CN102137874A - 抗表皮生长因子受体的重组抗体组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明系关于用于人类癌症治疗之重组抗体领域。更特定言之，本发明提供对人类EGFR具有两种独特的非重迭结合特异性之抗体组合物的用途。该抗体组合物可在用其它抗EGFR抗体治疗后有效于治疗癌症，无论该癌症是否在该先前治疗期间或之后显示进展皆然。该抗体组合物亦可用于在用本发明之抗体组合物进行第一线治疗后重复治疗复发性肿瘤，因为该组合物不会导致抗性肿瘤选择性。另一治疗用途为使用本发明之抗体组合物治疗对已知抗EGFR抗体具有抗性之癌症。

Description

抗表皮生长因子受体的重组抗体组合物
技术领域
本发明系关于用于人类癌症治疗之重组抗体领域。
背景技术
表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)在细胞增殖以及凋亡、血管生成及转移性扩散(对肿瘤进展至关重要之过程)中发挥着重要作用(Salomon等人，Crit.Rev.Oncology/Haematology，19：183-232(1995)；Wu等人，J.Clin.Invest.，95：1897-1905(1995)；Karnes等人，Gastroenterology，114：930-939(1998)；Woodburn等人，Pharmacol.Therap.82：241-250(1999)；Price等人，Eur.J.Cancer，32A：1977-1982(1996))。实际上，已有研究显示在包括非小细胞肺癌、前列腺癌、乳癌、胃癌及头颈部肿瘤之多种实体瘤中EGFR介导之细胞生长有所增加(Salomon DS等人，Critical Reviews inOncology/Haematology，19：183-232(1995))。此外，现已知癌细胞表面上EGFR之过度活化与晚期疾病、转移性表型之发展及癌症患者之不良预后相关(Salomon DS等人，Critical Reviews in Oncology/Haematology 19：183-232(1995))。
此外，EGFR表达时常伴有由EGFR表达肿瘤细胞产生EGFR配体(尤其TGF-α及EGF)，此表明自分泌环参与此等细胞之进展(Baselga等人，(1994)Pharmac.Therapeut.64：127-154；Modjtahedi等人，(1994)Int.J.Oncology.4：277-296)。因此，阻断该等EGFR配体与EGFR之间的相互作用可抑制肿瘤生长及存活(Baselga等人，(1994)Pharmac.Therapeut.64：127-154)。
EGFR为具有约170kDa分子量之膜结合糖蛋白。EGFR由以短的23个氨基酸之跨膜连接子连接之糖基化外部配体结合域(621个残基)及细胞质域(542个残基)组成。EGFR之细胞外部分含有25个双硫键及12个N连接糖基化位点，且通常认为其由四个子域(sub-domain)组成。EGFR之X射线晶体结构表明该受体采用不能结合EGF之自抑制束缚构形(tethered-conformation)(Ferguson等人，Mol Cell，2003，第11卷：507-517)与可介导EGF配体结合及受体二聚之活性构形(Garret等人，Cell 2002，第110卷：763-773；Ogiso等人，Cell，2002，第110卷：775-787)两者。详言之，已提出域I及域III为高亲和力配体结合位点之形成提供加性贡献。域II及域IV为富含半胱氨酸之层黏连蛋白样区域，其使蛋白质折迭稳定且含有可能的EGFR二聚界面。
已知EGFR以多种不同构形存在于细胞表面，其中束缚构形或锁定构形最为常见。束缚构形不能二聚且因此无活性。已知治疗性抗体尔必得舒(Erbitux)藉由与域III结合且在空间上阻碍受体达到非束缚状态来使束缚构形稳定。然而，一些受体可能仍能够采用非束缚构形，结合配体且二聚。单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)典型地仅可有效结合一种构形，且因此不能有效地靶向展现其它构形之癌细胞或展现多种构形之癌细胞。
针对EGFR之配体结合域的单克隆抗体(mAb)可阻断与EGFR配体之相互作用且随之阻断所得细胞内信号传递路径。
尔必得舒TM(西妥昔单抗(Cetuximab))为与人类(EGFR)之细胞外域特异性结合之重组人类/小鼠嵌合单克隆抗体。尔必得舒系由鼠类抗EGFR抗体之Fv区域与人类IgG1重链及κ轻链恒定区组成且分子量约为152kDa。尔必得舒系在哺乳动物细胞培养物(鼠类脊髓瘤)中产生。尔必得舒已获准用于治疗患有转移性结肠直肠癌且自身之肿瘤表达EGFR之患者。另外，尔必得舒可与放射疗法组合用于治疗患有不能藉由手术移除之头颈部鳞状细胞癌之患者，或用作标准铂基疗法已失败之头颈部鳞状细胞癌之第二线治疗。
维克替比TM(VectibixTM)(帕尼单抗(panitumumab))为与人类EGFR特异性结合之重组人类IgG2κ单克隆抗体。维克替比之分子量约为147kDa。帕尼单抗系在遗传工程改造之哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢(Chinese HamsterOvary))中产生。维克替比已获准用于治疗患有转移性结肠直肠癌、自身之肿瘤表达EGFR且在含有氟嘧啶、奥沙利铂(oxaliplatin)及伊立替康(irinotecan)之化学疗法摄生法治疗期间或之后疾病有进展之患者。
由Imclone以商品名称尔必得舒出售之西妥昔单抗描述于US 4,943,533及WO 96/40210中。由Abgenix以商品名称维克替比出售之帕尼单抗描述于US 6,235,883中。扎妥木单抗(Zalutumumab)(Humax-EGFR)为目前正处临床开发阶段之另一抗EGFR抗体。该抗体已由Genmab开发且描述于WO02/100348及WO 2004/056847中。西妥昔单抗、帕尼单抗及扎妥木单抗结合EGFR上之相同表位。
在全世界许多国家，但不包括欧洲或美国，US 5,891,996及US 6,506,883中所述之尼妥珠单抗(Nimotuzumab)(TheraCIM hR3)已获准用于治疗癌症。
此外，正处于临床开发阶段或已处于临床开发阶段之单克隆抗EGFR抗体包括：
-由癌症研究学会(Institute of Cancer Research)开发之ICR62。该抗体描述于WO 95/20045中。
-mAb806，其为针对EGFR之突变形式(EGFR vIII)的单克隆抗体。该抗体系由路德维格癌症研究学会(Ludwig Institute of Cancer Research)开发且描述于WO 02/092771中。
-由Merck-Serono开发之马妥珠单抗(Matuzumab)(EMD72000)描述于WO 02/66058中。鼠类前体mAb425描述于WO 92/15683中。
在此项技术中已知，长时期暴露于单克隆抗体会引起抗性肿瘤选择性。该类情形可在接受长时期用单克隆抗体治疗之患者中发生。随着尔必得舒(来自Imclone)及维克替比(来自Abgenix)(两种单克隆抗体结合相同表位)之广泛使用，临床医师很可能将遇到对此等抗体具有抗性之肿瘤。其它单克隆抗体正处于临床测试阶段且在不远的将来可能会进入市场。在此等单克隆抗体中有结合与尔必得舒及维克替比相同之表位的Humax-Egfr(来自Genmab之扎妥木单抗)。可假定对此三种单克隆抗体中之任一者具有抗性之肿瘤亦对其他两者具有抗性。
同样，可能存在有对目前正处临床测试阶段之任何其它单克隆抗EGFR抗体(尼妥珠单抗(YM Biosciences，Cuba)、马妥珠单抗(Merck KGaA)、mAb806(路德维格学会)及ICR62(癌症研究学会))具有抗性之肿瘤的临床实例。
肿瘤对任何此等单克隆抗体之完全或部分抗性可使用自患者分离之样本来检定，以便可先验地了解该肿瘤是否具有抗性。
除了对单克隆抗体疗法之抗性(或难治性肿瘤)外，在治疗EGFR表达癌症中遇到之另一问题为在手术、放射疗法及/或用化疗剂、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)及/或单克隆抗体作医学治疗后肿瘤有复发或进展。现有如下推测：因为复发或进展可能由抗性或至少部分抗性引起，所以复发性或进行性肿瘤应用不同药剂进行治疗。因此，对于对早期抗EGFR抗体治疗不起反应或在该早期抗EGFR抗体治疗后仍有进展之癌症需要第二线或第三线治疗。
发明概述
本发明之发明人已发现，对尔必得舒(西妥昔单抗)具有抗性之癌细胞系可在体外用本发明之抗体组合物来有效地治疗，而将抗性细胞系暴露于维克替比(帕尼单抗)如用尔必得舒治疗般无效。可预期扎妥木单抗亦将对此细胞系无效。此等结果可导致如下结论：本发明之抗体组合物对尔必得舒、维克替比及扎妥木单抗抗性肿瘤有效。因此，本发明之抗体组合物可用于治疗对任一此等产品不起反应之患者。同样，本发明之抗体组合物可用于治疗自一开始对任一此等单克隆抗体具有抗性之肿瘤。对诸如尔必得舒之单克隆抗体的抗性可在体外使用实施例21中所述之方法来检定。因此，当癌细胞系在含有10μg/mL尔必得舒之培养基中增殖时，认为其对尔必得舒具有部分抗性。对帕尼单抗及扎妥木单抗之抗性可以相同方式检定。
基于此等观察结果，本发明之发明人亦预期使用本发明之抗体组合物来治疗对目前正处开发阶段之任何其它抗EGFR抗体具有抗性或部分抗性的癌症，该等其它抗EGFR抗体包括(但不限于)西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体。
该等结果已藉由一项活体内研究(实施例23)来证实，其中将侵袭性癌细胞系植入小鼠体内。在用尔必得舒作初始处理后，选出部分反应者且对其用尔必得舒作延长处理或用本发明之抗体组合物处理。后者使得肿瘤尺寸快速减小，而在连续的尔必得舒处理下肿瘤尺寸却保持不变。即使尔必得舒与本发明之抗体1024及992之间在结合方面存在有部分重迭，仍可达成临床前功效。因此，在自尔必得舒转变为1024/992疗法后不久，在肿瘤中将存在有残余尔必得舒，且尔必得舒与本发明之组合物中的两种抗体之间在结合方面将存在有竞争，此可能会降低本发明之抗体组合物的功效。然而，此不会显著影响1024/992处理之功效。
一项活体内研究亦已证实(实施例25)，尔必得舒抗性细胞可用本发明之抗体组合来有效地治疗。因此，针对尔必得舒之后天抗性机制不会影响本发明之抗体组合物的功效。
总之，本发明之抗体组合物可用于治疗对单克隆抗EGFR抗体(诸如尔必得舒)具有抗性或部分抗性之癌症，且可用于治疗已在先前治疗方案中接受用单克隆抗EGFR抗体(诸如尔必得舒)治疗之个体的癌症。
基于尔必得舒、维克替比及扎妥木单抗之相同结合，可预期对于此三种mAb可达成类似结果。基于此等观察结果，本发明之发明人亦预期使用本发明之抗体组合物来治疗先前已用另一单克隆抗EGFR抗体治疗过之癌症，该另一单克隆抗EGFR抗体包括(但不限于)西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体。该治疗之功效可在类似于实施例23中所述之研究的临床前研究中进行验证。
此外，本发明之发明人已确定，在用本发明之抗体组合物治疗后，复发性肿瘤生长可成功地使用本发明之抗体组合物来消除。此点已在实施例22中所述之临床前研究中得到证实。复发性肿瘤与最初植入之肿瘤同样有效地被消除，此显然表明此等肿瘤对本发明之抗体组合物的治疗不具有抗性。
因此，在第一方面，本发明系关于一种用于治疗已经接受涉及抗人类EGFR抗体之先前治疗方案之个体的癌症之方法中的抗体组合物，该抗体组合物包含至少2种独特的抗人类EGFR抗体分子，
a.其中第一独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体992、包含抗体992之VL序列(SEQ ID NO 72之氨基酸3-109)及VH序列(SEQ ID NO 40之氨基酸3-124)之抗体、具有抗体992之CDR3(SEQ ID NO 116及111)之抗体、与抗体992结合相同表位之抗体、及能够抑制抗体992与人类EGFR结合之抗体；且
b.其中第二独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1024、包含抗体1024之VL序列(SEQ ID NO 73之氨基酸3-114)及VH序列(SEQ ID NO 41之氨基酸3-120)之抗体、具有抗体1024之CDR3(SEQ ID NO 120及114)之抗体、与抗体1024结合相同表位之抗体、及能够抑制抗体1024与人类EGFR结合之抗体。
在一项具体实例中，该先前治疗方案涉及与该抗体组合物相同之抗体组合物。
在另一项具体实例中，该先前治疗方案涉及选自下列的抗人类EGFR抗体：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体。较佳地，该抗人类EGFR抗体选自：西妥昔单抗、帕尼单抗、及扎妥木单抗以及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体。更佳地，该抗人类EGFR抗体选自：西妥昔单抗及帕尼单抗以及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体。更佳地，该抗人类EGFR抗体为西妥昔单抗或能够与西妥昔单抗结合相同表位之抗体。
该癌症可选自由以下者所组成之群组：头颈部癌、结肠癌、乳癌、肾癌(renal cancer)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、神经胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌(non-small-cell-lung-carcinoma，NSCLC)、胃癌、子宫颈癌、肝细胞癌、胃食道癌(gastrophageal cancer)、结肠直肠癌、直肠癌、上皮癌(epithelioid carcinoma)、RCC、头颈部鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma ofthe head and neck，SCCHN)、食道癌、多形性神经胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、以及肾脏癌(kidney cancer)、黑色素瘤、癌瘤(carcinoma)及肉瘤，如本文中所述。
该抗体治疗可为继手术及/或放射疗法后之辅助疗法。
该治疗可为涉及用化学疗法及/或至少一种酪氨酸激酶抑制剂及/或至少一种血管生成抑制剂及/或至少一种激素及/或至少一种分化诱导剂治疗之组合疗法。
该先前治疗方案可为第一线疗法、第二线疗法或第三线疗法。
该第一线疗法可另外涉及用化学疗法及/或至少一种酪氨酸激酶抑制剂及/或至少一种血管生成抑制剂及/或至少一种激素及/或至少一种分化诱导剂之治疗方案。
化学疗法较佳包括投予选自下列的化疗化合物：阿德力霉素(adriamycin)、顺铂(cisplatin)、紫杉醇(taxol)、多柔比星(doxorubicin)、拓朴替康(topotecan)、氟嘧啶、奥沙利铂、及伊立替康。
在本发明之一些具体实例中，该个体在先前治疗方案期间或之后疾病有进展。在其它具体实例中，该个体在该先前治疗方案之后疾病有进展。
该癌症可对先前治疗方案具有抗性或部分抗性。
在另一个方面，本发明系关于一种用于治疗癌症之方法中的抗体组合物，其中该癌症对使用至少一种选自下列的其它抗EGFR抗体之治疗具有抗性或部分抗性：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体；该抗体组合物包含至少2种独特的抗人类EGFR抗体分子，
a.其中第一独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体992、包含抗体992之VL序列(SEQ ID NO 72之氨基酸3-109)及VH序列(SEQ ID NO 40之氨基酸3-124)之抗体、具有抗体992之CDR3(SEQ ID NO 116及111)之抗体、与抗体992结合相同表位之抗体、及能够抑制抗体992与人类EGFR结合之抗体；且
b.其中第二独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1024、包含抗体1024之VL序列(SEQ ID NO 73之氨基酸3-114)及VH序列(SEQ ID NO 41之氨基酸3-120)之抗体、具有抗体1024之CDR3(SEQ ID NO 120及114)之抗体、与抗体1024结合相同表位之抗体、及能够抑制抗体1024与人类EGFR结合之抗体。
根据此方面，该组合物可用于第一线疗法。
在此方面之其它具体实例中，该组合物用于继涉及化学疗法及/或至少一种酪氨酸激酶抑制剂及/或至少一种血管生成抑制剂及/或至少一种激素及/或至少一种分化诱导剂之治疗方案后的第二线疗法。该组合物亦可用于第三线疗法。
该组合物可与化学疗法及/或至少一种酪氨酸激酶抑制剂及/或至少一种血管生成抑制剂及/或至少一种激素及/或至少一种分化诱导剂一起用于组合疗法。
在一些具体实例中，该组合物用作继手术及/或放射疗法后之辅助疗法。
完全或部分的抗性较佳系藉由检定自该个体分离之癌细胞样本来判定。此检定可包括量测西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体与来自该个体之癌细胞的结合。不存在结合指示对抗体之抗性。或者，部分或完全抗性可以类似于实施例21中之检定的增殖检定来判定。
在其它相关方面中，本发明系关于：
- 一种降低EGFR信号传递之方法；
- 一种杀死表达EGFR之细胞的方法；
- 一种诱导表达EGFR之细胞凋亡的方法；
- 一种抑制表达EGFR之细胞增殖的方法；
- 一种诱导活体内肿瘤细胞分化之方法；及
- 一种诱导EGFR内化之方法，
该等方法包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞先前已经接受选自下列的抗EGFR抗体处理：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、马妥珠单抗、mAb806、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系如本申请案中所述。
在其它方面，本发明系关于：
- 一种降低EGFR信号传递之方法；
- 一种杀死表达EGFR之细胞的方法；
- 一种诱导表达EGFR之细胞凋亡的方法；
- 一种抑制表达EGFR之细胞增殖的方法；
- 一种诱导活体内肿瘤细胞分化之方法；及
- 一种诱导EGFR内化之方法，
- 该等方法包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞对选自下列的抗EGFR抗体具有抗性或部分抗性：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、马妥珠单抗、mAb806、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系如本申请案中所述。
对于本发明之此等方面，本发明之抗体组合物可为本文所述之任何组合物。较佳地，本发明之抗体组合物系如标题为较佳抗体组合物之章节中所述(亦即，如本文中所述之基于抗体1024及992的抗体组合物)。
定义
术语“抗体”描述血清之一种功能性组分且通常称作一个分子集合(抗体或免疫球蛋白)或一种分子(抗体分子或免疫球蛋白分子)。抗体分子能够与特定抗原决定子(抗原或抗原性表位)结合或反应，此又可导致引发免疫效应机制。各个抗体分子通常被视为具有单特异性，且抗体分子之组合物可为单克隆抗体(亦即，由相同抗体分子组成)或多克隆抗体(亦即，由两种或两种以上与相同抗原或甚至独特、不同的抗原上之相同或不同表位反应的不同抗体分子组成)。各抗体分子均具有使其能够与其相应抗原特异性结合之独有结构，且所有天然抗体分子均具有相同总体基本结构：两条相同轻链及两条相同重链。抗体亦被统称为免疫球蛋白。如本文中所使用之术语抗体亦意欲包括：嵌合及单链抗体；以及抗体之结合片段，诸如Fab、Fv片段或scFv片段；以及多聚形式，诸如二聚IgA分子或五价IgM。抗体可为人类、鼠类、嵌合、人源化或改型(reshaped)抗体。
术语“同源(cognate)VH及VL编码对”描述相同的抗体产生细胞内所含有或来源于相同的抗体产生细胞之原始VH及VL编码序列对。因此，同源VH及VL对代表最初存在于该类细胞所源自之供体中之VH及VL配对。术语”由VH及VL编码对表达之抗体”指示抗体或抗体片段系由含有VH及VL编码序列之载体、质粒或类似物产生。当同源VH及VL编码对被表达为完全抗体或其稳定片段时，其保持最初由其所源自之细胞表达之抗体的结合亲和力及特异性。同源对文库亦称为同源对之库或集合，且可各个地保存或汇集。
术语“CDR”(互补决定区/complementarity determining region)系如Lefranc等人，(2003)IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cellreceptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.Dev.CompImmunol 27，55-77中所定义。
术语“重组多克隆蛋白质之独特(distinct)成员”表示包含不同但同源的蛋白质分子之蛋白质组合物中的一种蛋白质分子，其中各蛋白质分子与该组合物中之其它分子同源，而且含有一或多段可变多肽序列，其特征在于在多克隆蛋白质之具体成员之间氨基酸序列有差异。
术语“头接头启动子(head-to-head promoter)”系指启动子对系以极接近之方式置放以便使由该等启动子驱动之两个基因片段之转录在相反方向上发生。头接头启动子亦可用介于两个启动子之间由不相关核酸所组成之填充片段(stuffer)建构。该类填充片段可易于含有多于500个的核苷酸。头接头启动子亦可称为双向启动子。
术语“免疫球蛋白”通常系用作存在于血液或血清中之抗体混合物的总称，但亦可用于表示来源于其它来源之抗体混合物。
术语“免疫球蛋白分子”表示各个抗体分子，例如作为免疫球蛋白之一部分，或任何多克隆或单克隆抗体组合物之一部分。
术语“目标变异核酸分子文库”用于描述共同编码”目标重组多克隆蛋白质”之核酸分子的集合。当用于转染时，目标变异核酸分子文库包含于表达载体文库中。该类文库典型地具有至少2、3、5、10、20、50、1000、104、105或106个独特成员。
术语“成群转移(mass transfer)”用于描述目标核酸序列自一载体群体转移至另一载体群体，且对于各DNA同时如此进行而不藉助于目标各个DNA之分离。该等载体群体可为含有例如目标可变区、启动子、前导序列或增强组件之文库。此等序列可随后在不预先自例如噬菌体载体分离之情况下移至哺乳动物表达载体中。尤其对于抗体序列，此技术确保在将文库自例如选择载体(例如噬菌体展示载体)移至哺乳动物表达载体时不会失去VH与VL之间连接的多样性。由此，保留VH及VL之初始配对。
如本文中所使用，术语“可操作地连接”系指一区段与另一区段在功能上相关时该区段系连接于该另一区段。举例而言，编码信号序列之DNA若表达为参与多肽向内质网之转移的前导序列，则与编码该多肽之DNA可操作地连接。又，启动子或增强子若刺激编码序列之转录，则与该序列可操作地连接。
术语“多克隆抗体”描述能够与相同或不同抗原上之若干不同特异性抗原决定子结合或反应的不同抗体分子之组合物。通常认为多克隆抗体之可变性位于该多克隆抗体之所谓的可变区中。然而，在本发明之上下文中，多克隆性亦可理解为描述各个抗体分子之间的存在于所谓恒定区中之差异，例如在含有两种或两种以上抗体同型之抗体混合物的情况下，该等抗体同型诸如有人类IgG1同种型、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2，或鼠类IgG1同种型、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgA。出于本发明之目的，该类多克隆抗体亦可称为”抗体组合物”。
术语“表位”常用于描述动物(较佳为哺乳动物且最佳为人类)体内具有抗原或免疫原活性之较大分子之部分或较大分子之一部分(例如抗原或抗原性位点)。具有免疫原活性之表位为可引发动物体内之抗体反应的较大分子之一部分。具有抗原活性之表位为较大分子中如藉由此项技术中熟知之任何方法(例如藉由本文所述之免疫检定)所确定的可为抗体以免疫特异性方式所结合之一部分。抗原性表位并非必定需要具有免疫原性。抗原为可为抗体或抗体片段以免疫特异性方式所结合之物质，例如毒素、病毒、细菌、蛋白质或DNA。除非抗原或抗原性位点极小，否则其通常具有一个以上的表位，且通常能够刺激免疫反应。表位可为线性或构形表位。线性表位系由蛋白质分子上可为抗体所识别之约6至10个相邻氨基酸组成。与此相反，构形表位系由不按序排列之氨基酸组成。此处抗体仅可识别3维结构。当蛋白质分子折迭成三维结构时，形成表位之氨基酸被并置以使抗体能够识别该序列。在变性蛋白质中仅线性表位可被识别。根据定义，构形表位须位于折迭蛋白质之外部。可识别构形表位之抗体可能仅在温和、非变性的程序下结合。与同一抗原上之不同表位结合之抗体视表位之位置而定可对其所结合之抗原之活性具有不同效应。与抗原之活性位点中之表位结合的抗体可完全阻断该抗原之功能，而结合于不同表位处之另一抗体可能仅对抗原活性具有极小影响或甚至无影响。然而，该等抗体仍可活化互补序列且从而消除抗原，且当与一或多种结合于同一抗原上之不同表位处之抗体组合时可产生协同效应。在本发明中，表位较佳为EGFR细胞外域之部分。本发明之抗原较佳为可为抗体或抗体片段以免疫特异性方式所结合之细胞外域EGFR蛋白质、多肽或其片段。EGFR相关抗原亦可为可为抗体或抗体片段以免疫特异性方式所结合之EGFR多肽细胞外域或其片段的类似物或衍生物。
能够互相竞争结合于同一抗原之抗体可结合相同或重迭表位或可具有彼此紧挨之结合位点，以便使竞争主要系由位阻引起。测定抗体之间的竞争之方法描述于实施例中。
如本文中所使用，术语“多克隆蛋白质”或“多克隆性”系指包含不同但同源的蛋白质分子之蛋白质组合物，其中该等蛋白质分子较佳选自免疫球蛋白超家族。因此，各蛋白质分子与该组合物之其它分子同源，而且含有一或多段可变多肽序列，其特征在于在多克隆蛋白质之具体成员之间氨基酸序列有差异。该等多克隆蛋白质之已知实例包括抗体或免疫球蛋白分子、T细胞受体及B细胞受体。多克隆蛋白质可由所定义之蛋白质分子子集组成，所述子集已由诸如对所需标靶之共有结合活性的共同特征来定义，例如在针对所需靶抗原之多克隆抗体情况下。
“蛋白质”或“多肽”意谓任何氨基酸链，而不考虑长度或转译后修饰。蛋白质可以包含两个或两个以上经组装之多肽链、蛋白质片段、多肽、寡肽或肽之单体或多聚体形式存在。
术语“RFLP”系指”限制性片段长度多形性”，一种在用限制酶裂解后分析核酸分子片段之迁移凝胶图案之方法。
术语“不规则性(scrambling)”描述以下情况：含两个不同多肽链的多克隆蛋白质中两个或更多独特成员(例如来自免疫球蛋白超家族)系从单个细胞表达。此情况可在单个细胞将一对以上基因区段整合至基因组中时出现，其中每对基因区段编码多克隆蛋白质中的一个独特成员。在该等情况下，可产生由该等基因区段表达之非预期的多肽链组合。此等非预期的多肽链组合可能不具有任何治疗效应。
术语“VH-VL链不规则性”为以上定义之不规则性之一个实例。在此实例中，VH及VL编码基因区段构成一对基因区段。该不规则性出现在VH与VL多肽之非预期组合系由细胞产生、且其中两个不同的编码VH及VL的基因区段对被整合至同一细胞中时。该类不规则性抗体分子不太可能保留其初始特异性且因此可能不具有任何治疗效应。
术语“转染”在本文中系用作关于将外来DNA引入细胞中之广义术语。该术语亦意欲涵盖其它用于将外来DNA引入细胞中之功能上等效的方法，诸如转化、感染、转导或供体细胞与受体细胞之融合。
术语“可变多肽序列”及“可变区”可互换使用。
术语“独特表位(distinct epitope)”意谓当两种不同抗体结合独特表位时，对于抗原结合，竞争率低于100％，较佳为竞争率低于50％，更佳为基本上无竞争。抗体对之“独特表位”之分析典型的是在饱和抗体条件下利用结合实验经由对表达EGFR之细胞及各个经荧光标记之抗体作FACS分析或如实施例中所述使用捕获或结合于流动单元表面之EGFR抗原进行表面等离子共振分析而测定。
术语能够“抑制EGF结合”当应用于一种抗体分子时意谓该抗体分子对于与EGFR结合之EGF展现的IC 50值小于10nM，较佳小于8nM，更佳小于7nM，更佳小于5nM，更佳小于4nM，更佳小于3nM，更佳小于2nM，更佳小于2nM，更佳小于1nM。
术语“表皮生长因子受体”、”EGFR”及”EGFR抗原”在本文中可互换使用，且包括人类EGFR之变异体、同功异构物及物种同源物。在一项较佳具体实例中，本发明之抗体与EGFR抗原之结合藉由抑制或阻断EGFR配体与EGFR之结合而抑制表达EGFR的细胞(例如肿瘤细胞)之生长。术语“EGFR配体”涵盖EGFR之所有(例如生理学)配体，包括(但不限于)EGF、TGF-α、结合肝素之EGF(HB-EGF)、双调蛋白(amphiregulin，AR)、和瑞古林(heregulin)、β-细胞调节素(beta-celluli)及表皮调节素(epiregulin，EPI)。在另一项较佳具体实例中，本发明之抗体与EGFR抗原之结合介导表达EGFR之细胞的效应细胞吞噬及/或杀死。
EGFR域结构：成熟EGFR(SwissProt acc.#P00533)之细胞外部分由621个氨基酸及四个受体域组成：域I包涵残基1-165，域II包涵残基166-312，域III包涵残基313-481且域IV包涵残基482-621(Cochran等人，2004 Jimmunol.Methods 287，147-158)。已提出域I及域III有助于形成配体之高亲和力结合位点。域II及域IV为富含半胱氨酸之层黏连蛋白样区域，其使蛋白质折迭稳定且含有可能的EGFR二聚界面。
如本文中所使用，术语“抑制生长”(例如提及细胞)意欲意谓某一细胞当与抗EGFR抗体接触时，与未与抗EGFR抗体接触之相同细胞之生长相比，在增殖(细胞数目增加)或代谢方面有可量测之任何程度的减少，例如对细胞培养物之生长的抑制率达至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
如本文中所使用，术语“抑制结合”及“阻断结合”(例如提及抑制/阻断EGFR配体与EGFR之结合)可互换使用且包涵部分与完全抑制/阻断。抑制/阻断EGFR配体与EGFR结合较佳使在无抑制或阻断之情况下EGFR配体与EGFR结合时存在的正常程度或类型之细胞信号传递有所降低或改变。抑制及阻断亦意欲意谓EGFR配体在与抗EGFR抗体接触时，与未与抗EGFR抗体接触之状况相比，在与EGFR之结合亲和力方面有可量测之任何程度的降低，例如对EGFR配体与EGFR结合之阻断率达至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
术语“重组抗体”系用于描述由某一细胞或细胞系表达之一种抗体分子或若干种分子，其中该细胞或细胞系经包含不与该细胞天然相关的该抗体之编码序列的表达载体转染。
癌症：癌症(医学术语：恶性赘瘤)为如下一类疾病，其中一组细胞显示不受控制之生长(超过正常限度之分裂)、侵袭(侵扰及破坏相邻组织)及有时的转移(经由淋巴或血液扩散至体内其它位置)。癌症之此三种恶性性质使其有别于自限性、不会侵袭或转移之良性肿瘤。大部分癌症形成肿瘤，但如白血病的一些癌症并非如此。癌症亦可称为赘生性生长及过度增殖病症。
辅助疗法：在初步治疗后给予以用来提高治愈可能性之治疗。辅助疗法可包括化学疗法、放射疗法、激素疗法或生物学疗法。
化学疗法：用小分子药物进行治疗。
放射疗法：用放射线进行治疗。
第一线疗法：对疾病或病状之最初治疗。在癌症患者中，第一线疗法可为手术、化学疗法、放射疗法、抗体疗法或此等疗法之组合。亦称为初步疗法及初步治疗。
第二线疗法：当初始治疗(第一线疗法)不起作用或停止发挥作用时所给予之治疗。
第三线疗法：当第二线疗法不起作用或停止发挥作用时所给予之治疗。
TKI：酪氨酸抑制剂的抑制剂。
进展：在医学中，是指疾病(诸如癌症)在体内恶化或扩散之过程。
抗性癌症：对治疗不起反应之癌症。该癌症可在开始治疗时具有抗性或其可在治疗期间变得具有抗性。亦称为难治性癌症。与此对比，有效治疗可使肿瘤根除。
部分抗性的癌症：部分抗性癌症对治疗起反应，但该治疗并不能使肿瘤根除。在部分抗性癌症中，肿瘤生长可部分或完全受到抑制，但该肿瘤并不消退或消退仅仅为不明显的。
对选自由西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb425、马妥珠单抗及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体所组成之群组的抗EGFR抗体之抗性或部分抗性可在接受一或多种该等抗体之患者体内观察到，或可在体外检定中(例如藉由测定EGFR之表达及由单克隆抗体无结合或结合较弱来确定)或在增殖检定(诸如实施例21中所述)中量测出。
附图说明
图1：脾细胞之分选(关于细节，参见实施例1)。设定(描述)以下门：
·门1：活细胞(FSC/碘化丙锭图)。(左下图)
·门2：浆细胞经门控为CD43阳性/CD138阳性。(右下图)
·门3：成对辨别(右上图)
图2：鼠类-mSymplexTM PCR。用于扩增及同源连接来自单一细胞之重链及轻链抗体基因的多路重迭延伸RT-PCR。关于细节，参考实施例1。
图3：鼠库(repertoire)克隆。藉由重迭延伸，将mSymplexTM PCR产物池(pool)剪接成编码人类κ恒定轻链之基因，所述PCR产物编码来自单个浆细胞之VH/VL基因对。将编码完全人类-小鼠嵌合抗体之基因池插入表达载体中，继而插入双向启动子盒(2×CMV)。
图4：哺乳动物全长抗体表达载体00-VP-002之示意图。Amp及Amp pro，氨苄青霉素抗性基因及其启动子；pUC起点，pUC复制起点；CMV，驱动轻链及重链表达之哺乳动物启动子；IGHV前导序列，基因组人类重链前导序列；H填充片段，用于交换重链可变区编码序列之插入物；IGHG1，编码基因组免疫球蛋白同种型G1重链恒定区之序列(序列见附录2)；兔B-球蛋白A，兔β-球蛋白polyA序列；IGKV前导序列，鼠类κ前导序列；L填充片段，用于交换轻链编码序列之插入物；SV40 term，猿猴病毒40终止子序列；FRT，Flp识别靶位点；Neo，新霉素抗性基因；SV40 poly A，猿猴病毒40 poly A信号序列。
图5：450-620nm处的吸光度差异的聚类分析(cluster analysis)。根据活性将上清液聚类，如由克隆编号后之数字(1至4)所指示的。深灰色指示代谢活性细胞数目减少，而淡灰色指示代谢活性细胞数目增加。黑色指示上清液对于代谢活性细胞之数目无影响。
图6：以竞争ELISA所测定之抗EGFR抗体对所列之针对特定EGFR域之参考抗体的抑制程度。A)计算抑制率。B)如下对抑制率评分：25-49％：中度竞争(+)；50-74％：强烈的竞争(++)；75-100％：极强烈的竞争(+++)。显示显著抑制(50-100％)之框加有灰色阴影。以二重复展示尔必得舒及维克替比(四次独立实验)以说明检定之再现性。Ab2(225)为产生尔必得舒之鼠类前体。
图7：在Biacore 3000 SPR机器上进行之单一表位定位循环之图示，其中样本mAb与四种不同参考抗体竞争结合EGFR细胞外域。
图8：藉由竞争分析使用SPR技术所测定之抗EGFR抗体对所列的针对特定EGFR域之参考抗体的抑制程度。A)计算抑制率。B)如下对抑制率评分：25-49％：中度竞争(+)；50-74％：强烈的竞争(++)；75-100％：极强烈的竞争(+++)。显示显著抑制(50-100％)之格子加有灰色阴影。标有*标记之克隆1229在Biacore检定中未结合。
图9：藉由抗EGFR抗体对之SPR竞争分析对抗EGFR抗体库内表位聚类之测定。将抗体根据假定之EGFR域识别分组。将有如下发现之格子加上灰色阴影：抗体组合结合重迭表位从而产生大于50％之抑制率。将未进行测定之格子加上黑色。A)计算抑制率。B)如下对抑制率评分：25-49％：中度竞争(+)；50-74％：强烈的竞争(++)；75-100％：极强烈的竞争(+++)。
