BR112020010075A2 - anticorpos de afinidade aumentada para o receptor de fator de crescimento epidérmico e seus fragmentos derivados - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a novos anticorpos (Ab) e fragmentos que reconhecem a região extracelular do receptor de fator de crescimento de epiderme humana (hEGFR) com uma afinidade maior que o Ab nimotuzumabe, assim sendo capaz de reconhecer mais eficientemente linhas com expressão média de EGFR. A presente invenção também refere-se a composições farmacêuticas compreendendo como princípio ativo os Abs mostrados e fragmentos e seu uso na terapia de tumores com expressão de EGFR. Em adição, ela refere-se ao uso dos Abs e fragmentos mostrados ligados a um radioisótopo ou fluoróforo para a localização de tumores positivos EGFR. Adicionalmente, os Abs e fragmentos mostrados podem ser usados na direcionalização da resposta imune para células de tumores positivas EGFR quando eles são fundidos a proteína ou domínios de proteína de interesse imunológico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI-

CORPOS DE AFINIDADE AUMENTADA PARA O RECEPTOR DE

FATOR DE CRESCIMENTO EPIDÉRMICO E SEUS FRAGMENTOS DERIVADOS". Escopo da Técnica

[001] A presente invenção refere-se aos campos de biotecnologia e medicina, particularmente a variantes do anticorpo monoclonal (mAb) nimotuzumabe e fragmentos derivados do mesmo para ligação de antígeno que têm mutações na CDR1 e CDR2 da região variável da cadeia pesada e reconhecem a região extracelular do receptor de fator de crescimento de epiderme humano (hEGFR) com maior afinidade, assim como sua aplicação diagnóstica e terapêutica. Antecedentes

[002] EGFR é uma glicoproteína de transmembrana, que tem uma região de ligação de ligante extracelular, e uma região intracelular com atividade tirosina cinase. Estes ligantes incluem: o fator de cresci mento de epiderme (EGF), anfirregulina, o fator-α de crescimento transformante, betacelulina, epirregulina, e o EGF de ligação de hepa- rina (Olayioye, M.y et al., The EMBO Journal, 19: 3159-3167, 2000; Yarden, Y. and Sliwkowski, M., Nature Reviews, 2: 127-137, 2001). A ligação dos ligantes ao receptor induz mudanças conformacionais e arranjos na região extracelular que causam dimerização e ativação de receptor (Ogiso, H. et al., Cell 110: 775-787, 2002). Este receptor está envolvido em diferentes processos celulares que contribuem para a manutenção e sobrevivência de células epiteliais. Entretanto, desrre- gulação da via EGFR / EGF através de superexpressão ou ativação constitutiva promove a proliferação de células de tumor, invasão, e é associada com prognóstico pobre em muitas doenças (Yarden, Y. and Sliwkowski, M., Nature Reviews. 2: 127-137, 2001). Por esta razão, EGFR é considerado um antígeno associado a tumor (Ag) muito im-

portante para o desenvolvimento de terapias antitumor.

[003] Existem três tipos de mAbs anti-EGFR comercializados atualmente: cetuximabe (Erbitux), panitumumabe (Vectibix), e nimo- tuzumabe (TheraCIM) (Reichert, J. MAbs. 4: 413-415, 2012) e sete outros estão nas fases I-III de experimentos clínicos (Reichert, J. and Dhimolea, E., Drug Discovery Today, 17: 954-963, 2012). Eles foram especificamente projetados para reconhecimento de região extracelu- lar de EGFR, inibição competitiva de ligação de ligantes e dimerização de receptor, e assim inibir auto-fosforilação de receptor e a cascata de sinalização que conduz a sua ativação (Burgess, A. and others, Mole- cular Cell, 12: 541-552, 2003). Nimotuzumabe (mAb R3) é um mAb humanizado de isotipo IgG1 que reconhece hEGFR obtido através de clonagem de DNA das regiões hiper-variáveis de mAb murino egf/r3 ior e as estruturas humanas das regiões variáveis e constantes das cadeias pesadas e leves (REI y NEWN respectively) (Mateo, C. et al., Immunotechnology 3: 71-8 1, 1997). mAb R3 reconhece o EGFR com similar afinidade e ttem a mesma capacidade para inibir a ligação de EGF ao receptor que seu predecessor murino. Esta variante é menos imunogênica que a versão quimérica de ior egf/r3 mAb (Mateo, C. et al., Immunotechnology 3: 71-8.1, 1997). Nimotuzumabe reconhece um epitope em domínio III da região extracelular de EGFR que sobrepõe com o sítio de ligação dos ligantes neste domínio, o que explica sua habilidade para bloquear ligação de ligante e subsequente ativação de receptor (Tundidor, Y. et al., mAbs 6: 1013-1025, 2014). A eficácia de nimotuzumabe foi demonstrada em experimentos clínicos, em pacien- tes com tumor de cabeça e pescoço (Crombet, T. et al., J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004), glioma (Ramos, T. et al., Cancer Biol. Ther. 5: 375-379, 2006; MacDonald, T. et al., Neuro Oncol, 13: 1049-1058, 2011) e tumor esofageal (Ramos – Suzarte, M. et al. Cancer Biology & Therapy 13: 600-605, 2012). Este anticorpo (Ab) está em fase III de experimentos clínicos para cancer nasofaringgeal, cancer esophageal localmente avançado e carcinoma de célula escamosa esophageal (Galluzi, L. et al., Oncolmmunology, 1: 28-37, 2012).

