BR112019025070A2 - inovador anticorpo anti-c-met e utilização do mesmo - Google Patents

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Abstract

INOVADOR ANTICORPO ANTI-c-MET e UTILIZAÇÃO DO MESMO. A presente invenção refere-se a um novo anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a um receptor de fator de crescimento de hepatócitos humanos (c-Met) e a uma composição para prevenção ou tratamento de câncer, em que o anticorpo mostra uma excelente atividade inibidora da proliferação de células cancerígenas e uma atividade anticâncer notavelmente excelente, mesmo que em pequena quantidade, prevenindo ou tratando o câncer de maneira eficaz.

Description

“INOVADOR ANTICORPO ANTI-c-MET e UTILIZAÇÃO DO MESMO”
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001]A presente invenção refere-se a um anticorpo ou a um antígeno unindo- se a um fragmento do mesmo, especificamente a um receptor do fator de crescimento do hepatócito humano (c-Met) e a uma composição contendo o mesmo, para prevenção ou tratamento de câncer.
ANTERIORIDADE
[0002]Receptor tirosina quinase (RTK) funciona como um modulador vital em crescimento celular, diferenciação, neovascularização, recuperação de tecidos etc. Além de tais processos fisiológicos gerais, uma expressão anormal de um determinado RTK está associada ao desenvolvimento e a progressão de muitos tipos de câncer. Assim, tal RTK vem sendo considerado um alvo promissor de tratamento para câncer.
[0003]Um receptor do fator de crescimento do hepatócito (HGFR; c-Met), que é um tipo do RTK, é um receptor na superfície de células com relação ao fator de crescimento de hepatócito conhecido como fator de dispersão HGF/SF) (Laird AD et al., Expert. Opin. Investig. Drugs 12: 51-64 (2003)). Sabe-se que uma ativação anormal de c-Met pelo HGF, que é um dos mecanismos oncogênicos representativos, está associada à proliferação de tumores, inibição de apoptose, neovascularização, invasão, metástase e similares (Bottaro DP et al., Science 251: 802-804 (1991), Day RM et al., Oncogene 18: 3399-3406 (1999)). Ainda, relata-se que a ativação anormal de c-Met por amplificação ou mutação de c-Met está associada com diversos cânceres, tais como câncer de pulmão, câncer de colo, câncer de pescoço e cabeça, câncer de estômago, câncer de mama etc. e também está envolvida no aumento da agressividade do tumor e seu prognóstico desfavorável (Lefebvre J et al., FASEB J 26: 1387-1399 (2012), Liu X et al., Trends Mol Med 16: 37-45 (2010), Smolen GA et al., Proc Natl Acad Sci USA 103: 2316-2321 (2006), Foveau B et al., Mol Biol Cell 20: 2495-2507 (2009)).
[0004]Sendo assim, c-Met vem chamando muita atenção como um antígeno alvo para tratar diversos tipos de cânceres e diversas abordagens foram tentadas para inibir a expressão e a atividade de c-Met. Conhecidos até agora, como inibidores de tirosina quinase de pequenas moléculas especificamente de c-Met, existem Tivantinib (ArQule), INC280 (Novatis), AMG337 (Amgen) etc. E como anticorpos monoclonais especificamente de HGF, que são ligantes de c-Met, temos: Rilotumumab (Amgen), Ficlatuzumab (AVEP Pharmaceuticals), HuL2G7 (Galaxy Biotech). Adicionalmente, como anticorpo monoclonal antagonista que tem como alvo c-Met, existem Onartuzumab (WO 2006/015371) na fase clínica Ill de desenvolvimento por Genentech, Emibetuzumab (WO 2010/059654) na fase clínica Il por Lilly, SAIT-301 (US 2014154251) na fase clínica | de desenvolvimento, ABT-700 (Wang J et al., BMC Cancer. 16: 105-118(2016)) etc. Onartuzumab é um anticorpo antagonista monovalente derivado de um anticorpo monoclional bivalente (5D5), o qual atua sobre c-Met como agente (Mark Merchant, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 110(32): E2987-E299 (2013)). Como tais, diversas drogas foram desenvolvidas com relação a c-Met, mas c-Met está associado à ocorrência e à progressão de diversos cânceres conforme descrito acima, assim há uma demanda por um novo agente terapêutico capaz de tratar câncer por ter como alvo c-Met. Relato da invenção Problema técnico
[0005]Os presentes inventores desenvolveram um inovador anticorpo anti-c- Met ligado a um c-Met com alta afinidade e também identificaram que tal anticorpo anti-c-Met, uma quimera do mesmo e anticorpos humanizados e otimizados em afinidade inibem fortemente a proliferação de células tumorais e têm excelente efeito anti-câncer, tendo assim completado a presente invenção. Solução do Problema
[0006]Um propósito da presente invenção é prover um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente se liga a um receptor de fator de crescimento de hepatócitos (c-Met).
[0007]Outro propósito da presente invenção é prover uma molécula de ácido nucléico que codifica o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo, um vetor de expressão que compreenda a molécula de ácido nucléico, uma célula hospedeira que possua o vetor de expressão aqui apresentado, um método para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo utilizando a célula hospedeira. [0OO8]Ainda um outro propósito da presente invenção é prover uma composição para detectar c-Met que compreenda o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, um kit para detecção que compreenda o mesmo e um método para detectar o antígeno de c-Met utilizando o mesmo.
[0009]Um outro propósito ainda da presente invenção é prover uma composição para prevenir ou tratar câncer, que compreenda o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Efeitos Vantajosos da Invenção
[00010]O anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da presente invenção que especificamente se une a um receptor de fator de crescimento de hepatócitos (c-Met), possui uma sequência inovadora e apresenta uma excelente atividade inibitória de proliferação de células cancerosas e uma notadamente excelente atividade anti-câncer mesmo com uma pequena quantidade do mesmo, assim efetivamente impedindo ou tratando uma doença como câncer.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 mostra resultados de teste in vitro sobre atividade inibitória de proliferação de células cancerosas do anticorpo c-Met hibridoma da presente invenção. A FIG. 2 mostra um diagrama esquemático de um vetor para expressar um transcriptoma para mostrador scFv.
A FIG. 3 mostra resultados da análise da atividade inibitória de proliferação de células tumorosas por anticorpos otimizados em atividade de hu8C4 da presente invenção. AFIG.4 mostra resultados da análise da atividade inibitória de proliferação de células tumorosas por anticorpos biespecíficos da presente invenção. A FIG. 5 mostra resultados da análise da atividade inibitória de proliferação de células tumorosas por anticorpos biespecíficos da presente invenção. A FIG. 6 mostra resultados da comparação da atividade inibitória de proliferação de células tumorosas entre os anticorpos biespecíficos da presente invenção e uma terapia combinada em linhagens de células U-87 MG (glioblatoma), NCI-H292 (NSCLC), NCI-H1648 (NSCLC) e NCI-H596 (NSCLC). A FIG. 7 mostra resultados da comparação da atividade inibitória de proliferação de células tumorosas entre os anticorpos biespecíficos da presente invenção e uma terapia combinada em linhagens de células LS174T (cólon), BT20 (TNBC) e KP4 (pancreáticas). A FIG. 8 mostra resultados da comparação da atividade inibitória de proliferação de células tumorosas entre os anticorpos biespecíficos da presente invenção e uma terapia combinada em linhagens de células HCC827 (NSCLC) e NCI-H596 (NSCLC). A FIG. 9 mostra resultados da medição da capacidade de ligação do anticorpo anti-c-Met e do anticorpo biespecífico da presente invenção com relação a diversos tipos de antígenos de c-Met e EGFR pelo método ELISA. A FIG. 10 mostra resultados da medição do efeito de diminuir o nível receptor pelo anticorpo biespecífico da presente invenção em uma linhagem de célula NCI-H820 (NSCLC).
[00011]A FIG. 11 mostra resultados da medição da inibição de fosforilação de c-Met e EGFR pelo anticorpo anti-c-Met e pelo anticorpo biespecífico da presente invenção em uma linhagem de célula (NSCLC).
A FIG. 12 mostra resultados da medição do efeito anti-câncer do anticorpo biespecífico da presente invenção em modelo de xenoenxerto de célula U-87 MG (glioblastoma).
A FIG. 13 mostra resultados da medição do efeito anti-câncer do anticorpo biespecífico da presente invenção em modelo de xenoenxerto de célula NCI- H820 (NSCLC).
A FIG. 14 mostra resultados da análise da atividade de proliferação de células tumorosas tratando-se o anticorpo anti-c-Met da presente invenção e o anticorpo anti-HER2 por meio de uma terapia combinada em uma linhagem de célula NCI-H2170 (NSCLC).
[00012]A FIG. 15 mostra resultados da medição do efeito anti-câncer de uma terapia combinada com o anticorpo anti-c-Met da presente invenção e o anti- HER2 em um modelo de xenoenxerto de célula NCI-H2170 (NSCLC).
A FIG. 16 mostra resultados da medição do efeito anti-câncer do anticorpo biespecífico da presente invenção em um modelo de xenoenxerto t de célula NCI-H596 (NSCLC).
A FIG. 17 mostra resultados da medição do anticorpo biespecífico da presente invenção em um modelo de xenoenxerto de célula EBC-1 (NSCLC).
A FIG. 18 mostra resultados da indicação de uma quantidade de c-Met sobre a superfície de células, medida após tratar-se uma linhagem de célula HCC827 com um anticorpo biespecífico (hu8C4 x Vectibix scFv) etc.
A FIG. 19 18 mostra resultados da indicação de uma quantidade de EGFR sobre a superfície de células, medida após tratar-se uma linhagem de célula HCC827 com um anticorpo biespecífico (hu8C4 x Vectibix scFv) etc.
A FIG. 20 mostra resultados da indicação de um epítopo de um anticorpo biespecífico, analisado por uma espectrometria de massa de troca hidrogênio Ideutério (HDX-MS), em uma estrutura terciária.
[00013]Doravante, a presente invenção será descrita com mais detalhes conforme segue. Cada descrição e configuração aqui revelada pode ser aplicada também respectivamente a outras descrições e configurações. Ou seja, todas as combinações dos diversos elementos revelados na presente invenção estão contidas no escopo da presente invenção. Adicionalmente, o escopo da presente invenção não deve ser restringido pela descrição detalhada abaixo.
[00014]Para alcançar os propósitos acima, um aspecto da presente invenção provê um anticorpo ou um fragmento de ligação de um antígeno do mesmo que especificamente se une a um receptor do fator de crescimento de hepatócitos (c-Met).
[00015]O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo da presente invenção, especificamente unindo-se ao c-Met, une-se ao c-Met com alta afinidade de modo a inibir a expressão ou atividade do mesmo, assim apresentando excelente atividade inibitória de proliferação de células tumorais, de modo tal que o próprio anticorpo sozinho ou com quaisquer transportadores farmaceuticamente aceitáveis, outras drogas anti-câncer, adjuvantes anti-câncer etc. pode valiosamente ser usado como uma composição anti-câncer para prevenir ou tratar câncer.
[00016]Na presente invenção, o termo “anticorpo” significa uma molécula de proteína que serve como receptor para especificamente reconhecer um antígeno, compreendendo uma molécula de imunoglobulina que tem reatividade com um determinado antígeno, sendo que exemplos destes podem compreender um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo de comprimento total e fragmentos de anticorpo. Ainda, o termo pode compreender uma molécula bivalente ou biespecífica (por ex.um anticorpo biespecífico), um diabody, um triabody or um tetrabody.
[00017]Na presente invenção, o termo “anticorpo monoclonal” refere-se a uma molécula de anticorpo de composição de uma só molécula obtida a partir substancialmente da mesma população de anticorpos, sendo que tal anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade de ligação única e afinidade a um determinado epítopo. Na presente invenção, o termo “anticorpo de comprimento total” possui uma estrutura com duas cadeias leves de comprimento total e duas cadeias pesadas de comprimento total, onde cada uma das cadeias leves está ligada a uma cadeia pesada por uma ponte dissulfeto. Uma região constante da cadeia pesada possui tipos gamma (y), mu (yu), alpha (a), delta (5) e epsilon (e), e também possui como subclasse gamma1 (y1), gamma2 (y2), gamma3 (y3), gammaa4 (y4), alpha1 (a1) e alpbha2 (a2). Uma região constante da cadeia leve possui tipos kappa (K) e lambda (A). IgG compreende IgG1, IgG2, IgG3 e I9gG4 como subtipo.
[00018]Na presente invenção, os termos “fragmento”, “fragmento de anticorpo” e fragmento de ligação de antígeno” referem-se a quaisquer fragmentos do anticorpo da presente invenção que possua a função de ligação de antígeno do anticorpo, sendo que tais termos são utilizados de modo intercambiável. Exemplos de fragmentos de ligação de antígeno compreendem Fab, Fab', F(ab') 2, Fv e similares, mas não limitando-se a estes.
[00019]O Fab possui estrutura com região variada de cadeias leves e pesadas, uma região constante de cadeia leve e uma primeira região constante de cadeia pesada (domínio CH1) e também possui um local de ligação de antígeno. Um fragmento de ligação de antígeno de uma molécula de anticorpo ou um fragmento de molécula significa um fragmento que possua função de ligação de antígeno e o Fab' é diferente do Fab pelo fato de o primeiro possuir uma região de dobradiça que tem um ou mais resíduo de cisteína no C-terminal de um domínio de CH1 de cadeia pesada. O anticorpo F(ab') 2 é criado de maneira tal que um resíduo de cisteína de uma região posterior do Fab' forma uma ponte dissulfeto. Fv é um fragmento de anticorpo mínimo que possui apenas uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, sendo que uma tecnologia recombinante para criar fragmentos Fv é revelada nos Pedidos de Publicação de Patente Internacional WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086, WO 88/09344 e similares. Fv dce duas cadeias é formado de maneira tal que uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve são ligadas uma à outra por uma ponte não covalente, enquanto que o Fv de cadeia única é formado de modo tal que uma região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia única estejam geralmente ligadas uma à outra por uma ponte covalente através de um ligador de peptídeo ou diretamente ligados no C-terminal, formando assim uma estrutura como um dimer conforme mostrado no Fv de duas cadeias. Tal fragmento de anticorpo pode ser obtido utilizando-se hidrolase de proteína (por exemplo, Fab pode ser obtido desempenhando-se uma digestão de restrição do anticorpo inteiro por papain e o fragmento F(ab') 2 pode ser obtido desempenhando-se uma digestão do mesmo por pepsina) ou pode ser produzido por uma tecnologia de recombinação genética, mas não se limitando a isso.
[00020]Particularmente, a presente invenção pode prover que o anticorpo especificamente unindo-se ao c-Met é: (a) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo um CDR1 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 1; CDR?2 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 2; CDR3 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo um CDR1 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 7; CDR2 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 8; e um CDR3 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 9; (b)um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo um CDR1 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 4; CDR?2 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 5; CDR3 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 6, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo um CDR1 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 10; um CDR2 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 11; e um CDR3 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 12; ou (c) anticorpos de afinidade otimizada dos mesmos.
[00021]Na presente invenção, o termo “cadeia pesada” pode compreender tanto uma cadeia pesada de comprimento total quanto um fragmento da mesma contendo domínio VH de região variável com uma sequência de aminoácido que possui uma sequência de região variável suficiente para conferir especificidade a um antígeno, bem como três domínios CH1, CH2 e CH3 de região constante. Ainda, na presente invenção, o termo “cadeia leve” pode compreender tanto uma cadeia leve de comprimento total e um fragmento da mesma compreendendo domínio VL de região variável com uma sequência de aminoácido que possui uma sequência de região variável suficiente para conferir especificidade a um antígeno, bem como um domínio CL de região constante.
[00022]Na presente invenção, o anticorpo pode compreender tanto um anticorpo de camundongo produzido a partir de um camundongo e um mutante do mesmo, onde parte da sequência de aminoácido de um anticorpo original é substituído, adicionado e/ou deletado para melhorar a afinidade, imunidade etc. do anticorpo. O mutante pode compreender um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo de afinidade otimizada etc. como exemplo, mas não se limitando a isso. Na presente invenção, o mutante amplamente refere-se a um anticorpo, onde parte de uma sequência de aminoácido CDR de um anticorpo original é modificado (substituído, adicionado ou deletado) na condição de ter o mesmo CDR que o do anticorpo original ou ter como alvo o mesmo epítopo que o do anticorpo original. Tal mutante pode ser apropriadamente ajustado por aqueles com habilidade na matéria para melhorar a afinidade, imunidade e similar de um antígeno dentro do escopo de se manter a capacidade de união para o mesmo epítopo.
[00023]Em outras palavras, o anticorpo ou o antígeno unindo-se a fragmento do mesmo, da presente invenção, pode compreender uma sequência do anticorpo anti-c Met aqui descrito c-Met. em como equivalentes biológicos do mesmo, dentro do escopo de se reconhecer especificamente. Por exemplo, uma mudança adicional pode ser efetuada em uma sequência de aminoácido do anticorpo, a fim de melhorar ainda mais a afinidade de união e/ou outras características biológicas do anticorpo. Tal mudança compreende, por exemplo, a deleção, inserção e/ou substituição de um resíduo de sequência de aminoácido do anticorpo. Tal mutação de aminoácido é baseada na similaridade relativa do substituto da cadeia lateral de aminoácido, por exemplo, hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho etc. Analisando-se o tamanho, formato e tipo do substituto de cadeia lateral de aminoácido, pode ser observado que arginina, lisina e histidina são todos resíduos de carga positiva; alanina, glicina e serina podem possuir tamanho similar; e fenilalanina, triptofano e tirosina podem ter formato similar. Assim, com base em tais considerações, pode ser observado que arginina, lisina e histidina; alanina, glicina e serina; e fenilalanina, triptofano e tirosina are equivalentes funcionais biológicos.
[00024]Na presente invenção, o termo “anticorpo quimérico” é um anticorpo formado de modo que uma região variável de um anticorpo de camundongo é recombinada com uma região constante de um anticorpo humano, o que resulta em uma reação imune melhorada em comparação ao anticorpo de camundongo.
[00025]Na presente invenção, o termo “anticorpo humanizado” significa um anticorpo formado de modo que uma sequência de proteína de um anticorpo derivado de outras espécies que não humanas é modificado para ficar similar ao de um anticorpo mutante naturalmente produzido a partir de humano. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser preparado preparando-se uma região variável humanizada através de uma recombinação de CDR derivada de um camundongo com FR derivado de um anticorpo humano e então recombinando o mesmo com uma região constante de um anticorpo humano preferido. No entanto, um enxerto de CDR simples apenas resulta em baixa afinidade do anticorpo humanizado, então muitos resíduos de aminoácidos FR, os quais considera-se que possivelmente influenciem uma estrutura tridimensional de CDR, podem desenvolver afinidade com aqueles de anticorpo de camundongo, assim alcançando o mesmo nível que a afinidade de um anticorpo de camundongo original.
[00026]Na presente invenção, o termo “anticorpo otimizado em afinidade”, que é um mutante formado de modo que parte da sequência de CDR de um determinado anticorpo é substituído, adicionado ou deletado, significa um anticorpo com uma afinidade de união melhor a um antígeno enquanto se une ao mesmo epítopo que o do determinado anticorpo.
Particularmente, o anticorpo com afinidade otimizada da presente invenção refere-se a um anticorpo de mutante une-se ao mesmo epítopo que o de: (a) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve que compreende um CDR1 representado por SEQ ID NO: 1; um CDR?2 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 2; um CDR3 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia pesada que compreende um CDR1 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 7; um CDR2 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 8; um CDR3 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 9; ou (b) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve que compreende um CDR1 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 4; um CDR?2 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 5; um CDR3 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 6, e uma região variável de cadeia pesada que compreende um CDR1 representado por SEQ ID NO: 10; um CDR?2 de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 11; um CDR3 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 12. Alguém com habilidade na matéria pode preparar o anticorpo de afinidade otimizada fazendo uso de uma tecnologia conhecida com base em determinadas sequências de CDR de cadeia leve e de cadeia pesada.
Por exemplo, o anticorpo com afinidade otimizada da presente invenção pode ser preparado através de um mostrador de fago.
Na presente invenção, o termo “mostrador de fago" refere-se a uma tecnologia, a qual mostra um polipeptídio mutante como uma proteína de fusão com pelo menos uma parte de proteína de cobertura sobre um fago, por exemplo, sobre a superfície de partículas de fago fibrosa.
A utilidade do mostrador de fago reside no fato de que ele tem como alvo uma grande biblioteca de mutantes de proteínas randomizados, assim pronta e eficientemente classificando sequências unindo-se a um antígeno alvo com alta afinidade. Mostrar (dispor) uma biblioteca de peptídeos e proteínas no fago é usado para triagem de milhões de peptídeos a fim de ver um polipeptídio com uma característica de união específica.
[00027]Em uma configuração de exemplo da presente invenção, prove-se que o anticorpo é um anticorpo que compreende: (a) uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 15; ou (b) uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 16. Como exemplo, pode ser provido que o anticorpo é um anticorpo compreendendo: (a) uma região variável de cadeia leve codificada por um nucleotídeo representado por SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia pesada codificada por um nucleotídeo representado por SEQ ID NO: 19; ou (b) - uma região variável de cadeia leve codificada por um nucleotídeo representado por SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada codificada por um nucleotídeo representado por SEQ ID NO: 20, mas não se limitando a esses.
[00028]De acordo com uma configuração específica da presente invenção, um grupo de células de hibridoma foi obtido de um camundongo, no qual a proteína de fusão / Sema c-Met humano é um antígeno, do qual o anticorpo anti-co-Met especificamente unindo-se ao c-Met foi selecionado por escaneamento com método de análise ELISA usando c-Met/His proteína de fusão como antígeno. O anticorpo selecionado e o anticorpo quimérico do mesmo possuem uma atividade inibitória de proliferação de células tumorosas, a qual é igual ou mais excelente que os comercialmente disponíveis LY2875358 e OA-5D5 (Tabela 3 e FIG. 1), assim sendo muito valiosamente utilizados na prevenção ou no tratamento de câncer.
[00029]Em ainda uma outra configuração de exemplo da presente invenção, pode ser previsto que o anticorpo compreenda:
(a)uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 23; (b) uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 24; (c) uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 29 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 31; ou (d) uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 30 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 32. Como exemplo, pode ser previsto que o anticorpo seja um anticorpo compreendendo: (a) uma região variável de cadeia leve codificada por um nucleotídeo representado por SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia pesada codificada por um nucleotídeo representado por SEQ ID NO: 27; (b) uma região variável de cadeia leve codificada por um nucleotídeo representado por SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada codificada por um nucleotídeo representado por SEQ ID NO: 28; (c) uma região variável de cadeia leve codificada por um nucleotídeo representado por SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada codificada por um nucleotídeo representado por SEQ ID NO: 35; ou (d) uma região variável de cadeia leve codificada por um nucleotídeo representado por SEQ ID NO: 34 e uma região variável de cadeia pesada codificada por um nucleotídeo por SEQ ID NO: 36, mas não limitando- se a esses. Ainda, pode ser previsto que o anticorpo compreende uma região de dobradiça representada por um entre SEQ ID NO: 37 até SEQ ID NO: 44.
