KR20030074839A - 감소된 면역원성을 갖는 개질 항-ｅｇｆｒ 항체 - Google Patents

감소된 면역원성을 갖는 개질 항-ｅｇｆｒ 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특히 종양에 대한 치료 용도로 특히 인간에게 투여되는 EGF 수용체 (HER 1)에 대한 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 개질된 것이며, 이에 따라 인간 대상에 대해 투여시 면역 반응을 나타내는 항체의 성향을 감소시킨다. 본 발명은 특히 상이한 형태의 항-EGFR 항체 425 및 그의 절편의 개질에 관한 것이며, 그 결과 생체내 사용시 임의의 비개질 대조물 (counterpart)보다 면역원성이 적거나 또는 실질적으로 없는 Mab 425 변이체가 생성된다.

Description

감소된 면역원성을 갖는 개질 항-ＥＧＦＲ 항체{MODIFIED ANTI-EGFR ANTIBODIES WITH REDUCED IMMUNOGENICITY}
c-erbB1/Her 1로도 알려져 있는 표피 성장인자 수용체 (EGF 수용체 또는 EGFR) 및neu암 유전자의 생성물 (c-erbB2/Her 2로도 알려짐)은, 수용체 티로신 키나아제의 큰 군에 속하는 EGF 수용체 초군 (super family)의 일부이다. 이들은 세포 표면에서 특정 성장 인자 또는 천연 리간드, 예로서 EGF 또는 TGF 알파와 상호작용하여, 수용체 티로신 키나아제를 활성화시킨다. 단계 연쇄적인 다운스트림 신호 단백질들이 활성화되어 일반적으로 유전자 발현을 변경시키고, 성장 속도를 증가시킨다.
C-erbB2 (Her 2) 는, Her 2 에 대한 특정 리간드가 아직 명확하게 동정되지는 않았지만, EGF 수용체 (Her 1)에 대해 현저한 상동성을 갖는 분자량이 약 185,000 인 막투과성 티로신 키나아제이다.
상기 EGF 수용체는 분자량이 170,000 인 막투과성 당단백질이며, 많은 유형의 상피 세포에서 발견된다. 이는, 적어도 3 개의 리간드, EGF, TGF-α (변형 성장인자 알파) 및 암피레굴린에 의해 활성화된다. 표피 성장인자 (EGF) 및 변형 성장인자-알파 (TGF-α)는 모두 EGF 수용체에 결합하여, 세포 증식 및 종양 성장을 일으킨다는 것이 증명되어 왔다. 이들 성장인자들은 Her 2 에는 결합하지 않는다 (Ulrich and Schlesinger, 1990, Cell 61, 203). 이량체성 성질 (예로서, PDGF)로 인해 수용체 이량체화를 유도하는 일부 성장인자의 군들과는 달리, 단량체성 성장 인자들, 예로서 EGF 는 그들의 수용체에 대한 2 개의 결합 부위를 포함하며, 이에 따라 2 개의 인접하는 EGF 수용체들을 가교결합시킬 수 있다 (Lemmon 등, 1997, EMBO J. 16, 281). 수용체 이량체화는 고유의 촉매 활성을 자극하고, 성장인자 수용체들의 자가인산화를 위해 필수적이다. 수용체 단백질 티로신 키나아제들 (PTKs)은 동종- 및 이종 이량체화될 수 있다는 것에 주의하여야 한다. 임상 실험은 EGF 수용체 및 c-erbB2 모두가 특정 유형의 종양, 특히 유방, 난소, 방광, 결장, 신장, 머리 및 목의 암, 및 폐의 편평 암종에서 과잉발현된다는 것을 나타낸다 (Mendelsohn, 1989, Cancer Cells 7, 359; Mendelsohn, 1990, Cancer Biology 1, 339). 따라서, 이러한 관찰들은 암 치료를 위한 신규한 치료적 시도로서 인간 EGF 수용체 또는 c-erbB2의 기능을 저해하는 것을 목표로 하는 예비임상 연구를 고무시켜 왔다 (예로서, Baselga 등, 1996, J. Clin. Oncol. 14, 737;Fan and Mendelsohn, 1998, Curr. Opin. Oncol. 10, 67 참조). 예로서, 항-EGF 수용체 및 항-Her 2 항체들은 인간의 암 치료요법에서 효과적인 결과를 나타내는 것으로 보고되었다. 이에따라, 인간화 단일클론 항체 4D5 (hMAb 4D5, HERCEPTIN)는 이미 시판되는 제품이다.
항-EGF 수용체 항체는 EGF 및 TGF-α의 수용체로의 결합을 방지하는 한편, 종양 세포 증식을 저해하는 것으로 나타난다는 것이 증명되어왔다. 이러한 발견으로, EGF 수용체에 대한 다수의 쥐과 및 래트의 단일클론 항체들이 개발되어 왔으며, 시험관 내 및 생체 내에서 종양 세포의 성장을 저해하는 그들의 능력에 대해 시험되어 왔다 (Modjtahedi and Dean, 1994,J. Oncology 4, 277).
인간화 단일클론 항체 425 (hMAb 425) (US 5,558,864; EP 0531 472) 및 키메라성 단일클론 항체 225 (cMAb 225) (Naramura 등, 1993, Cancer Immunol. Immunother. 37, 343-349, WO 96/40210)는 모두, EGF 수용체에 관한 것으로, 임상 시험에서 효능을 나타내었다.
상기 C225 항체는 시험관 내에서 EGF 매개된 종양 세포 성장을 저해하고, 누드 마우스들에서의 생체 내 인간 종양 형성을 저해하는 것으로 증명되었다. 또한, 상기 항체는 무엇보다도, 특정 화학요법제 (즉, 독소루비신, 아드리아마이신, 탁솔 및 시스플라틴)와 함께 협동작용을 하여 이종이식편 마우스 모델에서 생체내 인간 종양을 근절시키는 작용을 하는 것으로 나타났다. Ye 등 (1999, Oncogene18,731)은 인간 난소암 세포를 cMAb 225 및 hMAb 4D5 를 조합하여 성공적으로 처리할 수 있음을 보고하였다.
치료적 단백질의 효능이 치료적 단백질에 대한 원치않는 면역 반응에 의해 제한되는 경우가 많이 있다. 일부 마우스 단일클론 항체들은 여러 인간 질환 설정에 있어서 치료법으로 유망하게 나타났지만, 일부 경우 심각한 정도의 인간 항-쥐과 (antimurine) 항체 (HAMA) 반응의 유도로 인해 실패하였다 [Schroff, R. W. 등, (1985)Cancer Res.45: 879-885; Shawler, D. L. 등, (1985)J. Immunol.135: 1530-1535]. 단일클론 항체에 대해, HAMA 반응을 감소시키기 위한 시도로 여러 기술이 개발되고 있다 [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 이들 재조합 DNA 접근법으로 인해 일반적으로 최종 항체 구축물 내 마우스 유전 정보는 감소되었지만, 최종 구축물 내 인간 유전 정보는 증가되었다. 그럼에도 불구하고, 생성된 "인간화" 항체는 여러 경우에서 여전히 환자에게서 면역 반응을 유도하였다 [Issacs J. D. (1990)Sem. Immunol.2: 449, 456; Rebello, P. R. 등, (1999)Transplantation 68: 1417-1420].
항체가, 면역 반응을 일으킬 수 있는 치료제로서 투여되는 유일한 폴리펩티드 분자 클래스는 아니다. 인간 유래이고 인간에서 생성되는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질도 여전히 인간에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 대표적인 예에는 그 중에서도 과립구-대식세포 콜로니 자극인자 [Wadhwa, M. 등, (1999)Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361] 및 인터페론 알파 2 [Russo, D. 등, (1996)Bri. J. Haem.94: 300-305; Stein, R. 등, (1988)New Engl. J. Med.318:1409-1413] 의 치료적 사용이 포함된다.
면역 반응 유도의 주요 요인은 MHC 클래스 II 분자 상에서의 제공을 통해 T 세포의 활성을 자극할 수 있는 펩티드, 소위 "T 세포 에피토프" 의 단백질 내 존재이다. 상기 잠재적인 T 세포 에피토프는 통상 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 상기 T 세포 에피토프는 MHC 결합의 구축으로 측정될 수 있다. 함축적으로는, "T 세포 에피토프" 는 MHC 분자에 결합하는 경우 T 세포 수용체 (TCR) 에 의해 인식될 수 있고, 최소한 원칙적으로 TCR 의 관여에 의해 상기 T 세포의 활성화를 유도하여 T 세포 반응을 촉진할 수 있는 에피토프를 의미한다. 그러나, 보통은 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 것으로 발견된 특정 펩티드들은, 상기 펩티드가 최종 단백질이 투여되는 유기체 내에서 "자가" 로 인식되기 때문에 단백질 서열 내에 보유될 수 있는 것으로 이해된다.
특정한 상기 T 세포 에피토프 펩티드는 세포 내에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 분해 도중 방출되고, 이어서 주 조직적합 복합체 (major histocompatability complex, MHC) 의 분자에 의해 제공되어 T 세포의 활성화를 유발시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. MHC 클래스 II 에 의해 제공되는 펩티드에 있어서, T 세포의 상기 활성화는 이어서, 예를 들어 B 세포의 직접적 자극에 의한 항체 반응을 일으켜서 상기 항체를 생산시킬 수 있다.
MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T 세포의 선택 및 활성화에 중심 역할을 하는 매우 다형성인 단백질군이다. 인간 백혈구 항원기 DR (HLA-DR)이 상기 단백질군의 주요 이종형(isotype) 이며, 본 발명에서 주로 초점을 맞추고 있다. 그러나, 이종형 HLA-DQ 및 HLA-DP 도 유사한 기능을 수행하므로, 본 발명은 상기물에도 대등하게 적용가능하다. MHC 클래스 II DR 분자는 세포막을 통해 이들의 C 말단에서 삽입되는 알파 및 베타 사슬로 이루어진다. 각각의 이종이량체 (hetero-dimer) 는 펩티드에 결합하는 길이 9 내지 20 개 아미노산의 리간드 결합 도메인을 보유하지만, 결합 그루브 (groove) 는 최대 11 개 아미노산을 수용할 수 있다. 리간드 결합 도메인은 알파 사슬의 1 내지 85 개 아미노산 및 베타 사슬의 1 내지 94 개 아미노산으로 구성된다. 최근에 DQ 분자가 상동 구조를 갖는 것으로 나타났고, DP 군의 단백질도 또한 매우 유사한 것으로 추정된다. 인간에서는 DR 이종형에 대해서는 대략 70 개의 상이한 동종이형 (allotype) 이 공지되어 있고, DQ 에 대해서는 30 개의 상이한 동종이형이 있으며, DP 에 대해서는 47 개의 상이한 동종이형이 공지되어 있다. 각 개인은 2 내지 4 개의 DR 대립유전자 (allele), 2 개의 DQ 및 2 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 여러 DR 분자의 구조가 밝혀져 있고, 상기 구조는 펩티드의 소수성 잔기 (포켓 잔기) 가 관여되는 여러 소수성 포켓을 갖는 개방말단 펩티드 결합 그루브를 나타낸다 [Brown 등,Nature(1993)364: 33; Stern 등, (1994)Nature 368: 215]. 클래스 II 분자의 상이한 동종이형을 나타내는 다형성(polymorphism) 은 펩티드 결합 그루브 내에서 펩티드에 대한 상이한 결합 표면의 광범위한 다양성에 기여하며, 집단 수준에서는 외래 단백질을 인식하고 병원성 유기체에 대해 면역 반응을 유발하는 능력에 대해 최대 유연성을 보장한다. 상이한 지리학적 집단 및 인종군 내 별개의 "군"에 따라 리간드 결합 도메인 내에 상당량의 다형성이 존재한다. 상기 다형성은 펩티드 결합 도메인의 결합 특징에 영향을 미쳐서, DR 분자의 상이한 "군"은 상이한 서열 특성을 갖는 펩티드에 대해 특이성을 가질 것이지만, 일부 중복이 있을 수 있다. 상기 특이성이 Th-세포 에피토프가 유도된 것과 동일한 단백질 상에 존재하는 B-세포 에피토프에 대한 항체 반응을 유도하는 데 궁극적으로 관여하는 Th-세포 에피토프의 인식 (클래스 II T 세포 반응)을 결정한다. 따라서, 개인에서의 단백질에 대한 면역 반응은, 개인의 HLA-DR 동종이형의 펩티드 결합 특이성의 작용인 T 세포 에피토프 인식에 의해 크게 영향을 받는다. 그러므로, 전체 집단 차원에서 단백질 또는 펩티드 내의 T 세포 에피토프의 동정을 위해서는, 가능한 한 다양한 HLA-DR 동종이형 세트의 결합 특성을 고려하여, 가능한 한 높은 퍼센트의 전체 집단을 커버하는 것이 바람직하다.