[004] Diferente de outros Abs direcionados contra EGFR, em ambos, estudos pré-clínicos em macacos verdes Cercopithecus aethi- ops sabaeus (Arteaga, M. and others, Cancer Biology & Therapy. 6:1390-1395, 2007) e em estudos clínicos ( Crombet, T. et al., J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004; Ramos, T. et al., Cancer Biol Ther 5: 375- 379, 2006; Ramos-Suzarte, M. et al., Cancer Biology & Therapy 13: 600-605, 2012; Strumberg, D. et al., Invest New Drugs, 30: 1138-1143, 2010), com nimotuzumabe nenhum sinal de toxidez severa usualmen- te associado com drogas contra este Ag foi detectado. Estas evidên- cias sugerem que nimotuzumabe é o único agente anti-EGFR que po- de ser usado cronicamente (Allan, D.,The Oncologist, 10: 760-761, 2005). O perfil de baixa toxidez, mas com efeito antitumor, deste mAb pode ser devido a sua afinidade intermediária (10-8) (Crombet, T. et al., J. Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004). Os autores prevêm que mAbs com afinidade intermediária devem ter alto efeito antitumor e baixa to- xidez uma vez que absorção por tumor (alta expressão de EGFR) é favorecida sobre absorção em tecido normal (baixa expressão de EGFR). Por outro lado, mAbs de alta afinidade (tal como cetuximabe) podem ser capturados por ambas, células de tumor e normais, e mAbs de baixa afinidade podem ter pequeno efeito devido baixa incorpora- ção em tumors (Crombet, T. et al., J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004). Entretanto, foi descrito que o efeito antitumor de nimotuzumabe de- pende da expressão de EGFR, uma vez que sua eficácia é reduzida em tumores com expressão média ou baixa deste receptor (Akashi, Y. et al., British Journal of Cancer, 98: 749-755, 2008). Por isso, obtenção de uma variante de nimotuzumabe com um moderado aumento em sua afinidade para o receptor pode traduzir-se em um anticorpo (Ab)

com maior efeito antitumor mas que mantem ao mesmo tempo sua baixa toxidez. Obtenção desta variante de afinidade intermediária a partir de nimotuzumabe, e manutenção de sua fina especificidade epi- tópica que é única entre Abs terapêuticos contra EGFR) (Tundidor, Y. et al., mAbs 6: 1013-1025, 2014), pode contribuir para conservação de valiosas propriedades do anticorpo original.

[005] A maturação de afinidade do Abs é um processo que ocorre naturalmente; entretanto, com o desenvolvimento da biologia combina- torial, este fenômeno foi reproduzido em laboratório. Estas tecnologias de evolução direcionada requerem diferentes etapas: mutação, mos- tra, seleção, e amplificação (Wark, K. and Hudson, P., Advanced Drug Delivery Reviews, 58: 657-670, 2006). A tecnologia de mostra de fago proporciona uma poderosa plataforma para a geração de novos Abs humanos e para aperfeiçoamento de sua afinidade in vitro (Hoogenbo- om, H., Nat Biotechnol, 23: 1105-1116, 2005).

[006] Os inventores da presente invenção verificaram variantes que sofreram mutação mostradas em fago de nimotuzumabe, com uma aumentada capacidade de ligação para a região extracelular de hEGFR. O conjunto de mutações que estas variantes possuem não foi anteriormente descrito nem é previsível a partir das analyses da estru- tura de cristal do fragmento de ligação de antígeno (Fab) de nimo- tuzumabe. Por isso, a novidade desta invenção consiste no provimento de novos fragmentos e mAbs que reconhecemhEGFR com uma maior afinidade (3 a 4 vezes maior), de modo que eles podem reconhecer linhas com expressão média de EGFR mais eficientemente do que ni- motuzumabe. Da mesma maneira, estes mAbs mostraram uma maior habilidade para inibir fosforilação de EGFR mediada por ligante como comparados com nimotuzumabe, o que indica que eles têm um efeito antitumor maior que nimotuzumabe. Tudo acima permite suportar o uso destes fragmentos e mAbs no diagnostic ou terapia de tumores com expressão intermediária de EGFR. Breve Descrição da Invenção

[007] A presente invenção refere-se a mAbs recombinantes que reconhecem a região extracelular de hEGFR Her1 e que tem mais de 95% de identidade com relação a anticorpo nimotuzumabe.

[008] Em uma modalidade ela refere-se a mAbs onde as sequên- cias da região determinante complementar (CDR) da CDR2 da região variável das cadeias pesadas é selecionada do grupo compreendendo: - SEQ ID NO: 20 e - SEQ ID NO: 21 as sequências de CDR1 e CDR3 das cadeias pesadas são SEQ ID NO. 9 e SEQ ID NO. 3, respectivamente, e as sequências CDR da re- gião variável das cadeias leves são: - CDR 1 SEQ ID NO. 22 - CDR 2 SEQ ID NO. 23 - CDR 3 SEQ ID NO. 24.

[009] Em uma outra modalidade, os mAbs recombinantes da pre- sente invenção são caracterizados em que a sequência da CDR2 da região variável das cadeias pesadas é selecionada do grupo compre- endendo: - SEQ ID NO. 10, - SEQ ID NO. 11, - SEQ ID NO. 12, - SEQ ID NO. 17, - SEQ ID NO. 18 e - SEQ ID NO. 29, a sequência da CDR1 é SEQ ID NO. 9 e a sequência de CDR3 é SEQ ID NO. 3 nas ditas cadeias pesadas e as sequências das CDRs da re- gião variável das cadeias leves são: - CDR 1 SEQ ID NO. 22

- CDR 2 SEQ ID NO. 23 - CDR 3 SEQ ID NO. 24.

[0010] Uma outra modalidade da presente invenção refere-se a mAbs onde a sequência CDR2 da região variável das cadeias pesadas é selecionada do grupo compreendendo: - SEQ ID NO. 2 e - SEQ ID NO. 8, as sequências da CDR1 e CDR das cadeias pesadas são SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3, respectivamente, e as sequências CDR da região variável das cadeias leves são: - CDR 1 SEQ ID NO. 22 - CDR 2 SEQ ID NO. 23 - CDR 3 SEQ ID NO. 24.

