WO2019105492A1 - Anticuerpos de afinidad incrementada por el receptor del factor de crecimiento epidérmico y sus fragmentos derivados - Google Patents

Anticuerpos de afinidad incrementada por el receptor del factor de crecimiento epidérmico y sus fragmentos derivados Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the branches of Biotechnology and Medicine, particularly with variants of the monoclonal antibody (mAb) nimotuzumab and antigen-binding fragments derived therefrom which have mutations in the CDR1 and CDR2 of the variable region of the heavy chain and that recognize the extracellular region of the human epidermal growth factor receptor (EGFR) with greater affinity, as well as its diagnostic and therapeutic application.
  • mAb monoclonal antibody
  • EGFR human epidermal growth factor receptor
  • EGFR is a transmembrane glycoprotein, which has an extracellular region of ligand binding, and an intracellular region with tyrosine kinase activity. Its ligands include: epidermal growth factor (EGF), amphiregulin, transforming growth factor, betacellulin, epiregulin, and EGF-like growth factor with heparin binding site. (Olayioye, My others, The EMBO Journal, 19: 3159-3167, 2000, Yarden, Y. and Sliwkowski, M., Nature Reviews, 2: 127-137, 2001).
  • Nimotuzumab is a humanized mAb of IgG1 isotype that recognizes human EGFR, was obtained by DNA cloning of the hypervariable regions of the mouse mAb ior egf / r3 and the frames of the variable regions and constant regions of the heavy and light chains of human origin (REI and NEWN, respectively) (Mateo, C. et al., Immunotechnology 3: 71 -8 1, 1997).
  • AcM R3 recognizes EGFR with similar affinity and has the same ability to inhibit EGF binding to the receptor as its mouse predecessor. This variant is less immunogenic than the chimeric version of mAb ior egf / r3 (Mateo, C.
  • Nimotuzumab recognizes an epitope in domain III of the extracellular region of EGFR that overlaps with the binding site of ligands in this domain, which explains its ability to block ligand binding and subsequent receptor activation (Tundidor, Y. and others, mAbs 6: 1013-1025, 2014).
  • the efficacy of nimotuzumab has been demonstrated in clinical trials, in patients with head and neck tumor (Crombet, T. et al., J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004), glioma (Ramos, T. et al. Ther 5: 375-379, 2006, MacDonald, T.
  • nimotuzumab has not shown the signs of severe toxicity usually associated with drugs directed against this Ag.
  • the maturation of the affinity of the Acs is a process that occurs naturally; and with the development of combinatorial biology, this phenomenon has been reproduced in the laboratory.
  • These technologies of directed evolution require different steps: mutation, presentation, selection and amplification (Wark, K. and Hudson, P., Advanced Drug Delivery Reviews, 58: 657-670,2006).
  • the phage display technology provides a powerful platform for the generation of new human Acs and for improving its affinity in vitro (Hoogenboom, H., Nat Biotechnol, 23: 1 105-1 1 16, 2005).
  • the inventors of the present invention found mutated variants of nimotuzumab presented on phages, with an increase in their ability to bind to the extracellular region of human EGFR.
  • the novelty of this invention is to provide new fragments and mAbs that recognize human EGFR with a higher affinity (between 3 and 4 times), so they can more efficiently recognize nimotuzumab, lines with medium expression of EGFR. Also, these mAbs showed a greater capacity to inhibit the phosphorylation of EGFR mediated by the ligand compared with nimotuzumab, which indicates that they have a greater antitumor effect than nimotuzumab. All of the above allows the use of these fragments and mAbs in the diagnosis or therapy of tumors with average expression of EGFR.
  • the present invention relates to recombinant MAbs that recognize the extracellular region of the human EGFR Heri and that have more than 95% identity with respect to the nimotuzumab antibody.
  • CDR2 complementarity determining region (CDR) of the variable region of the heavy chains are selected from the group comprising:
  • the CDR1 and CDR3 sequences of the heavy chains are SEQ ID NO. 9 and SEQ ID No. 3 respectively and the CDR sequences of the variable region of the light chains are:
  • the recombinant mAbs of the present invention are characterized in that the CDR2 sequence of the variable region of the heavy chains is selected from the group comprising:
  • the sequence of CDR1 is SEQ ID NO. 9 and the CDR3 sequence is SEQ ID No. 3 in said heavy chains and the CDR sequences of the variable region of the light chains are:
  • Another embodiment of the present invention relates to MAbs where the CDR2 sequence of the variable region of the heavy chains are selected from the group comprising:
  • the CDR1 and CDR3 sequences of the heavy chains are SEQ ID NO. 1 and SEQ ID No. 3 respectively and the CDR sequences of the variable region of the light chains are:
  • the MAbs of the present invention are characterized in that the sequence of the CDR1 of the variable region of the heavy chains are selected from the group comprising:
  • the CDR2 and CDR3 sequences of the heavy chains is SEQ ID NO. 14 and SEQ ID No. 3 respectively and the CDR sequences of the variable region of the light chains are:
  • the present invention relates to an MAb characterized by having the following variable region sequence of heavy and light chains:
  • the present invention encompasses all previous mAbs where the framework regions (FW) of the variable region of the heavy and light chains have the following sequences:
  • the disclosed Acs comprises the human IgG1 constant regions for the heavy chain and human kappa for the light chain.
  • fragments derived from the previous Acs where said fragments can be of Fab type, (Fab) 2 and fragments of variable region of single chain.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition useful in cancer therapy having as an active principle the mAbs or fragments disclosed in a range of 50-400 mg and a pharmaceutically acceptable carrier. Additionally, it is related to a pharmaceutical composition useful in the diagnosis of tumors whose active principle is the MAbs or fragments disclosed in a range of 1-9 mg and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the present invention relates to the use of mAbs and fragments disclosed in the therapy of tumors expressing EGFR; as well as in the diagnosis of tumors bearing EGFR, when they are conjugated to an appropriate marker. It is also related to the use of these mAbs and fragments to direct the immune response against EGFR positive tumors, when they are conjugated with proteins or protein domains of immunological interest.
  • the present invention relates to 13 fragments derived from nimotuzumab that share more than 97% identity with the amino acid sequence thereof and have increased ability to bind to the extracellular region of human EGFR. Mutations of the variants described in the present invention lead to the obtaining of variants of nimotuzumab with the ability to recognize a greater number of human cells with medium expression of EGFR compared with the original Fab of nimotuzumab.
  • the fragments described in the present invention can be obtained by selecting mutated variants of nimotuzumab Fab by virtue of their ability to bind to the extracellular region of human EGFR, from libraries of more than 10 7 molecules presented on filamentous phages. Genes corresponding to these variants can be inserted into phagmoid type expression vectors (fused to one of the genes coding for the capsid proteins of filamentous phages) and used for the production of viral particles that expose protein variants on their surface.
  • the libraries of departure can include different degrees of diversification in a set of positions of the regions determining complementarity (CDR), which would allow a thorough exploration of this region functionally important for the Ag-Ac interaction.
  • Each of the original residues in these positions can be replaced by a mixture of the 20 amino acids, by a pre-defined set of residues that share some physical-chemical property (s) such as hydrophobicity, aromatic character , net charge and / or size, or be submitted to soft randomization by introducing a minority proportion of a random mixture of nucleotides at each corresponding codon position (which would retain a predominance of the original sequence).
  • the chosen positions can be diversified simultaneously in the same library, or in several separate libraries. These libraries can contain variable proportions of molecules with one or several mutations, conservative or not, with respect to the Fab of the original nimotuzumab.
  • the selection of phage presenting variants with increased binding capacity to the extracellular region of human EGFR can be based on the incubation of phage mixtures from libraries in contact with human EGFR Ag immobilized on a solid surface, the elimination of phages not bound by washing, and the elution of bound phages under conditions that interfere with protein interactions. Several successive cycles of selection can be made under similar conditions.
  • the analysis of the DNA sequences inserted in the selected phagomidia may reveal regularities that lead to the identification of those more abundant substitutions and potentially related to the increase of EGFR binding capacity.
  • the recurrent mutations found, whether individual modifications or combinations of changes selected directly from the libraries, can be combined with each other in new variants to obtain additional increases in EGFR binding capacity.
  • binding capacity to the human EGFR of each of the variants selected directly from the libraries, or designed and constructed later, can be evaluated by immunochemical techniques taking advantage of the phage display format that allows the simultaneous characterization of multiple variants.