图10：藉由Biacore分析所测定之针对EGFR细胞外域之参考抗体及抗EGFR抗体的表位定位。A)针对EGFR细胞外域(ECD)之域I或域I/II的抗体之表位定位。B)针对EGFR ECD之域III的抗体之表位定位。
图11：针对EGFR上之非重迭表位的抗体之寡克隆混合物之同时结合的研究。A)依次添加针对域III、域I或未知特异性之抗体。单一样本mAb相对于不同mAb混合物或单一mAb所测得之抑制率值展示于加有阴影之框中。亦展示用于计算抑制率之Ru最大值。B)针对EGFR上之非重迭表位之六种独特样本mAb与含有该六种所测试抗体之抗体混合物的竞争分析。不包括所测试之样本抗体的抗体混合物充当阳性对照组。单一样本mAb相对于不同mAb混合物所测得之抑制率值展示于加有阴影之框中。亦展示用于计算抑制率之Ru最大值。C)来自B中之分析的相应感应图(sensogram)，其说明抗体阻断且在某些情况下抗体增强结合。D)相对于六种mAb抗体混合物针对域I、I/II及未知特异性之其它抗体之测试。
图12：藉由对全长EGFR进行抗体滴定及侦测与链亲和素HRP试剂结合的生物素化EGF配体来测定抗体介导之EGF配体阻断。分别将尔必得舒、维克替比及西那吉斯IgG(帕利珠单抗)用作阳性及阴性对照组。在用测试抗体阻断所识别之抗体表位后，藉由添加用于侦测之0.1μg/ml生物素化EGF配体及二级链亲和素-HRP结合物来显像EGF配体竞争程度。
图13：使用所指定抗体预处理对HN5细胞中EGF(50ng/ml)诱导之EGFR磷酸化的影响。将图中所指之抗体(10μg/ml)与细胞一起培养30分钟，随后添加EGF历时7.5min。标有*标记之数据组明显不同于对照组(阴性对照组)数据组(p＜0.05)。A.1208对EGFR磷酸化具有明显的保护效应。B.1277及1320显著地防止EGF诱导之磷酸化。误差条表示三个独立实验之标准偏差。
图14：HN5细胞中之磷酸化EGFR(pEGFR)及EGFR的细胞内西方分析。混合物表示992、1030与1042之最终浓度为10μg/ml之等莫耳混合物，其它抗体各自系以10μg/ml之浓度使用。添加50μg/ml EGF历时7.5min，随后固定以刺激EGFR磷酸化。误差条表示6个独立(ctlr-)或3个独立数据点(992、1030、1042、混合物或尔必得舒)之标准偏差。992、1030、混合物及尔必得舒对于磷酸化具有明显的(*＝p＜0.05)保护效应。
图15：抗体之培养对EGFR内化的影响。数据系以自细胞表面移除之受体相对于初始染色之百分比展示。误差条对应于SEM。
图16：A431-NS细胞在不同浓度之抗体992、1030及1042及其混合物存在下的生长曲线，其系藉由相较于未经处理之对照组的代谢活性细胞百分比测量。1001为用作阴性对照之具有类似同型之非功能性抗体。
图17：A431-NS细胞在10μg/ml抗体992、1030及1042及其混合物以及不同浓度之EGFR配体EGF存在下的生长曲线，其系藉由于450nm之吸光度测量。1001为用作阴性对照之具有类似同型之非功能性抗体。
图18：A431-NS细胞在不同浓度之抗体992及992与具有存在于域I、II或III中之非重迭表位之抗体的混合物存在下之生长曲线。1001为用作阴性对照之具有类似同型之非功能性抗体。
图19：A431NS细胞之凋亡。以10倍稀释测试EGFR-混合物、各个单克隆抗体、尔必得舒及维克替比。使用来自Roche之ELISA试剂盒量测来自凋亡细胞之组蛋白-DNA复合物。
图20：向四组10只裸Balb/C Nu/Nu小鼠接种1×106个A431NS细胞。当肿瘤为约100mm3时，开始处理。如箭头所指示，在实验期间向各组注射1mg/ml抗体五次。用数位测径器量测肿瘤直径。结果系以平均肿瘤体积(+/-SEM)展示。
图21：当各个小鼠在图20中所示之实验中被杀死时，切取肿瘤且称重。展示平均值+/-SEM。星号指示显著性为P＜0.05。
图22：A431-NS球状体在10μg/ml抗体1001、尔必得舒、维克替比及具有非重迭表位之三种抗体之混合物992+1030+1042存在下的生长。1001为用作阴性对照之具有类似同型之非功能性抗体。
图23：自源于猕猴皮肤表皮之cDNA克隆之猕猴EGFR细胞外域的DNA(SEQ ID NO 100)及蛋白质序列(SEQ ID NO 101)。
图24：所获得之猕猴EGFR ECD蛋白质序列(SEQ ID NO 101)与自GENBANK编号X00588获得之人类EGFR ECD(SEQ ID NO 108)的排比。亦展示一致序列(SEQ ID NO 109)。
图25：在结合人类或猕猴EGFR ECD或两者之交叉反应性与物种特异性抗体之间的ELISA检定辨别的实例。
图26：来自异种移植小鼠之四个实验组中之每一者的代表性肿瘤切片的显微照片。在200倍放大率，箭头指向活体内A431细胞终末分化之集中区。注意在用三种抗EGFR克隆之混合物(992+1030+1042)处理之肿瘤中终末分化之集中区明显较大且数目较多(上面两张图)。
图27：A)在添加10μg/ml对照抗体(利妥昔单抗(Rituximab)，抗CD-20)或992与1024之抗EGFR抗体混合物后24小时在40倍放大率取得之HN5球状体之影像。B)使用软件Image J定量由细胞覆盖之面积(*p＜0.01)。
图28：以占未经处理之对照组的百分比形式展示四个处理组之内披蛋白含量的图(分别与尔必得舒、维克替比及阴性对照组相比较，
图29：A)在60倍放大率取得的与10μg/ml Alexa-488标记之尔必得舒或992+1024一起培养2小时之HN5及A431NS细胞之影像。B)在60倍放大率使用小针孔取得的与10μg/ml Alexa-488标记之尔必得舒或992+1024一起培养2小时之A431NS细胞的影像。
图30：A)在60倍放大率取得的与10μg/ml Alexa-488标记之尔必得舒或992+1024一起培养所指定时段之HN5细胞的影像。
图31：藉由在ELISA中对A431-NS细胞及经纯化全长EGFR作连续抗体滴定来测定Fab 992、1024及1030之抗原呈递特异性。利用二级山羊抗人类Fab特异性HRP结合物来显像所结合之Fab抗体。A)针对来自A431细胞之经纯化全长EGFR测试之Fab抗体。B)针对表达于A431-NS细胞表面上之EGFR测试之Fab抗体。
图32：藉由在ELISA中对以三聚甲醛固定之A431-NS细胞作连续滴定来测定抗体992、1024、1030、尔必得舒及维克替比之IgG及Fab片段之功能性亲和力。利用二级山羊抗人类Fab特异性HRP结合物来显像所结合之Fab及IgG抗体。抗RSV蛋白质F抗体西那吉斯被用作阴性对照抗体，且在所用之ELISA检定中不展示任何结合。A)IgG抗体与A431-NS细胞之功能性结合。B)Fab抗体与A431-NS细胞之功能性结合。
图33：在预先用结合非重迭表位之Fab片段饱和受体后对IgG与A431-NS细胞上之EGFR结合之增强的测定。使所指定Fab片段饱和A431-NS细胞上所识别之EGFR表位30min，在此之后连续滴定特定IgG抗体，且在添加或不添加Fab之情况下所结合之IgG系藉由二级小鼠抗人类Fc HRP结合物来显像。A)在预先用或未用所指定Fab片段饱和受体之情况下IgG 992与A431-NS细胞之结合特征。B)在预先用或未用所指定Fab片段饱和受体之情况下IgG 1024与A431-NS细胞之结合特征。C)在预先用或未用所指定Fab片段饱和受体之情况下IgG 1030与A431-NS细胞之结合特征。
图34：猕猴全长EGFR cDNA(图34A；SEQ ID NO 102)及所编码之蛋白质(图34B；SEQ ID NO 103)。
图35：A431NS中用1μg/ml所指定抗体/组合获得之凋亡。以来自Roche之ELISA试剂盒侦测组蛋白-DNA复合物。凋亡程度与阳性对照组(最大凋亡)相比。
图36：向Balb/C nu/nu小鼠注射1×106个A431NS细胞。当肿瘤平均为约100mm3时，开始处理。小鼠接受17次抗体注射。第一次处理于第8日开始且最后一次在第34日。抗体/组合物系以每剂0.5mg或每剂0.17mg注射。展示肿瘤体积之平均值+/-SEM。
图37：A431NS增殖之抑制。X轴展示本发明之3种抗体之不同代表性组合。Y轴展示以占未经处理之对照组(对照组)之百分比表示的代谢活性。误差条表示+/-SEM。关于其它细节，参见实施例6。
图38：两种不同剂量之992+1024混合物与尔必得舒相比在A431NS人类肿瘤异种移植物中之生长抑制效应。向BALB/c nu/nu小鼠接种106个A431NS细胞。当肿瘤达到100mm3之平均尺寸(第8日)时，将小鼠随机分成每组9只之组且开始处理。将所指定抗体以每剂0.5mg或每剂1mg注射，每周两次总共9次注射。图上之淡灰色区域指示处理期。虚线之开始指明给定组中第一只小鼠由于肿瘤尺寸过大而被施以安乐死时之时间点。在第60日计算每周2mg 992+1024相对于每周2mg尔必得舒以及每周1mg992+1024相对于每周2mg尔必得舒之间的统计学显著差异性，其中除每周2mg 992+1024之组以外，所有组均终止。完成在第60日之前排除之动物之肿瘤尺寸，因此，该图展示给定组中所有小鼠之累计肿瘤体积。展示平均值+/-SEM。
图39：用992+1024抗体混合物、尔必得舒或对照抗体处理(与图38中所示者相同之实验)之小鼠之存活率的卡普兰-迈耶图(Kaplan-Meyer plot)。结果系以经处理小鼠之存活率百分比呈现。当比较992+1024与尔必得舒时，观察到在高剂量(每周2mg，P＝0.0008)与低剂量(每周1mg，P＝0.0004)组中小鼠存活率百分比之间的差异显著。又，当与高剂量尔必得舒相比时，低剂量992+1024显著较佳(P＝0.0087)。使用对数等级(曼特尔-库克斯)检定(Log-rank(Mantel-Cox)test)计算统计学差异性。
图40：藉由FACS分析之IgG 992、1024及1320针对经全长人类与猕猴EGFR转染之CHO细胞的交叉反应性之分析。用PE标记之山羊F(ab′)2抗人类IgG FC侦测所结合之抗体。对表达EGFR之均匀细胞(SCC/FCS特性)进行设门。结合系以1nM浓度之最大抗体结合％表示。
图41：992(A)及1024(B)之重链与轻链两者之鼠类(chi)与人源化(hu)候选可变区的可变区氨基酸序列之Clustalw2排比。将如以IMGT所定义之CDR区域划底线；间隙系以(-)表示，相同氨基酸系以(*)表示，保守突变系以(：)表示，半保守突变系以(.)表示。粗体氨基酸指示如下特征之氨基酸位置：若全人类框架变异体显示降低之结合亲和力时，则将进行回复突变以成为初始鉴别出之鼠类残基。序列ID编号如下：人源化992VH(SEQ ID NO 104)；人源化992VL(SEQ ID NO 105)；人源化1024VH(SEQ ID NO 106)；人源化1024VL(SEQ ID NO 107)；嵌合992VH(SEQ ID NO 40之aa 3-124)；嵌合992VL(SEQ ID NO 72之aa 3-109)；嵌合1024VH(SEQ ID NO 41之aa 3-120)；嵌合1024VL(SEQ ID NO 73之aa 3-114)。
图42A：992L1024之双重可变域编码基因之示意图；992L1024IGHV(751bp)如下展示：自5′AscI限制性位点开始，继而为992 IGHV、ASTKGP连接子、1024 IGHV，且终止于3′XhoI限制性位点；992L1024IGKV(1071bp)如下展示：其自5′NheI限制性位点开始，继而为992IGKV、TVAAP连接子、1024 IGKV、IGKC且终止于3′NotI限制性位点。
图42B：1024L992之双重可变域编码基因之示意图；1024L992IGHV(751bp)如下展示：自5′AscI限制性位点开始，继而为1024 IGHV、ASTKGP连接子、992 IGHV，且终止于3′XhoI限制性位点；1024L992IGKV(1071bp)如下展示：自5′NheI限制性位点开始，继而为1024 IGKV、TVAAP连接子、992 IGKV、IGKC且终止于3′NotI限制性位点。
图43：在不同浓度之所指定抗体存在下于0.5％ FBS中之HN5wt细胞(上图)及尔必得舒抗性HN5细胞(下图)的代谢活性。图注：抗体992及1024系如本申请案中所定义。Sym004为具有抗体992及1024之抗体组合物。
图44：各个A431NS肿瘤在用1mg具有抗体992+1024之抗体组合物作初始处理(总共注射9次)后的肿瘤生长曲线(左侧灰色框)。所有肿瘤均对该疗法起反应，但在处理后超过80日，3个肿瘤再次开始生长。用具有抗体992+1024之抗体组合物再处理此等肿瘤可促使肿瘤消退(右侧灰色框)。
图45：用尔必得舒预处理具有A431NS异种移植肿瘤之BALB/c nu/nu小鼠且随后随机化以继续尔必得舒处理或当肿瘤之平均肿瘤尺寸为约500mm3时转换为具有抗体992+1024之抗体组合物(图注中之Sym004)处理。与继续尔必得舒处理之组相比，在转换为具有抗体992+1024之抗体组合物处理的组中，观察到肿瘤负荷显著降低。
图46：在不同浓度之所指定抗体存在下于0.5％FBS中之尔必得舒抗性HN5克隆的代谢活性。
图47：经50mg/kg Sym004或尔必得舒处理之尔必得舒抗性HN5克隆#7肿瘤异种移植物的生长。图上标出平均值之标准误差。
发明详述
抗体混合物
本发明系关于一种用于治疗个体的癌症之方法中的抗体组合物，其中该个体已经接受涉及抗人类EGFR抗体之先前治疗方案，或其中该癌症对至少一种其它抗EGFR抗体之治疗具有抗性或部分抗性，该抗体组合物包含至少2种独特的抗人类EGFR抗体分子。在本发明中，该至少2种独特的抗人类EGFR抗体与非重迭表位结合。该等抗体之非重迭性质较佳系使用经不同标记之抗体对EGFR表达细胞作FACS分析来确定，或藉由使用捕获或结合于流动单元表面之EGFR抗原作表面等离子共振分析来确定。亦可使用如实施例中所述之基于ELISA之方法。结合两个或两个以上非重迭EGFR表位之组合物可用于对抗较宽范围之EGFR依赖性癌症类型，此系因为与靶向一或两个表位之单克隆抗体组合物相比，前者较不易受EGFR构形差异影响且不易受突变影响。此外，结合两个或两个以上非重迭EGFR表位之抗体组合物与靶向仅一个表位之组合物相比可提供优良的功效。详言之，该抗体组合物可就活体内癌细胞终末分化而言提供优良的功效。对于单克隆抗EGFR抗体疗法，特定比例之患者将不能有效地对该抗体治疗起反应。对于一些患者，此可能系归因于该抗体之迅速清除或由于该抗体在患者体内产生针对该抗体之免疫反应。对于一些患者，缺乏反应可能系由于其特定EGFR依赖性癌症表达某一构形之EGFR，此时单克隆抗体不能结合其表位。此可能系由于如下原因：糖基化差异、域缺失或突变及/或SNP。
又，对于一些癌症，由癌细胞产生配体引起之自分泌EGFR刺激具有重要性，而在其它情况下，由癌细胞所表达之EGFR无需配体刺激。对于后面的癌症类型，能够抑制配体结合之抗体可能无效。
所含抗体能够结合EGFR上之至少两个独特的表位之抗体组合物将会有更广泛之应用，此系因为两个表位相较于该等抗体所识别之表位皆发生改变之可能性得到减低。此外，所有抗体均被患者清除之可能性更小得多。在诱导癌细胞终末分化方面已藉由使用针对非重迭表位之两种域III抗体而最明显地显示出优越性。该有效的抗体诱导之癌细胞终末分化先前未有报导，且其在设计有效的基于抗体之癌症疗法方面代表一项重大进步。后来的结果显示：类似或更优良之结果可使用两种抗体之特定组合获得。
为了改良临床功效且拓宽针对较宽范围之EGFR依赖性癌症类型的效用范围，可增加组合物中之抗体种数。因此，组合物可包含能够结合三个非重迭表位之抗体。组合物可包含能够结合四个非重迭表位之抗体。组合物可包含能够结合五个非重迭表位之抗体。组合物可包含能够结合六个非重迭表位之抗体。本申请案之实施例显示至少六种独特的抗体可同时与EGFR结合(实施例3)。此并不排除可能或甚至宜藉由谨慎选择抗体来设计包含能够结合多于六个(诸如七个或八个)非重迭表位之抗体的组合物。
可存在有包括针对重迭表位之抗体的优势，因为此可提高表位被结合之可能性。在此背后之一项基本原理为：在一些患者中及/或在一些癌细胞中，表位可能由于构形变化或突变或SNP而改变。虽然此可能影响一种抗体之结合，但其可能不影响结合重迭表位之另一抗体之结合。此外，存在以下风险：该等抗体中之一者由于其被视为抗原而被患者清除。藉由包括两种结合不同但重迭的表位之抗体，可减少两种抗体中之一者被清除的后果及表位突变的后果之发生。
已使用能够结合两个非重迭EGFR表位之抗体的特定组合而获得优良结果。此等较佳之“两种抗体”的组合物连同与如何设计本发明之抗体组合物有关之指导一起系在下文中作更详细的描述。已有结果表明，与包含抗体992、1030及1042之三种抗体的组合物相比，当使用仅具有两种抗体(992及1024)之组合物时可获得类似或甚至改良之功效。由于抗体1024与1042属于同一聚类(cluster)，因此具有相同结合特异性，实际上，对于三种抗体的组合物所观察到之结果(包括对终末分化之影响)可归因于组合物中仅有的两种结合特异性(992及1024/1042)。
组合物中的多个抗体可为具有非人类可变链与人类恒定链之嵌合抗体。非人类可变链可来自小鼠、大鼠、绵羊、猪、鸡、非人类灵长类动物或其它合适的动物。为获得全人类抗体，抗体可在具有人类抗体基因之转基因动物体内产生。抗体亦可为所谓的人源化抗体，其中非人类CDR序列已被植入人类框架序列中。
较佳地，人类恒定链为IgG1或IgG2同型。更佳地，组合物中之所有抗体均具有相同同型以便于制造。然而，组合物中可能宜包括不同同型之抗体。
较佳地，本发明之抗体组合物包含能够与选自由人类EGFR、突变人类EGFR及人类EGFR之缺失变异体所组成之群组的EGFR结合之抗体。较佳地，抗体能够结合人类与非人类灵长类EGFR两者，以便其可在临床实验之前在相关毒理学研究中进行测试。较佳地，非人类灵长类动物为猕猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))。
为支持以上所确定之使用结合两个或两个以上独特的表位之抗体治疗EGFR依赖性癌症的构想，本发明之发明人已鉴别、制造且特性化一系列针对EGFR之嵌合小鼠/人类抗体。已将此等嵌合抗体各个地及以混合物形式与现有技术水平之单克隆抗体(以尔必得舒TM及维克替比TM为例)进行对比。
表1展示各个嵌合抗体及与此等抗体有关之特征的概况。抗体编号为贯穿本申请案所使用之参考数字。特异性系针对抗体所结合之EGFR域，此如实施例3中所证实。ΔEGFR为抗体与EGFR突变体(EGFRvIII)结合之能力，此如实施例1中所述。猕猴EGFR为抗体结合猕猴EGFR之能力(实施例10)。EGF inhib为抗体抑制EGF结合之能力(实施例4)。增殖为抗体抑制癌细胞系(A431及HN-5)增殖之能力(实施例6)。
表1.本发明之抗体
  抗体编号   特异性   ΔEGFR   猕猴EGFR   EGF inhib   增殖
  992   域III   不能/弱   能   能/弱   能
  1030   域III   能   能   能   能
  1024   域III   能   能   能
  1042   域III   弱   能   (能)   能
  1277   域III   能   能   能   HN5
  1254   域III   能   能   能   HN5
  1208   域III   能   能   能   能 HN5+/-992
  1320   域III   弱   不能   能   能
  1257   域I/II   不能   能   不能   能
  1261   域I   不能   能   不能   能
  1229   非域I/II   能   不能   不能   能(A431)
  1284   域I   不能   能   能   能
  1344   域I/II   不能   能   nd   HN5 w/992
  1260   域I/II   不能   能   能   A431
  1308   域I   不能   能   nd   HN5 w/992
  1347   域I   不能   能   nd   HN5 w/992
  1428   域I及II   不能   能   能   HN5 w/992
根据使用嵌合抗体在增殖、结合、受体降解/失活及移动检定中以及在动物模型中作单独及组合测试所产生的数据，可得出多个结论。
使用两种癌细胞系HN-5及A431(实施例6)获得之结果已使用不同的癌细胞系(MDA-MB-468-乳癌细胞系；DU145-前列腺癌细胞系)进行重复。自此等实验显而易见，由本发明之发明人提供之抗体组合显示针对极广范围之癌细胞系的功效，此支持抗体组合物针对一系列EGFR构形之功效。
亦已显示在增殖检定中抗体混合物之优势在将生理学浓度之配体(EGF)添加至生长培养基中时高于不添加EGF时(图17)。根据文献(Hayashi及Sakamoto 1998 J Pharmacobiodyn 11；146-51)，血清含有约1-1.8ng/ml或0.2-0.3nM EGF，而胃液据报导含有0.3ng/ml(约0.05nM)(Pessonen等人，1987 Life Sci.40；2489-94)。在活体内环境中，可能存在EGF及其它EGFR配体，且因此，抗体混合物之能力在EGFR配体存在下有效为本发明之抗体混合物之重要特征。
本发明之嵌合小鼠/人类抗体在组合使用时提供比单独使用时更佳之结果。此在若干实验(参见例如实施例6)中进行例示，在该等实验中，当单独测试时，抗体对癌细胞系(A431-NS)仅展示中度抗增殖效应，但在以任一组合使用时，展示显著优良之结果。此等结果已使用本发明之嵌合抗体之多种组合得到证实。已使用包含抗体992及1024之组合物获得尤其优良之结果。
举例而言，若干抗体已与抗体992、1208、1254及1277中之任一者一起在使用A431-NS及HN-5之抗增殖检定中进行了测试。
受体结合研究已显示一些抗体可实际上刺激其它抗体之结合，以使得特定抗体在受体经一种或数种抗体饱和后以较高数量与该受体结合。针对域III之抗体992之结合明显受益于藉由预先用一或多种结合非重迭表位之抗体来饱和受体所获得之此协同效应。当相对于经结合非重迭表位之抗体饱和的EGFR测试针对未知表位之抗体1396时可见此协同效应之另一实例。
受体结合研究亦已显示，有可能使至少6种抗体与EGFR细胞外域同时结合。此6种抗体为3种域III抗体、一种域I抗体、一种域I/II抗体及一种结合未知表位之抗体。有趣的是，三种域III抗体之结合似乎促进其它抗体之后续结合。此显然支持提供具有若干结合独特表位之抗体的抗体组合物之构想。
当设计针对EGFR之抗体组合物之组合物时，较佳使用针对非重迭表位之抗体，因为此等抗体可提供较高的协同效应。
EGFR之域III对于配体与受体之结合很重要。此外，与域III结合之抗体可稳定呈不会产生受体信号传递之束缚单体构形之EGFR。因此，较佳的是抗体组合物含有至少两种对域III具有特异性之抗体。较佳之域III抗体包括抗体992、1024、1030、1208、1254、1277及1320。抗体组合物可较佳包含两种以上域III抗体，诸如至少3种域III抗体，例如至少4种域III抗体，诸如至少5种域III抗体，例如至少6种域III抗体。
在另一项较佳具体实例中，抗体组合物包含至少一种域I抗体。较佳地，该至少一种域I抗体系选自由抗体1284、1308、1344及1347所组成之群组。更佳地，该至少一种域I抗体系选自由抗体1284及1347所组成之群组。
在另一项较佳具体实例中，抗体组合物包含至少一种域I/II抗体。较佳地，该至少一种域I/II抗体系选自由抗体1257、1260、1261、1428及1434所组成之群组。更佳地，该至少一种域I/II抗体系选自由抗体1261及1260所组成之群组。
具有三种抗体之较佳混合物包括：抗体992+1320+1024；992+1024+1030；992+1255+1024；992+1024+1214；992+1024+1284；992+1024+1211；992+1024+1030。
具有四种抗体之较佳混合物包括：抗体992+1320+1024+1030；992+1024+1030+1284。
具有五种抗体之较佳混合物包括：抗体992+1030+1024+1260+1347；992+1030+1024+1261+1347；992+1030+1024+1261+1284。
一种具有八种抗体之较佳混合物包括：抗体992+1030+1024+1277+1254+1320+1260+1261+1284+1347。
此外，为能够对非人类灵长类动物进行毒理学研究，较佳的是组合物中之所有抗体均不仅与人类EGFR结合，而且与至少一种其它灵长类EGFR结合，该其它灵长类EGFR诸如黑猩猩(chimpanzee)、恒河猕猴(Macacamulatta)、恒河猴(Rhesus monkey)及其它猴类或猕猴之EGFR。猕猴为相对较小之动物，且极其适合于毒理学研究。因此，其它灵长类EGFR较佳为猕猴EGFR。较佳地，该等抗体以大致相同之亲和力与人类及非人类灵长类EGFR结合。
本发明当在一种组合物中组合2种、3种、4种、5种、6种、7种及8种抗体时在一或多个功能检定中展示优良结果。虽然此等数据对组合物中抗体种数之选择提供指导，但其决不应以限制性方式来解释。尽管实验数据仅展示6种抗体之同时结合，组合物亦可包含多于8种抗体。对于组合物中包括多于6种抗体，可能存在其它原因，诸如抗体成员之清除速率之差异。
组合物之抗体的另一较佳特征为蛋白质均质性，因此可容易地纯化该等抗体。对于各个抗体成员，为便于特性化，具有一个独特峰之离子交换层析图谱较佳。为便于特性化最终抗体组合物，清晰的离子交换层析图谱亦较佳。当组合抗体时，亦较佳的是该等抗体可使用离子交换层析法来区分，以便使具有所有抗体之组合物可在一次操作中得以特性化。
该等抗体可来自任何来源，诸如人类、鼠类、兔、鸡、猪、羊驼、绵羊。该等抗体亦可为如实施例中所述之嵌合抗体或可为使用此项技术中所述之熟知方法获得之其人源化、超人源化或改型形式。
较佳抗体组合物
如随附实施例中所示，基于抗体992及1024之抗EGFR组合物具有独有且独特之特性。抗体992之结合因包括1024之其它抗体之结合而增强。与市售抗体不同，992与1024优先与细胞上所展示之构形表位结合(实施例14及15)。992与1024之表位均与尔必得舒及维克替比表位重迭，但不同于尔必得舒及维克替比表位。与各个抗体与非重迭表位结合之若干种其它两种抗体的组合物不同，基于抗体992及1024之结合特异性的组合物可迅速且有效地引发受体内化。在动物模型中在用基于抗体992及1024之抗体组合物处理后观察到涉及伴有内披蛋白(involucrin)表达增加及角质珠(keratinpearl)出现之终末分化的新颖作用机制。此独有的作用机制导致体外及活体内更有效且持续的生长抑制。此最明显地见于活体内实施例中，其中肿瘤在终止治疗后继续减小。在接受尔必得舒之对照组中，肿瘤在终止治疗后不久开始生长。此显然指示不同的作用机制。
据信该新颖作用机制系藉由使用由一种抗体组合物中之抗体992与1024所显示之两种结合特异性的组合达成。当使用不与抗体992及1024竞争之第三抗体时，例如在抗体992、1024与1030之三重组合中亦可观察到此作用机制。
此等观察结果使得可设计包含至少2种独特的抗人类EGFR抗体分子之抗体组合物，其中第一独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体992、包含抗体992之VL序列(SEQ ID NO 72之氨基酸3-109)及VH序列(SEQ ID NO 40之氨基酸3-124)之抗体、具有抗体992之CDR3(SEQ ID NO 116及111)之抗体、与抗体992结合相同表位之抗体及能够抑制抗体992与人类EGFR结合之抗体；且其中第二独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1024、包含抗体1024之VL序列(SEQ ID NO 73之氨基酸3-114)及VH序列(SEQ ID NO 41之氨基酸3-120)之抗体、具有抗体1024之CDR3(SEQ ID NO 120及114)之抗体、与抗体1024结合相同表位之抗体及能够抑制抗体1024与人类EGFR结合之抗体。
较佳地，该第一独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体992、包含抗体992之VL序列及VH序列之抗体、具有抗体992之CDR3之抗体及与抗体992结合相同表位之抗体；且该第二独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1024、包含抗体1024之VL序列及VH序列之抗体、具有抗体1024之CDR3之抗体及与抗体1024结合相同表位之抗体。
本发明涵盖抗体992及1024之CDR3序列的突变以提供具有相同结合特异性之抗体。因此，在一项具体实例中，具有与抗体992相同之结合特异性的抗体包含具有下式之CDRH3：CTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15W，其中X1至X15系各个地选自以下所列氨基酸之群：
X1＝R或K；
X2＝N、D、E或Q；
X3＝G、A、V或S；
X4＝D、E、N或Q；
X5＝Y、F、W或H；
X6＝Y、F、W或H；
X7＝V、I、L或A；
X8＝S、T、G或A；
X9＝S、T、G或A；
X10＝G、A、V或S；
X11＝D、E、N或Q；
X12＝A、G、V或S；
X13＝M、L、I或V；
X14＝D或E；且
X15＝Y或F；
及由下式说明之CDRL3：CX1X2X3X4X5X6PPTF，其中X1至X6系各个地选自以下所列氨基酸之群：
X1＝Q或H；
X2＝H、E或Q；
X3＝Y、F、W或H；
X4＝N、Q或H；
X5＝T、S、G或A；且
X6＝V、I、L或A。
因此，在一项具体实例中，具有与抗体1024相同之结合特异性的抗体包含具有下式之CDRH3：CVX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11W，其中X1至X11系各个地选自以下所列氨基酸之群：
X1＝R或K；
X2＝Y、F、W或H；
X3＝Y、F、W或H；
X4＝G、A、V或S；
X5＝Y、F、W或H；
X6＝D、E、N或Q；
X7＝E或D；
X8＝A、G、V或S；
X9＝M、L、I或V；
X10＝D、E、N或Q；且
X11＝Y或F；
及由下式说明之CDRL3：CX1X2X3X4X5X6PX7TF，其中X1至X7系各个地选自以下所列氨基酸之群：
X1＝A、G或V；
X2＝Q或H；
X3＝N、Q或H；
X4＝L、I、M或V；
X5＝E、D、N或Q；
X6＝L、I、M或V；且
X7＝Y、F、W或H。
具有突变CDR3之抗体可使用标准技术来制备且可使用本文所述之方法加以表达并针对结合加以测试。
根据本发明之此方面之抗体可为嵌合、人类、人源化、改型或超人源化抗体。此可藉由使用此项技术中已知之方法来达成。举例而言，抗体992及1024可使用实施例18中所述之方法来人源化。”超人源化”之方法描述于US6,881,557中。
更佳地，该第一独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体992、包含抗体992之VL序列及VH序列之抗体及具有抗体992之CDR3之抗体；且该第二独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1024、包含抗体1024之VL序列及VH序列之抗体及具有抗体1024之CDR3之抗体。
更佳地，该第一独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体992及包含抗体992之VL序列及VH序列之抗体；且该第二独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1024及包含抗体1024之VL序列及VH序列之抗体。
最佳地，组合物包含抗体992及1024。
正如所述，第一及第二抗EGFR抗体较佳不抑制彼此与人类EGFR之结合。甚至更佳的是，该等抗体中之至少一者能够增强另一抗体对于人类EGFR之最大结合能力。对于抗体992及1024观察到此效应(实施例16)。
两种抗体之间的比率不必精确地为1∶1比率。因此，组合物中第一抗体相对于第二抗体之比例可介于5％与95％之间，诸如介于10％与90％之间，较佳介于20％与80％之间，更佳介于30％与70％之间，更佳介于40％与60％之间，诸如介于45％与55％之间，诸如为约50％。
较佳地，第一及第二抗体为IgG1同种型或IgG2。
本发明之发明人鉴别出之与抗体992结合相同表位之抗体的实例为来自包含克隆1209、1204、992、996、1033及1220之抗体聚类的抗体。
本发明之发明人鉴别出之与抗体1024结合相同表位之抗体的实例为来自包含克隆1031、1036、1042、984、1024、1210、1217、1221及1218之抗体聚类的抗体。
CDR3决定着抗体之结合特异性。在较佳具体实例中，包含抗体992之CDR3的抗体另外包含抗体992之VH及VL的CDR1及CDR2。同样，包含抗体1024之CDR3的抗体较佳另外包含抗体1024之VH及VL的CDR1及CDR2。抗体之CDR序列可见于实施例17之表12中。
在其它具体实例中，与抗体992竞争之抗体系选自由抗体1208、1254及1277所组成之群组。同样，与抗体1024竞争之抗体可选自由抗体1042及1320所组成之群组。
在一项具体实例中，组合物除该第一及第二抗体外不含有其它抗体，更佳为不含有其它抗EGFR抗体。
在其它具体实例中，组合物进一步包含第三独特的抗EGFR抗体，其中该第三独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1030、包含抗体1030之VL序列(SEQ ID NO 74之氨基酸3-113)及VH序列(SEQ ID NO 42之氨基酸3-120)之抗体、具有抗体1030之CDR3(SEQ ID NO 112及119)之抗体、与抗体1030结合相同表位之抗体及能够抑制抗体1030与人类EGFR结合之抗体。该第三抗体较佳使得该第一及/或该第二抗体与人类EGFR之结合增强。在一项具体实例中，组合物除该第一、该第二及第三抗体外不含有其它抗体，更佳为不含有其它抗EGFR抗体。
与抗体1030结合相同表位之抗体可选自由克隆1195、1030、1034、1194、980、981、1246及1223所组成之抗体聚类。
包含抗体1030之CDR3的抗体可另外包含抗体1030之VH及VL的CDR1及CDR2。
该等抗体可调配于一个容器中以供投药。然而，其可各个地制造、纯化且特性化，并以分装部分之试剂盒形式提供于2个或3个独立容器中，其中每一容器中具有一种抗体。因此，其可同时、依次或单独投予。
在另一个方面，将抗体992及1024之两种结合特异性组合于一种双特异性结合分子中。较佳地，该双特异性结合分子包含抗体992及1024之CDR，更佳为包含抗体992及1024之VH及VL序列。双特异性结合分子可为如实施例19中所述之双可变域抗体。亦可如文献中所述设计呈双特异性Fab片段、双特异性scFV或双功能抗体形式之双特异性结合分子。
基于抗体992及1024之结合特异性的抗体组合物较佳引起一或多个以下结果：受体内化、活体内A431NS肿瘤消退、诱导活体内A431NS细胞终末分化及上调活体内肿瘤内披蛋白表达。
本申请提供具有与抗体992与1024之组合相同或类似的效应之抗体的若干实例。此等抗体之实例包括自与该两种抗体中之一种相同的免疫中获得且属于与该两种抗体中之一种相同的聚类之抗体，及各个地与该两种抗体中之一种竞争之抗体。具有相同或类似效应之抗体组合物可基于抗体992及1024之VL序列及VH序列以及基于该等抗体之CDR，尤其此两种抗体之CDR3加以设计。
具有相同或类似效应之其它抗体组合物可藉由基本上如实施例中所述进行免疫及筛选来制备。具有与抗体992及1024相同之结合特异性的抗体可如本文所述在两个独立竞争检定中鉴别出来。最终，一种抗体可增强另一抗体之结合的抗体组合物可基本上如实施例16中所述藉由进行结合实验来鉴别。可如实施例中所述就对受体内化、体外及活体内功效、结合亲和力等之影响对抗体组合物作进一步筛选。
本发明之抗体组合物之用途
