KR20160055253A - 변형된 항-상피세포 성장인자 수용체 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

변형된 항-상피세포 성장인자 수용체 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20160055253A
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게 웨이
그레고리 이안 프로스트
헤롤드 마이클 셰퍼드
크리스토퍼 디. 타노스
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할로자임, 아이엔씨
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Abstract

본원은 변형된 항-EGFR 항체 및 변형된 항-EGFR 항체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 또한 본 발명은 변형된 항-EGFR 항체를 사용하는 치료 방법 및 용도를 제공한다.

Description

변형된 항-상피세포 성장인자 수용체 항체 및 이의 사용 방법{MODIFIED ANTI-EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF}
관련된 출원
우선권의 이익은 2013.09.12. 자로 출원된 발명의 명칭이 "변형된 항-상피세포 성장인자 수용체 항체 및 이의 사용 방법"인 미국 가출원 일련번호 제61/960,253호에 대하여 주장된다.
본 출원은 미국 가출원 일련번호 제61/960,253호에 대하여 우선권을 주장하는, 이와 동일자에 출원된 발명의 명칭이 "변형된 항-상피세포 성장인자 수용체 항체 및 이의 사용 방법"인 미국 출원 일련번호 제14/485,620호와 관련된다.
본 출원은 또한 2012.03.12. 자로 출원된 "조건부 활성 항-상피세포 성장인자 수용체 항체 및 이의 사용 방법"을 명칭으로 하는 미국 가출원 일련번호 제61/685,089호에 대하여 우선권을 주장하는, 2013.03.08. 자 출원된 "조건부 활성 항-상피세포 성장인자 수용체 항체 및 이의 사용 방법"을 명칭으로 하는 미국 출원 일련번호 제13/815,553호에 관련된다.
본 출원은 또한 2012.03.8. 자 출원된 "조건부 활성 항-상피세포 성장인자 수용체 항체 및 이의 사용 방법"을 명칭으로 하는 미국 가출원 일련번호 제61/685,089호에 대하여 우선권을 주장하는 2013.03.08. 자 출원된 "조건부 활성 항-상피세포 성장인자 수용체 항체 및 이의 사용 방법"을 명칭으로 하는 국제 PCT 출원 일련번호 제PCT/US13/30055호에 관련된다.
본 출원은 또한 2010.09.08.자 출원된 "조건부 활성 치료적 단백질을 평가 및 확인 또는 진화시키는 방법 및 조건부 활성 치료적 단백질"을 명칭으로 하는 미국 가출원 일련번호 제61/402,979호에 대하여 우선권을 주장하는 2011.09.08. 자 출원된 "조건부 활성 치료적 단백질을 평가 및 확인 또는 진화시키는 방법"을 명칭으로 하는 국제 출원 제PCT/US11/50891호의 부분-연속 출원(continuation-in-part)인, 2011.09.27. 자로 출원된 "조건부 활성 치료적 단백질을 평가 및 확인 또는 진화시키는 방법"을 명칭으로 하는 미국 출원 일련번호 제13/200,666호와 관련된다.
상기 표시된 관련된 출원 각각의 주제는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
전자적으로 제공된 서열 목록의 참조에 의한 통합
서열 목록의 전자 버전이 본원과 함께 제출되며, 그 내용물은 전체로서 본원에 참조에 의해 통합된다. 전자적 파일은 2014.09.12.자로 작성되었고, 744 킬로바이트(kilobytes) 크기이고, 3118seqPC1.txt로 명명되었다.
발명의 분야
본원에서 변형된, 조건부 활성 항-EGFR 항체 및 변형된, 조건부 활성 항-EGFR 항체를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다.
항-EGFR 항체는 인간 질환, 예를 들어 암의 치료 및 진단을 위한 임상적 설정에서 사용된다. 예를 들어, 예시적인 치료적 항체는 세툭시맙(Cetuximab)을 포함한다. 세툭시맙은 재발성 또는 전이성 두경부암, 대장암 및 기타 질환 및 상태의 치료용으로 허가되었다. 세툭시맙은 또한 EGFR의 과발현 또는 EGFR의 비정상적 신호전달 또는 활성화와 관련된 기타 질환 또는 상태의 치료에 사용될 수 있다. 투여된 항-EGFR 항체는 건강한 세포 및 조직의 EGFR에 결합할 수 있다. 이는 투여될 수 있는 투여량을 제한한다. 그러므로, 세툭시맙 및 기타 항-EGFR 항체는 환자에게 투여될 때 한계(limitations)를 나타낸다. 따라서, 비-종양 환경과 비교하여 종양 미세환경에서 증가된 EGFR 결합 활성을 나타내는 개선된 항-EGFR 항체를 제공하는 것이 본원의 목표 중에 있다.
요약
본원에서 변형된 항-상피세포 성장인자 수용체(EGFR) 항체, 및 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 구체적으로, 상기 항체 및 이의 항원 결합 단편은 항-EGFR 항체 세툭시맙 또는 이의 항원-결합 단편 및 기타 세툭시맙 변이체 및 항원-결합 단편과 비교하여 아미노산 치환을 포함한다. 상기 항체는 가변 중쇄에서 서열번호 2 또는 7에 기재된 아미노산 위치를 참고로 하여 104번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)으로의 치환에 상응하는 아미노산 치환을 함유한다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 EGFR 항원(예를 들어, 인간 EGFR) 및 이의 가용성 단편에 특히적으로 결합하고 약 7 내지 7.2의 중성 pH를 갖는 피부 기저층에 존재하는 바와 같은, 비-종양 조직에 존재하는 바와 같은 중성 pH 조건 하에서 보다 종양 미세환경에서 존재하는 바와 같은 산성 pH 조건 하 더 큰 활성(결합 친화도)을 나타낸다. 그러므로 104번 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환인 글루탐산을 함유하는 변형된 세툭시맙 항체 및 이의 단편들이 제공된다. 이는 추가 변형을 함유하는 세툭시맙, 세툭시맙의 변형된 변이체 및 이의 단편을 포함한다.
항-EGFR 항체들은 EGFR 수용체에 결합하여 리간드 결합을 억제함으로써 리간드 결합 하에 발생하는 EGFR-매개 활성을 방지하므로 항-종양 치료제로 사용된다. 그 결과, 이러한 항체들은 종양을 억제 또는 치료할 수 있다. 종양이 아닌, 피부 조직과 같은 조직들도 EGFR을 발현하기 때문에, 항-EGFR 항체들은 이들 수용체 활성을 억제하고, 이로 인하여 원치않는 부작용을 야기한다. 본원에서 제공되는 항체는 pH-선택적 결합 활성을 나타내지 않는 항체에 비하여 및/또는 산성 pH 조건 하 EGFR 결합 활성에 비하여 EGFR 결합 활성이 중성 pH(예를 들어 pH 7.0 내지 7.4)에서 감소되므로, pH-선택적 결합 활성을 나타낸다. pH-선택적 활성 덕분에, 제공되는 항-EGFR 항체는 더 적거나, 더 낮은 원치않는 부작용을 나타내고 및/또는 더 높은 용량으로 투여하는 능력 덕분에 치료되는 개체에 개선된 효능을 나타낸다.
예를 들어, 비변형 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄에서서열번호 2 또는 7에 기재된 아미노산 위치를 참고로 하여 104번 위치에 상응하는 위치에 글루탐산(E)으로의 치환에 상응하는, 아미노산 치환(들)을 함유하는 변형된 항-EGFR 항체 및 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 상기 변형된 항-EGFR 항체는 특이적으로 상피세포 성장인자 수용체(EGFR) 또는 이의 가용성 단편에 결합하고; 상기 비변형 항-EGFR 항체는 세툭시맙, 이의 항원-결합 단편 또는 이의 변이체이고, 특이적으로 EGFR에 결합하며, 아미노산 치환을 함유하지 않고; 및 상응하는 아미노산 위치는 상기 항체의 가변 중쇄와 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄의 정렬에 의해 식별된다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 임의의 예에 있어서, 아미노산 치환이 이루어진 비변형 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄, 또는 서열번호 2 또는 7과 적어도 70% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열; 및 서열번호 4, 9 또는 11에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 4, 9 또는 11과 적어도 705 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유한다. 예를 들어, 비변형 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2 또는 7에 기재된 아미노산 서열에 대하여 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 나타내는 가변 중쇄; 및/또는 서열번호 4, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열에 대하여 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 가변 경쇄를 함유한다.
예를 들어, 글루탐산으로 치환된 비변형 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄를 함유한다. 몇몇 변형에서, 상기 비변형 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 9 또는 11에 기재된 가변 경쇄를 함유한다.
상술한 예들 중 임의의 예에서 아미노산이 치환된 비변형 항-EGFR 항체는 세툭시맙의 인간화 변이체이다. 이러한 예에서, 인간화 비변형 세툭시맙은 서열번호 14에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 15에 기재된 가변 경쇄를 가질 수 있고; 또는 서열번호 16에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 17에 기재된 가변 경쇄를 가질 수 있다.
상술한 예들 중 임의의 예에서, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2 또는 7에 대하여 적어도 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 또는 85% 서열 동일성을 나타내는 가변 중쇄를 가질 수 있다.
본원에서 제공되는 임의의 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 전장(full-length) 항체일 수 있고 또는 Fab, Fab', F(ab')2, 단일-쇄 Fv(single-chain Fv, scFv), Fv, dsFv, 디아바디(diabody), Fd 및 Fd' 단편 중에서 선택된 항원-결합 단편일 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편에 포함되는 것은 서열번호 74 또는 75에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 74 또는 75에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 4, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 4, 9 또는 11에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 가변 경쇄(VL)를 갖는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 예를 들어, 비변형 세툭시맙 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄를 갖고, 변형되어 서열번호 75에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 75에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 4에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 가변 경쇄(VL)를 갖는 변형된 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 생성한다. 다른 예들에서, 비변형 세툭시맙 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 비변형 항-EGFR 항체는 서열번호 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 9에 기재된 가변 경쇄를 갖고, 상기 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 74에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 74에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 9에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 가변 경쇄(VL)를 갖는다. 다른 예들에서, 비변형 세툭시맙 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 11에 기재된 가변 경쇄를 갖고, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 74에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 74에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 11에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 가변 경쇄(VL)를 갖는다.
본원의 임의의 예에서 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 74 또는 75에 기재된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 72의 아미노산 120-449에 기재된 중쇄 불변 영역 또는 서열번호 72의 아미노산 120-449에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체; 및 서열번호 4, 9 또는 11 중 어느 하나에 기재된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 3 또는 10의 아미노산 108-213에 기재된 불변 영역 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체 또는 서열번호 8 또는 13의 아미노산 108-214에 기재된 불변 영역, 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 갖는 전장(full-length) IgG 항체이다. 예를 들어, 전장(full-length) 중쇄는 서열번호 72에 기재된 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체, 및 서열번호 3, 8, 10 또는 13 중 어느 하나에 기재된 전장(full-length) 경쇄 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 갖는다.
제공되는 임의의 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 비변형 항체와 비교하여 가변 중쇄에 하나 이상의 추가적 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있다. 서열번호 2 또는 7에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 추가적 변형의 비-제한적 예들은 아미노산 치환 T023K, T023H, T023R, T023A, T023C, T023E, T023G, T023I, T023M, T023N, T023P, T023S, T023V, T023W, T023L, V024R, V024A, V024F, V024G, V024I, V024M, V024P, V024S, V024T, V024L, V024E, S025H, S025R, S025A, S025C, S025D, S025E, S025F, S025G, S025I, S025M, S025P, S025Q, S025T, S025V, S025L, G026H, G026R, G026D, G026F, G026M, G026N, G026P, G026Q, G026S, G026Y, G026L, F027H, F027R, F027A, F027D, F027E, F027G, F027M, F027P, F027Q, F027S, F027T, F027V, F027W, F027Y, F027L, S028K, S028H, S028R, S028A, S028D, S028I, S028M, S028P, S028Q, S028V, S028W, S028L, S028C, L029K, L029H, L029A, L029D, L029G, L029I, L029M, L029N, L029S, L029V, T030H, T030R, T030D, T030G, T030I, T030M, T030N, T030P, T030S, T030V, T030W, T030Y, N031K, N031H, N031D, N031E, N031G, N031I, N031T, N031V, N031L, Y032H, Y032R, Y032C, Y032M, Y032N, Y032T, Y032V, Y032L, G033E, G033M, G033S, G033T, G033Y, V034A, V034C, V034I, V034M, V034P, V034L, H035I, H035Q, W036K, W036A, W036I, W036V, W036Y, V050K, V050H, V050A, V050D, V050E, V050G, V050I, V050N, V050Q, V050T, V050L, I051K, I051H, I051A, I051C, I051E, I051G, I051N, I051Q, I051S, I051V, I051Y, I051L, W052I, W052N, W052Y, S053H, S053R, S053A, S053C, S053G, S053I, S053M, S053P, S053Q, S053L, S053T, S053V, S053Y, G054H, G054R, G054A, G054C, G054D, G054P, G054S, G055H, G055R, G055M, G055S, G055Y, N056K, N056A, N056P, N056S, N056V, N056G, T057H, T057R, T057L, T057A, T057C, T057D, T057F, T057M, T057N, T057Q, T057W, T057Y, D058L, D058G, D058M, D058N, D058Q, Y059H, Y059R, Y059A, Y059C, Y059D, Y059E, Y059G, Y059I, Y059P, Y059Q, Y059S, Y059T, Y059V, Y059W, N060K, N060A, N060C, N060D, N060F, N060G, N060P, N060Q, N060S, N060T, N060Y, T061N, T061Q, P062G, F063H, F063R, F063L, F063A, F063C, F063D, F063G, F063M, F063N, F063Q, F063S, F063V, F063P, T064R, T064L, T064C, T064F, T064G, T064N, T064Q, T064V, S065H, S065R, S065L, S065C, S065E, S065F, S065G, S065I, S065M, S065N, S065P, S065Q, S065T, S065W, S065Y, R066L, R066A, R066C, R066E, R066F, R066N, R066P, R066Q, R066S, R066T, R066V, R066G, L067A, L067C, L067D, L067E, L067I, L067M, L067Q, L067S, L067T, L067V, L067Y, L067G, S068K, S068H, S068R, S068L, S068C, S068D, S068E, S068F, S068G, S068I, S068N, S068Q, S068T, S068V, I069A, I069C, I069G, I069Y, N070H, N070R, N070L, N070D, N070E, N070F, N070G, N070I, N070P, N070Q, N070S, N070T, N070V, N070Y, K071H, K071R, K071L, K071A, K071C, K071F, K071G, K071Q, K071S, K071T, K071V, K071W, K071Y, D072K, D072H, D072R, D072L, D072A, D072G, D072I, D072M, D072N, D072Q, D072S, D072V, D072W, D072Y, D072P, N073H, N073R, N073L, N073A, N073C, N073G, N073I, N073M, N073P, N073Q, N073S, N073T, N073V, N073W, N073Y, S074K, S074H, S074R, S074L, S074A, S074C, S074D, S074E, S074G, S074I, S074M, S074P, S074T, S074V, S074Y, K075H, K075R, K075L, K075A, K075C, K075E, K075F, K075M, K075Q, K075T, K075V, K075W, K075Y, K075G, K075P, S076H, S076R, S076L, S076A, S076C, S076D, S076E, S076F, S076M, S076P, S076Q, S076T, S076Y, S076I, S076V, Q077H, Q077R, Q077L, Q077A, Q077E, Q077G, Q077I, Q077M, Q077N, Q077S, Q077V, Q077W, Q077Y, Y093H, Y093V, Y093W, Y094R, Y094L, R097H, R097W, A098P, L099N, L099W, T100H, T100L, T100A, T100D, T100I, T100N, T100P, T100Q, T100S, T100V, T100Y, Y101H, Y101E, Y101F, Y101M, Y101W, Y102R, Y102C, Y102D, Y102I, Y102N, Y102W, D103R, D103L, D103A, D103C, D103I, D103P, D103Q, D103Y, E105H, E105T, F106L, F106V, F106W, F106Y, A107K, A107H, A107R, A107L, A107C, A107D, A107E, A107G, A107N, A107S, A107T, A107Y, Y108K, Y108H, Y108R, Y108L, Y108C, Y108F, Y108I, Y108N, Y108S, Y108T, Y108V, Y108W, W109I, W109M, W109Y, G110R, G110A, G110M, G110P, G110T, Q111K, Q111H, Q111R, Q111L, Q111D, Q111E, Q111G, Q111M, Q111P, Q111S, Q111T, Q111W, Q111Y, Q111V, Q111I, G112A, G112N, G112P, G112S, G112T 및/또는 G112Y에 상응한다.
본원의 임의의 예에서, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2 또는 7을 참고로, 아미노산 치환(들) V24I, V24L, V24E, S25C, S25G, S25I, S25M, S25V, S25Q, S25T, S25L, S25H, S25R, S25A, S25D, F27R, S28C, L29H, T30F, N31H, N31I, N31T, N31V, Y32T, V50L, S53G, G54D, G54S, G54R, G54C, G54P, D58M, Y59E, F63R, F63C, F63G, F63M, F63V, F63P, F63S, T64N, T64V, L67G, S68F, S68Q, D72K, D72L, D72P, D72M, D72W, N73Q, S74H, S74R, S74D, S74G, S74Y, K75H, K75G, K75W, K75P, S76I, S76V, Q77R, Q77E, R97H, T100I, T100P, Y101W, Y105V, A107N, Q111I, Q111P, 및/또는 Q111V에 상응하는 비변형 항체의 가변 중쇄에서의 하나 이상의 추가적 아미노산 치환(들)을 함유한다. 그러한 예들에서, 상응하는 아미노산 위치들은 상기 항체의 가변 중쇄와 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄의 정렬에 의해 식별된다.
예를 들어, 변형된 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 치환(들) V24E, S25C, S25V, F27R, T30F, S53G, D72L, R97H, 및/또는 Q111P에 상응하는 비변형 항체의 가변 중쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있다. 추가적인 변형들을 함유하는 변형된 항-EGFR 항체들 및 이의 항원-결합 단편들의 비-제한적 예들은 아미노산 치환들 HC-Y104E/ HC-Q111P; HC-S25C/HC-Y104E; HC-Y104E/LC-I29S; HC-Y104E/HC-Q111P/LC-I29S; HC-S53G/HC-Y104E; HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S25V/HC-Y104E; HC-S25V/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104E; HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-T30F/HC-Y104E; HC-T30F/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104E; HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-D72L/HC-Y104E; HC-D72L/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S53G/ HC-D72L/HC-Y104E; 또는 HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104E/HC-Q111P을 갖는 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 HC는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄에 있는 변형을 의미한다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체들 및 항원 단편들 중에 서열번호 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 4, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 4, 9 또는 11에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄(VL)를 함유하는 것들이 포함된다.
예를 들어, 서열번호 2에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄를 갖는 비변형 세툭시맙 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 변형되어 본원에서 제공되는, 서열번호 80, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 또는 123에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 80, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 또는 123 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 4에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄(VL)를 함유하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 항원-결합 단편이 생성될 수 있다.
다른 예에서, 서열번호 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 9에 기재된 가변 경쇄를 갖는 비변형 세툭시맙 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 변형되어 본원에서 제공되는, 서열번호 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 또는 122에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 또는 122 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 9에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄(VL)를 함유하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 항원 결합 단편이 생성될 수 있다.
다른 예에서, 서열번호 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 11에 기재된 가변 경쇄를 갖는 비변형 세툭시맙 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 변형되어 본원에서 제공되는, 서열번호 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 또는 122에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 또는 122 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 11에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄(VL)를 함유하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 항원 결합 단편이 생성될 수 있다.
다른 예시적 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 서열번호 74, 77 또는 104에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 74, 77 또는 104 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 4, 9 또는 11 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 4, 9 또는 11 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄(VL)을 함유할 수 있다.
일부 예에서, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전장(full-length) 항체이다. 이러한 변형 항체들은 서열번호 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 또는 121 중 어느 하나의 아미노산 120-449에 기재된 중쇄 불변 영역 또는 서열번호 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 또는 121 중 어느 하나의 아미노산 120-449에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체; 및 서열번호 3 또는 10의 아미노산 108-213에 기재된 경쇄 불변 영역 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체 또는 서열번호 8 또는 13의 아미노산 108-214에 기재된 불변 영역 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 변형된 항체들은 서열번호 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 또는 121 중 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 갖는 전장(full-length) 중쇄 및 서열번호 3, 8, 10 또는 13 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 갖는 전장(full-length) 경쇄를 가질 수 있다.
임의의 상기 예시적 변형된 항-EGFR 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 4에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 아미노산 치환(들) D001W, I002C, I002V, I002W, L003D, L003F, L003G, L003S, L003T, L003V, L003W, L003Y, L003R, L004C, L004E, L004F, L004I, L004P, L004S, L004T, L004V, L004W, L004K, L004H, L004R, T005A, T005C, T005D, T005E, T005F, T005G, T005N, T005S, T005W, T005L, T005K, T005H, T005R, T005P, R024A, R024C, R024F, R024L, R024M, R024S, R024W, R024Y, R024G, A025C, A025G, A025L, A025V, S026A, S026C, S026D, S026I, S026M, S026N, S026V, S026W, S026L, S026G, S026H, S026R, Q027A, Q027D, Q027E, Q027F, Q027I, Q027M, Q027N, Q027P, Q027T, S028A, S028D, S028N, S028Q, S028L, S028K, S028H, I029A, I029E, I029F, I029S, I029T, I029R, G030A, G030E, G030F, G030I, G030M, G030P, G030Q, G030S, G030V, G030Y, G030L, G030K, G030H, G030R, T031A, T031F, T031G, T031M, T031S, T031V, T031W, T031L, T031K, T031H, N032G, I033F, I033G, I033M, I033T, I033V, I033H, I048M, I048S, I048L, I048K, K049A, K049E, K049F, K049G, K049N, K049Q, K049S, K049T, K049V, K049Y, K049L, K049H, K049R, A051T, A051L, S052A, S052C, S052D, S052E, S052G, S052I, S052M, S052Q, S052V, S052W, S052R, S052K, E053G, S054M, I055A, I055F, S056G, S056L, S056A, S056C, S056D, S056E, S056F, S056N, S056P, S056Q, S056V, S056W, S056H, S056R, S056K, Y086F, Y086M, Y086H, Y087L, Y087C, Y087D, Y087F, Y087G, Y087I, Y087N, Y087P, Y087S, Y087T, Y087V, Y087W, Y087K, Y087H, Y087R, Q089E, N091L, N091A, N091C, N091I, N091M, N091S, N091T, N091V, N091H, N091R, N092C, N092D, N092L, N092M, N092S, N092T, N092V, N092W, N092Y, N092H, N092K, N092R, N093T, T096L, T096C, T096M, T096V, T097L, T097A, T097D, T097G, T097Q, T097S, T097V, T097K, T097R, F098A, F098M, F098S, F098V, F098Y, G099L, G099D, G099E, G099F, G099I, G099M, G099N, G099S, G099T, G099V, G099K, G099H, Q100C, Q100D, Q100E, Q100F, Q100I, Q100M, Q100N, Q100P, Q100T, Q100V, Q100W, Q100Y, Q100K, Q100H 또는 Q100R에 상응하는 비변형 항체의 가변 경쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 더 함유할 수 있고, 여기서 상응하는 아미노산 위치는 상기 항체의 가변 경쇄와 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄의 정렬에 의해 식별된다.
일부 실시예에서, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 4를 참고로 아미노산 치환(들) L4C, L4F, L4V, T5P, R24G, I29S, S56H 및/또는 N91V에 상응하는 비변형 항체의 가변 경쇄에서의 아미노산 치환(들)을 함유하고, 여기서 상응하는 아미노산 위치들은 상기 항체의 가변 경쇄와 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄의 정렬에 의하여 식별된다. 구체적 예에서, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 4를 참고로 아미노산 치환 I29S에 상응하는 비변형 항체의 가변 경쇄에서의 아미노산 치환을 함유한다. 이러한 항체들의 예들은 아미노산 치환들이 HC-Y104E/LC-I29S 또는 HC-Y104E/HC-Q111P/LC-I29S인 항체들을 포함한다.
변형된 가변 중쇄 및 변형된 가변 경쇄를 함유하는, 본원에서 제공되는, 예시적 변형된 항-EGFR 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들은 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 변형된 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 125, 126 또는 127에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 125, 126 또는 127 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 변형된 가변 경쇄(VL)를 함유할 수 있다.
예를 들어, 서열번호 2 및 4 각각에 기재된 비변형 세툭시맙 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄 및 경쇄는 변형되어 서열번호 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 또는 123에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 또는 123 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 변형된 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 126에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 126에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 변형된 가변 경쇄(VL)를 갖는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 생성될 수 있다.
다른 예들에서, 서열번호 7 및 9 각각에 기재된 비변형 세툭시맙 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄 및 경쇄는 변형되어 서열번호 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 또는 122에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 또는 122 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 변형된 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 125에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 125에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 변형된 가변 경쇄(VL)를 갖는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 생성될 수 있다.
추가 예들에서, 서열번호 7 및 11 각각에 기재된 비변형 세툭시맙 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄 및 경쇄는 변형되어 서열번호 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 또는 122에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 또는 122 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 변형된 가변 중쇄(VH); 및 서열번호 127에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 127에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 변형된 가변 경쇄(VL)를 갖는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 생성될 수 있다.
일부 예들에서, 변형된 항-EGFR 항체는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 하나에 기재된 변형된 중쇄 가변 영역 또는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열 및 서열번호 72, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 또는 121 중 어느 하나의 아미노산 120-449에 기재된 중쇄 불변 영역 또는 서열번호 72, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 또는 121 중 어느 하나의 아미노산 120-449에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체; 및 서열번호 125, 126 또는 127에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 125, 126 또는 127 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 변형된 가변 경쇄(VL) 및 서열번호 124의 아미노산 108-214에 기재된 경쇄 불변 영역 또는 서열번호 124의 아미노산 108-214에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 갖는 전장 IgG 항체이다. 예를 들어, 전장(full-length) IgG 항체는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 하나에 기재된 전장 변형된 중쇄 또는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 하나에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열; 및 서열번호 124에 기재된 전장 경쇄 또는 서열번호 124에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 가질 수 있다.
본원에서 제공되는 임의의 예시적 변형된 항-EGFR 항체들은 인간화(humanized) 되도록 더 변형될 수 있다. 본원에서 제공되는 인간화 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄에 대하여 65% 내지 85% 서열 동일성을 나타내는 가변 중쇄; 및 서열번호 4에 기재된 가변 중쇄에 대하여 65% 내지 85% 서열 동일성을 나타내는 가변 중쇄를 함유할 수 있다. 이러한 인간화, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2 또는 7의 104번 위치에 상응하는 위치에 글루탐산(E)으로의 아미노산 치환을 함유할 수 있다.
본원에서 제공되는 예시적 인간화 및 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 61 또는 63에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 61 또는 63에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 아미노산 서열을 가진다.
일부 예에서, 서열번호 2에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄를 갖는, 비변형 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화되고 변형되어 서열번호 63에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 63에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 184에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 184에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 항-EGFR 항체 또는 항원-결합 단편이 생성된다.
다른 예에서, 서열번호 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 9에 기재된 가변 경쇄를 갖는, 비변형 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화되고 변형되어 서열번호 61에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 61에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 항-EGFR 항체 또는 항원-결합 단편이 생성된다.
추가 예에서, 서열번호 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 11에 기재된 가변 경쇄를 갖는, 비변형 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화되어 서열번호 61에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 61에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 186에 대하여 적어도 855 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 항-EGFR 항체 또는 항원-결합 단편이 생성된다.
일부 예에서, 인간화, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전장 IgG 항체인데, 이는 서열번호 59에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 59에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호 181에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 191에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 갖는다.
본원에서 설명된, 임의의 인간화, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 서열번호 2 또는 7에 기재된 비변형 가변 중쇄의 위치를 참고로, T023K, T023H, T023R, T023A, T023C, T023E, T023G, T023I, T023M, T023N, T023P, T023S, T023V, T023W, T023L, V024R, V024A, V024F, V024G, V024I, V024M, V024P, V024S, V024T, V024L, V024E, S025H, S025R, S025A, S025C, S025D, S025E, S025F, S025G, S025I, S025M, S025P, S025Q, S025T, S025V, S025L, G026H, G026R, G026D, G026F, G026M, G026N, G026P, G026Q, G026S, G026Y, G026L, F027H, F027R, F027A, F027D, F027E, F027G, F027M, F027P, F027Q, F027S, F027T, F027V, F027W, F027Y, F027L, S028K, S028H, S028R, S028A, S028D, S028I, S028M, S028P, S028Q, S028V, S028W, S028L, S028C, L029K, L029H, L029A, L029D, L029G, L029I, L029M, L029N, L029S, L029V, T030H, T030R, T030D, T030G, T030I, T030M, T030N, T030P, T030S, T030V, T030W, T030Y, N031K, N031H, N031D, N031E, N031G, N031I, N031T, N031V, N031L, Y032H, Y032R, Y032C, Y032M, Y032N, Y032T, Y032V, Y032L, G033E, G033M, G033S, G033T, G033Y, V034A, V034C, V034I, V034M, V034P, V034L, H035I, H035Q, W036K, W036A, W036I, W036V, W036Y, V050K, V050H, V050A, V050D, V050E, V050G, V050I, V050N, V050Q, V050T, V050L, I051K, I051H, I051A, I051C, I051E, I051G, I051N, I051Q, I051S, I051V, I051Y, I051L, W052I, W052N, W052Y, S053H, S053R, S053A, S053C, S053G, S053I, S053M, S053P, S053Q, S053L, S053T, S053V, S053Y, G054H, G054R, G054A, G054C, G054D, G054P, G054S, G055H, G055R, G055M, G055S, G055Y, N056K, N056A, N056P, N056S, N056V, N056G, T057H, T057R, T057L, T057A, T057C, T057D, T057F, T057M, T057N, T057Q, T057W, T057Y, D058L, D058G, D058M, D058N, D058Q, Y059H, Y059R, Y059A, Y059C, Y059D, Y059E, Y059G, Y059I, Y059P, Y059Q, Y059S, Y059T, Y059V, Y059W, N060K, N060A, N060C, N060D, N060F, N060G, N060P, N060Q, N060S, N060T, N060Y, T061N, T061Q, P062G, F063H, F063R, F063L, F063A, F063C, F063D, F063G, F063M, F063N, F063Q, F063S, F063V, F063P, T064R, T064L, T064C, T064F, T064G, T064N, T064Q, T064V, S065H, S065R, S065L, S065C, S065E, S065F, S065G, S065I, S065M, S065N, S065P, S065Q, S065T, S065W, S065Y, R066L, R066A, R066C, R066E, R066F, R066N, R066P, R066Q, R066S, R066T, R066V, R066G, L067A, L067C, L067D, L067E, L067I, L067M, L067Q, L067S, L067T, L067V, L067Y, L067G, S068K, S068H, S068R, S068L, S068C, S068D, S068E, S068F, S068G, S068I, S068N, S068Q, S068T, S068V, I069A, I069C, I069G, I069Y, N070H, N070R, N070L, N070D, N070E, N070F, N070G, N070I, N070P, N070Q, N070S, N070T, N070V, N070Y, K071H, K071R, K071L, K071A, K071C, K071F, K071G, K071Q, K071S, K071T, K071V, K071W, K071Y, D072K, D072H, D072R, D072L, D072A, D072G, D072I, D072M, D072N, D072Q, D072S, D072V, D072W, D072Y, D072P, N073H, N073R, N073L, N073A, N073C, N073G, N073I, N073M, N073P, N073Q, N073S, N073T, N073V, N073W, N073Y, S074K, S074H, S074R, S074L, S074A, S074C, S074D, S074E, S074G, S074I, S074M, S074P, S074T, S074V, S074Y, K075H, K075R, K075L, K075A, K075C, K075E, K075F, K075M, K075Q, K075T, K075V, K075W, K075Y, K075G, K075P, S076H, S076R, S076L, S076A, S076C, S076D, S076E, S076F, S076M, S076P, S076Q, S076T, S076Y, S076I, S076V, Q077H, Q077R, Q077L, Q077A, Q077E, Q077G, Q077I, Q077M, Q077N, Q077S, Q077V, Q077W, Q077Y, Y093H, Y093V, Y093W, Y094R, Y094L, R097H, R097W, A098P, L099N, L099W, T100H, T100L, T100A, T100D, T100I, T100N, T100P, T100Q, T100S, T100V, T100Y, Y101H, Y101E, Y101F, Y101M, Y101W, Y102R, Y102C, Y102D, Y102I, Y102N, Y102W, D103R, D103L, D103A, D103C, D103I, D103P, D103Q, D103Y, E105H, E105T, F106L, F106V, F106W, F106Y, A107K, A107H, A107R, A107L, A107C, A107D, A107E, A107G, A107N, A107S, A107T, A107Y, Y108K, Y108H, Y108R, Y108L, Y108C, Y108F, Y108I, Y108N, Y108S, Y108T, Y108V, Y108W, W109I, W109M, W109Y, G110R, G110A, G110M, G110P, G110T, Q111K, Q111H, Q111R, Q111L, Q111D, Q111E, Q111G, Q111M, Q111P, Q111S, Q111T, Q111W, Q111Y, Q111V, Q111I, G112A, G112N, G112P, G112S, G112T 및 G112Y 중에서 선택된 아미노산 치환(들)에 상응하는 가변 중쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환(들); 및/또는
서열번호 4에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 아미노산 치환(들) D001W, I002C, I002V, I002W, L003D, L003F, L003G, L003S, L003T, L003V, L003W, L003Y, L003R, L004C, L004E, L004F, L004I, L004P, L004S, L004T, L004V, L004W, L004K, L004H, L004R, T005A, T005C, T005D, T005E, T005F, T005G, T005N, T005S, T005W, T005L, T005K, T005H, T005R, T005P, R024A, R024C, R024F, R024L, R024M, R024S, R024W, R024Y, R024G, A025C, A025G, A025L, A025V, S026A, S026C, S026D, S026I, S026M, S026N, S026V, S026W, S026L, S026G, S026H, S026R, Q027A, Q027D, Q027E, Q027F, Q027I, Q027M, Q027N, Q027P, Q027T, S028A, S028D, S028N, S028Q, S028L, S028K, S028H, I029A, I029E, I029F, I029S, I029T, I029R, G030A, G030E, G030F, G030I, G030M, G030P, G030Q, G030S, G030V, G030Y, G030L, G030K, G030H, G030R, T031A, T031F, T031G, T031M, T031S, T031V, T031W, T031L, T031K, T031H, N032G, I033F, I033G, I033M, I033T, I033V, I033H, I048M, I048S, I048L, I048K, K049A, K049E, K049F, K049G, K049N, K049Q, K049S, K049T, K049V, K049Y, K049L, K049H, K049R, A051T, A051L, S052A, S052C, S052D, S052E, S052G, S052I, S052M, S052Q, S052V, S052W, S052R, S052K, E053G, S054M, I055A, I055F, S056G, S056L, S056A, S056C, S056D, S056E, S056F, S056N, S056P, S056Q, S056V, S056W, S056H, S056R, S056K, Y086F, Y086M, Y086H, Y087L, Y087C, Y087D, Y087F, Y087G, Y087I, Y087N, Y087P, Y087S, Y087T, Y087V, Y087W, Y087K, Y087H, Y087R, Q089E, N091L, N091A, N091C, N091I, N091M, N091S, N091T, N091V, N091H, N091R, N092C, N092D, N092L, N092M, N092S, N092T, N092V, N092W, N092Y, N092H, N092K, N092R, N093T, T096L, T096C, T096M, T096V, T097L, T097A, T097D, T097G, T097Q, T097S, T097V, T097K, T097R, F098A, F098M, F098S, F098V, F098Y, G099L, G099D, G099E, G099F, G099I, G099M, G099N, G099S, G099T, G099V, G099K, G099H, Q100C, Q100D, Q100E, Q100F, Q100I, Q100M, Q100N, Q100P, Q100T, Q100V, Q100W, Q100Y, Q100K, Q100H 또는 Q100R에 상응하는 비변형 항체의 가변 경쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환(들)과 같은 추가 변형을 함유할 수 있고, 여기서 상응하는 아미노산 위치들은 상기 항체 가변 경쇄와 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄의 정렬에 의하여 식별된다.
임의의 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2 또는 7을 참고로, 아미노산 치환 V24I, V24L, V24E, S25C, S25G, S25I, S25M, S25V, S25Q, S25T, S25L, S25H, S25R, S25A, S25D, F27R, S28C, L29H, T30F, N31H, N31I, N31T, N31V, Y32T, V50L, S53G, G54D, G54S, G54R, G54C, G54P, D58M, Y59E, F63R, F63C, F63G, F63M, F63V, F63P, F63S, T64N, T64V, L67G, S68F, S68Q, D72K, D72L, D72P, D72M, D72W, N73Q, S74H, S74R, S74D, S74G, S74Y, K75H, K75G, K75W, K75P, S76I, S76V, Q77R, Q77E, R97H, T100I, T100P, Y101W, Y105V, A107N, Q111I, Q111P, Q111V에 상응하는 비변형 항체의 가변 중쇄에서의 아미노산 치환(들)을 더 함유할 수 있고, 여기서 상응하는 아미노산 위치는 상기 항체의 가변 중쇄와 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄의 정렬에 의하여 식별된다.
본원에서 제공되는, 인간화, 변형된 항-EGFR 또는 이의 항원-결합 단편의 임의의 예는 비변형 항체의 아미노산 치환(들) V24E, S25C, S25V, F27R, T30F, S53G, D72L, R97H, 및 Q111P에 상응하는 가변 중쇄에서 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환(들)을 함유한다. 예를 들어, 본원에 기술된 인간화, 변형된 항-EGFR 항체 또는 항원 단편은 HC-Y104E/ HC-Q111P; HC-S25C/ HC-Y104E; HC-Y104E/LC-I29S; HC-Y104E/HC-Q111P/LC-I29S; HC-S53G/HC-Y104E; HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S25V/HC-Y104E; HC-S25V/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104E; HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-T30F/HC-Y104E; HC-T30F/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104E; HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-D72L/HC-Y104E; HC-D72L/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S53G/ HC-D72L/HC-Y104E; 또는 HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104E/HC-Q111P에 상응하는 가변 중쇄 또는 전장 중쇄에서 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 구체적 예에서, 인간화, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 치환들 HC-Y104E/ HC-Q111P 또는 HC-T30F/HC-Y104E/HC-Q111P을 함유한다.
예를 들어, 인간화, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 비-제한적 예들 중 다음을 함유하는 항체가 본원에 제공된다:
a) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 155, 156 또는 158에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 155, 156 또는 158에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
b) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 162, 163 또는 165에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 162, 163 또는 165에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
c) 서열번호 137 또는 139에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 137 또는 139에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 155, 156 또는 158에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 155, 156 또는 158에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
d) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 169, 170 또는 172에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 169, 170 또는 172에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
e) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 176, 177 또는 179에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 176, 177 또는 179에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
f) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
g) 서열번호 137 또는 139에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 137 또는 139에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
h) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 190, 191 또는 193에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 190, 191 또는 193에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
i) 서열번호 143 또는 145에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143 또는 145에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
j) 서열번호 149 또는 151에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 149 또는 151에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 197, 198 또는 200에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 197, 198 또는 200에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
k) 서열번호 143 또는 145에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143 또는 145에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 197, 198 또는 200에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 197, 198 또는 200에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
l) 서열번호 149 또는 151에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 149 또는 151에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 204, 205 또는 207에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 204, 205 또는 207에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
m) 서열번호 143 또는 145에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143 또는 145에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 204, 205 또는 207에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 204, 205 또는 207에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
n) 서열번호 211 또는 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211 또는 213에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 253, 254 또는 256에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 253, 254 또는 256에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
o) 서열번호 217 또는 219에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 217 또는 219에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 253, 254 또는 256에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 253, 254 또는 256에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
p) 서열번호 223 또는 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223 또는 225에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 260, 261 또는 263에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 260, 261 또는 263에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
q) 서열번호 229 또는 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229 또는 231에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 260, 261 또는 263에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 260, 261 또는 263에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
r) 서열번호 235 또는 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235 또는 237에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 267, 268 또는 270에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 267, 268 또는 270에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
s) 서열번호 241 또는 243에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 241 또는 243에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 274, 275 또는 277에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 274, 275 또는 277에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
t) 서열번호 223 또는 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223 또는 225에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 274, 275 또는 277에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 274, 275 또는 277에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
u) 서열번호 229 또는 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229 또는 231에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 274, 275 또는 277에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 274, 275 또는 277에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
v) 서열번호 235 또는 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235 또는 237에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
w) 서열번호 247 또는 249에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247 또는 249에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
x) 서열번호 223 또는 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223 또는 225에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
y) 서열번호 229 또는 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229 또는 231에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
z) 서열번호 235 또는 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235 또는 237에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
aa) 서열번호 247 또는 249에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247 또는 249에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
bb) 서열번호 223 또는 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223 또는 225에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
cc) 서열번호 229 또는 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229 또는 231에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
dd) 서열번호 235 또는 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235 또는 237에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 295, 296 또는 298에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 295, 296 또는 298에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
ee) 서열번호 247 또는 249에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247 또는 249에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 302, 303 또는 305에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 302, 303 또는 305에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
ff) 서열번호 211 또는 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211 또는 213에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 302, 303 또는 305에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 302, 303 또는 305에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
gg) 서열번호 211 또는 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211 또는 213에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열; 및
hh) 서열번호 211 또는 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211 또는 213에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열.
일부 예에서, 서열번호 2에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄를 갖는 비변형 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화되고 변형되어 다음을 함유하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 생성된다:
a) 서열번호 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 156에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 156에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
b) 서열번호 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 163에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 163에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
c) 서열번호 139에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 139에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 156에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 156에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
d) 서열번호 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 170에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 170에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
e) 서열번호 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 177에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 177에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
f) 서열번호 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 184에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 184에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
g) 서열번호 139에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 139에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 184에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 184에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
h) 서열번호 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 133에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 191에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 191에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
i) 서열번호 145에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 145에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 184에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 184에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
j) 서열번호 151에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 151에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 198에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 198에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
k) 서열번호 145에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 145에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 198에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 198에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
l) 서열번호 151에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 151에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 205에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 205에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
m) 서열번호 145에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 145에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 205에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 205에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
n) 서열번호 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 213에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 254에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 254에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
o) 서열번호 219에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 219에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 254에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 254에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
p) 서열번호 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 225에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 261에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 261에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
q) 서열번호 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 231에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 261에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 261에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
r) 서열번호 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 237에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 268에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 268에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
s) 서열번호 243에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 243에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 275에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 275에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
t) 서열번호 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 225에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 275에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 275에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
u) 서열번호 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 231에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 275에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 275에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
v) 서열번호 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 237에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 282에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 282에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
w) 서열번호 249에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 249에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 282에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 282에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
x) 서열번호 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 225에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 282에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 282에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
y) 서열번호 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 231에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 282에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 282에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
z) 서열번호 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 237에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 289에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 289에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
aa) 서열번호 249에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 249에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 289에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 289에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
bb) 서열번호 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 225에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 289에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 289에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
cc) 서열번호 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 231에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 289에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 289에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
dd) 서열번호 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 237에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 296에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 296에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
ee) 서열번호 249에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 249에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 303에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 303에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
ff) 서열번호 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 213에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 303에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 303에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
gg) 서열번호 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 213에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 282에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 282에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열; 및
hh) 서열번호 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 213에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 289에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 289에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열.
다른 예에서, 서열번호 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 9에 기재된 가변 경쇄를 갖는 비변형 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화되고 변형되어 다음을 함유하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 생성된다:
a) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 155에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 155에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
b) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 162에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 162에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
c) 서열번호 137에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 137에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 155에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 155에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
d) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 169에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 169에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
e) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 176에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 176에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
f) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
g) 서열번호 137에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 137에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
h) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 190에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 190에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
i) 서열번호 143에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
j) 서열번호 149에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 149에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 197에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 197에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
k) 서열번호 143에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 197에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 197에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
l) 서열번호 149에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 149에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 204에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 204에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
m) 서열번호 143에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 204에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 204에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
n) 서열번호 211에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 253에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 253에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
o) 서열번호 217에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 217에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 253에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 253에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
p) 서열번호 223에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 260에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 260에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
q) 서열번호 229에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 260에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 260에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
r) 서열번호 235에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 267에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 267에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
s) 서열번호 241에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 241에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 274에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 274에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
t) 서열번호 223에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 274에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 274에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
u) 서열번호 229에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 274에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 274에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
v) 서열번호 235에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
w) 서열번호 247에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
x) 서열번호 223에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
y) 서열번호 229에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
z) 서열번호 235에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
aa) 서열번호 247에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
bb) 서열번호 223에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
cc) 서열번호 229에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
dd) 서열번호 235에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 295에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 295에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
ee) 서열번호 247에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 302에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 302에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
ff) 서열번호 211에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 302에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 302에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
gg) 서열번호 211에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열; 및
hh) 서열번호 211에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열.
추가 예에서, 서열번호 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 11에 기재된 가변 경쇄를 갖는 비변형 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화되고 변형되어 다음을 함유하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 생성된다:
a) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 158에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 158에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
b) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 165에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 165에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
c) 서열번호 137에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 137에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 158에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 158에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
d) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 172에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 172에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
e) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 179에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 179에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
f) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 186에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
g) 서열번호 137에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 137에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 186에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
h) 서열번호 131에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 193에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 193에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
i) 서열번호 143에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 186에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
j) 서열번호 149에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 149에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 200에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 200에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
k) 서열번호 143에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 200에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 200에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
l) 서열번호 149에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 149에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 207에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 207에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
m) 서열번호 143에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 207에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 207에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
n) 서열번호 211에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 256에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 256에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
o) 서열번호 217에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 217에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 256에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 256에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
p) 서열번호 223에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 263에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 263에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
q) 서열번호 229에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 263에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 263에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
r) 서열번호 235에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 270에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 270에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
s) 서열번호 241에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 241에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 277에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 277에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
t) 서열번호 223에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 277에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 277에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
u) 서열번호 229에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 277에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 277에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
v) 서열번호 235에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 284에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
w) 서열번호 247에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 284에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
x) 서열번호 223에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 284에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
y) 서열번호 229에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 284에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
z) 서열번호 235에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 291에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
aa) 서열번호 247에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 291에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
bb) 서열번호 223에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 291에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
cc) 서열번호 229에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 291에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
dd) 서열번호 235에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 298에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 298에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
ee) 서열번호 247에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 305에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 305에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
ff) 서열번호 211에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 305에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 305에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
gg) 서열번호 211에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 284에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열; 및
hh) 서열번호 211에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 291에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열.
또한 임의의 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중에 본원에서 상기 설명한 임의의 인간화, 변형된 항-EGFR 항체에 대해서 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 임의의 인간화, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 포함된다. 서열 동일성은 갭(gap)을 포함하거나 갭(gap) 없이 글로벌 정렬(global alignment)을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 예에서, 인간화, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 함유하는 전장 항체이다:
a) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 153에 기재된 경쇄 또는 서열번호 153에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
b) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 160에 기재된 경쇄 또는 서열번호 160에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
c) 서열번호 135에 기재된 중쇄 또는 서열번호 135에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 153에 기재된 경쇄 또는 서열번호 153에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
d) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 167에 기재된 경쇄 또는 서열번호 167에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
e) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 174에 기재된 경쇄 또는 서열번호 174에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
f) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 181에 기재된 경쇄 또는 서열번호 181에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
g) 서열번호 135에 기재된 중쇄 또는 서열번호 135에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 181에 기재된 경쇄 또는 서열번호 181에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
h) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 188에 기재된 경쇄 또는 서열번호 188에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
i) 서열번호 141에 기재된 중쇄 또는 서열번호 141에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 181에 기재된 경쇄 또는 서열번호 181에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
j) 서열번호 147에 기재된 중쇄 또는 서열번호 147에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 195에 기재된 경쇄 또는 서열번호 195에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
k) 서열번호 141에 기재된 중쇄 또는 서열번호 141에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 195에 기재된 경쇄 또는 서열번호 195에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
l) 서열번호 147에 기재된 중쇄 또는 서열번호 147에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 202에 기재된 경쇄 또는 서열번호 202에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
m) 서열번호 141에 기재된 중쇄 또는 서열번호 141에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 202에 기재된 경쇄 또는 서열번호 202에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
n) 서열번호 209에 기재된 중쇄 또는 서열번호 209에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 251에 기재된 경쇄 또는 서열번호 251에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
o) 서열번호 215에 기재된 중쇄 또는 서열번호 215에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 251에 기재된 경쇄 또는 서열번호 251에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
p) 서열번호 221에 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 258에 기재된 경쇄 또는 서열번호 258에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
q) 서열번호 227에 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 258에 기재된 경쇄 또는 서열번호 258에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
r) 서열번호 233에 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 265에 기재된 경쇄 또는 서열번호 265에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
s) 서열번호 239에 기재된 중쇄 또는 서열번호 239에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 272에 기재된 경쇄 또는 서열번호 272에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
t) 서열번호 221에 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 272에 기재된 경쇄 또는 서열번호 272에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
u) 서열번호 227에 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 272에 기재된 경쇄 또는 서열번호 272에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
v) 서열번호 233에 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 279에 기재된 경쇄 또는 서열번호 279에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
w) 서열번호 245에 기재된 중쇄 또는 서열번호 245에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 279에 기재된 경쇄 또는 서열번호 279에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
x) 서열번호 221에 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 279에 기재된 경쇄 또는 서열번호 279에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
y) 서열번호 227에 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 279에 기재된 경쇄 또는 서열번호 279에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
z) 서열번호 233에 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 286에 기재된 경쇄 또는 서열번호 286에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
aa) 서열번호 245에 기재된 중쇄 또는 서열번호 245에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 286에 기재된 경쇄 또는 서열번호 286에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
bb) 서열번호 221에 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 286에 기재된 경쇄 또는 서열번호 286에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
cc) 서열번호 227에 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 286에 기재된 경쇄 또는 서열번호 286에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
dd) 서열번호 233에 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 293에 기재된 경쇄 또는 서열번호 293에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
ee) 서열번호 245에 기재된 중쇄 또는 서열번호 245에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 300에 기재된 경쇄 또는 서열번호 300에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
ff) 서열번호 209에 기재된 중쇄 또는 서열번호 209에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 300에 기재된 경쇄 또는 서열번호 300에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
gg) 서열번호 209에 기재된 중쇄 또는 서열번호 209에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 279에 기재된 경쇄 또는 서열번호 279에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열; 및
hh) 서열번호 209에 기재된 중쇄 또는 서열번호 209에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 286에 기재된 경쇄 또는 서열번호 286에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 임의의 예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, pH 및 락테이트(lactate) 농도 차이를 제외하고 동일 조건 하에서 측정시 약 pH 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도 중 하나 또는 둘다의 존재 하와 비교하여 pH 6.0 내지 6.5 (각 경계값 포함)인 pH 및/또는 15 mM 내지 20 mM (각 경계값 포함)의 락테이트 농도 중 하나 또는 둘다의 존재 하에서 1.0을 초과하는 EGFR에 대한 결합 활성의 비율을 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 변형된 항-EGFR 항체는 pH 차이를 제외하고는 동일한 조건 하에서 측정시 약 pH 7.4의 존재 하에서와 비교하여, pH 6.0 내지 6.5 (각 경계값 포함)의 pH 존재 하에서 1.0을 초과하는 EGFR에 대한 결합 활성의 비율을 나타낸다. 이러한 예에서, 결합 활성의 비율은 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0. 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 50.0 또는 그 이상일 수 있다. 구체적 예에서, 결합 활성의 비율은 적어도 3.0, 4.0, 5.0, 6.0. 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 50.0 또는 그 이상이다.
본원의 임의의 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 친화도는 EGFR 또는 이의 가용성 단편 결합에 대한 해리 상수(Kd)로 측정된다. 이러한 예에서 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 산성 pH 6.0 내지 6.5 (각 경계값 포함) 및 15 mM 내지 20 mM (각 경계값 포함) 락테이트 중 하나 또는 둘다를 포함하는 조건 하 1×10-8 M, 5×10-9 M, 1×10-9 M, 5× 10-10 M, 1×10-10 M, 5×10-11 M, 1×10-11 M 또는 그 이하에 미만하는 EGFR 에 대한 결합 친화도(Kd); 및/또는 약 7.4 및 1 mM 락테이트(각 경계값 포함) 중 하나 또는 둘다를 포함하는 조건 하 1×10-8 M, 1×10-7 M, 1×10-6 M 또는 그 이상을 초과하는 EGFR에 대한 Kd 를 가질 수 있다.
본원의 임의의 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 또는 항원-결합 단편의 결합 친화도는 최대 효과 농도의 절반값(EC50)으로 측정된다. 이러한 예에서, 변형된 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 산성 pH (pH 6.0 내지 6.5, 각 경계값 포함) 및/또는 15 mM 내지 20 mM (각 경계값 포함) 락테이트 중 하나 또는 둘다를 포함하는 조건 하 10 mM, 5 mM, 4　mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 또는 그 이하에 미만하는 EGFR 또는 이의 가용성 분획 결합에 대한 EC50 및/또는 약 pH 7.4 및 1 mM 락테이트 (각 경계값 포함) 중 하나 또는 둘다를 포함하는 조건 하 5 mM, 10　mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM 또는 그 이상을 초과하는 EGFR 또는 이의 가용성 분획 결합에 대한 EC50를 갖는 결합 활성을 나타낸다.
본원의 임의의 예에서, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 활성은 적어도 12 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 30　mg/mL, 35 mg/mL, 40 mg/mL, 45 mg/mL or 50 mg/mL인 단백질 농도 존재 하 측정될 수 있고, 이는 예를 들어, 인간 혈청과 같은 혈청, 또는 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민으로 제공될 수 있다.
본원의 임의의 예에서, 단백질은 혈청에서 제공되고 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 및 단편의 결합 활성을 시험하기 위한 결합 어세이(assay)는 20% (vol/vol) 내지 90% (vol/vol) 혈청, 예를 들어 20% (vol/vol) 내지 50% (vol/vol) 또는 20% (vol/vol) 내지 40% (vol/vol) 혈청의 존재 하 수행된다. 구체적 예에서, 결합 어세이는 인간 혈청과 같은, 25% (vol/vol) 혈청 또는 약 25% (vol/vol) 혈청 존재 하 수행된다.
변형된 항-EGFR 항체 또는 항원 결합 단편의 가변 중쇄는 비변형 항-EGFR 항체의 아미노산 서열과 비교하여, 서열번호 2 또는 7에 기재된 비변형 가변 중쇄와 같은, 비변형 가변 중쇄와 비교하여, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5개의 아미노산 치환과 같은 1 내지 50개의 아미노산 치환을 포함하는, 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다.
본원에서 제공되는 임의의 항-EGFR 항체 또는 EGFR-결합 단편은 생산 후 분리 또는 정제될 수 있다.
표적제(targeted agent)에 직접적 또는 간접적으로 연결된 본원에서 제공되는 임의의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 함유하는 컨쥬게이트가 본원에서 제공된다. 이러한 컨쥬게이트는 EGFR (Ab)에 결합하는 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 하나 이상의 표적제 및 Ab를 표적제에 연결하기 위한 선택적 링커(L)를 함유한다. 일부 예에서, 0 내지 8개의 링커에 의해 항체에 컨쥬게이트된 1 내지 8개의 표적제가 있다.
컨쥬게이트의 표적제는 단백질, 펩티드, 핵산, 또는 소분자일 수 있다. 구체 예에서, 표적제는 세포독성 모이어티, 방사성 동위원소, 화학요법제, 용균(lytic) 펩티드 또는 사이토카인과 같은 치료적 모이어티이다. 본원에서 제공되는 임의의 변형된 항-EGFR 항체 또는 단편에 컨쥬게이트될 수 있는 예시적 치료적 모이어티는 탁솔(taxol); 사이토칼라신 B(cytochalasin B); 그래미시딘 D(gramicidin D); 에티디움 브로마이드(ethidium bromide); 에메틴(emetine); 마이토마이신(mitomycin); 에토포시드(etoposide); 테노포시드(tenoposide); 빈크리스틴(vincristine); 빈블라스틴(vinblastine); 콜히친(colchicine); 독소루비신(doxorubicin); 다우노루비신(daunorubicin); 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione); 메이탄신(maytansine) 또는 이의 유사체 또는 유도체; 오리스타틴(auristatin) 또는 이의 기능적 펩티드 유사체 또는 유도체; 돌라스타틴(dolastatin) 10 또는 15 또는 이의 유사체; 이리노테칸(irinotecan) 또는 이의 유사체; 미톡산트론(mitoxantrone); 미트라마이신(mithramycin); 악티노마이신 D(actinomycin D); 1-데하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone); 글루코코르티코이드(glucocorticoid); 프로카인(procaine); 테트라카인(tetracaine); 리도카인(lidocaine); 프로프라놀롤(propranolol); 퓨로마이신(puromycin); 칼리키아마이신(calicheamicin) 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항대사물질(antimetabolite); 알킬화제(alkylating agent); 백금 유도체; 듀오카마이신 A(duocarmycin A), 듀오카마이신 SA(duocarmycin SA), 라첼마이신(rachelmycin)(CC-1065), 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항생제; 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀(pyrrolo[2,l-c][l,4]-benzodiazepines)(PDB); 독소(toxin); 리보뉴클레아제(ribonuclease)(RNase); 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I), 스타필로코걸 엔테로톡신 A(Staphylococcal enterotoxin A); 및 자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질을 포함한다.
구체적 예에서, 치료적 모이어티는 안사미토신(ansamitocin) 또는 머탄신(mertansine)(DM1)과 같은 메이탄시노이드(maytansinoid)인 메이탄신 유도체; 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 또는 F (MMAF)와 같은 오리스타틴(auristatin) 또는 이의 기능적 펩티드 유사체 또는 유도체; 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머캅토퓨린(mercaptopurine), 6-티오구아닌(thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 플루다라빈(fludarabine), 5-플루오로우라실(fluorouracil), 데카르바진(decarbazine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 아스파라기나제(asparaginase), 젬시타빈(gemcitabine) 또는 클라드리빈(cladribine)과 같은 항대사물질; 메클로레타민(mechlorethamine), 티오테파(thiotepa), 클로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카무스틴(carmustine)(BCNU), 로무스틴(lomustine)(CCNU), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 다카르바진(dacarbazine)(DTIC), 프로카르바진(procarbazine) 및 미토마이신 C(mitomycin C)과 같은 알킬화제; 시스플라틴 또는 카르보플라틴과 같은 백금 유도체; 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin) 또는 안트라마이신(anthramycin)(AMC)과 같은 항생제; 디프테리아 독소(diphtheria toxin) 및 이의 활성 단편 및 혼성체 분자, 라이신 독소(ricin toxin), 콜레라 독소, 쉬가-유사 독소(Shiga-like toxin), LT 독소, C3 독소, 쉬가 독소(Shiga toxin), 백일해 독소(pertussis toxin), 파상풍 독소(tetanus toxin), 대두 보먼-버크 프로테아제 억제제(soybean Bowman-Birk protease inhibitor), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin), 알로린(alorin), 사포린(saporin), 모데신(modeccin), 젤라닌(gelanin), 아브린 A 쇄(abrin A chain), 모데신 A 쇄(modeccin A chain), 알파-사르신(alpha-sarcin), 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 자리공과 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질, 여주(momordica charantia) 억제제, 커신(curcin), 크로틴(crotin), 젤로닌(gelonin), 미토질린(mitogillin), 리스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin) 및 에노마이신(enomycin) 독소와 같은독소; 또는 피롤로벤조디아제핀(PBD)이다. PBD 컨쥬게이트는 천연(naturally occuring) 또는 합성 PBDs를 포함할 수 있다. 천연(naturally occuring) PBDs는 앱배이마이신(abbeymycin), 안트라마이신(anthramycin), 치카마이신(chicamycin), DC-81, 마제트라마이신(mazethramycin), 네오트라마이신 A 및 B(neothramycin A and B), 포로트라마이신(porothramycin), 프로트라카르신(prothracarcin), 시바노미신(sibanomicin, DC-102), 시비로마이신(sibiromycin) 및 토마마이신(tomamycin)을 포함한다. 예시적 컨쥬케이트들은 또한 이량체의 단량체 PBD 단위를 연결하는 다리를 함유하는 이량체를 포함하여, PBD 이량체를 포함한다. PBD 이량체는 동성이량체(homodimer) 또는 헤테로이량체(heterodimer)일 수 있다.
일부 예에서, 컨쥬게이트의 항체 및 표적제는 직접적으로 연결된다. 다른 예에서 컨쥬게이트의 항체 및 표적제는 링커를 통하여 연결된다. 상기 링커는 펩티드, 폴리펩티드 또는 화학적 링커일 수 있고, 이는 절단가능한(cleavable) 또는 비절단가능하다(non-cleavable). 상기 링커는 몇가지 방법에 의해 항체에 컨쥬게이트 될 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 항체 상의 하나 이상의 유리 티올기 또는 항체 상의 하나 이상의 일차 아민에 컨쥬게이트될 수 있다.
또한 본원에서 제공되는 임의의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄를 암호화하는 핵산 분자(들)이 본원에서 제공된다.
본원에서 제공되는 임의의 항-EGFR 항체, EGFR-결합 단편 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 벡터 및 세포, 예를 들어 본원에서 제공되는 임의의 항-EGFR 항체, EGFR-결합 단편 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 세포를 암호화하는 본원에서 제공되는 벡터를 함유하는 원핵세포 또는 진핵세포가 제공된다.
적절한 숙주 세포 내에서 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 본원에서 제공되는 벡터 또는 벡터들로부터 암호화된 중쇄 또는 경쇄를 발현시키고 항체를 회수함으로써 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 또한 본원에서 제공된다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본원에서 제공되는 컨쥬게이트, 및 화학요법제 또는 항암제를 포함하는 조합물이 본원에서 제공된다. 상기 제제는 알킬화제, 니트로소우레아(nitrosoureas), 토포아이소머라제 저해제, 및 항체로부터 선택될 수 있다. 일부 예에서, 화학요법제는 이리노테칸(irinotecan), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 5-플루오로우라실(5-FU), 젤로다(Xeloda), 캠토사(Camptosar), 엘록사틴(Eloxatin), 아드리아마이신(Adriamycin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine) 또는 카보플라틴(carboplatin)이다. 일부 예에서, 화학요법제는 제1 항체와는 상이한 추가의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 예에서, 추가의 항-EGFR 항체가 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 및 이의 항원-결합 단편 또는 이의 변이체로부터 선택된다.
하나 이상의 용기 안에 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 본원에서 제공되는 조합물 및 사용 지침서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
본원에서 제공되는 임의의 변형된 항-EGFR 항체, 항원-결합 단편 또는 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 겔, 연고, 액체, 용액, 현탁액, 에어로졸, 정제, 환제(pill), 산제(powder) 또는 동결건조제로 제형화될 수 있고, 및/또는 전신적, 비경구, 국소적(topical), 경구, 점막, 비강내, 피하(subcutaneous), 에어로졸화, 정맥내, 기관지, 폐, 질, 외음질(vulvovaginal), 식도(esophageal), 또는 구강식도 투여용으로 제형화될 수 있다. 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 단일 투여량 투여용 또는 다중 투여량 투여용으로 제형화될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 서방성 제형이다.
본원에서 제공되는 약제학적 조성물의 약제학적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태의 예는 특히 종양이 EGFR을 발현하는, 고형 종양과 같은 종양, 암 또는 전이(metastasis)를 포함한다.
일부 예에서, 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태는 두경부암, 비-소세포 폐암 또는 대장암(colorectal cancer)이다. 일부 예에서, 치료되는 대상체가 항-EGFR 치료에 저항성(resistance)을 부여하는 KRAS, NRAS 또는 BRAF와 같은 마커를 가지지 않는 종양을 가진다. 그러므로 일부 예에서 대상체는 KRAS 돌연변이-음성 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)-발현 대장암을 가질 수 있다.
치료를 위한 대상체는 인간과 같은 포유류일 수 있다. 대상체는 본원에서 제공되는 약제학적 조성물의 국소적(topical), 비경구적, 국부적(local), 또는 전신적 투여에 의해 치료될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 비강내, 근육내, 진피내, 복강내, 정맥내, 피하적, 경구적, 또는 폐 투여에 의해 투여될 수 있다.
본원에서 제공되는 대상체에서 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상채를 치료하는 방법은 또한 이리노테칸(irinotecan), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 5-플루오로우라실(5-FU), 젤로다(Xeloda), 캠토사(Camptosar), 엘록사틴(Eloxatin), 아드리아마이신(Adriamycin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine), 카보플라틴(carboplatin) 및 방사선과 같은 항암제 또는 항암 치료를 포함할 수 있고, 또는 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 및 이의 항원-결합 단편과 같은 하나 이상의 추가의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여를 포함할 수 있다.
이러한 방법에서, 약제학적 조성물 및 항암제가 단일 조성물 또는 별개의 조성물로 제형화될 수 있고, 약제학적 조성물 및 항암제는 순차적으로, 동시에 또는 간헐적으로 투여될 수 있다.
본원에서 제공되는 방법에서, 항체는 예를 들어, 약 0.5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 80 mg/kg, 또는 약 50 mg/kg 내지 약 100 mg/kg과 같은 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 용량으로; 또는 예를 들어, 약 0.01 mg/m2, 약 0.1 mg/m2, 약 0.5 mg/m2, 약 1 mg/m2, 약 5 mg/m2, 약 10 mg/m2, 약 15 mg/m2, 약 20 mg/m2, 약 25 mg/m2, 약 30 mg/m2, 약 35 mg/m2, 약 40 mg/m2, 약 45 mg/m2, 약 50 mg/m2, 약 100 mg/m2, 약 150 mg/m2, 약 200 mg/m2, 약 250 mg/m2, 약 300 mg/m2, 약 400 mg/ m2, 약 500 mg/ m2, 약 600 mg/ m2 또는 약 700 mg/ m2과 같은 약 0.01 mg/m2 내지 약 800 mg/m2 또는 그 이상의 용량으로 투여될 수 있다.
또한 대상체에서 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태를 치료하는 약제로 제형화될 수 있는 약제학적 조성물 및 대상체에서 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태를 치료하기 위한 약제학적 조성물의 용도가 본원에서 제공된다. 이러한 약제학적 조성물 또는 용도는 종양, 예를 들어 고형 종양이거나 및/또는 EGFR을 발현하는 종양, 암 또는 전이에 적용될 수 있다. 구체적 예에서, 본원에서 제공되는 약제학적 조성물 또는 용도에 의해 치료되는 상태는 두경부암, 비소세포 폐암 또는 대장암이다.
도 1(A-B)는 종래 세툭시맙의 예시적 중쇄 및 경쇄의 정렬을 도시한다. 예를 들어, 도 1A는 이하의 정렬을 도시한다: 서열번호 5에 기재된 중쇄 아미노산 서열, 이는 서열번호 2에 기재된 중쇄 가변 도메인(VH) 및 서열번호 21에 기재된 중쇄 불변 도메인(CH)을 함유하고; 서열번호 6에 기재된 중쇄 서열, 이는 서열번호 7에 기재된 VH 및 서열번호 22에 기재된 CH를 함유하고; 서열번호 12에 기재된 중쇄 서열, 이는 서열번호 2에 기재된 VH 및 서열번호 23에 기재된 CH를 함유하고, 및 서열번호 1에 기재된 중쇄 서열, 이는 서열번호 2에 기재된 VH 및 서열번호 20에 기재된 CH를 함유한다. 중쇄 가변 도메인(VH), 중쇄의 세 상보성 결정영역(CDRs) (VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3), 중쇄 불변 도메인의 세 서브도메인(CH1, CH2 및 CH3) 및 경첩 영역 잔기는 각 영역 또는 도메인에 붙인 화살표로 표시된다. 도 1B는 이하의 정렬을 도시한다: 서열번호 3에 기재된 경쇄 서열, 이는 서열번호 4에 기재된 경쇄 가변 도메인(VL) 및 서열번호 33에 기재된 경쇄 불변 도메인(CL)을 함유하고; 서열번호 10에 기재된 경쇄 서열, 이는 서열번호 11에 기재된 VL 및 서열번호 33에 기재된 CL을 함유하고; 서열번호 13에 기재된 경쇄 서열, 이는 서열번호 4에 기재된 VL 및 서열번호 34에 기재된 CL을 함유하고; 및 서열번호 8에 기재된 경쇄 서열, 이는 서열번호 9에 기재된 VL 및 서열번호 34에 기재된 CL을 함유한다. 경쇄 가변 도메인(VL), 경쇄의 세 상보성 결정영역(CDRs) (VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3) 및 경쇄 불변 도메인(CL)은 각 영역 또는 도메인에 붙인 화살표로 표시된다. 도시된 정렬에서, "*"는 정렬된 잔기가 동일함을 의미하고, ":"는 정렬된 잔기가 동일하지 않지만 유사하고 정렬된 위치에 보존적 아미노산을 함유함을 의미하고, "."는 정렬된 잔기가 유사하고 정렬된 위치에 반-보존적 아미노산을 함유함을 의미한다. 위치 104번에 상응하는 아미노산 치환을 위한 예시적, 비-제한적 위치가 강조로 표시된다.
도 2(A-D)는 정렬된 항체 사이 또는 중에 상응하는 잔기를 식별하기 위한 정렬을 도시한다. 예를 들어, 도 2A는 서열번호 2 및 7에 기재된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 14에 기재된 H225로 지정된 예시적 비변형 항-EGFR 항체의 중쇄 가변 도메인의 정렬을 도시한다. 도 2B는 서열번호 2 및 7에 기재된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 16에 기재된 Hu225로 지정된 예시적 비변형 항-EGFR 항체의 중쇄 가변 도메인의 정렬을 도시한다. 중쇄 불변 도메인의 세 서브도메인(CH1, CH2, 및 CH3)은 각 도메인에 붙인 화살표로 표시된다. 도 2C는 서열번호 4, 9 및 11에 기재된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 15에 기재된 H225로 지정된 예시적 비변형 항-EGFR 항체의 경쇄 가변 도메인의 정렬을 도시한다. 도 2D는 서열번호 4, 9 및 11에 기재된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 17에 기재된 Hu225로 지정된 예시적 비변형 항-EGFR 항체의 경쇄 가변 도메인의 정렬을 도시한다. 경쇄의 세 상보성 결정영역(CDRs) (VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3)는 각 도메인에 붙인 화살표로 표시된다. 도시된 정렬에서, "*"는 정렬된 잔기가 동일함을 의미하고, ":"는 정렬된 잔기가 동일하지 않지만 유사하고 정렬된 위치에 보존적 아미노산을 함유함을 의미하고, "."는 정렬된 잔기가 유사하고 정렬된 위치에 반-보존적 아미노산을 함유함을 의미한다. 아미노산 치환을 위한 예시적, 비-제한적 상응하는 위치가 강조로 표시된다.
목차
A. 정의
B. EGFR 및 항-EGFR 항체
1. EGFR
2. 항-EGFR 항체 및 부작용EP1944322
3. 세툭시맙(Erbitux) 및 이의 유도체
a. 구조
b. 기능
C. 산성 pH 선택성을 갖는 변형된 활성 항-EGFR 항체
1. 104E 변형을 함유하는 항-EGFR 항체
a. 추가 변형
i. 추가 중쇄 변형
ii. 추가 경쇄 변형
iii. 기타 변형
b. 예시적 104E 변형된 항-EGFR 항체 및 이의 단편
2. 인간화 항-EGFR 항체
3. 104D 변형을 함유하는 항-EGFR 항체
4. 컨쥬게이트(Conjugates)
a. 표적제
i. 메이탄시노이드 약물 모이어티
ii. 오리스타틴 및 돌라스타틴 약물 모이어티
iii. 피롤로벤조디아제핀(PBDs)
iv. 세포 독소 모이어티
v. 표적 전달을 위한 핵산
b. 링커(Linker)
i. 펩티드 링커
ii. 화학적 링커
c. 예시적 컨쥬게이트
i. 항-EGFR 항체-오리스타틴 컨쥬게이트
ii. 항-EGFR 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트
D. 항-EGFR 항체를 생산하는 방법
1. 항-EGFR 항체의 생성(generating) 및 생산
a. 벡터
b. 세포 및 발현 시스템
i. 원핵세포 발현
ii. 효모균
iii. 곤충
iv. 포유류 세포
ㅍ. 식물
2. 정제
E. 항-EGFR 항체 성질 및 활성을 확인하고 평가하는 방법
1. 결합 어세이
2. 세포 기반 어세이
3. 동물 모델
4. 약동학 및 약력학 어세이
F. 약제학적 조성물, 제형, 키트, 제조품 및 조합물
1. 약제학적 조성물 및 제형
2. 제조품/키트
3. 조합물
G. 치료적 용도
1. 예시적인 질환 및 상태
a. 암
b. 비-암성 과증식성 질환
c. 자가면역 질환 및 장애
d. 염증성 장애
e. 감염성 질환
f. 기타 질환 및 상태
2. 치료에 대한 대상체
a. EGFR을 과발현하는 대상체의 선택
b. EGFR-관련 다형성(polymorphism)을 나타내는 대상체의 선택
c. 항-EGFR-관련 부작용을 나타내는 대상체의 확인
i. 피부 독성
ii. 저마그네슘혈증(Hypomagnesemia)
d. 기타 치료를 위한 대상체를 선택 또는 확인하는 방법
3. 투여량
4. 투여의 경로
5. 조합 치료
H. 실시예
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명(들)이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원 명세서 전체에 걸쳐 언급되는 모든 특허, 특허 출원서, 공개 출원서 및 간행물, 젠뱅크(Genbank) 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 기타 공개된 자료는, 달리 언급되지 않는 한, 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에서 용어에 대한 복수의 정의가 있는 경우, 본 섹션의 것이 우선한다. URL 또는 기타 그러한 식별자 또는 주소로 참조된 경우, 그러한 식별자는 바뀔 수 있고 인터넷 상의 특정 정보는 변동할 수 있지만, 동등한 정보가 인터넷 검색에 의해 발견될 수 있다. 그것의 참조는 이러한 정보의 이용가능성 및 공적인 보급을 증명한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 조건부 활성 단백질(예를 들어, 항체)은 하나의 환경, 특히 하나의 인 비보(in vivo) 환경에서, 제 2 환경과 비교하여 더욱 활성이다. 그러므로, 조건부 활성 단백질은 다른 환경과 비교하여 하나의 환경에서 선택적 활성(예를 들어, 결합 활성)을 나타낸다. 본원의 목적상, 조건부 활성 단백질은 pH-선택적 활성을 나타내고, 피부, GI 트랙 또는 기타 비-종양 환경과 같은 비-종양 환경에 존재하는 바와 같은 pH 7.0 내지 7.4 (각 경계값 포함), 및/또는 0.5 mM 내지 5 mM (각 경계값 포함) 락테이트(예를 들어, 1 mM) 중 하나 또는 둘다를 포함하는 조건 하에서보다, 종양 환경에서 존재하는 것과 같은, pH 6.0 내지 6.5 (각 경계값 포함) 및/또는 10 mM 내지 20 mM (각 경계값 포함) 락테이트 중 하나 또는 둘다를 포함하는 조건 하, 더 활성이다. 그러므로, 본원에서 제공되는 조건부 활성 단백질은 선택적 활성을 나타내는 단백질이고, 피부, GI 트랙, 또는 기타 비-종양 환경과 같은 비-종양 미세환경에서 보다 종양 미세환경에서 더 활성이다. 조건부 활성은 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro)에서 조절될 수 있다. 예를 들어 만약 종양 환경에서의 활성(예를 들어 결합 활성)이 비-종양 환경에서 더 크다면, 예를 들어 비-종양 미세환경에 비하여 종양 환경에서의 활성 비율이 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0 또는 그 이상이면 조건부 활성이 인 비보(in vivo)에 존재한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "종양 미세환경에서 조건부 활성"을 갖거나, 또는 "종양 미세환경에서 조건부 활성"인 치료제 또는 이의 변이체는 비-종양 미세환경(예를 들어, 건강한 또는 비-병적 조직 또는 세포, 예컨대 피부의 기저층)보다 종양 미세환경에서 치료제로서 더욱 활성인, 예컨대 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체와 같은 치료제이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "pH 선택적 활성"은 중성 pH (예를 들어, pH 7.0 내지 7.4, 및 선택적으로 정상 락테이트 농도, 예를 들어, 0.5 mM 내지 5 mM) 환경에서보다 산성 pH (예를 들어, pH 6.0 내지 6.5, 및 선택적으로 상승된 락테이트 수준, 예를 들어, 10 mM 내지 20 mM) 존재 하를 포함하는 조건 하 더 활성인 단백질(예를 들어, 항체)를 말한다. pH-선택적 활성은 인 비보 또는 인 비트로에서 조절될 수 있다. 만약 활성(예를 들어, 결합 활성)이 중성 조건(예를 들어, pH 7.0 내지 7.4 및/또는 0.5 mM 내지 5 mM 락테이트) 하에서 보다 산성 조건(예를 들어, pH 6.0 내지 6.5 및/또는 10 mM 내지 20 mM 락테이트) 하 더 크다면, pH-선택적 활성이 존재한다. 예를 들어, 중성 조건에 대하여 산성 조건 하, 활성 비율이 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0 또는 그 이상이라면 pH-선택적 활성이 존재한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 병적 또는 비-병적 미세환경을 "시뮬레이션한 조건(condition that simulate)"은, 인 비보 환경에 존재하는 조건 또는 조건들에 상응하는 인 비트로 또는 인 비보 어세이(assay) 조건을 말한다. 예를 들어, 만약 미세환경이 낮거나 산성인 pH에 의해서 특징지어진다면, 미세환경을 시뮬레이션하는 조건은 낮거나 산성인 pH를 갖는 어세이 조건 또는 완충액(buffer)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 종양 미세환경에서 존재하는 조건은 비-종양 미세환경(예를 들어, 건강한 또는 비-병적 세포 또는 조직)과 비교하여 그 안에 존재하는 조건을 포함한다. 종양 미세환경에서 존재하는 조건은 증가된 혈관 신생(vascularization), 저산소증(hypoxia), 낮은 pH, 증가된 락테이트(lactate) 농도, 증가된 피루브산염(pyruvate) 농도, 증가된 간질액(interstitial fluid) 압력 및 변경된 대사체 또는 종양의 대사 지표를 포함한다. 예를 들어, 종양 미세환경 내에 존재하는 조건은 pH 7.4 미만의 낮은 pH, 전형적으로 약 5.6 내지 6.8, 예컨대 약 또는 pH 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 또는 6.8 미만이다. 또한 종양 미세환경 내에 존재하는 조건은 약 또는 5 mM 내지 20 mM 락테이트, 예를 들어, 10 mM 내지 20 mM 락테이트, 예컨대 15 mM 내지 18 mM, 및 특히 적어도 또는 적어도 약 16 mM, 16.5 mM, 16.7 mM 또는 17 mM 락테이트의 높은 락테이트 농도를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 비-종양 미세환경에 존재하는 조건은 종양 미세환경에 존재하지 않는 조건 또는 조건들을 포함한다. 본원의 목적을 위하여, 조건 또는 조건들은 종양 미세환경 및 비-종양 미세환경에 존재하는 상응하는 성질 또는 특징, 예컨대 pH, 락테이트 농도 또는 피루브산염 농도이나, 이것들은 두 미세환경 사이에 다르다. 비-종양 미세환경(예를 들어, 피부의 기저층)에 존재하는 조건은 pH 약 7.0 내지 약 7.8, 예컨대 적어도 또는 약 또는 pH 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7 또는 7.8의 pH 이다. 예를 들어, pH는 약 pH 7.4와 같은, 약 또는 7.0 내지 7.4 사이의 중성의 pH이다. 비-종양 미세환경(예를 들어, 피부의 기저층)에 존재하는 조건은 예를 들어 0.5 mM 내지 4 mM 락테이트, 예컨대 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 mM 락테이트와 같은 0.5 내지 5 mM 락테이트인 락테이트 농도를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "낮은 pH" 또는 "산성 pH"는 본원에서 상호호환적으로 사용되는데, 이는 약 5.6 내지 약 6.8 범위의 pH, 예컨대 약 또는 pH 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 또는 6.8 미만의 pH를 말한다. 예를 들어, 낮은 pH 또는 산성 pH는 약 pH 6.0 또는 6.5와 같은, 각 경계값을 포함하는 6.0 내지 6.5이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상피세포 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor)(EGFR; 유니프롯(Uniprot) 수탁번호 P00533 및 서열번호: 43에 기재됨)는 수용체 티로신 키나아제(tyrosine kinase)의 ErbB 패밀리의 일원이고 리간드 예컨대 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor)(EGF)뿐만 아니라, TGF-α, 암피레귤린(amphiregulin), 헤파린-결합 EGF (HB-EGF) 및 베타셀룰린(betacellulin)을 포함하는 다른 내인성 EGF-유사 리간드에 의해 결합되고 활성화되는 티로신 키나아제 성장 인자 수용체를 말한다. 활성화되면, EGFR는 세포 성장, 증식, 생존 및 운동에 대한 중요한 시그널링 캐스케이드(signaling cascade)에 관련된다. 종양 세포 상에 이들의 존재 이외에, 표피세포 성장 인자 수용체는 어디에나 있고(ubiquitous), 조혈 세포 및 표피세포 유래의 세포를 제외한, 정상 세포의 표면상에 임의로 분포되어 있다. 예를 들어, EGFR은 피부 케라티노사이트에 발현된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 활성에 대한 활성 비율은 pH 약 7.4 및 락테이트 농도 약 1 mM 중 하나 또는 둘다를 포함하는 제2 세트의 조건 하와 비교하여, pH 6.0 내지 6.5 (각 경계값 포함) 및 락테이트 농도 15 mM 내지 20 mM (각 경계값 포함) 중 하나 또는 둘다를 포함하는 제1 세트의 조건 하, EGFR 항원(예를 들어, 인간 EGFR 또는 이의 가용성 간편)에 대한 결합 활성 관계를 말한다. 이는 상기 활성이 결합 활성과 정적 상관관계(positively correlate)에 있는 한, 제2 조건에서의 활성에 의해 제1 조건에서의 활성을 나눈 몫으로 표현된다. 본원의 일부 예에서, 결합 활성(예를 들어 EC50 또는 KD)은 결합 활성에 부적 상관관계(negatively correlate)인 표시(measure)로서 제공된다. 이러한 예에서, 활성 비율은 양 세트의 조건 하 결합 활성의 역(inverse)으로 먼저 표시되고, 제1 조건에서의 활성의 역(inverse)을 제2 조건에서의 활성으로 나눈 몫으로 표현된다. 결합 활성 및 결합 활성의 비율을 결정함에 있어, 제1 및 제2 조건 하 결합 활성이 pH 및/또는 젖산 농도에서의 차이를 제외하고, 동일한 어세이 조건 하 측정된다고 이해된다. 1>의 결합 활성의 비율은 결합 활성이 제2 세트의 조건 하에서 보다 제1 세트의 조건 하에서 더 크거나 더 높다는 것을 가리킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항-EGFR 항체는 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하고 리간드가 EGFR에 결합하는 것을 차단함으로써, EGFR의 경쟁적 억제 및 EGFR 활성 억제를 야기하는 임의의 항체를 말한다. 그러므로, 항-EGFR 항체는 EGFR 억제제이다. 본원에서 항-EGFR 항체에 대한 참조는 특이적으로 EGFR에 결합하는 전장(full-length) 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상피세포 성장인자 수용체(EGFR) 항원은 상피세포 성장인자(EGF)와 같은 리간드에 의해 결합되는 티로신 성장인자 수용체를 말한다. EGFR은 인간 및 비-인간 단백질을 포함한다. 구체적으로, EGFR 항원은 인간 EGFR을 포함하는데, 이는 서열번호 43에 기재된 아미노산 서열을 갖는 170 kDa 타입 I 글리코프로테인이다(Uniprot Accession No. P00533 참고).
본원에서 사용된 바와 같이, 가용성 EGFR은 막관통(transmembrane) 또는 세포내 영역을 결핍하는 가용성 EGFR 동형단백(isoform)을 말한다. 그러므로 가용성 EGFR은 EGFR의 세포외 도메인(ECD)만을 포함하는 단백질을 포함한다. 예시적 가용성 EGFR은 서열번호 43에 기재된 EGFR의 ECD, 또는 서열번호 43의 아미노산 잔기 25-645에 상응하는, EGF에 결합하기에 충분한 이의 부분, 또는 EGF에 결합하기에 충분한 부분만을 함유한다. 가용성 EGFR은 또한 기타 단백질의 기타 도메인 또는 영역에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 단백질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세툭시맙(225, 또한 얼비툭스(Erbitux)로 알려지고 시판됨)은 특이적으로 EGFR에 결합하고 EGFR 억제제인 키메라 (마우스/인간) 단일클론 항체(chimeric (mouse/human) monoclonal antibody)인 항-EGFR 항체를 말한다. 세툭시맙은 각 449개의 아미노산의 2개의 동일한 중쇄(예를 들어, 서열번호 12에 기재됨) 및 각 214개의 아미노산의 2개의 동일한 경쇄(예를 들어, 서열번호 13에 기재됨)을 포함하는 4개의 폴리펩티드 쇄로 구성된다고 보고된다(IMGT Acc. No. 7906 참고). M225의 가변 영역에 상응하는 가변 영역은 서열번호 12(서열번호 2에 기재된 가변 중쇄)의 아미노산 잔기 1-119 및 서열번호 13(서열번호 4에 기재된 가변 경쇄)의 아미노산 잔기 1-107에 기재된다. C225는 CH1 (서열번호 12의 아미노산 잔기 120-127), 경첩 영역(서열번호 12의 아미노산 잔기 218-232), CH2 (서열번호 12의 아미노산 잔기 233-342) 및 CH3(서열번호 12의 아미노산 잔기 343-449)를 포함하는, 인간 불변 도메인 CH1-CH2-경첩-CH3을 함유하는 서열번호 12의 아미노산 잔기 120-449 (서열번호 23에 기재됨)에 기재된 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 함유한다. C225는 또한 서열번호 13의 아미노산 잔기 108-213 (서열번호 34에 기재됨)에 기재된 인간 Cκ 경쇄 불변 영역을 함유한다. 본원의 세툭시맙의 참조는 몇몇 아미노산에서 차이가 있는 문헌들에 보고된 항체들도 인용한다(예를 들어, 미국특허 제7,060,808호; 공개된 미국특허출원 제20110117110호; 미국특허공개 제20130266579호; 국제공개된 PCT 출원 제WO2004085474호; GenBank Accession No. CAH61633; DrugBank Acc. No. DB00002; IMGT Acc. No. 7906 참고). 그러므로, 본원의 세툭시맙의 참조는 서열번호 1(중쇄) 및 3(경쇄); 서열번호 5(중쇄) 및 3(경쇄); 서열번호 6(중쇄) 및 8(경쇄); 또는 서열번호 6(중쇄) 및 10(경쇄)에 기재된 아미노산 서열도 포함한다. 세툭시맙 서열 및 상응하는 서열번호들은 도 1A 및 1B 및 표 5에 제공된다.
본원에서 세툭시맙의 참조로, 표시되었을 때에는, 세툭시맙과 동일한 상보성 결정 영역(CDRs)을 함유하는 세툭시맙의 인간화 또는 기타 변이체 유도체도 포함한다. 세툭시맙의 CDRs는 VH CDR1 (서열번호 35에 기재된, 서열번호 2 또는 7의, Kabat 정의에 따른, 아미노산 잔기 31-35); VH CDR2 (서열번호 36에 기재된, 서열번호 2 또는 7의 아미노산 잔기 50-65); VH CDR3 (서열번호 37에 기재된, 서열번호 2 또는 7의 아미노산 잔기 98-108); VL CDR1 (서열번호 38에 기재된, 서열번호 4, 9 또는 11의 아미노산 잔기 24-34); VL CDR2 (서열번호 39에 기재된, 서열번호 4, 9 또는 11의 아미노산 잔기 50-56); 및 VL CDR3 (서열번호 40에 기재된, 서열번호 4, 9 또는 11의 아미노산 잔기 89-97)를 포함한다, 미국공개특허 제20110117110호를 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세툭시맙의 항원-결합 단편은 세툭시맙의 전장 보다는 짧으나 항원 결합 부위(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 CDR들)를 형성하기에 충분한 항체의 가변 영역의 부분을 적어도 포함하고, 따라서 세툭시맙의 결합 특이성 및/또는 활성을 유지하는 세툭시맙 유래의 항체를 말한다. 세툭시맙 중쇄의 가변 영역은 서열번호 2 또는 7에 기재되는데, 이는 서열번호 1, 5, 6 또는 12의 아미노산 1-119에 상응한다. 세툭시맙 경쇄의 가변 영역은 서열번호 4, 9 또는 11에 기재되는데, 이는 서열번호 3, 8, 10 또는 13의 아미노산 1-107에 상응한다(도 1A 또는 1B 및 표 5 참고). 그러므로 예시적인 세툭시맙의 항원-결합 단편은 서열번호 2에 기재된 아미노산의 서열(가변 중쇄) 및 서열번호 4에 기재된 아미노산의 서열(가변 경쇄)를 함유하는 항체, 서열번호 7에 기재된 아미노산의 서열(가변 중쇄) 및 서열번호 9에 기재된 아미노산의 서열(가변 경쇄)를 함유하는 항체, 서열번호 7에 기재된 아미노산의 서열(가변 중쇄) 및 서열번호 11에 기재된 아미노산의 서열(가변 경쇄)를 함유하는 항체, 또는 항원에 결합하기에 충분한 가변 중쇄 또는 경쇄 부분을 포함한다. 예를 들어, 세툭시맙의 예시적인 항원-결합 단편은 서열번호 2 또는 7에 기재된 아미노산 서열을 함유하고 서열번호 23 중 임의에 기재된 IgG1 항체의 CH1 영역 또는 서열번호 19-22 (VH-CH1) 및 서열번호 3(경쇄 VH-CL) 중 임의에 기재된 기타 보고된 IgG1의 CH1 영역을 포함하는 Fab 항체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비변형 항체"는 본원에서 제공되는 바와 같은 변형을 위해 선택되는 출발 폴리펩티드 중쇄 및 경쇄 또는 이의 단편을 말한다. 출발 표적 폴리펩티드는 활성이 평가되는 주된 참조(reference) 폴리펩티드인, 항체의 야생형 또는 참조 형태일 수 있다. 예를 들어, 세툭시맙은 본원에서 변형을 위한 주된 또는 참조 폴리펩티드이다. 비변형 또는 출발 표적 항체는 변형되거나 돌연변이되어 항체의 주된 또는 참조 형태와 달라진 것일 수 있으나, 그럼에도 불구하고, 본원에서 생산되는 그 뒤에 변형된 폴리펩티드(예를 들어, 항원-결합 단편 또는 세툭시맙의 변이체)에 대하여 상대적으로 비변형 출발 표적 단백질로서 본원에서 언급된다. 따라서, 비변형 참조 단백질과 비교하여 특히 활성 또는 성질에서 바람직한 증가 또는 감소를 가지도록 변형될 수 있는 당해 분야에서 공지된 기존의 단백질이 선택될 수 있고 출발 비변형 표적 단백질로 사용될 수 있다.