[00030]Em uma configuração específica da presente invenção, foi preparado um anticorpo humanizado compreendendo CDR do anticorpo obtido através de seleção de mostrador de fago, e foi identificado que tal anticorpo apresentou uma atividade anticâncer, que era similar àquele do anticorpo de quimera da presente invenção (Exemplos 2 e 3). Ainda, em uma outra configuração da presente invenção, uma atividade inibitória de proliferação de células tumorosas do anticorpo foi avaliada de acordo com uma sequência de região de dobradiça, e foi identificado que uma proliferação de maior parte das células tumorosas foi efetivamente inibida, mesmo com uma razoável diferença na atividade dependendo da diferença da sequência posterior (Tabela 7).
[00031]Em mais uma outra configuração de exemplo da presente invenção, mas não limitando-se a essa, pode ser previsto que um anticorpo de atividade otimizada para o anticorpo humanizado é um anticorpo no qual um ou mais sequência(s) de aminoácidos é (são) substituída(s) de um anticorpo contendo: uma região variável de cadeia leve compreendendo um CDR1 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 1; um CDR?2 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 2; um CDR3 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia pesada CDR1 representada por SEQ ID NO: 7; um CDR?2 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 8; um CDR3 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 9, e onde, (i) G na 1º posição da cadeia leve CDR1 é substituído por A, E, K L, N, R, S, Vou W; A na sua 2º posição é substituído por C, G, |, P, S, Tou V; S na sua 3º posição é substituído por G, M, N, P, Q, R, Sou T; E na sua 4º posição é substituído por A, D, FE, 6, H K M, Q, R, S, Tou V; N na sua 5a posição é substituído por A, D, E, G, K, L, P, OQ, R, S, T ou V; | na sua 6º posição é substituído por A, F, L, M, Q, R, S, T ou V; Y na sua 7º posição é substituído por F, H, R ou V; ou G na sua 8º posição é substituído por D, F, H, MÓ N, R, S, T ou V; (ii) G na 1º posição do CDR?2 de cadeia leve é substituído por D, F, H, K P, Q, S, Vou Y; T na sua 3º posição é substituído por Q; ou N na sua 4º posição é substituído por G; (iii) Q na 1º posição do CDR3 de cadeia leve é substituído por E, G, |, M ou N; N na 2º posição é substituído por A, D, E, H, L, Q, S ou T; V na sua 3º posição é substituído por |, L, M, N, Q, S ou T; L na sua 4º posição é substituído por F, H, , M, R, S, V, Wou Y; S na sua 5º posição é substituído por C, D, E, FE, G, H K L, N, Q, R, T, Vou Y; S na sua 6º posição é substituído por D, E, FE, G, 6 | L MÓ N, P, O, R T, V ou Y; P na sua 7? posição é substituído por A, D, E, G, N, Q, S ou V; Y na 8º posição é substituído por E, F, L, M ou Q; ou T em sua 9º posição é substituído por D, F, G, |, L N,S,V,
W ou Y; (iv) D na 1º posição do CDR1 de cadeia pesada é substituído por G ou Q; Y na sua 2º posição é substituído por Q; ou | na 4º posição é substituído por A ou Q; (v) F na 3º posição do CDR2 de cadeia pesada é substituído por D, E, W ou Y; G na sua 5º posição é substituído por D, H ou Y; S na 6º posição é substituído por F, P, W ou Y; G na 7º posição é substituído por A, F, L, N ou T; N na sua 8º posição é substituído por F, P, S, Tou Y; T na sua 9º posição é substituído por A, D, E, F, G, H, L, P, S ou V; H na sua 10º posição é substituído por A, D, E, M, R, S, T, V, W ou Y; F na 11º posição é substituído por G, H, I, L, M, N, P, Q, Vou Y; S na sua 12º posição é substituído por A, D, G, HI, L, P, Tou V; A na sua 13º posição é substituído por D, E, FE, G, H, |, K, L, M, P, R, S, T, Vou Y; R na 14º posição é substituído por A, E, G, H, L, N, P, Q, S, W ou Y; F na sua 15º posição é substituído por D, E, G, L M, P, R, S, V ou W; K na sua 16º posição é substituído por A, E, FE, G, HA L R, S,T, V ou Y; ou G na sua 17º posição é substituído por E, E, HH L MN,P, Q,R,S, T, V ou W; ou (vi) G na 1º posição do CDR3 de cadeia pesada é substituído por E, F, H, N, Q, V ou W; D na sua 2º posição é substituído por E; Y na sua 3º posição é substituído por L, Q, T ou V; G na sua 4º posição é substituído por W; F na sua 5º posição é substituído por L ou Y; L na sua 6º posição é substituído por Q, S ou Y; ou Y na sua 7º posição é substituído por C, L, M, N ou Q. Aqui, pode ser previsto que o CDR1 de cadeia leve compreende 0 a 5 substituições, o CDR2 de cadeia leve compreende O a 1 substituição, o CDR3 de cadeia leve compreende O a 7 substituições, o CDR1 de cadeia pesada compreende 0 a 1 substituição, o CDR2 de cadeia pesada compreende 0 a 11 substituições e o CDR3 de cadeia pesada compreende 0 a 6 substituições.
[00032]Particularmente, em uma outra inda configuração de exemplo da presente invenção, pode ser previsto que o anticorpo de afinidade otimizada compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo um CDR1 de cadeia leve representado por qualquer um entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 229 até SEQ ID NO: 268; um CDR2 de cadeia leve representado por qualquer um entre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 182 até SEQ ID NO: 190, SEQ
ID NO: 227 e SEQ ID NO: 228;jum CDR3 de cadeia leve representado por qualquer um entre SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 142 até SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 191 até SEQ ID NO: 226 e SEQ ID NO: 269 até SEQ ID NO: 301; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo um CDR1 de cadeia pesada representado por qualquer um entre SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 108 até SEQ ID NO: 112; um CDR?2 de cadeia pesada representado por qualquer um entre SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 54 até SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72 até SEQ ID NO: 107 e SEQ ID NO: 118 até SEQ ID NO: 141; um CDR3 de cadeia pesada representado por qualquer um entre SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 64 até SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 113 até SEQ ID NO: 117, mais particularmente, compreendendo uma região variável de cadeia leve representada por qualquer um entre SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 306 até SEQ ID NO: 311, e uma região variável de cadeia pesada representada por qualquer um entre SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 302 até SEQ ID NO: 305, e ainda mais particularmente compreendendo: (a) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 302; (b) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 305; (c) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 310 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 23; (d) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 308 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 305; (e) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 306 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 303; (f) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 307 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 304; (g) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 308 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 304; (h) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 309 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 304; (i) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 311 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 304; or (]) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 306 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 302, mas não se limitando a esses.
[00033]Em uma configuração específica da presente invenção, um método de seleção competitivo foi utilizado para selecionar um anticorpo com uma afinidade mais aperfeiçoada que a do anticorpo humanizado, assim obtendo- se diversos anticorpos com afinidade otimizadas (Tabelas 8 a 10 e 12) O anticorpo de afinidade otimizada possui um efeito de inibição de proliferação de células tumorosas que é de 4,3 a 28,5 vezes mais excelente que o do humanizado (Tabelas 11, 13 e FIG. 3).
[00034]Na presente invenção, pode ser previsto que o anticorpo é um anticorpo ou um antígeno unindo-se a fragmento do mesmo especificamente unindo-se ainda a um receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) além de especificamente unir-se ao c-Met.
[00035]É sabido que o EFGR, um dos ErbB tirosina quinases, é anormalmente ativado em muitos tumores de células epidérmicas compreendendo carcinoma de pulmão de células não pequenas, causando invasão, proliferação celular, metástase e angiogênese e aumentando a sobrevivência das células. Gefitinib (Iressa), elotinib (Tarceva) and osimertinib (Tagrisso), os quais são inibidores de EGFR tirosina quinase, são usados como representações de agente terapêutico de câncer pulmonar; e cetuximab (Erbitux) e panitumumab (Vectibix), os quais são anticorpos de alvo EGFR, são usados como agente terapêutico de câncer de cólon (Yewale C et al., Biomaterials. 2013 34(34):8690-707 (2013), Deric L. Wheeler et al., Nature Reviews Clinical Oncology 7, 493-507 (2010)).
[00036]Tais agentes terapêuticos de alvo EGFR causam resistência um ano antes e depois do tratamento, onde a mutação, amplificação de c-Met e ativação induzida por HGF são conhecidas como mecanismo chave de
(Simona Corso Cancer Discovery 3:978-992 (2013), Curtis R Chong et al. Nature Medicine 19, 1389-1400 (2013)). Ainda, há relato de EGFR e c-Met sejam simultaneamente expressos em diversas células tumorosas, onde, mediante inibição de EGFR, c-Met torna-se ativado, desse modo prontamente desenvolvendo a resistência de EGFR TKI (Engelman, J.A,, et al., Science, 316:1039-43 (2007)).
[00037]Com base em tal mecanismo, um único tratamento com uma droga de alvo c-Met apenas e um tratamento combinado com uma droga de alvo EGFR estão agora em ensaios clínicos, mas a eficácia destes ainda não foi verificada como agente terapêuticos, e há necessidade de se desenvolver um agente terapêutico para tumores cancerosos relacionados a c-Met, conhecido como fator chave de resistência. De acordo com isso, os presentes inventores prepararam um anticorpo biespecífico baseado no anticorpo descrito acima. O anticorpo biespecífico não só inibe efetivamente a proliferação de células tumorais, que são resistentes aos agentes terapêuticos EGFR existentes, como também apresenta uma excelente atividade inibitória de proliferação contra células tumorais, assim sendo valiosamente utilizado no tratamento de doenças tais como cânceres mediados por c-Met através de mecanismos diversos.
[00038]Pode ser previsto que o anticorpo biespecífico seja formado de modo que um anticorpo ou um antígeno unindo-se a fragmento do mesmo, especificamente unindo-se a EGFR, esteja ligado ao terminus de cadeia leve ou cadeia pesada do anticorpo específico de c-Met, por exemplo, sendo ligado ao C-terminal de cadeia pesada, mas não se limitando a isso.
[00039]Pode ser previsto que o fragmento de união especificamente unindo- se ao EGFR seja Fab, Fab', F(ab') 2 ou Fv.
[00040]Em uma configuração de exemplo da presente invenção, pode ser previsto que Fv seja um fragmento scFv, onde o fragmento scFv está ligado por um conector capaz de unir o fragmento scFv ao terminal de cadeia leve ou o de cadeia pesada do anticorpo c-Met. Em uma configuração de exemplo da presente invenção, um anticorpo especificamente unindo-se ao EGFR é ainda preparado por ligação com um conector representado por SEQ ID NO:
312.
[00041]Pode ser previsto que o fragmento scFv de EGFR seja um scFv de EGFR capaz de especificamente unir-se a EGFR, conhecido na matéria, onde há, por exemplo, Erbitux, Vectibix, Portrazza, TheraCIM ou similar, mas não se limitando a esses.
[00042]Em uma configuração de exemplo da presente invenção, pode ser previsto que o scFv de EGFR seja um fragmento de scFv de Erbitux ou Vectibix; particularmente, o scFv de EGFR compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 313 ou SEQ ID NO: 314, onde o scFv Vectibix compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 315, mas não se limitando a esses.
[00043]De acordo com uma configuração específica da presente invenção, como resultado da identificação da atividade inibitória de proliferação de células tumorais do anticorpo biespeciífico, foi identificado que o anticorpo possuía uma eficácia inibitória de atividade tumoral mais excelente que o anticorpo otimizado com hu8C4 (Tabelas 16 e 17, e FIGS. 4,5, 16 é 17) Em particular, identificou-se que o anticorpo da presente invenção possuía um excelente efeito inibitório de proliferação de células mesmo sobre as linhagens de células NCI-H292 e NCI-H1648, nas quais c-Met e EGFR estão normalmente expressos (Tabelas 17 e 19 e FIG. 6). Com base em tais resultados, pode ser observado que o efeito anti-câncer do anticorpo da presente invenção não se limita particularmente a uma anormalidade da expressão de c-Met, nem à presença ou à ausência de mutação de c-Met etc.
[00044]Além disso, foi identificado que o anticorpo biespecífico da presente invenção possuía uma eficácia inibitória de atividade tumoral mais excelente do que uma terapia combinada com dois anticorpos (Tabelas 18 a 21 e FIGS. 6 a 8). Ainda, como resultado da identificação de um efeito do anticorpo biespecífico da presente invenção sobre a atividade de antígenos e materiais de transdução de sinais, foi identificado que o anticorpo biespecífico da presente invenção possuía uma eficácia inibitória de transdução de sinais mais excelente do que um anticorpo sozinho (FIG. 11).
[00045]Pode ser previsto que o anticorpo ou o antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da presente invenção une-se a uma região de epítopo representada por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo representando por SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333 e/ou SEQ ID NO: 334. Um anticorpo de afinidade otimizada preparado com base em um determinado anticorpo 9anticorpo de referência) é caracterizado por possuir uma alta homologia com sequência de CDR de cadeia leve e cadeia pesada de uma região variável com relação ao anticorpo de referência, assim unindo-se à mesma região de epítopo que o anticorpo de referência, de modo tal que o referido anticorpo com afinidade otimizada pode compartilhar de todas as características biológicas, tais como mecanismo farmacêutico e eficácia farmacêutica causada pelo local de união, especificidade e anticorpo, e exibir um efeito de mais excelência sobre a afinidade de união que o anticorpo de referência.
[0OO046]A região de epítopo respectivamente significa, por exemplo, YVSKPGAQL (SEQ ID NO: 331) nas 321as. às 329as. posições, IGASLNDDI (SEQ ID NO: 332) nas 333as. às 341as. posições, PIKYVND (SEQ ID NO: 333) nas 366as às 372as posições, e QVYVVSRSGPST (SEQ ID NO: 334) nas 464as às 474as posições do N-terminal de um antígeno de c-Met de referência (SEQ ID NO: 335), onde a sequência do antígeno de c-Met com o anticorpo ou o antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da presente invenção compreende uma mutação parcial (substituição, adição ou deleção) ou um antígeno de união existe na forma de um fragmento, precursor ou subtipo de c-Met, assim seus locais de união ou sequências podem de alguma forma variar de acordo com isso. No entanto, aqueles com habilidade na matéria poderão claramente especificar uma posição e uma sequência, aos quais o antígeno ou o fragmento de união da presente invenção se une com base na informação de sequência do epítopo de um antígeno de c-Met de referência.
[00047]Em uma configuração específica da presente invenção, foi identificado que o anticorpo biespecífico hu8C4 x Vectibix scFv da presente invenção une- se a 4 regiões de epítopo de Y321 - L329 (SEQ ID NO: 331), 1333 - 1841 (SEQ ID NO: 332), P366 - D372 (SEQ ID NO: 333), e Q464 - S474 (SEQ ID NO: 334) de uma cadeia B de domínio sema de c-Met humano (Tabela 28).
[00048]O "anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo especificamente unindo-se a c-Met" da presente invenção significa aquele que se une a c-Met humano por K D 1 X 10 -7 M ou menos. Pode ser previsto que o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo une-se a c-Met humano, por exemplo, por KD 5 X 10-8 M ou menos, KD 1 X 10-8 M ou menos, KD 5 X 10-9 M ou menos, ou KD 1 X 10-9 M ou menos, mas não se limitando a esses.
[00049]EM uma configuração específica da presente invenção, foi diretamente identificado que o anticorpo ou o antígeno unindo-se a fragmentos do mesmo da presente invenção possuíam alta afinidade de união a antígeno c-Met por identificação de uma afinidade de união de hu8C4, hu8C4 AH71 e hu8C4 x Vectibix scFv a c-Met ECD, assim identificando-se valores de KD de 3,173 X 10-10, 9,993 X 10-11e 2,78 X 10-10, respectivamente (Tabela 22). Foi identificado que o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da presente invenção possuía uma reatividade cruzada a um antígeno c-Met de macaco cynomolgus, o qual é um macaco (Tabela 22), mas não se unia a outros antígenos derivados de animais (por ex. roedores) (FIG. 9). Ainda, foi identificado que o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da presente invenção não se unia a outros receptores na superfície de células que não c-Met (Tabela 24). Assim sendo, pode ser observado a partir dos resultados acima que o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da presente invenção apresentava uma especificidade ao antígeno de c-Met de humanos e macacos.
[00050]Conforme aqui utilizado, o termo “constante de união K on)" significa uma proporção de união de uma determinada interação anticorpo — antígeno, e o termo “constante de dissociação (K off)" significa uma proporção de dissociação de uma determinada interação anticorpo — antígeno. Ainda, na presente invenção, o termo “afinidade a antígeno (K D)” é aquela que a proporção de K off: Kon (ie. Koff/ Kon) é indicada como concentração molar (M). pode ser previsto que o valor K D para um anticorpo seja medido utilizando-se um método amplamente estabelecido na matéria. Por exemplo, como método para medir o valor K D de um anticorpo, pode ser previsto análise de ressonância de plasmon de superfície utilizando-se um sistema Biocore TM system, mas não limitando-se a esse.
[00051]Um outro aspecto da presente invenção provê um método para produzir uma molécula de ácido nucleico para codificar o anticorpo ou o antígeno unindo-se a fragmento do mesmo, um vetor de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico, a célula hospedeira possuindo o vetor de expressão aqui introduzido, um anticorpo utilizando a célula hospedeira ou um antígeno unindo-se a fragmento do mesmo.
[00052]O anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da são tal qual o descrito acima.
[00053]Conforme aqui utilizado, o termo “molécula de ácido nucléico” possui significado que compreende de modo abrangente moléculas de DNA e RNA, onde um nucleotídeo, uma unidade constituinte básica na molécula de ácido nucléico, compreende não só um nucleotídeo natural, como também um análogo, no qual um açúcar ou porção de base é modificado (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhiman and Peyman, Chemical Reviews, (1990) 90:543-584). A sequência de molécula de ácido nucléico para codificar as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve da presente invenção pode ser modificada, onde a modificação compreende adição, deleção, substituição conservativa ou não conservativa de nucleotídeo.
[0O0O54]Entende-se que a molécula de ácido nucléico da presente invenção também compreende uma sequência de nucleotídeos representando uma identidade substancial com a sequência de nucleotídeos já mencionada. Na presente invenção, no caso de alinhamento da já mencionada sequência de nucleotídeos da presente invenção com quaisquer outras sequências do modo correspondente e análise das sequências alinhadas por um algoritmo convencionalmente utilizado na matéria, a identidade substancial significa uma sequência de nucleotídeos que representa homologia mínima de 80%, particularmente homologia mínima de 90% e, mais particularmente, homologia mínima de 95%.
[00055]Conforme aqui utilizado, o termo “vetor”, que é um meio de expressar um gene alvo em uma célula hospedeira, compreende um vetor plasmídeo; um vetor cosmídeo; um vetor viral tal como um vetor bacteriófago, um vetor adenoviral, um vetor retroviral e um vírus adeno-associado, particularmente um vetor plasmídeo, mas não se limitando a esses.
[00056]No vetor da presente invenção, pode ser previsto que a molécula de ácido nucléico para codificar uma região variável de cadeia leve e a molécula de ácido nucléico para codificar a região variável de cadeia pesada são operacionalmente ligadas com um promotor.
[00057]Na presente invenção, o termo “operacionalmente ligadas” significa uma união funcional entre uma sequência regulatória de expressão de ácido nucléico (por ex., um promotor, uma sequência de sinais, ou uma disposição em um local de união de fator regulatório transcricional) e outra sequência de ácido nucléico; assim sendo, a sequência regulatória a transcrição e/ou decodificação da outra sequência de ácido nucléico.
[00058]O sistema de vetor recombinante da presente invenção pode ser construído através de diversos métodos conhecidos na matéria. Por exemplo, tais métodos detalhados são revelados em in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), cujos documentos estão aqui incorporados por referência.
[00059]O vetor da presente invenção pode ser tipicamente construído como vetor para clonagem ou vetor para expressão. Ainda, o vetor da presente invenção pode ser construído de modo que uma célula procariótica ou uma célula eucariótica seja hospedeira.
[00060]Por exemplo, se o vetor da presente invenção for um vetor de expressão e uma célula procariótica for a hospedeira, em geral compreenderá poderosos promotores capazes de conduzir transcrição (por ex., promotor tac, promotor lac, promotor lacUV5, promotor Ipp, promotor pLA, promotor pRA, promotor rac5, promotor amp, promotor recA, promotor SP6, promotor trp, promotor T7 e similares), um local de união de ribossomo para iniciar decodificação e transcrição/ decodificação da sequência de terminação. Se E. coli (por ex., HB101, BL21, DH5a etc.) for usada como célula hospedeira, porções de promotor e operador de via biossintética de triptofano de E. coli (Yanofsky, C., J. Bacteriol., (1984) 158:1018-1024), e fago À de promotor da esquerda (pLA promotor, Herskowitz, |. e Hagen, D., Ann. Rev. Genet., (1980) 14:399-445) podem ser usados como porção regulatória. Se Bacillus sp. for usado como célula hospedeira, um promotor de gene de proteína de toxina de Bacillus thuringiensis (Appl. Environ. Microbiol. (1998) 64:3932-3938; Mol. Gen. Genet. (1996) 250:734-741) ou quaisquer outros promotores passíveis de expressão em inBacilus sp. Podem ser utilizados como porção regulatória.
[00061]Enquanto isso, o vetor recombinante da presente invenção pode ser preparado manipulando-se plasmídeo (ex, pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, puUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, plJ61, ptAFR1, pHV14, série pGEX, série pET, puC19 e similares), fago (ex., Agt4-AB, A-Charon, Miz1, M13 e similares) ou vírus (ex., SV40, etc.) geralmente usados na matéria. [0O0062]Enquanto isso, se o vetor da presente invenção for um vetor de expressão e uma célula eucariótica for hospedeira, promotores derivados de genoma de células de mamíferos (ex., promotor da metalotioneína, promotor de B-actina, promotor de hemoglobina humana e promotor de creatina de músculo humano) ou promotores derivados de vírus de mamíferos (ex. promotor de adenovírus tardio, promotor de vírus de vacina 7,5K, promotor SVA40, promotor de citomegalovírus (CMV), promotor tk de HSV, promotor de vírus de tumor de mama de camundongo (MMTV), promotor LTR de HIV, promotor de vírus Moloney, promotor de vírus Epstein-barr (EBV) e promotor de vírus do sarcoma de Rous (RSV)) podem ser usados, onde eles geralmente possuem uma sequência de poliadenilação como sequência de terminação de transcrição. Particularmente, o vetor recombinante da presente invenção compreende um promotor de CMV.
