JP2004519233A - 免疫原性の低減された修飾された抗ｅｇｆｒ抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、特にヒトに対し、特に腫瘍の治療で使用するために投与されるＥＧＦレセプター（ＨＥＲ１）に対する抗体に関する。この抗体は修飾されており、この修飾の結果、ヒト対象に投与したときに、抗体が免疫反応を誘発する傾向が低減される。本発明は特に、インビボで使用したときに実質的に免疫原性がないか、または非修飾の対応抗体に比べて免疫原性が低減されたＭａｂ４２５変異体を生成するための、抗ＥＧＦＲ抗体４２５の様々な形態およびその断片の修飾に関する。

Description

【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、特にヒトに投与され、そしてとりわけ腫瘍の治療に使用するＥＧＦ受容体（ＨＥＲ１）に導かれる抗体に関する。この抗体は修飾された抗体であり、この修飾により、抗体がヒトに投与された際に免疫反応を誘発する傾向が低減するという結果をもたらす。本発明は特に、インビボで使用した時に、非修飾の相当物に比べて免疫原性が低い、または実質的に非免疫原性である、Ｍａｂ４２５の変異体をもたらす抗ＥＧＦＲ抗体４２５の異なる型およびその断片の修飾に関する。本発明はさらに、前記非修飾タンパク質に由来するＴ細胞エピトープペプチドに関し、これにより免疫原性の低減された修飾Ｍａｂ４２５変異体の作成を可能にするものである。
【０００２】
（発明の背景）
ｃ−ｅｒｂＢ１／Ｈｅｒ１としても知られている上皮成長因子レセプター（ＥＧＦレセプターまたはＥＧＦＲ）およびｎｅｕ腫瘍遺伝子産物（ｃ−ｅｒｂＢ２／Ｈｅｒ２としても知られている）は、レセプターチロシンキナーゼの大ファミリーに属するＥＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーである。これらは細胞表面で、ＥＧＦまたはＴＧＦ−αなどの特定の成長因子すなわち元のリガンドと相互作用し、その結果、レセプターチロシンキナーゼを活性化する。一般には、下流のシグナルタンパク質カスケードが活性化され、遺伝子発現の変化および成長率の増加をもたらす。
【０００３】
ｃ−ｅｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）は膜貫通チロシンキナーゼであり、約１８５，０００の分子量を有し、ＥＧＦレセプター（Ｈｅｒ１）と高い相同性を有している。ただし、Ｈｅｒ２に特異的なリガンドは、これまでのところ明確に特定されていない。
【０００４】
ＥＧＦレセプターは膜貫通グリコタンパク質であり、１７０，０００の分子量を有し、多くの上皮細胞種において見出される。これは、少なくとも３種のリガンド、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α（形質転換成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）−α）およびアンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）によって活性化される。上皮成長因子（ＥＧＦ）および形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）の両方は、ＥＧＦレセプターに結合し、細胞増殖および腫瘍成長を引き起こすことが示されている。これらの成長因子はＨｅｒ２には結合しない（ＵｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、１９９０、Ｃｅｌｌ ６１、２０３）。二量体性（例えば、ＰＤＧＦ）によってレセプターの二量化を引き起こす成長因子の幾つかのファミリーと対照的に、ＥＧＦなどの単量体性成長因子はそのレセプターに対する２つの結合部位を有し、これにより、隣接する２つのＥＧＦレセプターを架橋することができる（Ｌｅｍｍｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９７、ＥＭＢＯ Ｊ．１６、２８１）。レセプターの二量化は、固有の触媒活性を刺激し成長因子レセプターを自動リン酸化するために必須である。ここで注目すべきは、レセプタータンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫｓ）が、同種および異種の二量化の両方を受けることができることである。臨床研究によると、ＥＧＦレセプターとｃ−ｅｒｂＢ２は両方とも、ある種の腫瘍、特に、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、大腸がん、腎臓がん、頭部および頚部のがん、および肺の扁平上皮細胞がんにおいて過剰発現することが示されている（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ７、３５９；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、１９９０、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １、３３９）。したがって、これらの観察結果により、がんを処置するための新たな治療アプローチとして、ヒトのＥＧＦレセプターまたはｃ−ｅｒｂＢ２の機能を阻害することに的を絞った前臨床研究が行われてきた（例えば、Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４、７３７；ＦａｎおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０、６７参照）。例えば、抗Ｈｅｒ２抗体と同様に、抗ＥＧＦレセプター抗体は、ヒトのがん治療において効果的であると報告されている。この結果、ヒト化モノクローナル抗体４Ｄ５（ｈＭＡｂ ４Ｄ５、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））が既に商業的に生産されている。
【０００５】
抗ＥＧＦレセプター抗体は、ＥＧＦおよびＴＧＦ−αがレセプターに結合するのを阻止すると同時に、がん細胞の増殖を阻害するようであると示されている。これらの知見に基づき、ＥＧＦレセプターに対する多数のマウスおよびラットモノクローナル抗体が開発されており、そのインビトロおよびインビボにおけるがん細胞増殖阻害能力が調べられている（ＭｏｄｊｔａｈｅｄｉおよびＤｅａｎ、１９９４、Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ４、２７７）。
【０００６】
ヒト化モノクローナル抗体４２５（ｈＭＡｂ４２５）（米国特許第５，５５８，８６４号；ＥＰ ０５３１ ４７２）およびキメラモノクローナル抗体２２５（ｃＭＡｂ ２２５）（Ｎａｒａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７、３４３−３４９、ＷＯ ９６／４０２１０）は、両方ともＥＧＦレセプターに対してであるが、治験において有効性を示している。
【０００７】
Ｃ２２５抗体は、ＥＧＦが媒介するがん細胞のインビトロでの増殖を阻害することおよびヌードマウスではインビボでのヒトがん細胞の形成を阻害することが示されている。さらに、この抗体は、とりわけある種の化学療法剤（すなわち、ドキソルビシン、アドリアマイシン、タキソールおよびシスプラチン）と相乗的に作用し、異種移植マウスモデルにおいてインビボでヒトの腫瘍を根絶するようである。Ｙｅら（１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８、７３１）は、ヒト卵巣がん細胞が、ｃＭＡｂ ２２５およびｈＭＡｂ ４Ｄ５の両方の組合せにより効果的に治療されることを報告している。
【０００８】
治療用タンパク質に対して望ましくない免疫反応が起こるために、治療用タンパク質の有効性が制限される例が多々ある。いくつかのマウスモノクローナル抗体はヒトの多数の疾病症状において治療剤としての見込みを示すが、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応が著しく誘導するため失敗したケースもある［Ｓｃｈｒｏｆｆ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：８７９−８８５；Ｓｈａｗｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５３０−１５３５］。モノクローナル抗体については、ＨＡＭＡ反応を低減させようと多数の技術が開発されている［ＷＯ ８９／０９６２２；ＥＰ ０２３９４００；ＥＰ ０４３８３１０；ＷＯ ９１／０６６６７］。これらの組換えＤＮＡ手法は、一般に最終的な抗体コンストラクトにおいてマウス遺伝子情報を低減させる一方、最終コンストラクト中のヒト遺伝子情報を増加させるものである。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、依然として患者に免疫反応を誘発する場合があった［Ｉｓｓａｃｓ Ｊ．Ｄ．（１９９０）Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４９，４５６；Ｒｅｂｅｌｌｏ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８：１４１７−１４２０］。
【０００９】
抗体は、治療剤として投与した際にそれに対して免疫反応が発動し得る唯一の種類のポリペプチド分子ではない。ヒトに由来する、しかも人体内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、人体内で免疫反応を引き起こすことがある。顕著な例としては、とりわけ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子［Ｗａｄｈｗａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：１３５３−１３６１］やインターフェロンアルファ２［Ｒｕｓｓｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｂｒｉ．Ｊ．Ｈａｅｍ．９４：３００−３０５；Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｍｅｄ．３１８：１４０９−１４１３］の治療上の使用が挙げられる。
【００１０】
免疫反応誘導の主要な要因は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上での提示を介してＴ細胞活性を刺激し得るペプチド、いわゆる「Ｔ細胞エピトープ」がタンパク質内に存在することである。このような潜在的Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を備えた任意のアミノ酸残基配列として一般に定義される。このようなＴ細胞エピトープは、ＭＨＣ結合を確立することで測定できる。暗黙にではあるが、「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合する際、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）によって認識され、少なくとも原理的には、ＴＣＲと結びつきＴ細胞応答を促進することによって、これらＴ細胞の活性化を引き起こし得るエピトープを意味する。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することが判明しているある種のペプチドはタンパク質配列中に保持されているものと通常理解されており、このようなペプチドは、最終タンパク質が投与される有機体内で「自己」として認識される。
【００１１】
これらのＴ細胞エピトープペプチドのある種は、細胞内でのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解中に放出され得るものであり、続いてＴ−細胞の活性化を起動すべく主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されることが知られている。ＭＨＣクラスＩＩによって提示されたペプチドの結果として、Ｔ細胞のこのような活性化は、次いで、例えばＢ細胞の直接の刺激による抗体応答を引き起こし、そうした抗体を産生する。
【００１２】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴ細胞の選択および活性化に中心的な役割を果たす高度に多型的なタンパク質のグループである。ヒトの白血球抗原グループＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）はこのグループタンパク質で優性なアイソタイプで、本発明の主な着目点である。しかしながら、アイソタイプＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰも同様の機能を果たし、したがって本発明はこれらにも等しく適用可能である。ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ分子は、アルファ鎖およびベータ鎖で形成され、それらのＣ末端は細胞膜を通して挿入される。各ヘテロダイマーは、９〜２０個の範囲のアミノ酸長のペプチドに結合するリガンド結合領域を有するが、結合溝に収容できるのは最高１１個のアミノ酸である。リガンド結合領域は、アルファ鎖の１〜８５個のアミノ酸およびベータ鎖の１〜９４個のアミノ酸が含まれる。ＤＱ分子は、相同的な（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）構造を有することが最近示されており、ＤＰ族タンパク質も非常に類似していると予想される。ヒトでは、ＤＲアイソタイプのおよそ７０種類の異なるアロタイプが知られており、ＤＱについては３０種類の異なるアロタイプが、また、ＤＰについては４７種類の異なるアロタイプが知られている。各個人は２〜４個のＤＲ対立遺伝子、２個のＤＱおよび２個のＤＰ対立遺伝子を有する。多数のＤＲ分子の構造が解明されており、それらの構造は、ペプチドの疎水性残基（ポケット残基）と結合する多数の疎水性ポケットを有する開放端のペプチド結合溝を指している［Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６４：３３；Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：２１５］。