예를 들어, 하나 또는 그 이상의 단일 아미노산 변화에 의해 주된 또는 참조 형태로부터 변형되고, 바람직한 성질의 증가 또는 감소, 예컨대 감소된 면역원성을 가지는 단백질이 표적 단백질이 될 수 있고, 동일한 또는 다른 성질 중 어느 하나의 추가 변형을 위한, 비변형 단백질로 본원에서 언급된다. 예시적 참조 또는 비변형 항-EGFR 항체는 서열번호 1(중쇄) 및 3(경쇄), 서열번호 5 (중쇄) 및 3(경쇄), 서열번호 12(중쇄 및 13(경쇄), 또는 서열번호 6(중쇄) 및 8(경쇄), 서열번호 6(중쇄) 및 10(경쇄)에 기재된 전장 항-EGFR 항체 폴리펩티드 또는 이의 항원-결합 단편이다. 예시적 항원-결합 단편은 서열번호 2(가변 중쇄) 및 4(가변 경쇄), 서열번호 7(가변 중쇄) 및 9(가변 경쇄), 또는 서열번호 7(가변 중쇄) 및 서열번호 11(가변 경쇄)에 기재된 폴리펩티드를 함유하는항-EGFR 항체 단편을 포함한다. 비변형 또는 참조 항체는 또한 임의의 인용된 서열번호에 대하여 적어도 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내어 결과적인 항체가 특이적으로 EGFR에 결합하는 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 부분을 나타내는 이의 항체 변이체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 항-EGFR 항체" 또는 "변이체 항-EGFR 항체"는 참조 또는 비변형 항-EGFR 항체와 비교하여 아미노산 서열에서 본원에서 기술된 바와 같이 적어도 하나의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환을 포함하는 항-EGFR 항체를 말한다. 본원의 목적 상, 적어도 하나의 아미노산 치환은 서열번호 2 또는 7을 참고로 104번 위치에 상응하는 위치에 가변 중쇄 중 글루탐산(E)로의 치환이다. 변형된 항-EGFR 항체는 추가적 변형(예를 들어 아미노산 치환들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 변형된 항-EGFR 항체는 결과로 얻은 변형된 항-EGFR 항체가 EGFR에 결합함을 나타내는 한, 최대 150개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 전형적으로, 변형된 항-EGFR 항체는 비변형 항체에 비하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 아미노산 치환을 포함한다. 변형된 항-EGFR 항체는 또한 본원에서 기술된 적어도 하나의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환 이외에, 임의의 하나 또는 그 이상의 기타 변형을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 가변 중쇄, 가변 경쇄 또는 둘다에서의 변형과 관련하여 "둘다(both)"는 항체가 항체의 가변 중쇄에서 하나 이상의 변형 및 가변 경쇄에서 하나 이상의 변형을 함유하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형"은 폴리펩티드의 아미노산의 서열 또는 핵산 분자에서 뉴클레오티드의 서열의 변형을 참조로 하고 아미노산 또는 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 치환을 각각 포함한다. 폴리펩티드를 변형하는 방법은 예컨대 재조합 DNA 방법론에 의한 것은 당업자에게 일상적인 일이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 언급할 때, "결실"은 서열, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 자연 또는 야생형 서열에 비해 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 결실을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 또는 아미노산 서열을 언급할 때, "삽입"은 표적, 자연, 야생형 또는 다른 관련 서열 내, 하나 또는 그 이상의 부가적인 뉴클레오티드 또는 아미노산의 포함을 설명한다. 따라서, 야생형 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 삽입을 포함하는 핵산 분자는 서열의 선형 길이 내에 하나 또는 그 이상의 부가적 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 및 아미노산 서열에 "첨가"는 다른 서열에 비해 각각의 말단 상에 뉴클레오티드 또는 아미노산의 첨가를 설명한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치환(substitution)" 또는 "치환(replacement)"은 선택가능한 뉴클레오티드 또는 아미노산을, 분자의 길이 변화없이(잔기의 숫자로서 기술됨), 자연, 표적, 야생형 또는 다른 핵산 또는 폴리펩티드 서열 내 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산으로 치환하는 것을 말한다. 따라서, 분자 내 하나 또는 그 이상의 치환은 분자의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 개수를 변경하지 않는다. 특정 폴리펩티드에 비하여 아미노산 치환은 폴리펩티드 서열의 길이에 따른 아미노산 잔기 개수에 관하여 표현될 수 있다. 예를 들어, 티로신(Try; T)의 글루탐산(Glu; E)으로 치환/대체된 아미노산 서열의 104번째 위치에 아미노산에서 변형을 갖는 변형된 폴리펩티드는 Y104E, Tyr104Glu 또는 104E로 표현될 수 있다. 간단히 Y104는 변형된 104번 위치의 아미노산이 티로신임을 가리키는데 사용될 수 있다. 본원의 목적상, 변형이 항체의 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC)에 있으므로, 변형은 또한 변경되는 폴리펩티드의 쇄(chain)를 나타내기 위해 HC- 또는 LC-에 대해 참조로 나타낼 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 개시된 서열, 예컨대 서열 목록에 기재되는 것에서 "상응하는 위치" 또는 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치에 "상응하는" 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치에 대한 언급은 표준 정렬 알고리즘, 예컨대 GAP 알고리즘을 사용하여 동일성을 최대로 하는 개시된 서열과 함께 정렬시에 확인되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치를 말한다. 본원의 목적을 위해, 본원에서 제공되는 변형을 위한 잔기는 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 4, 9 또는 11에 기재된 가변 경쇄에 기재된 아미노산 위치를 참조로 한다. 따라서, 상응하는 잔기는 서열번호 2 또는 7 (예를 들어, 도 2A 또는 2B)에 기재된 서열과, 참조 중쇄 서열, 또는 이의 부분의 정렬에 의해 및/또는 서열번호 4, 9 또는 11 (예를 들어, 도 2C 또는 2D)에 기재된 서열과, 참조 경쇄 서열, 또는 이의 부분의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 서열의 정렬에 의해, 당업자는 예를 들어, 가이드(guide)로써 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 사용하여, 상응하는 잔기를 확인할 수 있다. 일반적으로, 상응하는 위치를 확인하기 위해, 최상위 일치가 얻어지도록 아미노산의 서열이 정렬된다(예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffm, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo 외 (1988) SIAM J Applied Math 48:1073 참조). 예시적인 정렬이 도 2A-D에 제공되고 상응하는 정렬된 잔기에 기초한 예시적인 아미노산 치환이 표 6 및 표 8에 기재된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 서열의 정렬은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 둘 또는 그 이상의 서열을 나란하게 하는 상동(homology)의 사용을 말한다. 전형적으로, 50% 또는 그 이상의 동일성(identity)과 관련되는 둘 또는 그 이상의 서열이 정렬된다. 서열이 정렬된 세트는 상응하는 위치에 정렬되는 2 또는 그 이상의 서열을 말하고 게놈 DNA 서열과 정렬되는, RNA로부터 유래하는 정렬하는 서열, 예컨대 EST 및 다른 cDNA을 포함할 수 있다. 관련되는 또는 변이체 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 정렬될 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 일치를 최대화하고, 방법, 예컨대 수동 정렬(manual alignment)을 사용함 및 사용가능한 다수의 정렬 프로그램을 사용함(예를 들어, BLASTP) 및 당업자에게 공지된 다른 방법을 포함한다. 가이드로서 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 사용하여, 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 정렬함에 의해, 당업자는 유사한 부분 또는 위치를 확인할 수 있다. 또한, 당업자는 또한 보존되는 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기를 인간 및 비-인간 서열 사이와 그 중에서 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기를 찾기 위해 가이드로서 사용할 수 있다. 상응하는 위치는 또한 예를 들어, 단백질 구조의 컴퓨터 모의 정렬(computer simulated alignment)을 사용함에 의해 구조적 정렬에 기초할 수 있다. 다른 경우에, 상응하는 영역이 확인될 수 있다. 당업자는 또한 인간 및 비-인간 서열 사이와 그 중에서 상응하는 아미노산 잔기를 찾기 위해 가이드로서 보존되는 아미노산 잔기를 사용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "동일한 조건 하에서 비교되는" 단백질에 대한 설명은 단백질의 활성 또는 성질에 영향을 줄 수 있는 임의의 하나 또는 그 이상의 조건이 동일하거나 실질적으로 동일하도록 또는 시험 제제들간 차이가 없거나 실질적으로 차이가 없는 제제로 처리된 다른 단백질을 의미한다. 예를 들어, 변형된 항-EGFR 항체의 활성이 비변형 항-EGFR 항체와 비교될 때 임의의 하나 또는 그 이상의 조건 예컨대 폴리펩티드의 양(amount) 또는 농도; 활성 제제(active agent)(예컨대, 항-EGFR 항체)이외의 제형에서 부형제, 담체 또는 다른 구성의 양(amount)을 포함하는, 존재; 온도; pH, 저장 시간; 저장 용기; 저장 성질 (예를 들어, 교반) 및/또는 노출 또는 사용과 관련된 다른 조건이 비교되는 폴리펩티드 사이 및 그 중에서 동일하거나 실질적으로 동일하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유해한 효과(adverse effect)," 또는 "부작용(side effect)" 또는 "이상반응(adverse event)," 또는 "이상 부작용(adverse side effect)"은 치료제 투여와 관련되는 해로운, 유해한 및/또는 바람직하지 않은 효과를 말한다. 예를 들어, 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙과 관련되는 부작용은 당업자에게 공지되어 있고 본원에 기술된다. 이러한 부작용은 예를 들어, 피부과학적인 또는 피부의 독성 예컨대 발진을 포함한다. 부작용 또는 유해한 효과는 각각의 등급에 대해 제공하는 정의가 존재하는 독성 및 다양한 독성 단계로 등급이 매겨진다. 이러한 단계의 예는 국립 암 연구소 일반 독성 기준(National Cancer Institute Common Toxicity Criteria) 버전 2.0, 세계 보건 기구(World Health Organization) 또는 이상 반응에 대한 일반적인 용어 기준(Common Terminology Criteria for Adverse Events)(CTCAE) 단계이다. 일반적으로, 단계는 다음과 같다: 제 1 등급 = 경미한(mild) 부작용; 제 2 등급 = 중간(moderate) 부작용; 제 3 등급= 심각한(severe) 부작용; 제 4 등급 = 생명을 위협하거나 장애를 입히는 부작용; 제5 등급 = 치명적(fatal). 중증도 등급의 부여는 의사 또는 다른 보건 전문가의 경험 내에 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드, 예컨대 항체의 "성질"은 폴리펩티드에 의해 나타나는 결합 특이성, 구조적 배열(configuration) 또는 입체구조(conformation), 단백질 안정성, 단백질분해(proteolysis)에 대한 저항성, 입체구조적 안정성, 열의 내성(thermal tolerance), 및 pH 조건에 대한 내성을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 성질을 말한다. 성질의 변화가 폴리펩티드의 "활성"을 변경할 수 있다. 예를 들어, 항체 폴리펩티드의 결합 특이성의 변화는 항원에 결합하는 능력 및/또는 다양한 결합 활성, 예컨대 폴리펩티드의 친화도(affinity) 또는 결합활성(avidity), 또는 생체 내(in vivo) 활성을 변경할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드, 예컨대 항체의 "활성" 또는 "기능적 활성"은 폴리펩티드에 의해 나타나는 임의의 활성을 말한다. 이러한 활성은 경험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 활성은 생체분자와 상호작용하는 능력, 예를 들어 항원-결합, DNA 결합, 리간드 결합, 또는 이량체화(dimerization), 효소 활성, 예를 들어, 키나아제 활성 또는 단백질분해 활성을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체(항체 단편을 포함하는)에 대해, 활성은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 능력, 항원-결합 친화도(affinity)(예를 들어, 높은 또는 낮은 친화도), 항원-결합 결합활성(avidity)(예를 들어, 높은 또는 낮은 결합활성), 온-속도(on-rate), 오프-속도(off-rate), 이펙터(effector) 기능, 예컨대 항원 중화 또는 클리어런스(clearance), 바이러스 중화, 및 생체 내(in vivo) 활성, 예컨대 생체 내 병원균의 감염 또는 침입을 예방하거나, 또는 클리어런스를 촉진하거나, 또는 특정 조직 또는 유체 또는 세포에 침투하는 능력을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 활성은 온-(on-) 또는 오프-속도(off-rate), 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 면역형광법 조직학(immunofluorescence histology) 및 현미경 관찰(microscopy), 세포-기반 어세이(cell-based assay), 유세포분석기(flow cytometry) 및 결합 어세이(binding assay)(예를 들어, 패닝 어세이(panning assay)를 측정하기 위해 알려진 분석, 예컨대 ELISA, 유세포 분석기(flow cytometry), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 또는 등가물 어세이(equivalent assay)를 사용하여 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 항체 폴리펩티드에 대해, 활성은 결합 친화도(binding affinity), 결합활성(avidity) 및/또는 결합 계수(binding coefficient)(예를 들어, 온-/오프-속도(on-/off-rate)), 및 시험관 내(in vitro) 다른 활성 또는 생체 내(in vivo) 다양한 효과, 예컨대 면역 효과, 예를 들어, 항원 클리어런스, 항체의 조직으로의 침투 또는 국소화, 질환, 예를 들어, 감염으로부터 보호, 혈청 또는 다른 유체 항체 역가, 또는 당업자에게 공지된 다른 어세이를 측정함에 의해 평가될 수 있다. 폴리펩티드가 활성을 나타내는 것을 표시하는 이러한 분석의 결과는 생체 내(in vivo) 폴리펩티드의 활성과 연관될 수 있고, 여기서 생체 내(in vivo) 활성은 치료적 활성, 또는 생물학적 활성으로 지칭될 수 있다. 변형된 폴리펩티드의 활성은 비변형 폴리펩티드의 활성에 비해 활성의 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 또는 그 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 비변형 폴리펩티드의 활성의 백분율의 임의의 수준이 될 수 있다. 변형된 (또는 변이체) 항체의 기능성 또는 활성을 결정하기 위한 어세이가 당업계에 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "결합(bind)", " 결합된(bound)" 또는 이의 문법의 변화는 다른 분자와의 임의의 끌어당기는 상호작용에서의 분자의 참여를 말하며, 안정한 연합(association)을 초래하여 두 개의 분자들이 서로 매우 가까이에 있게 된다. 결합은 이에 제한되는 것은 아니나, 비공유 결합, 공유 결합(예컨대 가역적 또는 비가역적 공유 결합)을 포함하며, 그리고 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 및 저분자들, 예컨대 약물을 포함하는 화학적 화합물과 같은 분자 사이의 상호작용을 포함한다. 예시적 결합은 항체-항원 상호작용 및 수용체-리간드 상호작용이다. 항체가 특정 항원과 "결합" 되었을 때, 결합은 항체 결합 부위에서 동족 항체-항원 상호작용을 통한, 항체에 의한 항원의 특이적 인식을 말한다. 결합은 또한 폴리펩티드의 다중 쇄의 연합, 예컨대 이황화 결합을 통해 상호작용하는 항체 쇄를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 결합 활성(binding activity)은 분자, 예를 들어, 폴리펩티드의, 하나 또는 그 이상의 결합 파트너와 결합하는지 여부 및 어떻게 하는지와 관련된 성질을 말한다. 결합 활성은 결합 파트너(들)과 결합하는 능력, 결합 파트너와 결합하는 친화도(예를 들어, 높은 친화도), 결합 파트너와 결합하는 결합활성(avidity), 결합 파트너와의 결합 강도(strength) 및/또는 결합 파트너와 결합을 위한 특이성(specificity)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "친화도(affinity)" 또는 "결합 친화도(binding affinity)"는 두 개 또는 그 이상 분자, 예컨대 결합 파트너 사이의 상호작용의 강도, 전형적으로 두 개의 결합 파트너 사이의 비공유 상호작용의 강도를 말한다. 항원 에피토프(epitope)에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 친화도는 단일 항체 결합 부위 및 에피토프 사이의 총 비공유 상호작용의 강도의 측정이다. 낮은-친화도의 항체-항원 상호작용은 약하고, 분자가 급속하게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은 친화도의 항체-항원-결합은 강하고 분자가 더 긴 시간 동안 결합된 채로 남아있다. 결합 친화도는 결합 역학, 예를 들어 연합 비율(k a 또는 k on) 및/또는 해리 비율(k d 또는 k off), 최대유효농도의 반값(EC50), 및/또는 열역학 데이타(예를 들어 깁스 자유에너지(ΔG), 엔탈피(ΔH), 엔트로피(-TΔS)를 측정하거나, 및/또는 연합상수(Ka) 또는 해리상수(Kd)를 계산하여 결정될 수 있다.
어패어런트(apparent) Kd라고도 불리는 EC50은 항체 농도(예를 들어, ng/ml)인데, 여기서 최대 결합의 50%는 항원의 고정된 양으로 관찰된다. 전형적으로 EC50 값은 S자 모양(sigmoidal)의 용량-반응곡선으로 확인되며, 여기서 EC50은 변곡점에서의 농도이다. 기질에 대한 높은 항체 친화도는 낮은 EC50 값에 관련되며, 낮은 친화도는 높은 EC50 값에 상응한다. 친화도 상수는 항체 반응에 대한 표준 역학 방법론, 예를 들어 면역분석법, 예컨대 ELISA, 뒤이은 곡선 적합(curve-fitting) 분석에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "친화도 상수(affinity constant)"는 항원에 대한 항체의 친화도를 측정하는데 사용되는 연합 상수(association constant)(Ka)를 말한다. 친화도 상수가 더 높을수록 항원에 대한 항체의 친화도가 더 크다. 친화도 상수는 몰농도의 역수의 단위로 표현되고(즉, M-1) 항체 반응을 위한 표준 동력학 방법론(standard kinetic methodology)(예를 들어, 면역어세이(immunoassays), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance), 또는 당업계에 공지된 다른 운동 상호작용 분석(어세이))에 의해 측정된 연합-해리 반응을 위한 속도 상수로부터 계산될 수 있다. 항체의 결합 친화도는 또한 해리 상수, 또는 Kd 값으로 표현될 수 있다. 해리 상수는 연합 상수의 역수, Kd = 1/Ka이다. 따라서, 친화도 상수는 또한 Kd 값으로 나타낼 수 있다. 친화도 상수는 항체 반응을 위한 표준 동력학 방법론, 예를 들어, 면역어세이(immunoassay), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)(SPR)(Rich 및 Myszka (2000) Curr . Opin . Biotechnol 11:54; Englebienne (1998) Analyst. 123:1599), 등온 적정 칼로리 측정법(isothermal titration calorimetry)(ITC) 또는 본 발명의 분야에서 알려진 다른 동력학 상호작용 분석에 의해서 결정될 수 있다(예를 들어 Paul, ed., Fundamental Immunology, 2판., Raven Press, New York, pages 332-336 (1989) 참조; 또한 항체의 결합 친화도 계산을 위한 예시적인 SPR 및 ITC 방법의 기술에 대한 미국 특허번호 제7,229,619호 참조). 결합 비율의 실시간 검출 및 모니터링을 위한 기기 및 방법이 알려져 있고 상업적으로 사용가능하다(예를 들어, 비아코어(BIAcore) 2000, 비아코어 AB, 웁살라, 스웨덴 및 GE 헬스케어 생명 과학(GE Healthcare Life Sciences); Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335).
친화도를 계산하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들어 연합/해리 상수를 결정하는 방법 또는 EC50 값을 결정하는 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, EC50에 있어서, 높은 결합 친화도는 항체가 약 10　ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/mL, 7 ng/mL, 6 ng/mL, 5 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/mL, 1　ng/mL 또는 그 이하에 미만인 EC50로, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 높은 결합 친화도는 또한, 10-6 M 또는 더 낮은 평형 해리 상수(Kd), 예를 들어, 10-7 M, 10-8 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M 또는 더 낮은 평형 해리 상수(Kd)로 특징지어질 수 있다. 평형 연합 상수(Ka)에 있어서, 높은 결합 친화도는 일반적으로 약 106 M-1과 동등하거나 더 큰, 약 107 M-1과 동등하거나 더 큰, 약 108 M-1과 동등하거나 더 큰, 또는 약 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 또는 1012 M-1과 동등하거나 더 큰, Ka 값에 관련된다. 친화도는 경험적으로 평가될 수 있고 또는 친화도들은 비교적으로, 예를 들어, 특정 항원에 대한 둘 이상의 항체들의 친화도를 비교함으로써, 예를 들어 시험하는 항체들의 친화도의 비율을 쌍으로(pairwise) 계산함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 이러한 친화도는 예를 들어, ELISA; 평형 투석(equilibrium dialysis); 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance);에 의해, 방사선 표지된 표적 항원을 사용한 방사선면역측정법(radioimmunoassay)에 의하여 또는 본 분야의 기술자에게 알려진 또 다른 방법과 같은 전통적 기술을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. 친화도 데이터는 예를 들어, Scatchard 외, Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)의 방법에 의하여 또는 곡선 적합 분석, 예를 들어 y=((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D, 여기서 A는 최소 점근선, B는 경사 인자, C는 변곡점(EC50), 및 D는 최대 점근선인 방정식을 사용하여 4 Parameter Logistic 비선형 회귀 모델을 사용하여 분석될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체 결합활성(avidity)은 다가 항체(multivalent antibody) 및 그의 동족 항원(cognate antigen) 사이의, 예컨대 반복되는 에피토프 또는 에피토프 배열(epitope array)을 가진 항원과 연합하는 다중 결합 부위를 포함하는 항체와의 다중 결합의 강도를 말한다. 높은 결합활성 항체는 낮은 결합활성 항체와 비교하여 높은 강도의 이러한 상호작용을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "적어도 하나의 활성을 나타냄" 또는 "적어도 하나의 활성을 유지함"은 변형을 포함하지 않는, 표적 또는 비변형 폴리펩티드와 비교하여, 변형된 폴리펩티드, 예컨대 변이체 항체 또는 다른 치료상 폴리펩티드(예를 들어, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편)에 의해 나타나는 활성을 말한다. 표적 폴리펩티드의 활성을 유지하는 변형된, 또는 변이체, 폴리펩티드는 향상된 활성, 감소된 활성을 나타낼 수 있고, 또는 비변형 폴리펩티드의 활성을 유지할 수 있다. 일부의 경우, 변형된, 또는 변이체, 폴리펩티드는 비변형 폴리펩티드 또는 표적과 비교하여 증가된 활성을 유지할 수 있다. 일부의 경우, 변형된, 또는 변이체, 폴리펩티드는 비변형 또는 표적 폴리펩티드와 비교하여 감소된 활성을 유지할 수 있다. 변형된, 또는 변이체, 폴리펩티드의 활성은 비변형 또는 표적 폴리펩티드에 비해 활성의 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 또는 그 이상의 활성을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 비변형 또는 표적 폴리펩티드의 활성의 백분율의 임의의 수준이 될 수 있다. 다른 구현예에서, 활성의 변화는 비변형 또는 표적 폴리펩티드보다 적어도 약 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배, 또는 그 이상 배를 초과한다. 활성의 유지에 대한 어세이는 유지되는 활성에 의존한다. 이러한 어세이는 실험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 수행될 수 있다. 활성은 예를 들어, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나, ELISA 및 패닝(panning) 분석과 같은 당업계에 공지되고 하기 실시예에 기술된 분석 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 비변형 또는 표적 폴리펩티드와 비교하여 변형된, 또는 변이체, 폴리펩티드는 또한 생체 내 치료 또는 생물학적 활성 또는 폴리펩티드의 투여에 따른 결과의 관점에서 평가될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 변형된 항-EGFR 항체와 관련하여 "증가된 활성"은 동일한 조건 하에서 시험 될 때, 변형된 항-EGFR 항체가 아미노산 치환(들)을 포함하지 않는 비변형 항-EGFR 항체와 비교하여 더 큰 활성을 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어, 변형된 항-EGFR 항체는 비변형 또는 참조 항-EGFR 항체의 활성의 적어도 또는 약 적어도 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500% , 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 이상을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체 결합 친화도와 관련하여 사용될 때, 용어 "동일"은 EC50, 연합 상수(Ka) 또는 해리 상수(Kd)가 참조 항체의 친화도 보다 약 1 내지 100 배 또는 1 내지 10배 내(참조 항체보다, 1-100 배 초과 친화도 또는 1-100 배 미만 친화도, 또는 그러한 범위 내의 임의의 수치 값 또는 범위 또는 값)인 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, EC50, 연합 상수(Ka) 또는 해리 상수(Kd)와 관련하여 사용될 때, "실질적 동일"은, Ka , Kd 또는 EC50가 참조 항체의 Ka , Kd 또는 EC50의 약 5 내지 5000배 이상 또는 이하 이내(참조 항체보다 5-5000 배 초과 또는 5-5000 배 미만)임을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 "특이적 결합" 또는 "면역특이적 결합"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 항체의 항체 결합 부위(들) 및 항원 사이의 비공유적 상호작용에 의한, 동족 항원과 하나 또는 그 이상의 비공유 결합을 형성하는 항체 또는 항원-결합 단편의 능력을 말한다. 전형적으로, EGFR에 면역특이적으로 결합(또는 특이적 결합)하는 항체는 약 또는 1x107 M-1 또는 1x108 M-1 또는 그 이상인 친화도 상수(affinity constant) Ka (또는 1x10-7 M 또는 1x10-8 M 또는 그 이하인 해리 상수(Kd))를 가지고 EGFR과 결합하는 것이다. 특정 항원(예를 들어, EGFR)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이 예를 들어, 면역 어세이, 예컨대 방사선면역어세이(radioimmunoassays)(RIA), 효소-결합 면역흡착 어세이(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA), 표면 플라스몬 공명, 또는 당업자에게 알려진 기타 기술에 의해서 확인될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)"은 바이오센서 매트릭스(biosensor matrix) 내에서 예를 들어, 비아코어 시스템(BIACore system)(GE 헬스케어 생명 과학)을 사용하여, 단백질 농도의 변경을 검출함에 의해, 실시간 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 자연 또는 부분적 또는 전적으로 합성된, 예컨대 재조합적으로, 생산된 것이든, "항체"는 항원 결합 부위를 형성하기에 충분한 면역글로불린 분자의 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 적어도 부분을 포함하는 이의 임의의 단편을 포함하는, 면역글로불린 및 면역글로불린 단편이고, 조립되었을 때 항원에 특이적으로 결합하는 것을 말한다. 따라서, 항체는 면역글로불린 항원-결합 도메인(항체 결합 부위)에 상동성 또는 실질적 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 예를 들어, 항체는 두 개의 중쇄(H 및 H'으로 표시될 수 있음) 및 두 개의 경쇄(L 및 L'으로 표시될 수 있음)를 포함하는 항체를 말하고, 여기서 각각의 중쇄는 전장(full-length) 면역글로불린 중쇄 또는 항원 결합 부위(예를 들어, 중쇄는 VH 쇄(chain), VH-CH1 쇄 및 VH-CH1-CH2-CH3 쇄를 포함하나 이에 제한되지 않는다)를 형성하는데 충분한 이의 부분이 될 수 있고, 각각의 경쇄는 전장 경쇄 또는 항원 결합 부위를 형성하기에 충분한 이의 부분(예를 들어, 경쇄는 VL 쇄 및 VL-CL 쇄를 포함하나, 이에 제한되지 않는다)이 될 수 있다. 각각의 중쇄(H 및 H')는 하나의 경쇄(각각, L 및 L')와 짝을 이룬다. 전형적으로, 항체는 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL)의 전체 또는 적어도 부분을 최소한으로 포함한다. 항체는 또한 불변 영역(constant region)의 전체 또는 부분을 포함할 수 있다.
본원의 목적을 위해, 용어 항체는 전장 항체 및 항체 단편을 포함하는 이의 부분, 예컨대, 항-EGFR 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이황화결합 Fvs(dsFv), Fd 단편, Fd' 단편, 단일-쇄 Fvs(scFv), 단일-쇄 Fabs(scFab), 디아바디(diabody), 항유전자형(anti-idiotypic)(anti-Id) 항체, 또는 상기의 임의의 항원-결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체는 또한 합성 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 인간 항체, 비-인간 항체, 인간화 항체, 키메라(chimeric) 항체, 및 인트라바디(intrabody)를 포함한다. 본원에서 제공되는 항체는 임의의 면역글로불린 클래스(예를 들어, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY), 임의의 서브클래스(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 서브-서브클래스(예를 들어, IgG2a 및 IgG2b)의 일원이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 형태는 항체의 특정 구조를 말한다. 본원에서 항체는 전장 항체 및 이의 부분, 예컨대, 예를 들어, Fab 단편 또는 다른 항체 단편을 포함한다. 따라서, Fab는 항체의 특정 형태이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 "상응하는 형태"에 대한 언급은 두 개의 항체의 성질 또는 활성을 비교할 때, 항체의 동일한 형태를 사용하여 성질이 비교되는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체가 제 1 항체의 상응하는 형태의 활성과 비교하여 적은 활성을 가지는 것으로 명시되어 있다면, 특정 형태, 예컨대 항체의 Fab가 제 1 항체의 Fab 형태와 비교하여 적은 활성을 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 전장 항체는 두 개의 전장 중쇄(예를 들어, VH-CH1-CH2-CH3 또는 VH-CH1-CH2-CH3-CH4) 및 두 개의 전장 경쇄(VL-CL) 및 경첩(hinge) 영역을 갖는 항체, 예컨대 항체 분비 B 세포에 의해 생산되는 인간 항체 및 합성적으로 생산되는 동일한 도메인을 갖는 항체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체 단편 또는 항체 부분은 전장보다 짧으나 항원 결합 부위(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 CDR)를 형성하기에 충분한 항체 가변 영역의 부분을 적어도 포함하고 따라서 전장 항체의 결합 특이성 및/또는 활성을 유지하는 전장 항체의 임의의 부분을 말한다; 항체 단편은 전장 항체의 효소적 처리에 의해 생산된 항체 유도체뿐만 아니라, 합성적으로 예를 들어, 재조합적으로 생산된 유도체를 포함한다. 항체 단편의 예는, Fab, Fab', F(ab')2, 단일-쇄(single-chain) Fvs(scFv), Fv, dsFv, 디아바디(diabody), Fd 및 Fd' 단편(예를 들어, Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov 참조)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 단편은 함께 연결된, 예컨대 이황화 가교(disulfide bridge)에 의한, 및/또는 펩티드 링커(linker)에 의한, 다중 쇄(multiple chain)를 포함할 수 있다. 항체 단편은 일반적으로 적어도 약 50개 아미노산 및 전형적으로 적어도 200개 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fv 항체 단편은 비공유 상호작용에 의해 연결된 하나의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 하나의 가변 경쇄(VL) 도메인으로 구성되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, dsFv는 VH-VL 쌍을 안정화시키는, 조작된 분자간 이황화결합을 갖는 Fv를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fd 단편은 항체 중쇄의 가변 도메인(VH) 및 하나의 불변 영역 도메인(CH1)을 포함하는 항체의 단편이다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fab 단편은 전장 면역글로불린의 파파인(papain)의 소화에 기인한 항체 단편, 또는 합성적으로, 예를 들어 재조합 방법에 의해 생산된 동일한 구조를 갖는 단편이다. Fab 단편은 경쇄(VL 및 CL 을 포함하는) 및 중쇄(VH)의 가변 도메인 및 중쇄의 하나의 불변 영역 도메인 부분(CH1)을 포함하는 다른 쇄를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, F(ab')2 단편은 pH 4.0-4.5에서 면역글로불린의 펩신의 소화에 기인한 항체 단편이거나, 합성적으로 예를 들어, 재조합 방법에 의해 생산된 동일한 구조를 갖는 단편이다. F(ab')2 단편은 두 개의 단편을 연결하는 이황화 연결을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하는, 각각의 중쇄 부분이 부가적인 몇 개의 아미노산을 포함하는, 두 개의 Fab 단편을 필수적으로 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fab' 단편은 F(ab')2 단편의 반(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄)을 포함하는 단편이다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fd' 단편은 F(ab')2 단편의 하나의 중쇄 부분을 포함하는 항체의 단편이다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fv' 단편은 항체 분자의 VH 및 VL 도메인만을 포함하는 단편이다.
본원에서 사용된 바와 같이, hsFv는 Fab 단편 내에 정상적으로 존재하는 불변 도메인이 헤테로이량체 코일드-코일 도메인(heterodimeric coiled-coil domain)으로 치환된 항체 단편을 말한다(예를 들어, Arndt 외 (2001) J Mol Biol . 7:312:221-228 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, scFv 단편은 임의의 순서로 폴리펩티드 링커(linker)에 의해 공유적으로 연결된, 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체 단편을 말한다. 링커는 두 개의 가변 도메인들이 실질적인 간섭없이 가교되도록 하는 길이를 말한다. 예시적인 링커는 가용성을 증가시키도록 도처에 분산된 일부 Glu 또는 Lys 잔기를 갖는 (Gly-Ser)n 잔기이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 디아바디(diabody)는 이량체 scFv이다; 디아바디는 전형적으로 scFvs보다 짧은 펩티드 링커를 가지고 있고, 우선적으로 이량화한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 "도메인"은 구조적 및/또는 기능적으로 구별될 수 있거나 정의될 수 있는 폴리펩티드의 부분(3 또는 그 이상의, 일반적으로 5, 10 또는 그 이상의 아미노산 서열)이다. 예시적인 폴리펩티드의 도메인은 하나 또는 그 이상의 구조적 모티프(motif)로 구성된 폴리펩티드 내에서 독립적으로 접힌 구조(예를 들어, 루프 영역(loop region)에 의해 연결된 알파 나선(alpha helice) 및/또는 베타 가닥(beta strand)의 조합)를 형성할 수 있고 그리고/또는 특정 기능적 활성, 예컨대 효소 활성, 이량체화(dimerization) 또는 항원-결합에 의해 인식될 수 있는 폴리펩티드의 부분이다. 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상, 전형적으로 하나 초과의, 별개의 도메인을 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 구조적 도메인 및 하나 또는 그 이상의 기능적 도메인을 가질 수 있다. 단일 폴리펩티드 도메인은 구조 및 기능에 기초하여 구별될 수 있다. 도메인은 아미노산의 인접한(contiguous) 선형 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 도메인은 폴리펩티드의 아미노산의 선형 서열을 따라 비-인접한, 인접하지 않은 복수의 아미노산 부분을 포함할 수 있다. 전형적으로, 폴리펩티드는 복수의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 항체 분자의 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄는 각각 약 110개 아미노산 길이인, 복수의 면역글로불린 (Ig) 도메인을 포함한다. 당업자는 폴리펩티드 도메인에 익숙하고 다른 이러한 도메인과 함께 구조적 및/또는 기능적 상동성에 의해 그들을 확인할 수 있다. 본원에서 예시를 위해, 정의가 제공되지만, 명칭에 의해 특정 도메인을 인식하는 것이 당업자에게 잘 이해된다. 필요한 경우, 적절한 소프트웨어가 도메인을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 기능적 영역은 적어도 하나의 기능적 (특정 기능, 예컨대 생체분자와 상호작용, 예를 들어, 항원-결합, DNA 결합, 리간드 결합, 또는 이량체화, 또는 효소 활성, 예를 들어, 키나아제 활성 또는 단백질 분해 활성에 의한 것과 같은 능력을 부여하는)도메인을 포함하는 폴리펩티드의 영역이다; 폴리펩티드의 예시적인 기능적 영역은 항체 도메인, 예컨대 VH, VL, CH, CL, 및 이의 부분, 예컨대 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는, CDR, 또는 항원-결합 부분, 예컨대 항체 결합 부위이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 구조적 영역은 적어도 하나의 구조적 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 영역이다.
본원에서 사용된 바와 같이, Ig 도메인은 루프(loop)에 의해 연결되는 아미노산의 역-평행 베타 가닥(anti-parallel beta strand)를 포함하는 두 개의 베타-병풍시트(beta-pleated sheet)을 각각 포함하는, 면역글로불린 (Ig) 접힘(fold)으로 지칭되는 구조에 의해 구별되는 것으로, 당업자에 의해 인식되는 도메인이다. Ig 접힘에서 두 개의 베타 시트(beta sheet)는 소수성 상호작용 및 보존된 쇄내(intra-chain) 이황화 결합에 의해 함께 붙어있다(sandwiched). 항체 쇄(chain) 내 개별적인 면역글로불린 도메인은 기능에 기초하여 더 구별될 수 있다. 예를 들어, 경쇄는 하나의 가변 영역 도메인(VL) 및 하나의 불변 영역 도메인(CL)을 포함하는 반면에, 중쇄는 하나의 가변 영역 도메인(VH) 및 세 개 또는 네 개의 불변 영역 도메인(CH)을 포함한다. 각각의 VL, CL, VH, 및 CH 도메인은 면역글로불린 도메인의 예이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체와 관련하여 가변 도메인은 다른 항체들 간 다양한 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 특이적 Ig 도메인이다. 각각의 경쇄 및 각각의 중쇄는 하나의 가변 영역 도메인을 갖는다(VL 및 VH). 가변 도메인은 항원 특이성을 제공하고, 따라서 항원 인식에 책임이 있다. 각각의 가변 영역은 항원 결합 부위 도메인의 일부인 CDR 및 프레임워크(framework) 영역(FR)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "초가변(hypervariable) 영역," "HV," "상보성-결정 영역," "CDR" 및 "항체 CDR"은 항체의 항원 결합 부위를 함께 형성하는 각각의 가변 영역 내에 복수의 부분의 하나를 말하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 각각의 가변 영역 도메인은 CDR1, CDR2, 및 CDR3로 지칭되는 세 개의 CDR을 포함한다. 세 개의 CDR은 선형 아미노산 서열을 따라 비-인접하나, 접힌 폴리펩티드 내에 근접하다. CDR은 가변 도메인의 베타 시트의 평행 가닥(parallel strand)을 연결하는 루프 내에 위치한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항원-결합 도메인(antigen-binding domain)," "항원-결합 부위(antigen-binding site)," "항원 결합 부위(antigen combining site)" 및 "항체 결합 부위(antibody combining site)"는 동족 항원과 물리적으로 상호작용하고 인식하는 항체 내의 도메인을 말하는 동의어로 사용된다. 자연의 종래의 전장 항체 분자는 중쇄 가변 영역의 부분 및 경쇄 가변 영역의 부분을 각각 포함하는, 두 개의 종래의 항원-결합 부위를 가진다. 종래의 항원-결합 부위는 가변 영역 도메인 내에 역-평행 베타 가닥(anti-parallel beta strand)을 연결하는 루프를 포함한다. 항원 결합 부위는 가변 영역 도메인의 다른 부분을 포함할 수 있다. 각각의 종래의 항원-결합 부위는 중쇄 유래의 세 개의 초가변 영역 및 경쇄 유래의 세 개의 초가변 영역을 포함한다. 초가변 영역은 또한 상보성-결정 영역(complementarity-determining region)(CDR)으로 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 가변 중쇄 또는 경쇄와 관련하여 "이의 부분"은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체로 조립될 때, 항체 결합 부위를 형성하기에 충분한 이의 인접한 부분을 말하고, 그것은 모든 6개 CDR을 포함하는 상응하는 전장 항체의 결합 특이성의 부분을 적어도 유지하기에 충분한 가변 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 적어도 1 또는 2, 전형적으로 3, 4, 5 또는 모든 6개의 CDR을 적어도 포함한다. 일반적으로, 충분한 항원 결합 부위는 중쇄의 CDR3(CDRH3)를 필요로 한다. 그것은 전형적으로 경쇄의 CDR3(CDRL3)을 더 필요로 한다. 본원에 기술한 바와 같이, 당업자는 카바트(Kabat) 또는 코티아(Chothia) 넘버링에 기초한 CDR을 인지하고 확인할 수 있다(예를 들어, Kabat, E.A.외 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, 미국 보건복지부(U.S. Department of Health and Human Services), NIH 출판번호 제91-3242호, 및 Chothia, C. 외(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, 프레임워크 영역(FR)은 베타 시트(beta sheet) 내에 위치하는 항체 가변 영역 도메인 내의 도메인이고; FR 영역은, 그들의 아미노산 서열 면에서, 초가변 영역(hypervariable region)보다 비교적 더 보존적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 불변 영역 도메인은 가변 영역 도메인보다 항체들 중에서 비교적 더 보존된 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 또는 경쇄 내의 도메인이다. 각각의 경쇄는 단일 경쇄 불변 영역(CL) 도메인을 갖고, 각각의 중쇄는 하나 또는 그 이상의 중쇄 불변 영역(CH) 도메인을 포함하고, 이것은 CH1, CH2, CH3 및 CH4을 포함한다. 전장 IgA, IgD 및 IgG 아이소타입(isotypes)은 CH1, CH2, CH3 및 경첩 영역을 포함하는 반면, IgE 및 IgM은 CH1, CH2, CH3 및 CH4을 포함한다. CH1 및 CL 도메인은 항체 분자의 Fab 팔(arm)로 연장되므로, 따라서 항원 및 항체 팔 회전과 함께 상호작용에 기여한다. 항체 불변 영역은 이펙터(effector) 기능, 예컨대, 예를 들어 다양한 세포, 생체분자 및 조직간의 상호작용을 통하여, 항체가 특이적으로 결합하는, 항원, 병원체 및 독소의 제거(clearance)를 제공할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "카바트 넘버링(Kabat numbering)"은 IgGl 카바트 항체의 인덱스 넘버링을 말한다(예를 들어, Kabat, E.A. 외 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, 미국 보건복지부, NIH 공개번호 91-3242 참조). 예를 들어, 카바트 넘버링을 기초로, CDR-LI은 잔기 L24-L34에 상응하고; CDR-L2은 잔기 L50-L56에 상응하고; CDR-L3은 잔기 L89-L97에 상응하고; CDR-H1은 길이에 따라 잔기 H31-H35, 35a 또는 35b에 상응하고; CDR-H2은 잔기 H50-H65에 상응하고; 그리고 CDR-H3는 잔기 H95-H102에 상응한다. 당업자는 카바트를 사용하여 불변 영역의 영역을 확인할 수 있다. 표 1 및 2에 예시적인 항체 세툭시맙에 대해 카바트 넘버링 및 EU 넘버링 체계를 사용한 상응하는 잔기가 기재된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "EU 넘버링" 또는 "EU 인덱스"는 Edelman 외, Proc Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85에 기술된 EU 항체의 넘버링 체계를 말한다. "카바트에서 EU 인덱스"는 카바트, E.A. 외 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, 미국 보건복지부, NIH 공개번호 제91-3242호에 기재된 바와 같이 인간 IgGl 카바트 항체의 EU 인덱스 넘버링을 말한다. EU 넘버링 또는 카바트에서 EU 넘버링이 당업자에 의해 경쇄 및 중쇄 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기의 번호를 매기는데 종종 사용된다. 예를 들어, 당업자는 EU 넘버링을 사용하여 불변 영역의 영역을 확인할 수 있다. 예를 들어, CL 도메인은 카바트 넘버링에 따라 잔기 L108-L216 또는 EU 넘버링에 따라 L108-L214에 상응한다. CH1은 잔기 118-215 (EU 넘버링) 또는 114-223 (카바트 넘버링)에 상응하고; CH2은 잔기 231-340 (EU 넘버링) 또는 244-360 (카바트 넘버링)에 상응하고; CH3은 잔기 341-446 (EU 넘버링) 또는 361-478 (카바트 넘버링) 도메인에 상응하고; CDR-L2은 잔기 L50-L56에 상응하고; CDR-L3은 잔기 L89-L97에 상응하고; CDR-H1은 길이에 따라 잔기 H31-H35, 35a 또는 35b에 상응하고; CDR-H2는 잔기 H50-H65에 상응하고; 그리고 CDR-H3은 잔기 H95-H102에 상응한다. 표 1 및 2에 예시적인 항체 세툭시맙에 대해 카바트 넘버링 및 EU 넘버링을 사용하여 상응하는 잔기가 기재된다. 맨 윗 줄(볼드체)는 아미노산 잔기 번호를 기재하고; 두 번째 줄(볼드체)은 맨 윗줄에서 번호로 표시되는 위치에서의 아미노산 잔기에 대한 1-문자를 제공하고; 세 번째 줄(이탤릭체)은 카바트 넘버링에 따른 상응하는 카바트 번호를 나타내고; 그리고 네 번째 줄(볼드체 아님, 이탤릭체 아님)은 EU 넘버링에 따른 상응하는 EU 인덱스를 나타낸다.
표 1. 세툭시맙 경쇄의 카바트 및 EU 넘버링
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
표 2. 세툭시맙 중쇄의 카바트 및 EU 넘버링
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 경첩(hinge) 영역" 또는 "경첩 영역"은 다른 항체 도메인과 상동성이 없는 CH1 및 CH2 도메인 사이에, 감마, 델타 및 알파 항체 아이소타입(isotype)의 중쇄에 자연적으로 존재하는 폴리펩티드 영역을 말한다. 이러한 영역은 프로린(proline) 잔기가 풍부하고 IgG, IgD 및 IgA 항체에 그들이 항원에 결합함에 따라 서로에 대하여 다양한 각도를 취한다고 가정하면, Fab 부분의 두 개의 "팔(arm)"(각각 하나의 항체 결합 부위를 포함하는)이 이동하는 것을 허용하는 유연성을 준다. 이러한 유연성은 세포 표면 또는 다른 항원 상의 에피토프와 상호작용하는 항체 결합 부위를 나란하게 하기 위해 Fab 팔이 움직일 수 있도록 한다. 경첩 영역 내 두 개의 쇄 간(interchain) 이황화 결합은 두 개의 중쇄 사이의 상호작용을 안정화시킨다. 본원에서 제공되는 일부 구현예에서, 합성적으로 생산되는 항체 단편은, 예를 들어, 두 개의 항체 쇄 사이의 상호작용을 통해 안정화를 촉진하는, 하나 또는 그 이상의 경첩 영역을 포함한다. 경첩 영역은 예시적인 이량체화 도메인이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 다른 항체, 예컨대 단일클론 항체로부터 유래되는 항체 단편을 언급할 때, 문구 "로부터 유래된"은 원래의 항체의 결합 특이성을 보유하는 항체 단편의 조작(예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2, 단일-쇄 Fv (scFv), Fv, dsFv, 디아바디(diabody), Fd 및 Fd' 단편)을 말한다. 이러한 단편은 효소적 분해, 화학적 가교(crosslinking), 재조합 수단 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 유래 될 수 있다. 일반적으로 유래된 항체 단편은 부모 항체(parent antibody)의 동일한 또는 실질적으로 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 공유하므로, 항체 단편 및 부모 항체는 동일한 에피토프에 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부모 항체(parent antibody)" 또는 "기원 항체(source antibody)"는 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab)2, 단일-쇄(single-chain) Fv (scFv), Fv, dsFv, 디아바디(diabody), Fd 및 Fd' 단편)이 유래되는 항체를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프(epitope)"는 항체의 파라토프(paratope)가 결합하는 항원 상의 항원 결정기를 말한다. 에피토프 결정기는 전형적으로 분자 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 그룹을 포함하고 전형적으로 특정 삼차원 구조 특징뿐만 아니라, 특정 전하 특징을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 인간화 항체는 인간으로 투여가 면역 반응을 유발하지 않도록 아미노산의 "인간" 서열을 포함하도록 변형된 항체를 말한다. 인간화 항체는 전형적으로 비-인간 종의 면역글로불린으로부터 유래하는 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 루프(hypervariable loop)) 및 인간 면역글로불린으로부터 주로 유래하는 항체 분자의 나머지를 포함한다. 이러한 항체를 제조하는 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 암호화(encoding)하는 DNA는 비-가변 영역의 아미노산 조성이 인간 항체를 기초로 하는 항체를 암호화하기 위한 재조합 DNA 기술에 의해 변경될 수 있다. 면역글로불린의 가변 및 비-가변 영역을 확인하기 위해 설계된, 컴퓨터 프로그램을 포함하는, 이러한 영역을 확인하는 방법이 공지되어 있다. 따라서, 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 두 개의, 가변 도메인의 모두를 실질적으로 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프(예를 들어, CDRs)가 비-인간 글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 면역글로불린 서열의 그것에 상응한다. 인간화 항체는 또한 전형적으로 인간 면역글로불린인, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 한 부분을 선택적으로 포함할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 다량체화 도메인(multimerization domain)은 제 1 도메인과 안정한 다량체를 형성하는 동일하거나 상이한 다량체화 도메인일 수 있는, 상보적인 다량체화 도메인을 각각 포함하는, 하나 또는 그 이상의 부가적인 폴리펩티드 분자와 안정한 상호작용을 촉진하는 아미노산 서열을 말한다. 일반적으로, 폴리펩티드는 다량체화 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다. 예시적인 다량체화 도메인은 면역글로불린 서열 또는 이의 부분, 류신 지퍼(leucine zipper), 소수성 영역, 친수성 영역, 및 양립가능한 단백질-단백질 상호작용 도메인을 포함한다. 다량체화 도메인은, 예를 들어, 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인, 예컨대, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형(subtype)을 포함하는, IgG, IgA, IgE, IgD 및 IgM 유래의 Fc 도메인 또는 이의 부분, 및 이의 변형된 형태가 될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 이량체화 도메인(dimerization domain)은 두 개의 폴리펩티드 서열(예컨대, 비제한적으로, 항체 쇄들(antibody chains)) 사이의 상호작용을 용이하게 할 수 있는 다량체화 도메인이다. 이량체화 도메인은 이에 제한되지는 않으나, 두 개의 폴리펩티드 서열 사이의 이황화 결합의 형성을 용이하게 하는 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 예컨대 전장 항체 경첩 영역의 전부 또는 일부, 또는 폴리펩티드들 사이의 상호작용을 증진시키는 것으로 알려진 아미노산 서열인 하나 또는 그 이상의 이량체화 서열(예컨대, 류신 지퍼, GCN4 지퍼)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 제 1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한, 항체 중쇄의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD, 및 IgE의 마지막 두 개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 또는 IgE 및 IgM의 마지막 세 개의 불변 영역 면역글로불린 도메인을 말한다. 선택적으로, Fc 도메인은 이러한 도메인에 유연한 경첩 N-말단의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. IgA 및 IgM에 대해, Fc는 J 쇄를 포함할 수 있다. IgG의 예시적인 Fc 도메인에 대해, Fc는 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3, 및 선택적으로, Cγl 및 Cγ2 사이 경첩의 전부 또는 일부를 포함한다. Fc 영역의 경계는 변할 수 있지만, 전형적으로, 경첩 영역의 적어도 일부를 포함한다. 또한, Fc는 또한 임의의 대립 또는 종 변이체 또는 임의의 변이체 또는 변형된 형태, 예컨대 FcR에 대한 결합을 변경하는 또는 Fc-매개된 이펙터(effector) 기능을 변경하는 임의의 변이체 또는 변형된 형태를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Fc 키메라(chimera)"는 Fc 영역 또는 이의 유도체에, 직접적으로 또는 간접적으로, 연결된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드가 연결된 키메라 폴리펩티드를 말한다. 전형적으로, Fc 키메라는 다른 폴리펩티드와 면역글로불린의 Fc 영역에 결합한다. 변형된 Fc 폴리펩티드의 유도체는 당업자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 키메라 폴리펩티드는 적어도 두 개의 다른 폴리펩티드 또는 단일 폴리펩티드의 두 개의 비-인접한(non-contiguous) 부분 유래의 부분을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 따라서, 키메라 폴리펩티드는 일반적으로 하나의 폴리펩티드의 전부 또는 일부 유래의 아미노산 잔기의 서열 및 또 다른 폴리펩티드의 전부 또는 일부 유래의 아미노산의 서열을 포함한다. 두 개의 부분이 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있고 평형 조건 및 생리학적 조건, 예컨대 등장성의 pH 7 완충 식염수 하에서 키메라 폴리펩티드의 실질적 부분의 온전함(integrity)을 유지하기에 충분한 힘의 펩티드 결합, 다른 공유 결합 또는 다른 비-공유 상호작용을 통해 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 융합 단백질은 두 개의 별개 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열을 포함하도록 조작된 폴리펩티드이고, 이는 예컨대 두 개의 폴리펩티드들을 암호화하는 두 개의 핵산을 매우 가깝게, 예컨대 벡터의 길이에 따라 서로 인접하게 포함하는 벡터로부터의 융합 단백질 발현에 의하여 함께 연결된다. 따라서, 융합 단백질은 펩티드 결합을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 둘, 또는 둘의 부분, 또는 그 이상의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 키메라 단백질을 말한다. 두 개의 분자는 구축물(construct) 내에서 인접할 수 있고, 링커, 또는 스페이서 폴리펩티드에 의해 구분될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "링커(linker)" 또는 "스페이서(spacer)" 펩티드는 두 개의 폴리펩티드 서열들(또는 이러한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산)을 연결하는 짧은 아미노산 서열을 말한다. "펩티드 링커"는 두 개의 폴리펩티드 서열을 연결시키는 짧은 아미노산 서열을 말한다. 폴리펩티드 링커의 예시는 합성 항체 단편, 예컨대 scFv 단편에서 펩티드 전달 도메인(peptide transduction domain)을 항체에 연결하는 링커 또는 2개의 항체 쇄를 연결하는 링커이다. 링커가 잘 알려져 있고, 임의의 알려진 링커가 상기 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 폴리펩티드 링커의 예시는 가용성을 증가시키도록 도처에 분산된 일부 Glu 또는 Lys 잔기를 갖는, (Gly-Ser)n 아미노산 서열을 포함한다. 다른 예시적 링커가 본원에 기술된다; 임의의 이들 및 다른 알려진 링커가 상기 제공된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "태그(tag)" 또는 "에피토프 태그(epitope tag)"는 폴리펩티드, 예컨대 본원에서 제공된 항체의 N- 또는 C- 말단에 전형적으로 추가되는, 아미노산의 서열을 말한다. 폴리펩티드로 융합되는 태그의 포함(inclusion)은 폴리펩티드 정제 및/또는 검출을 가능하게 할 수 있다. 전형적으로, 태그 또는 태그 폴리펩티드는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기 또는 검출 또는 정제를 위해 제공할 수 있고, 그러나 연결되는 폴리펩티드의 활동을 방해하지 않도록 충분히 짧은 폴리펩티드를 말한다. 태그 폴리펩티드는 일반적으로 충분히 독특하여 항체가 그것에 특이적으로 결합하고 그것이 연결되는 폴리펩티드의 에피토프와 실질적으로 교차-반응하지 않는다.
적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 5개 또는 6개 아미노산 잔기를 갖고 보통 약 8개 내지 50개의 아미노산 잔기, 전형적으로 9개 내지 30개의 잔기를 갖는다. 태그는 다량체(multimer)에서 하나 또는 그 이상의 키메라(chimeric) 폴리펩티드에 연결될 수 있고 다량체의 검출 또는 시료 또는 혼합물로부터 그것의 회복을 허용한다. 이러한 태그가 잘 알려져 있고 쉽게 합성되고 설계될 수 있다. 예시적인 태그 폴리펩티드는 친화도 정체(affinity purification)를 위해 사용되는 것을 포함하고, FLAG 태그, His 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(influenza hemagglutinin) (HA) 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5, (Field 외 (1988) Mol . Cell. Biol. 5:2159-2165); c-myc 태그 및 그것에 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(예를 들어, Evan 외 (1985) Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616 참조); 및 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex virus) 당 단백질 D(glycoprotein D)(gD) 태그 및 그의 항체를 포함한다(Paborsky 외 Protein Engineering 5:547-553). 에피토프-태그된 항체를 검출하기 위해 사용되는 항체는 전형적으로 본원에서 2차 항체로 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대 본원에서 제공된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편)에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되거나 연결될 수 있는 또는 그것과 함께 관련될 수 있는, 그리고 생체 내(in vivo) 및/또는 시험관 내(in vitro)에서 검출될 수 있는, 라벨(label) 또는 검출가능한 모이어티는 검출가능한 마커(예를 들어, 형광(fluorescent) 분자, 화학발광(chemiluminescent) 분자, 생물발광(bioluminescent) 분자, 조영제(contrast agent)(예를 들어, 금속), 방사선핵종(radionuclide), 발색단(chromophore), 검출가능한 펩티드, 또는 검출가능한 생성물의 형성을 촉진하는 효소)이다. 검출 방법은 검출의 공지된 생체 내 및/또는 시험관 내 방법(예를 들어, 육안 검사, 자기공명(MR)분광법, 초음파 신호, X-선, 감마선 분광법(예를 들어, 양전자 방출 단층촬영(PET) 스캐닝, 단일-광자 방출 전산화 단층촬영(single-photon emission computed tomography)(SPECT)), 형광 분광법 또는 흡수(absorption)에 의한 이미징(imaging))을 포함하는, 당업계에 공지된 방법일 수 있다. 간접적 검출은 물리적 현상, 예컨대 검출가능한 모이어티에 직접적 또는 간접적으로 결합하는 원자, 분자 또는 조성물의, 에너지 또는 입자 방출 또는 흡수의 측정(예를 들어, 일차 항체(예를 들어, 본원에서 제공된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편)에 결합하는 표지된 이차 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검출)을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "핵산"은 전형적으로 인산디에스테르 연결에 의해, 함께 연결된, 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는, 적어도 두 개의 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 말한다. 또한 용어에서 "핵산"은 펩티드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트(phosphorothioate) DNA, 및 다른 이러한 유사체 및 유도체 또는 이의 조합이 포함된다. 핵산은 또한 예를 들어, 뉴클레오티드 유사체 또는 인산디에스테르 결합 이외의 "백본(backbone)"결합, 예를 들어, 포스포로트리에스테르(phosphotriester) 결합, 포스포로아미데이트(phosphoramidate) 결합, 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 티오에스테르(thioester) 결합, 또는 펩티드 결합(펩티드 핵산)을 포함하는, DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 용어는 또한 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어지는 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 등가물, 파생물, 변이체 및 유사체로서, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 핵산을 포함한다. 디옥시리보뉴클레오티드는 디옥시아데노신(deoxyadenosine), 디옥시시티딘(deoxycytidine), 디옥시구아노신(deoxyguanosin) 및 디옥시티미딘(deoxythymidine)을 포함한다. RNA에 대해, 우라실(uracil) 염기는 유리딘(uridine)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 분리된 핵산 분자는 핵산 분자 자연의 기원(source)에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. "분리된" 핵산 분자, 예컨대 cDNA 분자는, 재조합 기술에 의해 생산될 때 배양 배지, 또는 다른 세포 물질이 실질적으로 없을 수 있고, 화학적으로 합성될 때 다른 화합물질 또는 화학적 전구체가 실질적으로 없을 수 있다. 본원에서 제공된 예시적인 분리된 핵산 분자는 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열과 관련하여 "작동가능하게 연결된(operably linked)" 영역, 요소 또는 도메인은 서로 기능적으로 관련된 핵산 영역을 의미한다. 예를 들어 리더 펩티드를 암호화하는 핵산은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있고, 그에 따라 핵산은 기능적인 융합 단백질을 발현하도록 전사되고 번역될 수 있으며, 상기 리더 펩티드는 융합 폴리펩티드를 분비하게 한다. 일부 예에서, 첫 번째 폴리펩티드(예를 들어, 리더 펩티드)를 암호화하는 핵산은 두 번째 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결되고 핵산은 단일 mRNA 전사체(transcript)로서 전사되지만, mRNA 전사체의 번역은 발현되는 폴리펩티드의 둘 중 하나로 발현할 수 있다. 예를 들어, 부분적 앰버 억제 세포(partial amber suppressor cell) 내로 도입될 때, 생성된 단일 mRNA 전사체가 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 각각의 융합 단백질을 생산하도록 번역될 수 있거나, 또는 단지 첫 번째 폴리펩티드를 생산하도록 번역될 수 있도록, 앰버 종결 코돈(amber stop codon)이 첫 번째 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 두 번째 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 사이에 위치할 수 있다. 다른 예에서, 프로모터는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 이에 따라 프로모터는 핵산의 전사를 조절하거나 매개한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어, 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드와 관련하여, "합성한(synthetic)"은 재조합 방법 및/또는 화학적 합성 방법에 의해 생산되는 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 자연적으로 발생된 α-아미노산의 잔기들은 자연에서 발견되는 20개 α-아미노산의 잔기로 인간에서 그것의 동족 mRNA 코돈과 대전된 tRNA 분자의 특이적 인식에 의하여 단백질로 통합된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"는 공유적으로 결합된 둘 또는 그 이상의 아미노산을 말한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "펩티드"는 2개 내지 약 또는 40개 아미노산 길이인 폴리펩티드를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산"은 아미노기 및 카르복실기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 두 개 또는 그 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적을 위하여, 제공된 항체에 포함된 아미노산은 20개의 자연적으로 발생한 아미노산(표 3), 비-자연적으로 발생한 아미노산, 및 아미노산 유사체(예를 들어, α-탄소가 측쇄를 갖는 아미노산)를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 나타나는 폴리펩티드의 다양한 아미노산 서열에서 발생하는 아미노산은 그들의 잘 알려진, 3-문자 또는 1-문자 약어에 따라 확인된다(표 3 참조). 다양한 핵산 분자 및 단편에서 발생하는 뉴클레오티드는, 당 분야에서 일상적으로 사용되는 표준-단일 글자 명칭으로 지정된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 그것의 펩티드 연결에서 폴리펩티드의 화학적 소화(가수분해)에 의해 형성되는 아미노산을 말한다. 본원에서 기술되는 아미노산 잔기는 일반적으로 "L" 이성체 형태이다. "D" 이성체 형태의 잔기는 폴리펩티드에 의하여 원하는 기능적 성질이 유지되는 한, 임의의 L-아미노산 잔기로 치환될 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 자유 아미노기를 말한다. COOH는 폴리펩티드의 카르복실 말단에 존재하는 자유 카르복실기를 말한다. J. Biol . Chem., 243: 3557-3559 (1968)에 기술된 표준 폴리펩티드 명명법 및 37 C.F.R.§§ 1.821-1.822서 채택된 것에 따른, 아미노산 잔기에 대한 약어가 표 3에 나타내어진다:
표 3. 대응 표
Figure pct00009
본원에서 나타낸 아미노산 잔기의 모든 서열은 아미노-말단에서 카르복실-말단의 통상적인 방향에서 좌측에서 우측으로의 방향성을 갖는 방식에 의하여 나타낸다. 또한, 어구 "아미노산 잔기" 는 대응표(표 3)에 열거된 아미노산, 변형된, 비-자연적이고 일반적이지 않은 아미노산을 포함하는 것으로 정의된다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 말단에서 대쉬(dash)는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열에, 또는 아미노-말단기 예컨대 NH2 또는 카르복실-말단기, 예컨대 COOH에 펩티드 결합을 나타낸다.
펩티드 또는 단백질에서, 아미노산의 적절한 보존적 치환이 당업자에게 알려져 있고 일반적으로 생성된 분자의 생물학적 활성의 변경 없이 만들어질 수 있다. 당업자는, 일반적으로, 폴리펩티드의 비-본질적 영역의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 것을 인식한다(예를 들어, Watson 외, Molecular Biology of the Gene, 4판, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224 참조).
이러한 치환이 다음 표 4에 기재된 예시적인 치환에 따라 제조될 수 있다:
표 4. 예시적 보존적 아미노산 치환
Figure pct00010
다른 치환이 또한 허용가능하고 경험적으로 또는 다른 알려진 보존적 또는 비-보존적 치환에 따라 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "자연적으로 발생하는 아미노산"은 폴리펩티드에서 발생하는 20개의 L-아미노산을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-자연적 아미노산"은 자연 아미노산과 유사한 구조를 갖으나 자연적 아미노산의 구조 및 반응성을 모방하기 위하여 구조적으로 변형된 유기 화합물을 말한다. 비-자연적으로 발생한 아미노산은 예를 들어, 20개의 자연적으로 발생한 아미노산 이외에 아미노산 또는 아미노산의 유사체를 포함하며, 이에 제한되지 않으나, 아미노산의 D-입체이성질체(D-stereoisomer)를 포함한다. 예시적인 비-자연적 아미노산이 당업자에게 알려져 있고, 이에 제한되지 않으나, 2-아미노아디핀산(2-Aminoadipic acid)(Aad), 3-아미노아디핀산(3-Aminoadipic acid)(bAad), β-알라닌/β-아미노-프로피온산(β-alanine/β-Amino-propionic acid)(Bala), 2-아미노부티르산(2-Aminobutyric acid)(Abu), 4-아미노부티르산/피페리딘산(4-Aminobutyric acid/piperidinic acid)(4Abu), 6-아미노카프로산(6-Aminocaproic acid)(Acp), 2-아미노헵탄산(2-Aminoheptanoic acid)(Ahe), 2- 아미노이소부티르산(2-Aminoisobutyric acid)(Aib), 3-아미노부티르산(3-Aminoisobutyric acid)(Baib), 2-아미노피멜린산(2-Aminopimelic acid)(Apm), 2,4-디아미노부티르산(2,4-Diaminobutyric acid)(Dbu), 데스모신(Desmosine)(Des), 2,2'-디아미노피멜산(2,2'-Diaminopimelic acid)(Dpm), 2,3-디아미노프로피온산(2,3-Diaminopropionic acid)(Dpr), N-에틸글리신(N-Ethylglycine)(EtGly), N-에틸아스파라긴(N-Ethylasparagine)(EtAsn), 하이드록시라이신(Hydroxylysine)(Hyl), 알로-하이드록시라이신(allo-Hydroxylysine)(Ahyl), 3-하이드록시프롤린(3-Hydroxyproline)(3Hyp), 4-하이드록시프롤린(4-Hydroxyproline)(4Hyp), 이소데스모신(Isodesmosine)(Ide), 알로-이소류신(allo-Isoleucine)(Aile), N-메틸글리신(N-Methylglycine), 사르코신(sarcosine)(MeGly), N-메틸이소류신(N-Methylisoleucine)(Melle), 6-N-메틸라이신(6-N-Methyllysine)(MeLys), N-메틸발린(N-Methylvaline)(MeVal), 노르발린(Norvaline)(Nva), 노르류신(Norleucine)(Nle), 및 오르니틴(Ornithine)(Orn)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, DNA 구축물은 자연에서 발견되지 않는 방식으로 조합 및 병치된 DNA 분절을 포함하는 단일 또는 이중 가닥, 선형 또는 환형의 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간 조작의 결과로서 존재하고, 조작된 분자의 클론 및 다른 복사본(copy)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, DNA 분절은 특정 속성을 가진 더 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분절은 더 긴DNA 분자, 예컨대 5'에서 3' 방향으로 해독될 때, 특정 폴리펩티드의 아미노산의 서열을 암호화하는, 플라스미드 또는 플라스미드의 단편의 부분이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 말단으로 해독되는 디옥시리보클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중- 가닥 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 이것은 자연의 기원으로부터 분리되거나, 시험관내에서 합성되거나, 또는 자연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 본원에서 뉴클레오티드("nt"로 약기) 또는 염기쌍("bp"로 약기) 측면에서 주어진다. 용어 뉴클레오티드는 문맥이 허용하는 경우 단일- 및 이중-가닥 분자에 사용된다. 용어가 이중-가닥 분자에 적용되는 경우, 이것은 전체 길이를 나타내기 위해 사용되고, 용어 염기쌍과 동등한 것으로 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 두 개 가닥은 길이에 있어서 약간 다를 수 있고 이의 말단이 엇갈리게 배치될 수 있으며; 그러므로 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내의 모든 뉴클레오티드가 쌍을 이루지 않을 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 이러한 쌍을 이루지 않은 말단은, 일반적으로, 20개 뉴클레오티드 길이를 초과하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 이용한 재조합적 수단에 의한 생산은, 클로닝된 DNA에 의해 암호화되는 단백질의 발현을 위한 분자생물학의 잘 알려진 방법의 이용을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리펩티드가 폴리뉴클레오티드의 전사 및 번역에 의해 생산되는 과정을 말한다. 폴리펩티드의 발현의 수준은 예를 들어, 숙주 세포로부터 생산된 폴리펩티드의 양을 결정하는 방법을 포함하는, 당해 분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법은 이에 제한되는 것은 아니나, ELISA에 의한 세포 용해물에서 폴리펩티드의 정량, 겔 전기영동에 이은 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue staining), 로우리 단백질 어세이(Lowry protein assay) 및 브래드포드 단백질 어세이(Bradford protein assay)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 벡터를 받아들이고, 유지하고, 재생하고 증폭하기 위해 사용되는 세포이다. 숙주 세포는 또한 벡터에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 벡터에 포함되는 핵산은 숙주 세포가 분할할 때 복제되며, 그렇게 함으로써 핵산을 증폭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 하나 또는 그 이상의 이종성 단백질로부터 복제가능한 핵산이고, 벡터가 적절한 숙주 세포로 형질전환될 때 발현될 수 있다. 벡터에 대한 언급은 전형적으로 제한효소 소화(restriction digest) 및 연결(ligation)에 의하여 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 도입될 수 있는, 이러한 벡터를 포함한다. 벡터에 대한 언급은 또한 폴리펩티드, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 이러한 벡터를 포함한다. 벡터는 핵산의 증폭 또는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현/전시를 위해 숙주 세포로 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 도입하는데 사용된다. 벡터는 전형적으로 에피솜(episome)으로 남아있지만, 게놈의 염색체로 유전자 또는 이의 부분의 통합(integration)을 가져오도록 설계될 수 있다. 또한 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체인 벡터가 고려된다. 이러한 비히클(vehicle)의 선택 및 사용이 당업자에게 잘 알려져 있다. 벡터는 또한 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 외인성 유전자를 세포 내로 운반하기 위해(비히클(vehicle)로서 또는 셔틀(shuttle)로서) 외인성 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 조작된 바이러스이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 이러한 DNA 단편의 발현을 실행할 수 있는 조절 서열, 예컨대 프로모터 영역에 사용가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 이러한 부가적 분절은 프로모터 및 종결(terminator) 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 복제 기점, 하나 또는 그 이상의 선별 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 또는 이들 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서 발현 벡터는 적절한 숙주 세포로 도입시 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는, 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대 플라스미드, 파지(phage), 재조합 바이러스 또는 기타 벡터를 말한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있고, 진핵 세포 및/또는 원핵 세포 내에서 복제 가능한 것들 및 에피좀으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "일차 서열"은 폴리펩티드 내 아미노산 잔기의 서열 또는 핵산 분자 내 뉴클레오티드의 서열을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "서열 동일성"은 시험(test) 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교에서 동일하거나 유사한 아미노산 또는 뉴클레오티드 염기의 수를 말한다. 서열 동일성은 유사성 또는 동일성의 영역을 확인할 수 있는 핵산 또는 단백질 서열의 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다. 본원의 목적을 위해, 서열 동일성은 동일한 잔기를 확인하기 위해 정렬에 의해 일반적으로 결정된다. 정렬은 로컬(local) 또는 글로벌(global)일 수 있다. 일치, 불일치 및 갭(gap)이 비교되는 서열 사이에서 확인될 수 있다. 갭은 동일한 또는 유사한 특징이 정렬되도록 정렬된 서열의 잔기 사이에 삽입된 아미노산 또는 뉴클레오티드가 없는 것이다. 일반적으로, 내부 및 종점 갭이 될 수 있다. 갭 페널티(penalty)를 사용할 때, 서열 동일성이 말단 갭에 대한 페널티없이 결정될 수 있다(예를 들어, 말단 갭이 불리하게되지 않는다). 선택적으로, 서열 동일성이 갭을 고려하지 않고 동일한 위치의 수/총 정렬된 서열의 길이 x 100과 같이 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "글로벌 정렬(global alignment)”는 두개의 서열이 처음부터 끝까지, 각 서열 내의 각 문자가 오직 한번씩 나란하게되는 정렬인 정렬이다. 서열 사이의 유사성 또는 동일성 존재 여부에 상관없이, 정렬이 생성된다. 예를 들어, "글로벌 정렬"에 기초한 50% 서열 동일성은 100개의 뉴클레오티드 길이 각각의 두 개의 비교되는 서열의 전 서열의 정렬에서, 잔기의 50%가 동일하다는 것을 의미한다. 정렬된 서열의 길이가 동일하지 않을 경우에도 글로벌 정렬은 또한 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있는 것으로 이해된다. "말단 갭에 대한 페널티 없음"이 선택되지 않는 한, 서열의 말단에서 차이가 서열 동일성을 결정하는데 고려될 수 있다. 일반적으로, 글로벌 정렬은 그 길이 대부분에 대해 상당한 유사성을 공유하는 서열에 사용된다. 글로벌 정렬을 수행하기 위한 예시적 알고리즘은 니들만-원취(Needleman-Wunsch)를 포함한다(Needleman 외 J. Mol . Biol . 48: 443 (1970). 글로벌 정렬을 수행하기 위한 예시적인 프로그램은 공개적으로 사용가능하고 생명공학 정보를 위한 국가센터(National Center for Biotechnology Information)(NCBI) 웹사이트(ncbi.nlm.nih.gov/)에서 글로벌 서열 정렬 툴(Global Sequence Alignment Tool), 및 deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html에서 사용가능한 프로그램을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "로컬 정렬(local alignment)"은 두 개의 서열을 정렬하지만, 단지 유사성 또는 동일성을 공유하는 서열의 이러한 부분을 정렬하는 정렬이다. 따라서, 로컬 정렬은 하나의 서열의 서브-분절(sub-segment)이 다른 서열에 존재하는지를 결정한다. 유사성이 없는 경우, 정렬이 맞춰지지 않는다. 로컬 정렬 알고리즘은 BLAST 또는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘을 포함한다(Adv. Appl . Math. 2: 482 (1981)). 예를 들어, "로컬 정렬"에 기초한 50% 서열 동일성은 임의 길이의 두 개의 비교되는 서열의 전체 서열의 정렬에서, 100개 뉴클레오티드 길이의 유사성 또는 동일성 영역이, 유사성 또는 동일성 영역 내에 동일한 50%의 잔기를 갖는다는 것을 의미한다.
본원의 목적을 위해, 서열 동일성은 각각의 공급자에 의해 설정된 디폴트 갭 페널티(default gap penalty)를 사용하는 표준 정렬 알고리즘 프로그램에 의해 결정될 수 있다. GAP 프로그램에 대한 디폴트 파라미터는 다음을 포함할 수 있다: (1) 1진법 비교 매트릭스(동일성에 대해서는 1의 값을, 비-동일성에 대해서는 0의 값을 포함) 및 Schwartz 및 Dayhoff, 편저, Atlas of Protein Sequence and Structure, 국립 생물의학 연구 재단(National Biomedical Research Foundation), pp. 353-358(1979)에 의해 기술된 것과 같은 Gribskov 등(1986) Nucl . Acids Res. 14:6745(1986)의 편중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대해서는 3.0의 페널티 및 각각의 갭 내 각 기호에 대해서는 추가적인 0.10의 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대한 페널티 없음. 임의의 두개의 핵산 분자 또는 임의의 두개의 폴리펩티드가 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% "동일성", 또는 퍼센트 동일성을 말하는 다른 유사한 변형인 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 가지는지가 로컬 또는 글로벌 정렬에 기초한 알려진 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 알려진 수십개의 링크 및 공개적으로 사용가능한 정렬 데이터베이스 및 프로그램을 제공하는, wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software 참조). 일반적으로, 본원의 목적을 위해 서열 동일성이 글로벌 정렬, 예컨대 NCBI/BLAST 로부터 사용가능한 니들만-원취 글로벌 서열 정렬 툴(Needleman-Wunsch Global Sequence Alignment tool)(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome); LAlign (황 및 밀러 알고리즘(Huang and Miller algorithm)을 시행하는 윌리엄 피어슨(William Pearson)(Adv . Appl .Math.(1991)12:337-357)); 및 deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html에서 사용가능한 자이와퀴 황(Xiaoqui Huang)으로부터 프로그램을 사용하여 결정된다. 전형적으로, 각각의 비교되는 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드의 전장(full-length) 서열이 글로벌 정렬에서 각각의 서열의 전장에 걸쳐 정렬된다. 비교되는 서열이 실질적으로 동일한 길이일 때 로컬 정렬이 또한 사용될 수 있다.
따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동일성"은 시험 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교 또는 정렬을 나타낸다. 하나의 비-제한적 예에서, "적어도 90% 동일한"은 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 90 내지 100% 상대적인 퍼센트 동일성을 말한다. 90% 또는 그 이상의 수준의 동일성은, 예증의 목적으로 가정하면, 100개 길이의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 시험 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 비교되었을 때, 시험 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 내의 오직 10%(즉, 100 중 10)에 지나지 않는 아미노산 또는 뉴클레오티드가 그들의 참조 폴리펩티드와 차이가 있다는 사실과 동일한 것이다. 유사한 비교가 시험 및 참조 폴리뉴클레오티드 사이에 행해질 수 있다. 이러한 차이는 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포하는 점 돌연변이로서 나타날 수 있거나, 또는 최대 허용가능한, 예를 들어 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 길이를 달리하는 하나 또는 그 이상의 위치에서 무리를 이룰 수 있다. 차이는 또한 아미노산 잔기의 결실 또는 절단에 의할 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 비교되는 서열의 길이에 따라, 약 85 내지 90% 이상의 동일성 또는 상동성 수준에서, 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트에 독립적일 수 있고; 이러한 높은 수준의 동일성이, 종종 소프트웨어에 의지하지 않고 쉽게 평가될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 이황화 결합(또한 S-S 결합 또는 이황화 가교(disulfide bridge)라고도 함)은 티올 기의 커플링으로부터 유래되는 단일 공유 결합이다. 단백질에서 이황화 결합이 시스테인 잔기의 티올(thiol)기 사이에서 형성되고, 폴리펩티드 도메인, 예컨대 항체 도메인 사이 상호작용을 안정화한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "커플링된(coupled)" 또는 "컨주게이션된(conjugated)"은 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 부착됨을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 모이어티, 예컨대 진단 또는 치료 모이어티의 부착을 언급할 때, 문구 "항체에 컨주게이션된" 또는 "항체에 연결된" 또는 이의 문법적 변형은, 펩티드 연결에 대해 임의의 알려진 수단에 의한, 예컨대, 예를 들어, 화학적 수단에 의한 후-번역으로 또는 재조합 수단에 의한 융합 단백질의 생산에 의해, 모이어티가 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 부착됨을 의미한다. 컨주게이션(conjugation)은 펩티드 또는 화합물 링커 또는 화학적 교차-결합(cross-linking) 제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는 컨주게이션에 영향을 주는 임의의 다양한 연결 제제를 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아우리스타틴 약물 모이어티"는 아우리스타틴 유도체의 구조를 가진 항체-약물-건주게이트의 하부 구조를 말한다. 아우리스타틴은 미세소관 동역학, GTP 가수분해 및 핵과 세포분열을 방해하는 합성 분자의 분류이다. 예시적 아우리스타틴 실시는 N-말단 및 C-말단으로 연결된 모노메틸 아우리스타틴 약물 모이어티 MMAE 및 MMAF (Senter 외 (2004)　 "Proceedings of the American Association for Cancer Research," 45 권, 요약 번호 623, 및 2004년 3월 28일 발표; 미국 특허 공개공보 2011/0020343)를 포함한다. 예시적 아우리스타틴 유도체 합성 및 구조는 미국 특허 공개공보 제2003-0083263호, 제2005-0238649호 및 제2005-0009751호; 국제 특허 공개공보 WO 04/010957, WO 02/088172 및 미국 특허번호 제6,323,315호; 제6,239,104호; 제6,034,065호; 제5,780,588호; 제5,665,860호; 제5,663,149호; 제5,635,483호; 제5,599,902호; 제5,554,725호; 제5,530,097호; 제5,521,284호; 제5,504,191호; 제5,410,024호; 제5,138,036호; 제5,076,973호; 제4,986,988호; 제4,978,744호; 제4,816,444호; 및 제4,486,414호에 기술되고, 각각은 전체적으로 참조로써 본 명세서에 통합된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "메이탄시노이드(Maytansinoid) 약물 모이어티"는 메이탄신(maytansine) 화합물의 구조를 갖는 항체-약물 컨주게이트(conjugate)의 구조를 의미한다. 메이탄신(Maytansine)은 동 아프리카 관목(east African shrub) Maytenus serrata로부터 처음 분리되었다(미국 특허번호 제3,896,111호). 이어서, 특정 미생물(microbe)이 또한 메이탄시노이드(maytansinoid), 예컨대 메이탄시놀(maytansinol) 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것이 발견되었다(미국 특허번호 제4,151,042호). 합성 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체가 보고되었다. 미국 특허번호 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,234호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호, 및 Kawai 외 (1984) Chem. Pharm. Bull. 3341-3351 참조).
"자유 시스테인 아미노산(free cysteine amino acid)"은 티올 관능기(─SH)를 갖고, 분자내 또는 분자간 이황화 가교로 짝을 짓지 않는 시스테인 아미노산 잔기를 말하다. 그것은 부모 항체(parent antibody)로 조작될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "링커(Linker)", "링커 유닛(Linker Unit)", 또는 "링크(link)"는 약물 모이어티 또는 치료적 모이어티에 항체를 공유적으로 부착하는 원자 쇄(chain)를 포함하는 펩티드 또는 화학적 모이어티를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 및 "ADCC"는 세포-매개된 반응을 말하고, 여기서 Fc 수용체(FcRs)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(Natural Killer)(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)는 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 야기한다. ADCC를 매개하는 일차 세포인, NK 세포는 FcγRⅢ만을 발현함에 비해, 단핵세포는 FcγRI, FcγRⅡ 및 FcγRⅢ을 발현한다. 조혈 세포(hematopoietic cell) 상 FcR 발현이 Ravetch 및 Kinet, (1991) Annu. Rev. Immunol, 9:457-92의 464쪽 표 3에 요약된다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관 내(in vitro) ADCC 어세이가 수행될 수 있다(미국 특허번호 제55,003,621호; 미국 특허번호 제5,821,337호). 이러한 어세이를 위한 유용한 이펙터(effector) 세포는 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell)(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 선택적으로, 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성이 생체 내(in vivo), 예를 들어, 동물 모델에서, 예컨대 Clynes 외 (1998) PNAS (USA), 95:652-656에 개시된 것과 같이 평가될 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료적 활성"은 치료적 폴리펩티드의 생체 내(in vivo) 활성을 말한다. 일반적으로, 치료적 활성은 질환 또는 상태의 치료와 관련된 활성이다. 예를 들어, 항-EGFR 항체의 치료적 활성은 EGFR 인산화, 신호 및 세포 성장 상의 억제 활성, 및 특히 종양 세포 성장 상의 억제 활성을 포함한다. 변형된 폴리펩티드의 치료적 활성은, 비변형 폴리펩티드에 비해 치료적 활성의 1 % 활성, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 또는 그 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 비변형 폴리펩티드의 치료적 활성의 임의의 수준의 백분율일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "평가"는 시료에 존재하는, 단백질, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 활성에 대한 절대적 값을 얻고, 그리고 또한 활성의 수준을 나타내는 인덱스(index), 비율, 백분율, 시각, 또는 다른 값을 얻는 의미에서 양적 및 질정 측정을 포함하기 위한 것이다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애"는 감염, 후천적 조건, 유전적 조건, 및 식별가능한 증상에 의해 특징화 되는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 원인 또는 조건으로부터 기인하는 유기체에서 병적인 상태를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "EGFR-관련된 질환 또는 상태" 또는 "항-EGFR 항체에 의한 치료에 반응하는 상태"는, 비정상적인 EGFR 시그널링(signaling) 또는 EGFR 과발현에 의해 야기되거나 관련되는 임의의 질환 또는 상태를 말한다. 이러한 질환 및 상태는 당해 분야에 공지되어 있고, 이러한 예시가 본원에 기술된다. 예를 들어, EGFR-관련된 질환 또는 상태 또는 항-EGFR 항체에 의한 치료에 반응하는 상태는 암, 예컨대, 대장암(colorectal cancer), 두경부의 편평세포 암(squamous cell cancer of the head and neck) 및 비-소세포 폐암(non-small-cell lung cancer)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 질환 또는 상태를 갖는 대상체의 "치료"는 대상체의 증상이 부분적으로 또는 전적으로 경감되거나, 치료 다음에 정적으로 남아있는 것을 의미한다. 따라서 치료는 예방, 치료 및/또는 치유를 포함한다. 예방(prophylaxis)은 질환의 증상 또는 진행의 악화의 예방 및/또는 잠재적 질환의 예방을 말한다. 치료는 또한 본원에서 제공되는 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 본원에서 제공되는 조성물의 임의의 약제학적 사용을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "예방(prevention)" 또는 예방(prophylaxis), 및 이의 문법적으로 동일한 형태는, 질환 또는 상태의 발병 위함을 감소시키는 방법을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 유효한 제제"는 예를 들어, 마취제, 혈관수축제, 분산제, 작은 분자 약물 및 치료용 단백질을 포함하는, 종래의 치료적 약물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 치료제 또는 생물활성 제제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료적 효과"는 변경되는, 전형적으로 질환 또는 상태의 증상을 증진시키거나 개선하는 또는 질환 또는 상태를 치유하는 대상체의 치료로부터 기인하는 효과를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효한 용량"은 대상체에 투여에 따른 치료적 효과를 낳는데 적어도 충분한 화합물을 포함하는 제제, 화합물, 물질, 또는 조성물의 양을 말한다. 따라서, 질환 또는 장애의 증상을 예방, 치유, 개선, 저지 또는 부분적으로 저지하는데 필요한 양이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료적 효과"는 화합물을 포함하는 제제, 화합물, 물질, 조성물이 투여되는 대상체에서 치료적 효과를 낳는 화합물을 포함하는 제제, 화합물, 물질, 또는 조성물의 능력을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "예방적 유효량" 또는 "예방적 유효한 용량"은 대상체에 투여했을 때 의도된 예방적 효과를 가질 수 있는, 예를 들어, 질환 또는 증상의, 발현, 또는 재발을 예방 또는 지연시키거나, 질환 또는 증상의 발현, 또는 재발의 가능성을 감소시키거나, 또는 바이러스 감염의 발생(incidence)을 감소시킬 수 있는, 화합물을 포함하는 제제, 화합물, 물질, 또는 조성물의 양을 말한다. 완전한 예방적 효과는 일 용량의 투여에 의해 반드시 발생하는 것은 아니며, 일련의 용량의 투여 이후에만 발생할 수 있다. 따라서, 예방적 유효양은 일 또는 그 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 치료에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상의 개선, 예컨대 약제학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여에 의함은, 조성물 또는 치료제의 투여와 관련되거나 기인할 수 있는 증상의 영구적 또는 임시적, 지속적 또는 일시적이든, 어떤 개선을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "전구약물"은 부모 약물에 비해 종양 세포에 세포독성이 적고 효소적으로 활성이거나 더욱 활성인 부모 형태로 변환될 수 있는 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태이다(예를 들어, Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615th Meeting Belfast, 14:375-382; 및 Stella 외, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt 외, (ed.): 247-267, Humana Press, 1985 참조.)