본 발명의 목적 단백질과 같은 치료적 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 클래스 II 펩티드 제공 경로를 통해 진행된다. 여기에서, 외인성 단백질이 포획되고, DR, DQ 또는 DP 유형의 MHC 클래스 II 분자와의 연합된 제공을 위해 처리된다. MHC 클래스 II 분자는 그 중에서도 대식세포 및 수지상 세포와 같은 전문적인 항원 제공 세포 (APC) 에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 특정한 기타 공수용체 (coreceptor) 의 교차 결합과 함께, T 세포 표면 상의 동족 (cognate) T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 참여는 T 세포에서의 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 B 세포와 같은 기타 임파구를 추가 활성화시켜 항체를 생산하거나 또는 완전 세포성 면역 반응으로서 T 킬러 세포를 활성화시키는 시토카인의 방출을 일으킨다. APC 표면 상의 제공을 위해 주어진 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드의 능력은 여러 요인, 가장 중요하게는 그 일차 서열에 의존한다. 이는, 그 단백분해성 절단에 대한 경향 및 MHC 클래스 II 분자 상의 펩티드 결합 틈 (cleft) 내에서의 결합에 대한 그 친화도 모두에 영향을 미칠 것이다. APC 표면 상의 MHC 클래스 II/펩티드 복합체는 노출된 펩티드 잔기 및 MHC 클래스 II 분자 모두에 의해 제공되는 결정기를 인식할 수 있는 특정 T 세포 수용체 (TCR) 에 대한 결합면을 제공한다.
당 기술 분야에서는, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 합성 펩티드를 동정하는 절차가 있다 (예, W098/52976 및 WO00/34317). 상기 펩티드는 모든 상황에서, 특히 생체 내에서, 처리 경로 또는 기타 현상으로 인해 T 세포 에피토프로서 작용하지 못할 수 있다. T 세포 에피토프 동정이 에피토프 제거의 제 1 단계이다. 단백질로부터의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정 및 제거에 대해서는 이미 개시되어 있다. 당 기술분야에서, 컴퓨터 수단에 의해 T 세포 에피토프의 검출을 가능하게 하기 위해 통상 실험적으로 결정되는 T 세포 에피토프에서 인식된 서열 모티브를 스캐닝 (scanning)하거나, 이와는 달리 MHC 클래스 II-결합 펩티드 및 특히 DR-결합 펩티드를 예측하는 컴퓨터 기술을 사용하는 방법들이 제공되었다. W098/52976 및 WO00/34317 은 인간 MHC 클래스 II DR 동종이형의 하위 세트에 결합할 수 있는 가능성을 갖는 폴리펩티드 서열을 동정하기 위한 전산적 트레딩(threading) 분석 접근법을 교시하고 있다. 상기 교시에서, 예측된 T 세포 에피토프는 비인간 및 인간 유래 모두의 치료적 항체 또는 비항체 단백질의 일차서열 내에서의 적절한 아미노산 치환을 이용하여 제거된다.
인간 또는 실험 동물 대상체의 말초 혈액 시료로부터의 T 세포 클론에 결합할 수 있는, 합성 펩티드와 조합된 재조합 MHC 분자의 가용성 복합체를 개발하기 위한 기타 기술이 당 기술분야에서 사용되어 왔으며 [Kern, F. 등, (1998)Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W. W. 등, (2001)TRENDS in Immunology 22: 583-588], 또한 에피토프 동정 전략에도 사용될 수 있다.
상기에 서술된 바와 같이, 그리고 그 결과로서, 원칙적으로 치료적으로 유용하지만 본래 면역원성인 소정의 폴리펩티드 또는 단백질 또는 면역글로불린으로부터 T 세포 에피토프를 동정하고, 제거하거나 또는 최소한 감소시키는 것이 바람직할 것이다.
개질 Mab 425 (US 5,558,864; EP 0531 427) 및 키메라성 및 인간화 형태의 c225 (WO 96/40210)는 이미 제공되었으나, 이들 시도는 표준 방법에 의해 쥐과 종류로부터 상기 항체들의 키메라성 및 인간화 형태를 제조함으로써 면역원성을 감소시키는 것에 관한 것이다. 이들 중 어느 것도 단백질의 면역원적 잠재성에 대한 T 세포 에피토프의 중요성을 인식하지 못하였고, 본 발명의 방법에 따른 특이적이고 조절되는 방식으로 상기 특성에 직접적으로 영향을 미칠 것을 생각하지 못하였다.
그러나, 증강된 특성을 갖는 항-EGFR 항체에 대한 지속적인 요구가 존재한다. 목적하는 증강은 상기 치료물의 발현 및 정제에 대한 대안적인 방법 및 양식 뿐만 아니라, 특히 면역 글로불린의 생물학적 특성의 개선을 포함한다. 특히 인간 대상체에 투여될 경우 생체 내 특성의 증강에 대한 요구가 존재한다. 이와 관련하여, 인간 대상체에서 면역 반응을 유도하는 잠재성이 감소되거나 없는 항-EGFR 항체, 특히 MAb 425를 제공하는 것이 매우 요구된다.
본 발명은 특히 인간에게, 특히 종양에 대한 치료 용도를 위해 투여되는 EGF 수용체 (HER 1)에 대한 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 개질 항체로, 여기에서 개질은 인간 대상체에 투여시 면역 반응을 일으키는 항체의 성향을 감소시킨다. 본 발명은 특히, 생체 내에서 사용되는 경우, 임의의 비개질 대조물 (counterpart)에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 Mab 425 변이체를 만드는, 상이한 형태의 항-EGFR 항체 425 및 그의 단편의 개질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 비개질 항체에서 유도된 T 세포 에피토프 펩티드에 관한 것으로, 이에 의해 감소된 면역원성을 갖는 개질 Mab 425 변이체를 생성하는 것이 가능하다.
발명의 개요
본 발명은 개질된 형태의 항-EGFR 항체, 바람직하게는 MAb 425 를 제공하는 것으로, 여기에서 면역 특성은 잠재적인 T-세포 에피토프의 수의 감소 또는 제거를 통해 개질된다.
본 발명은, MHC 클래스 II 결합 가능성으로 인한 잠재적인 T-세포 에피토프인, MAb 425 일차 서열 내에서 동정된 서열들을 개시한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라 원칙적으로 생물학적 활성에는 영향을 미치지 않으면서 특정 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변경되는 분자의 일차 서열 내의 특정 위치들을 개시한다. 면역원성의 손실이 생물학적 활성 또는 항체 특이성/회피성을 동시에 손실시킴에 의해서만 달성될 수 았는 경우, 항체 변이체의 아미노산 서열내에서의 추가 변경에 의해 상기 파라미터들을 회복시키는 것이 가능하다.
본 발명은 또한 이러한 개질 항체의 제조방법, 및 무엇보다도 면역원성 부위들을 감소 또는 제거하기 위하여 변경을 필요로 하는 상기 T-세포 에피토프들을 동정하는 방법을 개시한다.
본 발명에 따른 개질 항-EGFR 항체는 인간 대상 내에서 증가된 순환 시간을나타낼 것으로 예측되며, 다수의 적응증에 대한 경우에서와 같이 만성 또는 재발성 질병 세팅에서 특히 유리할 것이다. 본 발명은 생체 내에서 향상된 성질을 나타내는 것으로 예측되는 상기 항체 단백질의 개질된 형태를 제공한다. 이들 개질 항-EGFR 항체 분자들은 약학 조성물에 사용될 수 있다.
요약하면, 본 발명은 하기 문제에 관한 것이다:
ㆍ 소정 종의 면역 계에 노출되고 비개질 항체에 비교했을 경우, EGF 수용체 (Her 1)에 대한 임의의 본래 면역원적으로 비개질된 항체보다 동일한 수용체에 대해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 개질 항체 또는 그의 단편으로, 여기에서 개질 항체는 본래의 비개질 항체에 비해, T-세포 에피토프 서열 및/또는 상기 비개질 항체로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형체를 감소된 수로 함유하거나 또는 함유하지 않는다;
ㆍ 상기에 따른, 상기 본래 존재하는 T-세포 에피토프가 클래스 II 상에서의 제공을 통하여 T-세포를 자극하거나 또는 결합할 수 있는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인, 특정 개질 항체;
ㆍ 상기에 따른, 임의의 본래 존재하는 T-세포 에피토프 중의 1~9 개의 아미노산 잔기들, 바람직하게는 1 개의 아미노산 잔기가 변경된, 특정 개질 항체;
ㆍ 상기에 따른, 아미노산 잔기의 변경이 특정 위치(들)에서 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 다른 아미노산 잔기(들)로의 치환, 결실 또는 삽입인, 특정 개질 항체;
ㆍ 상기에 따른, 특정 아미노산(들)의 추가의 치환, 삽입 또는 결실을 수행하여 상기 분자의 생물학적 활성을 회복하는, 특정 개질 항체;
ㆍ 상기에 따른, 아미노산 변경이 상동성 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 (in silico) 모델링 기술을 참조하여 수행되는, 특정 개질 항체;
ㆍ 상기에 따른, 상기의 본래 면역원적으로 비개질된 항체가 비인간 기원으로부터 완전히 또는 부분적으로 유도되는 서열들을 함유하는, 특정 개질 항체;
ㆍ 상기에 따른, 상기의 본래 면역원적으로 비개질된 항체가 키메라성 항체 또는 대응하는 참조 인간 골격부 (framework) 서열들로부터 유도되는, CDR 영역에 가깝지 않은 것들을 제외한 표면 잔기들을 함유하는 비인간 항체 (베니어드 항체 (veneered antibody))인, 특정 개질 항체;
ㆍ 상기에 따른, 상기의 본래 면역원적으로 비개질된 항체가 쥐과의 MAb 425 이고, 바람직하게는 표 5 에 나타낸 것과 같은 서열들 중 임의의 것을 함유하는, 특정 개질 항체;
ㆍ 상기 특정한 것과 같은 개질 항체의 중쇄 (heavy chain) 및/또는 경쇄 (light chain)를 코딩하는 DNA 서열;
ㆍ 상기 정의된 것과 같은 개질 항-EGFR 항체, 및 임의의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 약학 조성물;
ㆍ 약물학적으로 유효한 약물, 바람직하게는 세포독성제, 보다 바람직하게는 화학요법제를 추가로 함유하는 대응 약학 조성물 또는 키트;
ㆍ 하기 단계를 포함하는, 소정의 종의 면역계에 노출되고 비개질 항체와 비교할 경우, EGF 수용체 (Her 1)에 대해 면역원적으로 비개질 임의의 본래 항체보다동일한 수용체에 대해 면역원성이 적거나 또는 실질적으로 없는 개질 항체 또는 그의 단편의 제조방법:
(i) 본래 면역원적으로 비개질된 항체 또는 그의 일부의 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열을 결정하는 단계, (ii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용하여 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의해, 항체의 아미노산 서열 중 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프를 동정하는 단계, (iii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 사용하여 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합에 의해 또는 T 세포들에 대한 펩티드-MHC 복합체의 결합에 의해 결정되는 T 세포 에피토프의 활성이 실질적으로 감소 또는 제거되도록 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 중의 하나 이상의 아미노산을 사용하여 새로운 서열 변이체를 고안하는 단계, (iv) 재조합 DNA 기술에 의해 이러한 서열 변이체들을 구축하고, 목적하는 성질을 갖는 하나 이상의 변이체들을 동정하기 위하여 상기 변이체들을 시험하는 단계, 및 (v) (ii)~(iv) 단계들을 임의로 반복하는 단계;
ㆍ 상기에 따른, 단계 (iii)이 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프에서 1~9 개의 아미노산 잔기들의 치환, 삽입 또는 결실에 의해, 임의로, 상동성 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조하여 실시되는 방법;
ㆍ 상기에 따른, 단계 (ii)가 하기 단계들에 의해 실시되는 방법: (a) 기지의 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드의 영역을 선택하는 단계; (b) 선택된 영역으로부터 3 개 이상의 아미노산 잔기들에 의해 구성되는, 미리 결정된 균일한 크기의중복 아미노산 잔기 절편을 순차적으로 샘플링하는 단계; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 각 소수성 아미노산 잔기의 측쇄에 대해 지정된 값들의 합산에 의한, 상기 각 샘플링된 절편에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 점수를 계산하는 단계; 및 (d) 그 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 점수에 근거하여, 펩티드의 치료적 유용성을 실질적으로 감소시키지 않으면서 펩티드에 대한 전체 MHC 클래스 II 결합 점수를 변화시키는 개질에 적합한 하나 이상의 절편을 동정하는 단계;
ㆍ 상기에 따른, 단계 (c)가 하기에 의해, 12~6 의 반데르 발스 리간드-단백질 에너지 반발 항목 및 리간드 구조 에너지 항목을 포함하도록 개질된 봄 (Boehm) 점수계산 함수를 사용함으로써 실시되는 방법: (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 제 1 데이타베이스를 제공하고; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 제 2 데이타베이스를 제공하고; (3) 상기 제 1 데이타베이스로부터 모델을 선택하고; (4) 상기 제 2 데이타베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하고; (5) 샘플링된 각 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄들을 동정하고; (6) 샘플링된 각 절편에 존재하는 모든 측쇄들에 대한 결합 친화도 값을 결정하고; 상기 각 모델 및 상기 각 골격에 대해 단계 (1) 내지 (5)를 반복;
ㆍ 상기에 따른, 비인간 기원으로부터 완전히 또는 부분적으로 유도되는 서열을 함유하는, 본래 면역원적으로 비개질된 항체가 사용되는 방법;
ㆍ 상기에 따른, 본래 면역원적으로 비개질된 항체가 키메라성 항체, 또는 대응하는 인간 참조 골격부 서열로부터 유도되는, CDR 영역에 가깝지 않은 것들을제외한 표면 잔기들을 함유하는 비인간 항체 (베니어드 항체)인 방법인 방법;
ㆍ 상기에 따른, 본래 면역원적으로 비개질된 항체가 쥐과의 항체, 바람직하게는 쥐과의 MAb 425 인 방법;
ㆍ 생체 내에서 사용되는 경우 비개질 항체에 비해 면역원성이 적거나 또는 실질적으로 없는, 면역원적으로 개질된 항체의 제조를 위한, 면역원적으로 비개질된 항체로부터 제조되고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 13량체 (13mer) T 세포 에피토프 펩티드, 바람직하게는 상기 13량체 T 세포 에피토프의 9 개 이상의 연속된 아미노산 잔기의 펩티드의 용도 [상기 각 항체는 상기 및 청구의 범위에서 특정된 것이다].