【００１３】
クラスＩＩ分子の様々なアロタイプを識別する多型は、ペプチド結合溝内の様々な異なるペプチド結合表面に寄与し、集団レベルで外来タンパク質を認識し病原性有機体への免疫反応を引き起こす能力に関する最大の柔軟性を保証する。リガンド結合領域には相当な量の多型が存在し、これは異なる地理的な集団および民族グループ内で区別される「ファミリー」を備えている。この多型は、ペプチド結合領域の結合特性に影響し、したがって、ＤＲ分子の異なる「ファミリー」は、幾分かは重複があるかもしれないが、異なる配列特性を備えたペプチドに対して特異性を有するであろう。この特異性は、Ｔｈ細胞エピトープの認識（クラスＩＩ Ｔ細胞反応）を決定し、これは最終的には、Ｔｈ細胞エピトープが由来するのと同じタンパク質上に存在するＢ細胞エピトープに対する抗体反応を駆動する原因となる。したがって、個人におけるタンパク質への免疫反応は、その個人のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性によって決まるＴ細胞エピトープ認識によって重大な影響を受ける。ゆえに、世界的な人口レベルにおいてタンパク質またはペプチド内のＴ細胞エピトープを識別するためには、ＨＬＡ−ＤＲアロタイプのできるだけ多様なセット（それにより世界人口のできるだけ高い割合をカバーする）の結合特性を考慮することが望ましい。
【００１４】
本発明の対象であるタンパク質などの治療のタンパク質に対する免疫反応は、ＭＨＣクラスＩＩペプチド提示経路経由で進行する。ここに外来タンパク質は、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子と連携した提示のために飲み込まれ処理される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、とりわけマクロファージおよび樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現される。Ｔ細胞表面上の同族のＴ細胞レセプターによるＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の結合は、ＣＤ４分子などの他のある種のコレセプターの相互結合を伴って、Ｔ細胞内での活性化状態を引き起こすことができる。活性化は、サイトカインの放出をもたらし、Ｂ細胞などの他のリンパ細胞をさらに活性化して抗体を産生するか、完全な細胞性免疫反応としてＴリンパ球を活性化する。ペプチドがＡＰＣ表面における提示用の所与のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する能力は、多数の要因（最も顕著にはその１次配列）に依存する。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合溝（ｃｌｅｆｔ）内でのタンパク質分解による切断およびその結合親和性の両者に影響を及ぼすことになる。ＡＰＣ表面上のＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体は、特別なＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）が、露出したペプチド残基およびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方によって提供される決定基（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を認識することができるように結合面を提示する。
【００１５】
当技術分野では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できる合成ペプチドを識別するための操作手順が存在する（例えば、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７）。そのようなペプチドは、必ずしもすべての状況下で（特にインビボでは処理経路または他の現象により）Ｔ細胞エピトープとして特に機能しないかもしれない。Ｔ細胞エピトープ識別はエピトープ除去に向けての最初のステップである。タンパク質からの潜在的なＴ細胞エピトープの識別および除去はすでに示されている。当技術分野では、通常、実験的に決定されたＴ細胞エピトープ中で認識された配列モチーフを走査する計算手段により、あるいはＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドおよび特にＤＲ結合ペプチドクラスを予想するために計算上の技術を用いることにより、Ｔ細胞エピトープの検知を可能にする方法が提供された。ＷＯ９８／５２９７６とＷＯ００／３４３１７は、ポリペプチド配列がヒトのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのサブセットに結合する可能性を識別するための計算によるスレッディング（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）手法を教示する。これらの教示では、予想されたＴ細胞エピトープは、ヒト由来および非ヒト由来の治療用抗体または非抗体タンパク質の１次配列内で慎重なアミノ酸置換を用いることによって除去される。
【００１６】
合成ペプチドとの組合せで、ヒトまたは実験動物の末梢血試料から得られたＴ細胞クローンと結合し得る組換えＭＨＣ分子の可溶性複合体を開発する他の技術が、当技術分野で使用され［Ｋｅｒｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：９７５−９７８；Ｋｗｏｋ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ ａｌ（２００１）ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｉｍｍｕｏｌｏｇｙ ２２：５８３−５８８］、さらにエピトープ識別戦略において開発されるかもしれない。
【００１７】
上記のように、およびその結果として、基本的に治療上価値があるが本来は免疫原性であるポリペプチド、タンパク質または免疫グロブリンからＴ細胞エピトープを識別しさらに除去または少なくとも低減することが望ましいであろう。
【００１８】
修飾されたＭａｂ４２５はＣ２２５のキメラおよびヒト化バージョン（ＷＯ９６／４０２１０）と同様に既に早い段階で公開されている（米国特許第５，５５８，８６４号；ＥＰ ０５３１ ４７２）。しかしこれらのアプローチは、上記抗体のキメラおよびヒト化バージョンをマウス型から標準の手法により調製することによって、免疫原性の減少をもたらしている。これらの教示のいずれも、タンパク質の免疫原特性に対するＴ細胞エピトープの重要性を認識するものではないし、本発明のスキームに従って特異的かつ制御されたかたちでこうした特性に直接影響を及ぼすとは考えられていない。
【００１９】
しかしながら、特性の強化された抗ＥＧＦＲ抗体には継続的な需要がある。強化が望まれている点としては、前記治療剤の発現および精製のための別スキームおよび精製の様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）が含まれるが、また特に、免疫グロブリンの生物学的特性における改良も含まれる。ヒトに投与した際のインビボ特性の改善は特に必要である。この点では、ヒトに免疫反応を引き起こす可能性が低減されているか可能性のない抗ＥＧＦＲ抗体、特にＭＡｂ４２５の提供が強く望まれている。
【００２０】
（発明の概要）
本発明は、「抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくはＭＡｂ４２５」の修飾形（潜在的なＴ細胞エピトープの数の低減または除去によって免疫の特性は修正されているもの）を提供する。
【００２１】
本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ結合能力により潜在的なＴ細胞エピトープであるＭＡｂ４２５の１次配列内に識別された配列を開示する。
【００２２】
本発明は、基本的に生物活性に影響することなく、特定のアミノ酸の置換、付加または欠失によって変更されなければならない、本発明による分子の１次配列内の特定の位置も開示する。免疫原性の喪失が生物活性または抗体の特異性／結合活性の喪失と同時にのみ成される場合は、抗体変異体のアミノ酸配列内のさらなる変更によって前記パラメータを回復することが可能である。
【００２３】
本発明は、このような修飾された分子を生産する方法をさらに開示し、とりわけ免疫原性部位を低減するか除去するために変更を必要とするＴ細胞エピトープを識別する方法を開示する。
【００２４】
本発明による修飾された抗ＥＧＦＲ抗体は、対象とするヒトの体内で増加した循環時間を示すことが期待され、慢性または再発性の疾病状態（例えば、多数の兆候の場合）において特に有益であろう。本発明は、インビボで増強された特性を示すと期待される上記抗体タンパク質の修飾形を提供する。修飾された抗ＥＧＲＦ抗体分子は医薬組成物において使用できる。
【００２５】
要約すると、本発明は以下の対象となる事項に関する：
・所与の生物種の免疫系に曝し、免疫原として非修飾の任意の元の抗体と比較したとき、ＥＧＦ受容体（Ｈｅｒ１）に対して実質的に免疫原性がないか、またはその非修飾抗体より免疫原性が低い、前記受容体に対する修飾された抗体またはその断片であって、前記非修飾抗体に由来するペプチドを結合する能力を有するＴ細胞エピトープ配列および／またはＭＨＣアロタイプが、存在しないか、またはその数が非修飾の元の抗体と比較して低減されている、修飾された抗体またはその断片；
・これに応じた特定の修飾された抗体（もともと存在するＴ細胞エピトープがクラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激するか結合する能力を示すＭＨＣクラスＩＩリガンドであるかペプチド配列であるもの）；
・これに応じた特定の修飾された抗体（１〜９個のアミノ酸残基、好ましくは本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれか１つにおいてアミノ酸残基が変更されたもの）；
・これに応じた特定の修飾された抗体（アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換、欠失または付加したもの）；
・これに応じた特定の修飾された抗体（加えて、特定のアミノ酸の通常、さらなる置換、付加または欠失が、前記分子の生物活性を回復するようにされているもの）；
・アミノ酸の変更が、同族体タンパク質配列に関して、および／またはインシリコモデリング技術において行われる、これに応じた修飾された抗体；
・もともとの免疫原性の非修飾抗体が部分的にまたは完全に非ヒト由来の配列を含む、これに応じた修飾された抗体；
・上記もともとの免疫原性の非修飾抗体がＣＤＲ領域の近辺ではないことを除く表面残渣を含むキメラ抗体若しくは非ヒト抗体であり、これらは対応するヒト基準フレームワーク配列（ベニア抗体）由来である、これに応じた修飾された抗体；
・上記もともとの免疫原性の非修飾抗体が、マウスＭＡｂ４２５、好ましくは表５に示す配列のいずれかを含む、これに応じた修飾された抗体；
・上記に特定されるような、修飾された抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列；
・場合により薬学的に受容可能な担体、希釈剤または賦形剤とともに含む、上記に定義された修飾された抗ＥＧＦＲ抗体を含む医薬組成物；
・さらに薬効のある薬剤、好ましくは細胞毒性剤、さらに好ましくは化学療法剤を含む、対応する医薬組成物若しくはそのキット；
・所与の生物種の免疫系に曝し、免疫原として非修飾の任意の元の抗体と比較したとき、ＥＧＦ受容体（Ｈｅｒ１）に対して実質的に免疫原性がないか、またはその非修飾抗体より免疫原性が低い、前記受容体に対する修飾された抗体またはその断片の製造方法であって、以下のステップを含む、
製造方法：（ｉ）もともとの免疫原性の非修飾抗体の重鎖および／または軽鎖もしくはその一部のアミノ酸配列を決定すること；（ｉｉ）インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）技術を用いるか生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法により、抗体のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；（ｉｉｉ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いて測定されたペプチドのＭＨＣ分子への結合もしくはペプチド−ＭＨＣ複合体のＴ細胞への結合により示されるＴ細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内において１つまたは複数のアミノ酸が修飾（変更）された新規な配列変異体を設計すること；（ｉｖ）組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構成し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること；および（ｖ）場合によってはステップ（ｉｉ）〜（ｉｖ）を繰り返す。；