본원에서 사용된 바와 같이, "항암제"는 악성 세포 및 조직을 파괴하거나 독성이 있는 임의의 제제를 말한다. 예를 들어, 항암제는 암세포를 살해하거나 달리 종양 또는 암세포를 억제하거나 손상시키는 제제를 포함한다. 예시적인 항암제는 화학치료제이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항-혈관 제제"또는 "혈관신생 억제제"는 혈관의 발달을 막거나, 방해하는 화합물이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "과증식성 질환"은 수용체의 EGFR 패밀리의 일원을 발현하는 비-암세포의 과도한 성장으로 인한 상태이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유류, 예컨대 인간을 포함하는, 동물을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 환자는 인간 대상체를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 동물은, 예컨대, 인간, 고릴라, 및 원숭이를 포함하는 영장류; 예컨대 마우스(mouse) 및 랫트(rat)와 같은 설치류; 예컨대 닭과 같은, 가금류; 예컨대 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지 및 다른 동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 동물이다. 비-인간 동물은 고려되는 동물로 인간을 제외한다. 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 임의의 기원, 동물, 식물, 원핵생물 및 균류로부터 비롯된다. 대부분의 폴리펩티드는 포유류 기원을 포함하는, 동물 기원이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "조성물"은 임의의 혼합물을 말한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 임의의 이의 조합일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 안정화제는 예컨대 본원의 제형에서 조건(예를 들어, 온도)하에 저장되거나 사용되는 항체 또는 컨주게이트 모두를 보호하기 위해 제형에 첨가되는 화합물을 말한다. 그러므로, 조성물에서 다른 요소로부터 분해로부터 단백질을 예방하는 제제가 포함된다. 이러한 제제의 예는 본원에서 기술되는 아미노산, 아미노산 유도체, 아민, 당, 폴리올, 염 및 버퍼, 계면활성제, 저해제 또는 기질 및 기타 제제이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "조합"은 둘 또는 그 이상 항목 사이 또는 중에 임의의 연합을 말한다. 조합은 둘 또는 그 이상 별개의 물품, 예컨대 두 개의 조성물 또는 두 개의 수집물, 이의 혼합물, 예컨대 둘 또는 그 이상의 물품의 단일 혼합물, 또는 이의 임의의 변형일 수 있다. 조합의 요소는 일반적으로 기능적으로 연관되거나 관련된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 조합 치료는 둘 또는 그 이상 다른 치료제, 예컨대 항-EGFR 항체(또는 이의 항원 결합 단편) 및 하나 또는 그 이상의 치료제의 투여를 말한다. 다른 치료제가 별도로, 순차적으로, 간헐적으로, 제공되고 투여될 수 있고, 또는 단일 조성물로 제공될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 키트는 이에 제한되지 않으나 생물학적 활성 또는 능력의 활성, 투여, 진단 및 평가를 포함하는 목적을 위하여, 선택적으로 다른 요소, 예컨대 조합물 또는 그들의 요소의 사용을 위한 추가적인 시약 및 지침을 포함하는 포장된 조합물이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단위 용량 형태(unit dose form)"는 당 분야에 공지된 바와 같이 개별적으로 포장되고 인간 및 동물 대상체에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단일 투여량 제형(single dosage formulation)"은 직접 투여용 제형을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 다중-용량 제형(multi-dose formulation)은 치료제의 다중 용량을 포함하고 치료제의 여러 단일 투여량을 제공하도록 직접 투여될 수 있는 제형을 말한다. 용량은 분, 시간, 주, 일 또는 월에 걸쳐 투여될 수 있다. 다중용량 제형은 용량 조정, 용량-통합(dose-pooling) 및/또는 용량-분할(dose-splitting)을 허용할 수 있다. 다중-용량 제형은 시간이 흘러도 사용되므로, 이들은 일반적으로 미생물 성장을 예방하는 하나 또는 그 이상의 방부제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제조품"은 만들어 판매되는 산물이다. 본 출원에 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 본원에서 제공되는 포장 물품에 포함되는 임의의 조성물을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유체"는 흐를 수 있는 임의의 조성물을 말한다. 유체는 따라서 반고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림, 및 다른 이러한 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 분리된 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질(예를 들어, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 또는 이의 생물학적으로 활성인 단백질(예를 들어, 분리된 항원-결합 단편)은 단백질이 유래된 세포 또는 조직 유래의 세포성 물질이나 다른 오염성 단백질이 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성되었을 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 제제는 만약 그들이, 당분야의 통상의 기술자가 추가적인 정제가 물리적 및 화학적 성질, 예컨대 물질의 화학적 및 생물학적 활성을 바꾸지 않도록 순도 또는 충분한 순수함을 확인하기 위하여 사용하는, 분석 표준 방법, 예컨대 박막크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 에 의하여 확인되는 바와 같이 쉽게 검출가능한 불순물이 없는 것으로 나타난다면 순수(free) 한 것으로 확인될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 생산하는 화합물의 정제 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은, 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 이러한 경우, 추가의 정제는 화합물의 특정 활성을 증가시킬 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "세포 추출물" 또는 "용해물"은 용해 또는 파괴된 세포로부터 만들어지는 제제 또는 부분(fraction)을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대조군"은 시험 파라미터로 처리되지 않은 것을 제외하고는, 실질적으로 시험 시료와 동일한 시료를 말하고, 또는, 혈장 시료인 경우, 관심 상태에 영향받지 않은 정상 지원자로부터 비롯될 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나의," "한" 및 "상기"는 문맥상 명백하게 달리 지정하지 않는 경우 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 면역 글로불린 도메인"은 하나 또는 복수의 면역글로불린 도메인으로 된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 명쾌하게 대체(alternatives)만을 말하는 의도가 아닌 한 또는 대체가 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로 표현될 수 있다. 또한 약은 정확한 양을 포함한다. 따라서 "약 5개 아미노산"은 "약 5개 아미노산" 및 "5개 아미노산"을 또한 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "선택적" 또는 "선택적으로"는 뒤이어 기술된 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 것과 설명이 상기 사건 또는 상황이 발생하는 예시 및 발생하지 않는 예시를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 선택적 변이체 부분은 변이체이거나 비-변이체인 부분을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 임의의 보호기, 아미노산 및 기타 화합물에 대한 약어는, 달리 표시되지 않는 한, 통상적인 사용, 인식되는 약어, 또는 생화학 명명법의 IUPAC-IUB 위원회에 따른다(Biochem. (1972) 11(9): 1726-1732 참조).
제한하고자 함이 아니라, 명확한 개시를 위해, 상세한 설명은 다음과 같이 하위섹션으로 나누어진다.
B. EGFR 및 항- EGFR 항체
본원에서 제공되는 항-표피 성장 인자 수용체(EGFR) 항체들은 중성 pH 조건/정상 락테이트 수준(예를 들어 피부 진피 내 존재)보다 산성 pH 조건 및/또는 증가된 락테이트 수준 하에 더 큰 결합능을 보인다.
항-EGFR 항체들은 전이성 대장암(mCRC), 두경부 편평 상피암(SCCHN) 및 비-소세포 폐암(NSCLS), 췌장암, 유방암, 위암, 난소암, 직장암, 방광암, 및 다른 고형 종양을 포함하는 다양한 적응증에 대하여 알려져 있고 승인되어 있다. 항-EGFR 항체들은 이에 제한되지 않으나, 얼비툭스®(Ervitux®)(세툭시맙(cetuximab), C225 또는 IMC-C225), Zhu 에 의한 11F8 (WO 2005/090407호), EMD 72000 (마투주맙(matuzumab)), Vectibix™(파니투무맙(panitumumab); ABX-EGF), TheraCIM(니모투주맙(nimotuzumab)), 및 Hu-Max-EGFR(잘루투무맙(zalutumumab))을 포함한다. 그러나, 이들 항체들은 다양한 pH 조건 하에 EGFR에 대하여 실질적으로 유사한 결합 활성을 보여서 이들의 활성은 종양 특이적이지 않고 따라서 피부와 같이 비-표적 위치에서 원하지 않은 활성의 결과를 초래한다. 따라서, 대상체에 투여될 때, 이들 치료 항체들은 대상체에 대하여 부작용을 유발한다 (Eng C. (2009) Nat. Rev. Clin. Oncol., 6:207-218). 이것은 그들의 사용을 제한한다.
예를 들어, 항-EGFR 항체들은 피부 독소 및 소화 장애(매스꺼움, 구토, 설사를 포함)를 포함하는 뚜렷하고 특징적인 부작용들과 관련되어 있으며, 이들은 종종 투여 중지 및 치료의 중단을 하게 한다. 예를 들어, EGFR은 전-케라티노사이트 및 피부의 기저세포에서 높게 발현된다. 항-EGFR 항체에 의한 피부 전구체에서의 EGFR 신호전달의 차단은 피부 전구체 성장 억제, 세포자멸사 및 염증을 유도한다. 이들은 피부 독성, 예컨대 발진 및 기타 피부 병변을 야기할 수 있다. 특히, 존재하는 항-EGFR 항체(예를들어, 에툭시맙, 파니투무맙)는 3-4 등급인 25 %를 포함하여 피부 관련된 독성에 기인하는 최대 80 %로 높은 독성을 보인다 (Cunningham 외 (2004) NEJM, 351:337). 특히, 피부 병변은 농포로 발전할 수 있는 가려운 홍반성 모낭 구진을 가진 발진을 포함할 수 있다.
치료적으로, 항-EGFR 항체들의 활성은 산성 pH 및 증진된 락테이트 수준, 예를 들어 10-15 mM 락테이트를 보이는 종양 환경에 대해 주로 표적된다. 대조적으로, 많은 부작용이 국소화되어 있는 진피는 중성 pH 및 정상 락테이트 수준을 보인다. 본원에서는 표적으로 하는 질병 조직, 예컨대 종양에서 증가된 활성을 나타내고 비-질병 조직 또는 기관, 특히 부작용과 관련된 조직 부위 (예컨대, 피부 또는 진피의 기저층)에서 감소된 활성을 나타내는 항체의 제공에 의하여 부작용이 감소될 수 있음을 확인하였다. 고형 종양을 특징화하는 조건, 예컨대 낮은 pH와 저산소증과 같은 차이는 종양 질병 미세환경에서 더 활성인 항체의 제공에 영향을 줄 수 있다. 그러므로, 본원에서 제공된 변형된 항-EGFR 항체들은 종양 미세환경에서 조건부 활성이고 정상 조직과 비교하여 종양 미세환경에 존재하는 조건 하에서 변형된 활성 또는 증가된 활성을 나타낸다. 예를 들어, 본원에서 제공된 항체들은 중성 pH 또는 낮은 락테이트보다 낮은 pH 및/또는 높은 락테이트에서 더 활성이다. 이러한 변형된 활성의 결과에 따라, 대상체들은 더 낮고/낮거나 감소된 부작용을 갖는 항체로 치료된다.
특히, 서열번호 2 또는 7로 기재되는 가변 중쇄을 참고로 하여 104 위치에 상응하는 위치에서 음성 전하 아미노산 (예를 들어, Asp 또는 Glu)로 가변 중쇄에서 아미노산의 치환을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체는 중성 pH (예를 들어 7.4)보다 종양의 산성 pH 환경과 같은 낮은 또는 산성 pH, 예를 들어 pH 6.0 내지 6.5에서 증가된 활성, 예를 들어 결합능을 보인다. 그러나, Glu(E)에 대해 아미노산 치환을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체는 중성 pH (예를 들어, pH 7.4)에서 아미노산 치환 Asp(D)를 포함하는 항체보다 실질적으로 약하거나 낮은 결합능을 나타내는 것으로 본원에서 보여졌다. 이 차이는 분자의 산성에 영향을 미치는 추가의 CH2 그룹의 존재에 기인될 수 있다. 중성 pH에서 감소된 결합 때문에, 서열번호 2 또는 7로 기재되는 가변 중쇄를 참고로 하여 104 위치에 상응하는 위치에서 음성 전하 아미노산 Glu(E)로 가변 중쇄에서 아미노산 치환(예를 들어 Y104E)을 포함하는 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체(예를 들어, Y104E)는 증가된 산성 pH-결합 선택성을 보이고, 따라서 활성이 요구되는 종양 표적 선택성을 증진시켰다. 이러한 변형된 항-EGFR 항체는 또한 증가된 활성, 예를 들어 증가된 락테이트 농도, 예컨대 15 내지 20 mM 락테이트에서 결합능을 보일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체는 증가된 활성 예컨대, 감소된 pH(예를 들어 산성 pH 6.0 내지 6.5 포함) 및 증가된 락테이트(예를 들어, 15 mM 내지 20 mM 락테이트) 수준 모두에서 결합활성으로 결합한다. 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체는 변경된 활성을 제공하여 그들이 투여될 때 감소 또는 더 적은 부작용을 수여한다.
1.EGFR
표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR; 또한 수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-1, ErbB-1, HER1로 알려짐)(Uniprot Accession No. P00533; 서열번호 43)는 170 kDa I형 당단백질이다. EGFR은 수용체 티로신 키나아제 ErbB 패밀리의 일원이고, 이는 HER2/c-neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3) 및 Her4(ErbB-4)를 포함한다. EGFR은 세포표면에 존재하며 세포외 리간드-결합 도메인, 세포내 티로신 키나아제 도메인 및 막관통 친지질 분절을 포함하는 세가지 도메인을 함유한다. 종양세포에 존재 하는 것 외에도, 표피 성장 인자 수용체들은 상피 기원세포 및 조혈모세포를 제외한 정상 세포의 표면 어디에나 산발적으로 분포되어 있다.
EGFR은 세포의 성장, 분화, 생존 및 운동성에 중요한 신호전달 캐스케이드(cascade)에 관여하는 티로신 키나아제 성장 인자 수용체이다. EGFR 활성은 내생적 리간드, 예컨대 표피 성장 인자(EGF) 뿐만 아니라 TGF-α, 앰피레귤린(amphiregulin), 헤파린-결합 EGF(HB-EGF) 및 베타셀루린(betacellulin)을 포함하는 다른 내생적 EGF-유사 리간드의 결합에 의하여 자극되거나 활성화된다. 리간드 결합을 하면, 리간드-EGFR 복합체는 이량체화 및 세포로 내부화를 겪게된다. EGFR은 다른 단량체 EGFR 분자와 함께 호모이량체화가 될 수 있거나, 다른 HER 수용체, 예컨대 HER2, ErbB-3 또는 ErbB-4와 함께 헤테로 이량체화가 될 수 있다. EGFR 이량체화는 EGFR의 세포질(cytoplasmic) 꼬리 내 티로신 잔기의 자가인산화를 이끌고 본질적으로 세포 내 단백질-티로신 키나아제 활성을 활성화시킨다. EGFR 인산화티로신 잔기는 미토젠-활성화 단백질 키나아제(MAPK), Akt/포스파티딜이노시톨-3-OH 키나아제(PI3K) 및 c-Jun N-말단 키나아제(JNK)를 포함하는 다양한 신호 전달 경로의 개시를 유발하는 하류의 이펙터들 예컨대 어댑터 분자 및 효소에 대하여 도킹부위로 작용하고, 그렇게 함으로써 DNA 합성, 세포분화, 세포 이동, 세포 생존 및 세포 부착에 관여하는 다양한 미토겐 메커니즘을 조절한다.
EGFR은 세포 생존 및 사멸, 혈관 신생, 세포 이동능 및 전이를 조절하는데 중요하다 (Herbst 외 (2001) Expert Opin . Biol . Ther . 1(4):719-732). EGFR 활성화는 뚜렷하게 혈관성 표피 성장 인자 분비의 상향 조절, 종양 혈관 신생 자극과 관계가 있다(Petit 외 (1997) Am J Pathol 151:1523-1530). 비정상적 EGFR 신호 및 EGFR 과발현은 다양한 암에서 관찰되고 침투 또는 전이 질환의 낮은 진단 및 높은 위험과 상관관계가 있다(Herbst 외 (2001) Expert Opin . Biol . Ther . 1(4):719-732). 예를 들어, EGFR의 디레귤레이션은 신경교종 및 결장, 두경부, 췌장, 비-소세포 폐, 유방, 신장, 난소 및 방광 암종을 포함하는 다양한 고형 인간 종양에서 관찰된다(Herbst 및 Hong (2002) Seminars in Oncology 29(5) Suppl. 14: 18-30). 보통 EGFR은 항암 치료제의 매력적인 표적이다.
2. 항- EGFR 항체 및 부작용
비정상적인 EGFR 신호전달을 표적으로 하고 억제하는 치료 제제는 항-EGFR 항체를 포함한다. 항-EGFR 항체는 EGFR에 결합하여, EGF의 세포 밖 리간드 결합 도메인에 대한 리간드의 예컨대 EGF의 결합을 억제하고 수용체 이량화, 자가 인산화를 억제하며 신호 전달 이벤트 초래를 억제한다. 그러므로, 항-EGFR 항체는 EGFR-매개된 세포 신호전달 및 세포 성장을 차단함으로써 효과적인 치료제가 될 수 있다. 항-EGFR 항체는 당업계에 잘 알려져 있고 많은 수가 암의 치료를 위해 임상 개발 또는 승인된다. Erbitux® 의 상표 하에 ImClone에 의해 판매되는 세툭시맙은 인간화된 형태를 포함하여 미국특허 제4,943,533호 및 제7,060,808호에 기술되어 있다. Vectibix 상표 하에 Abgenix에 의해 판매되는 파니투무맙(Panitumumab)은 미국 특허번호 제6,235,883호에서 기술된다. Genmab에 의해 개발된 잘루투무맙 (Zalutumumab) (HuMax-EGFr)은 국제공개공보 WO 02/100348 및 WO 2004/056847에 기술되어 있다. 세툭시맙, 파니투무맙 및 잘루투무맙은 EGFR의 동일 에피토프에 결합한다. 이에 제한되지 않으나, 추가 단일클론 항-EGFR 항체는 니모투주맙(Nimotuzumab) (TheraCIM hR3; 미국특허번호 제5,891,996호 및 미국특허번호 제6,506,883호); ICR62 (암연구소(The Institute of Cancer Research); 국제공개공보 WO 95/20045); mAb806 (루두비히 암연구소(Ludwig Institute of Cancer Research); 국제공개공보 WO 02/092771); 및 마투주맙(Matuzumab) (EMD72000, Merck-Serono; 국제공개공보 WO 02/66058, 국제공개공보 WO 92/15683)을 포함한다.
그러나, 항-EGFR 항체는 암세포와 정상세포의 표면에 EGF 수용체들을 구별할 수 없으며, EGFR 신호의 일반적 억제는 부작용을 초래한다. 예를 들면 EGFR은 상피 조직의 도처에 분포하고 있고 많은 EGFR 억제제를 사용하는 치료는 피부 독성을 보인다.(Herbst 및 Hong (2002) Seminars in Oncology 29(5) Suppl. 14: 18-30). 인간 피부에서, EGFR은 기저 각질 세포에서 발현되고 상피 성장 자극, 분화 억제 및 상처 회복의 가속화를 할 수 있다(Lacouture 및 Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12, 1-5; Nanney 외(1990) J. Invest. Dermatol 94(6):742-748; Lacouture, M.E. (2006) Nat Rev Cancer 6:803-812). EGFR 기능의 억제는 케라티노사이트의 성장 및 이동을 손상시킬 수 있으며, 염증성 케모카인의 발현, 그 결과로 인한 발진을 초래할 수 있다(Lacouture, M.E. (2006) Nat Rev Cancer 6:803-812). EGFR 억제제를 이용한 치료에 있어서 각질 세포의 증가된 세포자멸사는 EGFR 억제제로 처리된 대상체에서의 발진의 시작과도 상호 관련이 있다(Lacouture, M.E. (2006) Nat Rev Cancer 6:803-812). 케라티노사이트들은 pH 7.0 내지 7.2 를 갖는 피부의 더 깊은 층인 기저층(stratum basal)에 위치하고 있다. 피부 내의 혈관은 상피에 영양분을 제공하고 폐기물을 제거하며, 이에 따라 상피, 특히 전신성 순환 항-EGFR 치료에 가장 민감한 기저층을 생성한다.
가장 일반적인 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙과 관련된 부작용은 피부과적 반응이며, 이는 환자의 약 45-100%에서 확인된다(Le 및 Perez-Soler (2009) Target Oncol 4:107-119). 일반적인 피부과적 반응은 여드름양 발진(acneiform rash), 구진농포성 발진(papulopustular rash), 비정상적 털 성장, 피부 건조증 및 소양증 및 연화를 동반한 손발톱 주위의 염증을 포함한다(Eng (2009) Nat Rev Clin Oncol 6:207-218; Monti 외 (2007) Int J Biol Markers 22:S53-S61; Saif 및 Kim (2007) Expert Opin Drug Saf 6:175-182). 추가적인 피부과적 반응은 모세혈관 확장증, 과색소침착, 발진을 동반하지 않는 소양증, 홍반 및 구강 아프타(oral aphthae)를 포함한다(Eng (2009) Nat Rev Clin Oncol 6:207-218). 세툭시맙은 일부 환자들에서 심각한 아나필락시스 반응 보고와 함께, 약 5-15%의 환자에서 면역 반응을 이끌어 낸다(Chung 외 (2008) N Engl J Med 358:1109-1117). 이러한 과민감성 반응은 IgG 항체의 생산을 유도하는 세툭시맙에서의 갈락토오스-알파-1,3-갈락토오스 올리고사카라이드와 연관이 있다(Chung 외 (2008) N Engl J Med 358:1109-1117). 추가적인 부작용은 호흡곤란, 기침, 천명, 폐렴, 저산소증, 호흡 부전/부전증, 폐 색전, 흉수 및 비-특이적 호흡 장애를 포함하는 폐 독성을 포함한다(Hoag 외 (2009) J Experimental & Clinical Cancer Research 28:113). 다른 부작용은 발열, 오한, 무력증/불안, 점막 표면 문제, 오심, 위장 문제, 복통, 두통 및 저마그네슘혈증을 포함한다 (Eng (2009) Nat Rev Clin Oncol 6:207-218; Fakih 및 Vincent, (2010) Curr. Oncol . 17(S1):S18-S30; 국제 출원 공개번호 WO2011059762호).
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 비-종양 세포 표적, 예컨대 기저 케라티노사이트 및 다른 기저 세포들과 비교하여 종양 세포에 대해 결합하기 위한 선택성을 나타낸다. 그러므로 변형된 항-EGFR 항체는 현재 이용되고 있는 항-EGFR 항체들과 비교하여 환자에 투여되었을 때, EGFR 신호전달을 차단하는 그들의 능력을 유지함과 동시에 피부 독성을 포함하는 전신성 부작용의 제거, 최소화 또는 감소를 포함하는 부작용을 감소시키는 결과를 유도할 수 있다. 그들은 또한 기존의 치료법과 비교하여 증가된 효율을 달성하는 투여를 가능하게 한다.
3. 세툭시맙
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체들에는 항- EGFR 항체 세툭시맙, 이의 항원-결합 단편 또는 그들의 변이체(예를 들어, 인간화된 형태의 세툭시맙, 예컨대 Hu225 또는 H255)들과 비교하여 변형된 것(예를 들어, 가변 중쇄에서 104 위치에 상응하는 위치에서 Glu(E)로 아미노산 치환을 포함함)인, 변형된 항-EGFR 항체가 포함된다. 세툭시맙(또한 C225 또는 IMC-C225로도 알려짐)은 인간 표피 성장 인자 수용체에 결합하는 마우스/인간 키메릭 IgG1 단일클론 항체이다. 세툭시맙은 M225로부터 유래되었으며, 이는 면역원으로써 인간 A431 표피암세포로부터 EGFR 을 이용하여 확인된다(Gill 외 (1984) J Biol Chem 259:7755-7760; Sato 외, (1983) Mol Biol Med 1:511-529; Masui 외, (1984) Cancer Res 44:1002-1007; Kawamoto 외. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:1337-1341). M225는 EGF 수용체에 대한 표피 성장 인자의 결합을 억제하고, 생체 내(in vivo) EGF-자극된 티로신 키나아제 활성의 길항제이다(Gill 외 (1984) J Biol Chem 259:7755-7760).
a. 구조
세툭시맙은 전장 마우스/인간 키메릭 IgG1 항체이다. 전장 항체는 네개의 폴리펩티드 체인, 두 개의 동일한 중쇄(H)(각각 보통 약 440개의 아미노산을 함유함) 및 두 개의 동일한 경쇄(L)(각각 약 220개의 아미노산을 함유함)를 함유한다. 경쇄는 두 개의 구별된, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 형태로 존재한다. 각 쇄는 면역글로불린(Ig) 도메인으로 구성된 도메인들의 시리즈로 구성되어 있다. Ig 도메인은 Ig 접힘으로 불리는 구조에 의하여 특징화되며, 이는 루프에 의해서 연결된 역-평형 베타 가닥을 각각 함유하는 두개의 베타-병풍 시트를 함유한다. Ig 접힘 내의 두개의 베타 시트는 소수성 상호작용 및 항체 쇄 내 보존된 이황화 결합에 의하여 붙어있다. 복수의 항체 쇄 내의 Ig 도메인들은 가변(V) 및 불변(C) 영역 도메인으로 구성되어 있다.
가변 도메인은 상보성 결정 부위(CDRs) 또는 초가변 (HV) 영역이라고 불리는 세개의 부분을 통하여 항원 특이성을 항체에 부여한다. CDR 영역은 항체내에서 정확히 정의되고 보편적으로 번호를 부여받는다(예를 들어, Kabat, E.A. 외 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 및 Chothia, C. 외 (1987) J. Mol . Biol. 196:901-917 196:901-917; AbM (Martin 외 (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272; Martin 외 (1991) Methods Enzymol 203:121-153; Pederson 외 (1992) Immunomethods 1:126 참조). 이와 함께, 세개의 중쇄 CDRs 및 세개의 경쇄 CDRs 들은 항체의 항원 결합 부위(항체 결합 부위)를 구성하고, 이는 물리적으로 관련이 있는 항원과 상호작용을 하고 항체에 특이성을 제공한다.
불변 영역은 보체 및 이펙터 세포(effector cell)의 활성화를 촉진한다. CDR 영역과 같이, 불변영역들은 항체 내에서 정확히 정의되고 EU 인덱스 및 카바트 넘버링 스킴을 사용하여 보편적으로 번호를 부여받는다(예컨대 Kabat, E.A. 외 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조).
경쇄는 C 영역(CL ) 및 V 영역(VL) 에 상응하는 두 개의 도메인을 가지고 있다. 중쇄는 V 영역(VH) 및 C 영역 내의 세개 또는 네개의 도메인(CH1, CH2, CH3 및 CH4)인 4개의 영역 및, 일부 케이스에서 힌지 영역(hinge region)을 갖는다. 각각의 중쇄는 이황화 결합에 의하여 경쇄와 연결되어 있고, 이들 두개의 중쇄는 서로 이황화 결합으로 연결되어 있다. 중쇄의 연결은 중쇄의 유연성 있는 영역에 의하여 매개되며, 이는 힌지 영역으로 알려져 있다.
세툭시맙(또한 C225로 불림)은 마우스 단일클론 항체 225(M225)로부터 가변 영역 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 인간-마우스 키메라 항체이다. 항체 M225는 미국특허번호 제4,494,533호에 기술되어 있고, 접근 번호 HB11935로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)로 기탁된 하이브리도마 세포주로부터 생산될 수 있다. 키메라 형태는 인간 IgG1 불변 영역을 가진 M225의 비-인간 불변 영역으로 대체되도록 개발되었다 (예를 들어 Prewett 외. (1996) J. Immunother . Emphasis Tumor Immunol., 19:419-27 참조). C225는 상업적으로 Erbitux® (세툭시맙)으로 알려졌고 미국에서 ImClone 및 Bristol-Myers에 의해 다른 곳에서 Merck KgaA에 의해 판매되고 있다. Erbitux®은 두경부의 편평상피암(SCCHN) 치료를 위해 방사선 치료와 조합되어 또는 사전 백금 기반 치료를 받은 환자에서 단일제제로 사용을 위해 2006년 3월에 FDA에 의해 승인되었다. Erbitux®은 DNA 토포이소머라제 차단제인 이리노데칸(Camptosar®)과 조합으로 전이성 결장암의 치료를 위해 또한 권고된다.
세툭시맙은 각각 449 개 아미노산의 2 개의 동일한 중쇄(예를 들어 서열번호 12로 기재), 각각 214 개 아미노산의 2개의 동일한 경쇄(예를 들어 서열번호 13으로 기재)를 포함하여 4개 폴리펩티드 쇄로 구성되는 것으로 알려져 있다 (참고 IMGT Acc. No. 7906). M225 가변 영역에 상응하는 가변 영역은 서열번호 12의 아미노산 잔기 1-119(가변 중쇄, 서열번호 2로 기재) 및 서열번호 13의 아미노산 잔기 1-107(가변 경쇄, 서열번호 4로 기재)로 기재된다. C225는 CH1 (서열번호 12의 아미노산 잔기 120-217), 힌지 영역 (서열번호 12의 아미노산 잔기 218-232), CH2 (서열번호 12의 아미노산 잔기 233-342) 및 CH3 (서열번호 12의 아미노산 잔기 343-449)를 포함하여 인간 불변 도메인 CH1-CH2-힌지-CH3 를 함유하는 서열번호 12의 아미노산 잔기 120-449(서열번호로 23으로 기재)로 기재된 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함한다. C225는 또한 서열번호 13의 아미노산 잔기 108-213(서열번호 34로 기재됨)으로 기재된 인간 Cκ 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 가변은 예를 들어 생성된 서열에서 시퀀싱 또는 클로닝 인공산물 또는 다른 변이 때문에 세툭시맙의 보고되고 생성된 서열에서 존재하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 세툭시맙의 가변 서열 버전은 문헌들에서 기술되어 있다 (예를 들어 미국 특허번호 제7,060,808호; 미국 공개 특허 제2011-0117110호 및 미국 공개 특허 제2013-0266579호; 국제공개공보 WO2004085474; GenBank Accession No. CAH61633; DrugBank Acc. No. DB00002; IMGT Acc. No. 7906 참조). 표 5는 중쇄 및/또는 경쇄 의 비-CDR 영역에서 단지 일부 아미노산 잔기에서 다른 예시 참고 세툭시맙 서열을 기재한다(또한 도 1 A 및 도 1B 참조).
표 5로 기재된 예시적 참고 서열에 관하여, 중쇄는 마우스 가변 영역(VH, 서열번호 1, 5, 6 또는 12의 아미노산 잔기 1-119, 서열번호 2 또는 7로 기재) 로 구성되고 경쇄는 마우스 가변 영역(VL, 서열번호 3, 8, 10 또는 13의 아미노산 잔기 1-107, 서열번호 4, 9 또는 11로 기재)로 구성된다. 세툭시맙의 CDRs은 VH CDR 1 (카바트 정의에 따르면 서열번호 2 또는 7의 아미노산 잔기 31-35, 서열번호 35로 기재); VH CDR 2 (서열번호 2 또는 7의 아미노산 잔기 50-65, 서열번호 36으로 기재); VH CDR 3 (서열번호 2 또는 7의 아미노산 잔기 98-108, 서열번호 37로 기재); VL CDR1 (서열번호 4, 9 또는 11의 아미노산 잔기 24-34, 서열번호 38로 기재); VL CDR2 (서열번호 4, 9 또는 11의 아미노산 잔기 50-56, 서열번호 39로 기재); 및 VL CDR3 (서열번호 4, 9 또는 11의 아미노산 잔기아미노산 잔기 89-97, 서열번호 40으로 기재)을 포함한다, 예를 들어 미국 공개특허 제20110117110호 참조.
세툭시맙의 인간화 버전은 쥐 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 프레임 영역 (framework regions)에서 아미노산 치환에 의해 인간화되어 제조된다(표 5 참조). 예를 들어, 미국 특허번호 제7,060,808호는 서열번호 14로 기재된 아미노산 서열을 가지는 가변 중쇄 및 서열번호 15로 기재된 아미노산 서열을 가지는 가변 경쇄 포함하는 H225를 기술한다. Hu 225로 지정된 또 다른 인간화 변이는 서열번호 16으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 가변 중쇄 및 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열을 가지는 가변 경쇄를 포함하는 항체로 미국 공개 특허 제2011/0117110호에 기술된다. 인간화 변이의 CDRs는 M225 및 C225와 상기 기술된 다른 리포트된 세툭시맙 항체와 동일하다. 이러한 인간화 항체들은 세툭시맙과 비교하여 감소된 면역원성을 보인다. 본 명세서의 다른 곳에서 기술한 바와 같이, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 변이체에 관하여, 세툭시맙의 인간화 변이체는 전장 항체일 수 있거나 Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG, 및 scFv 단편을 포함하는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 전장 항체로써, 인간화된 항체는 임의의 이소형 또는 글래스(예를 들어 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY), 임의의 서브클래스 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브-서브 클래스 (예를 들어 IgG2a 및 IgG2b)를 포함할 수 있다.
Figure pct00011
또한 변경된 특성 또는 활성을 보이는 다른 세툭시맙 변이체들은 기술되어 있고 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 미국특허번호 제7,657,380호, 제7,930,107호, 제7,060,808호, 제7,723,484호, 미국특허공개번호 제2011014822호, 제2005142133호, 제2011117110호, 국제특허 공개번호 WO2012003995호, WO2010080463호, WO2012020059호, WO2008152537호, 및 Lippow 외 (2007) Nat Biotechnol. 25(10):1171-1176 참조).
본원에서 기술되는 변형은 당분야에서 알려진 것을 포함하는 임의의 세툭시맙, 이의 항원-결합 단편 또는 그들의 변이체가 될 수 있다.
b. 기능
세툭시맙은 EGFR에 대해 특이적으로 결합한다. EGFR의 세포외 도메인(sEGFR) 에 결합된 세툭시맙 Fab의 크리스탈 구조는 결정되어 있다 (Li 외, (2005) Cancer Cell 7:301-311). 세툭시맙은 표피 성장 인자 수용체의 도메인 Ⅲ (서열번호 43의 아미노산 310-514) 에 천연 리간드 표피 성장 인자와 부분적으로 겹치는 에피토프를 가지고 결합된다. 세툭시맙의 잔기 L27Gln, L50Tyr, L94Trp,(예를 들어 서열번호 4로 기재된 가변 영역을 참고하여) 및 H52Trp, H58Asp, H101Tyr, H102Tyr, H103Asp 및 H104Tyr(예를 들어 서열번호 2로 기재된 가변 영역을 참고하여)는 sEGFR의 도메인 Ⅲ 와의 접촉을 구성한다. 세툭시맙의 경쇄는 세툭시맙의 VL CDR1 잔기 L27Gln 과 sEGFR의 N473 잔기와의 결합과 함께 EGFR의 C-말단 도메인에 결합한다. VH CDR 3 잔기 H102Tyr 은 sEGFR의 Q384 및 Q408의 글루타민 측쇄에 대한 수소 결합을 만드는 도메인 Ⅲ의 큰 β 시트 표면 상의 소수성 포켓으로 돌출된다. VH CDR 2 및 VH CDR 3 은 소수성 포켓에 놓여져 있고 H52Trp 및 sEGFR 의 S418 및 H104Tyr 및 sEGFR의 S468 사이의 측쇄와 측쇄의 수소결합에 의하여, H54Gly 및 H103Asp 카르보닐 산소 및 sEGFR S440 및 R353 사이의 측쇄와 주쇄(main chain)의 상호작용에 의하여, 그리고 sEGFR의 S418 및 Q384 와 H56Asn 사이의 간접적인 수소 결합에 의하여 부착되어 있다. EGF 와 sEGFR의 결합 차단 외에도, 세툭시맙의 가변 중쇄는 도메인 I을 입체구조적으로 차단하고 이에 의하여 도메인 Ⅱ가 이량체화에 필수적인 형태를 선정하는 것을 막는다.
세툭시맙은 일반 및 종양 세포 상의 EGFR의 세포외 도메인에 결합하고, 이는 리간드 결합과 연속적인 활성화를 막는다(Li 외, (2005) Cancer Cell 7:301-311; Blick 외, (2007) Drugs 67(17):2585-2607). 세툭시맙은 표피 성장 인자 및 형질전환 성장 인자 알파(TGF-알파)의 결합을 경쟁적으로 억제하고 이는 세포 성장 및 전이가 퍼지는 것을 막는다. 즉 세툭시맙의 결합은 티로신-수용체 키나아제의 인산화 및 활성화를 차단하고, 그 결과 세포의 성장 억제, 세포자멸사 유도, 매트릭스 메탈로프로테아제 분비의 감소 및 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor) 생산의 감소를 나타낸다. 세툭시맙은 또한 혈관신생억제를 통해 항종양 효과를 유도할 수 있다. 세툭시맙은 높은 전이성인 인간 TCC 253JB-V 세포에서 VEGF, IL-8 및 bFGF 의 발현을 용량의존적으로 억제하고 미세혈관 밀도를 감소시킨다(Perrotte 외 (1999), Clin . Cancer Res., 5:257-264). 세툭시맙은 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 종양 세포에서 VEGF의 발현을 하향 조절할 수 있다(Petit 외. (1997), Am. J. Pathol ., 151:1523-1530; Prewett 외. (1998), Clin. Cancer Res.4:2957-2966). 세툭시맙은 또한 보체활성과 항체-의존적 세포성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC) 및 수용체 내재화에도 관여한다.
C. 산성 pH 선택성을 가진 변형된 활성 항- EGFR 항체
서열번호 2 또는 7을 참고로 하여 항-EGFR 항체의 중쇄의 가변 도메인의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민 산 (Glu, E)로 치환된 아미노산 치환(104E로 지정된)을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 비변형된 항-EGFR 항체에서 104 위치에 상응하는 위치는 서열번호 2 또는 7로 기재된 가변 중쇄로 가변 중쇄의 정렬에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어 도 2 참조). 또한 서열번호 2 또는 7을 참고로 하여 항-EGFR 항체의 중쇄의 가변 도메인의 104 위치(104E로 지정된)에 상응하는 위치에서 보존적 아미노산 아스파르트산 (D)로 상응하는 치환을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
104E에 상응하는 아미노산 치환을 포함하는 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 EGFR 항원 (예를 들어, 인간 EGFR) 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합한다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 결합 활성은 중성 pH 또는 약 pH 7.4 및 약 1 mM 의 락테이트의 농도의 하나 또는 둘다를 포함하는 조건 하와 대비하여 pH 6.0 내지 6.5 및 15 mM 내지 20 mM의 락테이트 농도의 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하보다 더 크다. 예를 들어, 약 pH 7.4 및/ 또는 약 1 mM 락테이트 하나 또는 둘을 포함하는 조건하에 결합 활성에 대한 pH 6.0 내지 6.5 및 15 mM 내지 20 mM 락테이트의 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하에 결합 활성의 비는 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0 또는 그 이상 클 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 단백질의 생리적 농도의 존재에서 변경된 결합 활성을 보일 수 있다 (예를 들어 25 % 혈청). 그러므로, 본원에서 제공되는 항체는 종양 선택적 EGFR 결합 활성을 보일 수 있고, 결합활성은 비-종양 미세 환경에서 존재하는 조건과 대비하여 종양 미세 환경에서 존재하는 조건 하에 더 크다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 항체로 조립시에 EGFR 항원 (예를 들어 인간 EGFR), 또는 이의 가용성 단편에 결합하기 충분한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 또는 이의 부분을 최소로 포함하며, 적어도 가변 중쇄는 104E로 치환됨으로써 변형된다. 생성된 변형된 항-EGFR 항체는 전장 IgG(예를 들어, IgG1) 항체일 수 있고, 또는 이의 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, 단쇄 Fv (scFv), Fv, dsFv, 2가 항체절편(diabody), Fd 및 Fd' 단편일 수 있다. 또한, 생성된 변형된 항-EGFR 항체는 IgG1 이외의 도메인을 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 비변형된 항-EGFR 항체와 비교하여 가변 중쇄에서 104E 아미노산만의 치환, 또는 보존적 아미노산 아스파르트 산 (D)에 상응하는 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 다른 예에서, 중쇄 또는 경쇄의 하나 또는 둘 모두에서 추가적인 아미노산 치환 또는 변형은 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체에 포함될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 변형을 포함하지 않는 항-EGFR 항체와 대비하여 적어도 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상 변형된 위치를 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 모든 예에서, 변형된 항-EGFR 항체는 비변형된 항-EGFR 항체와 대비하여 104E 아미노산 치환 또는 상응하는 보존적 아미노산 치환을 포함하고, 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도의 하나 또는 둘 모두를 포함하는 조건 하와 대비하여 6.0 내지 6.5의 산성 pH 및/또는 15 mM 내지 20 mM의 락테이트의 농도 하나 또는 둘 모두를 포함하는 조건 하에 더 높은 결합 활성능을 보이는 것으로 이해된다
비변형된 항-EGFR 항체는 세툭시맙 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 그들의 변이체일 수 있다. 아미노산 치환 104E를 포함하여 본원에서 아미노산 치환이 제조될 수 있는 예시적 비변형 항-EGFR 항체는 이에 제한되지 않지만, 서열번호 1, 2, 5, 6, 7, 12, 14 또는 16 중 어느 하나로 기재되는 중쇄, 또는 서열번호 1, 2, 5, 6, 7, 12, 14 또는 16 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 포함하는 항원-결합 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 항-EGFR 세툭시맙 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 비변형 항-EGFR 항체는 서열번호 2로 기재된 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 4로 기재된 가변 경쇄, 서열번호 7로 기재된 VH 및 서열번호 9로 기재된 VL, 서열번호 7로 기재된 VH 및 서열번호 11로 기재된 VL, 서열번호 14로 기재된 VH 및 서열번호 15로 기재된 VL, 또는 서열번호 16로 기재된 VH 및 서열번호 17로 기재된 VL, 또는 가변 중쇄 또는 경쇄 서열번호들의 하나 또는 둘에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄를 포함하는 이의 변이체를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 비변형 항-EGFR 항체는 전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수도 있다. 예를 들어, 비변형된 항-EGFR 항체는 임의의 상기 VH 또는 VL 영역 및 서열번호 1로 기재된 중쇄 및 서열번호 3으로 기재된 경쇄, 서열번호 5로 기재된 중쇄 및 서열번호 3으로 기재된 경쇄, 서열번호 12로 기재된 중쇄 및 서열번호 13으로 기재된 경쇄, 서열번호 6으로 기재된 중쇄 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 또는 서열번호 6으로 기재된 중쇄 및 서열번호 10으로 기재된 경쇄를 포함하는 중쇄 및 경쇄 불변영역을 포함할 수 있고, 중쇄 또는 경쇄 서열번호의 하나 또는 둘에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 전장 항체 또는 이의 변이체의 항원-결합 단편일 수 있다. 이러한 임의의 예시에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 104 위치에 상응하는 위치에서 티로신(Y)이 E로 치환되는 Y104E 아미노산 치환을 가진 가변 중쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 104 위치에 상응하는 위치에서 변형된(예를 들어 치환된) 아미노산 잔기는 서열번호 2 또는 7로 기재된 아미노산에 대해 보존적 또는 반보전적인 아미노산 잔기이다.
본원에서 목적을 위해, 아미노산 치환 또는 치환을 포함하는 변형을 위한 위치 및 아미노산에 대한 참고는 서열번호 2 또는 7로 기재된 야생형 세툭시맙 항체의 가변 중쇄, 및 서열번호 4로 기재된 야생형 세툭시맙 항체 쇄의 가변 경쇄로 참고된다. 항-EGFR 서열번호 2 또는 7로 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 4로 기재된 가변 경쇄로 참고된 항-EGFR 중쇄 또는 경쇄의 정렬에 의해 비변형된 항-EGFR 항체의 가변 중쇄 또는 가변 경쇄에서 아미노산 잔기에 상응하는 동일함에 의해 다른 항-EGFR 항체 내 가변 중쇄(104E 포함) 또는 가변 경쇄에서 임의의 변형을 제조하는 것이 당업자의 통상의 수준 내이다. 예를 들어, 도 2 A 및 도 2 B는 서열번호 2 및 7로 예시적 항-EGFR 항체의 정렬을 기술하며 도 2C 및 도 2D는 서열번호 4, 9 또는 11로 예시적 항-EGFR 항체의 경쇄의 정렬을 기술한다. 변형의 목적을 위해(예를 들어 아미노산 치환), 치환된 위치에서 상응하는 아미노산 잔기는 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, 서열번호 2 또는 7 또는 서열번호 4로 기재된 잔기에 대해 동일할 필요는 없다. 전형적으로, 서열번호 2 또는 7 또는 서열번호 4에서 잔기로 정렬에 의해 동일한 상응하는 아미노산 잔기는 서열번호 2 또는 7 또는 서열번호 4에 대해 동일한 아미노산 잔기이거나, 그것에 보존적 또는 반-보존적 아미노산 잔기이다 (예를 들어, 도 2 참조). 예시로서, 104 위치에 상응하는 위치에서 잔기는 서열번호 2 및 7에서 Tyr(Y)이다. 그러므로, 글루타민산(E)에 의해 치환된 즉, 서열번호 2 또는 7에서 Y104E에 상응하는 비변형된 항-EGFR 항체에서 상응하는 잔기는 트립토판(Trp, W104E) 또는 페닐알라닌(Phe, F104E)와 같은 보존적 아미노산 잔기일 수 있다 (표 4 참조).
본원에서 제공되는 예시적 치환은 치환이 항-EGFR 항체 중쇄 또는 경쇄의 비치환된 형태에서 존재하는 아미노산과 다른 한 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역과 같은 항-EGFR 항체 중쇄 또는 경쇄에서 상응하는 잔기에서 제조될 수 있는 것으로 또한 이해된다. 본원의 다른 부분에서 설명과 이 상세한 설명에 기초하여, 기술된 변이의 어느 하나 이상을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체를 제조하기 위한 것과 본원에서 제공되는 바와 같이 특성 또는 활성을 위한 각각의 테스트는 당업자의 기술 수준 내이다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 비변형된 항-EGFR 항체의 상응하는 형태, 예컨대 서열번호 2 또는 7로 기재된 아미노산의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 야생형 세툭시맙의 상응하는 형태와 대비하여 산성 pH 6.0 내지 6.5를 포함하는 조건 하에 EGFR 항원(예를 들어, 인간 EGFR 또는 이의 가용성 형태)에 대한 크거나 증가된 결합 활성 및/또는 중성 pH 7.4를 포함하는 조건 하에 약한 결합을 보일 수 있다. 일반적으로, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 비변형 항-EGFR 항체의 상응하는 형태와 대비하여, 예컨대 서열번호 2 또는 7로 기재된 아미노산의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 야생형 세툭시맙의 상응하는 형태와 대비하여 중성 pH7.4에서 EGFR 항원 또는 이의 가용성 단편 (예를 들어, 인간 EGFR 또는 이의 가용성 형태)에 대해 약한 결합 활성을 보인다. 특정 실시예에서, 본원에서 제공되는 항체는 동일 조건 하에 비변형된 항-EGFR 항체의 결합 활성과 대비하여 pH 6.0 내지 6.5에서 유사하거나 증가된 결합 활성을 보유하거나 보이지만, 비변형된 항-EGFR 항체의 상응하는 형태보다 중성 pH의 약 pH 7.4에서 감소된 결합 활성, 예컨대 pH 7.4에서 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이하 결합활성을 보인다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 비변형된 항-EGFR 항체의 상응하는 형태와 대비하여 중성 pH 7.0 내지 7.4에서 적어도 또는 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배 또는 그 이상 약한 결합 활성보인다.
EGFR 항원(예를 들어 인간 EGFR 또는 이의 가용화 형태)에 대한 결합 활성은 EGFR(예를 들어 인간 EGFR)에 대한 항체, 또는 항원 결합 단편의 결합을 평가하기 위한 당업자에게 알려진 임의의 방법에 기초하여 결정되거나 평가될 수 있다. 이러한 검정법의 예시는 섹션 E.에 기술되어 있다. 이러한 검정법은 이에 제한되지 않으나 면역 검정법 (예를 들어 효소 면역 측정법 ;ELISA), 친화도 기반 바이오센서 검정법(예를 들어 BIA코어 기술), 또는 in vivo 결합 검정을 포함한다. 이러한 검정법에서, 결합 활성은 탐지 가능한 신호 (예를 들어, 결합의 분광 측정 또는 형광 측정), 반수 최대 결합의 농도(EC50) 또는 결합의 반응 속도 측정(예를 들어, 해리 상수 Kd, 결합 상수 Ka, 오프 속도 또는 결합의 다른 속도 파라미터)로 측정되거나 나타내어질 수 있다. 당업자는 특정 검정법 사용에 따라서 높은 결합 활성이 더 높은 값에 의해 일부 예시로 나타내어 질 수 있고 약한 결합 활성이 더 낮은 값에 의해 나타내어질 수 있음(예를 들어 결합 활성이 Ka로 나타내어 질 때 또는 결합 신호의 측정에 의해 나타내어질 때)을 이해한다. 다른 예에서, 더 높은 결합 활성은 낮은 값으로 나타내어질 수 있고 낮은 활성은 높은 값에서 측정될 수 있다 (예를 들어, 결합 활성이 KD 또는 오프-속도를 나타낼 때).
본원에서 목적을 위해, 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0 또는 그 이상의 결합 활성 비율은 변형된 항-EGFR 항체가 pH 7.4 및 1 mM 락테이트를 포함하는 조건보다 pH 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM 락테이트 하나 또는 모두를 포함하는 조건 하에 EGFR 항원(예를 들어 인간 EGFR 또는 이의 가용성 단편)에 대한 더 높은 결합 활성 배수 차이(예를 들어 더 높거나 더 단단한 결합 활성)를 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 적어도 2.0 의 결합 활성의 비율은 적어도 2배 더 단단한 결합이 있음을 의미하며, 적어도 3.0 의 결합 활성의 비율은 적어도 3배 더 단단한 결합이 있음을 의미하며, 적어도 4.0 의 결합 활성의 비율은 적어도 4배 더 단단한 결합이 있음을 의미하며, 적어도 5.0 의 결합 활성의 비율은 적어도 5배 더 단단한 결합이 있음을 의미하며, 적어도 10.0 의 결합 활성의 비율은 적어도 10배 더 단단한 결합이 있음을 의미한다.
다른 실시예에서, 적어도 2.0의 결합 활성의 비율은 항체가 적어도 2배 더 느린 오프-속도를 보이는 것을 의미하며, 적어도 3.0의 결합 활성의 비율은 항체가 적어도 3배 더 느린 오프-속도를 보이는 것을 의미하며, 적어도 4.0의 결합 활성의 비율은 항체가 적어도 4배 더 느린 오프-속도를 보이는 것을 의미하며, 적어도 5.0의 결합 활성의 비율은 항체가 적어도 5배 더 느린 오프-속도를 보이는 것을 의미하며, 적어도 10.0의 결합 활성의 비율은 항체가 적어도 10배 더 느린 오프-속도를 보이는 것을 의미한다. 이러한 예에서, 결합 활성이 EC50, KD로 측정되었을 때, 더 높은 결합 활성 (예를 들어, 더 단단한 결합 친화도)는 낮은 농도에 의해 나타내어지며, 예컨대 pH7.4, 1 mM 락테이트에 대한 pH 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM 락테이트에서 결합 활성의 비율은 pH7.4, 1 mM 락테이트에서 EC50, KD의 역에 대한 pH 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM 락테이트에서 EC50 또는 KD의 역의 몫으로 나타내어진다. 예로서, pH 6.0 내지 6.5 및 15 mM 내지 20 mM 락테이트에서 4 mM EC50 및 pH7.4, 1 mM 락테이트에서 16 mM EC50을 가지도록 측정된 항체의 결합 활성의 비율은 4.0 (
Figure pct00012
)이다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 또는 항원-결합 단편은 산성 pH 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM 락테이트를 포함하는 조건 하에 1 x10- 8 M, 5 x 10-9 M, 1 x10- 9 M, 5 x 10-10 M, 1 x 10-10 M, 5 x 10-11 M, 1 x 10-11 M 또는 그 이하인 EGFR(예를 들어 인간 EGFR) 또는 이의 가용성 단편에 결합을 위한 해리 상수(KD)를 일반적으로 가진다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 산성 pH 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM 락테이트를 포함하는 조건 하에 1 x108 M-1, 5 x 109 M-1, 1 x109 M-1, 5 x 1010 M-1, 1 x 1010 M-1, 5 x 1011 M-1, 1 x 1011 M-1 또는 그 이상인 EGFR(예를 들어 인간 EGFR) 또는 이의 가용성 단편에 결합을 위한 결합 상수(KA)를 일반적으로 가진다. 다른 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 산성 pH 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM 락테이트를 포함하는 조건 하에 10 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 또는 그 이하인 EGFR(예를 들어 인간 EGFR) 또는 이의 가용성 단편에 결합을 위한 EC50을 일반적으로 가진다. 특정 실시예에서, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체는 pH 6.0 내지 6.5, 16.6 mM 락테이트에서 EGFR에 대한 결합을 비슷하게 유지하면서 pH7.4, 1 mM 락테이트에서 EGFR 항원(예를 들어, 인간 EGFR 또는 가용성 단편)에 대한 결합 친화도(예를 들어, Kd 또는 EC50)에서 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 그 이상 감소를 보이며, 따라서 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0 또는 그 이상의 pH　7.4, 1 mM 락테이트와 대비하여 pH 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM 락테이트에서 더 큰 결합 활성 비율(예를 들어 더 높은 친화력 또는 더 단단한 친화 결합)을 보인다.
그러므로, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 변경된 결합 활성의 장점에 의해 항체는 비-종양 미세 환경(예를 들어, 피부의 기저층)에서보다 EGFR 항원에 대한 증가된 결합 활성을 보인다. 변형된 pH 미세환경은 가장 일반적으로 종양 미세환경에서 발견되는 미세환경이다(Fogh Andersen 외. (1995) Clin . Chem., 41:1522-1525; Bhujwalla 외. (2002) NMR Biomed ., 15:114-119; Helmlinger 외. (1997) Nature Med., 3:177; Gerweck 및 Seetharaman (1996), Cancer Res. 56(6):1194-1198 참조). 예를 들어, 많은 종양에서 'warburg effect'는 5.6 내지 6.8 pH 범위를 갖는 미세환경을 창조한다. 또한 증가된 락테이트 수준은 이에 제한되는 것은 아니나 두경부, 전이성 대장암, 자궁경부암 및 편평세포암종을 포함하는 다양한 종양과 관련되어 발견된다(Walenta 외. (1997) American Journal of Pathology 150(2): 409-415; Schwickert 외. (1995) Cancer Research 55: 4757-4759; Walenta 외. (2000) Cancer Research 60: 916-921; Guo 외. (2004) J Nucl Med 45: 1334-1339; Mathupala 외. (2007) J Bioenerg Biomembr 39: 73-77; Holroyde 외. (1979) Cancer Research 39: 4900-4904; Schurr and (2007) Neuroscience 147: 613-619; Quennet 외. (2006) Radiotherapy and Oncology 81: 130-135 참조). 많은 종양에서, 'warburg effect'는 10 내지 20 mM 사이의 락테이트 농도를 갖는 미세환경을 창조한다. 종양 미세환경과 반대로, 항-EGFR 항체들의 투여에 의하여 초래되는 많은 부작용들이 위치하는 피부는 중성 pH(예를 들어, pH 7.4) 및 정상 락테이트 수준(예를 들어 0.5 내지 2 mM)을 나타낸다.
일반적으로, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR은 생리학적 수준의 단백질 존재 하에서 활성의 비율을 보인다. 생체 내(in vivo) 또는 생리학적 환경 내에서, 간질 단백질 농도(예컨대 알부민)는 대략 혈장의 20-25% 이다. 혈청은 약 60-80g/L 단백질을 함유하고, 다양한 조직들은 12mg/mL 내지 40mg/mL 간질 단백질을 함유하는 것으로 알려져 있다(Aukland 및 Reed (1993) Physiological Reviews, 73:1-78 참조). 그러므로, 본원에서 제공되는 변형된 항 EGFR 항체들은, 10 mg/mL 내지 50 mg/mL 단백질, 예컨대 적어도 12 mg/mL 내지 40 mg/mL 이상 단백질(예컨대 적어도 12 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 30 mg/mL, 35 mg/mL 또는 40 mg/mL 이상의 단백질)의 존재 내에서 이러한 결합 활성 비율을 나타낼 수 있고, 이것은 예를 들면, 혈청, 예컨대 인간 혈청 또는 혈청 알부민으로써, 예컨대 인간 혈청 알부민, 또는 항체 또는 수용체와 상호작용하지 않는 또는 이 외에 직접적으로 항체-수용체 상호작용을 바꾸지 않는 다른 단백질 내에서 제공될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 20% 내지 50% 혈청(vol/vol), 예컨대 20% 내지 50% 인간 혈청, 예컨대 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% (vol/vol) 이상의 혈청내에서 결합활성의 비율을 보여줄 수 있다.
그러므로, 중성 pH 7.4 및 1 mM 락테이트를 포함하는 조건과 대비하여 산성 pH 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM 락테이트의 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하에 결합 활성의 큰 비율 덕택으로, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 비-질환 또는 비-종양 미세 환경, 예컨대 피부 또는 피부의 기저층에서 확인되는 것들보다 종양 미세 환경에서 EGFR 항원(예를 들어 인간 EGFR)에 대한 더 큰 결합 활성을 보인다. 그러므로, 본원에서 제공된 변형된 항-EGFR 항체는 종양에 대한 선택적 활성과 비-종양 미세 환경에서 세포에 대한 감소된 결합 활성을 보인다. 그들이 조건부 결합 활성에 의해 성취되는 이러한 선택성은 비-종양 세포, 예컨대 기저 케라티노사이트에 원하지 않는 활성을 최소화한다. 그러므로, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 대상체에 투여되었을 때 감소되거나 낮은 부작용을 부여한다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 비-질환 환경과 대비하여 종양 미세 환경에서 EGFR에 대한 증가된 억제 활성을 보일 수 있다. 이러한 억제 활성은 이에 한정되지 않으나, 리간드-유도된 인산화, 이량체화 및/또는 세포 성장의 억제를 포함한다. 이러한 활성의 결과로서, 본원에서 제공되는 항체는 종양, 예컨대 고형 종양을 가지는 대상체에 대해 in vivo로 투여될 때 종양 성장 억제를 보인다. 종양 성장 억제는 투여되는 항체의 부재에서 종양의 성장과 대비하여 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 억제될 수 있다. 종양 모델에서 평가될 때, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 기능적 활성은 항-EGFR 치료 예컨대 비-질환 조직에서 활성이 감소되어 제공되는 세툭시맙으로 치료의 존재보다 적거나 유사하거나 클 수 있다. 감소된 활성은 예를 들어, 피부 발진의 감소된 발생 또는 심각도에 의해 입증된다. 예를 들어, 제공되는 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 감소된 진피 독성을 보인다. 진피 독성, 예컨대 피부 발진은 당업자에 알려지고 본원에서 기술된 표준 검정법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 예컨대 영장류 모델에서 평가에서 평가되어 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상 감소된 발진을 보인다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 당업자에게 알려진 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 표적 단백질에서 임의의 하나 이상의 아미노산의 변이를 가져오기 위한 당업계에 알려진 임의의 방법이 이용될 수 있다. 방법은 핵산 분자를 코딩하는 일반적인 부위 특이적 또는 임의 변이, 또는 고체 상 폴리펩티드 합성 방법을 포함한다. 예를 들어, 항-EGFR 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 변이, 예컨대, 핵산을 코딩하는 임의 변이, 에러-프론(Error-prone) PCR, 부위특이적 변이, 오버랩 PCR, 유전자 셔플링 또는 다른 재조합 방법에 대한 대상이 될 수 있다. 항-EGFR 항체를 코딩하는 핵산은 또한 이종(heterologously)으로 발현되기 위해 숙주 세포로 도입될 수 있다. 그러므로, 또한 임의의 변형된 항-EGFR 항체를 코딩하는 핵산분자가 본원에서 제공된다.
본원에서 제공되는 바와 같이, 변형된 항-EGFR 항체의 비제한적인 예는 하기 기술된다.
1. Y104E를 포함하는 변형된 항- EGFR 항체
서열번호 2 또는 7로 기재된 위치를 참고로 하여 비변형된 항-EGFR 항체의 104(104E) 위치에 글루타민 산(E) 아미노산 치환을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체가 제공된다. 하기 본원의 다른 부분에서 설명과 같은 추가의 변형(예를 들어 아미노산 치환)은 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 1 mM 락테이트 농도를 포함하는 조건 하와 대비하여, 산성 pH 6.0 내지 6.5 및/또는 락테이트 농도 15 mM 내지 20 mM을 포함하는 조건 하에 더 큰 결합 활성을 보이는 한, 104E 아미노산 치환에 추가하여 항-EGFR 항체 및 EGFR 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄로 포함될 수 있다. 추가 변형은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 가변 중쇄 및/또는 경쇄에서 있을 수 있다. 추가 변형은 또한 항체의 가변 영역에서 변형 및 항체의 불변 영역, 예를 들어, CH1, 힌지, CH2, CH3 또는 CL 영역에서 변형을 포함하여 다른 변형을 또한 포함하는 항-EGFR 항체로 또한 제조될 수 있다.
또한, 본원에서 하기 기술된 중쇄 및/또는 경쇄에서 임의의 하나 이상의 추가 변형을 포함하는 104E 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM 락테이트 농도를 포함하는 조건 하와 대비하여 산성 pH 6.0 내지 6.5 및/또는 락테이트 농도 15 mM 내지 20 mM을 포함하는 조건 하에 더 큰 결합 활성을 보이는 한 인간화에 의해 추가로 변형될 수 있다고 이해된다.
아미노산 치환 104E를 포함하는 아미노산 치환(들)은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 가지는 가변 중쇄 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 가변 경쇄; 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열을 가지는 가변 중쇄 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 가변 경쇄; 또는 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열을 가지는 가변 중쇄 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 가변 경쇄를 포함하는 비변형된 항-EGFR 항체에서, 또는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열번호 2 또는 7로 기재된 가변 중쇄의 변이체 및/또는 서열번호 4, 9 또는 11로 기재된 경쇄의 변이체를 포함하는 비변형 항-EGFR에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 서열번호 14로 기재된 아미노산 서열을 가지는 가변 중쇄 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 가변 경쇄, 또는 서열번호 16으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 가변 중쇄 및 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 가변 경쇄를 포함하는 인간화된 세툭시맙 항체, 또는 서열번호 14 또는 16으로 기재된 가변 중쇄 및/또는 서열번호 15 또는 17로 기재된 가변 경쇄에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열 변이체에서 제조될 수 있다.
예를 들어, 서열번호 74 또는 75 중 어느 하나로 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 104E 아미노산 치환, 또는 서열번호 74 또는 75 중 어느 하나에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하고 적어도 104E 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열; 및 서열번호 4, 9, 11, 15 또는 17 중 어느 하나로 기재된 경쇄 가변 도메인, 또는 서열번호 4, 9, 11, 15 또는 17에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체가 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 항체로 결합될 때 항원 결합을 위한 가변 중쇄 또는 가변 경쇄의 충분한 부분을 포함하는 전장 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있고, 여기서 가변 중쇄는 적어도 104E 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 변형된 항-EGFR 항체의 예시는 아래 제공되는 바와 같다.
a. 추가적인 변형
104E 아미노산 치환에 더하여 변형을 포함할 수 있는 104E 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 제공된다. 추가적인 변형은 단일 아미노산 변형, 예컨대 단일 아미노산 치환 또는 대체, 삽입 또는 결실, 또는 다중 아미노산 치환, 예컨대 다중 아미노산 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 예시적인 변형은 아미노산 치환이고, 이는 단일 또는 복수의 아미노산 치환을 포함한다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체들은 변형을 포함하지 않는 비변형 항-EGFR 항체와 비교하여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 변형된 위치를 포함한다. 아미노산 치환은 보존적 치환, 예컨대 표 4에 기재된 것과 같은 것, 또는 비-보존적 치환, 예컨대 본원에서 기술된 것 중 어느 것일 수 있다.
ⅰ. 추가적인 중쇄 변형
비변형된 항-EGFR 항체(예를 들어, 세툭시맙), 이의 항원 결합 단편 또는 이의 변이체의 가변 중쇄의 104 위치(즉, 104E)에서 Glu(E)의 아미노산 치환, 및 선택적으로 추가적인 변형(들) 예컨대 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체를 본원에서 제공한다. 생성된 변형(들)은 서열번호 2 또는 7로 기재된 가변 중쇄, 또는 그에 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 가지는 이의 변이체에서 일 수 있다. 예를 들어, 생성된 변형은 서열번호 14 또는 16으로 기재된 가변 중쇄를 포함하는 비변형 항-EGFR 항체에서 또는 그에 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 가지는 이의 변이체 또는 이의 부분에서 일 수 있다. 또한 변형은 상기 어느 하나의 가변 중쇄, 예컨대 서열번호 1, 5, 6 또는 12로 기재된 어느 하나를 포함하는 전장 중쇄, 또는 그에 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 가지는 이의 변이체 또는 이의 부분에서 일 수 있다. 변형은 상보성 결정영역 (CDR) 또는 프레임 영역에서 일 수 있다.
예를 들어, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 32에 기재된 임의의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특히, 104E 아미노산 치환 및 서열번호 2 또는 7로 기재된 아미노산 위치를 참고로 하여 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 93, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 또는 112 위치에 상응하는 어느 위치에서 하나 이상의 다른 아미노산 치환(들) 또는 대체(들)을 가진 가변 중쇄, 또는 이의 부분을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 예를 들어, 아미노산 위치는 서열번호 2로 기재된 아미노산 위치를 참고로 하여 23 위치 트레오닌(T) (T23), V24, S25, G26, F27, S28, L29, T30, N31, Y32, G33, V34, H35, W36, V50, I51, W52, S53, G54, G55, N56, T57, D58, Y59, N60, T61, P62, F63, T64, S65, R66, L67, S68, I69, N70, K71, D72, N73, S74, K75, S76, Q77, Y93, Y94, R97, A98, L99, T100, Y101, Y102, D103, E105, F106, A107, Y108, W109, G110, Q111 또는 G112의 치환에 상응하는 위치에서 치환될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 위치 중 어느 것에 대응하는 위치에서 변형된(예를 들어 치환된) 아미노산 잔기는 서열번호 2 또는 7에 기재된 아미노산에 대한 보존적 잔기 또는 반-보존적 아미노산 잔기이다(예를 들어, 도 2A 또는 2B 참조).
위치에서 아미노산 치환은 생성된 치환된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 EGFR 항원(예를 들어, 인간 EGFR)에 특이적 결합을 보이는 한 위치에서 임의의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 일반적으로, 추가의 변형을 포함하는 생성된 항-EGFR, 또는 이의 항원 결합 단편은 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하와 대비하여 산성 pH의 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하에 더 큰 결합 활성을 보이며, 이러한 결합 활성의 비율은 1.0 보다 큰, 예컨대 상기 본원에서 기술된 바와 같이 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0. 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 20.0, 40.0, 30.0, 40.0 또는 그 이상이다.
104E 아미노산 치환 및 서열번호 2 또는 7로 기재된 위치를 참고로 하여 표 6에 기재된 치환에 상응하는 하나 이상의 다른 아미노산 치환(들)을 가진 가변 중쇄, 또는 이의 부분을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
Figure pct00013
Figure pct00014
예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2 또는 7 중 어느 것으로 기재되는 위치를 참고로 하여, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 50, 53, 54, 58, 59, 63, 64, 67, 68, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 97, 100, 101, 107, 111 위치 또는 상응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 다른 아미노산 치환(들)을 갖는 가변 중쇄, 또는 이의 부분을 포함한다. 예를 들면, 추가적인 치환(들)은 서열번호 2 또는 7에 기재되는 아미노산 위치를 참고로 하여 위치 24의 발린(V) (V24), S25, F27, S28, L29, T30, N31, Y32, V50, S53, G54, D58, Y59, F63, T64, L67, S68, D72, N73, S74, K75, S76, Q77, R97, T100, Y101, A107, Q111에 상응하는 위치에서 일 수 있다. 예를 들면, 본원에서 제공되는 예시적인 변형된 항-EGFR 항체는 V24I, V24L, V24E, S25C, S25G, S25I, S25M, S25V, S25Q, S25T, S25L, S25H, S25R, S25A, S25D, F27R, S28C, L29H, T30F, N31H, N31I, N31T, N31V, Y32T, V50L, S53G, G54D, G54S, G54R, G54C, G54P, D58M, Y59E, F63R, F63C, F63G, F63M, F63V, F63P, F63S, T64N, T64V, L67G, S68F, S68Q, D72K, D72L, D72P, D72M, D72W, N73Q, S74H, S74R, S74D, S74G, S74Y, K75H, K75G, K75W, K75P, S76I, S76V, Q77R, Q77E, R97H, T100I, T100P, Y101W, Y105V, A107N, Q111I, Q111P 및/또는 Q111V 중쇄 치환에 상응하는 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환(들)을 포함한다.
특정 예에서, 본원에서 제공되는 예시적인 추가 변형은 서열번호 2 또는 7로 기재되는 아미노산 위치를 참고로 하여 24, 25, 27, 30, 53, 72, 97 및 111 위치 에 상응하는 위치에서의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 도메인의 변형을 포함한다. 예를 들면, 추가적인 아미노산 위치는 서열번호 2 또는 7로 기재된 아미노산 위치를 참고로 하여 위치 24의 발린(V) (V24), S25, F27, T30, S53, D72, R97 또는 Q111에 상응하는 위치에서 치환될 수 있다. 예를 들어, 104E 치환에 더하여, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 내의 추가 아미노산 치환은 이에 제한되는 것은 아니나 다음을 갖는 중쇄 잔기의 치환을 포함한다; 24에 상응하는 위치에서의 글루탐산 (E); 25에 상응하는 위치에서의 C; 위치 25에 상응하는 위치에서의 V; 27에 상응하는 위치에서의 R; 위치 30에 상응하는 위치에서의 F; 위치 53에 상응하는 위치에서의 G; 위치 72에 상응하는 위치에서의 L; 97에 상응하는 위치에서의 H; 또는 111에 상응하는 위치에서의 P. 예를 들면, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 서열번호 2 또는 7로 기재된 아미노산 서열을 참고로 하여 V24E, S25C, S25V, F27R, T30F, S53G, D72L, R97H 또는 Q111P 의 중쇄 치환에 상응하는 하나이상의 추가적인 아미노산 치환(들), 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 변형된 항-EGFR 항체는 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하와 대비하여 산성 pH의 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하에 더 큰 결합 활성을 보이며, 이러한 결합 활성의 비율은 1.0 보다 큰, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0. 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0 또는 그 이상이다.
상기 본원에서 제공된 가변 중쇄 내의 임의의 아미노산 치환에 대하여, 치환은 다른 항-EGFR 항체와 서열번호 2 또는 7로 기재된 서열을 함께 배열하는 것에 의한 상응하는 위치(도 2 A 또는 2 B 참조)에서 만들어 질 수 있는 것으로 이해되고, 그렇게 되도록 하는 상응하는 위치는 정렬된 위치이다. 그러므로, 항체는 중쇄 불변 영역 또는 이의 부분을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 세툭시맙 중쇄 또는 이의 부분, 예컨대 서열번호 1, 2, 5, 6, 7, 12, 14 또는 16 중 어느 것 또는 이들과 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 변이체 내의 상응하는 위치에서 아미노산 치환(들)이 될 수 있다.
비변형 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 도메인 내 비 제한적인 아미노산 치환은 표 7에 기재된다. 표는 서열번호에 의해 지정된 예시적인 중쇄 아미노산 서열을 기재한다. 변형된 중쇄 및 경쇄를 포함하는 이러한 변형된 항-EGFR 항체의 예시는 하기 제공된다. 변형된 항-EGFR, 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄에서 또한 추가적인 변형, 예를 들어, 하기 서브섹션(C.1.a.ⅱ)에 기술된 바, 또는 본원에 기술된 항체의 인간화 결과로, 예를 들어 C.2 서브섹션에 기술된 바와 같이 포함될 수 있다.
Figure pct00015
ⅱ. 추가적인 경쇄 변형
비변형 항-EGFR 항체(예를 들어, 세툭시맙), 항원-결합 단편, 또는 이의 변이체의 가변 경쇄에서 위치 104에서 Glu(E) 아미노산 치환 (즉, 104E) 및 선택적으로 추가 변형(들) 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체가 본원에서 제공된다. 생성된 변형(들)은 서열번호 4, 9 또는 11 중 어느 하나로 기재된 가변 경쇄에서, 또는 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 그에 서열 동일성을 가지는 이의 변이체에서 일 수 있다. 예를 들어, 생성된 변형은 서열번호 15 또는 17로 기재된 가변 경쇄를 포함하는 비-변형 항-EGFR 항체에서, 또는 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 그에 서열 동일성을 가지는 이의 변이체에서 일 수 있다. 변형은 또한 상기 임의의 가변 경쇄, 예컨대 서열번호 3, 8, 10 또는 13 중 어느 것으로 기재된 전장 경쇄에서, 또는 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 그에 서열 동일성을 가지는 이의 변이체에서 일 수 있다. 변형(들)은 상보적 결정 영역(CDR) 또는 프레임 영역에서 일 수 있다.
예를 들면, 104E 아미노산 치환을 가진 가변 중쇄를 포함하고 서열번호 4로 기재되는 아미노산 위치를 참고로 하여 1, 2, 3, 4, 5, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 86, 87, 89, 91, 92, 93, 96, 97, 98, 99 또는 100 에 상응하는 임의의 위치에서 가변 경쇄 또는 이의 부분 내에 적어도 하나의 아미노산 치환 또는 대체(substitution)를 포함하는 변형된 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다. 예를 들면, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 위치를 참고로 하여 위치 1의 아스파르트산(D)(D1), I2, L3, L4, T5, R24, A25, S26, Q27, S28, I29, G30, T31, N32, I33, I48, K49, A51, S52, E53, S54, I55, S56, Y86, Y87, Q89, N91, N92, N93, T96, T97, F98, G99 또는 A100 의 치환에 상응하는 위치에서 아미노산 위치가 치환될 수 있다. 일부 예에서, 상기 임의의 위치 상응하는 위치에서 변형된(예를 들면, 치환된) 아미노산 잔기는 서열번호 4의 임의의 것으로 기재되는 아미노산에 대하여 보존적 잔기 또는 반-보존적 아미노산 잔기이다.
위치에서 아미노산 치환은 치환된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 EGFR 항원(예를 들어, 인간 EGFR)에 특이적으로 결합을 보이는 한 위치에서 임의의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 일반적으로, 추가의 변형을 포함하는 생성된 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하와 대비하여 산성 pH의 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하에 더 큰 결합 활성을 보이며, 이러한 결합 활성의 비율은 1.0 보다 큰, 예컨대 상기 본원에서 기술된 바와 같이 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0. 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 20.0, 40.0, 30.0, 40.0 또는 그 이상이다.
104E 아미노산 치환을 가진 가변 중쇄 또는 이의 부분; 및 서열번호 4로 기재된 위치를 참고로 하여 표 8에 기재된 치환에 상응하는 가변 경쇄에서 하나 이상의 다른 아미노산 치환을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.
Figure pct00016
예를 들어, 본원에서 제공되는 예시적 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 104E 아미노산 치환을 가지는 가변 중쇄 또는 이의 부분; 및 서열번호 4의 임의의 것으로 기재된 위치를 참고로 하여 4, 5, 24, 29, 56 또는 91 위치 또는 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 가변 경쇄 또는 이의 부분을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 위치는 서열번호 4로 기재된 아미노산 위치를 참고로 하여 4 위치에서 루신(L)의 치환 (L4), T5, R24, I29, S56 또는 N91에 상응하는 위치에서 치환(들)일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 예시적인 변형된 항-EGFR 항체는 경쇄 치환 또는 L4C, L4F, L4V, T5P, R24G, I29S, S56H 또는 N91V 치환에 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 치환(들)을 포함한다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체는 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열에서 I29S의 경쇄 치환에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다.
상기 본원에서 제공되는 가변 경쇄에서 임의의 아미노산 치환에 대하여, 치환은 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열을 가진 그것과 함께 정렬에 의해 또다른 항-EGFR 항체에서 상응하는 위치에서 제조될 수 있는 것으로 이해되며, 그것에 의하여 상응하는 위치는 배열된 위치이다. 특정 예에서, 아미노산 치환(들)은 세툭시맙 경쇄, 또는 이의 부분 예컨대 서열번호 3, 4, 8-11, 13, 15, 또는 17 중 어느 것으로 기재된 것 내, 또는 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 그에 서열 동일성을 가지는 이의 변이체 내 상응하는 위치에서 일 수 있다. 일반적으로, 변형된 항-EGFR 항체는 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하와 대비하여 산성 pH의 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하에 더 큰 결합 활성을 보이며, 이러한 결합 활성의 비율은 1.0 보다 큰, 예컨대 상기 본원에서 기술된 바와 같이 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0. 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 20.0, 40.0, 30.0, 40.0 또는 그 이상이다.
가변 중쇄에서 104E 치환에 더하여, 비변형 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 가변 경쇄에서 비제한적인 아미노산 치환은 표 9에 기재된다. 표는 서열번호에 의해 지정된 예시적 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열을 기재한다. 변형된 중쇄 및 변형된 경쇄를 포함하는 이러한 변형된 항-EGFR 항체의 예는 하기 제공된다. 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 중쇄에서 추가적인 변형을 예를 들어 상기 서브섹션에서 기술된 바와 같이, 또는 본원에서 기술된 항체의 안간화의 결과와 같이, 예를 들어 서브섹션 C.2에 기재된 바와 같이 포함할 수 있다. 또한, 상기 기술된 바와 같은 중쇄에서 임의의 변형 및 본원에서 기술된 바와 같이 경쇄에서 임의의 변형은 항-EGFR 항체 또는 이의 EGFR 결합 단편에서 조합될 수 있다.
Figure pct00017
ⅲ. 다른 변형
또한 본원에서 제공되는 변형된 임의의 항-EGFR 항체는 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역에서 하나 이상의 추가 변형을 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체에 포함될 수 있는 다른 추가적인 변형의 예는 이에 제한되지 않지만 미국특허 제7,657,380호, 제7,930,107호, 제7,060,808호, 제7,723,484호, 미국 공개특허 제20110142822호, 제2005142133호, 제2011117110호, 국제 특허 공개 공보 WO2012003995, WO2010080463, WO2012020059, WO2008152537, 및 Lippow 외 (2007) Nat Biotechnol. 25(10):1171-1176에 기재된 것을 포함한다. 본원에서 제공되는 임의의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 포함될 수 있는 당 기술 분야에서 기재된 예시적 아미노산 치환의 비제한적인 예는 아래를 포함한다 :
서열번호 4로 기재된 아미노산 서열에서 글루타메이트로 위치 1에서 아스파테이트 (D1E), D1C, I2T, I2C, L3V, L3T, L3C, L4C, T5C, Q6C, S7C, P8C, V9C, V9A, V9D, V9G, V9P, V9S, I10T, I10S, I10F, I10C, L11Q, L11C, S12A, S12C, V13L, V13M, V13S, V13A, V13C, S14T, S14C, P15V, P15L, P15C, G16K, G16C, E17D, E17K, E17C, R18V, R18K, R18C, V19A, V19T, V19C, S20T, S20C, S20A, F21I, F21L, F21C, S22T, S22C, R24P, A25V, A25S, A25I, A25P, A25T, A25Y, A25C, A25F, A25M, A25L, A25W, S26D, Q27W, Q27E, Q27F, Q27Y, Q27T, Q27H, S28R, S28F, G30Y, G30C, G30H, G30K, G30Q, G30R, G30W, G30F, G30T, G30M, G30S, G30A, T31E, T31V, T31D, T31R, N32H, I33L, H34C, Q38K, R39K, T40P, T40S, N41G, N41D, G42Q, G42K, G42E, S43A, S43P, R45K, K49Y, K49F, Y50G, S53V, S60D, S60A, G64S, G64A, D70E, D70V, F71Y, S74T, N76S, N76T, S77R, S77G, V78L, E79Q, S80P, S80A, E81A, I83F, I83S, I83V, I83A, D85V, D85T, D85I, D85M, Y87S, Q89C, Q89H, Q90C, N91C, N91Q, N91L, N92C, N92L, N92R N92K, N92M, N92Y, N92H, N92E, N92F, N93A, N93D, N93E, N93V, N93K, N93C, W94F, W94Y, P95C, T96C, T96L, T96E, T97C, T97A, T97D, T97E, T97P, T97K, T97N, T97Q, T97I, T97G, T97L, T97H, T97R, T97S, G99A, A100G, A100Q, K103T, L104V 및 L106I의 치환에 상응하는 하나 이상의 위치에서 가변 경쇄(VL) 내 아미노산 치환(대체)를 포함하는 변이체;
서열번호 2 또는 7로 기재된 아미노산 서열에서 글루탐산으로 위치 1에서 글루타민 (Q1E), Q1C, V2C, Q3T, Q3C, L4C, K5Q, K5V, K5L, K5C, Q6E, Q6C, S7C, G8C, P9A, P9G, P9C, G10V, G10C, L11C, V12C, Q13K, Q13R, Q13C, P14C, S15G, S15T, S15C, Q16G, Q16R, Q16E, Q16C, S17T, S17C, L18C, S19K, S19R, S19T, S19C, I20L, I20C, T21S, T21C, T23A, T23K, T23C, V24A, V24C, S25C, F27G, S28N, S28T, L29I, T30S, T30K, N31V, N31D, N31I, N31T, N32S, Y32R, Y32W, G33A, G33D, G33E, G33Y, V34L, V34N, V34E, V34Q, V34S, V34W, H35S, V37I, S40A, S40P, P41T, G44A, L48V, L48I, G49S, G49A, V50L, V50Q, V50E, V50I, V50Y, V50N, I51G, I51M, I51S, I51Q, I51A, I51C, I51V, W52F, W52Y, W52G, W52T, S53Q, S53T, S53N, S53Y, G54A, G54V, G54L, G54I, G54S, G55D, G55A, G55E, G55H, G55F, N56A, N56G, N56S, N56T, T57A, T57D, T57G, T57S, T57E, T57P, D58Y, D58N, Y59A, Y59C, Y59E, Y59F, Y59G, Y59S, Y59W, T59H, Y59P, Y59Q, N60D, N60A, T61E, T61P, P62S, F63L, F63V, T64K, T64E, T64A, T64N, T64D, S65G, L67F, L67V, S68T, N70S, N70T, K71V, D72E, N73T, S74A, S76N, Q77T, Q77S, V78L, V78F, V78A, F79Y, F79S, F79V, F80L, F80M, K81Q, K81T, K81E, K81Q, M82L, N83T, N83S, S84N, L85M, L85V, Q86R, Q86D, Q86T, S87A, S87P, N88E, N88V, N88G, N88A, N88D, I92T, I92V, A96C, R97C, A98C, L99C, L99E, T100D, T100C, T100A, Y101C, Y101W, Y101A, Y102C, Y102F, Y102A, Y102W, D103E, D103P, D103C, E105C, E105N, E105D, E105Y, F106C, F106D, F106Y, A107C, A107D, Y108C 및 Y108F의 치환에 상응하는 위치에서 가변 중쇄(VH) 내 아미노산 치환(대체)를 포함하는 변이체; 및
EU 인덱스 넘버링에 따라, 알라닌으로 230 위치에서 프롤린 (P230A), E233D, L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239F, S239T, S239H, S239Y, V240I, V240A, V240T, V240M, F241W, F241L, F241Y, F241E, F241R, F243W, F243L F243Y, F243R, F243Q, P244H, P245A, P247V, P247G, V262I, V262A, V262T, V262E, V263I, V263A, V263T, V263M, V264L, V264I, V264W, V264T, V264R, V264F, V264M, V264Y, V264E, D265G, D265N, D265Q, D265Y, D265F, D265V, D265I, D265L, D265H, D265T, V266I, V266A, V266T, V266M, S267Q, S267L, S267T, S267H, S267D, S267N, E269H, E269Y, E269F, E269R, E269T, E269L, E269N, D270Q, D270T, D270H, E272S, E272K, E272I, E272Y, V273I, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276S, N276E, N276R, N276L, N276Y, Y278T, Y278E, Y278K, Y278W, E283R, Y296E, Y296Q, Y296D, Y296N, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, Y296H, N297S, N297D, N297E, S298H, T299I, T299L, T299A, T299S, T299V, T299H, T299F, T299E, V302I, W313F, E318R, K320T, K320D, K320I, K322T, K322H, V323I, S324T, S324D, S324R, S324I, S324V, S324L, S324Y, N325Q, N325L, N325I, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, K326L, K326I, K326T, A327N, A327L, A327D, A327T, L328M, L328D, L328E, L328N, L328Q, L328F, L328I, L328V, L328T, L328H, L328A, P329F, A330L, A330Y, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H, A330S, A330W, A330M, P331V, P331H, I332D, I332E, I332N, I332Q, I332T, I332H, I332Y, I332A, E333T, E333H, E333I, E333Y, K334I, K334T, K334F, T335D, T335R, T335Y, D221K, D221Y, K222E, K222Y, T223E, T223K, H224E, H224Y, T225E, T225E, T225K, T225W, P227E, P227K, P227Y, P227G, P228E, P228K, P228Y, P228G, P230E, P230Y, P230G, A231E, A231K, A231Y, A231P, A231G, P232E, P232K, P232Y, P232G, E233N, E233Q, E233K, E233R, E233S, E233T, E233H, E233A, E233V, E233L, E233I, E233F, E233M, E233Y, E233W, E233G, L234K, L234R, L234S, L234A, L234M, L234W, L234P, L234G, L235E, L235K, L235R, L235A, L235M, L235W, L235P, L235G, G236D, G236E, G236N, G236Q, G236K, G236R, G236S, G236T, G236H, G236A, G236V, G236L, G236I, G236F, G236M, G236Y, G236W, G236P, G237D, G237E, G237N, G237Q, G237K, G237R, G237S, G237T, G237H, G237V, G237L, G237I, G237F, G237M, G237Y, G237W, G237P, P238D, P238E, P238N, P238Q, P238K, P238R, P238S, P238T, P238H, P238V, P238L, P238I, P238F, P238M, P238Y, P238W, P238G, S239Q, S239K, S239R, S239V, S239L, S239I, S239M, S239W, S239P, S239G, F241D, F241E, F241Y, F243E, K246D, K246E, K246H, K246Y, D249Q, D249H, D249Y, R255E, R255Y, E258S, E258H, E258Y, T260D, T260E, T260H, T260Y, V262E, V262F, V264D, V264E, V264N, V264Q, V264K, V264R, V264S, V264H, V264W, V264P, V264G, D265Q, D265K, D265R, D265S, D265T, D265H, D265V, D265L, D265I, D265F, D265M, D265Y, D265W, D265P, S267E, S267Q, S267K, S267R, S267V, S267L, S267I, S267F, S267M, S267Y, S267W, S267P, H268D, H268E, H268Q, H268K, H268R, H268T, H268V, H268L, H268I, H268F, H268M, H268W, H268P, H268G, E269K, E269S, E269V, E269I, E269M, E269W, E269P, E269G, D270R, D270S, D270L, D270I, D270F, D270M, D270Y, D270W, D270P, D270G, P271D, P271E, P271N, P271Q, P271K, P271R, P271S, P271T, P271H, P271A, P271V, P271L, P271I, P271F, P271M, P271Y, P271W, P271G, E272D, E272R, E272T, E272H, E272V, E272L, E272F, E272M, E272W, E272P, E272G, K274D, K274N, K274S, K274H, K274V, K274I, K274F, K274M, K274W, K274P, K274G, F275L, N276D, N276T, N276H, N276V, N276I, N276F, N276M, N276W, N276P, N276G, Y278D, Y278N, Y278Q, Y278R, Y278S, Y278H, Y278V, Y278L, Y278I, Y278M, Y278P, Y278G, D280K, D280L, D280W, D280P, D280G, G281D, G281K, G281Y, G281P, V282E, V282K, V282Y, V282P, V282G, E283K, E283H, E283L, E283Y, E283P, E283G, V284E, V284N, V284T, V284L, V284Y, H285D, H285E, H285Q, H285K, H285Y, H285W, N286E, N286Y, N286P, N286G, K288D, K288E, K288Y, K290D, K290N, K290H, K290L, K290W, P291D, P291E, P291Q, P291T, P291H, P291I, P291G, R292D, R292E, R292T, R292Y, E293N, E293R, E293S, E293T, E293H, E293V, E293L, E293I, E293F, E293M, E293Y, E293W, E293P, E293G, E294K, E294R, E294S, E294T, E294H, E294V, E294L, E294I, E294F, E294M, E294Y, E294W, E294P, E294G, Q295D, Q295E, Q295N, Q295R, Q295S, Q295T, Q295H, Q295V, Q295I, Q295F, Q295M, Q295Y, Q295W, Q295P, Q295G, Y296K, Y296R, Y296A, Y296V, Y296M, Y296G, N297Q, N297K, N297R, N297T, N297H, N297V, N297L, N297I, N297F, N297M, N297Y, N297W, N297P, N297G, S298D, S298E, S298Q, S298K, S298R, S298I, S298F, S298M, S298Y, S298W, T299D, T299E, T299N, T299Q, T299K, T299R, T299L, T299F, T299M, T299Y, T299W, T299P, T299G, Y300D, Y300E, Y300N, Y300Q, Y300K, Y300R, Y300S, Y300T, Y300H, Y300A, Y300V, Y300M, Y300W, Y300P, Y300G, R301D, R301E, R301H, R301Y, V303D, V303E, V303Y, S304D, S304N, S304T, S304H, S304L, V305E, V305T, V305Y, K317E, K317Q, E318Q, E318H, E318L, E318Y, K320N, K320S, K320H, K320V, K320L, K320F, K320Y, K320W, K320P, K320G, K322D, K322S, K322V, K322I, K322F, K322Y, K322W, K322P, K322G, S324H, S324F, S324M, S324W, S324P, S324G, N325K, N325R, N325S, N325F, N325M, N325Y, N325W, N325P, N325G, K326P, A327E, A327K, A327R, A327H, A327V, A327I, A327F, A327M, A327Y, A327W, A327P, L328D, L328Q, L328K, L328R, L328S, L328T, L328V, L328I, L328Y, L328W, L328P, L328G, P329D, P329E, P329N, P329Q, P329K, P329R, P329S, P329T, P329H, P329V, P329L, P329I, P329M, P329Y, P329W, P329G, A330E, A330N, A330T, A330P, A330G, P331D, P331Q, P331R, P331T, P331L, P331I, P331F, P331M, P331Y, P331W, I332K, I332R, I332S, I332V, I332F, I332M, I332W, I332P, I332G, E333L, E333F, E333M, E333P, K334P, T335N, T335S, T335H, T335V, T335L, T335I, T335F, T335M, T335W, T335P, T335G, I336E, I336K, I336Y, S337E, S337N, S337H, S298A, K326A, K326S, K326N, K326Q, K326D, K325E, K326W, K326Y, E333A, E333S, K334A, K334E, Y300I, Y300L, Q295K, E294N, S298N, S298V, S298D, D280H, K290S, D280Q, D280Y, K290G, K290T, K290Y, T250Q, T250E, M428L, M428F, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239T, V240I, V240M, V264I, V264T, V264Y, E272Y, K274E, Y278T, N297D, T299A, T299V, T299I, T299H, K326T, L328A, L328H, A330Y, A330L, A330I, I332D, I332E, I332N 및 I332Q의 치환을 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 힌지, CH2 및 CH3 영역 내 아미노산 치환(대체)를 포함하는 변이체.
b. 예시적인 104E 변형된 항- EGFR 항체 및 이의 단편
서열 번호 2 또는 7로 기재된 중쇄 가변 도메인을 참고로 하여 글루탐산으로 104 위치에 상응하는 아미노산 치환 (즉, 104E), 및 선택적으로 항체의 중쇄 또는 경쇄에서 하나 이상의 추가 아미노산 치환(들)을 포함하는 본원에서 제공되는 예시적인 변형된 항-EGFR 항체는 하기 기재된 바와 같다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 예컨대 본원에서 기재된 어느 것은 항체에 결합될 때 EGFR 항원(예를 들어 인간 EGFR)에 특이적으로 결합하기 충분한 변형된 가변 중쇄 및/또는 변형된 가변 경쇄 또는 이의 부분을 최소한으로 포함한다. 104E- 포함 항-EGFR 항체는 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하와 대비하여 산성 pH의 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하에 더 큰 결합 활성을 보일 수 있으며, 이러한 결합 활성의 비율은 1.0 보다 큰, 예컨대 상기 본원에서 기술된 바와 같이 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0. 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0 또는 그 이상이다.