  • fragments of the present invention can be obtained by exploiting other platforms of combinatorial biology, such as presentation on ribosomes or yeasts.
  • the genes coding for the new variable regions can be cloned into expression vectors of mammalian cells and recombinantly produce the complete mAbs containing the new mutations. It can also be verified that in this format, the obtained mAbs retain the ability to recognize more the extracellular region of human EGFR compared with nimotuzumab, through affinity measurements based on surface plasmon resonance (BIAcore).
  • each of the fragment variants selected directly from the libraries or subsequently constructed in the form of fragments or complete Acs can be demonstrated in in vitro or in vivo assays.
  • the recognition of cell lines with different expression of EGFR can be evaluated by means of flow cytometry, verifying that the new variants recognize a higher percentage of positive cells and with a higher mean intensity of fluorescence; and this effect is more evident in lines with medium or low EGFR expression.
  • cell lines can be used with:
  • EGFR squamous cell carcinoma of human origin A431, breast adenocarcinoma with pleural fluid metastasis of human origin MDA-MB-468, without being limited thereto.
  • EGFR small cell lung cancer of human origin U1906, breast adenocarcinoma of human origin MDA-MB-231, SKOV3 ovarian carcinoma, SKBR3 breast carcinoma, without being limited thereto.
  • each mAb or fragment For each mAb or fragment, one can also evaluate the ability to inhibit the phosphorylation of EGFR mediated by its ligand (EGF), at different concentrations and in cell lines with different expression of EGFR. Proliferation inhibition assays can also be performed by Alamar blue in lines with different expression of the receptor. Additionally, the ability of each mAb to induce Ac-dependent cellular cytotoxicity can be determined in lines with different receptor expression. In all cases it could be expected that the higher affinity variants had a greater effect and that it was more evident in lines with medium or low expression of EGFR.
  • EGF ligand
  • the antitumor effect of the mAbs or fragments in athymic mice carrying human tumors with different expression of EGFR could be measured, where the delay in tumor growth would be measured.
  • fragments or mAbs with radioactive isotopes or with fluorophores can be marked and inoculated in athymic mice carrying human tumors with different expression of EGFR. This allows us to evaluate the ability of the fragments to detect in vivo the recognition of tumors, which corroborates their use as tools for the diagnosis of cancer by obtaining images.
  • the new mAbs and fragments obtained in the present invention have a higher affinity than nimotuzumab, which makes it possible to use them in scenarios where nimotuzumab has limitations, as in the case of cells with low or medium expression of EGFR.
  • Said mAbs may have application in the treatment of patients with head and neck tumors, glioma, esophagus, lung and pancreas.
  • the mAbs and fragments must be administered to a subject carrying the disease independently or in combination with conventional therapies for the treatment of cancer such as radiotherapy or chemotherapy, so that they enhance its therapeutic action.
  • the route of administration may be any of those described in the state of the art for the parenteral administration of drugs, preferably by intravenous or subcutaneous route.
  • the mAbs and fragments of the present invention should be administered in doses that are in the range of concentrations for which they have an antitumor effect without toxic manifestations.
  • the ranges of doses to be explored can vary between 50 mg - 400 mg per patient in 6 weekly cycles of treatment. Treatment with the new variants with higher affinity could be adjusted to lower doses and maintain an effect similar to that of nimotuzumab or the recommended dose for nimotuzumab (200 mg) could be used, showing a greater antitumor effect, which would depend on the toxicity profile of the new MAbs and fragments.
  • the mAbs and fragments of the present invention may have application for the diagnosis of EGFR positive tumors by conjugating them with radioisotopes or fluorophores; because they have greater affinity and ability to recognize cells with median or low expression of EGFR have an advantage over nimotuzumab in the diagnosis of tumors with this feature.
  • these mAbs and fragments would be administered in tumor-bearing patients to identify the location of the tumor or possible EGFR positive metastases by imaging.
  • the mAbs and fragments conjugated to radioisotopes or fluorophores should be administered in doses that are in the range of concentrations for which the kinetics of distribution in tissues and their elimination make it possible to obtain fast quality images. This range can be 0.5 mg - 9 mg per patient, preferably 3 mg.
  • fragments described in the present invention can be fused to proteins or protein domains of immunological interest, with the aim of directing the immune response to EGFR positive tumor cells.
  • This application has the advantage of combining the potentiality of both therapies separately by concentrating the response in the tumor site; Fab fragments provide specificity for tumor cells that express Ag, while proteins or fused protein domains play their immunological role, which could have an effect superior to that of monotherapies.
  • compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to: saline, phosphate buffered saline, and the like. Other buffering agents, dispersing agents, and non-toxic inert substances suitable for administration to a patient may be included in the compositions of the present invention.
  • the compositions are usually sterile and free of undesirable particles.
  • Figure 1 Evaluation by ELISA of the recognition of FabR3 presented on filamentous phages. The different preparations of purified phages were adjusted to an equivalent concentration of 10 12 viral particles / ml. Absorbance was measured at 490 nm.
  • Figure 2. Evaluation by ELISA of the reactivity of the phage mixture of the FabR3 library after three rounds of selection against the extracellular region of human EGFR. The different preparations of purified phages were adjusted to an equivalent concentration of 10 11 viral particles / ml. Absorbance was measured at 490 nm.
  • Figure 3 Alignment of the amino acid sequence of the three CDRs of the variable region of the heavy chain (VH) of nimotuzumab and of the 1 1 variants of FabR3 with unique sequences after three rounds of selection of the library against the extracellular region of the human EGFR.
  • the dashes indicate that the original amino acid was maintained in that position.
  • the number of times the sequence was repeated is indicated in parentheses.
  • FIG. 4 Evaluation by ELISA of the recognition of FabR3 variants on phages with unique sequences obtained from the soft randomization library after three rounds of selection against the extracellular region of human EGFR.
  • the phage preparations were previously normalized according to the amounts of protein presented.
  • FIG. 1 Variants of FabR3 on phages constructed from the combination of the most recurrent CDR1 mutation and the CDR2 mutations of the best FabR3 variants of group 1.
  • A Alignment of the amino acid sequence of the three CDRs of the VFI of the original nimotuzumab and the two constructed variants.
  • B Evaluation by ELISA of the recognition of the constructed variants. Absorbance was measured at 490 nm.
  • Figure 6 Recognition of cells of the FU 25 line, by Fab derived from nimotuzumab and mAbs K4 and K5.
  • A Point chart showing the percentage of recognized EGFR positive cells.
  • B Fluorescence mean intensity fisttograms (EGFR positive cells).
  • Figure 7 Inhibition of EGFR-mediated EGFR phosphorylation induced by nimotuzumab and MAb K4 and K5.
  • A Line FU 25, which presents an average expression of EGFR.
  • B Line MDA-MB-468, with high expression of EGFR.
  • Example 1 Successful presentation of the antigen-binding fragment of nimotuzumab (FabR3) on filamentous phage M13.
  • VL and VFI variable regions of the light (VL) and heavy (VFI) chains of nimotuzumab flanked by the restriction sites ApaLI / Xhol and Sfil / BstEII, respectively, they were amplified by PCR. Both VL and VH gene fragments were cloned into the vector pCES1 (de Haard, H., Methods in Molecular Biology.178: 87-100, 2002) followed by the genes coding for the kappa light constant region (CK) and the region heavy constant (CH1), respectively. The gene coding for the CH1 region is linked to a gene encoding the c-myc tag peptide and is followed by the gene III.
  • This genetic construct encoded an Ag binding fragment derived from nimotuzumab (FabR3).
  • Competent bacteria of the species Escherichia coli strain TG1 were transformed with the resulting genetic constructs and used to produce and purify phage presenting FabR3 fused to the P3 protein of the viral capsid, at a scale of 50 ml_ (Marks, J. et al. J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991).
  • the specific recognition of the molecules presented on the purified phages was evaluated by ELISA ( Figure 1).
  • polystyrene plates (MaxiSorp, USA) were coated with the Ag of nimotuzumab, the extracellular region of human EGFR (Her ⁇ ) (Ram ⁇ rez, B. et al., Int. J. Cancer., 19: 2190-2199, 2006).
  • the anti-label mAb c-myc 9E10 Center for Genetic Engineering and Biotechnology of Sancti Spiritus, Cuba
  • BSA as an unrelated molecule.
