将平板在37℃、95％RH及5％(v/v)CO2条件下培养5天，其后在最后一天将所得细胞用10％TCA(三氯乙酸；Sigma,#T0699)溶液固定。以将80μl的0.4％SRB(磺酰罗丹明B)溶液添加至各孔中的方式，将所得经固定的细胞染色25分钟，其后用1％乙酸溶液洗涤所得细胞5次。随后，将150μl的10mM Tris溶液嵌入干燥板的各孔中以溶解SRB染料，其后通过使用酶标仪在540nm的波长下测量其光密度。
此外，将MKN45(#JCRB0254)细胞系稀释在含有10％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基(Gibco,#A10491)中，其后将所得细胞系以2.5×103分配至96孔板的各孔中，使得所得平板在37℃、5％CO2条件下培养过夜。随后，平板各孔的培养基用100μl的含有1％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基替换，其后以1/10的比率(即，100nM、10nM、1nM、100pM、10pM及1pM)依序稀释测试抗体，以在100nM的最终浓度下达到1pM，使得将所得抗体以100μl添加至各孔中。接着，将平板在37℃、5％CO2条件下培养5天，其后自其中移除培养基，使得将200μl TCA溶液嵌入各孔中以固定细胞。如对U87 MG细胞的测试中所示，根据常规SRB比色测定方法，将平板的细胞染色，其后在540nm的波长下通过使用酶标仪测量各孔的光密度。U87 MG和MKN45细胞系的结果示于表3和图1中。
[表3]
杂交瘤c-Met抗体的肿瘤细胞增殖抑制活性的活体外测试的结果
Figure BDA0002296115610000261
如以上表3和图1中所见，本发明的抗c-Met 8C4、5G3抗体及其嵌合体抗体均具有肿瘤细胞增殖抑制活性，其与已知的c-Met抗体LY2875358和OA-5D5(对照组)同等优异或比其更优异。因此，8C4、5G3抗体及其突变体(诸如本发明的嵌合体抗体、人源化抗体及针对抗原的亲和力经优化的抗体)可极有价值地用于预防或治疗c-Met相关的癌症。
本发明的8C4、5G3抗体的轻链和重链可变区的特异性共同序列示于下表4中。
[表4]
8C4、5G3抗体的轻链和重链可变区的共有SEQ ID NO
Figure BDA0002296115610000271
实施例2. 8C4抗体的人源化抗体的制备及其体外肿瘤细胞增殖抑制活性的鉴定
作为一个实施例，将小鼠抗体8C4人源化，并鉴定其体外肿瘤细胞增殖抑制活性，以便进一步鉴定本发明中所制备的抗体的效果。
对于8C4抗体重链的人源化设计，首先经Ig Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，分析与小鼠抗体8C4的重链可变区中的基因具有高同源性的人生殖系基因。结果，鉴定出IGHV3-23与8C4抗体在氨基酸水平上具有48％同源性，并且还鉴定出IGHV3-11与8C4抗体在氨基酸水平上具有46％同源性。
小鼠抗体8C4的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3由Kabat编号定义，且hu8C4-1以如下方式制备，即，小鼠抗体8C4的CDR部分表示为被引入IGHV3-23的构架中。此时，第48号(V→I)、第49号(S→G)、第71号(R→A)、第73号(N→K)、第78号(L→A)和第94号(K→G)氨基酸被回复突变为小鼠抗体8C4的原始氨基酸序列，以最终构建hu8C4-1的重链。在hu8C4-2的情况下，小鼠抗体8C4的CDR部分表示为被引入IGHV3-11的构架中，且第48号(V→I)、第49号(S→G)、第71号(R→A)、第73号(N→K)、第78号(L→A)及第94号(R→G)氨基酸被回复突变为小鼠抗体8C4的原始氨基酸序列，以最终构建hu8C4-2的重链。
甚至在8C4抗体的轻链的情况下，对于人源化设计，通过Ig Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，分析与小鼠抗体8C4的轻链可变区中的基因具有高同源性的人生殖系基因。结果，鉴定出IGKV1-27与8C4抗体在氨基酸水平上具有65.3％同源性，且IGKV1-33与8C4抗体在氨基酸水平上具有64.2％同源性。
小鼠抗体8C4的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3由Kabat编号定义，且小鼠抗体8C4的CRD部分表示为被引入IGKV1-33的构架及IGKV1-27的构架中，由此分别制备hu8C4-1和hu8C4-2。此时，hu8C4-1和hu8C4-2两者的第69号(T→R)氨基酸被回复突变为小鼠抗体8C4的原始氨基酸序列。
8C4人源化抗体通过使用pCLS05载体(韩国专利注册号10-1420274)在293T细胞中表达。关于此类获得的呈IgG1形式的人源化抗体，通过与以上实施例1中所示的相同的方法，鉴定其在U-87 MG(人成胶质细胞瘤细胞系)中是否具有肿瘤细胞增殖抑制活性。
结果，鉴定出hu8C4-1和hu8C4-2的IC50值分别为30nM和24.6nM，因此指示与嵌合体8C4抗体(IC50＝32.4nM)的抗癌活性水平相似的抗癌活性水平。
hu8C4-1和hu8C4-2人源化抗体的轻链及重链可变区的特异性共有序列示于表5中。
[表5]
hu8C4-1和hu8C4-2人源化抗体的轻链和重链可变区的共有SEQ ID NO
Figure BDA0002296115610000281
Figure BDA0002296115610000291
实施例3. 5G3抗体的人源化抗体的制备及其活体外肿瘤细胞增殖抑制活性的鉴定
随后，将本发明的小鼠抗体5G3人源化，以鉴定其活体外肿瘤细胞增殖抑制活性。
特别地，对于hu5G3-1的重链设计，首先通过Ig Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，分析与小鼠抗体5G3的重链可变区中的基因具有最高同源性的人生殖系基因。结果，鉴定出IGHV1-46与5G3抗体在氨基酸水平上具有67.3％同源性。小鼠抗体5G3的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3由Kabat编号定义，且小鼠抗体5G3的CRD部分表示为被引入IGHV1-46的构架中。此时，第48号(M→I)、第69号(M→L)、第71号(R→A)、第73号(T→K)及第78号(V→A)氨基酸被回复突变为小鼠抗体5G3的原始氨基酸序列。藉此，构建了hu5G3-1的重链。
对于hu5G3-1的轻链，在与5G3抗体具有63.5％同源性的IGKV3-20基因中进行CDR移植，且第43号(A→S)、第60号(D→A)及第71号(F→N)氨基酸被回复突变以构建hu5G3-1的轻链。
此外，为了设计hu5G3-2的重链，由Kabat编号定义的小鼠抗体5G3的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3通过使用VH3亚型而被引入，所述亚型常规地已知为最稳定的亚型。此时，第67号(F→A)、第69号(I→L)、第73号(T→K)、第90号(Y→F)和第94号(T→R)氨基酸被回复突变为小鼠抗体5G3的原始氨基酸序列。藉此，构建了hu5G3-2的重链。
对于hu5G3-2的轻链，在IGVKⅢ基因中进行CDR移植，已知所述IGVKⅢ基因稳定地形成具有VH3亚型的结构，并且不进行回复突变。
通过使用pCLS05载体(韩国专利注册号10-1420274)，在293T细胞中表达5G3人源化抗体。关于此类获得的呈IgG2形式的人源化抗体，通过与以上实施例1中所示的相同的方法，鉴定其在MKN45(人胃癌细胞系)中是否具有肿瘤细胞增殖抑制活性。