예를 들어, ⅰ) 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 것으로 기재된 변형된 가변 중쇄, 또는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 123 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열; 및 ⅱ) 서열번호 4, 9 또는 11 중 어느 것으로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 4, 9 또는 11 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열을 포함하는 104E 변형된 항-EGFR 항체가 본원에서 제공된다.
다른 예에서, ⅰ) 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 것으로 기재된 변형된 가변 중쇄, 또는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 123 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열; 및 ⅱ) 서열번호 125-127 중 어느 것으로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 125-127 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열을 포함하는 104E 변형된 항-EGFR 항체가 본원에서 제공된다.
특정 예에서, ⅰ) 서열번호 74 또는 75로 기재된 변형된 가변 중쇄, 또는 서열번호 74 또는 75 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열; 및 ⅱ) 서열번호 125-127 중 어느 것으로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 125-127 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열을 포함하는 104E 변형된 항-EGFR 항체가 본원에서 제공된다.
또 다른 특정 예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 모두에서 추가적인 변형을 포함하는 104E 변형된 항-EGFR 항체가 본원에서 제공되며, 그것에 의하여 항-EGFR 항체는 ⅰ) 서열번호 77 또는 78로 기재된 변형된 가변 중쇄, 또는 서열번호 77 또는 78 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열; 및 ⅱ) 서열번호 125-127 중 어느 것으로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 125-127 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열을 포함한다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 전장 IgG1 항체, 또는 IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 다른 서브타입일 수 있다. 예를 들어, 항-EGFR 항체는 카파 경쇄 불변 영역 (서열번호 31 또는 33으로 기재) 또는 서열번호 19-23 중 어느 것으로 기재된 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 전장 IgG1 항체일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 또한 Ig 클래스, 예컨대, IgG2(서열번호 24로 기재), IgG3(서열번호 25로 기재) 또는 IgG4(서열번호 26으로 기재)로부터 일 수 있다. 경쇄 불변 영역은 또한 인간 람다 경쇄 (서열번호 32로 기재)일 수 있다.
예를 들어, ⅰ) 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 것으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변, 또는 104E 아미노산 치환을 포함하는 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열, 및 추가로 서열번호 19-23 중 어느 것으로 기재된 IgG1 불변 영역에 상응하는 아미노산 서열; 및 ⅱ) 경쇄를 포함하는 전장 항체인 변형된 항-EGFR 항체가 본원에서 제공된다. 경쇄는 추가로 서열번호 31, 33 또는 34 중 어느 것으로 기재된 카파 경쇄 불변 영역 또는 서열번호 32로 기재된 람다 경쇄 불변 영역 또는 이들의 변이체를 포함하는 서열번호 4, 9 또는 11 중 어느 것으로 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 4, 9 또는 11 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경쇄는 서열번호 3, 8, 10 또는 13으로 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 3, 8, 10 또는 13 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열을 가질 수 있다. 경쇄는 또한 추가로 서열번호 31, 33 또는 34 중 어느 것으로 기재된 카파 경쇄 불변 영역 또는 서열번호 32로 기재된 람다 경쇄 불변 영역 또는 이들의 변이체를 포함하는, 서열번호 125-127 중 어느 것으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 변형된 경쇄 가변 도메인, 또는 서열번호 125-127 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열일 수 있다.
특히, ⅰ) 서열번호 72, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 또는 121 중 어느 것으로 기재된 중쇄, 104E 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 72, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 또는 121 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열; 및 ⅱ) 경쇄를 포함하는 전장 항체인 변형된 항-EGFR 항체가 본원에서 제공된다. 경쇄는 서열번호 3, 8, 10 또는 13으로 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 3, 8, 10 또는 13 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열을 가질 수 있다. 경쇄는 또한 서열번호 124로 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 124에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열을 가질 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 또한 항체 단편을 포함하고, 이는 전장 항체의 전체 서열보다 작지만, 적어도 전장 항체의 특이적 결합 능력 부분, 예컨대 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 유지하는 것이다. 항체 단편은 또한 항체의 항원-결합 부분을 포함할 수 있고 이는 부모 항체의 결합 친화도를 유지하기 위하여 항체의 프레임 워크로 삽입될 수 있다(예컨대, 키메릭 항체). 항체 단편의 예시는 이에 제한되는 것은 아니나 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 Fv (scFv), Fv, dsFv, 2가 항체 절편(Diabody), Fd 및 Fd' 단편 및 변형된 단편을 포함하는 다른 단편(예를 들면, Methods in Molecular Biology, Vol. 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov 참조)을 포함한다.
항체 단편은 서로 연결된 다중 쇄(multiple chain), 예컨대 이황화 가교에 의해서 연결된 것을 포함할 수 있고 재조합적으로 생산된 것일 수 있다. 항체 단편은 또한 두개 또는 그 이상의 도메인을 연결하기 위한 합성 링커, 예컨대 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 항원-결합 단편을 생성하기 위한 방법은 당 분야에 잘 알려져 있고 본원에서 제공되는 임의의 항체를 변형하는데 사용될 수 있다. 항체 분자의 단편이 예컨대 예를 들어 효소적 절단에 의하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 프로테아제에 있어서 파파인에 의한 절단에 의하여, 중쇄 불변 영역의 이량체(dimer), Fc 도메인이, 두 개의 Fab 영역으로부터 절단된다(즉, 가변 영역을 포함하는 부분). 대안적으로, 펩신 절단은 항체의 이가 (Fab')2 단편 제조를 위해 사용될 수 있다. 항체 단편은 합성으로 또는 재조합 DNA방법에 의해 제조될 수 있다.
단일 쇄 항체들은 특정 항체의 중쇄 가변영역(VH) 및 중쇄 가변역역(VL) 의 결합에 의하여 재조합적으로 만들어질 수 있다. 가변 영역을 위한 특정 핵산 서열은 표준 분자 생물학 방법, 예컨대 예를 들면 중합효소연쇄반응 (PCR) 및 다른 재조합 핵산 기술에 의하여 클로닝될 수 있다. scFvs 를 생산하는 방법이, 예를 들면 Whitlow 및 Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird 외. (1988) Science 242:423-426; Pack 외. (1993) Bio/Technology 11:1271-77; 및 미국특허 제4,946,778호, 제5,840,300호, 제5,667,988호, 제5,658,727호, 제5,258,498호에 기술되어 있다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 단편, 예컨대 상기 본원에서 기술된 임의의 것은 ⅰ) 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 것으로 기재된 변형된 가변 중쇄, 또는 104E 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122 또는 123 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 항원 결합 단편 또는 이의 변이체; 및 ⅱ) 서열번호 4, 9, 11, 15, 17 또는 125-127 중 어느 것으로 기재된 가변 경쇄 도메인, 또는 서열번호 4, 9, 11, 15, 17 또는 125-127 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 항원 결합 단편 또는 이의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 항체 단편의 예는 이에 제한되지 않지만, Fab, Fab', F(ab')2, 단쇄 Fv (scFv), Fv, dsFv, diabody, Fd 및 Fd' 단편을 포함한다.
예를 들어, 이러한 항-EGFR 항체는 Fab 단편 (VH-CH1 및 CL-CL)일 수 있다. 이러한 예에서, 상기 기술된 104E 가변 중쇄 영역은 IgG1(예를 들어, 서열번호 19-23 중 어느 것의 아미노산 잔기 1-98에 상응하는) 또는 다른 서브타입 또는 이소타입 (예를 들어, 서열번호 24-27 중 어느 것의 아미노산 잔기 1-98에 상응하는)으로부터 중쇄 CH1 불변 영역을 더 포함할 수 있다. 상기 기술된 가변 경쇄 영역은 서열번호 31, 33 또는 34 중 어느 것으로 기재된 카파 경쇄 불변 영역 또는 서열번호 32로 기재된 람다 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, ⅰ) 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 것으로 기재된 가변 중쇄, 또는 104E 아미노산 치환을 포함하고 서열번호 19-23 중 어느 것에 기재된 IgG1 불변 영역의 아미노산 1-98에 상응하는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 더 포함하며 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열; 및 ⅱ) 서열번호 3, 8, 10, 13 또는 124 중 어느 것으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄, 또는 서열번호 3, 8, 10, 13 또는 124 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열을 포함하는 변형된 항-EGFR Fab 항체가 본원에서 제공된다.
특정 예에서, 변형된 항-EGFR 항체는 단일쇄 항체이다. 단일쇄 항체는 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체 중 임의의 것의 항원-결합 도메인으로부터 생성될 수 있다. 재조합 기술을 이용하여 단일 쇄 항체를 생성하는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있고, 예컨대 그들은 예를 들면, Marasco 외. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:7889-7893, Whitlow 및 Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird 외. (1988) Science 242:423-426; Pack 외. (1993) Bio/Technology 11:1271-77; 및 미국 특허 제4,946,778호, 제5,840,300호, 제5,667,988호, 제5,658,727호에 기술되어 있다.
단일 쇄 항체는 본원에서 제공된 임의의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 가변(VL) 도메인 또는 그들의 기능 영역 및 중쇄 가변(VH) 도메인 또는 그들의 기능 영역을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 단일 쇄 항체의 VL 도메인 또는 그들의 기능 영역은 본원에서 제공된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CD2R2) 및/또는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다. 일부 예에서 단일 쇄 항체의 VH 도메인 또는 그들의 기능 영역은 본원에서 제공된 임의의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CDR2) 및 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.
일부 예에서, 단일 쇄 항체는 추가적으로 펩티드 링커를 포함한다. 이런 예에서, 펩티드 링커는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 중쇄 가변 도메인(VH) 사이에 위치할 수 있다. 단일쇄 항체는 항체의 하나 또는 그 이상의 도메인 사이에 펩티드 스페이서 또는 링커를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 경쇄 가변 도메인(VL)은 유연성있는 링커 펩티드를 통해서 중쇄 가변 도메인(VH) 과 짝지어질 수 있다. 일반적으로, 링커 단백질은 대략 1 -50 아미노산 길이이다. 여기에서 사용되는 링커는 또한 세포 내 유효성, 혈청 안정성, 특이성 및 용해도를 증가시킬 수 있고 또한 증가된 유연성 또는 경감된 입체 장애를 제공한다. 링커 모이어티는 예를 들어, Huston 외. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883, Whitlow 외 (1993) Protein Engineering 6:989-995, 및 Newton 외., (1996) Biochemistry 35:545-553에 기재된다.
다양한 펩티드 링커가 당 분야에 잘 알려져 있으며, 제공되는 방법에서 사용될 수 있다. 펩티드 링커는 연속적인 글리신 잔기(Gly) 또는 세린(Ser) 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 폴리펩티드 링커는 아미노산 서열 (Gly-Ser)n, (GlymSer)n 또는 (SermGly)n 을 갖는 펩티드이며, m은 1 내지 6, 일반적으로 1 내지 4, 및 전형적으로는 2 내지 4 및 n은 1 내지 30, 또는 1 내지 10, 및 전형적으로는 1 내지 4이고 가용성을 증가시키기 위하여 도처에 분산되어진 몇개의 글루탐산(Glu) 또는 리신(Lys) 잔기를 함께 갖는 펩티드이다(예컨대 PCT 국제출원 번호 WO 96/06641 참조, 이는 컨주게이트(conjugate)에서 사용을 위한 예시적인 링커를 제공함). 예시적인 펩티드 링커는 이에 제한되는 것은 아니나 서열 (Gly4Ser)3 (서열번호 46), GGSSRSSSSGGGGSGGGG (서열번호 327), GSGRSGGGGSGGGGS (서열번호 328), EGKSSGSGSESKST (서열번호 329), EGKSSGSGSESKSTQ (서열번호 330), EGKSSGSGSESKVD (서열번호 331), GSTSGSGKSSEGKG (서열번호 332), KESGSVSSEQLAQFRSLD (서열번호 333), 및 ESGSVSSEELAFRSLD (서열번호 334)을 갖는 펩티드를 포함한다. 다른 적절한 펩티드 링커들은 미국특허 4,751,180호 또는 4,935,233호에 기술된 것들 중 임의의 것을 포함하고, 이들은 참조로서 본 명세서에 통합된다.
2. 인간화 항- EGFR 항체
인간 또는 인간화 항-EGFR 항체가 본원에서 제공된다. 예를 들면, 상기 서브섹션 C.1에서 제공된 것과 같은 변형된 중쇄 및/또는 변형된 경쇄를 포함하는 임의의 변형된 항-EGFR이 인간화될 수 있다. 예를 들어, 인간화는 상기 기술된 예시적 항체 중 임의의 것을 포함하여, 104E를 포함하는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123으로 기재된 가변 중쇄를 포함하는 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체 중 임의의 것, 또는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 서열; 및 서열번호　4, 9, 11 또는 124-127 중 어느 것에 기재된 가변 경쇄, 또는 서열번호　4, 9, 11 또는 124-127 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 보이는 서열을 참고로 하여 수행될 수 있다. 인간화 방법은 당 분야의 통상의 기술자들에게 잘 알려져 있다. 항체 인간화는 마우스 또는 다른 비-인간 항체를 인간 항체로 발달시키는데 사용될 수 있다. 생성된 항체는 인간 서열에서 증가와 비-인간(예를 들어 마우스) 항체 서열의 제거에 대한 감소와 동시에 시작 항체와 같은 결합 친화도와 특이성을 유사하게 유지하는 것을 포함한다.
비-인간 또는 인간 항체의 조작 또는 인간화를 위한 방법이 사용될 수 있으며, 당 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 또는 조작된 항체들은 비-인간, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나 마우스, 랫트, 토끼, 비-인간 영장류 또는 다른 포유류 유래의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 가지고 있다. 인간 아미노산 잔기가 그들에게 도입되고, 따라서 이들은 종종 "도입(import)" 잔기로 언급되며, 이는 전형적으로 알려진 인간 서열의 "도입" 가변, 불변 또는 다른 도메인으로부터 얻어진다. 알려진 인간 Ig 서열이, 예컨대 ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; atcc.org/phage/hdb.html; sciquest.com/; www.abcam.com/; antibodyresource.com/onlinecomp.html; public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html. immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html; biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html; nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; m.ehime-u.ac.jp/.about.yasuhito/Elisa.html; biodesign.com/table.asp; icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; isac-net.org/sites_geo.html; aximt1.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/links1.html; recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwvu.edu/; mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; jerini.de/fr_products.htm; patents.ibm.con/ibm.html. Kabat 외 of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)에 기술된다.
이와 같은 도입된 서열들은 면역원성 감소 또는 당 분야에 잘 알려진 결합, 친화도, 온-속도(on-rate), 오프-속도(off-rate), 결합활성, 특이도, 반감기 또는 임의의 다른 적절한 성질을 감소, 강화 또는 변형시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로 오리지널 비-인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는 가변 영역(예를 들어, 프레임 영역) 및 불변 영역의 비-인간 서열이 인간 서열 또는 다른 아미노산으로 치환되는 동안 유지된다.
항체는 또한 경우에 따라서, 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 선호하는 생물학적인 능력을 유지하도록 인간화될 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위하여, 인간화 항체는 경우에 따라 부모 서열의 분석 과정 및 다양한 부모 및 인간화 서열의 삼차원 모델을 이용한 인간화 산물의 구성 과정에 의하여 준비될 수 있다. 삼차원 면역글로불린 모델은 당업자에게 일반적으로 이용가능하고 친숙하다. 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있으며 이는 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 삼차원 입체 구조를 묘사하고 보여준다. 이러한 디스플레이 분석은 후보 면역글로불린 서열의 기능 내에서 잔기의 역할과 같은 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 이의 항원에 결합하는 능력에 대한 영향과 같은 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이와 같은 방식에서, FR 잔기는 보존 및 도입 서열로부터 선택되고 결합될 수 있으며 이에 따라 원하는 항체 성질, 예컨대 목적 항원(들)에 대한 증가된 친화도를 달성할 수 있다.
일반적으로, CDR 잔기는 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주며 참여한다. 그러므로, CDR 잔기는 인간화를 위해 일반적으로 표적되지 않는다. 항체의 인간화 또는 조작은 임의의 알려진 방법, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나 Jones 외., Nature 321:522 (1986); Riechmann 외., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen 외., Science 239:1534 (1988)), Sims 외., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter 외., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta 외., J. Immunol. 151:2623 (1993), 미국특허 5,723,323호, 5,976,862호, 5,824,514호, 5,817,483호, 5,814,476호, 5,763,192호, 5,723,323호, 5,766,886호, 5,714,352호, 6,204,023호, 6,180,370호, 5,693,762호, 5,530,101호, 5,585,089호, 5,225,539호; 4,816,567호, PCT/: US98/16280호, US96/18978호, US91/09630호, US91/05939호, US94/01234호, GB89/01344호, GB91/01134호, GB92/01755호; WO90/14443호, WO90/14424호, WO90/14430호, EP 229246호에 기술되어 있는 것을 이용할 수 있고 그들에 인용된 참조를 포함하는 각각은 전체적으로 참조로써 본원에 통합된다.
예를 들면, 항체 인간화는 예를 들어, 개별적인 인간 프레임워크의 풀에 대하여 프레임에서 융합된 인간화를 하기 위한 목적 항체(예컨대, 상기 기재된 임의의 변형된 항-EGFR 항체의 CDR)의 6개의 CDR을 포함하는 조합 라이브러리 합성에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, CDR들은 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123로 기재된 어느 것의 하나 또는 그 이상의 CDRH1 (AbM 정의에 따라, 아미노산 잔기 26-35, 또는 카바트 정의에 따라 아미노산 잔기 31-35), CDRH2 (아미노산 잔기 50-65) 또는 CDRH3 (아미노산 잔기 95-102)로부터 유래될 수 있으며 및/또는 서열번호 4 9, 11 또는 125-127으로 중 어느 것으로 기재된 임의의 하나 또는 그 이상의 CDRL1 (아미노산 잔기 24-34), CDRL2 (아미노산 잔기 50-56) 또는 CDRL3 (아미노산 잔기 89-97)로부터 유래될 수 있다. 인간 생식세포계열의 모든 알려진 중쇄 및 경쇄 유전자의 대표적인 유전자들을 포함하는 인간 프레임워크 라이브러리가 활용될 수 있다. 생산된 재조합 라이브러리는 그 다음으로 본원에서 기술된 바와 같이 관심있는 항원에 대한 조건부 결합에 대하여 스크리닝 될 수 있다. 이러한 접근법은 부모 항체의 친화도 및 조건부 결합 활성 유지 면에서 전장 인간 프레임워크의 가장 선호하는 조합을 선택하는 것이 허용될 수 있게 한다. 인간화된 항체는 그 다음 다양한 기술에 의하여 추가적으로 최적화될 수 있다.
당업자는 상기 기술된 것을 포함하는 많은 인자들에 의존하여 아미노산 대체(substitution) 또는 치환(replacement) 수가 인간화에 영향을 주도록 할 수 있다. 일반적으로, 항-EGFR 항체, 단편 또는 변이체에 대한 아미노산 치환 (대체), 삽입 또는 결실 수는 본원에서 명시된 바와 같이, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 이상이 되지 않으며, 예컨대 1 내지 30 또는 그들 내의 임의의 범위 또는 값이다. 기능을 위해 필수적인 항-EGFR 항체의 아미노산 수는 당 분야에 알려진 방법, 예컨대 위치-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발(예컨대, Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham 및 Wells, Science 244:1081-1085 (1989))과 같은 당분야에 알려진 방법에 의하여 확인될 수 있다. 후자의 방법은 분자 내 모든 잔기에 알라닌 돌연변이를 도입한다. 생성된 돌연변이 분자는 그 후 생물학적 활성, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나 본원에서 기술된 임의의 방법을 이용하여 EGFR 에 대한 결합이 시험된다. 항체 결합에 필수적인 위치는 구조 분석, 예컨대 결정화(crystallization), 핵자기 공명 또는 광친화성 표지(photoaffinity labeling)(Smith, 외., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) 및 de Vos, 외., Science 255:306-312 (1992))에 의하여 또한 확인될 수 있다.
본원에서 제공되는 인간화된 항체는 또한 알려진 인간화된 백본(Backbone) 또는 항-EGFR 항체 참고에 기초하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 알려진 인간화된 항체 H255(서열번호 14로 기재된 VH 및 서열번호 15로 기재된 VL) 또는 Hu 225(서열번호 16으로 기재된 VH 및 서열번호 17로 기재된 VL)은 104E 아미노산 치환, 및 선택적으로 하나 이상의 다른 아미노산 치환(들)이 도입되는 비변형 또는 참고 항-EGFR 항체로 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간화된 세툭시맙 항-EGFR 항체, 예를 들어 서열번호 14로 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 15로 기재된 가변 경쇄를 가진 H225, 및 서열번호 16로 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 17로 기재된 가변 경쇄를 가진 Hu225는 인간화된 104E(E-h) 항체 및 이의 변이체를 제조하기 위한 부위 특이적 돌연변이에 의해 변형될 수 있다.
다른 경우에서, 마국 특허 출원 13/815,553에 기재된 임의의 인간화된 항-EGFR 항체는 104E 아미노산 치환, 및 선택적으로 하나 이상의 다른 아미노산 치환이 도입되는 비변형된 또는 참고 항-EGFR 항체로 사용될 수 있다. 비변형된 또는 참고 항-EGFR 항체로 사용될 수 있는 인간화된 항체는 이에 제한되지 않으나, 표 11(예를 들어, DP-h1-h10, DP-h12-h14 또는 FDP-h1-h21로 지정된)에 기재된 104D 아미노산 치환을 포함하는 임의의 인간화된 항체를 포함한다. 예를 들어, 예시적인 인간화된 참고 또는 백본 항체는 Y104D/Q111P (DP-h07) 로 지정된 항-EGFR 항체(예를 들어, 서열번호 55로 기재된 중쇄 및 서열번호 181로 기재된 경쇄를 가지는) 또는 T030F/Y104D/Q111P (FDP-h03) 로 지정된 항-EGFR 항체(예를 들어, 서열번호 65로 기재된 중쇄 및 서열번호 258로 기재된 경쇄를 가지는) 또는 Y104D (D-h07) 로 지정된 항-EGFR 항체 (예를 들어, 서열번호 57로 기재된 중쇄 및 서열번호 181로 기재된 경쇄를 가지는)이다. 이러한 임의의 비변형 또는 참고 인간화 서열은 104E 아미노산 치환, 및 선택적으로 하나 이상의 다른 아미노산 치환을 포함하는 인간화 항-EGFR 항체를 생성하기 위한 부위 특이적 돌연변이의 대상이 될 수 있다.
104E 인간화된 클론의 비제한적인 예는 각 클론의 중쇄 및 경쇄의 서열번호가 기재된 표 10에 기재된다.
Figure pct00018
Figure pct00019
가변 영역a -b : 알려진 세툭시맙 중쇄 가변 영역으로부터 유래된(섹션 B 참조)
가변 영역c -e : 알려진 세툭시맙 경쇄 가변 영역으로부터 유래된(섹션 B 참조)
본원에서 제공되는 예시적인 인간화된 항-EGFR 항체들은 하기 기재된 아미노산 서열을 가지는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함하는 것을 포함한다:
서열번호 61 또는 63으로 기재된 VH 또는 서열번호 61 또는 63에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186으로 기재된 VL 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 131 또는 133으로 기재된 VH 또는 서열번호 131 또는 133에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 155, 156 또는 158로 기재된 VL 또는 서열번호 155, 156 또는 158에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 131 또는 133으로 기재된 VH 또는 서열번호 131 또는 133에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 162, 163 또는 165로 기재된 VL 또는 서열번호 162, 163 또는 165에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 137 또는 139으로 기재된 VH 또는 서열번호 137 또는 139에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 155, 156 또는 158로 기재된 VL 또는 서열번호 155, 156 또는 158에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 131 또는 133으로 기재된 VH 또는 서열번호 131 또는 133에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 169, 170 또는 172로 기재된 VL 또는 서열번호 169, 170 또는 172에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 131 또는 133으로 기재된 VH 또는 서열번호 131 또는 133에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 176, 177 또는 179으로 기재된 VL 또는 서열번호 176, 177 또는 179에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 131 또는 133으로 기재된 VH 또는 서열번호 131 또는 133에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186으로 기재된 VL 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 137 또는 139으로 기재된 VH 또는 서열번호 137 또는 139에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186으로 기재된 VL 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 131 또는 133으로 기재된 VH 또는 서열번호 131 또는 133에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 190, 191 또는 193으로 기재된 VL 또는 서열번호 190, 191 또는 193에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 143 또는 145로 기재된 VH 또는 서열번호 143 또는 145에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186으로 기재된 VL 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 149 또는 151로 기재된 VH 또는 서열번호 149 또는 151에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 197, 198 또는 200으로 기재된 VL 또는 서열번호 197, 198 또는 200에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 143 또는 145로 기재된 VH 또는 서열번호 143 또는 145에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 197, 198 또는 200으로 기재된 VL 또는 서열번호 197, 198 또는 200에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 149 또는 151로 기재된 VH 또는 서열번호 149 또는 151에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 204, 205 또는 207로 기재된 VL 또는 서열번호 204, 205 또는 207에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 143 또는 145로 기재된 VH 또는 서열번호 143 또는 145에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 204, 205 또는 207로 기재된 VL 또는 서열번호 204, 205 또는 207에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 211 또는 213으로 기재된 VH 또는 서열번호 211 또는 213에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 253, 254 또는 256으로 기재된 VL 또는 서열번호 253, 254 또는 256에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 217 또는 219으로 기재된 VH 또는 서열번호 217 또는 219에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 253, 254 또는 256으로 기재된 VL 또는 서열번호 253, 254 또는 256에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 223 또는 225로 기재된 VH 또는 서열번호 223 또는 225에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 260, 261 또는 263으로 기재된 VL 또는 서열번호 260, 261 또는 263에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 229 또는 231으로 기재된 VH 또는 서열번호 229 또는 231에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 260, 261 또는 263으로 기재된 VL 또는 서열번호 260, 261 또는 263에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 235 또는 237로 기재된 VH 또는 서열번호 235 또는 237에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 267, 268 또는 270으로 기재된 VL 또는 서열번호 267, 268 또는 270에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 241 또는 243으로 기재된 VH 또는 서열번호 241 또는 243에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 274, 275 또는 277로 기재된 VL 또는 서열번호 274, 275 또는 277에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 223 또는 225로 기재된 VH 또는 서열번호 223 또는 225에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 274, 275 또는 277으로 기재된 VL 또는 서열번호 274, 275 또는 277에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 229 또는 231으로 기재된 VH 또는 서열번호 229 또는 231에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 274, 275 또는 277으로 기재된 VL 또는 서열번호 274, 275 또는 277에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 235 또는 237로 기재된 VH 또는 서열번호 235 또는 237에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284로 기재된 VL 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 247 또는 249로 기재된 VH 또는 서열번호 247 또는 249에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284로 기재된 VL 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 223 또는 225로 기재된 VH 또는 서열번호 223 또는 225에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284로 기재된 VL 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 229 또는 231으로 기재된 VH 또는 서열번호 229 또는 231에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284로 기재된 VL 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 235 또는 237로 기재된 VH 또는 서열번호 235 또는 237에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291으로 기재된 VL 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 247 또는 249로 기재된 VH 또는 서열번호 247 또는 249에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291로 기재된 VL 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 223 또는 225로 기재된 VH 또는 서열번호 223 또는 225에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291로 기재된 VL 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 229 또는 231으로 기재된 VH 또는 서열번호 229 또는 231에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291로 기재된 VL 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 235 또는 237로 기재된 VH 또는 서열번호 235 또는 237에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 295, 296 또는 298로 기재된 VL 또는 서열번호 295, 296 또는 298에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 247 또는 249으로 기재된 VH 또는 서열번호 247 또는 249에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 302, 303 또는 305로 기재된 VL 또는 서열번호 302, 303 또는 305에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 211 또는 213으로 기재된 VH 또는 서열번호 211 또는 213에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 302, 303 또는 305로 기재된 VL 또는 서열번호 302, 303 또는 305에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 211 또는 213으로 기재된 VH 또는 서열번호 211 또는 213에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284로 기재된 VL 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 211 또는 213으로 기재된 VH 또는 서열번호 211 또는 213에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291로 기재된 VL 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열.
임의의 상기 항-EGFR 항체는 추가적으로 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역, 또는 이의 부분을 포함할 수 있다. 불변 영역은 임의의 면역글로불린 클래스 (예컨대 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY), 임의의 서브클래스(Subclass) (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브-서브클래스(Sub-subclass) (예컨대 IgG2a 및 IgG2b)가 될 수 있다. 특정 예에서, 본원에서 제공되는 항체는 IgG1 항체 또는 IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 다른 서브타입 유래 불변 영역을 추가적으로 더 포함하는 전장 항체일 수 있다. 예를 들면, 항-EGFR 항체는 카파 경쇄 불변 영역 (서열번호 31 또는 31로 기재) 또는 IgG1 중쇄 불변 영역 (서열번호 19-23 중 임의의 것 기재)를 포함하는 전장 IgG1 항체일 수 있다. 상기 중쇄 불변 영역은 또한 Ig 클래스 유래, 예컨대 IgG2(서열번호 24로 기재), IgG3(서열번호 25로 기재) 또는 IgG4(서열번호 26으로 기재)가 될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 또한 인간 람다 경쇄(서열번호 32로 기재)일 수 있다.
본원에서 제공되는 예시적인 인간화된 항-EGFR 항체들은 하기 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 것을 포함한다:
서열번호 59로 기재된 중쇄 또는 서열번호 59에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 181로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 181에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 129로 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 153로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 153에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 129로 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 160로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 160에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 135로 기재된 중쇄 또는 서열번호 135에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 153로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 153에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 129로 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 167로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 167에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 129로 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 174로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 174에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 129로 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 181로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 181에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 135로 기재된 중쇄 또는 서열번호 135에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 181로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 181에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 129로 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 188로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 188에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 141로 기재된 중쇄 또는 서열번호 141에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 181로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 181에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 147로 기재된 중쇄 또는 서열번호 147에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 195로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 195에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 141로 기재된 중쇄 또는 서열번호 141에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 195로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 195에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 147로 기재된 중쇄 또는 서열번호 147에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 202로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 202에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 141로 기재된 중쇄 또는 서열번호 141에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 202로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 202에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
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서열번호 215로 기재된 중쇄 또는 서열번호 215에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 251로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 251에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 221로 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 258로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 258에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 227로 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 258로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 258에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 233로 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 265로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 265에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 239로 기재된 중쇄 또는 서열번호 239에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 272로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 272에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 221로 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 272로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 272에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 227로 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 272로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 272에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 233로 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 279로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 279에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 245로 기재된 중쇄 또는 서열번호 245에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 279로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 279에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 221로 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 279로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 279에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 227로 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 279로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 279에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 233으로 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 286로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 286에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 245로 기재된 중쇄 또는 서열번호 245에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 286로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 286에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 221로 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 286으로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 286에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 227로 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 286으로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 286에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 233으로 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 293로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 293에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 245로 기재된 중쇄 또는 서열번호 245에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 300으로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 300에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 209로 기재된 중쇄 또는 서열번호 209에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 300으로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 300에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 209로 기재된 중쇄 또는 서열번호 209에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 279로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 279에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열;
서열번호 209로 기재된 중쇄 또는 서열번호 209에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열, 및 서열번호 286로 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 286에 대해 적어도 85 % 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 또한 항체 단편을 포함하고, 이는 전장 항체의 전체 서열보다 적은 서열을 포함하나, 적어도 전장 항체의 특이적 결합 능력의 부분은 유지하는, 예를 들면 중쇄 및 경쇄의 가변 부분인 전장 항체 유도체이다. 항체 단편은 또한 항체의 항원-결합 부분을 포함할 수 있고, 이는 부모 항체의 결합 친화도를 유지하기 위하여 항체 프레임워크에 삽입될 수 있다(예를 들어, 키메릭 항체). 항체 단편의 예시는 이에 제한되는 것은 아니나, Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 Fv (scFv), Fv, dsFv, 디아바디(diabody), Fd 및 Fd' 단편 및 변형된 단편을 포함하는 다른 단편(예를 들면, Methods in Molecular Biology, Vol. 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov 참조)을 포함한다. 항체 단편은 예컨대 이황화 가교에 의하여 서로 연결된 다중쇄를 포함할 수 있고, 재조합적으로 생산될 수 있다. 항체 단편들은 또한 두 개 또는 그 이상의 도메인을 연결하기 위한 합성 링커, 예컨대 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 항원-결합 단편을 제조하기 위한 방법은 당 분야에 잘 알려져 있으며 본원에서 제공되는 임의의 항체를 변형하기 위하여 사용될 수 있다. 항체 분자의 단편이, 예컨대 예를 들면 효소적 절단에 의하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 파파인에 의한 프로테아제 절단에 있어서, 중쇄 불변 영역, Fc 도메인의 이량체는 두 개의 Fab 영역(즉, 가변 영역을 포함하는 부분)으로부터 절단될 수 있다. 대체적으로, 펩신에 의한 프로테아제 절단이 항체의 이가 F(ab')2 의 단편을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
단일 쇄 항체는 특이적 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 결합에 의하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 가변 영역에 대한 특정 핵산 서열은 표준 분자 생물학적 방법, 예컨대 예를 들면 중합효소연쇄 반응(PCR) 및 다른 재조합 핵산 기술에 의하여 클로닝될 수 있다. scFvs 생산 방법이 예를 들면, Whitlow 및 Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird 외. (1988) Science 242:423-426; Pack 외. (1993) Bio/Technology 11:1271-77; 및 미국특허 4,946,778호, 5,840,300호, 5,667,988호, 5,658,727호, 5,258,498호)에 의하여 기술된다.
본원에서 제공되는 임의의 상기 인간화된 항-EGFR 항체, 또는 항원-결합 단편은 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하와 대비하여 산성 pH의 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM의 락테이트 농도를 포함하는 조건 하에 더 큰 결합 활성을 보이며, 이러한 결합 활성의 비율은 1.0 보다 큰, 예컨대 상기 본원에서 기술된 바와 같이 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0. 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0 또는 그 이상이다. 또한, 일반적으로, 상기 임의의 인간화된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 포유류 세포 내에서 생산될 때, 특히 비-인간화된 부모 항체와 비교하여 생산성에 뚜렷한 영향을 준다. 예를 들면, 상기 임의의 인간화된 항-EGFR 항체를 암호화하는 핵산(예를 들어, 표 10으로 기재되는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 것들)을 포함하는 포유류 숙주 세포는 적어도 약 1 mg/mL, 1.5 mg/mL, 2.0 mg/mL, 2.5 mg/mL, 3.0 mg/mL, 3.5 mg/mL, 4.0 mg/mL, 4.5 mg/mL, 5.0 mg/mL, 5.5 mg/mL, 6.0 mg/mL, 6.5 mg/mL, 7.0 mg/mL, 8.0 mg/mL, 9.0 mg/mL, 10.0 mg/mL 또는 그 이상을 초과하는 농도에서 항체의 발현에 영향을 줄 수 있다.
3. 104D 변형을 포함하는 항- EGFR 항체
서열번호 2 또는 7을 참고로 하여 항-EGFR 항체의 중쇄의 가변 도메인의 104 위치에 상응하는 위치에서 아스파르트산 (D)의 아미노산 치환(104D 지정)을 포함하는 변형된 항-EGFR 항체를 또한 본원에서 제공한다. 비변형된 항-EGFR 항체의 104 위치에 상응하는 위치는 서열번호 2 또는 7로 기재된 가변 중쇄로 가변 중쇄의 배열에 의해 결정될 수 있다(예를 들어 도 2 참조). 아스파르트 산으로 104 위치에서 글루탐산의 대체는 보존적 변이이다. 따라서, 본원에서 기술된 임의의 104 E 항체는 상응하는 104D 항-EGFR 항체를 제조하기 위해 보존적으로 변이될 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 104D 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체로 결합될 때 EGFR 항원 (예를 들어, 인간 EGFR), 또는 이의 가용성 단편에 결합하기 충분한 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 또는 이의 부분을 최소로 포함하여, 적어도 가변 중쇄는 104D를 가진 치환에 의해 변형된다. 생성된 변형된 항-EGFR 항체는 전장 IgG1 항체일 수 있고, 또는 이의 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, 단쇄 Fv (scFv), Fv, dsFv, diabody, Fd 및 Fd' 단편일 수 있다. 또한, 생성된 변형된 항-EGFR 항체는 IgG1이외의 다른 도메인을 포함할 수 있다.
104D 변형은 본원에서 기술되거나 당업계에 알려진 임의의 항-EGFR 항체 예컨대, 비변형된 항-EGFR 항체 (예를 들어 세툭시맙 항체), 이의 항원 결합 단편 또는 이의 변이체로 도입될 수 있다. 본원에서 아미노산 치환이 제조될 수 있는 예시적인 비변형된 항-EGFR 항체는 이에 제한되지 않지만, 서열번호 1, 2, 5, 6, 7, 12, 14 또는 16 중 어느 것으로 기재된 중쇄를 포함하는 항-EGFR 세툭시맙 항체, 또는 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 서열번호 1, 2, 5, 6, 7, 12, 14 또는 16 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 포함하는 항원 결합 단편 또는 이의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 비변형된 항-EGFR 항체는 서열번호 2로 기재된 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 4로 기재된 가변 경쇄(VL), 서열번호 7로 기재된 VH 및 서열번호 9로 기재된 VL, 서열번호 7로 기재된 VH 및 서열번호 11로 기재된 VL, 서열번호 14로 기재된 VH 및 서열번호 15로 기재된 VL, 또는 서열번호 16로 기재된 VH 및 서열번호 17로 기재된 VL을 포함하는 아미노산 서열, 또는 가변 중쇄 또는 경쇄 서열번호들의 하나 또는 둘에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄를 포함하는 변이체를 포함할 수 있다.
비변형된 항-EGFR 항체는 전장 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 예를 들어, 비변형된 항-EGFR 항체는 상기 임의의 VH 또는 VL 영역 및 서열번호 1로 기재된 중쇄 및 서열번호 3으로 기재된 경쇄, 서열번호 5로 기재된 중쇄 및 서열번호 3으로 기재된 경쇄, 서열번호 12로 기재된 중쇄 및 서열번호 13으로 기재된 경쇄, 서열번호 6으로 기재된 중쇄 및 서열번호 8으로 기재된 경쇄 또는 서열번호 6으로 기재된 중쇄 및 서열번호 10으로 기재된 경쇄를 포함하는 중쇄 및 경쇄의 불변 영역을 포함할 수 있고, 또한 중쇄 또는 경쇄 서열번호들 하나 또는 둘 다에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 전장 항원 결합 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 임의의 이러한 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 104 위치에 상응하는 위치에서 티로신(Y)가 D로 치환된 Y104D 아미노산 치환으로 가변 중쇄를 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 비변형된 항-EGFR 항체와 비교하여 가변 중쇄에서 오직 104D 아미노산 치환을 포함할 수 있고 또한 104D에 추가하여 중쇄 또는 경쇄의 하나 또는 모두에서 아미노산 치환 또는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 변형을 포함하지 않는 항-EGFR 항체와 대비하여 적어도 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상 변형된 위치를 포함할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄에서 예시적 추가적 변형은 상기 섹션 C.1(예를 들어, 표 6 및 8)에 기재된 것을 포함한다. 본원에서 제공되는 변형된 104D 항-EGFR 항체의 모든 예에서 변형된 항-EGFR 항체는 비변형된 항-EGFR 항체와 대비하여 104D 아미노산 치환을 포함하고, 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하와 대비하여 산성 pH의 6.0 내지 6.5 및/또는 10 mM 내지 20 mM의 락테이트 농도 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하에 더 큰 결합 활성을 보인다.
본원에서 제공되는 변형된 104D 항-EGFR 항체는 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하와 대비하여 산성 pH의 6.0 내지 6.5 및/또는 10 mM 내지 20 mM의 락테이트 농도 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하에 더 큰 결합 활성을 보인다. 예를 들어, 약 pH 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하의 결합활성에 대한 pH 6.0 내지 6.5 및/또는 10 mM 내지 20 mM의 락테이트 하의 결합 활성의 비율은 적어도 또는 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0 또는 그 이상 일 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 단백질의 생리적 농도(예를 들어, 25 % 혈청)의 존재하에 변경된 결합 활성을 보일 수있다. 그러므로, 본원에서 제공되는 104D 항체는 종양 선택적 EGFR 결합 활성을 보일 수 있어, 결합 활성은 비-종양 미세 환경 존재인 조건과 대비하여 종양 미세환경에서 존재하는 조건 하에 더 큰 결합활성이다.
본원에서 기술된 임의의 항체는 조합의 본원에서 제공되는 변이 항체 및 본원에서 제공되는 인간화된 항체를 포함하는 104D 대체를 포함할 수 있도록 변형될 수 있다. 비제한적 예시 104D 변형된 항-EGFR 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 하기 표 11에 기재된다. 또한 표 11에 기재된 중쇄 및/또는 경쇄의 어느 서열번호들에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항EGFR 항체는 생성된 항체가 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하와 대비하여 산성 pH의 6.0 내지 6.5 및/또는 10 mM 내지 20 mM의 락테이트 농도 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하에 더 큰 결합 활성을 보이는 한 본원에서 제공된다.
Figure pct00020
Figure pct00021
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4. 컨주게이트 (Conjugate)
또한 본원에서 제공되는 것은 하나 또는 그 이상의 표적 제제에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결되는 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체를 포함하는 컨주게이트이다. 이 컨주게이트는 다음의 구성요소를 포함한다: 항체(Ab), (링커(L))q, (표적 제제)m 및 식: Ab-(L)q-(표적 제제)m, 여기서 q는 0 또는 그 이상이고 m은 적어도 1임에 의해 나타내짐. 따라서, 본원에서 제공되는 컨주게이트는 본원에서 제공되는 변형된 항체에 공유적으로 연결되는 하나 또는 그 이상의 표적을 포함한다. 콘주게이트는 중성 pH 또는 약 7.4 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하와 대비하여 산성 pH의 6.0 내지 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM의 락테이트 농도 하나 또는 둘을 포함하는 조건 하에 EGFR 항원(예를 들어, 인간 EGFR) 또는 이의 가용성 단편에 대한 더 큰 결합 활성을 보인다.
따라서, 또한 항체-약물 컨주게이트(antibody-drug conjugate)(ADC) 또는 면역컨주게이트(immunoconjugate)로 지칭되는, 이러한 컨주게이트는, 세포독성(cytotoxic) 또는 세포증식억제(cytostatic) 제제, 즉, 암의 치료에서 EGFR을 발현하는 종양 세포를 살해하거나 억제하는 약물에 사용될 수 있다. 이러한 컨주게이트는 비-질병 세포에 대해 제거되는 것이 요구되는 종양 세포에 선택성을 나타내고, 그렇게 함으로써, 정상 세포에 수용할 수 없는 수준의 독성을 초래하지 않는다. 따라서, 컨주게이트는 최소 독성 및 감소된 부작용과 함께 최대 효과를 달성한다. 따라서, 이러한 화합물은 암 및 다른 질환 또는 장애의 진단 또는 치료의 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 표적 제제의 수는 변수 m에 의해 지정되고, 여기서 m은 1 이상의 정수이다. 표적 제제는 변수 q, 여기서 q는 0 또는 임의의 정수에 의해 지정되는 링커의 수에 의해 본원에서 제공되는 항체에 컨주게이션된다. 변수 q 및 m이 선택되어, 생성된 컨주게이트는 표적 세포의 EGFR, 특히, 종양 세포와 상호작용하고, 그리고 표적 제제는 표적 세포에 의해 내재화된다. 전형적으로, m은 1 내지 8 사이이다. 링커의 기능 및/또는 연결된 표적 및 표적 제제의 수에 따라, q는 0 또는 그 이상이다; q는 일반적으로 0 내지 4이다. 하나 이상의 표적 제제가 컨주게이트에 존재할 때 표적 제제는 동일하거나 상이할 수 있다.
표적 제제는 변형된 항-EGFR 항체에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 연관된 표적 제제의 내재화를 가져오도록 생성된 컨주게이트가 표적 세포의 EGFR와 상호작용하는 한 컨주게이트의 요소 중 임의의 적절한 연관(association)이 고려된다. 따라서, 본원에서 제공되는 컨주게이트가 융합단백질로 생산될 수 있거나, 화학적으로 커플링될 수 있거나, 또는 융합 단백질 부분 및 화학적으로 연결된 부분 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
표적 제제는 또한 그들이 링커 및/또는 변형된 항-EGFR 항체와의 컨주게이션(conjugation)을 위해 더욱 적절하게 하거나 또는 그들의 세포내 활성을 증가시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 표적 제제의 경우, 이러한 변형은 N-말단 또는 C-말단 근처에 Cys 잔기 도입, 표적제제의 카르복시-말단(예를 들어, Seetharam 외 (1991) J. Biol . Chem . 266:17376-17381; 및 Buchner 외 (1992) Anal. Biochem . 205:263-270 참조)에서의 반응기, 예컨대 티올(thiol)기를 도입하는 유도체화, 및/또는 정렬 신호의 첨가, 예컨대 (Xaa-Asp-Glu-Leu)n (서열목록에서열번호 350이 아닌) 여기서 Xaa는 Lys 또는 Arg, 바람직하게 Lys이고, 그리고 n은 1 내지 6, 바람직하게 1-3, 바람직하게, 소포체에 표적 제제를 지시하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 예에서, 표적 제제는 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 제거하기 위해, 예를 들어, 바람직한 위치에 더 많은 예측가능한 티올 컨주게이션을 제공하기 위해 변형될 수 있다. 변경을 원하지 않는 한, 생성된 변형된 표적 제제의 특이성을 변경하지 않도록 주의해야한다. 모든 경우에 있어서, 특정 변형이 경험적으로 결정될 수 있다.
링커, L이 공유 결합(들)을 통해 표적 제제에 항체를 붙인다. 링커는 펩티드 또는 비-펩티드일 수 있고 변형된 항-EGFR 항체에 표적 제제의 근접성에 의한 입체 장애를 개선시키거나 감소시키도록 그리고/또는 컨주게이트의 다른 성질, 예컨대 특이성, 독성, 가용성, 혈청 안정성 및/또는 표적 모이어티의 세포내 유효성(availability)을 증가시키거나 변경하도록 그리고/또는 항-EGFR 항체 및 표적 제제 사이의 연결의 유연성을 증가시키기 위해 선택될 수 있다.
융합 단백질을 고려할 때, 생성된 핵산 분자가 EGFR을 발현하는 종양 미세환경에서 세포에 의해 내재화하고 결합하는 융합 단백질을 암호화하고 내재화된 단백질의 모두 또는 부분이 세포질로 바람직하게 수송하도록 링커가 선택된다. 또한 여러 링커가 각각의 링커의 유리한 성질을 채택하기 위해 연결될 수 있는 것이 고려된다. 이러한 경우, 컨주게이트의 링커 부분은 50개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 생성된 융합 단백질이 세포질 및/또는 핵에 표적 제제를 수송하는 경로를 통해 연결된 표적 제제를 내재화하고 표적 세포의 EGFR에 결합하는 한 잔기의 수는 중요하지 않다.
표적 제제는 요구되는 종양 세포의 선택된 집단에 표적 제제를 전달하는 단백질, 펩티드, 핵산, 소분자, 치료 모이어티, 또는 다른 제제일 수 있다. 이러한 표적 제제는, 세포독성 제제, DNA 및 RNA 뉴클레아제, 독소, 약물 및 다른 제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 치료적 모이어티(therapeutic moiety)는 세포독성 모이어티, 방사성동위원소, 화학치료제, 용해성 펩티드 및 사이토카인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 치료적 모이어티는 탁솔(taxol); 사이토칼라신 B(cytochalasin B); 그래미시딘 D(gramicidin D); 에티디움 브로마이드(ethidium bromide); 에메틴(emetine); 마이토마이신(mitomycin); 에토포시드(etoposide); 테니포시드(teniposide); 빈크리스틴(vincristine); 빈브래스틴(vinblastine); 콜히친(colchicine); 독소루비신(doxorubicin); 다우노루비신(daunorubicin); 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione); 메이탄신(maytansine) 또는 이의 유사체 또는 유도체; 오스타틴(auristatin) 또는 이의 기능적 펩티드 유사체 또는 유도체; 돌라스타틴(dolastatin) 10 또는 15 또는 이의 유사체; 이리노테칸(irinotecan) 또는 이의 유사체; 미톡산트론(mitoxantrone); 미트라마이신(mithramycin); 악티노마이신 D(actinomycin D); 1-데하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone); 글루코코르티코이드(glucocorticoid); 프로카인(procaine); 테트라카인(tetracaine); 리도카인(lidocaine); 프로프라놀롤(propranolol); 퓨로마이신(puromycin); 칼리키아마이신(calicheamicin) 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항대사물질(antimetabolite); 알킬화제; 백금 유도체; 듀오카마이신 A(duocarmycin A), 듀오카마이신 SA(duocarmycin SA), 라첼마이신(rachelmycin)(CC-1065), 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항생제; 피롤로[2,l-c][l,4]-벤조디아제핀(pyrrolo[2,l-c][l,4]-benzodiazepine)(PDB); 독소; 리보뉴클레아제(RNase); DNase I, 스타필로코컬 장독소 A(Staphylococcal enterotoxin A); 및 자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
약물은 또한 이러한 방법에서 표적 제제로서 사용될 수 있다. 이러한 약물은 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 및 항생제, 예컨대 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 이다루비신(idarubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 미트라마이신(mithramycin), 마이토마이신(mitomycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 프리카마이신(plicamycin) 및 안트라마이신(anthramycin)(AMC), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin) 및 빈데신(vindesine)을 포함한다.
항체-독소 컨주게이트에서 사용되는 독소는 박테리아 독소 예컨대 디프테리아 독소, 및 이의 활성 단편 및 하이브리드(hybrid) 분자, 식물 독소, 예컨대 리신(ricin) 독소, 소분자 독소 예컨대 겔다마이신(geldanamycin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 예컨대 DM1, DM3 및 DM4, 및 칼리키아마이신(calicheamicin). 마지막으로, 오리스타틴(auristatin) 펩티드, 오리스타틴 E(auristatin E)(AE), 모노메틸오리스타틴(monomethylauristatin E)(MMAE), 및 모노메틸오리스타틴 F(monomethylauristatin F)(MMAF), 돌로스타틴(dolastatin) 합성 유사체가 사용될 수 있다. 다른 독소는 콜레라(cholera) 독소, 시가-유사(Shiga-like) 독소, LT 독소, C3 독소, 시가(Shiga) 독소, 백일해(pertussis) 독소, 파상풍(tetanus) 독소, 대두 보먼-버크 프로테아제(soybean Bowman-Birk protease) 억제제, 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin), 알로린(alorin), 사포린(saporin), 모데신(modeccin), 갈라닌(galanin), 아브린 A 쇄(abrin A chain), 모데신 A 쇄(modeccin A chain), 알파-사르신(alpha-sarcin), 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안신(dianthin) 단백질, 자리공과 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 커르신(curcin), 크로틴(crotin), 젤로닌(gelonin), 미토길린(mitogillin), 리스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 및 에노마이신(enomycin) 독소를 포함한다. 독소는 튜불린(tubulin) 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제(topoisomerase) 억제를 포함하는 메커니즘에 의해 그들의 세포독성 및 세포증식억제 활성을 나타낼 수 있다.
a. 표적 제제
표적 제제는 종양 세포의 선택된 집단에 표적된 전달이 필요한 단백질, 펩티드, 핵산, 소분자, 치료적 모이어티(moiety), 또는 다른 제제일 수 있다. 이러한 표적 제제는, 세포독성 제제, DNA 및 RNA 뉴클레아제, 독소, 약물 또는 다른 제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
i. 메이탄시노이드 약물 모이어티 ( Maytansinoid Drug Moieties)
컨주게이트에서 표적 제제로 세포독성 모이어티는 미국 특허 제8,142,784호에 기술된 메이탄시노이드 약물 모이어티를 포함한다. 메이탄신 화합물은 미세소관 단백질, 튜불린 집합의 억제를 통해 유사분열 동안 미세소관의 형성을 억제함으로써 세포 증식을 억제한다(Remillard 외 (1975) Science 189:1002-1005; 미국 특허 제5,208,020호). 메이탄신 및 메이탄신노이드는 매우 세포독성이지만 주로 종양에 대한 이들의 낮은 선택성에 의한 이들의 심각한 전신성 부작용에 의해 암 치료에서의 이들의 임상 사용이 매우 제한적이었다. 메이탄신의 임상 시험이 중추신경계 및 위장관계 상에 심각한 부작용으로 인해 중단되었다(Issell 외 (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199-207).
메이탄시노이드 약물 모이어티는 그들이 (i) 발효 또는 화학적 변형에 의해 발효 생성물의 유도체를 제조하는 것이 상대적으로 편하고, (ⅱ) 항체에 비-이황화 링커를 통해 컨주게이션에 적합한 관능기를 갖는 유도체화를 잘 받아들이고, (ⅲ) 혈장에서 안정하고, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 유효하기 때문에 항체-약물 컨주게이트에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드 약물 모이어티로 사용하기에 적합한 메이탄신 화합물이 당업계에 잘 알려져 있고, 공지된 방법에 따라 자연 기원으로부터 분리될 수 있고, 유전 공학 기술에 의해 생산될 수 있거나(Yu 외 (2002) PNAS 99:7968-7973 참조), 또는 메이탄신시놀 및 메이탄시놀 유사체가 공지된 방법에 따라 합성적으로 제조될 수 있다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 변형된 방향족 고리, 예컨대: C-19-디클로로(C-19-dechloro) (미국 특허 제4,256,746호) (안사미토신 P2(ansamitocin P2)의 리튬 알루미늄 수소화물 환원에 의해 제조됨); C-20-하이드록시(또는 C-20-디메틸)+/-C-19-디클로로(C-20-hydroxy(or C-20-demethyl)+/-C-19-dechloro)(미국 특허 제4,361,650호 및 제4,307,016호)(스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 액티노마이시즈(Actinomyces)를 사용하여 탈메틸화 또는 LAH를 사용하는 탈염소화에 의해 제조됨); 및 C-20-디메톡시, C-20-아실옥시(―OCOR), +/-디클로로(미국 특허 제4,294,757호)(아실 클로라이드를 이용하는 아셀화에 의해 제조됨); 및 다른 위치에 변형을 갖는 것을 포함한다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 변형을 갖는 것 예컨대: H2S 또는 P2S5으로 메이탄시놀의 반응에 의해 제조되는, C-9-SH, (미국 특허 제4,424,219호); C-14-알콕시메틸(디메톡시/CH2OR)(C-14-alkoxymethyl(demethoxy/CH2OR))(미국 특허 제4,331,598호); 노카르디아(Nocardia)로부터 제조되는 C-14-하이드록시메틸(C-14-hydroxymethyl) 또는 아실옥시메틸(acyloxymethyl)(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 제4,450,254호); 스트렙토마이세스(Streptomyces)에 의한 메이탄시놀의 변환에 의해 제조되는, C-15-하이드록시/아실옥시(C-15-hydroxy/acyloxy) (미국 특허 제4,364,866호); 트레위아 누디플로라(Trewia nudiflora)로부터 분리된, C-15-메톡시(C-15-methoxy)(미국 특허 제4,313,946호 및 미국 특허 제4,315,929호); 스트렙토마이세스(Streptomyces)에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조된, C-18-N-디메틸(C-18-N-demethyl)(미국 특허 제4,362,663호 및 미국 특허 제4,322,348); 및 메이탄시놀의 삼염화 티탄(titanium trichloride)/LAH 환원에 의해 제조되는, 4,5-디옥시(4,5-deoxy)(미국 특허 제4,371,533호)를 또한 포함한다.
메이탄신 화합물 상에 많은 위치가 링크의 유형에 따라, 연결(linkage) 위치로 유용한 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 에스테르 연결 형성에 대해, 하이드록시 기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록시기로 변형된 C-15 위치 및 하이드록시기를 갖는 C-20 위치가 모두 적합하다.
메이탄시노이드 약물 모이어티가 변형된 항-EGFR 항체에 직접 컨주게이션 또는 본원에서 제공되는 임의의 링커를 사용하여 연결될 수 있다. 특정 예에서, 세포독성 또는 약물 제제는 메르탄신(mertansine)이고, 또한 DM1 (N 2 '-디아세틸-N 2 '-(3-메르캅토-l-옥소프로필)-메이탄신)((N 2 '-deacetyl-N 2 '-(3-mercapto-l-oxopropyl)-maytansine))로 알려져 있다. 메르탄신은 4-메르캅토발레르산(4-mercaptovaleric acid)을 통해 연결될 수 있다. 엠타신(emtansine) 컨주게이트는 또한 링커 4-(3-메르캅토-2,5-디옥소-l-피롤리디닐메틸)-사이클로헥산카르복실산(4-(3-mercapto-2,5-dioxo-l-pyrrolidinylmethyl)-cylohexanecarboxylic acid)(MCC)을 사용하여 본원에서 항체와 함께 형성될 수 있다.
ii. 오리스타틴 및 돌라스타틴 약물 모이어티 ( Auristatins and Dolastatins Drug Moieties)
컨주게이트에서 표적 제제로 세포독성 모이어티는 미국 공개 특허 US2011/0217321호에 기술된 것들을 포함하는 오리스타틴(auristatin) 및 돌라스타틴(dolastatin)을 포함한다. 돌라스타틴 및 오리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하는 것으로 보고되었고(Woyke 외 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) 항암(미국 특허 제 5,663,149호) 및 항균(antifungal) 활성을 갖는 갖는다(Pettit 외 (1998) Antimicrob. Agents Chemother . 42:2961-2965). 또한, 오리스타틴은 매우 강력하고, 합성물질이며, 안정하고 그리고 링커 부착을 허용하는 화학적 변형을 잘 받아들인다(Senter (2009) Curr Opin Chem Biol 12:1-10).
오리스타틴이 합성물질이기 때문에, 내재된 구조적 변형이 부모(parent) 약물의 성질을 상당히 변경하도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 모노메틸오리스타틴 F (MMAF)는 아미노산 잔기 페닐알라닌로 종결되고, 이것은 세포 막 투과성을 손상시킨다(Doronina 외, (2006) Bioconjug Chem. 17:114-124). 따라서, ADC에 대한 MMAF의 컨주게이션은 항원-양성 세포에 의해 선택적인 약물 흡수를 용이하게 할 수 있다(Doronina 외, (2006) Bioconjug Chem . 17:114-124; Doronina 외, (2003) Nat Biotechnol. 21 :778-784).
돌라스타틴 또는 오리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C(카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다(WO 2002/088172). 예시적인 오리스타틴 구현예는 N-말단 및 C-말단 연결된 모노메틸오리스타틴 약물 모이어티 MMAE 및 MMAF을 포함한다(Senter 외 (2004) "Proceedings of the American Association for Cancer Research," Volume 45, Abstract Number 623, 및 2004년 3월 28일 제출됨; 미국 출원 공개번호 제2011/0020343호).
돌라스타틴 또는 오리스타틴은 직접 컨주게이션 또는 본원에서 제공된 임의의 링커를 사용하여 변형된 항-EGFR 항체에 연결될 수 있다. 특정 예에서, 돌라스타틴 또는 오리스타틴은 펩티드 링커, 예컨대 발린-시트룰린(valine-citrulline)(Val-Cit)으로 항-EGFR 항체에 연결될 수 있다.
ⅲ. 피롤로벤조디아제핀 ( PBDs )
컨주게이트로 표적 제제에 세포독성 모이어티는 상당한 항종양 특성을 가진 서열 선택적 DNA 알킬화제 항생제인 피롤로벤조디아제핀(PBDs) (또는 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀)을 포함한다. 피롤로벤조디아제핀은 DNA의 특정 서열을 인지하고 결합하고; 바람직한 DNA 서열은 PuGPu (퓨린-구아닌-퓨린)이다. 피롤로벤조디아제핀은 또한 PuGPy (퓨린-구아닌-피리미딘) 또는 PyGPu 서열, 바람직하게 PyGPy 서열에 대해 결합할 수 있다.
피롤로벤조디아제핀은 자연 발생하거나 합성할 수 있다. 자연적으로 발생하는 피롤로벤조디아제핀은 아베이마이신 (abbeymycin) (Hochlowski, 외., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), 안트라마이신 (anthramycin) (Leimgruber, 외., J. Am. Chem. Soc, 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, 외., J. Am. Chem. Soc, 87, 5791 -5793 (1965)), 치카마이신(chicamycin) (Konishi, 외., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (Thurston, 외., Chem. Brit, 26, 767-772 (1990); Bose, 외., Tetrahedron, 48, 751 -758 (1992)), 마제트라마이신(mazethramycin) (Kuminoto, 외., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), 네오트라마이신(neothramycins) A 및 B (Takeuchi, 외., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), 포로트라마이신(porothramycin) (Tsunakawa, 외., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), 프로트라카르신(prothracarcin) (Shimizu, 외, J. Antibiotics, 29, 2492- 2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), 시바노미신(sibanomicin) (DC- 102)(Hara, 외., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, 외., J. Antibiotics, 41, 1281 -1284 (1988)), 시비로마이신(sibiromycin) (Leber, 외., J. Am. Chem. Soc, 110, 2992-2993 (1988)), 및 토마마이신(tomamycin) (Arima, 외., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972))를 포함한다. 피롤로벤조디아제핀의 합성 및 합성 유사체의 생성은 또한 기술되어 있다(예를 들어, 미국 특허번호 제6,562,806호, 제6,608,192호, 제6,747,144호, 및 제7,049,311호, 제7,528,126호 참조).
피롤로벤조디아제핀은 화학식 Ⅰ의 일반적 구조이다 :
Figure pct00023
피롤로벤조디아제핀은 치환기의 숫자, 종류 및 위치, 이들의 방향족 A 고리 및 피롤로 C 고리 모두, 및 C 고리의 포화의 정도에서 다르다. B-고리에서, 알킬화 DNA를 담당하는 전자성 중심인 N10-C11에서 이민 (N=C), 카비놀아민(NH-CH(OH)), 또는 카비놀아민 메틸 에테르(NH-CH(OMe)) 중 하나가 있다. 모든 알려진 천연 생성물은 A 고리에 대해 C 고리로부터 볼 때 오른 방향으로 회전으로 그들을 제공하는 키랄 C11 위치에서 (S)-형태(configuration)을 가진다. 이는 B-형태 DNA의 작은 홈으로 이소헬리시티(isohelicity)에 대한 적절한 3차원 구조를 그들에게 준다(Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). 피롤로벤조디아제핀은 DNA 프로세싱 간섭과 세포 주기 어레스트 및 세포 사멸을 이끄는 PDB/DNA 부가물을 형성하는, PuGPU 콘센서스(consensus) 서열에서 구아닌의 고리외 N2로 공유, 아미날 결합을 형성한다. 그러므로, 피롤로벤조디아제핀은 효과적인 항종양 제제이다.
피롤로벤조디아제핀의 이량체는 효과적인 항종양 제제이다. 피롤로벤조디아제핀 이량체는 피롤로벤조디아제핀 단량체에 의해 포함되는 3개 염기 쌍을 대신하여 6개 염기쌍을 포함한다. 또한 이량체에서 피롤로벤조디아제핀은 서열 선택적 DNA 가교를 이끄는 DNA의 상보적 가닥 (즉, 쇄간 구아닌-구아닌 교차 연관)에서 서열을 결합하게 할 수 있다. 피롤로벤조디아제핀 이량체 유도 교차 연관은 가닥 분리를 방지하여, DNA 복제를 방지한다. 이는 G2/M 인터페이스에서 세포 주기 어레스트 및 세포 사멸을 초래한다. DNA 교차 연관에 더하여 피롤로벤조디아제핀 단량체와 대비하여 피롤로벤조디아제핀 이량체 증가된 범위는 항종양 제제로 상당히 증진된 효능을 이끈다.
피롤로벤조디아제핀 이량체는 동종 이량체 또는 이종 이량체일 수 있고, 유연한 링커를 통해 그들의 C8 위치를 통해 함께 두 단량체 피롤로벤조디아제핀를 연결함으로써 합성될 수 있다. 일반적으로 사용되는 링커는 프로필디옥시 (PBD-C8-O-(CH2)3-O-C8'-PBD') 및 펜틸디옥시 (PBD-C8-O-(CH2)5-O-C8'-PBD')를 포함한다. 링커의 특성은 예컨대 링커의 길이는 특이적 DNA 서열에 대한 이량체 표적을 위해 선택될 수 있다. (Rahman 외., (2011) Nucleic Acids Res. 39(13): 5800-5812 및 Gregson 외., (2004) J Med Chem 47:1161-1174). 예시적 피롤로벤조디아제핀 간 링커는 Bose 외., (1992) J Am Chem Soc . 114:4939-4941, Bose 외., (1992) J Chem Soc Chem Commun . 14:1518-1520, Thurston 외., (1996) J Org Chem. 61:8141-8147, Gregson 외., (2001) J Med Chem. 44:737-738, 및 Gregson 외., J Med Chem 2004;47:1161-1174에 기재되어 있다. 예시적인 피롤로벤조디아제핀 이량체는 당업계에 기술되어 있고 (예를 들어, 미국 특허번호 제6,562,806호, 제6,608,192호, 제6,747,144호, 제7,049,311호, 제7,528,126호, 제7,741,319호, 제8,592,576호) 이에 제한되지 않으나, DSB-120 (미국 특허번호 제7,049,311호), DRH-165 (미국 특허번호 제7,049,311호), ELB21 (Rahman 외 (2011) Nucleic Acids Res. 39(13): 5800-5812), SG2000/SJG136 (Rahman 외 (2011) Nucleic Acids Res. 39(13): 5800-5812; 미국 특허번호 제7,049,311호), SG2057/DRG16 (Rahman 외 (2011) Nucleic Acids Res. 39(13): 5800-5812), SG2202 (미국 특허번호 제7,741,319호; Hartley 외 (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858), SG2285 (Hartley 외 (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858), SG3132 (미국 공개 특허 제2013-0028919호)에 지정된 화합물을 포함한다.
피롤로벤조디아제핀 및 피롤로벤조디아제핀 이량체는 이에 제한되지 않지만 티올, 아민 및 페놀 컨주게이션을 포함하는 임의의 방법에 의해 본원에서 제공되는 임의의 항체에 대해 컨주게이트될 수 있다. 일반적으로 피롤로벤조디아제핀 또는 피롤로벤조디아제핀 이량체는 in vivo 순환에서 안전한 절단 가능한 링커를 사용하여 항체에 컨주게이트되고, 이러한 피롤로벤조디아제핀 또는 피롤로벤조디아제핀 이량체는 표적 세포 내부에서 링커의 절단에 이어 항체로부터 방출된다. 일부 예에서, 피롤로벤조디아제핀 또는 피롤로벤조디아제핀 이량체는 쇄간 시스테인으로 컨주게이트될 수 있다. 일부 예에서, 항체는 피롤로벤조디아제핀 또는 피롤로벤조디아제핀 이량체의 직접적인 티올 결합을 촉진하기 위한 쇄간 시스테인을 삽입 또는 제거하기 위한 아미노산 치환을 위해 변형될 수 있다.
ⅳ. 세포 독소 모이어티
상기 방법 및 조성물에 사용하기 위한 적합한 세포 독소는 소분자, 예컨대 DNA 절단 제제, 및 박테리아, 균류(fungal), 식물, 곤충, 뱀 및 거미 독을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 단백질성 세포 독소를 포함한다. 본원에서 제공되는 컨주게이트(Conjugate)에 혼합(incorporation)을 위해 고려되는 예시적인 세포 독소가 표 12에 기재된다.
표 12: 독소의 예시적인 아미노산 서열
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(a) DNA 절단 제제(DNA cleaving agents)
상기 방법의 실행에서 사용되는 키메라 리간드-독소 내에 세포 독소로서 포함(inclusion)하기 위해 적합한 DNA 절단 제제의 예시는, 안트라퀴논-올리고피롤-카르복스아미드(anthraquinone-oligopyrrol-carboxamide), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 레이나마이신(leinamycin); 디네마이신 A(dynemycin A); 엔다이인(enediyne); 뿐만 아니라 이의 생물학적 활성 유사체 또는 유도체(즉, 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖는 것)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 공지된 유사체 및 유도체가 예를 들어, Islam 외, J. Med . Chem . 34 2954-61, 1991; Skibo 외, J. Med . Chem . 57:78-92, 1994; Behroozi 외, Biochemistry 35:1768-74, 1996; Helissey 외, Anticancer Drug Des. 11:527-51, 1996; Unno 외, Chem . Pharm . Bull. 45:125-33, 1997; Unno 외, Bioorg . Med . Chem ., 5:903-19, 1997; Unno 외, Bioorg. Med . Chem ., 5:883-901, 1997; 및 Xu 외, Biochemistry 37: 1890-7, 1998)에 개시된다. 다른 예시는, 엔디인 퀴논 이민(endiyne quinone imine)(미국 특허 제5,622,958호); 2,2r-비스(2-아미노에틸)-4-4'-바이티아졸(2,2r-bis(2-aminoethyl)-4-4'-bithiazole)(Lee 외, Biochem . Mol Biol . Int . 40:151-7, 1996); 에립티신-살렌.구리 컨주게이트(epilliticine-salen.copper conjugate)(Routier 외, Bioconjug . Chem ., 8:789-92, 1997)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
(b) 항대사물질 ( Antimetabolites )
키메라 리간드-독소 내에 세포 독소로서 포함(inclusion)하기 위하여 유용한 항대사물질의 예시는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate), 멜팔란(melphalan), 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 질소 머스타드(nitrogen mustard) 및 마이토마이신 c(mitomycin c)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
(c) 단백질성 세포 독소(Proteinaceous cell toxins)
상기 방법에서 사용되는 키메라 리간드-독소로 혼합(incorporation)에 유용한 단백질성 세포 독소의 예시는, 유형 1 및 유형 2 리보좀 불활성 단백질(ribosome inactivating protein)(RIP)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 유용한 유형 1 식물 RIP는 다이안틴 30(dianthin 30), 다이안틴 32, 라이크닌(lychnin), 사포린(saporin) 1-9, 자리공 활성화 단백질(pokeweed activated protein)(PAP), PAP Ⅱ, PAP-R, PAP-S, PAP-C, 마팔민(mapalmin), 도데칸드린(dodecandrin), 브리오딘-L(bryodin-L), 브리오딘, 콜리신(Colicin) 1 및 2, 러핀(luffin)-A, 러핀-B, 러핀-S, 19K- 단백질 합성 억제성 단백질(protein synthesis inhibitory protein)(PSI), 15-PSI, 9K-PSI, 알파-키리로윈(alpha-kirilowin), 베타-키리로윈, 게로닌(gelonin), 모모르딘(momordin), 모모르딘-Ⅱ, 모모르딘-Ic, MAP-30, 알파-모모찰린(alpha-momorcharin), 베타-모모찰린(beta-momorcharin), 트리코산틴(trichosanthin), TAP -29, 트리코키린(trichokirin); 보리(barley) RIP; 플랙스(flax) RIP, 트리틴(tritin), 콘(corn) RIP, 아스피린(Asparin) 1 및 2를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 유용한 유형 2 RIP는, 볼켄신(volkensin), 리신(ricin), 니그린-b(nigrin-b), CIP-29, 아브린(abrin), 모데신(modeccin), 에부리틴-α(ebulitin-α), 에부리틴-β, 에부리틴-γ, 비르쿠민(vircumin), 포렉틴(porrectin)뿐만 아니라, 이의 생물학적 활성 효소 서브유닛을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Stirpe 외, Bio/Technology 70:405-12, 1992; Pastan 외, Annu . Rev. Biochem. 61:331-54; Brinkmann 및 Pastan, Biochim . et Biophys. Acta 1198:21-45, 1994; 및 Sandvig 및 Van Deurs, Physiol . Rev. 75:949-66, 1996).
(d) 박테리아 독소(Bacterial toxins)
세포 독소로서 유용한 박테리아의 독소의 예시는, 시가(shiga) 독소 및 시가-유사 독소(즉, 동일한 활성 또는 구조를 갖는 독소)뿐만 아니라, 촉매적 서브유닛 및 이의 생물학적 기능적 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 박테리아 독소는 또한 유형 2 RIPs (Sandvig 및 Van Deurs, Physiol . Rev. 76:949-66, 1996; Armstrong, J. Infect. Dis ., 777:1042-5, 1995; Kim 외, Microbiol . Immunol. 47:805-8, 1997, 및 Skinner 외, Microb . Pathog . 24:117-22, 1998)이다. 유용한 박테리아 독소의 추가적 예시는, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 및 디프테리아(Diphtheria) 독소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Pastan 외, Annu. Rev. Biochem. 67:331-54; 및 Brinkmann 및 Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:21 AS, 1994). 독소 효소 서브유닛의 잘린 형태 및 돌연변이는 또한 세포 독소 모이어티로 사용될 수 있다(Pastan 외, Annu . Rev. Biochem . 67:331-54; Brinkmann 및 Pastan, Biochim . et Biophys . Acta 1198:21 AS, 1994; Mesri 외, J. Biol. Chem . 265:4852-62, 1993; Skinner 외, Microb . Pathog . 24:111-22, 1998; 및 미국 특허 제5,082,927호). 다른 표적 제제는 콜리신(colicin) A, B, D, El-9, 클로아신(cloacin) DF13 및 균류(fungal) RNase, α-사르신(α-sarcin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Ogawa 외 Science 283: 2097-100, 1999; Smarda 외, Folia Microbiol ( Praha ) 43:563-82, 1998; Wool 외, Trends Biochem . Sci., 17: 266-69, 1992).
(e) 포르피린 및 다른 광 활성 독소( Porphyrins and other light activated toxins)
포르피린은 단백질에 쉽게 가교-결합(cross-linked) 될 수 있는 광 활성화 독소로 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,257,970호, 제5,252,720호; 제5,238,940호; 제5,192,788호; 제5,171,749호; 제5,149,708호; 제5,202,317호; 제5,217,966호; 제5,053,423호; 제5,109,016호; 제5,087,636호; 제5,028,594호; 제5,093,349호; 제4,968,715호; 제4,920,143호 및 국제특허 공개공보 WO93/02192 참조).
v. 표적화된 전달을 위한 핵산(Nucleic acids for targeted delivery)
본원에서 제공되는 컨주게이트는 또한 표적 세포로 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 핵산은 세포의 게놈을 변형하고, 그렇게 함으로써 유전적 치료를 가져오는 DNA, 및 안티센스 제제로서 사용을 위한 DNA 및 RNA를 포함한다. 핵산은 안티센스 제제로 사용되기 위한 안티센스 RNA, DNA, 리보자임 및 다른 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 핵산은 또한 RNA 수송 신호(trafficking signal), 예컨대 바이러스성 패키징 서열(packaging sequence)을 포함한다(예를 들어, Sullenger 외 (1994) Science 262: 1566-1569 참조). 핵산은 또한 본래(intact) 유전자를 암호화 또는 유전자 치료에 사용되기 위한 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함한다.
유전자 치료를 행하도록 세포로 전달될 수 있는 DNA (또는 RNA)는, 결함 유전자를 치환하도록, 종양-특이적 세포독성 분자, 예컨대 종양 괴사 인자, 바이러스 항원 및 세포가 항암 제제에 민감하도록 하는 다른 단백질을 암호화하는 DNA, 및 유전자, 예컨대 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)과 관련된 결함 유전자(CFTR)를 암호화하는 DNA를 포함한다(예를 들어, 국제출원 WO 93/03709; 및 Riordan 외 (1989) Science 245:1066-1073 참조)
본원에서 기술된 바와 같은 사용을 위한 핵산 및 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다(예를 들어, WO 93/01286; 미국 특허 제5,218,088호; 제5,175,269호; 및 제5,109,124호 참조). 안티센스 제제로 사용을 위한 올리고뉴클레오티드 및 리보자임에 대한 확인은 당 기술분야의 기술 내에 있다. 유전자 치료를 위한 표적 전달을 위한 DNA 암호화 유전자의 선택은 또한 당 기술분야의 기술 수준 내에 있다. 예를 들어, 이러한 올리고뉴클레오티드의 바람직한 성질, 길이 및 그의 특징이 잘 알려져 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 내인성 핵산분해 효소에 의한 분해에 저항하도록 설계되고, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate), 설폰(sulfone), 설페이트(sulfate), 케틸(ketyl), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스페이트 에스테르(phosphate ester), 및 기타 이러한 연결을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.(예를 들어, Agrawal 외 (1987) Tetrahedron Lett . 25:3539-3542; Miller 외 (1971) J. Am. Chem . Soc . 93:6657-6665; Stec 외 (1985) Tetrahedron Lett. 25:2191-2194; Moody 외 (1989) Nucl . Acids Res. 17:4769-4782; Letsinger 외 (1984) Tetrahedron 40:137-143; Eckstein (1985) Annu . Rev. Biochem . 54:367-402; Eckstein (1989) Trends Biol . Sci . 14:97-100; Stein (1989) In: Oligodeoxynucleotides . Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, ed, Macmillan Press, London, pp.97-117; Jager 외 (1988) Biochemistry 27:7237-7246 참조).
(a) 다음을 포함하는, 안티센스 뉴클레오티드: 안티센스 올리고뉴클레오티드; 삼중 분자; 덤벨 올리고뉴클레오티드; DNA; 세포외 단백질 결합 올리고뉴클레오티드; 및 작은 뉴클레오티드 분자
안티센스 뉴클레오티드는 상보적 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드이고, 그렇게 함으로써, mRNA의 번역을 방지한다(예를 들어, Altman 외의 미국 특허 제5,168,053호, Inouye의 미국 특허 제5,190,931호, Burch의 미국 특허 제5,135,917호; Smith의 미국 특허 제5,087,617호 및 덤벨(dumbbell) 안티센스 올리고뉴클레오티드를 기술하는, Clusel 외 (1993) Nucl . Acids Res. 27:3405-3411 참조). 삼중(Triplex) 분자는 이중체(duplex) DNA를 표적으로 하는 단일 DNA 가닥을 말하고 그렇게 함으로써 전사를 방지한다(예를 들어, 이중 DNA 상 표적 부위에 결합하는 합성 올리고뉴클레오티드를 만드는 방법을 기술한 미국 특허 제5,176,996호 참조).
(b) 리보자임 ( Ribozymes )
리보자임은 메신저(messenger) RNA를 특이적으로 절단(cleavage)하는 RNA 구축물(construct)이다. RNA 쇄(chain)의 절단 및/또는 연결(ligation)에 관련된 것으로 알려진 적어도 5개 클래스의 리보자임이 있다. 리보자임은 임의의 RNA 전사체를 표적으로 할 수 있고 이러한 전사체를 촉매적으로 절단할 수 있다(예를 들어, 리보자임 및 이의 생산 방법을 기술하는, 미국 특허 제5,272,262호; 제5,144,019호; 제5,168,053호, 제5,180,818호, 제5,116,742호 및 제5,093,246호 참조). 임의의 이러한 리보솜이 산성 환경 하에서 EGFR를 갖는 세포로 전달을 위해 조건부 활성 항-EGFR 항체에 연결될 수 있다.
리보자임은 핵으로 도입 시 리보자임이 직접 전사되도록, 진행세포 프로모터, 예컨대 진핵세포 바이러스 프로모터, 일반적으로 후기(late) 프로모터에 연결된 리보자임을 암호화하는 DNA로서 표적화 세포로 전달될 수 있다. 이러한 예에서, 구축물은 핵으로 연결된 핵산의 전달을 적절하게 하도록 하기 위하여, 일반적으로 표적 제제의 부분 또는 링커의 부분으로 핵 전좌 서열(nuclear translocation sequence)을 또한 포함할 수 있다.
(c) 표적 전달을 위한 치료적 산물을 암호화하는 핵산
사용을 위해 고려되는 치료적 생산적절한 사본(copy)의 항암제, 예컨대 종양 괴사인자를 암호화하는 DNA 및 EGFR 관련 종양 세포에 대한 세포독성 제제, 예컨대 시가(shiga A1) 독소 또는 사포린이 있다. 컨주게이트는 핵 전좌 서열(nuclear translocation sequence)(NTS)을 포함해야 한다. 컨주게이트가 표적 제제 및 연결되는 DNA가 세포질에서 잘리도록 설계된다면, 그뒤에 NTS는 내재화시, 컨주게이트가 핵으로 수송되도록, DNA에 결합되어 남는 링커의 부분에 포함되어야 한다. 핵 전좌 서열(NTS)은 이종성(heterologous) 서열일 수 있거나 또는 선택되는 케모카인(chemokine) 수용체 표적 제제로부터 유래될 수 있다. 전형적인 공통(consensus) NTS 서열은 7개 내지 9개 아미노산의 배열에서 아미노-말단 프롤린 또는 글리신 뒤에 적어도 세개의 염기성 잔기를 포함한다(예를 들어, Dang 외 (1989) J. Biol . Chem. 264:18019-18023 참조).
(d) 단백질에 대한 핵산의 커플링(Coupling of nucleic acids to proteins)
본원에서 화학적 컨주게이션을 가져오기 위해, 표적 제제는 직접 또는 하나 또는 그 이상의 링커에 의해 핵산에 연결되어 있다. 5' 말단, 3' 말단 및 그밖에, 단백질에서 아미노 및 카르복실 말단 및 다른 부위로 핵산을 컨주게이션하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다(검토를 위해 예를 들어, Goodchild, (1993) In: Perspectives in Bioconjugate Chemistry, Mears, Ed., American Chemical Society, Washington, D.C. pp.77-99 참조). 예를 들어, 단백질은 자외선 조사(Sperling 외 (1978) Nucleic Acids Res. 5:2755-2773; Fiser 외 (1975) FEBS Lett. 52:281-283), 이기능성 화합물(Baumert 외 (1978) Eur . J. Biochem. 89:353-359; 및 Oste 외 (1979) Mol . Gen. Genet. 168:81-86), 및 광화학적 교차-결합(photochemical cross-linking)(Vanin 외 (1981) FEBS Lett. 124:89-92; Rinke 외 (1980) J. Mol . Biol . 137:301-314; Millon 외 (1980) Eur . J. Biochem . 110:485-454)을 사용하여 핵산에 연결될 수 있다.
특히, 시약 (N-아세틸-N'-(p-글리옥시릴벤조일)시스타민)(N-acetyl-N'-(p-glyoxylylbenzolyl)cystamine)) 및 2-이미노티올란(2-iminothiolane)은 혼합된 이황화(disulfide) 형성을 통해 단백질, 예컨대 α2마크로글로불린(α2macroglobulin)(α2M)에 DNA를 커플링하는데 사용된다(Cheng 외 (1983) Nucleic Acids Res. 11:659-669 참조). N-아세틸-N'-(p-글리옥시릴벤조일)시스타민은 짝지어지지 않은(non-paired) 구아닌 잔기와 특이적으로 반응하고, 환원시, 자유 설프히드릴(sulfhydryl)기를 생성한다. 2-이미노티올란은 설프히드릴기를 생성하는 단백질과 반응하고 그리고 나서 분자간 이황화 교환 반응에 의해 유도된 DNA에 컨주게이션된다. 임의의 연결이 컨주게이트의 내재화시, 표적화 핵산이 활성인 경우 사용될 수 있다. 따라서, 비록 임의의 시약, 예컨대 핵으로 전달을 위해 프로모터에 연결된 리보자임을 암호화하는 DNA 또는 치료제를 암호화하는 DNA에 대해, 이러한 절단이 필요하지 않는 것으로 생각되는 경우라도, 연결의 절단이 필요할 수 있는 것으로 예상된다.
티올(thiol) 연결은 헤테로이기능성(heterobifunctional) 시약을 사용하여 쉽게 형성될 수 있다. 아민은 또한 핵산과 수용성 카르보디이미드(carbodiimide), 예컨대 1-에틸-3'[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드(1-ethyl-3'[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide)(EDC) 또는 N-에틸-N'(3-디메틸아미노프로필카르보디이미드히드로클로라이드(N-ethyl-N'(3-dimethylaminopropylcarbodiimidehydrochloride)(EDCI)의 반응에 의해, pH 6의 이미다졸 완충액에서, 5'포스포리미다졸라이드(5'phosphorimidazolide)을 생성하는, 수용액에서 비보호된 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 말단 5' 인산에 부착될 수 있다. 5'포스포리미다졸라이드의 아민-포함 분자 및 에틸렌디아민(ethylenediamine)과의 접촉은, 안정한 포스포라미데이트(phosphoramidate)를 야기한다(예를 들어, Chu 외 (1983) Nucleic Acids Res. 11:6513-6529; 및 WO 88/05077 참조). 특히, DNA의 용액은 EDC로 pH 6에서 포화되고, 4 ℃에서 하룻밤 교반 배양되었다. 생성된 용액은 그리고 나서 예를 들어 100 mM 시트레이트(citrate) 완충액의 약 3배 부피의 첨가, 및 케모카인(chemokine) 수용체 표적 제제의 약 5 ㎍ 내지 약 20 ㎍의 첨가, 및 생성된 혼합물의 4℃에서 약 48시간 동안 교반에 의해 pH 8.5로 완충되었다. 비반응 단백질은 예를 들어, 용출 완충액(eluting buffer)로 0.1 M 암모늄 카보네이트(ammonium carbonate) 용액, pH 7.0을 사용하는, 세파덱스(SEPHADEX) G75 (파마시아(Pharmacia))를 사용하여, 컬럼 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 제거될 수 있다. 분리된 컨주게이트는 사용할 때까지 동결건조되고 저장될 수 있다.
미국 특허 제5,237,016호는 그들의 5'말단이 브롬아세틸화되는(bromacetylated) 뉴클레오티드를 제조하고 생성된 올리고뉴클레오티드와 티올(thiol)기가 반응하는 방법을 제공한다. 미국 특허 제5,237,016호에 기술된 바와 같이 그들의 5'-말단이 브롬아세틸기로 유도체화된 올리고뉴클레오티드는 5'-아미노헥실-포스포라미데이트(5'-aminohexyl-phosphoramidate) 올리고뉴클레오티드와 브로모아세트산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(bromoacetic acid-N-hydroxysuccinimide ester)의 반응에 의해 제조될 수 있다. 미국 특허 제5,237,016호는 또한 선택된 성장 인자상의 티올기와 반응될 수 있는, 티올-유도체화 뉴클레오티드를 제조하는 방법을 기술한다. 간단히, 티올-유도체화 뉴클레오티드는 2 단계의 5'-인산화 뉴클레오티드를 사용하여 제조된다: (1) 하나의 단계에서 디이미드(diimide) 존재 하에서 이미다졸(imidazole)과 포스페이트(phosphate)기의 반응 및 이미다졸 이탈기를 시스타민(cystamine)으로 치환; 및 (2) 시스타민 링커의 이황화 결합의 디티오트레이톨(dithiothreitol)로의 환원(또한, 유사한 공정을 기술하는, Chu 외 (1988) Nucl . Acids Res. 16:5671-5691 참조). 5'-인산화된 시작 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, Maniatis 외(1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, p. 122 참조).
안티센스 올리고머 또는 핵산, 예컨대 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드(methylphosphonate oligonucleotide)(MP-올리고머)는, SPDP 또는 SMPB와의 반응에 의해 유도체화될 수 있다. 생성된 MP-올리고머는 HPLC에 의해 정제될 수 있고 그리고 나서 케모카인 수용체 표적 제제와 커플링될 수 있다. MP-올리고머(약 0.1 μM)가 약 40-50 ㎕의 1:1 아세토니트릴(acetonitrile)/물에 용해되고 이것은 포스페이트 완충액(pH 7.5, 최종 농도 0.1 M)이고 약 1ml 포스페이트 완충 식염수에 1 mg MP-올리고머가 첨가된다. 상기 반응은 실온에서 약 5-10 시간 동안 진행이 허용되고 그리고나서 약 15 μL 0.1 아이오도아세트아미드(iodoacetamide)로 반응이 종결된다. 컨주게이트는 헤파린 세파로스(sepharose) Hi 트랩(Trap) 컬럼(1 ml, 파마시아(Pharmacia)) 상에서 정제될 수 있고, 선형 또는 단계 구배로 용출될 수 있다. 컨주게이트는 0.6 M NaCl에서 용출되어야 한다.
b. 링커(linker)
링커, L은, 항체를 표적제에 공유 결합(들)을 통해 부착시킨다. 링커는 이기능성(bifunctional) 또는 다기능성(multifunctional) 모이어티이고 하나 또는 그 이상의 표적제(들)을 항-EGFR 항체에 연결하여 항체-약물 컨쥬게이트(antibody-drug conjugate)(ADC)를 형성하도록 사용될 수 있다. ADC는 표적제 및 항-EGFR 항체에 결합하기 위한 반응성 기능성(functionality)을 갖는 링커를 사용하여 쉽게 제조될 수 있다. 항-EGFR 항체의 시스테인 티올기, 또는 아민기, 예를 들어 N-말단 또는 라이신(lysine) 측쇄는 링커 시약, 표적제 또는 표적제-링커 시약의 작용기(functional group)와 결합을 형성할 수 있다.