[00063]O vetor recombinante da presente invenção pode ser fundido com outras sequências a fim de facilitar refino de um anticorpo expresso a partir do mesmo. Como exemplos de sequências fundidas, há glutationa S- transferase (Pharmacia, USA), proteína de união de maltose (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) e similares. Ainda, uma proteína expressada pelo vetor da presente invenção é um anticorpo, assim o anticorpo expressado pode ser facilmente purificado através de uma coluna de proteína A etc. sem sequência adicional para refino. [0OO64]Enquanto isso, o vetor recombinante da presente invenção compreende um gene de resistência a antibióticos convencionalmente usado na técnica como marcador selecionado, em que pode compreender, por exemplo, genes de resistência a ampicilina, gentamicina, carbenicilina, cloranfenicol, — estreptomicina, = canamicina, geneticinay neomicina e tetraciclina.
[00065]Como vetor para expressar o anticorpo da presente invenção, pode haver um sistema vetorial, no qual uma cadeia leve e uma cadeia pesada são simultaneamente expressas em um vetor, e um sistema no qual uma cadeia leve e uma cadeia pesada são respectivamente expressos em um vetor separado. No último caso, dois vetores podem ser introduzidos em uma célula hospedeira, por exemplo, por co-transformação ou transformação direcionada. A co-transformação é um método para selecionar células que expressam cadeias leves e pesadas após a introdução simultânea de cada DNA de vetor para codificar cadeias leves e pesadas em uma célula hospedeira. A transformação direcionada é um método para selecionar uma célula transformada com um vetor que compreende uma cadeia leve (ou pesada) e transformar uma célula selecionada novamente com um vetor que compreende uma cadeia pesada (ou leve) para finalmente selecionar uma célula que expresse tanto cadeia leve quanto pesada. [0O0O66]Contanto que sejam capazes de clonar e expressar de maneira estável e contínua o vetor da presente invenção, quaisquer células hospedeiras conhecidas na matéria podem ser utilizadas, onde essas células hospedeiras podem compreender cepas de Bacillus sp. como Escherichia coli, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis e células hospedeiras procarióticas como Streptomyces, Pseudomonas (ex. Pseudomonas putida), Proteus mirabilis ou Staphylococcus (ex. Staphylococcus carnosus), mas não se limitando a essas.
[00067]Como células hospedeiras eucarióticas adequadas do vetor, pode haver micetos, tais como espécies de Aspergillus, leveduras tais como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces e Neurospora crassa, outras células eucarióticas inferiores, células de eucariotos superiores, tais como células derivadas de insetos e células derivados de plantas ou mamíferos.
[00068]Particularmente, as células hospedeiras podem ser células COS7 (células renais de macaco), células NSO, SP2 / O, células de ovário de hamster chinês (CHO), W138, células de rim de hamster filhote (BHK), MDCK, linhas celulares de mieloma, células HuT 78 ou 293; mais particularmente células CHO, mas não se limitando a essas. [0O0O69]Na presente invenção, "transformação" e / ou "transfecção" em células hospedeiras pode(m) ser realizada(s) selecionando-se uma tecnologia padrão adequada de acordo com as células hospedeiras, como conhecido na técnica,
compreendendo quaisquer métodos para introduzir ácido nucleico em organismos, células, tecidos ou órgãos. Os métodos compreendem eletroporação, plasmogamia, precipitação com fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação com cloreto de cálcio (CaCI2), agitação usando fibra de carboneto de silício, transformação mediada por agrobactérias, PEG, sulfato de dextrano, lipofectamina, transformação mediada por secagem / supressão e similares, mas não se limitando a esses.
[00070]Na presente invenção, o método para produzir um anticorpo ou um antígeno unindo-se a fragmento do mesmo pode particularmente compreender etapas de: (a) cultivar uma célula hospedeira transformada com um vetor recombinante da presente invenção; e (b) expressar um anticorpo anti-c-Met ou um antígeno unindo-se a seu fragmento na célula hospedeira. [0007 1]Na preparação do anticorpo acima, a cultura de uma célula hospedeira transformada pode ser realizada em um meio apropriado e sob condições de cultura conhecidas na matéria. Esse processo de cultura pode ser facilmente ajustado de acordo com uma cepa selecionada por aqueles com especialidade na matéria. Esse método de cultura é divulgado em vários documentos (por exemplo, James M. Lee, Bioquímica Engineering, Prentice- Hall International Editions, 138-176). A cultura de células é dividida em cultura de suspensão e cultura de ligação de acordo com o tipo de crescimento celular e de acordo com o método de cultura: cultura descontínua, cultura descontínua alimentada e cultura contínua. Um meio usado em cultura deve satisfazer adequadamente os requisitos de uma determinada cepa.
[00072]Na cultura de células animais, o meio compreende várias fontes de carbono, fontes de nitrogênio e ingredientes de microelementos. Exemplos de fontes de carbono utilizáveis podem compreender carboidratos tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; gorduras como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de mamona e óleo de coco; ácidos graxos tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico; álcoois tais como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos tais como ácido acético, onde que essas fontes de carbono podem ser usadas sozinhas ou combinadas.
[00073]As fontes de nitrogênio que podem ser usadas na presente invenção, podem compreender, por exemplo, fontes de nitrogênio orgânico tais como peptona, extrato de levedura, caldo de carne, extrato de malte, líquido de maceração de milho (CSL) e soja-trigo e fontes de nitrogênio inorgânico, tais como como ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio, sendo que essas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou combinadas. Como fonte de fósforo, o meio pode compreender di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio e sal contendo sódio correspondente ao mesmo. Além disso, o meio pode compreender sais metálicos, tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro. Além disso, o meio pode compreender aminoácidos, vitaminas, precursores apropriados e similares.
[00074]Durante a cultura, compostos como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico são adicionados a um produto de cultura de maneira apropriada para ajustar o pH do produto de cultura. Além disso, durante a cultura, a formação de bolhas pode ser suprimida utilizando-se um agente antiespumante, como éster de poliglicol de ácido graxo. Ainda, oxigênio ou gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) é injetado em um produto de cultura, a fim de manter o estado aeróbico do produto de cultura. A temperatura do produto da cultura é normalmente de 20 ºC a 45 ºC; de preferência 25 ºC a 40 ºC.
[00075]O método de produção pode ainda compreender uma etapa de: (c) coletar um anticorpo anti-c-Met ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, expresso na célula hospedeira. Um anticorpo obtido cultivando-se a célula hospedeira transformada pode ser utilizado em um estado não purificado ou ainda usado em um estado purificado com alta pureza usando vários métodos convencionais, por exemplo, diálise, precipitação de sal, cromatografia e similares. Desses métodos, o método para uso de cromatografia é mais frequentemente usado, sendo que o tipo e a ordem da coluna podem ser selecionados a partir de cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de afinidade etc., de acordo com as características do anticorpo, método de cultura etc.
[00076]Outro aspecto da presente invenção prevê uma composição para a detecção de c-Met, compreendendo o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo, um kit para detecção que compreende o mesmo e um método para detectar o anticorpo c-Met utilizando o mesmo.
[00077]A composição para a detecção de c-Met e o kit compreendendo o mesmo formam um complexo antígeno-anticorpo, de modo que um anticorpo que se una especificamente a c-Met ou um antígeno unindo-se a fragmento do mesmo entra em contato com amostra do espécime, detectando efetivamente c-Met.
[00078]Como aqui utilizado, o termo "complexo antígeno-anticorpo" significa um conjugado de c-Met e anticorpo para reconhecê-lo, a fim de identificar um tumor ou uma célula cancerosa expressando c-Met em uma amostra.
[00079]O método para quantificar o antígeno de c-Met que usa uma composição para detectar o c-Met e um kit compreendendo o mesmo pode ser realizado pela identificação de uma formação de um complexo antígeno- anticorpo, sendo que identificação da formação de um complexo antígeno- anticorpo pode ser realizada por imunoensaio enzimático (ELISA), transferência de Western, imunofluorescência, coloração imuno-histoquímica, citometria de fluxo, imunocitoquímica, radioimunoensaio (RIA), ensaio de imunoprecipitação, ensaio de imunodifusão, ensaio de fixação de complemento, chip de proteína etc., mas não se limitando a esses. O ELISA compreende vários métodos de ELISA, tal como ELISA direto, utilizando um anticorpo marcado para reconhecer um antígeno ligado a um suporte sólido; um ELISA indireto usando um anticorpo secundário marcado para reconhecer um anticorpo de captura em um complexo de um anticorpo para reconhecer um antígeno ligado a um suporte sólido; um ELISA sanduíche direto usando outro anticorpo marcado para reconhecer um antígeno em um complexo de um anticorpo e um antígeno ligado a um suporte sólido; um ELISA sanduíche indireto usando um anticorpo secundário marcado para reagir com outro anticorpo para reconhecer um antígeno em um complexo de um anticorpo e um antígeno ligado a um suporte sólido e, em seguida, reconhecer esse anticorpo, etc. ensaio de fixação, um chip de proteína etc., mas não sendo limitado a esses.
[00080]Como rótulo para tornar qualitativa ou quantitativamente mensurável a formação de um complexo antígeno-anticorpo, há: enzima, material fluorescente, ligante, material luminoso, micropartícula, molécula redox, radio isótopo e similares, mas não necessariamente se limitando a esses. Como enzimas, existem B-glucuronidase, B-D-glucosidase, B-D-galactosidase, urease, peroxidase, fosfatase alcalina, acetilcolinesterase, glicose oxidase, hexocinase e GDPbase, RNase, glicose oxidase e luciferase, fosfofructoquinase, carboxofosfuvase, aspartato aminotransferase, fosfoenolpiruvato descarboxilase, p-lactamase etc., mas não se limitando a essas.
[00081]Outro aspecto da presente invenção provê uma composição para prevenção ou tratamento de câncer compreendendo o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da presente invenção.
[00082]Ainda um outro aspecto da presente invenção provê um método para prevenção ou tratamento de câncer, compreendendo a etapa de administrar a composição que compreende o anticorpo e o antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da presente invenção para um indivíduo com perigo de desenvolver ou ter câncer.
[00083]Ainda outro aspecto da presente invenção provê utilização de tratamento contra câncer e utilização da preparação de uma droga anticâncer, com relação a uma composição compreendendo o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da presente invenção.
[00084]O anticorpo e o antígeno unindo-se a fragmento do mesmo são conforme descritos acima.
[00085]O anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da presente invenção é capaz de se ligar ao c-Met sozinho ou a uma combinação de c- Met e EGFR com alta afinidade para inibir o crescimento de células cancerosas, de modo que o anticorpo sozinho ou em combinação com portadores farmaceuticamente aceitáveis convencionais possa ser usado no tratamento, prevenção e diagnóstico de doenças hiperproliferativas, tais como câncer. [0O0086]Na presente invenção, o termo "prevenção" significa todos os atos que impedem ou atrasam doenças como câncer etc., da ocorrência ou recorrência por meio da administração da composição da presente invenção; e o termo "tratamento" significa inibição do desenvolvimento de doenças como câncer, redução de câncer ou remoção de câncer.
[00087]Pode ser previsto que o câncer, uma doença aplicada à composição da presente invenção, seja particularmente câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer retal, câncer de mama triplo negativo (TNBC), glioblastoma, câncer de pâncreas, câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer de ovário, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de próstata, solenoma, tumor de glândula salivar ou câncer de tireoide, mais particularmente câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer retal, câncer de mama triplo negativo (TNBC), glioblastoma, câncer de pâncreas, câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama e muito mais particularmente câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer retal, câncer de mama triplo negativo (TNBC), glioblastoma, câncer de pâncreas, câncer de cabeça e pescoço, mas não estando limitado a esses. Na presente invenção, pode ser previsto que o câncer seja o causado principalmente pela superexpressão, amplificação, mutação ou ativação do c- Met, mas não se limitando a isso. Em outras palavras, a composição compreendendo o anticorpo ou o seu fragmento de ligação da presente invenção tem um efeito inibitório na proliferação de todos os tumores cancerosos, independentemente da expressão ou mutação anormal do c-Met, de modo que o uso farmacêutico da presente invenção seja não limitado por um aspecto de expressão ou presença ou ausência de mutação do c-Met.
[00088]A composição pode ser uma forma de composição farmacêutica, uma composição de “quase-medicamento” e uma composição para alimentos saudáveis.
[00089]A composição da presente invenção para prevenção ou tratamento de câncer pode compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo farmaceuticamente aceitável é o convencionalmente usado na preparação de uma formulação, compreendendo lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, borracha de acácia, fosfato de cálcio, alginato, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope , metilcelulose, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio, óleo mineral e similares, mas não se limitando a esses. Além dos ingredientes, a composição da presente invenção para prevenção ou tratamento de câncer pode compreender ainda lubrificante, umectante, adoçante, aromatizante, emulsificante, agente de suspensão, conservante etc. Transportadores e preparações farmaceuticamente aceitáveis adequados são descritos em detalhes em Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995).
[00090]A composição da presente invenção pode ser administrada por via oral ou parenteral, sendo que a administração parenteral pode ser realizada por infusão intravenosa, infusão subcutânea, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, administração endotelial, administração local, administração intranasal, administração intrapulmonar, administração retal e similares. Durante a administração oral, digere-se proteína ou peptídeo, então a composição oral pode ser formulada de tal maneira que seu medicamento ativo seja revestido ou protegido de decomposição no estômago. A composição da presente invenção pode ser administrada por um dispositivo predeterminado através do qual a substância ativa possa ser movida para a célula alvo.
[00091]A dosagem adequada da composição da presente invenção para prevenção ou tratamento de câncer varia de acordo com fatores como método de formulação, tipo de administração, idade, peso, sexo, condição mórbida do paciente, alimentação, tempo de administração, via de administração, velocidade de excreção, sensibilidade à resposta, sendo que um médico especialista pode facilmente determinar e prescrever a dose eficaz para tratamento ou prevenção desejados. De acordo com uma modalidade de exemplo da presente invenção, a dose diária da composição farmacêutica da presente invenção pode atingir 0,001-100 mg / kg ou mais. Nas presentes especificações, o termo "dose eficaz farmacêutica" significa uma quantidade suficiente para tratar, prevenir e diagnosticar doenças como o câncer.
[00092]A composição da presente invenção para prevenção ou tratamento de câncer pode ser formulada em uma preparação usando veículos e / ou expedientes farmaceuticamente aceitáveis, de acordo com um método, o qual pode ser facilmente realizado por aqueles com habilidade na matéria à qual a presente invenção se refere, de modo que essa composição possa ser preparada em forma de dose única ou preparada por inserção em um recipiente de doses múltiplas. Nesse momento, a forma de dosagem pode estar em solução em óleo ou meio aquoso, suspensão ou emulsão, ou na forma de extrato, pó, supositório, medicamento em pó, grânulo, comprimido ou cápsula, e pode ainda compreender agente de dispersão ou estabilizador.
[00093]A composição da presente invenção pode ser administrada como um agente terapêutico individual ou administrada em combinação com outros agentes terapêuticos e pode ser administrada sequencial ou simultaneamente com agentes terapêuticos convencionais.
[00094]O anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo da presente invenção pode ser usado no tratamento de câncer de modo que seja injetado in vivo na forma de um agente terapêutico como anticorpo (molécula funcional) e um conjugado de agente terapêutico como anticorpo biespecífico (molécula funcional), os quais são como o descrito acima. Várias condições apropriadas e desejáveis para direcionar um medicamento a um local alvo específico são relatadas em documentos, por exemplo, Trouet et al., Plenum Press, Nova York e Londres, (1982) 19-30.
[00095]De acordo com uma configuração específica da presente invenção, como resultado da identificação de uma atividade antitumoral da composição da presente invenção para prevenir ou tratar câncer em um modelo de xenoenxerto de camundongo, identificou-se que sua eficácia inibitória da atividade tumoral era notavelmente excelente em comparação com o grupo de controle (FIGS. 12 e 13).
[00096]O c-Met, direcionado por um anticorpo ou antígeno unindo-se a um fragmento do mesmo incluído na composição da presente invenção, é uma molécula expressa na superfície das células cancerosas, assim podendo ser usada na prevenção, tratamento e diagnóstico canceres relacionados a c-Met, de tal maneira que uma molécula funcional se una também ao anticorpo da presente invenção ou seja administrada em combinação com o mesmo. À molécula funcional pode compreender uma substância química, nuclídeo radioativo, agente imunoterapêutico, citocina, quemocina, toxina, agente biótico, inibidor de enzima e similares.
[00097]A molécula funcional capaz de se acoplar ao anticorpo ou seu fragmento da presente invenção resulta em conjugados de anticorpo-droga (ADC) pode ser uma substância química, citocina ou quimiocina, mas não se limita a isso. A substância química pode ser, por exemplo, um fármaco anticâncer, particularmente acivicina, aclarubicina, acodazol, acronicina, adozelesina, alanosina, aldesleucina, alopurinol sódico, altretamina, aminoglutetimida, amonafeto, amplígeno, amsacrina e andrógenos, anguidina, afididina, afididina-azididina, 5-azitidina, (BCG), antifol de Baker, beta-2-dioxitioguanosina, bisantreno HCl, bleomicina sulfato, bulsufan,
butionina sulfoximina, BWA773U82, BW502acatac carboplatina, carmustina, clorambucil, = cloroquinoxalina-sulfonamida, —clorozotocina, clorozotocina, cromomicina, cromo parvum, CPT-11, crisnatol, ciclocitidina, ciclofosfamida, citarabina, ditembena, diclorobina, dicloridrato de benzodiazepina, dexrazoxano, dianidro-galactitol, diaziquona, dibromodulcitol, didemnina B, dietilditio — carbamato, diglicoaldeído, di-hidro-5-azacido doxorrubicina, equinomicina , dedatrexato, edelfosina, eflornitina, solução de Elliot, elsamitrucina, epirrubicina, esorubic ina, fosfato de estramustina, estrogênio, etanidazol, etiofos, etoposídeo, fadrazol, fazarabina, fenretinida, filgrastim, finasterida, ácido acético flavona, floxuridina, fosfato de fludarabina, 5'- fluorouracil, fluoruracil S5"'-fluoruracil, fluor de goserelina,y hepsulfam, hexametileno bisacetamida, homoharringtonina, sulfato de hidrazina, 4- hidroxiandrostenediona, — hidroxiureia, idarubicina HCl, ifosfamida, 4- ipomeanol, iproplatina, isotretinoína, leucovorina desodorizante, lipossolubidemia, lipossolubidemia melfalano, menogaril, merbarona, 6- mercaptopurina, mesna, extrato de metanol do bacilo calmette-guerin, metotrexato, N-metilformamida, mifepristona, mitoguazona, mitomicina-C, mitomicina-C, mitotonia / mochoxanona, mitoxanona, mitocôndria , nabilona, nafoxidina, neocarzinostatina, acetato de octreotida, ormaplat, oxaliplatina, paclitaxel, pala, pentostatina, piperazina diona, pipobromano, pirarubicina, piritrexim, cloridrato de piroxantrona, PIXY-321, plicamicina, porfímero de sódio, prednimustina, procarbazina, progestinas, pirazofurina, razoxano, sargramostim, semustina, espirogermanio, espiromustina, estreptonigrina, estreptozocina, sulofenur, suramina de sio, tamoxifeno, taxorere, tegafur, teniposídeo, tereftalamidina, teroxirona, tioguanina, tiotepa, trotoxina, trifluridina, trimetrexato, fator de necrose tumoral (TNF), mostarda de uracil, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, vindesina, vinorelbina, vinzolidina, Yoshi 864, zorubicina, citosina arabinosídeo, etoposídeo, melfalano, taxotere, taxol e suas misturas, mas não se limitando a esses.
[00098]Modo de Conduzir a Invenção
[00099]A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes por meio de exemplos. Os exemplos a seguir são providos apenas para propósito de ilustração da presente invenção com mais detalhes. Assim, de acordo com o propósito da presente invenção, fica aparente àqueles com habilidade na matéria que os Exemplos não devem ser interpretados de modo a limitar o escopo da presente invenção. Exemplo 1. Preparação de célula de hibridomsa para produzir anticorpo específico para c-Met e identificação da atividade inibitória de proliferação de células tumorais do mesmo (1)Preparação e seleção de linhagem de célula de hibridomas para produzir anticorpo monoclonal para proteína de c-Met
[000100]Uma proteína de fusão Fc / de domínio c-Met Sema humano (auto- produzida) foi injetada intraperitonealmente como antígeno em um camundongo, a fim de obter um camundongo imunizado necessário para o desenvolvimento de uma linhagem celular de hibridomas por imunização animal. A triagem foi realizada através de um método de análise ELISA utilizando-se uma proteína de fusão c-Met / His humana como antígeno, a fim de selecionar uma célula de hibridomas que responda especificamente à proteína c-Met apenas de um grupo de células de hibridomas. (2) Anticorpo para c-Met
[000101]As sequências de aminoácidos CDR de cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo de camundongo obtido a partir de uma linhagem celular de hibridomas selecionada são mostradas nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. Tabela 1 CDR de cadeia leve de hibridoma 'Anticorpo] CDR 1 SEQ ID NOs CDR 2 JSEQ ID NOs CDR 3 TSEQIDNOs 8C4 |GASENIYGALN 1 | GINAD 2 QNVLSSPYT 3 5G3 | SATSSVRYNY 1 DTSNLAS 5 | QQNSSYPRT 6 Tabela 2
CDR de cadeia pesada de hibridoma anticorpo) CDR 1 [SEQ ID NOs] CDR 2 SFQ ID NOs| CDR 3 |SEQ ID NOs| F BOA | DWVIN | 7 EIFPGSGNIHFSAREKG 8 GOYGELY| 9 | | ss | DME | DD ISONmED 1 GW) E |
[000102](3) Atividade inibitória de proliferação de células tumorais in vitro do anticorpo para C-Met de hibridomas
[000103]Com relação a um anticorpo de camundongo específico para c-Met obtido a partir de uma linhagem celular de hibridomas, bem como a um anticorpo quimérico preparado por fusão do anticorpo com regiões humanas constantes de cadeia pesada e de cadeia leve, a atividade inibitóriada proliferação de células tumorais foi testada em uma linhagem celular de glioblastoma humano U-87 MG e uma linhagem celular de câncer de estômago humano MKNA45.