结果，鉴定出hu5G3-1和hu5G3-2的IC50值分别为0.52nM和0.5nM，因此指示与嵌合体5G3抗体(IC50＝0.41nM)的抗癌活性水平相似的抗癌活性水平。
hu5G3-1和hu5G3-2人源化抗体的轻链和重链可变区的共同序列示于表6中。
[表6]
hu5G3-1和hu5G3-2人源化抗体的轻链及重链可变区的共有SEQ ID NO
Figure BDA0002296115610000301
Figure BDA0002296115610000311
实施例4.铰链突变体的制备及其肿瘤细胞增殖抑制活性的测试
随后，根据人IgG1重链恒定区的铰链序列对肿瘤细胞增殖抑制活性进行测试。
首先，人IgG1重链恒定区的铰链具有氨基酸序列“EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:37)”，其经取代以获得具有氨基酸序列SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:44的铰链区突变体。
所得突变体分别克隆至包含以上实施例2中制备的hu8C4-1、hu8C4-2人源化抗体的重链可变区的载体中。通过与以上实施例1中所示相同的方法，在U-87 MG中鉴定根据铰链序列的活体外肿瘤细胞增殖抑制活性。
此外，关于非小细胞肺癌细胞系NCI-H1993(ATCC,#CRL-5909)如下分析8C4人源化抗体的效果。将NCI-H1993细胞系稀释于含有10％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基(Gibco,#A10491)中，其后将所得细胞系以3.0×103分配至96孔板的各孔中，使得所得平板在37℃、5％CO2条件下过夜培养。此后，平板各孔的培养基用100μl的含有2％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基替换，其后以1/10的比率(即，100nM、10nM、1nM、100pM、10pM和1pM)依序稀释测试抗体，以在100nM的最终浓度下达到0.001nM，使得将所得抗体以100μl添加至各孔中。接着，将平板在37℃、5％CO2条件下培养5天，其后自其中移除培养基，使得将200μl的TCA溶液(Sigma,#T0699)嵌入各孔中以固定细胞。此外，根据常规SRB比色测定方法，将平板的细胞染色，其后在540nm的波长下通过使用酶标仪测量各孔的光密度。
U-87 MG和NCI-H1993(ATCC,#CRL-5909)中的hu8C4-1的结果示于表7中。
[表7]
铰链区突变体序列及肿瘤细胞增殖抑制活性的活体外测试的结果
Figure BDA0002296115610000321
如表7中所见，根据铰链序列的差异，hu8C4抗体的肿瘤细胞增殖抑制活性存在一定差异，但鉴定出此类抗体有效地抑制大部分肿瘤细胞的增殖。因此，在下文中，将代表性地具有hu8C4-1中铰链区SEQ ID NO:38的IgG1人源化抗体称为hu8C4，并且制备其亲和力经优化的抗体以鉴定其效果。
实施例5.hu8C4的亲和力经优化的抗体的制备及其活体外肿瘤细胞增殖抑制活性的鉴定
为了制备hu8C4的亲和力经优化的抗体，首先通过使用以scFv和pIII的组合形式展示的噬菌粒载体来制备噬菌体展示的scFv文库，其中载体的示意性结构绘示于图2中。噬菌粒载体包含在IPTG诱导型lac启动子控制下的抗体的scFv片段，其中所用的接头序列为GGGGS GGGGS GGGGS(SEQ.No.53)。
随后，具有NNK密码子的诱导突变的寡核苷酸用于将变种引入hu8C4的重链及轻链CDR结构域中。因此，制备了具有His、HA及pIII的融合的hu8C4 scFv文库，其后从所制备的抗体文库中选择人c-Met特异性抗体。
特别地，竞争选择法用于选择具有提高的亲和力的抗体。人c-Met抗原根据制造商准则结合于
Figure BDA0002296115610000332
M-280(Thermo Fisher Scientific,11205D)中。具有结合至其的抗原的珠粒由超封闭Tris缓冲盐水(TBS,Pierce)封闭2小时。此外，重组噬菌体在37℃下生长隔夜，且随后使重组噬菌体离心，且其上清液的噬菌体用超封闭TBS、0.05％Tween 20封闭2小时。随后，用含有0.05％Twin 20的PBS洗涤珠粒。将经封闭的噬菌体溶液添加至经洗涤的珠粒中，其后将所得珠粒在旋转器中温育2小时以用于噬菌体结合，使得所得珠粒用含有0.05％Twin 20的PBS洗涤。随后，将人c-Met抗原添加至含有0.05％Twin 20的1ml PBS中，其后将所得抗原在旋转器中温育24小时(Rouet R等人(2012)Nat Protoc.7:364-373)。此后，结合至珠粒的噬菌体用100mM三乙醇胺洗脱5分钟，其后用0.5M Tris/Cl(pH 7.2)中和洗脱液。用大肠杆菌TG1感染经洗脱的噬菌体中和液体。
通过实验选择的单个克隆在96孔格式的添加有羧苄青霉素和安比西林的2xYT培养液200μl中生长，其后其培养上清液直接用于ELISA，以选择与涂覆有靶蛋白的平板结合的噬菌体展示的scFv。检测到的抗体的轻链和重链CDR区的氨基酸序列示于表8和9中，且亲和力经优化的抗体的轻链及重链可变区的代表性氨基酸序列示于表10中。
[表8]
重链CDR序列的列表
Figure BDA0002296115610000331
Figure BDA0002296115610000341
Figure BDA0002296115610000351
Figure BDA0002296115610000361
[表9]
Figure BDA0002296115610000362
Figure BDA0002296115610000371
Figure BDA0002296115610000381
Figure BDA0002296115610000391
[表10]
亲和力经优化的抗体的轻链及重链可变区的序列列表
Figure BDA0002296115610000401
此外，通过使用亲和力经优化的抗体的一部分对U-87 MG细胞系进行增殖抑制活性的体外测试，其中其结果示于表11中。
[表11]
hu8C4轻链和重链亲和力经优化的抗体的体外肿瘤细胞增殖抑制活性
Figure BDA0002296115610000402
Figure BDA0002296115610000411
如表11中所见，鉴定出U-87 MG细胞中的hu8C4亲和力经优化抗体的肿瘤细胞增殖抑制活性的IC50为5.0-18nM，其中其功效增加为亲本抗体hu8C4的4.3-9.8倍。以上结果表示了对具有表8至10中所示的氨基酸序列的一部分抗体进行的测试，其中亲本hu8C4抗体的亲和力被优化，并且所有抗体均基于抗原亲和力经由选择程序进行选择。因此，预期即使对于亲和力经优化抗体的其余部分以及具有所示重链和轻链可变区CDR的组合的抗体，也可能存在充分相等的效果。
对于额外实验，通过将轻链和重链可变区组合来制备10种亲和力经优化的抗体。轻链和重链序列的特异性组合展示于表12中。
[表12]
亲和力经优化抗体的组合可变区序列的列表
Figure BDA0002296115610000412
随后，通过与以上实施例1中所示的相同的方法，评估肿瘤细胞增殖抑制活性，其中其结果展示于表13和图3中。
[表13]
亲和力经优化抗体的体外肿瘤细胞增殖抑制活性
Figure BDA0002296115610000413
Figure BDA0002296115610000421
如以上表13中所见，鉴定出hu8C4以及具有其亲和力经优化抗体的轻链及重链可变区的组合的10种关键抗体也展示肿瘤细胞增殖抑制活性。特别地，10种抗体的IC50为1.7-5.3nM，且鉴定出它们具有肿瘤细胞增殖抑制效果，其比亲本抗体hu8C4优异9.2-28.5倍。