[0011] Ainda em uma modalidade os mAbs da presente invenção são caracterizados em que a sequência CDR1 da região variável das cadeias pesadas é selecionada do grupo compreendendo: - SEQ ID NO. 13 e - SEQ ID NO. 19, as sequências CDR2 e CDR3 das cadeias pesadas são SEQ ID NO. 14 e SEQ ID NO. 3, respectivamente, e as sequências CDR da região variável das cadeias leves são: - CDR 1 SEQ ID NO. 22 - CDR 2 SEQ ID NO. 23 - CDR 3 SEQ ID NO. 24.

[0012] Particularmente, a presente invenção refere-se a um mAb caracterizado por ter a seguinte sequência de região variável das ca- deias pesadas e leves: Cadeia pesada - CDR1 SEQ ID NO. 15 - CDR2 SEQ ID NO. 16

- CDR3 SEQ ID NO.3 Cadeia leve - CDR 1 SEQ ID NO. 22 - CDR 2 SEQ ID NO. 23 - CDR 3 SEQ ID NO. 24.

[0013] A presente invenção abrange todos os prévios mAbs onde as regiões de estrutura (FW) da região variável das cadeias pesadas e leves têm as seguintes sequências: Cadeia pesada - FW 1 SEQ ID NO. 4 - FW 2 SEQ ID NO. 5 - FW 3 SEQ ID NO. 6 - FW 4 SEQ ID NO. 7 Cadeia leve - FW 1 SEQ ID NO. 25 - FW 2 SEQ ID NO. 26 - FW 3 SEQ ID NO. 27 - FW 4 SEQ ID NO. 28

[0014] Adicionalmente, os Abs mostrados compreendem as regi- ões constantes IgG1 para cadeia pesada e kappa humana para cadeia leve.

[0015] Em uma particular modalidade ela refere-se aos fragmentos derivados dos prévios mAbs onde os ditos fragmentos podem ser do tipo Fab, (Fab)2 e fragmentos de região variável de cadeia simples.Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma composi- ção farmacêutica útil em terapia de câncer que tem como princípio ati- vo os mAbs ou fragmentos mostrados em uma faixa de 50 a 400 mg e um carreador farmaceuticamente aceitável. Adicionalmente, ela é rela- cionada a uma composição farmacêutica útil no diagnóstico de tumo- res cujo princípio ativo sejam mAbs ou fragmentos mostrados em uma faixa de 1 a 9 mg e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0016] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se ao uso de mAbs e fragmentos mostrados na terapia de tumores que expressam EGFR, assim como no diagnóstico de tumores transpor- tando EGFR, quando eles são conjugados a um apropriado marcador. Ela também está relacionada ao uso destes mAbs e fragmentos para direcionar a resposta imune contra tumores positivos EGFR, quando eles estão conjugados com proteínas ou domínios de proteínas de in- teresse imunológico. Descrição Detalhada da Invenção Obtenção de fragmentos derivados de nimotuzumabe com au- mentada capacidade de ligação à região extracelular de EGFR humano

[0017] A presente invenção refere-se a 13 fragmentos derivados de nimotuzumabe que compartilham mais que 97% de identidade com a sua sequência de aminoácidos e têm aumentada habilidade para ligação com a região extracelular de hEGFR. Mutações das variantes descritas na presente invenção conduzem a obtenção de variantes de nimotuzumabe com a habilidade para reconhecer um maior número de células humanas com um meio de expressão de EGFR como compa- radas com o Fab original de nimotuzumabe.

[0018] Os fragmentos descritos na presente invenção podem ser obtidos através de seleção de variantes que sofreram mutação do Fab de nimotuzumabe devido a sua habilidade para ligar a região extrace- lular de hEGFR,a partir de bibliotecas de mais que 107moléculas mos- tradas em fago filamentoso. Os genes correspondendo a estas varian- tes podem ser inseridos em vetores de expressão tipo fagemídeo (fun- didos a um dos genes codificando as proteínas de capsídeo do fago filamentoso) e usados para a produção de partículas virais que ex- põem em sua superfície as variantes de proteínas. As bibliotecas de partida podem incluir diferentes graus de diversificação em um conjun- to de posições das regiões determinantes complementares (CDRs), o que pode permitir uma inteira exploração desta região, o que é funcio- nalmente importante para a interação Ag-Ab. Cada um dos resíduos originais nestas posições pode ser substituído por uma mistura dos 20 aminoácidos, por um conjunto pré-definido de resíduos que comparti- lham alguma propriedade(s) física tal como hidrofobicidade, caráter aromático, carga líquida e/ou tamanho, ou ser submetido a randomiza- ção suave através de introdução de uma proporção em minoria de uma mistura randômica de nucleotídeos em cada correspondente po- sição de códon (que pode manter uma predominância da sequência original). As posições escolhidas podem ser simultaneamente diversifi- cadas na mesma biblioteca, ou em várias bibliotecas separadas. Estas bibliotecas podem conter proporções variáveis de moléculas com uma ou várias mutações, conservativas ou não, com relação ao Fab de ni- motuzumabe original. Seleção de fragmentos análogos e mAbs de nimotuzumabe com aumentada capacidade de ligação para a região extracelular de hEGFR

[0019] A seleção de fagos que têm variantes com aumentada ca- pacidade de ligação para a região extracelular de hEGFR pode ser ba- seada na incubação das misturas de fagos a partir das bibliotecas em contato com o Ag hEGFR. Imobilizado sobre uma superfície sólida, a remoção de fagos não ligados através de lavagem, e a eluição de fa- gos ligados sob condições que interferem com interações de proteí- nas. Vários ciclos sucessivos de seleção podem ser realizados sob condições similares. A análise das sequências de DNA inseridas nos fagemídeos selecionados pode revelar regularidades que conduzem à identificação da substituição mais abundante que pode estar relacio- nada ao aumento de capacidade de ligação de EGFR. As mutações recorrentes encontradas, se elas são modificações individuais ou combinações de mudanças selecionadas diretamente das bibliotecas, podem ser combinadas entre elas mesmas para formação de novas variantes e obtenção de adicionais aumentos em capacidade de liga- ção de EGFR.