[000104]Particularmente, as células U-87 MG (ATCC, & HTB14) foram diluídas em um meio de cultura EMEM (ATCC, * 30-2003) contendo 10% (v / v) de FBS, 100 U / 500 ml de penicilina e 100 ug / 500 ml de estreptomicina (Invitrogen, t 15140-122), após o qual as células resultantes foram adicionadas por 100 ué em cada poço de uma placa de 96 poços a uma concentração de 2,5 X 10 3 células, de modo que a placa foi cultivada sob 37 ºC, 95 Condições de% de UR e 5% (v / v) de CO 2 por 18 a 24 horas. O meio de cultura de células foi removido de cada poço, após o qual um meio EMEM contendo FBS a 2% (v / v) foi adicionado por 100 ué em cada poço, e um anticorpo preparado a 2X de uma concentração final (100 nM) foi continuamente diluído a uma proporção de 1/10, de modo que as células resultantes foram adicionadas por 100 ug a cada poço em seis concentrações (isto é, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM e 2 pM) para cada anticorpo. Em seguida, a placa foi cultivada por 5 dias sob condições de 37 ºC, 95% de UR e 5% (v / v) de CO 2, após o que as células resultantes foram fixadas com solução de TCA a 10% (ácido tricloroacético; Sigma, tt TOG99) no dia final. As células fixas resultantes foram tingidas por 25 minutos, de modo que 80 ul de solução de SRB a 0,4% (sulforodamina B) foram adicionados a cada poço, após o que as células resultantes foram lavadas 5 vezes com solução de ácido acético a 1%. Em seguida, 150 ul da solução 10 mM de Tris foram inseridos em cada poço de uma placa seca para dissolver o corante SRB, após o qual sua densidade óptica foi medida no comprimento de onda de 540 nm usando um leitor de microplacas.
[000105]Além disso, as linhagens celulares MKN45 (%& JCRBO0254) foram diluídas em um meio RPMI-1640 (Gibco, tt A10491) contendo 10% (v / v) de FBS, após o qual as linhagens celulares resultantes foram divididas em 2,5 X 3 em cada poço de uma placa de 96 poços, de modo que a placa resultante foi cultivada durante a noite sob condições de 37 ºC, 5% de CO2. Em seguida, o meio de cada poço da placa foi substituído por 100 ué de um meio RPMI- 1640 contendo 1% (v / v) de FBS, após o qual um anticorpo de teste foi diluído sequencialmente na proporção de 1/10 (ou seja, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 PM, 10 pM e 1 pM) para atingir 1 DM a uma concentração final de 100 nM, de modo que o anticorpo resultante foi adicionado por 100 py em cada poço. Em seguida, a placa foi cultivada por 5 dias sob condições de 37 ºC, 5% de CO?2, após o qual o meio foi removido, de modo que uma solução de TCA foi inserida por 200 ué em cada poço para fixar as células. Como mostrado no teste na célula U87 MG, as células da placa foram tingidas de acordo com um método convencional de ensaio colorimétrico SRB, após o qual a densidade óptica de cada poço foi medida no comprimento de onda de 540 nm usando um leitor de microplacas. Os resultados das linhas celulares U87 MG e MKN45 são mostrados na Tabela 3 e na FIG. 1 Tabela 3 [000 106]Resultados dos testes in vitro na atividade inibitória da proliferação da célula do tumor do anticorpo do hibridoma c-Met pa -) ;nÍn nn P / 0" T “ 0" . A íu5 | | U-87 MG I (Câncer gastrico, c-Met | | (GBM, HGF — autócrino) | | | amplificado) | IC5o (NM) | | | ICs5o (nM) | F A EISTGSSS É moreno crrrereeerrereerrrrrrrrree—) | > 100 0.34 | (Eli Lilly) | OA-5D5 | | > 100 Í > 100 | | (Genética) | | nibridoma 8CA 17.5 | 9.78 | | Í Í | hibridoma 5G3 > 100 0.32 Í | [804 Quimera TgG1 32.4 | > 100 | Í | [8C4 Quimera IgG2 > 100 12.92 | | jo6s Quimera 1gG2 > 100 | 0.41
[000107]Como visto na Tabela 3 e FIG. 1 acima, os anticorpos anti-c-Met 8C4, 5G3 e seus anticorpos quiméricos da presente invenção têm uma atividade inibitória da proliferação de células tumorais, que é igual ou mais excelente que os anticorpos c-Met conhecidos LY2875358 e OA-5D5 (grupo de controle). Assim, os anticorpos 8C4, 5G3 e seus mutantes, como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos otimizados por afinidade para o antígeno da presente invenção, podem ser usados com muito valor na prevenção ou tratamento de câncer relacionado ao c-Met. [159]
[000108]Sequências de consenso específicas para regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada dos anticorpos 8C4, 5G3 da presente invenção são mostradas na Tabela 4 a seguir. Tabela 4
[000109]Consenso SEQ ID NOs para regiões variáveis de cadeia suave e cadeia pesada dos anticorpos 8C4 e 5G3. | Consenso da sequência de aminoácidos Consenso da sequência de nucleotídeos | | cadeia suave cadeia pesada cadeia suave cadeiapesada =| | agettcagetgcagea | | atattctgatgaceca | tctegagctgagcteg | | tetecaget teactet | | gaggcceggegcttoa | ctgcatctgteggagaa | | tgaagctetectgeaa actgtcacceateacatg | | cttctggctacacet | | tggagcaagtgagaata | Itcagtgactactatata | | tttacggtgctttaaat | | a1acteggtgaagcages | TLMTQSPASLSASVGE EVQLQQSGAELARPGAS tggtatcagcgaaaaca | actggacaggegccttg | VTITOGASENIYGALN VKLSCKASGYTFSDYYI geggaaaatctecteage | | tggattegagagatt | YARKQGKSPQLLIYGA NIVKQGTGOGLEWIGEI tcctgatctatggtgca | tttcctggaagtggaaa | | NLADGMSSRFSGSGSG FPGSGNTHFSARFKGKA jaccaacttggcagalgs | BC4 Lactcacttcagtgcga | | IFSLKITSLHPDDVAT TLTADKSSSTAYMQLSS lcatgtcatcgaggttca | | ttcaagegcaagece | | YCQNVLSSPYTFGGGT LTSTDSAVYFCAGGDYG gtggcagtggetctggt | | cactgactgcagacaa | KLEIK (SEQ ID NO:FLYWGRGTLYTVSA lagacagt tttctctcaa Í tectecageacagect 13) (SEQ ID NO: 15) gatcactagcctgeate | | icatgcagctcageage | | ctgacgatgttgcaacg | | ctgacatctacggacte | tattactgtcaaaatet | | tgcagtctatttetgtg | ctaagtagtecgtaca | | cCCEBBERteactacges | Ccgt tcggagggeggace | tttetttactgegggeeg | aagctggaaatcaaa | | igeggactetggteactg | | (SEQ ID NO: 17) | J tetetgca (SEQ ID
| : 19) | cagggecagetgeages caaattgtteteaceca gtetegegctraacteg btctccageaatcatet caagacctgggecctea Ltgeatctecaggegas tgaagatgtcctgcaa tata cttetggetacacet cagtgecacetcaagtg It tactgactacacgetg ltacgttacatgtactes cactgggtaaaacagag IVLTOSPAIMSASPGE RGQLQQSGAELARPGAS — cctggacangetctes KVTMICSATSSYRYMYW VKMSCKASGYTFTDYTL reECRECEEIT Mmatggattggatacatt QQKPGSSPRLLIYDTS HWVYKQRPGQGLEW LGY | lugat ttatgacacatos Hatcettacagtegtta —., NLASGVPGRESGSGSGT NPYSGYTNYNQKFKDKA aacctggettetegagt jtactaattacaatcaga pos SNSLTISRLEAEDAATY ITLTADKSSSTAYMQLSG tccectggtegetteageg hat tcaaggacaaggec YCAQUSSYPRTFGGGTK LTSEDSAVFYCARGHMD gcagtegestctggeace acattgactgcagacas EIK (SEQ ID NO:WYWGQGTSVIVSS (SEQtctaacteteteacaat atccetecageacagect 14) ID NO: 16) ascegatnASES acatgeaactgageggo laagat getgocacttat Dtgacatctgaagacte lactgccagcagtegas tgcagtettttatregtg fsttaeaen aagaggacat atggac |tcggtggaggcaccaag |tactgeegtcaaggaac Diegoantoaas (SEQctcagtcaccgterect b NO: 18) ca (SEQ 1D NO: | 0) Exemplo 2. Preparação de anticorpo humanizado de anticorpo 8C4 e identificação da atividade inibitória de proliferação de células tumorais in vitro do mesmo
[000110]Como um exemplo, o anticorpo 8C4 de camundongo foi humanizado e a atividade inibitória da proliferação de células tumorais in vitro foi identificada, a fim de identificar ainda mais um efeito de um anticorpo preparado na presente invenção.
[000111]Para um projeto humanizado de cadeias pesadas de anticorpos 8C4, um gene da linha germinativa humana com alta homologia com um gene em uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo 8C4 de camundongo foi analisado primeiro por Ig Blast (http: //www.ncbi.nlm.nih .gov / igblast /). Como resultado, foi identificado que o IGHV3-23 tinha 48% de homologia com o anticorpo 8C4 no nível de aminoácidos e também identificou-se que o IGHV3-11 tinha 46% de homologia com o anticorpo 8C4 no nível de aminoácidos.
[000112]As CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 do anticorpo 8C4 de camundongo foram definidas pela numeração de Kabat e o hu8C4-1 foi preparado de tal maneira que a porção CDR do anticorpo 8C4 de camundongo foi representada por ser introduzida em uma estrutura de IGHV3-23. Nesse momento, n. 48 (V — |), n. 49 (S > G), n. 71 (RA), n. 73 (N>K),n. 78 (L — A) e n. 94 aminoácidos 94 (R — G) foram submetidos a uma mutação reversa em uma sequência de aminoácidos original do anticorpo 8C4 de camundongo para finalmente construir uma cadeia pesada de hu8C4-1. No caso de hu8C4-2, a porção CDR do anticorpo 8C4 de camundongo foi representada por ser introduzida em uma estrutura de IGHV3-11, e não. 48 (V — |), n. 49 (S > G), n. 71 (RA), n. 73 (N > K), n. 78 (L — A) e não. Os aminoácidos 94 (R — G) foram submetidos a uma mutação reversa em uma sequência de aminoácidos original do anticorpo 8C4 de camundongo para finalmente construir uma cadeia pesada de hu8C4-2.
[000113]Mesmo no caso de uma cadeia leve do anticorpo 8C4, para um projeto humanizado, um gene da linha germinativa humana com alta homologia com um gene em uma região variável da cadeia leve do anticorpo 8C4 do camundongo foi analisado através de lg Blast (htto: // www. ncbi.nIm.nih.gov/igblast/). Como resultado, foi identificado que o IGKV1-27 apresentava 65,3% de homologia com o anticorpo 8C4 no nível de aminoácidos e que o IGKV1-33 apresentava 64,2% de homologia com o anticorpo 8C4 no nível de aminoácidos.
[000114]As CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 do anticorpo 8C4 de camundongo foram definidas pela numeração de Kabat, e a porção CRD do anticorpo 8C4 de camundongo foi representada por ser introduzida em uma estrutura de IGKV1-33 e uma estrutura de IGKV1- 27, preparando-se assim hu8C4-1 e hu8C4-2, respectivamente. Nesse momento, o aminoácido no. 69 (T — R) de ambos e hu8C4-2 foram submetidos a uma mutação reversa em uma sequência de aminoácidos original do anticorpo 8C4 de camundongo.
[000115]O anticorpo humanizado 8C4 foi expresso em uma célula 293T utilizando-se um vetor pCLSO5 (Registro de Patente na Coréia No. 10- 1420274). No que diz respeito a tais anticorpos humanizados obtidos na forma de IgG1, foi identificado se eles tinham ou não uma atividade inibitória da proliferação de células tumorais em U-87 MG, uma linha celular de glioblastoma humano, pelo mesmo método como mostrado no Exemplo 1 acima.
[000116]Como resultado, identificou-se que os valores de IC50 de hu8gC4-1 e hu8C4-2 totalizavam 30 nM e 24,6 nM, respectivamente, indicando um nível semelhante de atividade anticâncer ao de um anticorpo quimérico 8C4 (IC 50 =32,4nM).
[000117]Sequências de consenso específicas para regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada dos anticorpos humanizados hu8C4-1 e hu8gCcC4- 2 são mostradas na Tabela 5. [176]
[000118]Tabela 5
[000119]Consenso SEQ ID NOs nas regiões variáveis da cadeia suave e da cadeia pesada dos anticorpos humanizados hu8C4-1 e hu8gC4-2
Entatccagat gacc gaggt tcagttagtg cagteteccageagt Bgaat ccgagaggagga Etttccgettetgts — Geteatagegtgace eaastt tgaggcte at aacttgcggagca tcatgegcagecagt Aagtgagaatatttac gactacacetteagt ggtgctttaaattes gactactatataaac DIQUTQSPSSLSASV VQLVESGGGLYQPG taccagcagaagect Itgggtaagacagect DRVTITCGASENTY SLRLSCAASGYTFS gugaaaget ccaaas CCggaaaagencts GALNVYQQKPGKAPK DYY INVVRQAPGKGL ctgotgatetateet pagtegattegagas LIYGATNLADGVPS EVIGEIFPGSGNTNF gcaaccaacttegca atttttcctegaagt hu8Cc4-1 RFSGSGSGRDFTFTI SARFKGRATLSADKS gatggcgtccetage ggaaatactcactte SSLQPEDIATYYCQN AVLQUNSLRAED agat tcagcggcagt agtgcgaggttcaag VLSSPYTFGQGTKVE TAVYYCAGGDYGFLY BRgaagcggcagagac geccgagecacecte IK (SEQ ID NO:WGQGTLVIVSS teacttteacaatelteageagacaaaage 21) [sm 1D NO: 23) tectecetgeaaece laagaataccgcctat gaggacat tgcaace ctgcagatgaatage lactattgtcaaaat ttcgegcagaagat Etectaagtagtece ctgecgtgtattac k acacgtttggccagltgtgccgggagtgac ggaaccaagst tgaaltacgggtttetttac httaaa (SEQ IDtggggacagggeaco mo: 25) Ittggigacagtetct pe, oo ID NO: 27) Cagettcagttagtg acatccagatgacc gaat ccggagganga agtetocatectee etagtgangectas! ttctucatetuta gsaast ttgaascts PRENSAS (FADO (CATE CODADATEe! tcacttgcggagea ggetacacetteagt Arena adatddas tgctttaaattgg tegatcagacaggct TQMTASPSSLSASY QVQLVESGGGLVKPG kt at cagcagaaacca cccggaaaagencteg aDRVT1TCGASENT1Y GSLRLSCAASGYTFS gggaaagt tcctaag gagt ggat tggagag ALNHYQQKPGKVPK DYY INWIRQAPGKGL tectgatctategt atttttectegaagt LIYGATNLADGVPS EWIGEIFPGSGNTHF caaccsacttggca geaaatacteactte hu8c4-2 FSGSGSGRDFTLTI SARFKGRATISADKA gat ggegt ccecatet petecenea! tcaag SSLQPEDVATYYCQN KNSAYLQMNSLRAED cggt t cagt ggcagt ggccgagccaceate VLSSPYTFGQGTKVE TAVYYCAGGDYGFLY egat ct gggcgagat — IK (SEQ 1D NO:WGQGILVIVSS teactcetcaccatc aagaatagegectat 2) (SEQ ID NO: 24) agcagcctgcagect ctgcagatgaatage aagatgttgcaact ct togegcagangat attactgteaaast actecogtetattas tgctaagtagtccg tgtgccgegenteac aescntttnecanucaeatttetteas garra garças attaaa (SEQ IDttggtgacagtetet | : 26) ket (SEQ 1D " 28) o Exemplo 3. Preparação de anticorpo humanizado de anticorpo 5G3 e identificação da atividade inibitória de proliferação de células tumorais in vitro do mesmo
[000120]Então, o anticorpo 5G3 de camundongo da presente invenção foi humanizado para identificar uma atividade inibitória da proliferação de células tumorais in vitro.
[000121]Particularmente, para um projeto de cadeia pesada de hu5G3-1, um gene da linha germinativa humana com uma homologia mais alta com um gene em uma região variável da cadeia pesada do anticorpo 5G3 do camundongo foi analisado primeiro por Ig Blast (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov / igblast /). Como resultado, foi identificado que o IGHV1-46 tinha 67,3% de homologia com o anticorpo 5G3 no nível de aminoácidos. As CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 do anticorpo 5G3 de camundongo foram definidas pela numeração de Kabat, e a porção CRD do anticorpo 5G3 de camundongo foi representada por ser introduzida em uma estrutura de IGHV1-46. Nesse momento, o aminoácido no. 48 (M — |), n. 869 (ML), n. 71 (R— A), n. 73 (T — K) e no. 78 (V — A) foram submetidos a mutação reversa em uma sequência de aminoácidos original do anticorpo 5G3 de camundongo. Ao fazer isso, uma cadeia pesada de hu5G3-1 foi construída.
[000122]Para uma cadeia leve de hu5G3-1, enxerto de CDR foi realizado no gene IGKV3-20 com 63,5% de homologia com o anticorpo 5G3 e aminoácido no. 43 (A — S), n. 60 (D — A) e no. 71 (F — N) foram submetidos a uma mutação reversa para construir uma cadeia leve de hu5G3-1.
[000123]Ainda, para projetar uma cadeia pesada de hu5G3-2, o CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 do anticorpo de camundongo 5G3 definido pela numeração de Kabat foram introduzidos usando o subtipo VH3, que era convencionalmente conhecido por ser o mais estável. Neste momento, o aminoácido no. 67 (F— A), n. 69 (| => L), n. 73 (T > K), n. 90 (S > F) e n. 94 (T — R) foram submetidos a uma mutação reversa em uma sequência de aminoácidos original do anticorpo 5G3 de camundongo. Ao fazer isso, uma cadeia pesada de hu5G3-2 foi construída.
[000124]Para uma cadeia leve de hu5G3-2, a CDR-enxertia foi realizada no gene IGVK Ill, que era conhecido por formar estavelmente uma estrutura com o subtipo VH3, e a mutação reversa não foi realizada.
[000125]O anticorpo humanizado 5G3 foi expresso em uma célula 293T usando um vetor pCLSO05 (Registro de Patente na Coréia No. 10-1420274). No que diz respeito a tais anticorpos humanizados obtidos na forma de I1gG2, foi identificado se eles tinham ou não uma atividade inibitória da proliferação de células tumorais em MKNA45, uma linha celular de câncer de estômago humano, pelo mesmo método mostrado no Exemplo 1 acima.
[000126]Como resultado, identificou-se que os valores de IC50 de hu5G3-1 e hu5G3-2 totalizavam 0,52 nM e 0,5 nM respectivamente, indicando assim um nível semelhante de atividade anticâncer ao de um anticorpo quimérico 5G3 (IC50 = 0,41 nM).
[000127]Sequências de consenso para as regiões variáveis da cadeia leve e cadeia pesada dos anticorpos humanizados hu5G3-1 e hu5G3-2 são mostradas na Tabela 6. Tabela 6
[000128]Consenso SEQ ID NOs nas regiões variáveis da cadeia suave e da cadeia pesada dos anticorpos humanizados hu5G3-1 e hu5G3-2
Í Consenso da sequência de aminoácidos | Consenso da sequência de nucleotídeos | O" cadeiasuave | cadeiapesada | cadeiasuave — | cadeiapesada 7 | gaaat tgtgt tgaca caggtgcagetegtg | agtctecagecace cagtctggggetgag | tgtetttgteteca gtgaagaagectees | EgggAadgagecace pectenst ane! | tctectgcagtgec [ectgeaaggeatet| | acctcaagtgtacgt ggatacacetteace | tacatgtactggtac gactacacgetgeac|) 1 VLTQSPATLSLSP QVQL VQSGAEVKKPG cagcagaaacctgge esstaenacantos RATLSCSATSSVR ASVKVSCKASGYTFT cagt ct cccaggete cetegacaagegott 'QQKPGQSPRL DYTLHIVRQAPGQGL ct catctatgacaca preces LIYDTSNLASGIPAR ENIGY INPYSGYTNY | ccaacetggettet fe esteetaea husG3-1 FSGSGSGTDNTLTIS NQKFKDRVTLTADKS ggcat cccagcaagg ggttatactaattac) RLEPEDFAVYYCQQW STAVILSSLRSEDktcagtancagt ada cat cagazat teaas SSYPRTFGGGTKVEI TAVYYCARGHMDYWG t ctgggacagacaac gacagagt caccttg K (SEQ ID NO:QGILVIVSS sites rama 29) ID NO: 31) hgactegagectgaa acgagcacagectas, gattttgcagtttat atggagctgagcage tactgtcagcagteg Dire tag acecaces scgsecgtatat tas Aacgt tcgecggages tgtectagaggacat accaaggtggagat c atggactactgegeo aaa (SEQ ID NO:caaggaaccctggte
83) accgtcetectea
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[000129]EmM seguida, foi realizado um teste da atividade inibitória da proliferação de células tumorais de acordo com uma sequência de dobradiça da região constante da cadeia pesada de IgG1 humana.
[000130]Primeiramente, uma dobradiça da região constante da cadeia pesada de 19G1 humana possuía a sequência de aminoácidos "EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 37)", a qual foi substituída para obter um mutante da região de dobradiça que possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 44.
[000131]Os mutantes resultantes foram clonados respectivamente em um vetor compreendendo a região variável da cadeia pesada de anticorpos humanizados hu8C4-1, hu8C4-2 preparados no Exemplo 2 acima. Atividade inibitória da proliferação de células tumorais in vitro de acordo com uma sequência de dobradiça foi identificada em U-87 MG pelo mesmo método como mostrado no Exemplo 1 acima.
[000132]Além disso, o efeito do anticorpo humanizado 8C4 foi analisado como se segue em relação à linhagem celular NCI-H1993 de câncer de pulmão de células não pequenas (ATCC, tt CRL-5909). As linhas celulares NCI-H1993 foram diluídas em um meio RPMI-1640 (Gibco, *% A10491) contendo 10% (v / v) de FBS, após o qual as linhagens celulares resultantes foram divididas por 3,0 x 10 3 em cada poço de 96 poços placa, de modo que a placa resultante foi cultivada durante a noite sob condições de 37 ºC, 5% de CO 2. Depois disso, o meio de cada poço da placa foi substituído por 100 ué de um meio RPMI-1640 contendo 2% (v / v) de FBS, após o qual um anticorpo de teste foi diluído sequencialmente na proporção de 1/10 (ou seja, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM e 1 pM) para atingir 0,001 nM a uma concentração final de 100 nM, de modo que o anticorpo resultante foi adicionado por 100 py em cada poço. Em seguida, a placa foi cultivada por 5 dias sob condições de 37 ºC, 5% de CO 2, após o qual o meio foi removido, de modo que uma solução de TCA (Sigma, t TO699) foi inserida por 200 ué em cada poço para fixar as células. Ainda, as células da placa foram tingidas de acordo com um método convencional de ensaio colorimétrico SRB, após o qual uma densidade óptica de cada poço foi medida no comprimento de onda de 540 nm, usando um leitor de microplacas.