实施例6.双特异性抗体的制备及体外肿瘤细胞增殖抑制活性
为了制备特异性结合至c-Met及EGFR的双特异性抗体，将已知特异性结合至EGFR的爱必妥及帕妥木单抗scFv片段通过GGGGSGGGGS(SEQ.No.312)连接体分别与本发明的c-Met抗体的重链C端连接。
为了提高scFv的稳定性，重链的第44个残基及轻链的第100个残基经胱氨酸取代(Reiter Y.等人,Biochemistry 33(18):5451-5459(1994))。爱必妥及帕妥木单抗scFv序列、双特异性抗体的重链的氨基酸序列以及双特异性抗体的可变区的组合展示于下表14和15中。
[表14]
用于制备双特异性抗体的EGFR抗体以及双特异性抗体的氨基酸序列列表
Figure BDA0002296115610000422
Figure BDA0002296115610000431
Figure BDA0002296115610000441
Figure BDA0002296115610000451
Figure BDA0002296115610000461
Figure BDA0002296115610000471
[表15]
双特异性抗体的组合可变区序列的列表
Figure BDA0002296115610000481
Figure BDA0002296115610000491
随后，通过与实施例1中所示相同的方法，在U-87 MG肿瘤细胞系中评估连接爱必妥和帕妥木单抗scFv片段的双特异性抗体的体外抗癌功效。
此外，通过使用NCI-H1993、NCI-H292及NCI-H820肺癌细胞系评估肿瘤细胞增殖抑制活性。特别地，关于具有c-Met基因在其中过表达的NCI-H1993(ATCC,#CRL-5909)细胞系、具有EGFR及c-Met在其中正常表达的NCI-H292(ATCC,#CRL-1848)细胞系及具有苏氨酸(T)在EGFR氨基酸第790号中突变为甲硫氨酸(M)的NCI-H820(ATCC,#HTB-181)，通过以下方法进行肿瘤细胞增殖抑制活性。将各细胞系稀释于含有10％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基(Gibco,#A10491)中，其后将所得细胞系以2.0×103分配至96孔板的各孔中，使得所得平板在37℃、5％CO2条件下培养隔夜。随后，平板的各孔用100μl无血清培养基替换，其后所得平板在37℃、5％CO2条件下培养18小时。此后，培养基用100μl含有2％(v/v)FBS或HGF 50ng/ml的RPMI-1640培养基替换，其后将测试抗体以1/10的比率(即，100nM、10nM、1nM、100pM、10pM及1pM)依序稀释，以在100nM的最终浓度下达到0.001nM，使得将所得抗体添加100μl至各孔中。随后，平板在37℃、5％CO2条件下培养5天，其后自其中移除培养基，使得200μl TCA溶液嵌入各孔中以固定细胞。此外，根据常规SRB比色测定方法，将平板的细胞染色，其后在540nm的波长下通过使用酶标仪测量各孔的光密度。
以上各细胞系的增殖抑制活性的结果展示于表16和17以及图4和图5中。
[表16]
双特异性抗体的体外肿瘤细胞增殖抑制活性
Figure BDA0002296115610000501
[表17]
双特异性抗体的体外肺癌细胞系增殖抑制活性
Figure BDA0002296115610000502
结果，在通过该方法由U-87 MG肿瘤细胞系制备的双特异性抗体之间无功效差异，且鉴定出其活性抑制功效比hu8C4经优化抗体的IC50优异约15倍。此外，作为使用NCI-H1993、NCI-H292和NCI-H820肺癌细胞系评估肿瘤细胞增殖抑制活性的结果，鉴定出在所制备的双特异性抗体之间无功效差异。
此类结果表明无论c-Met和EGFR是否过表达或突变，本发明抗体对所有癌症类型均具有增殖抑制效果，因此可有效地用于这些癌症类型中。
实施例7.双特异性抗体与组合疗法相比的体外肿瘤细胞增殖抑制活性的比较评估
使用八种类型的癌症来比较分别靶向c-Met和EGFR的每种抗体的组合疗法与本发明的双特异性抗体之间的肿瘤细胞增殖抑制活性。
特别地，在以下细胞系中评估肿瘤细胞增殖抑制活性：肺癌细胞系NCI-H292(ATCC,#CRL-1848)、HGF自分泌成胶质细胞瘤细胞系U-87 MG(ATCC,#HTB-14)、肺癌细胞系NCI-H1648(ATCC#CRL-5882)及NCI-H596(ATCC#HTB-178)、HCC827(ATCC,#CRL2868)、结肠癌细胞系LS174T(ATCC,#CL-188)、三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系BT20(ATCC,#HTB-19)及胰腺癌细胞系KP4(JCRB,#RCB1005)。NCI-H1648细胞系的特征在于EGFR及c-Met的正常表达，NCI-H596细胞系的特征在于MET基因第14号外显子的一些序列缺失，且HCC827细胞系的特征在于EGFR基因第19号外显子的一些序列缺失。此外，LS174T细胞系具有KRAS突变，且KP4的特征在于自分泌HGF。
U-87 MG细胞系通过实施例1的方法评估，而NCI-H292细胞系通过实施例6的方法评估。此外，将NCI-H1648、NCI-H596和HCC827细胞系稀释于含有10％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基(Gibco,#A10491)中，稀释后将所得细胞系以2.0×103分配于96孔板的各孔中。将LS174T细胞系稀释于含有10％(v/v)FBS的DMEM培养基(Gibco,#11995-065)中，稀释后将所得细胞系以2.0×103分配。将BT20细胞系稀释于含有10％(v/v)FBS的EMEM培养基(ATCC,#30-2003)中，稀释后将所得细胞系以3.0×103分配。并且，将KP4细胞系稀释于含有10％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基(Gibco,#A10491)中，稀释后将所得细胞系以1.5×103分配，使得所得平板在37℃、5％CO2条件下培养隔夜。随后，平板的各孔用100μl无血清培养基替换，其后所得平板在37℃、5％CO2条件下培养18小时。此后，培养基用100μl含有2％(v/v)FBS或HGF 50ng/ml的RPMI-1640培养基替换，其后以1/10的比率(即，100nM、10nM、1nM、100pM、10pM及1pM)依序稀释测试抗体，以在100nM的最终浓度下达到1pM，使得将所得抗体添加100μl至各孔中。随后，将平板在37℃、5％CO2条件下温育5天，其后自其中移除培养基，使得200μl TCA溶液嵌入各孔中以固定细胞。此外，根据常规SRB比色测定方法，将平板的细胞染色，其后在540nm的波长下通过使用酶标仪测量各孔的光密度。
此实施例的结果展示于表18至21及图6至8中。
[表18]
在U-87 MG及NCI-H292细胞系中，组合疗法与双特异性抗体之间的体外肿瘤细胞增殖抑制活性的比较评估
Figure BDA0002296115610000521
[表19]
在NCI-H1648及NCI-H596细胞系中，组合疗法与双特异性抗体之间的体外肿瘤细胞增殖抑制活性的比较评估
Figure BDA0002296115610000522
[表20]
在LS174T、BT20及KP4细胞系中，组合疗法与双特异性抗体之间的体外肿瘤细胞增殖抑制活性的比较评估
Figure BDA0002296115610000531
[表21]
在HCC827及NCI-H596细胞系中，组合疗法与双特异性抗体之间的体外肿瘤细胞增殖抑制活性的比较评估
Figure BDA0002296115610000532