・ステップ（ｉｉｉ）が本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基の置換、付加または欠失により行われ、任意に同族体タンパク質配列に関して、および／またはインシリコモデリング技術において行われる、これに応じた特定の方法；
・これに応じた特定の方法であって、ステップ（ｉｉ）が以下のステップ：（ａ）既知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；（ｂ）予め定義した均一サイズを有し、少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される重複したアミノ酸残基セグメントを選択された領域から連続的にサンプリングすること；（ｃ）サンプリングされた前記セグメント中に存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対し割り当てられた値を合計することにより、サンプリングされた前記セグメントの各々についてＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および（ｄ）実質的にペプチドの治療上の有用性を低減させずに、ペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合スコア全体を変更するために、そのセグメントについて計算されたＭＨＣクラスＩＩ結合スコアに基づいて、修飾に適した前記セグメントの少なくとも１つを識別することにより実行される；
・ステップ（ｃ）が、１２−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンド立体構造のエネルギー項を含むように修飾されたベームスコアリング関数（Ｂｏｅｈｍ ｓｃｏｒｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用い、（１）ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；（２）前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；（３）前記第１のデータベースからモデルを選択すること；（４）前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；（５）サンプリングされた各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；（６）サンプリングされた各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること；および前記各モデルと各骨格についてステップ（１）〜（５）を繰り返すことによって実行する、これに応じた特定の方法；
・部分的にまたは完全に非ヒト由来の配列を含む、もともとの免疫原性の非修飾抗体が用いられる、これに応じた特定の方法；
・上記もともとの免疫原性の非修飾抗体がＣＤＲ領域の近辺ではないことを除く表面残渣を含むキメラ抗体若しくは非ヒト抗体であり、これらは対応するヒト基準フレームワーク配列（張り合わせ抗体）由来である、これに応じた特定の方法；
・上記もともとの免疫原性の非修飾抗体が、マウス抗体、好ましくはマウスＭＡｂ４２５である、これに応じた特定の方法；
・上記１３ｍｅｒのＴ細胞エピトープペプチドのうち少なくとも９個の連続するアミノ酸残基ペプチドである、１３ｍｅｒのＴ細胞エピトープペプチドの使用方法であって、潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有し、さらに、免疫原性非修飾抗体から、インビボにて使用した時に上記非修飾抗体と比較して、免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性である免疫原性修飾抗体の製造のためにもたらされ、各抗体は上記および請求項において特定される。
【００２６】
修飾された本発明における抗ＥＧＦＲ抗体をもたらす本発明の一般的な方法は、次のステップを含む：
（ａ）ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を決定すること；
（ｂ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法により免疫グロブリンのアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
（ｃ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定したＴ細胞エピトープ活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内の１つまたは複数のアミノ酸を用いて新規な配列変異体を設計する。このような配列変異体は、そのような新しい潜在的なＴ細胞エピトープが、設計毎に、Ｔ細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように修飾されないのであれば、配列変化によって新しい潜在的なＴ細胞エピトープの生成を回避する方法で作成される。そして、（ｄ）組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体をよく知られた組換えＤＮＡ技術によって試験する。
【００２７】
ステップ（ｂ）による潜在的なＴ細胞エピトープの識別は従来法によって実行することができる。適当な方法はＷＯ ９８／５９２４４；ＷＯ ９８／５２９７６；ＷＯ ００／３４３１７に開示されており、Ｍａｂ４２５から誘導されるペプチドのＭＨＣクラスＩＩ分子への結合性向を識別するために好適に使用できる。
【００２８】
実際上、多数の異なる抗ＥＧＦＲ免疫グロブリン、好ましくはＭＡｂ４２５が生産され、所望の免疫特性および機能特性に関して試験される。抗体断片の化学合成を含む他の操作手順も考え得るが、最も好ましくは変異体抗体は組換えＤＮＡ技術によって生産される。
【００２９】
本発明は、１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープ活性の実質的な低減またはタンパク質からの除去をもたらす位置で少なくとも１つのアミノ酸残基を置換した抗体類似体に関する。表１に識別された潜在的なＭＨＣクラスＩＩリガンドのうちのいずれかの特定のポイントにおいて、１または複数のアミノ酸置換を行うことで、ヒト宿主に治療剤として投与した際、低減された免疫原の可能性を有するＭＡｂ４２５をもたらすことができる。好ましくは、アミノ酸置換は、Ｔ細胞エピトープの活性の実質的な低減または除去を達成すると予想されるペプチド配列内の適切なポイントで行われる。実際上、適切なポイントは、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝内に与えられるポケットのうちの１つにおいて結合するアミノ酸残基と一致することが好ましいであろう。
【００３０】
ペプチドのいわゆるＰ１またはＰ１アンカー位置で溝の第１のポケット内に結合するものを変更することが最も好ましい。ペプチドのＰ１アンカー残基と、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝第１ポケットとの間の結合相互作用の特性は、ペプチド全体に対する総合的な結合親和性の主な決定要素であると認められる。ペプチドのこの位置での適切な置換は、ポケット内にはより収容されにくい残基のためであり、例えばより親水性の大きな残基への置換である。ＭＨＣ結合溝内の他のポケット領域内での結合と同等な位置でのペプチド中のアミノ酸残基も考慮され、本発明の範囲に入る。
【００３１】
所与の潜在的Ｔ細胞エピトープ内の単一のアミノ酸置換が、エピトープ除去の最も好ましいルートであることが理解される。単一のエピトープ内での置換の組合せも考えられ、例えば、個別に定義されたエピトープが互いに重複する場合には特に適切になものとなり得る。さらに、所与のエピトープ内における単一のアミノ酸置換または単一のエピトープ内における置換の組合せは、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝に関して「ポケットペプチド」と同等な位置でなくともペプチド配列内のどのポイントでされていてもよい。置換は、同族体構造に関してか当技術分野で知られたインシリコ技術を用いて生成する構造的方法で行われてもよいし、本発明による分子の公知の構造上の特徴に基づくものでもよい。そのような置換はすべて本発明の範囲内に入る。
【００３２】
特に、リストに挙げたペプチド内で行われた置換と組み合わせて行う場合、上に識別されたペプチド内以外のアミノ酸置換を考えてもよい。例えば、変異体分子の構造や生物活性を回復するために変更を考えることができる。そのような補償的変更および抗ＥＧＦＲ抗体からの特定のアミノ酸残基の除去または付加を含む変更は、所望の活性で、かつ開示するペプチドのうちのいずれかの変化と組み合わせた変異体をもたらし、本発明の範囲内に入る。
【００３３】
本発明の修飾された抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくはＭＡｂ４２５に関する限り、そのような修飾された免疫グロブリンまたはその融合タンパク質の断片を含む組成物ならびに関連する組成物は、本発明の範囲内と考えるべきである。別の実施態様では、本発明は修飾された抗ＥＧＲＦ抗体、好ましくはＭＡｂ４２５をコードする核酸に関する。別の実施態様では、本発明は修飾された免疫グロブリンを使用するヒトの治療方法に関する。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
前述のまたは以下に用いる「より少ないまたは低減された免疫原性」という用語は相対的な用語であり、本発明に従って修飾した抗体と比較した、インビボで同一の種に曝した時のそれぞれの元の抗体（原抗体）の免疫原性に関するものである、という点を指摘しておく必要がある。したがって、原抗体は完全に非ヒト抗体、例えばマウスまたはラットの抗体でもよい。しかし、本発明は、さらに、ヒトの配列を既に含む抗体、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体にも関する。従来の基本的な方法によって得られた、これらの人工的に設計された抗体においては、まだ免疫原性を有する１次構造内の配列が存在する。こうしたキメラ変型またはヒト化変型をよく知られた方法により生成する一方で、新たなＴ−細胞エピトープが生成されることもあり得る。たとえ完全にヒトの抗体またはその断片でも、遺伝的、免疫学的に異なるパターンを有するある種のヒト個体または個体集団に対しては免疫原性を示す可能性がある。「キメラ抗体」という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるが、一方でこれらの鎖の残部は、他の種に由来するか、または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびに、所望の生物活性を示す限り、これらの抗体の断片における対応する配列と同一または相同である抗体を意味する。（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４））。キメラ抗体およびヒト化抗体を生成する方法は、当技術分野で知られている。例えば、キメラ抗体の作成方法として、Ｂｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）およびＣａｂｉｌｌｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）による特許（米国特許第４，８１６，３９７号；米国特許第４，８１６，５６７号）に記載されたものが挙げられる。「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限含んだ非ヒト（例えば、げっ歯類動物）キメラ抗体の形態である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲｓ）由来の残基を、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来残基に置き換えたものである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基と置き換えられている。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変領域の実質的に全てを含み、そこでは、超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンに対応し、ＦＲの全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列であるものである。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部をも含むであろう。