  • the bound phages were detected with the anti-M13 mAb conjugated to horseradish peroxidase (GE Healthcare, USA) and the corresponding substrate of the enzyme.
  • FabR3 was correctly presented folded over phage, measured by the recognition of mAb 9E10 that detects the levels of presentation and because it retained the ability of nimotuzumab to recognize specifically Heri.
  • Example 2 Selection and characterization of filamentous phages presenting fragments of FabR3 variants with greater reactivity for the extracellular region of human EGFR.
  • a 25-residue soft scrambling strategy was designed, located in protruding segments of the three CDRs (according to the AbM definition) of the heavy chain of nimotuzumab. Most of them (24/25) were replaced by a mixture that potentially contained all 20 amino acids, but retained the original residue in most of the library's molecules. To this end, degenerate codons were introduced that maintained the original nucleotide in 90% in each position, while the remaining 10% corresponded to an equimolar mixture of the other three nucleotides. The other residue (F29) was only replaced by other hydrophobic residues (I, L, M, V), although in the majority of the library's molecules the original residue predominated.
  • a degenerate codon was used in positions one and three of the triplet that maintained the original nucleotide (T and C respectively) 90% while the remaining 10% corresponded to an equimolar mixture of the other three nucleotides, Second position of the triplet (T) was not modified.
  • the designed library was constructed in a Fab format by cloning the variable regions in the vector pCES-1. In this way, a library of Nimotuzumab Fab variants composed of 1.5x10 7 members was built.
  • the phages produced from the library were purified by polyethylene glycol precipitation according to previously established procedures (Marks, J. et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991).
  • To isolate functional mutated variants of FabR3 presented on the phages with greater capacity of binding to their antigen said viral particles were incubated on immunotubes (Nunc, Denmark), coated with Her ⁇ . After washing to remove the unbound phages, the bound phages were eluted by incubation with a basic solution of triethylamine.
  • Bacteria of strain TG1 were infected with the selected phages, which were amplified with the helper phage M13K07 and used as starting material for a new round of selection. Three cycles of phage selection were carried out, which showed an increase in reactivity by the Heri of the phage mixture as the number of cycles increased ( Figure 2).
  • Example 3 Demonstration of increased reactivity of new FabR3 variants on filamentous phage by the extracellular region of human EGFR.
  • Competent bacteria of the species E. coli strain TG1 were transformed with the genetic constructs resulting from the three selection cycles that contained unique sequences different from that of the original nimotuzumab. From these, phage presenting the variants of FabR3 were produced and purified. To determine the reactivity of these new variants by the Heri, the recognition of phage preparations at different concentrations of viral particles was determined by ELISA. All the variants evaluated, the 6 with mutations exclusively in the CDR2 ( Figure 4A), and the 5 with mutations in the CDR1 and CDR2 ( Figure 4B) presented greater reactivity by the Her ⁇ than the original FabR3 at the different concentrations evaluated.
  • DNA reconstituted in phosphate buffered saline was used to electroporate NSO cells.
  • mAb K4 and mAb K5 4 pg of the vector pSV-gpt was co-transfected with the corresponding VH (Table 1) and 8 pg of the vector pSV-hyg-VK of the original nimotuzumab.
  • the procedure for obtaining stable clones was carried out with xanthine, hypoxanthine and mycophenolic acid as selection drugs. This methodology allowed us to obtain the three molecules of interest as Acs of isotype lgG1 and light chain kappa.
  • the produced Acs were purified from the supernatant by protein A affinity chromatography.
  • the affinity for Biacore was decided to measure the affinity for Biacore.
  • the Fab derived from mAb R3, mAb K4 and mAb K5 were obtained by enzymatic digestion with papain and subsequent separation by protein A.
  • the new MAb K4 and K5 showed an increase in affinity of 3 and 3 , 6 times, respectively, with respect to mAb R3.
  • Example 5 Fabs derived from mAbs K4 and K5 produced in mammalian cells showed greater recognition of the human lung carcinoma cell line H125 than Fab derived from nimotuzumab.
  • the ability of the Fab derived from mAbs K4 and K5 to recognize the Heri molecule was determined. In this case, the recognition of Her ⁇ was evaluated by flow cytometry in a cell line, its natural context. To this end, the Fab derived from mAb R3, mAb K4 and mAb K5 were incubated at 1.25 pg / ml with lung adenocarcinoma cells of human origin H125, which have a medium expression of the receptor.
  • the cells were treated for 2 hours with the mAbs R3, K4 and K5 at 10 pg / ml, 5 pg / ml and 2.5 pg / ml. Subsequently the medium was removed to remove the mAbs not bound to the cells, fresh medium was added with human EGF for 10 minutes to induce the phosphorylation of the receptor. Next, a lysate was performed in RIPA buffer from these cells subjected to the different treatments. The protein concentration was quantified according to the instructions of the bicinconilic acid reagent set (Pierce) 25 pg of proteins of the Used were applied in a 9% gel SDS-PAGE and the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane.

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Abstract

Esta invención proporciona nuevos anticuerpos (Ac) y fragmentos que reconocen la región extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) humano con una mayor afinidad que el Ac nimotuzumab, por lo que pueden reconocer con mayor eficiencia, líneas con mediana expresión del EGFR. La presente invención se relaciona además, con las composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo los Acs y fragmentos divulgados y su uso en la terapia de tumores con expresión del EGFR. Además, los Acs y fragmentos divulgados son útiles cuando están enlazados a un radioisótopo o fluoróforo en la localización de tumores que presenten el EGFR. Adicionalmente, se pueden utilizar en direccionalizar la respuesta inmune a las células tumorales EGFR positivas cuando se fusionan a proteínas o dominios proteicos de interés inmunológico.

Description

ANTICUERPOS DE AFINIDAD INCREMENTADA POR EL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO Y SUS FRAGMENTOS DERIVADOS
CAMPO DE LA TÉCNICA
La presente invención se relaciona con las ramas de la Biotecnología y la Medicina, particularmente con variantes del anticuerpo monoclonal (AcM) nimotuzumab y fragmentos de unión al antígeno derivados de este que tienen mutaciones en los CDR1 y CDR2 de la región variable de la cadena pesada y que reconocen la región extracelular del receptor del factor de crecimiento epiérmico (EGFR) humano con mayor afinidad, así como su aplicación diagnóstica y terapéutica.
ANTECEDENTES
El EGFR es una glicoproteína transmembrana, que presenta una región extracelular de unión al ligando, y una región intracelular con actividad tirosina cinasa. Entre sus ligandos se encuentran: el factor de crecimiento epidérmico (EGF, del inglés epidermal growth factor), la anfirregulina, el factor de crecimiento transformante, la betacelulina, la epirregulina, y el factor de crecimiento similar a EGF con sitio de unión a heparina (Olayioye, M.y otros, The EMBO Journal. 19: 3159-3167, 2000; Yarden, Y. y Sliwkowski, M., Nature Reviews. 2: 127-137, 2001 ). La unión de los ligandos al receptor induce cambios conformacionales y arreglos en la región extracelular del receptor que provocan la dimerización y activación del mismo (Ogiso, Fl. y otros, Cell. 1 10: 775-787, 2002). Este receptor está involucrado en diferentes procesos celulares que contribuyen al mantenimiento y supervivencia de las células epiteliales. Sin embargo, la desregulación de la vía EGFR/EGF por sobreexpresión o activación constitutiva promueve la proliferación de células tumorales, la invasión, y está asociada con mal pronóstico en muchas malignidades (Yarden, Y. y Sliwkowski, M., Nature Reviews. 2: 127-137, 2001 ). Por tal motivo el EGFR es considerado como un antígeno (Ag) tumor-asociado muy importante para el desarrollo de terapias antitumorales.
Actualmente existen en el mercado tres AcMs específicos por el EGFR: el cetuximab (Erbitux), el panitumumab (Vectibix), y el nimotuzumab (TheraCIM) (Reichert,J., mAbs.4: 413-415, 2012) y otros siete se encuentran en fase de ensayos clínicos l-lll (Reichert, J. y Dhimolea, E., Drug Discovery Today. 17: 954-963, 2012). Los mismos fueron específicamente diseñados para reconocer la región extracelular del EGFR, inhibir competitivamente la unión de los ligandos y la dimerización del receptor, lo que
i inhibiría la auto-fosforilación y la cascada de señalización que conlleva a la activación del receptor (Burgess, A. y otros, Molecular Cell, 12: 541-552, 2003).