结果，鉴定出在所有8种肿瘤细胞系中，本发明的双特异性抗体的肿瘤细胞增殖抑制能力比hu8C4、帕妥木单抗或两种抗体的组合疗法的肿瘤细胞增殖抑制能力更优异。此外，鉴定出与用作对照双特异性抗体的EM1-MAb(Janssen)相比，在U-87MG、NCI-H292、BT20及KP4细胞系中具有显著优异的肿瘤细胞增殖抑制能力。
此外，当与LA480(Lilly)、OA-5D5(Genentech)及AbF46(Samsung)(其为U-87MG细胞系中的c-Met靶抗体)相比时，鉴定出hu8C4及hu8C4×帕妥木单抗scFv两者与对照抗体相比均具有优异的肿瘤细胞增殖抑制能力。
此外，尽管厄洛替尼(HCC827细胞系中的EGFR酪氨酸激酶抑制剂)在HGF处理条件下显示出抗性，但鉴定出在与厄洛替尼、hu8C4、hu8C4×帕妥木单抗scFv或c-Met抑制剂在此类条件下组合处理时，其显示出优异的肿瘤细胞增殖抑制能力。
此外，作为在NCI-H596细胞系中比较各种EGFR抑制剂及c-Met抑制剂的结果，鉴定出hu8C4×帕妥木单抗scFv的肿瘤细胞增殖抑制能力与EGFR或c-Met单靶标药物相比是优异的。
实施例8.与ECD(BIAcore)的结合力的测量
随后，为了测量本发明的c-Met抗体与细胞外结构域(ECD)的结合力，c-Met抗体和双特异性抗体与c-Met ECD和EGFR ECD的结合通过使用BIAcore在人与食蟹猕猴之间测量。
特别地，使用人c-Met ECD(ACROBiosystems,MET-H5227)、食蟹猕猴c-Met ECD(SiNo.Biological,90304-C08H)、人EGFR ECD链霉素(ACROBiosystems,EGR-H5285)及食蟹猕猴EGFR ECD(SiNo.Biological,90285-C08B)。
首先，为了捕获抗c-Met抗体及双特异性抗体，以10000RU的水平将Fc特异性抗人IgG抗体(SouthernBiotech,2047-01)固定至CM5传感器芯片。将抗体以1-2μg/ml的浓度稀释于HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA及0.005％(v/v)表面活性剂P20)中，其后将所得抗体以30μl/min的流动速率注射到具有固定至其的抗人Ig Fc的CM5芯片中持续10-120秒，且随后在150-200RU的范围内捕获。在以10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125及0.15625nM稀释之后使用各抗原，其后将所得抗原自较低浓度依序注射。随后，将所得抗原以30μl/min的流动速率注射持续5分钟以进行结合，其后将运行缓冲液注入其中持续10-15分钟以进行解离。将15μl的10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)用于复活芯片。通过使用“1:1朗缪尔结合”模型在BIAevaluation软件版本4.1中评估每个循环的结合及解离速度，且biacore数据概述于表22及23中。
[表22]
与c-Met ECD的亲和力的测量
Figure BDA0002296115610000551
[表23]
与EGFR ECD的亲和力的测量
Figure BDA0002296115610000552
使用数据证明了hu8C4、本发明的hu8C4×帕妥木单抗scFv双特异性抗体以优异的亲和力与人及食蟹猕猴的c-Met ECD结合。
实施例9.在各种动物物种之间c-Met抗体对c-Met ECD、EGFR ECD结合能力的测量(ELISA)
通过使用ELISA，在小鼠、食蟹猕猴与人之间测量c-Met抗体及双特异性抗体与c-Met ECD及EGFR ECD的结合。
特别地，小鼠c-Met(SiNo.Biological Inc,50622-M08H)、食蟹猕猴c-Met(SiNo.Biological Inc,90304-C08H)、人c-Met(R&D Systems,358-MT)、小鼠EGFR(SiNo.Biological Inc,51091-M08H)、食蟹猕猴EGFR(SiNo.Biological,90285-C08B)及人EGFR(Abcam,155639)抗原均以2μg/ml的浓度分到96孔板中，其后将所得平板在4℃下反应隔夜。在于室温下封闭1小时之后，将hu8C4×帕妥木单抗scFv双特异性抗体以1/5的比率自100nM依序稀释，以在7个浓度区段(即，100nM、20nM、4nM、800pM、160pM、32pM及6.4pM)中测量其结合能力。
在于室温下结合hu8C4×帕妥木单抗scFv双特异性抗体持续1小时之后，将抗人IgG、F(ab')2片段特异性HRP缀合的抗体(Jackson Immunoresearch,109-035-097)以1:2500的比率稀释，其后将所得抗体在室温下反应1小时。通过使用TMB(Sigma,T4444)溶液进行显色，其中在450nm的光密度下测量其值，且其ELISA结果显示于图9中。
结果，鉴定出hu8C4单特异性抗体及hu8C4×帕妥木单抗scFv双特异性抗体不与小鼠c-Met及小鼠EGFR结合，但与猴及人的c-Met及EGFR结合。此外，鉴定出用作阴性对照组的人IgG抗体完全不结合。以上结果表明本发明的c-Met抗体仅对人及猴的c-Met及EGFR具有特异性。
实施例10.c-Met抗体与细胞表面上的各种受体的交叉反应性
通过间接ELISA方法，分析根据本发明的特异性结合至c-Met的hu8C4抗体的特异性以及其与其他受体酪氨酸激酶抗原的交叉反应性，并且从关键受体酪氨酸激酶中选出5种抗原FGF R3、VEGFR R2、IGF IR、PDGF R及RON以进行分析。
在本实施例中，将人c-Met Fc嵌合体(R&D systems,358-MT_CF)、人FGF R3(IIIc)Fc嵌合体(R&D systems,766-FR)、人IGF-I R(R&D systems,391-GR-050)、人PDGF RβFc嵌合体(R&D systems,385-PR_CF)、人VEGF R2 Fc嵌合体(R&D systems,357-KD_CF)及人MSPR/Ron(R&D systems,1947-MS-050)用作抗原。
将各抗原以1μg/ml的浓度稀释于0.05M碳酸盐-碳酸氢盐(Sigma,C3041)缓冲液中，其后将所得抗原添加至96孔板(Corning,#2592)的各孔中，以使得所得平板在4℃下涂覆隔夜。用TBS-T洗涤平板一次，其后将含有4％脱脂牛奶的TBS-T添加200μl至所得平板的各孔中，以便抑制非特异性结合，使得所得平板在37℃下反应1小时。随后，用TBS-T缓冲液洗涤平板一次，其后将一级抗体自30nM的最高浓度至0.002nM依序稀释于含有2％脱脂牛奶的TBS-T缓冲液中，使得将所得抗体添加100μl至各孔中，从而在37℃下反应2小时。在用TBS-T缓冲液洗涤三次之后，将抗人κ轻链-过氧化物酶(Sigma,A7164)作为二级抗体以1:5000的比率稀释，其后将所得抗体添加100μl至各孔中，从而在37℃下反应1小时。随后，在用TBS-T缓冲液洗涤三次之后，将TMB溶液(Sigma,T4444)添加100μl至各孔中以进行显色反应，其后将2N硫酸铵溶液添加50μl至各孔中以停止反应。基于在450nm波长下的值，通过使用酶标仪测量光密度，且使用570nm的参考波长。抗c-Met抗体与各抗原的结合程度与光密度信号值成比例，其中其结果展示于表24中。
[表24]
抗c-Met抗体hu8C4与各种抗原的结合特异性
Figure BDA0002296115610000571
如表24中所见，本发明的hu8C4抗体优选地与c-Met结合，且鉴定出其确实几乎不与其他抗原FGF R3、VEGFR R2、IGF IR、PDGF R及RON结合。