개질 항-EGFR 항체를 만드는 본 발명의 일반적 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 항체 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
(b) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합 측정을 포함하는 임의의 방법에 의한, 면역 글로불린의 아미노산 서열 내의 1 개 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프를 동정하는 단계;
(c) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용하여 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합에 의해 측정되는 T 세포 에피토프의 활성이 실질적으로 감소 또는 제거되도록 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체를 고안하는 단계. 상기 서열 변이체는 서열 변화에 의한 새로운 잠재적 T 세포 에피토프의 생성을 회피하는 방식으로 생성되는데, 새로운 잠재적 T 세포 에피토프가 그렇지 않은 경우, T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하도록 개질된다; 및
(d) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축, 및 널리 공지된 재조합 기술에 따라 목적하는 특성을 갖는 1 개 이상의 변이체를 동정하기 위하여 상기 변이체를 시험하는 단계.
단계 (b) 에 따른 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정은 선행 기술에 미리 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 적합한 방법은 WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317 에 개시되어 있으며, 바람직하게는 MHC 클래스 II 분자에 대한 Mab 425-유도된 펩티드의 결합 성향을 확인하는 데 사용될 수 있다. 계산에 의한 T 세포 에피토프 동정에 매우 효과적인 또다른 방법이 본 발명에 따른 바람직한 구현예인 실시예에 기재되어 있다.
실제로, 여러 변이체 항-EGFR 면역글로불린, 바람직하게는 MAb 425 가 제조되고, 목적하는 면역 및 기능적 특징에 대해 시험될 것이다. 변이체 항체는 가장 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 것이지만, 항체 단편의 화학적 합성을 포함하는 기타 방법도 고려될 수 있다.
본 발명은, 1 개 이상의 아미노산 잔기의 치환이, 단백질로부터의 1 개 이상의 잠재적 T 세포 에피토프의 제거 또는 활성의 실질적 감소를 일으키는 위치에서 수행되는 항체 유사체에 관한 것이다. 표 1 에 확인된 임의의 잠재적 MHC 클래스 II 리간드 내의 특정 위치에서의 1 개 이상의 아미노산 치환은, 인간 숙주에게 치료제로서 투여되는 경우 감소된 면역원적 잠재성을 갖는 MAb 425를 얻게 할 수있다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 T 세포 에피토프의 활성을 제거하거나 실질적으로 감소시킬 것으로 추정되는 펩티드 서열 내의 적절한 지점에서 수행된다. 실제로, 적절한 지점은 바람직하게는 MHC 클래스 II 결합 그루브 내에 제공되는 포켓들 (pockets) 중 하나에 결합하는 아미노산 잔기와 같을 것이다.
펩티드의 소위 P1 또는 P1 고정 위치에서 틈의 제 1 포켓 내의 결합을 변경시키는 것이 가장 바람직하다. 펩티드의 P1 고정 잔기와 MHC 클래스 II 결합 그루브의 제 1 포켓 사이의 결합 상호작용의 질은 전체 펩티드에 대한 전체 결합 친화성의 주요 결정기로 인식된다. 펩티드의 상기 위치에서의 적절한 치환은 포켓 내에서 덜 쉽게 수용되는 잔기에 대한 것으로, 예를 들어 보다 친수성 잔기로의 치환일 것이다. MHC 결합 틈 내의 다른 포켓 영역 내에서의 결합에 상응하는 위치에서의 펩티드의 아미노산 잔기도 또한 고려되며, 본 발명의 범위 내에 속한다.
주어진 잠재적 T 세포 에피토프 내의 단일 아미노산 치환이 에피토프가 제거될 수 있는 가장 바람직한 경로로 이해된다. 단일 에피토프 내의 치환의 조합이 포함될 수 있고, 예를 들어 개별적으로 정의된 에피토프가 서로 중복되는 경우 특히 적절할 수 있다. 또한, 주어진 에피토프 내에서 단독으로 또는 단일 에피토프 내에서 조합된 아미노산 치환은 MHC 클래스 II 결합 그루브에 대해 "포켓 잔기" 에 해당하지 않는 위치 뿐만 아니라 펩티드 서열 내의 임의 위치에서도 수행될 수 있다. 치환은 상동성 구조 또는 당 분야에 공지된 컴퓨터 이용 기술을 사용하여 생성되는 구조적 방법을 참조하여 수행될 수 있고, 본 발명에 따른 분자의 공지된 구조적 특징에 근거할 수 있다. 상기 모든 치환은 본 발명의 범위 내에 속한다.
상기 동정된 펩티드 내부의 것 이외의 아미노산 치환이, 특히 열거된 펩티드 내에서 이루어지는 치환(들)과의 조합으로 수행되는 경우에는 고려될 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자의 구조 또는 생물학적 활성을 복구시키기 위한 변화가 고려될 수 있다. 상기 보상적인 변화들, 및 항-EGFR 항체로부터의 특정 아미노산 잔기의 결실 또는 부가를 포함하여 목적하는 활성을 갖는 변이체를 수득하게 하고, 임의의 개시된 폴리펩티드 내의 변화와 조합된 변화들도 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명이 개질된 항-EGFR 항체, 바람직하게는 MAb 425 에 관한 것인 한, 상기 개질된 면역 글로불린 또는 그 단편, 이의 융합 단백질을 함유하는 조성물 또는 관련 조성물은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주되어야 한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 개질된 항-EGFR 항체, 바람직하게는 MAb 425 를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 개질 면역글로불린을 이용한 인간의 치료적 처치 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
상기 및 이후에 사용되는 "적은 또는 감소된 면역원성" 이라는 표현은 상대적인 표현이며, 동일한 종의 생체 내에 노출되는 경우 본 발명에 따라 개질 항체와 비교되는 개별적인 본래 항체원 (source antibody)의 면역원성에 대한 것임을 나타내는 것이다. 따라서, 항체원은 완전히 비인간 항체, 예로서 마우스 또는 래트 항체일 수 있다. 그러나, 본 발명은 인간 서열, 예로서 키메라성 또는 인간화항체를 이미 함유하는 서열에도 관한 것이다. 기존의 표준 방법에 의해 수득되는 이러한 인공적으로 고안된 항체들 중, 여전히 면역원성인 일차 구조 중의 서열들이 있다. 널리 공지된 방법에 의해 이러한 키메라성 또는 인간화 형태를 생성하는 한편, 새로운 T 세포 에피토프들을 생성하는 것도 가능하다. 완전한 인간 항체 또는 그의 단편들도 면역유전학적으로 상이한 양상을 갖는 특정 개인들 또는 개인들의 군에 대해 면역원성일 수 있다. "키메라성 항체"라는 용어는, 그들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유도되는 항체 중의 대응 서열과 동일하거나 또는 상동성이거나, 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 한편, 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종들로부터 유도되는 항체 중의 대응 서열과 동일하거나 상동성이거나, 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체, 및 이러한 항체의 단편을 의미한다 (예로서, US 4,816,567; Morrison 등,Proc. Nat.Acad.Sci. USA, 81:6851~6855 (1984)). 키메라성 및 인간화 항체의 제조방법은 본 기술분야에서도 알려져 있다. 예로서, 키메라성 항체의 제조방법은 Boss (Celltech) 및 Cabilly (Genentech) 의 특허 (US 4,816,397; US 4,816,567)에 기재된 것들을 포함한다. "인간화 항체"는 비인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소한의 서열을 함유하는 비인간 (예로서, 설치류) 키메라성 항체의 형태이다. 대부분의 경우, 인간화 항체들은 수령자의 고변이성 영역 (CDRs)로부터의 잔기들이 바람직한 특이성, 친화성 및 용량 (capacity)을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종 (공여자 항체)의 고변이성 영역으로부터의 잔기들에 의해 치환된 인간 면역글로불린 (수령자 항체)이다. 어떤 경우에는, 인간 면역글로불린의 골격부 영역 (FR) 잔기들이 대응하는 비인간 잔기들에 의해 치환된다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 1 개 이상의, 전형적으로 두 개의 변이성 도메인을 함유할 것이며, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 고변이성 루프는 비인간 면역 글로불린의 고변이성 루프에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변영역의, 적어도 일부를 함유할 것이다. 인간화 항체의 제조방법은 예로서, Winter (US 5,225,539) 및 Boss (Celltech, US 4,816,397)에 기재되어 있다. "항체 단편"은 바람직하게는 항원-결합 또는 그의 변이성 영역을 함유하는, 무손상 항체 부분을 함유한다. 항체 단편의 예들은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 Fc 단편들, 다이아보디 (diabodies), 선형 항체, 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편(들)로부터 형성된 다중특이적 항체들을 포함한다. "무손상 (intact)" 항체는 항원결합 변이성 영역 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3 를 포함하는 것이다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 작동 기능을 갖는다. 항체의 파파인 소화는, "Fab" 단편이라고 하는 두 개의 동일한 항원 결합 단편들을 생성하며, 이들 각각은 하나의 항원 결합 부위 및 CL 및 CH1 영역, 및 잔기 "Fc" 단편 (이의 이름은 쉽게 결정화되는 이의 능력을 반영한다)을 함유한다. 항체의 "Fc" 영역은 대개 CH2, CH3 및 IgG1 또는 IgG2 항체 주 클래스의 경첩 영역을 함유한다. 펩신 처리로 2 개의항원 결합 부위를 가지며, 여전히 항원을 가교결합할 수 있는 "F(ab')2" 단편이 수득된다. "Fv" 는 완전한 항체 인식 및 항체 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유 결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 변이성 도메인의 이량체로 이루어진다. "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편들은 항체의 VH, 및 VL 도메인을 함유하며, 여기에서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드쇄에 존재한다. 바람직하게는, 상기 Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 연결체를 더 함유한다. 단일쇄 FV 항체들은 예로서, Plueckthun (The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269~315 (1994)), WO93/16185; US 5,571,894; US 5,587,458; Huston 등 (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 5879) 또는 Skerra and Plueckthun (1988, Science 240, 1038) 로부터 알려져 있다.