ヒト化抗体の作成方法は、例えばＷｉｎｔｅｒ（米国特許第５，２２５，５３９号）およびＢｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ、米国特許第４，８１６，３９７号）に記載されている。「抗体断片」は、完全抗体（ｉｎｔａｃｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の一部、好ましくはその抗原結合部位すなわち可変部位を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびＦｃ断片、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、直線状抗体、単一鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体がある。「完全（ｉｎｔａｃｔ）」抗体は、軽鎖定常領域（ＣＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）とともに抗原結合可変領域を含むものである。好ましくは、完全抗体は、１個または複数のエフェクター機能を有する。抗体をパパインにより消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２個の同一の抗原結合断片が生じる。各断片は、単一の抗原結合部位およびＣＬおよびＣＨ１領域、および残りの「Ｆｃ」断片（その名前は、結晶化しやすい能力を反映したものである）を含む。抗体の「Ｆｃ」領域は、一般に、ＣＨ２、ＣＨ３およびＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体主要クラスのヒンジ領域を含んでいる。ペプシン処理することにより、二つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋できる「Ｆ（ａｂ’）２」断片が得られる。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小限の抗体断片である。この領域は、１本の重鎖および１本の軽鎖可変領域の強固な非共有結合の会合による二量体によって構成されている。「単一鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）」すなわち「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬ領域をこれらの領域が単一のペプチド鎖として存在するように含むものである。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、さらにＶＨおよびＶＬ領域間のポリペプチドリンカーを含み、これによりｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。単一鎖ＦＶ抗体は、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｖｏｌ．１１３、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９−３１５（１９９４））、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；米国特許第５，５８７，４５８号；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５、５８７９）またはＳｋｅｒｒａ および Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０３８）により知られている。
【００３５】
「Ｔ−細胞エピトープ」という用語は、本発明においては、ＭＣＨクラスＩＩに結合可能で、Ｔ細胞を刺激するかつ／または（必ずしも測定可能な程度に活性化せずに）ＭＨＣクラスＩＩとの複合体中でＴ細胞に結合可能なアミノ酸配列を意味する。本明細書および添付する特許請求の範囲において「ペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸は、ペプチド結合（以下に定義される）によって互いに連結される。ペプチドの生物学的生産に関わる２０個の異なる天然アミノ酸が存在し、これらが任意の数、任意の順序で連結して、ペプチド鎖または環を形成する。ペプチドの生物学的生産で使用される天然アミノ酸はすべてＬ−配置である。合成ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはこれら２種の異なる配置のアミノ酸の様々な組合せを使用し従来の合成方法を用いて調製できる。ペプチドによっては数単位のアミノ酸しか含まないものもある。短いペプチド、例えば、アミノ酸単位が１０個未満のものは、時に「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは多数のアミノ酸残基、例えば、１００個以上を含み、「ポリペプチド」と呼ばれる。慣例では「ポリペプチド」は、３個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖と考えられ、「オリゴペプチド」は通常、特に「短い」タイプのポリペプチドと見なされる。したがって、本願では、「ポリペプチド」へのどのような言及もオリゴペプチドを含むと理解される。さらに、「ペプチド」へのどのような言及もポリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む。アミノ酸の個々の異なる配置は異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成することができるポリペプチドの数、従って異なるタンパク質の数は、実際上、無制限である。
【００３６】
本発明で用いる「修飾されたタンパク質／抗体」という用語は、Ｔ−細胞エピトープの数が減少し、したがって親タンパク質に比べて、所与の生物種の免疫機構に曝されたときの免疫原性が低減されたタンパク質／抗体をいう。本発明で用いる「非修飾タンパク質」とは、「修飾されたタンパク質」と比較した「親」タンパク質をいい、これは多数のＴ−細胞エピトープを有するので、所与の生物種の免疫機構に曝されたときの免疫原性が修飾されたタンパク質と比較して増強されている。
【００３７】
「アルファ炭素（Ｃα）」はペプチド鎖中に存在する炭素水素（ＣＨ）部分の炭素原子である。「側鎖」は、ペプチドの大きさと比較して著しく変化し得る物理的な大きさを有する、単純なまたは複雑な基または部分を含み得るＣαへのペンダント基である。
【００３８】
以下のパラグラフでは、高い治療的価値を有することが示されたモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体４２５について本発明を詳細に説明する。しかし、本発明はこの抗体およびそのいくつかの存在する形態に限定されるものではなく、他の抗ＥＧＦＲ抗体、とりわけ非常によく似た性質を有するキメラ化抗体２２５にも及ぶ。
【００３９】
特に断らない限り、可変重鎖および軽鎖中のアミノ酸はすべてＫａｂａｔら（１９９１年）（免疫学的に興味のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、米国保健福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ））に従ってナンバリングしている。潜在的なＴ細胞エピトープは、エピトープの最初のアミノ酸を重鎖および軽鎖の最初のアミノ酸から線状に数えて番号を付けている。
【００４０】
１．マウスサブグループフレームワークとの比較
マウス４２５ＶＨ（重鎖）およびＶＫ（軽鎖）のアミノ酸配列を、Ｋａｂａｔマウス重鎖および軽鎖サブグループについてコンセンサス配列と比較した。４２５ＶＨはマウス重鎖サブグループＩＩＢに割り当てることができる。このサブグループのコンセンサス配列との比較により、４２５ＶＨにおける位置９４のセリンが異常であることを示す。この位置での最も一般的な残基はアルギニンである。４２５ＶＫはマウスカッパ鎖サブグループＶＩに割り当てることができる。このサブグループについてのコンセンサス配列との比較により、４２５ＶＫにおける位置４５〜４７、６０および１００での残基がこのサブグループでは異常であることを示す。アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔによって示されたところによる。
【００４１】
２．ヒトフレームワークとの比較
マウス４２５ＶＨ（可変重鎖）およびＶＫ（可変カッパ軽鎖）のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系ＶＨ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ ｅｔ ａｌ．、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８）およびＶＫ（Ｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．、（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４ ８２７−８３６）配列のディレクトリ配列およびヒト生殖細胞系Ｊ領域配列（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．、ｉｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｎ、Ｃｌａｒｋ，Ｍ．ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｔｉｔｌｅｓ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ、ｐｐ１３−４４、１９９１）と比較した。重鎖および軽鎖のマウス４２５配列は、例えば、ＥＰ ０５３１ ４７２で得られる。
【００４２】
４２５ＶＨに対し選択される参照ヒトフレームワークは、ヒトＪＨ６を有するＶＨ１ＧＲＲとした。ディレクトリにおけるＶＨ１ＧＲＲ配列は、残基８８で終わっている。したがって、マウス配列の位置９４においては、異常なセリンに対応する残基はない。この生殖細胞系配列は、４アミノ酸を変化させた再配置した成熟抗体遺伝子中に見出された。４２５ＶＫに対し選択される参照ヒトフレームワークは、ヒトＪＫ２を有するＬ６／ｖｇとした。この生殖細胞系配列は、アミノ酸が変更されていない再配置された成熟抗体重鎖中に見出された。
【００４３】
３．「張り合わせ」配列の形成
参照ヒトフレームワーク配列の識別に続いて、４２５ＶＨおよびＶＫフレームワーク内の一定の異なったアミノ酸残基を、ヒト参照フレームワーク配列の対応するアミノ酸に変更した。抗体構造および結合のために重要と考えられる残基はこの方法では除外し変更しなかった。この段階で保持されたマウス残基は大部分、非表面性の埋没残基で、例えばＮ−末端の残基（これは最終抗体（１〜８アミノ酸残基、好ましくは１〜５アミノ酸残基）中のＣＤＲに近い）から離れている。この方法により、表面の残基が主としてヒト性となり埋没残基が元のマウス配列内となるので「張り合わせ」（「ｖｅｎｅｅｒｅｄ」）抗体に広く類似した配列を生じる。
【００４４】
４．ペプチドスレッディング分析
マウスおよび張り合わせ４２５ＶＨおよびＶＫ配列を本発明による方法を用いて分析した。アミノ酸配列はすべての可能な１３ｍｅｒに分割する。引き続いて、１３ｍｅｒペプチドをＨＬＡ−ＤＲアロタイプ結合溝モデルに提示し、各対立遺伝子について各ペプチドに対し結合スコアを割り当てる。ペプチドの各ポケット結合側鎖についてコンホメーションスコアを計算する。このスコアは立体的な重なり、結合溝内のペプチドと残基間に起こり得る水素結合、ペプチドとポケット残基の間の静電的相互作用および優先的な接触に基づく。次いで、各側鎖のコンホメーションを変更し、スコアを再計算する。最も高いコンホメーションスコアを決定し、次いで、結合溝疎水性残基、非溝の親水性残基、および結合溝に嵌まり込む残基の数に基づいて結合スコアを計算する。ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する既知の結合剤であるペプチドは、ほとんど偽陰性のない高い結合スコアを達成する。したがって、この分析でかなりの結合スコアを達成するペプチドは潜在的なＴ細胞エピトープであると考えられる。４２５ＶＨおよび４２５ＶＫペプチドスレッディング分析の結果を表１に示す。潜在的Ｔ細胞エピトープは１３ｍｅｒの最初の残基の線形的な番号により示されている。
【００４５】
【表１】

【００４６】
５．潜在的Ｔ細胞エピトープの除去
置換に用いるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔによる。潜在的Ｔ細胞エピトープは１３ｍｅｒの最初の残基の線形的な番号によって示す。
【００４７】
張り合わせ４２５重鎖可変部位から潜在的Ｔ細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった：
・残基４１（Ｋａｂａｔ番号４１）においてアラニンをプロリンに置換することにより、残基番号３１における潜在的エピトープが除去される。
【００４８】
・残基４５（Ｋａｂａｔ番号４５）においてロイシンをプロリンに置換することにより、残基番号４３における潜在的エピトープが除去される。位置４５におけるプロリンはヒト生殖細胞系ＶＨ配列、ＤＰ５２において見出される。
【００４９】