实施例11.c-Met抗体的体外内化活性和双特异性抗体的c-Met水平抑制活性
鉴定出本发明的c-Met抗体在肿瘤细胞中具有体外内化活性，并且通过能够同时结合至c-Met和EGFR的双特异性抗体具有降低受体水平的效果。
首先，通过正常受体的生理学活性进行抗体内化，其中，在结合至特异性配体时，在细胞外部正常表达的受体通过同源二聚化或异源二聚化变得活化，并引起受体介导的胞吞作用。对细胞的受体具有特异性的抗体具有诱发此类现象的能力，并通过引起胞吞作用而被内化至细胞中，因此诱发受体的分解，降低其表达程度，且可能抑制通过特定受体的信号转导。在细胞外部结合的抗体的量可通过使用荧光激活细胞分选(FACS)装置检测，由此发现在细胞内部内化的抗体的量。在通过使用具有结合至抗人κLC的FITC的抗体作为待测量抗体轻链的二级抗体来结合抗体的情况下，可以定量测量并未内化但仍与细胞外部的靶受体结合的抗体的量，由此相应地鉴定内化抗体的量。通过使用对抗原非特异的人IgG抗体，通过测试中所用抗体的非特异性结合，可以测量背景信号，从而通过实际的特异性结合测量荧光信号。
在本实施例中，MKN45细胞系(#JCRB0254)(胃癌细胞系)用于鉴定肿瘤细胞内c-Met抗体的体外内化活性。MKN45通过扩增MET基因以高水平表达c-Met受体，使得c-Met受体的磷酸化以HGF非依赖性方式诱发。如下进行测试，以查看c-Met受体是否通过抗c-Met抗体hu8C4被内化至细胞中，由此降低表达水平。
首先，MKN45胃癌细胞系以5.0×105分配至含有RPMI-1640培养基(2ml)的6孔板的各孔中，该培养基含有10％(v/v)FBS，其后将平板在37℃、RH 95％及5％CO2条件下培养24小时。将待分析的抗c-Met抗体以及抗IgG抗体(对照组)稀释，以达到100nM的终浓度，其后将所得抗体反应隔夜。待用作非内化对照组的平板是经抗c-Met抗体和人IgG抗体处理(对照组)，其后将所得平板在4℃下反应1小时。随后，用1ml无酶细胞解离缓冲液(Gibco,#13151)收集各孔的细胞，其后用冷PBS将所收集的细胞洗涤两次。作为二级抗体，抗人κLC-FITC(LSBio#LS-C60539)以1:2000的比率稀释，其后将所得抗体添加至其中，由此在4℃下反应1小时。随后，用PBS洗涤细胞两次，其后将所得细胞用100μl BD Cytofix(BD,#554655)固定并用PBS洗涤一次，从而通过使用BD FACS Canto II薄壁组织细胞分析仪来测量FITC几何平均(MFI)值(荧光染色程度)。在细胞外部结合的抗体的量通过以下公式获得，其中其结果示于表25中。
表面结合的Ab(％)＝[(MFI[37℃exp.]-MFI[IgG对照])/(MFI[4℃对照]-MFI[IgG对照])]×100
[表25]
hu8C4和OA-5D5对照抗体内化至MKN45胃癌细胞系的测量
抗体 OA-5D5 hu8C4
FITC MFI[IgG对照] 127 127
FITC MFI[4℃对照] 1763 1444
FITC MFI[37℃exp.] 1724 858
表面结合的Ab(％) 98 56
如以上表25中所见，在MKN45胃癌细胞系中，OA-5D5(用作对照组的抗c-Met抗体)几乎不内化至细胞中，而本发明的hu8C4抗体内化至细胞中约40％或更高。即，显示了hu8C4抗体显著降低c-Met受体的表达水平。
随后，进行用于测量NCI-H820肺癌细胞系上的受体水平的测试，以便鉴定通过能够同时与c-Met受体和EGFR受体结合的双特异性抗体降低受体水平的效果。NCI-H820细胞系为适用于测量通过抗c-Met×EGFR双特异性抗体降低受体水平的效果的细胞系，原因在于c-Met受体以约83,000SABC(特异性抗体结合能力)的水平表达，且EGFR受体以约74,000SABC的水平表达。
首先，NCI-H820细胞系以1.0×105分配至具有RPMI-1640培养基(2ml)的6孔版板的各孔中，该培养基含有10％(v/v)FBS，其后将所得平板在37℃、RH 95％及5％CO2条件下培养24小时。随后，将其用无血清培养基替换，其后将所得平板在37℃、RH 95％及5％CO2条件下培养24小时。随后，将待分析的抗c-Met抗体、抗c-Met×EGFR双特异性抗体、抗EGFR抗体及作为对照组的人IgG抗体在含有2％FBS的培养基中稀释及处理，以达到10nM的终浓度，其后将所得抗体培养5天。此后，用1ml无酶细胞解离缓冲液收集各孔的细胞，其后用冷PBS洗涤所收集的细胞两次。随后，将山羊F(ab`)2抗小鼠IgG-CSF(R&D Systems Cat.#F0103B)添加10μl至各孔中作为二级抗体，由此在4℃下反应1小时。随后，用PBS洗涤细胞两次，其后将所得细胞用100μl BD Cytofix(BD,#554655)固定并用PBS洗涤一次，从而通过使用BDFACS Canto II薄壁组织细胞分析仪来测量FITC几何平均(MFI)值(荧光染色程度)。
结果，当处理抗c-Met抗体hu8C4时，EGFR受体几乎不降低，但c-Met受体显著降低至2％的水平(图10)。此外，抗EGFR抗体帕妥木单抗将EGFR受体降低至约83％的水平，但c-Met受体几乎不降低。相比之下，在处理同时结合至c-Met及EGFR受体的本发明的hu8C4×帕妥木单抗双特异性抗体的情况下，分别鉴定出EGFR受体降低至约21％的水平，且c-Met受体降低至约4％的水平。
因此，鉴定出本发明的hu8C4×帕妥木单抗双特异性抗体同时显著地降低c-Met和EGFR受体的表达水平。
实施例12.双特异性抗体的c-Met和EGFR体外信号抑制活性的鉴定
随后，使用NCI-H820细胞系进行实验，以鉴定本发明的双特异性抗体对抗原及信号转导物质的活性的效果。
首先，将NCI-H820细胞系以每孔5×105个细胞的浓度分配至6孔板中，其后将所得平板在37℃、5％CO2条件下培养隔夜，使得其用无血清培养基替换并再次培养隔夜。将抗体稀释并在无血清培养基中以100nM的浓度处理，其后使所得抗体反应24小时，使得在收集细胞之前15分钟将HGF(Gibco,PHG0254)及EGF(R&D Systems,236-EG-200)分别以50ng/ml和10ng/ml的浓度处理。随后，将细胞溶解于溶解缓冲液中以进行细胞收集，其后通过使用劳立测定法(Lowry assay method)将蛋白质浓度定量。将20μg蛋白质加载至各孔上并在SDS-PAGE中电泳，其后在硝化纤维素膜中进行印迹。在封闭膜之后，将所有一级抗体以1:1,000的比率稀释并反应，其后将HRP结合抗兔抗体以1:5,000的比率稀释并作为二级细胞进行反应。随后，吸附至膜上的抗体与增强的化学发光(ECL)反应，其后所得抗体通过使用LC-3000装置来测量。
结果，如图11中所见，当处理hu8C4×帕妥木单抗scFv双特异性抗体时，EGFR磷酸化、Erk磷酸化及Akt磷酸化比单独处理hu8C4或帕妥木单抗抗体显著降低。
因此，本发明的hu8C4×帕妥木单抗scFv双特异性抗体可降低NCI-H820细胞系中诸如EGFR、Erk、Akt等受体和下游信号转导物质的活性。结果表明，本发明的抗体通过信号转导抑制而显示出功效。
实施例13.U-87 MG异种移植小鼠模型中的肿瘤细胞增殖抑制活性的鉴定
通过使用hu8C4 IgG2×帕妥木单抗scFv代表性地进行实验，以便鉴定本发明的双特异性抗体在HGF依赖性U-87 MG细胞异种移植模型中的肿瘤细胞增殖抑制活性。
首先，通过使用含有L-谷氨酰胺(300mg/l)、25mM HEPES、25mM NaHCO3、10％热灭活FBS等的EMEM(
Figure BDA0002296115610000612