[0020] A capacidade de ligação ao hEGFR de cada uma das vari- antes selecionadas diretamente das bibliotecas, ou desenhadas e construídas mais tarde, pode ser avaliada através de técnicas imuno- químicas tomando vantagem do formato de mostra de fago que permi- te a caracterização simultânea de múltiplas variantes.

[0021] Alternativamente, os fragmentos da presente invenção po- dem ser obtidos através de exploração de outras plataformas de biolo- gia combinatorial, tal como mostra de ribossomas ou leveduras.

[0022] Adicionalmente, os genes que codificam as novas regiões variáveis podem ser clonados em vetores de expressão de células mamíferas e produzem os mAbs recombinantes contendo as novas mutações. Também pode ser verificado que neste formato, os mAbs obtidos retêm a habilidade para reconhecer preferencialmente a região extracelular de hEGFR como comparado a nimotuzumabe, através de medições de afinidade baseadas em ressonância plasmon de superfí- cie (BIAcore). Demonstração da superioridade funcional dos novos mAbs e fra- gmentos derivados de nimotuzumabe

[0023] Superioridade funcional de cada uma das variantes de fra- gmentos selecionadas diretamente das bibliotecas ou construídas subsequentemente em fragmentos ou formatos Abs completos, pode ser demonstrada em ensaios in vitro ou in vivo. Para cada variante, o reconhecimento de linhas de células com diferente expressão de EGFR pode ser avaliado através de citometria de fluxo, verificação de que as novas variantes reconhecem uma maior porcentagem de célu-

las positivas e com uma maior intensidade média de fluorescência; e este efeito é mais evidente em linhas com expressão de EGFR média ou baixa. Para este propósito, células com as seguintes características serão usadas: - alta expressão de EGFR: tal como carcinoma de célula escamosa A431 de origem humana, adenocarcinoma de mama MDA- MB-468 com metástase de fluido pleural de origem humana, sem ser limitado a estas - expressão média de EGFR: adenocarcinoma de pulmão H125 e H292 de origem humana, sem ser limitada a estas. - baixa expressão de EGFR: célula pequena U1906 de câncer de pulmão de origem humana, MDA-MB-231 de adenocarci- noma de mama de origem humana, SKOV3 de carcinoma ovariano, SKBR3 de câncer de mama, sem ser limitado a estas.

[0024] A habilidade de cada mAb ou fragmento para inibir a fosfori- lação de EGFR mediada por seu ligante (EGF) também pode ser ava- liada, em diferentes concentrações e em linhas de células com diferen- te expressão de EGFR. Ensaios de inibição de proliferação através de azul Alamar também podem ser realizados sobre linhas com diferente expressão de receptor. Adicionalmente, a habilidade de cada mAb pa- ra induzir citotoxidez celular dependente de Ab pode ser determinada em linhas com diferente expressão do receptor. Em todos os casos pode ser esperado que as variantes de maior afinidade mostrem um maior efeito e que isto pode ser mais evidente em linhas com expres- são de EGFR média ou baixa.

[0025] Por outro lado, o efeito antitumor de mAbs ou fragmentos em camundongos atímicos transportando tumores humanos com dife- rente expressão de EGFR pode ser medido, onde o retardo em cres- cimento de tumor pode ser medido.

[0026] Adicionalmente, os fragmentos ou mAbs com isótopos radi-

oativos ou com fluoróforos podem ser rotulados e inoculados em ca- mundongos atímicos transportando tumores humanos com diferente expressão de EGFR. Isto permite a avaliação da habilidade dos frag- mentos para detecção in vivo de reconhecimento de tumores, o que suporta seu uso como ferramentas para o diagnóstico de câncer atra- vés de obtenção de imagens. Aplicação terapêutica e métodos de tratamento de novos mAbs e fragmentos derivados

[0027] Os novos mAbs e fragmentos obtidos na presente invenção têm afinidade maior que nimotuzumabe, o que permite uso dos mes- mos em cenários onde nimotuzumabe tem limitações, como em célu- las com expressão baixa ou intermediária de EGFR. Os ditos mAbs podem ser usados no tratamento de pacientes com tumores de cabeça e pescoço, glioma, esôfago, pulmão e pâncreas.

[0028] Para uso terapêutico, os mAbs e fragmentos devem ser administrados a um sujeito transportando a doença tanto independen- temente ou combinados com terapias convencionais para o tratamento de câncer tal como radioterapia ou quimioterapia, para aperfeiçoamen- to de sua ação terapêutica. A rota de administração pode ser qualquer uma daquelas descritas no estado da técnica para a administração pa- renteral de drogas, preferivelmente através de rota intravenosa ou subcutânea.

[0029] Para obter o desejado efeito terapêutico, os mAbs e frag- mentos da presente invenção devem ser administrados em doses que estão na faixa de concentrações para as quais eles produzem um efei- to antitumor sem manifestações tóxicas. As faixas de doses a serem exploradas podem variar de 50 mg a 400 mg por paciente em 6 ciclos semanais de tratamento. Tratamento com as novas variantes com maior afinidade pode ser ajustado para administrar doses menores e manter um efeito similar àquele de nimotuzumabe ou a dose recomen-

dada para nimotuzumabe (200 mg) pode ser usada, mostrando um maior efeito antitumor, que pode depender do perfil de toxidez dos no- vos mAbs e fragmentos.