"T 세포 에피토프" 라는 용어는 본 발명의 이해에 따라 MHC 클래스 II 에 결합할 수 있고, T 세포를 자극하고/하거나 또한 MHC 클래스 II 와 조합되어 T 세포와 결합할 수 있는 (반드시 측정가능한 정도로 활성화시킬 필요는 없음) 아미노산 서열을 의미한다. 본원 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는 "펩티드" 라는 용어는, 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은, (본원에서 하기에 정의되는) 펩티드 결합에 의해 함께 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 20 개의 상이한 천연 발생 아미노산이 존재하며, 이들의 임의의 수를 임의의 순서로 연결하여 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생산에 사용되는 천연 발생 아미노산은 모두 L-입체구조를 갖는다.합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 2 가지 상이한 입체구조의 아미노산의 다양한 조합을 이용하는 통상적 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 펩티드는 소수의 아미노산 단위만을 함유한다. 짧은 펩티드, 예컨대 10 개 미만의 아미노산 단위를 갖는 것들을 때로 "올리고펩티드" 로 부른다. 다른 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예컨대 100 개 전후를 함유하며, "폴리펩티드" 로 불린다. 통상적으로, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산을 함유하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있는 반면, "올리고펩티드" 는 통상적으로 "짧은" 폴리펩티드의 특정 유형으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 모든 언급은 올리고펩티드도 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "펩티드" 에 대한 모든 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각각의 상이한 아미노산 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수 - 따라서 상이한 단백질의 수는 실제로 무한하다. 본 발명에 사용된 것과 같은 "개질 단백질/항체"라는 표현은 감소된 수의 T 세포 에피토프를 가지고, 이에따라 소정의 종의 면역계에 노출되었을 경우 부모(parent) 단백질에 대해 상대적으로 감소된 면역원성을 발하는 단백질/항체를 의미한다. 본 발명에 사용된 것과 같은 "비개질 단백질"이라는 용어는 "개질 단백질"에 비교하여 "부모" 단백질을 의미하며, 다수의 T 세포 에피토프를 가지고, 이에따라 소정의 종의 면역계에 노출되었을 경우 개질 단백질에 비해 향상된 면역원성을 갖는다.
"알파 탄소 (Cα)" 는 펩티드 사슬 내에 있는 탄소-수소 (CH) 성분의 탄소원자이다. "측쇄" 는 펩티드의 크기에 비해 상당히 다양할 수 있는 물리적 크기를 갖는, 단순하거나 복잡한 기 또는 부분을 구성할 수 있는 Cα에 대한 펜던트 기이다.
하기 단락에서, 높은 치료적 가치를 갖는 것으로 나타난 단일클론성 항-EGFR 항체 425에 대한 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명이 이 항체 및 이의 몇몇 존재 형태에 한정되는 것은 아니며, 기타 항-EGFR 항체, 무엇보다도 매우 유사한 성질을 갖는 키메라성 항체 225 까지에도 관한 것일 수 있다.
달리 언급되지 않는다면, 변이성 중쇄 및 경쇄 중의 모든 아미노산들은 Kabat 등, 1991 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services)에서와 같이 번호매김된다. 잠재적인 T 세포 에피토프들은, 중쇄 및 경쇄들의 첫번째 아미노산으로부터 계수하여, 에피토프의 첫번째 아미노산의 선형 수로 번호매김된다.
1. 마우스 하위군 골격부 (Subgroup Framework)와의 비교
쥐과의 425 VH (중쇄) 및 VK (경쇄)의 아미노산 서열을 Kabat 쥐과의 중쇄 및 경쇄 하위그룹에 대한 공통서열과 비교하였다. 425 VH 는 마우스 중쇄 하위군 IIB 으로 지정될 수 있다. 이 하위군에 대한 공통 서열과의 비교 결과, 425 VH의 94 위치에서 일반적이지 않은 세린이 존재한다는 것을 나타낸다. 이 위치에서 가장 흔한 잔기는 아르기닌이다. 425 VK 는 마우스 카파 쇄 하위군 VI 에 지정될 수 있다. 이 하위 군에 대해 공통서열을 비교한 결과 425 VK의 45~47, 60 및 100 위치에서 이 하위 군에 일반적이지 않은 잔기들이 나타났다. 아미노산 잔기의 번호매김은 Kabat 에 따랐다.
2. 인간 골격부와의 비교
쥐과의 425 VH (변이성 중쇄) 및 VK (변이성 카파 경쇄)의 아미노산 서열들을 인간 배 계열 (germline) VH (Tomlinson, I.M. 등 (1992) J. Mol. Biol.227: 776~798) 및 VK (Cox, J.P.L. 등, (1994) Eur. J. Immunol.24: 827~836)의 디렉토리 (directory)의 서열들 및 인간 배 계열 J 영역 서열들 (Routledge, E.G 등,Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. ed. Academic Titles, Nottingham, UK, pp13~44, 1991)과 비교하였다. 쥐과의 425 의 중쇄 및 경쇄의 서열은 예로서, EP 0531 472 로부터 취할 수 있다.
425 VH 에 대하여 선택된 참조 인간 골격부는 인간 JH6을 갖는 VH1GRR 이었다. 디렉토리에서 VH1GRR 의 서열은 잔기 88 에서 끝난다. 따라서, 쥐과의 서열의 94 위치에서 일반적이지 않은 세린에 대한 대응 잔기는 존재하지 않는다. 이 배 계열 서열은 4 개의 아미노산 변화가 있는 재배열된 성숙한 항체 유전자 중에서 발견된다. 425 VK 에 대해 선택된 참조 인간 골격부는 인간 JK2 를 갖는 L6/vg 이었다. 이 배 계열 서열은 아미노산이 변화가 없는 재배열된 성숙한 항체 중쇄 중에서 발견된다.
3. "베니어드" 서열의 고안
참조 인간 골격부 서열의 동정 후, 425 VH 및 VK 골격부 내에서 특정의 동일하지 않은 아미노산 잔기들을 인간 참조 골격부 서열 중의 대응 아미노산으로 변화시켰다. 항체 구조 및 결합에 매우 중요한 것으로 생각되는 잔기들은 이 과정에서 배제하여 변경시키지 않았다. 이 단계에서 유지된 쥐과의 잔기들은 대개는 N-말단에서의 잔기로부터 떨어진, 예로서 최종 항체에서 CDRs 에 가까운, 표면에 존재하지 않는 숨은 (buried) 잔기들이다 (1~8, 바람직하게는 1~5 아미노산 잔기들). 이 과정에서, 표면 잔기들로는 주로 인간 서열 및 숨은 잔기들로는 본래의 쥐과 서열에서와 같은 "베니어드" 항체와 대략적으로 유사한 서열이 생산된다.
4. 펩티드 트레딩 (threading) 분석
상기 쥐과 및 베니어드 425 VH 및 VK 서열들을 본 발명에 따른 방법을 사용하여 분석하였다. 아미노산 서열들을 모든 가능한 13량체로 나눈다. 상기 13량체 펩티드들을 HLA-DR 동종이형의 결합 그루브 (groove)의 모델 및 각 대립유전자에 대한 각 펩티드에 지정된 결합 점수에 순차적으로 제공하였다. 구조적 점수를 펩티드의 각 포켓 결합 측쇄에 대해 계산하였다. 이 점수는 입체적 (steric) 중복, 결합 그루브 내의 펩티드 및 잔기들 간의 잠재적인 수소 결합, 정전기적 상호작용 및 펩티드 및 포켓 잔기들과의 바람직한 접촉에 근거한 것이다. 각 측쇄의 구조를 변경시킨 후 점수를 재계산하였다. 가장 높은 구조 점수를 결정하면, 결합점수를 그루브 결합된 소수성 잔기, 비그루브 친수성 잔기들 및 결합 그루브 내에 맞는 잔기들의 수에 근거하여 계산한다. 인간 MHC 클래스 II 에 대한 결합체로서 알려진 펩티드들은 거의 잘못된 네가티브 (negative) 없이 높은 결합 점수를 달성한다. 따라서, 현 분석에서 상당한 결합 점수를 달성하는펩티드들은 잠재적인 T 세포 에피토프들인 것으로 생각된다. 펩티드 트레딩 분석의 결과를 425 VH 및 425 VK 에 대해 표 1 에 나타내었다. 잠재적인 T 세포 에피토프들은 13량체의 최초 잔기의 선형 수에 의해 명명된다.
쥐과 및 베니어드 425 서열 중의 잠재적 T 세포 에피토프
서열 잠재적 T 세포 에피토프의 수 괄호 안의 결합 대립유전자의 수를 갖는 13량체의 첫번째 잔기의 수
쥐과의 425 VH 8 31(7), 35(17), 43(7), 46(8), 58(10), 62(12), 81(11), 84(16)
베니어드 425 VH 7 31(7), 43(7), 46(8), 58(10), 62(11), 81(11), 84(16)
쥐과의 425 VK 9 1(8), 2(5), 17(5), 27(5), 43(16), 72(18), 75(10), 92(10), 93(17)
베니어드 425 VK 4 27(5), 43(16), 92(8), 93(17)
5. 잠재적 T 세포 에피토프의 제거
치환을 위한 아미노산 잔기들의 숫자매김은 Kabat에 따른다. 잠재적인 T 세포 에피토프들은 13량체의 첫번째 잔기의 선형 수에 따라 명명된다.
잠재적인 T 세포 에피토프들을 베니어드 425 중쇄 변이성 영역으로부터 제거하는데 요구되는 아미노산 치환은 하기와 같다:
ㆍ41 잔기 (Kabat 번호 41)에서 프롤린을 알라닌으로 치환하여 잔기 번호 31 에서 잠재적인 에피토프를 제거한다.
ㆍ45 잔기 (Kabat 번호 45)에서 프롤린을 류신으로 치환하여 잔기 번호 43에서 잠재적인 에피토프를 제거한다. 45 위치에서의 프롤린은 인간 배 계열 VH 서열, DP52 에서 발견된다.
ㆍ48 잔기 (Kabat 번호 48)에서 프롤린을 이소류신으로 치환하여 잔기 번호 46에서 잠재적인 에피토프를 제거한다.
ㆍ68 잔기 (Kabat 번호 67)에서 발린을 알라닌으로 치환하여 잔기 번호 58에서 잠재적인 에피토프를 제거한다.
ㆍ70 잔기 (Kabat 번호 69)에서 이소류신을 류신으로 치환하여 잔기 번호 62에서 잠재적인 에피토프를 제거한다.
ㆍ91 잔기 (Kabat 번호 87)에서 트레오닌을 세린으로 치환하여 잔기 번호 81 및 84 에서 잠재적인 에피토프를 제거한다.
잠재적인 T 세포 에피토프를 베니어드 425 경쇄 변이성 영역으로부터 제거하는데 요구되는 아미노산 치환은 하기와 같다:
ㆍ35 잔기 (Kabat 번호 36)에서 히스티딘을 티로신으로 치환하여 잔기 번호 27에서 잠재적인 에피토프를 제거한다.
ㆍ50 잔기 (Kabat 번호 51)에서 알라닌을 트레오닌으로 치환하여 잔기 번호 43에서 잠재적인 에피토프를 제거한다. 이 잔기는 CDR2 내에 존재한다. 알라닌은 인간 및 쥐과의 항체 모두에서 일반적으로 이 위치에서 공통적으로 발견된다. 이 에피토프를 제거하기 위한 다른 치환은 45 위치 (Kabat 번호 46)에서 알라닌을 류신으로 치환하는 것이다. 잠재적인 에피토프를 제거하는 다른 보존적 치환은 없을 것이다. 알라닌은 일부 항체들에서 이 위치에서 발견된다.
ㆍ94 잔기 (Kabat 번호 95)에서 프롤린을 이소류신으로 치환하여 잔기 번호 92에서 잠재적인 에피토프를 제거한다. Kabat 잔기 95 는 CDRL3 내에 존재한다. 프롤린은 마우스 항체 서열의 이 위치에서 일반적이며, 잠재적인 에피토프를 제거하는 CDR 내에서의 다른 변경은 없다.
ㆍ103 잔기 (Kabat 번호 104)에서 발린을 류신으로 치환하여 잔기 번호 93에서 잠재적인 에피토프를 제거한다.
6. 탈면역화 서열의 고안
잠재적인 T 세포 에피토프를 제거하는데 요구되는 변화들을 참조하고, 항체 구조 및 결합에 치명적일 수 있는 골격부 잔기들을 고려하여, 탈면역화 중쇄 및 경쇄 변이성 영역 서열들을 고안하였다. 베니어드 서열에 기초한 탈면역화 서열들 외에, 쥐과 서열에 기초한 각 VH 및 VK 에 대한 추가의 서열을 고안하였으며, 이를 트레딩된 마우스 펩티드 (Mo PT) 형으로 명명하였다. 이 형태에 대하여, T 세포 에피토프를 제거하기 위하여 쥐과 서열을 직접적으로 변화시켰으나, 결합에 불리한 것으로 여겨지는 CDR 을 사용한 변화들은 제외되었다. 상기 탈면역화 서열의 이러한 형태에서 표면 (B 세포) 에피토프들을 제거하려는 시도는 이루어지지 않았다.
일차적인 탈면역화 VH 는 상기 항목 5 에서 언급된 1 내지 6 개의 치환들을 포함하며, 잠재적인 T 세포 에피토프들은 포함하지 않는다. 항체 결합에 필요한 각종 치환의 효과를 시험하기 위하여, 추가의 4 개의 탈면역화 VH 서열들을 고안하였다. 일차 탈면역화 서열들 (425 VH1GRR-VH-v1)에 만들어진 누적 변경들 및 잔류하는 잠재적인 T 세포 에피토프들을 표 2 에 상세히 나타내었다. 트레딩된 마우스 형태는 비교를 위해 포함시켰다.