30-2003TM)培养基，将人成胶质细胞瘤U-87 MG细胞系在37℃、5％CO2条件下培养。随后，将U-87 MG细胞以每小鼠1×107个细胞的浓度皮下接种200μl至6至8周龄雄性无胸腺裸鼠(Harlan)的侧腹中。在鉴定出在接种后25天内形成的肿瘤体积达到60-130mm3之后，进行分组，其后将测试材料腹膜内施用一周一次，持续4周(总共5次：0、7、14、21及28天)。测试材料以5mg/kg施用，且肿瘤体积及小鼠重量一周测量两次。对于数据，赋形剂对照组与测试材料施用组之间的比较通常通过使用学生t检验来验证，且所用的统计方法为Origin Pro 8.5程序。“最大抑制％”指与溶剂处理对照组相比，肿瘤生长的抑制％。
结果，与溶剂对照组相比，用3.5mg/kg及6.8mg/kg的hu8C4 IgG2×帕妥木单抗scFv施用的组具有对肿瘤体积的最大抑制96％，且用其1.5mg/kg施用的组具有最大抑制80％，因此自施用后第7天直至测试最后一天，将肿瘤体积降低至显著水平(p<0.01)(图12)。此外，当与作为阳性对照组的BsAB-01相比时，本发明的双特异性抗体将肿瘤生长降低至显著水平(p<0.01)。
因此，从以上结果鉴定出本发明的双特异性抗体显著降低肿瘤生长，因此具有优异的抗肿瘤功效。
实施例14.NCI-H820异种移植小鼠模型中的肿瘤细胞增殖抑制活性的鉴定
NCI-H820细胞系(具有突变为甲硫氨酸(M)的EGFR氨基酸第790号的苏胺酸(T)且具有MET基因扩增的细胞系)已知为AZD9291(奥希替尼，泰瑞沙)(其为第三代EGFR TKI)的抗性细胞系(Darren A.E.Cross,等人,Cancer Discov.4(9):1046-1061(2014))。通过代表性地使用出自本发明的双特异性抗体的hu8C4×帕妥木单抗scFv，在NCI-H820异种移植小鼠模型中进行评估，以便查看在对此类EGFR TKI具有抗性的NCI-H820细胞系中，双特异性抗体的肿瘤细胞增殖抑制活性。
特别地，用于此实施例中的小鼠为6周龄雄性小鼠(Jackson Laboratory，STOCKHgftm1.1(HGF)Aveo Prkdcscid/J)，其中从中移除小鼠HGF基因并转化，以表达人HGF基因。将NCI-H820(ATCC,#HTB-181)细胞系嵌入烧瓶中，用于与含有10％FBS的RPMI1640培养基一起进行细胞培养，其后将所得烧瓶在37℃、5％CO2条件下培养。随后，用PBS洗涤所得细胞，并将2.5％胰蛋白酶-EDTA(Gibco,15090)稀释10倍，其后将其添加入其中，以分离细胞。此后，进行离心(1,000rpm，5min)以除去上清液，并在新培养基中得到细胞悬浮液。随后，通过显微镜鉴定细胞存活率，其后将所得细胞在无血清培养基中以5.0×107个细胞/毫升的浓度稀释，从而制备细胞系。将所制备的细胞系以0.1毫升/头的量皮下施用至小鼠中。施用之后，当具有移植至其中的细胞系的区域中的肿瘤尺寸达到约100-150mm3时，分配细胞系，以使得各组的肿瘤尺寸可根据排名的肿瘤尺寸而均匀地分散。随后，自开始细胞施用后第7天直至分组之日后第28天(开始施用测试材料之日)和停止施用测试材料之后，一周两次鉴定瘤发生，其后通过测径器测量肿瘤的长轴及短轴，从而计算肿瘤尺寸(ab2/2(a：长轴长度，b：短轴长度))。通过Prism 5.03(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)进行统计分析。若p值小于0.05，则将其判定为统计学上显著的。
结果，从开始施用测试材料后第4天直至第28天，在用hu8C4×帕妥木单抗scFv施用的所有组中，显示肿瘤增殖抑制活性显著高于溶剂对照组(p<0.001)，且还鉴定出肿瘤抑制比率共计为最大100％(图13)。在另一方面，用作阳性对照组的AZD9291(Selleckchem)未显示与溶剂对照组的显著差异。
实施例15.通过5G3 c-Met抗体与HER2抗体的组合施用，鉴定体外肿瘤细胞增殖抑制活性
通过NCI-H2170细胞系进行细胞增殖抑制活性的体外测试，以便根据本发明的抗c-Met抗体5G3与抗HER2抗体的组合评估肿瘤细胞增殖抑制活性。NCI-H2170细胞系(ATCC#CRL-5928)是非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤细胞系，其中，作为测量其受体水平的结果，EGFR以约2,700特异性抗体结合能力(SABC)的水平表达，而c-Met以约11,000SABC的水平表达。
特别地，将NCI-H2170细胞稀释于含有10％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基中，其后将所得细胞以每孔3.0×103个细胞的浓度添加100μl至平板中，以使得所得平板在37℃、95％RH及5％(v/v)CO2条件下培养18-24小时。随后，将各孔的细胞培养基自其中移除，其后将含有2％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基添加100μl至各孔中。此后，在2×终浓度(100nM)下制备的抗体以1/10的比率连续稀释，以使得将所得抗体以每种抗体六个浓度(即，200nM、20nM、2nM、200pM、20pM及2pM)添加100μl至各孔中。将平板在37℃、95％RH及5％(v/v)CO2条件下培养5天，其后在最后一天将20μl WST-8溶液(CCK-8,Dojindo)添加至各孔中以进行显色持续1-2小时，从而在450nm的波长下，通过酶标仪测量光密度。
细胞增殖抑制活性的结果展示于表26及图14中。
[表26]
抗c-Met抗体及抗HER2抗体的组合疗法的体外肿瘤细胞增殖抑制活性
Figure BDA0002296115610000631
如表26中所见，鉴定出在NCI-H2170肿瘤细胞系中，5G3抗体与作为抗HER2抗体的A091抗体的组合治疗(韩国专利注册号10-1515535)比每种抗体的单一治疗具有更优异的肿瘤细胞增殖抑制能力。
实施例16在作为人肺癌细胞系的NCI-H2170异种移植小鼠模型中，5G3 c-Met抗体及HER2抗体的组合施用的体内肿瘤细胞增殖抑制活性的鉴定
在作为肺癌细胞系的NCI-H2170异种移植小鼠模型上进行抗癌活性实验，以便查看HER2抗体及c-Met抗体的组合功效。
特别地，在本实施例中，通过与实施例14中所示相同的方法，通过使用与以上实施例13中所示相同的小鼠来测量小鼠的肿瘤尺寸。在作为肺肿瘤细胞的NCI-H2170异种移植小鼠模型中，A091及5G3组合的抗肿瘤功效的评估结果展示于图15中。
结果，在进行仅A091的单次施用或A091与5G3的组合施用的情况下，自施用后第14天，肿瘤体积与溶剂对照组相比降低至显著水平(p<0.05)。此外，与仅用A091施用的组或用BsAB02(US2010/0254988A1)作为对照双特异性抗体施用的组相比，用A091与5G3的组合施用的组显示肿瘤体积的显著降低(p<0.01)。
实施例17.在NCI-H596异种移植小鼠模型中，肿瘤细胞增殖抑制活性的鉴定
由于NCI-H596细胞系为在c-Met的外显子14中具有突变的肺癌细胞系，因此对NCI-H596异种移植小鼠模型进行评估，以便鉴定hu8C4×帕妥木单抗scFv的抗癌效果。
在本实施例中，小鼠的肿瘤尺寸通过使用与以上实施例14中所示相同的小鼠及相同的方法来测量。
在作为肺肿瘤细胞的NCI-H596异种移植模型中，施用hu8C4×帕妥木单抗scFv一周一次或两次持续4周之后的抗癌功效的评估结果展示于图16中。
作为测量肿瘤尺寸的结果，自开始施用测试材料后第11天直至实验结束，用hu8C4×帕妥木单抗scFv 10mg/kg施用一周两次的组中的肿瘤尺寸水平与对照组相比显示统计学上显著的差异，且自开始施用测试材料后第18天，用hu8C4×帕妥木单抗scFv 5mg/kg施用一周两次的组和用hu8C4×帕妥木单抗scFv 10mg/kg施用一周一次的组中的肿瘤尺寸水平与对照组相比也明显较低。此外，用测试材料施用的组中的肿瘤尺寸水平倾向于根据测试材料剂量以剂量相关方式变化，且即使在施用测试材料的最后一天(第28天)之后，测试组的肿瘤尺寸与对照组相比也较低。