[0030] Os mAbs e fragmentos da presente invenção podem ter aplicação para o diagnóstico de tumores positivos EGFR através de conjugação dos mesmos com radioisótopos ou fluoróforos; uma vez que eles têm maior afinidade e habilidade para reconhecer células com expressão média ou baixa de EGFR, o que é uma vantagem comparado a nimotuzumabe no diagnóstico de tumores com esta ca- racterística.

[0031] Para uso dos mesmos como ferramentas de detecção estes mAbs e fragmentos podem ser administrados em pacientes que trans- portam tumores para identificar por meio de formação de imagem a localização do tumor ou possíveis metástases positivas EGFR. Os mAbs e fragmentos conjugados a radioisótopos ou fluoróforos devem ser administrados em doses na faixa de concentrações para as quais as cinéticas de distribuição nos tecidos e sua eliminação tornam pos- sível obtenção de rápidas imagens de qualidade. Esta faixa pode ser de 0,5 mg a 9 mg por paciente, preferivelmente 3 mg.

[0032] Adicionalmente, os fragmentos descritos na presente in- venção podem ser fundidos a proteínas ou domínios de proteínas de interesse imunológico, com o objetivo de direcionamento de resposta imune para as células de tumor positivas EGFR. Esta aplicação tem a vantagem de potencial combinação de ambas terapias separadamente através de concentração de resposta no sítio de tumor; fragmentos Fab provêm especificidade para células de tumor que expressam o Ag, enquanto proteínas ou domínios de proteínas fundidas desempenham seu papel imunológico, o que pode ter um efeito superior para monote- rapias. Composições Farmacêuticas

[0033] Os mAbs e fragmentos descritos na presente invenção são administrados como parte de uma composição terapêutica útil em te- rapia de câncer. Preferivelmente, a presente invenção abrange com- posições farmacêuticas, compreendendo um carreador farmaceutica- mente aceitável. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a: solução salina, solução salina tamponada com fosfato, e similares. Outros agentes tamponantes, agentes disper- santes, e substâncias inertes não tóxicas apropriadas para administra- ção a um paciente podem ser incluídos nas composições da presente invenção. As composições são normalmente estéreis e livres de partí- culas indesejáveis.

[0034] A presente invenção é ainda elaborada com os seguintes exemplos e desenhos. Entretanto, estes exemplos não devem ser construídos como limitantes do escopo da invenção. Breve Descrição das Figuras

[0035] Figura 1. Avaliação através de ELISA do reconhecimento de FabR3 mostrado em fagos filamentosos. As diferentes preparações de fagos purificados foram ajustadas para uma concentração equiva- lente a 1012 partículas virais / mL. Absorbância foi medida em 490 nm.

[0036] Figura 2. Avaliação através de ELISA da reatividade da mistura de fago da biblioteca FabR3 após três rodadas de seleção contra a região extracelular de EGFR humano. As diferentes prepara- ções de fagos purificadas foram ajustadas para uma concentração equivalente a 1011 partículas virais / mL. Absorbância foi medida em 490 nm.

[0037] Figura 3. Alinhamento da sequência de aminoácidos das ttrês CDRs da região variável de cadeia pesada (VH) de nimotuzuma- be e das 11 variantes do FabR3 com sequências únicas após três ro- dadas de seleção da biblioteca contra a região extracelular de EGFR humano. Os traços indicam que o aminoácido original foi mantido na-

quela posição. O número de vezes que a sequência foi repetida é indi- cado em parênteses.

[0038] Figura 4. Avaliação através de ELISA do reconhecimento de variantes de FabR3 mostradas em fagos com sequências únicas obtidas a partir da biblioteca de randomização suave após três roda- das de seleção contra a região extracelular de EGFR humano. As pre- parações de fagos foram previamente normalizadas de acordo com as quantidades de proteínas mostradas. (A) Variantes incluídas em grupo 1, têm somente mutações na CDR2 da VH. (B) Variantes de grupo 2, apresentam mutações na CDR1 e a CDR2 de VH. Absorbância foi medida em 490 nm.

[0039] Figura 5. Variantes de FabR3 sobre fagos construídos a partir de combinação da mutação CDR1 mais recorrente e as muta- ções CDR2 das melhores variantes de FabR3 de grupo 1. (A) Alinha- mento da sequência de aminoácidos das três CDRs da VH do nimo- tuzumabe original e as duas variantes construídas. (B) Avaliação atra- vés de ELISA do reconheci mento das variantes construídas. Absor- bância foi medida em 490 nm.

[0040] Figura 6. Reconhecimento de células da linha H125 pelo Fab derivado de nimotuzumabe, mAbs K4 e K5. (A) Gráfico de pontos mostrando a porcentagem de células positivas EGFR reconhecidas. (B) Histogramas de intensidade média de fluorescência (células positi- vas EGFR).

[0041] Figura 7. Inibição de fosforilação de EGFR mediada por EGF e induzida por nimotuzumabe e MAb K4 e K5. (A) Linha H125, que tem uma expressão média de EGFR. (B) linha MDA-MB-468, com alta expressão de EGFR. Exemplos Exemplo 1: Mostra de fago filamentoso de M13 bem-sucedida do fragmento de ligação de antígeno de nimotuzumabe (FabR3)

[0042] Os genes codificando as regiões variáveis das cadeias le- ves (VL) e pesadas (VH) de nimotuzumabe flanqueadas pelos sítios de restrição ApaLI / XhoI e Sfil / BstEII, respectivamente, foram amplifica- dos por PCR.