为用于活体内治疗及预防与EGFR表达(例如过度表达)相关之疾病，使用任何合适之投药途径(诸如注射及此项技术中已知之用于基于抗体之临床产品的其它投药途径)向患者(例如人类个体)以治疗有效剂量(例如可引起表达EGFR之肿瘤细胞之生长抑制、吞噬、移动降低、终末分化及/或可杀死该等肿瘤细胞之剂量)投予本发明之抗体。
可用本发明之抗体来治疗、改善及/或预防之典型EGFR相关疾病包括(但不限于)自体免疫疾病及癌症。举例而言，可被治疗、改善及/或预防之癌症包括膀胱癌、乳癌、子宫/子宫颈癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、鳞状细胞癌、肺(非小细胞)癌、食道癌、头颈部癌、皮肤癌。可被治疗之自体免疫疾病包括例如牛皮癣。
在另一项具体实例中，本发明系关于一种治疗、改善及/或预防以下疾病之方法：神经胶质母细胞瘤，包括多形性神经胶质母细胞瘤；星形细胞瘤，包括儿童星形细胞瘤；神经胶质瘤；神经母细胞瘤；胃肠道之神经内分泌肿瘤；支气管肺泡癌；滤泡状树突细胞肉瘤；唾液腺癌；釉质母细胞瘤；恶性周边神经鞘肿瘤；内分泌胰腺肿瘤；或睾丸生殖细胞肿瘤，包括精原细胞瘤、胚胎癌、卵黄囊瘤、畸胎瘤及绒膜癌。
可变重链及可变轻链编码对之分离及选择
产生抗EGFR重组抗体组合物之方法包括自合适之来源分离编码可变重链(VH)及可变轻链(VL)之序列，从而产生VH及VL编码对之库。通常，获得VH及VL编码序列之合适来源为含有淋巴细胞之细胞部分，诸如来自用人类EGFR多肽或肽、或用来源于表达人类EGFR之细胞的EGFR蛋白质或用表达人类EGFR之细胞或该等细胞之部分免疫/接种之非人类动物的血液、脾脏或脊髓样本。较佳地，自具有人类免疫球蛋白基因之非人类哺乳动物或转基因动物收集含有淋巴细胞之部分。所收集之含有淋巴细胞之细胞部分可经进一步富集以获得特定淋巴细胞群体，例如B淋巴细胞谱系之细胞。较佳地，使用磁珠细胞分选(magnetic bead cell sorting，MACS)及/或荧光活化细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)，利用例如B细胞、浆母细胞及/或浆细胞之谱系特异性细胞表面标记蛋白质进行富集。较佳地，针对B细胞、浆母细胞及/或浆细胞富集或分选含有淋巴细胞之细胞部分。甚至更佳地，自脾脏或血液分离具有CD43及CD138之高度表达之细胞。此等细胞有时称为循环浆细胞、早期浆细胞或浆母细胞。为方便起见，在本发明中仅将其称为浆细胞，不过亦可互换地使用其它术语。
VH及VL编码序列之分离可以传统方式进行，其中将VH及VL编码序列随机组合于载体中以产生VH及VL编码序列对之组合文库。然而，在本发明中，较佳的是反映出在EGFR免疫后于体液免疫反应中产生之抗体的多样性、亲和力及特异性。此包括保持最初存在于供体中之VH及VL配对，从而产生序列对之库，其中各对编码对应于最初存在于由可分离出该等序列之供体产生的抗体中之VH及VL对的可变重链(VH)及可变轻链(VL)。此亦称为VH及VL编码序列之同源对且该抗体被称为同源抗体。较佳地，本发明之组合的或同源的VH及VL编码对系自小鼠供体获得，且因此该等序列为鼠类序列。
有若干种不同方法用于产生VH及VL编码序列之同源对，一种方法包括自由含有淋巴细胞之细胞部分分选出之单细胞扩增且分离VH及VL编码序列。为获得类似于供体中VH及VL序列对之多样性的VH及VL编码序列对之库，使VH及VL对之不规则性(随机组合)尽可能小的高通量方法较佳，例如如WO 2005/042774(以引用的方式并入本文中)中所述。
VH及VL编码序列可经单独扩增且在第二步骤中配对，或其可在扩增期间配对(Coronella等人，2000.Nucleic Acids Res.28：E85；Babcook等人，1996.PNAS 93：7843-7848及WO 2005/042774)。第二种方法包括VH及VL编码序列之细胞内扩增及配对(Embleton等人，1992.Nucleic Acids Res.20：3831-3837；Chapal等人，1997.BioTechniques 23：518-524)。第三种方法为选择淋巴细胞抗体法(selected lymphocyte antibody method，SLAM)，其组合溶血空斑检定与VH及VL cDNA之克隆(Babcook等人，1996.PNAS93：7843-7848)。可与小鼠配合使用之另一方法为标准杂交瘤技术，继而筛选及选择优势候选者(lead candidate)且随后克隆所编码之抗体。
在本发明之一较佳具体实例中，成员对反映负责由EGFR免疫产生之体液免疫反应之基因对的VH及VL编码对之库系根据包含以下步骤之方法产生：i)提供来自经人类EGFR免疫之动物供体的含有淋巴细胞之细胞部分；ii)视情况自该细胞部分富集B细胞或浆细胞；iii)获得经分离单细胞之群体，其包含将细胞自该细胞部分各个地分配至复数个器皿中；iv)以多路重迭延伸RT-PCR程序，使用来源于该等经分离单细胞之模板扩增VH及VL编码对且实现VH及VL编码对之连接；及v)视情况进行已连接之VH及VL编码对之巢式PCR(nested PCR)。较佳地，使该等经分离之同源VH及VL编码对经受如下所述之筛选程序。
一旦产生VH及VL序列对后，随即进行筛选程序以鉴别出编码针对EGFR相关抗原具有结合活性之VH及VL对的序列。较佳地，该EGFR相关抗原包含EGFR之细胞外部分，诸如域III、II、I及/或IV，该等域之片段或完整细胞外域。其它抗原包括突变体，诸如EGFR或SNP之缺失突变体，或其片段。若VH及VL序列对为组合的，则可在筛选之前应用噬菌体展示程序来富集编码与EGFR结合之抗体片段的VH及VL对。
为真实反映(mirror)在经EGFR免疫后于体液免疫反应中产生之抗体的多样性、亲和力及特异性，本发明已开发出一种用于同源对之筛选程序，以便获得尽可能最广泛的多样性。出于筛选目的，使用已转染至合适宿主细胞中之细菌或哺乳动物筛选载体使同源VH及VL编码对之库各个地表达为抗体片段(例如scFv或Fab)或全长抗体。可针对(但不限于)以下方面筛选Fab/抗体之库：对EGFR之活性、针对表达EGFR之癌细胞系的抗增殖活性以及抑制配体(例如EGF)与EGFR结合之能力、抑制磷酸化、诱导凋亡、EGFR内化。
同时，针对诸如人类及视情况存在之猕猴或黑猩猩或恒河猴EGFR肽之选定抗原筛选Fab/抗体之库。该等抗原肽可例如选自人类EGFR细胞外域、人类突变EGFR细胞外域及猕猴EGFR细胞外域或其片段。该等肽可生物素化以有利于在筛选期间固定于珠粒或板上。亦可使用替代性固定方法。基于EGFR生物学知识选择抗原且可提供能够与此等抗原潜在结合之预期中和及/或保护效应抗体。此筛选程序同样可应用于组合噬菌体展示文库。
用于筛选之重组EGFR蛋白质可表达于细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或另一合适之表达系统中。出于正确加工(包括糖基化)之目的，使该等蛋白质表达于哺乳动物细胞中。EGFR-ECD蛋白质可表达为可溶性蛋白质(无跨膜区及细胞内区域)或其可与第三蛋白质融合，以增强稳定性。若EGFR蛋白质与融合标签一起被表达，则该融合搭配物可能在筛选之前发生裂解。除上述初级筛选外，可进行二级筛选，以便确保所选序列均不编码假阳性。
通常，免疫检定适用于本发明中所进行之筛选。该等检定在此项技术中系熟知的且构成例如ELISPOT、ELISA、FLISA、膜检定(例如西方墨点法(Western blot))、过滤器上之数组(array on filter)及FACS。或者可在无任何预先富集步骤之情况下，利用由编码VH及VL对之序列产生之多肽进行该等检定。倘若VH及VL编码对之库为同源对，则在筛选之前无需藉由例如噬菌体展示进行富集。然而，在筛选组合文库时，免疫检定较佳与富集方法组合进行或在富集方法之后进行，该等富集方法诸如噬菌体展示、核糖体展示、细菌表面展示、酵母展示、真核病毒展示、RNA展示或共价展示(于FitzGerald，K.，2000.Drug Discov.Today 5，253-258中有所评论)。
通常使筛选中所选出之VH及VL对编码序列经受定序，且对可变区多样性进行分析。尤其关注CDR区域之多样性，而且关注VH及VL家族表达(family representation)。基于此等分析，选出编码VH及VL对之序列，其中该等VH及VL对代表自一或多个动物供体分离之EGFR结合抗体之总体多样性。较佳地，选出在所有CDR区域(CDRH1、CDRH2、CDRH3以及CDRL1、CDRL2及CDRL3)中均具有差异之序列。若存在具有一或多个相同或极类似的CDR区且属于不同VH或VL家族之序列，则亦将此等序列选出。较佳地，在所选序列对之中，至少可变重链之CDR3区域(CDRH3)不同。可能地，VH及VL序列对之选择可严格地基于CDRH3区之可变性而进行。在序列之启动及扩增期间，在可变区之框架区中(尤其在第一框架区中)可能发生突变。较佳地，校正第一框架区中发生之错误，以便确保序列与生殖系来源之序列完全或至少98％一致，例如使得VH及VL序列为完全鼠类序列。
当确保所选之编码VH及VL对之序列的集合之总体多样性高度代表遗传层面上在对EGFR免疫之体液反应中所见之多样性时，可预期由所选VH及VL编码对之集合表达之抗体的总体特异性亦可代表EGFR免疫动物体内所产生之抗体的特异性。由所选VH及VL编码对之集合表达之抗体的特异性是否代表由供体产生之抗体的特异性之标志可藉由将供体血液对所选抗原之抗体力价与由所选VH及VL编码对之集合表达之抗体的特异性进行比较来获得。此外，可对由所选VH及VL编码对之集合表达之抗体的特异性作进一步分析。特异性程度与可侦测到结合活性之不同抗原的数目有关。在本发明之另一项具体实例中，由所选VH及VL编码对之集合表达之各个抗体的特异性系藉由表位定位来分析。
表位定位可藉由多种方法进行，该等方法不一定互相排斥。一种定位抗体分子之表位特异性的方法为评估与来源于靶抗原之一级结构的不同长度之肽的结合。该等肽既可为线性肽，又可为构形肽，且可用于多种检定格式中，该等检定格式包括ELISA、FLISA及表面等离子共振(SPR，Biacore，FACS)。此外，该等肽可使用可用序列及结构数据来作出合理选择以代表例如靶抗原之细胞外区或保守区，或可设计为代表所选部分抗原或全部抗原之一组重迭肽(Meloen RH，Puijk WC，Schaaper WMM.Epitope mapping byPEPSCAN.Immunology Methods Manual，Iwan Lefkovits编，1997，AcademicPress，第982-988页)。抗体克隆针对一或多种该等肽之特定活性通常为表位特异性之标志。然而，在许多情况下，肽为由针对蛋白质抗原产生之抗体识别之表位的不良模拟物，此既归因于缺乏天然或特定构形，而且亦归因于相较于抗体及肽，抗体与蛋白质抗原之间的相互作用之包埋表面积(buriedsurface area)通常较大。允许确定直接针对蛋白质抗原之特异性的第二种表位定位方法系藉由使用现有、明确确定之抗体选择性地遮蔽表位而进行。继阻断后第二探测抗体与抗原之结合减少通常指示共有或重迭表位。藉由选择性遮蔽来进行表位定位可藉由多种免疫检定法进行，该等免疫检定法包括(但不限于)此项技术中所熟知之ELISA及Biacore(例如Ditzel等人，1997.J.Mol.Biol.267：684-695；Aldaz-Carroll等人，2005.J.Virol.79：6260-6271)。另一种确定抗EGFR抗体之表位特异性的潜在方法为在抗体存在下选择逃避突变体(escape mutant)。此可例如使用丙氨酸扫描来进行。目标来自该等逃避突变体之基因的定序通常可揭示抗原中之何种氨基酸对于抗体识别很重要且因此构成表位(之一部分)。
由所选V H 及V L 编码对产生抗EGFR抗体组合物
本发明之抗体组合物可在一或数个生物反应器或其等效物中由多克隆表达细胞系制得。按照此方法可将抗EGFR抗体以单一制剂形式自反应器中纯化出来而不必在处理期间分离构成抗EGFR抗体组合物之具体成员。若抗体组合物系在一个以上生物反应器中制备，则经纯化之抗EGFR抗体组合物可藉由汇集自各生物反应器之经各个纯化的上清液获得之抗体而获得。
一种制备重组抗体组合物之方法描述于WO 2004/061104及WO2006/007850(此等参考文献系以引用的方式并入本文中)中。其中所述之方法系以将抗体编码序列位点特异性地整合至各个宿主细胞之基因组中为基础，从而确保在制备期间VH及VL蛋白质链得以保持其初始配对。此外，该位点特异性整合使位置效应最小化且因此可预期多克隆细胞系中之各个细胞之生长及表达特性极其类似。一般而言，该方法涉及以下项：i)具有一或多个重组酶识别位点之宿主细胞；ii)具有至少一个重组酶识别位点与宿主细胞之重组酶识别位点兼容的表达载体；iii)藉由将所选VH及VL编码对自筛选载体转移至表达载体以使得全长抗体或抗体片段可由该载体表达(若筛选载体与表达载体相同则该类转移可为不必要的)来产生表达载体之集合；iv)用该表达载体集合及编码重组酶之载体转染宿主细胞，其中该重组酶能够组合宿主细胞基因组中之重组酶识别位点与表达载体中之重组酶识别位点；v)自该经转染之宿主细胞获得/产生多克隆细胞系；及vi)由该多克隆细胞系表达抗体组合物且进行收集。
若对于一种组合物使用少数种类(2-3种或2-3种以上)的抗体，则其可以类似于制造单克隆抗体之方式各个地加以表达且纯化，例如如WO2004/085474中所述。该等经纯化之抗体可在纯化后混合或包装于独立小瓶中以供在投药之前混合或用于单独投药。
较佳地，使用哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、脊髓瘤细胞(例如Sp2/0或NS0细胞)、纤维母细胞(诸如NIH 3T3)及不朽化人类细胞(诸如海拉细胞(HeLa cell)、HEK 293细胞或PER.C6)。然而，亦可使用非哺乳动物真核或原核细胞，诸如植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌、大肠杆菌(E.coli)等。合适之宿主细胞在其基因组中包含一或多个合适之重组酶识别位点。宿主细胞亦应含有与整合位点可操作地连接之选择模式，以便能够对整合物(亦即，在整合位点处具有抗EGFR Ab表达载体或表达载体片段之整合拷贝的细胞)进行选择。在基因组之预定位置处具有FRT位点之细胞的制备描述于例如US 5,677,177中。较佳地，宿主细胞仅具有单个整合位点，其位于使整合物能够高度表达之位点(所谓热点(hot-spot))处。
合适之表达载体包含匹配宿主细胞之重组酶识别位点之重组识别位点。较佳地，该重组酶识别位点与不同于用于建构宿主细胞之选择基因的合适选择基因连接。选择基因在此项技术中系熟知的，且包括谷氨酰胺合成酶基因(GS)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及新霉素(neomycin)，其中GS或DHFR可用于所插入之VH及VL序列的基因扩增。该载体亦可含有两个不同的重组酶识别位点，以允许抗体编码序列之重组酶介导之盒式交换(recombinase-mediated cassette exchange，RMCE)代替载体之完全整合。RMCE描述于(Langer等人，2002；Schlake及Bode 1994)中。合适之重组酶识别位点在此项技术中系熟知的，且包括FRT、lox及attP/attB位点。较佳地，整合载体为同型编码载体，其中恒定区(较佳包括内含子)在自筛选载体转移VH及VL编码对之前存在于该整合载体中(或若对全长抗体进行筛选，则恒定区已存在于筛选载体中)。存在于载体中之恒定区可为整个重链恒定区(CH1至CH3或至CH4)或编码抗体之Fc部分之恒定区(CH2至CH3或至CH4)。在转移之前亦可存在轻链κ或λ恒定区。恒定区(若存在)数目之选择视所使用之筛选及转移系统而定。重链恒定区可选自IgG1同种型、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD及IgE。较佳同型为IgG1、IgG2及/或IgG3。此外，用于抗EGFR抗体编码核酸的位点特异性整合之表达载体含有指导VH及VL链中之每一者之高量表达的合适启动子或等效序列。图4说明一种设计表达载体之可能方式，不过亦可能存在多种其它设计。
自筛选载体转移所选VH及VL编码对可藉由习知限制酶裂解及接合来进行，以使得各表达载体分子含有一个VH及VL编码对。较佳地，VH及VL编码对系各个地被转移，然而必要时，其亦可整体地被转移。当所有所选VH及VL编码对均转移至表达载体中时，获得表达载体之集合或文库。必要时，亦可使用替代性转移方法。若筛选载体与表达载体相同，则表达载体之文库系由筛选期间所选出之VH及VL序列对构成，该等VH及VL序列对位于筛选/表达载体中。
将核酸序列转染至宿主细胞中之方法在此项技术中系已知的。为确保位点特异性整合，亦必须向宿主细胞提供合适之重组酶。此较佳系藉由共转染编码重组酶之质粒来实现。合适之重组酶为例如Flp、Cre或噬菌体ΦC31整合酶，其与具有相应重组酶识别位点之宿主细胞/载体系统一起使用。宿主细胞可成批地被转染，此意谓以单一反应将表达载体之文库转染至细胞系中，从而获得多克隆细胞系。或者，可将表达载体之集合各个地转染至宿主细胞中，从而产生各个细胞系之集合(各细胞系产生具有特定特异性之抗体)。随后针对位点特异性整合物对转染后产生之细胞系(各个或多克隆)进行选择，且使其适合于生长于悬浮液及无血清培养基中，此系在该等细胞系在转染之前尚未具有该等特性时进行。若各个地进行转染，则进一步对各个细胞系之生长特性及抗体产生进行分析。较佳地，选择具有类似增殖速率及抗体表达量之细胞系以供产生多克隆细胞系。随后藉由以预定比率混合各个细胞系来产生多克隆细胞系。一般而言，由该多克隆细胞系制得多克隆主细胞库(polyclonal master cell bank，pMCB)、多克隆研究细胞库(polyclonal researchcell bank，pRCB)及/或多克隆工作细胞库(polyclonal working cell bank，pWCB)。多克隆细胞系系藉由以预定比率混合各个细胞系来产生。将多克隆细胞系分配至安瓿中，从而产生多克隆研究细胞库(pRCB)或多克隆主细胞库(pMCB)，多克隆工作细胞库(pWCB)可由pRCB或pMCB藉由扩增研究或主细胞库之细胞而产生。研究细胞库主要用于构想研究之证明，其中多克隆细胞系可能不包含与主细胞库中之多克隆细胞系同样多之各个抗体。通常，进一步扩增pMCB以制备用于制造目的之pWCB。在pWCB用完后，可扩增来自pMCB之新安瓿以制备新pWCB。
本发明之一项具体实例为能够表达本发明之重组抗EGFR抗体组合物的多克隆细胞系。
本发明之另一项具体实例为多克隆细胞系，其中的每种细胞能够表达单一VH及VL编码对，且该多克隆细胞系整体上能够表达VH及VL编码对之集合，其中每对VH及VL编码抗EGFR抗体。较佳地，VH及VL编码对之集合为根据本发明之方法产生之同源对。
本发明之重组抗体组合物可藉由将来自pWCB之一个安瓿在适当培养基中培养允许抗体充分表达且多克隆细胞系能保持稳定之一段时间(范围大致介于15日与50日之间)来制备。可使用诸如补料分批或灌注之培养法。重组抗体组合物系自培养基获得且藉由习知纯化技术来纯化。对于IgG之纯化常常使用与诸如离子交换层析法、疏水相互作用及凝胶过滤之后续纯化步骤组合之亲和力层析法。在纯化之后，例如藉由离子交换层析法评估多克隆抗体组合物中所有具体成员之存在。该类抗体组合物之特性化详细描述于WO 2006/007853(以引用的方式并入本文中)中。
在重组宿主中表达抗体混合物之替代方法描述于WO 2004/009618中。此方法自单一细胞系产生具有与同一轻链接合之不同重链之抗体。若由组合文库产生抗EGFR抗体组合物，则此方法可为适用的。
治疗组合物
本发明之另一个方面为一种包含本发明之抗EGFR抗体组合物或抗EGFR重组Fab或另一抗EGFR重组抗体片段组合物或双特异性结合分子作为活性成份的医药组合物。较佳地，该类组合物之活性成份为如本发明中所述之抗EGFR重组抗体组合物。该等组合物意欲用于改善及/或预防及/或治疗癌症。较佳地，向人类、家畜或宠物投予该医药组合物。
医药组合物进一步包含医药学上可接受之赋形剂。
抗EGFR抗体组合物或其抗体片段可以于医药学上可接受之稀释剂、载剂或赋形剂中之单位剂型投予。可使用习用医药操作法来提供适合于投予癌症患者之配制剂或组合物。在一项较佳具体实例中，投药为治疗性的，此意谓在已诊断出癌症病状后投药。可使用任何合适之投药途径，例如投药方式可为非经肠、静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、鼻内、气溶胶、栓剂或经口投药。举例而言，医药配制剂可呈液体溶液或悬浮液形式。对于口服投药而言，需要防止胃内降解。对于鼻内配制剂而言，抗体可以散剂、滴鼻剂或气溶胶形式投予。
本发明之医药组合物系以本身已知之方式制备，例如藉助于习知溶解、冻干、混合、造粒或调制方法来达成。该等医药组合物可根据习用医药操作法(参看例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(第20版)，A.R.Gennaro编，2000，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA andEncyclopedia of Pharmaceutical Technology，J.Swarbrick及J.C.Boylan编，1988-1999，Marcel Dekker，New York，NY)调配。
较佳地，使用活性成份之溶液或悬浮液，且尤其使用其等张水性溶液或悬浮液来制备本发明之医药组合物。在仅包含活性成份或包含活性成份以及载剂(例如甘露糖醇)之冻干组合物的情况下，若有可能，则可在使用之前制备该等溶液或悬浮液。该等医药组合物可经灭菌且/或可包含赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂及/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压之盐及/或缓冲剂，且系以本身已知之方式制备，例如藉助于习知溶解或冻干方法来达成。该等溶液或悬浮液可包含增黏物质，诸如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯吡咯啶酮或明胶。
注射组合物系以惯用方式在无菌条件下制备；该等无菌条件亦应用于将组合物引入安瓿或小瓶中及密封容器。
医药组合物包含约1％至约95％、较佳约20％至约90％之活性成份。本发明之医药组合物可例如呈单位剂型，诸如呈安瓿、小瓶、栓剂、锭剂、丸剂或胶囊之形式。配制剂可以治疗或预防有效量(例如可预防、消除或降低病理学病状之量)向人类个体投予以提供对疾病或病状之治疗。欲投予之治疗剂之较佳剂量可能视诸如以下之变量而定：癌症之严重程度、特定患者之总体健康状况、化合物赋形剂之调配及其投药途径。
本发明之组合物之治疗性用途
本发明之医药组合物可用于治疗或改善哺乳动物之疾病。可用本发明之医药组合物进行治疗或预防的状况包括预防及治疗患者癌症，其较佳可用本发明之医药组合物进行治疗性治疗。
本发明之一项具体实例为一种预防、治疗或改善哺乳动物之一或多种与癌症有关之症状的方法，其包含向该哺乳动物投予有效量之本发明之抗EGFR重组抗体组合物。
本发明之另一项具体实例为一种本发明之抗EGFR重组抗体组合物之用途，其系用于制备用以治疗、改善或预防哺乳动物之一或多种与癌症有关之症状的组合物。
较佳地，上述具体实例中之哺乳动物为人类、家畜或宠物。
本发明之抗体适用于治疗某些实体肿瘤。根据包括EGFR表达量之多种因素，尤其以下肿瘤类型似乎呈现为较佳适应症：乳癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈部癌及非小细胞肺癌。
癌症之其它实例包括癌瘤及肉瘤。癌瘤至少包括以下癌瘤：
上皮性瘤，NOS；
鳞状细胞瘤；
鳞状细胞癌，NOS；
基底细胞瘤；
基底细胞癌，NOS；
移行细胞乳头状瘤及移行细胞癌；
腺瘤及腺癌(腺体)；
腺瘤，NOS；
腺癌，NOS；
皮革胃(Linitis plastica)；
胰岛素瘤，NOS；
升糖素瘤(glucagonoma)，NOS；
胃泌素瘤，NOS；
VIP瘤(Vipoma)；
胆管癌；
肝细胞癌，NOS；
腺样囊性癌；
阑尾类癌瘤，NOS；
泌乳素瘤；
嗜酸性腺瘤；
何氏细胞腺瘤(Hurthle cell adenoma)；
肾细胞癌；
格拉维茨瘤(Grawitz tumor)；
多发性内分泌腺瘤；
子宫内膜样腺瘤，NOS；
附件瘤及皮肤附属器瘤；
黏液表皮样瘤；
囊性瘤、黏液瘤及浆液瘤；
囊腺瘤，NOS；
腹膜假黏液瘤；
导管瘤、小叶瘤及髓质瘤；
腺泡细胞瘤；
复合上皮性瘤；
沃辛氏瘤(Warthin′s tumor)；
胸腺瘤，NOS；
特殊性腺瘤；
生殖索基质肿瘤；
泡膜细胞瘤，NOS；
粒层细胞瘤，NOS；
含睾丸细胞之卵巢腺瘤，NOS；
塞托利-莱迪希氏细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)；
副神经节瘤及血管球瘤；
副神经节瘤，NOS；
嗜铬细胞瘤，NOS；
血管球瘤；
痣及黑色素瘤；
黑素细胞痣；
恶性黑色素瘤，NOS；
黑色素瘤，NOS；
结节性黑色素瘤；
发育不良痣；
恶性小痣黑色素瘤；
表浅散播型黑色素瘤；
恶性肢端痣样黑色素瘤。
肉瘤之实例包括。根据肉瘤所源自之组织类型，给予肉瘤许多不同名称。举例而言，骨肉瘤源自骨骼，软骨肉瘤源自软骨，且平滑肌肉瘤源自平滑肌。诸如平滑肌肉瘤、软骨肉瘤及胃肠基质肿瘤(GIST)之软组织肉瘤在成人中比在儿童中更常见。
就此等适应症中每一者而言，三种临床路径似乎提供独特的临床成功可能性：
辅助疗法：在辅助疗法中，将用本发明之抗体与化疗剂或抗肿瘤剂及/或放射疗法之组合对患者进行治疗。以上所列之原发性标靶将按照方案藉由向标准第一线及第二线疗法或第三线疗法添加本发明之抗体来进行治疗。方案设计将着手解决如根据肿瘤块减小以及降低标准化学疗法常用剂量之能力所评估的有效性。此等剂量上的降低由于降低化疗剂之剂量相关毒性而使得可进行额外及/或长期治疗。先前技术之抗EGFR抗体已与或正与以下化疗剂或抗肿瘤剂组合用于若干辅助临床试验中：阿德力霉素(尔必得舒：晚期前列腺癌)、顺铂(尔必得舒：晚期头颈部癌及肺癌)、紫杉醇(尔必得舒：乳癌)及多柔比星(尔必得舒)。
本发明提供医药物品，其包含以组合形式用于在癌症疗法中同时、单独或依次投药的本发明之抗体组合物及至少一种能够诱导癌细胞分化之化合物。藉由将本发明之抗体组合物与已知可诱导癌细胞终末分化之药剂组合可进一步改良其功效。
该至少一种化合物可选自由以下者所组成之群组：视网酸(retinoic acid)、反式视网酸、顺式视网酸、苯基丁酸盐、神经生长因子、二甲亚砜、活性形式之维生素D(3)、过氧化体增殖物激活型受体γ、12-O-四癸酰基佛波醇13-乙酸酯、六亚甲基-双-乙酰胺、转化生长因子β、丁酸、环状AMP及维司力农(vesnarinone)。较佳地，该化合物选自：视网酸、苯基丁酸盐、所有反式视网酸、活性形式之维生素D。
包含本发明之抗体组合物及至少一种化疗化合物或抗肿瘤化合物之医药物品可以组合形式用于在癌症疗法中同时、单独或依次投药。该化疗化合物可选自由以下者所组成之群组：阿德力霉素、顺铂、紫杉醇、多柔比星、拓朴替康、氟嘧啶、奥沙利铂及伊立替康。
单一疗法：就本发明之抗体在肿瘤之单一疗法中之用途而言，可在无化疗剂或抗肿瘤剂之情况下向患者投予该等抗体。经由使用本发明之抗体产生且在本文中讨论之临床前结果已显示作为独立疗法之阳性结果。
成像剂：经由使放射性核种(例如钇(90Y))与本发明之抗体结合，可预期本发明之放射性标记抗体能用作诊断、成像剂。在该类作用中，本发明之抗体将定位于实体肿瘤以及表达EGFR之细胞的转移性病灶。就本发明之抗体作为成像剂之用途而言，该等抗体可在实体肿瘤之辅助外科手术治疗中用作手术前筛选以及手术后跟踪以确定哪些肿瘤残余及/或复发。(111In)-尔必得舒抗体已在具有不可切除鳞状细胞肺癌瘤之患者的I期人类临床试验中用作成像剂。(Divgi等人，J.Natl.Cancer Inst.83：97-104(1991))。用标准前部及后部γ照相机跟踪患者。初步数据表明鉴别出所有原发性病灶及大型转移性病灶，而仅侦测出一半小型转移性病灶(不到1cm)。
酪氨酸激酶抑制剂(TKI)为主要衍生自喹唑啉之合成低分子量分子，其与受体之细胞内酪氨酸激酶域相互作用且藉由竞争细胞内Mg-ATP结合位点来抑制配体诱导之受体磷酸化。临床开发中之若干TKI靶向EGFR，该等TKI包括吉非替尼(Gefitinib)(易瑞沙(Iressa)，ZD1839)、埃罗替尼(Erlotinib)(它赛瓦(Tarceva)，OSI-774)、拉帕替尼(Lapatinib)(泰克布(Tykerb)，GW572016)、卡奈替尼(Canertinib)(CI-1033)、EKB-569及PKI-166。TKI与抗EGFR之组合治疗已显示在活体内与体外针对EGFR依赖性癌细胞均为有益的。包含本发明之抗体组合物及至少一种靶向EGFR之TKI的医药物品可以组合形式用于在癌症疗法中同时、单独或依次投药。其它小分子抑制剂包括：索拉非尼(Sorafinib)(raf及多种RTK)、舒尼替尼(Sunitinib)(多种RTK)、西罗莫司(Temsirolimus)(mTOR)、RAD001(mTOR)及AZD217(VEGFR2)。
在其它具体实例中，本发明之抗体组合物与其它抗体治疗剂组合使用。此等抗体治疗剂之实例包括例如针对HER2之抗体(赫赛汀，Herceptin)及针对VEGF之抗体(阿瓦斯丁，avastin)。在其它具体实例中，本发明之抗体组合物与已知可刺激免疫系统之细胞的药剂组合使用，该组合治疗使得免疫介导的本发明之抗体组合物之功效增强增大。该等免疫刺激剂之实例包括(但不限于)重组介白素(例如IL-21及IL-2)。
投药之剂量及途径
虽然本发明之抗体的特定剂量尚未确定，但某些剂量考虑因素可经由与已经核准之类似产品(ImClone C225(尔必得舒))相比较来确定。C225抗体典型的是以在5mg/m2至400mg/m2范围内之剂量投予，其中关于安全性研究，仅使用较低剂量。因此，可预期在患者体内本发明抗体之剂量可在此范围内或更低，或许在50mg/m2至300mg/m2范围内，且仍然有效。与以mg/kg计之习知剂量量度不同，以mg/m2计之剂量为基于表面积之量度且为经设计成包括自婴儿至成人之所有体型之患者的适宜剂量量度。
可用于尔必得舒(西妥昔单抗)之处方信息包括初始120分钟静脉内(IV)输注400mg/m2，继而每周60min输注250mg/m2。此等剂量被推荐用于独立治疗以及与放射疗法组合。对于维克替比(帕尼单抗)，推荐剂量为每14日经60分钟投予6mg/kg。
Genmab之HuMaxEGFr抗体(扎妥木单抗)之预期临床剂量为8mg/kgHuMax-EGFr之初始剂量，继而每周输注维持剂量直至疾病进展。该维持剂量应视需要进行调整直至患者显现出剂量限制性皮疹，至多为16mg/kgHuMax-EGFr之最大剂量(关键III期研究(pivotal Phase III study)之剂量，可由Genmab之产品说明得知)。
如就现今临床所用之单克隆抗EGFR抗体(尔必得舒及维克替比)所观察到，本发明之抗体组合物之临床剂量可能受皮疹程度限制。猕猴之六周毒理学研究之资料展示，当以等同于用临床中所用之单克隆抗体之一治疗时之用量的剂量投予本发明之抗体组合物时无皮疹迹象(实施例20)。因此，本发明之抗体组合物可静脉内投予且每周给予250mg/m2(对于体表面积为1.8m2且体重为60kg之人，折算为7.5mg/kg)。此外，可给予400mg/m2(对于体表面积为1.8m2且体重为60kg之人，折算为12mg/kg)之初始负荷剂量，随后为后续每周给药。
可预期三种独特的传递方法适用于传递本发明之抗体。习知静脉内传递估计可能为用于大多数肿瘤之标准传递技术。然而，就腹膜腔中之肿瘤(诸如卵巢、胆管、其它管道及其类似组织之肿瘤)而言，腹膜内投药可证实有利于在肿瘤处获得高剂量之抗体且使抗体清除率减至最低程度。以类似方式，某些实体肿瘤具有适合于局部灌注之血管结构。局部灌注将使得可于肿瘤部位处获得高剂量之抗体且可使抗体之短期清除率减至最低程度。
如同任何基于蛋白质或抗体输注之疗法一般，安全性问题主要与以下项有关：(i)细胞激素释放综合征，亦即低血压、发烧、颤抖、寒战；(ii)对物质之免疫原性反应之产生(亦即，患者产生针对治疗性抗体之人类抗体，或HAHA或HACA反应)；及(iii)对表达EGF受体之正常细胞(例如表达EGFR之肝细胞)之毒性。标准测试及跟踪研究将用于监测此等安全性问题中之每一者。详言之，将在临床试验期间频繁地监测肝功能以便评估对肝之损害(若存在时)。
诊断用途
本发明之另一项具体实例系针对诊断试剂盒。本发明之试剂盒包含根据本发明制备之抗EGFR抗体组合物，其蛋白质可以可侦测标记进行标记或不经标记以供无标记侦测。该试剂盒可用于鉴别罹患与EGFR过度表达有关之癌症的个体。
实施例
实施例1：抗EGFR抗体之克隆
免疫
使用雌性BALB/c品系A或C57B16小鼠(8-10周龄)，藉由注射除EGFR过度表达细胞外之不同经纯化蛋白质进行免疫。
对于一些免疫使用市售EGFR蛋白质(R&D systems，目录号1095-ER或Sigma#E3641)。对于其它免疫而言，使用以融合蛋白质形式产生之重组人类EGFR及EGFRvIII，其由EGFR或EGFRvIII之ECD与人类生长激素(hGH)组成，除实施例10b中所述之His标签外，亦包括烟草蚀刻病毒(Tobacco EtchVirus，TEV)裂解位点。在一些情况下，藉由TEV蛋白酶裂解且随后经镍管柱纯化来分离EGFR之ECD。
使用每个细胞表达约107个受体之人类头颈部癌细胞系HN5(Easty DM，Easty GC，Carter RL，Monaghan P，Butler LJ.Br J Cancer，1981年6月；43(6)：772-85.Ten human carcinoma cell lines derived from squamouscarcinomas of the head and neck)进行基于细胞之免疫。将细胞培养于补充有10％FBS(胎牛血清)、3mM甘油、5mM丙酮酸钠及1％青霉素链霉素之DMEM培养基中。在各免疫之前，用PBS洗涤细胞，用TrypLE进行胰蛋白酶化且再悬浮于生长培养基中。随后藉由以250×g离心5min，移出且再悬浮于15ml无菌PBS中而用PBS洗涤细胞悬浮液两次。
用PBS稀释细胞或抗原且随后与弗氏佐剂(Freund′s Adjuvant)以1∶1混合。使用佐剂来增强且调节免疫反应。对于第一次免疫使用完全弗氏佐剂(Complete Freund′s Adjuvant，CFA)，而对于后续免疫使用不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund′s Adjuvant，IFA)。IFA为由矿物油所组成之水包油乳液，且CFA为添加有经热杀死、干燥之分枝杆菌(Mycobacterium)物种之IFA。两种佐剂皆具有储存效应(depot effect)。CFA使免疫反应长期持久且用于第一次免疫以增强免疫反应，且使用IFA进行后续免疫。藉由在具有水之玻璃表面上添加一液滴来测试该等乳液。若该液滴保持为一液滴，则乳液为稳定的且可进行注射。仅向小鼠投予稳定乳液。
视时程(参见表2)而定，对于各注射使用25-100μg抗原或107个细胞。小鼠总共接受4次注射。所有小鼠均被注射300μl或200μl乳液。视时程而定，进行皮下(s.c)、腹膜内(i.p)或静脉内(i.v)注射。
结束时，藉由颈部脱臼杀死小鼠，且移取脾脏并转移至74μm细胞过滤网(cell strainer，Corning#136350-3479)中。经由过滤器分离细胞，再悬浮于具有10％ FBS之冷RPMI 1640中且以300×g离心5分钟。将细胞球粒再悬浮于具有1％FBS之RPMI 1640中，经由50μm注射过滤器(BD#340603)过滤且藉由离心收集。将细胞球粒再悬浮于具有10％ DMSO之FCS中，随后冷藏，且将冷冻之细胞储存于-80℃直至FACS分选。
鼠类浆细胞之FACS分选