[000133]Os resultados de hu8C4-1 em U-87 MG e NCI-H1993 (ATCC, HCRL- 5909) são mostrados na Tabela 7. Tabela 7
[000134]Sequência mutante de região articulada e resultado de teste in vitro na atividade inibitória de proliferação da célula com tumor. | NCI-HN1993 | I U-87 MG SEQ SEA | (NSCLC, c- | | (GBM, HGF ID) Aminoácidos ID | Nucleotídeos | Met Í |: autócrino) NOs NOs | | amplificado ) | | CTCso DD | ] (ICso NM) | EPKSCDKTHICPP| — gagcccaaatcttgtgacaaaacteacacateçe| — |) 37 45 | 12.6 > 100 P caccgtgeeca | | gagegaaaatgt tgtgtcgagtgeceacegtgee | | 38 ERKCCVECPPCP | 46 | | 310 0.30 ca | 39 ECCVECPPCP — | 47 ——— tgtgtcgagtgcccaccgtgceca | 57.3 | >100 40 ERKCCCPPCP 48 gagcgaaaatgttgttgcccacegtgceca | 37.6 0.23 41 ECCCPPCP Í 49 Bagtettgttgcccacegtgecea | 25.3 [> 100 42 EKCCVECPPCP | 50 gagaaategttegtetcgagtgcccacegtececa | 31.4 0.48 L dn — ——— À 43 ERKCCVCPPCP | 51 gagcgaaaatgttgtetctgeccacegtgeeca | 30.8 0.47 44 EKCCVCPPCP — | 52 gagaaatg! tgtgtetgeceacegtgecea | 75.9 | 038
[000135]Como visto na Tabela 7, há diferença na atividade inibitória da proliferação de células tumorais do anticorpo hu8gC4 de acordo com a diferença na sequência da dobradiça, mas foi identificado que esse anticorpo inibiu efetivamente a proliferação da maioria das células tumorais. Assim sendo, a seguir, um anticorpo humanizado por IgG1 que tem representativamente uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 38 em hu8C4- 1 foi nomeado como hu8gC4, e um anticorpo otimizado por afinidade foi preparado para identificar o efeito do mesmo.
[000136]Exemplo 5. Preparação de anticorpo com afinidade otimizada de hu8gC4 e identificação da atividade inibitória de proliferação de células tumorais in vitro do mesmo
[000137]Para preparar um anticorpo de hu8C4 otimizado por afinidade, uma biblioteca de scFv exibida por fago foi primeiro preparada usando um vetor fagomídeo exibido em uma forma combinada de scFv e plll, em que uma estrutura esquemática do vetor é ilustrada na FIG. 2. O vetor fagomídeo compreende um fragmento scFv de um anticorpo sob o controle de um promotor lac indutor de IPTG, em que a sequência ligante utilizada foi GGGGS GGGGS GGGGS (SEQ. 53).
[000138]Então, um oligonucleotídeo indutor de mutação com um códon NNK foi usado para introduzir variedade no domínio CDR da cadeia pesada e da cadeia leve de hu8C4. Por conseguinte, foi preparada uma biblioteca de hu8C4 scFv com uma fusão de His, HA e plll, após o que um anticorpo humano específico para c-Met foi selecionado da biblioteca de anticorpos preparada.
[000139]Particularmente, um método de seleção competitivo foi usado para selecionar um anticorpo com uma afinidade aprimorada. Um antígeno c-Met humano foi ligado de acordo com as diretrizes do fabricante em Dynabeads&O M-280 (Thermo Fisher Scientific, 11205D). Um cordão com um antígeno que se liga ao mesmo foi bloqueado durante 2 horas por uma solução salina tamponada com Tris superbloqueada (TBS, Pierce). Também o fago recombinante cresceu durante a noite a 37 º C e, em seguida, o fago recombinante foi centrifugado e um fago do seu sobrenadante foi bloqueado com o superbloco TBS, 0,05% de Tween 20 por 2 horas. Em seguida, o cordão foi lavado com PBS contendo 0,05% de Twin 20. Uma solução de fago bloqueada foi adicionada ao cordão lavado, após o qual o cordão resultante foi incubado em um rotador por 2 horas para ligação do fago, de modo que o cordão resultante foi lavado com PBS contendo 0,05% de Twin 20. Em seguida, um antígeno c-Met humano foi adicionado ao PBS 1 ml contendo 0,05% de Twin 20, após o que o antígeno resultante foi incubado em um rotador por 24 horas (Rouet R et al. (2012) Nat (Protocolo 7: 364-373). Depois disso, a ligação do fago ao grânulo foi eluída com trietanolamina 100 mM por minutos, após o que um eluente foi neutralizado com Tris / CI 0,5 M (pH 7,2). Um líquido de neutralização de fago eluído foi infectado com E. coli TG1.
[000140]Um clone individual selecionado pelo experimento cresceu em um formato de 96 poços de caldo 2xYT 200 ué com adição de carbenicilina e ampicilina, após o qual um sobrenadante da cultura foi diretamente usado para o ELISA para selecionar uma ligação de scFv exibida em fago a uma placa revestida com alvo proteína. As sequências de aminoácidos das regiões CDR da cadeia leve e da cadeia pesada de um anticorpo detectado são mostradas nas Tabelas 8 e 9, e as sequências representativas de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada de um anticorpo otimizado por afinidade são mostradas na Tabela 10. Tabela 8
[000141]Lista de sequência da cadeia pesada CDR
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LL ALISS AL196 Tabela 10
[000142]Lista de sequência de cadeia suave e cadeia pesada do anticorpo otimizado-afinidade o a PN
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSDYY INWVRQAPGKGLEW ANTI — [IGEIFPGNWGNTHESARFKGRATLSADKSKNTAYLOMNSLRAEDTAVY | — 302
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[000143]Além disso, um teste in vitro da atividade inibitória da proliferação foi realizado na linha de células U-87 MG usando uma parte dos anticorpos otimizados por afinidade, em que os resultados dos mesmos são mostrados na Tabela 11. Tabela 11
[000144]Atividade inibitória da proliferação da célula com tumor in vitro por anticorpos otimizados-afinidade da cadeia suave e da cadeia pesada hu8C4.
pr ““irg7 MG (GBM, HGF — autóerimo) 25 Teste de inibição da proliferação da célula, 1Cso Anticorpos (nM) Dobra ICso Antitornos hu8C4 | otimizados — afinidade hu8CA AH71 1.3 8.5 | hu8C4 AHT2 10.9 95.5 8.8 | hu8C4 AH73 | 10.9 95.5 8.8 IRuBC4 AHBS | 101 | 9655 95 | hu8C4 ALI35 | 7.1 31.9 | 4.5 hu8C4 ALI65 | 6.8 39.0 5.7 hu8C4 ALIG6 | 9.1 39.0 4.3 hu8C4 ALI194 9.6 94.5 9.8 | hu8C4 ALI95 | 18.0 94.5 9.3
[000145]Como visto na Tabela 11, identificou-se que o IC50 da atividade inibitória da proliferação de células tumorais de um anticorpo otimizado por afinidade hu8C4 em uma célula U-87 MG era de 5,0 - 18 nM, sendo que a eficácia foi aumentada 4,3 - 9,8 vezes mais do que um anticorpo parental hu8C4. Os resultados acima representam um teste realizado em uma parte de anticorpos com uma sequência de aminoácidos apresentada nas Tabelas 8 a 10, em que uma afinidade do anticorpo progenitor hu8C4 foi otimizada e todos os anticorpos foram selecionados com base em uma afinidade por antígeno através de um processo de seleção. Assim, espera-se que possa haver um efeito suficientemente igual, mesmo com relação ao restante de anticorpos otimizados por afinidade, bem como anticorpos com a combinação de CDRs de região variável de cadeia pesada e cadeia leve apresentadas.
[000146]Para uma experiência adicional, 10 tipos de anticorpo otimizado por afinidade foram preparados combinando as regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. Uma combinação específica de sequências de cadeia leve e cadeia pesada é mostrada na Tabela 12. Tabela 12
[000147]Lista de sequência de região variável combinado do anticorpo otimizado-afinidade | Região variável da cadeia pesada Região variável da cadeia suave + - + — | Região variável da cadeia hu8C4 AlI71 | AII7I(SEQ ID NO: 302) Suave do anticorpo | hu8C4-1 (SEQ ID NO: 21) | Região variável da cadeia hu8C4 AH85 | AHSS(CSEQ ID NO: 305) suave do anticorpo | hu8C4-1 (SEQ ID NO: 21) | | Regiovanisveldacadeiapesada — | ] hu8C4 ALI94 | do anticorpo hu8C4-1 AL194(SEQ ID NO: 310) | (SEQ ID NO: 23) hu8C4 AS6G | AH8SS(SEQ ID NO: 305) f ALI65(SEQ ID NO: 308) hu8CA A62 AH72(SEQ ID NO: 303) | ALISO(SEQ ID NO: 306) hu8&CA A71 | AH73(SEQ ID NO: 304) ALI35(SEQ ID NO: 307) hu8C4 A7T2 | ANTS(SEQ ID NO: 304) | ALIGS(SEQ ID NO: 308) | | hu8ca a73 | AHTBCSEQ ID NO: 304) | ALIGG(SEQ ID NO: 309) | hu8C4 A7G6 | AH73(SEQ ID NO: 304) AL195(SEQ ID NO: 311) hu8C4 A78 AH71(SEQ ID NO: 302) f AL130(SEQ ID NO: 306)
[000148]Então, uma atividade inibitória de proliferação da célula do tumor foi avaliado pelo mesmo método como mostrado no exemplo 1 acima, onde os resultados dos mesmos são mostrados na tabela 13 e figura 3. Tabela 13
[000149]Atividade inibitória de proliferação da célula de tumor in vitro por um anticorpo otimizado-afinidade U-87 MG (GBM, HGF autócrino) Teste de inibição de proliferação da célula , Anticorpos ICso (nl) Dobra ICso Cc Aanteormes | otimizados — afinidade hu8CA hu8C4 AL194 5.3 49.0 9.2 huBca AB6 | 7 | 490 | 285 | husc4 A62. 18 49.0 27.6 RC LD o Tra Do grreaaaanos TA — 7 —— hu8CA A72 3.6 49.0 13.8 TU8sC4 ATB | 4.0 | 4900 | 1P8.) hu8gC4 A78 2.6 49.0 18.9
[000150]Como visto na Tabela 13 acima, foi identificado que o hu8C4, bem como 10 tipos de anticorpo chave com uma combinação de regiões variáveis da cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo otimizado por afinidade, também exibia uma atividade inibitória da proliferação de células tumorais. Em particular, o IC50 dos 10 tipos de anticorpos atingiu 1,7 - 5,8 NM e foi identificado que eles tinham um efeito inibidor da proliferação de células tumorais, que foi 9,2 - 28,5 vezes mais excelente que o anticorpo progenitor hu8gC4.
Exemplo 6. Preparação de anticorpo biespecífico e atividade inibitória de proliferação de células tumorais in vitro
[000151]Para preparar um anticorpo biespecífico que se liga especificamente aos fragmentos c-Met e EGFR, Erbitux e Vectibix scFv, conhecidos por se ligarem especificamente ao EGFR, foram ligados respectivamente a um terminal C da cadeia pesada do anticorpo c-Met da presente invenção por um GGGGSGGGGS (SEQ. No. 312).
[000152]Para aumentar a estabilidade do scFv, um 44º resíduo de uma cadeia pesada e um 100º resíduo de uma cadeia leve foram substituídos por cistina (Reiter Y. et al., Biochemistry 33 (18): 5451-5459 (1994)). As sequências de Erbitux e Vectibix scFv, sequências de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo biespecífico e uma combinação de regiões variáveis do anticorpo biespecífico são mostradas nas Tabelas 14 e 15 a seguir.
Tabela 14
[000153]Lista de sequência de aminoácidos do anticorpo EGFR para preparação do anticorpo biespecifico bem como do anticorpo biespecífico.
RJ Sequencia de aminoácidos O seg in xos |
RVQLKOSGPGLVQPSQSLSI TC VSGFSLTNYGVHWYRQSPGKCLEMLGVINSGGNTDENTPI Erbitux scFv 4L [PSRLS1 NEDNSKSQVFFKMNSLASNDTA |YCARALTYY DYEF MY WGQGTI VTYSAGGGESSGS 313 SGEGGSCGECSDILLTOSPV: LSYSPGERVSPSCRASQSIGTNI HKYQQRTNGSPRLL 1KY|
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ISSLGTOTY ICNVNHKPSNTKVDKKVERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLNI Cadeia pesada IEVTCVVVJVSHEDE EVKENN VOGVEVHNAKTKPREBQYNSTYRVYSVLTVUHQUALNGKEY| hu8C4 AH73 x Vectibix KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPREPQVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGIFY PSD] AVEM 229 scFPv heavy chain VGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSWIIHEALHNHY TOKSLSLSP,
SKEGGGSCRGGSQVALQESGPGLVKPSETLSLTCTYSGGSVSSGDYYNTNIRCSPGKCLENIG TV SGNTNYNDSLASRL TISIDISKTGPSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVICAFDINOCCTM VTYSSGGGISGEGESEGEESCCGISDTANTASFSSLSASVGDRVTI TOQASQUI SNYLNINYCQ PGKAPKL:IYDASNLETGVPSRESGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGCG
VEIK A Anino acids sequence Contr Seg qu Nos | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSGYTFSDYY INWYRQAPGKGLENTGE 1 FPGNGNSHVYSR KGRATLSADKSKNTAYLONNSL2AEDTAVYYOAGQDYCELYWGOGTLVIVSSASTKGPSVFP| PSSKSTSGGTAALGCLVKDY F?EPVTVSINSGAL TSCVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVP S: ITY LONVNHKPSNTKVDKA VERKCCVECPPCPAPEULGGPSVFLFPPKPKDTLNI SRT) Cadeia pesada PEYVTCYVVDVSHEDPEVKFNKY VOGVEVHYAKTKPREEOYNSTYRYYSVLTVLHODWLNGKEY husC4 AHSS x Vectibix KCKVSNKALPAPIEXTISKAKCOPREPQVITLPPSRDELTKNQVSLTCLYRGEYPSDIAVENE |. sefv ISNGAPENNYETTPPYLDSDGSFF.YSKLTYDKSREQQGNVFSCSYMHEALHNHY TOKSLSLSF| GKGCCGSCEGESQVALQESGPCLYKPSETLSLTCTVSCCSVSSCDYYWNTWIRQSPCKCLENIG| HI YSGNTNYNPSLASELTIS] DTSKTQFSLKLSSYTAADTA] YYCYRDRNTGAFDI NGAGTM
YSSCCSESCEGESCAEGESCAGESDTQNTASPSSLSASVEDRVT ITCOASQDI SNYLNHYOA KPGKAPKLL]YDASNLETGVPSRSSGSGSGTDFTFT I SSLOPEDIATY FOQHFDHLPLAFGCO
KYEIK Tabela 15
[000154]Lista de sequência de região variável combinada do anticorpo biespecífico.
Região variável | Região variável de cadeia pesada | de cadeia suave o q == ÁCÉC0ãÔzaÔÕCÉZÓGoziovanáveldecadeia | hu8C4 x Erbitux scFv HL | hu8C4 x Erbitux scFv HL | suave do anticorpo hu8C4-1 (SEQ ID NO: 316) Í . | (SEQ ID NO: 21) o " ' qo —— Região variável decadeia- hu8C4 AH71 x Erbitux scFv /hu8C4 AH71 x Erbitux scFv| suave do anticorpo hu8C4-1 un HL (SEQ ID NO: 317) | (SEA 10 NO: ED) - — Regiãovariável de cadeia hu8C4 AH85 x Erbitux scFv hu8C4 AH85 x Erbitux serv. | suavedoanticorpo hu8C4-1 HL HL (SEQ ID NO: 320) 1 (SEQ ID NO: 21) hu8C4 ALI94 x Erbitux scFvi hu8C4 x Erbitux scFv ne ALIGA(SEO 10 NO: 210) | 194 : 3 nl (SEQ ID NO: 316) | “huBC4 ASG x Erbitux scFv hu8C4 AHS5 x Erbitux seBvL 2 | ALIG6S(SEQ ID NO: 308) HL HL (SEQ ID NO: 320) hu8C4 A62 x Erbitux scFv /hu8C4 AH72 x Erbitux scFv ALISO(SEG 1D NO 5) 130(SE : 30 nu HL (SEQ ID NO: 318) hu8C4 A71 x Erbitux scFv /hu8C4 AH73 x Erbitux scFv ALISSISOO 10/30: 307) 135(SE : 307 He HL (SEQ ID NO: 319) hu8C4 A72 x Erbitux scFv /hu8C4 AH73 x Erbitux scFv, | ALIG6S(SEQ ID NO: 308) HL HL (SEQ 1D NO: 319) | hu8C4 A73 x Erbitux scFy /hu8C4 AH73 x Erbitux se ALIGG(SEQ ID NO: 309) n HL (SEQ 1D NO: 319) | Na hu8BC4 A76 x Erbitux scFvy /hu8C4 AH73 x Erbitux scFv ALIOS ) L195(SEQ ID NO: 311 HL HL (SEQ ID NO: 319) | hu8CA4 A78 x Erbitux scFv /hu8C4 AH71 x Erbitux scFv AL1I30(SEQ ID NO: 306) HH HL (SEQ ID NO: 317) RD a Região variável de cadeia —| hu8C4 x Erbitux scFv LH hu8C4 x Erbitux scFv LH | suave do anticorpo hu8C4-1 | (SEQ ID NO: 321) (SEQ ID NO: 21) NS o J TA A Região variável de cadeia | hu8C4 AH71 x Erbitux scFv hu8C4 AH71 x Erbitux scFv suave do anticorpo hu8C4-1 Ui LH (SEQ ID NO: 322) (SEQ ID NO: 21) | Região variável de cadeia hu8C4 AH85 x Erbitux scFv fauêca AH85 x Erbitux scFv suave do anticorpo hu8C4-1 LH | LH (SEQIDNO: 325) | (SEQ ID NO: 21) hu8C4 ALI94 x Erbitux scFv| hu8C4 x Erbitux scFv LH ALI94(SEQ ID NO: 310) Mm (SFQ ID NO: 321) hu8C4 AS6 x Erbitux scFv |hu8C4 AH85 x Erbitux scFv ALI65(SEQ 1D NO: 308) LH LH (SEQ ID NO: 325) hu8C4 A62 x Erbitux scFv hu8C4 AH72 x Erbitux scFv AL1I3O(SEQ ID NO: 306) LH LH (SEQ ID NO: 323) hu8C4 A71 x Erbitux scFv |hu8C4 AH73 x Erbitux scFv ALIS5(SEQ 1D NO: 307) UH LH (SEQ ID NO: 324) Hu8C4 A72 x Erbitux scFv hu8C4 AH73 x Erbitux scEv : ALI65(SEQ 1D NO: 308) LH LH (SEQ ID NO: 324) hu8C4 A73 x Erbitux scFv hu8C4 AH73 x Erbitux scFv ALI66(SEQ ID NO: 309) um LH (SEQ ID NO: 324) hu8C4 A76 x Erbitux scFv |/hu8C4 AH73 x Erbitux scFv AL195(SEQ ID NO: 311) wu LH (SEQ ID NO: 324) hu8C4 A78 x Erbitux scFv hu8C4 AH71 x Erbitux scFvi ALISO(SEQ ID NO: 306)
"7 | LH (SEQ1D NO: 322) | Í Região variável de cadeia | hu8CA x Vectibix scFv | hu8C4 x Vectibix scFv | suave do anticorpo hu8C4-1 | (SEQ ID NO: 326) | (SEQ ID NO: 21) fo Cute a | hu8C4 AH71 x Vectibix hu8C4 AH71 x Vectibix scFv, suave do anticorpo hu8C4-1 | scFv (SEQ ID NO: 327) | (SEQ ID NO: 21) | Região variável de cadeia | hu8C4 AH8S x Vectibix Íhu8C4 AH85 x Vectibix scFv, | — suavedoanticorpo hu8C4-1 | scFv (SEQ ID NO: 330) Í (SEQ ID NO: 21) MUSCA ALIOA x Vectibix | MuSC4 x Vectibix seBv ||| | | ALIS4(SEQ ID NO: 310) scFv Í (SEQ ID NO: 326) | hu8C4 AHBS x Vectibix hu8C4 AS6 x Vectibix scFv | ALI65(SEQ ID NO: 308) | scFv (SEQ ID NO: 330) THÀ>—>)mugoo<<AAAnRNPoveun |||) hu8C4 A62 x Vectibix scFv) AL130(SEQ ID NO: 306) | scFv (SEQ ID NO: 328) E eiBami-i é E PPA go MB x Vectíbio | | hu8C4 A71 x Vectibix scFv) ALI35(SEQ ID NO: 307) | scFv (SEQ ID NO: 329) Mo huBC4 ANTB x Veetibi | hu8C4 A72 x Vectibix scFv ALI65(SEQ ID NO: 308) | secFv (SEQ ID NO: 329) gg C“Fgixigadecbia | hu8C4 A73 x Vectibix scFv ALI66(SEQ ID NO: 309) | scFv (SEQ ID NO: 329) | | hu8C4 AH73 x Vectibix hu8C4 A76 x Vectibix scFv ALI95(SEQ ID NO: 311) | scFv (SEQ ID NO: 329) a RBCA AH7I x Vectibix | hu8C4 A78 x Vectibix scFv AL1I3O(SEQ 1D NO: 306) | scFv (SEQ ID NO: 327)
[000155]Em seguida, avaliou-se a eficácia anticâncer in vitro de um anticorpo biespecífico que liga os fragmentos Erbitux e Vectibix scFv em uma linhagem de células tumorais U-87 MG pelo mesmo método que o mostrado no Exemplo
1.
[000156]Além disso, uma atividade inibitória da proliferação de células tumorais foi avaliada usando as linhagens celulares de câncer de pulmão NCI- H1993, NCI-H292 e NCI-H820. Particularmente, no que diz respeito a uma linhagem celular NCI-H1993 (ATCC, tt CRL-5909) com o gene c-Met nela superexpressa, uma linhagem celular NCI-H292 (ATCC, %& CRL-1848) com EGFR e c-Met normalmente expressa nela e NCI-H820 (ATCC, tt HTB-181) com treonina (T) mutada em metionina (M) no aminoácido EGFR no. 790, uma atividade inibitória da proliferação de células tumorais foi realizada pelo método a seguir. Cada linhagem celular foi diluída em um meio RPMI-1640 (Gibco, % A10491) contendo 10% (v / v) de FBS, após o qual as linhas celulares resultantes foram divididas por 2,0 X 10 3 em cada poço de uma placa de 96 poços, de modo que a placa resultante foi cultivada durante a noite sob condições de 37 ºC, 5% de CO2. Em seguida, cada poço da placa foi substituído por 100 ué de um meio isento de soro, após o qual a placa resultante foi cultivada sob condições de 37 ºC, 5% de CO 2 por 18 horas. Depois disso, o meio foi substituído por 100 ué do meio RPMI-1640 contendo 2% (v / v) de FBS ou HGF 50 ng / ml, após o qual um anticorpo de teste foi diluído sequencialmente na proporção de 1/10 (ou seja, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM e 1 pM) para atingir 0,001 nM a uma concentração final de 100 nM, de modo que o anticorpo resultante foi adicionado por 100 py em cada poço. Posteriormente, a placa foi cultivada por 5 dias sob condições de 37 ºC, 5% de CO?2, após o qual o meio foi removido, de modo que uma solução de TCA foi inserida por 200 ué em cada poço para fixar as células. Além disso, as células da placa foram tingidas de acordo com um método convencional de ensaio colorimétrico SRB, após o qual a densidade óptica de cada poço foi medida no comprimento de onda de 540 nm, usando um leitor de microplacas.
