CN104530237B - 抗Her1的治疗性抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能够结合人Her1细胞外子区域D4的全人源单克隆抗体，该抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导肿瘤细胞的死亡。本发明通过构建合成的全人源噬菌体抗体库并淘选出相应的抗体，通过与细胞外域Her1 ECD和其他子区域D1D2，D3和D3D4的结合特性分析，显示出本发明的抗体具有比尼妥珠单抗更强的亲和力，可以和其他抑制Her 1细胞外子区域D3的抗体联合使用用于治疗Her 1过表达的恶性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种全人源的IgG1型抗体，该抗体与人表皮生长因子受体(EGFR或Her1)的细胞外域的不同子区域结合。本发明进一步涉及该抗体抑制Her1表达的肿瘤细胞增殖的方法。本发明还涉及这类抗体对于治疗各种恶性疾病的用途。
背景技术
Her家族与肿瘤的联系已经在文献中被广泛描述，这些受体通过同型或异型二聚物的形式在激酶家族成员内形成信号复合物(Yarden and Sliwkowski,Nat Rev Mol CellBiol.2001,2:127-37)。抗Her家族成员的药物能够抑制配体结合和受体的激活，经由补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)诱导受体内化和向下调节，增强受体降解来介导免疫系统应答(Ciardiello and Tortora,N Engl J Med.2008,358:1160-74)。
Her1是一个已经被验证的肿瘤免疫治疗的靶点(Mendelsohn,Endocr RelatCancer.2001,8:3-9)。在目前的临床实践中，一个治疗策略就是针对受体的特异性抗体的应用，包括西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗(et al.,Immunol Lett.2008,116:126-40；Quatrale et al.,Front Biosci(Landmark Ed).2011,16:1973-85)。尼妥珠单抗在临床上成功用于内皮源性肿瘤的治疗(Ramakrishnan et al.,MAbs.2009,1:41-8)。众所周知，正如西妥昔单抗和帕尼单抗，尼妥珠单抗作用于Her 1的细胞外子区域3(D3)。
最近的研究显示，同时靶向Her1的非竞争性抗体会更加有效，应用两种抗D3的抗体比单独应用一种抗体，使得具有配体自分泌功能的迁移和增殖细胞会在更大的程度上被抑制。抗体的联合应用会增加受体的向下调节，不必激活下游的信号传导(Spangler etal.,Proc Natl Acad Sci U S A.2010,107:13252-7)。又一个近期在II期临床试验中被应用的抗D3抗体连用的例子，就是Sym004(Koefoed et al.,MAbs.2011,3:584-95)，能够协同抑制肿瘤细胞的生长。Sym004能够在体内和体外诱导小鼠异种移植模型上的受体转移，等效或强效于西妥昔单抗或帕尼单抗(Pedersen et al.,Cancer Res.2010,70:588-97)。此外，这种联合应用显示了在西妥昔抵抗的细胞模型上体内和体外的抗肿瘤活性(Iida etal.,Neoplasia.2013,15(10):1196-206)，同时增加了人肺和头颈部细胞的辐射敏感性(Huang et al.,Mol Cancer Ther.2013,12:2772-81)。非竞争性的抗D3抗体和西妥昔单抗或帕尼单抗都已经被鉴定出来。这种结合能够增强受体的降解，抑制增殖和体外的三阴性乳腺癌细胞的异种移植生长(Ferraro et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2013,110:1815-20)。因此，研究靶向于Her1细胞外域多个不同子区域的新的单克隆抗体是提高EGFR靶点治疗概念的一个极具吸引力的课题。尤其是，到目前为止，在临床上还没有靶向于D4子区域的抗体被评价。
发明内容
本发明的主要目的在于获得识别Her1细胞外子区域4(D4)的全人源单克隆抗体。本发明的另一个主要目的是应用这类单克隆抗体治疗Her1表达的肿瘤。
相应地，本发明涉及从合成的全人源噬菌体抗体库中挑选结合重组Her1细胞外子区域3-4(D3D4)的全人源单克隆抗体；这些抗体在抑制Her1表达的肿瘤细胞的增殖和诱导细胞死亡中的用途；这些抗体和其他抑制Her1细胞外子区域D3的抗体在治疗一些恶性疾病中的联合使用。
本发明的技术方案如下：