实施例18.EBC-1异种移植小鼠模型中，肿瘤细胞增殖抑制活性的鉴定
由于EBC-1为具有c-Met基因扩增的肺癌细胞系，因此对EBC-1异种移植小鼠模型进行评估，以便鉴定hu8C4×帕妥木单抗scFv的抗癌效果。
用于此实施例中的小鼠为六周龄雌性无胸腺裸鼠(Harlan)。将EBC-1(JCRB,#JCRB0820)细胞系嵌入烧瓶中，用于与含有10％FBS的EMEM培养基一起进行细胞培养，其后所得细胞系在37℃、5％CO2条件下培养。以将所得细胞系以5.0×107个细胞/毫升的浓度在无血清培养基中稀释的方式制备细胞系，其后将细胞系以0.1毫升/头的量皮下施用至小鼠中。当具有移植至其中的细胞系的区域中的肿瘤尺寸达至约100-150mm3时，施用hu8C4×帕妥木单抗scFv一周一次或两次持续4周，其后小鼠的肿瘤尺寸通过与实施例14中所示相同的方法来测量。
在作为肺癌细胞的EBC-1异种移植模型中，hu8C4×帕妥木单抗scFv的抗癌功效的评估结果展示于图17中。
作为测量肿瘤尺寸的结果，自开始施用测试材料后第7天直至开始施用测试材料后第56天，与对照组相比，用hu8C4×帕妥木单抗scFv 10mg/kg施用一周两次的组的肿瘤尺寸水平显示统计学上显著的差异。自开始施用测试材料后第18天，与对照组相比，用hu8C4×帕妥木单抗scFv 5mg/kg施用一周两次的组及用其施用一周一次的组显示显著较低的水平。此外，用测试材料施用的组中的肿瘤尺寸水平倾向于根据测试材料剂量以剂量相关方式变化，且在施用测试材料最后一天(第28天)之后，在观察期期间，用hu8C4×帕妥木单抗scFv 10mg/kg施用一周两次的组中的肿瘤尺寸水平与对照组相比显著低，直至开始施用测试材料后第56天。特别地，发现了在开始施用测试材料后第18天，用hu8C4×帕妥木单抗scFv 10mg/kg施用一周两次的组中的个体具有完全反应。
实施例19.通过双特异性抗体减少癌细胞表面上的c-Met及EGFR的效果
鉴定了通过本发明的双特异性抗体(hu8C4×帕妥木单抗scFv)减少体外肿瘤细胞表面上的c-Met及EGFR的效果，并将其与本发明的c-Met抗体(hu8C4)、帕妥木单抗、c-Met/EGFR组合和其他抗体的效果进行比较。
通常位于细胞膜上的受体在与抗体结合时内化至细胞中，因此其位于细胞膜上的量减少。此类细胞膜上的受体的减少造成受体活化的抑制及其下游信号通过配体结合的减弱。
在此实施例中，使用肺腺癌细胞系HCC827观察细胞膜上c-Met及EGFR的减少。HCC827具有EGFR E746-A750缺失突变并且过表达c-Met。HCC827用本发明的双特异性抗体(hu8C4×帕妥木单抗scFv)及其他抗体处理，其后通过对c-Met及EGFR特异性的抗体进行免疫荧光染色，以使得用荧光激活细胞分选仪分析所得细胞系，从而测量细胞表面上的c-Met及EGFR的量。详细方法如下。
首先，将HCC827细胞(
Figure BDA0002296115610000661
CRL-2868TM)以3.0×105分配至含有RPMI-1640培养基(2ml)的6孔板的各孔中，该培养基含有10％(v/v)FBS，其后将平板在37℃、RH 95％及5％CO2条件下培养24小时。将本发明的双特异性抗体(hu8C4×帕妥木单抗scFv)、本发明的c-Met抗体(hu8C4)、帕妥木单抗、本发明的c-Met抗体(hu8C4)与帕妥木单抗的混合物、C-EM1及LA480稀释，以达到100nM的最终浓度，其后将所得抗体处理且反应18小时。作为待用作具有c-Met及EGFR的非降低对照组的平板，将人IgG抗体处理并反应18小时。随后，通过500μl无酶细胞解离缓冲液(Gibco,#13151)收集各孔的细胞，其后通过离心分离器将细胞与无酶细胞解离缓冲液分离，以使得自其中移除无酶细胞解离缓冲液。对于免疫荧光染色，山羊衍生的c-Met抗体(R&D systems,AF276)、山羊衍生的EGFR抗体(R&D systems,AF231)或用于测量染色量的山羊衍生的非特异性抗体分别以2μg与200μl含有2％(v/v)FBS的冷PBS混合，其后将所得抗体处理至各孔中，以使得所得平板在4℃下反应1小时。随后，将所得平板用含有2％(v/v)FBS的冷PBS洗涤两次。结合ALEXA488作为二级抗体，其后将与山羊抗体结合的1μl驴衍生的抗体(Thermo Fisher,A-11055)用200μl含有2％(v/v)FBS的冷PBS稀释，以使用所得抗体。在与二级抗体在4℃下反应1小时之后，将所得细胞用含有2％(v/v)FBS的冷PBS洗涤两次，其后通过使用200μl BD Cytofix(BD,#554655)固定所得细胞。在用PBS洗涤一次之后，通过使用BD FACS Canto II荧光激活细胞分选仪来测量ALEXA488几何平均(MFI)值(荧光染色程度)。位于细胞膜上的c-Met及EGFR的量通过以下公式表示为几何平均荧光强度(MFI)。关于反复进行测试三次之后所获得的值，其平均值及标准偏差展示于表27及图18及19中。
c-Met或EGFR表面量＝几何MFI[实验组]-几何MFI[山羊衍生的非特异性抗体]
[表27]
在用双特异性抗体(hu8C4×帕妥木单抗scFv)等处理HCC827细胞系之后，所测量的细胞表面上的c-Met及EGFR的量
Figure BDA0002296115610000671
如以上表27中所见，与c-Met结合的所有抗体均使细胞表面上的c-Met减少40～70％，而与EGFR结合的抗体显示了减少10-15％的不显著效果。进一步考虑到减少c-Met的效果，hu8C4、hu8C4+帕妥木单抗的组合、C-EM1及C-LA480使细胞表面上的c-Met减少约40％左右，而hu8C4×帕妥木单抗scFv使细胞表面上的c-Met减少70％，由此显示比其他抗体及抗体组合更优异的减少细胞表面上的c-Met的效果。
以上结果展示本发明的双特异性抗体(hu8C4×帕妥木单抗scFv)显著减少细胞表面上的c-Met的量。
实施例20.表位作图
为了找出本发明的双特异性抗体(hu8C4×帕妥木单抗scFv)在人c-Met抗原上的表位，将其分析委托给五松医疗创新基金会(Osong Medical Innovation Foundation)(KBIO，韩国)的分子模型设计支持小组。该分析通过氢-氘交换质谱法(HDX-MS)进行。
c-Met sema结构域由两条α/β链组成，由此鉴定出两条链各自的覆盖度。由于样本中存在多个二硫键，通过调整淬灭保持时间、TCEP浓度、胃蛋白酶浓度等来优化肽覆盖度。最终，在100mM K.磷酸盐、125mM TCEP、0.5M胍-HCl及pH 2.66的淬灭缓冲液条件下进行实验。
分别以3.3mg/ml及65mg/ml的浓度制备抗原及抗体，且将37pmol cMET抗原及36pmol抗体在实验前3小时结合。氘标记缓冲液反应0、0.33、10、60及240分钟。根据各标记时间，用淬灭缓冲液停止标记，并进行涡旋，其后将它们立即冷冻于液氮中，从而在分析之前储存在-80℃下。将所得抗原及抗体加载到胃蛋白酶柱上并用质谱仪(MS)分析。
作为分析结果，鉴定出本发明的双特异性抗体(hu8C4×帕妥木单抗scFv)结合至人c-Met sema结构域β链的4个区Y321-L329(SEQ.No.331)、I333-I341(SEQ.No.332)、P366-D372(SEQ.No.333)及Q464-S474(SEQ.No.334)中的3维形式的表位(表28)。通过使用PyMOL程序在人c-Met抗原(PDB编号4K3J)的三级结构上进行标记，其中其结果展示于图20中。
[表28]
表位区的氨基酸序列