[000157]Os resultados da atividade inibitória da proliferação em cada linha celular acima são mostrados nas Tabelas 16 e 17 e nas FIGS.4 e 5. Tabela 16
[000158]Atividade inibitória da proliferação da célula de tumor in vitro por anticorpo biespecífico. ] Teste de inibição de prouiferação da célula: TCso | (nM) Lo Anticorpos biespecífico | U-87 MG | NCI-H1993 | GB, IGP | (NSCLC, c-Met amplificado) | autócrino) bs x Vectibik seBv | 0.06 | 0.32 o hu8C4 AH7I x Erbitux scFv| | | 0.06 0.41 ue | AuUSCA ASS x Erbitux scFv| B B o | 0.06 0.48 He | uBCA ALIO4 x Erbitux scFv | | 0.07 0.64 He | MuSC4 A5S6 x Erbitux seFv || VV B' | 0.07 0.57 ne | RuSC4 A62 x Erbitux scFv | 0.08 0.65 nm | huBCA4 A7O x Erbitux scFv | | 0.07 0.67 un | FUSCA 72 x Erbitux scFv | T
0.06 0.49 no | FUSCA A73 x Erbitux scFv | ] 0.06 0.50 un | hu8C4 A76 x Erbitux scFv | ] ' | 0.06 0.49 ne | huSCA A78 x Erbitux scFv | | | 0.06 0.76 ne Tabela 17
[000159]Atividade inibitória da proliferação da linha de célula cânce no pulmão por anticorpo biespecífico. o B Teste de inibição de proliferação da célula TCso (n) o TJ “NcrH820 ] Anticorpos biespecífico NCI-H292 (NSCLC : EGFR T790M, | (NSCLC) c-Met amplificado) “nolGF FGF SOng/ml nolGF FGF SOng/ml | usa x Vectibix seFv | 0.70 | 0.24 | >100 | 42 | huBC4 AH71 x Erbitux scFv
0.51 0.22 > 100 8.5
HL huBC4 AH85 x Erbitux scFv
0.43 0.23 > 100 76 | A | |hu8C4 ALIS4 x Erbitux scFv B Í |
0.41 0.24 > 100 19.0 He | huBC4 A56 x Erbitux scFv I |
0.42 0.29 > 100 21.7 | un hu8C4 AG2 x Erbitux scFv
0.74 0.28 > 100 40.2 nm [MuBCA ATO x Erbitux seBv |O
0.74 0.23 > 100 40.9 He AFuBC4 A72 x Erbitux seFv | | = 5
0.78 0.23 > 100 19.5 nm | hu8C4 A73 x Erbitux scFv Í |
0.87 0.26 > 100 38.4 | He | hu8C4 A76 x Erbitux scFv |
0.73 0.21 > 100 10.3
HL
[000160]Como resultado, não houve diferença na eficácia entre os anticorpos biespecíficos preparados a partir da linha de células tumorais U-87 MG pelo método e foi identificado que uma eficácia inibitória da atividade foi cerca de vezes mais excelente que a IC50 do anticorpo otimizado para hu8C4. Além disso, como resultado da avaliação de uma atividade inibitória da proliferação de células tumorais usando as linhagens celulares de câncer de pulmão NCI- H1993, NCI-H292 e NCI-H820, identificou-se que não havia diferença na eficácia entre os anticorpos bi-específicos preparados. em cada linhagem celular acima são mostrados nas Tabelas 16 e 17 e nas FIGS.4 e 5.
[000161]Tais resultados sugerem que o anticorpo da presente invenção tem um efeito inibidor da proliferação em todos os tipos de câncer, independentemente de uma superexpressão ou mutação de c-Met e EGFR, podendo assim ser efetivamente usado nesses tipos de câncer. Exemplo 7. Avaliação comparativa de atividade inibitória de proliferação de células tumorais in vitro de anticorpo biespecífico comparado a terapia combinada
[000162]Foram utilizados oito tipos de câncer para comparar a atividade inibitória da proliferação de células tumorais entre uma terapia combinada de cada anticorpo direcionado a c-Met e EGFR, respectivamente, e o anticorpo biespecífico da presente invenção.
[000163]Particularmente, a atividade inibitória da proliferação de células tumorais foi avaliada em uma linha de células de câncer de pulmão NCI-H292 (ATCC, tt CRL-1848), uma linha de células de glioblastoma HGF-glioblastoma autocrinal U-87 MG (ATCC, %& HTB-14), câncer de pulmão linhas celulares NCI-H1648 (ATCC * CRL-5882) e NCI-H596 (ATCC %& HTB-178), HCC827 (ATCC, t CRL2868), uma linha celular de câncer de cólon LS174T (ATCC, É CL-188), um triplo negativo de linha celular BT20 de câncer de mama (TNBC) (ATCC, %& HTB-19) e uma linha celular KP4 de câncer pancreático (JCRB, f RCB1005). A linha celular NCI-H1648 é caracterizada por uma expressão normal de EGFR e c-Met, a linha celular NCI-H596 é caracterizada por uma exclusão de alguma sequência do exon no. 14 do gene MET e a linha celular HCC827 é caracterizada por uma deleção de alguma sequência do exon no. 19 do gene EGFR. Além disso, a linha celular LS174T possui uma mutação KRAS e a KP4 é caracterizada pelo autocrinamento do HGF.
[000164]A linhagem de células U-87 MG foi avaliada por um método do Exemplo 1 e a linhagem de células NCI-H292 foi avaliada por um método do Exemplo 6. Além disso, as linhagem s de células NCI-H1648, NCI-H596 e HCC827 foram diluídas em um RPMI -1640 (Gibco, % A10491) contendo 10% (v/v) de FBS, após o que as linhagem s celulares resultantes foram divididas por 2,0 x 10 3 em cada poço de uma placa de 96 poços.
A linhagem celular LS174T foi diluída em um meio DMEM (Gibco, f 11995-065) contendo 10% (v/v) de FBS, após o qual as linhagem s celulares resultantes foram divididas por 2,0 x 10 3. A linhagem celular BT20 foi diluída Meio EMEM (ATCC, * 30- 2003) contendo 10% (v / v) de FBS, após o qual as linhagem s celulares resultantes foram divididas por 3,0 x 103. E a linhagem celular KP4 foi diluída em meio RPMI-1640 (Gibco , % A10491) contendo 10% (v / v) de FBS, após o qual as linhagem s celulares resultantes foram divididas por 1,5 x 10 3, de modo que a placa resultante foi cultivada durante a noite sob condições de 37 ºC 5% de CO2. Em seguida, cada poço da placa foi substituído por 100 ué de um meio isento de soro, após o qual a placa resultante foi cultivada sob condições de 37 ºC, 5% de CO 2 por 18 horas.
Depois disso, o meio foi substituído por 100 ué do meio RPMI-1640 contendo 2% (v / v) de FBS ou HGF 50 ng / ml, após o qual um anticorpo de teste foi diluído sequencialmente na proporção de 1/10 (ou seja, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM e 1 pM) para atingir 1 pM a uma concentração final de 100 nM, de modo que o anticorpo resultante foi adicionado por 100 y em cada poço.
Em seguida, a placa foi incubada por 5 dias sob condições de 37 ºC, 5% de CO 2, após o qual o meio foi removido, de modo que uma solução de TCA foi inserida por 200 ué em cada poço para fixar as células.
Além disso, as células da placa foram tingidas de acordo com um método convencional de ensaio colorimétrico SRB, após o qual uma densidade óptica de cada poço foi medida no comprimento de onda de 540 nm, usando um leitor de microplacas.
[000165]Os resultados deste exemplo são mostrados nas tabelas 18 a 21 e nas FIGS.6 a 8. Tabelas 18 [000 166]Avaliação comparativa da atividade inibitória de proliferação da célula de tumor in vitro entre terapia combinada e anticorpo biespecífico nas linhas de célula U-87MG e NCI-H292 | | Teste de inibição de proliferação da célula » ICso (NM) | | U-87 MG T NCI-H292 (NSCLC) | Anticorpos | (GBM, HGF | No HGF HGF 50 ng/ml | autócrino ) | | Vectibix >100 0.09 >100 | + i j | hu8Cc4 83.9 >100 >100 | huBC4 + Vectra n€/1”7T? ) geTwuuio!s |V | 79.0 0.10 0.34 | combinado | huBC4 x Vectibix scFv 0.4 0.15 0.12 | C-EMI-MAD | > 100 | 65.29 | 5.73 | C-LA480 858.8 7 7 | t Í Í i | C-OA-5D5 171.9 - - , CABRGO >100 po AZ P“AOAGt
[000167]Tabela 19
[000168]Avaliação comparativa da atividade inibitória de proliferação da célula de tumor in vitro entre terapia combinada e anticorpo biespecífico nas linhas de célula NCI-H1648 e NCI-H506
| Teste de inibição de proliferação da célula, 1Cso (nM) | erre rermrrrErremErErEEEree— | NCI-H1648 NCI-H596 | | Anticorpos | | (NSCLC) (NSCLC, c-Met “mutado), | No HGF —HGF SOng/ml No HGF jHGF 5Ong/ml| [ Vectibix > 100 >100 | >100 [ hu8C4 >100 | >100 > 100 2.38 | [MBC + Vectibio fo AFZA | > 100 | >100 > 100 2.4 | | combinado | | hu8C4 x Vectibix scFv 15.4 29.5 > 100 0.4 |
[000169]Tabela 20
[000170]Avaliação comparativa da atividade inibitória de proliferação da célula de tumor in vitro entre terapia combinada e anticorpo biespecífico nas linhas de célula LS174T, BT20 e KP4 fu 5 oBm)ilEE “Foste de inibição de proliferação da célula , 1C5o (nd) | | asma | Bm | ka | | Anticorpos (Colon, KRAS G12V) (TNBC) (Pancreas) | Í | [TEN | HGF 5Ong/ml HGF SOng/ml Í | Autócrino [O Vectibix — >10 | >N0 | >1 | | hu8C4 | > 100 | >100 42.0 | | —hu8C4 + Vectibix Í | 34.4 > 100 36.4 Í | combinado Í ImBC4 x Vectibix serv 33,4. -10 | 270 [| oceNANHAD eo sam > Tabela 21 [00017 1]Avaliação comparativa da atividade inibitória de proliferação da célula de tumor in vitro entre terapia combinada e anticorpo biespecífico nas linhas de célula HCC827 e NCI-H596
So“ ) 6Ó g ” [JD 20 ="“E 55, go inibição de protiferação da célula - 1050 | (no) | — AA“ NCI-H596 Í HCC827 | Í Anticorpos Í | — (NSCLC, c-Met Í (NSCLC, EGFR Mutados), Í Í Mutados ) | Lerner qrememroreneeerereeseeanorrereeeeemeeserrserearees——— Í | HE 50 | Í No HGF | HGF 50 ng/ml Í | ng/ml Í Tarceva 2.96 | >100 > 100 Í Vectibix > 100 | >100 | > 100 | hu8C4 [1 >10 | >100 67.2 Í hu8C4 x Vectibix scFv ; >100 | >100 0.8 Í LA480 1 >100 | > 100 | > 100 Í TNC280 1 >10 | >10 42.5 Í END1214063 | >100 | >100 | 68.2 | Tarceva + hu8C4 combinado — | 3.24 ] 3.09 | - | Tarceva + hu8C4 x Yectibix scFv | | | 2.35 | 2.42 | - Í Combinado Í | | Í —— 1 — — — | Tarceva + LAIBO combinado — 3,24 4.78 - | Tarceva + INC280 combinado — | 3.06 2.88 - | Tarceva + EMDI214063 combinado | 2. 8 Jo |
[000172]Como resultado, foi identificado que a capacidade inibitória da proliferação de células tumorais do anticorpo biespecífico da presente invenção era mais excelente do que a do hu8C4, Vectibix ou uma terapia combinada de dois anticorpos nos 8 tipos de linha de células tumorais todos.
Além disso, identificou-se que possuía uma capacidade inibitória da proliferação de células tumorais notavelmente excelente nas linhas celulares U-87MG, NCI-H292, BT20 e KP4 quando comparado ao EM1-MAb (Janssen) usado como anticorpo biespecífico de controle.
[000173]Além disso, foi identificado que o hu8gC4 e o hu8gCc4 x Vectibix scFv tinham uma excelente capacidade inibitória da proliferação de células tumorais em comparação com um anticorpo de controle, quando comparados com LA480 (Lilly), OA-5D5 (Genentech) e ADF46 (Samsung), que eram c - Metente os anticorpos alvo nas linhas celulares U-87MG.
[000174]Ainda, Tarceva, um inibidor de tirosina quinase de EGFR na linhagem celular HCC827, mostrou resistência sob condições de processamento de HGF, mas foi identificado que mostrou uma excelente capacidade inibitória da proliferação de células tumorais ao ser processado em combinação com Tarceva, hu8C4, hugC4 x Vectibix scFv ou inibidores de c-Met nessas condições. Exemplo 8. Medição de capacidade de união a ECD (BlAcore)
[000175]Em seguida, para medir a capacidade de ligação do anticorpo c-Met da presente invenção a um domínio extracelular (ECD), a ligação do anticorpo c-Met e do anticorpo biespecífico ao c-Met ECD e EGFR ECD foi medida entre humanos e macacos cynomolgus usando o BlAcore.
[000176]Particularmente, um ECD c-Met humano (ACROBIiosystems, MET- H5227), um ECD c-Met de macaco cynomolgus (SiNo. Biological, 90304- CO8H), uma fita de ECD EGFR humana (ACROBiosystems, EGR-H5285) e um EGFR ECD de macaco cynomolgus (SiNo. Biological, 90285-C08B). foram utilizados. [00017 7]Primeiramente, para capturar um anticorpo anti-c-Met e um anticorpo biespecífico, um anticorpo IgG antichumano específico de Fc (SouthernBiotech, 2047-01) foi fixado a um chip de sensor CM5 no nível de 10000 RU. Os anticorpos foram diluídos em tampão HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM e surfactante P20 a 0,005% (v / v)) a uma concentração de 1 - 2 ug / ml, após o que os anticorpos resultantes foram injetados em um chip CM5 com uma Ig Fc anti-humana fixada a ele a uma taxa de fluxo de 30 u / min por 10-120 segundos e, em seguida, capturados em uma faixa de 150 a 200 RU.
Cada antígeno foi utilizado após ser diluído a 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 e 0,15625 nM, após o que os antígenos resultantes foram injetados sequencialmente a partir de uma concentração mais baixa.
Em seguida, os antígenos resultantes foram injetados a uma taxa de fluxo de 30 u / min por 5 minutos para realizar a ligação.
Então, um tampão de execução foi injetado nele por 10 a 15 minutos para realizar uma dissociação. 15 de Glicina-HCI 10 mM (pH 1,5) foram usados para recuperar o chip.
A velocidade de ligação e dissociação para cada ciclo foi avaliada usando-se um modelo "1: 1 Langmuir binding" no software BlAevaluation versão 4.1, e os dados biacore estão resumidos nas Tabelas 22 e 23. Tabela 22 Medição da afinidade c-Met ECD
Ligação constante | Dissociação- Afinidade ao antígeno hu8C4 | constante | (Ko, 1) ko, 1/MS) | (Ckosr, 1/8) c-Met Humano 6.77 x10 | 2148x10' 3.173 x 107º o o == o Macaco Met | ememetus CPC 7 a6r x 10 | 3.447 x 107 4.616 x 107º | | Dissociação SS A Ligação constante | constante Afinidade ao antígeno | (Ko, 1) kn, Ms) | Corr, 1/s) | —e-Met Humano 8.306 x 10º | 8,301 x 10º 9.993 x 107" see e e | | — Dissociação. hu8C4 x Vectibix scFv tigarSo ronstante-| constante ANA NE SD antígeno | (Ko. MW L Mion. 1Ms) | Corr, 1/8) | “cMetHumano =—Ú0 739 x10 | 20x 10 28x Macaco cynomolgus c-Met a | | TTTXAO | 337x107 4.338 x 107º | Tabela 23
[000178]Medição da afinidade EGFR ECD
Dissacação | Afinidade ao antígeno | Vectibix Ligação constante constante | | (Ko, NM) | (Kon, 1/Ms) (kost, 1/s) | f Humano EGFR | 5.278 x10 | 15x 10º 2.841 x 107º | Macaco cynomolgus EGFR| 9,37 x 10º 1.963 x 10 2.095 x 107º | | Í Dissociação , | hu8C4 x Vectibix scFv | tigação constante constante efa: anNaeno | (Ko, MW) | (ko. 1/Ms) (kost, 1/s) | Humano EGFR | 7.776 x 10º 1.257 x 10 1.617 x 10º | Macacocynomolgus EGFR| 1,424 x 10º | 1,274 x 10º ms 8.942 x 10% |
[000179]Os dados foram utilizados para provar que os anticorpos biespecíficos hu8C4, hu8C4 x Vectibix scFv da presente invenção se ligam ao ECD c-Met de humanos e macacos cynomolgus com excelente afinidade.
[000180]Exemplo 9. Medição de capacidade de união de anticorpo de c-Met a c-Met ECD , EGFR ECD entre diversas espécies animais (ELISA)
[000181]A união do anticorpo c-Met e anticorpo biespecífico ao c-Met ECD e EGFR ECD entre camundongo, macaco cynomolgus e humano foi medida utilizando-se ELISA
[000182]Particularmente, c-Met de camundongo (SiNo. Biological Inc, 50622- MO8H), c-Met de macaco cynomolgus (SiNo. Biological Inc, 90304-C08H), c- Met humano (R&D Systems, 358-MT), EGFR de camundongo (Biological Inc, 51091-MO8H), antígenos de EGFR de macaco cynomolgus (SiNo. Biological, 90285-C08B) e antígenos humanos de EGFR (Abcam, 155639) foram todos divididos em uma placa de 96 poços a uma concentração de 2 u / ml, após o que a placa resultante foi reagida a 4 º C durante a noite. Após ser bloqueado à temperatura ambiente por 1 hora, o anticorpo biespecífico hu8C4 x Vectibix scFv foi diluído sequencialmente na proporção de 1/5 a partir de 100 nM para medir sua capacidade de união em 7 seções de concentração (ou seja, 100 NM, 20 nM, 4 nM, 800 pM, 160 pM, 32 pM e 6,4 pM).
[000183]Após a união do anticorpo biespecífico hu8C4 x Vectibix scFv à temperatura ambiente por 1 hora, o anticorpo conjugado com HRP específico para o fragmento IgG anti-humano, F (ab') 2 (Jackson Immunoresearch, 109- 035-097) foi diluído na proporção de 1 : 2500, após o que o anticorpo resultante reagiu à temperatura ambiente durante 1 hora. Oo desenvolvimento da cor foi feito usando a solução TMB (Sigma, T4444), em que seu valor foi medido a uma densidade óptica de 450 nm e seus resultados por ELISA são mostrados na FIG. 9
[000184]Como resultado, foi identificado que o anticorpo monoespecífico hu8C4 e o anticorpo biespecífico hu8C4 x Vectibix scFv não se uniam a um c- Met e a um EGFR de camundongo, mas se uniam a c-Mets e EGFRs de macaco e humanos. Além disso, foi identificado que um anticorpo IgG humano, usado como um grupo de controle negativo, não se unia. Os resultados acima sugerem que o anticorpo c-Met da presente invenção é específico apenas para c-Mets e EGFRs de humanos e macacos. Exemplo 10. Reatividade cruzada de anticorpo de c-Met a diversos receptores sobre a superfície de células
[000185]A especificidade do anticorpo hu8C4 que se une especificamente ao c-Met de acordo com a presente invenção, bem como sua reatividade cruzada com outros antígenos receptores tirosina quinase, foram analisadas por um método ELISA indireto e 5 antígenos de FGF R3, VEGFR R2, IGF IR, PDGF R e RON foram selecionados dentre os principais receptores tirosina quinases para se realizar análise.
[000186]Neste exemplo, quimera humana c-Met Fc (R&D systems, 358- MT CF), quimera humana FGF R3 (lllc) Fc (R&D systems, 766-FR), IGF-IR humana (R&D systems, 391-GR-050 ), quimera PDGF RB Fc humana (R&D systems, 385-PR CF), quimera VEGF R2 Fc humana (R&D systems, 357-
KD CF) e MSP R/ Ron humana (R&D systems, 1947-MS-050) foram usadas como antígeno.
[000187]Cada antígeno foi diluído em tampão 0,05 M de carbonato- bicarbonato (Sigma, C3041) a uma concentração de 1 pu / ml, após o que o antígeno resultante foi adicionado a cada poço de uma placa de 96 poços (Corning, t 2592), de modo que a placa resultante fosse revestida a 4º C durante a noite. A placa foi lavada uma vez com TBS-T, após o que TBS-T contendo 4% de leite desnatado foi adicionado por 200 ué em cada poço da placa resultante, a fim de inibir uma união não específica, de modo que a placa resultante fosse reagida a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, a placa foi lavada uma vez com tampão TBS-T, após que um anticorpo primário foi diluído sequencialmente em tampão TBS-T contendo 2% de leite desnatado de uma concentração mais alta de 30 nM a 0,002 nM, de modo que o anticorpo resultante foi adicionado por 100 ué em cada poço, reagindo assim a 37 ºC por 2 horas. Após ser lavada três vezes com tampão TBS-T, uma cadeia leve- peroxidase anti-humana kappa (Sigma, A7164) foi diluída na proporção de 1: 5000 como um anticorpo secundário, e a seguir o anticorpo resultante foi adicionado por 100 ué cada poço, reagindo assim a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, após ser lavada três vezes com tampão TBS-T, a solução TMB (Sigma, T4444) foi adicionada por 100 ué em cada poço para realizar uma reação de revelação de cor, após o que a solução de sulfato de amônio 2 N foi adicionada por 50 em cada poço bem para cessar a reação. A densidade óptica foi medida com base em valor no comprimento de onda de 450 nm usando um leitor de microplacas e um comprimento de onda de referência de 570 nm. O grau de união do anticorpo anti-c-Met a cada antígeno foi proporcional ao valor de sinal de densidade óptica, e seus resultados são mostrados na Tabela 24. Tabela 24
[000188]Ligação da especificidade do anticorpo c-Met hu8C4 para vários antígenos [rd mu a a E A [on | es jien e | em | eee | eee | c-Met IGF-IR VEGFR2 (na)
30.000 [2.55 2.51 10.00 [0.00 [0.00 [0.00 | 0.01 | 0.01 [| 0.00 0.01 [0.01 [0.02
1.200 [1.81 / 1.74 10.00 | 0.00 [0.00 [0.00 [-0.01/-0.01/-0.01/-0.01/ 0.00 10.01
0.048 [0.76 0.76 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |-0.01/-0.01/-0.02/-0.01/ 0.00 0.00
[000189]Conforme visto na Tabela 24, o anticorpo hu8gC4 da presente invenção se liga preferencialmente ao c-Met e foi identificado que dificilmente se unia a outros antígenos de FGF R3, VEGFR R2, IGF IR, PDGF R e RON.