本发明同时提供了一种能够结合人Her1细胞外子区域D4的全人源单克隆抗体，该抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导肿瘤细胞的死亡，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其重链可变区依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO 1或17所示；所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO 2或18所示；所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO 3或19所示；
其轻链可变区依次包含高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’的氨基酸序列如SEQ ID NO 4或20所示；所述CDR2’的氨基酸序列如SEQ ID NO 5或21所示；所述CDR3’的氨基酸序列如SEQ ID NO 6或22所示。
其重链框架区序列如SEQ ID NO 7-10或SEQ ID NO 23-26所示，其轻链框架区序列如SEQ ID NO 11-14或SEQ ID NO 27-30所示。
其重链核苷酸序列如序列SEQ ID NO15或31所示，轻链核苷酸序列如序列SEQ IDNO16或32所示。
本发明同时提供了一种单克隆抗体，能够识别Her1ECD和D3D4，但不能单独识别D1D2或D3。
本发明提供的全人源单克隆抗体，所述的抗体能够导致体外抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞死亡的活性。
本发明同时提供了所述的全人源单克隆抗体的筛选方法，该筛选方法包含下面的步骤：
(1)获得合成的人噬菌体展示Fab片段库；
(2)筛选：应用重组Her1细胞外子区域D3D4从人抗体库中筛选；
(3)评价结合特性：应用Her1细胞外域ECD和子区域D1D2,D3和D3D4来评价选中的特异性抗体的结合特性；
(4)评价Her1过表达的肿瘤细胞系的抗增殖和诱导细胞死亡的效果。
本发明提供了所述的全人源单克隆抗体用于制备治疗EGFR过表达的恶性疾病的药物中的用途。
其中，所述的药物为一种治疗性抗体联合应用靶向于Her 1子区域D3的另一种治疗性抗体。
其中所述的一种治疗性抗体是如上所述的全人源单克隆抗体，所述的另一种治疗性抗体是尼妥珠单抗。
本发明的另一个优选的实施例是关于D1和E1抗体在Her1表达的肿瘤细胞中对于抑制增殖和诱导细胞死亡的能力的实验。
附图说明
图1：合成的scFv模板基因(VH-linker-Vlambda)，用于构建抗体库。两侧是限制性酶切位点ApaLI和NotI，在每个CDR3区包含连续3个终止密码子。
图2：在pHAB噬菌粒内基于scFv模板基因的基因构建。
图3：反义诱变寡核苷酸，用于增加库中CDR3序列中VH(A-C)and Vλ(D-E)的多样性。
图4a：pTSE质粒载体图。
图4b：组氨酸标记的Her1细胞外子区域I-II(D1D2)和III-IV(D3D4)的表达。Her1的细胞外域应用亲和色谱柱纯化(León et al.,J Chromatogr B Analyt Technol BiomedLife Sci.2009,877:3105-10)。
图4c：尼妥珠单抗对重组Her1细胞外域和它的子区域的结合。抗人CD6抗体T1h用作阴性对照(Roque-Navarro et al.,Hybrid Hybridomics.2003,22:245-57)。
图4d：D1和E1抗体对于重组Her1细胞外域的D3D4的结合。
图5a：单生物素化的重组Her1细胞外域D1D2,D3和D3D4的表达。
图5b：尼妥珠单抗hR3、D1和E1对重组Her1细胞外域和它的子区域的结合。
图5C：D1和E1抗体的亲和力。
图6：D1和E1抗体在Her1过表达的肿瘤细胞系中抑制细胞增殖的能力。
相应序列的简要说明
SEQ ID NO 1-3：D1重链可变区的高变区的氨基酸序列
SEQ ID NO 4-6：D1轻链可变区的高变区的氨基酸序列
SEQ ID NO 7-10：D1重链框架区的氨基酸序列
SEQ ID NO 11-14：D1轻链框架区的氨基酸序列
SEQ ID NO 15：D1重链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO 16：D1轻链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO 17-19：E1重链可变区的高变区的氨基酸序列
SEQ ID NO 20-22：E1轻链可变区的高变区的氨基酸序列
SEQ ID NO 23-26：E1重链框架区的氨基酸序列
SEQ ID NO 27-30：E1轻链框架区的氨基酸序列