・残基４８（Ｋａｂａｔ番号４８）においてイソロイシンをアラニンに置換することにより、残基番号４６における潜在的エピトープが除去される。
【００５０】
・残基６８（Ｋａｂａｔ番号６７）においてアラニンをバリンに置換することにより、残基番号５８における潜在的エピトープが除去される。
【００５１】
・残基７０（Ｋａｂａｔ番号６９）においてロイシンをイソロイシンに置換することにより、残基番号６２における潜在的エピトープが除去される。
【００５２】
・残基９１（Ｋａｂａｔ番号８７）においてセリンをトレオニンに置換することにより、残基番号８１および８４における潜在的エピトープが除去される。
【００５３】
張り合わせ４２５軽鎖可変部位から潜在的Ｔ細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった：
・残基３５（Ｋａｂａｔ番号３６）においてチロシンをヒスチジンに置換することにより、残基番号２７における潜在的エピトープが除去される。
【００５４】
・残基５０（Ｋａｂａｔ番号５１）においてトレオニンをアラニンに置換することにより、残基番号４３における潜在的エピトープが除去される。この残基はＣＤＲ２内にある。アラニンはヒトおよびマウスの両方の抗体において、この位置において通常見出される。このエピトープを除去する別の置換は、位置４５（Ｋａｂａｔ番号４６）におけるロイシンのアラニンへの置換である。潜在的エピトープを取り除く保存的置換はない。アラニンはいくつかの抗体で、この位置で見出される。
【００５５】
・残基９４（Ｋａｂａｔ番号９５）においてイソロイシンをプロリンに置換することにより、残基番号９２における潜在的エピトープが除去される。Ｋａｂａｔ残基９５はＣＤＲＬ３内にある。プロリンは、マウスの抗体配列において、通常この位置に存在し、ＣＤＲ外では潜在的エピトープを除去する変更はない。
【００５６】
・残基１０３（Ｋａｂａｔ番号１０４）においてロイシンをバリンに置換することにより、残基番号９３における潜在的エピトープが除去される。
【００５７】
６．脱免疫配列の設計
脱免疫された重鎖および軽鎖可変領域配列を、潜在的なＴ細胞エピトープの除去に必要な変更を参考とし、また抗体構造および結合に肝要と思われるフレームワーク残基を考慮して設計した。張り合わせ配列に基づく脱免疫配列に加え、マウス配列に基づくＶＨおよびＶＫそれぞれについて追加的な配列を設計し、マウスペプチドのスレッディング（ＭｏＰＴ）変型（ｖｅｒｓｉｏｎ）と名付けた。この変型については、Ｔ−細胞エピトープを除去するためにマウス配列に直接変更を行ったが、結合に有害であると考えられないＣＤＲ外の変更のみである。この脱免疫配列変型では表面（Ｂ−細胞）エピトープを除去する試みは行わなかった。
【００５８】
この主要な脱免疫化ＶＨは、上記第５項における１〜６の置換を含み、潜在的Ｔ細胞エピトープは含まない。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するために、さらに４個の脱免疫化ＶＨ配列を設計した。主要な脱免疫化配列（４２５ ＶＨｌＧＲＲ−ＶＨ−ｖ１）に行われた累積的な変更および残っている潜在的なＴ細胞エピトープを表２に詳しく示す。マウスのスレッディング変型を比較のために含む。
【００５９】
【表２】

【００６０】
主要な脱免疫化ＶＫは上記第５項における１〜４の置換を含み、潜在的Ｔ細胞エピトープは含まない。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するために、さらに４個の脱免疫化ＶＫ配列を設計した。変型２は、同じ潜在的Ｔ細胞エピトープを別の置換で除去した変型１の代替物である。主要な脱免疫化配列（４２５ Ｌ６−ｖｇ−ＶＫ−ｖ１）に行われた累積的な変更および残っている潜在的なＴ細胞エピトープを表３に詳しく示す。マウスのスレッディング変型を比較のために含む。
【００６１】
【表３】

【００６２】
【表４】

【００６３】
【表５】

【００６４】
【表６】

【００６５】
既に述べたように、本発明による修飾された抗ＥＧＦＲ抗体好ましくはＭＡｂ４２５は、好ましくは癌治療用の医薬組成物および医薬キットにおいて使用できる。「癌」および「腫瘍」は、典型的には無秩序な細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的症状を指すか述べるものである。本発明の医薬組成物によって、胸部、心臓、肺、小腸、大腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部および頚部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、頚部および肝臓の腫瘍等を治療することができる。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、本発明の併用療法（「補助療法」）に伴う副作用を低減または回避する薬剤を含み得る。こうした薬剤としては、例えば抗癌剤の毒性を緩和する薬剤、例えば骨吸収阻害剤、心保護（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記補助剤は、化学療法、放射線療法または手術に伴う嘔気嘔吐の発生を防止するか低減し、骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）抗癌剤の投与に伴う感染の発生を低減する。補助剤は当技術分野においてよく知られている。本発明による修飾された抗体は、ＢＣＧおよび他の免疫系刺激剤などの補助剤とともに投与してもよい。さらに、組成物は、細胞毒として有効な放射標識同位体または他の細胞毒性剤、例えば、細胞毒ペプチド（例えばサイトカイン）や細胞毒性薬などを含む上記の化学療法剤を含んでもよい。腫瘍または腫瘍の転移を治療する薬剤キットは、パッケージおよび一般的には腫瘍および腫瘍転移の治療における試薬の用い方についての指示に言及している。本発明のキット試薬は、典型的にはここで述べるように治療的組成物として製剤され、したがってキットにおける分配に適した種々の形態をとり得る。その形態とは、液体、紛体、錠剤、懸濁液などの、本発明のアンタゴニストおよび／または融合タンパク質を提供する形態を含むものである。試薬は、本発明に従って別々に投与するのに適した別々の容器で提供されてもよいし、あるいはパッケージ中の単一容器内の組成物として組み合わせて提供されてもよい。パッケージは、ここで述べる治療方法に従って１回または複数回分の用量に十分な量の試薬を含む。本発明のキットは、パッケージに含まれる物質の「使用方法」をも含む。薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤およびこれらの文法的変種は、吐き気、めまい、胃のむかつき等の望ましくない生理的効果を生じないで哺乳動物に対し投与することができる物質である。
【００６７】
活性成分が溶解または分散している薬理学的組成物の調製は、この分野においてよく知られており、処方に基づいて限定される必要はない。典型的には、そのような組成物は液体溶液または懸濁液の注射剤として調製されるが、使用に先立って液体中の溶液または懸濁液にするのに適した固体形態として調製することもできる。調製は乳化によることもできる。活性成分は製薬上許容でき、活性成分と適合するような、ここで述べる治療方法に用いるのに適した量の賦形剤と共に混合することができる。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびこれらの組合せである。さらに、もし必要であれば、組成物は、保湿剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の活性成分の効果を増加させるような少量の補助的な物質を含むことができる。本発明の治療用組成物は、成分の製薬上許容可能な塩を含むことができる。
【００６８】
典型的には、治療上効果のある量の抗ＥＧＦＲ抗体とは、生理学的に耐え得る組成物として投与された時、血漿中濃度が約０．０１マイクログラム（μｇ）／ミリリットル（ｍｌ）から約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌであり、通常は約５μｇ／ｍｌを達成するのに十分な量である。言い換えれば、投与量は、１日に１回または複数回を１日から数日間の投与で、約０．１ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇまで、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで変更できる。一般的には、本発明の免疫原として修飾された抗体を対応する非修飾型に代えて用いた場合、上記の少な目の用量を適用して、同じ効果を示すことができる。
【００６９】
例えば化学療法剤を用いる併用療法が必要か、または推奨される場合は、そのような活性成分の典型的用量は、１日当たりキログラム体重につき１０ｍｇから１０００ｍｇ、好ましくは約２０ｍｇから２００ｍｇ、さらに好ましくは５０ｍｇから１００ｍｇである。
【００７０】
以下の実施例は、本発明に従って、非修飾免疫原性を有する元の抗体上に存在するＴ−細胞エピトープを識別する方法を一般的に説明する。しかし、このエピトープ配列の識別は上記に特定した知られた方法により実施することができる。
【００７１】
（実施例）
タンパク質、ポリペプチドまたは免疫グロブリンの全体的構造を決定するのに重要な役割を果たす要因は多数存在する。第１に、ペプチド結合、アミノ酸を鎖状に互いに連結するその結合は、共有結合である。この結合は平面構造であり実質的に置換アミドである。「アミド」は−ＣＯＮＨ−基を含む有機化合物の任意の基である。
隣接アミノ酸のＣαを連結する平面状ペプチド結合は以下に示すように表すことができる：
【００７２】
【化１】

【００７３】
Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子は比較的剛性な平面内にあるので、これらの軸の周りに自由な回転は生じない。このため、破線によって模式的に描いた平面は時として「アミド平面」または「ペプチド平面」と呼ばれ、この平面にはペプチド骨格の酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）および水素（Ｈ）原子が載る。このアミド平面の相対する両隅にはＣα原子が位置する。ペプチド平面すなわちアミド平面内では、Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子の周りの回転が実質的にないので、ポリペプチド鎖はＣα原子を連結する一連の平面状ペプチド結合を含む。
【００７４】
ポリペプチドまたはタンパク質の全体構造または立体構造を規定する上で重要な役割を果たす第２の要因は、共通なＣα連結の周りの各アミド平面の回転角である。「回転角」および「ねじり角」という用語は以下では同義語と見なされる。アミド平面にＯ、Ｃ、ＮおよびＨ原子が載ると仮定すると（立体構造によってはこれらの原子のうちいくつかは平面から若干ずれるかもしれないが、これは通常有効な仮定である）、これらの回転角はＮとＲポリペプチドの骨格の立体構造、つまり隣接残基間に存する構造を定義する。これらの２つの角度はφおよびψとして知られている。したがって、１組の角度、φ_iおよびψ_i（ここで添字ｉはポリペプチド鎖の特定の残基を表す）はポリペプチドの２次構造を有効に規定する。角度φおよびψを定義するのに使用される慣用規則、すなわち、所与のポリペプチドについてのアミド平面が角度０を形成する参照ポイント、並びに角度φの定義および角度ψの定義は、文献に定義される。例えば、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２３：２８３−４３７（１９６８）、特に２８５−９４ページ参照（これらのページは言及によって本願に組み込まれる）。
【００７５】
本発明の方法は任意のタンパク質に適用することができ、ヒトでは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合溝の主要なポケット１アンカー位置が、特定のアミノ酸側鎖に対してよく設計された特異性を有するという発見に部分的に基づいている。このポケットの特異性は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータ鎖の位置８６でのアミノ酸の同一性によって決定される。このサイトはポケット１の底に位置し、このポケットに収容され得る側鎖の大きさを決定する。Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｗ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：４９４６−４９５６（１９９４）。この残基がグリシンである場合、すべての疎水性脂肪族および芳香族アミノ酸（疎水性脂肪族は以下のものである：バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン、また芳香族は以下のものである：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン）は、ポケット内に収容され得る（芳香族側鎖が優先される）。このポケット残基がバリンである場合、このアミノ酸側鎖はポケット内部に突出するので、収容できるペプチド側鎖のサイズを制限する（例えば疎水性脂肪族側鎖だけが収容可能である）。したがって、アミノ酸残基配列において、疎水性脂肪族および芳香族側鎖を有するアミノ酸が存在する場合にはいつでも、ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープが存在する可能性がある。しかし、側鎖が疎水性脂肪族である場合は、芳香族側鎖の場合と比較して、（全人口において、ポケット１タイプの分布がほぼ均一であると定すれば）Ｔ細胞エピトープに関連する可能性はおよそ２倍である。