Ambos fragmentos de gene VL e VH foram clonados em vetor pCES1 (Haard, H., Methods in Molecular Biology.178: 87-100, 2002) seguido pelos genes codificando a região constante leve kappa (CK) e região pesada constante (CH1), respectivamente.

O gene codi- ficando a região CH1 está ligado a um gene codificando o peptídeo etiqueta c-myc e seguido pelo gene III.

Esta construção genética codi- ficou um fragment ligante Ag derivado de nimotuzumabe (FabR3). Bactérias competentes de linhagem TG1 das espécies Escherichia coli foram transformadas com as resultants construções genéticas e usa- das para produção e purificação de fagos mostrando FabR3 fundido à proteína P3 do capsídeo viral, em uma escala de 50 mL (Marks, J. et al.

J.

Mol.

Biol. 222: 581-597, 1991). O específico reconhecimento de fagos purificados mostrando as moléculas foi avaliado por ELISA (Fi- gura 1). Para este fim, placas de poliestireno (MaxiSorp, USA) foram revestidas com o Ag de nimotuzumabe, a região extracelular do EGFR humano (Her1) (Ramirez, B. et al., Int.

J.

Cancer, 119: 2190-2199, 2006), o mAb 9E10 etiqueta anti c-myc (Center of Genetic Engineering and Biotechnology of Sancti Spiritus, Cuba) e BSA como uma molécu- la não relacionada.

Os fagos ligados foram detectados com o mAb an- ti-M13 conjugado a peroxidase de raiz forte (GE Healthcare, USA) e o correspondente substrato da enzima.

Como mostrado na Figura 1, FabR3 mostrado sobre fagos foi propriamente dobrado, medido por reconhecimento de mAb 9E10 que detecta os níveis de mostra e por- que ele reteve a habilidade de nimotuzumabe para reconhecer especi- ficamente Her1. Exemplo 2: Seleção e caracterização de fagos filamentosos mos- trando fragmentos de variantes de FabR3 com maior reatividade para a região extracelular de EGFR humano

[0043] Uma estratégia de randomização suave de 25 resíduos, localizados em segmentos em protrusão das três CDRs (de acordo com a definição AbM) da cadeia pesada de nimotuzumabe, foi dese- nhada. Maioria dos mesmos (24/25) foi substituída por uma mistura que potencialmente conteve todos os 20 aminoácidos, mas que reteve o resíduo original na maioria das moléculas da biblioteca. Para este fim, codons degenerados que preservaram o nucleotide original em 90% em cada posição foram introduzidos, enquanto os restantes 10% corresponderam a uma mistura equimolar dos outros três nucleotí- deos. O outro resíduo (F29) foi somente substituído por outros resí- duos hidrofóbicos (I, L, M, V), embora o resíduo original tenha predo- minado na maioria das moléculas da biblioteca. Para assim fazer, um códon degenerado foi usado em posições um e três do tripleto que manteve 90% do nucleotide origin nal (T e C respectivamente) en- quanto os restantes 10% corresponderam a uma mistura equimolar dos outros três nucleotídeos, a segunda posição do tripleto (T) não foi modificada. A biblioteca designada foi construída em um format Fab através de clonagem de regiões variáveis em vetor pCES-1. Desta maneira, uma biblioteca de variantes Fab de Nimotuzu mabe compos- ta por 1,5x107 membros foi construída.

[0044] Os fagos produzidos a partir da biblioteca foram purificados por precipitação com polietileno glycol de acordo com procedi mentos previamente estabelecidos (Marks, J. et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991). Para isolar variantes de mutação mostradas em fago funcionais de FabR3 com maior capacidade de ligação a seu antígeno as partícu- las virais foram incubadas sobre tubos imuno (Nunc, Dinamar- ca)revestidos com Her1. Após lavagem para remoção de fagos não ligados, os fagos ligados foram eluídos através de incubação com uma solução básica de trietilamina. Bactérias de linhagem TG1 foram infec-

tadas com os fagos selecionados, que foram amplificados com fago auxiliary M13KO7, e usados como material de partida para um novo round de seleção. Três rodadas de seleção de fagos foram realizados e um aumento na reatividade através de Her1 da mistura de fagos quando o número de ciclos aumentou foi observado (Figura 2). O se- quenciamento dos genes inseridos no fagemídeo selecionado, que originou-se do terceiro ciclo de seleção, descreveu 11 sequências úni- cas divididas em dois grupos (Figura 3). O primeiro grupo consistiu em variantes nas quais somente a CDR2 foi randomizada e o segundo grupo onde apareceram mutações na CDR1 e CDR2. Exemplo 3: Demonstração do aumento da reatividade das novas variantes de FabR3 mostradas em fagos filamentosos pela região extracelular de hEGFR

[0045] Bactérias competentes da linhagem TG1 de E. coli foram transformadas com as construções genéticas resgatadas após três rodadas de seleção que contiveram sequências únicas diferentes da- quela do nimotuzumabe original. A partir destas sequências, fagos mostrando variantes de FabR3 que foram produzidas e purificadas. Para determinar a reatividade destas novas variantes através de Her1, o reconhecimento de preparações de fago em diferentes concentra- ções de partículas virais foi determinado por ELISA. Todas as varian- tes avaliadas, as 6 com mutações exclusivamente na CDR2 (Figura 4A), e as 5 com mutações na CDR1 e CDR2 (Figura 4B) mostraram maior reatividade na direção de Her1 que o FabR3 original nas diferen- tes concentrações avaliadas. Adicionalmente, duas novas variantes foram construídas através de mutagênese Kunkel que combinou as mutações CDR2 que mais aumentaram reatividade, com a mutação mais recorrente da CDR1 (Figura 5A). O reconhecimento destas novas variantes foi avaliado por ELISA. A combinação das mutações foi compatível porque ambas variantes mostraram uma maior reatividade para Her1 que o FabR3 mostrado em fago original (Figura 5B). Exemplo 4: Demonstração de aumentada afinidade das novas va- riantes de nimotuzumabe produzidas como proteína solúvel em células mamíferas