SEQ ID NO 31：E1重链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO 32：E1轻链可变区的核苷酸序列
具体实施方式
下面的实施例是用于证实本发明但不仅限于它的范围。现有技术方法的详细描述暂未提供。
实施例1：抗重组Her1D3D4的全人源合成噬菌体展示scFv抗体库的构建和淘选
根据已经建立好的程序(Fellouse and Sidhu,in Making and usingantibodies,CRC Press.2007,157-177)，通过大规模的Kunkel突变法(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1985,82:488-492)来构建合成scFv抗体库。库的模板基因(图1)是基于通过微基音编码连接肽，两侧是限制性酶切位点(Chaudhary et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990,87:1066-1070)连接重链和轻链可变区基因(分别衍生于IGHV1-46和IGLV2-14种系基因)。模板在相应于VH和Vλ的CDR3位置包含三个连续的终止密码子(TAA)3。图2显示基因构建过程，通过克隆合成模板基因进入pHAB噬菌粒载体(Rojaset al.,ACS Chem.Biol.2013,8:376-386)。这种基础构建的多样化是通过和两个系列退化的诱变寡核苷酸(分别靶向VH和Vλ的CDR3，如图3所示)经Kunkel反应实现的。第一个系列经过核苷酸延伸编码8，11或14位的随机氨基酸，被用于替换VH CDR3的终止密码子，而第二个系列合并Vλ的CDR3的10或12位的随机化残基序列，代替终止密码子。电转感受态TG1大肠杆菌细胞用纯化的Kunkel产物来转化，提取出一个scFv抗体库，库容为1.36x1010。
编码Her1D1D2和D3D4的基因片段被克隆入一个pTSE载体中(pTSE载体结构如图4a所示，制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)用于表达组氨酸标记的蛋白，HEK293E细胞用于瞬时转染。重组蛋白从培养基上清中用nickel柱纯化出来，用于包被ELISA板。组氨酸标记蛋白的表达是经过辣根过氧化物酶标记的抗组氨酸标记抗体(图4b)来评价。对hR3(尼妥珠单抗)的结合是通过辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体(购自中山金桥生物技术有限公司)来揭示的(如图4c所示)。正如所预期的，hR3结合到Her1的D3D4区域而非D1D2区域。
Her1的D3D4用于scFv抗体库的淘选，根据已经建立起来的程序(Marks et al.,J.Mol.Biol.1991,222:581-597)，库中的噬菌体采用300mL规模用M13KO7辅助噬菌体释放，然后在免疫管中被固定化的蛋白上进行淘选。绑定噬菌体用100mmol/L的三乙胺洗脱，中和，用于感染以指数方式生长的TG1大肠杆菌细胞。被感染的细胞被用于生产纯化的噬菌体制剂，正如上所述，开始新一轮的选择。在同样的条件下，进行三轮淘选。淘选的过程结束后，TG1感染的克隆被分别挑选出来，用于在96孔板上生产噬菌体(Marks et al.,J.Mol.Biol.1991,222:581-597)。包含噬菌体的上清通过ELISA方法在包被D3D4微板上检测。绑定噬菌体用抗M13/辣根过氧化物酶缀合物检测，阳性上清用于感染以指数生长的XL-1Blue大肠杆菌细胞，用QIAprep Spin miniprep试剂盒(Qiagen)纯化噬菌粒DNA，送去自动测序，由于具有高的噬菌体ELISA吸收值，D1和E1结合部位从进一步的结构确证中筛选出来。其序列如序列表中所示。
D1和E1结合部位的VH和Vλ的可变区克隆进入pTSE载体，这些载体编码人γ1和λ链。HEK293E细胞用于瞬时转染，人D1和E1IgG1通过蛋白A亲和性色谱柱纯化。两种抗体能够在大范围浓度范围内识别Her1D3D4(图4d)。
实施例2：D1和E1单克隆抗体的结合特性
编码Her1ECD和它的子区域的基因片段被克隆进入pTSE载体中(pTSE载体结构如图4a所示，制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)，体内表达单生物素化的分泌的重组蛋白(Predonzani et al.,BMC Biotechnol.2008,8:41)。Her1ECD,D1D2,D3和D3D4被融合到SV5蛋白标签和一个生物素受体标签(BAP)。载体编码细菌的生物素蛋白连接酶BirA。HEK293E细胞用于瞬时转染，在一个补充生物素的培养基中培养。收集培养上清，经过PBS透析转移走游离的生物素。