El nimotuzumab (AcM R3) es un AcM humanizado de isotipo lgG1 que reconoce al EGFR humano, se obtuvo mediante el clonaje del ADN de las regiones hipervariables del AcM de ratón ior egf/r3 y los marcos de las regiones variables y de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de origen humano (REI y NEWN, respectivamente) (Mateo, C. y otros, Immunotechnology. 3: 71 -8 1 , 1997). El AcM R3 reconoce al EGFR con similar afinidad y presenta la misma capacidad de inhibir la unión del EGF al receptor que su predecesor de ratón. Esta variante es menos inmunogénica que la versión quimérica del AcM ior egf/r3 (Mateo, C. y otros, Immunotechnology. 3: 71 -8 1 , 1997). El nimotuzumab reconoce un epitopo en el dominio III de la región extracelular del EGFR que se solapa con el sitio de unión de los ligandos en este dominio, lo que explica su capacidad de bloquear la unión de los ligandos y posterior activación del receptor (Tundidor, Y. y otros, mAbs. 6: 1013-1025, 2014). La eficacia del nimotuzumab se ha demostrado en ensayos clínicos, en pacientes con tumor de cabeza y cuello (Crombet, T. y otros, J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004), glioma (Ramos, T. y otros. Cáncer Biol Ther. 5: 375-379, 2006; MacDonald, T. y otros, Neuro Oncol. 13: 1049-1058, 201 1 ) y tumor de esófago (Ramos-Suzarte, M. y otros, Cáncer Biology & Therapy 13: 600-605, 2012). Este anticuerpo (Ac) se encuentra en ensayos clínicos fase III para cáncer nasofaríngeo, cáncer de esófago localmente avanzado y carcinoma de esófago de células escamosas (Galluzzi, L. y otros, Oncolmmunology. 1 : 28-37, 2012). A diferencia de otros Acs dirigidos contra el EGFR, tanto en estudios de preclínica en monos verdes Cercopithecus aethiops sabaeus (Arteaga, M. y otros, Cáncer Biology & Therapy. 6: 1390-1395, 2007), como en estudios en la clínica (Crombet, T. y otros, J Clin Oncol 22:1646-1654, 2004; Ramos, T. y otros. Cáncer Biol Ther. 5: 375-379, 2006; Ramos-Suzarte, M. y otros, Cáncer Biology & Therapy 13: 600-605, 2012; Strumberg, D. y otros, Invest New Drugs. 30: 1 138-1 143, 2010), el nimotuzumab no ha mostrado los signos de toxicidad severos usualmente asociados a las drogas dirigidas contra este Ag. Estas evidencias lo hacen el único de los agentes anti-EGFR que puede ser usado de manera crónica (Alian, D., The Oncologist. 10: 760-761 , 2005). El bajo perfil de toxicidad, pero con efecto antitumoral, de este AcM pudiera deberse a su afinidad intermedia (10_ 8) (Crombet, T. y otros, J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004). Los autores predicen que los AcMs con afinidad intermedia deben tener alto efecto antitumoral y baja toxicidad al favorecerse la unión del Ac por el tejido tumoral (alta expresión del EGFR) sobre el normal (baja expresión del EGFR). Por otra parte, los AcMs de alta afinidad (como el cetuximab) serían capturados tanto por las células tumorales como por las normales; y los AcM de baja afinidad tendrían bajo efecto por la baja incorporación en los tumores (Crombet, T. y otros, J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004). Sin embargo, se ha descrito que el efecto antitumoral del nimotuzumab depende de la expresión del EGFR, pues en tumores con mediana o baja expresión del receptor disminuye su eficacia (Akashi, Y. y otros, British Journal of Cáncer. 98: 749-755, 2008). Por lo que la obtención de una variante del mismo con un aumento moderado de su afinidad por el receptor se podría traducir en un anticuerpo (Ac) con mayor efecto antitumoral y que mantuviera la baja toxicidad. La obtención de esta variante de afinidad intermedia a partir del nimotuzumab, manteniendo su especificidad epitópica fina (que es única entre los Acs terapéuticos contra el EGFR), (Tundidor, Y. y otros, mAbs. 6: 1013-1025, 2014), contribuiría a que las propiedades valiosas del anticuerpo original se conserven.
La maduración de la afinidad de los Acs es un proceso que ocurre de forma natural; y con el desarrollo de la biología combinatoria se ha logrado reproducir este fenómeno en el laboratorio. Estas tecnologías de evolución dirigida requieren de diferentes pasos: mutación, presentación, selección y amplificación (Wark, K. y Hudson, P., Advanced Drug Delivery Reviews. 58: 657- 670,2006). La tecnología de presentación sobre fagos proporciona una potente plataforma para la generación de nuevos Acs humanos y para mejorar su afinidad in vitro (Hoogenboom, H., Nat Biotechnol. 23: 1 105-1 1 16, 2005). Los inventores de la presente invención encontraron variantes mutadas del nimotuzumab presentadas sobre fagos, con un incremento en su capacidad de unión a la región extracelular del EGFR humano. El conjunto de mutaciones que poseen dichas variantes no ha sido descrito anteriormente ni es predecible a partir del análisis de la estructura cristalina del Fab del nimotuzumab. Por tanto, la novedad de esta invención consiste en proporcionar nuevos fragmentos y AcM que reconocen al EGFR humano con una mayor afinidad (entre 3 y 4 veces), por lo que pueden reconocer con mayor eficiencia el nimotuzumab, líneas con mediana expresión del EGFR. Asimismo, estos AcM presentaron una mayor capacidad de inhibir la fosforilación del EGFR mediada por el ligando comparados con el nimotuzumab, lo que indica que presentan un mayor efecto antitumoral que el nimotuzumab. Todo lo anterior permite la utilización de estos fragmentos y AcM en el diagnóstico o terapia de tumores con expresión media del EGFR.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN. La presente invención se relaciona con AcMs recombinantes que reconocen la región extracelular del EGFR humano Herí y que tienen más del 95% de identidad respecto al anticuerpo nimotuzumab.
En una modalidad se refiere a AcMs donde las secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) del CDR2 de la región variable de las cadenas pesadas se seleccionan del grupo que comprende:
- SEQ ID NO. 20 y
- SEQ ID NO. 21
las secuencias del CDR1 y del CDR3 de las cadenas pesadas son las SEQ ID NO. 9 y SEQ ID N0.3 respectivamente y las secuencias de los CDR de la región variable de las cadenas ligeras son:
- CDR 1 SEQ ID NO. 22
- CDR 2 SEQ ID NO. 23
- CDR 3 SEQ ID NO. 24.
En otra modalidad los AcMs recombinantes de la presente invención se caracterizan porque la secuencia del CDR2 de la región variable de las cadenas pesadas se selecciona del grupo que comprende:
- SEQ ID NO. 10,
- SEQ ID NO. 1 1 ,
- SEQ ID NO. 12,
- SEQ ID NO. 17,
- SEQ ID NO. 18 y
- SEQ ID NO. 29,
la secuencia del CDR1 es la SEQ ID NO. 9 y la secuencia del CDR3 es la SEQ ID N0.3 en dichas cadenas pesadas y las secuencias de los CDR de la región variable de las cadenas ligeras son:
- CDR 1 SEQ ID NO. 22
- CDR 2 SEQ ID NO. 23
- CDR 3 SEQ ID NO. 24.
Otra modalidad de la presente invención se relaciona con AcMs donde la secuencia del CDR2 de la región variable de las cadenas pesadas se seleccionan del grupo que comprende:
- SEQ ID NO. 2 y
- SEQ ID NO. 8, las secuencias del CDR1 y del CDR3 de las cadenas pesadas son la SEQ ID NO. 1 y SEQ ID N0.3 respectivamente y las secuencias de los CDR de la región variable de las cadenas ligeras son:
- CDR 1 SEQ ID NO. 22
- CDR 2 SEQ ID NO. 23
- CDR 3 SEQ ID NO. 24.