表位区 氨基酸序列 SEQ ID NO
Y321～L329 YVSKPGAQL 331
I333～I341 IGASLNDDI 332
P366～D372 PIKYVND 333
Q464～S474 QVVVSRSGPST 334
由以上结果可看出，特异性结合至c-Met的小鼠抗体、人源化抗体、本发明的亲和力经优化的抗体或其抗原结合片段选择性地作用于c-Met，其中它们甚至以其极少量展示了优异的癌细胞增殖抑制活性以及显著优异的抗癌活性，由此有效地预防或治疗癌症。
当本发明的特定部分已在上文详细地描述时，本领域技术人员显而易见的是，阐述此类详细描述仅为说明示例性实施方案，但并不解释为限制本发明之范围。因此，应理解，本发明的实质范围由所附的权利要求及其等同物限定。
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Claims (22)

1.特异性地结合至肝细胞生长因子受体c-Met的抗体及其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
(a)包含以下的抗体：轻链可变区，其包含由SEQ ID NO:1表示的轻链CDR1、由SEQ IDNO:2表示的轻链CDR2、由SEQ ID NO:3表示的轻链CDR3；和重链可变区，其包含由SEQ IDNO:7表示的重链CDR1、由SEQ ID NO:8表示的重链CDR2和由SEQ ID NO:9表示的重链CDR3；
(b)其亲和力经优化的抗体，其中所述亲和力经优化的抗体包含：
(i)由SEQ ID NO:21表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:302表示的重链可变区；
(ii)由SEQ ID NO:21表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:305表示的重链可变区；
(iii)由SEQ ID NO:310表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:23表示的重链可变区；
(iv)由SEQ ID NO:308表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:305表示的重链可变区；
(v)由SEQ ID NO:306表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:303表示的重链可变区；
(vi)由SEQ ID NO:307表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:304表示的重链可变区；
(vii)由SEQ ID NO:308表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:304表示的重链可变区；
(viii)由SEQ ID NO:309表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:304表示的重链可变区；
(ix)由SEQ ID NO:311表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:304表示的重链可变区；或
(x)由SEQ ID NO:306表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:302表示的重链可变区。
2.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：(a)由SEQ ID NO:13表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:15表示的重链可变区。
3.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
(a)由SEQ ID NO:21表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:23表示的重链可变区；
(b)由SEQ ID NO:22表示的轻链可变区和由SEQ ID NO:24表示的重链可变区。
4.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由SEQ ID NO:37至SEQID NO:44中的任一表示的铰链区。
5.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体进一步特异性结合至表皮生长因子受体EGFR。
6.根据权利要求5的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为以下的抗体：结合至EGFR的抗体或其抗原结合片段与c-Met特异性抗体的一个轻链或重链端连接。
7.根据权利要求5的抗体或其抗原结合片段，其中结合至EGFR的所述抗原结合片段为Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
8.根据权利要求7的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fv为选自由以下组成的组的一或多个scFv片段：爱必妥、帕妥木单抗、耐昔妥珠单抗和TheraCIM。
9.根据权利要求8的抗体或其抗原结合片段，其中所述爱必妥scFv包含由SEQ ID NO:313或SEQ ID NO:314表示的氨基酸序列。
10.根据权利要求8的抗体或其抗原结合片段，其中所述帕妥木单抗scFv包含由SEQ IDNO:315表示的氨基酸序列。
11.根据权利要求6的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段通过由SEQ ID NO:312表示的连接体连接。
12.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
13.核酸分子，其编码权利要求1至12中任一项的抗体或其抗原结合片段。
14.表达载体，其包含权利要求13的核酸分子。
15.用于检测c-Met的组合物，其包含权利要求1至12中任一项的抗体或其抗原结合片段。
16.用于检测c-Met的试剂盒，其包含权利要求15的用于检测c-Met的组合物。
17.使用权利要求1至12中任一项的抗体或其抗原结合片段检测c-Met抗原的非诊断方法。
18.用于预防或治疗癌症的组合物，其包含权利要求1至12中任一项的抗体或抗原结合片段。
19.如权利要求18的用于预防或治疗癌症的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与c-Met结合以抑制受体活性。
20.根据权利要求19的用于预防或治疗癌症的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步与EGFR结合以抑制所述受体活性。
21.根据权利要求18的用于预防或治疗癌症的组合物，其中所述癌症是通过c-Met过表达、扩增、突变或活化所导致。
22.根据权利要求18的用于预防或治疗癌症的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、三阴性乳癌TNBC、成胶质细胞瘤、胰腺癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、脑癌、子宫癌、子宫内膜瘤、甲状腺癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤及肾上腺皮质癌。
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