【００７６】
本発明を具体化する計算方法は、以下のようにＴ細胞エピトープを含むペプチド領域の可能性を特徴づける：
（１）予め定義した長さのペプチドセグメントの１次配列を走査し、存在する疎水性脂肪族と芳香族側鎖をすべて識別する。（２）疎水性脂肪族側鎖には芳香族側鎖用のそれより大きな値、好ましくは芳香族側鎖に割り当てる値の約２倍を割り当てる（例えば、疎水性脂肪族側鎖に対しては値２を、芳香族側鎖に対しては値１を割り当てる）。（３）ペプチド内の予め定義した一定の長さの各重複するアミノ酸残基セグメント（ウィンドウ）について存在が決定された値を合計し、特定のセグメント（ウィンドウ）に対する値の合計を、セグメント（ウィンドウ）の中間位置で単一のアミノ酸残基、好ましくは、サンプリングされたセグメント（ウィンドウ）の中間点付近の残基に割り当てる。この手続きを、サンプリングされた各重複するアミノ酸残基セグメント（ウィンドウ）について繰り返す。したがって、ペプチドの各アミノ酸残基は、特定のセグメント（ウィンドウ）内に存在するＴ細胞エピトープの可能性に関係のある値を割り当てられる。（４）上記ステップ３に記載するように計算し割り当てた値は、評価するアミノ酸残基配列全体のアミノ酸座標に対してプロットすることができる。（５）予め定義した値（例えば値１）のスコアを有する配列のすべての部分は、Ｔ細胞エピトープを含むと認められ、必要であれば、修飾することができる。本発明のこの特定の実施態様は、Ｔ細胞エピトープを含むであろうペプチド領域を記述できる一般的な方法を提供する。これらの領域内のペプチドに対する修飾は、ＭＨＣクラスＩＩ結合特性を修飾する可能性を有する。
【００７７】
本発明の別の実施態様によれば、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子モデルによりペプチドの相互作用を考慮に入れたより精巧な計算方法を使用して、Ｔ細胞エピトープをより高精度で予想できる。特にこの実施態様によるペプチド内に存在するＴ細胞エピトープの計算上の予想では、すべての公知のＭＨＣクラスＩＩ分子の構造に基づく少なくとも４２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のモデルの構築が考えられ、Ｔ細胞エピトープの計算による識別におけるこれらのモデルの使用、相対的なペプチド骨格アルファ炭素（Ｃα）位置の知られた変わりやすさを考慮に入れるための各モデルのペプチド骨格のライブラリーの構築、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との間の相互作用において重要な位置での２０個のアミノ酸置換各々のための各モデルを備えた各骨格ドック（ｄｏｃｋ）のアミノ酸側鎖コンホメーションのライブラリーの構築、および特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容（ｄｏｃｋ）された特定のペプチドについての最適な骨格および側鎖コンホメーション選択のための、これら骨格および側鎖コンホメーションライブラリーの使用、並びにこの相互作用からの結合スコアの誘導が考えられる。
【００７８】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のモデルは相同モデリングによって、ブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンク（「ＰＤＢ」）で見出された多数の同様の構造から誘導できる。これらは、エネルギー最小化のためのＣＨＡＲＭｍ力場（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ．から入手可能）と共に、シミュレートされたアニーリング機能を組み込んだ半自動的な相同モデリングソフトウェア（Ｍｏｄｅｌｌｅｒ，Ｓａｌｉ Ａ．＆ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ＴＬ．、１９９３．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２３４：７７９−８１５）によって形成できる。別のモデリング方法も同様に利用できる。
【００７９】
本願の方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の小さな集合について結合溝内の各位置での各アミノ酸選択肢の実験により得た結合データのライブラリーを使用する他の計算方法（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｗ．、ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、１（３）：１５７−１６２）（１９９５）や溝内の特定タイプの結合ポケットの結合特性を定義するために実験による同様の結合データを使用し（ここでもまたＭＨＣクラスＩＩ分子の比較的小さな部分集合を使用する）次いでこのポケットライブラリーからポケットタイプを「混合およびマッチング」して人為的に別の「仮想的な」ＭＨＣクラスＩＩ分子を生成するさらに別の計算方法（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ Ｔ．、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、１７（６）：５５５−５６１（１９９９）と著しく異なる。先行技術は両方とも分析が複雑である点および多数のペプチド変異体を合成する必要がある点の不利益を被り、少数のＭＨＣクラスＩＩ分子しか実験的に走査できない。したがって、第１の先行技術の方法は少数のＭＨＣクラスＩＩ分子の予想しかできない。第２の先行技術の方法は、異なるクラスＩＩ対立遺伝子間においては、１個の分子中で類似したアミノ酸で裏打ちされているポケットは同じ結合特性を持つという仮定も前提としており、ポケットライブラリーに含まれるポケットを含むそうしたＭＨＣクラスＩＩ分子だけが「仮想的に」生成されるという欠点をさらに有する。本明細書に述べるモデリング手法を使用すれば、任意の数およびタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子の構造を推定でき、したがって全集団を代表する対立遺伝子を特異的に選択できる。さらに、走査されるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は、複雑な実験によって追加データを生成する必要以上にさらにモデルを生成することにより増加させることができる。
【００８０】
骨格ライブラリーの使用により、走査されている様々なペプチドについて、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容された時のＣα原子位置における変化を考慮に入れることができる。この点もまた、上記の先行技術における計算方法（これらは特定のポケット中でアミノ酸結合を走査するため単純化されたペプチド骨格の使用に依存している）と対照的である。これらの単純化された骨格は、「実際の」ペプチドで見つかる骨格構成の代表ではないであろうし、その結果、ペプチド結合の予想が不正確になる。本発明の骨格ライブラリーは、タンパク質データバンク内で見出されるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するすべてのペプチドの骨格を重ね、結合溝内に位置する１１個のアミノ酸各々のＣα原子間の２乗平均平方根（ＲＭＳ）偏差を記録することにより生成される。このライブラリーは、より大きな変動の可能性までも考慮に入れるために、少数（現在１３個）の適切な利用可能なマウスおよびヒト構造から誘導できる一方、各Ｃ”−αについてのＲＭＳ数値は、５０％増加する。その後、各アミノ酸の平均のＣα位置が決定され、その半径がその位置でのＲＭＳ偏差プラス５０％と等しい球がこの点のまわりに描かれる。この球体は許容されるＣα位置をすべて表す。
【００８１】
最小のＲＭＳ偏差を有するＣα（これは、上記のポケット１中のアミノ酸であり、結合溝中の１１個の残基の位置２と等価である）を動かして、球体は３次元的にグリッド化され、次いでグリッド内の各頂点はそのアミノ酸のＣαのために可能な位置として使用される。結果として得られるアミド平面は、引き続きアミノ酸へのペプチド結合に対応し、これらのＣαの各々にグラフトされ、次のＣαを位置付けるためにφおよびψ角を所定の間隔で回転させる。引き続きＣαがＣαに対して「許容される位置の球」内にある場合にはジペプチドの向きが許容され、それが球の外部になる場合には、ジペプチドは拒絶される。その後、先行するＣαのあらゆる組合せから９個の後続Ｃαがすべて位置付けられるまで、ペプチドがポケット１ Ｃα「種子」から成長するように後続Ｃα位置の各々についてこのプロセスを繰り返す。次いで、ポケット１の前の単一Ｃαについてこのプロセスをもう一度繰り返して結合溝内に位置する骨格Ｃα位置のライブラリーを生成する。
【００８２】
生成された骨格の数はいくつかの要因に依存する：「許容される位置の球」の大きさ；ポケット１位置の「１次球」のグリッドの精密さ；後続Ｃαを位置付けるために用いるφおよびψの段階的回転角の精密さ。このプロセスを使用すると、大きな骨格ライブラリーを生成できる。骨格ライブラリーが大きい程、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝内の特定のペプチドに対して最もよく適合するものが見つかる可能性は大きくなる。各対立遺伝子について、結合領域のアミノ酸との衝突により、必ずしもすべての骨格がＭＨＣクラスＩＩ分子のすべてのモデルに収容されるのには適さないため、その対立遺伝子によって収容され得る骨格を含むライブラリーの部分集合が生成される。骨格ライブラリーの使用は、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルと共に、各許容される骨格に収容される各ＭＨＣクラスＩＩ分子について結合溝の各位置の各アミノ酸の許容される側鎖コンホメーションからなる徹底的なデータベースを作成する。このデータセットは、単純な立体的重なり関数を用いて生成され、ここで、ＭＨＣクラスＩＩ分子は骨格と結合し、アミノ酸側鎖は所望の位置で骨格上にグラフトされる。各々の側鎖の回転可能な結合を設定した間隔で段階的に回転させ、得られる原子位置は注目する結合に依存する。原子と結合溝の側鎖の原子との相互作用が注目され、位置は次の基準によって許容されるか拒絶される：ここまでに位置付けられたすべての原子の重なりの合計は、予め決めた値を超過してはならない。したがって、コンホメーション探索の厳格性は、結合の段階的回転で用いる間隔と全重なりについて予め決めた限界の関数である。特定のポケットが剛性であると知られている場合、この後者の値は小さくなり得るが、ポケット側鎖の位置に比較的柔軟性があると知られている場合は、比較的緩和である。したがって、許容は結合溝ポケット内の柔軟性における変化を模倣するようになすことができる。次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各々に収容された時、このコンホメーション探索を各骨格のすべての位置にあるすべてのアミノ酸について繰り返し、側鎖コンホメーションの徹底的なデータベースを作成する。
【００８３】
適切な数式を用いて、上記骨格／側鎖コンホメーションの大きなデータベースの走査により経験的に導き出さなければならないペプチドリガンドコンホメーションと組み合うＭＨＣクラスＩＩ分子モデル間の結合エネルギーを評価する。したがって、９〜２０アミノ酸の範囲で長さが変化する（もっとも、長さは各走査に対しては一定にしておく）可能なペプチドに、以下の計算を施すことにより、タンパク質を潜在的なＴ細胞エピトープについて走査する：ＭＨＣクラスＩＩ分子をその分子に許容されるペプチド骨格とともに選択し、所望のペプチド配列に対応する側鎖をグラフトする。骨格上の特定の位置での原子の識別および特定の側鎖に関する原子間距離データを、そのアミノ酸の許容される各コンホメーションについて集める（上記データベースから得られる）。これを骨格に沿って各側鎖に対して繰り返し、スコアリング関数を用いてペプチドスコアを導く。その骨格のための最良のスコアを保持し、選択されたモデルについて各許容される骨格に対してこのプロセスを繰り返す。すべての許容される骨格から得られたスコアを比較し、最高のスコアをそのＭＨＣクラスＩＩモデル中の所望のペプチドについてのペプチドスコアであると見なす。次いで、このプロセスを、走査されているタンパク質に由来するあらゆる可能なペプチドを備えた各モデルについて繰り返し、ペプチド対モデルのスコアを表示する。
【００８４】