탈면역화 425 VH 에서 아미노산 변화 및 잠재적 에피토프들
변이체 누적 잔기 변화 잠재적 T 세포 에피토프
425 VH1GRR-VH-v1 없음 없음
425 VH1GRR-VH-v2 48A →I 46(8)
425 VH1GRR-VH-v3 45P →L 43(7), 46(8)
425 VH1GRR-VH-v4 67V →A, 69I→L 43(7), 46(8), 58(10), 62(11)
425 VH1GRR-VH-v5 41P →A 31(7), 43(7), 46(8), 58(10), 62(11)
425 VH1-MoPT NA 43(7), 46(8)
일차 탈면역화 VK 는 상기 항목 5 에서 1 내지 4 개의 치환들을 포함하며, 잠재적인 T 세포 에피토프들은 포함하지 않는다. 항체 결합에 필요한 각종 치환의 효과를 시험하기 위하여, 추가의 4 개의 탈면역화된 VK 서열들을 고안하였다. 2 형태는 1 형태에 대해 대체적이며, 여기에서 대체적인 치환은 동일한 잠재적 T 세포 에피토프들을 제거하기 위하여 사용되었다. 일차 탈면역화 서열 (425 L6-vg-VK-v1)에 만들어진 누적 변경 및 잔류하는 잠재적인 T 세포 에피토프들을 표 3 에 상세히 나타내었다. 트레딩된 마우스 형태는 비교를 위해 포함시켰다.
탈면역화 425 VK 중의 아미노산 변화 및 잠재적 에피토프
변이체 누적 잔기 변화 잠재적 T 세포 에피토프
425 L6-vg-VK-v1 없음 없음
425 L6-vg-VK-v1 51A →T, 46L →A 없음
425 L6-vg-VK-v1 46A →L 43(16)
425 L6-vg-VK-v1 95P →I 43(16), 92(8)
425 L6-vg-VK-v1 36H →Y 27(5), 43(16), 92(8)
425VK-MoPT NA 27(5), 43(16), 92(8)
이미 언급된 것과 같이, 본 발명에 따른 개질 항-EGFR 항체들, 바람직하게는 MAb 425 는, 바람직하게는 암의 치료에 사용되는 약학 조성물 및 약학 키트에 사용될 수 있다. "암" 및 "종양"은 전형적으로 비조절된 세포 성장으로서 특징되는 포유류에서의 생리학적 상태를 칭하거나 기술하는 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물에 의해, 유방, 심장, 폐, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 머리 및 목, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환, 자궁경부, 및 간의 종양과 같은 종양들을 치료할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물들은 본 발명의 병용 요법 ("보조적 요법")과 관련된 부작용을 감소시키거나 또는 피하는 제제들을 함유할 수 있으며, 이들은 이에 제한되지는 않지만, 예로서 항암제의 독성 효과를 감소시키는 제제, 예로서 골흡수 저해제, 심장보호제를 포함한다. 상기 보조 제제들은 화학요법, 방사선요법 또는 수술과 관련된 오심 및 구토의 발생을 예방 또는 감소시키거나, 또는 골수억제성 항암 약물의 투여와 관련된 감염의 발생을 감소시킨다. 보조 제제들은 당 기술분야에서 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 개질 항체들은 부가적으로 BCG 및 기타 면역계 자극제와 같은 보조제들과 함께 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 상기 기재된 것과 같이, 세포독성 작용의 방사선 표지 동위원소들, 또는 세포독성 펩티드 (예로서, 시토카인) 또는 세포독성 약물 등과 같은 기타 세포독성제를 함유하는 화학요법 제제를 포함할 수 있다. 종양 또는 종양 전이 치료용 약학 키트는 패키지 (package), 및 일반적으로 종양 및 종양 전이 처리 방법에 대한 시약들의 사용을 위한 지시사항을 칭한다. 본 발명의 키트에서 시약은 전형적으로 여기 기재된 것과 같은 치료 조성물로서 제형화되며, 따라서 배포에 적합한 각종 임의의 형태로 키트 내에 존재할 수 있다. 이러한 형태는, 본 발명의 안타고니스트 및/또는 융합 단백질을 제공하기 위한, 액체, 분말, 정제, 현탁액 등의 제형을 포함할 수 있다. 시약은 본 발명에 따라 개별적인 투여에 적합한 별개의 용기들 중에 제공될 수 있거나, 또 다르게는, 패키지 중의 하나의 용기 내의 조성물 중에 조합되어 제공될 수 있다. 상기 패키지는 여기 기재된 치료 방법에 따라 시약들의 일회 이상의 투약량에 충분한 양을 함유할 수 있다. 본 발명의 키트는 패키지 내에 포함된 물질들의 "사용 지시사항"도 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제 및 이들의 문법적으로 다른 표현들은 오심, 현기증, 위장 장애 등과 같은 바람직하지 않은 생리학적 효과들을 생성시키지 않으면서 포유류에 투여될 수 있는 물질들이다.
그 안에 용해 또는 분산된 유효 성분들을 함유하는 약물학적 조성물의 제조는 당 기술분야에서 잘 이해되며, 제형에 따라 제한될 필요가 없다. 전형적으로, 이러한 조성물들은 액상 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 형태로서 제조되지만, 사용 전에 액상 중의 용액 또는 현탁액으로 되기 적합한 고체 형태들도 제조될 수 있다. 제제는 에멀션화될 수도 있다. 유효 성분은 약학적으로 허용가능하고, 유효 성분과 사용될 수 있는 부형제와, 여기 기재된 치료 방법에 사용되기 적합한 양으로 혼합될 수 있다. 적합한 부형제들은 예로서, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 그의 조합을 들 수 있다. 또한, 바람직한 경우, 조성물은 미량의 보조 물질들, 예로서 유효 성분의 작용성을 증강시키는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등을 함유할 수 있다. 본 발명의 치료 조성물은 그 안에, 성분들의 약학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다.
전형적으로, 항-EGFR 항체의 치료 유효량은 생리학적으로 관용성인 (tolerable) 조성물로 투여시 밀리리터 (㎖) 당 약 0.01 마이크로그램 (㎍) 내지 약 100 ㎍/㎖, 바람직하게는 약 1 ㎍/㎖ 내지 약 5 ㎍/㎖, 및 일반적으로 약 5 ㎍/㎖의 혈장 농도를 달성하기에 충분한 양이다. 달리 말하면, 투약량은, 하루 또는 며칠동안 1 회 이상의 투약 투여로, 약 0.1 mg/kg 내지 약 300 mg/kg, 바람직하게는 약 0.2 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 로 변화할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 면역원적으로 개질된 항체가 대응하는 비개질 형태 대신에 사용되는 경우, 상기 나타낸 것과 같은 보다 적은 투약량이 동일한 효능으로 적용될 수 있다.
예로서 화학치료제와의 병용 요법이 필요하거나 권장되는 경우, 이러한 유효 성분의 전형적인 투약량은 하루당 kg 체중 당 10 mg 내지 1000 mg, 바람직하게는 약 20 내지 200 mg, 보다 바람직하게는 50 내지 100 mg 이다.
하기 실시예는 본 발명에 따라, 비개질 면역원성능을 갖는 본래 항체 상에 존재하는 T 세포 에피토프들을 동정하기위한 방법의 일반적인 형태이다. 그러나, 상기 에피토프 서열들의 동정은 상기 특정된 것과 같은 알려진 방법에 의해 실시될 수 있다.
단백질 또는 폴리펩티드 또는 면역글로불린의 전체 구조를 결정하는 데 중요한 역할을 하는 여러 요인들이 있다. 첫 번째로, 펩티드 결합, 즉 사슬 내의 아미노산을 함께 연결하는 결합은 공유 결합이다. 상기 결합은 평면 구조이며, 본질적으로 치환 아미드이다. "아미드" 는 -CONH- 그룹을 함유하는 유기 화합물의 임의의 기이다.
인접한 아미노산의 Cα를 연결하는 평면 펩티드 결합은 하기 도시한 바와 같이 나타낼 수 있다:
O=C 및 C-N 원자들이 비교적 고정된 평면 상에 놓이므로, 상기 축에 대해서는 자유 회전이 일어나지 않는다. 따라서, 점선으로 도식적으로 묘사된 평면은 때때로 "아미드" 또는 "펩티드 평면" 으로 불리며, 여기에 펩티드 골격의 산소 (O), 탄소 (C), 질소 (N), 및 수소 (H) 원자가 놓인다. 상기 아미드 평면의 반대 구석에는 Cα원자가 위치한다. 펩티드 또는 아미드 평면에서 O=C 및 C-N 원자에 대해 실질적으로 회전이 없으므로, 폴리펩티드 사슬은 Cα원자를 연결하는 일련의 평면 펩티드 결합을 포함한다.
폴리펩티드 또는 단백질의 전체 구조 또는 입체구조를 정의하는 데 중요한 역할을 하는 제 2 요인은 공통 Cα결합에 대한 각각의 아미드 평면의 회전각이다. "회전각" 및 "비틀림 (torsion) 각" 이라는 용어는 이후 동등한 용어로 간주된다. O, C, N, 및 H 원자가 아미드 평면에 존재한다고 가정하면 (일부 입체구조에 대해상기 원자의 평면성이 약간 변경될 수 있지만, 통상적으로 타당한 가정임), 상기 회전각은 N 및 R 폴리펩티드의 골격 입체구조, 즉 인접한 잔기 사이에 존재하는 그대로의 구조를 정의한다. 상기 두 각은 φ및 ψ로 공지되어 있다. 따라서, 한 세트의 각 φi, ψi(여기서 아래첨자 i 는 폴리펩티드 사슬의 특정 잔기를 나타냄)은 폴리펩티드의 2 차 구조를 효과적으로 정의한다. 주어진 폴리펩티드에 대해 φ, ψ각을 정의하는데 사용되는 관례, 즉 아미드 평면이 0 도 각을 형성하는 기준점 및 어느 각이 φ이고 어느 각이 ψ인가에 대한 정의는 문헌에 정의되어 있다. 예컨대, 본원에 참고문헌으로 도입된 [Ramachandran 등.Adv. Prot. Chem. 23: 283-437 (1968), 페이지 285-94] 를 참조.
본 발명의 방법은 어느 단백질에나 적용될 수 있으며, 부분적으로, 인간에서 MHC 클래스 II 분자 결합 그루브의 일차 포켓 1 고정 위치는 특정 아미노산 측쇄에 대해 잘 고안된 특이성을 갖는다는 발견에 근거한다. 상기 포켓의 특이성은 MHC 클래스 II 분자의 베타 사슬의 86 번 위치에서 아미노산의 정체성에 의해 결정된다. 상기 부위는 포켓 1 의 기저부에 위치하며, 상기 포켓에 의해 수용될 수 있는 측쇄의 크기를 결정한다 [Marshall, K. W.,J. Immunol.,152: 4946-4956 (1994)]. 상기 잔기가 글리신이라면, 모든 소수성 지방족 및 방향족 아미노산 (소수성 지방족은: 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌이고, 방향족은: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이다) 은 포켓 내에 수용될 수 있는데, 방향족 측쇄가 바람직하다. 상기 포켓 잔기가 발린이라면, 상기 아미노산의 측쇄는 포켓 내로 돌출하여, 소수성 지방족 측쇄만이 수용될 수 있도록, 수용될 수 있는 펩티드 측쇄의 크기를 제한한다. 따라서, 아미노산 잔기 서열에서, 소수성 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산이 발견되는 어느 곳에나, MHC 클래스 II 에 제한된 T 세포 에피토프가 존재할 가능성이 있다. 그러나, 측쇄가 소수성 지방족이라면, 방향족 측쇄에 비해 T 세포 에피토프와 연합될 가능성이 2 배 가량 더 높다 (전체 집단에 대해 포켓 1 유형의 대략 균일한 분포를 가정함).
본 발명을 구현하는 전산적인 방법은 하기와 같이 T 세포 에피토프를 포함할 가능성이 있는 펩티드 영역을 프로파일링한다:
(1) 소정의 길이의 펩티드 절편의 일차 서열을 스캐닝하고, 존재하는 모든 소수성 지방족 및 방향족 측쇄를 확인한다. (2) 소수성 지방족 측쇄에 방향족 측쇄보다 더 높은 값; 바람직하게는 방향족 측쇄에 지정된 값의 약 2 배, 예컨대, 소수성 지방족 측쇄에 대한 값으로 2, 및 방향족 측쇄에 대한 값으로 1 을 지정한다. (3) 존재하는 것으로 결정된 값을 펩티드 내의 소정의 균일한 길이를 갖는 각각의 중복되는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 합산하고, 특정 절편 (윈도우) 에 대한 전체 값을 절편 (윈도우)의 중간 위치에 있는 단일 아미노산 잔기에, 바람직하게는 샘플링된 절편 (윈도우)의 대략 정중앙 위치의 잔기에 부여한다. 상기 절차를 각각의 샘플링된 중복되는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 반복한다. 따라서, 펩티드의 각 아미노산 잔기에는 T 세포 에피토프가 상기 특정 절편 (윈도우)에 존재할 가능성에 관련된 값이 부여된다. (4) 상기 단계 3 에 기재된 바와 같이 계산 및 부여된 값을 평가되는 전체 아미노산 잔기 서열의 아미노산 축에 대해 플롯팅할 수 있다. (5) 소정의 값, 예컨대 값 1 의 점수를 갖는 서열의 모든 부분은, T 세포 에피토프를 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 필요하다면 개질될 수 있다.