링커는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)가 안정하고 그대로 남아있도록, 즉, 항체가 표적 세포로 수송 또는 전달 전에, 표적제에 연결되어 남아있도록, 세포외 환경에서 안정한 것이 바람직하다. 따라서, 링커는 표적 세포 밖에서 안정하고 일단 세포 내 어떤 효과적인 비율에서 항체 및 표적제를 해리할 수 있게 하거나 절단될 수 있다. 고려되는 링커는 (i) 항체의 특이적 결합 성질을 방해하지 않고; (ⅱ) 컨쥬게이트 또는 표적제의 세포내 전달을 허용하고; (ⅲ) 안정적이고 그대로 유지되고, 즉, 컨쥬게이트가 그의 표적화 부위로 전달되거나 수송될 때까지, 절단되지 않고, 그리고 (iv) 표적제의 세포독성, 세포-살해(cell-killing) 효과 또는 세포분열억제(cytostatic) 효과를 방해하지 않을 것이다. ADC의 안정성은 표준 분석 기술 예컨대 질량 분석법 및/또는 HPLC에 의해 측정될 수 있다.
링커는 항체 및 표적제 둘 다에 공유적 부착을 허용하는 두 개의 반응성 작용기를 갖고, 따라서 반응성 의미에서 2가(bivalency)를 나타낸다. 두 개 또는 그 이상의 기능성 또는 생물학적 활성 모이어티, 예컨대 펩티드, 핵산, 약물, 독소, 항체, 합텐(hapten), 및 리포터 기의 부착에 유용한, 이러한 화학적 교차-결합 시약이 공지되어 있고, 컨쥬게이트를 생성하는 데 그들을 사용하기 위한 방법이 기술되어 있다(Hermanson, G.T.(1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p234-242).
일부 예에서, 링커는 항체에 존재하는 친전자성기에 반응하는 친핵성기를 갖는 반응성 작용기를 갖는다. 항체에 유용한 친전자성기는 알데히드 및 케톤 카보닐기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 링커의 친핵성기의 헤테로 원자는 항체의 친전자성기와 반응하고 항체 유닛에 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커 상에 유용한 친핵성기는, 히드라지드(hydrazide), 옥심(oxime), 아미노, 히드라진(hydrazine), 티오세미카바존(thiosemicarbazone), 히드라진 카복실레이트(hydrazine carboxylate), 및 아릴히드라지드(arylhydrazide)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체 상에 친전자성기는 링커에 부착을 위한 편리한 부위를 제공한다.
i. 펩티드 링커
링커는 하나 또는 그 이상의 아미노산 유닛을 포함하는 펩티드일 수 있다. 펩티드 링커 시약은 자동 합성기 예컨대 레이닌 심포니 펩티드 합성기(Rainin Symphony Peptide Synthesizer)(프로테인 테크놀로지 주식회사(Protein Technologies, Inc.), 또는 모델 433(어플라이드 바이오시스템즈((Applied Biosystems))에, t-BOC 화학(Geiser 외 거대분자 시퀀싱 및 합성에서 "고체-상 펩티드 합성의 자동화"("Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis), Alan R. Liss, Inc., 1988, pp. 199-218) 및 Fmoc/HBTU 화학(Fields, G. 및 Noble, R. (1990) "9-플루오레닐메톡시카보닐 아미노산을 사용하는 고체상 펩티드 합성"("Solid phase peptide synthesis utilizing 9- fluorenylmethoxycarbonyl amino acids"), Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214)을 포함하는, 펩티드 화학 분야에 잘 알려진, 고체상 또는 액체상 합성 방법 (E. Schroder 및 K. Lubke, The Peptides, volume 1, pp 76-136 (1965) Academic Press)에 의해 제조될 수 있다. 단백질분해는 효소적이고, 상기 효소가 종양 세포 내 우선적 발현을 위해 선택될 수 있으므로, 펩티드-기반(Peptide-based) 링커는, 가수분해 또는 환원되기 쉬운 링커에 대해 장점을 제공한다. 카텝신(cathepsin) B-절단성(cleavable) 펩티드 링커, 발린-시트룰린(valine-citrulline)(Val-Cit), 및 이의 변형 예컨대 말레이미도카프로일-발린-시트룰린(maleimidocaproyl-valine-citrulline)(mc-vc), 페닐알라닌-라이신(phenylalanine-lysine), Ala-Leu-Ala-Ala (서열번호: 351), 다른 트리/테트라펩티드(tri/tetrapeptide)는 ADC에서 사용되는 예시적인 펩티드 링커이다(Dosio 외, (2010) Toxins 3:848-883; Doronina 외, (2006) Bioconjug Chem . 17:114-124; Doronina 외 , (2003) Nat Biotechnol . 21:778-784; Sanderson 외 , (2005) Clin Cancer Res 11:843-852; Durcy 및 Stump (2010) Bioconjub Chem . 21:5-13). 예시적인 비-절단성(non-cleavable) 펩티드 링커는 N-메틸-발린-시트룰린(N-methyl-valine-citrulline)을 포함한다. 다른 펩티드 링커는 미국 출원 공개번호 제2011/0020343호에 기술된다.
바람직한 펩티드 링커는 융합 단백질에 포함될 수 있고 숙주 세포, 예컨대 E. coli에 발현되는 것이다. 이러한 링커는 다음을 포함한다: 효소 기질, 예컨대 카텝신 B 기질, 카텝신 D 기질, 트립신 기질, 트롬빈 기질, 서브틸리신(subtilisin) 기질, 인자 Xa 기질, 엔테로키나아제(enterokinase) 기질; 가용성, 가요성, 및/또는 세포내 절단성(cleavability)을 증가시키는 링커; 예컨대 (glymser)n 및 (sermgly)n , 여기서 m은 1 내지 6, 바람직하게 1 내지 4, 더욱 바람직하게 2 내지 4이고, n은 1 내지 6, 바람직하게 1 내지 4, 더욱 바람직하게 2 내지 4인 링커를 포함한다(예를 들어, 컨쥬게이트에서 사용을 위한 예시적인 링커를 제공하는, 국제 PCT 출원 공개번호 WO 96/06641 참조). 일부 구현예에서, 여러 링커가 각각의 링커의 바람직한 성질을 활용하기 위해 포함될 수 있다.
ⅱ. 화학적 링커
ADC는 또한 비-절단성(non-cleavable) 모이어티 또는 화학적 교차-결합(cross-linking) 시약인 링커를 사용하여 제조될 수 있다. 예시적인 비-절단성 링커는 아마이드 링커 및 숙시네이트 스페이서(succinate spacer)를 갖는 아마이드 및 에스테르의 연결을 포함한다(Dosio 외, (2010) Toxins 3:848-883). 예시적인 화학적 교차-결합 링커는, SMCC(숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate)) 및 SIAB(숙신이미딜 (4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(Succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. SMCC는 중간-길이 사이클로헥산-안정화 스페이서 팔의 다른편 말단에 NHS-에스테르 및 말레이미드 반응성기를 포함하는 아민-대-설프히드릴(amine-to-sulfhydryl) 가교제(crosslinker)이다. SIAB는 아민-대-설프히드릴 컨쥬게이션을 위한 짧은, NHS-에스테르 및 아이오도아세틸(iodoacetyl) 가교제이다. 다른 예시적인 교차-결합 시약은 상업적으로 이용가능한(피얼스 바이오테크놀로지 주식회사)(Pierce Biotechnology, Inc.)), 티오에테르(thioether) 링커, 화학적으로 불안정한 하이드라존(hydrazone) 링커, 4-머캅토발레르산(4-mercaptovaleric acid), BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SMPB, SMPH, 설포(sulfo)-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)(succinimidyl-(4-vinylsulfone)benzoate)), 및 비스-말레이미드(bis-maleimide) 시약, 예컨대 DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)3, 및 BM(PEO)4를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 비스-말레이미드 시약은 순차적 또는 동시 방식으로, 항체의 시스테인 잔기의 자유 티올(thiol)기를 티올을 함유하는 표적제, 또는 링커 중간체에 부착하는 것을 허용한다. 말레이미드(maleimide) 이외의 다른 티올-반응성 작용기는, 아이오도아세트아미드(iodoacetamide), 브로모아세트아미드(bromoacetamide), 비닐 피리딘(vinyl pyridine), 디설파이드(disulfide), 피리딜 디설파이드(pyridyl disulfide), 이소시아네이트(isocyanate), 및 이소티오시아네이트(isothiocyanate)를 포함한다. 다른 예시적인 링커 및 사용방법이 미국 출원 공개번호 제2005/0276812호 및 Durcy 및 Stump (2010) Bioconjug Chem. 21:5-13에 기술된다.
링커는 선택적으로 용해성이나 반응성을 조절하는 기(group)로 치환될 수 있다. 예를 들어, 설포네이트(sulfonate) 치환체는 ADC를 제조하는데 사용되는 합성 경로에 따라, 시약의 수가용성을 증가시키고 항체 또는 약물 모이어티와 링커 시약의 커플링 반응을 용이하게 하거나, 또는 표적제와 항-EGFR Ab-L, 또는 항-EGFR Ab와 표적제-L의 커플링 반응을 용이하게 할 수 있다.
다른 링커 시약은 또한 상업적 출처, 예컨대 분자 생명과학 주식회사(Molecular Biosciences Inc.)(볼더, 콜로라도주 (Boulder, Colo.))를 통해 얻어지거나, Toki 외 (2002) J. Org . Chem . 67:1866-1872; 미국 특허번호 제6,214,345호; WO 02/088172; U.S.2003130189; U.S.2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; 및 WO 04/032828에 기술된 공정에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 링커 시약 예컨대 DOTA-말레이미드(maleimid)(4-말레이미도부틸람이미도벤질-DOTA)((4-maleimidobutyramidobenzyl-DOTA))는 Axworthy 외 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807)의 공정에 따라, 이소프로필클로로포르메이트(isopropylchloroformate))(알드리치(Aldrich))로 활성화되는 4-말레이미도부틸산(4-maleimidobutyric acid))(플루카(Fluka))과 아미노벤질-DOTA(aminobenzyl-DOTA)의 반응에 의해 제조될 수 있다. DOTA-말레이미드 시약은 시스테인 조작된 항체의 자유 시스테인 아미노산과 반응하고 항체 상에 금속 착물 리간드를 제공한다(Lewis 외 (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). 킬레이트화 링커 라벨 시약, 예컨대 DOTA-NHS (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-l,4,7,10-테트라아세트산 모노 (N-하이드록시숙신이미드 에스테르)(l,4,7,10-tetraacetic acid mono (N-hydroxysuccinimide ester))이 상업적으로 사용가능하다(매크로시클릭스, 달라스, 텍사스(Macrocyclics, Dallas, Tex.)).
링커는 하나 이상의 약물 모이어티를 분지한, 다기능성 링커 모이어티를 통해 항체에 공유적 결합하기 위한 수지상 형태(dendritic type) 링커, 다기능성 링커일 수 있다(Sun 외 (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun 외 (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King 외 (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). 수지상 링커는 항체에 표적제의 몰 비율, 즉 ADC의 효능을 증가시킬 수 있는 로딩(loading)을 증가시킬 수 있다. 따라서, 항체가 단지 하나의 반응성 시스테인 티올기를 갖는 곳에서, 다수의 약물 모이어티가 수지상 링커를 통해 부착될 수 있다. 예시적인 수지상 링커 시약이 미국 특허 공개번호 제2005/0276812호에 기술된다.
c. 예시적인 컨쥬게이트
또한 본원에서 제공되는 것은 오리스타틴 또는 메이탄시노이드인 세포독성 모이어티에 직접적 또는 간접적으로 연결된 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체 중 임의의 것을 함유하는 Y104E- 및 Y104D-항-EGFR 항체 컨쥬게이트이다. 이 항체 컨쥬게이트는 다음의 식(formula)을 갖는다: (Ab), (L)q, 및 (표적제)m, 여기에서 항체(Ab)는 Y104E- 또는 Y104D-항-EGFR 항체 또는 EGFR에 결합하는 이의 항원-결합 단편이고; L은 표적제에 Ab를 연결하기 위한 링커이며; 표적제는 오리스타틴 또는 메이탄시노이드이고, m은 적어도 1이고; q는 야기되는 컨쥬게이트가 EGFR에 결합하는 이상 0 또는 그 이상이다. 일부 예에서, m은 1 내지 8이고 q는 0 내지 8이다. 전형적으로, 컨쥬게이트 내의 구성요소의 방향은 Ab-[(L)q-(표적제)m]인데, 여기에서 Ab는 표적제, 즉 오리스타틴 또는 메이탄시노이드에 링커를 통하여 간접적으로 연결된다. 일반적으로 m 및 q는 각각 독립적으로 2 내지 6이다. 특정 예에서, m 및 q는 동일하고, 이 경우 야기되는 컨쥬게이트는 식 Ab-[(L)-(표적제)]p을 갖는데, 여기에서 p는 2 내지 6, 예를 들어 일반적으로 적어도 또는 약 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
ⅰ. 항-EGFR 항체-오리스타틴 컨쥬게이트
본원에서 오리스타틴 세포독성 모이어티에 직접적 또는 간접적으로 연결된 본원에서 제공되는 임의의 항-EGFR 항체를 함유하는 Y104E- 및 Y104D-항-EGFR 항체 컨쥬게이트인 항체 컨쥬게이트들이 제공된다. 이러한 예에서, 항체 컨쥬게이트는 식 (Ab), (L)q, 및 (오리스타틴)m을 갖고, 여기에서 항체 (Ab)는 변이체 Y104E- 또는 Y104D-항-EGFR 항체 또는 EGFR에 결합하는 이의 항원-결합 단편이고, L은 Ab를 오리스타틴에 연결하기 위한 링커이고, m은 적어도 1(예컨대 m은 1 내지 8)이고 q는 야기되는 컨쥬게이트가 EGFR에 결합하는 한 0 또는 그 이상(예컨대 0 내지 8)이다. 전형적으로, 컨쥬게이트 내 구성요소의 방향은 Ab-[(L)q-(오리스타틴),,,]인데, 여기에서 Ab는 링커를 통해 오리스타틴에 간접적으로 연결된다. 특정 예에서, m 및 q는 동일하고, 이 경우 야기되는 컨쥬게이트는 식 Ab-[(L)-(오리스타틴)]p을 갖는데, 여기에서 p는 2 내지 6, 예컨대 일반적으로 적어도 또는 약 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
상기 예에서, 항체 구성요소는 임의의 본원에서 기술되는 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 될 수 있다. 일 예에서, 상기 항체 구성요소는 상기 서브섹션 C.1 및 C.2에 기재된 임의의 것과 같은, Y104E-변이체 항체가 될 수 있다. 특히, 본원에서 제공되는 오리스타틴-함유 컨쥬게이트 내에서 Y104E-변이체 항-EGFR 항체의 예는 서열번호 72로 기재되는 중쇄 및 서열번호 8로 기재되는 경쇄를 함유하는 항체, 또는 서열번호 72의 아미노산 1-119(즉, 서열번호 74로 기재됨)에 상응하는 가변 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 1-107(즉, 서열번호 9로 기재됨)에 상응하는 가변 경쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내고 가변 중쇄에서 아미노산 치환 Y104E를 함유하는 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 부분을 함유하는 항체, 또는 이의 인간화된 형태이다. 예를 들어, 오리스타틴-함유 컨쥬게이트 내에서 Y104E-변이체 항-EGFR 항체는 표 7, 9 또는 표 10에 기재된 임의의 것과 같은 본원에서 제공되는 변이체 Y104E 항체를 함유하거나, 각각의 중쇄의 아미노산 1-119에 상응하는 가변 중쇄 및 각각의 경쇄의 아미노산 1-107에 상응하는 가변 경쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편이다. 예로써, 오리스타틴-함유 컨쥬게이트 내에서 Y104E-변이체 항-EGFR 항체는 서열번호 59로 기재되는 중쇄 및 서열번호 181로 기재되는 경쇄를 함유하는 E-h로 명명된 인간화된 Y104E 항체, 또는 서열번호 59의 아미노산 1-119에 상응하는 가변 중쇄 및 서열번호 181의 아미노산 1-107에 상응하는 가변 경쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편이다. 항체 구성요소는 전장 항체 또는 항원-결합 단편, 예컨대 Fab, Fab´, F(ab´)2, 단일쇄 Fv(scFv), Fv, dsFv, 이중체(diabody), Fd 및 Fd´ 단편이 될 수 있다.
다른 예에서, 항체 구성요소는 Y104D-변이체 항체, 예를 들어 서브섹션 C.3에 기재된 임의의 것과 같은 Y104D-변이체 항체가 될 수 있다. 특히, 본원에서 제공되는 오리스타틴-함유 컨쥬게이트 내의 Y104D-변이체 항-EGFR 항체의 예는 서열번호 67로 기재되는 중쇄 및 서열번호 8로 기재되는 경쇄를 함유하는 항체, 또는 서열번호 67의 아미노산 1-119에 상응하는 가변 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 1-107에 상응하는 가변 경쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내고 가변 중쇄 내에 아미노산 치환 Y104D를 함유하는 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 부분을 함유하는 항체, 또는 이의 인간화된 형태이다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 예시적인 오리스타틴-함유 컨쥬게이트 내의 Y104D-변이체 항-EGFR 항체는 표 11에 기재된 임의의 것이거나, 또는 각각의 중쇄의 아미노산 1-119에 상응하는 가변 중쇄 및 각각의 경쇄의 아미노산 1-107에 상응하는 가변 경쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편이다. 일 예로서, 오리스타틴-함유 컨쥬게이트 내의 Y104D-변이체 항-EGFR 항체는 서열번호 57로 기재되는 중쇄 및 서열번호 181로 기재되는 경쇄를 함유하는 D-h로 명명된 인간화된 Y104D 항체를 함유하고, 또는 서열번호 57의 아미노산 1-119에 상응하는 가변 중쇄 및 서열번호 181의 아미노산 1-107에 상응하는 가변 경쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편이다. 항체 구성요소는 전장 항체 또는 이의 항원 결합 단편인데, 예를 들어 Fab, Fab´, F(ab´)2, 단일쇄 Fv(scFv), Fv, dsFv, 이중체(diabody), Fd 및 Fd´ 단편이다.
컨쥬게이트 내의 오리스타틴은 서브섹션 C.4.a.ii에 기술된 임의의 것을 포함하는, 당업계에 알려져 기술된 임의의 것일 수 있다. 또한 PCT 출원 WO2012-054748호 및 미국 특허 출원 US2011/0020343에 공개된 것을 참조하라. 일 예에서, 오리스타틴은 하기 구조를 갖는 MMAE 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
Figure pct00025
또 다른 예에서, 오리스타틴은 하기 구조를 갖는 MMAF 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
Figure pct00026
임의의 이러한 예에서, 링커는 서브섹션 C.4.b에 기술된 임의의 링커가 될 수 있다. 전형적으로, 링커는 항체의 설프히드릴 기(sulfydryl group)와 반응할 수 있는 링커이다. 링커는 식 Aa-Yy-Zz-Xx 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이며, 여기에서 A는 항체의 설프히드릴 기와 반응할 수 있는 브릿지 유닛(bridge unit)이고; a는 0 또는 1이고; Y 및 Z는 각각 독립적으로 아미노산 유닛이고; y 및 z는 각각 독립적으로 0 내지 12 범위의 정수이고; X는 스페이서 유닛(Spacer unit)이고; 및 X는 0, 1 또는 2이다.
이러한 예에서, 브릿지 유닛은 항체를, 만약 있다면, 아미노산 Y 또는 W에, 그리고 만약 있다면, 스페이서 유닛 X에, 또는 표적제에 연결할 수 있다. 이러한 예에서, 항체의 설프히드릴 기는 브릿지 유닛과 반응할 수 있는 작용기이다. 일 예에서, 설프히드릴 기는 항체의 분자내 이황화 결합(disulfide bond)의 환원에 의해 생성될 수 있다. 디설파이드는, 예를 들어 디티오트레이톨(dithiothreitol), 머캅토에탄올(mercaptoethanol), 또는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine)으로, 표준 방법을 사용하여 환원될 수 있다. 다른 예에서, 설프히드릴 기는 2-이미노티올란(2-iminothiolane)(트라우트 시약(Traut's reagent)) 또는 기타 설프히드릴 생성 시약과 항체의 라이신(lysine) 모이어티의 아미노기의 반응에 의해 생성될 수 있다. 항체의 황 원자와 결합을 형성할 수 있는 반응성 링커는 당업계에 알려져 있다(예컨대 국제 PCT 국제 공개 WO2012/054748 및 WO/2005/007197 참조).
일 예에서, 브릿지 유닛의 기능성 또는 반응성 모이어티는 티올 기에 대하여 광범위하게 선택적인 것들을 포함하는데, 예를 들어 아이오도세타마이드(iodocetamide), 말레이미드(maleimide), 비닐설폰(vinylsulfone), 비닐 피리딘(vinyl pyridine) 및 아크릴레이트(acrylate) 및 메타크릴레이트 에스터(methacrylate ester)가 있다. 이러한 티올 선택적 컨쥬게이션 모이어티는 단일 티오에스터 컨쥬게이트 결합을 항체와 생산할 수 있다. 예를 들어, 가교는 말레이미드인 반응성 기를 함유할 수 있다. 특정 예에서, 브릿지 유닛은 말레이미도카프로일(maleimidocaproyl, MC) 또는 말레이미도프로파노일(maleimidopropanoyl, MP)이다. b. 예를 들어, 가교는 함유한다
다른 예에서, 브릿지 유닛의 반응성 모이어티는 항체의 교차쇄(interchain) 이황화 결합을 유지하는 이기능성 링커(bifunctional linker)이다. 예를 들어, 브릿지 유닛은 미국 특허출원 US2013/0224228에 기술된 이기능성 피롤-2,5-디온-(pyrrole-2,5-dione-) 및 피롤리딘-2,5-디온-(pyrrolidine-2,5-dione-) 기반 링커를 함유할 수 있다. 이러한 예에서, 2개의 시스테인(cysteine)과 이기능성 링커의 반응은 2개의 티오에스터 결합을 통해 연결된 디설파이드를 통해 하나의 링커와 "스테이플된" 디티오숙신이미드(dithiosuccineimide) 또는 디티오말레이미드(dithiomaleimide) 항체 컨쥬게이트를 제공한다. 다른 예에서, 이기능성 링커는 국제 PCT 출원 WO2005/007197호에 기술된 것과 같은 비스-티올 알킬화 시약(bis-thiol alkylating reagent)이 될 수 있다. 비스-티올 알킬화 시약은 환원된 디설파이드로부터 유래된 시스테인 티올 둘 다를 연결하기 위해 비스-알킬화를 거칠 수 있다. 일단 형성되면, 시약은 상호작용하는 미카엘(Michael) 및 역-미카엘 반응을 거쳐 3-탄소 가교를 건너 2개의 자유 티올이 재-아닐링(re-anneal)될 수 있는 것으로 형성되도록 할 수 있다. 일 예에서, 비스-티올 알킬화 시약은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00027
여기에서, (CH2CH2O)n은 친수성 PEG 스페이서이다. 예를 들어, 비스-티올 알킬화 시약은 하기 구조를 갖는 4-(3-토실-2-(토실메틸)프로파노일)벤즈아미드-PEG(4-(3-tosyl-2-(tosylmethyl)propanoyl)benzamide-PEG)이 될 수 있다.
Figure pct00028
오리스타틴-기반 컨쥬게이트의 임의의 예에서, 각각 독립적으로 존재하는 경우, 아미노산 Y 및 Z는, 천연 또는 비-천연 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 각각 독립적으로 존재하는 경우, Y 및 Z는 알라닌(alanine), 발린(valine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan) 또는 프롤린(proline)인 아미노산이 될 수 있다. Y-Z는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드 또는 그 이상 유닛의 펩티드인 아미노산 유닛을 대표할 수 있다. 아미노산 유닛은 암 또는 종양-관련 프로테아제를 포함하는 1 또는 그 이상의 효소에 의해 효소적으로 절단되어 표적제를 해방시킬 수 있는 아미노산 유닛이 될 수 있다. 예를 들어, Y는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린인 아미노산이 될 수 있고, Z는 라이신, 아세틸 또는 포르밀(formyl)로 보호된 라이신, 아르기닌(argine), 토실(tosyl) 또는 니트로(nitro) 기로 보호된 아르기닌, 히스티딘(histidine), 오르니틴(ornithine), 아세틸 또는 포르밀로 보호된 오르니틴 또는 시트룰린(citrulline)이 될 수 있다. 특정 예에서, Y-Z는 페닐알라닌-라이신, 발린-시트룰린 또는 발린-라이신이다.
링커에서, X는 스페이서 유닛이다. 스페이서 유닛은 비-자기-희생적(non-self immolative) 또는 자기-희생적일 수 있다. 비-자기 희생적 스페이서 유닛은 스페이서 유닛의 일부 또는 전부가 항체 약물 컨쥬게이트로부터 절단, 예를 들어 아미노산 유닛 Y-Z의 효소적 절단 후에 표적제에 결합된 채로 남아있다. 비-자기-희생적 스페이서 유닛의 예는 (글리신-글리신) 스페이서 유닛 및 글리신 스페이서 유닛을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 스페이서 유닛(-X-)는 -Gly-이다. 다른 예에서, 스페이서 유닛 (-X-)는 -Gly-Gly-이다. 다른 사례에서, 스페이서 유닛은 2개의 서로 떨어진 화학적 모이어티를 안정한 3구성(tripartite) 분자로 함께 공유적으로 연결할 수 있는 이기능성 화학적 모이어티이다. 이는 제1 모이어티에 대한 그것의 결합이 절단되는 경우 제2 모이어티로부터 자연적으로 분리될 것이다. 예를 들어, 스페이서 유닛 (-X)는 p-아미노벤질 알코올(p-aminobenzyl alcohol, PAB)이다. 스페이서 유닛(-X-)은 또한 PAB와 전자적으로 유사한 방향성 화합물일 수 있는데, 예를 들어 2-아미노이미다졸-5-메탄올(2-aminoimidazole-5-methanol) 유도체(Hay 외, (1999) Bioorg . Med . Chem . Lett . 9:2237) 및 오르토(ortho) 또는 파라(para)-아미노벤질아세탈(aminobenzylacetal)이다. 스페이서는 아미노 결합 가수분해에 있어서 고리화(cyclization)를 거치는데 사용될 수 있는데, 예를 들어 치환된 또는 비치환된 4-아미노부티르산 아미드(4-aminobutyric acid amide)(Rodrigues 외 (1995) Chemistry Biology 2:223), 적절히 치환된 바이사이클로[2.2.1](bicyclo[2.2.1]) 및 바이사이클로(bicyclo[2.2.2]) 고리 시스템(Storm et. al (1972). Amer . Chem . Soc . 94:5815) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드(2-aminophenylpropionic acid amide)(Amsberry et. al (1990) Org . Chem . 55:5867)에 사용될 수 있다. 특히, 스페이서는 하기 구조를 갖는 p-아미노 벤질을 함유한다.
Figure pct00029
본원에서 제공되는 컨쥬게이트의 특정 예에서, 링커 L은 6-말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카보닐(6-maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl, MC-vc-PAB) 또는 4-(3-토실-2-(토실메틸)프로파노일)벤즈아미드-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카보닐(4-(3-tosyl-2-(tosylmethyl)propanoyl)benzamide -valine-citruline-p-aminobenzyloxycarbonyl)이다.
일 예에서, 본원에서 제공되는 Y104D- 또는 Y104E-변이체 항-EGFR 항체 컨쥬게이트 중에는 표적제가 MMAF이고 L-(표적제)가 하기 구조를 갖는 컨쥬게이트가 있다:
Figure pct00030
다른 예에서, 본원에서 제공되는 Y104D- 또는 Y104E-변이체 항-EGFR 항체 컨쥬게이트 중에는 표적제가 MMAE이고 L-(표적제)가 하기 구조를 갖는 컨쥬게이트가 있다.
Figure pct00031
추가적인 예에서, 본원에서 제공되는 Y104D- 또는 Y104E-변이체 항-EGFR 항체 컨쥬게이트 중에는 표적제가 MMAE이고 L-(표적제)가 하기 구조를 갖는 컨쥬게이트가 있다:
Figure pct00032
임의의 이러한 예에서, m 및 q는 동일하고 컨쥬게이트는 식 Ab-[(L)-(표적제)]p를 갖는다. 예를 들어, p는 2 내지 6, 예컨대 일반적으로 약 또는 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6이 될 수 있다. 최종 컨쥬게이트는 항체 당 2 내지 6 오리스타틴(예컨대 MMAE 또는 MMAF) 분자, 예컨대 일반적으로 약 또는 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개를 함유한다.
ⅱ. 항-EGFR 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트
본원에서 메이탄시노이드 세포독성 모이어티에 직접적 또는 간접적으로 연결된 본원에서 제공되는 임의의 항-EGFR 항체를 함유하는 Y104E- 및 Y104D-항-EGFR 항체 컨쥬게이트인 항체 컨쥬게이트들이 제공된다. 이러한 예에서, 항체 컨쥬게이트는 식 (Ab), (L)q, 및 (메이탄시노이드)m을 갖고, 여기에서 항체 (Ab)는 변이체 Y104E- 또는 Y104D-항-EGFR 항체 또는 EGFR에 결합하는 이의 항원-결합 단편이고, L은 Ab를 메이탄시노이드에 연결하기 위한 링커이고, m은 적어도 1(예컨대 m은 1 내지 8)이고 q는 야기되는 컨쥬게이트가 EGFR에 결합하는 한 0 또는 그 이상(예컨대 0 내지 8)이다. 전형적으로, 컨쥬게이트 내 구성요소의 방향은 Ab-[(L)q-(메이탄시노이드),,,]인데, 여기에서 Ab는 링커를 통해 메이탄시노이드 제에 간접적으로 연결된다. 특정 예에서, m 및 q는 동일하고, 이 경우 야기되는 컨쥬게이트는 식 Ab-[(L)-(메이탄시노이드)]p인데, 여기에서 p는 2 내지 6, 예컨대 일반적으로 적어도 또는 약 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
상기 예에서, 항체 구성요소는 임의의 본원에서 기술되는 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 될 수 있다. 일 예에서, 상기 항체 구성요소는 상기 서브섹션 C.1 및 C.2에 기재된 임의의 것과 같은, Y104E-변이체 항체가 될 수 있다. 특히, 본원에서 제공되는 메이탄시노이드-함유 컨쥬게이트 내에서 Y104E-변이체 항-EGFR 항체의 예는 서열번호 72로 기재되는 중쇄 및 서열번호 8로 기재되는 경쇄를 함유하는 항체, 또는 서열번호 72의 아미노산 1-119(즉, 서열번호 74로 기재됨)에 상응하는 가변 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 1-107(즉, 서열번호 9로 기재됨)에 상응하는 가변 경쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 81%＞, 82%＞, 83%＞, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내고 가변 중쇄에서 아미노산 치환 Y104E를 함유하는 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 부분을 함유하는 항체, 또는 이의 인간화된 형태이다. 예를 들어, 메이탄시노이드-함유 컨쥬게이트 내에서 Y104E-변이체 항-EGFR 항체는 표 7, 9 또는 표 10에 기재된 임의의 것과 같은 본원에서 제공되는 변이체 Y104E 항체를 함유하거나, 각각의 중쇄의 아미노산 1-119에 상응하는 가변 중쇄 및 각각의 경쇄의 아미노산 1-107에 상응하는 가변 경쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편이다. 일 예로서, 메이탄시노이드-함유 컨쥬게이트 내에서 Y104E-변이체 항-EGFR 항체는 서열번호 59로 기재되는 중쇄 및 서열번호 181로 기재되는 경쇄를 함유하는 E-h로 명명된 인간화된 Y104E 항체, 또는 서열번호 59의 아미노산 1-119에 상응하는 가변 중쇄 및 서열번호 181의 아미노산 1-107에 상응하는 가변 경쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편이다. 항체 구성요소는 전장 항체 또는 항원-결합 단편, 예컨대 Fab, Fab´, F(ab´)2, 단일쇄 Fv(scFv), Fv, dsFv, 이중체(diabody), Fd 및 Fd´ 단편이 될 수 있다.
다른 예에서, 항체 구성요소는 Y104D-변이체 항체, 예를 들어 서브섹션 C.3에 기재된 임의의 것과 같은 Y104D-변이체 항체가 될 수 있다. 특히, 본원에서 제공되는 메이탄시노이드-함유 컨쥬게이트 내의 Y104D-변이체 항-EGFR 항체의 예는 서열번호 67로 기재되는 중쇄 및 서열번호 8로 기재되는 경쇄, 또는 서열번호 67의 아미노산 1-119에 상응하는 가변 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 1-107에 상응하는 가변 경쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편, 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 함유하고, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내고 가변 중쇄 내에 아미노산 치환 Y104D를 함유하는 이의 부분을 함유하는 항체, 또는 이의 인간화된 형태이다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 예시적인 메이탄시노이드-함유 컨쥬게이트 내의 Y104D-변이체 항-EGFR 항체는 표 11에 기재된 임의의 것이거나, 또는 각각의 중쇄의 아미노산 1-119에 상응하는 가변 중쇄 및 각각의 경쇄의 아미노산 1-107에 상응하는 가변 경쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편이다. 일 예로서, 메이탄시노이드-함유 컨쥬게이트 내의 Y104D-변이체 항-EGFR 항체는 서열번호 57로 기재되는 중쇄 및 서열번호 181로 기재되는 경쇄를 함유하는 D-h로 명명된 인간화된 Y104D 항체를 함유하고, 또는 서열번호 57의 아미노산 1-119에 상응하는 가변 중쇄 및 서열번호 181의 아미노산 1-107에 상응하는 가변 중쇄를 함유하는 이의 항원-결합 단편이다. 항체 구성요소는 전장 항체 또는 이의 항원 결합 단편인데, 예를 들어 Fab, Fab´, F(ab´)2, 단일쇄 Fv(scFv), Fv, dsFv, 이중체(diabody), Fd 및 Fd´ 단편이다.
컨쥬게이트 내의 메이탄시노이드는 서브섹션 CAa.i에 기술된 임의의 것을 포함하는, 당업계에 알려져 기술된 임의의 것일 수 있다. 또한 미국 특허번호 제7,097,840; EP1928503호를 참조하라. 메이탄시노이드는 당업계에 잘 알려져 있으며 공지의 기술에 의해 합성되거나 천연 기원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는, 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호 및 앞에서 언급된 기타 특허 및 비특허 문헌에, 개시된다. 특히, 메이탄시노이드는 메이탄시놀(maytansinol) 및 방향족 고리 내에 또는 메이탄시놀 분자의 기타 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들어 다양한 메이탄시놀 에스터이다.
예시적인 메이탄시노이드는 하기 구조를 갖는 DM1이다.
Figure pct00033
상기 구조에서, "R"은 선택된 링커와 화학적 결합을 형성할 수 있는 다양한 기(group)에 의해 점유될 수 있다. 예를 들어, "R"은 SH가 될 수 있거나 SSRi가 될 수 있는데, 여기에서 R1은 메틸, 선형 알킬, 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 단순 또는 치환된 아릴 또는 헤테로사이클릭을 대표한다. 전형적으로, "R"은 링커와 S-S 결합을 형성하는 SH 기 또는 이의 보호된 유도체이다. 예를 들어, 메이탄시노이드 DM1을 형성하기 위해서, 메이탄신의 C-3 하이드록실기에서 측쇄는 자유 설프히드릴 기(SH)를 갖도록 변형된다. 이러한 메이탄신의 티올화 형태는 변형된 항체와 반응하여 컨쥬게이트를 형성할 수 있다.
임의의 이러한 예에서, 링커는 서브섹션 C.4.b에서 상기 기술된 임의의 링커가 될 수 있다. 링커는 전형적으로 이기능성 교차연결화제이고, 항체는 이기능성 교차연결화 시약과 반응함으로써 변형되어, 항체에 대한 링커 분자의 공유적 부착을 야기한다. 예시적인 링커는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(succinimidyl-4-(Nmaleimidomethyl)cycohexane-l-carboxylate, SMCC), 이미노티올란(iminothiolane, IT), 이미도에스터(imidoester)의 이기능성 유도체(예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCL(dimethyl adipimidate HCL), 활성 에스터(예컨대 디숙신이미딜(disuccinimidyl) 기질), 알데히드(예컨대 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민(bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), 비스-디아조니움(bis-diazonium) 유도체(예컨대 비스-(p-디아조니움벤조일)-에틸렌디아민(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine), 디이소시아네이트(diisocyanate)(예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트(toluene 2,6-diisocyanate)), 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene))이다. 예를 들어, 링커는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate, SPDP)(Carlsson et al., Biochem . J. 173:723-737 [1978]) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(N-succinimidyl-4-(2-pyridylthio)pentanoate, SPP)를 포함하여 디설파이드 연결을 제공할 수 있다. 링커는 절단가능한 또는 비-절단가능한 링커일 수 있다. 예시적인 비-절단가능한 링커는 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate, SMCC)이다.
예를 들어, 본원에서 제공되는 Y104D- 또는 Y104E- 변이체 항-EGFR 항체 컨쥬게이트 중에 표적제가 DM1이고 L-(표적제)가 하기 구조를 갖는 컨쥬게이트가 있다:
Figure pct00034
이러한 예에서, m 및 q는 동일하고 상기 컨쥬게이트는 식 Ab-{(L)-(표적제)]p를 갖는다. 예를 들어, p는 2 내지 6, 예컨대 일반적으로 약 또는 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 최종 컨쥬게이트는 항체 당 2 내지 6 DM1 분자, 예컨대 일반적으로 약 또는 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개를 함유한다.
D. 항-EGFR 항체를 생산하는 방법
1. 항-EGFR 항체의 생성 및 생산
항-EGFR항체, 예컨대 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 당업계에 공지된 표준 세포 배양 및 다른 발현 시스템을 이용하여 발현될 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에서 사용 전, 상기 단백질은 정제될 수 있다. 대안적으로, 전체 상청액 또는 희석된 상청액이 본원에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 당업자의 이해의 범위 내의 재조합 DNA방법에 의해 생산될 수 있다. 변형된 항-EGFR 항체를 암호화하는 DNA는 합성적으로 생산될 수 있거나 통상적인 절차(예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여)를 이용하여 용이하게 단리되고 시퀀싱(sequence)될 수 있다. 예를 들어, 변형된 항-EGFR 항체를 생산하거나 발현하기 위해 공지된 임의의 세포 기원은 이러한 DNA의 선호되는 기원으로 사용될 수 있다. 다른 예에서, 변형된 항-EGFR을 암호화하는 DNA의 서열이 결정되는 경우, 핵산 서열은 유전자 합성 기술을 이용하여 구성될 수 있다.
또한, 돌연변이 기술은 항-EGFR 항체의 변형된 형태를 생성시키기 위해 사용될 수도 있다. DNA는 또한 변형될 수 있다. 예를 들어, 유전자 합성 또는 일상적인 분자 생물학 기술이 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 첨가 또는 치환이 일어나도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 추가의 뉴클레오티드 서열이 핵산 서열에 합쳐질 수 있다. 하나의 예에서 링커 서열, 예컨대 벡터, 예를 들어 단백질 발현 벡터에 항체 유전자를 복제하는 목적을 위해 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 서열이 추가될 수 있다. 또한, 기능적 DNA 요소를 명시하는 추가의 뉴클레오티드 서열이 핵산 분자에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 서열의 예는 세포내 단백질 발현을 용이하게 설계한 프로모터 서열, 및 단백질 분비를 용이하게 설계한 선도(leader) 펩티드 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 제공되는 임의의 아미노산 서열이, 당업자에 의해 통상적으로 사용되는 표준 방법을 사용하여, 역-변역되어, 벡터 내로 복제되고 발현되어 본원에서 제공되는 항체 및 단편을 생성시킬 수 있는, 상응하는 암호화 핵산 서열을 생성시킬 수 있다는 것이 이해된다. 항-EGFR 항체, 예컨대 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는, 전장 단백질로서 또는 전장 단백질보다 적게 발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편이 발현될 수 있다. 본원에서 제공되는 핵산 분자 및 단백질은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 절차는 일반적이고 당업자에게 널리 공지되어 있다. 그들은 유전자 합성, PCR, 라이게이션(ligation), 복제(cloning), 형질 감염(transfection) 및 정제기술을 포함하는 일상적인 분자 생물학 기술을 포함한다. 이러한 절차의 개시는 하기 제공된다.
일단 분리되면, 상기 DNA는 발현 벡터로 배치될 수 있고, 이후 숙주 세포에 형질 감염된다. 벡터의 선택은 원하는 적용에 의존할 수 있다. 예를 들어, 핵산의 삽입 이후, 벡터는 전형적으로 숙주 세포를 형질 전환시키기 위해, 예를 들어, 복제를 위한 단백질 유전자의 증폭 및/또는 이의 발현을 위해 사용된다. 이러한 예에서, 높은 수준 발현에 적합한 벡터가 사용된다.
항체의 발현에 대해, 일반적으로, 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산이 벡터에 복제되고 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산이 벡터에 복제된다. 상기 유전자는 이의 이중 발현을 위한 단일 벡터, 또는 별개의 벡터에 복제될 수 있다. 원하는 경우, 벡터는 또한 추가의 불변 영역(들) 또는 다른 항체 형태를 생성시키는 힌지(hinge) 영역을 암호화하는 추가의 서열을 함유할 수 있다. 벡터는 숙주 세포에 형질 감염되고 발현될 수 있다. 발현은 당업자에게 공지된 임의의 세포 발현 시스템에서 될수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 재조합 숙주 세포에서 항체의 합성을 획득하기 위해, 형질감염이 되지 않으면 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 세포를 포함한다. 예를 들어, 숙주 세포는 시미안(simian) COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 293FS 세포, HEK293-6E 세포, NSO 세포 또는 다른 골수종 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 발현 벡터 및 숙주 세포는 본원에 기술되어 있다.
그러므로, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 전장 항체로서, 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대 예를 들어, Fab, Fab', Fab 힌지, F(ab')2, 단일-쇄 Fv(scFv), scFv 탠덤(tandem), Fv, dsFv, scFv 힌지, scFv 힌지(ΔE) 이중체, Fd 및 Fd' 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 전장 보다 적은 항체로 생성되거나 발현될 수 있다. 다양한 기술이 항체 단편의 생산을 위해 개발되어 왔다. 예를 들어 단편은 온전한 항체의 단백질 분해 소화를 통해 유래될 수 있다(예컨대 Morimoto 외. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117; Brennance 외. (1985) Science, 229:81 참조). 또는, 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 숙주 세포, 예컨대 E. coli에서 발현되고 그로부터 분비될 수 있어, 이러한 단편의 용이한 대량 생산을 용이하게 할 수 있다. 또한, F(ab')2 단편은 Fab'-SH 단편과의 화학적 커플링에 의해 생산될 수 있고(Carter 외. (1992) Bio/Technology, 10:163-167), 또는 그들은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 일부 예에서, 변형된 항-EGFR 항체는 단일-쇄 Fv 단편(scFv)이다(예컨대 W093/16185호; 미국 특허 번호 5,571,894호 및 미국 특허 번호 5,587,458호 참조). Fv 및 scFv 단편은 온전한 복합 부위를 가지나 불변 영역이 전혀 없다; 따라서, 그들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이 결합에 적합하다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카복시 말단에 이펙터(effector) 단백질을 부착하기 위해 구성될 수 있다. 항체 단편은 또한 선형 항체일 수 있다(예컨대 미국 특허 번호 5,641,870 참조). 이러한 선형 항체 단편은 단일 특이성 또는 이중 특이성일 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
발현시, 항체 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 단편은 전장 항체 또는 이의 단편을 형성하기 위해 쇄간(interchain) 이황화결합에 의해 짝지어진다. 예를 들어, 전장 Ig의 발현을 위해, VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 암호화하는 서열은 첫번째 발현 벡터에 복제될 수 있고 VL-CL도메인을 암호화하는 서열은 두번째 발현 벡터에 복제될 수 있다. 공동-발현시, 전장 중쇄 및 경쇄가 이황화결합에 의해 상호연결되어 전장 항체를 생성한다. 다른 예에서, Fab를 생성하기 위해, VH 및 CH1 영역을 암호화하는 서열은 첫번째 발현 벡터에 복제될 수 있고 VL-CL도메인을 암호화하는 서열은 두번째 발현 벡터에 복제될 수 있다. 공동-발현시, 중쇄는 경쇄와 짝을 이루어 Fab 단량체를 생성한다.
전체 항체 및 항체 단편의 발현을 위해 벡터 내로 삽입될 수 있는 예시적인 서열은 본원에서 제공되는 임의의 변형된 항-EGFR 항체의 상응하는 중쇄 또는 경쇄 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 임의의 항체 또는 단편의 임의의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 기술되는 또는 당업자에게 알려진 적합한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체 및 EGFR-결합 단편의 임의의 아미노산 서열은, 표준 공정을 사용하여, 역 번역(반대-번역(back translation)이라고도 불리는)되어 핵산 서열, 예컨대 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 생성할 수 있다. 예를 들어, 단백질 서열을 암호화하는 DNA 서열로 전환할 수 있는 몇몇 온-라인 도구들이 있는데, 예컨대 bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html; biophp.org/minitools/protein_to_dna/demo.php;
vivo.colostate.edu/molkit/rtranslate/; ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/;
molbiol.ru/eng/scripts/01_19.html; 및 genefinity.org/sms/sms_backtranslation.html 이 있다. 이러한 역 번역된 서열은 제공 되는 항체 또는 단편의 발현 및 생산을 위해 본원에서 제공되는 임의의 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
특히, 104E 아미노산 치환을 갖는 변형된 항-EGFR 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 73으로 기재되는 가변 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 및 서열번호 51로 기재되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 갖는다. 적합한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있는, 다른 가변 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산의 서열의 비-제한적인 예는 표 10에 기재되고 서열번호 60, 62, 130, 132, 136, 138, 142, 144, 148, 150, 210, 212, 216, 218, 222, 224, 228, 230, 234, 236, 240, 242, 246, 248 및 이의 임의의 축퇴 서열(degenerate sequence)로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 가변 중쇄를 암호화하는 것들, 및 154, 157, 161, 164, 168, 171, 175, 178, 182, 185, 189, 192, 196, 199, 203, 206, 252, 255, 259, 262, 266, 269, 273, 276, 280, 283, 287, 290, 294, 297, 301, 304 및 이의 임의의 축퇴 서열로 기재되는 뉴클레오티드의 서열을 갖는 가변 경쇄를 암호화하는 것들을 포함한다.
항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체의 발현과 관련한 본원의 목적을 위해, 벡터는 상기 항체의 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 항체의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 함유할 수 있다. 벡터는 CH1, CH2, 힌지, CH3 또는 CH4 및/또는 CL의 하나 또는 전부에 대한 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 예컨대 Fab의 발현을 위해, 벡터는 CH1 또는 CL(캅파 또는 람다 경쇄)에 대한 서열을 함유한다. 불변 영역 또는 힌지 영역의 서열은 당업자에게 알려져 있다(예컨대 미국 공개번호 제2008-0248028호 참조). 이러한 서열의 예가 본원에서 제공된다.
중쇄 또는 경쇄의 전부 또는 일부가 또한 IgG 항체 또는 이의 단편의 발현을 위해 벡터 내로 삽입 또는 함유될 수 있다. 예를 들어, 비-제한적인 예는 서열번호 58, 71, 128, 134, 140, 146, 208, 214, 220, 226, 232, 238, 244, 및 이의 임의의 축퇴 서열로 기재되는 뉴클레오티드의 서열을 갖는 전장 중쇄를 암호화하는 것들 및 서열번호 50, 152, 159, 166, 173, 180, 187, 194, 201, 250, 257, 264, 271, 278, 285, 292, 299 또는 이의 축퇴서열로 기재되는 뉴클레오티드의 서열을 갖는 가변 경쇄를 암호화하는 것들을 포함한다.
또한, VH-CH1 및 VL-CL서열은 Fab 분자의 발현을 위해 적합한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 핵산은 적합한 발현 벡터, 예컨대 단일 쇄 항체를 생산하기 위해 가변 중쇄 및 가변 경쇄 사이의 링커에 대해 암호화 하는 벡터에 발현될 수 있다. 예시적인 링커는 글리신 풍부 가요성 링커(-G4S-)n를 포함하고, 여기서, n은 1(서열번호:346), 2(서열번호:347), 3(서열번호:46), 4(서열번호:348), 5(서열번호:349), 또는 초과의 양의 정수이다.
a. 벡터
벡터의 선택은 원하는 적용에 의존할 수 있다. 많은 발현 벡터는 항-EGFR 항체 또는 이의 부분, 예컨대 항원 결합 단편의 발현에 이용가능하고 당업자에게 공지되어 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현 시스템의 선택에 의해 영향을 받는다. 이러한 선별은 널리 숙련된 당업자의 수준 내이다. 일반적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터 및 선택적으로 인핸서, 번역 신호, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함할 수 있다. 안정한 형질 전환에 사용되는 발현 벡터는 전형적으로 형질 전환된 세포의 선별 및 유지를 허용하는 선별 마커를 갖는다. 일부 경우에, 복제 원점은 세포에서 벡터의 복제 개수를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 벡터는 또한 라이게이션된 핵산 분자에 작동적으로(operably) 연결된 추가의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다.(예컨대 히스 태그(His tag), 플래그 태그(Flag tag)). 항체와의 적용에 대해, 벡터는 일반적으로 불변 영역을 암호화하는 서열을 포함한다. 따라서, 항체 또는 이의 부분은 또한 단백질 융합체로서 발현될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 폴리펩티드에 추가적인 기능성을 추가하기 위해 생성될 수 있다. 융합 단백질의 예는 신호 서열의 융합, 예컨대 국소화를 위한 에피토프 태그, 예컨대 His6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제를 위한 태그, 예를 들어, GST 태그, 및 단백질 분비 및/또는 막 연합을 지향하는 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체의 발현은, 당업계에 공지된 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 적합한 박테리아성 프로모터는 당업계에 널리 공지되었고 하기 본원에서 기술된다. 포유류 세포, 효모 세포 및 곤충 세포를 위한 다른 적합한 프로모터는 당업계에 널리 공지되었고 일부는 하기에 예시되어 있다. 이종성 핵산의 직접적인 발현에 사용되는 프로모터의 선별은 특정 적용에 의존한다. 사용될 수 있는 프로모터는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: SV40 초기 프로모터(Bernoist 및 Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), 라우스육종(Rous sarcoma) 바이러스의 3' 장 말단반복(long terminal repeat) 내에 포함된 프로모터(Yamamoto 외. Cell 22:787-797 (1980)), 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터(Wagner 외, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1441-1445 (1981)), 메탈로티오네인 유전자(metallothionein gene)의 조절 서열(Brinster 외, Nature 296:39-42 (1982))을 포함하는 진핵생물 발현 벡터; 원핵생물 발현 벡터, 예컨대 β-락타마아제(lactamase) 프로모터(Jay 외., (1981) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 78:5543) 또는 택(tac) 프로모터(DeBoer 외., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); 또한 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": Scientific American 내 242:79-94 (1980) 참조); 노팔린(nopaline) 합성효소 프로모터(Herrera-Estrella 외., Nature 303:209-213 (1984)) 또는 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner 외., nucleic acids Res. 9:2871 (1981))를 함유하는 식물 발현 벡터, 및 광합성 효소 리불로스이인산 카복실라아제(photosynthetic enzyme ribulose bisphosphate carboxylase)의 프로모터(Herrera-Estrella 외., Nature 310:115-120 (1984)); 효모 및 다른 진균 유래 프로모터 요소, 예컨대 Gal4 프로모터, 알코올 탈수소효소 프로모터, 포스포글리세롤(phosphoglycerol) 키나아제 프로모터, 알칼라인 포스파타아제 프로모터, 및 조직특이성을 보이고 유전자이식(transgenic) 동물에서 사용되어온 다음의 동물 전사조절영역: 췌장 포상세포(pancreatic acinar cells)에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절영역(Swift 외, Cell 38:639-646 (1984); Ornitz 외, Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol . 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); 췌장 베타세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절영역(Hanahan 외., Nature 315:115-122 (1985)), 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절영역(Grosschedl 외, Cell 38:647-658 (1984); Adams 외, Nature 318:533-538 (1985); Alexander 외., Mol . Cell Biol . 7:1436-1444 (1987)), 고환, 유방, 림프계 및 비만세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역(Leder 외, Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역(Pinkert 외, Genes and Devel . 1:268-276 (1987)), 간에서 활성인 알파-태아단백질 유전자 조절 영역(Krumlauf 외., Μol . Cell. Biol . 5:1639-1648 (1985); Hammer 외, Science 235:53-58 1987)), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 조절영역(Kelsey 외., Genes and Devel . 7:161-171 (1987)), 골수세포에서 활성인 베타글로빈 유전자 조절영역(Magram 외, Nature 315:338-340 (1985); Kollias 외, Cell 46:89-94 (1986)), 뇌의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에서 활성인 수초염기성단백질(myelin basic protein) 유전자 조절영역(Readhead 외, Cell 48:703-712 (1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절영역(Shani, Nature 314:283-286 (1985)), 및 시상하부의 성선자극세포(gonadotrophs)에서 활성인 성선자극호르몬 분비호르몬 유전자 조절영역(Mason 외., Science 234:1372-1378 (1986)).
프로모터에 더하여, 발현 벡터는 전형적으로 숙주 세포에서, 항체, 또는 이의 부분의 발현에 요구되는 모든 추가의 요소를 포함하는 전사 단위 또는 발현 카세트를 포함한다. 전형적인 발현 카세트는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 및 전사물의 효율적인 폴리아데닐화에 요구되는 신호, 리보솜 결합 부위 및 번역 종결을 포함한다. 카세트의 추가의 요소는 인핸서를 포함할 수 있다. 또한, 카세트는 전형적으로 효율적인 종결을 위해 제공하기 위해 구조 유전자의 하류에 전사 종결 영역을 함유한다. 종결 영역은 프로모터 서열로서 동일한 유전자로부터 획득될 수 있고 다른 유전자로부터 획득될 수 있다.
일부 발현 시스템은 유전자 증폭을 제공하는 마커, 예컨대 티미딘 키나아제 및 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase)를 갖는다. 대신, 유전자 증폭을 포함하지 않는 고수율 발현 시스템 역시 적합한데, 예컨대 다면체 프로모터 또는 다른 강한 배큘로바이러스 프로모터의 지시 하에 단백질을 암호화하는 핵산 서열과, 배큘로바이러스 벡터를 곤충 세포에서 사용할 수 있다.
예시적인 발현 벡터는 임의의 포유류 발현 벡터, 예컨대, 예를 들어, pCMV 및 pCDNA3.1을 포함한다. 다른 진핵생물 벡터, 예를 들어 진핵생물 바이러스 유래 조절 요소를 수반하는 임의의 벡터는 진핵생물 발현 벡터로 이용될 수 있다. 이러한 것은 예를 들어, SV40 벡터, 유두종(papilloma) 바이러스 벡터, 및 엡스타인-바(Epstein-Bar) 바이러스 유래 벡터를 포함한다. 예시적인 진핵생물 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMT010/A+, pMAM네오-5, 배큘로바이러스(baculovirus) pDSCE, 및 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥐과 유방 종양 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 다면체(polyhedron) 프로모터, 또는 진핵생물에 발현에 효과적으로 보이는 다른 프로모터의 지도 하에서 단백질의 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터를 포함한다. 박테리아 발현을 위해, 예시적인 벡터는 pBR322, pUC, pSKF, pET23D, 그리고 MBP, GST 및 LacZ와 같은 융합 벡터를 포함한다.
DNA 단편의 벡터로의 삽입에 대한 당업자에게 공지된 임의의 방법은 단백질 또는 항체 쇄를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기술 및 생체내 재조합(유전적 재조합)을 포함할 수 있다. 복제 벡터로의 삽입은 예를 들어, 상보적 점착성(cohesive) 말단을 갖는 복제 벡터로의 DNA 단편을 라이게이션함으로써 달성될 수 있다. 만약 DNA를 단편화 하기위해 사용되는 상보적 제한 부위가 복제 벡터에 존재하지 않는 경우, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대신, 임의의 원하는 부위가 DNA 말단 위에 뉴클레오티드 서열(링커)을 라이게이션함으로써 생산될 수 있다; 이러한 라이게이션된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 암호화하는 특이적인 화학적으로 합성된 핵산을 함유할 수 있다.
일 예에서, 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산은, 첫 번째 발현 벡터 내로 라이게이션되고 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산은 두 번째 발현 벡터 내로 암호화된다. 일반적으로 중쇄 및 경쇄의 상당한 단백질 발현을 허용할 수 있도록 충분히 양립가능함에도 불구하고, 발현 벡터들는 동일하거나 상이할 수 있다. 첫 번째 및 두 번째 발현 벡터는 일반적으로 숙주 세포 내로, 전형적으로 1:1 비율로 공동-형질감염된다. 예시적인 벡터는 pylHC 및 pκIX를 포함하나 이에 제한되지 않는다(Tiller 외. (2008) J Immunol . Methods, 329:1 12-24). 다른 발현 벡터는 경쇄 발현 벡터 pAG4622 및 중쇄 발현 벡터 pAH4604를 포함한다(Coloma et al. (1992) J Immunol . Methods, 152:89-104). pAG4622 벡터는 인간 κL 쇄의 C-영역 도메인을 암호화하는 게놈 서열 및 gpt 선별가능 마커를 함유한다. pAH4604 벡터는 히스D(hisD) 선별가능 마커 및 인간 H 쇄 γi C-영역 도메인을 암호화하는 서열을 함유한다. 다른 예에서, 중쇄 및 경쇄는 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대해 발현 카세트를 갖는 단일 벡터 내로 복제될 수 있다.
일부 예에서, 벡터는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 오픈 리딩 프레임 사이에 내부 리보솜 결합 부위(IRES)를 함유하는 바이시스트로닉(bicistronic) 벡터이다. 예를 들어, 예시적인 벡터는 pcDNA3-Erbitux-LC-IRES-HC-WT(예컨대 서열번호 306)으로 명명된 벡터를 포함하는데, 여기에서 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 임의의 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC)를 암호화하는 핵산은 그 안의 서열의 자리에 치환될 수 있다. 이러한 벡터의 예는 서열번호 307-3014로 기재된다.
b. 세포 및 발현 시스템
일반적으로, 이종성 DNA를 발현하기 위해 조작될 수 있고 분비 경로를 가진 임의의 세포 유형이 본원에서 제공되는 변형된 항-EGF 항체의 발현에 적합하다. 발현 숙주는 원핵 및 진핵 생물, 예컨대 박테리아성-세포(예컨대 E. coli), 효모 세포, 진균 세포, 고세균, 식물 세포, 곤충 세포 및 인간 세포를 포함하는 동물 세포를 포함한다. 발현 숙주는 발현된 단백질에 나타나는 번역 후 변형의 유형뿐만 아니라 그들의 단백질 생산 수준에서 서로 다를 수 있다. 또한, 발현 숙주의 선택은 종종 사용되는 벡터의 선택 및 전사 및 번역 요소의 선택과 관련이 있다. 예를 들어, 발현 숙주의 선택은 종종, 그러나 항상은 아니지만, 이용되는 전구 서열의 선택에 의존한다. 예를 들어, 많은 이종성 신호 서열은 오직 동일한 종의 숙주 세포에서 발현될 수 있다(즉, 곤충 세포 신호 서열은 곤충 세포에서 최적으로 발현된다). 그에 반해, 다른 신호 서열, 예컨대, 예를 들어, 효모, 곤충, 또는 포유류 숙주 세포에서 잘 작동하는 인간 혈청 알부민(hHSA) 신호 서열 및 곤충 및 포유류 세포에서 기능적인 것으로 나타나온 조직 플라스미노겐(plasminogen) 활성자 프리/프로 서열은 이종성 숙주에서 이용될 수 있다(Tan 외., (2002) Protein Eng . 15:337). 발현 숙주의 선택은 이것들 및 다른 요소들, 예컨대 조절 및 안전 고려사항, 생산 비용 및 정제 필요 및 방법에 기초하여 만들어질 수 있다. 따라서, 벡터 시스템은 이용되는 숙주 세포와 양립가능되어야 한다.
진핵생물 숙주에서의 발현은 효모 예컨대 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 곤충 세포 예컨대 초파리(Drosophila) 세포 및 인시류(lepidopteran) 세포, 식물 및 식물 세포 예컨대 담배(tobacco), 옥수수, 쌀, 조류(algae), 및 개구리밥(lemna)에서의 발현을 포함할 수 있다. 발현을 위한 진핵세포는 또한 포유류 세포주 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포를 포함한다. 진핵생물 발현 숙주는 또한 예를 들어, 혈청, 젖 및 알에서의 생산을 포함하여, 형질 전환 동물에서의 생산을 포함한다.
재조합 분자는 유전자 서열의 많은 복사본이 생성되도록, 예를 들어, 형질전환, 형질 감염, 감염, 전기천공(electroporation) 및 초음파천공(sonoporation)을 통해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 일반적으로, 표준 형질 감염 방법은 항체 쇄의 많은 양을 발현하는 박테리아, 포유류, 효모, 또는 곤충 세포주를 생산하기 위해 이용되고, 이후 표준 기술을 이용하여 정제된다(예컨대, Colley 외. (1989) J. Biol. Chem ., 264:17619-17622; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed.), 1990 참조). 진핵생물 및 원핵생물의 형질전환은 표준 기술에 따라 수행된다(예컨대, Morrison (1977) J. Bact . 132:349-351; Clark-Curtiss 및 Curtiss (1983) Methods in Enzymology , 101, 347-362 참조). 예를 들어, 외래 뉴클레오티드 서열을 숙주세포에 도입하기 위해 임의의 널리-공지된 공정이 이용될 수 있다. 이러한 것들은 인산칼슘(calcium phosphate) 형질감염, 폴리브렌(polybrene), 원형질(protoplast) 융합, 전기천공(electroporation) 유전자총법(biolistics), 리포솜(liposomes), 미세주입(microinjection), 플라즈마 벡터, 바이러스성 벡터 및 복제된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외부 유전 물질을 숙주 세포에 도입하기 위한 널리 공지된 기타 방법의 이용을 포함한다. 일반적으로, 항체를 발현하는 목적을 위해, 숙주 세포는 적어도 VH 쇄를 암호화하는 첫번째 벡터 및 적어도 VL 쇄를 암호화 하는 두번째 벡터로 형질감염된다. 따라서, 항체 폴리펩티드, 또는 이의 변형된 형태를 발현할 수 있는 숙주 세포에 적어도 두 유전자를 성공적으로 도입할 수 있도록 사용되는 특정 유전 공학 공정만이 필요하다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 시험관내 및 생체내 방법 예컨대, 예를 들어, 숙주 세포 또는 숙주 동물에 항체를 암호화하는 핵산 분자의 도입 및 시험관내에서 재조합 항체를 암호화하는 핵산 분자로부터의 발현을 포함하는 단백질 생산을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법으로 생산될 수 있다. 원핵생물, 특히 E. coli는 재조립 항체 또는 이의 부분의 많은 양을 생산하기 위한 시스템을 제공하고, 특히 단백질의 발현 및 정제의 적용에 요구된다. E. coli의 형질 전환은 당업자에 널리 공지된 간단하고 신속한 기술이다. 높은 처리량 발현을 위한 E. coli 숙주 계통은 BL21 (EMD Biosciences) 및 LMG194(ATCC)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 E. coli 숙주 계통의 특정 예는 BL21이다. 높은 처리량 발현을 위한 벡터는 pBR322 및 pUC 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
i. 원핵세포 발현
원핵생물, 특히 E. coli는 대량의 변형된 항-EGFR 항체, 또는 이의 부분을 생산하기 위한 시스템을 제공한다. E. coli의 형질 전환은 당업자에게 널리 공지된 간단하고 신속한 기술이다. E. coli용 발현 벡터는 고수준의 단백질 발현 유도 및 숙주세포에 어떤 독성을 나타내는 단백질 발현에 유용한 유도성 프로모터를 함유할 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7과 SP6 RNA 프로모터 및 온도로 조절되는 λPL 프로모터를 포함한다.
항체 또는 이의 부분은 E. coli의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 상기 세포질은 환원성 환경이고, 일부 항체에 대하여, 이는 불용성 봉입체(inclusion bodies)의 형성을 야기할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올 및 변성화제(예컨대, 예를 들어, 구아니딘-HCl 및 요소)는 항체를 재용해하는데 사용될 수 있다. 예시적인 대안적 접근법은 가용성 단백질의 생산을 이끄는 산화성 환경 및 샤페로닌-유사 및 다이설파이드 이소머라제(disulfide isomerases)를 제공하는 박테리아의 주변세포질 공간(periplasmic space) 내 재조합 항체 또는 이의 단편의 발현이다. 전형적으로, 선도 서열(leader sequence)은 발현된 단백질에 융합되어 그 단백질을 주변세포질로 향하게 한다. 상기 선도는 이후 주변세포질 내의 신호 펩티다아제에 의해 제거된다. 주변세포질로 발현된 단백질을 이동시키는 예시적인 경로는 Sec 경로, SRP 경로 및 TAT 경로이다. 주변세포질-표적 선도 서열의 예는 펙테이트(pectate) 리아제(lyase) 유전자로부터의 pelB 선도, StII 선도 서열, 및 DsbA 선도 서열을 포함한다. 일부 경우에, 주변세포질 발현은 배양배지 내로 발현된 단백질의 유출을 허용한다. 항체의 분비는 배양 상청액으로부터 신속하고 간단한 정제를 가능케 한다. 분비되지 않은 항체는 삼투압성 용해에 의해 주변세포질로부터 획득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우에 단백질은 불용성이 될 수 있고, 가용화 및 리폴딩(refolding)을 용이하게 하기 위해 변성화제와 환원제가 사용될 수 있다. 유도 및 성장의 온도는 또한 발현 수준 및 가용성에 영향을 줄 수 있다. 전형적으로, 25℃와 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 돌연변이 또한 발현된 단백질의 가용성을 증가시키 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 박테리아는 아글리코실화된(aglycosylated) 단백질을 생산한다. 따라서, 글리코실화는 숙주 세포로부터 정제 후 시험관내에 추가될 수 있다.
ii. 효모
효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아료위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)가 재조합 항체 또는 이의 부분용 발현 숙주로 유용하다. 효모는 에피솜 복제 벡터 또는 동종성 재조합에 의한 안정한 염색체 통합으로 형질 전환될 수 있다. 전형적으로, 유도성 프로모터는 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 이러한 프로모터의 예는 AOX1, GAL1, GAL7 및 GAL5, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1을 포함한다. 발현 벡터는 종종 형질 전환된 DNA의 선별 및 유지를 위한 선별 마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 종종 가용성이다. 샤페로닌, 예컨대 Bip 및 단백질 디설파이드 이소머라제와의 공동-발현은 발현수준 및 가용성을 개선시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 분비 신호 펩티드 융합, 예컨대 사카로마이세스 세레비제 유래의 효모 교배형 알파-인자 분비 신호 및 효모 세포 표면 단백질 예컨대 Aga2p 교배 부착 수용체(mating adhesion receptor) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adreninivorans) 글루코아밀라제와 융합을 이용하여 분비되도록 지시될 수 있다. 예컨대 Kex-2 프로테아제를 위한 프로테아제 절단부위는, 그들이 분비 경로를 탈출 시, 발현된 폴리펩티드로부터 융합된 서열을 제거하도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화가 가능하다.
iii. 곤충
특히 배큘로바이러스 발현을 이용하는, 곤충세포는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 부분 발현에 유용하다. 곤충세포는 고수준의 단백질을 발현하고, 고등 진핵생물에 의해 이용되는 번역-후 변형 대부분이 가능하다. 배큘로바이러스는 안전성을 개선시킬 수 있고 진핵발현의 조절 우려(regulatory concerns)를 감소시킬 수 있는 제한성 숙주 범위를 가진다. 전형적인 발현 벡터는 고수준 발현을 위한 프로모터, 예컨대 배큘로바이러스의 다면체(polyhedrin) 프로모터 및 plO 프로모터를 사용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 배큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcNPV), 및 누에나방(Bombyx mori) 핵다각체병 바이러스(BmNPV) 및 곤충세포주, 예컨대 도둑나방(Spodoptera frugiperda)에서 유래된 Sf9 및 트리코프루시아니(Trichoplusia ni)에서 유래된 TN을 포함한다. 고수준의 발현을 위하여, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 다면체 개시코돈의 바로 하류에 융합될 수 있다. 인간 항체를 발현할 수 있는 배큘로바이러스 재조합체를 생성하기 위해, 이중-발현 수송, 예컨대 pAcUW51 (PharMingen)이 이용된다. 포유류 분비 신호는 곤충세포에서 정확히 처리되고 발현된 단백질을 배양 배지 내로 분비하기 위하여 이용될 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 발현용 곤충 세포 내의 대안적인 발현 시스템은 안정한 형질 전환 세포의 이용이다. 세포주 예컨대 도둑나방(Spodoptera frugiperda)에서 유래된 Sf9 및 트리코프루시아니(Trichoplusia ni)에서 유래된 TN이 발현을 위해 이용될 수 있다. 배큘로바이러스 즉시(immediate) 초기 유전자 프로모터 IE1은 일관된 발현 수준을 유도하기 위해 이용될 수 있다. 전형적인 발현 벡터는 pIEl-3 및 pI31-4 수송 벡터(Novagen)를 포함한다. 발현벡터는 선별 마커, 예컨대 네오마이신(neomycin) 및 하이그로마이신(hygromycin)의 사용에 의해 전형적으로 유지된다.
iv. 포유류 세포
포유류 발현 시스템은 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 발현 구축물(construct)은 바이러스 감염 예컨대 아데노바이러스에 의해 또는 직접적인 DNA 이동 예컨대 리포솜, 인산칼슘, DEAE-덱스트란에 의해 및 물리적인 수단 예컨대 전기천공과 미세주입에 의해 포유류 세포에 전달될 수 있다. 포유류 세포용 발현 벡터는 전형적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 번역 개시 서열(Kozak 공통 서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. 상기 벡터는 종종 고수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV)의 장 말단반복(long terminal repeat)을 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서는 많은 세포형에서 활성이다. 조직 및 세포-유형 프로모터 및 인핸서 영역이 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터/인핸서 영역은 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유방 종양 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질(fetoprotein), 알파 1 항트립신, 베타 글로빈, 수초 염기성 단백질, 미오신 경쇄 2, 및 성선자극호르몬 분비(gonadotropic releasing)호르몬 유전자 조절과 같은 유전자 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
선별 마커는 발현 구축물을 가진 세포를 선별하고 유지하기 위해 사용될 수 있다. 선별 마커 유전자의 예는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 데아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, NEOR/G418 시스템, 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase, DHFR) 시스템 또는 글루타민 합성효소(GS) 시스템을 이용하여, 변형된 항-EGFR 항체가 생산될 수 있다. GS 시스템은 중쇄 및 경쇄 모두를 발현하기 위해 합동 발현 벡터, 예컨대 pEE12/pEE6을 이용한다. 세포 표면 신호 분자를 가진 융합체, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ는 세포 표면에서 활성 상태인 단백질의 발현을 전개할 수 있다.
많은 세포주가 마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함한 포유류 발현에 이용가능하다. 예시적인 세포주는 예컨대, 예를 들어, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비성) 및 다른 골수종(myeloma) 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유아세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포와 같은, 당업계에 공지되거나 본원에서 기술된 임의의 것을 포함한다. 세포배양 배지로부터 분비된 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 적응된 세포주 또한 이용가능하다. 하나의 이러한 예는 무혈청 EBNA-1 세포주(Pham 외., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.)이다.
v. 식물
유전자 이식 식물 세포 및 식물은 항-EGFR 항체, 예컨대 본원에서 기술된 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 부분을 발현하기 위해 이용될 수 있다. 발현 구축물은 전형적으로 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 원형질체 내로의 PEG-매개 전달과 같은 직접적 DNA 전달을 이용하여, 그리고 아그로박테리움-매개 형질전환으로 식물로 전달된다. 발현 벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사 종결 요소 및 번역 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현 벡터 및 형질 전환 기술은 일반 적으로 쌍자엽식물(dicot) 숙주, 예컨대 애기장대(Arabidopsis)와 담배(tobacco), 및 단자엽식물(monocot) 숙주, 예컨대 벼와 옥수수로 나뉜다. 발현을 위해 사용되는 식물 프로모터의 예는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 CaMV 35S프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, 리보오스 이인산 카복실라아제 프로모터 및 옥수수 유비퀴틴-1(ubi -l) 프로모터를 포함한다. 선별 마커 예컨대 하이그로마이신(hygromycin), 포스포만노스(phosphomannose) 이소머라제 및 네오마이신(neomycin) 포스포트랜스퍼라제가 종종 형질 전환된 세포의 선별 및 유지를 용이하게 하기 위해 사용된다. 형질 전환된 식물세포는 세포, 응집체(캘러스 조직)로서 배양물 내 유지되거나 전체 식물로 재생될 수 있다. 유전자이식 식물 세포는 또한 프로테아제 또는 변형된 프로테아제(예를 들어, Mayfield 외. (2003) PNAS 700:438-442 참조)를 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다. 식물은 포유류 세포와 상이한 글리코실화 패턴을 가지므로, 이는 이들 숙주 내에서 생산되는 단백질 선택에 영향을 미칠 수 있다.
2. 정제
항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체 및 이의 항원 결합 부분은 당업자에게 공지되거나 본원에서 기술된 임의의 공정에 의해 정제될 수 있다. 단백질은 SDS-PAGE, 크기 분획(size fraction) 및 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전, 킬레이트 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 컬럼 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 이용하여 상당한 순도로 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체를 정제하는 방법의 예시는 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 것이고, 여기서 고체 지지체 컬럼 물질은 높은 친화성으로 면역글로불린에 결합하는, 단백질 G, 연쇄구균(Streptococcus) 유래 세포 표면-관련 단백질에 결합된다. 일부 예에서, 항-EGFR 항체는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있고, 여기서 고체 지지체 컬럼 물질은 면역글로불린, 예컨대 IgG 항체와 높은 친화성으로 결합하는 단백질 A, 포도구균(Staphylococcus) 유래 세포 표면-관련 단백질에 결합된다(예컨대, Liu 외. (2010) MAbs 2(5):480-499 참조). 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있는 다른 면역글로불린-결합 박테리아성 단백질은 단백질 A/G, 단백질 A 및 단백질 G의 IgG 결합 도메인과 결합되는 재조합 융합 단백질; 및 단백질 L, 펩토스트렙토콕쿠스(Peptostreptococcus) 유래 표면 단백질(Bjorck (1988) J. Immunol., 140(4):1194-1197; Kastern, 외. (1992) j. Biol . Chem . 267(18):12820-12825; Eliasson 외. (1988) J. Biol. Chem. 263:4323-4327)을 포함한다.
항-EGFR 항체는 60%, 70%, 80% 순도 및 전형적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 순도로 정제될 수 있다. 순도는 표준 방법 예컨대 SDS-PAGE 및 쿠마씨 염색(coomassie staining)에 의해 평가될 수 있다.
숙주 세포로부터 항체 또는 이의 부분을 포함하는, 항-EGFR 항체의 정제를 위한 방법은 선택된 숙주 세포 및 발현 시스템에 의존한다. 분비된 분자에 대해, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양 배지로부터 정제된다. 세포내 발현을 위하여, 세포는 용해되고, 단백질은 추출물로부터 정제될 수 있다. 유전자 이식 유기체, 예컨대 유전자 이식 식물 및 동물이 발현을 위해 사용될 때, 조직 또는 기관은 용해된 세포추출물을 만들기 위하여 출발물질로서 사용될 수 있다. 또한, 유전자 이식 동물 생산은 젖 또는 알에서 폴리펩티드 생산을 포함할 수 있으며, 이는 수집되어, 필요하다면, 추가적으로 상기 단백질이 추출되고, 당업계의 표준 방법을 이용하여 추가 정제될 수 있다.
전형적으로 프로모터 유도 후에, 단백질이 형질전환 박테리아에 의해 대량으로 발현되는 경우, 발현이 일정할 수 있더라도, 폴리펩티드는 비가용성 응집(aggregate)을 형성할 수 있다. 당업자에게 공지된 폴리펩티드 봉입체(inclusion bodies)의 정제에 적합한 몇가지 프로토콜이 있다. 많은 변화는 당업자에게 당연히 명백할 수 있다.
E. 항-EGFR 항체 성질 및 활성을 평가하는 방법
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 및 이의 변이체 및 단편은, EGFR 항원(예컨대 인간 EGFR) 또는 이의 가용성 단편에 대한 결합에 대해 평가될 수 있다. 결합 활성은 낮은 pH/증가된 락테이트(lactate) 농도의 조건 및 중성 pH/생리적 락테이트 활성의 조건 하에서 항체의 활성을 비교하는 조건 하에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 결합 활성은 산성 pH(예컨대 pH 5.8 내지 6.5, 예컨대 pH 6.0 내지 6.5) 및/또는 증가된 락테이트 농도(예컨대 10 내지 20 mM, 예컨대 15 내지 20 mM)의 조건 하에서 평가될 수 있고 중성 pH(예컨대 pH 7.0 내지 7.6, 예컨대 pH 7.0 내지 7.4) 및/또는 생리적 락테이트 농도(예컨대 0.5 내지 5 mM, 예컨대 약 1 mM)의 조건 하에서의 결합 활성과 비교될 수 있다. 이러한 어세이는 결합 활성이 약 7.4의 중성 pH 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도의 하나 또는 둘 다를 포함하는 조건 하에서와 비교하여 산성 pH 6.0 내지 6.5를 포함하고 및/또는 락테이트 농도 15 mM 내지 20 mM 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 조건 하에서 더 크다는 것을 확인할 수 있다.
어세이는 또한 생리적 농도의 단백질 또는 혈청(예컨대 10 mg/mL 내지 50 mg/mL 단백질, 예컨대 혈청 알부민; 또는 20-50% 혈청, 예컨대 인간 혈청)의 존재에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 항-EGFR 항체는 전형적으로 20-50% 혈청(vol/vol) 또는 10-50 mg/mL 단백질(예컨대 혈청 알부민), 및 약 5.8 내지 6.8 사이의 산성 pH, 예컨대 pH 6.0 및/또는 10 mM 내지 20 mM의 상승된 락테이트 수준을 포함하는 제1 조건 세트 하에서 활성에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, 항-EGFR 항체는 20-50% 혈청(부피/부피) 또는 10-50 mg/mL 단백질(예를 들어, 혈청 알부민), 및 약 5.8 내지 6.8의 산성 pH 및/또는 10 mM 내지 20 mM의 상승된 락테이트 수준을 포함하는, 제 1 세트의 조건 하(예를 들어, 종양 미세환경에서 존재하는 조건)에서 전형적으로 활성에 대해 평가된다. 예를 들어, 제 1 조건 세트는 적어도 25% 혈청(부피/부피) 또는 12-40 mg/mL 단백질 (예를 들어, 혈청 알부민), 및 약 6.0 내지 6.5의 산성 pH 및/또는 15 mM 내지 20 mM, 예컨대 16.7 mM의 상승된 락테이트 수준을 포함한다. 이러한 방법에서, 항-EGFR 항체는 또한 20-50% 혈청(부피/부피) 또는 10-50 mg/mL 단백질(예를 들어, 혈청 알부민), 및 중성 pH 근처의 또는 약 7.0 내지 7.4의 중성 pH의 중성 pH 및/또는 0.5 내지 5 mM의 락테이트 농도를 포함하는 제 2 조건세트 하에서 활성에 대해 평가된다. 예를 들어, 제 2 조건 세트는 적어도 25% 혈청(부피/부피) 또는 12-40 mg/mL 단백질(예를 들어, 혈청 알부민), 및 약 7.2 내지 7.4, 예컨대 pH 7.4의 pH 및/또는 0.5 mM 내지 2 mM, 예컨대 1 mM의 락테이트 농도를 포함한다. 일부 예에서, 항-EGFR 항체는 또한 적어도 25% 혈청(부피/부피) 또는 12-40 mg/mL 단백질(예컨대 혈청 알부민), 및 약 6.0 내지 6.5 사이의 산성 pH, 예컨대 pH 6.5 및/또는 15 mM 내지 20 mM의 상승된 락테이트 수준, 예컨대 약 16.7 mM을 포함할 수 있는 제 3 조건 세트 하에서 활성에 대해 평가될 수 있다. 이러한 어세이에서, 생리적 환경을 시뮬레이션하기 위해 첨가되는 단백질(예를 들어, 혈청 단백질)의 양은 전형적으로 시험되는 모든 조건의 세트와 동일하거나 실질적으로 동일하나, 한 조건과 다른 조건에서 ±25% 또는 이하로 변할 수 있다.
따라서, 결합 활성은 생리적 환경을 시뮬레이션하는 조건 또는 생리적 환경인 것에서 결정될 수 있다. 결합은 시험관내(예컨대 면역어세이)에서 또는 생체외 또는 생체내(예컨대 종양 세포 또는 비-종양 세포, 예컨대 피부 진피의 세포에 대한 결합)에서 평가될 수 있다. 본원에서 제공되는 어세이는 상이한 pH 및/또는 락테이트 농도, 및 선택적으로 총 단백질의 생리적 농도의 존재 하에서 검출가능한 또는 기타 측정가능한 방식으로 변형된 항-EGFR 항체의 활성을 시험 또는 평가할 수 있는 임의의 어세이를 포함한다. 본원에서 제공되는 어세이는 다수의 항-EGFR 항체, 예를 들어 단백질 변이체의 활성을 이중 포맷에서 한번에 평가하기 위해 고수율 포맷으로 개발될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 결합 어세이는 고체-기반 결합 어세이 또는 용액 결합 어세이를 사용하여 수행될 수 있는데, 여기에서 결합은 상기 조건 하에서 수행된다. 다른 예에서, 결합 어세이는 결합이 종양에서 존재하는 세포 대 비-종양 세포에서 존재하는 세포에서 비교되는 생체내에서 수행될 수 있다. 특히, 생체내 결합 어세이가 종양 세포 대 기저 피부 케라티노사이트(keratinocyte)에 대해 투여된 항체의 결합 또는 국소화(localization)를 평가하기 위해 수행될 수 있다. 이는 이종이식 또는 피부 이식 모델을 사용하여 본원에서 예시된다. 다른 모델 또한 이용될 수 있다. 예시적인 어세이의 기술은 하기에서 제공된다.
결합 어세이 뿐 아니라, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 활성을 평가하기 위한 다른 어세이는, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 활성 및/또는 부작용을 측정하기 위해 기능적 어세이, 생체내 어세이, 동물 모델 및 임상적 어세이를 포함하나 이에 제한되지 않는 시험관내 또는 생체내 어세이에서 수행되고 포함할 수 있다. 평가되는 활성은 항-EGFR 항체의 임의의 활성, 예컨대 EGFR에 대한 결합, 세포 성장 억제(CGI) 활성 또는 종양 성장 억제 활성일 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 항체는 또한 당업자에게 알려진 임상적 성질, 예컨대 예를 들어 치료적 효율, EGFR에 대한 친화성, 독성, 부작용, 약동학 및 약력학을 평가하기 위한 다양한 어세이에서 특징지어질 수 있다.
1. 결합 어세이(Binding Assays)
변형된 항-EGFR 항체는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 EGFR에 결합하는 그들의 능력에 대해 평가될 수 있다. 예시적인 어세이가 본원에서 하기에 기술된다.
결합 어세이가 용액, 현탁액, 또는 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다. 예를 들어, EGFR은 고체 지지체(예를 들어, 탄소 또는 플라스틱 표면, 조직 배양 접시 또는 칩(chip))에 고정화(immobilization)될 수 있고 항체와 접촉될 수 있다. 비결합 항체 또는 표적 단백질이 세척될 수 있고 그 다음에 결합된 복합체가 검출될 수 있다. 결합 어세이가 비특이적 결합을 감소시키는 조건 하에서, 예컨대 비이온성 세제(detergent)(예를 들어, 0.1 % 트리톤(Triton) X-100 또는 트윈(Tween) 20) 및/또는 차단(blocking) 단백질(예를 들어, 소 혈청 알부민 또는 젤라틴)과 함께 높은 이온 강도 완충액(예를 들어, 0.3-0.4 M NaCl)를 사용하여 수행될 수 있다. 음성 대조군이 또한 배경 결합의 측정으로 이러한 어세이에 포함될 수 있다. 결합 친화성이 정량적인 ELISA, 스캐차드(Scatchard) 분석(Munson 외,(1980) Anal. Biochem., 107:220), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance), 등온 열량측정(isothermal calorimetry), 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 사용하여 확인될 수 있다(예를 들어, Liliom 외 (1991) J. Immunol Methods. 143(1):119-25).
이러한 어세이는 예를 들어, 용액에서(예를 들어, Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-421), 비드(bead) 상에서(Lam (1991) Nature 354:82-84), 칩(chip) 상에서(Fodor (1993) Nature 364:555-556), 박테리아 상에서(미국 특허번호 제5,223,409호), 포자(spore) 상에서(미국 특허번호 제5,571,698호; 제5,403,484호; 및 제5,223,409호), 플라스미드(plasmid) 상에서(Cull 외 (1992) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 89:1865-1869) 또는 파지(phage) 상에서(Scott 및 Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla 외 (1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:6378-6382; 및 Felici (1991) J. Mol . Biol. 222:301-310) 수행될 수 있다.
전형적으로, EGFR 결합은 활성의 수준이 평가될 수 있을 정도로 정량화될 수 있는 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 정량화의 방법은, 분광광도계, 형광 및 방사성활성 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법은, 예를 들어 비색 신호, 화학발광 신호, 화학형광 신호 또는 방사성활성 신호를 측정한다.
일부 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 검출 및 EGFR 결합 활성의 결정을 용이하게 하기 위해서 검출가능한 모이어티 또는 태그로 표지 될 수 있다. 당업자는 당업계에 기술되거나 알려진 어세이들에서 적절한 검출가능한 모이어티 또는 태그를 선택할 수 있다. 검출될 수 있거나 확인될 수 있는 것으로 당업자에게 알려진 임의의 검출가능한 모이어티(즉, 당업자에게 알려진 태그 또는 기타 모이어티)가 시험될 변형된 항-EGFR 항체 또는 단편에, 직접적 또는 간접적으로, 예를 들어, 링커를 사용하여 연결될 수 있다. 연결은 치료적 항체의 N- 또는 C- 말단에 있을 수 있다. 본원의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 태그 및 모이어티는 표 13에 기재된 임의의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
Figure pct00035
본원에 기술된 치료적 항체에 검출가능한 모이어티를 연결할 수 있는 당업자에게 알려진 임의의 링커가 사용될 수 있다. 예시적인 링커는 글리신 풍부 가요성 링커(Glycine rich flexible linker)인 (-G4S-)n을 포함하는데, 여기에서 n은 양의 정수, 예컨대 1 (서열번호: 346), 2 (서열번호: 347), 3 (서열번호: 46), 4 (서열번호: 348), 5 (서열번호: 349), 또는 그 이상이다.
결합 어세이는 용액 내에서, 변형된 항-EGFR 항체를 고체 지지체에 부착함으로써, 또는 EGFR를 고체 지지체에 부착함으로써 수행될 수 있다. 임의의 당업자에게 알려진 고체 지지체 결합 어세이가 본원에서 제공되는 항체의 활성을 시험하기 위해 고려될 수 있는데, 이는 표면 플라스몬 공명, 바이오-층 간섭계(bio-layer interferometry), 면역어세이, 면역형광 또는 면역조직화학을 사용한 조직에 대한 결합, 및 세포 기반 결합 어세이(예컨대 임의의 하기 기술되는 EGFR-발현 세포를 사용하여)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
면역어세이는 웨스턴 블롯 또는 면역블롯, 예컨대 정량적 웨스턴 블롯; 방사성면역어세이; ELISA(효소 연결 면역흡착 어세이); 메조 스케일 발견(Meso Scale Discovery, MSD, Gaithersburg, Maryland); 및 "샌드위치" 면역어세이; 면역침전 어세이; ELISPOT; 침강소(precipitin) 반응; 겔 확산 침강소 반응; 면역확산 어세이; 응집(agglutination) 어세이; 보체-고정 어세이; 면역방사성측정 어세이; 형광 면역어세이; 단백질 A 면역어세이; 면역조직화학; 면역-전자 현미경 또는 리포좀 면역어세이(LIA)와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 기술을 사용한 경쟁적 및 비-경쟁적 어세이 시스템을 포함한다. 이러한 어세이는 당업계에서 일상적이고 잘 알려져 있다(예컨대 Ausubel 외, Eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York 참조).
일부 예에서, 면역조직화학 및/또는 면역형광이 생체외에서, 동물 모델에서 EGFR 결합에 대해 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 설치류 또는 기타 동물 모델에서 이종이식 종양에 대한 항체 결합이 분석될 수 있다. 다른 예에서, 면역조직화학은 피부, 예컨대 영장류 피부에 대한 변형된 항-EGFR 결합을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 다른 예에서, 면역조직화학은 이종이식 종양 및 영장류 피부 이식에 대한 결합을, 생체 외에서, 예를 들어 시험된 항체가 항체의 결합 선호도를 시각적으로 또는 정량적으로 비교하기 위해 그리고 생체내에서 선택적 또는 조건적 결합을 나타내는지 결정하기 위해, 평가하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어 실시예 11-13 참조).
다른 예에서, 이종이식 종양 또는 피부 이식을 함유하는 동물 모델, 예컨대 본원에서 기술되는 동물 모델에 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체가, 예컨대 전신적 투여에 의해, 변형된 항-EGFR 항체의 생체내 결합을 평가하기 위해 투여될 수 있다. 이러한 예에서, 조직은 상기 기술된 바와 같이 면역조직화학 또는 면역형광에 의해 생체외 결합을 평가하기 위해 특정 시점(들)에 수확될 수 있다. 다른 예에서, 투여된 변형된 항-EGFR 항체는 피부를 통해 형광을 전달할 수 있는 형광단(fluorophore), 예컨대 적외선 형광단(예를 들어 DyLight755)에 컨쥬게이션된다. 이러한 예에서, 항-EGFR 항체 결합은 IVIS 캘리퍼 이미징 시스템을 사용하여 생체내에서 시각화될 수 있으며, 이종이식 종양 및/또는 영장류 피부 이식에 대한 항체 결합이 평가될 수 있다(예컨대 실시예 13 참조). 그 다음 조직이 생체외 확인적 면역조직화학 분석을 위해 수확될 수 있다.