将具有冷冻脾细胞之小瓶于37℃解冻且在冰仍存在之情况下转移至15ml试管中。在涡旋的同时将10ml冰冷RPMI、10％FBS(胎牛血清)逐滴添加至该试管中。在以10ml FACS PBS洗涤一次后，添加5ml FCS PBS，随后经由50μm Filcon过滤细胞。随后使细胞成粒且再悬浮于1ml(最终体积)具有2％FBS之PBS中，且根据特定稀释度以抗CD43-FITC及抗CD138-PE染色至最终浓度为约5μg/ml。于4℃在黑暗中培养细胞20min。随后，用2ml FACS缓冲液洗涤细胞2次。添加达15ml之FACS PBS。以1∶100添加碘化丙锭(PI)(1份PI对比100份FACS PBS缓冲液)，且随后将细胞分选至含有PCR反应缓冲液(参见下文)之96孔PCR板中，且以400×g离心2min，随后将该等板于-80℃冷冻。如图1所示，将浆细胞以CD43阳性/CD138阳性设门。
同源V H 及V L 对之连接
对以浆细胞设门之单细胞进行VH及VL编码序列之连接，此有利于VH及VL编码序列之同源配对。该程序使用基于单步多路重迭延伸RT-PCR继而巢式PCR之两步PCR程序。本发明之实施例中所用之引物混合物仅扩增κ轻链。然而，必要时，可将能够扩增λ轻链之引物添加至多路引物混合物及巢式PCR引物混合物中。若添加λ引物，则应对分选程序进行调适以使λ阳性细胞不被排除。同源VH及VL序列连接之原理示于图2中。
将所准备之96孔PCR板解冻且所分选之细胞充当用于多路重迭延伸RT-PCR之模板。在单细胞分选之前添加至各孔中之分选缓冲液含有反应缓冲液(单步RT-PCR缓冲液；Qiagen)、RT-PCR之引物(参见表3)及RNase抑制剂(RNasin，Promega)。此分选缓冲液补充有单步RT-PCR酶混合物(25倍稀释液；Qiagen)及dNTP混合物(各200μM)以在20μl反应体积中获得给定最终浓度。于55℃培养板30分钟以允许自各细胞反转录RNA。在RT后，使板经受以下PCR循环：94℃10min，35×(94℃40sec，60℃40sec，72℃5min)，72℃10min。
在H20BIT热循环仪(ABgene)中进行PCR反应，所述热循环仪配有用于24个96孔板之的剥离密封框(Peel Seal Basket)以便进行高通量处理。在循环后，将该等PCR板储存于-20℃。
对于巢式PCR步骤而言，准备96孔PCR板，其中各孔(20μl反应物)中具有以下混合物以获得给定最终浓度：1×FastStart缓冲液(Roche)、dNTP混合物(各200μM)、巢式引物混合物(参见表4)、Phusion DNA聚合酶(0.08U；Finnzymes)及FastStart高保真酶掺合物(0.8U；Roche)。自多路重迭延伸PCR反应物转移1μl作为巢式PCR之模板。使巢式PCR板经受以下热循环：35×(95℃30sec，60℃30sec，72℃90sec)，72℃10min。
以1％琼脂糖凝胶分析随机选择之反应物以证实具有约890个碱基对(bp)之重迭延伸片段之存在。
将板储存于-20℃直至进一步加工该等PCR片段。
将来自巢式PCR之已连接的VH及VL编码对之库在不将来自不同供体之对混合的情况下汇集，且藉由制备型1％琼脂糖凝胶电泳纯化。藉由重迭延伸将人类κ恒定轻链编码序列剪接至已连接的VH及VL编码对之汇集PCR产物之VL编码区(图3)。在含有以下各物之反应物中自含有具有κ轻链之人类抗体之编码序列的质粒扩增人类κ恒定轻链编码序列：Phusion酶(2U；Finnzymes)、1×Phusion缓冲液、dNTP混合物(各200μM)、hKCforw-v2引物与κ3′引物(表5)及质粒模板pLL138(10ng/μl)，总体积为50μl。使反应物经受以下热循环：25×(95℃30sec，55℃30sec，72℃45sec)，72℃10min。藉由制备型1％琼脂糖凝胶电泳纯化所得PCR片段。
藉由随后经由含有以下之重迭延伸PCR(总体积为50μl)进行剪接使各库之经纯化汇集之PCR片段剪接至经扩增及纯化之人类κ恒定编码区(附录2)之PCR片段：人类κ恒定编码区片段(1.4ng/μl)、经纯化汇集之PCR片段(1.4ng/μl)、Phusion DNA聚合酶(0.5U；Finnzymes)及FastStart高保真酶掺合物(0.2U；Roche)、1×FastStart缓冲液(Roche)、dNTP混合物(各200μM)、mhKCrev引物及mJH组引物(参见表5)。使反应物经受以下热循环：95℃2min，25×(95℃30sec，55℃30sec，72℃1min)，72℃10min。藉由制备型1％琼脂糖凝胶电泳纯化所得PCR片段(约1070个bp)。
将同源V H 及V L 编码对插入筛选载体中
为鉴别具有针对EGFR之结合特异性之抗体，将所获得之VH及VL编码序列表达为全长抗体。此包括将VH及VL编码对之库插入表达载体中且转染至宿主细胞中。
使用两步克隆程序来产生含有已连接的VH及VL编码对之表达载体之库。在统计学上，若表达载体之库所含重组质粒多达用于产生筛选库之同源配对VH及VL PCR产物之数目的十倍，则所有独有基因对均得以展示的可能性为99％。因此，若获得400个重迭延伸V基因片段，则产生至少4000个克隆之库用于筛选。
简言之，在引入PCR产物末端之识别位点处用XhoI及NotI DNA核酸内切酶裂解已连接的VH及VL编码对之库的剪接至人类κ恒定编码区之经纯化的PCR产物。藉由标准接合程序将经裂解及纯化之片段接合至经XhoI/NotI消化之哺乳动物IgG表达载体OO-VP-002(图4)中。将接合混合物电穿孔至大肠杆菌中且添加至含有适当抗生素之2×YT板中，并于37℃培养隔夜。使用标准DNA纯化法(Qiagen)将经扩增之载体库自板中所回收之细胞纯化。制备质粒以供藉由使用AscI及NheI核酸内切酶裂解来插入启动子-前导序列片段。此等酶之限制性位点位于VH与VL编码基因对之间。在纯化载体后，藉由标准接合程序将经AscI-NheI消化之双向哺乳动物启动子-前导序列片段插入AscI及NheI限制性位点中。将已接合之载体在大肠杆菌中扩增且使用标准方法纯化质粒。藉由习知程序将所产生之筛选载体库转化至大肠杆菌中。将所获得之群落固定于384孔母板中且储存。所排列之群落的数目超过所引入PCR产物之数目至少3倍，由此对于所获得之所有独有V基因对均存在具有95％的可能性。
筛选与EGFR细胞外域之结合
一般而言，以两步程序进行该筛选。在ELISA中针对对重组EGFR蛋白质之活性筛选抗体文库，在此之后使用FMAT(FLISA)作为基于细胞之方法，使用NR6wtEGFR细胞系，来侦测EGFR-抗体与细胞表面表达之EGFR的结合。对于101及108/109文库(表2)，使用代表EGFR细胞外域之重组EGFR进行ELISA。
简言之，对于ELISA，于4℃用以PBS稀释之1μg/ml蛋白质(室内制备)涂布Nunc maxisorb板(目录号464718)隔夜。在以50μl 2％-牛奶-PBS-T阻断之前，用PBS+0.05％吐温(Tween)20(PBS-T)洗涤该等板一次。用PBS-T洗涤板一次，添加20μl 2％-牛奶-PBS-T及5μl来自FreeStyle CHO-S转染物(参见下文)之上清液，且于室温下培养1.5小时，在此之后用每孔20μl PBS-T洗涤板一次。添加用2％牛奶-PBS-T以1∶10000稀释之第二抗体(HRP-山羊-抗人类IgG，Jackson，目录号109-035-097)以侦测与孔结合之抗体且于室温下培养1小时。用PBS-T洗涤板一次，随后添加25μl底物(Kem-en-tecDiagnostics，目录号4390)，培养5min。培养后添加25μl 1M硫酸以终止反应。用ELISA读取器于450nm下侦测特定信号。
对于抗EGFR抗体之基于细胞之FMAT侦测，在所述生长培养基中培养SKBR-3(ATCC#HTB-30)或NR6wtEGFR(Welsh等人，1991，J Cell Biol，114，3，533-543)细胞。对细胞进行计数且用以1∶40,000稀释之结合Alexa-647之山羊-抗人类IgG(H-L)抗体(分子探针第A21445号，批号34686A)稀释至每毫升125,000个细胞。将总共20μl此悬浮液转移至384孔透明底Nunc板中。随后将10μl转染上清液添加至细胞中。在培养6-10小时后，量测反应物之FMAT信号。
筛选情报表明，在ELISA中总克隆中之221个(4.8％)为阳性。在FMAT中该等克隆中之93个(2.0％)亦为阳性。在FMAT中该等克隆中之总共220个(4.8％)为阳性，且其中127(220-93)个仅对于细胞表面抗原为阳性。以类似方式筛选111文库，但由于免疫程序使得产生对于缺失突变EGFR受体EGFRvIII具有特异性之抗体，故ELISA筛选包括侦测野生型EGFR与EGFRvIII之检定。在ELISA中鉴别出七个克隆对于EGFRvIII具有特异性，且有趣的是，在FMAT中，该等克隆对于wtEGFR表达细胞之染色为阴性。在FMAT及ELISA中鉴别出13个克隆对于wtEGFR为阳性，但对于EGFRvIII不为阳性，与101及108/109文库相比，此情况为此文库所独有。选择所有ELISA阳性克隆用于进一步分析。
序列分析及克隆选择
自初始母板(384孔格式)回收在ELISA中鉴别为EGFR特异性之克隆且固定至新板中。自该等克隆分离DNA，且提交用于V基因之DNA定序。排比序列且选择所有独有克隆。所得序列之多重排比揭示各特定克隆之独有性且使得可鉴别独有抗体。根据220个克隆之序列分析，鉴别出70个遗传上独特之抗体序列聚类。相关序列之各聚类可能经由通用前躯克隆之体细胞超突变衍生出。总体上，选择各聚类中之一至两个克隆用于验证序列及特异性。所选抗体可变序列之序列展示于附录1中。核苷酸序列包括两端之限制性位点。因此，根据IMGT定义(Lefranc等人，(2003)IMGT unique numberingfor immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamilyV-like domains.Dev.Comp Immunol 27，55-77)，相应转译之氨基酸序列(使用DNA序列之第三阅读框架)在N末端包括并不形成VH及VL序列之部分的两个氨基酸。全部展示之VL序列包括相同人类κ恒定区，其以氨基酸-TVAAP-起始，且在C末端以-NRGEC结束。出于本发明之目的，术语VL序列当指特异性抗体时不包括κ恒定区及两个N末端氨基酸(LA-)。术语VH序列当指特异性抗体时不包括两个N末端氨基酸(RA-)。
序列及特异性验证
为验证编码抗体之克隆，制备DNA质粒且以2ml规模进行FreeStyleCHO-S细胞(Invitrogen)之转染以供表达。转染后96小时收集上清液。用标准抗IgG ELISA估算表达量且藉由EGFR及EGFRvIII特异性ELISA测定特异性。显示85％的克隆具有正确的特异性及序列。
筛选抗增殖效应
细胞损伤将不可避免地导致细胞保持代谢细胞功能及生长且为代谢细胞功能及生长提供能量的能力之损失。代谢活性检定基于此前提。通常其量测线粒体活性。细胞增殖试剂WST-1(Roche目录号11 644 807 001)为量测活细胞代谢活性之即用底物。随后假定代谢活性与活细胞数目有关。在本实施例中，使用WST-1检定来量测用含有不同抗EGFR抗体之细胞培养物上清液处理后代谢活性细胞之数目。
在进行WST-1检定之前，将2ml上清液中之不同体积(0、10、25、50及150μl)转移至96孔板之适当孔中。
随后用1×PBS洗涤HN5细胞且藉由用3ml胰蛋白酶溶液胰蛋白酶化来分离。随后添加17ml完全培养基且将该等细胞以300×g(1200 rcf)离心5min。移除上清液且使细胞再悬浮于DMEM+0.5％ FBS中。对细胞进行计数且调整其浓度，且将1500个细胞添加至具有上清液之孔中以便各孔总共含有200μl培养基。在含湿气恒温箱中于37℃培养板4日。随后每孔添加20μl WST-1试剂且于37℃培养板1小时。随后将板转移至回转式盘震荡器中且再保持1小时。用ELISA读取器量测450及620nm(参考波长)下之吸光度。代谢活性细胞(MAC)含量之差值经如下计算为对照组上清液之百分比：
Figure BDA0000048237920000511
随后使用此等值作为使用免费软件Cluster及TreeView进行之受监督分级聚类分析(基于在ELISA中之活性进行分类)之基础。
较佳能够在抗体选择过程之早期筛选功能性抗体。在使用于0.5％ FBS中之HN5细胞进行之增殖检定中，使用83个2ml转染之培养物上清液来针对生长抑制功能进行筛选。藉由简单分级聚类分析显像结果。如聚类分析(图5)中可见，发现多种上清液以浓度依赖性方式减少代谢活性HN5细胞之数目(深灰色)(聚类2)。类似地，一些上清液以浓度依赖性方式增加代谢活性HN5细胞之数目(淡灰色)(聚类1、3及4)。有趣的观察结果为降低代谢活性HN5细胞数目之上清液具有活性2(黑色箭头)，而增加代谢活性HN5细胞数目之上清液具有活性1(灰色箭头)。具有活性2之上清液在wtEGFR与EGFRvIIIELISA中均为阳性，而具有活性1之上清液仅对wtEGFR具有活性。因此，该等分析可提供ELISA中之抗体活性与细胞检定中之功能性之间的关系。
克隆修复
当使用多重PCR方法时，由于引物简并性及高度同源性，可预期存在某种程度之V基因家族内及V基因家族间的交叉启动(cross-priming)。该交叉启动引入并非天然存在于免疫球蛋白框架中之氨基酸，伴随产生若干潜在后果，例如结构变化及免疫原性增加，所有均导致治疗活性降低。
为消除此等缺陷且确保所选克隆反映天然体液免疫反应，在称为克隆修复之过程中校正交叉启动突变。
在克隆修复程序之第一步骤中，用含有对应于相关克隆所源自之VH基因之序列的引物组对VH序列进行PCR扩增，从而校正由交叉启动引入之任何突变。用XhoI及AscI消化PCR片段，且使用习知接合程序接合回经XhoI/AscI消化之哺乳动物表达载体(图4)中。将接合之载体在大肠杆菌中扩增且藉由标准方法纯化质粒。对VH序列进行定序以证实校正且用NheI/NotI消化载体以制备其以供插入轻链。
在第二步骤中，用含有对应于相关克隆所源自之VL基因之序列的引物组对完整轻链进行PCR扩增，从而校正由交叉启动引入之任何突变。用NheI/NotI消化PCR片段且接合至以上所制备之含有VH的载体中。将接合产物在大肠杆菌中扩增且藉由标准方法纯化质粒。随后，对轻链进行定序以证实校正。
在所选克隆之κ恒定区含有基因扩增期间所引入之突变的情况下，将该κ恒定区替换为未突变恒定区。此以重迭PCR进行，其中将经修复之VL基因(在无恒定区之情况下扩增)与具有正确序列之恒定区(以独立PCR获得)融合。扩增整个序列且克隆至上述含有VH之载体中并对经修复之轻链进行定序以证实校正。
表2 用于产生抗EGFR克隆之起始物质的免疫时程
Figure BDA0000048237920000531
表3 RT-PCR多路重迭延伸引物混合物
Figure BDA0000048237920000532
W＝A/T，R＝A/G，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，M＝A/C，H＝ACT，B＝GCT；Conc.-最终浓度。
表4 巢式引物组
Figure BDA0000048237920000542
K＝G/T，M＝A/C，D＝AGT；Conc.-最终浓度。
表5 κ恒定剪接引物组
Figure BDA0000048237920000543
Figure BDA0000048237920000551
实施例2：抗EGFR抗体之哺乳动物制备
对于抗EGFR抗体之短暂表达使用FreeStyle MAX CHO表达系统(Invitrogen)。抗体系以200-2000ml体积表达。
在转染前约24小时，将CHO-S细胞继代培养以达到每毫升0.5×106个细胞之细胞浓度。将质粒(每毫升细胞培养基1.25μg)稀释于OptiPro无血清培养基中且与由供货商推荐之FreeStyle MAX转染试剂之溶液混合。将该等转染试剂转移至细胞培养物中且6日后收集上清液。
使用亲和力层析步骤，采用用于纯化IgG1分子之蛋白质A-琼脂糖管柱(MabSelect Sure，GE Health Care)将所表达之抗体自培养物上清液纯化。使用0.1M甘氨酸(2.7)自管柱洗提抗体。汇集藉由于280nm下量测吸光度所确定之含有抗体的洗提份且用5mM乙酸钠、150mM NaCl(pH 5)透析。藉由LAL检定测试经纯化之抗体样本中内毒素的存在。
实施例3：测定表位特异性
用参考抗体进行竞争ELISA
藉由使用如公开于(J.R.Cochran等人，JIM 2004：287；147-158)中的与EGFR之已知域结合之参考抗体，开发出竞争ELISA，其可藉由与对抗EGFR抗体之人类Fc区具有特异性且对小鼠或大鼠IgG Fc展现出无交叉反应性之二级试剂一起培养来辨别抗EGFR抗体之结合表位。该ELISA系根据公开于Ditzel等人，1995，The Journal of Immunology，第154卷，第2期893-906中之描述修改而来。
藉由用PBS将全长EGFR受体抗原稀释至0.5μg/ml；且于4℃每个ELISA孔涂布50μl隔夜来进行表位阻断ELISA。次日早晨用PBS-T洗涤该等孔两次且于室温下用PBS-T-1％ BSA阻断1小时，继而用PBS-T洗涤两次。随后将25μl鼠类或大鼠参考mAb以先前实验中已知之稀释度添加至独立ELISA孔中以产生200倍最大抗原结合。15min后，将25μl抗EGFR抗体以2μg/ml之浓度添加至与参考抗体一起预培养之孔或含有25μl PBS之孔中。混合后此产生1μg/ml抗EGFR抗体之最终浓度及参考抗体之100倍最大抗原结合。于室温下培养抗体45min，在此之后用PBS-T洗涤孔四次。以1∶3000稀释二级山羊-抗人类IgG HRP结合物，且添加50μl至各孔中，继而于室温下培养30min。最终，用PBS-T洗涤孔四次，且藉由每孔添加50μlTMB使板显色且于620nm下每5-15-30min进行读取。由下式计算抑制程度：抑制％＝(1-(OD竞争/OD无竞争(PBS)))×100。
ELISA试剂：
1)涂布缓冲液：1×PBS；Gibco目录号：20012-019；
2)抗原：自A431细胞纯化之野生型全长EGFR；Sigma E3641；
3)ELISA板：NUNC Maxisorp；目录号：442404；
4)阻断/稀释缓冲液：于PBS-T中之1％ BSA(PBS-T-1％ BSA)；
5)洗涤缓冲液：1×PBS/0.05％吐温20(PBS-T)；
6)阳性对照组：尔必得舒(Merck KGaA，64271 Darmstadt，Germany，目录号：018964；西妥昔单抗)、维克替比(Amgen Inc，One Amgen Center Drive，Thousand Oaks CA 91320-1799，USA，目录号241400；帕尼单抗)；
7)参考抗体：
·ICR10(大鼠)，Abcam，Ab231；
·199.12(鼠类)，Lab VisionAb-11，MS-396-PABX；
·EGFR.1(鼠类)，Lab Vision Ab-3，MS-311-PABX；
·H11(鼠类)，Lab Vision Ab-5，MS-316-PABX；
·B1D8(鼠类)，Lab Vision Ab-16，MS-666-PABX；
·111.6(鼠类)，Lab Vision Ab-10，MS-378-PABX；
·225(鼠类)，Lab Vision Ab-2，MS-269-PABX；
·528(鼠类)，Lab Vision Ab-1，MS-268-PABX；
8)山羊-抗人类IgG HRP结合物；Serotec，Star 106P；
9)TMB Plus；KemEnTec，目录号4390L；
10)1M H2SO4。
竞争ELISA之结果展示于图6中。ELISA竞争检定系用于根据所用的针对EGFR细胞外域产生之参考抗体之域特异性将抗EGFR抗体上清液分级。我们认为50-100％之抑制率值指示结合抗原上之重迭表位或紧挨表位之抗体对之间的显著竞争，而低于50％之抑制率值指示由该等抗体对识别之表位不紧挨着，此使得位阻减小。发现抗EGFR抗体结合包括域I、II及III之EGFR ECD上的多个表位。对于一些抗体而言，此分析不能辨别特异性mAb是否针对域I或域II。该等特异性系针对经标记之域I/II。其它一些抗体似乎结合不能以所用之竞争ELISA进一步推断出之独有表位(例如克隆1229及1320，图6)。有可能此等抗体中之一些系针对域IV，对于该域IV，任何参考抗体均不具有活性。有趣的是，域III抗体可基于由所测试之针对此域之鼠类参考抗体获得的不同竞争模式而进一步分成四个亚组。组I仅由mAb992组成，发现该mAb 992与参考抗体Ab1及Ab2竞争结合。组II由mAb1024及1042组成，二者皆来源于相同Ig重排且因此在DNA及氨基酸层面上展示非常接近之序列同源性。发现此两种抗体仅与Ab2竞争结合。组III由mAb 1030、1208及1277组成，后三者与参考抗体Ab1、Ab5及Ab10竞争结合。最后，组IV由mAb 1254组成，后者与所有所用之域III参考抗体Ab1、Ab2、Ab5及Ab10竞争结合。
用表面等离子共振技术进行独特表位与参考或同种抗体之竞争分析
在含有四个流动单元之Biacore 3000机器上进行SPR分析。根据制造商之说明书，将CM5B iacore芯片与10,000共振单位(Ru)多克隆抗His抗体与流动单元1-4结合。使用5μl/min之流速，以20μg/ml之浓度注入15μl 6×HisEGFR ECD，且使其捕获于已结合有抗His多克隆抗体之全部四个流动单元上。在参考实验期间，在抗原注射后即刻在各流动单元中建立抗EGFR mAb之无竞争的最大结合。简言之，以40μg/ml之浓度将5μl抗体注射于具有所捕获之EGFR的全部流动单元上，继而以低pH值之酸性洗涤液洗去抗体/抗原复合物(与10mM甘氨酸-HCl(pH 2)接触10秒时间)。测定抗EGFR抗体与各流动单元之最大结合后，在相同Biacore循环中进行竞争实验。首先用EGFR ECD抗原使流动单元饱和，继而将不同参考抗体或抗EGFR抗体注入使用与上述相同之抗原饱和条件之独立流动单元中。此步骤之后立即第二次将抗EGFR抗体注射于用EGFR抗原及竞争抗体饱和之流动单元上以使抗原或阻断抗体之解离最小。随后以低pH值之酸性洗涤液洗去抗体/抗原复合物(与10mM甘氨酸-HCl(pH 2)接触10秒时间)且用新的抗EGFR抗体重复整个以参考实验开始之循环。藉由引入在注入各样本前后两秒所记录之报导点比较各个抗EGFR抗体竞争前后之Ru最大值来测定所测试之抗EGFR抗体之抑制程度。一个Biacore循环之实施例展示于图7中。
试剂：
1.CM5芯片；Biacore，目录号BR-1000-14；
2.NHS；Biacore BR-1000-50；
3.EDC；Biacore BR-1000-50；
4.10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)；Biacore，目录号BR-1003-50；
5.Tetra-His抗体(不含BSA)；Qiagen，目录号34670；
6.乙醇胺，1.0M，pH 8.5；Biacore BR-1000-50；
7.10×HBS-EP电泳缓冲液：0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15M NaCl、3mMEDTA、0.005％v/v界面活性剂P20；
8.抗原：具有6×His之室内制造之重组人类EGFR细胞外域；
9.10mM甘氨酸HCl(pH 2.0)；
10.参考抗体：
·ICR10(大鼠)，Abcam，Ab231；
·199.12(鼠类)，Lab Vision Ab-11，MS-396-PABX；
·EGFR.1(鼠类)，Lab Vision Ab-3，MS-311-PABX；
·H11(鼠类)，Lab Vision Ab-5，MS-316-PABX；
·B1D8(鼠类)，Lab Vision Ab-16，MS-666-PABX；
·111.6(鼠类)，Lab Vision Ab-10，MS-378-PABX；
·225(鼠类)，Lab Vision Ab-2，MS-269-PABX；
·528(鼠类)，Lab Vision Ab-1，MS-268-PABX。
为确认竞争ELISA中所获得之表位分析且为藉由同物种抗EGFR抗体对之间的竞争进行进一步表位分析，建立基于由表面等离子共振实时量测之抗体结合的竞争检定。针对参考抗体组测试之抗EGFR克隆所获得之表位定位展示于下图8中。我们认为50-100％之抑制率值可指示结合抗原上之重迭表位或紧挨表位之抗体对之间的显著竞争，而低于50％之抑制率值指示由该等抗体对识别之表位不紧挨着，此使得位阻减小。低于25％之抑制率值不包括于重迭表位之分析中，因为认为其不代表明显之抑制。发现除1320以外的所有所测试之抗体均与一或多种所用参考抗体竞争，此指示1320系针对未知表位，对于该未知表位，任何参考抗体均不具有活性。该分析包括全人类或人源化抗体维克替比及尔必得舒且发现其结合重迭表位。自竞争ELISA及竞争SPR分析获得之数据均对于所建立之抗EGFR抗体域特异性充分相关。然而，在两种检定中有时观察到各个参考抗体之间的竞赛模式之细微差异，或许归因于ELISA竞争检定使用全长EGFR受体抗原而SPR竞争检定使用重组细胞外域EGFR之事实。
在两种不同竞争检定中证实抗EGFR抗体之表位定位后，研究抗EGFR抗体对之同物种组合之竞争分析以解决哪组抗体对识别独特表位及是否识别重迭表位之抗体对可进一步分成表位聚类。此分析之结果展示于图9中。又，在此分析中认为50-100％之抑制率值可指示结合重迭表位之抗体对之间显著竞争。此标准似乎有效，因为所测试之抗体与自身竞争，且因此识别全部重迭表位使得值介于70％-100抑制％之间，如图9所示。此外，此观察结果说明分析期间抗原或抗体对之解离似乎并不影响所测试抗体之实验结果。藉由根据先前部分中所确定之假定EGFR ECD域特异性将抗体分组，发现仅结合域I或域I或II(I/II)之抗体主要与具有相同特异性之抗体成员成同一聚类，而不与识别域III之抗体成员成同一聚类。同样，发现域III抗体仅与识别域III之抗体成员竞争结合，而不与识别EGFR域I或I/II之抗体竞争。虽然发现来源于相同Ig重排之两种域III抗体1024及1042识别重迭表位，但重要的是未发现1024或1042与992或1030之成对组合产生显著竞争。因此，推断抗体992、1030及1024/1042识别EGFR ECD之域III上的三个非重迭表位。最终，发现mAb 1320与均针对域III之mAb 1024及1449竞争结合，且不与其它所测试之域III抗体竞争(未确定1320与1042之竞争)。因此，假定mAb 1320结合在EGFR细胞外域之域III周围。表位特异性之概要可见于图10中，其中说明针对EGFR ECD域I、I/II或III之抗体之表位定位。
如由SPR所测定发现992、1030及1024/1042之成对组合并不产生显著抗体竞争后，设计新的Biacore实验以检验可同时与受体抗原结合之抗体的数量。首先研究用三种抗体992、1024及1030饱和域III对于针对不为域III之其它EGFR特异性之抗体的结合有何影响。此分析之结果展示于图11A中。单一抗体之抑制系藉由以与单一抗体或在各Biacore循环中依次添加一种额外抗体所产生之至多三种抗体之抗体混合物之组合形式测试该等抗体而确定。为确保完全阻断所识别之表位，以40μg/ml之各个浓度测试抗体。如图11A中所示，发现三种域III抗体992、1024及1030同时与受体结合而无任何结合抑制。所观察到的对于所添加之各抗体增加之负抑制值进一步表明对于随后所添加之抗体的结合协同作用。重要的是，在将域III与该三种抗体一起培养后，针对域I/II(mAb 1261)、域I(1347)或未知特异性(1361)之非重迭表位的其它抗体似乎可结合而无来自三种mAb混合物之表位阻断。此外，此等所测试抗体具有较小负抑制率值，表明其在用三种mAb混合物饱和受体后结合良好。因此，此实验表明该等六种所测试抗体可同时与EGFR之ECD结合。为进一步测试此所观察到之现象，制备由所有测试抗体(1261、1347、992、1024、1030及1361)所组成之抗体混合物且针对该混合物中每种样本抗体之抑制进行测试。亦测试不包括所测试样本抗体之抗体混合物以充当阳性对照组。如图11B/C中所示，发现当对于与抗体之完全混合物一起培养之EGF受体之结合进行测试时，所有六种测试抗体均被抑制80-116％。然而，当自此混合物移除各个样本抗体时，未发现该特定样本抗体之显著抑制，此说明该混合物中之抗体仅由自身阻断与EGF受体之结合。此实验清晰地说明至少六种识别非重迭表位之抗体可同时与EGFR结合。最后之实验对于以下问题进行研究：是否针对域I(1284)、I/II(1257)之其它抗体或未知特异性聚类(1183、1255)可与EGFR在其与该等六种抗体混合物一起培养时结合。如图11D中所示，在将EGFR与该六种抗体混合物一起培养后，所测试抗体均不能显著地与EGFR结合。此可能由于抗体集合并不包括针对六种已结合抗体未占据之位点中之任一者的抗体。或者，有可能实际上所测试域上之所有位点均被抗体阻断。
表6 具有经证明之针对EGFR细胞外域之特异性的市售抗体
  克隆   物种  域I   域II  域III
  ICR10   大鼠  X
  199.12/Ab11   小鼠  X
  EGFR.1/Ab3   小鼠   X
  H11/Ab5   小鼠  X
  111.6/Ab10   小鼠  X
  528/Ab-1   小鼠  X
  225/Ab-2   小鼠  X
实施例4：EGFR活化抑制
藉由竞争ELISA测定抗体介导的对EGF配体与EGFR受体结合的阻断
为证实所测试抗EGFR抗体与EGFR受体结合且同时阻断生物素化EGF配体之结合，于4℃用每孔80μl于PBS中之0.5μg/ml浓度之全长EGFR涂布ELISA孔隔夜。次日早晨用PBS-T洗涤孔两次且于室温下用150μlPBS-T-1％ BSA阻断1小时，继而用PBS-T洗涤两次。随后将80μl连续稀释之抗EGFR抗体及对照抗体添加至孔中且于室温下培养30min。培养抗体后，将20μL生物素化EGF配体以0.5μg/ml之浓度添加至含有抗EGFR抗体稀释液之所有孔中或仅含有PBS-T 1％ BSA之孔中，且于室温下培养1小时。随后用PBS-T洗涤孔五次，继而与每孔100μl用阻断缓冲液以1∶1000稀释之链亲和素-HRP二级试剂一起培养且于室温下培养30min。最终用PBS-T洗涤孔五次且藉由每孔添加100μL TMB底物且培养60min使板显色。培养后，藉由每孔添加100μl 1M H2SO4使反应终止；且于OD 450nm下读取板。
ELISA试剂：
1)涂布缓冲液：1×PBS；Gibco目录号20012-019；
2)抗原：自A431细胞纯化之野生型全长EGFR；Sigma E2645；
3)ELISA板：NUNC Maxisorp；目录号442404；
4)阻断/稀释缓冲液：于PBS-T中之1％ BSA(PBS-T-1％ BSA)；
5)洗涤缓冲液：1×PBS/0.05％吐温20(PBS-T)；
6)阳性对照组：尔必得舒、维克替比；
7)阴性对照组：西那吉斯(Synagis)(Medimmune Inc，帕利珠单抗(Palivizumab)，目录号NDC 60574-4111-1)；
8)生物素化EGF配体；Invitrogen，目录号E3477；
9)链亲和素-HRP，超敏：Sigma S 2438；
10)TMB Plus；KemEnTec，目录号4390L；
11)1M H2SO4。
使用ELISA竞争检定将抗EGFR抗体抑制生物素化EGF配体与涂布至ELISA孔之全长EGFR受体结合之能力分级。如图12中所示，尔必得舒与维克替比似乎皆极有效地阻断EGF配体结合，而不针对EGFR之阴性对照抗体西那吉斯并不抑制EGF配体结合。如图12A中所示，对针对域III且识别非重迭表位之三种抗体992、1030及1042单独或以等莫耳混合物形式测试其抑制EGF配体结合之能力。当与尔必得舒及维克替比相比时，三种所测试抗体中仅mAb 1030展示适度EGF配体抑制活性。mAb 992、1030与1042之等莫耳混合物在抑制EGF配体结合方面似乎比单独测试之单一抗体有效。发现1μg/ml之总IgG浓度的等莫耳混合物比单独测试之mAb 1030抑制EGF配体结合有效两倍，且比单独测试之mAb 992及1042有效四倍，证明混合识别非重迭表位之三种域III抗体之协同效应。如图12B中所示，在此检定中亦测试抗EGFR克隆1208、1260、1277及1320。当与尔必得舒对照物相比时，此四种克隆能够以剂量依赖方式抑制EGF配体结合，该方式比对于克隆992、1030及1042所观察到者有效。高于0.33μg/ml之浓度的抗EGFR克隆1208、1260、1277及1320似乎正如以相同浓度测试之尔必得舒在阻断EGF配体结合方面同样有效。
抑制HN5细胞中EGF诱导之EGFR磷酸化的能力
以细胞内西方分析(in cell western analysis)测试抗EGFR抗体对于EGFR磷酸化之活性。该细胞内西方程序使得能够侦测同一样本中之EGFR及磷酸化EGFR(pEGFR)，此又使得有可能比较各抗体处理中之EGFR与pEGFR表达之比率及数据组。根据ATCC所提供之说明，将HN5细胞培养于补充有10％FCS及pen/strep之DMEM中。将43,000个HN5细胞接种于Nunc之96孔板(目录号167008)中，24h后使其饥饿。将细胞在DMEM中饥饿16h，随后添加抗体。添加200μl于DMEM中最终浓度为10μg/ml之抗体且将混合物上下抽吸至少五次以便混合。抗体处理30分钟后，以50μg/ml之浓度添加EGF至适当孔中且保持7.5min。基本上按照由细胞内西方试剂盒制造商(Odyssey，LI-COR biosciences)所提供之说明进行细胞内西方法。
EGF刺激后，将细胞于3.7％甲醛(Sigma F-8775，批号71K500，含有约1％甲醇)中固定20分钟。使用PBS-Triton X-100(0.1％)洗涤五次，每次5min以使细胞膜可渗透，随后于LI-COR阻断缓冲液(927-40000)中阻断。以对应于所提供说明之浓度添加第一抗体，且在温和震荡情况下于室温下培养2.5h(总EGFR小鼠，1∶500稀释液，biosource international，目录号AHR5062，及磷酸EGFR Tyr1173，兔1∶100稀释液，biosource，目录号44-794G)。
与第一抗体一起培养后，用PBS-T(0.1％吐温20)洗涤细胞五次历时五分钟，在此之后添加第二抗体(山羊-抗兔IRDye 680，1∶200稀释液，LI-COR目录号926-32221，及山羊-抗小鼠，IRDye 800CW 1∶800稀释液；LI-COR目录号926-32210)且在温和震荡以铝箔覆盖之板的情况下于室温下培养1h。
以Tecan荧光读取器量测之前，以PBS-T洗涤板五次历时五分钟。藉由突然中断板之投掷运动，向下开孔以去除洗涤液，继而与纸巾相抵敲击该板来终止所有洗涤。(与ELISA板之处理相同，其重要之处在于应注意：细胞在此处理期间保持在板上，且洗涤液可藉由此程序而非藉由扰乱细胞单层完全性之抽吸移除)。藉由在孔侧以多道吸管平缓抽吸移除最后洗涤所剩之任何残余洗涤液。对于680nm通道(激发675nm且发射705nm，两者频宽皆为10nm)且对于800nm通道(激发762nm且发射798nm，两者频宽皆为10nm)量测荧光信号。
使用细胞内西方分析(in-cell Western analysis)，很明显三种抗体显著地(p＜0.05)影响HN5细胞之pEGFR状态；1208、1277及1320抗体(图13)。
测试抗EGFR抗体之抗EGFR混合物(992、1030及1042)及其中各个抗体在抑制EGF诱导之EGFR磷酸化的细胞内西方分析中之效应。如图14中可见，992及1030及抗EGFR抗体混合物显著抑制EGF诱导之EGFR磷酸化(p＜0.05)。
实施例5：A431NS细胞中EGF受体之内化
使用TrypLE自80-90％汇合T175培养瓶将A431NS细胞(ATCC#CRL-2592)胰蛋白酶化。用PBS洗涤所分离之细胞且悬浮于无血清之DMEM中。将细胞分成1-2ml之部分且在冰上与所检验之抗体一起培养30min。抗体浓度为10μg/ml。用DMEM(250g，4min，4℃)洗涤细胞三次且再悬浮于1.8ml DMEM中。将各部分分至六个FACS管中，各含有300μl细胞悬浮液。将各部分之三个管置于37℃水浴中恰好40min且将其它三个管立即置于冰上。培养后，以(250g，4min，4℃)洗涤细胞两次且将球粒再溶解于100μlDMEM中之兔抗人类IgG FcγF(ab′)2-FITC中。于4℃培养细胞30min，随后用4℃ DMEM洗涤三次，且用FACSCalibur分析。