본 발명의 상기 특정 측면은 T 세포 에피토프를 포함할 것 같은 펩티드 영역을 나타낼 수 있는 일반적인 방법을 제공한다. 상기 영역에서의 펩티드 개질은 MHC 클래스 II 결합 특징을 개질시킬 수 있는 가능성을 갖는다.
본 발명의 또다른 측면에 따라, MHC 클래스 II 대립유전자의 모델과 펩티드의 상호작용을 고려한 보다 복잡한 전산적 방법을 이용하여, T 세포 에피토프가 보다 정확히 예측될 수 있다. 상기 특정 측면에 따른 펩티드 내에 존재하는 T 세포 에피토프의 전산적 예측에는, 모든 공지된 MHC 클래스 II 분자의 구조를 기반으로 하는 42 개 이상의 MHC 클래스 II 대립유전자 모델의 구축, 및 T 세포 에피토프의 전산적 동정에 있어서 상기 모델의 이용 방법, 상대적인 펩티드 골격 알파 탄소 (Cα) 위치에 있어서 공지된 변화를 가능케 하기 위한 각각의 모델에 대한 펩티드 골격 라이브러리의 구축, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용에 대해 결정적인 위치의 20 개 아미노산 대안물 각각에 대한 각 모델을 사용한 각각의 골격 잔교 (dock)에 대한 아미노산 측쇄 입체구조의 라이브러리 구축, 및 특정 MHC 클래스 II 분자로 도킹된 특정 펩티드에 대한 최적 골격 및 측쇄 입체구조를 선택하기 위한 점수계산 기능 및 상기 상호작용으로부터 결합 점수의 유도와 연관된, 상기 골격 및 측쇄 입체구조의 라이브러리의 사용이 포함된다.
MHC 클래스 II 분자의 모델은 Brookhaven 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에서찾을 수 있는 여러 유사한 구조로부터 상동성 모델링을 통해 유도할 수 있다. 이들은 에너지 최소화를 위한 CHARMm 력장 (force-field) (Molecular Simulations Inc., San Diego, Ca. 에서 구입가능) 와 함께 시뮬레이션된 어닐링 기능을 도입한 반자동 상동성 모델링 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다 (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993.J. Mol Biol 234: 779-815). 대안적인 모델링 방법도 또한 이용할 수 있다.
본 발명의 방법은, MHC 클래스 II 분자의 작은 세트를 위한 결합 그루브 내 각각의 위치에서 대안적인 각각의 아미노산의 실험적으로 유도된 결합 데이타의 라이브러리를 이용하는 다른 전산적 방법 (Marshall, K. W., 등,Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids,1(3): 157-162) (1995), 또는 그루브 내의 특정 유형의 결합 포켓의 결합 특징을 정의하기 위해, 다시 MHC 클래스 II 분자의 비교적 작은 서브세트를 이용한 후 상기 포켓 라이브러리로부터의 포켓 유형을 '혼합 및 대조'하여 추가적인 '버츄얼' MHC 클래스 II 분자를 인공적으로 생성시키는 유사한 실험적 결합 데이타를 이용하는 또다른 전산적 방법 (Sturniolo T., 등,Nat. Biotech,17(6): 555-561 (1999))과는 상당히 상이하다. 두 가지 선행 방법 모두, 분석의 복잡성 및 다수의 펩티드 변이체를 합성해야 한다는 필요성으로 인해, 단지 소수의 MHC 클래스 II 분자만이 실험적으로 스캐닝될 수 있다는 주요 단점을 갖는다. 따라서, 첫번째 선행 방법은 소수의 MHC 클래스 II 분자에 대해서만 예측할 수 있다. 두번째 선행 방법도 또한, 한 분자 내의 유사한 아미노산이 배열된 포켓이 상이한 클래스 II 대립유전자의 맥락에서 동일한 결합 특징을 갖는다는 가정을 하고, 포켓 라이브러리 내에 포함되는 포켓을 포함하는 MHC 클래스 II 분자만이 '버추얼하게 (virtually)' 생성될 수 있다는 추가적 단점을 갖는다. 본원에 기재된 모델링 접근법을 이용하여, 임의 수 및 유형의 MHC 클래스 II 분자의 구조를 유추할 수 있고, 따라서 전체 집단을 대표하도록 대조유전자를 구체적으로 선택할 수 있다. 또한, 스캐닝되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 복잡한 실험을 통해 추가적인 데이타를 생성시켜야 하는 것보다 훨씬 더 많은 모델을 만들어서 증가될 수 있다.
골격 라이브러리의 이용은 특정한 MHC 클래스 II 분자로 도킹되는 경우, 스캐닝되는 다양한 펩티드의 Cα원자의 위치에서의 변화를 허용한다. 이는 다시, 특히 포켓에서의 아미노산 결합의 스캐닝을 위해 단순화한 펩티드 골격의 이용에 의존하는 상기 기재된 대안적인 전산적 선행 방법과 대조적이다. 이러한 단순화된 골격은 '실제' 펩티드에서 발견되는 골격 입체구조의 대표물이 아닐 수 있어, 펩티드 결합의 예측이 부정확해진다. 본 발명의 골격 라이브러리는 단백질 데이타 뱅크 내에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 결합된 모든 펩티드의 골격을 포개고, 결합 그루브 내에 위치하는 11 개 아미노산 각각의 Cα원자 사이의 제곱 평균 제곱근 (RMS) 편차를 확인함으로써 생성된다. 상기 라이브러리는 소수의 적합하고 이용가능한 마우스 및 인간 구조 (현재 13 개) 에서 유도될 수 있지만, 더욱 큰 다양성을 가능케하기 위해, 각각의 C"-α위치에 대한 RMS 수를 50% 증가시킨다. 이어서 각각의 아미노산의 평균 Cα위치를 결정하고, 반경이 그 지점에서의 RMS 편차 + 50% 가 되는 상기 지점 주위로 구를 그린다. 상기 구가 허용되는 모든 Cα위치를 나타낸다.
최소의 RMS 편차를 갖는 Cα로 작업시 (결합 그루브 내 11 개 잔기의 위치 2 에 해당하는, 상기 언급된 포켓 1 의 아미노산의 것), 구를 3 차원적 격자로 분할하고, 격자 내의 각각의 정점을 상기 아미노산의 Cα의 가능한 위치로서 사용한다. 후속 아미노산으로의 펩티드 결합에 해당되는, 후속 아미드 평면은 상기 Cα들의 각각에 그래프트되며, φ및 Ψ각은 후속 Cα의 위치를 정하기 위해, 설정된 간격으로 단계적으로 회전된다. 후속의 Cα가 상기 Cα 에 대해 '허용되는 위치의 구' 내에 속하는 경우, 디펩티드의 배향이 허용되지만, 구의 외부에 속하는 경우 디펩티드는 거부된다. 이어서, 상기 절차를, 모든 9 개의 후속 Cα들이 선행 Cα들의 가능한 모든 순열로부터 배치될 때까지, 각각의 후속 Cα위치에 대해, 펩티드가 포켓 1 Cα'시드 (seed)' 로부터 성장하도록 반복한다. 이어서, 상기 절차를 단일 Cα선행 포켓 1 에 대해 한 번 더 반복하여, 결합 그루브 내에 위치하는 골격 Cα위치의 라이브러리를 생성시킨다.
생성되는 골격의 수는 여러 요인에 의존한다: '허용된 위치의 구' 의 크기; 포켓 1 위치에서 '일차 구' 의 격자의 세밀함; 후속 Cα의 위치를 정하는데 사용되는 Φ및 Ψ각의 단계적 회전의 세밀함. 상기 방법을 이용하여, 커다란 골격 라이브러리가 생성될 수 있다. 골격 라이브러리가 커질수록, MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 내의 특정 펩티드에 대한 최적의 피트 (fit) 가 발견될 가능성이 높아질 것이다. 결합 도메인의 아미노산과의 충돌로 인해, 모든 골격이 모든 MHC 클래스 II 분자 모델의 도킹에 적합하지는 않을 것이므로, 각각의 대립유전자에 대해, 상기 대립유전자에 의해 수용될 수 있는 골격을 포함하는 라이브러리의 서브세트를 생성한다. MHC 클래스 II 분자 모델과 함께 골격 라이브러리의 이용은, 각각의 허용되는 골격에 도킹된 각각의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브의 각 위치에서 각각의 아미노산에 대해 허용된 측쇄 입체구조로 구성되는 방대한 데이타베이스를 생성시킨다. 상기 데이타 세트는, MHC 클래스 II 분자가 골격에 도킹되고, 아미노산 측쇄가 목적하는 위치에서 골격에 그래프트되는 단순한 입체 오버랩 함수를 이용하여 생성된다. 측쇄의 각각의 회전가능한 결합은 설정된 간격으로 단계적으로 회전되며, 수득된 원자 위치는 언급된 결합에 의존한다. 상기 원자와 결합 그루브의 측쇄 원자간의 상호작용이 주지되며, 위치는 하기 기준에 따라 허용되거나 거부된다: 그 때까지 배치된 모든 원자의 겹침의 총 합은 소정 값을 초과하지 말아야 한다. 따라서, 입체구조 탐색의 엄격성 (stringency) 은 결합의 단계적 회전에 사용되는 간격 및 총 오버랩에 대한 소정 한계의 함수이다. 상기 후자의 값은 특정 포켓이 경직된 것으로 공지된 경우 작을 수 있지만, 엄격성은 포켓 측쇄의 위치가 비교적 유동적인 것으로 공지된 경우 완화될 수 있다. 따라서, 결합 그루브의 포켓 내에서 유연성의 변동을 모사할 수 있다. 이어서, 각각의 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 경우, 상기 입체구조 탐색을 각 골격의 매 위치마다 모든 아미노산에 대해 반복하여, 측쇄 입체구조의 방대한 데이타베이스를 생성시킨다.
상술된 골격/측쇄 입체구조의 거대 데이타베이스를 스캐닝하여 실험적으로 유도되어야 하는 펩티드 리간드 입체구조와 함께 MHC 클래스 II 분자 모델간의 결합 에너지를 추정하기 위해, 적합한 수학적 표현을 사용한다. 따라서, 하기 계산에 9 내지 20 개 아미노산 길이 (길이는 각각의 스캐닝에 대해 일정하게 유지됨) 의 각각의 가능한 펩티드를 적용시켜, 잠재적인 T 세포 에피토프에 대해 단백질을 스캐닝한다: 상기 분자에 대해 허용되는 펩티드 골격과 함께 MHC 클래스 II 분자를 선택하고, 목적하는 펩티드 서열에 해당하는 측쇄를 그 위에 그래프트한다. 골격 상의 특정 위치에서 특정 측쇄에 대한 원자 정체 및 원자간 거리 데이타를 상기 아미노산에 허용되는 각각의 입체구조에 대해 수집한다 (상술한 데이타베이스로부터 수득됨). 이를 골격을 따라 각각의 측쇄에 대해 반복하고, 점수계산 함수를 이용하여 펩티드 점수를 유도한다. 상기 골격에 대한 최고 점수를 간직하고, 선택된 모델에 대해 허용된 각각의 골격에 대해 절차를 반복한다. 허용된 모든 골격에 대한 점수를 비교하고, 최고 점수를 상기 MHC 클래스 II 모델에서 목적하는 펩티드에 대한 펩티드 점수로 간주한다. 이어서 스캐닝되는 단백질로부터 유도되는 가능한 모든 펩티드로써 각각의 모델에 대해 상기 절차를 반복하고, 모델 대비 펩티드 점수를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 결합 친화성 계산에 제시되는 각각의 리간드는 상술한 바와 같은 펩티드 또는 단백질에서 선택되는 아미노산 절편이다. 따라서, 상기 리간드는 공지된 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 유도되는 약 9 내지 20 개 아미노산 길이의 아미노산 연장물에서 선택된다. "아미노산" 및 "잔기" 라는 용어는 이후 동등한 용어로 간주된다. 조사될 펩티드의 연속적 아미노산이 골격 라이브러리로부터의 골격 상에 그래프트된 형태인 리간드를, 펩티드 골격의 C"-α원자의 좌표를 통해 MHC 클래스 II 분자 모델 라이브러리로부터의 MHC 클래스 II 분자의 결합 틈 내에 위치시키고, 각각의 측쇄에 허용되는 입체구조를 허용되는 입체구조의 데이타베이스로부터 선택한다. 관련된 원자 정체 및 원자간 거리를 또한 상기 데이타베이스로부터 검색하고, 펩티드 결합 점수를 계산하는 데 사용한다. MHC 클래스 II 결합 포켓에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 리간드를 위치 지정 돌연변이화에 대한 후보물로 지정한다. 지정된 리간드 내 (즉, 관심 단백질 내임)에 아미노산 치환을 수행한 후, 점수계산 함수를 이용해서 재시험하여, 결합 친화도를 소정 역치값 미만으로 감소시키는 변화를 결정한다. 이어서, 상기 변화를 관심 단백질 내로 도입하여 T 세포 에피토프를 제거시킬 수 있다.