당업자에게 알려진 임의의 용액 결합 어세이를 포함하는, 용액 결합 어세이가 평형 투석, 경쟁적 결합 어세이(competitive binding assays)(예컨대, Myers 외, (1975) Proc . Natl . Acad . Sci . USA), 방사능표지 결합 어세이(예컨대, Feau 외, (2009) J. Biomol Screen. 14(l):43-48), 등온 역가 열량측정(isothermal titration calorimetry, ITC) 및 시차 주사 열량측정(differential scanning calorimetry)(예컨대, Alvarenga 외, (2012) Anal. Biochem 421(1)138-151, Perozzo 외, (2004) J Recept Signal Transduct Res. 24(1-2):1-52; Holdgate (2001) Biotechniques 31(1):164-166, 168, 170), Celej 외 (2006) Anal Biochem . 350(2):277-284))을 포함하는 열량 측정, 및 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 어세이(Wu 외(2007), J . Pharm . Biomed . Anal. 44(3):796-80 1)를 포함하는 분광 형광 어세이(spectroscopic fluorescence assay)를 포함하여, 결합 활성을 평가하기 위해 고려된다. 결합 어세이에 대한 조건은 고체 지지체에서 수행되는 결합 어세이에 대해 상기 논의한 조건에서 적응될 수 있다.
항체 결합을 측정하기 위해 선택된 정량적 어세이에 따라, 절대적 결합이, 예를 들어 광학 밀도(OD)에 대하여, 예컨대 농도측정(densitometry) 또는 분광학 측정; 임의의 형광 단위(arbitrary fluorescent units, AFU), 예컨대 형광 측정; 또는 강(lumen), 예컨대 화학발광 측정으로부터 표시될 수 있다. 일부 예에서, 특이적 활성은 항체 단백질 농도에 의해 절대적 결합 신호를 나눔으로써 계산된다. 일부 예에서, 특이적 활성은 비변형된 항-EGFR 부모 항체, 예컨대 야생형 세툭시맙과 같은 참조 항체의 특이적 활성에 의해 변형된 항-EGFR 항체의 특이적 활성을 나눔으로써 각 변형된 항-EGFR 항체에 대한 정규화된 특이적 활성(NSA)을 제공하기 위해 정규화된다.
결합 활성은 또한 결합 친화성에 대하여 측정될 수 있는데, 이는 결합 속도(k a 또는 kon) 및/또는 해리의 속도(k d 또는 k off ), 반수 최대 유효 농도(EC50) 값, 및/또는 열역학적 데이터(예컨대 깁스 자유 에너지(AG), 엔탈피(△H), 엔트로피(-TAS)), 및/또는 결합 상수(KA) 또는 해리 상수(KD)를 계산함으로써 측정될 수 있다. 전형적으로, 결합 역학의 결정은 공지의 항체 및 EGFR 단백질 농도를 요구한다. 결합 속도(k a ) 및 결합 상수(KA)는 결합 친화성과 양의 상관관계가 있다. 대조적으로, 해리의 속도(k d), 해리 상수(KD) 및 EC50 값은 결합 친화성과 음의 상관관계가 있다. 따라서, 더 높은 결합 친화성은 더 낮은 k d, KD 및 EC50 값에 의해 표시된다.
낮은 pH 및/또는 상승된 락테이트 수준의 조건 및 중성 pH 및또는 정상 락테이트 수준의 조건 하에서 본원에서 제공되는 변형된 항체의 결합 활성을 비교하는 것은 동일한 조건(예컨대, 상이한 pH 및/또는 락테이트 조건 외에, 동일한 단백질 희석 및 결합 조건) 하에서 절대적 결합을 비교함으로써 또는 상이한 조건 하에서 결합 친화성을 비교함으로써 달성될 수 있다.
따라서, 이러한 어세이를 사용하여, 중성 pH 또는 약 7.4의 pH 및또는 약 1 mM의 락테이트 농도 중 하나 또는 둘 다의 조건 하에서와 비교하여, pH 6.0 내지 6.5를 포함하는 것, 및/또는 10 mM 내지 20 mM을 포함하는 사이의 락테이트 수준을 포함하는 조건 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함하는 조건 하에서 결합 활성의 비율이 결정될 수 있다. 이용되는 어세이에 따라, 결합 활성은 절대적 값(예컨대 광학 밀도), 결합 또는 효력의 농도 측정(예컨대 EC50) 또는 역학적 측정(예컨대 결합 또는 해리 상수)인 정량화된 값의 비율일 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 모든 경우에서, 1 초과의 비율은, 중성 pH 및/또는 약 7.4의 pH 및/또는 약 1 mM의 락테이트 농도의 조건 하에서와 비교하여, pH 6.0 내지 6.5를 포함하는 pH, 및/또는 10 mM 내지 20 mM을 포함하는 사이의 락테이트 농도 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 조건 하에서, 결합이 더 크다는 것을(예컨대 더 강한 결합 친화성 또는 더 낮은 EC50) 나타내는 것과 같은 방식으로 결정된다.
예를 들어, 절대적 결합이 측정되는 예에서, 조건부 결합이 산성 pH(예컨대 pH 6.0 또는 6.5) 및/또는 상승된 락테이트(예컨대 16.7 mM) 조건하에서의 절대적 결합 대비 중성 pH(예컨대 pH 7.4) 및또는 정상 락테이트(예컨대 1 mM) 조건 하에서의 절대적 결합의 비율을 계산함으로써, 예를 들어, ODpH6 .0/ODpH7 .4 또는 ODpH6.5/ODpH7.4의 몫(quotient)을 결정함으로써, 결정될 수 있다. 결합 활성이 결합 친화성(예컨대 k a 및 KA)과 양의 상관 관계가 있는 역학적 수치에 대하여 결정될 때, 활성의 비율은 중성 pH(예컨대 pH 7.4) 및/또는 정상 락테이트(예컨대 1 mM) 조건 하에서 절대적 결합 대비 산성 pH(예컨대 pH 6.0 내지 6.5) 및/또는 상승된 락테이트(예컨대 16.7 mM) 조건 하에서 양의 상관관계가 있는 항(term)들의 비율을 계산함으로써, 예를 들어 KA(pH 6.0)/KA( pH7 .4) 또는 KA( pH6 .5)/KA( pH7 . 4)의 몫을 결정함으로써 산정될 수 있다. 결합 활성이 결합 친화성(예컨대 KD 또는 EC50)과 음으로 또는 역으로 상관관계가 있는 결합 수치에 대하여 결정될 때, 결합 활성의 비율이 역으로, 또는 반대로, 산성 pH(예컨대 pH 6.0 또는 6.5) 및/또는 상승된 락테이트(예컨대 16.7 mM) 하에서 음의 상관관계가 있는 항들 대비 중성 pH(예컨대 pH 7.4) 및/또는 정상 락테이트(예컨대 1 mM) 조건 하에서 절대적 결합을 계산함으로써, 예를 들어, (1/EC50(pH 6.0)/1/EC50(pH7.4))의 몫을 결정함으로써 산정될 수 있다.
전형적으로, 본원에서 제공되는 항체는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 50인 결합 활성의 비율을 갖는데, 이는 적어도 2 배, 3배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 10 배, 15 배, 20 배, 25 배, 30 배, 35 배, 40 배, 50 배 또는 그 이상 더 큰 결합(예컨대 더 강한 결합 친화성 또는 더 낮은 EC50)을 가리킨다.
2. 기타 세포 기반 어세이
본원에서 제공되는, 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체의 활성을 측정하기 위한 어세이는 세포 기반 어세이를 포함한다. 사용될 수 있는 세포주는 당업계에 기술된 임의의 세포주 또는 저장소 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 획득할 수 있는 세포주를 포함한다. 숙련된 당업자는 원하는 성질을 갖는 세포주를 선별할 수 있다. 일반적으로, 어세이는 EGFR를 발현하는 것으로 공지된 세포주를 이용하여 수행된다. 이러한 세포주는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 세포주를 확인하기 위해 ATCC 카탈로그(atcc.org)를 찾아볼 수 있다.
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체를 스크리닝하기 위해 세포 기반 어세이에서 사용될 수 있는 EGFR을 발현하는 예시적인 세포주는 DiFi 인간 대장 암 세포(human colorectal carcinoma cells), A431 세포(ATCC CRL-1555), Caco-2 대장 선암종 세포(Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells, ATCC HTB-37), HRT-18 대장 선암종 세포(ATCC CCL-244), HT-29 대장 선암종 세포(ATCC HTB-38), 인간 신생아 케라티노사이트(human neonatal keratinocytes) 및 MCF10A 상피 세포(epithelial cells)(ATCC CRL-10317)(예컨대, Olive 외. (1993) In Vitro Cell Dev Biol. 29A(3 Pt l):239-248; Wu 외. (1995) Clin . Invest. 95(4):1897-1905 참조)를 포함한다. 본원에서 기술된 세포 기반 어세이에서 사용될 수 있는 예시적인 세포는 예를 들어, 본원에서 기술된 종양 또는 암 세포를 포함하여, 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 세포를 포함한다.
일부 예에서, 본원에서 제공되는, 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체의 활성을 측정하기 위한 어세이, 예컨대 본원에서 기술된 어세이는, 항-EGFR 항체의 부작용, 예컨대 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 부작용과 관련된 조직으로부터 세포주를 이용하여 수행된다. 예를 들어, 어세이는 피부 세포주를 이용하여 수행될 수 있다. EGFR은 케라티노사이트(keratinocyte), 예컨대 기저(basal) 케라티노사이트 및 모낭(hair follicle)의 외근초(outer root sheath)를 포함하여, 몇 개의 세포 유형에서 발현되고; 및 에크린(eccrine)샘 및 피지(sebaceous)샘의 세포에서 발현된다(Albanell 외 (2002) J Clin . Oncol . 20(1):110-124; Lacouture, 및 Melosky (2007) Skin Therapy Lett . 12, 1-5; Nanney 외. (1990) J. Invest. Dermatol 94(6):742-748).
일부 예에서, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 활성을 측정하기 위해 세포-기반 어세이는 케라티노사이트, 예컨대, 예를 들어, 인간 신생아 케라티노사이트(human neonatal keratinocytes); 모낭의 외근초로부터의 세포; 및 에크린샘 및 피지샘의 세포를 이용하여 수행된다. 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 활성을 측정하기 위한 세포-기반 어세이에 사용될 수 있는 다른 세포는 예를 들어, 멜라노사이트(melanocytes), 예컨대, 예를 들어, 신생(newborn) 멜라노사이트; 랑게르한스 세포; 섬유아세포; 메르켈 세포(Merkel's cells); 신경 세포; 샘(glandular) 세포; 피지샘 세포(세보사이트(sebocytes)); 및 섬유아세포 예컨대, 예를 들어 진피 섬유아세포 및 상처 섬유아세포를 포함한다. 이러한 세포를 배양하는 방법은 숙련된 당업자의 능력 내이다(예컨대, Limat 및 Hunziker (1996) Methods MoI Med . 2:21-31; Abdel-Naser 외. (2005) Egypt. Dermatol. Online J. 1(2):1 참조).
EGFR을 발현하는 세포주는 일시적 또는 안정한 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 또한, 임의의 일차 세포 또는 세포주는 예컨대 형광 표지 항-EGFR 항체 및 형광 활성화 세포 분리(FACS)를 이용하여, EGFR의 발현에 대해 평가될 수 있다. 예시적인 세포주는 A549(폐), 헬라(HeLa), 주르카트(Jurkat), BJAB, Colo205, HI 299, MCF7, MDA-MB-231, PC3, HUMEC, HUVEC, 및 PrEC를 포함한다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 활성은, 예를 들어, 세포의 표면에 결합하는 것을 검출할 수 있는 임의의 어세이를 이용하여, 평가될 수 있다. 활성은 또한 항-EGFR 항체의 기능적 활성을 평가하여 평가될 수 있다. 일부 예에서, 어세이는 EGFR에 결합하고 일부 생화학적 반응, 예를 들어 세포 용해(cellular lysis), 식균작용(phagocytosis) 리간드/수용체 결합 억제, 성장 및/또는 증식의 억제 및 세포자멸사(apoptosis)와 같은 이펙터 기능을 매개하는 항-EGFR 항체의 능력의 생명 작용에 기반한다.
이러한 어세이는 변형된 항-EGFR 항체에 대한 세포의 반응, 예를 들어 세포 생존, 세포 사멸, 세포의 식세포작용, 세포 용해, 세포 형태의 변화, 또는 전사 활성화 예컨대 천연 유전자 또는 리포터 유전자의 세포적 발현을 모니터링하는 것과 종종 관련된다. 예를 들어, 세포 증식 어세이, 세포 사멸 어세이, 유동세포 분석법, 세포 분리 기술, 형광 활성화 세포 분리(FACS), 위상 현미경, 형광 현미경, 수용체 결합 어세이, 세포 신호 어세이, 면역세포화학, 리포터 유전자 어세이, 세포 형태(예컨대, 세포 부피, 핵 부피, 세포 둘레(perimeter), 및 핵 둘레), 리간드 결합, 기질 결합, 뉴클레아제 활성, 세포자멸사, 주화성(chemotaxis) 또는 세포 이동, 세포 표면 마커 발현, 세포적 증식, GFP 양성(positivity) 및 색소 희석 어세이(예컨대, 세포막에 결합하는 염료를 가진 세포 추적 어세이), DNA 합성 어세이(예컨대, 3H-티미딘 및 BrdU 또는 Hoechst 색소와 같은 형광 DNA-결합 색소를 이용한 FACS 분석) 및 핵 반점 어세이(nuclear foci assay)는 모두 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 활성을 측정하기 위한 적합한 어세이이다. 측정될 수 있는 다른 기능적 활성은, 리간드 결합, 기질 결합, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성, 공지된 유전적 마커 및 특정되지 않은 유전적 마커 둘 다에 대한 전사적 변화(예컨대, 노던 블럿), 세포 대사의 변화, 세포적 증식과 관련된 변화, 세포 표면 마커 발현, DNA 합성, 마커 및 색소 희석 어세이(예컨대, GFP 및 세포 추적 어세이), 접촉 억제, 누드 마우스에서 종양 성장, 및 기타를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 그들의 EGFR을 발현하는 것으로 공지된 세포의 하나 이상의 표현형의 조절에 대해 평가될 수 있다. 그들의 사용을 위한 표현형 어세이, 키트 및 시약은 당업자에게 널리 공지되어 있고 본원에서 변형된 항-EGFR 항체의 활성을 측정하기 위해 사용된다. 임의의 몇몇 상업적 판매회사(vendor)로부터 구입될 수 있는, 대표적인 표현형 어세이는, 세포 생존능력, 세포 독성, 증식 또는 세포 생존(Molecular Probes, Eugene, Oregon; PerkinElmer, Boston, Mass.)를 결정하기 위한 것들, 효소적 어세이를 포함하는 단백질-기반 어세이(Panvera, LLC, Madison, Wis.; BD Biosciences, Franklin Lakes, N.J.; Oncogene Research Products, San Diego, Calif), 세포 조절, 신호 전달, 염증, 산화적 과정 및 세포자멸사(assay Designs Inc., Ann Arbor, Mich.), 중성지방 축적(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.), 혈관신생 어세이, 튜브 형성 어세이, 사이토카인 및 호르몬 어세이 및 대사적 어세이(Chemicon International Inc., Temecula, Calif; Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.)를 포함한다.
특정 표현형 어세이에 적절하도록 결정된 세포(즉, EGFR을 발현하는 것으로 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 세포)는 대조군 항체 뿐만 아니라 항-EGFR 항체로 처리될 수 있다. 일부 예에서, EGF, 또는 이의 단편은, 수용체의 활성화가 일어나도록 포함될 수 있다. 처리 기간의 끝에서, 처리된 및 처리되지 않은 세포는 본원에서 기술되거나 당업계에서 공지된 하나 이상의 방법에 의해 분석될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 활성은 세포 형태의 변화를 측정하거나, EGFR 인산화 또는 세포 증식을 측정함으로써 평가될 수 있다.
어세이는 EGFR에서 및/또는 EGFR을 발현하는 세포에서, 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체의 효과를 평가하기 위해 수행될 수 있다. 일부 예에서, EGFR의 활성은 항체가 EGF 또는 다른 자극제의 작용을 조절(예컨대 억제)하는지 결정하기 위해 EGF 또는 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 존재 또는 부재 하에서 EGF 또는 다른 자극제의 존재 하에서 자극될 수 있다. 예를 들어, 항-EGFR 항체는 EGFR과 상호작용하는 EGF의 능력을 차단함으로써 작용할 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 길항제 또는 성질에 대해 시험될 수 있다.
예를 들어, EGFR 인산화 어세이는 EGFR의 인산화를 억제하는 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 능력을 측정하기 위해 사용될 수 있다. EGF의 EGFR의 세포외 도메인과의 결합은 수용체 이량체화, 및 티로신 인산화를 유도하며, 비조절된 증식을 야기할 수 있다(Seshacharyulu 외 (2012) Expert. Opin . Ther . Targets. 16(1):15-31). 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는, EGFR에 대한 EGF의 결합을 억제할 수 있고 EGFR 인산화를 감소시킬 수 있다(예컨대, 미국 특허 번호 제8,071,093호 참조). 따라서, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 활성은 인산화된 EGFR을 검출함으로써 평가될 수 있다. 일부 예에서, 인산화된 EGFR은 당업계에 공지되거나 본원에서 기술된 방법을 이용하는 ELISA 어세이에 의해 세포 용해물에서 검출될 수 있다(예컨대, 실시예 8 참조). 억제 효과에 대한 변형된 항-EGFR 항체의 용량-의존은 변형된 항-EGFR 항체의 농도 대비 인산화된 EGFR의 농도를 플롯팅(plotting)함으로써 결정될 수 있다. EGFR의 티로신 인산화 형태는 예컨대 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.), RAYBIO (Norcross, Ga) 또는 Thermo Scientific (Rockford, IL)로부터 이용가능한 EGFR phospho ELISA 키트를 이용하여 검출될 수 있다.
성장 어세이는 변형된 항-EGFR 항체의 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 어세이는 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체에 의해 EGFR를 발현하는 세포의 성장 억제를 측정할 수 있다. 세포는 세포가 성장할 충분한 시간을 위해 배양될 수 있다(예컨대, 예를 들어, 12 시간, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 일 또는 그 이상). 세포 성장은 3H-티미딘 혼합 어세이, 5-브로모-2-데옥시우리딘(5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU) ELISA, 테트라졸리움 마이크로플레이트(tetrazolium microplate) 어세이 및 산 포스파타아제 어세이를 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다(예컨대, Maghni 외. (1999) J. Immunol . Method. 223(2):185-194). 세포 성장은 또한 Invitrogen(Cyquant NF 세포 증식 어세이 키트), Cambrex(ViaLight HS (고감도) 바이오어세이), Promega(CellTiter-Glo 발광성(Luminescent) 세포 생존능 어세이, Guava Technologies(세포성장 어세이), Stratagene(Quantos 세포 증식 어세이)으로부터 이용가능한 키트를 이용하여 측정될 수 있다(예컨대, assays for Cell Proliferation Studies, Genetic Eng . Biotechnol. News. 26(6)). 일부 예에서, 세포 성장은 항체 없을 경우 세포의 성장으로 정규화될 수 있다. 예시적인 성장 어세이에서, 세포는 어세이될 항-EGFR 항체를 포함하는 정상 성장 배지에 96-웰 플레이트의 웰에 첨가될 수 있다. 예시적인 세포 성장 어세이는 실시예 9에 도시되어 있다.
3. 동물 모델
동물 모델을 이용한 생체내(in vivo) 연구는 또한 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 치료적 활성을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 항-EGFR 항체는 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체를 이용한 치료가 고려되는 질환 및 상태의 동물 모델에 투여될 수 있다. 이러한 동물 모델은 당업계에 공지되어 있고, 인간 암 외식편(explants) 또는 계대(passaged) 이종이식(xenograft) 조직이 도입되는 면역 손상 동물, 예컨대 누드 또는 SCID 마우스(예컨대, Klein, 외. (1997) Nature Medicine 3:402-408 참조) 외인성(xenogenic) 암 모델을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 효능은 종양 형성의 억제, 종양 퇴화 또는 전이를 측정하는 어세이를 이용하여 예측될 수 있다. 동물 모델은 또한 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 부작용을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
다양한 종양 세포주 또는 종양 동물 모델이 당업계에 공지되었고 본원에 기술되어 있다. 항-EGFR 항체의 활성은 항-EGFR 항체의 투여에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 상태의 치료를 가리키는 파라미터를 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 항-EGFR 항체가 종양-내포 동물에 투여되고 그 다음 체중 및 종양 부피를 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 항-종양원성(anti-tumorigenicity)를 나타내는 파라미터는 종양 크기의 수축 및/또는 종양 진행의 지연이다. 따라서, 예를 들어, 항-EGFR 항체는 종양 성장 또는 크기를 감소시키는 것들에 대해 확인하기 위해 평가될 수 있다. 종양 크기는 항-EGFR 항체로 치료되는 종양-내포(bearing) 인간 또는 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다. 종양 수축 또는 종양 크기는 당업계에 공지된 다양한 어세이, 예컨대, 무게, 부피 또는 물리적 측정에 의해 평가될 수 있다. 항-EGFR 항체는 또한 정상 동물에 투여될 수 있고, 항-EGFR 항체와 관련된 유해 부작용을 평가하기 위해 체중이 모니터링될 수 있다.
생체 내 종양은 면역결핍 설치류에 종양 세포를 접종 또는 주입(예컨대 피하주사에 의해)함으로써 생성되는 이종이식(xenograft) 종양, 대응하는 면역적격 마우스 또는 랫트 계통(strain)에 마우스 또는 랫트 종양 세포주를 접종(예컨대 피하 주사에 의해)하여 생성된 동계의(syngenic) 종양 모델, 동물 모델에 이식된 일차 종양의 전이에 의해 생성된 전이성 종양, 종양 세포의 기원과 동일한 종에 종양 세포의 이식에 의해 생성된 동종이식(allograft) 종양, 및 동물의 유전적 조작에 의해 생성된 자연발생적인 종양을 포함하여, 임의의 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 종양 모델은 그들의 기원의 조직 또는 장기에 종양 세포의 주입, 예컨대 마우스 유방(mammary) 지방 패드에 유방 종양 세포의 주입에 의해 정위로(orthotopically) 생성될 수 있다. 일부 예에서, 이종이식 모델 또는 동계의 모델이 사용된다. 예를 들어, 종양은 면역적격 숙주(동계의) 또는 면역 결핍 숙주(예컨대 누드 또는 SCID 마우스; 이종이식)에 종양 세포 현탁액(예컨대 1 x 106 내지 5 x 106 세포/동물)으로 오른쪽 겨드랑이(armpit)에 피하 주사에 의해 형성될 수 있다. 상기 동물 모델은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 생명체, 예컨대, 예를 들어, 원숭이 및 마우스를 포함한 포유류에서의 모델을 포함한다.
종양은 동계(syngeneic), 동종(allogeneic), 또는 이종(xenogeneic)일 수 있다. 종양은 내인성 또는 외인성 EGFR을 발현할 수 있다. 외인성 EGFR 발현은 적절한 핵산을 가진 세포의 형질감염 또는 형질도입을 통해 당업계에 공지된 또는 본원에 기재된 재조합 발현의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예시적인 세포주는 EGFR이 형질감염된 NIH3T3, MCF7(인간 유방), 인간 표피양 편평(epidermoid squamous) 암종 A431, 구강 편평 세포 암종(OSCC) 세포주 BcaCD885, COLO 356/FG 췌장 세포주, HT29 및 LS174T 대장(colorectal) 종양, 및 MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 세포주를 포함한다(예컨대, Santon 외., (1986) Cancer Res. 46:4701-05 및 Ozawa 외., (1987) Int . J. Cancer 40:706-10; 미국 특허 공개 번호 20110111059호; Reusch 외. (2006) Clin . Cancer Res. 12(1):183-190; 및 Yang 외. (2011) Int. J. Nanomedicine 6: 1739-1745 참조).
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 다양한 정위(orthotopic) 종양 모델에서 시험될 수 있다. 이러한 동물 모델은 병태생리 및 공격적 암 예컨대, 예를 들어, 췌장, 전립선 및 유방 암의 치료를 연구하기 위해 숙련된 당업자에 의해 사용된다. 무흉선(athymic) 누드 또는 SCID 마우스를 포함하나, 이에 제한되지 않는 면역 결함 마우스는 공여자 환자의 인간 종양 세포 또는 단편의 장기내(intraorgan)(예컨대 췌장, 전립선 또는 유선(mammary gland))주사 부위에서 전파된 국소 및 전신 종양을 스코어링(scoring)하는데 사용될 수 있다.
일부 예에서, 항-EGFR 표적 단백질의 시험은 EGFR 항원을 내포하는 특이적 표적 세포의 감소의 평가를 용이하게 하기 위해서 영장류(예컨대 사이노몰구스 원숭이 모델)에서 효능의 연구를 포함할 수 있다. 추가적인 영장류 모델은 붉은털원숭이(rhesus monkey)의 모델을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 종양의 수여자는 임의의 적합한 쥐과 계통일 수 있다. 수여자는 nu/nu, SCID, 및 베이지 마우스를 포함하나 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 면역-관련 기능에 면역적격 또는 면역손상일 수 있다. 종양 세포가 이식될 수 있는 동물의 예는 BALB/c 마우스, C57BL/6 마우스, 중증 복합 면역결핍/베이지 마우스 (SCID-베이지)를 포함한다(예컨대, 미국 특허공개 번호 20110111059호; Reusch 외. (2006) Clin . Cancer Res. 12(1):183-190; Yang 외. (2011) Int . J. Nanomedicine 6:1739-1745 참조). 다른 예는 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식 마우스, 및 형질전환 마우스(녹인(knockin) 및 녹아웃(knockout)을 포함하여)를 포함한다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체는 마우스 암 모델, 예를 들어 이종이식 마우스에서 시험될 수 있다. 이러한 방법에서, 종양 또는 종양 세포주는 마우스에 이식되거나 주사되고, 그 후 상기 마우스는 암 성장 및 전이를 감소 또는 억제하는 항-EGFR 항체의 능력을 결정하기 위해 항-EGFR 항체로 치료된다. 또한 면역-결핍 마우스가 인간 말초 혈액 림프구(PBLs)로 주사되는 SCID 쥐과 모델의 사용 역시 고려된다.
마우스 예컨대 누드 또는 SCID 마우스에서 예시적인 인간 종양 이종이식 모델은, 인간 폐 암종(A549 세포, ATCC 번호 CCL-185); 인간 유방 종양(GI-101A 세포, Rathinavelu 외, (1999) Cancer Biochem . Biophys ., 17:133-146 또는 MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 세포); 인간 난소 암종(OVCAR-3 세포, ATCC 번호 HTB-161); 인간 췌장 암종(PANC-l 세포, ATCC 번호 CRL-1469 및 MIA PaCa-2 세포, ATCC 번호 CRL-1420); DU145 세포(인간 전립선 암 세포, ATCC 번호 HTB-81); 인간 전립선 암(PC-3 세포, ATCC# CRL-1435); 결장 암(HT-29 세포); 인간 흑색종(melanoma)(888-MEL 세포, 1858-MEL 세포 또는 1936-MEL 세포; 예컨대 Wang 외, (2006) J. Invest. Dermatol 126:1372-1377 참조); 및 인간 섬유육종(fibrosarcoma)(HT-1080 세포, ATCC 번호 CCL-121,) 및 인간 중피종(mesothelioma)(MSTO-211H 세포)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 마우스에서 예시적인 랫트 종양 이종이식 모델은 신경교종(glioma tumor)(C6 세포; ATCC 번호 CCL-107)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 마우스 종양 동종이식 모델은 마우스 흑색종(B16-F10 세포; ATCC 번호 CRL-6475)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 마우스에서 예시적인 고양이 종양 이종이식 모델은 고양이과(feline) 섬유육종(FC77.T 세포; ATCC 번호 CRL-6105)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 마우스에서 예시적인 개 종양 이종이식 모델은 개과(canine) 골육종(osteosarcoma)(D17 세포; ATCC 번호 CCL-183)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인간 이종이식 모델 및 동계의 종양 모델의 비-제한적인 예는 하기 표 14 및 15에 기재된다.
Figure pct00036
Figure pct00037
변형된 항-EGFR 항체에 대한 투여 경로는 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 투여 경로, 예컨대 복강내, 종양내 또는 정맥내일 수 있다. 항-EGFR 항체는 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 다양한 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 변형된 항-EGFR 항체는 예를 들어, 약 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg.kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg 또는 그 이상에서 또는 그 사이로 종양-내포 동물에 투여될 수 있다.
일부 예에서, 예시적인 투여량은 약 0.01 mg/㎡ 내지 약 800 mg/㎡, 예컨대 예를 들어, 약 0.01 mg/㎡, 약 0.1 mg/㎡, 약 0.5 mg/㎡, 약 1 mg/㎡, 약 5 mg/㎡, 약 10 mg/㎡, 약 15 mg/㎡, 약 20 mg/㎡, 약 25 mg/㎡, 약 30 mg/㎡, 약 35 mg/㎡, 약 40 mg/㎡, 약 45 mg/㎡, 약 50 mg/㎡, 약 100 mg/㎡, 약 150 mg/㎡, 약 200 mg/㎡, 약 250 mg/㎡, 약 300 mg/㎡, 약 400 mg/㎡, 약 500 mg/㎡, 약 600 mg/㎡ 및 약 700 mg/㎡를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 mg/kg 및 mg/m2의 단위 간의 투여량을 인식하고 변환할 수 있는 것으로 이해된다(예컨대, Michael J. Derelanko, TOXICOLOGIST'S POCKET HANDBOOK, CRC Press, p.16 (2000) 참조).
종양 크기 및 부피는 당업자에게 공지된 기술에 근거하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 종양 크기 및 부피는 방사선 촬영(radiography), 초음파 영상(ultrasound imaging), 부검(necropsy)에 의해, 캘리퍼스(calipers)의 사용에 의해, microCT에 의해 또는 18F-FDG-PET에 의해 모니터링될 수 있다. 종양 크기는 또한 시각적으로 평가될 수 있다. 특정의 예에서, 종양 크기(직경)가 캘리퍼스를 이용하여 직접적으로 측정된다. 다른 예에서, 종양 부피는 캘리퍼스 또는 초음파 평가에 의해 획득된 종양 직경(D)의 측정의 평균을 이용하여 측정될 수 있다.
부피는 공식 V = D3 x π/6 (캘리퍼스를 이용하여 측정된 직경에 대해); 공식 V = 2[길이 x (너비)2 ]/2 여기서 길이는 가장 긴 직경이고 너비는 길이에 수직인 가장 짧은 직경; 또는 V = D2 x d x π/6(초음파를 이용하여 측정된 직경에 대해 여기서 d는 깊이 또는 두께인)로 부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 캘리퍼 측정은 종양길이(l) 및 너비(w)로 구성될 수 있고 종양 부피는 길이 x 너비2 x 0.52로 측정될 수 있다.
다른 예에서, microCT 스캔은 종양 부피를 측정하기 위해 사용될 수 있다(예컨대 Huang 외. (2009) PNAS, 106:3426-3430 참조). 이러한 예에서, 마우스는 Optiray Pharmacy ioversol 주사 74% 조영제(contrast medium)(예컨대 741 mg의 ioversol/mL)로 주사될 수 있고, 마우스가 마취되면, MicroCat 1A 스캐너 또는 다른 유사한 스캐너(예컨대 IMTek)(40 kV, 600 μΑ, 196 회전 단계, 총 각도 또는 회전= 196)를 이용한 CT 스캐닝이 수행될 수 있다. 영상은 소프트웨어(예컨대 RVA3 소프트웨어 프로그램; ImTek)를 이용하여 재구성될 수 있다. 종양 부피는 이용가능한 소프트웨어를 이용함으로써 결정될 수 있다(예컨대 아미라(Amira) 3.1 소프트웨어; 머큐리 컴퓨터 시스템즈). 일부 예에서, 종양은 0일차에 피하에 주사되고, 원발성 종양의 부피는 지정된 시점에서 측정될 수 있다.
주입된 종양이 미리 결정된 크기 또는 부피에 도달하면, 변형된 항-EGFR 항체는 투여될 수 있다. 종양 진행은 시각화될 수 있고 종양 크기 및 종양 부피는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 종양 부피 또는 종양 크기는 본원에서 기술된 임의의 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 종양 부피 및 크기는 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 투여 후의 기간에 걸쳐 정기적 간격으로 예컨대, 예를 들어, 감염 후 매 시간, 매 6시간, 매 12시간, 매 24시간, 매 36시간, 매 2일, 매 3일, 매 4일, 매 5일, 매 6일, 매 7일, 매 주, 매 3주, 매 달 또는 그 이상으로 평가 또는 측정될 수 있다. 시간에 걸친 종양 부피의 중앙값 변화의 그래프가 만들어질 수 있다. 이것은 실시예 10에 예시되어 있다. 총 곡선하면적(AUC)이 계산될 수 있다. 치료적 지수는 또한 공식 AUC 비치료 동물 - AUC치료 동물/AUC비치료 X 100을 이용하여 계산될 수 있다.
일반적으로, 동일한 방식으로, 동시에, 동일한 유형의 종양 세포로 생성된 종양-내포 동물이 대조군으로 사용된다. 이러한 대조군 종양-내포 동물은 치료되지 않은 채로 남은 동물들(변형된 항-EGFR 항체가 투여되지 않은)을 포함한다. 추가적인 대조군 동물은 당업계에 공지된 항-EGFR 항체가 투여된 것들을 포함한다. 이러한 항-EGFR 항체의 예는 세툭시맙이다. 공지된 항-EGFR 항체가 투여된 종양-내포 동물이 대조군인 예에서, 투여되는 대조군 항체의 양은 변형된 항-EGFR 항체의 양과 동일할 수 있다.
항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체의 활성의 평가는, 치료된 대조군 또는 비치료된 종양-내포 동물과 비교하여 종양 크기(예컨대 직경), 부피 또는 무게의 감소를 매개하는 항체를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 치료된 대조군 또는 비치료된 종양-내포 동물과 비교하여 종양 크기, 부피 또는 무게의 감소는 항-EGFR 항체 그 자체가 종양 퇴화 또는 수축을 매개하는 것을 의미하거나 또는 항-EGFR 항체가 치료된 대조군 또는 비치료된 종양-내포 동물과 비교하여 지연된 종양 진행을 매개하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 종양 수축 또는 종양 진행의 지연은 항-종양형성(tumorigenicity)을 가리키는 파라미터이다.
예를 들어, 항-EGFR 항체는 치료된 대조군 또는 비치료된 종양-내포 동물과 비교하여 동물에서 종양 크기의 시각적 평가에 기반한 종양 크기 또는 부피에서 감소를 매개하는 것으로 확인될 수 있다. 다른 예에서, 종양 크기가 비치료된 종양-내포 동물과 비교하여 또는 참조 항-EGFR 항체로 치료되는 종양-내포 동물과 비교하여 당업계에 공지된 임의의 측정(예컨대 캘리퍼스의 사용)에 의해 측정되어 직경이 감소되는 경우 항-EGFR 항체는 종양 크기 또는 부피에서의 감소를 매개하는 것으로 확인된다. 종양 크기 또는 부피의 비교는 감염 후 임의의 미리결정된 시간에 이루어질 수 있고, 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 일부 예에서, 비교는 상기 비치료된 대조군이 희생되는 날에 이루어질 수 있다고 이해된다. 다른 예에서, 총 AUC의 분석은 이루어질 수 있고, AUC 값은 기간 동안 종양의 크기 및 부피의 지표로 비교된다.
종양 크기 또는 부피에 대한, 변형된 항-EGFR 항체의 효과는 항-EGFR 항체-치료 동물과 비교하여 대조군 치료 동물의 투여 후 지정된 시간에 종양 크기 또는 부피의 비율(대조군-치료 동물의 종양 크기 또는 부피/변형된 항-EGFR 항체-치료 동물의 종양 크기 또는 부피)로서 나타날 수 있다. 평가는 1.0 보다 큰, 예를 들어, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 또는 그 이상보다 큰 종양 수축 비율을 보이는 동물을 유발하는 항-EGFR 항체를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 특정의 예에서, 상기 결과는 치료 과정 동안 총 AUC 영역의 비율(대조군-치료 동물의 종양 크기 또는 부피의 AUC/변형된 항-EGFR 항체-치료 동물의 AUC 종양 크기 또는 부피)로서 나타난다. 항-EGFR 항체는 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 또는 그 이상보다 큰 AUC에 의해 측정되는 대상체에서 종양 수축의 비율을 유발하는 것으로 확인될 수 있다. 1.2 또는 5의 비율은 변형된 항-EGFR 항체가 감소된 종양 크기 또는 부피를 유발하고 참조 또는 대조군과 비교하여 120% 또는 500% 항-종양형성 활성의 결과를 가져오는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
특정의 예에서, 치료지수(therapeutic index)는 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체의, 종양 크기 또는 부피에 대한 효과의 척도로서 결정될 수 있다. 항-EGFR 항체는, 대조군 항-EGFR 항체의 치료지수와 비교하여 적어도 또는 약 적어도 또는 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 또는 그 이상을 가질 수 있다.
추가의 예에서, 종양은 동물로부터 수확될 수 있고 무게가 측정될 수 있다. 항-EGFR 항체의 투여는 대조군 종양-내포 동물로부터 수확된 종양과 비교하여 종양 무게에서 감소를 야기할 수 있다. 무게는 또한 투여 후 동일한 시간에 대조군 cfy 동물로부터 수확된 종양과 비교될 수 있다. 무게에 있어서의 변화는 종양 무게의 비율로서 표현될 수 있다(종양 무게 대조군 치료 동물/항-EGFR 치료된 동물의 종양 무게). 항-EGFR 항체는 1.0보다 큰, 예를 들어 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 또는 그 이상보다 큰 종양 무게의 비율을 나타내는 대상체를 야기할 수 있다. 1.2 또는 5인 종양 무게의 비율은 항-EGFR 항체가 감소된 종양 무게를 달성하고 참조 또는 대조군과 비교하여 120% 또는 500% 항-종양형성을 야기하는 것을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
특정의 예에서, 상기 동물에서 다른 장기 또는 조직에 항-EGFR 항체의 효과는 평가될 수 있다. 예를 들어, 다른 장기는 상기 동물로부터 수확될 수 있고, 무게가 측정 및/또는 조사될 수 있다.
동물 연구는 또한 표준 약리학적 프로파일에서 산정될 수 없는 또는 변형된 항-EGFR 항체의 반복된 투여 후에만 일어나는 부작용과 같은 유해 부작용을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 변형된 항-EGFR 항체의 평가되는 유해 부작용은 피부독성 및 저마그네슘혈증을 포함하는, 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 항-EGFR 항체의 임의의 부작용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세툭시맙의 공지의 부작용은 증상적 저마그네슘혈증, 손발톱주위염(paronychia), 발열, 피부과 독성(dermatologic toxicity), 안면 및 상반신의 구진농포성 발진(papulopustular rash), 털 성장 이상, 두피 모발(scalp hair)의 손실, 얼굴의 털 및 속눈썹의 증가된 성장, 피부 건조증 및 소양증, 및 연화를 동반한 손발톱주위 염증(periungual inflammation with tenderness)(Eng (2009) Nat. Rev. 6:207-218; Schrag 외. J. Natl . Cancer Inst . 97(16):1221-1224; Lacouture, 및 Melosky (2007) Skin Therapy Lett . 12:1-5)을 포함하여 본원에서 기술된 및/또는 당업계에 공지된 임의의 것을 포함한다. 부작용을 평가하기 위해 측정될 수 있는 다른 파라미터들은 음식 소비, 체중, 항체 형성, 임상 화학, 및 표준 장기/조직의 거시적 및 미시적 조사(예컨대 심장독성)을 포함하는 표준 측정을 포함한다. 추가적인 측정의 파라미터는 주사 부위 외상(trauma) 및 임의의 중화 항체의 측정을 포함한다.
예를 들어, 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 저마그네슘혈증은 진단될 수 있고 및/또는 혈청 마그네슘 수준의 측정에 의해 평가될 수 있다. 구진농포성 발진 및 여드름양 발진은 구진(papules)(작게 올라온 여드름) 및 농포(pustules)(작은 고름이 가득한 물집)로 구성된 뾰루지(eruptions)를 관찰함으로써, 동물 모델, 예컨대 마우스 모델 및 사이노몰구스 원숭이 모델에서 특징화될 수 있다. 피부 건조증은 얇게 벗겨지고 칙칙한 피부, 세공(fine pores), 및 종이 같이 얇은 피부 질감으로 특징화될 수 있다. 과색소침착(hyperpigmentation)은 과도한 멜라닌 퇴적에 의한 피부의 다크닝(darkening)에 의해 특징화될 수 있다. 소양증(Pruritus)은 긁는 동물을 관찰함으로써 평가될 수 있다. 손발톱주위염(Paronychia)은 검사에 의해 평가될 수 있다.
일부 예에서, 피부 독성의 존재는 인간 피부가 마우스에 이식된 마우스 모델에서 평가될 수 있다(예컨대, Nanney 외.(1996) J. Invest. Dermatol . 106(6):1169-1174 참조). 또한, 피부과의 부작용은 다른 동물 모델에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 사이노몰구스 원숭이에서, 세툭시맙 투여 후 주사 부위에의 염증 및 외부의 외피(external integument)의 박리가 평가될 수 있다. 유사한 효과는 비강통로, 식도, 및 혀의 상피 점막에서, 및 신장 세뇨관 상피에서의 퇴행성 변화에서 관찰될 수 있다. 평가될 수 있는 다른 상피 독성은 결막염, 붉게 부은 눈, 및 창자 장애의 증상을 포함한다(예컨대, Lutterbuese 외. (2010) Proc . Natl . Acad . Sci. 107(28):12605-12610; European Medicines Agency (2009) Summary of product characteristics (Erbitux) 참조).
부작용은 건강한 동물 모델 또는 질병 또는 상태의 동물 모델, 예컨대 본원에서 기술되는 동물 모델에서 평가될 수 있다. 일부 예에서, 이러한 어세이는 임의의 예측되지 않은 유해한 효과가 간과되지 않음을 확실히 하기 위하여 2개 종(예컨대 설치류 및 비-설치류)에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 이러한 모델은 유전독성, 만성 독성, 면역독성, 생식/발달 독성, 발암성을 포함하는 다양한 독성을 측정할 수 있다.
4. 약동학 및 약력학 어세이
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 약동학(PK) 및 약력학(PD) 어세이는 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다(예컨대, Klutchko, 외, (1998) J Med . Chem . 41:3276-3292 참조). 측정의 파라미터의 예는 일반적으로 투여 후, 최대(피크) 혈장 농도(Cmax), 피크 시간(즉 최대 혈장 농도가 발생하는 경우; Tmax), 최소 혈장 농도(즉 용량 간의 최소 혈장 농도; Cmin), 제거 반감기(T1/2) 및 키나아제 하 면적(즉 시간 대 혈장 농도를 플롯팅함으로써 생성되는 곡선하면적; AUC)을 포함한다. 투여된 변형된 항-EGFR 항체의 절대적인 생체이용률은 피하 전달에 의한 곡선하면적(AUCSC)과 정맥 전달에 의한 AUC(AUViv)를 비교함으로써 결정될 수 있다. 절대적인 생체이용률(F)은, 공식을 이용하여 계산될 수 있다: F = ([AUC]SC χ dosesc) / ([AUC]iv x doseiv). 투여 후의 혈장 내 항-EGFR 항체의 투여는 혈액 시료에서 항체의 투여를 평가하기 위해 적합한 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예시적인 방법은 ELISA 및 혼탁법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가의 측정되는 파라미터는 i.v.(정맥내) 투여 후에 획득된 농도-시간 데이터 및 생체이용률의 구획화된(compartmental) 분석을 포함할 수 있다. 생체 내 분포(Biodistribution), 선량측정(dosimetry) (방사능 표지된 항체 또는 Fc 융합체에 대한), 및 PK 연구는 또한 설치류 모델을 포함하여, 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 동물 모델을 포함한, 동물 모델에서 수행될 수 있다. 이러한 연구는 일부 또는 모든 투여된 용량에서의 내성, 국소 조직에 대한 독성, 설치류 이종이식 동물 모델에 대한 우선적 국소화(localization) 및 표적 세포(예컨대 CD20 양성 세포)의 감소를 평가할 수 있다. 약력학적 연구는 특정 종양 세포를 표적화하는 것 또는 신호 메커니즘을 차단하는 것, EGFR을 발현하는 세포 또는 신호의 감소를 측정하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
PK 및 PD 어세이는 건강한 동물모델, 질병에 걸린 동물 모델 및 인간을 포함하여, 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 동물 모델에서 수행될 수 있다. PD 및/또는 PK 특성에 대한 변형된 항-EGFR 항체를 스크리닝하는 것은 변형된 항-EGFR 항체에 의해 부여되는 PD, PK, 및 치료적 효능의 최적의 균형을 정의하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체의 배열(array)은 서로 다른 조직에서뿐만 아니라, 다양한 면역 세포 유형에서 상이하게 발현되는 것으로 당업계에 공지되어 있다. Fc 수용체의 상이한 조직 분포는 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 약력학적(PD) 및 약동학적(PK) 성질에 영향을 미칠 수 있다.
용량의 범위 및 투여의 상이한 투여 빈도는 그 용량에서 변형된 항-EGFR 항체의 농도를 증가 또는 감소시키는 효과를 평가하기 위해 약동학적 연구에 적용될 수 있다. 투여된 변형된 항-EGFR 항체의, 약동학적 성질, 예컨대 생체이용률은 본원에서 기술된 치료제 또는 요법(regimen)의 병용-투여와 함께 또는 병용-투여없이 평가될 수 있다. 예를 들어, 개, 예컨대 비글은 변형된 항-EGFR 항체 단독으로 또는 본원에서 기술된 하나 이상의 치료제 또는 투여 요법과 함께 투여될 수 있다. 변형된 항-EGFR 항체는 치료제 또는 투여 요법의 전, 그 동안 또는 후에 투여될 수 있다. 혈액 시료는 이후 다양한 시점에 취해질 수 있고 혈장의 변형된 항-EGFR 항체의 양은 예컨대 혼탁법(nephelometry)에 의해 결정된다. 상기 AUC는 이후 측정될 수 있으며 추가의 치료제(들) 또는 요법(들)의 병용-투여와 함께 또는 병용-투여없이 투여된 변형된 항-EGFR 항체의 생체이용률이 결정될 수 있다. 이러한 연구는 투여된 항-EGFR 항체의 약동학적 성질, 예컨대 생체이용률에 있어 병용-투여의 효과를 평가하기 위해 수행될 수 있다.
변형된 항-EGFR 항체의 단일 또는 반복된 투여는 혈장 농도를 이용하여 반감기를 평가하기 위해 약 6000-배(약 0.05-300 mg/kg)의 용량 범위를 통해 일어날 수 있고 정상 상태(steady state)에서의 분포 용적 및 전신적 흡수의 수준뿐만 아니라 청소율(clearance)이 측정될 수 있다.
F. 약제학적 조성물, 제형, 키트, 제조품 및 조합물
1. 약제학적 조성물 및 제형
임의의 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 약제학적 조성물은 투여를 위해 본원에 제공된다. 약제학적으로 허용가능한 조성물은 조절 기관 또는 동물 및 인간에서 사용을 위해 일반적으로 인식되는 약전에 따라 제조되는 다른 기관용 승인을 고려하여 제조된다. 전형적으로, 화합물은 당업계에 널리 공지된 기술 및 공정을 이용하여 약제학적 조성물로 제형화된다(예컨대, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126 참조).
약제학적 조성물은 치료적, 예방적, 및/또는 진단적 용도에 이용될 수 있다. 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제로 제형화될 수 있다. 일반적으로, 이러한 약제학적 조성물은 항체, 예컨대 그것의 특정 에피토프에 결합(예컨대 EGFR에 결합)하는 것과 같은 생물학적 성질을 상당히 손상시키지 않을 요소를 이용한다. 각각의 요소는 다른 성분과 양립가능되고 환자에게 유해하지 않는다는 의미에서 약제학적으로 및 생리적으로 허용가능하다. 상기 제형은 단위 투여량 형태로 편리하게 나타날 수 있고 정제, 환제, 분말, 액체 용액 또는 현탁액(예컨대, 주사가능한 제형, 섭취가능한 제형, 및 국소 제형(예컨대, 안약, 겔, 페이스트, 크림, 또는 연고), 에어로졸(예컨대, 비강 스프레이), 리포솜, 좌약, 페서리, 주사가능하고 주입가능한 용액 및 지연 방출 형태를 포함)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 의약 업계에 널리 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, Gilman, 외. (eds. 1990) Goodman 및 Gilman's 참조: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa.; Avis, 외. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, 외. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; 및 Lieberman, 외. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY를 참조하라. 전신적으로 투여되는 경우, 치료적 조성물은 멸균이고, 발열성 물질이 없고, 일반적으로 미립자 물질이 없는, 및 pH, 등장성(isotonicity), 및 안전성을 충분히 고려하여 비경구적으로 허용가능한 용액 내이다. 이러한 조건은 당업자에게 공지되어 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하는 방법은 널리 공지되거나 당업자에게 명백하거나 예컨대, "Remington : The Science and Practice of Pharmacy (종전에는 Remington's Pharmaceutical Sciences)", 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)에 더 상세히 기재될 것이다.
본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 다양한 형태, 예컨대, 고체, 반-고체, 액체, 분말, 수성, 또는 동결건조 형태일 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 당업계에 공지되어 있고 무엇보다도 물, 완충제, 식염수, 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline solutions), 습윤제의 다양한 형태, 멸균 용액, 알코올, 검 아라빅(gum arabic), 식물성 오일, 벤질 알코올, 젤라틴, 글리세린, 탄수화물 예컨대 락토스, 수크로스, 아밀로스 또는 전분, 스테아르산 마그네슘, 탈크, 규산, 점성이 있는 파라핀, 퍼퓸 오일, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세리드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 하이드록시 메틸셀룰로스, 분말을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 그중에서도 예를 들어, 항산화제, 보존제, 항생제, 진통제(analgesic agents), 결합제, 붕해제, 착색제, 희석제, 부형제, 전색제(extenders), 활주제(glidants), 가용화제, 안정화제, 장성제(tonicity agents), 비히클(vehicles), 증점제(viscosity agents), 착향료, 에멀전, 예컨대 오일/물 에멀전, 유화 및 현탁화제, 예컨대 아카시아, 한천, 알긴산(alginic acid), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 벤토나이트(bentonite), 카보머(carbomer), 카라기난(carrageenan), 카복시메틸셀룰로스(carboxymethylcellulose), 셀룰로스(cellulose), 콜레스테롤(cholesterol), 젤라틴, 하이드록시에틸 셀룰로스(hydroxyethyl cellulose), 하이드록시프로필 셀룰로스(hydroxypropyl cellulose), 하이드록시프로필메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose), 메틸셀룰로스(methylcellulose), 옥톡시놀 9(octoxynol 9), 올레일 알코올(oleyl alcohol), 포비돈(povidone), 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트(propylene glycol monostearate), 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate), 소르비탄 에스테르(sorbitan esters), 스테아릴 알코올(stearyl alcohol), 트래거캔스(tragacanth), 잔탄 검(xanthan gum), 및 이의 유도체, 용매, 및 다양한(miscellaneous) 성분 예컨대 결정 셀룰로스(crystalline cellulose), 미결정 셀룰로스(microcrystalline cellulose), 시트르산(citric acid), 덱스트린(dextrin), 덱스트로스(dextrose), 액체 글루코스(liquid glucose), 젖산(lactic acid), 락토스(lactose), 염화마그네슘(magnesium chloride), 포타슘 메타포스페이트(potassium metaphosphate), 전분을 포함하는 다른 첨가제를 포함할 수 있다(일반적으로, Alfonso R. Gennaro (2000) Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins 참조). 이러한 담체 및/또는 첨가제는 종래의 방법에 의해 제형화될 수 있고 적합한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 안정화제 예컨대 지질, 뉴클레아제 억제제, 폴리머, 및 킬레이트제는 체내에서 분해로부터 조성물을 보호할 수 있다.
항체 투여의 경로는 공지된 방법과 일치되고, 예컨대 정맥내, 복강내(intraperitoneal), 대뇌내(intracerebral), 근육내, 피하, 안구내, 동맥내, 척추강내(intrathecal), 흡입(inhalation) 또는 병변내(intralesional) 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 또는 하기 기재된 지연 방출 시스템에 의한다. 항체는 전형적으로 주입 또는 볼루스 주사에 의해 지속적으로 투여된다. 누구나 국소 또는 전신의 방식으로 항체를 투여할 수 있다.
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항체는 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 제조될 수 있다. 제형(formulation) 및 화합물의 투여에 대한 기술은 당업계에 공지되어 있다(예컨대 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa. 참조). 이러한 치료적 조성물은 정맥으로 또는 코 또는 폐를 통해, 바람직하게는 액체 또는 분말 에어로졸(동결건조)으로 투여될 수 있다. 조성물은 또한 희망된다면 비경구 또는 피하로 투여될 수 있다. 전신적으로 투여되는 경우, 치료적 조성물은 멸균이고, 발열성 물질이 없고, pH, 등장성(isotonicity), 및 안정성을 충분히 고려한 비경구로 허용가능한 용액이어야한다. 이러한 조건은 당업자에게 공지되어 있다.
사용에 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 항-EGFR 항체가 의도한 목적을 성취하기 위해 유효량으로 함유되는 조성물을 포함한다. 치료적 유효량의 결정은 널리 당업자의 능력 범위 내에 있다. 치료적 유효 투여량은 본원에 기술된 바와 같이 시험관내의 사용 및 생체내 방법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 약제학적 제조의 경우, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체는 투여를 위한 단위 투여 형태로 나타날 수 있다.
치료적 제형은 다양한 종래 투여량 제형으로 투여될 수 있다. 요약하면, 본원에서 제공되는 항체의 투여량 제형은 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제와 함께 바람직한 순도를 갖는 화합물을 혼합함으로써 저장 또는 투여를 위해 제조된다. 이러한 물질은 도입되는 투여량 및 농도로 수신자에게 비-독성이며 완충액, 예컨대 트리스 HCl, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 및 다른 유기산 염; 항산화제, 예컨대 아스코르브산; 저분자량(약 10개 잔기 미만) 펩타이드, 예컨대 폴리아르기닌, 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예컨대 폴리비닐피롤리디논(polyvinylpyrrolidinone); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루탐산(glutamic acid), 아스파르트산, 또는 아르기닌; 단당류, 이당류, 및 셀룰로스 또는 이의 유도체, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 반대이온, 예컨대 나트륨 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN, PLURONICS 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol)을 포함할 수 있다.
본원의 특정의 예에서, 안정화제를 함유하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다. 상기 안정화제는 아미노산, 아미노산 유도체, 아민, 당, 폴리올, 염(salt) 또는 계면활성제일 수 있다. 일부 예에서, 안정한 공동-제형은 단일한 안정화제를 함유한다. 다른 예에서, 안정한 공동-제형은 2, 3, 4, 5 또는 6종의 상이한 안정화제를 함유한다.
예를 들어, 상기 안정화제는 당 또는 폴리올, 예컨대 글리세롤, 소르비톨, 만니톨, 이노시톨, 수크로스 또는 트레할로스일 수 있다. 특정의 예에서, 상기 안정화제는 수크로스이다. 다른 예에서, 상기 안정화제는 트레할로스이다. 상기 당 또는 폴리올의 농도는 각 경계값을 포함하여 약 100 mM 내지 500 mM, 100 mM 내지 400 mM, 100 mM 내지 300 mM, 100 mM 내지 200 mM, 200 mM 내지 500 mM, 200 mM 내지 400 mM, 200 mM 내지 300 mM, 250 mM 내지 500 mM, 250 mM 내지 400 mM, 250 mM 내지 300 mM, 300 mM 내지 500 mM, 300 mM 내지 400 mM, 또는 400 mM 내지 500 mM일 수 있다.
예를 들어, 상기 안정화제는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 폴록사머 및 폴리소르베이트인 계면활성제일 수 있다. 예를 들어, 상기 계면활성제는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 폴록사머 및 폴리소르베이트, 예컨대 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80일 수 있다. 특정의 예에서, 상기 안정화제는 폴리소르베이트 80이다. 계면활성제의 농도는, 각 경계값을 포함하여 제형 내 질량 농도의 a %(w/v)로서, 각 경계값을 포함하여 약 0.005% 내지 1.0%, 0.01% 내지 0.5%, 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 또는 0.01% 내지 0.02% 사이이다.
생체 내 투여를 위해 사용될 때, 변형된 항-EGFR 항체 제형은 멸균이어야 하고 통상적인 약제학적 관습에 따라 제형화될 수 있다. 이는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에, 멸균 필터 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 항체는 보통 동결건조된 형태로 또는 용액 내에서 보관될 것이다. 참깨, 땅콩, 또는 목화 오일과 같은 자연적으로 발생하는 식물성 오일 또는 에틸 올레이트 또는 그와 유사한 것과 같은 합성 지방 비히클이 희망될 수 있다. 완충액, 보존제, 항산화제 및 그와 유사한 것들이 수용되는 약제학적 관습에 따라 통합될 수 있다.
항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체는 약 0.1 내지 10 mg/mL, 예컨대, 예를 들어 적어도 또는 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10 mg/mL 또는 그 이상의 농도로 제공될 수 있다. 용액의 부피는 약 1 내지 100 mL, 예컨대, 예를 들어, 적어도 또는 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mL 또는 그 이상이 될 수 있다. 일부 예에서, 항-EGFR 항체는 인산 완충 식염수로 공급된다. 예를 들어, 항-EGFR 항체는 50-mL으로서, 인산 완충 식염수에 2 mg/mL의 농도에 항-EGFR 항체의 100 mg을 함유하는 1회용 바이알로 공급될 수 있다.
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체는 저장을 위해 동결건조될 수 있고 사용 전에 적합한 담체 내에 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 도입될 수 있는 종래 면역글로불린 및 단백질 제조 및 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 효과적이라는 것을 보여준다.
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체는 제어 방출 또는 지연 방출 조성물로 제공될 수 있다. 고분자 물질은 본원에서 제공되는 항체의 제어 또는 지연방출을 달성할 수 있는 환제 및 캡슐의 제형화에 대해 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Medical Applications of Controlled Release, Langer 및 Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability , Drug Product Design and Performance, Smolen 및 Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Langer 및 Peppas (1983) J, Macromol . Sci . 23:61 참조; 또한 Levy 외. (1985) Science 228:190; During 외. (1989) Ann. Neurol . 25:351; Howard 외 (1989) J. Neurosurg. 71:105 참조; 미국 특허 번호 제5,679,377호, 제5,916,597호, 제5,912,015호, 제5,989,463호, 제5,128,326호; 및 PCT 공개 번호 WO 99/15154호 및 WO 99/20253호 참조). 지연 방출 제형으로 사용되는 고분자의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸메타크릴레이트)(poly(2-hydroxy ethylmethacrylate)), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(poly(methyl methacrylate)), 폴리(아크릴산)(poly(acrylic acid)), 폴리(에틸렌-코-바이닐 아세테이트)(poly(ethylene-co-vinyl acetate)), 폴리(메타크릴산)(poly(methacrylic acid)), 폴리글리콜라이드(polyglycolides, PLG), 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 폴리(N-바이닐 피롤리돈)(poly(N-vinyl pyrrolidone)), 폴리(바이닐 알코올)(poly(vinyl alcohol)), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리(에틸렌 글리콜)(poly(ethylene glycol)), 폴리락타이드(polylactides, PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(poly(lactide-co-glycolides), PLGA), 및 폴리오르토에스테르(polyorthoesters)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 지연 방출 제형에서 사용되는 고분자는 불활성(inert)이고, 여과할 수 있는 불순물이 없고, 저장소에서 안정하고, 멸균이고, 및 생분해성이다. 지연 방출 제형의 생산을 위한 당업계에 공지된 임의의 기술은 본원에서 제공되는 하나 이상의 항-EGFR 항체를 포함하는 지연 방출 제형을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
일부 예에서, 약제학적 조성물은 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체 및 하나 이상의 추가적인 항체를 함유한다. 일부 예에서, 하나 이상의 추가의 항체는 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 항-EGFR 항체 예컨대, 예를 들어, ABX-EGF 또는 세툭시맙을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
2. 제조품/키트
변형된 항-EGFR 항체 또는 변형된 항-EGFR 항체를 암호화하는 핵산, 또는 이의 유도체 또는 생물학적 활성 부분의 약제학적 조성물은 포장 물질, 항-EGFR 항체의 투여에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 상태, 예컨대 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 질환 및 상태를 치료하는데 유효한 약제학적 조성물, 및 항체 또는 핵산 분자가 감염, 질환, 또는 장애를 치료하는데 사용될 것이라고 표시하는 라벨을 함유하는 제조품으로 포장될 수 있다. 약제학적 조성물은 단일 투여 또는 다중 투여용 약제학적 조성물의 양을 함유하는 단위 투여량 형태로 포장될 수 있다. 포장된 조성물은 제공되는 변형된 항-EGFR 항체를 함유하는 약제학적 조성물의 동결건조된 분말을 포함할 수 있고, 투여 전에 재구성(예컨대 물 또는 식염수로)될 수 있다.
본원에서 제공되는 제조품은 포장 물질을 함유한다. 약제학적 제품들을 포장하는데 이용하기 위한 포장 물질들이 당업자에게 널리 공지되어 있다(예컨대 미국 특허 제5,323,907호, 제5,052,558호 및 제5,033,252호 참조. 약제학적 포장 물질의 예로는 물집 팩, 병, 튜브, 흡입기(예컨대, 가압 정량 흡입기(MDI), 건조 분말 흡입기(DPI)), 분무기(예컨대, 제트 또는 초음파 분무기) 및 다른 단일 호흡 액체 시스템), 펌프, 봉지, 바이알, 용기, 주사기, 병, 및 선별된 제형 및 의도된 투여 및 치료 형태에 적합한 임의의 포장 물질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 상기 항체를 암호화하는 핵산분자, 약제학적 조성물 또는 조합물은 또한 키트로 제공될 수 있다. 키트는 선택적으로 하나 이상의 구성요소 예컨대 사용을 위한 지침, 장치 및 추가 시약(예컨대, 조성물의 희석 및/또는 동결건조된 단백질의 재구성을 위한 멸균된 물 또는 식염수), 및 구성요소, 예컨대 상기 방법의 실행을 위한 튜브, 컨테이너 및 주사기를 포함할 수 있다. 예시적인 키트는 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체를 포함할 수 있고 선택적으로 사용을 위한 지침, 대상체에 항-EGFR 항체를 투여하는 장치, 대상체에서 항-EGFR 항체를 검출하는 장치, 대상체로부터 획득된 시료에서 항-EGFR 항체를 검출하는 장치, 및 대상체에 추가적 치료제를 투여하는 장치를 포함할 수 있다.
상기 키트는 선택적으로, 지침을 포함할 수 있다. 지침은 전형적으로 변형된 항-EGFR 항체 및, 선택적으로 키트에 포함되는 다른 구성요소를 기술하는 구체적인 표현, 및 대상체의 적정한 상태를 결정하기 위한 방법, 적절한 투여량, 투여 요법, 및 항-EGFR 항체를 투여하기 위한 적절한 투여 방법을 포함하는, 투여 방법을 포함한다. 지침은 또한 치료 시간의 지속에 걸쳐 대상체를 모니터링하기 위한 안내서를 포함할 수 있다.
키트는 또한 본원에서 기술된 약제학적 조성물 및 진단용 아이템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 대상체에 선별된 항-EGFR 항체의 농도, 양 또는 활성을 측정하기 위한 아이템을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 항-EGFR 항체는 분리된 생물학적 시료(예컨대, 종양 세포, 예컨대 대상체로부터 획득된 순환 종양 세포 또는 대상체로부터 적출된 종양 세포)에서 EGFR의 검출을 위한 진단 키트에 제공된다. 일부 예에서, 진단 키트는 하나 이상의 항-EGFR 항체 및/또는 하나 이상의 대조군 항체(즉 당업계에 공지된 비-EGFR 결합 항체 또는 EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙)의 패널을 포함하고, 패널에서 하나 이상의 항체는 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체이다.
본원에서 제공되는 키트는 또한 대상체에 항-EGFR 항체를 투여하는 장치를 포함할 수 있다. 대상체에 의약품을 투여하기 위한 당업계에 공지된 임의의 다양한 장치는 본원에서 제공되는 키트에 포함될 수 있다. 예시적인 장치는 피하주사 바늘(hypodermic needle), 정맥주사 바늘 및 카테터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로 키트의 변형된 항-EGFR 항체의 투여를 위한 장치는 변형된 항-EGFR 항체의 바람직한 투여 방법과 양립가능될 것이다.
3. 조합물
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체 및 제2 제제, 예컨대 제2 항-EGFR 항체 또는 다른 치료적 또는 진단적 제제의 조합물이 제공된다. 조합물은 본원에서 제공되는 방법에 따르는 이의 치료를 수행하기 위한 임의의 항-EGFR 항체 또는 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조합물은 임의의 항-EGFR 항체 및 화학요법제를 포함할 수 있다. 조합물은 또한 하나 이상의 추가의 치료적 항체와 함께 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 치료제는 항암제, 예컨대 예를 들어, 섹션 G에 기술된 바와 같은 화학요법제이다. 제공되는 이의 변형된 항-EGFR 항체의 조합물은 또한 항-EGFR 항체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 본원에서 기술된 바와 같이 항-EGFR 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 숙주 세포를 함유할 수 있다. 본원에서 제공되는 조합물은 단일 조성물 또는 별개의 조성물로 제형화될 수 있다.
G. 치료적 용도
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 또는 이의 단편은 항-EGFR 항체의 사용을 위해 숙련된 당업자에게 공지된 임의의 목적으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 치료, 진단, 산업 및/또는 연구 목적으로 이용될 수 있다. 특히, 본원에서 제공되는 방법은 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 치료적 사용을 위한 방법을 포함한다. 일부 예에서, 본원에서 기술된 항-EGFR 항체는 EGFR을 포함하는 표적세포, 예컨대, 예를 들어 암 세포를 죽이기 위해 이용될 수 있다. 일부 예에서, 항-EGFR 항체는 EGFR을 차단, 길항(antagonize) 또는 작용(agonize)할 수 있다. 이러한 활성 덕분에, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 또는 이의 단편은 종양, 암 또는 전이를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 항-EGFR 항체로의 치료에 반응하는 임의의 상태의 치료를 위해 환자 또는 대상체에 투여될 수 있다. 치료적 용도는 단독 또는 다른 치료 또는 제제와 병용하여, 항-EGFR 항체의 치료적 유효량의 투여를 포함한다.
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체, 및 이의 단편은 기존의 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙이 이용되는 임의의 질환 또는 상태의 치료를 위해 치료제로서 이용될 수 있다. 투여 시, 항-EGFR 항체는 다른 항-EGFR 항체의 투여 후 관찰될 수 있는 부작용과 비교하여 감소되거나 줄어든 부작용을 나타내는 대상체를 야기한다. 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체로의 질환 또는 상태의 치료는 주입, 피하 주사, 근육내, 피내, 구강, 및 국소 및 경피 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 본원에서 기술된 바와 같이 적합한 제형을 이용하여 임의의 적합한 투여 경로에 의해 수행될 수 있다.
본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 기존의 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙은, 투여 시, 국소 및 전신의 부작용, 특히 피부 부작용을 나타내는 대상체를 야기할 수 있다. 이러한 부작용은 치료적 용도를 제한한다. 많은 경우에, 이러한 부작용은 중성의 생리적 pH 환경, 예컨대 피부 진피에서 EGFR에의 결합과 관련이 있다. 중성 pH(예컨대 약 7.0 내지 7.4를 포함하는 pH) 및/또는 0.5 mM 내지 5 mM(예컨대 1 mM)의 정상 락테이트 농도 중 어느 하나 또는 둘 다를 함유하는 조건 하에서 보다, 예컨대 약 5.6 내지 약 6.8, 그리고 특히 6.0 내지 6.5를 포함하는 범위의 낮은 pH, 및/또는 15 mM 내지 20 mM(예컨대 16.6 mM 또는 16.7 mM)의 락테이트 농도 중 어느 하나 또는 둘 다를 함유하는 조건 하에서 더 활성인, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체가 본원에서 기술되는 임의의 질환 또는 상태의 치료를 위해 투여될 수 있다. 활성 때문에, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 항-EGFR 항체의 하나 이상의 부작용과 관련된 중성 생리적 환경, 예컨대 피부 기저층보다 종양 환경(낮은 pH 및/또는 증가된 젖산 농도를 가질 수 있는)에서 더 큰 활성을 가질 수 있다. 이것은 국소 및 전신 부작용을 포함하여, 부작용을 감소시키거나 예방하기 위해, 오직 질병에 걸린 조직, 예컨대 종양 조직에 대한 표적 치료에 의해 유리해질 수 있다.
감소된 부작용과 관련된 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 예컨대 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 고투여량 요법에서 이용될 수 있고, 개선된 효능 및 안전성을 가질 수 있다. 기존의 항-EGFR 항체 치료, 예컨대 세툭시맙에 의해 관찰되는 것들과 비교하여 감소될 수 있는 부작용은 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 바람직하지 않은 비치료적 효과, 예컨대 오심, 구토, 흉부 압박, 두통, 및 관련 심혈관 효과, 예컨대 혈압 불안정 및 동맥 수축, 피부 독성, 골수 억제(bone marrow suppression), 심독성, 탈모, 신장 기능 장애, 구내염, 빈혈, 발작, 면역 반응, 예컨대 급성 아나필락시스(anaphylaxis), 혈청병, 항체의 생성, 감염, 암, 자가 면역 질환 및 심독성을 포함한다. 일부 예에서, 기존의 항-EGFR 항체 치료제, 예컨대 세툭시맙의 투여에 의해 야기된 부작용과 비교하여, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 투여는 비변형 EGFR 항체의 하나 이상의 부작용의 중증도 대비 하나 이상의 부작용의 중증도를 적어도 약 99 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 75 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 65 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 55 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 45 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 35 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 25 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 15 %, 또는 적어도 약 10 % 감소시킨다.
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항- EGFR 항체, 및 항체 단편은, 투여 시, 다른 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙과 비교하여 줄어든 또는 감소된 부작용을 나타내는 대상체를 야기할 수 있는 반면, 투여 시 일부 부작용이 발생할 수 있다는 것이 이해된다. 참을 수 있는 부작용의 수 및 정도는 상기 화합물이 투여되는 상태에 의존하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 덜한 결과의 장애를 치료할 때 용인될 수 없는 특정 독성 및 바람직하지 않은 부작용은 생명을 위협하는 질병을 치료하는 경우 용인된다. 치료적 용도를 위한 유효량은 투여 경로뿐만 아니라 대상체의 질환의 중증도 및 체중 및 일반적인 상태에 의존할 수 있다. 치료제의 국소 투여는 일부의 경우에, 치료제의 국소 농도가 전신 투여 시 안전하게 달성할 수 있는 것보다 높을지라도, 전신 투여의 임의의 모드보다 전형적으로 더 적은 투여량을 요구할 것이다.
이 섹션은 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체를 위한 예시적인 용도, 및 투여 방법을 제공한다. 이 기술된 용도들은 예시이고 본원에서 기술된 방법의 적용을 제한하는 것은 아니다. 항-EGFR 항체를 사용하여 치료될 수 있는 질환 또는 상태를 확인하는 것은 치료 의사의 수준 내에 있다.
1. 예시적인 질환 및 상태
본원에서 기술된 변형된 항-EGFR 항체는 항-EGFR 항체가 사용될 수 있는 임의의 치료적 목적으로 이용될 수 있다(예컨대, Reeves 외. (2011) Otolaryngol Head Neck Surg . 144(5):676-84; Adams 외. (2008) Expert Rev Anticancer Ther . 8(8):1237-45; Belda-Iniesta 외. (2006) Cancer Bioi Ther . 5(8):912-4; Liu 외. (2010) Cancer Chemother Pharmacal . 65(5):849-61). 일부 예에서, 항-EGFR 항체는 항-EGFR 항체로 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 환자에 투여된다. 일부 예에서, 질환의 치료는 질환의 증상과 싸우기 위해 질환의 임상적 징후 이후 본원에서 기술된 항-EGFR 항체의 투여를 포함한다. 일부 예에서, 본원에서 기술된 항-EGFR 항체의 투여는 질환을 근절하기 위해 투여된다. 본원에서 기술된 변형된 항-EGFR 항체로 치료될 수 있는 질환 또는 장애의 예는 자가면역 및 염증성 질환, 감염성 질환, 및 암을 포함한다.
a. 암
EGFR은 인간 악성 종양(malignancies)의 다양한 암, 예컨대 폐암, 두경부암, 대장암, 유방암, 난소암 및 신경 교종(glioma)의 발달 및 진행과 관련된다. EGFR-관련 분자적 인자, 예컨대 복제수 및 유전자 돌연변이는 암에 대한 예언 및 예측 인자로서 확인되어 왔다(예컨대, Bronte 외. (2011) Front Biosci . 3:879-887; Harding 및 Burtness (2005) Drugs Today 41(2):107-127 참조). 예를 들어, 높은 EGFR 발현은 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)을 가진 환자에 불량한 예후와 관련된다(Szabo 외. (2011) Oral Oncol . 47(6):487-496).
본원에서 기술된 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체는 EGF 수용체에 결합하고 자극을 방지할 수 있다. pH 선택적 결합으로 인해, 결합 활성은 산성 pH 및 상승된 락테이트 농도의 하나 또는 둘 다를 나타내는 종양 미세환경에 선택적이다. 예를 들어, 변화된 pH 미세환경은 질환 상태, 예컨대 종양 미세환경에서 발견되는 가장 일반적인 미세환경이고, 다른 특징, 예컨대 저산소증(hypoxia)과 비교하여 질환 미세환경 내에서 가장 균일하다(예컨대 Fogh Andersen 외. (1995) Clin . Chem., 41:1522-1525; Bhujwalla 외. (2002) NMR Biomed , 15:114-119; Helmlinger 외. (1997) Nature Med ., 3:177; Gerweck 및 Seetharaman (1996), Cancer Res. 56(6):1194-1198 참조). 예를 들어, 많은 종양에서 '바르부르크 효과(Warburg effect)'는 약 5.6부터 약 6.8까지, 예컨대 약 pH 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 또는 6.8 또는 그 미만의 pH 범위를 가진 미세환경을 만든다. 따라서, 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 활성인 항-EGFR 항체, 예컨대 본원에서 기술된 변형된 항-EGFR 항체는 비-표적 질환 세포 또는 조직에서 활성을 최소화시키면서, EGFR 발현 종양을 치료하기 위해 이용될 수 있다.
또한, 많은 종양에서 '바르부르크 효과'는 10 내지 20 mM 사이의 락테이트 농도를 가진 미세환경을 만든다. 상승된 락테이트 수준은 두경부, 전이성 대장암(colorectal cancer), 자궁경부암(cervical cancer) 및 편평 상피암(squamous cell carcinoma)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 많은 종양과 관련된 것으로 알려져 왔다(예컨대, Walenta 외, (1997) American Journal of Pathology 150(2): 409-415; Schwickert 외, (1995) Cancer Research 55: 4757-4759; Walenta 외, (2000) Cancer Research 60: 916-921; Guo 외, (2004) J Nucl Med 45: 1334-1339; Mathupala et al, (2007) J Bioenerg Biomernhr 39: 73-77; Holroyde 외, (1979) Cancer Research 39: 4900-4904; Schurr 및 Payne. (2007) Neuroscience 147: 613-619; 및 Quennet et al, (2006) Radiotherapy and Oncology 81: 130-135). 따라서, 정상의 생리적 락테이트 농도에서보다 높은 락테이트 농도에서 더 활성인 항-EGFR 항체, 예컨대 본원에서 기술된 변형된 항-EGFR 항체는 비-표적 질환 세포 또는 조직에서 활성을 최소화하면서, EGFR 발현 종양을 치료하기 위해 이용될 수 있다.
변형된 항-EGFR 항체의 EGFR에 대한 결합은 수용체의 기능적 활성을 억제할 수 있다. 예를 들어, 변형된 항-EGFR 항체의 수용체에 대한 결합은 상피 성장 인자(EGF)의 결합을 억제할 수 있고/있거나 항체-수용체 복합체의 내재화를 야기할 수 있다(Harding 및 Burtness, Drugs Today (Bare)). 따라서, 항-EGFR 항체, 예컨대 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는, 예를 들어, 수용체 인산화 및 수용체-관련 키나아제(kinase) 활성의 활성화를 방지하여, 궁극적으로 수용체-매개 세포 신호전달을 차단할 수 있다.
본원에 기술된 변형된 항-EGFR 항체, 및 이의 단편은, EGFR을 발현하는, 고형 종양을 포함하는 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. EGFR 발현 종양은 그들의 국소 미세환경에 존재하는 EGF에 민감할 수 있고, 종양 생산된 EGF 또는 형질전환 성장 인자(TGF-a)에 의해 추가적으로 자극될 수 있다. 제공되는 변형된 항-EGFR 항체를 투여함으로써 치료 또는 예방될 수 있는 질환 또는 상태는, 예를 들어 EGFR 파라크린 및/또는 오토크린 고리를 통해 자극될 수 있는 종양 성장인 것들을 포함한다. 본원에 기술되는 치료는 따라서 혈관이 발달되지 않은, 또는 충분히 혈관이 발달되지 않은 종양의 치료에 유용한 것들일 수 있다.
또한, 본원에 기술된 변형된 항-EGFR 항체는 종양-관련 혈관신생을 억제할 수 있다. 혈관 내피의 EGFR 자극은 종양의 혈관발달과 관련이 있다. 전형적으로, 혈관 내피는 다른 조직(예컨대 종양 세포)으로부터의 EGF 및/또는 TGF-a에 의해 파라크린 방식으로 자극될 수 있다. 따라서, 항-EGFR 항체, 예컨대 본원에 기술되는 변형된 항-EGFR 항체는, 혈관이 발달된 종양 또는 신생물을 가진 대상체를 치료하는데 유용할 수 있다.
치료될 수 있는 종양은 내화성 종양(refractory tumors)뿐만 아니라, 일차 종양 및 전이성 종양을 포함한다. 내화성 종양은 화학요법제 단독, 항체 단독, 방사선 단독 또는 이의 조합의 치료에 대해 반응에 실패하거나 내성이 있는 종양을 포함한다. 내화성 종양은 또한 이러한 제제로 치료하는 것에 의해 억제되는 것으로 보이는, 그러나 치료가 중단된 후 5년, 가끔 10년 또는 그 이상까지 재발하는 종양을 포함한다. 상기 종양은 정상 수준에서 EGFR을 발현할 수 있고 또는 그것들은 예를 들어, 적어도 정상 수준의 10, 100, 또는 1000배 수준에서 EGFR을 과발현시킬 수 있다.
EGFR을 발현하고 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 및 이의 단편에 의해 치료될 수 있는 종양의 예는 암(carcinoma), 신경교종(gliomas), 육종(sarcomas)(지방 육종(liposarcoma)을 포함하여), 선암(adenocarcinomas), 선육종(adenosarcomas), 및 선종(adenomas)을 포함한다. 이러한 종양은 예를 들어, 유방, 심장, 폐, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 두경부, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환, 자궁경부 및 간을 포함하여, 신체의 거의 모든 부분에 발생할 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 및 이의 단편에 의해 치료될 수 있는 종양의 예는 EGFR을 과발현하는 것들이다. 치료될 수 있는 EGFR을 과발현하는 것으로 관찰되는 일부 종양은 대장 및 두경부 암, 특히 두경부의 편평 세포 암종, 뇌 종양 예컨대 신경교아종(glioblastomas), 및 폐, 유방, 췌장, 식도, 방광, 신장, 난소, 자궁경부, 및 전립선의 종양을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 제공되는, 항-EGFR 항체, 및 이의 항체 단편에 의해 치료될 수 있는 종양의 다른 예는 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), CNS 신생물, 신경아세포종(neuroblastomas), 모세관의 혈관 모세포종(capillary hemangioblastomas), 수막종(meningiomas) 및 대뇌의 전이(cerebral metastases), 흑색종(melanoma), 위장(gastrointestinal) 및 신장(renal) 암 및 육종(sarcomas), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 신경교아종(예컨대 다형성(multiforme) 신경교아종) 및 평활근 육종(leiomyosarcoma)을 포함한다. EGFR을 발현할 수 있는 암의 예는 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 신경 내분비 종양(neuroendocrine tumors), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwannoma), 수막종(meningioma), 흑색종(melanoma), 및 백혈병(leukemia) 또는 림프 악성 종양(lymphoid malignancies)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 예는 혈액 악성 종양(hematologic malignancies), 예컨대 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma); 비-호지킨 림프종(non- Hodgkin's lymphomas) 버키트 림프종(Burkitt's lymphoma), 소 림프구 림프종/만성 림프구 백혈병(small lymphocytic lymphoma/chronic lymphocytic leukemia), 균상식 육종(mycosis fungoides), 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 주변 영역 림프종(marginal zone lymphoma), 모양세포성백혈병(hairy cell leukemia) 및 림프구형질세포의 백혈병(lymphoplasmacytic leukemia)), B-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종(B-cell acute lymphoblastic leukemia/lymphoma), 및 T-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종(T-cell acute lymphoblastic leukemia/lymphoma)을 포함하는 림프구 전구 세포의 종양(tumors of lymphocyte precursor cells), 흉선종(thymoma), 말초 T-세포 백혈병(peripheral T-cell leukemias), 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종(adult T-cell leukemia/T-cell lymphomas) 및 대형 과립 림프구성 백혈병(large granular lymphocytic leukemia)을 포함하는 성숙한 T 세포 및 NK 세포의 종양(tumors of the mature T and NK cells), 랑게르한스 세포 조직구증(Langerhans cell histocytosis), 성숙한 AML(AML with maturation), 미분화 AML, 급성 전골수구성 백혈병(acute promyelocyte leukemia), 급성 골수단핵구성 백혈병(acute myelomonocytic leukemia), 및 급성 단핵구 백혈병(acute monocytic leukemias), 골수이형성 증후군(myelodysplasia syndromes)을 포함하는, 골수성 종양형성(myeloid neoplasias) 예컨대 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemias), 및 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia)을 포함하는 만성 골수증식성 장애(chronic myeloproliferative disorder); 중추신경계 종양 예컨대 신경교종(glioma), 교아종(glioblastoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 뇌질피복 세포증(ependymoma), 및 망막아종(retinoblastoma); 두경부의 고형 종양(예컨대, 비인두암(nasopharyngeal cancer), 침샘암(salivary gland carcinoma), 및 식도암(esophageal cancer)), 폐(예컨대, 소-세포 폐암(small-cell lung cancer), 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 폐의 선암(adenocarcinoma) 및 폐의 편평상피 암종(squamous carcinoma of the lung)), 소화기 계통(예컨대, 위장암을 포함한 위암, 담관(bile duct) 또는 담도(biliary tract) 암, 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 대장암(colorectal cancer), 및 항문암(anal carcinoma)), 생식계(예컨대, 고환(testicular), 음경(penile), 또는 전립선암, 자궁, 질, 외음부, 자궁 경부, 난소, 자궁내막암), 피부(예컨대, 흑색종), 기저세포암, 편평 세포암, 자외선 각화증(actinic keratosis)), 간(예컨대, 간암(liver cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 간세포암(hepatocellular cancer) 및 간종양(hepatoma)), 뼈(예컨대, 파골세포종(osteoclastoma), 및 융골성 골암(osteolytic bone cancers)) 추가 조직 및 장기(예컨대, 췌장암, 방광암, 신장(kidney) 또는 신장암(renal cancer), 갑상선암, 유방암, 복막암, 및 카포시 육종), 및 혈관계의 종양(예컨대, 혈관육종(angiosarcoma) 및 혈관주위세포종(hemangiopericytoma)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
b. 비-암성 과증식성 질환(non-Cancer Hyperproliferative disease)
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체, 및 이의 항체 단편은 대상체에서 비-암성 과증식성 질환을 치료하기 위해 이용될 수 있다. EGFR은 다양한 세포성 반응, 예컨대 미토겐(mitogen) 활성화 단백질 키나아제 활성화, 유전자 전사 및 증식에 대한 G-단백질-커플 수용체(GPCRs), 사이토카인, 수용체 티로신 키나아제 및 인테그린으로부터의 신호전달에 중요한 경로 요소이다. EGFR에 결합하는 리간드는 세포질 티로신 잔기의 자동인산화를 유도할 수 있고, 세포적 증식에 이르는 세포성 경로를 개시할 수 있다. 과발현 및/또는 과자극은 과증식을 야기할 수 있다. 예를 들어, EGFR vIII 돌연변이는 지속적인 활성 키나아제 기능을 가지고 세포적 증식을 자극하는 EGFR 수용체의 원인이 될 수 있다. 항-EGFR 항체는 비-암성 과증식성 장애를 치료할 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 희귀 전암성, 위장의 비-암성, 과증식성 장애인 메네트리어병(Menetrier's disease)은, 세툭시맙으로 치료된다(Fiske 외. (2009) Sci Trasl . Med. 1(8): 8ral8; Myers 외. (2012) Mol . Cell. Proteomics 11:10.1074/mcp.M 111.015222, 1-15).