En una modalidad adicional los AcMs de la presente invención se caracterizan porque la secuencia del CDR1 de la región variable de las cadenas pesadas se seleccionan del grupo que comprende:
- SEQ ID NO. 13 y
- SEQ ID NO. 19,
las secuencias del CDR2 y del CDR3 de las cadenas pesadas es la SEQ ID NO. 14 y la SEQ ID N0.3 respectivamente y las secuencias de los CDR de la región variable de las cadenas ligeras son:
- CDR 1 SEQ ID NO. 22
- CDR 2 SEQ ID NO. 23
- CDR 3 SEQ ID NO. 24.
Particularmente, la presente invención se refiere a un AcM se caracteriza por tener la siguiente secuencia de región variable de cadenas pesadas y ligeras:
Cadena pesada
- CDR1 SEQ ID NO. 15
- CDR2 SEQ ID NO. 16
- CDR3 SEQ ID N0.3
Cadena ligera
- CDR 1 SEQ ID NO. 22
- CDR 2 SEQ ID NO. 23
- CDR 3 SEQ ID NO. 24.
La presente invención engloba todos los AcMs anteriores donde las regiones marco (FW) de la región variable de las cadenas pesadas y ligeras tienen las siguientes secuencias:
Cadena pesada
- FW 1 SEQ ID NO.4
- FW 2 SEQ ID NO.5
- FW 3 SEQ ID NO.6
- FW 4 SEQ ID NO. 7
Cadena ligera
- FW 1 SEQ ID NO. 25 - FW 2 SEQ ID NO. 26
- FW 3 SEQ ID NO. 27
- FW 4 SEQ ID NO. 28
Adicionalmente, los Acs divulgados comprende las regiones constantes lgG1 humana para la cadena pesada y kappa humana para la cadena ligera.
En una modalidad particular se refiere a los fragmentos derivados de los Acs anteriores donde dichos fragmentos pueden ser de tipo Fab, (Fab)2 y fragmentos de región variable de cadena única.
En otra modalidad, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica útil en la terapia del cáncer que tiene como principio activo los AcMs o fragmentos divulgados en un rango de 50-400 mg y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Adicionalmente se relaciona con una composición farmacéutica útil en el diagnóstico de tumores que tiene como principio activo los AcMs o fragmentos divulgados en un rango de 1 -9 mg y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otra modalidad, la presente invención se refiere al uso de los AcMs y fragmentos divulgados en la terapia de tumores que expresen el EGFR; así como en el diagnóstico de tumores portadores del EGFR, cuando son conjugados a un marcador apropiado. Además se relaciona con el uso de estos AcMs y fragmentos para dirigir la respuesta inmune contra tumores EGFR positivos, cuando son conjugados con proteínas o dominios proteicos de interés inmunológico.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Obtención de los fragmentos derivados del nimotuzumab con capacidad de unión incrementada a la región extracelular del EGFR humano
La presente invención se relaciona con 13 fragmentos derivados del nimotuzumab que comparten más de un 97% de identidad con la secuencia aminoacídica del mismo y tienen capacidad incrementada de unión a la región extracelular del EGFR humano. Las mutaciones de las variantes descritas en la presente invención, conducen a la obtención de variantes del nimotuzumab con la capacidad de reconocer mayor número células humanas con mediana expresión del EGFR comparadas con el Fab original de nimotuzumab.
Los fragmentos descritos en la presente invención pueden obtenerse mediante la selección de variantes mutadas del Fab del nimotuzumab en virtud de su capacidad de unión a la región extracelular del EGFR humano, a partir de bibliotecas de más de 107 moléculas presentadas sobre fagos filamentosos. Los genes correspondientes a dichas variantes pueden insertarse dentro de vectores de expresión de tipo fagomidio (fusionados a uno de los genes que codifica para las proteínas de la cápside de los fagos filamentosos) y utilizarse para la producción de partículas virales que exponen en su superficie las variantes proteicas. Las bibliotecas de partida pueden incluir distintos grados de diversificación en un conjunto de posiciones de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), lo que permitiría una exploración exhaustiva de esta región funcionalmente importante para la interacción Ag-Ac. Cada uno de los residuos originales en estas posiciones puede reemplazarse por una mezcla de los 20 aminoácidos, por un conjunto pre-definido de residuos que compartan alguna(s) propiedad(es) físico-química(s) como la hidrofobicidad, el carácter aromático, la carga neta y/o el tamaño, o ser sometido a aleatorización suave mediante la introducción de una proporción minoritaria de una mezcla aleatoria de nucleótidos en cada posición del codón correspondiente (que conservarían un predominio de la secuencia original). Las posiciones escogidas pueden diversificarse simultáneamente en una misma biblioteca, o en varias bibliotecas separadas. Estas bibliotecas pueden contener proporciones variables de moléculas con una o varias mutaciones, conservativas o no, con respecto al Fab del nimotuzumab original.
Selección de los fragmentos y AcM análogos del nimotuzumab con capacidad de unión incrementada a la región extracelular del EGFR humano
La selección de los fagos que presentan variantes con capacidad de unión incrementada a la región extracelular del EGFR humano puede basarse en la incubación de las mezclas de fagos provenientes de las bibliotecas en contacto con el Ag EGFR humano inmovilizado sobre una superficie sólida, la eliminación de los fagos no unidos mediante lavados, y la elución de los fagos unidos en condiciones que interfieran con las interacciones proteicas. Pueden realizarse varios ciclos sucesivos de selección en condiciones similares. El análisis de las secuencias de ADN insertadas en los fagomidios seleccionados puede revelar regularidades que conduzcan a la identificación de aquellas sustituciones más abundantes y potencialmente relacionadas con el aumento de la capacidad de unión al EGFR. Las mutaciones recurrentes encontradas, ya sean modificaciones individuales o combinaciones de cambios seleccionados directamente de las bibliotecas, pueden combinarse entre sí en nuevas variantes para obtener incrementos adicionales de la capacidad de unión al EGFR.
La capacidad de unión al EGFR humano de cada una de las variantes seleccionadas directamente de las bibliotecas, o diseñadas y construidas posteriormente, puede evaluarse por técnicas inmunoquímicas aprovechando el formato de presentación sobre fagos que permite la caracterización simultánea de múltiples variantes. Alternativamente, los fragmentos de la presente invención pueden obtenerse mediante la explotación de otras plataformas de la biología combinatoria, como la presentación sobre ribosomas o levaduras.
Adicionalmente los genes que codifican para las nuevas regiones variables pueden clonarse en vectores de expresión de células de mamíferos y producir de manera recombinante los AcM completos que contengan las nuevas mutaciones. Igualmente se puede comprobar que en este formato, los AcM obtenidos conservan la capacidad de reconocer más la región extracelular del EGFR humano comparado con el nimotuzumab, a través de mediciones de afinidad basadas en resonancia de plasmones de superficie (BIAcore).
Demostración de la superioridad funcional de los nuevos AcM y fragmentos derivados del nimotuzumab
La superioridad funcional de cada una de las variantes de fragmentos seleccionadas directamente de las bibliotecas o construidas posteriormente en forma de fragmentos o Acs completos, puede demostrarse en ensayos in vitro o in vivo. Para cada variante se puede evaluar el reconocimiento de líneas celulares con diferente expresión del EGFR mediante citometría de flujo, comprobándose que las nuevas variantes reconocen un mayor porcentaje de células positivas y con mayor intensidad media de fluorescencia; y este efecto es más evidente en líneas con mediana o baja expresión del EGFR. Para ello se pueden utilizar las líneas celulares con:
- alta expresión del EGFR: carcinoma epidermoide de origen humano A431 , adenocarcinoma de mama con metástasis en líquido pleural de origen humano MDA-MB-468, sin limitarse a éstas.
mediana expresión del EGFR: adenocarcinoma de pulmón de origen humano FU 25 y H292, sin limitarse a éstas.
- baja expresión del EGFR: cáncer de pulmón de células pequeñas de origen humano U1906, adenocarcinoma de mama de origen humano MDA-MB-231 , carcinoma de ovario SKOV3, carcinoma de mama SKBR3, sin limitarse a éstas.
Para cada AcM o fragmento también se puede evaluar la capacidad de inhibir la fosforilación del EGFR mediada por su ligando (EGF), a diferentes concentraciones y en líneas celulares con diferente expresión del EGFR. También se pueden realizar ensayos de inhibición de la proliferación por Alamar blue en líneas con diferente expresión del receptor. Adicionalmente, se puede determinar la capacidad de cada AcM de inducir citotoxicidad celular dependiente de Ac, en líneas con diferente expresión del receptor. En todos los casos podría esperarse que las variantes de mayor afinidad tuviesen un mayor efecto y que el mismo fuera más evidente en líneas con expresión media o baja del EGFR.