[0046] Os genes codificando a VH original de nimotuzumabe (mAb R3) e a VH das duas variantes construídas de nimotuzumabe com mu- tações na CDR1 e CDR2, como descrito no Exemplo 3 (Figura 5A) e que foram nomeadas K4 e K5, assim como a região variável de cadeia leve kappa original (VK) de nimotuzumabe foram clonados nos vetores de expressão de células mamíferas pSV-gpt e pSV-hyg, respectiva- mente (Orlandi, R. et al., PNAS 3833-3837, 1989). Os vetores com os genes de interesse foram linearizados com enzima Pvu I e precipita- dos na presença de etanol. O DNA reconstituído em solução salina tamponada com fosfato foi usado para eletroporar células NS0. Para obter R3, mAb K4 e K5 produzindo clones, 4 µg do vetor pSV-gpt com a correspondente VH (Tabela 1) e 8 µg do vetor pSV-hyg-VK do nimo- tuzumabe original foram cotransfectados. O procedimento para obter clones estáveis foi realizado com xantina, hipoxantina e ácido micofe- nólico como drogas de seleção. Esta metodologia permitiu obtenção de três moléculas de interesse como Abs de isotipo IgG1 e kappa ca- deia leve. Os Abs produzidos foram purificados do sobrenadante por cromatografia de afinidade de proteína A. Tabela 1. Descrição dos genes VH e VL usados para cotransfecção de células NS0 para produção de mAbs R3, K4 e K5 pSV-gpt-VH pSV-hyg-Vk R3 mAb Original Original K4 mAb Mutações 3AS4+3AS22 Original K5 mAb Mutações 3AS4+3AS30 Original

[0047] Para demonstrar que as mutações obtidas sobre fagos que neste formato mostraram uma afinidade maior na direção de Her1, causaram o mesmo efeito no Ab completo, foi decidido medir-se a afi-

nidade através de Biacore. Primeiramente, o Fab derivado de mAbs R3, K4 e K5 foram obtidos por digestão enzimática com papaína e subsequente separação através de proteína A. Como mostrado na Ta- bela 2, o novo mAb K4 e K5 mostrou um aumento em afinidade de 3 e 3,6 vezes, respectivamente, com relação a mAb R3. Tabela 2. Aumento de afinidade de mAb K4 e K5 com relação a nimo- tuzumabe Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M) Aumento R3 mAb 1,879*104 12,483*10-4 6,643*10-8 - K4 mAb 2,743*104 6,019*10-4 2,194*10-8 3X K5 mAb 3,305*104 6,098*10-4 1,845*10-8 3,6X Exemplo 5: O Fab derivado de mAbs K4 e K5 produzido em célu- las mamíferas mostrou maior reconhecimento de linha de células humanas de adenocarcinoma de pulmão H125 do que o Fab deri- vado de nimotuzumabe

[0048] A habilidade dos Fabs derivados de mAbs K4 e K5 para reconhecer a molécula Her1 foi determinada. Neste caso, o reconhe- cimento de Her1 foi avaliado por citometria de fluxo em uma linha de células, seu contexto natural. Para este fim, os Fabs derivados de mAbs R3, K4 e K5 foram incubados a 1,25 µg/mL com linha de célula humana de adenocarcinoma de pulmão H125, que tem uma expressão média do receptor. Os Fabs ligados a Her1 na membrana das células foram detectados com um mAb de cadeia leve kappa anti-humana camundongo conjugado a ficoeritrina. Como evidenciado em Figura 6A, o Fab derivado de mAbs K4 e K5 reconheceu uma maior porcen- tagem de células positivas Her1 e com maior intensidade média de fluorescência (FMI) (Figura 6B) como comparado ao Fab derivado de mAB R3. Exemplo 6: O aumento em afinidade do mAb K4 e K5 resultou em uma maior capacidade destes Abs para inibir a fosforilação de EGFR mediada por EGF

[0049] Para determinar a capacidade dos novos mAbs para inibir fosforilação mediada por EGF, foi realizado um ensaio Western Blot. Duas linhas de células foram usadas:

[0050] Linha de células humanas de adenocarcinoma de pulmão H125 (média expressão de EGFR);

[0051] MDA-MB-468 de adenocarcinoma de mama com metástase de fluido pleural de origem humana (alta expressão de EGFR).

[0052] As células foram tratadas por 2 horas com os mAbs R3, K4 e K5 em 10 µg/mL, 5 µg/mL e 2,5 µg/mL. Subsequentemente, o meio foi removido para eliminar os mAbs não ligados às células, meio novo com EGF humano foi adicionado por 10 minutos para induzir fosforila- ção do receptor. A seguir, um lisado foi realizado em tampão RIPA a partir destas células expostas aos diferentes tratamentos. Concentra- ção de proteína foi quantificada de acordo com as instruções do kit de reagente de ácido bicinconínico (Pierce). 25 µg de proteínas dos lisa- dos foram aplicados em um gel SDS-PAGE 9% e as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose. O Ab primário pro- duzido em anti-pEGFR de coelho (Y1068) foi usado para detectar EGFR fosforilado (Fosfo-EGFR). O teor de proteína foi visualizado com o Ab secundário anti-coelho ligado ao fluoróforo HRP seguido pe- lo substrato quimioluminescente (Pierce). Os gráficos mostram o sinal obtido com o Fosfo-EGFR, que indica a quantidade desta proteína no lisado de células. Como evidenciado na Figura 7, em todas as concen- trações avaliadas, mAbs K4 e K5 mostraram uma maior habilidade pa- ra inibir fosforilação de EGFR mediada por EGF em ambas linhas de células como comparados a nimotuzumabe. Além disso, ambos mAbs na concentração mais baixa avaliada têm maior ou o mesmo efeito como nimotuzumabe mais alta concentração avaliada (4 vezes mais concentrado). Embora para todos os mAbs a inibição seja maior na linha MDA-MB-468, com maior expressão do receptor (Figura 7B), é importante destacar que o efeito inibidor do mAb K4 e K5 não é perdi- do na linha de células com menor expressão do receptor (Figura 7A) como ocorre com nimotuzumabe.