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체에 의해 치료될 수 있는 과증식성 질환의 예는 항-EGFR 항체의 투여에 의해 치료될 수 있는 임의의 과증식성 질환을 포함하고, 예를 들어, 건선(psoriasis), 화학선 각질증(actinic keratoses), 및 지루성 각질증(seborrheic keratoses), 물사마귀(warts), 켈로이드 흉터(keloid scars), 및 습진(eczema)을 포함한다. 또한 바이러스 감염, 예컨대 유두종(papilloma) 바이러스 감염에 의해 발생하는 과증식성 질환이 포함된다. 건선의 다른 유형은 예컨대 고름같은 수포(농포성(pustular) 건선), 피부의 심각한 허물벗겨짐 I(severe sloughing of the skin I)(홍피성(erythrodermic) 건선), 물방울-유사 점 (물방울양(guttae) 건선) 및 매끈한 염증이 생긴(smooth inflamed) 병변(역형(inverse)건선)과 같은 특징을 나타낼 수 있다. 건선의 치료는 건선의 모든 유형(예를 들어, 심상성건선(psoriasis vulgaris), 농포성 건선(psoriasis pustulosa), 홍피성 건선, 관절증 건선(psoriasis arthropathica), 유사건선(parapsoriasis), 수작족저 농포증(palmoplanar pustulosis))의 치료를 포함하는 것으로 이해된다.
c. 자가면역 질환 또는 장애
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 및 이의 항체 단편은 자가 면역 질환 또는 장애를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 본원에서 기술된 항-EGFR 항체로 치료될 수 있는 자가면역 질환 또는 장애는 동종 섬세포 이식 거부(allogenic islet graft rejection), 원형탈모(alopecia areata), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 항인지질체 증후군(antiphospholipid syndrome), 자가면역 애디슨 병(Addison's disease), 항호중구 세포질(antineutrophil cytoplasmic) 자가면역 항체(ANCA), 부신선(adrenal gland) 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 자가면역 간염(hepatitis), 자가면역 심근염(myocarditis), 자가면역 호중구감소증(neutropenia), 자가면역 난소염(oophoritis) 및 고환염(orchitis), 자가면역 혈소판감소증(thrombocytopenia), 자가면역 두드러기(urticaria), 베체트병(Behcet's disease), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 심근증(cardiomyopathy), 캐슬맨증후군(Castleman's syndrome), 실리악스프루-피부염(celiac spruce-dermatitis), 만성 피로 면역 기능장애 증후군(chronic fatigue immune dysfunction syndrome), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 처그-스트라우스증후군(Churg-Strauss syndrome), 반흔성유천포창(cicatricial pemphigoid), 크레스트 증후군(CREST syndrome), 한랭응집소병(cold agglutinin disease), 크론병(Crohn's disease), 피부근염(dermatomyositis), 원판성 루푸스(discoid lupus), 핵심 혼성 한성글로불린혈증(essential mixed cryoglobulinemia), 제8인자 결핍증(factor VIII deficiency), 섬유근육통-섬유근육염(fibromyalgia-fibromyositis), 사구체신염(glomerulonephritis), 그레이브스병(Grave's disease), 길랑 바레(Guillain-Barre), 굿패스투어 증후군(Goodpasture's syndrome), 대숙주성이식편병(graft-versus-host disease, GVHD)), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 혈우병에이(hemophilia A), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 특발성 혈소판 자반병(idiopathic thrombocytopenia purpura, ITP)), IgA 신경장애(IgA neuropathy), IgM 다발성신경장애(IgM polyneuropathies), 면역 매개 혈소판 감소증(immune mediated thrombocytopenia), 소아 관절염(juvenile arthritis), 가와사키병(Kawasaki's disease), 편평태선(lichen planus), 홍반성 낭창(lupus erythematosus), 메니에르병(Meniere's disease), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 인슐린 의존형 당뇨병(type 1 diabetes mellitus), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 악성 빈혈 (pernicious anemia), 결절성다발성동맥염(polyarteritis nodosa), 다연골염(polychondritis), 다선성 증후군(polyglandular syndromes), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염 및 피부근염(polymyositis and dermatomyositis), 원발성 무(無)감마글로불린혈증(primary agammaglobulinemia), 원발담즙성간경변(primary biliary cirrhosis), 건선(psoriasis), 건선성관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Reynaud's phenomenon), 라이터 증후군 (Reiter's syndrome), 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 유육종증(sarcoidosis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 고형 장기 이식 거부반응(solid organ transplant rejection), 강직-인간증후군(stiff-man syndrome), 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus), 타카야수 동맥염(Takayasu arteritis), 측두동맥염/거대 세포 동맥염(temporal arteritis/giant cell arteritis), 혈전성 혈소판감소성 자반(thrombotic thrombocytopenia purpura), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 포도막염(uveitis), 혈관염(vasculitides) 예컨대 포진성 피부염 맥관염(dermatitis herpetiformis vasculitis), 백반증(vitiligo), 및 베게너육아종증(Wegner's granulomatosis)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
d. 염증성 장애
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 및 이의 항체 단편은 염증성 질환 또는 장애를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체로 치료될 수 있는 염증성 장애는 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 급성 화농성관절염(acute septic arthritis), 알레르기성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 맥관염(allergic vasculitis), 알레르기(allergy), 천식(asthma), 동맥경화증(atherosclerosis), 만성 박테리아성 또는 바이러스성 감염에 의한 만성염증(chronic inflammation due to chronic bacterial or viral infections), 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD)), 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 뇌염 (encephalitis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 염증성 골용해(inflammatory osteolysis), 급성 및 지연성 과민반응과 연관된 염증(inflammation associated with acute and delayed hypersensitivity reactions), 종양과 연관된 염증(inflammation associated with tumors), 말초 신경 손상(peripheral nerve injury) 또는 탈수초질환(demyelinating disease), 조직 외상 예컨대 화상 및 허혈과 연관된 염증(inflammation associated with tissue trauma) 예컨대 화상(burns) 및 국소성빈혈(ischemia), 수막염에 의한 염증(inflammation due to meningitis), 복합 장기 손상 증후군(multiple organ injury syndrome), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 패혈증(sepsis) 및 패혈성 쇼크(septic shock), 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome), 미분화 관절증(undifferentiated arthropathy), 및 미분화 척추관절증(undifferentiated spondyloarthropathy)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
e. 감염성 질환
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 및 이의 항체 단편은 자가면역 질환 또는 장애를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 본원에서 기술된 항-EGFR 항체에 의해 치료될 수 있는 감염성 질환은 병원균, 예컨대 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물(protozoa), 및 기생충이 원인이 되는 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 감염성 질환은 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 뎅기열(dengue), 엡스타인-바(Epstein-Barr), 한타(hanta), A형 간염(hepatitis A), B형 간염(hepatitis B), C형 간염(hepatitis C), 유형I 단순 포진(herpes simplex type I), 유형II 단순 포진(herpes simplex type II), 인체 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV), 인유두종 바이러스(human papilloma virus, HPV), 인플루엔자(influenza), 홍역(measles), 볼거리(mumps), 파포바 바이러스(papova virus), 소아마비(polio), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 우역(rinderpest), 라이노 바이러스(rhinovirus), 로타바이러스(rotavirus), 풍진(rubella), SARS 바이러스(SARS virus), 천연두(smallpox) 및 바이러스성 수막염(viral meningitis)을 포함하는 바이러스가 원인이 될 수 있다. 감염성 질환은 또한 탄저균(Bacillus anthracis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 트라코마 클라미디아(Chlamydia trachomatis), 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum), 파상풍균(Clostridium tetani), 디프테리아(Diphtheria), 대장균(E. coli), 레지오넬라(Legionella), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 마이코박테리아 리케치아(Mycobacterium rickettsia), 마이코플라스마 나이세리아(Mycoplasma Neisseria), 백일해(Pertussis), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), S. 뉴모니아(S. pneumonia), 연쇄구균(Streptococcus), 포도구균(Staphylococcus), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 및 페스트균(Yersinia pestis)을 포함하는 박테리아가 원인이 될 수 있다. 감염성 질환은 또한 진균 예컨대 아스페르질루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis), 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum) 및 페니실리움 마르네페이(Penicillium marneffei)가 원인이 될 수 있다. 감염성 질환은 또한 원생동물 및 기생충 예컨대 클라미디아(chlamydia), 코크지디스(kokzidiose), 레슈마니아(leishmania), 말라리아(malaria), 리케치아(rickettsia), 및 트리파노소마(trypanosoma)가 원인이 될 수 있다.
f. 기타 질환 및 상태
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체, 및 이의 항체 단편은 EGFR의 발현과 관련된 및/또는 기존의 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙으로 치료되는 것으로 알려진 다른 질환 및 상태를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 본원에서 기술된 항-EGFR 항체로 치료될 수 있는 다른 질환 및 상태는 심장 상태 예컨대 울혈성 심부전(congestive heart failure, CHF), 심근염(myocarditis) 및 심근(myocardium)의 다른 상태; 피부 질환 예컨대 주사(rosacea), 여드름(acne), 및 습진(eczema); 뼈 및 치아 질환 예컨대 골 소실(bone loss), 골다공증 (osteoporosis), 페제트병(Paget's disease), 랑게르한스 세포 조직구증식증(Langerhans' cell histiocytosis), 치주질환(periodontal disease), 불용성 골감소증(disuse osteopenia), 골연화증(osteomalacia), 단골성 섬유 이형성증(monostotic fibrous dysplasia), 다골성 섬유성골 이형성증(polyostotic fibrous dysplasia), 골 전이(bone metastasis), 골 통증관리(bone pain management), 체액성 악성 고칼슘혈증(humoral malignant hypercalcemia), 치주 재건(periodontal reconstruction), 척수외상(spinal cord injury), 및 골 골절(bone fractures); 대사 질환 예컨대 고셔병(Gaucher's disease); 내분비 질환 예컨대 쿠싱증후군(Cushing's syndrome); 및 신경 상태(neurological conditions)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
2. 치료에 대한 대상체
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체로 치료하는 대상체 또는 후보는 대상체, 예컨대 항-EGFR 항체의 투여로 치료될 수 있는 질환 또는 상태, 예컨대 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 질환 또는 상태를 가진 인간 환자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
a. EGFR을 과발현하는 대상체의 선택
일부 예에서, 치료를 위한 대상체 또는 후보는 당업계에 공지된 방법 예컨대 예를 들어 막-발현 단백질 및/또는 총 균질물에 웨스턴 블롯(WB), 및 조직미세 배열에 면역조직화학(IHC)을 이용하여 양성 EGFR 발현의 증거에 대해 시험한다. 또한, 인산화된 EGFR(pEGFR)은 막 상에서 웨스턴 블롯에 의해 측정될 수 있다(예컨대, Thariat 외. (2012) Clin . Cancer Res. 18:1313 참조). EGFR 평가는 예를 들어 EGFR PHARMADEX 스코어링 설명지침(Dako, Glostrup, Denmark)을 이용하여 평가될 수 있다. EGFR 발현은 종양 침습의 가장 깊은 영역을 포함하는 섹션에서 평가될 수 있고, EGFR-양성 세포의 가장 큰 밀도를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 숙련된 당업자의 능력 내이다(예컨대, Ervin-Haynes 외. (2006) J. Clin . Oncol . ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol. 24, No. 18S (June 20 Supplement) 13000; Goldstein 및 Armin (2001) Cancer 92(5):1331-1346; Bibeau 외. (2006) Virchows Arch. 449(3):281-287 참조).
b. EGFR-관련 다형성을 나타내는 대상체의 선별
일부 예에서, 치료를 위한 대상체 또는 후보는 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 효능을 예측하기 위해 하나 이상의 다형성에 대해 스크리닝된다. 항-EGFR 항체, 예컨대 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체와 상호작용할 수 있는 많은 수용체는 인간 집단에서 다형성이다. 주어진 환자 또는 환자 인간 집단을 위해, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 효능은 단백질에서 특정 다형성의 존재 또는 부재에 의해 영향받을 수 있다.
예를 들어, FcyRIIIa는 위치 158에서 다형성이고, 일반적으로 V (높은 친화성) 또는 F (낮은 친화성)이다. V/V 동형(homozygous) 유전자형(genotype)을 가진 환자는 더 강한 자연 살해(NK) 반응을 시작하고 항-CD20 항체 리툭산®(리툭시맙)으로의 치료에 더 좋은 임상적 반응이 관찰된다(Dall'Ozzo 외. (2004) Cancer Res. 64:4664-4669). 추가의 다형성은 FcyRIIa R131 또는 H131을 포함하나, 이에 제한되지 않고 이러한 다형성은 다형성에 의존하는, Fc 결합 및 이후의 생물학적 활성을 증가 또는 감소시키는 것으로 알려져 있다.
일부 예에서, 치료를 위한 대상체 또는 후보는 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 효능을 예측하기 위해 하나 이상의 다형성에 대해 스크리닝된다. 이러한 방법은 숙련된 당업자의 능력 내이다. 이 정보는 예를 들어, 적절한 투여량 및 치료 옵션에 관해 의사 및 환자에게 지침을 제공하기 위해 임상적 시도 또는, 승인 후, 포함시키거나 또는 제외할 환자를 선별하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, FcyRIIIa 158F 항체 약물, 예컨대 항-CD20 mAb 리툭시맙에 대해 동형 또는 이형인 환자에서, 감소된 효능을 가질 수 있다(Carton 2002 Blood 99:754-758; Weng 2003 J. Clin. Oncol. 21:3940-3947); 이러한 환자는 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체에 훨씬 좋은 임상적 반응을 보일 수 있다.
c. 항-EGFR-관련 부작용을 나타내는 대상체의 확인
일부 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체로 치료를 위한 대상체 또는 후보는 대상체, 예컨대 항-EGFR 항체, 예컨대 당업계에 공지된 임의의 항-EGFR 항체의 투여로부터 야기되는 하나 이상의 부작용을 경험해 본 인간 환자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 부작용을 유발하는 항-EGFR 항체 치료 대신에 대상체에 본원에서 제공되는 항-EGFR의 투여는 감소된 또는 줄어든 부작용을 유발하는 반면, 필적할만한 또는 개선된 치료 효능을 유발할 수 있다.
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 투여의 투여량 및 빈도를 포함한, 투여 요법은 이전의 항-EGFR 항체 치료와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부의 경우에, 투여량은 증가되거나 감소될 수 있다. 예컨대 치료될 특정 대상체, 질환 또는 상태의 본질, 현존하는 증상 또는 부작용의 본질 및 투여될 본원에서 제공되는 특정한 변형된 항-EGFR 항체 요인에 기초하여 투여 요법을 결정하는 것은 의사의 능력 내에 있다.
본원의 다른 부분에서 논의된 바와 같이, EGFR은 많은 정상 인간 조직에서 발현된다(Lacouture, 및 Melosky (2007) Skin Therapy Lett . 12, 1-5). 그러므로, 많은 치료적 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙의 투여는 바람직하지 않은 반응을 유발할 수 있다. 이러한 부작용은 당업자에게 널리-공지되어 있고 평가되거나 확인될 수 있다. 항-EGFR 항체 치료가 원인이 되는 부작용을 확인하는 방법은 본원에서 기재된 임의의 방법, 예컨대 환자 인터뷰, 환자 대진 및 혈액 시험을 포함한다. 평가될 수 있는 부작용은 본원에서 기술된 임의의 부작용, 예컨대, 예를 들어, 세툭시맙의 투여와 관련된 부작용을 포함하는, 항-EGFR 항체의 투여와 관련된 당업자에게 공지된 임의의 부작용을 포함한다.
예를 들어, 세툭시맙의 부작용은 증상을 보이는 저마그네슘혈증, 손발톱주위염(paronychia), 발열(fever), 피부 독성(dermatologic toxicity), 안면 및 상반신의 구진농포 발진(papulopustular rash), 털 성장 이상(hair growth abnormalities), 두발 소실(loss of scalp hair), 얼굴의 털(facial hair) 및 속눈썹(eyelashes)의 증가된 성장, 피부 건조증 및 소양증, 및 연화를 동반한 손발톱주위 감염(periungual inflammation with tenderness)을 포함하는, 본원에서 기술된 임의의 부작용 및/또는 당업자에게 공지된 부작용을 포함한다(Eng (2009) Nat. Rev. 6:207-218; Schrag 외. (2005) J. Natl . Cancer Inst . 97(16):1221-1224; Lacouture 및 Melosky (2007) Skin Therapy Lett . 12:1-5). 일부 예에서, 세툭시맙의 부작용은 구진농포 발진(papulopustular eruption), 피부 건조증, 소양증(pruritus), 눈 및 손발톱의 변화, 여드름양 피부 반응(acneiform skin reaction), 여드름양 발진(acneiform rash), 여드름양 여포성 발진(acneiform follicular rash), 여드름-유사 발진(acne-like rash), 반구진 피부 발진(maculopapular skin rash), 단일형 농포 병변(monomorphic pustular lesions), 구진농포 반응(papulopustular reaction)을 포함하는, 피부 독성(dermatological toxicities)을 포함한다(Lacouture 및 Melosky (2007) Skin Therapy Lett . 12:1-5).
부작용은 외부 사건에 의해 유발될 수 있고 및/또는 시간경과에 따라 발달할 수 있다. 예를 들어, 피부 발진은 태양 노출에 의해 유발될 수 있고 단계, 예컨대 예컨대 지각장애(sensory disturbance), 홍반(erythema), 및 부종(edema)(예를 들어, 1주); 구진농포성 발진(예를 들어, 2주); 및 피각화(crusting)(예를 들어, 4주)로 발달될 수 있다. 발진이 성공적으로 치료되는 경우, 홍반 및 피부 건조증이 구진농포 발진에 의해 이전에 영향을 입었던 영역에서 보일 수 있다(예를 들어, 4-6주). 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙의 투여와 관련될 수 있는 다른 피부 독성은 소양증 및 홍반 및 손발톱주위 염증(paronychial inflammation)을 포함한다(Lacouture, 및 Melosky (2007) Skin Therapy Lett . 12, 1-5). 예를 들어, 세툭시맙은 환자의 약 5%에서 반응을 이끌어 낸다. 이러한 면역 반응은 순환으로부터 항체 또는 단편의 면역 복합체-매개 클리어런스를 유발시킬 수 있고, 치료에 부적합한 반복된 투여를 만들고, 이로써 환자에게 치료 이익을 감소시키고 항체의 재-투여를 제한한다.
일부 예에서, 부작용의 중증도는 부작용의 중증도를 등급화하는 기준을 기재한, 미국 국립 암학회의 이상반응 표준 용어 기준(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events, CTCAE) v4.0에 따라 평가될 수 있다. CTCAE는 각 유해한 효과에 대한 중증도의 고유한 임상적 설명을 기재하고 있는 중증도의 1 등급부터 5등급까지 포함한다. CTCAE의 일반적인 지침 하에, 1 등급 이상반응은 경증, 무증상 또는 경미한 증상, 임상적 또는 진단적 관찰만이 있고; 및 개입은 지시되지 않는다. 2 등급 이상 반응은 중도의, 최소한, 국소 또는 비침습적 개입이 지시되는, 제한 연령-적절 중요 일상생활활동(Activities of Daily Living, ADL)이다. 3 등급 이상 반응은 심각하거나 의학적으로 중요하지만 즉시 생명의 위협은 존재하지 않고, 지시되는 입원 또는 입원의 연장이 지시되는, 자가 관리 ADL을 불가능하게 하거나 제한하는 것이다. 4 등급 이상 반응은 생명을 위협하는 결과이고, 응급 개입이 지시된다. 5 등급 이상 반응은 이상 반응(들)과 관련된 죽음으로 분류된다. 따라서, 예를 들어, 부작용의 특정 등급을 가지는 것으로 확인되는 대상체에 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 투여는 CTCAE v4.0 하에 분류되는 부작용의 등급에서 감소에 의해 특징화되는 부작용의 감소를 야기할 수 있다. 일부 예에서, 부작용의 감소는 본원에서 기술되거나 당업자에게 공지된 임의의 증상을 포함하는, 부작용과 관련된 증상의 중증도의 감소에 의해 특징화된다.
당업자에게 공지된 항-EGFR 항체의 부작용을 나타내는 환자를 확인하는 다른 방법은 삶의 질 설문지(quality-of-life questionnaires)를 포함한다(예컨대, Jonker 외. (2007) N. Engl . J. Med . 357:2040-2048). 항-EGFR 항체의 부작용의 예, 및 부작용의 중증도를 확인하기 위한 숙련된 당업자에게 공지된 방법이 하기에 기술된다. 이러한 부작용은 예시적이고 제한을 의미하지 않는다. 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙의 투여와 관련된 당업계에 공지된 또는 본원에서 기술된 임의의 부작용은 대상체에서 확인될 수 있으며, 대상체는 이후 이러한 부작용이 더 악화되지 않고 및/또는 감소되도록 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체로 치료될 수 있다고 이해된다.
i. 피부 독성
인간 피부에서, EGFR은 기저 케라티노사이트(basal keratinocytes)에서 발현되고 표피 성장을 자극하고, 분화를 억제하고, 상처 치유를 가속화할 수 있다(Lacouture, 및 Melosky (2007) Skin Therapy Lett . 12:1-5; Nanney 외. (1996) J. Invest. Dermatol 94(6):742-748). 그러므로 기저 케라티노사이트에 의해 발현되는 EGFR과 상호작용하고 EGFR을 억제하는 항-EGFR 항체는 케라티노사이트의 성장 및 이동을 손상시킬 수 있고, 염증성 케모카인(chemokine) 발현을 야기할 수 있다. 이러한 효과는 부작용, 예컨대 본원에서 기술된 부작용을 유발할 수 있는, 염증성 세포 소집(inflammatory cell recruitment) 및 이후의 피부 손상을 일으킬 수 있다. 피부 기저층 환경의 pH는 중성이다(예컨대, 약 pH 7.0 - 7.4에서). 그러므로, 중성 pH에서보다 낮은 pH에서 증가된 활성을 갖는 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체는 감소된 피부 독성 및 감소된 부작용을 가질 수 있다. 피부에 EGFR 억제로부터 야기되는 부작용의 예, 및 이의 확인 및 분류의 방법은 하기에 기술되어 있다.
구진농포성 발진 및 여드름양 발진은 전형적으로 얼굴, 두피, 그리고 가슴 상부 및 등에 나타나는, 구진(papules)(작게 올라온 뾰루지) 및 농포(pustules)(작은 고름이 가득한 물집)로 구성되는 발진으로 특징된다. 여드름과 달리, 구진농포성 발진은 화이트헤드나 블랙헤드와 나타나지 않고, 가렵거나 연화의 병변으로 징후가 있을 수 있다(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010). 구진농포성 발진 및 여드름양 발진은 환자의 대진 및/또는 임상적 인터뷰에 의해 확인 및 분류될 수 있다. 1 등급 구진농포성 발진 또는 여드름양 발진은 소양증이나 연화의 증상과 관련될 수 있는, <10%의 체표면적(BSA)을 덮는 구진 및/또는 농포로 분류된다. 2 등급 구진농포성 발진 또는 여드름양 발진은 소양증이나 연화의 증상과 관련될 수 있는, 10-30% BSA를 덮는 구진 및/또는 농포; 심리사회적 영향과 관련된; 도구 일상생활기능(instrumental ADL) 제한으로 분류된다. 3 등급 구진농포성 발진 또는 여드름양 발진은 소양증이나 연화의 증상과 관련될 수 있는, >30% BSA를 덮는 구진 및/또는 농포; 자가-관리 ADL 제한; 및 경구용 항생제가 지시되는 국소적 중복 감염과 관련될 수 있는 것으로 분류된다. 4 등급 구진농포성 발진 또는 여드름양 발진은 소양증이나 연화의 증상과 관련될 수 있고 IV 항생제가 지시되는 광범위한 중복 감염과 관련이 있는, 임의의 퍼센트 BSA를 덮는 구진 및/또는 농포로; 생명을 위협하는 결과로 분류된다. 5 등급 구진농포성 발진 또는 여드름양 발진은 사망을 유발하는 것으로 분류된다(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, 2010. 6. 14. 출판; Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224).
항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙의 부작용의 예는 피부 건조증이고, 이는 각질이 일어나고(flaky) 칙칙한; 미세한 구멍, 및 종이처럼 얇은 피부 질감으로 특징되는 장애이다. 피부 건조증은 환자의 대진 및/또는 임상적 인터뷰에 의해 확인되고 분류될 수 있다. 1 등급 피부 건조증은 < 10% 의 BSA를 덮고 홍반 또는 소양증과 관련이 없는 것으로 분류된다. 2 등급 피부 건조증은 0%- 30% 의 BSA를 덮고 홍반 또는 소양증과 관련이 있고 도구 ADL을 제한하는 것으로 분류된다. 3 등급 피부 건조증은 >30% 의 BSA를 덮고 피부 건조증과 관련이 있고 자가 관리 ADL을 제한하는 것으로 분류된다(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, 2010. 6. 14. 출판; Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224).
과색소침착은 과도한 멜라닌의 축적에 의해 피부의 다크닝으로 특징되는 부작용이다. 과색소침착은 환자의 대진 및/또는 임상적 인터뷰에 의해 확인되고 분류될 수 있다. 1 등급 과색소침착은 < 10%의 BSA를 덮고, 심리사회적 영향이 없는 색소침착으로 분류된다. 2 등급 과색소침착은 > 10% 의 BSA를 덮고, 심리사회적 영향과 관련이 있는 색소침착으로 분류된다(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, 2010. 6. 14. 출판; Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)
소양증은 강렬한 가려운 느낌으로 특징되는 부작용이다. 소양증은 환자 대진 및/또는 임상적 인터뷰에 의해 평가될 수 있다. 1 등급 소양증은 경미한 또는 국소의 가려움으로 분류되고, 국소적(topical) 개입이 지시된다. 2 등급 소양증의 증상은 강렬한 또는 광범위한 소양증, 간헐적인 소양증, 긁음으로 인한 피부 변화(예컨대, 부종, 구진화(papulation), 찰과상(excoriations), 태선화(lichenification), 삼출성/껍질(oozing/crusts))을 포함하고, 도구 ADL을 제한하고, 경구적 개입이 지시될 수 있다. 3 등급 소양증의 증상은 강렬한, 광범위하고 및/또는 지속적인 가려움을 포함하고, 자가 관리 ADL 또는 수면을 제한하며, 경구 코르티코스테로이드 또는 면역억제치료가 지시될 수 있다(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, 2010. 6. 14. 출판; Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)
손발톱주위염은 손발톱 주변의 연조직과 관련된 감염성의 과정에 의해 특징되는 부작용이다. 손발톱주위염은 환자 대진 및/또는 임상적 인터뷰에 의해 평가될 수 있다. 1 등급 손발톱주위염은 조주름(nail fold) 부종 또는 홍반의 증상 및 큐티클의 붕괴를 포함하는 것으로 분류된다. 2 등급 손발톱주위염의 증상은 국소적 개입이 지시되는, 경구적 개입이 지시되는(예컨대, 항생제, 항진균제, 항바이러스제), 통증, 배출(discharge) 또는 조갑(nail plate) 분리를 수반한 조주름 부종 또는 홍반 및 도구 ADL 제한을 포함할 수 있다. 3 등급 손발톱주위염의 증상은 수술적 개입 또는 IV 항생제가 지시되는 자가 관리 ADL 제한을 포함할 수 있다.
ii. 저마그네슘혈증(Hypomagnesemia)
EGFR은 신장, 특히 여과된 마그네슘의 70%가 재흡수되는, 헨레 고리(loop of Henle)의 상행상지(ascending limb)에서 높게 발현된다. 그러므로, EGFR과 상호작용하는 항체는 마그네슘 수송을 방해할 수 있다. 혈액 속 마그네슘의 낮은 농도인, 저마그네슘혈증은 항-EGFR 항체의 투여의 부작용이 될 수 있다. 한 연구에서, 세툭시맙을 받는 환자의 5 퍼센트는 3 또는 4 등급의 저마그네슘혈증을 나타내었다.
헨레 고리는 중성 pH를 갖는다(예컨대, pH 6.9 - 7.4) (Dieleman 외.(2001) J. Acquir Immune Defic Syndr . 28(1):9-13; Dantzler 외. (2000) Pflugers Arch. 440(1):140-148.). 그러므로, 중성 pH에서보다 낮은 pH에서 증가된 활성을 갖는 변형된 항-EGFR 항체, 예컨대 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 저마그네슘혈증을 감소시킬 수 있다.
저마그네슘혈증은 혈청 마그네슘 수준의 측정에 의해 진단 및/또는 평가받을 수 있다. 예를 들어, CTCAE는 정상의 하한선(LLN) - 1.2 mg/dL ＞ 인 혈청 마그네슘 농도를 1등급 저마그네슘혈증으로 분류하였고; 2 등급 저마그네슘혈증은 1.2-0.9 mg/dL의 혈청 마그네슘 농도로; 3 등급 마그네슘혈증은 <0.9-0.7 mg/dL의 혈청 마그네슘 농도로, 4등급 저마그네슘혈증은 <0.7 mg/dL의 혈청 마그네슘 농도로 분류하였고 그리고 생명을 위협하는 결과가 수반될 수 있고 그리고 5 등급 저마그네슘혈증은 죽음을 야기한다. 또한, 저마그네슘혈증의 증상은 숙련된 당업자에게 공지되었고 피로감, 감각이상(paresthesias) 및 저칼슘혈증(hypocalcemia)을 포함한다(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, 2010. 6. 14. 출판; Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16): 1221-1224).
d. 기타 치료를 위한 대상체의 선택 또는 확인하는 방법
당업계에 공지된 치료를 위한 후보를 스크리닝하는 다른 방법이 고려된다. 예를 들어, 커스틴 랫트 육종 바이러스성 종양유전자 동족체(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS) 돌연변이 상태는 최근 대장암에서 세툭시맙 치료에 대한 반응을 예측하는 것으로 나타났다(Van Cutsem 외. (2008) J. Clin . Oncol 26 (May 20 suppl): Abstract 2). KRAS는 신호 전달 경로에서 많은 역할을 하는 GTPase이다. KRAS를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이는, 대장암의 25% 이상에서 나타나고, EGFR-억제 약물의 성공을 예측한다. 돌연변이 KRAS 유전자의 발현은 EGFR-억제제 치료에 감소된 반응을 야기한다. KRAS 돌연변이는 상업적으로 이용가능한 실험실 진단에 의해 검출될 수 있다.
3. 투여량
본원에서 제공되는 방법에서, 항-EGFR 항체 또는 항체 단편의 치료적 유효량이 투여될 수 있다. 그러한 투여량은 당업자, 예컨대 치료하는 의사에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 몇가지 예에서, 투여되는 투여량은 특정 질환 또는 상태에 대한 공지된 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙의 투여량에 대한 문헌에 기초한다. 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체의 치료적으로 유효한 농도는 공지된 시험관내 및 생체내 시스템에서 항-EGFR 항체를 시험하여 예컨대 본원에서 제공되거나 당업계에 공지된 어세이를 이용하여 경험적으로 결정될 수 있다.
치료적으로 투여되는 항-EGFR 항체의 유효량은, 예를 들어, 치료의 목적, 투여의 경로, 및 환자의 상태에 의존할 것이다. 또한, 주치의는 질환의 중증도 및 유형, 환자의 건강, 체중, 성별, 식습관, 투여의 시간 및 경로, 기타 약물 및 기타 관련 임상적 요인을 포함하여, 약물의 작용을 변형하는 것으로 알려진 다양한 요인을 고려할 수 있다. 또한, 치료 전문가는 부작용, 예컨대 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 부작용의 빈도 및 중증도를 고려할 수 있다. 따라서, 치료 전문가는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 역가할 수 있고 최적의 치료 효과를 획득하고 원치않는 부작용을 최소화하기 위해 필요한 대로 투여 경로를 변형할 수 있다. 임상의는 투여량이 원하는 효과를 얻는 정도에 도달할 때까지 항체를 투여할 수 있다. 이 치료법의 진행은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 종래 어세이에 의해 모니터링될 수 있다. 변형된 항-EGFR 항체의 용량은 부작용을 감소시키거나 제거하면서 활성을 달성하는데 필요한 최적 또는 최소 용량을 확인하도록 변화될 수 있다.
일반적으로, 본원에서 제공되는, 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체의 투여에 대한 투여량의 범위는, 항-EGFR 항체로의 치료에 반응하는 상태의 증상(들)이 개선되는, 원하는 치료 효과를 생산하기에 충분히 큰 범위이다. 일반적으로, 투여량은 연령, 상태, 성별 및 환자의 질환의 정도에 따라 변화될 수 있고 당업자에 의해 결정될 수 있다. 몇 가지 예에서, 투여량은 유해한 부작용을 야기할 정도로 크지 않다. 투여량은 임의의 유해한 부작용이 발생한 경우 개별적인 의사에 의해 조정될 수 있다.
예시적인 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예컨대 적어도 약 0.1 mg/kg, 약 0.15 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.30 mg/kg, 약 0.35 mg/kg, 약 0.40 mg/kg, 약 0.45 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.55 mg.kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.1 mg/kg, 약 1.2 mg/kg, 약 1.3 mg/kg, 약 1.4 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1.6 mg/kg, 약 1.7 mg/kg, 약 1.8 mg/kg, 약 1.9 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 3.5 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 4.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 5.5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 6.5 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 7.5 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 8.5 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 9.5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 11 mg/kg, 약 12 mg/kg, 약 13 mg/kg, 약 14 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 16 mg/kg, 약 17 mg/kg, 약 18 mg/kg, 약 19 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 21 mg/kg, 약 22 mg/kg, 약 23 mg/kg, 약 24 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 100 mg/kg 또는 그 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 예시적인 투여량은, 약 0.01 mg/㎡ 내지 약 800 mg/㎡, 예컨대, 적어도 약 약 또는 0.01 mg/㎡, 약 0.1 mg/㎡, 약 0.5 mg/㎡, 약 1 mg/㎡, 약 5 mg/㎡, 약 10 mg/㎡, 약 15 mg/㎡, 약 20 mg/㎡, 약 25 mg/㎡, 약 30 mg/㎡, 약 35 mg/㎡, 약 40 mg/㎡, 약 45 mg/㎡, 약 50 mg/㎡, 약 100 mg/㎡, 약 150 mg/㎡, 약 200 mg/㎡, 약 250 mg/㎡, 약 300 mg/㎡, 약 400 mg/㎡, 약 500 mg/㎡, 약 600 mg/㎡ 및 약 700 mg/㎡ 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 mg/kg 및 mg/㎡ 단위의 사이에서 투여량을 인식하고 변환할 수 있다고 이해된다(예컨대, Michael J. Derelanko, TOXICOLOGIST'S POCKET HANDBOOK, CRC Press, p.16 (2000) 참조).
질환 또는 상태의 치료를 위해, 항-EGFR 항체의 투여량은 질환의 유형 및 중증도에 따라 변화될 수 있다. 항-EGFR 항체는 단일 용량으로, 수회의 별개 투여로, 또는 지속된 주입에 의해 투여될 수 있다. 수 일 이상의 반복 투여의 경우, 상태에 따라, 치료는 병증의 원하는 억제가 일어나거나 환자의 상태에서 원하는 개선이 달성될 때까지 반복될 수 있다. 반복된 투여는 치료의 진행에 따라 항-EGFR 항체의 증가 또는 감소된 용량을 포함할 수 있다. 예를 들어, 초기 로딩 용량은 유지 용량보다 클 수 있다. 일부 예에서, 초기 로딩 용량은 400 mg/㎡이고, 유지 용량은 250 mg/㎡이다.
다른 투여 요법 또한 고려된다. 예를 들어, 투여 요법은 변화될 수 있다. 부작용 감소와 관련된 변형된 항-EGFR 항체는, 고용량 투여 요법에 사용될 수 있다. 또한, 병든 조직에서 증가된 활성을 갖는 항-EGFR 항체는 저용량 투여 요법에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 변형된 항-EGFR 항체를 포함하여, 항-EGFR 항체의 활성을 결정하는 방법은, 당업자에게 공지되어 있고 예시적인 방법은 본원에 기술되어 있다. 또한, 투여 요법은 경험적으로 결정될 수 있다. 개시된 항-EGFR 항체의 최적량 및 개별 투여량의 간격은 치료되는 상태의 성질 및 정도, 그 형태, 투여의 경로 및 부위, 및 치료될 특정 대상체의 연령 및 상태에 의해 결정될 것이고, 의사는 사용될 적절한 투여량을 결정할 수 있다. 이러한 투여량은 적절한 정도로 자주 반복될 수 있다. 부작용이 발생할 경우, 정상적인 임상 실행에 따라, 투여량의 용량 및/또는 빈도는 변경되거나 감소될 수 있다. 이러한 연구들은 당업자의 수준 내에 있다.
일부 예에서, 항-EGFR 항체는 하루 동안 또는 수 일에 걸쳐 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 이상 투여된다. 일부 예에서, 항-EGFR 항체는 2회 이상의 투여 순서로 투여되고, 그 투여는 선택된 시간 주기로 분할된다. 일부 예에서, 선택된 시간 주기는 적어도 또는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1월, 2월, 또는 3월이다.
특정 투여량 또는 투여 요법의 부작용은 예를 들어, 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 이의 항-EGFR 항체의 1회 이상의 투여 후에, 평가될 수도 있다. 투여 용량 및/또는 투여의 빈도는 부작용의 유형 및 중증도에 따라 변형될 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 최적의 치료 요법은 다양할 것이고 최적의 치료적인 투여량 및 투여의 빈도를 결정하기 위해 치료의 1회 이상의 주기 전, 후의 환자의 치료 중인 질환 및 전반적인 건강 상태를 평가하는 것은 치료 방법의 범위 내이다. 임의의 특정 대상체에 대해, 특정 투여 요법은 또한 개인별 필요 및 투여하는 사람 또는 약제학적 제제의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라, 시간에 걸쳐 조정될 수 있고, 본원에 기재된 투여량은 단지 예시일 뿐이며 이의 범위를 제한하는 것은 아니라고 이해된다. 질환 또는 상태, 예컨대 본원에서 기술된 질환 또는 상태의 치료를 위해 투여되는 항-EGFR 항체의 양은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 어세이 및 동물 모델은 최적의 투여량 범위를 확인하는데 도움이 되기 위해 이용될 수 있다. 이러한 어세이는 대상체, 예컨대 인간에 대한 투여에 대해 외삽될 수 있는 투여량 범위를 제공할 수 있다. 동물 모델에 기초한 최적의 투여량 범위를 확인하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예시들이 본원에 기술되어 있다.
4. 투여의 경로
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 예를 들어 전신 또는 국소 투여를 포함하여, 폴리펩티드의 투여를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 항-EGFR 항체는 예컨대 비경구(예컨대, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 또는 공동내(intracavity)), 국소, 경막외(epidural), 또는 점막(예컨대, 비강내, 구강, 질, 외음질, 식도, 구강식도(oroesophageal), 기관지, 또는 폐)의 경로를 통해 투여될 수 있다. 항-EGFR 항체는 대상체에 외부에서, 국소 또는 경피 작용의 행사를 위한 질환의 부위에 투여될 수 있다. 항-EGFR 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사를 통해, 상피 또는 점막 라이닝(예컨대, 구강 점막, 질, 직장 및 장 점막)을 통한 흡수를 통해 투여될 수 있다. 항-EGFR 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 조성물은 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 특정의 예에서, 항-EGFR 항체는 주입 전달, 예컨대 주입 펌프 또는 주사기 펌프를 통해 투여되고, 다른 치료제와 조합하거나 단일 요법으로 투여될 수 있다.
투여의 방법 및/또는 경로는 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체의 투여와 관련된 유해한 부작용을 개선시키기 위해 변경될 수 있다. 예를 들어, 환자가 경증 또는 중등증(즉, 1 등급 또는 2 등급) 주입 반응을 경험한 경우, 주입 속도는 감소될 수 있다(예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 감소). 환자가 중증(즉, 3 등급 또는 4 등급) 주입 반응을 경험한 경우, 주입은 일시적으로 또는 영구적으로 중단될 수 있다.
일부 예에서, 대상체는 유해한 부작용, 예컨대 심각한 피부 독성, 예를 들어, 심각한 여드름 형태 발진을 경험한 경우, 치료 조정이 만들어질 수 있다. 예를 들어, 유해한 부작용의 발생 이후, 투여는 유해한 부작용이 개선될 때까지 1 내지 2주 동안 지연될 수 있다. 일부 예에서, 유해한 부작용의 추가적인 발생 이후, 투여량은 감소될 수 있다. 예를 들어, 용량이 250 mg/㎡인 경우, 유해한 부작용의 두번째 발생 이후, 항-EGFR 항체의 투여는 1 내지 2주 동안 지연될 수 있다. 부작용이 개선된 경우, 항-EGFR 항체의 투여는 250 mg/㎡로 감소된 용량으로 계속될 수 있다. 부작용의 세번째 발생 이후, 항-EGFR 항체의 투여는 1 내지 2주 동안 지연될 수 있다. 부작용이 개선된 경우, 항-EGFR 항체의 투여는 150 mg/㎡로 감소된 투여량으로 계속될 수 있다. 유해한 부작용의 몇 번의 발생 이후, 항-EGFR 항체의 투여는 중단될 수 있다. 경증 또는 중등증 피부 독성을 가진 환자에서, 숙련된 당업자는 용량 변경없이 투여를 계속할 수 있다. 이러한 결정은 숙련된 당업자의 능력 내에 있다.
전달을 위한 적절한 방법은, 항-EGFR 항체 또는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 투여량의 성질에 근거하여 당업자에 의해 선별될 수 있다. 이러한 성질은, 가용성, 흡습성, 결정화 성질, 융점, 밀도, 점도, 유동성, 안정성 및 분해 프로파일을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
5. 조합 치료
본원에서 제공되는 방법에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 다른 치료 요법 또는 치료제 전, 후, 또는 병용하여 투여될 수 있다. 숙련된 의사가 경험적으로, 또는 치료제의 약동학 및 작용 방식을 고려하여, 투여의 적절한 타이밍 및 방법뿐만 아니라, 각각의 치료 요법 또는 치료제의 적절한 용량 또는 용량들을 결정할 수 있다. 추가적인 치료 요법 또는 치료제는 항-EGFR 항체의 효능 또는 안전성을 개선할 수 있다. 일부 예에서, 추가적인 치료 요법 또는 치료제는 항-EGFR 항체의 작용을 변경하기 보다는 동일한 질환 또는 동반 질환을 치료할 수 있다. 일부 예에서, 추가적인 치료 요법 또는 치료제는 당업계에 공지되거나 항-EGFR 항체의 투여와 관련된 본원에 기술된 하나 이상의 부작용을 개선, 감소 또는 제거할 수 있다.
예를 들어, 본원에서 기술된 항-EGFR 항체는 화학 치료, 방사선 치료, 또는 화학 치료 및 방사선 치료 모두와 함께 투여될 수 있다. 변형된 항-EGFR 항체는 항체, 세포 독성제, 화학 치료제, 사이토카인, 성장 억제제, 항-호르몬제, 키나아제 억제제, 항-혈관신생제, 심장보호제, 면역자극제, 면역억제제, 혈액세포 증식을 촉진하는 제제, 혈관형성 억제제, 단백질 티로신 키나아제(PTK) 억제제, 추가적인 항-EGFR 항체, FcyRIIb 또는 기타 Fc 수용체 억제제, 또는 기타 치료제를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 기타 예방 또는 치료적 제제와 병용하여 투여될 수 있다.
하나 이상의 추가적 제제는 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 이의 항-EGFR 항체와 함께 투여될 수 있다. 상기 제제는 이의 항-EGFR 항체와 함께 예를 들어, 동일한 약제학적 조성물 또는 동일한 전달 방법의 일부로서, 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 상기 제제는 이의 변형된 항-EGFR 항체로서 동시에, 그러나 다른 전달 수단에 의해, 항-EGFR 항체와 병용 투여될 수 있다. 상기 제제는 또한 이의 항-EGFR 항체의 투여와 다른 시간, 그러나 복합의 예방적 또는 치료적 효과를 갖기 위해 항-EGFR 항체의 투여 시간에 충분히 가까이, 투여될 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 추가적 제제는 선별된 기간에 의해 분리된 항-EGFR 항체의 투여 후 또는 전에 투여된다. 일부 예에서, 상기 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1월, 2월, 또는 3월이다. 일부 예에서, 하나 이상의 추가적 제제가 복수회로 투여되고 및/또는 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체가 복수회로 투여된다.
일부 예에서, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편과 함께 투여된다. 항-EGFR 항체는 동일 질환 또는 추가의 동반 질환을 치료하는데 효능을 가진 하나 이상의 다른 항체와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-EGFR 항체와 함께 투여되는 상기 하나 이상의 항체는 항암 항체, 자가면역(자가면역) 또는 염증성(inflammatory) 질환을 치료하는 항체, 이식 거부반응(transplant rejection)을 치료하는 항체, 이식편-대-숙주 질환(treat graft-versus-host-disease; GVHD)을 치료하는 항체 및 감염성 질환을 치료하는 항체 중에서 선별될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 둘 이상의 항-EGFR 항체가 조합되어 투여된다.
본원에서 제공되는 항-EGFR 항체와 병용 투여될 수 있는 항암 항체의 예는 항 17-IA 세포 표면 항원 항체 예컨대 파노렉스(Panorex®, 에드레콜로맙(edrecolomab)); 항-4-lBB 항체; 항-4Dc 항체; 항-A33 항체 예컨대 A33 및 CDP-833; 항-α1 인테그린(integrin) 항체 예컨대 나탈리주맙(natalizumab); 항-α4β7 인테그린 항체 예컨대 LDP-02; 항-αVβ1 인테그린 항체 예컨대 F-200, M-200, 및 SJ-749; 항-αVβ3 인테그린 항체 예컨대 압식시맙(abciximab), CNTO-95, Mab-17E6, 및 비탁신®(Vitaxin®); 항-보체인자 5(complement factor 5, C5) 항체 예컨대 5G1.1; 항-CA125 항체 예컨대 오바렉스®(OvaRex®, 오레고보맙(oregovomab)); 항-CD3 항체 예컨대 누비온®(Nuvion®, 비실리주맙(visilizumab)) 및 렉소맙(Rexomab); 항-CD4 항체 예컨대 IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A; 항-CD6 항체 예컨대 온콜리신 B(Oncolysin B) 및 온콜리신 CD6(Oncolysin CD6); 항-CD7 항체 예컨대 HB2; 항- CD19 항체 예컨대 B43, MT-103, 및 온콜리신 B(Oncolysin B); 항-CD20 항체 예컨대 2H7, 2H7.vl6, 2H7.vl14, 2H7.vl15, 벡사®(Bexxar®, 토시투모맙(tositumomab), 리툭산®(Rituxan®, 리툭시맙(rituximab)), 및 제바린®(Zevalin®, 이브리투모맙 튜세탄(Ibritumomab tiuxetan)); 항-CD22 항체 예컨대 림포사이드®(Lymphocide®, 에프라투주맙(epratuzumab)); 항-CD23 항체 예컨대 IDEC-152; 항-CD25 항체 예컨대 바실리시맙(basiliximab) 및 제나팍스®(Zenapax®, 다클리주맙(daclizumab); 항-CD30 항체 예컨대 AC10, MDX-060, 및 SGN-30; 항-CD33 항체 예컨대 마일로타그®(Mylotarg®, 젬투주맙 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin)), 온콜리신 M(Oncolysin M), 및 스마트 Ml 95(Smart Ml 95); 항-CD38 항체; 항-CD40 항체 예컨대 SGN-40 및 토랄리주맙(toralizumab); 항-CD40L 항체 예컨대 5c8, 안토바®(Antova®), 및 IDEC-131; 항-CD44 항체 예컨대 비바투주맙(bivatuzumab); 항-CD46 항체; 항-CD52 항체 예컨대 캠패스®(Campath®, 알렘투주맙(alemtuzumab)); 항-CD55 항체 예컨대 SC-1; 항-CD56 항체 예컨대 huN901-DMl; 항-CD64 항체 예컨대 MDX-33; 항-CD66e 항체 예컨대 XR-303; 항-CD74 항체 예컨대 IMMU-1 10; 항-CD80 항체 예컨대 갈리시맙(galiximab) 및 IDEC-1 14; 항-CD89 항체 예컨대 MDX-214; 항-CD123 항체; 항-CD138 항체 예컨대 B-B4-DM1; 항-CD146 항체 예컨대 AA-98; 항-CD148 항체; 항-CEA 항체 예컨대 cT84.66, 라베투주맙(labetuzumab), 및 펜타세아®(Pentacea®); 항-CTLA-4 항체 예컨대 MDX-101; 항-CXCR4 항체; 항-EGFR 항체 예컨대 ABX-EGF, 얼비툭스®(Erbitux®, 세툭시맙(세툭시맙)), IMC-C225, 및 머크 맙 425(Merck Mab 425); 항-EpCAM 항체 예컨대 크루셀(Crucell's) 항-EpCAM, ING-1, 및 IS-IL- 2; 항-에프린(ephrin) B2/EphB4 항체; 항-Her2 항체 예컨대 헤르셉틴®(Herceptin®), MDX-210; 항-FAP(섬유아세포 활성화 단백질(fibroblast activation protein) 항체 예컨대 시브로투주맙(sibrotuzumab); 항-페리틴(ferritin) 항체 예컨대 NXT-211; 항-FGF-1 항체; 항-FGF-3 항체; 항-FGF-8 항체; 항-FGFR 항체, 항-피브린(fibrin) 항체; 항-G250 항체 예컨대 WX-G250 및 렌카렉스®(Rencarex®); 항-GD2 갱글리오사이드(ganglioside) 항체 예컨대 EMD-273063 및 TriGem; 항-GD3 갱글리오사이드(ganglioside) 항체 예컨대 BEC2, KW-2871, 및 미투모맙(mitumomab); 항-gpIIb/IIIa 항체 예컨대 ReoPro; 항-헤파리나제(heparinase) 항체; 항-Her2/ErbB2 항체 예컨대 헤르셉틴®(Herceptin®, 트라스투주맙(trastuzumab)), MDX-210, 및 퍼투주맙(pertuzumab); 항-HLA 항체 예컨대 온콜림®(Oncolym®), 스마트 ID 10(Smart ID 10); 항-HM1.24 항체; 항-ICAM 항체 예컨대 ICM3; 항-IgA 수용체 항체; 항-IGF-1 항체 예컨대 CP-751871 및 EM-164; 항-IGF-lR 항체 예컨대 IMC-A12; 항-IL-6 항체 예컨대 CNTO-328 및 엘실리모맙(elsilimomab); 항-IL-15 항체 예컨대 휴맥스®(HuMax®)-IL15; 항-KDR 항체; 항-라미닌(laminin) 5 항체; 항-루이스(Lewis) Y 항원 항체 예컨대 Hu3S193 및 IGN-311; 항-MCAM 항체; 항-Muc1 항체 예컨대 브라바렉스(BravaRex) 및 트라이Ab(TriAb); 항-NCAM 항체 예컨대 ERIC-1 및 ICRT; 항-PEM 항원 항체 예컨대 테라진(Theragyn) 및 테렉스(Therex); 항-PSA 항체; 항-PSCA 항체 예컨대 IG8; 항-Ptk 항체; 항-PTN 항체; 항-RANKL 항체 예컨대 AMG-162; 항-RLIP76 항체; 항-SK-1 항원 항체 예컨대 모노팜 C(Monopharm C); 항-STEAP 항체; 항-TAG72 항체 예컨대 CC49-SCA 및 MDX-220; 항-TGF-β 항체 예컨대 CAT-152; 항-TNF-α 항체 예컨대 CDP571, CDP870, D2E7, 휴미라®(Humira®, 아달리무맙(adalimumab)), 및 레미케이드®(Remicade®, 인플리시맙(infliximab)); 항-TRAIL-Rl 및 TRAIL-R2 항체; 항-VE-카데린(cadherin)-2 항체; 및 항-VLA-4 항체 예컨대 안테그렌®(Antegren®)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, GD3 에피토프(epitope) 항체 BEC2 및 gp72 에피토프(epitope) 항체 105AD7를 포함하고, 이에 제한되지 않는 항-이디오타입(idiotype) 항체가 사용될 수 있다. 또한, 항-CD3/CD20 항체 Bi20을 포함하고 이에 제한되지 않는 이중특이적 항체가 사용될 수 있다.
자가면역 또는 염증성 질환, 이식 거부반응, GVHD를 치료할 수 있는, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체와 병용 투여될 수 있는, 항체의 예는 항-α4β7 인테그린 항체 예컨대 LDP-02, 항-beta2 인테그린 항체 예컨대 LDP-01, 항-보체(complement) (C5) 항체 예컨대 5G1.1, 항-CD2 항체 예컨대 BTI-322, MEDI-507, 항-CD3 항체 예컨대 OKT3, 스마트 항-CD3(SMART anti-CD3), 항-CD4 항체 예컨대 IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A, 항-CD11a 항체, 항-CD14 항체 예컨대 IC14, 항-CD18 항체, 항-CD23 항체 예컨대 IDEC 152, 항-CD25 항체 예컨대 제나팍스(Zenapax), 항-CD40L 항체 예컨대 5c8, 안토바(Antova), IDEC-131, 항-CD64 항체 예컨대 MDX-33, 항-CD80 항체 예컨대 IDEC-114, 항-CD147 항체 예컨대 ABX-CBL, 항-E-셀렉틴(selectin)항체 예컨대 CDP850, 항-gpIIb/IIIa 항체 예컨대 ReoPro®/압식시맙(Abcixima), 항-ICAM-3 항체 예컨대 ICM3, 항-ICE 항체 예컨대 VX-740, 항-FcyRl 항체 예컨대 MDX-33, 항-IgE 항체 예컨대 rhuMab-E25, 항-IL-4 항체 예컨대 SB-240683, 항-IL-5 항체 예컨대 SB-240563, SCH55700, 항-IL-8 항체 예컨대 ABX-IL8, 항-인터페론(interferon) 감마 항체, 및 항-TNFa 항체 예컨대 CDP571, CDP870, D2E7, 인플리시맙(Infliximab), MAK-195F, 항-VLA-4 항체 예컨대 안테그렌(Antegren)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 자가면역 또는 염증성 질환, 이식 거부반응 및 GVHD를 치료하기 위해 병용 투여될 수 있는 기타 Fc-함유 분자의 예는 p75 TNF 수용체/Fc 융합 엔브렐®(Enbrel®, 에타네르셉트(etanercept) 및 리제네론(Regeneron's) IL-1 트랩(trap)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
감염성 질환을 치료하기 위해 병용 투여될 수 있는 항체의 예는 항-탄저병(anthrax) 항체 예컨대 어브스랙스(ABthrax), 항-CMV 항체 예컨대 사이토겜(CytoGam) 및 세비루맙(sevirumab), 항-크립토스포리디움(cryptosporidium) 항체 예컨대 크립토겜(CryptoGAM), 스포리딘-G(Sporidin-G), 항-헬리코박터(helicobacter) 항체 예컨대 파일로란(Pyloran), 항-간염(hepatitis) B 항체 예컨대 헤페X-B(HepeX-B), 나비-HB(Nabi-HB), 항-HIV 항체 예컨대 HRG-214, 항-RSV 항체 예컨대 펠비주맙(felvizumab), HNK-20, 팔리비주맙(palivizumab), 레스피겜(RespiGam), 및 항-스타필로콕쿠스(staphylococcus) 항체 예컨대 오렉시스(Aurexis), 오로그랩(Aurograb), BSYX-A110, 및 SE-Mab을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 본원에서 기술된 변형된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 Fc 수용체에 결합되기 위해 경쟁하는 하나 이상의 분자와 함께 투여된다. 예를 들어, 억제성 수용체 FcyRIIb 억제제를 병용 투여하는 것은 증가된 이펙터(effector) 기능을 유발할 수 있다. 유사하게, FcyRIIIa와 같은 수용체 활성화 억제제 병용투여는 원치 않는 이펙터 기능을 최소화할 수 있다. Fc 수용체 억제제는 다른 면역글로불린 및 특히 IVIg(정맥내 면역글로불린(intravenous immunoglobulin))라고 불리는 치료제 뿐만 아니라, FcyRIIb, FcyRIIIa, 또는 다른 Fc 수용체에 결합하는 경쟁적 억제제로 행동하도록 설계된 Fc 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 상기 억제제는 투여되어 항-EGFR 항체가 투여되기 전에 작용하도록 허용된다. 순차적 투여의 효과 달성의 대안적 방법은 Fc 수용체 억제제의 속방출 형태 및 이후 항-EGFR 항체의 지연 방출 형태를 제공할 것이다. 속방출 및 제어방출 형태는 별개로 투여되거나 하나의 단위 투여 형태로 조합될 수 있다.
일부 예에서, 본원에서 기술된 변형된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 화학 치료 제제와 함께 투여된다. 화학 치료 제제의 예는 알킬화제 예컨대 티오테파(thiotepa) 및 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)(싸이톡산®(CYTOXAN®)); 알킬 설포네이트(alkyl sulfonate) 예컨대 부설판(busulfan), 임프로설판(improsulfan) 및 피포설판(piposulfan); 안드로겐(androgens) 예컨대 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone); 항-아드레날(adrenals) 예컨대 아미노글루테치미드(aminoglutethimide), 미토탄(mitotane), 트릴로스탄(trilostane); 항-안드로겐(androgens) 예컨대 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 바이칼루타미드(bicalutamide), 류프롤리드(leuprolide), 및 고세렐린(goserelin); 항생제(antibiotics) 예컨대 아클라시노마이신(aclacinomycins), 악티노마이신(actinomycin), 안트라마이신(anthramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycins), 칵티노마이신(cactinomycin), 칼리키아마이신(calicheamicin), 카루비신(carubicin), 카르미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로노마이신(chromomycins), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신(6-diazo-5-oxo-L-norleucine), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 마이토마이신(mitomycins), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포르피로마이신(porfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 큐엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 튜베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 예를 들어 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 4(5)-이미다졸을 억제하는 방향화효소(aromatase inhibiting 4(5)-imidazoles), 4-하이드록시타목시펜(4-hydroxytamoxifen), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY 117018, 오나프리스톤(onapristone), 및 토레미펜(toremifene, 화레스톤(Fareston))을 포함하는 항 에스트로겐; 항-대사산물 예컨대 메토트렉세이트(methotrexate) 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)); 엽산 유사체(folic acid analogues) 예컨대 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate); 아지리딘(aziridines) 예컨대 벤조데파(benzodepa), 카르보쿠온(carboquone), 메투레데파(meturedepa), 및 우레데파(uredepa); 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포아미드(triethylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포아미드(triethylenethiophosphoramide) 및 트리메틸롤 멜라민(trimethylol melamine)을 포함하는 에틸렌이민(ethylenimines) 및 메틸멜라민(methylmelamines); 엽산 보충제(folic acid replenisher) 예컨대 폴린산(folinic acid); 질소 머스타드(nitrogen mustards) 예컨대 클로람부실(chlorambucil), 클로나파진(chlornaphazine), 클로로포스파미드(chlorophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로로에타민(mechlorethamine), 메클로로에타민 옥사이드 하이드로클로라이드(mechlorethamine oxide hydrochloride), 멜팔란(melphalan), 노벰비신(novembichin), 펜에스테린(phenesterine), 프레드무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드(uracil mustard); 니트로소우레아(nitrosoureas) 예컨대 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라님무스틴(ranimustine); 백금 유사체(platinum analogs) 예컨대 시스플라틴(cisplatin) 및 카르보플라틴(carboplatin); 빈블라스틴(vinblastine); 백금(platinum); 단백질 예컨대 아르기닌 데이미나아제(arginine deiminase) 및 아스파라기나아제(asparaginase); 퓨린 유사체(purine analogs) 예컨대 플루다라빈(fludarabine), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine); 피리미딘 유사체(pyrimidine analogs) 예컨대 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(6-azauridine), 카르모포어(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플로수리딘(floxuridine), 5-FU; 탁센(taxanes), 예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel)(탁솔®(TAXOL®), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀(docetaxel)(탁소테레(TAXOTERE®), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 토포이소머라아제(topoisomerase) 억제제 RFS 2000; 티미딜레이트(thymidylate) 합성효소 억제제 (예컨대 토무덱스(Tomudex)); 아세글라톤(aceglatone)을 포함하는 추가적인 화학 치료; 알도포스파미드 글리코시드(aldophosphamide glycoside); 아미놀 에불린산(aminolevulinic acid); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비스안트렌(bisantrene); 에다트렉세이트(edatrexate); 데포스파미드(defosfamide); 데메콜신(demecolcine); 디아지쿠온(diaziquone); 디플루오로메틸오르니틴(difluoromethylornithine, DMFO); 에플오르니틴(eflornithine); 엘립티늅 아세테이트(elliptinium acetate); 에토글루시드(etoglucid); 갈륨 니트레이트(gallium nitrate); 하이드록시우레아(hydroxyurea); 렌티난(lentinan); 로니다민(lonidamine); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피다몰(mopidamol); 니트라크린(nitracrine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 포도필린산(podophyllinic acid); 2-에틸하이드라지드(2-ethylhydrazide); 프로카바진(procarbazine); PSK®; 라족산(razoxane); 시조피란(sizofiran); 스파이로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지쿠온(triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민(2,2',2"-trichlorotriethylamine); 우레탄(urethan); 빈데신(vindesine); 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노시드(arabinoside, "Ara-C"); 사이클로포스파미드(cyclophosphamide); 티오테파(thiotepa); 클로람부실(chlorambucil); 젬시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌(6-thioguanine); 머캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate);에토포시트(etoposide, VP-16); 이포스파미드(ifosfamide); 마이토마이신 C(mitomycin C); 미톡산트론(mitoxantrone); 빈크리스틴(vincristine); 비노렐빈(vinorelbine); 나벨빈(Navelbine); 노반트론(Novantrone); 테니포시드(teniposide); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 젤로다(Xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); CPT-ll; 레티노산(retinoic acid); 에스페라마이신(esperamycins); 카페시타빈(capecitabine); 및 토포이소머라아제(topoisomerase) 억제제 예컨대 이리노테칸(irinotecan)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체 또한 사용될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 이리노테칸(irinotecan)과 함께 투여된다(예컨대, Pfeiffer 외. (2007) Acta . Oncol . 46(5):697-701 참조).
화학 치료제는 전구약물(prodrug)로 투여될 수 있다. 본원에서 기술된 항-EGFR 항체와 함께 투여될 수 있는 보다 활성인 세포독성이 없는 약물로 전환될 수 있는, 전구약물의 예는 포스페이트(phosphate)-함유 전구약물, 티오포스페이트(thiophosphate)-함유 전구약물, 설페이트(sulfate)-함유 전구약물, 펩티드(peptide)-함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 글리코실화된 전구약물, 베타-락탐(lactam)-함유 전구약물, 선택적으로 치환된 페녹시 아세트아미드-함유 전구약물 또는 선택적으로 치환된 페닐아세트아미드(phenylacetamide)-함유 전구약물, 더 활성화된 세포독성이 없는 약물(cytotoxic free drug)로 변환될 수 있는 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine) 및 기타 5-플루오로우리딘(5-fluorouridine) 전구약물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 본원에서 제공되는 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 항-혈관신생제와 함께 투여된다. 예를 들어, 항-혈관신생 인자는 혈관신생(angiogenesis)을 촉진하는 것과 관련된 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는 소분자 또는 단백질(예컨대, 항체, Fc 융합체, 또는 사이토카인(cytokine))이 될 수 있다. 항-혈관신생제의 예는 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)에 결합하는 또는 VEGF-R에 결합하는 항체, VEGF 또는 VEGF-R 발현 수준을 감소시키는 RNA-기반 치료제, VEGF-독소 융합체,리제네론(Regeneron's) VEGF-트랩(trap), 안지오스타틴(angiostatin)(플라스미노겐(plasminogen) 단편), 항트롬빈 III(antithrombin III), 안지오자임(angiozyme), ABT-627, Bay 12-9566, 베네핀(BeneFin), 베바시주맙(bevacizumab), 비스포스포네이트(bisphosphonates), BMS-275291, 연골(cartilage)-유래 억제제(CDI), CAI, CD59 보체(complement) 단편, CEP-7055, Col 3, 콤브레타스타틴 A-4(Combretastatin A-4), 엔도스타틴(endostatin, 콜라겐 XVIII 단편), 파르네실(farnesyl) 전이효소 억제제, 파이브로넥틴(fibronectin) 단편, 그로-베타(gro-beta), 할로푸지논(halofuginone), 헤파리나아제(heparinases), 헤파린 육당류(heparin hexasaccharide)단편, HMV833, 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin, hCG), IM-862, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 유도가능 단백질 10(IP- 10), 인터루킨-12(interleukin-12), 크링글 5(kringle 5)(플라스미노겐(plasminogen) 단편), 마리마스타트(marimastat), 메탈로프로테이나아제(metalloproteinase) 억제제(예컨대 TIMPs), 2-메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol), MMI 270(CGS 27023A), 플라스미노겐(plasminogen) 활성제 억제제(PAI), 혈소판 인자-4(platelet factor-4, PF4), 프리노마스타트(prinomastat), 프로락틴(prolactin) 16 kDa 단편, 프롤리페린-관련 단백질(proliferin-related protein, PRP), PTK 787/ZK 222594, 레티노이드(retinoids), 솔리마스타트(solimastat), 스쿠알라민(squalamine), SS3304, SU5416, SU6668, SU11248, 테트라하이드로코르티솔-S(tetrahydrocortisol-S), 테트라티오몰리브데이트(tetrathiomolybdate), 탈리도미드(thalidomide), 트롬보스폰딘-1(thrombospondin-1, TSP-1), TNP470, 형질 전환(transforming) 성장 인자 베타(TGF-β), 바스큘로스타틴(vasculostatin), 바소스타틴(vasostatin)(칼레티큘린(calreticulin) 단편), ZS6126, 및 ZD6474를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 티로신(tyrosine) 키나아제 억제제와 함께 투여된다. 티로신 키나아제 억제제의 예는 퀴나졸린(quinazolines) 예컨대 PD 153035, 4-(3-클로로아닐리노)퀴나졸린(4-(3-chloroanilino)quinazoline); 피리도피리미딘(pyridopyrimidines); 피리미도피리미딘(pyrimidopyrimidines); 피롤피리미딘(pyrrolopyrimidines), 예컨대 CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706; 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidines), 4-(페닐아미노)-7H-피롤로(2,3-d)피리미딘(4-(phenylamino)-7H-pyrrolo(2,3-d)pyrimidines); 커큐민(curcumin) (디페룰로일메탄(diferuloylmethane), 4,5-비스(4-플루오로아닐리노)프탈이미드(4,5-bis(4-fluoroanilino)phthalimide)); 니트로티오펜(nitrothiophene) 모이어티를 함유하는 타이르포스틴(tyrphostins); PD-0183805 (워너 램버트(Warner-Lambert)사); 안티센스 분자(예컨대 ErbB-암호화 핵산에 결합하는 것들); 퀴녹살린(quinoxalines) (미국 특허 번호 제5,804,396호); 타이르포스틴(tyrphostins)(미국 특허 번호 제5,804,396호); ZD6474 (아스트라제네카(Astra Zeneca)사); PTK-787 (노바티스(Novartis)사/쉐링A G(Schering A G)사); pan-ErbB억제제 예컨대 Cl-1033 (화이자(Pfizer)사); 아피니탁(Affinitac) (ISIS 3521; 아이시스(Isis)/릴리(Lilly)사); 이마티닙 메실레이트(Imatinib mesylate) (STI571,글리벡®(Gleevec®); 노바티스(Novartis)사); PKI 166 (노바티스); GW2016 (글락소 스미스클라인(Glaxo SmithKline)사); Cl-1033 (화이자) ; EKB-569 (와이어스(Wyeth)사); 세막시닙(Semaxinib) (수젠(Sugen)사); ZD6474 (아스트라제네카); PTK-787 (노바티스/쉐링A G); INC-1 C11 (임클론(Imclone)사); 또는 하기 임의의 특허 공보에 기술된 것으로서: 미국 특허 번호 제5,804,396호; PCT WO99/09016(아메리칸 시아니미드(American Cyanimid)사); PCT WO98/43960(아메리칸 시아니미드); PCT WO97/38983(워너 램버트); PCT WO99/06378(워너 램버트); PCT WO99/06396 (워너 램버트); PCT WO96/30347(화이자); PCT WO96/33978(아스트라제네카); PCT WO96/33979(아스트라제네카); PCT WO96/33980(아스트라제네카), 제피티닙(gefitinib) (이레사®(Iressa®), ZD 1839, 아스트라제네카), 및 OSI-774(타쎄바®(Tarceva®), OSI 제약/제넨테크(OSI Pharmaceuticals/Genentech)사)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 본원에서 기술된 변형된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 면역조절제와 함께 투여된다. 이러한 제제는 하나 이상의 사이토카인(cytokines)의 생산을 증가 또는 감소시키거나, 자기-항원 제시를 상향-또는 하향-조절시키거나, MHC 항원을 마스크(mask)하거나 또는 하나 이상의 유형의 면역 세포의 증식, 분화, 이동, 또는 활성화 상태를 촉진시킬 수 있다. 면역조절제의 예는 비-스테로이드성 항-염증성 약물(NSAIDs) 예컨대 아스피린(aspirin), 이부프로펜(ibuprofen), 셀레콕시브(celecoxib), 디클로페낙(diclofenac), 에토돌락(etodolac), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 케토로락(ketorolac), 옥사프로진(oxaprozin), 나부메톤(nabumetone), 설린닥(sulindac), 톨메틴(tolmetin), 로페코시브(rofecoxib), 나프록센(naproxen), 케토프로펜(ketoprofen), 및 나부메톤(nabumetone); 스테로이드(예컨대 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 덱사메타손(dexamethasone), 코르티손(cortisone), 하이드록시코르티손(hydroxycortisone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 트리암시놀론(triamcinolone), 아줄피딘 에이코사노이드(azulfidine eicosanoids) 예컨대 프로스타글란딘(prostaglandins), 트롬복세인(thromboxanes), 및 류코트리엔(leukotrienes); 뿐만 아니라 국소 스테로이드(topical steroids) 예컨대 안트랄린(anthralin), 칼시포트리엔(calcipotriene), 클로베타솔(clobetasol), 및 타자로텐(tazarotene)); 사이토카인(tokines) 예컨대 TGFb, IFNa, IFNβ, IFNγ, IL-2, IL4, IL-10; 사이토카인, 케모카인, 또는 엔브렐(Enbrel®, 에타네르셉트(etanercept)), 휴미라(Humira®, 아달리무맙(adalimumab)), 및 레미케이드(Remicade®, 인플리시맙(infliximab))을 포함하는, BAFF, B7, CCR2, CCR5, CD2, CD3, CD4, CD6, CD7, CD8, CDll, CD14, CD15, CD17, CD18, CD20, CD23, CD28, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD52, CD64, CD80, CD86, CD147, CD152, 보체 인자(C5, D) CTLA4, 이오탁신(eotaxin), Fas, ICAM, ICOS, IFNα, IFNβ, IFNＢγ, IFNAR, IgE, IL-1, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5R, IL-6, IL-8, IL-9, IL-12, IL-13, IL-13R1, IL-15, IL-18R, IL-23, 인테그랄(integrals), LFA-1, LFA-3, MHC, 셀렉틴(selectins), TGFβ, TNFa, TNFβ, TNF-R1, T-세포 수용체에 대한 항체, 가용성 수용체, 및 수용체-Fc 융합체를 포함하는 수용체 길항제; 이종이식(heterologous) 항-림프구(lymphocyte) 글로불린; 다른 면역조절 분자 예컨대 2-아미노-6-아릴-5 치환 피리미딘(2-amino-6-aryl-5 substituted pyrimidines), MHC 결합 펩티드 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입(idiotypic) 항체, 아자티오프린(azathioprine), 브레퀴나르(brequinar), 브로모크립틴(Bromocryptine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 사이클로스포린 A(cyclosporine A), D-페니실아민(D-penicillamine), 데옥시스페르구알린(deoxyspergualin), FK506, 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 금(gold), 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine), 레플루노미드(leflunomide), 말로노니트릴아미드(malononitriloamides) (예컨대 레플루노미드(leflunomide)), 메토트렉세이트(methotrexate), 미노시클린(minocycline), 미조리빈(mizoribine), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 라파마이신(rapamycin), 및 설파살라진(sulfasalazine)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 본원에 기술된 항-EGFR 항체, 예컨대 변형된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 사이토카인과 함께 투여된다. 사이토카인의 예는 림포카인(lymphokines), 모노카인(monokines), 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 사이토카인 중에는 성장 호르몬 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐(N-methionyl) 인간 성장 호르몬, 및 소(bovine) 성장 호르몬; 부갑상선(parathyroid) 호르몬; 티록신(thyroxine); 인슐린; 프로인슐린(proinsulin); 릴랙신(relaxin); 프로릴락신(prorelaxin); 당단백질(glycoprotein) 호르몬 예컨대 여포(follicle) 자극 호르몬(FSH), 갑상선(thyroid) 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성(luteinizing) 호르몬(LH); 간(hepatic) 성장 인자; 섬유아세포(fibroblast) 성장 인자; 프로락틴(prolactin); 태반성 락토겐(placental lactogen); 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮐러관(mullerian)-억제 물질; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드(gonadotropin-associated peptide); 인히빈(inhibin); 액티빈(activin); 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(thrombopoietin, TPO); 신경 성장 인자 예컨대 NGF-베타; 혈소판(platelet)-성장 인자; 형질 전환(transforming) 성장 인자(TGFs) 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(erythropoietin, EPO); 뼈 전도성(osteoinductive) 인자; 인터페론 예컨대 인터페론-알파, 베타, 및 -감마; 콜로니(colony) 자극 인자(CSFs) 예컨대 대식세포(macrophage)-CSF(M-CSF); 과립구(granulocyte)-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(ILs) 예컨대 IL-1, IL-l알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, 종양 괴사 인자 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 LIF 및 키트 리간드(kit ligand, KL)를 포함하는 기타 폴리펩티드 인자가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 본원에서 기술된 변형된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 사이토카인 또는 면역 시스템의 세포를 자극하고 원하는 이펙터 기능을 향상시키는 다른 제제와 함께 투여된다. 예를 들어, IL-2를 포함하나 이에 제한되지 않는 NK 세포를 자극하는 제제는 본원에서 기술된 항-EGFR 항체와 함께 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, C5a, 포밀(formyl) 펩티드 예컨대 N-포밀-메치오닐-류실-페닐알라닌(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine) (Beigier-Bompadre 외. (2003) Scand. J. Immunol. 57:221-8)을 포함하나 이에 제한되지 않는, 대식세포를 자극하는 제제는 본원에서 기술된 항-EGFR 항체와 함께 투여될 수 있다. 또한, G-CSF 및 GM-CSF를 포함하나 이에 제한되지 않는 호중구(neutrophils)를 자극하는 제제는, 본원에서 기술된 항-EGFR 항체와 함께 투여될 수 있다. 또한, 이러한 면역조절 사이토카인의 이동을 촉진하는 제제는 본원에서 기술된 항-EGFR 항체와 함께 투여될 수 있다. 또한 인터페론 감마, IL-3 및 IL-7을 포함하나 이에 제한되지 않는 추가적인 제제는 하나 이상의 이펙터 기능을 촉진시킬 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 기술된 항-EGFR 항체는 하나 이상의 사이토카인 또는 이펙터 세포 기능을 억제하는 다른 제제와 함께 투여된다.
일부 예에서, 본원에서 기술된 항-EGFR 항체는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 항생제와 함께 투여된다: 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 항생제(예컨대 아프라마이신(apramycin), 아르베카신(arbekacin), 뱀버마이신(bambermycins), 부티로신(butirosin), 디베카신(dibekacin), 겐타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin), 네틸마이신(netilmicin), 파로모마이신(paromomycin), 리보스타마이신(ribostamycin), 시소마이신(sisomicin), 스펙티노마이신(spectinomycin)), 아미노사이클리톨(aminocyclitols) (예컨대 스펙티노마이신), 암페니콜(amphenicol) 항생제(예컨대 아지담페니콜(azidamfenicol), 클로람페니콜(chloramphenicol), 플로르페니콜(florfenicol), 및 티암페니콜(thiamphenicol)), 안사마이신(ansamycin) 항생제(예컨대 리파미드(rifamide) 및 리팜핀(rifampin)), 카바페넴(carbapenem) (예컨대 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 파니페넴(panipenem)); 세팔로스포린(cephalosporin)(예컨대 세파클로르(cefaclor)), 세파드록실(cefadroxil), 세파만돌(cefamandole), 세파트리진(cefatrizine), 세파제돈(cefazedone), 세포조프란(cefozopran), 세프피미졸(cefpimizole), 세프피라미드(cefpiramide), 세프피롬(cefpirome), 세프프로질(cefprozil), 세푸록심(cefuroxime), 세픽심(cefixime), 세팔렉신(cephalexin), 세프라딘(cephradine)), 세파마이신(cephamycins)(세프부페라존(cefbuperazone), 세폭시틴(cefoxitin), 세프미녹스(cefminox), 세프메타졸(cefmetazole), 및 세포테탄(cefotetan)); 린코사미드(lincosamides)(예컨대 클린다마이신(clindamycin), 린코마이신(lincomycin)); 매크롤라이드(macrolide)(예컨대 아지트로마이신(azithromycin), 브레펠딘 A(brefeldin A), 클라리트로마이신(clarithromycin), 에리트로마이신(erythromycin), 록시트로마이신(roxithromycin), 토브라마이신(tobramycin)), 모노박탐(monobactams)(예컨대 아즈트레오남(aztreonam), 카루모남(carumonam), 및 티게모남(tigemonam)); 무피로신(mupirocin); 옥사세펨(Oxacephems)(예컨대 플로모세프(flomoxef), 라타모세프(latamoxef), 및 모사락탐(moxalactam)); 페니실린(penicillins) (예컨대 암디노실린(amdinocillin), 암디노실린 피복실(amdinocillin pivoxil), 아목시실린(amoxicillin), 바캄피실린(bacampicillin), 벤질페니실린산(benzylpenicillinic acid), 벤질페니실린 소듐(benzylpenicillin sodium), 에피실린(epicillin), 펜베니실린(fenbenicillin), 플록사실린(floxacillin), 페나메실린(penamecillin), 페네타메이트 하이드리오다이드(penethamate hydriodide), 페니실린 o-베네타민(penicillin o-benethamine), 페니실린 O(penicillin O), 페니실린 V(penicillin V), 페니실린 V 벤조에이트(penicillin V benzoate), 페니실린 V 하이드라바민(penicillin V hydrabamine), 페니메피사이클린(penimepicycline), 및 페네티실린 포타슘(phenethicillin potassium)); 폴리펩티드(예컨대 바시트라신(bacitracin), 콜리스틴(colistin), 폴리믹신 B(polymixin B), 테이코플라닌(teicoplanin), 반코마이신(vancomycin)); 퀴놀론(quinolones)(아미플록사신(amifloxacin), 시녹사신(cinoxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 에녹사신(enoxacin), 엔로플록사신(enrofloxacin), 플레록사신(fleroxacin), 플루메퀸 (flumequine), 가티플록사신(gatifloxacin), 제미플록사신(gemifloxacin), 그레파플록사신(grepafloxacin), 로메플록사신(lomefloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 날리딕스산(nalidixic acid), 노르플록사신(norfloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 옥소린산(oxolinic acid), 페플록사신(pefloxacin), 피페미드산(pipemidic acid), 로속사신(rosoxacin), 루플록사신(rufloxacin), 스파르플록사신(sparfloxacin), 테마플록사신(temafloxacin), 토수플록사신(tosufloxacin), 및 트로바플로사신(trovafloxacin)); 리팜핀(rifampin); 스트렙토그라민(streptogramins)(예컨대 퀴누프리스틴(quinupristin), 달포프리스틴(dalfopristin)); 설폰아미드(sulfonamides)(설파닐아미드(sulfanilamide), 설파메톡사졸(sulfamethoxazole)); 테트라사이클린(tetracyclines)(클로르테트라사이클린(chlortetracycline), 데메클로사이클린 하이드로클로라이드(demeclocycline hydrochloride), 데메틸클로르테트라사이클린(demethylchlortetracycline), 독시사이클린(doxycycline), 듀라마이신(Duramycin), 미노사이클린(minocycline), 네오마이신(neomycin), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline), 및 반코마이신(vancomycin)).
일부 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 암포테리신 B(amphotericin B), 시클로피록스(ciclopirox), 클로트리마졸(clotrimazole), 에코나졸(econazole), 플루코나졸(fluconazole), 플루시토신(flucytosine), 이트라코나졸(itraconazole), 케토코나졸(ketoconazole), 미코나졸(miconazole), 니스타틴(nystatin), 테르비나핀(terbinafine), 테르코나졸(terconazole), 및 티오코나졸(tioconazole)을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 항-진균(fungal)제와 함께 투여된다. 일부 예에서, 본원에서 기술된 항-EGFR 항체는 프로테아제(protease) 억제제, 역전사효소(reverse transcriptase) 억제제, 및 유형 I 인터페론, 바이러스성 융합 억제제, 뉴라미니다아제(neuraminidase) 억제제, 아사이클로비르(acyclovir), 아데포비르(adefovir), 아만타딘(amantadine), 암프레나비르(amprenavir), 클레부딘(clevudine), 엔푸버타이드(enfuvirtide), 엔테카비르(entecavir), 포스카르네트(foscarnet), 간사이클로비르(ganciclovir), 이독수리딘(idoxuridine), 인디나비르(indinavir), 로피나비르(lopinavir), 플레코나릴(pleconaril), 리바비린(ribavirin), 리만타딘(rimantadine), 리토나비르(ritonavir), 사퀴나비르(saquinavir), 트리플루리딘(trifluridine), 비다라빈(vidarabine), 및 지도부딘(zidovudine)을 포함하는 기타를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 항바이러스제와 함께 투여된다.
본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 다른 치료 요법과 함께 조합될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체로 치료되는 환자는 방사선 치료를 받을 수 있다. 방사선 치료는 당업계에 일반적으로 적용되고 숙련된 당업자에게 공지된 프로토콜에 따라 투여될 수 있다. 그러한 치료는 세슘(cesium), 이리듐(iridium), 아이오딘(iodine), 또는 코발트(cobalt) 방사선을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 방사선 치료는 전신 조사될 수 있거나, 또는 체내 또는 신체 표면에 있는 특정 부위 또는 조직 예컨대 폐, 방광, 또는 전립선에 국소적으로 조사될 수 있다.
전형적으로, 방사선 치료는 약 1 내지 2주에서 몇 시간의 기간 동안 펄스(pulse)로 투여된다. 그러나, 상기 방사선 치료는 더 긴 시간의 기간 동안 투여될 수 있다. 예를 들어, 방사선 치료는 약 6 내지 약 7주 동안 두경부암(head and neck cancer)을 가지는 환자에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 상기 방사선 치료는 단일 용량 또는 다중의, 연속된 용량으로 투여될 수 있다. 숙련된 전문의는 본원에 유용한 방사선 치료의 적절한 용량 또는 용량을 경험적으로 결정할 수 있다. 항-EGFR 항체 및 선택적으로 하나 이상의 다른 항암 치료는 생체 외에서 암 세포를 치료하기 위해 적용된다. 이러한 생체 외 치료는 골수 이식(bone marrow transplantation) 및 특히, 자가(autologous) 골수 이식에 유용할 수 있을 것으로 고려된다. 예를 들어, 예컨대 본원에서 기술된, 항-EGFR 항체 및 하나 이상의 항암 치료로 암 세포를 포함하는 세포 또는 조직(들)의 치료는 수여자 환자에서 이식 전에 암 세포를 감손시키거나 또는 실질적으로 감손하는데 적용될 수 있다.
방사선 치료는 또한 동위원소로 표지된 분자, 예컨대 항체로의 치료를 포함할 수 있다. 방사선면역치료법(radioimmunotherapeutics)의 예는 제발린®(Zevalin®)(Y-90으로 표지된 항-CD20), 림포사이드®(LymphoCide®)(Y-90으로 표지된 항-CD22) 및 벡사®(Bexxar®)(1-131로 표지된 항-CD20)을 포함한다.
또한, 본원에서 제공되는 변형된 항-EGFR 항체는 그외에도 다른 치료적 기술 예컨대 수술 또는 광선요법과 조합하여 환자 또는 대상체에게 투여될 수 있다.
H. 실시예
하기 실시예들은 단지 예시적 목적을 위해 포함된 것이며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도가 아니다.
실시예 1
HC-Y104 돌연변이 항- EGFR 항체의 생성 및 발현
내부 리보솜 결합 부위(internal ribosomal entry site, IRES)에 의해 분리된, 세툭시맙의 경쇄(LC) 및 변형된 중쇄(HC)를 암호화하는 4개의 발현 벡터를 pcDNA3.1-Erbitux-LC-IRES-HC 백본 작제물(backbone construct)(서열번호 306)에서 생성하였다. 플라스미드 작제물 내 참조 세툭시맙 항-EGFR 항체는 서열번호 50(서열번호 8에 기재된 경쇄를 암호화함)에 기재된 경쇄 뉴클레오티드 서열에 직접적으로 연결된 Igκ 시그널 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 42)을 함유한다. 플라스미드 작제물 내 참조 세툭시맙 항-EGFR 항체는 서열번호 48(서열번호 6에 기재된 중쇄를 암호화함)에 기재된 중쇄 뉴클레오티드 서열에 직접적으로 연결된 Ig 시그널 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 41)을 또한 함유한다. 플라스미드는 또한 중쇄 불변 영역(domain)의 C-말단에 연결될 FLAG 태그(서열번호 45)를 암호화한다.
중쇄 아미노산 서열의 104번 위치에서 Tyr(Y)을 암호화하는 뉴클레오티드를 Asp(D) 또는 Glu(E)를 암호화하는 뉴클레오티드로 치환하는 코돈 치환에 의해 참조 플라스미드 작제물의 코딩 서열을 돌연변이화함으로써 변형된 중쇄를 생성하였다. 생성된 돌연변이들의 돌연변이 코돈, 각 변형된 항-EGFR 항체를 암호화하는 발현 벡터, 및 각 생성된 변이체의 중쇄 및 경쇄의 해당 서열번호를 표 16에 기재하였다.
Figure pct00038
프리스타일(FreeStyle) CHO-S 세포(인비트로젠)를 1 L 쉐이커 플라스크 내 300 mL 중 6×105 세포/mL의 밀도로 성장시키고, DNA FreeStyle MAX(인비트로젠)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 상기 생성된 작제물로 형질감염시켰다. 형질감염 후 168시간째에 상청액을 수확하고, 2-mL 단백질 A/G 컬럼(Bio-Rad)을 사용하여 발현된 항체들(mAbs)을 정제하였다. 용출된(eluted) 항체들(mAbs)을 인산염완충식염수(PBS)로 투석하고 0.5-1 mL의 부피로 농축하였다. 나노드랍(NanoDrop) 분광광도계 및 흡광 계수(extinction coefficient)를 사용하고, 비어-램버트 방정식(Beer-Lambert equation) A=εcl (여기서, A는 흡광도이고, ε는 흡광 계수이고, c는 단백질 농도이고, l은 경로 길이이다)을 사용하여, 정제된 항체들(mAbs)의 단백질 농도를 결정하였다. 발현된 항체들의 단백질 농도를 표 17에 기재하였다.
Figure pct00039
실시예 2
HC- Y104D 변이체 항- EGFR 항체를 발현하는 안정한 세포주의 생성
HC-Y104D 변이체 항-EGFR 항체를 발현하는 안정한 세포주를 수립하기 위하여, 제조사의 프로토콜에 따라 FreeStyle™ MAX 시약(인비트로젠) 37.5 ㎕와 함께 플라스미드 DNA(서열번호 308, 상기 파트 1에서 생성됨) 37.5 ㎍을 사용하여 약 1.0 × 106 세포/mL의 밀도의 30 mL의 CHO-S 세포를 형질감염시켰다.
형질감염 후 72시간째에, 96-웰 둥근 바닥 플레이트(Nunc)의 15개의 웰 내 글루타맥스(GlutaMAX)(8 mM) 및 1 mg/mL G418로 보충된 CD-CHO 배지에서 1차원 순차 희석 전략(1-dimensional serial dilution strategy)을 사용하여 세포의 클론 분리(clonal isolation)를 수행하였다. 4주 후에, 검출 항체로서 퍼옥시다제 컨주게이션된 항-인간 IgG Fc(Jackson Immunolab)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석(WB)에 의해 HC-Y104D 돌연변이를 발현하는 클론을 스크린하였다. 양성 클론을 12-웰로, 그리고 나서 6-웰로, 플레이트로, 이어서 T-25 및 T-75 플라스크 및 마지막으로 쉐이커 플라스크로 단계적으로 확장시켰다. HC-Y104D를 5 mg/L로 발현하는 2개의 클론을 웨이브백 바이오리액터 생산(wavebag bioreactor production)으로 추가로 확장시켰다. 30-mL 단백질 A 컬럼을 사용하여, 실시예 1에 기재된 친화성 크로마토그래피에 의해 항체들을 정제하였다.
실시예 3
HC-Y104 돌연변이 항- EGFR 항체의 pH-의존적 결합 평가(assessing)
실시예 1에서 생성된 flag-태그된 Y104D-GAT, Y104D-GAC, Y104E-GAA, 및 Y104E-GAG의 상청액에 대하여, pH 7.4, 6.5, 및 6.0의 3가지 pH 조건하에서 평행한 고처리 pH 민감성 ELISA(parallel, high-throughput pH sensitive ELISA)를 사용하여, EGFR의 His-태그된 가용성 세포외 도메인(sEGFR-H6; Sino Biologics, Cat #10001-H08H)으로의 결합에 대해 아세이하였다. Flag-태그된 비변형 야생형 세툭시맙 항-EGFR 항체(서열번호 18에 기재된 중쇄 및 서열번호 8에 기재된 경쇄) 및 flag-태그된 인간화된 T030F/Y104D/Q111P 돌연변이 항-EGFR 돌연변이 항체(FDP-h3으로 명명됨, 미국특허공개번호 2013/0266579의 실시예 15 참조)를 대조 항체로 사용하였다. FDP-h3은 서열번호 257에 기재된 뉴클레오티드 서열(경쇄, 서열번호 258에 기재된 경쇄를 암호화함) 및 서열번호 64에 기재된 뉴클레오티드 서열(중쇄, 서열번호 65에 기재된 중쇄를 암호화함)을 함유하며, 상기 중쇄는 C-말단에서 서열번호 45에 기재된 FLAG 태그에 직접적으로 연결된다.
간략하게, 완충제 A 크렙스-링거 완충제(Krebs-Ringer Buffer), pH 7.4, 무 혈청(KRB, Sigma Aldrich, # K4002) 중 12 nM(1.32 ㎍/mL)의 sEGFR-H6 항원 100 ㎕로 4℃에서 하룻밤 또는 실온(RT)에서 2시간 동안 96 웰 Hi-결합 플레이트(Costar #2592)를 코팅함으로써, sEGFR-H6를 상기 플레이트 상에 고정시켰다. 이후 플레이트를 KRB의 250 ㎕/웰로 3회 세척하였다. 이후 플레이트를 3개의 그룹으로 나누고 (1) 250 ㎕ pH 7.4 완충제 B(25% 인간 혈청 및 1 mM 젖산), (2) 250 ㎕ pH 6.5 완충제 C(25% 인간 혈청 및 16.7 mM 젖산), 또는 (3) 250 ㎕ pH 6.0 완충제 C(25% 인간 혈청 및 16.7 mM 젖산) 중 어느 하나와 함께 실온에서 1시간 동안, 덮여진 채로 차단하였다.
상기 flag-태그된 Y104D-GAT, Y104D-GAC, Y104E-GAA, 및 Y104E-GAG 항체들, 및 대조 야생형 및 FDP-h3 항체들을 3-배 계단 희석으로 희석하여 각 pH 조건하에서 각 항체의 7개의 실시 농도를 생성하였다. pH 7.4에서의 결합을 테스트하기 위해, Y104D-GAT, Y104D-GAC, Y104E-GAA, 및 Y104E-GAG 돌연변이 및 대조 FDP-h3을 각각 pH 7.4에서 완충제 B 중 1000 ng/mL, 333 ng/mL, 111 ng/mL, 37 ng/mL, 12.3 ng/mL, 4.1 ng/mL, 및 1.4 ng/mL로 희석하였다. pH 6.5 및 pH 6.0에서 테스트하기 위해, Y104D-GAT, Y104D-GAC, Y104E-GAA, 및 Y104E-GAG 돌연변이 및 대조 FDP-h3을 각각 pH 6.5 또는 pH 6.0에서 완충제 C 중 300 ng/mL, 100 ng/mL, 33.3 ng/mL, 11.1 ng/mL, 3.7 ng/mL, 1.2 ng/mL, 및 0.4 ng/mL로 각각 희석하였다. 야생형 세툭시맙을 pH 7.4, 6.5 및 6.0에서 3개의 각 완충제 중 100 ng/mL, 33.3 ng/mL, 11.1 ng/ml, 3.7 ng/ml, 1.2 ng/ml, 0.4 ng/mL, 및 0.14 ng/mL로 희석하였다. 상기 항체 희석액의 각각의 100 마이크로리터(100 ㎕)를 결합된 sEGFR-H6 항원을 함유하는 96-웰 플레이트의 개별 웰에 첨가한 후, 덮어서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 플레이트를 해당 pH의 완충제 B 또는 완충제 C의 250 ㎕/웰로 3회 세척하였다. 해당 pH의 완충제 B 또는 완충제 C 중 500 ng/mL의 100 ㎕ 염소 항-FLAG-HRP 검출 항체(Abcam, #ab 1238)를 각 웰에 첨가하였다. 이후 플레이트를 덮고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 플레이트의 웰들을 해당 pH의 완충제 B 또는 완충제 C의 250 ㎕로 3회 세척하였다. 마지막으로, 100 ㎕ Sureblue TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 1-성분(KPL, #52-00-03) 용액을 각 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 실온에서 15-20분 동안 현상되도록(develop)(빛을 차단하여) 두었다. 100 ㎕ TMB 정지 용액(KPL, #50-85-06)을 각 웰에 첨가하여 반응을 중단시키고, 마이크로플레이트 분광광도계(Molecular Devices, Spectra Max M3)를 사용하여 30분 이내에 450 nM(OD450)에서 웰의 광학 밀도(optical density)를 측정하였다.