ELISA板用10μg/mL的链霉抗生素蛋白包被，用0.05％的PBS-Tween 20和1％的牛血清白蛋白(PBS-T-BSA)封闭，加入稀释的培养上清。生物素化的重组蛋白的表达用辣根过氧化物酶标记的鼠抗-SV5抗体(Invitrogen)评估(图5a)，hR3、D1和E1单克隆抗体的结合活性用辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体(购自中山金桥生物技术有限公司)显示(如图5b所示)。正如所预料的，尼妥珠单抗识别生物素化的Her1ECD,D3和D3D4。挑选出的D1和E1结合到Her1ECD和D3D4，但不能结合D1D2或D3。因此，D1和E1抗体能结合到Her1D4或D3和D4之间的接触面，但是并不能单独识别D3。两种抗体不仅能识别结合到平板上的Her1D3D4(图4d)，而且能识别更加天然的构象(图5b)。
通过ELISA方法来评价纯化的E1、D1和hR3抗体对Her1ECD的结合能力。ELISA平板用10μg/mL的Her1ECD包被，用0.05％的PBS-Tween 20和2％的胎牛血清(PBS-T-FBS)封闭，加入稀释的抗体。hR3、D1和E1单克隆抗体的结合能力用AP-偶联的山羊抗人IgG抗体(Sigma)显示。正如所预料的，所有的抗体都能识别Her1ECD，但D1和E1抗体在同样的浓度下达到比hR3更高的光学密度，这暗示出D1和E1抗体具有更强的亲和力(图5c)。
实施例3：D1和E1抗体在Her1过表达的肿瘤细胞中抑制细胞增殖和诱导细胞死亡的活性
D1和E1抗体在Her1过表达的肿瘤细胞系中抑制细胞增殖的能力在体外是通过MTT比色测定法来评价的。A431细胞以10000细胞/孔接种于96孔板，加入1μg/mL D1、E1、hR3、Cetuximab和7A7单抗(Garrido,G.,B.Sanchez,H.M.Rodriguez,P.Lorenzano,D.Alonso,andL.E.Fernandez.7A7MAb:a new tool for the pre-clinical evaluation of EGFR-based therapies.Hybrid Hybridomics 2004；23:168–175)，孵育96小时。上清被陆续转移走，加入MTT(1mg/mL；Sigma)。4小时后，形成的晶体用DMSO溶解，在560nm和620nm下测量光学密度，D1和E1抗体降低了A431活细胞的数量，效果强于Cetuximab和hR3。这个结果与D1和E1抗体不能经过FACS方法识别A431细胞形成鲜明的对比，暗示着他们能够结合与Her1受体过渡态相关的Her1抗原表位(图6)。这个令人吃惊的特性增强了D1和E1抗体的创新性。
Claims (5)
1.一种能够结合人Her1细胞外子区域D4的全人源单克隆抗体，该抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导肿瘤细胞的死亡，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述抗体重链可变区依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO1或17所示；所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO 2或18所示；所述CDR3的氨基酸序列如SEQID NO 3或19所示；
所述抗体轻链可变区依次包含高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’的氨基酸序列如SEQ ID NO 4或20所示；所述CDR2’的氨基酸序列如SEQ ID NO 5或21所示；所述CDR3’的氨基酸序列如SEQ ID NO 6或22所示。
2.根据权利要求1所述的全人源单克隆抗体，其特征在于，所述抗体重链框架区序列如SEQ ID NO 7-10或SEQ ID NO 23-26所示，所述抗体轻链框架区序列如SEQ ID NO 11-14或SEQ ID NO 27-30所示。
3.根据权利要求2所述的全人源单克隆抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区核苷酸序列如序列SEQ ID NO 15或31所示，轻链可变区核苷酸序列如序列SEQ ID NO 16或32所示。
4.根据权利要求1所述的全人源单克隆抗体，其特征在于，所述抗体能够识别Her1ECD和D3D4，但不能单独识别D1D2或D3。
5.根据权利要求1-4任一所述的全人源单克隆抗体用于制备治疗EGFR过表达的恶性疾病的药物中的用途；
所述全人源单克隆抗体联合应用靶向于Her 1子区域D3的一种治疗性抗体；所述一种治疗性抗体为尼妥珠单抗。
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