本発明の状況では、結合親和性計算のために提示される各リガンドは、上に議論されるようなペプチドまたはタンパク質から選択されるアミノ酸断片である。したがって、リガンドは、公知の配列のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られ、長さがおよそ９〜２０個のアミノ酸である選択されたアミノ酸伸張物である。「アミノ酸」および「残基」という用語は以下においては同義語と見なされる。リガンドは、骨格ライブラリーから得た骨格上にグラフトされて検査されるペプチドの連続アミノ酸の形をしており、ペプチド骨格のＣ”−α原子の座標を介して、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルライブラリーから得られるＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝中に位置し、各側鎖に対して許容されるコンホメーションは許容されるコンホメーションデータベースから選択される。関連する原子同一性および原子間距離もこのデータベースから検索し、ペプチド結合スコアを計算するために使用する。ＭＨＣクラスＩＩ結合ポケットへの高い結合親和性を備えたリガンドには、部位指図突然変異生成に対する候補としてフラグが立てられる。フラグが立てられたリガンド（したがって対象タンパク質）でアミノ酸置換を行い、これはその後、結合親和性を予め定義した閾値以下に低減する変更を決定するためにスコアリング関数を使用して再試験する。次いで、これらの変更を対象タンパク質に組み入れ、Ｔ細胞エピトープを除去する。
【００８５】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチドリガンドと結合溝の間は、非共有結合性の相互作用（水素結合、静電気的相互作用、疎水性（親油性）相互作用およびファンデアワールス相互作用を含むが、これらに限定されない）を含む。これらは、以下に詳細に述べるペプチドスコアリング関数に含まれている。水素結合は極性または帯電基間で形成され得るもので、２つの他の原子によって共有された水素原子からなる非共有結合であることが理解されるべきである。水素受容体が部分的に負帯電を有する一方で、水素供与体の水素は正電荷を有する。
【００８６】
ペプチド／タンパク質相互作用のために、水素結合供与体は、水素と結合した窒素または酸素もしくは窒素に結合した水素のいずれでもよい。水素結合受容体原子は水素と結合していない酸素、水素が全く結合しておらず１個か２個の結合がある窒素、または１つの結合のみある硫黄でもよい。水素を結合した酸素またはイミン窒素（例えばＣ＝ＮＨ−）などのある種の原子は、水素受容体とも供与体ともなり得る。水素結合エネルギーは３〜７ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり、ファンデアワールス結合よりはるかに強いが共有結合よりは弱い。
【００８７】
水素結合はまた指向性が強く、供与体原子、水素原子および受容体原子が同一直線上にある場合に最も強い。静電的結合は反対荷電のイオン対間で形成され、相互作用の強さはクーロンの法則による原子間の距離の二乗に反比例する。イオン対間の最適距離は約２．８Åである。タンパク質／ペプチド相互作用では、静電的結合がアルギニン、ヒスチジンまたはリジンとアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩との間で形成され得る。それらは水素結合と強さがほぼ似ているが、結合の強さはイオン化基のｐＫａおよび媒体の誘電率に依存するであろう。
【００８８】
親油性（脂肪親和性）相互作用は、タンパク質とペプチドリガンド間に生じる良好な疎水性−疎水性接触である。通常、これらは結合溝のポケット内に埋没したペプチドの疎水性アミノ酸側鎖間に、それらが溶媒に露出しないように生じる。疎水性残基の溶媒への露出は、周囲の溶分子が互いに水素結合を強いられ、かご状のクラスレート構造を形成するので非常に不利である。結果として生じるエントロピーの減少は非常に不利である。脂肪親和性の強い原子は、極性でもなく水素受容体でもない硫黄や非極性の炭素原子などである。
【００８９】
ファンデアワールス結合は３〜４Å離れた原子間で見られる非特異的な結合である。これは水素結合や静電的結合より弱く特異性も低い。原子のまわりの電荷分布は時間とともに変化し、どの瞬間でも、電荷分布は対称ではない。電荷分布におけるこの一時的な非対称性は、近隣の原子にも同様の非対称性を引き起こす。この結果生じる原子間引力は、ファンデアワールス接触距離で最大に達するが、約２Å〜約１Åに至ると非常に急速に低減する。逆に、原子間の隔たりが接触距離未満になるとともに、原子の外殻電子雲が重なるため、強い斥力が支配的になる。引力は静電的結合や水素結合に比べて比較的弱いが（約０．６Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、斥力は特に、ペプチドリガンドがタンパク質に成功裡に結合するかどうか決する上で非常に重要であろう。
【００９０】
１つの実施形態では、ベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ１手法）が結合定数を評価するために使用される（Ｂｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、８（３）：２４３−２５６（１９９４）、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる）。別の実施形態では、スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ２手法）が、Ｔ細胞エピトープを含むリガンドの指標として結合親和力を評価するために使用される（Ｂｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、１２（４）：３０９−３２３（１９９８）、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる）。しかし、上記の文献に記述されているベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数は、タンパク質へのリガンドの結合親和力を評価するために使用されるが、この場合、リガンドがタンパク質に成功裡に結合することが既に知られており、タンパク質／リガンド複合体はその構造が解明されタンパク質データバンク（「ＰＤＢ」）の中に存在するものである。したがって、スコアリング関数は、陽性であることが知られた結合データを利用して開発されている。陽性および陰性バインダー間の区別を考慮に入れるために、方程式に反発項を加えなければならない。さらに、結合エネルギーのより満足な評価は、上記のベーム（Ｂｏｅｈｍ）関数の領域ベースのエネルギー項を用いるのではなく対同士の方法で脂肪親和性の強い相互作用を計算することで達成される。したがって、好ましい実施形態では、結合エネルギーは修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数を使用して評価される。修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数では、タンパク質とリガンド間の結合エネルギー（ΔＧ_bind）は、以下のパラメーターを考慮して評価される：リガンド（ΔＧ_o）の並進エントロピーと回転エントロピーの全面的な喪失による結合エネルギーの低減；少なくとも１個のパートナーが中性である、理想的な水素結合からの寄与（ΔＧ_hb）；摂動のないイオン間相互作用（ΔＧ_ionic）からの寄与；脂肪親和性リガンド原子と脂肪親和性受容体原子の間の脂肪親和性相互作用（ΔＧ_lipo）；リガンド中の内部自由度の凍結による結合エネルギーの喪失、つまり、各Ｃ−Ｃ結合の周りの回転自由度が低減する（ΔＧ_rot）；タンパク質とリガンド間の相互作用エネルギー（Ｅ_vdW）。これらの項を考慮すると方程式１が与えられる：
（ΔＧ_bind）＝（ΔＧ_o）＋（ΔＧ_hbｘＮ_hb）＋（ΔＧ_ionicｘＮ_ionic）＋（ΔＧ_lipoｘＮ_lipo）＋（ΔＧ_rot＋Ｎ_rot）＋（Ｅ_vdW）
式中、Ｎは特定の項の相互作用を特徴付ける数であり、１つの実施形態では、ΔＧ_o、ΔＧ_hb、ΔＧ_ionic、ΔＧ_lipoおよびΔＧ_rotは、それぞれ５．４、−４．７、−４．７、−０．１７および１．４の値を与えられる定数である。
【００９１】
Ｎ_hbは方程式２：
Ｎ_hb＝Σ_h-bondsｆ（ΔＲ，Δα）×ｆ（Ｎ_neighb）×ｆ_pcs
によって計算される。
【００９２】
ｆ（ΔＲ，Δα）は、理想状態からの水素結合の大きな偏差を説明し、方程式３によって計算されるペナルティ関数である：
ｆ（ΔＲ，Δ−α）＝ｆ１（ΔＲ）×ｆ２（Δα）
ここで、ｆ１（ΔＲ）＝１（ΔＲ＜＝ＴＯＬの場合）、
または ＝１−（ΔＲ−ＴＯＬ）／０．４（ΔＲ＜＝０．４＋ＴＯＬの場合）、
または ＝０（ΔＲ＞０．４＋ＴＯＬの場合）。
さらに、ｆ２（Δα）＝１（Δα＜３０°の場合）
または ＝１−（Δα−３０）／５０（Δα＜＝８０°の場合）
または ＝０（Δα＞８０°の場合）。
【００９３】
ＴＯＬは水素結合長さ（＝０．２５Å）で許容される偏差、
ΔＲはＨ−Ｏ／Ｎ水素結合長さの理想的な値（＝１．９Å）からの偏差、
Δαは水素結合角度∠_N/O-H,O/Nの理想的な値（＝１８０°）からの偏差、
ｆ（Ｎ_neighb）は、タンパク質表面の凹面と凸面の部分を識別し、したがってタンパク質表面で見られるものではなくポケットで見られる極性相互作用に大きな重みを割り当てる。この関数は下記方程式４：
ｆ（Ｎ_neighb）＝（Ｎ_neighb／Ｎ_neighb,0）α（ここで、α＝０．５）
によって計算される。
【００９４】
Ｎ_neighbは任意の所与のタンパク質原子に５Åより接近している非水素タンパク質原子の数であり、
Ｎ_neighb,0＝定数２５である。
【００９５】
ｆ_pcsは１つの水素結合当たり極性接触表面積を考慮に入れた関数であり、したがって強い水素結合と弱い水素結合を区別し、その値は次の基準によって決定される：
ｆ_pcs＝β（Ａ_polar／Ｎ_HB＜１０Ųの場合）、
またはｆ_pcs＝１（Ａ_polar／Ｎ_HB＞１０Ųの場合）
Ａ_polarはタンパク質リガンド接触表面の大きさであり、
Ｎ_HBは水素結合の数であり、
βは定数＝１．２である。
【００９６】
修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数の実行のためには、イオン相互作用からの寄与、ΔＧ_ionicを上記水素結合からの寄与と同様の方法で計算する（同じ幾何学依存性が仮定されるため）。
【００９７】
Ｎ_lipo項は方程式５によって計算される：
Ｎ_lipo＝Σ_ILｆ（ｒ_IL）
ｆ（ｒ_IL）はすべての脂肪親和性リガンド原子について、１また、すべての脂肪親和性タンパク質原子についてＬであり、以下の基準により計算される：
ｆ（ｒ_IL）＝１（ｒ_IL＜＝Ｒ１ｆ（ｒ_IL）＝（ｒ_IL−Ｒ１）／（Ｒ２−Ｒ１）でＲ２＜ｒ_IL＞Ｒ１の場合、
ｆ（ｒ_IL）＝０（ｒ_IL＞＝Ｒ２の場合）。
【００９８】
ここで、Ｒ１はｒ１^vdw＋ｒ_L ^vdw＋０．５および
Ｒ２＝Ｒ１＋３．０であり、
ｒ１^vdwは、原子１のファンデアワールスの半径であり、
ｒ_L ^vdwは、原子Ｌのファンデアワールスの半径である。
【００９９】
Ｎ_rotはアミノ酸側鎖の回転可能な結合の数であり、非環式のｓｐ³−ｓｐ³結合およびｓｐ³−ｓｐ²結合の数である。末端ＣＨ₃またはＮＨ₃の回転は考慮に入れない。
【０１００】
最後の項Ｅ_vdwは方程式６によって計算される：
Ｅ_vdw＝ε₁ε₂（（ｒ₁ ^vdw＋ｒ₂ ^vdw）¹²／ｒ¹²−（ｒ₁ ^vdw＋ｒ₂ ^vdw）⁶／ｒ⁶）。
【０１０１】
ここでε₁とε₂は原子同一性に依存する定数であり、
ｒ₁ ^vdw＋ｒ₂ ^vdwはファンデアワールスの原子半径であり、
ｒは１対の原子間の距離である。
【０１０２】
方程式６に関して、１つの実施形態では、定数ε₁とε₂はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：０．２４５、Ｎ：０．２８３、Ｏ：０．３１６、Ｓ：０．３１６（つまり、炭素、窒素、酸素および硫黄のそれぞれの原子について）。方程式５および６については、ファンデアワールスの半径はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：１．８５、Ｎ：１．７５、Ｏ：１．６０、Ｓ：２．００Å。
【０１０３】
タンパク質リガンド相互作用についての現時点での理解の制約内ではあるが、上記の方程式に現われるすべての所定の値および定数がすべて決定されることは理解されるべきである（特に本願で試みられている計算のタイプについて）。したがって、このスコアリング関数がさらに精緻化された場合には、これらの値および定数を変更することが可能で、したがって、リガンドへのタンパク質の結合エネルギーを評価する項において所望の結果を与える適当な数値を使用してもよく、したがって、本発明の範囲内である。
【０１０４】
上記のように、スコアリング関数は、側鎖コンホメーション、原子同一性および原子間の距離のデータベースから抽出されたデータに適用される。本発明を説明する目的のために言えば、このデータベースに含まれるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は４２個のモデルと４つの解決された構造である。本発明の計算方法の構築はモジュール化された性質を有するため、新しいモデルを加えペプチド骨格ライブラリーと側鎖コンホメーション関数を用いて走査するだけで、上記のペプチドスコアリング関数によって処理できる追加のデータセットを作成できることは上記の説明から明らかである。これにより、走査されたＭＨＣクラスＩＩ分子のレパートリーを容易に増加させることが可能になり、あるいは、データが入手できる場合には構造および関連データを置き換えて、既存の対立遺伝子のより正確なモデルを作成することができる。
【０１０５】
本発明の予想方法は、様々なＭＨＣクラスＩＩ分子に対する有する親和性が実験的に測定された多数のペプチドを含むデータセットにより較正できる。計算値を実験値と比較することによって、すべての実験的に測定したＴ細胞エピトープが正確に予想されることがわかれば有益性の一端を決定できる。