Por otro lado se podría medir el efecto antitumoral de los AcMs o fragmentos en ratones atímicos portadores de tumores humanos con diferente expresión del EGFR, donde se mediría el retardo en el crecimiento tumoral.
Adicionalmente se pueden marcar los fragmentos o AcMs con isotopos radioactivos o con fluoróforos e inocularlos en ratones atímicos portadores de tumores humanos con diferente expresión del EGFR. Esto permite evaluar la capacidad de los fragmentos de detectar in vivo el reconocimiento de tumores, lo que corrobora su uso como herramientas para el diagnóstico del cáncer mediante la obtención de imágenes.
Aplicación terapéutica y métodos de tratamiento de los nuevos AcM y de los fragmentos derivados
Los nuevos AcM y fragmentos obtenidos en la presente invención, tienen mayor afinidad que el nimotuzumab lo que posibilita utilizarlas en escenarios donde el nimotuzumab presenta limitaciones, como es el caso de células con baja o media expresión del EGFR. Dichos AcM pueden tener aplicación en el tratamiento de pacientes con tumores de cabeza y cuello, glioma, esófago, pulmón y páncreas.
Para su uso terapéutico, los AcM y fragmentos se deben administrar a un sujeto portador de la enfermedad de forma independiente o combinados con terapias convencionales para el tratamiento del cáncer como radioterapia o quimioterapia, para que potencien su acción terapéutica. La ruta de administración podrá ser cualquiera de las descritas en el estado de la técnica para la administración parenteral de fármacos, preferentemente por vía endovenosa o subcutánea.
Para obtener el efecto terapéutico deseado, los AcM y fragmentos de la presente invención deberán ser administrados en dosis que estén en el rango de concentraciones para el cual tengan un efecto antitumoral sin manifestaciones tóxicas. Los rangos de dosis a explorar pueden variar entre 50 mg - 400 mg por paciente en 6 ciclos semanales de tratamiento. El tratamiento con las nuevas variantes con mayor afinidad podría ajustarse a dosis más bajas y mantener un efecto similar al del nimotuzumab o podría utilizarse la dosis recomendada para el nimotuzumab (200 mg) manifestando un mayor efecto antitumoral, lo que dependería del perfil de toxicidad de los nuevos AcM y fragmentos.
Los AcM y fragmentos de la presente invención pueden tener aplicación para el diagnóstico de tumores EGFR positivos al conjugarlos con radioisótopos o fluoróforos; debido a que presentan mayor afinidad y capacidad de reconocer células con mediana o baja expresión del EGFR tienen una ventaja frente al nimotuzumab en el diagnóstico de tumores con esta característica.
Para utilizarlos como herramientas de detección estos AcM y fragmentos serían administrados en los pacientes portadores de tumor para identificar mediante imagenología la localización del tumor o posibles metástasis EGFR positivas. Los AcM y fragmentos conjugados a radioisótopos o fluoróforos deberán ser administrados en dosis que estén en el rango de concentraciones para la cual la cinética de distribución en los tejidos y su eliminación posibilite la obtención rápida de imágenes de calidad. Este rango puede ser de 0.5mg - 9 mg por paciente, preferentemente 3 mg.
Adicionalmente los fragmentos descritos en la presente invención se pueden fusionar a proteínas o dominios proteicos de interés inmunológico, con el objetivo de dirigir la respuesta inmune a las células tumorales EGFR positivas. Esta aplicación tiene la ventaja de combinar la potencialidad de ambas terapias por separado al concentrar la respuesta en el sitio tumoral; los fragmentos Fab aportan la especificidad por las células tumorales que expresan el Ag mientras que las proteínas o dominios proteicos fusionados desempeñan su rol inmunológico, lo que podría tener un efecto superior al de las monoterapias.
Composiciones farmacéuticas
Los AcM y fragmentos descritos en la presente invención se administran formando parte de una composición farmacéutica útil en la terapia del cáncer. Preferentemente, la presente invención engloba composiciones farmacéuticas, que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Entre los vehículos farmacéuticamente aceptables se incluyen, pero no se limitan a: solución salina, salina amortiguada con fosfato, y otros parecidos. Otros agentes de amortiguación, agentes dispersos, y sustancias inertes no tóxicas apropiadas para administrar a un paciente podrán ser incluidas en las composiciones de la presente invención. Las composiciones son normalmente estériles y libres de partículas indeseables.
La presente invención queda aún más elaborada con los siguientes ejemplos y dibujos. Sin embargo, estos ejemplos no deberían ser interpretados como una limitación del ámbito de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Evaluación por ELISA del reconocimiento del FabR3 presentado sobre fagos filamentosos. Las distintas preparaciones de fagos purificados se ajustaron a una concentración equivalente de 1012 partículas virales/ml. La absorbancia se midió a 490 nm. Figura 2. Evaluación por ELISA de la reactividad de la mezcla de fagos de la biblioteca del FabR3 luego de tres rondas de selección contra la región extracelular del EGFR humano. Las distintas preparaciones de fagos purificados se ajustaron a una concentración equivalente de 1011 partículas virales/ml. La absorbancia se midió a 490 nm.
Figura 3. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de los tres CDR de la región variable de la cadena pesada (VH) del nimotuzumab y de las 1 1 variantes del FabR3 con secuencias únicas luego de tres rondas de selección de la biblioteca contra la región extracelular del EGFR humano. Los guiones indican que se mantuvo el aminoácido original en esa posición. Entre paréntesis se indica el número de veces que se repitió la secuencia.
Figura 4. Evaluación por ELISA del reconocimiento de las variantes del FabR3 sobre fagos con secuencias únicas obtenidas a partir de la biblioteca de aleatorización suave luego de tres rondas de selección contra la región extracelular del EGFR humano. Se normalizaron previamente las preparaciones de fagos de acuerdo a las cantidades de proteína presentada. (A) Variantes incluidas en el grupo 1 , solo presentan mutaciones en el CDR2 de la VFI. (B) Variantes del grupo 2, presentan mutaciones en el CDR1 y CDR2 de la VFI. La absorbancia se midió a 490 nm.
Figura 5. Variantes del FabR3 sobre fagos construidas a partir de la combinación de la mutación más recurrente del CDR1 y las mutaciones del CDR2 de las mejores variantes del FabR3 del grupo 1. (A) Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de los tres CDR de la VFI del nimotuzumab original y las dos variantes construidas. (B) Evaluación por ELISA del reconocimiento de las variantes construidas. La absorbancia se midió a 490 nm.
Figura 6. Reconocimiento de células de la línea FU 25, por los Fab derivados del nimotuzumab y los AcM K4 y K5. (A) Gráfico de puntos donde se muestra el porcentaje de células EGFR positivas reconocidas. (B) Flistogramas de intensidad media de fluorescencia (células EGFR positivas).
Figura 7. Inhibición de la fosforilación del EGFR mediada por EGF e inducida por el nimotuzumab y los AcM K4 y K5. (A) Línea FU 25, que presenta una expresión media del EGFR. (B) Línea MDA-MB-468, con alta expresión del EGFR.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Presentación exitosa del fragmento de unión al antígeno del nimotuzumab (FabR3) sobre fagos filamentosos M13.