펩티드 리간드와 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 사이의 결합에는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비공유 상호작용이 관여된다: 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 (친유성) 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용. 이들은 하기에 상세히 설명되는 바와 같은 펩티드 점수계산 함수에 포함된다. 수소 결합은 극성 또는 하전된 기 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합이고, 2 개의 다른 원자에 의해 공유되는 수소 원자로 구성된다는 것이 이해되어야 한다. 수소 공여자의 수소는 양전하를 갖는 반면, 수소 수용자는 부분적인 음전하를 갖는다. 펩티드/단백질 상호작용의 목적 하에, 수소 결합 공여자는 수소가 부착된 질소, 또는 산소 또는 질소에 부착된 수소일 수 있다. 수소 결합 수용자 원자는 수소에 부착되지 않은 산소, 수소가 부착되지 않고 1 또는 2 개의 연결을 갖는 질소, 또는 1 개의 연결만을 갖는 황일 수 있다. 특정 원자, 예컨대 수소에 부착된 산소또는 이민 질소 (예, C=NH) 는 수소 수용자 및 공여자 둘 다 될 수 있다. 수소 결합 에너지는 3 내지 7 Kcal/몰 범위이고, 반 데르 발스 결합보다 훨씬 더 강하지만, 공유 결합보다는 약하다. 수소 결합은 또한 매우 방향성이 있고, 공여자 원자, 수소 원자 및 수용자 원자가 함께 선형이 될때 가장 강하다. 정전기적 결합은, 반대로 하전된 이온쌍 사이에서 형성되며, 상호작용의 강도는 쿨롱의 법칙에 따라 원자간 거리의 제곱에 반비례한다. 이온쌍 사이의 최적 거리는 약 2.8Å 이다. 단백질/펩티드 상호작용에서, 정전기적 결합은 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신과 아스파르테이트 또는 글루타메이트 사이에 형성될 수 있다. 결합의 강도는 이온화기의 pKa 및 매질의 유전 상수에 의존할 것이지만, 이들은 대략 수소 결합의 강도와 유사하다. 친유성 상호작용은 단백질 및 펩티드 리간드 사이에 일어나는 호의적인 소수성-소수성 접촉이다. 통상적으로 이들은, 용매에 노출되지 않도록 결합 그루브의 포켓 내에 묻혀있는 펩티드의 소수성 아미노산 측쇄 사이에 일어날 것이다. 소수성 잔기의 용매로의 노출은, 주위 용매 분자가 서로 수소 결합을 형성하도록 강요되어, 우리 모양의 포접화합물 (clathrate) 구조를 형성하므로 매우 불리하다. 생성되는 엔트로피의 감소도 매우 불리하다. 친유성 원자는 극성도 수소 수용자도 아닌 황이거나, 극성이 아닌 탄소 원자일 수 있다.
반 데르 발스 결합은 3 - 4Å 떨어진 원자 사이에서 발견되는 비특이적 힘이다. 이들은 수소 및 정전기적 결합보다 약하고 덜 특이적이다. 원자 주위의 전하 분포는 시간에 따라 변화하며, 어떤 경우에도 전하 분포는 비대칭적이다.상기 일시적인 전하의 비대층은 주위 원자에서도 유사한 비대칭을 유도한다. 생성된 원자 사이의 인력은 반 데르 발스 접촉 거리에서 최대치에 이르지만, 약 1Å 내지 약 2Å 에서 급격히 감소한다. 반대로, 원자가 상기 접촉 거리 미만으로 분리되면, 원자의 외부 전자 구름이 겹치면서, 점점 더 강해지는 척력이 우세해진다. 인력이 정전기적 및 수소 결합에 비해 비교적 약하지만 (약 0.6 Kcal/몰), 척력은 특히 펩티드 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있는지 여부를 결정하는데 매우 중요할 수 있다.
한 구현예에서는, Boehm 점수계산 함수 (SCORE1 접근법) 를 사용하여 결합 상수를 추정한다 (Boehm, H. J.,J. Comput Aided Mol. Des.,8(3): 243-256 (1994), 본원에 그 전문이 도입됨). 또다른 구현예에서는, 점수계산 함수 (SCORE2 접근법) 를 사용하여, T 세포 에피토프를 포함하는 리간드의 지표로서 결합 친화성을 추정한다 (Boehm, H. J.,J. Comput Aided Mol. Des.,12(4): 309-323 (1998) 본원에 그 전문이 도입됨). 그러나, 상기 참고문헌에 기재된 바와 같은 Boehm 점수계산 함수는, 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있음이 이미 공지되어 있고, 단백질/리간드 복합체의 구조가 해석되었으며, 해석된 구조가 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에 존재하는 경우의 단백질에 대한 리간드의 결합 친화성을 추정하는 데 사용된다. 따라서, 점수계산 함수는 공지된 긍정적 결합 데이타의 덕에 개발되었다. 긍정적 및 부정적 결합자들 사이의 구별을 가능하게 하기 위해, 반발 항목이 등식에 첨가되어야 한다. 또한, 상기 Boehm 함수의 면적 기준 에너지 항목을 이용하기보다는 쌍쌍의 (pairwise) 친유성 상호작용을 계산하여, 보다 만족스러운 결합 에너지의 추정이 얻어진다. 따라서, 바람직한 구현예에서는 결합 에너지가 변경된 Boehm 점수계산 함수를 이용하여 추정된다. 변경된 Boehm 점수계산 함수에서는, 단백질 및 리간드 사이의 결합 에너지 (ΔGbind)가 하기 파라미터를 고려하여 추정된다: 리간드의 전체적인 병진 및 회전 엔트로피의 소실로 인한 결합 에너지의 감소 (ΔG0); 1 개 이상의 파트너가 중성인 경우의 이상적인 수소 결합의 기여 (ΔGhb); 비교란 (unperturbed) 이온 상호작용의 기여 (ΔGionic); 친유성 리간드 원자와 친유성 수용자 원자 사이의 친유성 상호작용 (ΔGlipo); 리간드의 내부 자유도 동결, 즉 각각의 C-C 결합에 대한 회전 자유의 감소로 인한 결합 에너지의 소실 (ΔGrot); 단백질과 리간드 사이의 상호작용 에너지 (EVdW). 상기 항목을 고려하여 수학식 1 을 수득한다:
[수학식 1]
(ΔGbind) = (ΔG0) + (ΔGhb×Nhb) + (ΔGionic×Nionic) + (ΔGlipo×Nlipo) + (ΔGrot+ Nrot) + (EVdW).
식 중, N 은 특정 항목에 대해 한정하는 상호작용의 수이고, 한 구현예에서, ΔG0, ΔGhb, ΔGionic, ΔGlipo및 ΔGrot은 각각 하기 값을 갖는 상수이다: 5.4, -4.7, -4.7, -0.17, 및 1.4.
항목 Nhb는 하기 수학식 2 에 따라 계산된다:
[수학식 2]
Nhb= Σh-bondsf (ΔR, Δα) × f (Nneighb) × fpcs
f (ΔR, Δα) 는 이상적인 상황으로부터의 수소 결합의 큰 편차를 설명하는 페널티 함수이며, 수학식 3 에 따라 계산된다:
[수학식 3]
f (ΔR, Δ-α) = f1 (ΔR) × f2 (Δα)
[식 중, ΔR ≤TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 이거나
ΔR ≤0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 - (ΔR - TOL)/0.4 이거나
ΔR > 0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 0 이고,
또한: Δα < 30°인 경우, f2 (Δα) = 1 이거나
Δα ≤ 80°인 경우, f2 (Δα) = 1 - (Δα-30)/50 이거나
Δα > 80°인 경우, f2 (Δα) = 0 이며,
TOL 은 수소 결합 길이 = 0.25Å 에서의 관용 편차이고,
ΔR 은 이상값 = 1.9Å 로부터 H-O/N 수소 결합 길이의 편차이며,
Δα는 이상값 180°로부터 수소 결합각 ∠N/O-H..O/N의 편차이다].
f(Nneighb) 는 단백질 표면의 오목한 부분과 볼록한 부분을 구별하므로, 단백질 표면에서 발견되는 것보다는 포켓 내에서 발견되는 극성 상호작용에 더 큰 비중을 부여한다. 상기 함수는 하기 수학식 4 에 따라 계산된다:
[수학식 4]
f(Nneighb) = (Nneighb/Nneighb,0)α[식 중, α = 0.5 이다].
Nneighb는 임의의 주어진 단백질 원자에 대해 5Å 보다 더 가까운 비수소 단백질 원자의 수이다.
Nneighb.0는 상수 = 25 이다.
fpcs는 수소 결합 당 극성 접촉 표면적을 허용하는 함수이므로, 강한 수소 결합과 약한 수소 결합 사이를 구별하며, 그 값은 하기 기준에 따라 결정된다:
Apolar/NHB< 10Å2인 경우 fpcs= β이거나
Apolar/NHB> 10Å2인 경우 fpcs= 1 이다.
[식 중, Apolar는 극성 단백질-리간드 접촉면의 크기이고,
NHB는 수소 결합의 수이며,
β는 그 값이 1.2 인 상수이다].
변경된 Boehm 점수계산 함수의 실행에 있어서, 동일한 기하학적 의존성이 가정되므로, 이온성 상호작용의 기여인 ΔGionic은 상술된 수소 결합의 기여에 대해서와 유사한 방식으로 계산된다.
항목 Nlipo는 하기 수학식 5 에 따라 계산된다:
[수학식 5]
Nlipo= Σ1Lf(r1L)
f(r1L) 은 모든 친유성 리간드 원자, l 및 모든 친유성 단백질 원자, L 에 대해 하기 기준에 따라 계산된다:
r1L≤ Rl 인 경우 f(r1L) =1,
R2 < rlL> R1 인 경우 f(r1L) = (r1L-R1)/ (R2-R1),
r1L≥ R2 인 경우 f(r1L) = 0
[식 중, R1 = rl vdw+ rL vdw+ 0. 5 이고,
R2 = R1 + 3.0 이며,
rl vdw은 원자 l 의 반 데르 발스 반경이고,
rL vdw은 원자 L 의 반 데르 발스 반경이다].
항목 Nrot는 아미노산 측쇄의 회전가능한 결합의 수이며, 비환식 sp3-sp3및 sp3-sp2결합의 수로 여겨진다. 말단 -CH3또는 -NH3의 회전은 고려되지 않는다.
최종 항목 EVdW는 하기 수학식 6 에 따라 계산된다:
[수학식 6]
EVdW= ε1ε2((r1 vdw+ r2 vdw)12/r12- (r1 vdw+ r2 vdw)6/r6)
[식 중, ε1및 ε2는 원자 정체에 근거하는 상수이고,
r1 vdw+ r2 vdw는 반 데르 발스 원자 반경이며,
r 은 원자 쌍 사이의 거리이다].
수학식 6 에 대해, 한 구현예에서, 상수 ε1및 ε2에 각각 하기의 원자 값이 주어진다: C: 0.245, N: 0.283, O: 0.316, S: 0.316 (즉, 각각 탄소, 질소, 산소 및 황 원자에 대한 것). 수학식 5 및 6 에 대해, 반 데르 발스 반경에 하기의 원자 값이 주어진다: C: 1.85, N: 1.75, O: 1.60, S: 2.00Å.
상기 수학식에서 주어진 모든 소정의 값 및 상수는, 특히 본원에서 수행되는 계산의 유형에 따라 단백질 리간드 상호작용에 대한 현재의 이해 내용의 한계 내에서 결정되는 것임이 이해되어야 한다. 따라서, 상기 점수계산 함수가 더욱 개선됨에 따라, 상기 값 및 상수가 변할 수 있으므로, 리간드에 대한 단백질의 결합 에너지의 추정 차원에서 목적하는 결과를 제공하는 임의의 적합한 수치값이 사용될 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 범위 내에 속한다.