【０１０６】
利用可能ないくつかの精巧な方法論と比較して、上記のスコアリング関数は比較的単純であるが、計算が非常に急速に実行される、ということが理解されるべきである。また、目的が、選択されたＭＨＣクラスＩＩタンパク質の結合溝に収容される各ペプチドについて真の結合エネルギーそれ自身計算するものではないことも理解されるべきである。根本的な目的は、選択されたタンパク質の１次構造（すなわち、アミノ酸配列）に基づいてＴ細胞エピトープの位置を予想する助けとして相対的な結合エネルギーデータを得ることである。比較的高い結合エネルギー、すなわち選択された閾値以上の結合エネルギーは、リガンド中のＴ細胞エピトープの存在を示唆するだろう。次いで、リガンドに少なくとも１回のアミノ酸置換を施し、結合エネルギーを再計算すればよい。計算が迅速性を有するため、ペプチド配列のこれらの操作はコストに見合う利用可能なコンピューターハードウェアにおいてプログラムのユーザインターフェース内で対話形式に実行できる。したがって、コンピューターハードウェアへの大きな投資は要求されない。
【０１０７】
同じ目的のために他の利用可能なソフトウェアを使用できるかもしれないことは当業者には明白であろう。特に、タンパク質結合サイト内にリガンドをドッキングさせ得るより精巧なソフトウェアを、エネルギー最小化と共に使用してもよい。ドッキングソフトウェアの例は次の通りである：ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６１：２６９−２８８（１９８２））、ＬＵＤＩ（Ｂｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、８：６２３−６３２（１９９４））およびＦＬＥＸＸ（Ｒａｒｅｙ Ｍ．、ｅｔ ａｌ．、ＩＳＭＢ、３：３００−３０８（１９９５））。分子モデリングおよび操作ソフトウェアの例としては：ＡＭＢＥＲ（Ｔｒｉｐｏｓ）およびＣＨＡＲｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）。これらの計算方法の使用は、必要な計算を行うために要求される処理時間の長さにより本発明方法の処理能力を厳しく制限するだろう。しかし、本発明の方法によって「陽性なバインダー」であると判明したペプチドについて結合エネルギーのより正確な計算結果を得るために「第２のスクリーン」として、このような方法を使用し得るというのもあり得ることである。洗練された分子の機械的または分子の動的な計算のための処理時間の制限は、これらの計算を行うソフトウェアの設計およびコンピューターハードウェアの現在の技術制限の両者によって決まる。将来的には、より効率的なコードが書かれ、さらにコンピュータープロセッサー速度の持続的な増加によって、より扱いやすい時間枠内でそのような計算を行うことが実現可能になるかもしれない。巨大分子に適用されるエネルギー関数および折り畳まれたタンパク質構造内で起こる様々な相互作用についての考慮に関するさらに詳しい情報は以下に見られる：Ｂｒｏｏｋｓ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、４：１８７−２１７（１９８３）。一般的なタンパク質−リガンド相互作用に関するさらに詳細な情報は以下に見られる：Ｄａｕｂｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．、ｐｒｏｔｅｉｎｓ４（１）：３１−４７（１９８８）。その内容の全体は言及によって本願に組み入れられる。有用な背景的事項は、例えば以下に見られる：Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．、ｅｄ．、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ：０−３０６ ４３１３−９。

Claims (34)

1. 所与の生物種の免疫系に曝し、免疫原として非修飾の任意の元の抗体と比較したとき、ＥＧＦ受容体（Ｈｅｒ１）に対して実質的に免疫原性がないか、またはその非修飾抗体より免疫原性が低い、前記受容体に対する修飾された抗体またはその断片であって、前記非修飾抗体に由来するペプチドを結合する能力を有するＴ細胞エピトープ配列および／またはＭＨＣアロタイプが、存在しないか、またはその数が非修飾の元の抗体と比較して低減されている、修飾された抗体またはその断片。
2. 前記元より存在するＴ細胞エピトープが、クラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激し、または結合する能力を示すＭＨＣクラスＩＩリガンドまたはペプチド配列である請求項１に記載の修飾された抗体。
3. 元より存在するＴ細胞エピトープ中で１〜９個のアミノ酸残基が変更されている請求項２に記載の修飾された抗体。
4. １個のアミノ酸残基が変更されている請求項３に記載の修飾された抗体。
5. アミノ酸残基の変更が、特定位置における、元より存在するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換である請求項３または４に記載の修飾された抗体。
6. アミノ酸残基の変更が、特定位置における、元より存在するアミノ酸残基の欠失である請求項３または４に記載の修飾された抗体。
7. アミノ酸残基の変更が、特定位置における、元より存在する残基へのアミノ酸残基の追加である請求項３または４に記載の修飾された抗体。
8. 前記分子の生物活性を回復するために、特定のアミノ酸の置換、付加または欠失が、さらに追加して行われる請求項３から７のいずれかに記載の修飾された抗体。
9. アミノ酸の変更が、相同タンパク質配列を参照して行われる、請求項３から７のいずれかに記載の修飾された抗体。
10. アミノ酸の変更が、インシリコモデリング法を参照して行われる、請求項３から７のいずれかに記載の修飾された抗体。
11. 前記元の免疫原として非修飾の抗体が、完全にまたは部分的に非ヒト由来配列を含む請求項１から１０のいずれかに記載の修飾された抗体。
12. 前記元の免疫原として非修飾の抗体がキメラ抗体である請求項１１に記載の修飾された抗体。
13. 前記元の免疫原として非修飾の抗体が、対応するヒト参照フレームワーク配列（張り合わせ抗体）に由来する、ＣＤＲ領域に近くない残基以外の表面残基を含む非ヒト抗体である請求項１１に記載の修飾された抗体。
14. 前記元の免疫原として非修飾の抗体がマウス抗体である請求項１１から１３のいずれかに記載の修飾された抗体。
15. 前記元の抗体がマウスＭＡｂ４２５である請求項１４に記載の修飾された抗体。
16. 表５に表された配列のいずれかを含む請求項１５に記載の修飾されたＭＡｂ４２５。
17. 請求項１から１６のいずれかに記載の修飾された抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列。
18. 薬剤として許容できる担体、希釈剤または賦形剤と共に、請求項１から１６のいずれかにより定義される修飾された抗ＥＧＦＲ抗体を含む薬剤組成物。
19. さらに薬理学的に効果のある薬剤を含む請求項１８に記載の薬剤組成物。
20. 前記薬剤が細胞毒性剤である請求項１９に記載の薬剤組成物。
21. （ｉ）請求項１から１６のいずれかによって定義される少なくとも１種類の免疫原として修飾した抗ＥＧＦＲ抗体を含むパッケージ、および（ｉｉ）少なくとも１種類の他の薬効がある薬剤を含むパッケージを含む薬剤キット。
22. 前記薬剤が細胞毒性剤である請求項２１に記載の薬剤キット。
23. 所与の生物種の免疫系に曝し、免疫原として非修飾の任意の元の抗体と比較したとき、ＥＧＦ受容体（Ｈｅｒ１）に対して実質的に免疫原性がないか、またはその非修飾抗体より免疫原性が低い、前記受容体に対する修飾された抗体またはその断片の製造方法であって、以下のステップを含む：
    （ｉ）もともとの免疫原性の非修飾抗体の重鎖および／または軽鎖もしくはその一部のアミノ酸配列を決定すること；
    （ｉｉ）インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）技術を用いるか生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法により、抗体のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
    （ｉｉｉ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いて測定されたペプチドのＭＨＣ分子への結合もしくはペプチド−ＭＨＣ複合体のＴ細胞への結合により示されるＴ細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内において１つまたは複数のアミノ酸が修飾（変更）された新規な配列変異体を設計すること；
    （ｉｖ）組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構成し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること；および
    （ｖ）場合によってはステップ（ｉｉ）〜（ｉｖ）を繰り返す。
24. ステップ（ｉｉｉ）が、元より存在するＴ細胞エピトープにおける１〜９個のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失により行われる請求項２３に記載の方法。
25. 変更が、相同タンパク質配列および／またはインシリコモデリング法を参照してなされる請求項２３に記載の方法。
26. ステップ（ｉｉ）が、（ａ）既知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；（ｂ）予め定義した均一サイズを有し、少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される重複したアミノ酸残基セグメントを選択された領域から連続的にサンプリングすること；（ｃ）サンプリングされた前記セグメント中に存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対し割り当てられた値を合計することにより、サンプリングされた前記セグメントの各々についてＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および（ｄ）実質的にペプチドの治療上の有用性を低減させずに、ペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合スコア全体を変更するために、そのセグメントについて計算されたＭＨＣクラスＩＩ結合スコアに基づいて、修飾に適した前記セグメントの少なくとも１つを識別することにより実行される、請求項２３から２５のいずれかに記載の方法。
27. ステップ（ｃ）が、１２−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンド立体構造のエネルギー項を含むように修飾されたベームスコアリング関数（Ｂｏｅｈｍ ｓｃｏｒｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用い、（１）ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；（２）前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；（３）前記第１のデータベースからモデルを選択すること；（４）前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；（５）サンプリングされた各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；（６）サンプリングされた各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること；および前記各モデルと各骨格についてステップ（１）〜（５）を繰り返すことによって実行する、請求項２６に記載の方法。
28. 部分的にまたは完全に非ヒト由来の配列を含む、もともとの免疫原性の非修飾抗体が用いられる、請求項２３から２７のいずれかに記載の方法。
29. 前記元の免疫原として非修飾の抗体がキメラ抗体である請求項２８に記載の方法。
30. 前記元の免疫原として非修飾の抗体が、対応するヒト参照フレームワーク配列（張り合わせ抗体）に由来する、ＣＤＲ領域に近くない残基以外の表面残基を含む非ヒト抗体である請求項２８に記載の方法。
31. 前記元の免疫原として非修飾の抗体がマウス抗体である請求項２８から３０に記載の方法。
32. 前記元の抗体が、マウスＭＡｂ４２５である請求項３１に記載の方法。
33. インビボで使用した時に、実質的に非免疫原性であるか、または免疫原として非修飾の抗体よりも免疫原性が低い、免疫原として修飾された抗体を製造するための、潜在的ＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有し、前記非修飾の抗体から作製され、各抗体が請求項１から１６のいずれかによって特定されるものである１３ｍｅｒのＴ細胞エピトープペプチドの使用。
34. インビボで使用した時に、実質的に非免疫原性であるか、または免疫原として非修飾の抗体よりも免疫原性が低い、免疫原として修飾された抗体を製造するための、潜在的ＭＨＣクラスＩＩ結合活性を前記非修飾の抗体から作製され、各抗体が請求項１から１６のいずれかによって特定されるものである１３ｍｅｒのＴ細胞エピトープペプチドの少なくとも９個の連続するペプチド配列の使用。