Los genes que codifican para las regiones variables de las cadenas ligera (VL) y pesada (VFI) del nimotuzumab flanqueados por los sitios de restricción ApaLI/Xhol y Sfil/BstEII, respectivamente, se amplificaron por PCR. Ambos fragmentos génicos VL y VH se clonaron en el vector pCES1 (de Haard, H., Methods in Molecular Biology.178: 87-100, 2002) seguidos de los genes que codifican para la región constante ligera kappa(CK) y la región constante pesada (CH1 ), respectivamente. El gen que codifica para la región CH1 está unido a un gen que codifica para el péptido etiqueta c-myc y es seguido por el gen III. Esta construcción genética codificó para un fragmento de unión al Ag derivado del nimotuzumab (FabR3). Se transformaron bacterias competentes de la especie Escherichia coli cepa TG1 con las construcciones genéticas resultantes y se usaron para producir y purificar fagos presentadores del FabR3 fusionados a la proteína P3 de la cápsida viral, a escala de 50 ml_ (Marks, J. y otros, J. Mol. Biol. 222: 581 -597, 1991 ). El reconocimiento específico de las moléculas presentadas sobre los fagos purificados se evaluó mediante ELISA (Figura 1 ). Para ello se recubrieron placas de poliestireno (MaxiSorp, EUA) con el Ag del nimotuzumab, la región extracelular del EGFR humano (Herí ) (Ramírez, B. y otros, Int. J. Cáncer. 1 19: 2190-2199, 2006), el AcM anti-etiqueta c-myc 9E10 (Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de Sancti Spiritus, Cuba) y BSA como molécula no relacionada. Los fagos unidos se detectaron con el AcM anti- M13 conjugado a la peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare, EUA) y el correspondiente sustrato de la enzima. Como se observa en la Figura 1 el FabR3 se presentó correctamente plegado sobre fagos, medido por el reconocimiento del AcM 9E10 que detecta los niveles de presentación y porque conservó la capacidad del nimotuzumab de reconocer específicamente al Herí .
Ejemplo 2: Selección y caracterización de fagos filamentosos que presentan fragmentos de variantes del FabR3 con mayor reactividad por la región extracelular del EGFR humano.
Se diseñó una estrategia de aleatorización suave de 25 residuos, localizados en segmentos protuberantes de los tres CDRs (según la definición AbM) de la cadena pesada del nimotuzumab. La mayoría de ellos (24/25) se reemplazaron por una mezcla que potencialmente contenía los 20 aminoácidos, pero que conservaba el residuo original en la mayor parte de las moléculas de la biblioteca. Con este fin se introdujeron codones degenerados que mantenían en un 90% el nucleótido original en cada posición, mientras el 10% restante se correspondía con una mezcla equimolar de los otros tres nucleótidos. El otro residuo (F29) solo se reemplazó por otros residuos hidrofóbicos (I, L, M, V), aunque en la mayoría de las moléculas de la biblioteca predominaba el residuo original. Para ello se utilizó un codón degenerado en las posiciones uno y tres del triplete que mantenía en un 90% el nucleótido original (T y C respectivamente) mientras el 10% restante se correspondía con una mezcla equimolar de los otros tres nucleótidos, la segunda posición del triplete (T) no se modificó. La biblioteca diseñada se construyó en un formato Fab mediante el clonaje de las regiones variables en el vector pCES-1. De este modo quedó construida una biblioteca de variantes del Fab del nimotuzumab compuesta por 1.5x107 miembros.
Los fagos producidos a partir de la biblioteca se purificaron por precipitación con polietilenglicol según procedimientos previamente establecidos (Marks, J y otros, J. Mol. Biol. 222: 581 -597, 1991 ). Para aislar variantes mutadas funcionales del FabR3 presentadas sobre los fagos con mayor capacidad de unión a su antígeno, se incubaron dichas partículas virales sobre inmunotubos (Nunc, Dinamarca), recubiertos con Herí . Después de lavar para eliminar los fagos no unidos, los fagos unidos se eluyeron por incubación con una solución básica de trietilamina. Se infectaron bacterias de la cepa TG1 con los fagos seleccionados, que se amplificaron con el fago auxiliador M13K07 y se utilizaron como material de partida para una nueva ronda de selección. Se realizaron tres ciclos de selección de fagos donde se evidenció un incremento en la reactividad por el Herí de la mezcla de fagos a medida que aumentó el número de ciclos (Figura 2). La secuenciación de los genes insertados en los fagomidios seleccionados, provenientes del tercer ciclo de selección, reveló 1 1 secuencias únicas divididas en dos grupos (Figura 3). El primer grupo conformado por variantes donde se aleatorizó únicamente el CDR2 y el segundo grupo donde aparecieron mutaciones en el CDR1 y el CDR2.
Ejemplo 3: Demostración del aumento de la reactividad de las nuevas variantes de FabR3 sobre fagos filamentosos por la región extracelular del EGFR humano.
Se transformaron bacterias competentes de la especie E. coli cepa TG1 con las construcciones genéticas resultantes de los tres ciclos de selección que contenían secuencias únicas diferentes a la del nimotuzumab original. A partir de las mismas se produjeron y purificaron fagos presentadores de las variantes del FabR3. Para determinar la reactividad de estas nuevas variantes por el Herí se determinó por ELISA el reconocimiento de las preparaciones de fagos a diferentes concentraciones de partículas virales. Todas las variantes evaluadas, las 6 con mutaciones exclusivamente en el CDR2 (Figura 4A), y las 5 con mutaciones en el CDR1 y CDR2 (Figura 4B) presentaron mayor reactividad por el Herí que el FabR3 original a las distintas concentraciones evaluadas. Adicionalmente se construyeron por mutagénesis de Kunkel dos nuevas variantes que combinaron las mutaciones del CDR2 que mayor aumento de reactividad provocaron, con la mutación más recurrente del CDR1 (Figura 5A). El reconocimiento de estas nuevas variantes se evaluó por ELISA. La combinación de las mutaciones fue compatible porque ambas variantes mostraron una mayor reactividad por el Herí que el FabR3 original sobre fagos (Figura 5B). Ejemplo 4: Demostración del aumento de la afinidad de las nuevas variantes del nimotuzumab en formato de proteína soluble producida en células superiores.
Los genes que codifican para la VH original del nimotuzumab (AcM R3) y las VH de las dos variantes construidas del nimotuzumab con mutaciones en los CDR1 y CDR2, como se describió en el Ejemplo 3 (Figura 5A), a las que se les denominó K4 y K5, así como la región variable de cadena ligera kappa (VK) original del nimotuzumab se clonaron en los vectores de expresión en células de mamíferos pSV-gpt y pSV-hyg, respectivamente (Orlandi, R. y otros, PNAS. 86: 3833-3837, 1989). Los vectores con los genes de interés incorporados se linearizaron con la enzima Pvul y se precipitaron en presencia de etanol. El ADN reconstituido en solución salina tamponada por fosfatos se utilizó para electroporar células NSO. Para la obtención de clones productores del AcM R3 y de las dos variantes, AcM K4 y AcM K5, se co-transfectaron 4 pg del vector pSV-gpt con la VH correspondiente (Tabla 1 ) y 8 pg del vector pSV-hyg-VK del nimotuzumab original. El procedimiento de obtención de clones estables se realizó con xantina, hipoxantina y ácido micofenólico como drogas de selección. Esta metodología permitió obtener las tres moléculas de interés como Acs de isotipo lgG1 y cadena ligera kappa. Los Acs producidos se purificaron del sobrenadante mediante cromatografía de afinidad por proteína A.
Tabla 1 . Descripción de los genes VH y VL utilizados para co-transfectar células NSO para producir los AcM R3, K4 y K5.
Figure imgf000016_0001
Para determinar que las mutaciones obtenidas sobre fagos que en ese formato mostraron una mayor reactividad por el Herí , provocaban el mismo efecto en el Ac completo, se decidió medir la afinidad por Biacore. Primeramente se obtuvieron los Fab derivados del AcM R3, AcM K4 y AcM K5 mediante digestión enzimática con papaína y posterior separación por proteína A. Como se muestra en la Tabla 2 los nuevos AcM K4 y K5 mostraron un incremento en la afinidad de 3 y 3,6 veces, respectivamente, respecto al AcM R3.
Tabla 2. Incremento de afinidad de los AcM K4 y K5 respecto al nimotuzumab.
Figure imgf000017_0001
Ejemplo 5: Los Fab derivados de los AcM K4 y K5 producidos en células de mamíferos mostraron mayor reconocimiento de la línea celular humana de adenocarcinoma de pulmón H125 que el Fab derivado del nimotuzumab. Se determinó la capacidad de los Fab derivados de los AcM K4 y K5 de reconocer a la molécula Herí . En este caso se evaluó el reconocimiento del Herí por citometría de flujo en una línea celular, su contexto natural. Para ello se incubaron los Fab derivados de los AcM R3, AcM K4 y AcM K5 a 1 ,25 pg/ml con células de adenocarcinoma de pulmón de origen humano H125, que presentan una mediana expresión del receptor. Los Fab unidos al Herí en la membrana de las células se detectaron con un AcM de ratón anti-cadena ligera kappa humana conjugado a ficoeritrina. Como se evidencia en la Figura 6A, los Fab derivados de los AcM K4 y K5 reconocieron un mayor porcentaje de células Herí positiva y con mayor intensidad media de fluorescencia (IMF) (Figura 6B) comparados con el Fab derivado del AcM R3. Ejemplo 6: El aumento en la afinidad de los AcM K4 y K5 se tradujo en una mayor capacidad de estos Acs de inhibir la fosforilación del EGFR mediada por EGF.