[000190]Exemplo 11. Atividade de internalização in vitro de anticorpo de c- Met e atividade inibitória de nível de c-Met do anticorpo biespecífico
[000191]Foi identificado que o anticorpo c-Met da presente invenção possuía atividade de internalização in vitro em células tumorais, bem como efeito na redução de um nível de receptor por um anticorpo biespecífico capaz de se ligar simultaneamente a c-Met e EGFR.
[000192]Primeiramente, ocorre uma internalização de anticorpos por uma atividade fisiológica de um receptor normal, sendo que, quando se liga a um ligante específico, o receptor normalmente expresso nas células externas é ativado por meio de uma homo- ou hetero-dimerização e causa uma endocitose mediada por receptor. Um anticorpo específico para um receptor de uma célula tem capacidade para induzir esse fenômeno e é internalizado na célula causando a endocitose, induzindo assim uma decomposição do receptor, reduzindo o grau de expressão do mesmo e possivelmente inibindo uma transdução de sinal por um determinado receptor. Podem ser detectados vários anticorpos unidos às células externas usando-se um citômetro de fluxo (FACS), encontrando-se assim vários anticorpos internalizados dentro das células. No caso de união de anticorpos usando um anticorpo com união de FITC a um LC kappa anti-humano como anticorpo secundário para que uma cadeia leve de um anticorpo seja medida, é possível medir quantitativamente uma quantidade de anticorpos que não são internalizados, mas permanecem ligando-se a um receptor alvo fora das células, identificando assim uma quantidade de anticorpos internalizados de acordo. É possível medir um ruído de fundo por uma união não específica de um anticorpo usado em um teste usando um anticorpo IgG humano, não específico a um antígeno, medindo assim um sinal fluorescente por uma ligação específica.
[000193]Neste exemplo, uma linhagem celular MKN45 (tt JORBO0254), que era uma linhagem celular de câncer de estômago, foi usada para identificar uma atividade de internalização in vitro do anticorpo c-Met dentro das células tumorais. MKN45 expressa um receptor c-Met em um alto nível por amplificação do gene MET, de modo que uma fosforilação do receptor c-Met seja induzida de uma maneira não dependente de HGF. Foi realizado um teste da seguinte forma para verificar se o receptor c-Met é internalizado em uma célula por um anticorpo anti-c-Met hu8C4, reduzindo assim um nível de expressão.
[000194]Em primeiro lugar, as linhagens celulares de câncer de estômago MKNASB foram divididas em 5,0 x 10 5 em cada poço de uma placa de 6 poços contendo um meio RPMI-1640 (2 ml) contendo 10% (v / v) de FBS, após o qual a placa foi cultivadas sob condições de 37 ºC, RH 95% e 5% CO 2 por 24 horas. O anticorpo anti-c-Met a ser analisado, bem como um anticorpo anti- IgG (grupo controle), foram diluídos para atingir uma concentração final de 100 nM, após o que os anticorpos resultantes reagiram durante a noite. Como uma placa a ser usada como um grupo de controle não internalizado, foi tratado como um anticorpo anti-c-Met e um anticorpo IgG humano (grupo de controle), após o qual a placa resultante reagiu a 4 ºC por 1 hora. Em seguida, as células de cada poço foram coletadas com 1 ml de um tampão de dissociação de células sem enzima (Gibco, ft 13151), após o que as células coletadas foram lavadas duas vezes com um PBS frio. Como anticorpo secundário, o kappa anti-humano LC-FITC (LSBio tt LS-C60539) foi diluído na proporção de 1: 2000, após o que o anticorpo resultante foi adicionado ao mesmo, reagindo assim a 4 ºC por 1 hora. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS, após o que as células resultantes foram fixadas com 100 ué de BD Cytofix (BD, f% 554655) e lavadas uma vez com PBS, de modo que um valor FITC de média geométrica (MFI), um grau de coloração fluorescente, foi medida usando um analisador de células parenquimatosas BD FACS Canto Il. Foi obtida a quantidade de anticorpos unidos a células externas pela fórmula a seguir, cujos resultados são mostrados na Tabela 25.
[000195]Superfície unida Ab(%) = [(MF] [37ºC exp .]- MFI [IgG controle]) / (MFI [4ºC controle] - MFI [IgG controle])] x 100 [Table 25] Tabela 25
[000196]Medição da internalização do controle de anticorpos hu8C4 e AO- 5D5 para linha de célula de câncer de estômago MKN45
Anticorpo DA-SDS hu8C4 FITCMFI [IgG | | Í 127 127 controle ] FITC MFI [4 1763 1444 controle ] FITC MFI [37ºC exp.]l 1724 858 Superfícieligada AB(%) | 98 | 56 |
[000197]Conforme visto na Tabela 25 acima, pode ser demonstrado que OA- 5D5, um anticorpo anti-c-Met usado como grupo de controle, mal foi internalizado nas células, enquanto o anticorpo hu8C4 da presente invenção foi internalizado em cerca de 40% ou mais nas células da linhagem celular de câncer de estômago MKNA45. Ou seja, é mostrado que o anticorpo hu8gC4 reduz notavelmente o nível de expressão do receptor c-Met.
[000198]Em seguida, foi realizado um teste para medir o nível de receptor na linhagem de células de câncer de pulmão NCI-H820, a fim de identificar o efeito de redução do nível de receptor por um anticorpo biespecífico capaz de se ligar simultaneamente ao receptor c-Met e ao receptor EGFR. A linhagem celular NCI-H820 é uma linhagem celular adequada para medir efeito de redução do nível de receptor por um anticorpo biespecífico anti-c-Met x EGFR, pois o receptor c-Met foi expresso em um nível de cerca de 83.000 SABC (anticorpo específico capacidade de ligação) e o receptor de EGFR é expresso em um nível de cerca de 74.000 SABC.
[000199]Primeiramente, as linhagens celulares NCI-H820 foram divididas em 1,0 x 105 em cada poço de uma placa de 6 poços com um meio RPMI-1640 (2 ml) contendo 10% (v / v) de FBS, após o que a placa resultante foi cultivada durante a noite sob condições de 37 ºC, RH 95% e 5% de CO 2 por 24 horas.
Em seguida, foi substituído por um meio isento de soro, após o que a placa resultante foi cultivada durante a noite sob condições de 37 ºC, RH 95% e 5% de CO 2 por 24 horas. Em seguida, um anticorpo anti-c-Met, um anticorpo biespecífico anti-c-Met x EGFR, um anticorpo anti-EGFR e um anticorpo IgG humano como grupo controle, que deveriam ser analisados, foram diluídos e tratados em um meio contendo 2% - FBS para atingir uma concentração final de 10 nM, após o que os anticorpos resultantes foram cultivados por 5 dias. Depois disso, as células de cada poço foram coletadas com 1 ml de um tampão de dissociação celular livre de enzimas, após o que as células coletadas foram lavadas duas vezes com um PBS frio. Posteriormente, IgG- CSF anti-camundongo F (ab) 2 de cabra (R&D Systems Cat. tt FO103B) foi adicionado por 10 ué em cada poço como um anticorpo secundário, reagindo assim a 4 ºC por 1 hora. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS, após o que as células resultantes foram fixadas com 100 ué de BD Cytofix (BD, %& 554655) e lavadas uma vez com PBS, de modo que um valor FITC de média geométrica (MFI), um grau de coloração fluorescente, foi medida usando um analisador de células parenquimatosas BD FACS Canto "1.
[000200]Como resultado, ao tratar um anticorpo anti-c-Met hu8C4, o receptor de EGFR quase não foi diminuído, mas o receptor de c-Met foi notavelmente diminuído para um nível de 2% (FIG. 10). Além disso, o anticorpo anti-=EGFR Vectibix reduziu o receptor de EGFR para um nível de cerca de 83%, mas um receptor de c-Met mal diminuiu. Por outro lado, no caso de tratamento do anticorpo biespecífico hu8C4 x Vectibix da presente invenção, que se unem simultaneamente aos receptores c-Met e EGFR, identificou-se que o receptor EGFR diminuiu para um nível de cerca de 21% e o receptor c-Met diminuiu para um nível de cerca de 4%, respectivamente.
[000201]Assim, identificou-se que o anticorpo biespecífico hu8C4 x Vectibix da presente invenção reduziu notavelmente o nível de expressão dos receptores c-Met e EGFR simultaneamente.
[000202]Exemplo 12. Identificação da atividade inibitória de sinal in vitro de c- Met e EGFR do anticorpo biespecífico
[000203]Em seguida, foi realizada uma experiência usando uma linhagem celular NCI-H820 para identificar o efeito do anticorpo biespecífico da presente invenção na atividade de antígeno e materiais de transdução de sinal.
[000204]Primeiramente, as linhagens de células NCI-H820 foram divididas em uma placa de 6 poços com uma concentração de 5 x 10 5 células por poço, após o que a placa resultante foi cultivada durante a noite sob condições de 37 ºC 5% de CO 2, de modo que fosse substituído por um meio isento de soro e cultivado novamente durante a noite. Um anticorpo foi diluído e tratado em um meio isento de soro a uma concentração de 100 nM, após o que o anticorpo resultante reagiu por 24 horas, de modo que HGF (Gibco, PHGO0254) e EGF (R&D Systems, 236-EG-200) fossem tratados a uma concentração de 50 ng / ml e 10 ng / ml, respectivamente, 15 minutos antes da coleta das células. Em seguida, as células foram dissolvidas em um tampão de dissolução para realizar coleção de células, após o que uma concentração de proteína foi quantificada usando-se um método de ensaio Lowry. 20 ug de proteína foram carregados em cada poço e corridos em SDS- PAGE, após o que a transferência foi realizada em uma membrana de nitrocelulose. Após o bloqueio da membrana, todos os anticorpos primários foram diluídos e reagiram na proporção de 1: 1.000, após o que o anticorpo anti-coelho de união ao HRP foi diluído na proporção de 1: 5.000 e reagiu como células secundárias. Em seguida, os anticorpos absorvidos na membrana foram reagidos com quimioluminescência aprimorada (ECL), após o que os anticorpos resultantes foram medidos usando-se um dispositivo LC-
3000.
[000205]Como resultado, conforme visto na FIG. 11, ao tratar o anticorpo biespecífico hu8C4 x Vectibix scFv, a fosforilação de EGFR, a fosforilação de Erk e a fosforilação de Akt foram notavelmente diminuídas mais do que quando se tratou o anticorpo hu8C4 ou o Vectibix sozinhos.
[000206]Assim, o anticorpo biespecífico hu8C4 x Vectibix scFv da presente invenção pode reduzir a atividade de receptores como EGFR, Erk, Akt etc., e substâncias de transdução de sinal em cascata abaixo na linhagem celular NCI-H820. Como resultado, é mostrado que o anticorpo da presente invenção mostra uma eficácia através de inibição da transdução de sinal.
[000207]Exemplo 13. Identificação da atividade inibitória de proliferação de células tumorais em modelo de camundongo de xenoenxerto MG em U-87
[000208]Foi realizada uma experiência usando-se representativamente hu8C4 IgG2 x Vectibix scFv para identificar a atividade inibidora da proliferação de células tumorais pelo anticorpo biespecífico da presente invenção em um modelo de xenoenxerto de células U-87 MG dependente de HGF.
[000209]Em primeiro lugar, as linhas celulares de glioblastoma humano U-87 MG foram cultivadas em condições de 37 ºC, 5% de CO2, usando um meio EMEM (ATCCO 30-2003 TM) contendo L-glutamina (300 mg / £), HEPES 25 mM NaHCO3 25 mM, 10% de FBS inativado pelo calor e similares. Em seguida, as células U-87 MG foram inoculadas subcutaneamente por 200 ué no flanco de um camundongo nu atímico masculino de 6 a 8 semanas de idade (Harlan) a uma concentração de 1 x 107 por camundongo. Após identificar que o volume tumoral formado em 25 dias após a inoculação atingiu 60 - 130 mm 3, foi realizado um agrupamento, após o qual um material de teste foi administrado por via intraperitoneal uma vez por semana durante 4 semanas (total de 5 vezes: O, 7, 14, 21 e 28 dias). O material de teste foi administrado mg / kg, e um volume de tumor e um peso de camundongo foram medidos duas vezes por semana. Para os dados, uma comparação entre um grupo de controle de excipiente e um grupo administrado por material de teste foi geralmente verificada usando o teste t de Student, e um método estatístico usado foi o programa Origin Pro 8.5. "% De inibição máxima" indica uma% de inibição do crescimento do tumor em comparação com um grupo de controle tratado com solvente.
[000210]Como resultado, um grupo administrado com 3,5 mg / kg e 6,8 mg / kg de hu8C4 IgG2 x Vectibix scFv teve uma inibição máxima de 96% para um volume tumoral em comparação com um grupo controle de solvente, e um grupo administrado com 1,5 mg / kg do mesmo teve uma inibição máxima de 80%, reduzindo assim o volume do tumor para um nível significativo a partir do 7º dia após a administração até o último dia do teste (p <0,01) (FIG. 12). Além disso, quando comparado ao BsAB-01 como um grupo de controle positivo, o anticorpo biespecífico da presente invenção reduziu o crescimento do tumor a um nível significativo (p <0,01). [00021 1]Assim, foi identificado a partir dos resultados acima, que o anticorpo biespecífico da presente invenção reduziu notavelmente o crescimento tumoral, tendo assim uma excelente eficácia antitumoral. Exemplo 14. Identificação da atividade inibitória de proliferação de células tumorais em modelo de camundongo de xenoenxerto NCI-H820
[000212]Linhagem celular NCI-H820, que é uma linhagem celular com treonina (T) do aminoácido EGFR no. 790 modificado em metionina (M) e com um gene MET amplificado, é conhecido como uma linhagem celular resistente de AZD9291 (osimertinib, tagrisso), que é uma terceira geração de EGFR TKI (Darren AE Cross, et al., Cancer Discov. 4 (9): 1046-1061 (2014)). Foi feita uma avaliação em um modelo de xenoenxerto NCI-H820 usando representativamente o hu8C4 x Vectibix scFv dos anticorpos biespecíficos da presente invenção, a fim de observar a atividade inibidora da proliferação de células tumorais do anticorpo biespecífico na linhagem celular NCI-H820 tendo resistência a tal EGFR TKI.
[000213]Particularmente, o camundongo usado neste exemplo foi um camundongo de 6 semanas de idade (Jackson Laboratory, STOCK Hgftm1.1 (HGF) Aveo Prkdescid / J), em que um gene HGF de camundongo foi removido e transformado para expressar um gene humano de HGF. A linha celular NCI-H820 (ATCC, tt HTB-181) foi inserida em um balão para cultura celular juntamente com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS, após o que o balão resultante foi cultivado em condições de 37 ºC, 5% de CO2. Em seguida, as células resultantes foram lavadas com PBS e a tripsina-EDTA a 2,5% (Gibco, 15090) foi diluída 10 vezes, após o que foi adicionada às mesmas para separar as células. Depois disso, uma centrifugação (1.000 rpm, min.) foi realizada para se livrar do sobrenadante e obter uma suspensão celular em um novo meio. Posteriormente, a viabilidade celular foi identificada por um microscópio, após o que as células resultantes foram diluídas em um meio isento de soro a uma concentração de 5,0 x IO 7 células / ml, preparando assim as linhas celulares. As linhas celulares preparadas foram administradas subcutaneamente a um camundongo por uma quantidade de 0,1 ml / cabeça. Após a administração, quando o tamanho de tumor em uma região com linhagens de células transplantadas atingiu cerca de 100-150 mm3, as linhagens de células foram distribuídas para que o tamanho de tumor de cada grupo pudesse ser uniformemente disperso de acordo com tamanho de tumor classificado. Em seguida, a oncogênese foi identificada duas vezes por semana, do 7º dia após o início da administração celular até o 28º dia após o dia de agrupamento (dia do início da administração do material de teste) e após o fechamento da administração do material de teste, após o que o eixo principal do tumor e o eixo menor foram medidos por um paquímetro, calculando-se assim o tamanho do tumor (ab 2/2 (a: comprimento do eixo principal, b: comprimento do eixo menor)). A análise estatística foi realizada por Prism 5.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Se o valor de p fosse menor que 0,05, era considerado estatisticamente significativo.
[000214]Como resultado, em todos os grupos administrados com hu8gCc4 x Vectibix scFv a partir do quarto dia após o início da administração do material de teste até o 28º dia, foi demonstrado que a atividade inibidora da proliferação tumoral era significativamente maior do que o grupo controle com solvente (p <0,001 ) e também foi identificado que uma taxa de inibição do tumor era de no máximo 100% (FIG. 13). Por outro lado, o AZD9291 (Selleckchem), usado como grupo de controle positivo, não mostrou diferença significativa em relação ao grupo de controle de solvente. Exemplo 15. Identificação da atividade inibitória de proliferação de células tumorais in vitro por administração combinada de anticorpo 5G3 c-Met e anticorpo HER2
[000215]Um teste in vitro da atividade inibidora da proliferação celular foi realizado pela linhagem celular NCI-H2170, a fim de avaliar a atividade inibidora da proliferação celular de tumor de acordo com a combinação do anticorpo anti-c-Met 5G3 da presente invenção e anticorpo anti-HER2. A linha celular NCI-H2170 (ATCC tt CRL-5928) é uma linhagem celular tumoral de câncer de células não pequenas (NSCLC), em que, como resultado da medição de seu nível de receptor, o EGFR foi expresso no nível de cerca de
2.700 SABC (capacidade de união a anticorpos específicos), enquanto o c- Met foi expresso no nível de cerca de 11.000 SABC.
[000216]Particularmente, as células NCI-H2170 foram diluídas em um meio de cultura RPMI-1640 contendo 10% (v / v) de FBS, após o que as células resultantes foram adicionadas por 100 ué em uma placa a uma concentração de 3,0 X 10 3 células por poço, para que a placa resultante fosse cultivada sob condições de 37 ºC, 95% de UR e 5% (v / v) de CO 2 por 18 a 24 horas. Em seguida, o meio de cultura de células de cada poço foi removido, após o que um meio RPMI-1640 contendo 2% (v / v) de FBS foi adicionado por 100 ué em cada poço. Depois disso, os anticorpos preparados a 2X de uma concentração final (100 nM) foram continuamente diluídos na proporção de 1/10, de paras que os anticorpos resultante fossem adicionados por 100 ué em cada poço em seis concentrações (ou seja, 200 nM, 20 nM , 2 nM, 200 PM, 20 pM e 2 pM) para cada anticorpo. A placa foi cultivada por 5 dias sob condições de 37 ºC, 95% de UR e 5% (v / v) de CO 2, após o que foram adicionados 20 ué da solução WST-8 (CCK-8, Dojindo) em cada poço no último dia para realizar o desenvolvimento da cor por 1-2 horas, de modo que uma densidade óptica foi medida no comprimento de onda de 450 nm por um leitor de microplacas.
[000217]Os resultados da atividade inibitória da proliferação celular são mostrados na Tabela 26 e na FIG. 14 Tabela 26
[000218]Atividade inibitória da proliferação da célula de tumor in vitro por uma terapia combinada do anticorpo anti-cMet e o anticorpo anti-ER2 Aee. A*X“" = rossegeinibição de profiferação da célula « 1Cso Cnh] Anticorpos NCI-H2170 (NSCLC) | No HGF | HGF SOng/ml — pa A TEM TSM | 5G3 > 100 | > 100 Í | AOBI-FI1 + 5G3 combinado | > 100 | 11.22
[000219]Como visto na Tabela 26, foi identificado que um tratamento combinado de anticorpo 5G3 e A091 (Registro de Patente da Coréia No. 10- 1515535) como anticorpo anti-HER2 apresentava capacidade inibitória da proliferação de células tumorais mais excelente do que um único tratamento de cada anticorpo na linha de células tumorais NCI-H2170.
[000220]Exemplo 16. Identificação da atividade inibitória de proliferação de células tumorais in vivo por administração combinada de anticorpo 5G3 c-Met e anticorpo HER2 em um modelo de camundongo de xenoenxerto NCI-H2170 como linhagem de células cancerosas de pulmão humano
[000221]Foi realizada uma experiência de atividade anticâncer em um modelo de xenoenxerto NCI-H2170 como uma linha celular de câncer de pulmão, a fim de ver uma eficácia combinada do anticorpo HER2 e do anticorpo c-Met.
[000222]Particularmente, neste exemplo, mediu-se o tamanho do tumor de um camundongo pelo mesmo método que o mostrado no Exemplo 14, usando-se o mesmo camundongo que o mostrado no Exemplo 13 acima. Os resultados da avaliação de uma eficácia antitumoral por uma combinação de AO091 e 5G3 em um modelo de camundongo xenoenxerto NCI-H2170 como uma célula de tumor de pulmão são mostrados na FIG. 15.
[000223]Como resultado, no caso da realização de uma única administração de AO91 sozinho ou uma administração combinada de AO091 e 5G3, o volume do tumor foi reduzido para um nível significativo em comparação com um grupo controle de solvente a partir do 14º dia após a administração (p <0,05). Além disso, o grupo administrado com uma combinação de AO091 e 5G3 mostrou diminuição significativa no volume do tumor em comparação com um grupo administrado apenas com AO91 ou um grupo administrado com BsABO2 (US2010 / 0254988 A1) como um anticorpo biespecífico de controle (p <0,01). Exemplo 17. Identificação da atividade inibitória de proliferação de células tumorais em modelo de camundongo de xenoenxerto NCI-H596
[000224]Como a linha celular NCI-H596 era uma linha celular de câncer de pulmão com mutação no exon14 do c-Met, uma avaliação foi feita em um modelo de camundongo xenoenxerto NCI-H596, a fim de identificar um efeito anticâncer do hu8C4 x Vectibix scFv.
[000225]Neste exemplo, o tamanho de tumor de um camundongo foi medido usando-se o mesmo camundongo e o mesmo método, como mostrado no Exemplo 14 acima.