O acima provê uma vantagem para o uso destes novos mAbs obtidos a partir de incorporação de muta- ções na região variável de Nimotuzumabe, que resultam em uma mai- or afinidade para seu ligante e em uma maior atividade biológica.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal recombinante (mAb) que reconhe- ce a região extracelular do receptor de fator de crescimento de epi- derme humana (Her1), caracterizado por compartilhar mais que 95% de identidade com relação ao anticorpo nimotuzumabe e que a se- quência CDR2 da região variável das cadeias pesadas é selecionada do grupo compreendendo: - SEQ ID NO. 20 e - SEQ ID NO. 21, a sequência de CDR1 é SEQ ID NO. 9 e a sequência de CDR3 é SEQ ID NO. 3 nestas cadeias pesadas e as sequências CDR da região va- riável das cadeias leves são: - CDR 1 SE ID NO. 22 - SEQ ID NO. 23 - CDR 3 SEQ ID NO. 24.

2. mAb que reconhece Her1, caracterizado por a sequência CDR2 da região variável das cadeias pesadas ser selecionada do gru- po compreendendo: - SEQ ID NO. 10, - SEQ ID NO. 11, - SEQ ID NO. 12, - SEQ ID NO. 17, - SEQ ID NO. 18 e - SEQ ID NO. 29, a sequência de CDR1 é SEQ ID NO. 9 e a sequência de CDR3 é SEQ ID NO. 3, estas cadeias pesadas e as sequências CDR da região vari- ável das cadeias leves são: - CDR 1 SEQ ID NO. 22 - CDR 2 SEQ ID NO. 23 - CDR 3 SEQ ID NO. 24.

3. mAb que reconhece Her1, caracterizado por a sequência CDR2 da região variável das cadeias pesadas ser selecionada do gru- po compreendendo: - SEQ ID NO. 2 e - SEQ ID NO. 8, a sequência de CDR1 é SEQ ID NO. 1 e a sequência de CDR3 é SEQ ID NO. 3, estas cadeias pesadas e as sequências CDR da região vari- ável das cadeias leves são mostradas abaixo: - CDR 1 SEQ ID NO. 22 - CDR 2 SEQ ID NO. 23 - CDR 3 SEQ ID NO. 24.

4. mAb que reconhece Her1, caracterizado por a sequência CDR1 da região variável das cadeias pesadas ser selecionada do gru- po compreendendo: - SEQ MID NO. 13 e - SEQ ID NO. 19, a sequência CDR2 é SEQ ID NO. 14 e a sequência de CDR3 é SEQ ID NO. 3 estas cadeias pesadas e as sequências CDR da região vari- ável das cadeias leves são: - CDR 1 SEQ ID NO. 22 - CDR 2 SEQ ID NO. 23 - CDR 3 SEQ ID NO. 24.

5. mAb que reconhece Her1, caracterizado por o CDR da região variável das cadeias pesadas e leves conter as seguintes se- quências: Cadeia pesada - CDR1 SEQ ID NO. 15 - CDR2 SEQ ID NO. 16 - CDR3 SEQ ID NO.3 Cadeia leve

- CDR 1 SEQ ID NO. 22 - CDR 2 SEQ ID NO. 23 - CDR 3 SEQ ID NO. 24.

6. mAb de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por regiões de estrutura (FW) da região variável das cadeias pesadas e leve terem as seguintes sequências: Cadeia pesada - FW 1 SEQ ID NO. 4 - FW 2 SEQ ID NO. 5 - FW 3 SEQ ID NO. 6 - FW 4 SEQ ID NO. 7 Cadeia leve - FW 1 SEQ ID NO. 25 - FW 2 SEQ ID NO. 26 - FW 3 SEQ ID NO. 27 - FW 4 SEQ ID NO. 28

7. mAb de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a sequência das regiões constantes de cadeia pe- sada ser uma IgG1 humana.

8. mAb de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por regiões constantes de cadeia leve serem kappa humana.

9. Fragmento derivado do mAb como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser um fragmento de tipo Fab.

10. Fragmento de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado por ser um fragmento de tipo (Fab)2.

11. Fragmento de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado por ser um fragmento de região variável de cadeia simples.

12. Composição farmacêutica, caracterizada por ser útil em terapia de câncer tendo como ingrediente ativo o Ab ou fragmentos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 em uma faixa de 50 a 400 mg e um veículo farmaceuticamente aceitável.

13. Composição farmacêutica, caracterizada por ser útil no diagnóstico de tumores tendo como ingrediente ativo os Abs ou frag- mentos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 em uma faixa de 1 a 9 mg e um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Uso dos Abs e fragmentos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por ser na terapia de tu- mores expressando EGFR.

15. Uso dos Abs e fragmentos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por ser quando eles são conjugados a um apropriado marcador para o diagnóstico de tumores transportando EGFR.

16. Uso dos Abs ou fragmentos como definidos em qual- quer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por ser quando eles são conjugados com proteínas ou domínios de proteínas de interesse biológico para direcionar a resposta imune contra tumores positivos EGFR.