结果展示于图15中。使用尔必得舒及维克替比培养展示约30％之同等程度之受体内化，保持70％之初始表面染色。单独使用992培养产生约45％受体下调。使用含有结合非重迭表位之两种额外抗体之抗体混合物培养使受体下调增加：992+1024，74％；992+1024+1030，83％。
添加额外抗体并不使受体内化进一步增加。因此，似乎需要至少三种抗体来达成A431细胞中最大程度之内化。
实施例6：增殖检定
细胞损伤将不可避免地引起细胞保持及提供用于代谢细胞功能及生长之能量的能力的丧失。代谢活性检定基于此前提。通常其量测线粒体活性。细胞增殖试剂WST-1(Roche目录号11 644 807 001)为量测活细胞代谢活性之即用底物。随后假定代谢活性与活细胞数目有关。在本实施例中，使用WST-1检定来量测用不同浓度之不同抗体处理后代谢活性细胞之数目。
在进行WST-1检定之前，用补充有0.5％ FBS及1％ P/S之DMEM将适当抗体及抗体混合物稀释至20μg/ml之最终总抗体浓度，在具有最高抗体浓度之孔中产生10μg/ml之最终抗体浓度。随后将150μl此等溶液添加至96孔板之第2行孔中，且向下直至第9行进行三倍连续稀释以使各孔含有100μl抗体溶液。将100μl培养基添加至第11行中。将200μl培养基添加至第1列及第8列以及第1行及第12行中以降低实验孔中培养基蒸发之影响。
随后用1×PBS洗涤A431-NS细胞且藉由用3ml胰蛋白酶溶液胰蛋白酶化来分离。随后添加17ml完全培养基且将该等细胞以300×g(1200rcf)离心5min。移除上清液且使细胞再悬浮于DMEM+0.5％ FBS中。对细胞进行计数且将其浓度调整至每毫升15,000个细胞。随后将100μl细胞悬浮液(每孔1500个细胞)添加至第2-11行中之实验孔中。在含湿气恒温箱中于37℃培养板4日。随后每孔中添加20μl WST-1试剂且于37℃培板育1小时。随后将板转移至回转式盘震荡器中且再保持1小时。用ELISA读取器量测450及620nm(参考波长)下之吸光度。代谢活性细胞(MAC)之量经如下计算为占未经处理之对照组的百分比：
Figure BDA0000048237920000641
对于EGF滴定研究，将配体用DMEM+0.5％ FBS稀释至20nM/ml之浓度，在具有最高EGF浓度之孔中产生10nM/ml之最终浓度。随后将150μl此溶液添加至96孔板之第2行孔中，且向下直至第9行进行三倍连续稀释以使各孔含有100μl EGF溶液。将100μl培养基添加至第11行中。将200μl培养基添加至第1列及第8列以及第1行及第12行中以降低实验孔中培养基蒸发之影响。用补充有0.5％FBS及1％P/S之DMEM将适当抗体及抗体混合物稀释至40μg/ml之最终总抗体浓度，在孔中产生10μg/ml之最终抗体浓度。随后将50μl此等溶液添加至96孔板中第2-9行之孔中。
随后用1×PBS洗涤A431-NS细胞且藉由用3ml胰蛋白酶溶液胰蛋白酶化来分离。随后添加17ml完全培养基且将该等细胞以300×g(1200rcf)离心5min。移除上清液且使细胞再悬浮于DMEM+0.5％ FBS中。对细胞进行计数且将其浓度调整至每毫升40,000个细胞。随后将50μl细胞悬浮液(每孔2000个细胞)添加至第2-11行之实验孔中。在含湿气恒温箱中于37℃培养板4日。随后每孔添加20μl WST-1试剂且于37℃培养板1小时。随后将板转移至回转式盘震荡器中且再保持1小时。用ELISA读取器量测450及620nm(参考波长)下之吸光度。代谢活性细胞之量藉由450nm下之吸光度减去620nm之参考波长下之吸光度来指示。
代谢活性细胞(MAC)之量经如下计算为占未经处理之对照组的百分比：
Figure BDA0000048237920000651
结果
为证明结合域III内之非重迭表位之三种抗EGFR抗体的混合物优于单一抗体，进行研究对A431-NS生长之抑制之实验。如图16A中可见，该等抗体单独为A431-NS生长之不良抑制剂，但在组合时可获得对431-NS生长之协同抑制效应。尽管992与1042或1030之混合物亦极有效，但所有三种之混合物在所有抗体浓度范围上均优于此等混合物。
研究各个抗体及抗体混合物对用不同浓度EGF刺激之A431-NS细胞生长之效应，且结果展示于图17中。如图17中可见，在不存在抗体之情况下，高于0.1nM之EGF浓度对于细胞具有毒性。然而，显然结合EGFR域III内之非重迭表位之三种抗体(992、1030及1042)的混合物协同发挥作用抑制存在EGF(当测试达至少0.3nM EGF时)的情况下A431-NS细胞之生长，且混合物优于所有单克隆抗体。
随后证明亦可藉由将结合EGFR域III中之非重迭表位的两种抗体与结合EGFR域I或域II中之表位的抗体组合获得对A431-NS生长之协同抑制效应。如图18中可见，均为EGFR域III抗体之抗体992及1024与对EGFR域I具有活性之抗体(1284)或对EGFR域I/II具有活性之抗体(1434)的组合如与EGFR域III内之非重迭表位反应之三种抗体(992+1024+1030)一样有效。另外，此等抗体混合物比治疗性抗EGFR抗体尔必得舒及维克替比在抑制A431-NS生长方面更有效。
使用两种其它癌细胞系DU145(ATCC#HTB-81)及MDA-MB-468(ATCC#HTB-132)进行类似检定。此等增殖检定之结果展示于图16B及16C中。在两种情况下，三种抗体(992、1030及1042)之混合物均优于两种抗体之混合物及单一抗体。在DU145细胞中，三种抗体之混合物在所有浓度下均优于维克替比，且在MDA-MB-468中，在高浓度下优于维克替比。
使用类似于上述方法之方法测试三种抗EGFR抗体之不同组合。
结果
在A431NS细胞系中研究三种抗体之不同组合的效应。其中二十个最有效者之生长抑制活性展示于图37中。与未经处理之对照组相比，所有该等组合抑制A431NS细胞系之增殖大于60％。另一有趣之观察结果为除组合(992+1024+1254及992+1024+1320及992+1277+1320)外，该等组合含有结合非重迭表位之抗体。由此可见，有可能设计结合独特表位之三种抗体的若干组合。
实施例7：凋亡
凋亡为引起细胞死亡之生物机制。先前已藉由使用抗EGFR抗体(诸如尔必得舒)报导过此机制(Baselga J.The EGFR as a target for anticancertherapy-focus on cetuximab.Eur J Cancer.2001年9月：37，增刊4：S16-22)。其因此研究至以下程度，各个抗EGFR抗体992、1042及1030以及其混合物(992+1042+1030)能够诱导凋亡。
在三重测定中将1×104个A431NS细胞在96孔培养板中补充有0.5％FBS及抗生素之DMEM中，在0.01μg/ml至10μg/ml浓度范围内之EGFR混合物(相等份数之992、1030、1042)、992、1030、1042、尔必得舒或维克替比存在下培养。培养细胞及抗体22h。随后收集上清液且以来自Roche，目录号：11774425001之ELISA试剂盒(Basel，Switzerland)量测组蛋白质-DNA复合物之存在。
使用A431NS细胞来比较混合物与单独单克隆抗体中之每一者以及与参考抗体维克替比及尔必得舒之效应(结果参见图19)。以10倍稀释液测试该等抗体。当以1μg/ml及10μg/ml之浓度测试时，与各个单克隆抗体以及维克替比相比混合物显著(P＜0.05)更有效。在1μg/ml下，与尔必得舒相比，混合物在统计上显著(p＜0.05)增加凋亡。
实施例7b
除实施例7外，根据与实施例7中所述相同之方法对于992+1024之混合物以及992+1024+1030之混合物的凋亡活性进行研究(图35)。实际凋亡程度与最大阳性对照组有关。使用A431NS细胞，以1μg/ml，将该两种混合物与尔必得舒及各个单克隆抗体992、1024及1030以及对照抗体相比较。992+1024之混合物显著优于尔必得舒及各个单克隆抗体(所有P＜0.05)。
实施例8：活体内功效
对于由抗体992、1030及1042所组成之抗EGFR混合物在使用A431NS细胞之裸鼠异种移植模型中研究其活体内功效。此为广泛使用之用于研究单克隆抗癌症抗体(包括抗EGFR抗体)之效力的模型。裸鼠免疫功能不全且缺乏T细胞。此使得人类细胞可生长于该小鼠中。
向两组6-8周裸鼠皮下注射1×106个A431NS细胞。当平均肿瘤尺寸达到100mm3时开始处理。使小鼠以2-3日间隔接受腹膜内注射1mg抗体五次。使用数字测径器以两个直径量测肿瘤尺寸，且使用下式计算体积：肿瘤体积(mm3)＝L×W2×0.5，其中L为最长直径且W为最短直径(Teicher BA，Tumor Models in Cancer Research.Humana Press，NJ，USA 2002，第596页)。实验结束时，切除肿瘤且称重。
将西那吉斯用作对照抗体。该实验亦包括使用与抗EGFR混合物(抗体992、1030与1024)相同之时程以相同量之尔必得舒及维克替比处理。
如图20中可见，992、1030与1042之混合物显著抑制A431NS之肿瘤生长(P＜0.05)。平均重量展示于图21中。结果与所量测之肿瘤尺寸相关。处理组与对照组之间存在显著差异。
实施例8b：活体内功效
除实施例8中所述之活体内实验外，在上述A431NS异种移植模型中研究992+1024及992+1024+1030之混合物(图36)。向每组有9只6-8周裸鼠之四个组皮下注射1×106个A431NS细胞。当平均肿瘤尺寸达到100mm3时，小鼠接受第一次抗体注射。三个组接受992+1024、992+1024+1030之混合物、尔必得舒或对照抗体西那吉斯。小鼠总共接受17次0.5mg注射，一周4次。第一次注射在第8日给予且最后一次注射在第34日给予。量测肿瘤尺寸历时56日。终止抗体处理后，接受尔必得舒之小鼠肿瘤之尺寸开始扩大，而对于接受992+1024或992+1024+1030之混合物之两组中之小鼠而言，肿瘤尺寸继续减小。对于992+1024组，在第91日(终止处理后57日)未观察到肿瘤尺寸扩大。在第56日，992+1024之组合的平均肿瘤尺寸显著(P＜0.01)小于接受尔必得舒之小鼠的平均肿瘤尺寸。
亦监测该实验中小鼠之存活率。当肿瘤达到最大允许尺寸时将小鼠记为死亡。下表展示接种肿瘤细胞后56日存活小鼠之数目。与尔必得舒相比，两个组合皆可见提高之存活率。
  组   992+1024   992+1024+1030   尔必得舒   对照抗体
  初始小鼠数目   9   9   9   9
  在第56日剩余之小鼠   9   9   2   0
其它实验
实施例8中所述之异种移植实验之肿瘤裂解物的初步资料展示992+1042+1030之组合诱导A431NS产生VEGF的有效下调，VEGF为血管生成之重要介体。血管形成增加为许多实体肿瘤中可见之现象，其为一种参与持续提供养分等之机制，从而影响存活条件。
此外，其它初步数据展示，当与尔必得舒及维克替比相比时，实施例8中所述之异种移植实验之肿瘤裂解物中可观察到992+1042+1030之抗体组合量增加。
实施例8c：增强的活体内肿瘤细胞分化
细胞之终末分化为包括细胞类型特异性基因表达程序活化之复杂过程，其引入使细胞增殖能力不可逆丧失之多步过程。在恶性疾病中，癌细胞通常处于特征为增殖速率增加之去分化状态，且提示能够诱导癌细胞终末分化之药物能够去除恶性细胞且重建正常细胞体内平衡(Pierce GB，Speers WC：Tumors as caricatures of the process of tissue renewal：prospects for therapy bydirecting differentiation.Cancer Res 48：1996-2004，1988)。在某些实验条件下，先前已报导抗EGFR单克隆抗体能够使作为异种移植肿瘤在免疫受损小鼠中生长之人类鳞状癌细胞终末分化之速率增加(Milas L，Mason K，Hunter N，Petersen S，Yamakawa M，Ang K，Mendelsohn J，Fan Z：In vivo enhancement oftumor radioresponse by C225 antiepidermal growth factor receptor antibody.ClinCancer Res 6：701-8，2000；Modjtahedi H，Eccles S，Sandle J，Box G，Titley J，Dean C：Differentiation or immune destruction：two pathways for therapy ofsquamous cell carcinomas with antibodies to the epidermal growth factor receptor.Cancer Res 54：1695-701，1994)。
我们以组织学方式检验抗EGFR处理之作为异种移植物在小鼠中生长之A431NS细胞的终末分化程度。该组织学研究包括自实施例8中所述之实验的四个实验组中之每一者随机选择之3个小鼠异种移植肿瘤。
将组织剖开且瞬间冷冻，随后与Tissue-Tek一起安装于低温切片机(Leitz，型号1720)上，切成5μm之切片且在superfrost plus载玻片上制成样本，随后经处理以供苏木素(hematoxylin)/伊红(eosin)染色。随后两个独立观察者以不知情方式进行所有组织切片之显微镜检验，对角质化区域(“角质珠”)评分作为终末分化程度之量度(Modjtahedi等人，1994)。表7列出所获得之结果。与用参考抗体尔必得舒及维克替比处理之小鼠(分别为第2组及第3组)相比，用三种抗EGFR抗体之混合物处理之小鼠(992+1024+1030，第1组)具有显著较大且较多之终末分化癌细胞之集中区(foci)。在接受PBS替代抗体之对照组(第4组)中未侦测到终末分化。
使用装备有数字相机之显微镜获得代表性显微图像，参见图26。
总之，与尔必得舒及维克替比单克隆抗体相比，结合域III内之非重迭表位之三种抗EGFR抗体(克隆992、1030及1042)之组合展示对活体内肿瘤细胞出乎意外之增强之分化诱导效应。所观察到之对终末分化之效应得出以下结论：本发明之抗体组合物可用于与其它分化诱导剂(诸如视网酸、4-丁酸苯酯)之组合疗法中。
表7
  组   肿瘤数目   角质珠数目之评分   批注
  1   16   ++++   大角质珠
  1   17   +++   大角质珠
  1   54   ++++   大角质珠
  2   14   ++   小角质珠
  2   45   ++   小角质珠
  2   49   ++   小角质珠
  3   11   ++   小角质珠
  3   34   ++   小角质珠
  3   56   ++   小角质珠
  4   43   -
  4   60   -
  4   31   -
实施例8d：本发明之抗体组合物之持续生长抑制效应
重复进行实施例8及8b中所提供之肿瘤异种移植实验以研究992+1024抗体混合物之活体内功效。简言之，向BALB/c nu/nu小鼠皮下注射106个A431NS细胞至侧腹(flank)中。允许肿瘤异种移植物生长至100mm3之平均肿瘤尺寸(第7日)，此时将小鼠随机分成五组，每组九只动物，且开始抗体处理。该等五组接受高剂量(每周2mg)或低剂量(每周1mg)之992+1024混合物或参考抗体尔必得舒，或高剂量(每周2mg)之对照抗体西那吉斯。所有小鼠总共接受9次0.5或1mg抗体注射，每周两次，在第7日开始且在第33日结束。
当与尔必得舒相比时，高剂量(每周2mg)992+1024混合物在控制初始肿瘤生长及诱导长期肿瘤消退方面极有效(P＝0.0002，图38)。每周接受2mg992+1024混合物之动物在研究期间(实验开始后118日，图38及39)均未死亡，与第60日仅九分之一动物剩余之高剂量(每周2mg)尔必得舒组相比为显著较佳之结果(P＝0.0008，图39)。此证明992+1024处理对长期存活之持续效应。尽管不及高剂量有效，但低剂量992+1024混合物(每周1mg)亦能够控制肿瘤生长，且与高剂量(每周2mg)尔必得舒相比当考虑肿瘤抑制(P＝0.0135，图38)与存活率(P＝0.0087，图39)时均显著较佳。此等结果证明992+1024组合甚至在低剂量下当与尔必得舒相比时具有优良的效力。与已获准之单克隆抗体相比，该等结果亦证明由992+1024组合产生之持续生长抑制。
实施例9：球状体生长
为进行球状体研究，向圆底96孔板中添加35μl 120mg/ml聚HEMA溶液且使其在流动通风柜中蒸发隔夜。聚HEMA预防细胞黏附。对A431-NS细胞进行如上处理、计数，且将其浓度调整为每毫升100,000个细胞。随后将50μl细胞悬浮液(每孔5,000个细胞)以及50μl 5％玛崔胶(matrigel)溶液添加至第2-11行之实验孔中。将200μl培养基添加至第1列及第8列以及第1行及第12行中以降低实验孔中培养基蒸发之影响。将板以300×g离心5分钟且使其在含湿气恒温箱中于37℃成型(form)隔夜。次日将适当抗体及抗体混合物在空96孔板中稀释至20μg/ml之最终总抗体浓度。在补充有0.5％FBS及1％P/S之DMEM中进行此操作，在具有最高抗体浓度之孔中产生10μg/ml之最终抗体浓度。随后将150μl此等溶液添加至96孔板之第2行孔中，且向下直至第9行进行三倍连续稀释以使各孔含有100μl抗体溶液。将100μl培养基添加至第11行中。随后将100μl此等溶液转移至含有球状体之板中且使其培养7日。随后每孔添加20μl WST-1试剂，且于37℃培养板1小时。随后将板转移至回转式盘震荡器中且再保持1小时。用ELISA读取器量测450及620nm(参考波长)下之吸光度。代谢活性细胞(MAC)之量经如下计算为占未经处理之对照组的百分比：
Figure BDA0000048237920000711
结合域III内之非重迭表位之三种抗体的混合物(992+1030+1042)有效抑制A431-NS球状体之生长，且比单克隆治疗性抗EGFR抗体尔必得舒及维克替比更有效(图22)。
实施例10：与猕猴EGFR ECD之结合
猕猴EGFR细胞外域之克隆
由自表皮分离之猕猴cDNA，藉由使用巢式PCR及来源于公开之全长人类EGFR序列之序列特异性引物(GENBANK X00588，Ullrich，A.等人，Nature 309(5967)，418-425(1984))克隆不包括信号肽之猕猴EGFR细胞外域。
PCR试剂：
自正常皮肤表皮分离之猕猴cDNA：CytoMol Unimed，目录号：ccy34218，批号：A711054。
Phusion反应缓冲液(5×)：Finnzymes，目录号：F-518，批号：11。
Phusion酶：Finnzymes，F-530S(2U/μL)。
dNTP 25mM：Bioline，目录号：BIO-39029，批号：DM-103F。
用于扩增包括部分信号序列及跨膜域之猕猴EGFR ECD之引物：
5′ATG引物：5′-TCTTCGGGAAGCAGCTATGC-3′(SEQ ID NO 135)；
3′Tm 2引物：5′-TTCTCCACTGGGCGTAAGAG-3′(SEQ ID NO 136)。
用于巢式PCR扩增猕猴EGFR ECD Bp1-1863且在跨膜域之前并入XbaI、MIuI限制性位点及终止密码子之引物：
5′EGFR XbaI：
5′-ATCTGCATTCTAGACTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGC-3′(SEQID NO 137)；
3′EGFR MiuI：
5′-TACTCGATGACGCGTTTAGGATGGGATCTTAGGCCCGTTCC-3′(SEQ IDNO 138)。
PCR条件：
30个循环：98℃/30sec解链，55℃/30sec退火，72℃/60sec延伸。30个循环后，使PCR产物再延伸5min。
使用1μl模板及2单位Phusion酶在总体积为50μL之含有0.2mMdNTP、0.5μM引物之反应缓冲液中进行PCR反应。
获得具有约1800-1900Bp之表观长度的最终PCR条带，且克隆至表达载体中。所克隆之猕猴EGFR细胞外域之DNA及蛋白质序列展示于图23中，且与人类EGFR ECD排比之猕猴EGFR ECD蛋白质序列展示于图24中。人类EGFR ECD与猕猴EGFR ECD DNA序列之排比展示97.6％之序列一致性，而相应蛋白质序列排比展示98.6％之序列一致性。
在ELISA中证明人与猕猴EGFR细胞外域之间的抗体交叉反应性
为证实所测试抗EGFR抗体与人类及猕猴EGFR ECD之结合同样良好且因此批准猕猴中之毒理学研究，藉由ELISA针对与重组人类及猕猴EGFRECD蛋白质之结合测试自1μg/ml开始连续四倍稀释之抗体。认为在此检定中展示相同结合特征之抗体为良好物种EGFR交叉反应性之指示。于4℃用每孔50μl于PBS中浓度为1μg/ml之全长EGFR涂布ELISA孔隔夜。次日早晨用PBS-T洗涤孔两次且于室温下用100μl PBS-T-1％ BSA阻断1小时，继而用PBS-T洗涤两次。随后将50μl连续稀释之抗EGFR抗体及对照抗体添加至孔中且于室温下培养1小时。抗体培养后，用PBS-T洗涤孔五次，继而与每孔50μl用阻断缓冲液以1∶3000稀释之链亲和素-HRP二级试剂一起培养且于室温下培养30min。最终用PBS-T洗涤孔五次且藉由每孔添加50μL TMB底物且于室温下培养使板显色。培养后，藉由每孔添加100μl 1MH2SO4使反应终止；且于OD 450nm下读取板。
ELISA试剂：
1.ELISA板：NUNC Maxisorp；目录号：442404；
2.抗原：人类rEGFR ECD；猕猴rEGFR ECD；
3.涂布缓冲液：1×PBS；Gibco目录号20012-019；
4.洗涤缓冲液：1×PBS/0.05％吐温20(PBS-T)；
5.阻断/稀释缓冲液：于PBS-T中之1％BSA；
6.山羊-抗人类IgG HRP结合物：Serotec，Star 106P；
7.TMB Plus(KemEnTec目录号4390L)；
8.(1M H2SO4)。
如图25中所示，所述ELISA检定可辩别交叉反应之人类及猕猴抗EGFRECD抗体(图25A)与仅识别小鼠免疫所用之人类EGFR ECD之物种特异性抗体(图25B)。
实施例11：抑制移动
大多数癌症死亡系源于肿瘤细胞之播散及于远处位置中之后续生长。局部侵袭相邻正常组织损害体内平衡功能且妨碍肿瘤之手术或放射性切除。最近的研究已指出诱导出之移动在促进此扩散中所发挥的主要作用。已知EGFR促进细胞移动及扩散，且因此抑制EGFR介导之移动为EGFR靶向药物之重要机制。
研究两种抗体992与1024之混合物对头颈部癌细胞系移动之效应。如实施例9中所述制备由10,000个细胞所组成之球状体隔夜。随后将球状体转移至NUNC T25细胞培养瓶中且使其黏附隔夜。随后添加10μg/ml抗体混合物992+1024或阴性对照抗体，且将球状体再培养24小时。在40倍放大率下采集图像且使用软件Image J量测由细胞覆盖之面积。
结果：如图27A中可见，添加EGFR特异性抗体992与1024使由肿瘤细胞覆盖之面积显著减小。在图27B中将移动定量，该图展示，与阴性对照抗体相比，移动降低约60％。此移动降低为高度显著的p＜0.01。
因此，抗体992与1024之组合有效抑制EGFR介导之肿瘤细胞移动，其表明抗EGFR抗体之组合可用于治疗播散性疾病。
实施例12：Sym004抗体组合物对内披蛋白之上调
内披蛋白为早期鳞状细胞分化之标记且为参与角质化外壳形成之蛋白质。因此内披蛋白含量可用作已分化肿瘤细胞之数目的量度。使用市售内披蛋白ELISA试剂盒(Biomedical Technologies)来估算在来自未经处理或用尔必得舒、维克替比或抗体992+1030+1042之混合物处理之A431NS异种移植肿瘤之蛋白质裂解物中的内披蛋白之含量。藉由使用Qiagen之TissueLyzer使30-40mg肿瘤组织在1ml RIPA缓冲液中均质化来制备肿瘤裂解物。使用Pierce之BCA蛋白质检定试剂盒测定各澄清裂解物中之蛋白质浓度，且使用ELISA检定估算在各样本之0.4μg蛋白质中内披蛋白之含量。
结果：如图27中可见，与阴性对照组及尔必得舒或维克替比处理组相比，发现992+1030+1042处理组中之内披蛋白含量显著较高。因此抗体992、1030及1042之组合提高A431NS异种移植肿瘤中内披蛋白之含量，且因此可能诱导较高程度之A431NS分化。该结果与此特定处理组中所发现之大量角质珠(参见实施例8)充分-致。
实施例13：Sym004抗体组合物使EGFR内化
一些抗体藉由诱导其表面标靶之内化而发挥功能。已知EGFR在被诸如EGF之配体活化时经历内化。
使用共聚焦显微镜术研究两种抗体992与1024之混合物诱导EGFR内化之能力。将A431NS及HN5细胞接种于LabTek之8孔腔室载玻片中，且在含有0.5％ FBS之DMEM中培养隔夜。随后向细胞添加10μg/ml经Alexa-488标记之992+1024抗体混合物或对照抗体尔必得舒，且随后培养不同时段。随后使用具有大针孔或小针孔之Biorad共聚焦显微镜在60倍放大率下采集图像。
结果：如图29A中所示，添加经Alexa-488标记之EGFR特异性抗体992及1024历时2小时使得抗体在A431NS与HN5细胞系之细胞内小泡中累积。相比之下，尔必得舒主要存在于细胞表面。图29B展示使用较小针孔获得之A431NS细胞图像，该较小针孔产生较薄细胞切片之图像。由此等图像很明显，抗体992+1024位于细胞内而尔必得舒主要存在于细胞表面。图30展示992+1024介导之内化的时间范围，且早在添加抗体后30分钟，可在细胞内小泡中发现该等抗体。4小时后，几乎所有抗体992+1024均在细胞内发现，而表面染色较低或较弱。相比之下，尔必得舒保留于细胞表面。亦获得证据展示由992+1024诱导之内化使得细胞中之EGFR持续降解且移除。
因此抗体992与1024之组合迅速且有效地诱导EGFR内化，而尔必得舒不能。
实施例14：使用表面等离子共振量测抗体亲和力。
Sym004 IgG抗体针对重组可溶性EGFR ECD之单价亲和力(monovalentaffinity)之量测。
在BIAcore 2000上使用如Canziani，Klakamp等人，2004，Anal.Biochem，325：301-307中所述之检定进行本发明之全长IgG抗体之动力学分析，使得可量测完整IgG分子针对可溶性抗原之单价亲和力。简言之，根据制造商说明使约10,000 Ru之多克隆抗人类IgG Fc抗体与CM5芯片表面结合，继而在抗Fc芯片表面上捕获25μg本发明之各个抗EGFR抗体或西那吉斯阴性对照组。对于各克隆优化捕获之IgG之密度，以使该检定中所使用之最高抗原浓度之结合不超过25 Ru。随后将250μL先前藉由凝胶排阻层析法展示仅含有单价蛋白质之可溶性人类EGFR ECD以25μL/min之流速以HBS-EP缓冲液中之连续两倍稀释液注射以产生反应曲线。在循环之间藉由10秒注射100mM H3PO4去除所捕获之抗体/抗原复合物使芯片表面再生。藉由首先减去含有阴性对照抗体西那吉斯之流动单元的反应，继而减去由仅注射HBS-EP缓冲液产生之反应，进行动力学分析(“双重参考”，doublereferencing)。由所产生之感应图(sensogram)使用制造商所提供之BIA评估软件4.1全面评估缔合速率常数(ka)及解离常数(kd)。
试剂：
1.CM5芯片：Biacore，目录号BR-1000-14；
2.NHS：Biacore BR-1000-50；
3.EDC：Biacore BR-1000-50；
4.10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)：Biacore，目录号BR-1003-50；
5.山羊抗人类IgG Fc：Caltag，目录号H10500；
6.乙醇胺，1.0M，pH 8.5：Biacore BR-1000-50；
7.10×HBS-EP电泳缓冲液：0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15M NaCl、3mMEDTA、0.005％ v/v界面活性剂P20；
8.抗原：具有6×His之人类EGFR细胞外域；
9.100mM H3PO4。
所计算出之本发明之全长IgG针对可溶性人类EGFR ECD的单价亲和力展示于下表8中。
表8.所量测出之抗EGFR IgG抗体针对可溶性受体之亲和力。抗体量测系藉由在BIAcore 2000上使用制造商所提供之评估软件作表面等离子共振分析而进行。*992之亲和力系藉由Scatchard分析来测定。NA：不适用。
Figure BDA0000048237920000761
大多数所测试之Sym004抗体以在10-20nM范围内之亲和力识别可溶性人类EGFR ECD，除1260、1277及1284分别具有4.2nM、0.4nM及4.6nM之较高亲和力以外。最终发现992以比其它所测试抗体低得多的亲和力结合可溶性EGFR ECD。因此，此抗体之动力学分析须藉由Scatchard分析测定，该分析揭示针对可溶性人类EGFR ECD之170nM之亲和力。
Sym004 Fab抗体针对经固定重组EGFR ECD之亲和力的量测
为研究以可溶性与固定形式存在之EGFR ECD之间的抗原呈递之可能差异，对称为EGFR-Fc之由融合至人类IgG Fc之人类EGFR ECD所组成之经固定嵌合EGFR受体抗原(R&D Systems，344-ER)进行一种新的亲和力量测。出于此目的，产生IgG抗体992、1024及1030之Fab片段以使得可量测单价亲和力。
Fab的生成：
使用Pierce之Fab制备试剂盒且根据制造商说明藉由木瓜蛋白酶消化产生992、1024及1030之Fab片段。简言之，根据制造商说明，在NAP-5管柱(Amersham Biosciences)上用新鲜制备之含有20mM半胱氨酸-HCl之消化缓冲液(pH 7.0)对2mg各IgG抗体进行缓冲液更换。随后用相同消化缓冲液将木瓜蛋白酶珠粒之350μl浆液洗涤两次，随后将该等珠粒离心且弃去上清液。藉由将1ml经缓冲液更换之IgG抗体添加至珠粒中，且于37℃以1000rpm震荡之情况下培养隔夜来消化抗体。次日早晨，藉由以HiTrap Protein A管柱(Ge Healthcare)去除全长IgG将未消化之IgG自粗Fab分离。最终用PBS将所产生之Fab透析隔夜且用SDS-PAGE在还原及非还原条件下分析。认为非还原条件下约50kDa之蛋白质条带为Fab成功产生之指示。
试剂：
1.ImmunoPure Fab制备试剂盒；Pierce；目录号44885；
2.NAP5脱盐管柱；Amersham，目录号17-0853-02；
3.PBS(pH 7.2)；Gibco；#20012-019；
4.HiTrap Protein AHP，1ml管柱；GE Healthcare；#17-0402-01；
5.NuPAGE 4-12％ Novex Bis-Tris凝胶；Invitrogen；#NP0322BOX；
6.分子标记；Seeblue Plus 2；Invitrogen；#LC5925；
7.抗EGFR抗体-各2.0mg。
本发明之Fab抗体之动力学分析系以Biacore 2000使用以极低密度固定于感应器表面上之重组抗原以避免成群转移(mass transport)之限制来进行。简言之，根据制造商之说明书，使总共285 Ru重组EGFR ECD-Fc嵌合体(R&D Systems，目录号344-ER)与CM5芯片表面结合。随后将来源于本发明之抗体的Fab片段以起始于经优化浓度之连续两倍稀释液测试，当在具有经固定EGFR芯片上测试时该经优化浓度不产生高于25之Ru最大值。藉由首先减去由仅注射HBS-EP缓冲液产生之反应进行动力学分析。由所产生之感应图使用制造商所提供之BIA评估软件4.1全面评估缔合速率常数(ka)及解离常数(kd)。
所计算出之本发明之所测试Fab片段针对经固定人类EGFR ECD的亲和力展示于下表9中。
表9：所量测出之抗EGFR Fab抗体针对经固定受体之亲和力。抗体量测系藉由在BIAcore 2000上使用制造商所提供之评估软件作表面等离子共振分析而进行。*992之亲和力系藉由Scatchard分析来测定。NA：不适用。
Figure BDA0000048237920000781
如以上表9中所呈现，发现992及1024之Fab片段分别具有与先前实施例中所呈现之亲和力一致的150nM及26nM之亲和力，此说明对于此两种抗体而言，针对可溶性及固定EGFR之抗体识别存在较小差异。然而，与可溶性受体相比，抗体1030针对固定抗原展现2.3nM之高十倍的亲和力，且因此优先识别暴露于固定抗原上之表位。
实施例15：EGFR抗原呈递研究及对A431-NS细胞之功能性亲和力之分级。
A431-NS细胞与经纯化全长EGFR受体之抗原呈递之间的比较。
由于动力学分析揭示抗体992以150-170nM之间的亲和力识别重组EGFR ECD，故研究是否该弱亲和力归因于与自A431细胞纯化之重组EGFRECD或全长EGFR上所展示之构形相比，mAb 992优先结合表达于A431-NS细胞上之EGFR之天然构形之事实。为研究EGF受体抗原呈递差异，使用Fab片段进行本发明之抗体亚群的同步ELISA结合研究以避免对所测试A431-NS细胞及来自相同细胞之经纯化全长EGFR之亲和力影响。
Fab生产：如实施例14中所述产生Fab片段。
间接ELISA：为进行间接ELISA，于4℃以于碳酸酯缓冲液中之1μg/ml(每孔50μl)涂布全长EGFR(Sigma E2645)隔夜。次日早晨用PBS-T洗涤孔两次且于室温下用含有1％ BSA之PBS-T阻断1小时，继而用PBS-T洗涤两次。随后将50μl Fab抗体于含有1％BSA之DMEM中之连续稀释液添加至独立ELISA孔中且于室温下培养1小时，在此之后用PBS-T洗涤孔四次。随后添加50μl用含有1％ BSA之DMEM以1∶5000稀释的二级山羊-抗人类(Fab特异性)HRP结合物，且在冰上培养30min。最终，用PBS-T洗涤孔四次，且藉由每孔添加50μl TMB底物使板显色，且于620nm下每5-15-30min进行读取。与底物一起培养后，藉由添加1M H2SO4终止反应，且于450nm下读取吸光度。
试剂，间接ELISA：
1)涂布缓冲液：50mM碳酸酯缓冲液，pH 9.8；
2)抗原：自A431细胞纯化之野生型全长EGFR；Sigma E2645；
3)ELISA板：NUNC Maxisorp；目录号：442404；
4)洗涤缓冲液：1×PBS/0.05％吐温20(PBS-T)；
5)阻断/稀释缓冲液：于PBS-T中之1％BSA(PBS-T-1％ BSA)；
6)抗体稀释缓冲液：含有1％ BSA之DMEM；
7)山羊-抗人类(Fab特异性)HRP结合物：Jackson，目录号109-035-097；
8)TMB Plus底物：KemEnTec，目录号4390L；
9)1M H2SO4。
细胞ELISA：藉由对A431-NS细胞进行抗体滴定测定定义为产生半数最大OD(ED50)之莫耳浓度的相对结合亲和力。简言之，使10,000个A431-NS细胞于37℃5％CO2下在含有添加有0.5％FCS及1％P/S的DMEM之96孔ELISA板中生长隔夜。次日早晨用PBS洗涤汇合细胞(每孔约20,000个)两次，且藉由于室温下与1％三聚甲醛溶液一起培养15min固定，继而用PBS洗涤四次。随后，将所测试之EGFR抗体及阴性对照抗体西那吉斯在含有1％BSA之DMEM中连续稀释，且将50μl各稀释液添加至孔中且于室温下培养1小时，在此之后用PBS洗涤孔四次。随后添加50μl用含有1％BSA之DMEM以1∶5000稀释的二级山羊-抗人类(Fab特异性)HRP结合物，且在冰上培养30min。最终，用PBS-T洗涤孔四次，且藉由每孔添加50μl TMB Plus底物使板显色，且于620nm下每5-15-30min进行读取。与底物一起培养后，藉由添加1M H2SO4终止反应，且于450nm下读取吸光度。藉由减去仅与二级试剂结合之平均本底，继而藉由绘制相对于所测试之各抗体之最大结合％校正结合曲线来计算表示为ED50值之功能性亲和力。