[000226]Os resultados da avaliação de uma eficácia anticâncer após a administração de hu8gC4 x Vectibix scFyv uma ou duas vezes por semana durante um total de 4 semanas em um modelo de xenoenxerto NCI-H596 como uma célula de tumor de pulmão são mostrados na FIG. 16.
[000227]Como resultado da medição do tamanho do tumor, o nível de tamanho do tumor em um grupo administrado com hu8C4 x Vectibix scFv 10 mg / kg duas vezes por semana mostrou uma diferença estatisticamente significativa em comparação com um grupo controle no 11º dia após o início da administração do teste até o final de um experimento, e os níveis de tamanho dos tumores em um grupo administrado com hu8C4 x Vectibix scFv mg / kg duas vezes por semana e em um grupo administrado com hu8gC4 x Vectibix scfv 10 mg / kg uma vez por semana também foram significativamente menores em comparação a um grupo controle a partir do 18º dia após o início da administração do material de teste. Além disso, o tamanho do tumor em um grupo administrado com material de teste teve uma tendência de alteração correlacionada à dose, de acordo com uma dose do material de teste, tendo o tamanho do tumor do grupo de teste sido menor em comparação com um grupo de controle, mesmo após uma último dia de administração de um material de teste (dia 28). Exemplo 18. Identificação da atividade inibitória de proliferação de células tumorais em modelo de camundongo de xenoenxerto EBC-1
[000228]Como o EBC-1 era uma linha celular de câncer de pulmão com uma amplificação do gene c-Met, foi realizada uma avaliação em um modelo de camundongo xenotransplante EBC-1, a fim de identificar um efeito anticâncer do hu8C4 x Vectibix scFv.
[000229]O camundongo usado neste exemplo foi um camundongo-fêmea nua atímica de seis semanas de idade (Harlan). As linhagens celulares EBC-1 (JCRB, %& JCRBO820) foram inseridas em um balão para cultura celular, juntamente com um meio EMEM contendo 10% de FBS, após o que as linhagens celulares resultantes foram cultivadas em condições de 37 ºC, 5%
de CO 2. As linhagens celulares foram preparadas de tal maneira que as linhagens celulares resultantes fossem diluídas em um meio isento de soro a uma concentração de 5,0 x IO 7 células / ml, após o que as linhagens celulares foram administradas subcutaneamente em um camundongo por uma quantidade de 0,1 ml /cabeça. Quando o tamanho de tumor em uma região com linhagens celulares transplantadas atingiu cerca de 100 - 150 mm3, o hu8C4 x Vectibix scFv foi administrado uma ou duas vezes por semana durante um total de 4 semanas, após o que o tamanho do tumor do camundongo foi medido pelo mesmo método que o mostrado no Exemplo 14.
[000230]Os resultados da avaliação da eficácia anticâncer por hugC4 x Vectibix scFy em um modelo de xenoenxerto EBC-1 como célula de câncer de pulmão são mostrados na FIG. 17.
[000231]Como resultado da medição do tamanho do tumor, o tamanho do tumor em um grupo administrado com hu8C4 x Vectibix scFv 10 mg / kg duas vezes por semana mostrou uma diferença estatisticamente significativa em comparação com um grupo controle a partir do 7º dia após o início da administração do teste até 56 dias após o início da administração do material de teste. Um grupo administrado com hu8C4 x Vectibix scFv 5 mg / kg duas vezes por semana e um grupo administrado com o mesmo uma vez por semana mostraram um nível baixo significativo em comparação com um grupo controle a partir do 18º dia após o início da administração do material de teste. Além disso, o tamanho do tumor em um grupo administrado com material de teste teve tendência de alteração correlacionada à dose, de acordo com a dose do material de teste. O tamanho de tumor em um grupo administrado com hu8gC4 x Vectibix scFv 10 mg / kg duas vezes por semana durante período de observação após o último dia (dia 28) da administração de um material de teste foi significativamente baixo em comparação com um grupo controle até um 56º dia após o início da administração do material de teste. Em particular, verificou-se que um indivíduo em um grupo administrado com hu8C4 x Vectibix scFv 10 mg / kg duas vezes por semana teve uma resposta completa no 18º dia após o início da administração do material de teste.
[000232]Exemplo 19. Efeito da redução de c-Met e EGFR na superfície de células cancerosas pelo anticorpo biespecífico
[000233]O efeito de redução de c-Met e EGFR na superfície de células tumorais, in vitro, pelo anticorpo biespecífico (hu8C4 x Vectibix scFv) da presente invenção foi identificado e comparado com um efeito do anticorpo c- Met (hu8C4) da presente invenção, de vectibix, da combinação c-Met/eGFR e de outros anticorpos.
[000234]Um receptor geralmente localizado em uma membrana celular foi internalizado em uma célula quando ligado a um anticorpo, de modo que uma quantidade dele na membrana celular foi diminuída. Uma diminuição no receptor em tal membrana celular causa uma inibição da ativação do receptor e uma diminuição em um sinal a jusante do mesmo, por uma ligação de ligante.
[000235]Neste exemplo, foi usada a linhagem HCC827, de células de adenocarcinoma pulmonar, para observar a diminuição no c-Met e EGFR em uma membrana celular. HCC827 tem uma mutação de deleção (EGFR E746- A7T50) e superexpressa c-Met. HCC827 foi tratada com o anticorpo biespecífico (hu8C4 x Vectibix scFv) da presente invenção e com outros anticorpos, após o que foi realizada sua coloração de imunofluorescência por um anticorpo específico para c-Met e EGFR, de modo que o resultado fosse analisada com um FACS (analisador de células ativadas por fluorescência ou citômetro de fluxo) e, assim, medida a quantidade de c-Met e EGFR na superfície das células. Um método detalhado é o seguinte:
[000236]Em primeiro lugar, células HCC827 (ATCCO CRL-2868 TM) foram cultivadas a 37ºC, RH 95% e 5% de CO?2 por 24 horas, sendo 3,0 x 105 células em cada poço de uma placa de 6 poços, todos contendo meio RPMI-1640 (2ml) com 10% (v/v) FBS. Depois disso, (foram adicionados aos diferentes poços) o anticorpo biespecífico (hu8C4 x Vectibix scFv) da presente invenção,
o anticorpo c-Met (hu8gC4) da invenção atual, vectibix, uma mistura do anticorpo c-Met (hu8C4) da invenção atual e vectibix, C-EM1 e LA480, todos diluídos para uma concentração final de 100 nM, e deixados para reagir por 18 horas. Como placa usada como grupo controle não-decrescente com c- Met e EGFR, um anticorpo IgG humano foi tratado e reagiu por 18 horas. Em seguida, as células de cada poço foram coletadas em 500 ul de um tampão de dissociação celular livre de enzimas (Gibco, f13151) e depois foram separadas do tampão por uma centrifugadora, de modo que o tampão foi removido. Para a imunofluorescência, um anticorpo c-Met derivado de cabra (sistemas de I&D, AF276), um anticorpo EGFR derivado de cabra (sistemas de I&D, AF231) e um anticorpo derivado de cabra não específico, diluídos 2 upg/200 ul de PBS frio, contendo 2% (v/v) FBS, foram usados em cada poço, reagindo a 4ºC por 1 hora. Em seguida, a placa resultante foi lavada duas vezes com um PBS frio contendo 2% (v/v) FBS. ALEXA488 foi unido como um anticorpo secundário e depois1 ul de um anticorpo derivado de burro (Thermo Fisher, A-11055) ligado a um anticorpo de cabra, diluídos com 200 ul de um PBS frio contendo 2% (v / v) FBS foram usados. Depois de reagirem com o anticorpo secundário a 4ºC por 1 hora, as células resultantes foram lavadas duas vezes com um PBS frio contendo 2% (v/v) FBS e depois fixadas usando 200 ul de BD Cytofix (BD, tt554655). Depois de ser lavado uma vez com PBS, o valor médio de ALEXA488 (IFM), um grau de coloração fluorescente, foi medido usando um fotômetro de fluxo BD FACS Canto Il. À quantidade de c-Met e EGFR localizado na membrana celular foi indicada pela intensidade de fluorescência média (IFM) pela fórmula a seguir. No que diz respeito aos valores obtidos, após três repetições do teste, o desvio médio e o padrão são mostrados na Tabela 27 e FIGS. 18 e 19.
[000237]c-Met ou EGFR quantidade na superfície = média IFM [grupo experimental] — média IFM [anticorpo derivado de cabra não específico] Tabela 27
[000238]Quantidade do c-Met e EGFR na superfícies das células medidas após tratamento da linha de célula HCC827 com anticorpo biespecifico (hu8C4 x Vectibix scFv), etc. | e-Met | EGFR ] f T T T ] Anticorpo tratado | Significa Significa | | S.D. | SD. | (geo MFI) (geo MFI) Humano TgG | 5653 | 1032 | 119 3276 | | hu8CA | 3486 | 82 | 11598 3448 | Vectibix | 5653 1309 10326 3256 | huBC4 + Vectibix combinado | 3551 | 107 | 1011 | 2932 | | hu8C4 x Vectibix scFv | 1689 321 9930 3305 C-FM1 | 3665 | 878 | 11503 3715 | - + d i À C-LA480 | 3267 764 11655 4156
[000239]Como visto na Tabela 27 acima, todos os anticorpos que se ligam ao c-Met diminuíram c-Met na superfície das células em 40-70%, enquanto os anticorpos que se ligam ao EGFR mostraram um efeito insignificante de diminuir em 10 - 15%. Além disso, considerando o efeito de redução de c-Met, hu8C4, combinação de hu8gC4 + Vectibix, C-EM1 e C-LA480 diminuíram c- Met na superfície das células em cerca de 40% ou mais, enquanto hu8gC4 x Vectibix scFv diminuiu c-Met na superfície das células em 70%, mostrando assim um mais excelente efeito de reduzir c-Met na superfície das células do que outros anticorpos ou que uma combinação de anticorpos.
[000240]Os resultados acima mostram que o anticorpo biespecífico (hu8C4 x Vectibix scFv) da invenção atual diminui notavelmente a quantidade de c-Met na superfície das células. Exemplo 20. Mapeamento de epítopo
[000241]Para descobrir um epítopo do anticorpo biespecífico (hu8C4 x Vectibix scFv) da presente invenção em um antígeno c-Met humano, sua análise foi encomendada à equipe de suporte ao projeto de modelo de molécula da Osong Medical Innovation Foundation (KBIO, Coréia). A análise foi realizada por espectrometria de massa de troca hidrogênio-deutério (HDX- MS).
[000242]O domínio sema c-Met consiste de duas cadeias a / E, identificando assim cada cobertura para as duas cadeias. Devido à presença de várias ligações dissulfeto em uma amostra, a cobertura peptídica foi otimizada ajustando-se o tempo de espera de parada, a concentração de TCEP, a concentração de pepsina etc. Finalmente, um experimento foi realizado sob condições de tampão de parada com 100 mM K. Fosfato, 125 mM de TCEP, 0,5 M de Guanidina-HCI e pH 2,66.
[000243]Antígenos e anticorpos foram preparados a uma concentração de 3,3 mg / ml e 65 mg / ml, respectivamente, e 37 pmol de antígenos cMET e 36 pmol de anticorpos foram ligados 3 horas antes da experiência. Um tampão de marcação de deutério foi reagido por O, 0,33, 10, 60 e 240 minutos. À marcação foi interrompida com um tampão de resfriamento de acordo com cada tempo de marcação e o vórtice foi realizado, após o que foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido, sendo armazenados a -80 ºC antes da análise. Os antígenos e anticorpos resultantes foram carregados em uma coluna de pepsina e analisados com um espectrômetro de massa (MS).
[000244]Como resultado da análise, foi identificado que o anticorpo biespecífico (hu8C4 x Vectibix scFv) da presente invenção se liga a uma forma tridimensional de epítopos em 4 regiões de Y321 - L329 (SEQ. No. 331), 1333 - 1341 (SEQ. Nº 332), P366 - D372 (SEQ. N º 333) e Q464 - S474 (SEQ. Nº 334) de uma cadeia B do domínio sema c-Met humano (Tabela 28). Uma marcação foi realizada em uma estrutura terciária de um antígeno c-Met humano (PDB No. 4K3J) usando-se u
[000245]m programa PyMOL, cujos resultados são mostrados na FIG. 20 Tabela 28 Sequência de aminoácido da região epítope Região epítope Sequência de aminoácidos =| — SEQ ID NO Eanes == sarau anna a ba sena Y321-L329 YVSKPGAQL | 331 | 1833131 | IGSINDDEO | 3323 | P366-D372 PIKYWND | 333 QI6G4-SATA | = QWVWSRSGPST | 334
[000246]A partir dos resultados acima, pode ser observado que anticorpo de camundongo, anticorpo humanizado, anticorpo otimizado por afinidade ou antígenos unindo-se a fragmentos dos mesmos da presente invenção, especificamente unindo-se ao c-Met, atuam seletivamente no c-Met, sendo que apresentam excelente atividade inibitória da proliferação de células cancerígenas, bem como atividade anticâncer notavelmente excelente, mesmo em uma pequena quantidade, prevenindo ou tratando efetivamente o câncer.
[000247]Embora porções específicas da presente invenção tenham sido descritas em detalhes acima, fica aparente para os especialistas na matéria que essas descrições detalhadas são estabelecidas para ilustrar apenas configurações de exemplo, não devendo ter caráter limitativo ao escopo da presente invenção. Assim, deve ficar entendido que o âmbito substancial da presente invenção é definido pelas reivindicações e equivalentes que acompanham o presente documento.

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo, caracterizado por especificamente unir-se a um receptor do fator de crescimento do hepatócito humano (c-Met).
2. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo unir-se a uma ou mais regiões de epítopo representadas por uma sequência de aminoácidos consistindo de SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333 and SEQ ID NO: 334.
3. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo unir-se a um c-Met humano por K D de 1 X 10-7, em que o K D é medido por análise de ressonância de plasmon (Biacore).
4. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo ser:(a) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 1; CDR2 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 2; CDR3 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo um CDR1 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 7; CDR2 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 8; e CDR3 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 9; (b) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 4; CDR2 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 5; CDR3 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 6, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 10; um CDR?2 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 11; e um CDR3 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 12; ou (c) anticorpos de afinidade otimizada dos mesmos.
5. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o anticorpo compreender:(a) uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 15; ou (b) uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 16.
6. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o anticorpo compreender:(a) uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 23; (b) uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 24; (c) uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 29 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 31; ou (d) uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 30 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 32.
7. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo compreende uma região de dobradiça representada por um entre SEQ ID NO: 37 até SEQ ID NO: 44.
8. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo de atividade otimizada ser um anticorpo em que ao menos uma sequência de aminoácidos é substituída a partir de um anticorpo conter uma região variável de cadeia leve compreendendo um CDR1 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 1; um CDR?2 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 2; um CDR3 de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia pesada CDR1 representada por SEQ ID NO: 7; um CDR?2 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 8; um CDR3 de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 9, e onde, (i) G na 1º posição da cadeia leve CDR1I é substituído por A, E, K L, N, R, S, V ou W; A na sua 2º posição é substituído por C, G, |, P, S, Tou V; S na sua 3º posição é substituído por G, M, N, P, Q, R, S ou T; E na sua 4º posição é substituído por A, D,/ FE, G, H K M Q,R,S, T ou V; N na sua 5a posição é substituído por A, D, E, G, K L, PR, O, RS, T ou V; | na sua 6º posição é substituído por A, F, L, M, O, R, S, Tou V; Y na sua 7º posição é substituído por F, H, R ou V; ou G na sua 8º posição é substituído por D, F, H, M, N, R, S, T ou V; (ii) G na 1º posição do CDR2 de cadeia leve é substituído por D, F, H, K, P, OQ, S, Vou Y; T na sua 3º posição é substituído por Q; ou N na sua 4º posição é substituído por G; (iii) Q na 1º posição do CDR3 de cadeia leve é substituído por E, G, |, M ou N; N na 2º posição é substituído por A, D, E, H, L, Q, S ou T; V na sua 3º posição é substituído por |, L, M, N, Q, S ou T; L na sua 4º posição é substituído por F, H, I, M, R, S, V, Wou Y; S na sua 5º posição é substituído por C, D,/ E, F, G, H, K, L, N, OQ, R, T, Vou Y; S na sua 6º posição é substituído por D, E, F, G, H, 1, L, M, N, P, OQ, RT, Vou Y; P na sua 7? posição é substituído por A, D, E, G, N, Q, Sou V; Y na 8º posição é substituído por E, F, L, M ou Q; ou Tem sua 9º posição é substituído por D, F, G, Il, L N, S, V, W ou Y; (iv) D na 1º posição do CDR1 de cadeia pesada é substituído por G ou Q; Y na sua 2º posição é substituído por Q; ou | na 4º posição é substituído por A ou Q;
(v) F na 3º posição do CDR2 de cadeia pesada é substituído por D, E, W ou Y; G na sua 5º posição é substituído por D, H ou Y; S na 6º posição é substituído por F, P, W ou Y; G na 7º posição é substituído por A, F, L, N ou T; N na sua 8º posição é substituído por F, P, S, Tou Y; T na sua 9º posição é substituído por A, D, E, F, G, H, L, P, S ou V; H na sua 10º posição é substituído por A, D, E, M, R, S, T, V, W ou Y; F na 11º posição é substituído por G, H, I, L, M, N, P, Q, Vou Y; S na sua 12º posição é substituído por A, D, G, HI, L, P, Tou V; A na sua 13º posição é substituído por D, E, FE, G, H, |, K, L, M, P, R, S, T, Vou Y; R na 14º posição é substituído por A, E, G, H, L, N, P, Q, S, W ou Y; F na sua 15º posição é substituído por D, E, G, L M, P, R, S, V ou W; K na sua 16º posição é substituído por A, E, FE, G, HA L R, S,T,
V ou Y; ou G na sua 17º posição é substituído por E, E, HH L MN,P, Q,R,S, T, V ou W; ou (vi) G na 1º posição do CDR3 de cadeia pesada é substituído por E, F, H, N, Q, V ou W; D na sua 2º posição é substituído por E; Y na sua 3º posição é substituído por L, Q, T ou V; G na sua 4º posição é substituído por W; F na sua 5º posição é substituído por L ou Y; L na sua 6º posição é substituído por Q, S ou Y; ou Y na sua 7º posição é substituído por C, L, M, N ou Q, onde o CDR1 de cadeia leve compreende O a 5 substituições, o CDR2 de cadeia leve compreende 0 a 1 substituição, o CDR3 de cadeia leve compreende 0 a 7 substituições, o CDR1 de cadeia pesada compreende O a 1 substituição, o CDR?2 de cadeia pesada compreende O a 11 substituições e o CDR3 de cadeia pesada compreende O a 6 substituições.
9. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo de atividade otimizada compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 representado por qualquer um entre SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO: 229 até SEQ ID NO: 268; um CDR?2 de cadeia leve representado por qualquer um entre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 182 até SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 227 e SEQ ID NO: 228;jum CDR3 de cadeia leve representado por qualquer um entre SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 142 até SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 191 até SEQ ID NO: 226 e SEQ ID NO: 269 até SEQ ID NO: 301; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo um CDR1 de cadeia pesada representado por qualquer um entre SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 108 até SEQ ID NO: 112; um CDR?2 de cadeia pesada representado por qualquer um entre SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 54 até SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72 até SEQ ID NO: 107 e SEQ ID NO: 118 até SEQ ID NO: 141; um CDR3 de cadeia pesada representado por qualquer um entre SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 64 até SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 113 até SEQ ID NO: 117.
10. Anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o anticorpo de atividade otimizada compreender uma região variável de cadeia leve representada por qualquer um entre SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 306 até SEQ ID NO: 311, e uma região variável de cadeia pesada representada por qualquer um entre SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 302 até SEQ ID NO: 305.
11. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o anticorpo de atividade otimizada compreender (a) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 302; (b) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 305; (c) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 310 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 23; (d) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 308 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 305; (e) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 306 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 303; (f) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 307 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 304; (9) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 308 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 304; (h) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 309 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 304; (i) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 311 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 304; ou (]) uma região variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 306 e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 302
12. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o anticorpo Ainda especificamente unir-se a um receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR).
13. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo que se une ao EGFR ser unido ao terminal de cadeia leve ou de cadeia pesada do anticorpo específico para c-Met.
14. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o antígeno unindo-se a fragmento que se une ao EGFR ser Fab, Fab', F(ab') 2 or Fv.
15. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o antígeno unindo-se a fragmento que se une ao EGFR ser Fab, Fab', F(ab') 2 or Fv.
16. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por scFv de Erbitux compreender uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 313 ou SEQ ID NO: 314.
17. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o scFv de Vectix compreender uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:
315.
18. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo ser unido por um conector representado pela SEQ ID NO: 312.
19. “ANTICORPO OU ANTÍGENO” unindo-se a fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o antígeno unindo-se a fragmento do mesmo ser Fab, Fab', F(ab') 2 or Fv.
20. “MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO CODIFICANDO O ANTICORPO OU ANTÍGENO” caracterizado por unir-se a fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19.
21. “VETOR DE EXPRESSÃO” caracterizado por compreender a molécula de ácido nucléico da reivindicação 20.
22. “CÉLULA HOSPEDEIRA” caracterizado por possuir o vetor de expressão introduzido dentro da mesma de acordo com reivindicação 21.
23. “MÉTODO PARA PRODUZIR ANTICORPO OU ANTÍGENO” caracterizado por unir-se a fragmento do mesmo, utilizando a célula hospedeira da reivindicação 22.
24. “COMPOSIÇÃO PARA DETECTAR C-Met”, caracterizado por compreender o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
25. “KIT PARA DETECTAR C-Met”, caracterizado por compreender a composição para detectar c-Met da reivindicação 24.
26. “MÉTODO PARA DETECTAR ANTÍGENO DE C- Met” caracterizado por utilizar o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
27. “COMPOSIÇÃO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE CÂNCER”, caracterizado por compreendendo o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
28. “COMPOSIÇÃO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE CÂNCER”, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o anticorpo ou antígeno unir-se a fragmento do mesmo unir-se ao c-Met de modo a inibir a atividade receptora.
29. “COMPOSIÇÃO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE CÂNCER”, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o anticorpo ou antígeno unindo-se a fragmento do mesmo unir-se ainda EGFR de modo a inibir a atividade receptora.
30. “COMPOSIÇÃO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE CÂNCER”, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o câncer ser causado por superexpressão, amplificação, mutação ou ativação de c-Met.
31. “COMPOSIÇÃO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE CÂNCER”, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o câncer ser selecionado do grupo constituído por: câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer retal, câncer de mama triplo negativo (TNBC), glioblastoma, câncer de pâncreas, câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de cérebro , câncer uterino, solenoma, câncer de tireóide, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, mieloma, mieloma múltiplo, melanoma, linfoma e câncer do córtex adrenal.
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