Para determinar la capacidad de inhibir la fosforilación mediada por el EGF de los nuevos AcM se realizó un ensayo de Western Blot. Se emplearon dos líneas celulares:
-Adenocarcinoma de pulmón de origen humano H125, que presentan una mediana expresión del EGFR.
.Adenocarcinoma de mama con metástasis en líquido pleural de origen humano MDA- MB-468, con alta expresión del EGFR.
Las células se trataron durante 2 horas con los AcM R3, K4 y K5 a 10 pg/ml, 5 pg/ml y 2,5 pg/ml. Posteriormente se retiró el medio para remover los AcM no unidos a las células, se adicionó medio fresco con EGF humano durante 10 minutos para inducir la fosforilación del receptor. A continuación se realizó un lisado en tampón RIPA a partir de estas células sometidas a los diferentes tratamientos. La concentración de proteínas se cuantificó según las instrucciones del juego de reactivos del ácido bicinconílico (Pierce). Se aplicaron 25 pg de proteínas de los Usados en un gel al 9% SDS-PAGE y las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Para detectar el EGFR fosforilado (Fosfo-EGFR) se utilizó el Ac primario producido en conejo anti-pEGFR (Y1068). El contenido de proteínas se visualizó con el Ac secundario anti-conejo unido al fluoróforo HRP seguido por el sustrato quimioluminiscente (Pierce). Los gráficos muestran la señal obtenida con el Fosfo-EGFR, indicativo de la cantidad de esta proteína en el lisado celular. Como se evidencia en la Figura 7 a todas las concentraciones evaluadas los AcM K4 y K5 mostraron una mayor capacidad de inhibir la fosforilación del EGFR mediada por EGF en ambas líneas celulares, en comparación con el nimotuzumab. Incluso, ambos AcM a la menor concentración evaluada presentan mayor o el mismo efecto que el nimotuzumab a la mayor concentración evaluada (4 veces más concentrado). Si bien para todos los AcM la inhibición es mayor en la línea MDA-MB-468, con mayor expresión del receptor (Figura 7B), es importante resaltar que el efecto inhibitorio de los AcM K4 y K5 no se pierde en la línea celular con menor expresión del receptor (Figura 7A) como si ocurre con el nimotuzumab. Lo anterior proporciona una ventaja para el uso de estos nuevos AcM obtenidos a partir de incorporar mutaciones en la región variable del nimotuzumab que se traducen en una mayor afinidad por su ligando y en una mayor actividad biológica.

Claims

ANTICUERPOS DE AFINIDAD INCREMENTADA POR EL RECEPTOR DEL FACTORDE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO Y SUS FRAGMENTOS DERIVADOS REIVINDICACIONES
1 . Un anticuerpo monoclonal (AcM) recombinante que reconoce la región extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) humano Herí caracterizado porque tiene más del 95% de identidad respecto al anticuerpo nimotuzumab y la secuencia del CDR2 de la región variable de las cadenas pesadas se seleccionan del grupo que comprende:
- SEQ ID NO. 20 y
- SEQ ID NO. 21 ,
la secuencia del CDR1 es la SEQ ID NO. 9 y la secuencia del CDR3 es la SEQ ID NO.3 en dichas cadenas pesadas y las secuencias de los CDR de la región variable de las cadenas ligeras son:
- CDR 1 SEQ ID NO. 22
- CDR 2 SEQ ID NO. 23
- CDR 3 SEQ ID NO. 24.
2. Un AcM que reconoce al EGFR humano Herí caracterizado porque la secuencia del CDR2 de la región variable de las cadenas pesadas se selecciona del grupo que comprende:
- SEQ ID NO. 10,
- SEQ ID NO. 1 1 ,
- SEQ ID NO. 12,
- SEQ ID NO. 17,
- SEQ ID NO. 18 y
- SEQ ID NO. 29,
donde la secuencia del CDR1 es la SEQ ID NO. 9 y la secuencia del CDR3 es la SEQ ID NO.3 en dichas cadenas pesadas y las secuencias de los CDR de la región variable de las cadenas ligeras son:
- CDR 1 SEQ ID NO. 22
- CDR 2 SEQ ID NO. 23
- CDR 3 SEQ ID NO. 24.
3. Un AcM que reconoce al EGFR humano Herí caracterizado porque la secuencia del CDR2 de la región variable de las cadenas pesadas se seleccionan del grupo que comprende: - SEQ ID NO. 2 y
- SEQ ID NO. 8,
la secuencia del CDR1 es la SEQ ID NO. 1 y la secuencia del CDR3 es la SEQ ID N0.3 en dichas cadenas pesadas y las secuencias de los CDR de la región variable de las cadenas ligeras se muestran a continuación:
- CDR 1 SEQ ID NO. 22
- CDR 2 SEQ ID NO. 23
- CDR 3 SEQ ID NO. 24.
4. Un AcM que reconoce al EGFR humano Herí caracterizado porque la secuencia del CDR1 de la región variable de las cadenas pesadas se seleccionan del grupo que comprende:
- SEQ ID NO. 13 y
- SEQ ID NO. 19,
donde la secuencia del CDR2 es la SEQ ID NO. 14 y la secuencia del CDR3 es la SEQ ID NO.3 en dichas cadenas pesadas y las secuencias de los CDR de la región variable de las cadenas ligeras son:
- CDR 1 SEQ ID NO. 22
- CDR 2 SEQ ID NO. 23
- CDR 3 SEQ ID NO. 24.
5. Un AcM que reconoce al EGFR humano Herí caracterizado porque los CDR de la región variable de las cadenas pesadas y ligeras contiene las siguientes secuencias:
Cadena pesada
- CDR1 SEQ ID NO. 15
- CDR2 SEQ ID NO. 16
- CDR3 SEQ ID N0.3
Cadena ligera
- CDR 1 SEQ ID NO. 22
- CDR 2 SEQ ID NO. 23
- CDR 3 SEQ ID NO. 24.
6. El AcM de acuerdo a la reivindicaciones 1 -5 caracterizado porque las regiones marco (FW) de la región variable de las cadenas pesadas y ligeras tienen las siguientes secuencias:
Cadena pesada
- FW 1 SEQ ID NO. 4
- FW 2 SEQ ID NO. 5
- FW 3 SEQ ID NO. 6 - FW 4 SEQ ID NO. 7
Cadena ligera
- FW 1 SEQ ID NO. 25
- FW 2 SEQ ID NO. 26
- FW 3 SEQ ID NO. 27
- FW 4 SEQ ID NO. 28
7. El Ac de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque la secuencia de las regiones constantes de cadena pesada es la de una lgG1 humana.
8. El Ac de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque las regiones constantes de cadena ligera es la de una kappa humana.
9. Un fragmento derivado de los Ac de las reivindicaciones 1 -8 caracterizado porque es un fragmento de tipo Fab.
10. Un fragmento según las reivindicaciones 1 -8 caracterizado porque es un fragmento de tipo (Fab)2.
1 1. Un fragmento según las reivindicaciones 1 -6 caracterizado porque es un fragmento de región variable de cadena única.
12. Una composición farmacéutica útil en la terapia del cáncer que tiene como principio activo los Ac o fragmentos de las reivindicaciones 1 -1 1 en un rango de 50-400 mg y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Una composición farmacéutica útil en el diagnóstico de tumores que tiene como principio activo los Acs o fragmentos de las reivindicaciones 1 -1 1 en un rango de 1 -9 mg y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Uso de los Acs y fragmentos de las reivindicaciones 1 -1 1 en la terapia de tumores que expresen el EGFR.
15. Uso de los Acs y fragmentos de las reivindicaciones 1 -1 1 cuando son conjugados a un marcador apropiado para el diagnóstico de tumores portadores del EGFR.
16. Uso de los Acs o fragmentos de las reivindicaciones 1 -1 1 cuando son conjugados con proteínas o dominios proteicos de interés inmunológico para dirigir la respuesta inmune contra tumores EGFR positivos.
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