상술한 바와 같이, 점수계산 함수는 측쇄 입체구조, 원자 정체 및 원자간 거리의 데이타베이스에서 추출되는 데이타에 적용된다. 본원의 목적 하에, 상기 데이타베이스에 포함되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 42 모델 + 4 개의 해석된 구조이다. 상기 기재로부터, 본 발명의 전산적 방법의 구축의 모듈적 성질은, 펩티드 골격 라이브러리, 및 상술한 바와 같이 펩티드 점수계산 함수에 의해 처리될 수 있는 부가적 데이터 세트를 생성시키는 측쇄 입체구조 탐색 함수를 사용하여, 신규 모델이 간단하게 첨가되고 스캐닝될 수 있음을 의미하는 것이 자명하다. 이는, 존재하는 대립유전자의 보다 정확한 모델을 생성시키도록 데이타가 존재한다면, 스캐닝된 MHC 클래스 II 분자의 목록이 쉽게 증가되게 하거나, 구조 및 관련 데이타가 대체될 수 있게 한다.
본 발명의 예측 방법은, 다양한 MHC 클래스 II 분자에 대한 친화성이 미리 실험적으로 결정된 다수의 펩티드를 포함하는 데이타 세트에 대해 보정될 수 있다. 계산된 데이타 대 실험적 데이타를 비교함으로써, 모든 실험적으로 결정된 T 세포 에피토프가 정확히 예측된 것으로 공지되는 하한치가 결정될 수 있다.
상기 점수계산 함수는 이용가능한 일부 복잡한 방법론에 비해 비교적 단순하지만, 계산은 극히 신속히 수행됨이 이해되어야 한다. 또한, 그 목적이, 선택된 MHC 클래스 II 단백질의 결합 그루브 내에 도킹된 각각의 펩티드에 대한 실제 결합 에너지 그 자체를 계산하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 기본적인 목적은, 선택된 단백질의 일차 구조 (즉, 아미노산 서열)를 근거로 T 세포 에피토프의 위치 예측에 도움을 주는, 비교적인 결합 에너지 데이타를 수득하는 것이다. 상대적으로 높은 결합 에너지 또는 상기 선택된 역치값 초과의 결합 에너지는 리간드 내 T 세포 에피토프의 존재를 제시할 것이다. 이어서, 리간드를 1 회 이상의 아미노산 치환 처리하여, 결합 에너지를 재계산할 수 있다. 신속한 계산의 속성으로 인해, 상기 펩티드 서열의 조작은, 비용효과적으로 이용가능한 컴퓨터 하드웨어 상의 프로그램의 사용자 인터페이스 내에서 쌍방향으로 수행될 수 있다. 따라서, 컴퓨터 하드웨어에 대한 거대한 투자가 요구되지 않는다.
당업자에게는, 동일한 목적을 위해 다른 이용가능한 소프트웨어를 사용할 수 있음이 자명할 것이다. 특히, 단백질 결합 부위 내로 리간드를 도킹시킬 수 있는 보다 복잡한 소프트웨어를 에너지 최소화와 연관시켜 이용할 수 있다. 도킹 소프트웨어의 예에는 하기가 있다: DOCK (Kuntz 등,J. Mol. Biol.,161: 269-288 (1982)), LUDI (Boehm, H. J.,J. Comput Aided Mol. Des.,8: 623-632 (1994)) 및 FLEXX (Rarey M., 등,ISMB,3: 300-308 (1995)). 분자 모델링 및 조작 소프트웨어의 예에는 하기가 포함된다: AMBER (Tripos) 및 CHARMm (Molecular Simulations Inc.). 상기 전산적 방법의 사용은, 필요한 계산을 수행하는 데 걸리는 처리 시간의 길이로 인해, 본 발명의 방법의 효율을 상당히 제한할 것이다. 그러나, 상기 방법들이, 본 발명의 방법을 통해 '긍정적 결합자' 로 밝혀지는 펩티드에 대한 보다 정확한 결합 에너지의 계산을 수득하기 위한 '2 차 스크린' 으로 사용될 수도 있다. 복잡한 분자 기계적 또는 분자 역학적 계산을 위한 처리 시간의 제한은, 상기 계산을 수행하는 소프트웨어의 고안 및 컴퓨터 하드웨어의 현재의 기술 한계 둘 다에 의해 정의되는 것이다. 미래에는, 보다 효율적인 코드의 기록 및 지속적인 컴퓨터 프로세서의 속도 증가로 인해, 보다 제어가능한 시간틀 내에서 상기 계산이 이루어질 것임을 예견할 수 있다. 폴딩된 단백질 구조 내에서 일어나는 다양한 상호작용의 고려 및 거대분자에 적용되는 에너지 함수에 대한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있고: [Brooks, B. R., 등,J. Comput.Chem.,4: 187-217 (1983)], 일반적인 단백질-리간드 상호작용에 관한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있으며: [Dauber-Osguthorpe 등,Proteins 4(1): 31-47 (1988)], 이들은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된다. 유용한 배경 정보는 또한, 예를 들어 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다 [Fasman, G. D. 편저,Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9].

Claims (34)

  1. 소정 종의 면역계에 노출되고 비개질 항체에 비교했을 경우, EGF 수용체 (Her 1)에 대한 임의의 본래 면역원적으로 비개질된 항체보다 동일한 수용체에 대해 면역원성이 적거나 또는 실질적으로 없는 개질 항체 또는 그의 단편으로, 상기 개질 항체는, 본래의 비개질 항체에 비해, T-세포 에피토프 서열 및/또는 상기 비개질 항체로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형체 (allotype)를 감소된 수로 함유하거나 또는 함유하지 않는 개질 항체 또는 그의 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 본래 존재하는 T 세포 에피토프가 클래스 II 상에서의 제공을 통하여 T 세포를 자극하거나 또는 결합할 수 있는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인 개질 항체.
  3. 제 2 항에 있어서, 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프 중의 1~9 개의 아미노산 잔기들이 변경된 개질 항체.
  4. 제 3 항에 있어서, 1 개의 아미노산 잔기가 변경된 개질 항체.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 아미노산 잔기들의 변경이 특정 위치(들)에서 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 다른 아미노산 잔기(들)로의 치환인 개질 항체.
  6. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 아미노산 잔기들의 변경이 특정 위치(들)에서 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 결실인 개질 항체.
  7. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 아미노산 잔기들의 변경이 특정 위치(들)에서 본래 존재하는 아미노산에 대해 아미노산(들)의 삽입 (addition)인 개질 항체.
  8. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 아미노산(들)의 추가의 치환, 삽입 또는 결실을 수행하여 상기 분자의 생물학적 활성을 회복하는 개질 항체.
  9. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변경이 상동성 단백질 서열을 참조하여 수행되는 개질 항체.
  10. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변경이 컴퓨터 이용 (in silico) 모델링 기술을 참조하여 수행되는 개질 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 본래의 면역원적으로 비개질된 항체가 비인간 기원(non-human origin)으로부터 완전히 또는 부분적으로 유도되는 서열들을 함유하는 개질 항체.
  12. 제 11 항에 있어서, 본래 면역원적으로 비개질된 항체가 키메라성 항체인 개질 항체.
  13. 제 11 항에 있어서, 본래 면역원적으로 비개질된 항체가, 대응하는 인간 참조 골격부 (framework) 서열로부터 유도되는, CDR 영역에 가깝지 않은 것들을 제외한 표면 잔기들을 함유하는 비인간 항체 (베니어드 항체: veneered antibody)인 개질 항체.
  14. 제 11 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 본래 면역원적으로 비개질된 항체가 쥐과 (murine)의 항체인 개질 항체.
  15. 제 14 항에 있어서, 본래 항체가 쥐과의 MAb425 인 개질 항체.
  16. 제 15 항에 있어서, 개질 MAb 425가 표 5 에 나타낸 것과 같은 서열 중 임의의 것을 함유하는 개질 항체.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 개질 항체의 중쇄 (heavy chain) 및/또는 경쇄 (light chain)를 코딩하는 DNA 서열.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 개질 항-EGFR 항체, 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 약학 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 약물학적으로 유효한 약물을 추가로 함유하는 약학 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 약물이 세포독성제인 약학 조성물.
  21. (i) 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 하나 이상의 면역원적으로 개질 항-EGFR 항체를 함유하는 패키지 (package), 및 (ii) 하나 이상의 기타 약물학적으로 유효한 약물을 함유하는 패키지를 포함하는 약학 키트.
  22. 제 21 항에 있어서, 약물이 세포독성제인 약학 키트.
  23. 하기 단계를 포함하는, 소정의 종의 면역계에 노출되고 비개질 항체와 비교할 경우, EGF 수용체 (Her 1)에 대한 임의의 본래 면역원적으로 비개질된 항체보다 동일한 수용체에 대해 면역원성이 적거나 또는 실질적으로 없는 개질 항체 또는 그의 단편의 제조방법:
    (i) 본래 면역원적으로 비개질된 항체 또는 그의 일부의 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    (ii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용하여 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의해, 항체의 아미노산 서열 중 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프를 동정하는 단계;
    (iii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 사용하여 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합에 의해 또는 T 세포들에 대한 펩티드-MHC 복합체의 결합에 의해 결정되는 T 세포 에피토프의 활성이 실질적으로 감소 또는 제거되도록 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 중의 하나 이상의 아미노산을 사용하여 새로운 서열 변이체를 고안하는 단계;
    (iv) 재조합 DNA 기술에 의해 이러한 서열 변이체들을 구축하고, 목적하는 성질을 갖는 하나 이상의 변이체들을 동정하기 위하여 상기 변이체들을 시험하는 단계; 및
    (v) (ii)~(iv) 단계들을 임의로 반복하는 단계.
  24. 제 23 항에 있어서, 단계 (iii)이 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프에서 1~9 개의 아미노산 잔기들의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 실시되는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 변경이 상동성 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조하여 수행되는 방법.
  26. 제 23 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 하기 단계들에 의해 실시되는 방법: (a) 기지의 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드의 영역을 선택하는 단계; (b) 선택된 영역으로부터 3 개 이상의 아미노산 잔기들에 의해 구성되는, 미리 결정된 균일한 크기의 중복 (overlapping) 아미노산 잔기 절편을 순차적으로 샘플링하는 단계; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 각 소수성 아미노산 잔기의 측쇄에 대해 지정된 값들의 합산에 의한, 상기 각 샘플링된 절편에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 점수를 계산하는 단계; 및 (d) 그 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 점수에 근거하여, 펩티드의 치료적 유용성을 실질적으로 감소시키지 않으면서 펩티드에 대한 전체 MHC 클래스 II 결합 점수를 변화시키는 개질에 적합한 하나 이상의 절편을 동정하는 단계.
  27. 제 26 항에 있어서, 단계 (c)가 하기에 의해, 12~6 의 반데르 발스 리간드-단백질 에너지 반발 항목 및 리간드 구조 에너지 항목을 포함하도록 변경된 봄 (Boehm) 점수계산 함수를 사용함으로써 실시되는 방법: (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 제 1 데이타베이스를 제공하고; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 제 2 데이타베이스를 제공하고; (3) 상기 제 1 데이타베이스로부터 모델을 선택하고; (4) 상기 제 2 데이타베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하고; (5) 샘플링된 각 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄들을 동정하고; (6) 샘플링된 각 절편에 존재하는 모든 측쇄들에 대한 결합 친화도 값을 결정하고;상기 각 모델 및 상기 각 골격에 대해 단계 (1) 내지 (5)를 반복.
  28. 제 23 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 기원으로부터 완전히 또는 부분적으로 유도되는 서열을 함유하는, 본래 면역원적으로 비개질된 항체가 사용되는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 본래 면역원적으로 비개질된 항체가 키메라성 항체인 방법.
  30. 제 28 항에 있어서, 본래 면역원적으로 비개질된 항체가, 대응하는 인간 참조 골격부 서열로부터 유도되는, CDR 영역에 가깝지 않은 것들을 제외한 표면 잔기들을 함유하는 비인간 항체 (베니어드 항체)인 방법.
  31. 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 본래 면역원적으로 비개질된 항체가 쥐과의 항체인 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 본래 항체가 쥐과의 MAb 425 인 방법.
  33. 생체 내에서 사용되는 경우 비개질 항체에 비해 면역원성이 적거나 또는 실질적으로 없는, 면역원적으로 개질된 항체의 제조를 위한, 면역원적으로 비개질된항체로부터 제조되고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 13량체 (13mer) T 세포 에피토프 펩티드의 용도 [상기 항체는 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 각각 특정된 것이다].
  34. 생체 내에서 사용되는 경우 비개질 항체에 비해 면역원성이 적거나 또는 실질적으로 없는 면역원적으로 개질된 항체의 제조를 위한, 면역원적으로 비개질된 항체로부터 제조되고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 13량체 T 세포 에피토프의 9 개 이상 연속된 아미노산 잔기들을 갖는 펩티드 서열의 용도 [상기 항체는 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 각각 특정된 것이다].
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