试剂，细胞ELISA：
1)DMEM培养基：Gibco，目录号41966-029；
2)FCS：Gibco，目录号10099-141；
3)Pen strep(P/S)：Gibco，目录号15140-122；
4)ELISA板：Costar，目录号3595；
5)洗涤缓冲液(PBS)：Gibco目录号20012-019；
6)抗体稀释缓冲液：含有1％BSA之DMEM；
7)细胞固定液：BD Biosciences，目录号340181；
8)山羊-抗人类(Fab特异性)HRP结合物：Jackson，目录号109-035-097；
9)TMB Plus底物：KemEnTec，目录号4390L；
10)1M H2SO4。
用同步ELISA结合研究，使用相同第二抗体试剂及培养时间来测定A431-NS细胞上所表达之EGF受体与来自相同细胞之经纯化受体之抗原呈递差异。结果展示于图31中。该实验清楚展示当与相同浓度之Fab 1030之结合相比时，Fab抗体992及1024与涂布于ELISA孔中之经纯化全长EGFR结合较弱。然而，当用所有三种Fab均对其展示强结合活性之A431-NS细胞测试抗体时，992及1024之此弱结合活性得以恢复。两种不同ELISA之比较说明与ELISA孔中经纯化抗原所展示之构形不同，Fab 992及1024优先结合表达于细胞表面上之天然EGFR构形。该结果亦提示表面等离子共振所量测出之992对于重组可溶性及经固定EGFR ECD之表观较弱亲和力归因于测试系统中992抗体表位之不利展示。
对A431-NS细胞之功能性亲和力之分级
使用如上述进行之细胞ELISA藉由计算表示为ED50值之半数最大OD值将992、1024、1030、维克替比及尔必得舒之IgG及Fab片段之功能性亲和力分级。此分析之结果展示于图32中，且所计算出之ED50值呈现于下表10中。
表10：表示为ED50值之功能性亲和力基于IgG之亲和性效应或Fab之单价亲和力的分级。藉由对A431-NS细胞之连续抗体滴定来测定ED50值。
SD：曲线拟合之标准偏差。
IgG亲和性                              Fab亲和力
该实验清楚展示当考虑亲和性效应时，IgG 992及1024似乎以高于尔必得舒与维克替比之亲和性结合A431-NS细胞，而IgG 1030在所测试之IgG抗体中具有最低亲和力。然而，当使用Fab片段测定细胞之单价亲和力时，992具有约10nM之最低亲和力。尽管如此，该单价功能性亲和力仍为用BIAcore测试的至多1/15。
实施例16：研究抗体诱导之结合增强性。
对本发明之抗体对进行之BIAcore竞争实验揭示，992及1024之结合在此等抗体针对彼此双向测试时分别增强约55％及58％(图9A)。为进一步研究此现象，设计使用未固定细胞之细胞ELISA以研究在预先用结合非重迭表位之抗体的Fab片段饱和受体后一种抗体克隆之IgG结合之效应。
细胞ELISA：ELISA基本上系如实施例15中所述加以修改而进行。细胞不经固定以在添加抗体后允许构形EGFR可挠性。简言之，使10,000个A431-NS细胞于37℃5％ CO2下在含有添加有0.5％FCS及1％P/S的DMEM之96孔ELISA板中生长隔夜。次日早晨用PBS洗涤汇合细胞(每孔约20,000个)两次，且将用于研究抗体诱导之结合增强之孔与先前展示产生饱和结合之25μl 40nM 992、1024或1030之单一Fab片段，或12.5μl呈双重组合形式之80nM各单一Fab一起预培养。将25μl含有1％BSA之DMEM添加至用于测试不添加Fab片段之IgG抗体之孔中。添加Fab及培养基之后，于室温下培养ELISA孔30min，在此之后将25μl以360nM浓度开始之本发明之IgG或西那吉斯阴性对照组之连续三倍稀释液添加至孔中且在冰上培养1小时。随后，用PBS洗涤孔四次，且添加50μl用含有1％BSA之DMEM以1∶5000稀释的二级单克隆小鼠-抗人类(Fc特异性)HRP结合物且在冰上培养30min。最终，用PBS-T洗涤孔四次，且藉由每孔添加50μl TMB底物使板显色，且于620nm下每5-15-30min进行读取。与底物一起培养后，藉由添加1M H2SO4终止反应，且于450nm下读取吸光度。藉由减去仅与二级试剂结合之平均本底，继而藉由绘制相对于所测试之各抗体之最大结合％校正结合曲线来计算表示为ED50值之功能性亲和力。
试剂，细胞ELISA：
1)DMEM培养基：Gibco，目录号41966-029；
2)FCS：Gibco，目录号10099-141；
3)Pen strep(P/S)：Gibco，目录号15140-122；
4)ELISA板：Costar，目录号3595；
5)Wash缓冲液(PBS)：Gibco目录号20012-019；
6)抗体稀释缓冲液：含有1％BSA之DMEM；
7)小鼠-抗人类(Fc特异性)HRP结合物：Ab-direct，目录号MCA647P；
8)TMB Plus底物：KemEnTec，目录号4390L；
9)1M H2SO4。
藉由同步ELISA结合研究，使用相同第二抗体试剂及培养时间测定抗体诱导之结合增强之研究。该研究之结果展示于图33中且所计算出之ED50值展示于下表11中。
表11：功能性亲和力分级，所述亲和力表示为ED50值，是预先用或未用所列Fab片段对受体进行饱和后基于IgG之亲和性效应算出的。藉由对A431-NS细胞之连续抗体IgG滴定来测定ED50值。SD：曲线拟合之标准偏差。
Figure BDA0000048237920000821
Figure BDA0000048237920000822
Figure BDA0000048237920000823
如图33及以上表11中所呈现，在预先用1024或1030或1024以及1030之Fab片段饱和受体后，IgG 992展示明显增强之结合。与当单独测试IgG 992时之0.6nM相比，与Fab片段一起培养产生分别为0.5、0.4及0.5nM之减小之ED50值。同样，当首先用Fab 992饱和细胞时IgG 1024及1030亦展示增加之结合，且仅1024在Fab 992与1030在IgG之前均添加至细胞中时展示增加之结合。此结果无疑说明具有一种以上针对相同靶受体上之非重迭表位之抗体的益处。
与实施例2相比，在此实验中测出略低之功能性亲和力。此结果可能归因于在本实施例中使用不同的二级试剂且将所测试IgG与未固定细胞在冰上一起培养以避免内化之事实。
实施例16B：全长猕猴EGFR之克隆。
由自表皮分离之猕猴cDNA，藉由使用巢式PCR及来源于公开之全长人类EGFR序列之序列特异性引物(GENBANK X00588，Ullrich，A.等人，Nature 309(5967)，418-425(1984))克隆包括信号肽之全长猕猴EGFR。
PCR试剂：
自正常皮肤表皮分离之猕猴cDNA：CytoMol Unimed，目录号：ccy34218，批号：A711054。
FastStart反应缓冲液(10×)：Roche，目录号：03 553 361 001；
FastStart酶：Roche，Roche，目录号：03 553 361 001；
Phusion酶：Finnzymes，F-530S(2U/μL)；
dNTP 25mM：Bioline，目录号：BIO-39029。
用于扩增包括信号序列之全长猕猴EGFR之引物：
5′ATG引物：5′-TCTTCGGGAAGCAGCTATGC-3′(SEQ ID NO 135)；
3′STOP引物：5′-TCATGCTCCAATAAATTCACTG-3′(SEQ ID NO 139)。
PCR条件：
95℃/2min，40个循环：95℃/30sec，55℃/30sec，72℃/3min 30sec，最终于72℃培养5min。
用于巢式PCR扩增全长猕猴EGFR且并入Not及Xho限制性位点之引 物：
E579 Cyn Not5′：
5′-GGAGTCGGCGGCCGCACCATGCGACCCTCCGGGACGG-3(SEQ ID NO140)；
E580 Cyn Xho5′：
5′-GCATGTGACTCGAGTCATGCTCCAATAAATTCACTGC-3(SEQ ID NO141)。
PCR条件：
95℃/2min，随后30个循环：95℃/30sec解链，55℃/30sec退火，72℃/3min延伸。30个循环后，再使PCR产物延伸10min。
使用0.5μl模板及0.1μl Phusion酶、0.4μl FastStart酶，在总体积为50μL的最终浓度为1×FastStart缓冲液、0.2mM dNTP及0.2μM各引物的反应物缓冲液中进行PCR反应。
获得表观长度为约4000bp之PCR片段且使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Part No.4506-41)进行克隆且定序。所克隆猕猴EGFR之DNA及蛋白质序列展示于图34中。人类EGFR与猕猴EGFR蛋白质序列之排比展示99.2％之序列一致性。
藉由FACS分析证明全长人类与猕猴EGFR之间的抗体交叉反应性
藉由稳定转染使全长人类及猕猴EGFR表达于CHO细胞表面上，且藉由FACS分析测试细胞与一组连续稀释之EGFR抗体之结合。在KD依赖性条件下，藉由在所有抗体连续稀释液中保持莫耳过量之抗体进行测定，该莫耳过量之抗体为表达于固定数目细胞之细胞表面上之EGFR抗原分子数的至少5倍。此设置允许对于所有所测试抗体浓度在完全受体饱和下进行抗体结合之FACS分析。
简言之，用BD FACS数组生物分析仪系统(BD FACS array BioanalyzerSystem)进行定量FACS分析以测定表达于用人类或猕猴全长EGFR转染之CHO细胞表面上之EGFR分子的数目。该分析藉由滴定细胞上经PE标记之尔必得舒IgG来进行，且藉由与由具有已知PE密度之Rainbow校准粒子制成之标准曲线比较来测定等效PE之分子数目。定量分析揭示经EGFR转染之CHO细胞在各细胞表面上展示约350,000个分子。随后，以5nM开始连续5倍稀释之本发明之抗体藉由与10,000个经EGFR转染之CHO细胞以增加之体积一起培养进行比较，该增加之体积允许在各测定中具有比表面展示之EGFR抗原至少5倍莫耳过量之抗体。将抗体与细胞一起在震荡器上培养14小时以促进在所有所测试抗体浓度下之完全抗原饱和，同时向FACS缓冲液中添加0.02％NaN3且将温度保持于4℃以防止受体内化。培养后，于4℃在1200RPM下使细胞成粒5min且再悬浮于200μl FACS缓冲液中。随后用稀释至1∶500之二级山羊F(ab′)2抗人类IgG FcγPE将细胞染色且于4℃在震荡器上培养30min。最后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次且用BD FACS数组生物分析仪分析，其中对呈现均匀前向/侧向散射特性之EGFR表达CHO细胞进行设门。
FACS试剂：
Rainbow校准粒子：BD，目录号：559123；
FACS缓冲液：1×PBS+2％FCS+0.02％NaN3；
山羊F(ab′)2抗人类IgG Fcγ PE：Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-170。
使用所述FACS结合检定来测定EGFR抗体IgG 992及1024之交叉反应性，且与不与猕猴EGFR交叉反应之对照抗体IgG 1320相比较。如以下图40中所示，所述FACS检定可极好地用于辩别展现人类与猕猴全长EGFR之间的良好交叉反应性之抗体(图40A，IgG 992及图40B，IgG 1024)以及仅识别全长人类EGFR之物种特异性抗体(图 40C，IgG 1320)。由此分析可推断出，IgG 992与1024皆展现针对表达于经稳定转染之CHO细胞表面上之人类与猕猴全长EGFR的极佳交叉反应性。鉴于高度序列相似性，猕猴与人类EGFR之间的结合差异令人吃惊，且突显出针对与用于临床前毒理学研究之动物体内的确切靶序列结合之测试抗体的重要性。
实施例17：与992、1024及1030同源之克隆
基于免疫吸附检定(ELISA及基于细胞之检定)之EGFR结合抗体克隆之筛选使得可鉴别如先前实施例中所述之克隆992、1024、1030。亦鉴别与992、1024、1030同源之EGFR特异性克隆(表12)。
预期属于相同聚类之克隆具有相同结合特异性但可能以不同亲和力结合。因此，在本发明之抗体组合物中聚类中之克隆可彼此替换，其限制条件为该等克隆之结合亲和力不相差过多。
Figure BDA0000048237920000861
Figure BDA0000048237920000871
实施例18：抗体922及1024之人源化
所有抗体含有引发人类抗抗体反应之潜力。该反应在某种程度上与所用治疗性抗体之”人源性”程度相关联。不可能预测免疫原性且从而不能预测人类抗抗体，但对于临床使用存在优选具有高度人源性之抗体的趋势。本发明中所述之抗体之人源性可藉由人源化处理[Reichert JM.Monoclonalantibodies in the clinic.Nature Biotechnol，2001；19：819-822；Reichert JM，Rosensweig CJ，Faden LB及Dewitz MC，Monoclonal antibody successes in theclinic.Nature Biotechnol，2005；23：1073-1078]增强。
鼠类mAb之人源化原则上系藉由通常称为CDR移植之程序将互补决定区(CDR)移植于具有密切相关序列之IGHV及IGKV域之人类框架区(FR)上来达成(Jones PT，Dear PH，Foote J，Neuberger MS及Winter G，Replacing thecomplementarity-determining regions in a human antibody with those from amouse.Nature，1986；321：522-525)。然而，仅超变区之简单CDR移植会使亲和力降低，因为一些框架氨基酸或区域产生与抗原之重要接触或支持抗原结合CDR环之构形[Queen C，Schneider WP，Selick HE，Payne PW，Landolfi NF，Duncan JF，Avdalovic NM，Levitt M，Junghans RP及Waldmann TA，Ahumanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor.Proc Natl Acad Sci US A，1989；86：10029-10033；Al-Lazikani B，Lesk AM及Chothia C，Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins.J Mol Biol，1997；273：927-948]。因此，抗体人源化应包括将源于鼠类可变区之CDR环移植于密切同源之人类框架上，同时保留对抗原结合活性具有已证明之影响的关键鼠类框架残基(Winter，G.及W.J.Harris.“Humanized antibodies.”Immunol.Today 14.6(1993)：243-46)。已开发出若干方法且成功应用于达成人源化同时保留抗体亲和力及功能(Almagro，J.C.and J.Fransson.“Humanization of antibodies.”Front Biosci.13(2008)：1619-33中所综述)。人源化可藉由合理方法达成，该等方法例如CDR移植、表面重塑、超人源化、人类序列含量优化(human string content optimization)，其均依赖于建构数个人源化抗体候选者。候选者之氨基酸序列基于对抗体结构及各个氨基酸直接与间接经由稳定抗原相互作用区域之整体结构对于抗原结合之贡献的洞察及预测。通常候选者须经改进且使一些氨基酸回复突变为初始鼠类残基，因为各抗体具有一些未预见之各个限制条件。通常对于该等方法可能需要数轮连续设计、测试及再设计以保留亲和力及功能。替代方法为较经验之方法，其中产生大型组合文库，且具有所需特征之抗体藉由诸如酵母或噬菌体展示或替代性筛选法之方法进行选择而自变异体池富集。
本发明所述之抗EGFR抗体可藉由CDR移植于人类V区域中来人源化。在较佳方案中，基于与初始鼠类V区域之同源性选择人类V区域。亦可使用具有其它所要特征(诸如低免疫原性)之人类V基因区域。本实施例描述欲用于人源化992与1024抗EGFR嵌合抗体之方法。图41A中所给出之人源化序列系藉由将IMGT定义之来自992 IGHV之CDR区域移植于IGHV1-46/IGHJ4中且将992 IGKV之CDR区域移植于IGKV1-27/IGKJ1-01中得以产生。图41B中所给出之氨基酸序列系藉由将IMGT定义之来自1024IGHV之CDR区域移植于IGHV1-2*02/IGHJ6*02中且将1024 IGKV之CDR区域移植于IGKV2-28*01/IGKJ2*01中计算机辅助(in silico)产生。合成编码所指定人源化抗体之人工基因且插入哺乳动物表达载体中。如实施例3中所述进行抗体之表达、纯化及活性测试。初始测试后，可如实施例14中所述藉由表面等离子共振测定人源化抗体之结合动力学。类似地，可如实施例15中所述测定与表达于细胞表面上之hEGFR之结合。
若人源化氨基酸之结合活性显著低于对于初始抗体所观察到之结合活性，则可由位于光标区(Vernier zone)之人源化框架残基或所提出的支持CDR区域结构之残基开始使用依次回复突变方案来使亲和力再生(Foote，J.及G.Winter.“Antibody framework residues affecting the conformation of thehypervariable loops.”J Mol.Biol.224.2(1992)：487-99；Padlan，E.A.“Anatomyof the antibody molecule.”Mol.Immunol 31.3(1994)：169-217)。在IMGT编号中，此等残基对于992 IGHV为氨基酸13、45及80；对于992 IGKV为氨基酸25；对于1024 IGHV为氨基酸13、45、80及82；对于1024 IGKL为氨基酸78。可藉由使用标准分子生物学方法使用PCR介导之位点定向诱变来建构此等突变。如上述测试所建构之突变。预期此等组之候选者将产生具有保留抗原结合特性之人源化抗体。然而藉由在CDR区中藉由位点定向诱变引入氨基酸取代获得之其它回复突变或亲和力成熟不能去除。
实施例19：双可变域抗体
双重可变域(DVD)抗体蛋白质系藉由以6个氨基酸之连接子(ASTKGP)将992与1024之IGHV域串接融合且以5个氨基酸之连接子(TVAAP)将992与1024之IGKV域串接融合来工程改造[Wu C，Ying H，Grinnell C，Bryant S，Miller R，Clabbers A，Bose S，McCarthy D，Zhu RR，Santora L，vis-Taber R，Kunes Y，Fung E，Schwartz A，Sakorafas P，Gu J，Tarcsa E，Murtaza A及GhayurT.Simultaneous targeting of multiple disease mediators by adual-variable-domain immunoglobulin.Nature Biotechnol，2007；25：1290-1297]。双重IGHV与IGKV域融合后继而分别进行IGHC与IGKC域之融合。在一种全长DVD抗体(992L1024)中，992 IGHV及IGKV为N末端，继而分别为连接子及1024 IGHV及IGKV。在第二种全长DVD抗体(1024L992)中，1024IGHV及IGKV为N末端，继而分别为连接子及992 IGHV及IGKV。将编码992及1024抗体之质粒DNA用作介导建构DVD编码基因之两步PCR之模板。首先分别扩增IGHV及IGKV之两个可变域编码区域，以使其在连接子编码区之位置处含有重迭延伸区域(对于模板与引物组合参见表13及表14)。扩增编码C末端邻近可变域的IGKV基因以使人类轻链恒定域编码基因(IGKC)包括于编码序列中。双可变域抗体亚单元之编码序列及氨基酸序列展示于附录3中。
准备第一PCR，其中在各管(50μl反应物)中具有以下混合物以获得所给最终浓度：1×FastStart缓冲液(Roche)、dNTP混合物(各200μM)、引物(各10pmol)(参见表14)、FastStart高保真酶掺合物(2.2U；Roche)及100ng质粒模板(参见表14)。使PCR经受以下热循环：95℃2min，20×(95℃30sec，55℃30sec，72℃1min)，72℃10min。将来自第一PCR反应之具有正确大小之所得PCR产物(参见表14)藉由制备型琼脂糖凝胶电泳纯化，且用于藉由重迭延伸PCR剪接两个可变域之第二步骤中。准备藉由重迭延伸PCR剪接DNA片段之第二PCR，其中在各管(50μl反应物)中具有以下混合物以获得所给最终浓度：1×FastStart缓冲液(Roche)、dNTP混合物(各200μM)、引物(各10pmol，参见表15)、FastStart高保真酶掺合物(2.2U；Roche)及模板(100ngPCR片段，参见表15)。使PCR经受如上所定义之热循环。将来自第二PCR步骤之所得产物藉由制备型琼脂糖凝胶电泳纯化，且以限制酶处理，AscI及XhoI用于双重IGHV，且NheI及NotI用于双重IGKV(包括IGKC)。将该等片段藉由标准限制酶消化及接合程序连续地接合至哺乳动物IgG表达载体OO-VP-002(图4)中。将所得表达质粒载体在大肠杆菌中扩增且将质粒制备物藉由标准方法纯化。将DVD抗体如实施例2中进行表达及纯化，且如实施例3-13中对活性进行特性化。
若所得抗体展示与标靶hEGFr之结合降低或不与标靶hEGFr结合，则可测试其它连接子。
表13用于自992与1024建构DVD抗体之引物
Figure BDA0000048237920000911
表14用于自992及1024建构DVD编码基因之第一PCR步骤的引物与模板组合
*所扩增之编码序列包括IGKC基因
表15用于自992及1024建构DVD编码基因之第二PCR步骤(重迭延伸剪接)的引物与模板组合
Figure BDA0000048237920000921
实施例20：在猕猴中与尔必得舒组合之6周静脉内投药毒性研究
研究目的：该研究之目的在于测定在向猕猴每周一次静脉内投药6周后测试制品(992+1024)之毒性。
由于在使用EGFR抑制剂(如尔必得舒及维克替比)之临床实践中毒性为剂量限制因素，故认为在早期评估临床相关剂量之992+1024之耐受性很重要。此系因992+1024似乎藉由不同于其它靶向EGFR之产品之机制发挥作用的事实而突出。其可潜在地产生新的不利效应或比使用其它EGFR抑制剂所见之效应更加严重。
将三只雌性猕猴之组用4/2.7mg/kg及12/8mg/kg 992+1024及12/8mg/kg尔必得舒之每周静脉内剂量处理6周。第一剂量4mg/kg及12mg/kg为负荷剂量且2.7mg/kg及8mg/kg为投予5次之维持剂量。12/8mg/kg剂量相当于临床实践中所投予之尔必得舒之人类临床剂量。
研究设计
Figure BDA0000048237920000922
#第一剂量浓度用作负荷剂量，第二剂量浓度用于自第8日起投药
在研究期间跟踪以下参数：死亡率、临床迹象、体重、食物消耗、血液学、临床化学、器官重量、宏观发现(Macroscopic finding)。
结果
死亡率：在研究过程中无意外死亡。
临床迹象：无治疗相关之不利临床观察结果。
体重：用992+1024或尔必得舒治疗对体重无影响。
食物消耗：对食物消耗无明显影响。
血液学：对可表明用992+1024或尔必得舒治疗之作用的血液学参数无影响。
临床化学：在可表明用任一测试物品治疗之作用的临床化学参数方面无变化。
在第4周，每日给予4.2/2.7mg/kg 992+1024之一只动物的天冬氨酸转胺酶及丙氨酸转胺酶含量与处理前之值相比有所增加。此等含量至第6周回到正常范围。由于在其它经处理动物中无类似效应，故肝脏酶之该增加之毒理学意义为未知的。
器官重量：经处理动物与对照组动物之间的器官重量之毒理学意义无差异。
宏观发现：尸检时未注意到可表明992+1024或尔必得舒之作用的一致之观察结果。
初步结论：初步资料展示992+1024在所测试剂量下耐受性良好且未观察到与治疗相关之不利效应。
实施例21：肺细胞癌株之生长抑制
已知肺癌细胞系表达酪氨酸激酶域中具有突变之EGFR(Steiner等人，Clin Cancer Res 13.5(2007)：1540-51)。藉由类似于实施例6中所用之方法，研究两种抗体992与1024之组合抑制具有不同EGFR突变之肺癌细胞系HCC827及H1975生长之能力。
结果
如表16及表17中可见，992与1024之组合能够抑制两种细胞系之生长。该组合优于单克隆抗体992及1024且优于维克替比。
表16 所指定抗体针对HCC827细胞系之IC50值及最大生长抑制
  HCC827   IC50(μg/ml)   最大抑制
  尔必得舒   0.013   80％
  维克替比   0.100   60％
  992   0.050   80％
  1024   0.034   40％
  992+1024   0.031   80％
表17 所指定抗体针对H1975细胞系之IC50值及最大生长抑制
  H1975   IC50(μg/ml)   最大抑制
  尔必得舒   0.010   30％
  维克替比   0.141   30％
  992   0.056   30％
  1024   -   0％
  992+1024   0.024   30％
实施例21：对尔必得舒抗性细胞之功效。
为研究具有抗体992+1024之抗体组合物是否可抑制尔必得舒抗性细胞，藉由使亲本HN5细胞连续接触递增含量之尔必得舒来产生尔必得舒抗性HN5细胞。在产生尔必得舒抗性细胞池后，使用WST-1生存力检定来测试尔必得舒、维克替比及具有抗体992+1024之抗体组合物的抑制效应。
方法
藉由经6个月长时期接触递增浓度之尔必得舒而由尔必得舒(西妥昔单抗)敏感性人类头颈部细胞系HN5产生尔必得舒抗性HN5细胞。以对应于西妥昔单抗之IC50(0.05μg/ml)起始剂量开始，逐渐增加接触剂量直至细胞在含有10μg/ml尔必得舒之培养基中成功地增殖。使该等细胞在补充有10％ FBS及适当浓度之尔必得舒的DMEM中生长，且每周继代培养两次。
细胞增殖试剂WST-1为量测活细胞之代谢活性的即用底物，且假定该代谢活性与活细胞之数目有关。在本实施例中，使用WST-1检定来量测用不同浓度之不同抗体处理后代谢活性细胞之数目。
在进行WST-1检定之前，用补充有0.5％ FBS及1％ P/S之适当培养基将适当抗体及抗体混合物稀释至20μg/ml之最终总抗体浓度，在含有最高抗体浓度之孔中产生10μg/ml之最终抗体浓度。随后将150μl此等溶液添加至96孔板之第2行孔中，且进行三倍连续稀释并添加至后续行之孔中直至第9行以使各孔含有100μl抗体溶液。将100μl培氧基添加至第11行中。将200μl培氧基添加至第1列及第8列以及第1行及第12行中以降低实验孔中培氧基蒸发之影响。
随后将HN5亲本及HN5抗性细胞用1×PBS洗涤且藉由用3ml胰蛋白酶溶液胰蛋白酶化来分离。随后添加17ml完全培养基且将该等细胞以300×g(1200rcf)离心5min。移除上清液且使细胞再悬浮于DMEM+0.5％FBS中。对细胞进行计数且将其浓度调整至每毫升15,000个细胞。随后将100μl细胞悬浮液(每孔1500个细胞)添加至第2-11行之实验孔中。在含湿气恒温箱中于37℃培养板4日。随后每孔中添加20μl WST-1试剂且于37℃培养板1小时。随后将板转移至回转式盘震荡器中历时1小时。使用ELISA读取器量测450及620nm(参考波长)下之吸光度。使用与实施例6中所用相同之式将代谢活性细胞(MAC)之量计算为占未经处理之对照组的百分比。
使用GraphPad Prism，藉由使滴定曲线与以下方程序拟合来计算各混合物之IC50：Y＝最低值+(最高值-最低值)/(1+10^((LogIC50-X)*斜率))。
结果
图43中展示HN5亲本细胞与尔必得舒抗性细胞之滴定结果。显然尔必得舒之效能及功效在尔必得舒抗性细胞中比在亲本细胞中显著降低。尔必得舒及维克替比之功效降低约50％且IC50增加10倍以上(表18)。相比之下，具有抗体992+1024之抗体组合物(Sym004)的效能仅降低43％且IC50增加2倍。此等结果显示具有抗体992+1024之抗体组合物更有效且抑制尔必得舒抗性HN5细胞生长之功效高于尔必得舒及维克替比。
表18.所指定抗体抑制HN5wt及HN5尔必得舒抗性细胞之IC50值及功效。ND：未测定
Figure BDA0000048237920000951
Figure BDA0000048237920000961
实施例22：使用具有抗体992+1024之抗体组合物进行活体内再处理方法
在6-8周龄BALB/c nu/nu雌性小鼠之右侧腹皮下注射1×106个A431NS细胞。用测径器量测肿瘤，每周一至三次，且使用下式计算肿瘤体积(V)：V＝(宽度)2×(长度)×0.5。当肿瘤达到约100mm3之平均肿瘤体积时，开始处理，且用1mg抗体992+1024经腹膜内处理小鼠，每周两次总共注射9次。初始处理期后，跟踪研究小鼠159日。若在此期间侦测肿瘤生长，则用1mg抗体992+1024再处理小鼠，每周两次直至研究结束。
结果
所有肿瘤均对初始4周疗法起反应(图44)。指数肿瘤生长停止且肿瘤消退至介于0mm3与约200mm3之间的肿瘤体积。此后，肿瘤体积再稳定85日，随后9个肿瘤中之3个再次开始生长。用1mg抗体992+1024处理在起始第二轮处理之前尺寸发生变化之3个肿瘤，每周两次历时余下的研究期。在所有三种情况下，再处理使得肿瘤立即消退，此指示肿瘤在用具有抗体992+1024之抗体组合物进行初始4周处理后未变成抗性处理。
实施例23：使用具有抗体992+1024之抗体组合物活体内处理部分尔必得舒反应者
方法
在6-8周龄BALB/c nu/nu雌性小鼠之右侧腹皮下注射1×106个A431NS细胞。用测径器量测肿瘤，每周三次，且使用下式计算肿瘤体积(V)：V＝(宽度)2×(长度)×0.5。当肿瘤达到约130mm3之平均肿瘤体积时，将小鼠分为10只及30只动物之两组。用对照抗体处理10只动物之组，而用1mg尔必得舒处理30只动物之组，总共3剂。此时，将经尔必得舒处理之组随机化为两组均衡的12只动物，其平均肿瘤尺寸为500mm3。每周两次用1mg抗体992+1024处理两组动物或继续尔必得舒处理。自研究中取出6个异常值。
结果
初始尔必得舒处理部分抑制A431NS肿瘤生长(图45)。尔必得舒处理11日后，将一半动物转变为用具有抗体992+1024之抗体组合物(图注中之Sym004)处理。在转换为用抗体992+1024处理之小鼠组中，与继续尔必得舒处理之组相比，观察到肿瘤明显消退。具有抗体992+1024之抗体组合物对经尔必得舒预处理之大肿瘤的此明确作用表明，在A431NS模型中具有抗体992+1024之抗体组合物比尔必得舒更有效且具有抗体992+1024之抗体组合物可为尔必得舒部分反应者之治疗选择。
实施例24：活体内处理尔必得舒抗性细胞
为进一步研究Sym004药物候选者是否可抑制尔必得舒抗性细胞，自尔必得舒抗性HN5细胞池产生尔必得舒抗性HN5克隆。藉由有限稀释法产生克隆且在产生尔必得舒抗性克隆后，使用WST-1生存力检定测试尔必得舒、维克替比及Sym004之抑制效应。
方法
藉由有限稀释法，自尔必得舒抗性细胞池(参见实施例21)产生尔必得舒抗性HN5克隆。藉由限制稀释法进行克隆为基于以下假设来分离细胞之程序：若用足够培养基稀释细胞悬浮液，则将产生使得精确量测体积之稀释悬浮液含有1个细胞之细胞浓度。当将此体积之稀释悬浮液置于96孔板之单独孔中时，各孔应接受每孔1个细胞。若此细胞仍活着(由于每孔1个细胞之明显低的细胞密度，故通常需要喂养细胞层及/或”改良”培养基)且增殖，则将在孔中形成细胞之分离克隆。使该等细胞在补充有10％ FBS及适当浓度之尔必得舒之DMEM中生长。
细胞增殖试剂WST-1为量测活细胞之代谢活性的即用底物，且假定该代谢活性与活细胞之数目有关。在本实施例中，使用WST-1检定来量测继用不同浓度之不同抗体处理后代谢活性细胞之数目。
在进行WST-1检定之前，用补充有0.5％ FBS及1％ P/S之适当培养基将适当抗体及抗体混合物稀释至20μg/ml之最终总抗体浓度，在含有最高抗体浓度之孔中产生10μg/ml之最终抗体浓度。随后将150μl此等溶液添加至96孔板之第2行孔中，且进行三倍连续稀释并添加至后续行之孔中直至第9行以使各孔含有100μl抗体溶液。将100μl培氧基添加至第11行中。将200μl培氧基添加至第1列及第8列以及第1行及第12行中以降低实验孔中培氧基蒸发之影响。
随后用1×PBS洗涤HN5亲本及HN5抗性细胞且藉由用3ml胰蛋白酶溶液胰蛋白酶化来分离。随后添加17ml完全培养基且将该等细胞以300×g(1200 rcf)离心5min。移除上清液且使细胞再悬浮于DMEM+0.5％FBS中。对细胞进行计数且将其浓度调整至每毫升15,000个细胞。随后将100μl细胞悬浮液(每孔1500个细胞)添加至第2-11行之实验孔中。在含湿气恒温箱中于37℃培养板4日。随后每孔中添加20μl WST-1试剂且于37℃培养板1小时。随后将板转移至回转式盘震荡器中历时1小时。使用ELISA读取器量测450及620nm(参考波长)下之吸光度。代谢活性细胞(MAC)之量经如下计算为占未经处理之对照组的百分比：
Figure BDA0000048237920000981
使用GraphPad Prism，藉由使滴定曲线与以下方程序拟合来计算各混合物之IC50：Y＝最低值+(最高值-最低值)/(1+10^((LogIC50-X)*斜率))。
结果
图46中展示四个代表性克隆之滴定结果。显然该等克隆具有不同程度之尔必得舒抗性。然而，Sym004在抑制所有四个克隆之生长方面优于尔必得舒及维克替比。该优势之证据为功效增加(克隆#7、#11及#14)及/或效能增加(克隆#8、#11及#14)(表19)。
表19.所指定抗体抑制四个尔必得舒抗性HN5克隆之IC50值及功效。*由于最大抑制程度存在差异，故不能比较IC50值。
实施例25：使用尔必得舒及具有抗体992+1024之抗体组合物活体内处理尔必得舒抗性HN5细胞
方法
将5×106个尔必得舒抗性HN5克隆#7细胞皮下注射至6-8周龄雌性无胸腺裸小鼠之右侧腹中。用测径器量测肿瘤，每周两次，且根据下式计算肿瘤体积(mm3)：(宽度)2×(长度)×0.5。当肿瘤达到约650mm3之平均尺寸时，依序开始处理。藉由腹膜内注射，用50mg/kg Sym004或尔必得舒处理小鼠，每周两次，持续3周。在3周处理期后，跟踪研究小鼠5周。
结果
在3周Sym004疗法后，Sym004组之两个肿瘤皆被完全消除(图47)。在尔必得舒组中3只经处理之小鼠中的2只仅对处理起部分反应。此指示对尔必得舒处理具有部分抗性/不起反应之肿瘤可用Sym004有效地治疗。因此，针对尔必得舒之后天抗性机制并不影响Sym004之功效。
附录1.抗体可变区序列
＞992VH  (Seq.no.24)
cgcgccgaggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtgaggcctggagcttcagtgaagctgtcct
gcaaggcttctggctacacattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggcct
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cggtctattactgtacaagaaatggggattactacgttagtagcggggatgctatggactactggggtca
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＞1024VH  (Seq.no.25)
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gcaaggcttctggctacaccttcaccagtcactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggcct
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＞1030VH  (Seq.no.26)
cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct
gtgcagcctctggattcactttcagtagttatgccctgtcttgggttcgccagactccagagaggaggct
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atgtccagagataatgccaggaacatcctgtacctccaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggcca
tgtattactgtgcaagaggttctgatggttacttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagt
caccgtctcg
＞1042VH  (Seq.no.27)
cgcgcccaggtgcagcttcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcct
gtaaggcttctggctacaccttcaccagccactggatgcactgggtgcagcagaggcctggacaaggcct
tgagtggattggagagattcatcctagcaacggtcgtactaactacaatgagaagttcaagaacaaggcc
acactgactgtagacaaatctcccagcacagcctacatgcaactcagcagtttgacatctgaggactctg
cggtctattactgtgcaagatactatggttacgacgatgctatggactactggggtcaaggaacctcagt
caccgtctcg
＞1208VH  (Seq.no.28)
cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct
gtgcagcctctggattcgctttcagtagctatgacatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct
ggagtgggtcgcatacattggtagtggtgatgataatacccactatccagactctgtgaagggccgattc
accatctccagacacaatgccaaaaacaccctatacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacag
ccatgtattactgtgcaagacagaagtatggtaactacggggacactatggactactggggtcaaggaac
ctcagtcaccgtctcg
＞1229\VH  (Seq.no.29)
cgcgcccaggttcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcactt
gctctgtctctggtttttcattaaccatctatggtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtct
ggagtggctgggagttatgtgggctggtggaaatacagattataattcggctctcatgtccagactgaac
atcagcaaggacaattccaagagccaagttttcttaaaagtgaacagtctacaaactgatgacacagcca
tgtactattgtaccagagatcccgatggttactacgtggggtggttcttcgatgtctggggcgcggggac
cacggtcaccgtctcg
＞1254VH  (Seq.no.30)
cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct
gtgcagcctctggattcgcttacagtacctatgacatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct
ggagtgggtcgcatacattagtagtggtggtgatgccgcctactatcccgacactgtgaagggccgattc
accatctccagagacaatgccaaaaacaccctatacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacag
ccatgtattactgtgcgaggtctcgctatggaaactacggggacgctatggactactggggtcaaggaac
ctcagtcaccgtctcg
＞1257VH  (Seq.no.31)
cgcgccgaggtccagctgcaacagtctggacctgagctggtgaaacctggggcttcagtgaagataccct
gcaagacttctggatacactttcactgactacaacatggcctgggtgaagcagagccatggaaagagcct
tgagtggattggagatattattcctaacaatggtggtgctatctacaaccagaaattcaagggcaaggcc
actttgactgtagacaaatcctccagtacagcctccatggagctccgcagcctgacatctgaggacactg
cagtctatttctgtgcaagaaagaatatctactataggtacgacggggcaggtgctctggactactgggg
tcaaggaacctcagtcaccgtctcg
＞1260VH  (Seq.no.32)
cgcgcccaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcactt
gcactgtctctgggttttcattaaccacctatggggtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtct
ggagtggctgggagtaatatgggctggtggaagcacaaattataattcggctctcatgtccagactgagc
atcaagaaagacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagcca
tgtactactgtgccagagcctatggttacaactttgactattggggccaaggcaccactctcacagtctc
g
＞1261VH  (Seq.no.33)
cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct
gtgcagtctctggattcactttcagtagctatgtcatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct
ggagtgggtcgcaaccattactagtggtggtaggaacatctactatctagacagtgtgaaggggcgattc
actatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacgg
ccatgtattactgtgcaagacatgaggactataggtacgacggttactatgctatggactactggggtca
aggaacctcagtcaccgtctcg
＞1277VH  (Seq.no.34)
cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagagtccttgaaactctcct
gtgcagcctctggattcgctttcagttactctgacatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct
ggagtgggtcgcatacatgagtagtgctggtgatgtcaccttctattcagacactgtgaagggccgattc
accatctccagagacaatgccaagaacaccctgtatctgcaagtgagcagtctgaagtctgaggacacag
ccatatattactgtgtaagacaccgggacgtggctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgt
ctcg
＞1284VH  (Seq.no.35)
cgcgcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcct
gcaaggcttctggctacaccttcaccagcgactggatgcactggatgaaacagaggcctggacaaggcct
tgagtggattggagagattaatcctagtaacggtcgctctagctacaatgagaagttcaagagcaaggcc
acactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctg
cggtctattactgtgcaagaataggtggtatctacgtggagacttactggggccaagggactctggtcac
tgtctcg
＞1308VH  (Seq.no.36)
cgcgccgaggtccagcttcagcagtctggagctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcct
gcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaggcagaggcctggacagggtct
tgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtagagcc
acactgactgcaaacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctaacatctgaggactctg
cggtctatttctgtgcaagaagggcatcttccctctatgatgtttacccctactactttgactactgggg
ccaaggcaccactctcacagtctcg
＞1320VH  (Seq.no.37)
cgcgcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcaatgaagctgtcct
gcaaggcttctggctacaccttcaccaactactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggcct
tgaatggattggagaaattaatcctagcaacggtcgtactaattacaatgagaagttcaagagcaaggcc
acactgactgtagacaaatcgtccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctg
gggtctattactgtgcaaaaggggggaactactatgattacgactgggactactggggccaaggcaccac
tctcacagtctcg
＞1344VH  (Seq.no.38)
cgcgcccaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcactt
gcactgtctctgggttttcattaaccatctatggtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtct
ggagtggctgggagtaatatgggctggtggaaacacaaattataattcggctctcatgtccagactgagc
atcagcaaagacaactccaagagtcaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagcca
tgtacttctgtgccagaggctatggctacaatttagactattggggccaaggcaccactctcacagtctc
g
＞1347VH  (Seq.no.39)
cgcgcccaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacat
gcaccgtctcaggattctcattaaccggccatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtct
ggagtggctgggaatgatatggggtgatggaagcacggactataattcaactctcaaatccagactgagt
atcagcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcagactgatgacaccgcca
ggtactactgtgccagaggctacggctacctttactactttgactactggggccaaggcaccactctcac
agtctcg
＞992VH  (Seq.no.40)
RAEVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSRST
NYDEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRNGDYYVSSGDAMDYWGQGTS
VTVS
＞1024VH  (Seq.no.41)
RAQVQLQQPGAELVEPGGSVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSSGRN
NYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCVRYYGYDEAMDYWGQGTSVTVS
＞1030VH  (Seq.no.42)
RAEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYALSWVRQTPERRLEWVASISGVGSTY
FPDSVKGRFTMSRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGSDGYFYAMDYWGQGTSVTVS
＞1042VH  (Seq.no.43)
RAQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSHWMHWVQQRPGQGLEWIGEIHPSNGRT
NYNEKFKNKATLTVDKSPSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYGYDDAMDYWGQGTSVTVS
＞1208VH  (Seq.no.44)
RAEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYIGSGDDNT
HYPDSVKGRFTISRHNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARQKYGNYGDTMDYWGQGTSVT
VS
＞1229VH  (Seq.no.45)
RAQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCSVSGFSLTIYGVHWVRQPPGKGLEWLGVMWAGGNTD
YNSALMSRLNISKDNSKSQVFLKVNSLQTDDTAMYYCTRDPDGYYVGWFFDVWGAGTTVT
VS
＞1254VH  (Seq.no.46)
RAEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAYSTYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGDAA
YYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARSRYGNYGDAMDYWGQGTSVT
VS
＞1257VH  (Seq.no.47)
RAEVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKTSGYTFTDYNMAWVKQSHGKSLEWIGDIIPNNGGA
IYNQKFKGKATLTVDKSSSTASMELRSLTSEDTAVYFCARKNIYYRYDGAGALDYWGQGT
SVTVS
＞1260VH  (Seq.no.48)
RAQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTN
YNSALMSRLSIKKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARAYGYNFDYWGQGTTLTVS
＞1261VH  (Seq.no.49)
RAEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSSYVMSWVRQTPEKRLEWVATITSGGRNI
YYLDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARHEDYRYDGYYAMDYWGQGTS
VTVS
＞1277VH  (Seq.no.50)
RAEVQLVESGGGLVKPGESLKLSCAASGFAFSYSDMSWVRQTPEKRLEWVAYMSSAGDVT
FYSDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQVSSLKSEDTAIYYCVRHRDVAMDYWGQGTSVTVS
＞1284VH  (Seq.no.51)
RAQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSDWMHWMKQRPGQGLEWIGEINPSNGRS
SYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARIGGIYVETYWGQGTLVTVS
＞1308VH  (Seq.no.52)
RAEVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVRQRPGQGLEWIGQIYPGDGDT
NYNGKFKGRATLTANKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRASSLYDVYPYYFDYWGQGT
TLTVS
＞1320VH  (Seq.no.53)
RAQVQLQQPGAELVKPGASMKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRT
NYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSGVYYCAKGGNYYDYDWDYWGQGTTLTV
S
＞1344VH  (Seq.no.54)
RAQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGNTN
YNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYFCARGYGYNLDYWGQGTTLTVS
＞1347VH  (Seq.no.55)
RAQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGHGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTD
YNSTLKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARGYGYLYYFDYWGQGTTLTVS
＞992VL  (Seq.no.56)
ctagccgacattcagatgactcagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatca
gttgcaggacaagtcaggacattggcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa
actcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgga
acagatttttctctcaccattaacaacgtggagcaagaggatgttgccacttacttttgccaacactata
atacggttcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
＞1024VL  (Seq.no.57)
ctagccgacatcgtgatgacacaagctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatct
cctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattggtatctgcagaagcc
aggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcagt
agcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttatt
actgtgctcaaaatctagaacttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgt
ggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtg
tgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgg
gtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgac
gctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcg
cccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
＞1030VL  (Seq.no.58)
ctagccgacattgtgctgactcagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccattt
catgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttttatgcactggtaccaactgaaaccagg
acagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggc
agtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaagaggaggatgctgcaacctattact
gtcagcacagtagggagtttccgttaacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgtggc
tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc
ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta
actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct
gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc
gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
＞1042VL  (Seq.no.59)
gatattgtgatgactcaggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgca
ggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattggtatctgcagaagccaggcca
gtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcagtagcagt
gggtcaagaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtg
ctcaaaatctagaacttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgtggctgc
accatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctg
ctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaact
cccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgag
caaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtc
acaaagagcttcaacaggggagagtgt
＞1208VL  (Seq.no.60)
ctagccgatgttgtgatgactcagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatct
cttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagcc
aggccagtctccaaaactcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagt
ggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatt
tctgctctcaaagtacacatgttcccacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaacgaactgtggc
tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc
ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta
actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct
gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc
gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
＞1229VL  (Seq.no.61)
ctagccgacattgtgatgacccagtctcacaaattcatgtccacatcagtgggagacagggtcagcatca
cctgcaaggccagtcaggatgtgactaatgccgtagcctggtatcaacaaaaaccaggacaatctcctaa
actactgatttactgggcatccatccgacacactggagtccctgatcgcttcacaggcagtagatctggg
acagattatactctcaccatcaacagtgtgcaggctgaagacctggccctttattattgtcagcaacatt
ataacactccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggaaataaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
＞1254VL  (Seq.no.62)
ctagccgatgttgtgatgacacagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatct
cttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggtaacacctatttacattggtacctgcagaagcc
aggccagtctccaaagctcctgctctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagt
ggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggagtctgaggatctgggagtttatt
tctgctctcaaaatacacatgtgtacacgttcggaggggggacaaagttggaaataaaacgaactgtggc
tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc
ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta
actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct
gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc
gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
＞1257VL  (Seq.no.63)
ctagcccaaattgtgctcacacagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatga
cctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatttactggtaccagcagaagccaggatcctcccccagact
cctgatttatgacgcatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtgggtctgggacc
tcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagca
gttacccaatcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgaactgtggctgcaccatctgtctt
catcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttc
tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtg
tcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagacta
cgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttc
aacaggggagagtgt
＞1260VL  (Seq.no.64)
ctagccgatatccagatgactcagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatca
gttgcagtgcaagtcagggcattaccaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa
actcctgatctattactcatcaagtttacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggg
acagattattctctcaccatcagcaacctggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcagtata
gtgagattccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
＞1261VL  (Seq.no.65)
ctagcccaaattgtgctgacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccataa
cctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgcactggttccagcagaagccaggcacttctcccaaact
ctggatttatagtacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtggatctgggacc
tcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagta
gttacccatacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaacgaactgtggctgcaccatctgtctt
catcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttc
tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtg
tcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagacta
cgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttc
aacaggggagagtgt
＞1277VL  (Seq.no.66)
ctagccgatgttgtgatgacccagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatct
cttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagcc
aggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagt
ggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatt
tctgctctcaaagtacacatgttccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggc
tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc
ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta
actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct
gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc
gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
＞1284VL  (Seq.no.67)
ctagccgacattgtgctaacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatct
catgcagggccagccaaagtgtcagtacatctacctatagttatatgcactggtatcaacagaaatcagg
acagccacccaaactcctcatcaagtatgcatccaacctagagtctggggtccctgccaggttcagtggc
agtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatactgcaacatattact
gtcagcacagttgggagattccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggc
tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc
ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta
actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct
gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc
gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
＞1308VL  (Seq.no.68)
ctagccgacatccagatgacacaaactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatca
gttgcagggcaagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa
agtcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgga
acagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggta
atacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
＞1320VL  (Seq.no.69)
ctagccgacattcagatgacccagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatca
gttgcagtgcaagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa
actcctgatctatcacacatcaactttacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggg
acagattattctctcaccatcagcaacctggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcaatata
gtaagcttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
＞1344VL  (Seq.no.70)
ctagccgacattcagatgacacagactacttcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatta
gttgcagtgcaagtcagggcattagtaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa
actcctgatctattacacatcaagtttacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggg
acagattattctctcaccatcagcaacctggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcagtata
gtaagcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
＞1347VL  (Seq.no.71)
ctagccgaaaatgtgctgactcagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaaaaggtcaccatga
cctgcagggccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcaaaagtcaggtgcctcccc
caaactctggatttatagcacatccaacttggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtct
gggacctcttactctctcacagtcaacagtgtggagactgaagatgctgccacttattactgccaccagt
acagtggtttcccattcacgttcggctcggggaccaagctggagctgaaacgaactgtggctgcaccatc
tgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaat
aacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccagg
agagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagc
agactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag
agcttcaacaggggagagtgt
＞992VL  (Seq.no.72)
LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDIGNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGV
PSRFSGSGSGTDFSLTINNVEQEDVATYFCQHYNTVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1024VL  (Seq.no.73)
LADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSN
LASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKRTVAAP
SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1030VL  (Seq.no.74)
LADIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSFMHWYQLKPGQPPKLLIYLASNL
ESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPLTFGGGTKLEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1042VL  (Seq.no.75)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLA
SGVPDRFSSSGSRTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSV
FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL
SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1208VL  (Seq.no.76)
LADVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN
RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPTFGGGTKLEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1229VL  (Seq.no.77)
LADIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVTNAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASIRHTGV
PDRFTGSRSGTDYTLTINSVQAEDLALYYCQQHYNTPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1254VL  (Seq.no.78)
LADVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLLYKVSN
RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVESEDLGVYFCSQNTHVYTFGGGTKLEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1257VL(Seq.no.79)
LAQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPGSSPRLLIYDASNLASGVP
VRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPITFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFP
PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL
TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1260VL(Seq.no.80)
LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGITNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYSSSLHSGV
PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSEIPYTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1261VL  (Seq.no.81)
LAQIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVP
ARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPYTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFP
PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL
TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1277VL  (Seq.no.82)
LADVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN
RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPTFGGGTKLEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1284VL  (Seq.no.83)
LADIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSTYSYMHWYQQKSGQPPKLLIKYASNL
ESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPWTFGGGTKLEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1308VL  (Seq.no.84)
LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKVLIYYTSRLHSGV
PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1320VL  (Seq.no.85)
LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSTLHSGV
PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1344VL  (Seq.no.86)
LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGV
PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
＞1347VL  (Seq.no.87)
LAENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASG
VPARFSGSGSGTSYSLTVNSVETEDAATYYCHQYSGFPFTFGSGTKLELKRTVAAPSVFI
FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
附录2.抗体恒定区序列
＞人类IGKC区(Seq.no.88)
ttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataact
tctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagag
tgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagac
tacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagct
tcaacaggggagagtgttaataagcggccgccggtggaggcggt
＞人类IGKC区(Seq.no.89)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS
KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
外显子1    1..298
内含子    299..689
外显子2    690..734
内含子    735..852
外显子3    853..1182
内含子    1183..1279
外显子4    1280..1602
＞人类IGHG1恒定域基因组序列(Seq.no.90)
agtgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacag
cggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccct
gaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtg
accgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacca
aggtggacaagagagttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccaggctcagcg
ctcctgcctggacgcatcccggctatgcagtcccagtccagggcagcaaggcaggccccgtctgcctctt
cacccggaggcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttccccaggctctg
ggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctg
ccaagagccatatccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccc
tcagctcggacaccttctctcctcccagattccagtaactcccaatcttctctctgcagagcccaaatct
tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggc
gggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtccacctcca
tctcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacac
cctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc
aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtaca
acagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaa
gtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggtgggacc
cgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgaccgctgta
ccaacctctgtccctacagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggaga
tgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg
ggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttc
ttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtga
tgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
＞IGHG1  (Seq.no.91)
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP
EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
附录3.双可变域抗体序列
＞992L1024\IGHV  (Seq.no.92)
ggcgcgccgaggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtgaggcctggagcttcagtgaagctgtc
ctgcaaggcttctggctacacattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggc
cttgagtggattgggaatatttatcctggtagtcgtagtactaactacgatgagaagttcaagagcaagg
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Claims (69)

1.抗体组合物，用在治疗个体的癌症的方法中，所述个体先前已接受涉及抗人类EGFR抗体之治疗方案，该抗体组合物包含至少2种独特的抗人类EGFR抗体分子，
a.其中第一独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体992、包含抗体992之VL序列(SEQ ID NO 72之氨基酸3-109)及VH序列(SEQ ID NO 40之氨基酸3-124)之抗体、具有抗体992之CDR3(SEQ ID NO 116及111)之抗体、与抗体992结合相同表位之抗体、及能够抑制抗体992与人类EGFR结合之抗体；且
b.其中第二独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1024、包含抗体1024之VL序列(SEQ ID NO 73之氨基酸3-114)及VH序列(SEQ ID NO 41之氨基酸3-120)之抗体、具有抗体1024之CDR3(SEQ ID NO 120及114)之抗体、与抗体1024结合相同表位之抗体、及能够抑制抗体1024与人类EGFR结合之抗体。
2.权利要求1的组合物，其中该先前治疗方案涉及与该抗体组合物相同之抗体组合物。
3.权利要求1的组合物，其中该先前治疗方案涉及选自下列的抗人类EGFR抗体：西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、扎妥木单抗(Zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、ICR62、mAb806、马妥珠单抗(Matuzumab)、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体。
4.权利要求3的组合物，其中该抗人类EGFR抗体选自：西妥昔单抗、帕尼单抗、及扎妥木单抗以及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体。
5.权利要求3的组合物，其中该抗人类EGFR抗体选自：西妥昔单抗及帕尼单抗以及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体。
6.权利要求3的组合物，其中该抗人类EGFR抗体为西妥昔单抗或能够与西妥昔单抗结合相同表位之抗体。
7.在先权利要求之一的组合物，其中该癌症选自：头颈部癌、结肠癌、乳癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、神经胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌(non-small-cell-lung-carcinoma，NSCLC)、胃癌、子宫颈癌、肝细胞癌、胃食道癌、结肠直肠癌、直肠癌、上皮癌、RCC、头颈部鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck，SCCHN)、食道癌、多形性神经胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、肾脏癌、肉瘤及黑色素瘤。
8.在先权利要求之一的组合物，其中该治疗为继手术及/或放射疗法后之辅助疗法。
9.在先权利要求之一的组合物，其中该治疗为涉及用化学疗法及/或至少一种酪氨酸激酶抑制剂及/或至少一种血管生成抑制剂(诸如贝伐单抗(Bevacizumab))及/或至少一种激素及/或至少一种分化诱导剂治疗之组合疗法。
10.在先权利要求之一的组合物，其中该先前治疗方案为第一线疗法。
11.在先权利要求1至8中任一项的组合物，其中该先前治疗方案为第二线疗法。
12.权利要求11的组合物，其中该第一线疗法涉及用化学疗法及/或至少一种酪氨酸激酶抑制剂及/或至少一种血管生成抑制剂及/或至少一种激素及/或至少一种分化诱导剂及/或至少一种血管生成抑制剂(诸如贝伐单抗)之治疗方案。
13.权利要求9或12的组合物，其中该化疗化合物选自：阿德力霉素(adriamycin)、顺铂(cisplatin)、紫杉醇(taxol)、多柔比星(doxorubicin)、拓朴替康(topotecan)、氟嘧啶(fluoropyrimidine)、奥沙利铂(oxaliplatin)、及伊立替康(irinotecan)。
14.在先权利要求之一的组合物，其中该个体在该先前治疗方案期间或之后疾病有进展。
15.在先权利要求之一的组合物，其中该个体在该先前治疗方案之后疾病有进展。
16.在先权利要求之一的组合物，其中该癌症对该先前治疗方案具有抗性或部分抗性。
17.在先权利要求之一的组合物，其中：
a.该第一独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体992、包含抗体992之VL序列及VH序列之抗体、具有抗体992之CDR3之抗体、及与抗体992结合相同表位之抗体；且
b.该第二独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1024、包含抗体1024之VL序列及VH序列之抗体、具有抗体1024之CDR3之抗体、及与抗体1024结合相同表位之抗体。
18.在先权利要求之一的组合物，其中：
a.该第一独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体992、包含抗体992之VL序列及VH序列之抗体、及具有抗体992之CDR3之抗体；且
b.该第二独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1024、包含抗体1024之VL序列及VH序列之抗体、及具有抗体1024之CDR3之抗体。
19.在先权利要求之一的组合物，其中：
a.该第一独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体992、及包含抗体992之VL序列及VH序列之抗体；且
b.该第二独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1024、及包含抗体1024之VL序列及VH序列之抗体。
20.在先权利要求之一的组合物，其中该组合物包含抗体992及1024。
21.在先权利要求之一的组合物，其中该组合物之第一及第二抗EGFR抗体并不抑制彼此与人类EGFR之结合。
22.在先权利要求之一的组合物，其中该组合物之抗体中之至少一者能够增强另一抗体对于人类EGFR之最大结合能力。
23.在先权利要求之一的组合物，其中该组合物中第一抗体相对于第二抗体之比例为5％-95％，诸如为10％-90％，较佳为20％-80％，更佳为30％-70％，更佳为40％-60％，诸如为45％-55％，诸如为约50％。
24.在先权利要求之一的组合物，其中该组合物之第一及第二抗体为IgG1或IgG2同种型。
25.在先权利要求之一的组合物，其中该与抗体992结合相同表位之抗体选自包含克隆1209、1204、992、996、1033、及1220之抗体聚类(cluster)。
26.在先权利要求之一的组合物，其中该与抗体1024结合相同表位之抗体选自包含克隆1031、1036、1042、984、1024、1210、1217、1221、及1218之抗体聚类。
27.在先权利要求之一的组合物，其中该包含抗体992之CDR3之抗体另外包含抗体992之VH及VL之CDR1及CDR2。
28.在先权利要求之一的组合物，其中该包含抗体1024之CDR3之抗体另外包含抗体1024之VH及VL之CDR1及CDR2。
29.在先权利要求之一的组合物，其中该与抗体992竞争之抗体选自抗体1208、1254、及1277。
30.在先权利要求之一的组合物，其中该与抗体1024竞争之抗体选自抗体1042及1320。
31.在先权利要求之一的组合物，其中该组合物除该第一及第二抗体外并不含有其它抗EGFR抗体。
32.在先权利要求1至30中任一项的组合物，其中该组合物进一步包含第三独特的抗EGFR抗体，其中该第三独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1030、包含抗体1030之VL序列(SEQ ID NO 74之氨基酸3-114)及VH序列(SEQ ID NO 42之氨基酸3-120)之抗体、具有抗体1030之CDR3(SEQ ID NO112及119)之抗体、与抗体1030结合相同表位之抗体、及能够抑制抗体1030与人类EGFR结合之抗体。
33.权利要求32的组合物，其中该第三抗体使得该第一及/或第二抗体与人类EGFR之结合增强。
34.权利要求32的组合物，其中该与抗体1030结合相同表位之抗体选自由克隆1195、1030、1034、1194、980、981、1246、及1223所组成之抗体聚类。
35.权利要求32的组合物，其中该包含抗体1030之CDR3之抗体另外包含抗体1030之VH及VL之CDR1及CDR2。
36.权利要求32的组合物，其中该组合物除该第一、第二及第三抗体外并不含有其它抗EGFR抗体。
37.在先权利要求之一的组合物，其中该组合物之独特抗体经制备用于同时、依次或分别投药。
38.在先权利要求之一的组合物，其中该组合物使得受体内化。
39.在先权利要求之一的组合物，其中该组合物使得活体内A431NS肿瘤消退。
40.在先权利要求之一的组合物，其中该组合物能够诱导活体内A431NS细胞之终末分化。
41.在先权利要求之一的组合物，其中该组合物能够上调活体内肿瘤内披蛋白(involucrin)表达。
42.在先权利要求之一的组合物，其中该第一及第二独特的抗EGFR抗体形成双特异性结合分子之组成部分。
43.权利要求42的组合物，其中该双特异性结合分子包含抗体992及1024之CDR。
44.权利要求42的组合物，其中该双特异性结合分子为双可变域型抗体。
45.权利要求42的组合物，其中该双特异性结合分子为双特异性Fab片段或双特异性scFv。
46.抗体组合物，用在治疗癌症之方法中，其中该癌症对使用至少一种选自下列的其它抗EGFR抗体之治疗具有抗性或部分抗性：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体；该抗体组合物包含至少2种独特的抗人类EGFR抗体分子，
a.其中第一独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体992、包含抗体992之VL序列(SEQ ID NO 72之氨基酸3-109)及VH序列(SEQ ID NO 40之氨基酸3-124)之抗体、具有抗体992之CDR3(SEQ ID NO 116及111)之抗体、与抗体992结合相同表位之抗体、及能够抑制抗体992与人类EGFR结合之抗体；且
b.其中第二独特的抗EGFR抗体分子选自：抗体1024、包含抗体1024之VL序列(SEQ ID NO 73之氨基酸3-114)及VH序列(SEQ ID NO 41之氨基酸3-120)之抗体、具有抗体1024之CDR3(SEQ ID NO 120及114)之抗体、与抗体1024结合相同表位之抗体、及能够抑制抗体1024与人类EGFR结合之抗体。
47.权利要求46的组合物，其中该组合物系权利要求17-45中任一项所述。
48.权利要求46的组合物，其中该组合物系用于第一线疗法。
49.权利要求46的组合物，其中该组合物系用于继涉及化学疗法及/或至少一种酪氨酸激酶抑制剂及/或至少一种血管生成抑制剂(诸如贝伐单抗)及/或至少一种激素及/或至少一种分化诱导剂之治疗方案后的第二线疗法。
50.权利要求46的组合物，其中该组合物系用于第三线疗法。
51.权利要求46的组合物，其中该组合物系与化学疗法及/或至少一种酪氨酸激酶抑制剂及/或至少一种血管生成抑制剂(诸如贝伐单抗)及/或至少一种激素及/或至少一种分化诱导剂一起用于组合疗法。
52.权利要求46的组合物，其中该组合物系用作继手术及/或放射疗法后之辅助疗法。
53.权利要求46的组合物，其中该完全或部分的抗性已藉由检定自该个体分离之癌细胞样本来判定。
54.一种降低EGFR信号传递之方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞先前已经接受选自下列的抗EGFR抗体处理：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1至45项中任一项所述，从而降低该EGFR信号传递。
55.一种杀死表达EGFR之细胞的方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞先前已经接受选自下列的抗EGFR抗体处理：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1及17至45中任一项所述；及杀死该等EGFR表达细胞。
56.一种诱导表达EGFR之细胞凋亡的方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞先前已经接受选自下列的抗EGFR抗体处理：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1及17至45中任一项所述，从而诱导凋亡。
57.一种抑制表达EGFR之细胞增殖的方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞先前已经接受选自下列的抗EGFR抗体处理：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1及17至45中任一项所述，从而抑制增殖。
58.一种诱导活体内肿瘤细胞分化之方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞先前已经接受选自下列的抗EGFR抗体处理：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1及17至45中任一项所述，从而诱导肿瘤细胞分化。
59.权利要求58的方法，其中该分化为终末分化。
60.权利要求58的方法，其中该分化伴有内披蛋白表达的增加。
61.一种诱导EGFR内化之方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞先前已经接受选自下列的抗EGFR抗体处理：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1及17至45中任一项所述，从而诱导EGFR内化。
62.一种降低EGFR信号传递之方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞对选自下列的抗EGFR抗体具有抗性或部分抗性：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1及17至45中任一项所述，从而降低该EGFR信号传递。
63.一种杀死表达EGFR之细胞的方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞对选自下列的抗EGFR抗体具有抗性或部分抗性：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1及17至45中任一项所述，及杀死该等EGFR表达细胞。
64.一种诱导表达EGFR之细胞凋亡的方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞对选自下列的抗EGFR抗体具有抗性或部分抗性：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1及17至45中任一项所述，从而诱导凋亡。
65.一种抑制表达EGFR之细胞增殖的方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞对选自下列的抗EGFR抗体具有抗性或部分抗性：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1及17至45中任一项所述，从而抑制增殖。
66.一种诱导活体内肿瘤细胞分化之方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞对选自下列的抗EGFR抗体具有抗性或部分抗性：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1及17至45中任一项所述，从而诱导肿瘤细胞分化。
67.权利要求66的方法，其中该分化为终末分化。
68.权利要求66的方法，其中该分化伴有内披蛋白表达的增加。
69.一种诱导EGFR内化之方法，其包含向EGFR表达细胞之组合物投予抗体组合物，该等细胞对选自下列的抗EGFR抗体具有抗性或部分抗性：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、ICR62、mAb806、马妥珠单抗、及能够与任何此等抗体结合相同表位之抗体，该抗体组合物系权利要求1及17至45中任一项所述，从而诱导EGFR内化。
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