ELISA를 삼중으로 수행하였고, 반응의 평균 OD 값을 각 샘플에 대하여 계산하였으며 항체 농도에 대하여 플롯하였다. 상기 결과의 커브-핏팅(curve-fitting) 분석을 위해 4 파라미터 로지스틱 비선형 회귀 모델을 사용하였으며, 하기 방정식을 사용하였다: y = ((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D, 여기서 A는 최소 점근선(asymptote)이고, B는 경사 계수이고, C는 변곡점/EC50 값이고, D는 최대 점근선이다. 결과를 하기 표 18 내지 20에 나타내었다.
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
각 테스트된 돌연변이 및 대조에 대하여 상이한 pH 조건에서의 EC50 값을 표 21에 추가로 요약하였는데, 여기서 더 높은 EC50은 더 약한 결합을 나타낸다. 표 21에는 또한 각 돌연변이의 pH 6.0 또는 6.5 대 pH 7.4에서의 결합 활성의 비율(즉, pH 6.0 또는 6.5 대 pH 7.4에서의 EC50의 역의 몫)을 기재하였는데, 여기서 비율 > 1인 경우는 중성 pH 조건 보다 산성 pH 조건하에서 결합이 더 크다는 것을 나타낸다.
Figure pct00043
상기 결과는 pH 7.4에서 야생형 세툭시맙 항체는 pH 6.0 또는 pH 6.5에서보다 약간 더 높은 EC50을 나타내었다는 것을 보여준다. 이에 반해서, Y104 돌연변이들 및 FDP-h3 대조의 경우, 산성 pH 테스트 조건보다 중성 pH 테스트 조건하에서 더 높은 EC50에 의해 입증되는 바와 같이 pH 6.5 또는 pH 6.0에서보다 pH 7.4에서 결합이 실질적으로 더 약했다. 따라서 돌연변이들 각각은 pH 7.4 보다 산성 pH 6.0 또는 6.5에서 더 큰 결합 비율을 나타낸다.
pH 7.4에서, Y104E 돌연변이는 Y104D 돌연변이의 EC50 값보다 약 3-배 더 큰 EC50 값을 나타내었는데, 이는 Y104E 돌연변이가 Y104D 돌연변이보다 pH 7.4에서 더 약한 결합을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다. 6.0 및 6.5의 산성 pH 조건에서, Y104E 및 Y104D 돌연변이의 EGFR에 대한 결합은 유사한 EC50 값으로부터 입증되듯이 실질적으로 동일하였다. 구체적으로, Y104E 돌연변이들, Y104E-GAA 및 Y104E-GAG는 pH 7.4에서 18.6 및 16.9의 EC50 값을 나타내었는데, 이는 중성 pH에서 야생형 항체의 EC50 값(EC50 = 3.3) 보다 5-배 이상 더 크고, 보다 산성 pH에서 해당 EC50 값보다 약 6-배 더 큰 값이다. 이러한 결과는 104번 위치에서 Tyr(Y)를 Glu(E)로 치환할 경우 해당 항체는 야생형과 비교하여 또한 104번 위치에 Asp(D)를 갖는 항체들과 비교하여 중성 pH에서 감소된 EGFR 결합을 나타내나, 산성인 조건 하에서는 유사한 EGFR 결합 수준을 보유한다는 것을 나타낸다.
실시예 4
인간화 Y104D , Y104E 및 Y104E / Q111P 항체의 생성
1. 인간화 및 pH- 의존성에 대한 스크리닝
서열번호 53(서열번호 52에 기재된 핵산 서열에 의해 암호화됨)에 기재된 중쇄 및 서열번호 8(서열번호 50에 기재된 핵산 서열에 의해 암호화됨)에 기재된 경쇄를 갖는 HC-Y104D/Q111P(클론 2-2; DP라고도 함; 미국특허출원번호 13/815,553 참조)의 전장의 경쇄 및 중쇄 서열을 암호화하는 이중쇄 DNA 단편을 사용하여 인간화된 클론의 라이브러리를 생성한 후, 이를 발현시키고 pH-의존적 EGFR 결합 및 단백질 발현 수준에 대해 스크린하였다(미국특허공개번호 2013/0266579의 실시예 15 참조). CHO-S 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 인간화된 클론으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간째에 상청액을 회수하였다. IgG 농도를 결정하고 상청액을 2 ng/mL로 조정하여 실시예 3에 기재된 pH 민감성 ELISA를 사용하여 pH 6.0 및 pH 7.4에서 EGFR 결합의 pH-의존적 결합에 대하여 테스트하였다.
낮은 발현 수준을 나타내는 클론은 제외하고, 부모 양성 대조(HC-Y104D/Q111P)와 비교하여 pH 6.0에서의 결합 활성 대 pH 7.4에서의 결합 활성의 비율에서 유사하거나 더 나은 비율을 나타내는 주요 히트(primary hits)를 선별하였다. 상기 주요 히트를 2차 작제 및 확인 스크리닝 대상으로 하였다. 스크리닝을 위해, 형질감염된 상청액을 4 ng/mL, 2 ng/mL 및 1 ng/mL의 농도로 조정하고, 실시예 3에 기재된 pH 민감성 ELISA를 사용하여 pH 6.0 및 pH 7.4에서 EGFR 결합의 pH-의존적 결합에 대하여 테스트하였다. 부모 양성 대조와 비교하여 pH 6.0에서의 결합 활성 대 pH 7.4에서의 결합 활성의 비율에서 유사하거나 더 나은 비율을 나타내는 히트를 식별하고(identified), 이들 식별된 히트의 서열을 결정하였다.
2. 인간화 백본으로부터 변이체의 생성
인간화 Y104D/Q111P 세툭시맙 돌연변이 항체(DP-h7로 명명됨; 서열번호 55(중쇄) 및 서열번호 181(경쇄))를 생성하고 상기 기술한 바와 같이 인간화된 히트로 선별하였다. 확인 스크리닝에서, 상기 DP-h7 인간화된 클론은 테스트한 농도에서 다음과 같은 pH 6.0/pH 7.4 OD 비율을 나타내었다: 4 ng/mL, 11.30의 비율; 2 ng/mL, 7.21의 비율; 1 ng/mL, 17.35의 비율.
서열번호 54(중쇄) 및 서열번호 180(경쇄)에 기재된 뉴클레오티드 서열을 함유하는, 서열번호 311에 기재된 DP-h7을 암호화하는 플라스미드를 출발 백본으로 사용하여 인간화 Y104D, Y104E 및 Y104E/Q111P 돌연변이 EGFR 항체를 생성하였다. 간략하게, 인간화 백본을 사용하여 104번 위치에서 Asp(D)를 Glu(E)로 및/또는 111번 위치에서 Pro(P)를 Gln(Q)로 돌연변이시켰다. 표 22는 돌연변이화된 코돈, 생성된 발현 벡터 및 생성된 인간화 항체의 결과적으로 얻은 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 요약한 것이다.
Figure pct00044
3. 인간화 Y104D , Y104E 및 Y104E / Q111P 항체의 발현 평가
인간화 Y104D(D-h), Y104E(E-h) 및 Y104E/Q111P(EP-h) 클론을 암호화하는 플라스미드를 실시예 1에 기재된 바와 같이 FreeStyle CHO-S 세포에서 발현시키고, 정제하고 농축하되, 다만 형질감염 후 96시간째에 상청액을 수확하여 최종 부피가 4.5 mL가 되도록 농축하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 나노드랍(NanoDrop) 분광광도계 및 흡광 계수(extinction coefficient)를 사용하여 발현된 항체의 단백질 농도를 결정하였다. 발현된 항체의 단백질 농도를 표 23에 기재하였다.
Figure pct00045
4. 인간화 Y104D (D-h), Y104E (E-h) 및 Y104E / Q111P ( EP -h) 항체의 pH-의존적 활성 평가
a.
인간화 Y104D(D-h), Y104E(E-h) 및 Y104E/Q111P(EP-h) 항체를 상기 소항목 3에 기재된 바와 같이 정제하고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 pH 7.4, 6.5, 및 6.0의 3가지 pH 조건하에서 평행한 고처리 pH 민감성 ELISA(parallel, high-throughput pH sensitive ELISA)를 사용하여 EGFR의 His-태그된 가용성 세포외 도메인(sEGFR-H6; Sino Biologics, Cat #10001-H08H)으로의 결합에 대해 아세이하였다. 비-인간화 flag-태그된 Y104D(서열번호 67에 기재된 중쇄 및 서열번호 8에 기재된 경쇄) 및 비-인간화 flag-태그된 Y104D/Q111P(서열번호 53에 기재된 중쇄 및 서열번호 8에 기재된 경쇄)의 결합 활성을 참조/대조 항체로 사용하였다.
ELISA를 삼중으로 수행하였고, 반응의 평균 OD 값을 각 샘플에 대하여 계산하였으며, 실시예 3에 기재된 4 파라미터 로지스틱 비선형 회귀 모델을 사용하여 항체 농도에 대하여 플롯하였다. 그 결과를 하기 표 24 내지 26에 기재하였다.
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
각 테스트된 돌연변이 및 대조에 대하여 상이한 pH 조건에서의 EC50 값을 표 27에 추가로 요약하였는데, 여기서 더 높은 EC50은 더 약한 결합을 나타낸다. 표 27에는 또한 각 돌연변이의 pH 6.0 또는 6.5 대 pH 7.4에서의 결합 활성의 비율(즉, pH 6.0 또는 6.5 대 pH 7.4에서의 EC50의 역의 몫)을 기재하였는데, 여기서 비율 > 1인 경우는 중성 pH 조건 보다 산성 pH 조건하에서 결합이 더 크다는 것을 나타낸다.
Figure pct00049
상기 결과는 모든 테스트된 변이체들이 pH 6.5 또는 pH 6.0에서보다 pH 7.4에서 더 높은 EC50, 및 따라서 더 약한 결합을 나타낸다는 것을 보여준다. 테스트된 돌연변이들의 상기 EC50에 의해 입증되는 바와 같이 결합 활성은 pH 6.0 및 pH 6.5에서 모두 실질적으로 동일하였고, 다만 변이체 Y104D/Q111P는 다른 테스트된 변이체들과 비교하여 pH 6.0 및 pH 6.5에서 약간 감소된 결합 활성을 나타내었다. 구체적으로, 비-인간화 Y104D, DP-h07, D-h, E-h, 및 EP-h 항체들의 EC50 값은 pH 6.0에서 유사했으며, 약 3 내지 4의 값의 범위였다. 비-인간화 Y104D/Q111P의 EC50은 pH 6.0에서 약간 더 높았다(EC50 = 7.2). 돌연변이들은 또한 pH 6.5에서 유사한 EC50 값을 나타내었다. 따라서, 산성 pH에서, 테스트된 모든 작제물들은 유사한 EGFR-결합 친화성을 갖는다.
각 돌연변이들은 pH 7.4에서보다 산성 pH 6.0 또는 6.5에서 더 높은 결합 활성의 비율을 나타내었다. 인간화 Y104E(E-h) 및 Y104D/Q111P(EP-h)는 테스트된 작제물의 pH 7.4에서보다 산성 pH 6.0 또는 6.5에서 가장 높은 결합 활성의 비율을 나타내었다. E-h 및 EP-h 돌연변이 변이체들은 또한 pH 7.4에서 가장 높은 EC50 값, 결국 가장 약한 결합 활성을 나타내었는데, 그 값은 pH 7.4에서 각각 46.1 및 69.8 이었다. 따라서 pH 6.0 또는 6.5 대 pH　7.4에서의 EC50의 역의 비율에 의해 측정되는, 결합 활성의 더 높은 비율은 중성 pH에서 감소된 결합 친화성(증가된 EC50 값) 때문이다.
b.
추가의 실험에서, 정제된 인간화 Y104D(D-h), Y104E(E-h) 및 Y104E/Q111P(EP-h)에 대하여, 상기 기재된 바와 같이 pH 7.4, 6.5, 및 6.0의 3가지 pH 조건하에서 평행한 고처리 pH 민감성 ELISA(parallel, high-throughput pH sensitive ELISA)를 사용하여 EGFR의 His-태그된 가용성 세포외 도메인(sEGFR-H6; Sino Biologics, Cat #10001-H08H)으로의 결합에 대해 아세이하였다. 비교를 위해, 비-인간화 flag-태그된 Y104D(서열번호 67에 기재된 중쇄 및 서열번호 8에 기재된 경쇄), 비-인간화 flag-태그된 Y104E(서열번호 71에 기재된 중쇄 및 서열번호 8에 기재된 경쇄), 및 서열번호 67에 기재된 중쇄 및 서열번호 8에 기재된 경쇄를 발현하는 Y104D-S로 명명된 수립된 안정한 CHO 세포주로부터 정제된 비-인간화 flag-태그된 Y104D의 결합 활성을 측정하였다.
ELISA를 삼중으로 수행하였고, 반응의 평균 OD 값을 각 샘플에 대하여 계산하였으며, 상기 기재된 4 파라미터 로지스틱 비선형 회귀 모델을 사용하여 항체 농도에 대하여 플롯하였다. 그 결과를 하기 표 28 내지 30에 기재하였다.
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
각 테스트된 돌연변이 및 대조에 대하여 상이한 pH 조건에서의 EC50 값을 표 31에 추가로 요약하였고, 각 돌연변이의 pH 6.0 또는 6.5 대 pH 7.4에서의 결합 활성의 비율(즉, pH 6.0 또는 6.5 대 pH 7.4에서의 EC50의 역의 몫)을 기재하였다.
Figure pct00053
상기 결과는 Y104E 돌연변이가 Y104D 돌연변이 보다 산성 pH에서 더 높은 pH 선택적 결합을 나타내었다는 것을 보여준다. 예를 들어, 비-인간화 Y104E 돌연변이는 pH 7.4에서 EC50가 38.9이므로, pH 6.0 (EC50 = 3.21) 또는 pH 6.5 (EC50 = 4.31)에서보다 pH 7.4에서 감소된 결합을 나타내었다. 인간화 Y104E(E-h) 항체는 대응 비-인간화 Y104E 항체 보다 pH 7.4에서 약간 감소된 결합 활성을 나타내었으나, pH 6.0 또는 6.5 대 pH 7.4에서의 결합 활성의 비율은 비-인간화 Y104E 항체의 결합 활성의 비율과 실질적으로 동일하였다. 인간화 Y104E/Q111P 돌연변이(EP-h)는 테스트된 작제물의 산성 조건하에서 EGFR 결합에 대하여 가장 높은 선택성을 나타내었다. 구체적으로, EP-h 돌연변이는 pH 7.4에서 EC50 209를 나타내었는데, 이는 pH 6.0에서의 대응 EC50 값보다 약 49배 더 높고 pH 6.5에서의 대응 EC50 값보다 약 17배 더 높은 것으로, EP-h 인간화 변이체가 테스트된 다른 변이체들보다 pH 7.4에서 실질적으로 보다 약한 결합을 나타낸다는 것을 보여준다. EC50 값에 의해 보여지는 바와 같이 산성 pH 6.0 또는 6.5에서의 EP-h 변이체의 결합 활성은 다른 테스트된 변이체와 유사하였다.
Y104D 돌연변이 역시 산성-pH 선택적 결합 활성을 나타내었으나, Y104E 돌연변이가 나타내는 선택적 결합 활성 보다는 낮은 범위였다. 인간화 Y104D(D-h) 돌연변이는 pH 7.4에서 56.4의 EC50을 나타내었는데, 이는 pH 6.0에서의 EC50보다 약 8배 더 높고 pH 6.5에서의 EC50보다 약 4배 더 높았다.
실시예 5
pH-의존적 EGFR 결합을 나타내는 항- EGFR 돌연변이의 생성 및 스크리닝
1. 항- EGFR 돌연변이 항체 라이브러리의 생성
pcDNA3.1-Erbitux-LC-IRES-HC 백본 작제물(서열번호 306) 내 부위-특이적 돌연변이생성(site-directed mutagenesis)에 의해 세툭시맙 항-EGFR 항체의 단일 점 돌연변이(point mutants)의 라이브러리를 구축 및 생성하였다. 상기 작제물은 참조 세툭시맙 항-EGFR 항체 플라스미드 작제물을 포함하며, 이는 서열번호 50(서열번호 8에 기재된 경쇄를 암호화함)에 기재된 경쇄 뉴클레오티드 서열에 직접적으로 연결된 Igκ 시그널 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 42)을 함유한다. 상기 플라스미드 작제물 내 상기 참조 세툭시맙 항-EGFR 항체는 서열번호 48(서열번호 6에 기재된 중쇄를 암호화함)에 기재된 중쇄 뉴클레오티드 서열에 직접적으로 연결된 Ig 시그널 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 41)을 또한 함유한다. 상기 플라스미드는 중쇄 불변 영역의 C-말단에 연결된 FLAG 태그(서열번호 45)를 또한 함유하였다.
세툭시맙 항-EGFR 항체의 변이체들을 함유하도록 라이브러리를 생성하였는데, 세툭시맙의 중쇄(서열번호 7에 기재된 가변 중쇄를 갖는 서열번호 6) 또는 경쇄(서열번호 9에 기재된 가변 경쇄를 갖는 서열번호 8) 중 어느 하나의 가변 영역 내 100개의 아미노산 위치 중 하나의 위치에서 각 멤버가 참조 항체와 비교하여 단일 아미노산 돌연변이를 함유하도록 하였다. 상기 서로 다른 위치들은 세툭시맙 항-EGFR 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 내에 존재하였고, 위치들의 대다수는 상기 경쇄 또는 중쇄의 CDRs에 존재하였다. 적어도 15개의 아미노산 돌연변이가 각 위치에서 만들어졌다. 상기 라이브러리의 각 멤버의 서열을 결정하고, 라이브러리의 멤버들의 글리세롤 스톡(stocks)을 제조하여 -80℃에서 보관하였다.
2. 항- EGFR 돌연변이 스크리닝
리포펙타민 2000(인비트로젠, Cat. No. 11668-027)을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 플라스미드 DNA를 단일층 CHO-S 세포(인비트로젠, Cat. No. 11619-012) 내로 형질감염시켰다. 간략하게, CHO-S 세포를 형질감염 전날 저녁에 시드하여 10% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 다음날, 세포가 80% 컨플루언트(confluent)가 된 후에, CHO-S 세포의 배지를 Opti-MEM(인비트로젠)으로 교체하였다. 플라스미드 DNA와 리포펙타민의 혼합물(0.2 ㎍ DNA 및 0.5 ㎕ 리포펙타민)을 CHO-S 세포에 첨가하여 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 CD-CHO 무혈청 배지(인비트로젠, Cat. No. 10743-029)로 보충하였다. 형질감염된 세포로부터의 상청액을 형질감염 후(일반적으로 형질감염 후 72 시간째) 회수하였다.
실시예 3에 기재된 바와 같이, 평행한 고처리 pH 민감성 ELISA를 사용하되, 항체를 2개의 희석물(희석 1 및 희석 2)로 첨가하고 pH 7.4 및 pH 6.0의 2가지 pH 조건하에서 결합을 측정함으로써, 상기 상청액에 대하여 EGF 수용체의 가용성 세포외 도메인(EGFR sECD)으로의 결합을 아세이하였다.
a. 항체 결합 결과
ELISA를 이중으로 수행하였고, 상기 이중 반응의 평균 OD 값을 계산하였다. OD 값을 기초로, pH 7.0에서와 비교하여 pH 6.0에서 sEGFR-H6에 더 높은 결합 활성을 나타내는 변이체 항-EGFR 항체를 식별하여 표 32에 나타내었다. 표 32는 희석 1 및 희석 2에서 변이체 항체의 pH 6.0에서의 평균 OD(ODpH 　6.0), pH 7.4에서의 평균 OD(ODpH　7.4), 및 pH 6.0 및 7.4에서의 평균 OD 값의 비율(ODpH 　6.0/ODpH 　7.4)을 기재하고 있다.
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
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Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
aHC = 중쇄; LC = 경쇄
bV = 가변
b. 항체 농도의 결정
항-EGFR 항체 정량 ELISA에 의해 항체 농도를 결정하였다. 간략하게, PBS 중 12 nM(1.32 ㎍/mL)의 sEGFR-H6(Sino Biologicals Inc, Cat# 10001-H08H) 항원 100 ㎕로 플레이트를 코팅하고, PBS의 250 ㎕/웰로 3회 세척하고; 5 mg/mL BSA를 포함하는 PBS 250 ㎕를 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 항-EGFR-FLAG 항체 표준(단백질 A 칼럼 정제된)의 순차적 희석물을 5 mg/mL BSA를 포함하는 PBS 중에서 제조하였다. 시작 항체 농도는 100 ng/mL이었고, 이어서 특정된 바와 같이 1:3 희석하였다. 테스트 시료 희석물을 제조하여(1:3 희석물), 표준 및 테스트 시료의 100 ㎕/웰을 웰에 첨가하여 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 5 mg/mL BSA를 포함하는 PBS의 250 ㎕/웰로 3회 세척하였다. 100 ㎕/웰 토끼 항-인간 IgG-Fc-HRP를 PBS/ 5 mg/mL BSA 중 1:5000(최종 농도 0.2 ㎕/mL) 희석으로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고; PBS / 5 mg/mL BSA의 250 ㎕/웰로 3회 세척하였다. TMB 기질을 첨가하고 상기 기재된 바와 같이 플레이트를 판독하였다.
c. 특이 활성의 계산
평균 OD 값을 항체 농도로 나누기하여 특이 활성(specific activity; SA)을 계산하였다. 그리고나서 변이체 항-EGFR 항체의 특이 활성을 참조 FLAG-태그된 항-EGFR 부모 항체의 특이 활성으로 나누기하여, 특이 활성을 표준화함으로써(normalized) 각 변이체에 대한 표준화 특이 활성(NSA)을 수득하였다. 표 33은 희석 1(dilution 1) 및 희석 2(dilution 2)에서 상기 기재된 각각의 식별된 변이체의 표준화 특이 활성을 기재하고 있다. pH 6.0에서 NSA > 0.4 및 pH 7.4에서 NSA < 0.4를 가지는 변이체 항-EGFR 항체를 식별하여 이를 추가 분석을 위해 선택하였다. 이들 식별된 항체들의 돌연변이는, 경쇄(LC) 돌연변이 L004C, L004V, S056H 또는 N091V를 포함하는 항체; 및 중쇄(HC) 돌연변이 V024I, V024L, S025C, S025G, S025I, S025Q, S025T, S025L, N031I, N031T, N031V, Y032seT, V050L, G054R, G054C, G054P, D058M, Y059E, F063R, F063C, F063G, F063M, F063V, T064N, T064V, S068F, S068Q, D072K, D072L, D072M, D072W, N073Q, S074H, S074R, S074D, S074G, S074Y, K075H, K075W, Q077R, Q077E, T100I, T100P, Y101W, Y104D, Y104F, Y104S 또는 A107N을 포함하는 항체들이다.
Figure pct00075
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Figure pct00095
Figure pct00096
3. 확인 스크린
2개의 pH 값 모두에서 5% 혈청을 사용한 점을 제외하고는 상기 항목 2에서 기재된 바와 같이 확인 스크린을 수행하였다. 표 34는 희석 1 및 희석 2에서 예시적인 테스트된 변형된 항체들에 대한 각 희석에서 pH 6.0에서의 OD(OD6.0), 각 희석에서 pH 7.4에서의 OD(OD7.4), 및 pH 6.0 및 7.4에서의 평균 OD 값의 비율(OD6.0/OD7.4)을 기재하고 있다.
Figure pct00097
Figure pct00098
실시예 6
조합적 라이브러리(Combinatorial Library)의 생성 및 스크리닝
HC-Y104E와 함께 LC-I29S, HC-V24E, HC-S25C, HC-F27R, HC-R97H 및/또는 HC-Q111P 돌연변이의 모든 조합을 갖는 항체 멤버를 포함하는 항-EGFR 변이체 멤버의 조합적 라이브러리를 생성하였다. 실시예 1에 기재된 HC-Y104E 세툭시맙 돌연변이 항-EGFR 항체(서열번호 74에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 8에 기재된 가변 경쇄를 포함함)의 중쇄 가변 영역 내에 또는 부위-특이적 돌연변이생성(site-directed mutagenesis)에 의해 실시예 4에서 생성된 HC-Y104E의 인간화 형태(서열번호 61에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 183에 기재된 가변 경쇄를 포함함)의 중쇄 가변 영역 내에 다중 점 돌연변이를 생성하였다. 상기 라이브러리의 각 멤버의 서열을 결정하고 글리세롤 스톡(stocks)으로 -80℃에서 보관하였다. 생성된 조합 돌연변이들 중에는 표 35에 기재된 돌연변이들이 포함되었다.
Figure pct00099
스크리닝을 위하여, 라이브러리의 멤버를 암호화하는 발현 벡터를 CHO 세포에서 별도로 발현시켜 IgG 항체 및 상청액을 회수하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, pH 민감성 ELISA에 의해 라이브러리를 스크리닝하였다. pH 7.4와 비교하여 pH 6.0에서 더 높은 결합 활성을 나타내는 예시적 항체들을 선별하였다.
실시예 7
식별된 히트(hits)의 결합 친화도
바이오-층 간섭계(bio-layer interferometry)를 수행하여 pH 6.5 및 pH 7.4에서 변이체 항-EGFR 항체의 EGFR으로의 결합을 측정하였다. 옥텟 큐케이이 기구(Octet QKe instrument)(ForteBio, Menlo Park, CA)를 사용하여 96-웰 포맷 내 바이오-층 간섭계에 의해 sEGFR에 대한 세툭시맙 및 Y104E-함유 변이체 항-EFGR 항체의 해리 상수(KD)를 측정하였다. 비오틴화된 sECD EGFR 리간드 로딩 및 항체 연합(association) 및 해리(dissociation) 단계를 포함한 모든 작동 단계에 데이터 획득 소프트웨어를 사용하였다. 리간드 로딩 및 항체 연합 및 해리 단계를 2개의 그룹, 하나는 pH 6.5에서 다른 하나는 pH 7.4에서 수행하였다.
용액 중 sEGFR 1 mg에 NHS-PEG4-비오틴 용액(초순수 중 20 mM)(PIERCE, Cat# 21329) 15 ㎕를 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 30분 동안 실온에서 인큐베이션하여 비오틴화된 sECD EGFR을 제조하였다. 비반응 NHS-PEG4-비오틴을 투석에 의해 제거하고, 제조사의 지침에 따라 BCA 단백질 아세이(PIERCE, Cat# 23225)에 의해 비오틴화된 sEGFR의 단백질 농도를 측정하였다.
1. pH 6.5 및 pH 7.4에서 항- EGFR 변이체의 결합 친화도
상이한 pH에서의 결합의 차이를 평가하기 위하여, pH 6.5에서 또는 pH 7.4에서 PBS 중 스트렙트아비딘 바이오층에 비오틴화된 sECD EGFR을 결합시켰다(리간드 로딩 단계). 그리고 나서, PBS(pH 6.5 또는 pH 7.4)를 함유하는 웰 내에 스트렙트아비딘 센서를 1분 동안 담갔다. 그 후, PBS(pH 6.5 또는 pH 7.4) 중 비오틴화된 sEGFR(50 ㎍/mL)을 함유하는 웰 내에 상기 센서를 2분 동안 담갔다. PBS(pH 6.5 또는 pH 7.4)를 함유하는 웰 중에서 센서를 씻어 내었다. 모든 단계 동안, 플레이트를 1000 rpm에서 교반하였다.
연합 속도(association rate)를 측정하기 위하여, pH 6.5 또는 7.4의 PBS 중 22 nM 또는 66.7 nM로 항체(세툭시맙 또는 Y104E 변이체 항-EGFR 항체)를 가지는 웰 내로 고정화된 sECD-EGFR 센서를 2분 동안 담갔다. 해리 속도(dissociation rate)을 측정하기 위하여, 항체가 결합된 센서를 pH 6.5 또는 7.4의 PBS 웰 중에 4분 동안 담갔다. 광학 층 및 바이오층으로부터 반사된 빛으로부터 생성된 간섭 패턴에 있어서의 변화를 측정함으로써 sEGFR와 항체(세툭시맙 또는 Y104E 변이체 항-EGFR 항체)의 연합 및 해리를 정량화하였다. 글로벌 커브 피팅(global curve fitting)을 사용하여 소프트웨어 데이터 분석(v. 6.4)를 이용하여 연합 속도, 해리 속도 및 KD 값을 계산하였다.
실시예 8
EGFR 인산화
참조 세툭시맙 항체 또는 Y104E 항-EGFR 항체 변이체로 처리된 인간 신생아 케라티노사이트 및 A431 세포로부터의 인산화된 EGFR의 농도를 ELISA(RnD systems reagent, #DYC3570-2)로 측정하였다.
1. 시료의 제조
약 10,000개의 세포, 인간 신생아 케라티노사이트(인비트로젠 C001-5C) 또는 A431 세포(ATCC CRL 1555)를 96 웰 플레이트(BD Falcon #35-3072)의 웰에 플레이트하였다. 5% CO2 인큐베이터의 가습 분위기에서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 무혈청 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 중에 재현탁시키고, 동일 조건하에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 세포를 차가운 인산염완충식염수(PBS; 137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HP04, 1.5 mM KH2P04, pH 7.2-7.4)로 세척하였다. 그 후, 플레이트를 2개의 그룹으로 나누었다. 제1 그룹은, 10 ㎍/mL 정제된 세툭시맙 또는 HC-Y104E 변이체를 포함하는 항-EGFR 항체 또는 완충제 대조군을 pH 7.4로 조정된 인산염 완충액에 첨가하였다. 제2 그룹은, 정제된 세툭시맙 또는 HC-Y104E 변이체를 포함하는 항-EGFR 항체 또는 완충제 대조군을 pH 6.5로 조정된 인산염 완충액에 첨가하였다.
A431 세포에 대하여, 용량-반응(dose-response)을 또한 수행하였는데, 세툭시맙 또는 HC-Y104E 변이체를 포함하는 항-EGFR 항체를 30 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 3.33 ㎍/mL, 1.11 ㎍/mL, 0.37 ㎍/mL, 0.123 ㎍/mL 및 0.001 ㎍/mL의 농도로 시료에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 15-30분 동안 인큐베이션하였다.
항체와 함께 초기 인큐베이션 후, EGF(RnD Systems, catalog no. 236-E)(100 ㎍/mL)를 항체와 동일한 완충액 중의 세포에 별개로 첨가하였다. 항체를 첨가하지 않은 세포(EGF 단독), 또는 항체 또는 EGF를 첨가하지 않은 세포(no Rx: 반응 없음)를 대조 세포로 또한 테스트하였다. 세포를 37℃에서 15-30분 동안 인큐베이션하였다. 항원과 함께 인큐베이션 후, 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 차가운 용해(lysis) 완충액(1% NP-40 대체제, 20 mM 트리스(pH 8.0), 137 mM NaCl, 10% 글리세롤, 2 mM EDTA, 1 mM 활성화된 소듐 오르쏘바나데이트(orthovanadate), 10 ㎍/mL 아프로티닌, 10 ㎍/mL 류펩틴(Leupeptin))을 첨가하였다. 용해물(lysate)을 회수하여 즉시 아세이하거나 또는 후속 분석을 위해 ≤ -70℃에서 보관하였다.
2. ELISA
96 웰 마이크로플레이트(Costar #2592)를 실온에서 하룻밤 동안 랫트 항-인간 항-포스포 EGFR 포획 항체(PBS 중 8.0 ㎍/mL, 100 ㎕/웰)(R&D Systems #842428)로 코팅하였다. 각 웰을 흡입시키고, 세척 완충액(PBS 중 0.05% TWEEN®20, pH 7.2-7.4)(R&D Systems #WA126)으로 총 5회의 세척으로 세척하였다. 플레이트를 차단 완충액(Block buffer)(1% BSA, PBS 중 0.05% NaN3, pH 7.2-7.4) 300 ㎕로 실온에서 1-2 시간 동안 차단시켰다. 웰을 흡입시키고 세척 완충액으로 총 5회의 세척으로 세척하였다. 세포 용해물(세툭시맙, 항-EGFR 항체 Y104E 변이체 항체, EGF 단독 또는 반응 없음(No Rx))을 IC 희석제(1% NP-40 대체제, 20 mM 트리스(pH 8.0), 137 mM NaCl, 10% 글리세롤, 2 mM EDTA, 1 mM 활성화된 소듐 오르쏘바나데이트) 중에서 희석시키고, 100 ㎕를 첨가하였다. 흡입 및 세척 단계를 반복하고, HRP(20 mM 트리스(pH 8.0), 137 mM NaCl, 0.05% TWEEN®20, 0.1% BSA)에 컨주게이션된 마우스 항-인간 포스포-EGF R(Y1068) 항체 100 ㎕를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 흡입 및 세척 단계를 반복하였다. 기질(H2O2 및 테트라메틸벤지딘의 1:1 혼합물(R&D Systems, Catalog# DY999)(100 ㎕)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 정지 용액(2 N H2S04)(R&D Systems, Catalog# DY994)(50 ㎕)을 첨가하고, 540 nm 또는 570 nm의 파장 보정을 갖는 450 nm로 설정된 마이크로플레이트 판독기에서 웰의 광학 밀도(OD)를 즉시 측정하였다.
실시예 9
세툭시맙 또는 HC- Y104E 항- EGFR 항체의 존재하에서 인간 및 신생아 케라티노사이트의 성장
인간 신생아 케라티노사이트(인비트로젠 C-001-5C) 및 인간 성인 케라티노사이트(인비트로젠 C-005-5C)를 세툭시맙 또는 HC-Y104E 변이체를 포함하는 항-EGFR 항체와 함께 인큐베이션한 후에 그 성장을 측정하였다. 테스트할 항체를 정상 성장 배지(10% FBS, DMEM (pH 7.4))에 10 ㎍/mL, 3.33 ㎍/mL, 1.11 ㎍/mL, 0.37 ㎍/mL, 0.123 ㎍/mL, 0.0411 ㎍/mL, 0.0137 ㎍/mL 및 0.00457 ㎍/mL의 농도로 첨가하였다.
세툭시맙 또는 HC-Y104E 변이체를 포함하는 항-EGFR 항체를 포함하는 정상 성장 배지의 존재하에 96-웰 플레이트(BD Falcon 35-3072)에 인간 신생아 케라티노사이트 및 인간 성인 케라티노사이트를 첨가하였다(1000 세포/웰). 각 조건을 5개의 복제(replicate) 웰에서 아세이하였다(즉, 조건 당 n=5). 세포를 5% CO2 인큐베이터의 가습 분위기에서 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다. CellTiter-Glo® 발광 세포 생육도 아세이(Promega Cat# G-7571)에 의해 세포 성장을 측정하고, 항체 없이 성장시킨 대조 세포와 비교한 백분율 생존 세포로 표현하였다.
실시예 10
이종이식 모델에서 세툭시맙 또는 HC- Y104E 변이체를 포함하는 항- EGFR 항체의 종양 성장에 대한 효과
A431 표피모양(epidermoid) 암종 세포, FaDu 하인두암(hypopharyngeal) 암종 세포, 및 A431 세포로부터 유래한 조작된 세포주 A431LDHA 및 A431CA9를 사용하여 이종이식 종양 모델을 생성하였고, 상기 모델을 사용하여 세툭시맙 및 HC-Y104E 변이체를 포함하는 항-EGFR 항체의 항종양 활성을 평가하였다.
1. 피하 A431 종양
RPMI-1640 배지 중에 현탁된 3.3×106 A431 표피모양(epidermoid) 암종 세포(ATCC CRL1555)를 0.1 mL 피하(SC) 주사로 수컷, 무흉선(athymic) NCr-nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 접종하였다. 종양이 ~100 mm3의 크기에 도달했을 때, 동물을 5개의 연구 그룹(n=4/그룹)으로 무작위로 나누었다: (1) 그룹 1 - 비히클(세툭시맙 완충액), (2) 그룹 2 - 0.1 mg/마우스(4 mg/kg 체중) 세툭시맙, (3) 그룹 3 - 1.0 mg/마우스(40 mg/kg 체중) 세툭시맙, (4) 그룹 4 - 0.1 mg/마우스(4 mg/kg 체중) HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체, 또는 (5) 그룹 5 - 1.0 mg/마우스(40 mg/kg 체중) HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체. 0, 4, 7, 11, 및 14일째에 주당 2회 세툭시맙 참조 또는 HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체 변이체 또는 비히클 대조의 0.1 mg 또는 1.0 mg을 마우스의 복강내로(IP) 투여하였다. 0, 4, 7, 11, 14 및 18일째에 상기 기재된 바와 같이 종양 성장을 측정하였고, 다만 비히클만 처리한 동물은 14일째에 희생시켰다.
세툭시맙 또는 HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체 처리 그룹의 종양 성장 억제(TGI)를 다음 식을 사용하여 계산하였다: % TGI = [1-(TB-TA)/(CB-CA)] × 100; 여기서, TB는 처리 개시 후 14일째에 처리 그룹의 평균 종양 부피(mm3)이고, TA는 처리 전 0일째에 처리 그룹의 평균 종양 부피(mm3)이고, CB는 처리 개시 후 14일째에 대조 그룹의 평균 종양 부피이고, CA는 처리 전 0일째에 대조 그룹의 평균 종양 부피이다(예를 들어, Teicher BA 및 Andrews PA: Anticancer Drug Development, Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials and Approval, 2판. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 134, 2004 및 T. Friess 외, (2006) Anticancer Research 26:3505-3512 참조). TGI를 야생형 세툭시맙 및 HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체 간에 비교하였다.
2. 피하 FaDu 종양:
RPMI-1640 배지 중에 현탁된 5.0×106 FaDu 하인두암(hypopharyngeal) 암종 세포(ATCC)를 0.1 mL 피하(SC) 주사로 수컷, 무흉선(athymic) NCr-nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 접종하였다. 종양이 ~100 mm3의 크기에 도달했을 때, 동물을 5개의 연구 그룹(n=4/그룹)으로 무작위로 나누었다: (1) 그룹 1 - 비히클(세툭시맙 완충액), (2) 그룹 2 - 4 mg/kg 세툭시맙, (3) 그룹 3 - 40 mg/kg 세툭시맙, (4) 그룹 4 - 4 mg/kg HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체, 또는 (5) 그룹 5 - 40 mg/kg HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체. 0, 3, 7, 및 10일째에 주당 2회 항체 또는 비히클 단독을 복강내로(IP) 투여하였다. 항체 투여 직전에 -1, 3, 7, 10, 14일째에 상기 기재된 바와 같이 캘리퍼스(calipers)를 사용하여 종양 성장을 측정하였다. 종양 성장 억제를 평가된 항체 간에 비교하였다.
실시예 11
피하의 종양 및 영장류 피부에서의 EGFR 발현
피하의 이종이식 종양 및 수확된 영장류 피부에서의 EGFR의 검출을 면역조직화학(immunohistochemistry; IHC)에 의해 확인 및 평가하였다.
a. 피하 종양에서의 EGFR 발현
실시예 10.1에 기재된 바와 같이 누드 마우스에서 이종이식으로 성장시킨 A431 인간 종양에서의 EGFR 발현의 수준을 면역조직화학(IHC)을 사용하여 평가하였다. A431 피하 종양을 수확하여 10% 중성 완충된 포르말린(NBF) 중에 고정시키고 파라핀 중에 포매하였다. 5 ㎛ 절편을 슬라이드 위에 올리고 건조하였다. 염색 전에, 슬라이드를 탈파라핀하고 재수화하였다. EGFR IHC 키트(Dako, Carpinteria, CA)를 사용하여 절편을 면역표지하였다. 제조사의 지침에 따라 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)을 사용하여 염색을 시각화하였다. 핵은 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 인사이트 파이어와이어 디지털 카메라(Diagnostic Instruments, Michigan)와 연결된 니콘 이클립스 TE2000U 현미경으로 현미경사진(micrograph)을 캡쳐하였다. 종양 세포에서 EGFR에 대한 강한 세포막 양성(positivity)은, A431 세포로부터 유래된 이종이식 종양이 높은 수준의 EGFR 발현을 유지한다는 것을 확인해 주었다.
b. 영장류 피부에서의 EGFR 발현
면역조직화학(IHC)을 사용하여 인간 및 비인간 영장류 피부 샘플에서의 EGFR 발현의 수준을 평가하였다. 인간 피부 샘플은 지역 외과 센터로부터 수득하였다; 사이노몰구스 원숭이, 마모셋 원숭이 및 다람쥐 원숭이 피부는 월드와이드 영장류 인코퍼레이션(Worldwide Primates Inc.)(마이애미, FL)로부터 수령하였다. 포름알데하이드 고정된 인간, 사이노몰구스 원숭이, 마모셋 원숭이 및 다람쥐 원숭이 샘플을 절편화하고 상기 기재된 바와 같이 EGFR IHC 키트(DAKO)를 사용하여 IHC로 처리하였다. 핵은 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 현미경사진을 20× 및 40× 대물렌즈(objective)로 상기와 같이 캡쳐하였다.
예측된 바와 같이, 기저(basal) 케라티노사이트의 막은 EGFR에 대하여 강한 염색을 나타내었다. 사이노몰구스 및 다람쥐 원숭이 피부 조직의 기저 케라티노사이트 역시 염색을 나타내었는데, 사이노몰구스 피부 염색은 인간 및 다람쥐 원숭이 조직에서 관찰된 염색보다 약간 덜한 강도를 나타내었다. 마모셋 원숭이 피부는 40× 대물렌즈를 사용한 경우에도 어떠한 검출가능한 염색도 나타내지 않았다. 이러한 결과는, 마모셋 원숭이 EGFR은 아니지만, 사이노몰구스 원숭이 및 다람쥐 원숭이 EGFR은 인간 EGFR과 충분히 유사하여 항-인간 EGFR 단일클론 항체에 의해 인식될 수 있음을 나타낸다.
실시예 12
HC- Y104E 변이체를 포함하는 항- EGFR 항체의 생체 외( Ex Vivo ) A431 피하 종양 또는 피부 이식에의 결합
앞선 실시예에 기재된 바와 같이 피하 종양 및 영장류 피부에서 EGFR이 발현되기 때문에, HC-Y104E 돌연변이 항체의 생체 외(Ex Vivo) 피하 종양 및 영장류 피부 이식에의 결합을 평가하였다.
1. 피하 종양에 대한 생체 외( Ex vivo ) 결합 연구
면역형광(IF)을 사용하여 인간 EGFR에 결합하는 세툭시맙 및 HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체의 능력을 평가 및 비교하였다. DyLight 594 항체 라벨링 키트(Thermo Scientific; Rockford, IL)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 PBS 중 10, 5, 1, 0.3, 0.1 ㎍/mL의 DyLight594에 세툭시맙 및 HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체를 컨쥬게이션하였다. 절편화(sectioning) 후, A431 종양의 동결된 절편을 차가운 아세톤 중에서 10분 동안 고정하고, DyLight594-컨쥬게이션된 세툭시맙 또는 HC-Y104E 항체 중 어느 하나의 5 ㎍/mL 또는 1 ㎍/mL와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 중에서 세척한 후, 절편을 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드)(Molecular Probes, Eugene)로 대조 염색하였다. 인사이트 파이어와이어 디지털 카메라(Diagnostic Instruments, Michigan)와 연결된 니콘 이클립스 TE2000U 현미경을 사용하여, 20× 및 40× 대물렌즈(objective)로 현미경사진을 캡쳐하였으며, 각 이미지에 대해 동일한 설정을 사용하여 실험 조건 간에 비교를 가능케 하였다. EGFR 결합을 항체 간에 비교하였다.
2. 영장류 피부에 대한 생체 외( Ex vivo ) 결합 연구
면역형광(IF)을 사용하여 다양한 영장류 피부 샘플에서 인간 EGFR에 결합하는 세툭시맙 및 HC-Y104E 변이체 항체의 능력을 평가하였다. 알렉사플루오르(Alexafluor) 594(Thermo Scientific DyLight 594 항체 라벨링 키트; Rockford, IL)에 컨쥬게이션된 1.0 ㎍/mL 세툭시맙 또는 HC-Y104E 변이체를 사용하여, 상기 기술된 바와 같이 중성 pH에서 인간, 사이노몰구스 원숭이, 마모셋 원숭이 및 다람쥐 원숭이(인간 피부는 지역 외과 센터로부터 수령; 사이노몰구스 원숭이, 마모셋 원숭이 및 다람쥐 원숭이 피부는 월드와이드 영장류, 플로리다로부터 수령)의 냉동절편을 직접적으로 면역표지하였다. 핵을 DAPI를 사용하여 대조염색하였다. 20× 및 40× 대물렌즈(objective)를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 현미경사진을 캡쳐하였다. 전-케라티노사이트(pre-keratinocyte) 및 기저 세포의 면역표지를 육안으로 평가하고 항체 간에 비교하였다.
실시예 13
형광적으로 -표지된 HC- Y104E 돌연변이 항- EGFR 항체의 생체 내( In Vivo ) 종양 대(versus) 피부에 대한 선택적 결합
세툭시맙, HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체, 및 대조군 인간 IgG를 디라이트755 설피드릴-반응성 염료(DL755)(Thermo Scientific, Rockford, IL), 근적외선 플루오르를 사용하여 60분 동안 상온에서 라벨링하였다. 745nm의 여기 파장 및 800nm의 방출 파장을 갖는 IVIS 캘리퍼 형광 이미징 시스템을 사용하여 DL755 라벨된 IgG, 세툭시맙, 및 HC-Y104E 돌연변이 항체의 이종이식 종양 또는 인간 또는 원숭이 피부 이식에의 결합을 평가하였다. 항체 투여 전, 및 항체 투여 후 1분, 2분, 10분, 60분, 120분, 240분, 360분, 1일째, 및 매일 이미지를 캡쳐하였다. 인간 피부 이식 모델에서도, 항체 투여 후 10일째에 이미지를 캡쳐하였다.
1. 세툭시맙 및 HC- Y104E의 피하 A431 종양에의 결합
a. 전체 동물 이미지화(whole animal imaging)
상기 실시예 10에 기재된 바와 같이 누드 마우스의 우측 옆구리에 A431 세포를 주사하여 A431 이종이식 종양을 생성하였다. 이식 후 21일째에, 마우스에 10 ㎍/마우스(0.5 mg/kg)의 인간 IgGDL755, HC-Y104E 변이체DL755, 또는 세툭시맙DL755를 투여하였다. 745nm의 여기 파장 및 800nm의 방출 파장을 갖는 IVIS 캘리퍼 형광 이미징 시스템을 사용하여, 그룹당 2 내지 4마리의 동물에서 DL755 라벨을 검출하였다. 항체 투여 전, 및 항체 투여 후 4시간째에, 그리고 7일 동안 매일 이미지를 캡쳐하였다. HC-Y104E 돌연변이 항체가 나타내는 결합을 세툭시맙DL755 및 음성 대조 항체인 인간 IgGDL755가 나타내는 결합과 비교하였다.
b. 전체 동물 이미지화 및 면역조직화학
상기 기재된 바와 같이, 누드 마우스의 우측 옆구리에 A431 세포를 주사하여 A431 종양을 생성하였다. A431 세포 이식 후 21일째에, 그룹당 적어도 2마리의 마우스에 1 mg/마우스로 IgGDL755, HC-Y104E 변이체DL755, 또는 세툭시맙DL755의 단일 정맥내 용량(dose)을 투여하였다. 항체 투여 후 48시간째에, 상기 기재된 바와 같이 IVIS 캘리퍼 형광 이미징 시스템을 사용하여 종양을 시각화하였다.
종양 이미지화에 이어서, Fc 검출에 의해, 인간 IgGDL755, HC-Y104E 변이체DL755, 및 세툭시맙DL755-주사된 마우스의 면역조직화학적 염색을 수행하여 항체 결합의 부위(localization)를 보다 자세히 평가하였다. 이미지화 후, 마우스를 관류시키고, 종양을 수확하여, 주사된 항체의 Fc 영역의 검출을 위한 HRP-컨주게이션된 염소 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 상기 종양의 냉동절편을 배양시킨 후, HRP 기질로서 DAB를 사용하고, 표준 면역조직화학적 염색 방법을 사용하여 시각화를 가능케하였다. 20× 대물렌즈가 장착된 인사이트 파이어와이어 디지털 카메라(Diagnostic Instruments, Michigan)와 연결된 니콘 이클립스 TE2000U 현미경을 사용하여 염색된 조직을 검사하였다.
2. 세툭시맙 및 HC- Y104E의 피하 PC-3 종양에의 결합
100 ㎕ 무혈청 Opti-MEM® 중의 2×106 PC-3 세포(Caliper Life Sciences)를 수컷 누드 마우스의 우측 경골주위(peritibial) 근육에 주사하여 PC-3 세포로부터 유래한 이종이식 종양을 생성하였다. 이식 후 35일째에, PC-3 종양을 지니는 마우스에 10 ㎍/마우스(0.5 mg/kg)의 인간 IgGDL755, HC-Y104E 변이체DL755, 또는 세툭시맙DL755(n=적어도 2/그룹)을 투여하고, 상기 기재된 바와 같이 IVIS 캘리퍼 형광 이미징 시스템을 사용하여 DL755 라벨을 검출하였다. 항체 투여 전 및 이후 5일 동안 매일 이미지를 캡쳐하였다. PC-3 이종이식 종양에 대해 인간 IgG(대조), HC-Y104D, 또는 세툭시맙(1 mg/마우스)의 정맥내 투여 후 48시간째에 상기 기재된 바와 같이 Fc 검출에 의해 평행한 면역조직화학적 연구를 또한 수행하였다.
3. 세툭시맙 및 HC- Y104E 항- EGFR 항체의 인간 피부 이식에의 결합
피부 독성을 평가하기 위한 모델로서, 마우스 내에 이식된 인간 및 원숭이 피부 이식에 대한 HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체의 결합을 생체 내(in vivo) 평가하였다. HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체, 및 각각 양성 및 음성 대조군으로서 세툭시맙 및 인간 IgG를 디라이트755 설피드릴-반응성 염료(DL755)(Thermo Scientific, Rockford, IL), 근적외선 플루오르를 사용하여 60분 동안 실온에서 라벨링하였다. 인간 부분층피부이식(split thickness skin graft, STSG)(인간 피부는 지역 외과 센터로부터 수령함) 및 인간 포피(foreskin) 이식(NDRI(1628 JFK Blvd, 8 Penn 센터, 필라델피아, PA)로부터 구매함)을 Ncr nu/nu 마우스의 좌측 등쪽 측면상에 외과적으로 이식하였다. 항-EGFR IHC 키트(Dako)에 의해, 이식 후 각각 70일 및 32일째에 인간 피부 이식에서 EGFR 발현을 확인하였다. 이식 후 32일 및 36일째에, 라벨링된 항체를 300 ㎍/마우스의 용량으로 인간 피부 이식을 가지는 마우스에 정맥내 투여하였다. 투여 후 1-10일의 각 날마다 DL755 신호의 이미지를 포착하였고, 육안 평가를 사용하여 순환하는 전신적 신호 및 피부 이식 부위로의 신호의 국소화(localization)를 평가 및 비교하였다.
다른 연구에서는, 이식 후 21일째에, 인간 포피 이식을 받은 마우스에 대해서, 10 ㎍/마우스(0.5 mg/kg)의 인간 IgGDL755, HC-Y104E 변이체DL755, 또는 세툭시맙DL755를 정맥내 투여 전 및 투여 후 4시간째에, 그리고 그 후 총 6일 동안 매일, 동일한 방법(n=3/그룹)을 사용하여, 항체 결합에 대해 분석하였다.
이식 후 28일째에, 표준 방법을 사용하여 면역조직화학에 의해 인간 포피 피부 이식에 대한 항체의 결합을 평가하였다. 인간 포피 이식을 받은 마우스에 1 mg/마우스로 IgG, Y104E 변이체, 또는 세툭시맙의 단일 정맥내 용량을 투여하였다. 항체 투여(dose) 후 48시간째에, 마우스를 관류시키고 냉동절편을 HRP-컨주게이션된 염소 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. HRP 기질로 DAB를 사용하였다. 40× 대물렌즈가 장착된 인사이트 파이어와이어 디지털 카메라 (Diagnostic Instruments, Michigan)와 연결된 니콘 이클립스 TE2000U 현미경을 사용하여 염색된 조직을 검사하였다.
4. 세툭시맙 및 HC- Y104E 항- EGFR 항체의 원숭이 피부 이식에의 결합
원숭이 STSG(부분층피부이식)(사이노몰구스 원숭이 피부는 BioTox로부터 수령함)를 7마리의 Ncr nu/nu 마우스의 좌측 등쪽 측면에 외과적으로 이식하였다. 항-EGFR IHC 키트(Dako)에 의해, 이식 후 각각 70일 및 32일째에 원숭이 피부 이식에서 EGFR 발현을 확인하였다. 이식 후 32일 및 36일째에, 상기 기재된 DL755-라벨링된 항체를 30 ㎍/마우스의 용량으로 원숭이 피부 이식 모델을 가지는 마우스에 정맥내 투여하였다. 항체 투여 후 1-9일의 각 날마다 상기 기재된 바와 같이 순환하는 형광 신호 및 국소화된 형광 신호를 검출하고 이미지를 캡쳐하였다.
5. A431 종양 대(vs.) 피부 결합
정량화된 형광 신호 강도를 사용하여, 본 실시예의 파트 1에서 결정된 종양 결합의 DL755 신호 강도를, 본 실시예의 파트 2에서 결정된 동일한 항체로부터의 인간 피부 이식 결합의 대응하는 DL755 신호 강도로 나누어줌으로써(n=적어도 2/그룹), 세툭시맙 및 HC-Y104E 돌연변이 항체의 종양:피부 결합의 비율을 결정하였다. 상기 비율을 대조군 IgG-투여된 동물에 대하여 계산된 종양:피부 결합 비율로 표준화하였다(normalize).
실시예 14
피부 이식 모델에서 피부 독성에 대한 세툭시맙의 효과
환자의 안검열(palpebral fissure)으로부터 공여자 피부를 수확하고, 부분층피부이식(STSG)을 4마리의 Ncr nu/nu 마우스에 이식하였다. 피부 이식 후 15일째에 시작하여, 두 마리의 마우스는 각각 4주 동안 매주 2회 2 mg HC-Y104E 항체 변이체 또는 세툭시맙(100 mg/kg, HED 60mg/kg)을 정맥내 투여하였다. 항체 투여 후 35일째에(즉, 항체의 마지막 투여 후 7일째에), 피부 이식의 상태, 예를 들어, 이식의 축소 및/또는 국소 자극(예를 들어, 홍조, 건조)를 육안으로 평가하였다. 인간 공여자 피부 이식 및 숙주 마우스의 인접 피부를 양자 모두 함유하는 공여자 피부 및 이식 피부의 샘플을 회수하여 항-EGFR IHC 키트(Dako)를 사용하여 면역조직화학에 의해 분석하였다. 인간 피부 이식 내 전-케라티노사이트(pre-keratinocyte) 및 기저 세포의 염색을 숙주 마우스에 고유한 인접 피부의 전-케라티노사이트 및 기저 세포의 염색과 비교하였다.
실시예 15
세툭시맙과 화학요법의 조합적 치료(Combinatorial Treatment)
화학요법제(chemotherapeutic reagent)인 시스플라틴과 조합한 세툭시맙의 효능을 A431 이종이식 종양 성장의 억제에 대하여 평가하였다.
상기 실시예 10에 기재된 바와 같이 수컷 누드 마우스에서 피하 A431 이종이식 종양을 수립하였다. 종양이 대략 100-200 mm3의 크기가 되었을 때, 표 36에 기재된 바와 같이 동물을 9개 연구 그룹(n=5/그룹)으로 무작위로 나누었고, 주당 2회 복강내 투여에 의해 세툭시맙을 투여하고 및/또는 주당 2회 정맥내 투여에 의해 시스플라틴 투여하였다. 구체적으로, 시험 물품은 0, 4, 7, 11, 및 14일에 투여하였다.
Figure pct00100
실시예 10에 기재된 바와 같이 디지털 캘리퍼스 및 계산법을 사용하여 1, 4, 7, 11 및 14일째에 종양 부피(mm3)로서 측정되는 종양 성장을 결정하였다. 처리군의 종양 성장 억제(TGI)를 다음 식을 사용하여 계산하였다: % TGI = [1 - (TB-TA)/(CB-CA)]×100; 여기서, TB는 14일째에 처리군에서의 평균 종양 부피(mm3)이고, TA는 첫 번째 처리 전날(-1일)에 처리군에서의 평균 종양 부피(mm3)이고, CB은 14일째에 비히클 단독 대조군에서의 평균 종양 부피이고, CA은 첫 번째 처리 전날(-1일)에 비히클 단독 대조군에서의 평균 종양 부피이다(예를 들어, Teicher BA 및 Andrews PA: Anticancer Drug Development, Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials and Approval, 2판. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 134, 2004 및 T. Friess 외, (2006) Anticancer Research 26:3505-3512 참조). 그 결과를 상기 표 36에 기재하였다.
1.5 mg/kg 시스플라틴은 그 자체로는 종양 성장을 유의하게 억제하지 못했으나, 4 mg/kg 세툭시맙(세툭시맙 단독 41.8% TGI 대 조합시 53.2% TGI) 및 12 mg/kg 세툭시맙(세툭시맙 단독 65.9% TGI 대 조합시 74.1% TGI)과 조합시 추가적인 종양 성장 억제에 기여하였다. 5 mg/kg 시스플라틴 단독 처리는 34.2% TGI를 나타내었고, 4 mg/kg 세툭시맙(세툭시맙 단독 41.8% TGI 대 조합시 50.2% TGI) 및 12 mg/kg 세툭시맙(세툭시맙 단독 65.9% TGI 대 조합시 85.2% TGI)과 조합시 TGI에 추가로 기여하였다. 최대 종양 성장 억제는 12 mg/kg 세툭시맙 + 5 mg/kg 시스플라틴에서 관찰되었다.
실시예 16
세툭시맙 대(vs.) HC- Y104E 변이체와 화학요법의 조합적 치료
화학요법제인 시스플라틴과 조합한 세툭시맙 대 HC-Y104E 항-EGFR 변이체의 효능을 A431 이종이식 종양 성장의 억제에 대하여 평가하였다.
상기 기재된 바와 같이 수컷 누드 마우스에서 피하 A431 이종이식 종양을 수립하였다. 종양이 대략 100 mm3의 크기가 되었을 때, 동물을 연구 그룹(n=5/그룹)으로 무작위로 나누었고, 하기 표 37에 나타난 바와 같이, 주당 2회, 복강내 투여에 의해 세툭시맙 또는 HC-Y104E-함유 변이체(Y104E)를 투여하고 및/또는 정맥내 투여에 의해 시스플라틴을 투여하였다. 구체적으로, 시험 물품은 0, 4, 7 및 11일에 투여하였다. 앞서 기재된 바와 같이 -1, 4, 7, 11 및 14일째에 종양 부피(mm3)를 결정하였다.
Figure pct00101
실시예 17
항- EGFR 항체-약물 컨주게이트(ADCs)의 종양 세포 및 케라티노사이트 세포 성장 억제에 대한 효과
비오틴화된 항체 및 스트렙트아비딘-사포린(Saporin)(Advanced Targeting Systems Bio, Cat# IT-27)을 혼합하거나 또는 표적 세포 안으로 약물 방출을 가능케하는 절단가능한 단백질 크로스-링커(어드밴스드 타겟팅 시스템스 바이오에 의해 제공되는 서비스)를 사용하는 것에 의해 세툭시맙 또는 HC-Y104E 변이체 항-EGFR 항체에 면역독소(immunotoxin) 사포린을 융합시킴으로써 항-EGFR 항체-약물 컨주게이트(ADCs)를 생성하였다.
비오틴-스트렙트아비딘 기반 ADC 형성을 위해, 4℃에서 30분 동안 최종 농도 5 mg/ml의 나트륨 과요오드산염(sodium periodate; NaI04)을 사용하여, 항체 당 사슬의 인접 하이드록실기를 알데하이드기로 변화시킴으로써 0.1 M 포스페이트 완충제, pH 7.2 중 1-2 mg/ml의 농도의 항체를 산화시켰다. 그 후, 산화된 항체를 0.1 M 포스페이트 완충제, pH 7.2로 투석하고, 투석된 항체를 부피 비율 9 대 1로 DMSO 중에서 제조된 50 mM 하이드라지드-비오틴과 혼합하여 반응 중의 5 mM 하이드라지드-비오틴을 수득하였다. 상기 혼합물을 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 항체의 알데하이드기와 하이드라지드기 사이에 하이드라존 결합을 형성하였다. 비오틴화된 항체를 1×PBS로 투석하고, 동일 몰 비율(molar ratio)의 스트렙트아비딘-사포린과 혼합하여 항체-사포린 복합체를 형성하였다. 그 후, 인간 종양 세포주, A431 및 MDA-MB-468, 및 인간 케라티노사이트 세포주, HEK-N의 세포 성장을 억제하는 ADC의 능력에 대해 시험하였다.
1. 사포린 ADC의 A431 세포 성장의 억제
10% 소태아 혈청(FBS; Mediatech)으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 A431 세포를 배양하였다. ADC 처리 전날, 투명 바닥 흰색 96-웰 플레이트 내 200 ㎕ 부피 중 1,000 세포/웰로 A431 세포를 시드하였다. 세포를 비처리 상태로 두거나 또는 1 ㎍/mL로부터 시작하여 증가하는 농도로 사포린 컨주게이션된 세툭시맙(Wt-Sap), 사포린 컨주게이션된 HC-Y104E 변이체(Y104E-Sap), 또는 사포린-컨주게이션된 인간 IgG로 처리하였다. 세포를 5일 동안 ADC 처리하였다. 제조사의 지침에 따라 세포 역가-글로 발광성 키트(Cell Titer-glo Luminescent kit, 프로메가)를 사용하여 5일째에 살아있는 세포를 측정하였다. 생존 세포의 백분율을 비처리 세포에 상대적으로 계산하였고, GraphPad Prism을 사용하여 EC50 값을 산출하였다.
2. 사포린 ADC의 신생아 케라티노사이트 ( HEK -N) 세포의 억제
성장 인자 보충된 에피라이프 배지(Epilife medium)(Gibco)에서 신생아 케라티노사이트(HEK-N) 세포를 배양하였다. 사포린 ADC 처리 전날, 투명 바닥 흰색 96-웰 플레이트 내 200 ㎕ 부피 중 1,000 세포/웰로 HEK-N 세포를 시드하였다. 세포를 비처리 상태로 두거나 또는 1 ㎍/mL의 농도로부터 시작하여 증가하는 농도로 사포린 컨주게이션된 세툭시맙(Wt-Sap), 사포린 컨주게이션된 HC-Y104E 변이체(Y104E-Sap), 또는 사포린-컨주게이션된 인간 IgG로 처리하였다. 세포를 5일 동안 ADC 처리하였다. 제조사의 지침에 따라 세포 역가-글로 발광성 키트(프로메가)를 사용하여 5일째에 살아있는 세포를 측정하였다. 생존 세포의 백분율을 비처리 세포에 상대적으로 계산하였고, GraphPad Prism을 사용하여 EC50 값을 산출하였다.
실시예 18
Y104D -DM1, Y104D - MMAE 및 Y104D - MMAF 항체-약물 컨주게이트(ADCs)의 생체 내 A431 피하 종양 성장에 대한 효과
EGFR + 종양의 모델인 A431 종양 이종이식 모델을 사용하여 HC-Y104D 변이체 항-EGFR 항체의 항체 약물 컨주게이트(ADCs)의 종양 성장 억제 활성을 평가하였다. 구체적으로, 세포독성 약물인 메이탄시노이드 DM1, 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE), 또는 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF)를 함유하는 HC-Y104D 변이체 항-EGFR 항체 컨주게이트를 생성하고 각각을 이 모델에서 평가하였다. DM1 및 MMAE는 10 pM 내지 1 nM의 비슷한 효능을 가지고, MMAF는 10 nM 내지 100 nM의 효능을 가진다("Second-Generation ADCs." Biological Drug Products: Development and Strategies. Ed. Wei Wang, Ed. Manmohan Singh. ISBN: 978-1-118-14889-1, 2013. Section 9.4.2.3).
1. 메이탄시노이드 DM1에 컨주게이션된 HC- Y104D 변이체 항- EGFR 항체 (Y104D-DM1)
a. Y104D - MCC -DM1( Y104D -DM1)의 생성
비-절단성 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC) 링커를 통해, HC-Y104D 항체를 메이탄시노이드 DM1에 컨주게이션하였다. Y104D-DM1 ADCs를 생성하기 위해, 컨주게이션 버퍼 1(50 mM 포타슘 포스페이트/50 mM 소디움 클로라이드, pH 6.5, 2 mM EDTA)로 미리-평형화시킨 PD-10 탈염(desalting) 컬럼(GE Health) 상에 실시예 2에서 기재된 바와 같이 생성된 Y104D 2.5 mL를 로딩하였다. 이어서 샘플을 0.5 mL 컨주게이션 버퍼 1로 처리하고, 탈염된 항체를 회수하였다. 항체의 농도를 측정하고 20 mg/mL로 조정하였다.
디메틸아세트아미드(DMA) 중의 10 mM SMCC를 항체 용액에 7:1 몰 비율로 첨가하여(10 mM SMCC 0.933 mL를 20 mg/mL 항체 용액 10 mL에 첨가) Y104D-MCC 컨주게이트를 먼저 생성하였다. 그 후, DMA를 상기 혼합물에 첨가하여 10% v/v DMA가 되게 하였다. 혼합물을 2시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. Y104D-MCC 컨주게이트를 미리-평형화된 PD-10 탈염 컬럼 상에 로딩하였다. 이어서 샘플을 0.5 mL 컨주게이션 버퍼 1로 처리하고, 탈염된 항체를 회수하였다. 용출물(eluate)(ε=1.45 mg-1cm-1, 또는 217500 M-1cm- 1)의 A280을 사용하여 컨주게이트의 농도를 측정하였다.
용액 중 유리 티올기의 환원을 결정하는 것에 의해, 간접적 측정으로 항체 당 SMCC 분자의 평균 수를 결정하였다. 5 ㎕ 버퍼 또는 Y104D-MCC를 마이크로원심분리기(microcentrifuge) 튜브 내 5 ㎕ 1 mM 시스테인에 첨가하고, 이어서 PBS(DMSO 스톡 중 0.1 M로부터 희석된) 중의 1 mM 엘만 시약(Ellman's reagent)(5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산) 또는 DTNB)을 처리하였다. 보텍싱(vortexing) 후, 혼합물을 5분 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 280 nm 및 412 nm에서 흡광도를 측정하고, A280 및 흡광계수 ε= 210,863 cm-1M- 1를 사용하여 농도를 계산하였다. 크로모포어(chromophore), 5-머캅토-2-니트로벤조산의 흡광계수(ε= 13,600 cm-1M- 1)를 사용하여 버퍼 단독 샘플 중의 시스테인 농도를 결정하였다. 링커 농도는 버퍼와 Y104D-MCC 샘플 간의 차이인 것으로 결정하였는데, 항체 당 대략 평균 4.5개의 SMCC 분자였다.
DMA 중의 10 mM DM1-SH 1.7 당량을 10 mg/mL 컨주게이트 버퍼 1로 희석된 Y104D-MCC에 혼합함으로써 Y104D-DM1으로 명명된 Y104D-MCC-DM1 컨주게이트를 생성하였다. DMA를 첨가하여 최종 DMA 농도가 10%v/v이 되게 하였고, 반응 혼합물을 상온(25 ℃)에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도 및 흡광계수 ε= 1.48 mg-1cm- 1를 사용하여 Y104D-MCC-DM1의 약물 항체 비율(DAR)을 계산하였다. 항체 당 DM1 분자의 평균 수는 4.6이었다.
각 컨주게이션 단계 후 SEC-HPLC에 의해 응집(aggregation)을 또한 모니터링하였다. 컨주게이션 전에, Y104D 항체는 약 1%의 고 분자량(MW) 단백질을 함유하였다. Y104D-MCC-DM1 컨주게이트는 전형적으로 약 1-15%의 고 분자량 단백질을 함유하였다. 최종 Y104D-DM1 컨주게이트는 전형적으로 약 1-15%의 고 분자량 단백질을 함유하였다.
b. Y104D -DM1의 종양 성장 억제 활성
RPMI-1640 배지 중에 현탁된 3.3×106 A431 표피모양(epidermoid) 암종 세포(ATCC CRL1555)를 0.1 mL 피하(SC) 주사로 수컷, 무흉선(athymic) NCr-nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 접종하였다. 종양이 ~100 mm3의 크기에 도달하였을 때, 동물을 5개의 연구 그룹으로 무작위로 나누었다: (1) 그룹 1 - 비히클(8.48mg/mL 소디움 클로라이드, 1.88 mg/mL 소디움 포스페이트 2염기성 7수화물, 0.42 mg/mL 멸균수 중 소디움 포스페이트 1염기성 1수화물)(n=8), (2) 그룹 2 - 컨주게이션되지 않은 Y104D를 0, 3, 7, 및 10일째에 복강내 주사에 의해 매주 2회 5 mg/kg 체중으로 투여(n=8), (3) 그룹 3 - Y104D-DM1을 0일째에 단일 정맥 투여에 의해 1.0 mg/kg 체중으로 투여(n=6), (4) 그룹 4 - Y104D-DM1을 0일째에 단일 정맥 투여에 의해 5.0 mg/kg 체중으로 투여(n=6), 또는 (5) 그룹 5 - Y104D-DM1을 0일째에 단일 정맥 투여에 의해 10.0 mg/kg 체중으로 투여(n=6). 0, 3, 7, 10 및 13일째에, 실시예 10에 기재된 바와 같이, 종양 성장을 측정하였다. 13일째의 측정에 기초하여, 종양 성장 억제(TGI)를 상기 기재한 바와 같이 계산하였다.
그 결과를 하기 표 38에 기재하였다. 결과는, 비히클 단독과 비교하여 Y104D 또는 Y104D-DM1로 처리된 모든 동물에서 종양 성장의 속도가 감소되었다는 것을 보여준다. 매주 2회 투여된 Y104D 단독 처리는 13일째에 26.5% TGI를 나타내었다. 단일 정맥 주사에 단 1회 투여된 Y104D-DM1 컨주게이트는 13일째에 1.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 및 10.0 mg/kg에 대하여 각각 32.6%, 10.0% 및 20.4%의 TGI를 나타내었다. 던넷(Dunnet) 포스트 테스트를 이용한 2way-ANOVA에 기초하여, Y104D-DM1 처리 그룹의 관찰된 TGI는 서로 유의적으로 다르지 않았다.
Figure pct00102
2. 모노메틸 오리스타틴 E( MMAE )에 컨주게이션된 HC- Y104D 변이체 항- EGFR 항체(Y104D-MMAE)
a. Y104D - Mc - VcPAB - MMAE(Y104D-MMAE)의 생성
실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 Y104D 항체를 Francisco et al. Blood 102:1458-1465 (2003)에 기재된 바와 같이 절단가능한 링커인 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질 링커(말레이미도카프로일-vcPAB-MMAE)를 통해 MMAE에 컨주게이션하였다. 항체 내의 내생적 디설파이드를 잠시 환원시키고 말레이미도카프로일 모이어티에 컨주게이션시켜 Y104D-MMAE으로 명명된 항체-약물 컨주게이트를 생성하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 평가한바 최종 컨주게이션된 생성물은 대략 4의 약물:항체(DAR) 비율을 가졌다. 전형적으로, 고 분자량 물질은 총 준비물(prep)의 대략 1-2%에 해당하였다. 한편, 컨주게이션되지 않은 단백질은 무손상(intact) IgG의 대략 1-2%에 해당하였다.
b. Y104D - MMAE의 종양 성장 억제 활성
A431 이종이식 종양을 지니는 마우스를 상기 기재된 바와 같이 생성하되, 다만 처리 전에 종양이 ~350　mm3의 크기에 도달하도록 두었다. 종양이 ~350　mm3의 크기에 도달하였을 때, 동물의 4개의 연구 그룹으로 무작위로 나누었다: (1) 그룹 1 - 비히클(8.48mg/mL 소디움 클로라이드, 1.88 mg/mL 소디움 포스페이트 2염기성 7수화물, 0.42 mg/mL 멸균수 중 소디움 포스페이트 1염기성 1수화물)(n=6), (2) 그룹 2 - Y104D-MMAE를 1.5 mg/kg 체중으로 투여(n=6), (3) 그룹 3 - Y104D-MMAE를 5 mg/kg 체중으로 투여(n=6), 및 (4) 그룹 4 - Y104D-MMAE를 15 mg/kg 체중으로 투여(n=6). 종양의 시작 크기가 증대되었기 때문에, 모든 처리는 0, 3, 7, 및 10일째에 격주로, 정맥 주사에 의해 투여하였다. -1, 2, 6, 10, 14 및 17일째에 상기 기재된 바와 같이 종양 성장을 측정하였다.
그 결과를 하기 표 39에 기재하였다. 비히클만을 투여받은 마우스는 연구 과정 동안 점진적인 종양 성장을 나타내었다. 1.5 mg/kg Y104D-MMAE를 투여받은 마우스는 비히클 대조와 비교하여 종양 성장의 감소된 속도를 나타내었다. Y104D-MMAE의 더 높은 투여량에서, 비히클 대조와 비교하여 상당히 감소된 종양 성장이 나타났다. 예를 들어, 5 또는 15 mg/kg Y104D-MMAE를 투여받은 마우스의 종양은 종양 크기가 기저(baseline) 부피로 퇴행하는 종양 성장 감소를 나타내었다. 17일째에 종양 성장 억제(TGI)는, 비히클에 대하여 상대적으로, 1.5 mg/kg Y104D-MMAE의 경우 34.2%, 5 mg/kg Y104D-MMAE의 경우 96.3%; 및 15 mg/kg Y104D-MMAE의 경우 100.9%였다. 이러한 결과는, DM1 및 MMAE 탄두의 유사한 효능에도 불구하고, Y104D-MMAE 컨주게이트에 의해 매개되는 종양 성장 억제가 Y104D-DM1 컨주게이트의 그것보다 실질적으로 크다는 것을 나타낸다(상기 참조).
Figure pct00103
3. 모노메틸 오리스타틴 F( MMAF )에 컨주게이션된 HC- Y104D 변이체 항- EGFR 항체(Y104D-MMAF)
a. Y104D - Mc - MMAF(Y104D-MMAF)의 생성
실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 Y104D 항체를 상기 파트 2에 기재된 바와 실질적으로 동일하게 MMAF에 컨주게이션하되, 다만 비-절단성 링커인 말레이미도카프로일에 컨주게이션된 MMAF(즉, MC-MMAF)를 사용하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC-HPLC)에 의해 평가한바 최종 컨주게이션된 생성물은 대략 4의 약물:항체(DAR) 비율을 가졌다. 전형적으로, 고 분자량 물질은 총 준비물(prep)의 대략 6.38%에 해당하였다. 한편, 컨주게이션되지 않은 단백질은 무손상(intact) IgG의 대략 4.58%에 해당하였다.
b. Y104D - MMAF의 종양 성장 억제 활성
A431 이종이식 종양을 지니는 마우스를 상기 파트 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. 종양이 ~350　mm3의 크기에 도달하였을 때, 동물의 4개의 연구 그룹으로 무작위로 나누었다: (1) 그룹 1 - 비히클(8.48mg/mL 소디움 클로라이드, 1.88 mg/mL 소디움 포스페이트 2염기성 7수화물, 0.42 mg/mL 멸균수 중 소디움 포스페이트 1염기성 1수화물)(n=6), (2) 그룹 2 - Y104D-MMAF를 1.5 mg/kg 체중으로 투여(n=6), (3) 그룹 3 - Y104D-MMAF를 5 mg/kg 체중으로 투여(n=6), 및 (4) 그룹 4 - Y104D-MMAF를 15 mg/kg 체중으로 투여(n=6). 종양의 시작 크기가 증대되었기 때문에, 모든 처리는 0, 3, 7, 11, 및 16일째에 격주로, 정맥 주사에 의해 투여하였다. -1, 2, 6, 10, 14, 및 17일째에 상기 기재된 바와 같이 종양 성장을 측정하였다.
그 결과를 하기 표 40에 기재하였다. 비히클만을 투여받은 마우스는 연구 과정 동안 점진적인 종양 성장을 나타내었다. 1.5 mg/kg Y104D-MMAF를 투여받은 마우스는 비히클 대조와 비교하여 종양 성장의 감소된 속도를 나타내었다. Y104D-MMAF의 더 높은 투여량에서, 비히클 대조와 비교하여 상당히 감소된 종양 성장이 나타났다. 예를 들어, 5 또는 15 mg/kg Y104D-MMAF를 투여받은 마우스의 종양은 종양 성장 감소를 나타내었고, 이어서 종양 크기가 대략 기저 부피로 퇴행하였다.
이러한 결과는, MMAE 및 DM1 탄두와 비교하여, MMAF의 감소된 효능에도 불구하고, Y104D-MMAF 컨주게이트에 의해 매개되는 종양 성장 억제가 Y104D-MMAE에서 관찰된 억제와 유사하고, Y104D-DM1 컨주게이트에서 관찰된 억제보다 실질적으로 크다는 것을 나타낸다(상기 참조).
Figure pct00104
실시예 19
Y104D - MMAF 항체-약물 컨주게이트(ADCs)의 생체 내( in vivo ) KRAS 돌연변이 된, EGFR+ MDA MB 231 삼중 음성 유방암(TNBC) 종양의 종양 성장에 대한 효과
KRAS 돌연변이된, EGFR+ 종양의 모델인 MDA-MB-231M 인간 유방 종양 이종이식 모델을 사용하여 Y104D-MMAF 항체 약물 컨주게이트(ADCs)의 종양 성장 억제 활성을 평가하였다. 실시예 18에 기재된 바와 같이 Y104D-MMAF ADCs를 생성하였다. Y104D-MMAF의 종양 성장 억제 활성을 컨주게이션되지 않은 세툭시맙과 비교하였다.
MDA-MB-231-luc-D2H2LN 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포(Caliper Life Sciences)를 80% 내지 90% 컨플루언시의 서브-컨플루언트 성장 단계까지 표준 조건하에서 성장시켰다. 세포를 수확하고, 멸균 HBSS로 2회 세척하고, 계수하고, HBSS를 사용하여 5.0×107 세포/mL로 희석하였다. 세포 현탁액의 0.1 mL(5.0×106 세포)를 4- 내지 6-주령, 암컷 무흉선 NCr-nu/nu 마우스의 유방 지방 패드(mammary fat pad)에 주입하였다. 종양이 ~450　mm3의 크기에 도달하였을 때, 동물을 다음과 같은 3개의 연구 그룹으로 무작위로 나누었다: HBSS(비히클 대조); 30　mg/kg 세툭시맙 대조; 및 30 mg/kg huY104D-MMAF. 0, 3, 7, 10, 14, 및 17일째에 처리 물품을 정맥 주사로 마우스에 투여하였다. 처리한 날에 상기 기재된 바와 같이 종양 성장을 측정하였다.
그 결과를 표 41에 나타내었다. 비히클만을 투여받은 마우스는 연구 과정 동안 점진적인 종양 성장을 나타내었다. 세툭시맙 처리는 비히클-처리 대조 동물과 비교하여 종양 성장에 아무런 효과가 없었는데, 이는 항체가 이 모델에서 종양 성장 억제를 나타낼만큼 충분하지 않았다는 것을 의미한다. 대조적으로, Y104D-MMAF를 투여받은 마우스는 비히클 대조와 비교하여 연구 과정 동안 실질적으로 감소된 종양 성장을 나타내었으며, 모든 테스트 시점에서 대략 기저 레벨의 일관된(sustained) 종양 부피를 나타내었다.
Figure pct00105
실시예 20
인간화된 Y104D - MMAE 및 Y104E - MMAE 항체-약물 컨주게이트(ADCs)의 생체 내( in vivo ) KRAS 돌연변이된, EGFR+ 종양의 종양 성장에 대한 효과
양자 모두 KRAS 돌연변이된, EGFR+ 종양의 모델인, HT29 종양 이종이식 모델 및 MDA-MB-231M 인간 유방 종양 이종이식 모델을 사용하여 변이체 Y104D 또는 Y104E 항-EGFR 항체의 항체 약물 컨주게이트(ADCs)의 종양 성장 억제 활성을 평가하였다. 실시예 4.3에 기재된 바와 같이 인간화된 Y104D 및 인간화된 Y104E 항체를 제조하고, 실시예 18에 기재된 바와 같이 MMAE에 컨주게이션시켜 huY104D-MMAE 및 huY104E-MMAE로 명명된 ADCs를 생성하였다. 각 ADC의 종양 성장 억제 활성을 실시예 18에서 생성된 키메릭 Y104D-MMAE 컨주게이트와 비교하였다.
1. HT29 종양 이종이식 모델
HT29 종양 이종이식을 생성하기 위하여, HBSS 중에 현탁된 5.0×106 HT29 대장암 암종 세포(ATCC HTB-38)를 0.1 mL 피하(SC) 주사로 수컷, 4- 내지 6-주령 무흉선 NCr-nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 접종하였다. 종양이 ~300　mm3의 크기에 도달하였을 때, 동물을 다음과 같은 10개의 연구 그룹으로 무작위로 나누었다: (1) HBSS(비히클 대조); 10　mg/kg 키메릭 Y104D-MMAE; 또는 3, 6, 10, 또는 30 mg/kg huY104D-MMAE; 또는 3, 6, 10, 또는 30 mg/kg huY104E-MMAE. 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 및 25일째에 각 시험 물품을 주당 2회 정맥 주사로 마우스에 투여하였다. 처리한 날에 상기 기재된 바와 같이 종양 성장을 측정하였다. 종양 부피가 약 2000 mm3까지 증가하거나 이를 초과할 때 동물을 희생시켰다.
그 결과를 하기 표 42(huY104D-MMAE) 및 표 43(huY104E-MMAE)에 나타내었다. 결과를 기재한 각 표에 있어서, 각 시점에 비히클 대조 또는 키메릭 Y104D-MMAE 투여 후 종양 부피를 또한 표에 나타내었다. 비히클만을 투여받은 마우스는 연구 과정 동안 점진적인 종양 성장을 나타내었다. 종양 성장의 규모 때문에, 비히클 대조를 투여받은 마우스는 14일 후에 희생시켰다.
Figure pct00106
Figure pct00107
표 42 및 표 43의 결과는, 10 mg/kg Y104D-MMAE를 마우스에 투여한 경우 비히클 대조와 비교하여 종양 성장을 억제하였고 11일째에 기저 종양 부피 이하의 종양 퇴행을 나타냈으며 이는 연구 기간 동안 지속되었음을 보여준다. 상기 결과는 ADC 컨주게이트의 인간화 형태인 huY104D-MMAE 또는 huY104E-MMAE를 투여받은 마우스 역시 종양 퇴행과 함께 강력한 항-종양 반응을 나타내었음을 또한 보여준다.
예를 들어, 표 42에 나타난 바와 같이, huY104D-MMAE를 투여받은 마우스는 용량-의존적 종양 성장 억제를 나타내었는데, 종양 억제 활성의 정도가 10 mg/kg의 등가 용량에서 비-인간화 키메릭 Y104D-MMAE의 종양 억제 활성 보다는 약간 낮았으나, 30 mg/kg 용량에서는 실질적으로 동일하거나 더 높았다. 예를 들어, 6 또는 10 mg/kg의 용량에서, huY104D-MMAE로 처리된 마우스는 비히클 대조로 처리된 마우스와 비교하여 감소된 종양 성장을 나타내었고, 대략 기저 종양 부피로의 종양 퇴행을 나타내었다. 30 mg/kg의 더 높은 용량에서, huY104D-MMAE의 존재는 종양 성장을 억제하였고 기저 레벨 미만으로의 종양 퇴행을 나타내었으며, 25일째에 종양 부피가 출발(기저) 종양 부피의 반보다 더 작았다.
huY104D-MMAE의 결과와 유사하게, 표 43의 결과는 huY104E-MMAE를 투여받은 마우스 역시 용량-의존적 종양 억제를 나타내었다는 것을 보여준다. 이 실험에서, huY104E-MMAE의 항-종양 반응의 정도는 모든 테스트 용량에서 비-인간화 키메릭 Y104D-MMAE의 항-종양 반응보다 역시 약간 낮았다. 예를 들어, 10 또는 30 mg/kg를 투여받은 마우스는 비히클-처리한 동물과 비교하여 감소된 종양 성장을 나타내었으며, 약 기저에 이르는 종양 퇴행을 나타내었다.
2. MDA MB 231 삼중 음성 유방암( TNBC )
상기 실시예 19에 기재된 MDA MB 231M 이종이식 모델을 사용하여 생성한 유방암 이종이식 모델에서 상기 기재된 것과 유사한 연구를 또한 수행하였다. 종양이 ~400　mm3의 크기에 도달하였을 때, 동물을 다음과 같이 각 그룹당 6마리의 마우스를 포함하는 10개의 연구 그룹으로 무작위로 나누었다: HBSS(비히클 대조); 10　mg/kg 키메릭 Y104D-MMAE 대조; 3, 6, 10, 또는 30 mg/kg huY104D-MMAE; 또는 3, 6, 10, 또는 30 mg/kg huY104E-MMAE. 0, 3, 6, 9, 13, 16, 20, 및 23일째에 처리 물품을 정맥 주사로 마우스에 투여하였다. 처리한 날에 상기 기재된 바와 같이 종양 성장을 측정하였다.
그 결과를 표 44(huY104D-MMAE) 및 표 45(huY104E-MMAE)에 기재하였다. 결과를 기재한 각 표에 있어서, 각 시점에 비히클 대조 또는 키메릭 YY104D-MMAE 투여 후 종양 부피를 또한 표에 나타내었다. 비히클만을 투여받은 마우스는 연구 과정 동안 점진적인 종양 성장을 나타내었다. 종양 성장의 규모 때문에, 비히클 대조를 투여받은 마우스는 13일 후에 희생시켰다.
Figure pct00108
Figure pct00109
표 44 및 표 45에 나타난 바와 같이, 그 결과는, 10 mg/kg Y104D-MMAE를 마우스에 투여한 경우 비히클 대조와 비교하여 종양 성장을 억제하였고 9일째에 기저 종양 부피 이하의 종양 퇴행을 나타냈으며 이는 연구 기간 동안 지속되었음을 보여준다.
HT29 이종이식 종양 모델에서의 위 결과와 유사하게, 상기 결과는 ADC 컨주게이트의 인간화 형태인 huY104D-MMAE 또는 huY104E-MMAE를 투여받은 마우스 역시 종양 퇴행과 함께 강력한 항-종양 반응을 나타내었음을 또한 보여준다. 테스트한 huY104D-MMAE 및 huY104E-MMAE의 각각의 보다 낮은 용량인 3 mg/kg 및 6 mg/kg에서, 비히클 대조와 비교하여 종양 성장의 감소가 관찰되었으나, 종양 퇴행으로의 진전은 없었다. 대조적으로, 키메릭 Y104D-MMAE와 마찬가지로, huY104D-MMAE 및 huY104E-MMAE 양자 모두는 10 mg/kg 및 30 mg/kg의 테스트 용량의 투여시에는 종양 퇴행을 나타내었다.
예를 들어, 표 44에 나타난 바와 같이, 10 또는 30 mg/kg huY104D-MMAE로 처리된 마우스는 대조와 비교하여 감소된 종양 성장을 나타내었고 연구 6일째에 시작한 종양 퇴행이 지속되었다. 연구 종료시에, huY104D-MMAE로 처리한 마우스 내 잔존하는 종양 부피는 초기 종양 부피의 약 14%(10 mg/kg) 또는 7%(30 mg/kg)에 불과하였다(표 44 참조). 표 45에 나타난 바와 같이 huY104E-MMAE를 10 mg/kg 및 30 mg/kg 용량으로 투여한 마우스에서 유사한 결과가 관찰되었다. 연구 종료시에, huY104E-MMAE로 처리한 마우스 내 잔존하는 종양 부피는 초기 종양 부피의 약 50%(10 mg/kg) 또는 13%(30 mg/kg)였다(표 45 참조)
3. 결론
이러한 결과는 Y104D-MMAE 컨주게이트, 및 인간화 형태인 huY104D-MMAE 및 huY104E-MMAE가 KRAS 돌연변이된, EGFR+ 종양 모델에서 강력한 항-종양 반응을 나타낸다는 것을 확인해주는 것이다. 테스트한 항체의 각각의 항-종양 반응은 종양 성장 퇴행을 달성한다.
실시예 21
세툭시맙 - MMAE 또는 Y104D - MMAE 항체-약물 컨주게이트(ADCs)의 존재하에서 종양 세포 대(Versus) 케라티노사이트의 pH-의존적 성장의 평가
EGFR-발현 세포의 성장에 대한 항-EGFR ADC 컨주게이트의 pH-의존적 효과를 평가하였다. 구체적으로, 각각 세툭시맙-MMAE 또는 Y104D-MMAE의 존재하에서, pH 6.8에서 A431 종양 세포의 세포 성장 또는 pH 7.4에서 케라티노사이트 세포의 세포 성장을 평가하고 비교하였다. Y104D-MMAE는 실시예 18에 기재된 바와 같이 생성하였다. 세툭시맙-MMAE는 유사한 절차를 사용하여 생성하였다.
1. 방법
처리 전날, 적절한 pH로 조정된 100 ㎕ 완전 배지 중 약 2,000 세포/웰로 96 웰 플레이트(BD Falcon #35-3072)의 웰에 A431 세포(ATCC CRL 1555) 또는 인간 신생아 케라티노사이트 세포주(Invitrogen C-001-5C)를 플레이팅하였다. 케라티노사이트는 pH 7.4에서 EpiLife 한정 성장 보충물(Life Technologies)로 보충된 EpiLife에서 테스트하였고, A431 세포는 MES로 완충된 RPMI 1640 + 10% FBS (pH 6.8)에서 테스트하였다. MES-완충된 RPMI 1640 + 10% FBS의 pH는 처음에는 pH 7.4로 설정하였고 CO2 인큐베이터에서 2시간 후에 배지는 pH 6.8에 도달하였다. 따라서, A431 세포의 세포 성장은 pH 6.8에서 평가하였고, 케라티노사이트 세포의 세포 성장은 pH 7.4에서 평가하였다. 세포를 각각의 ADCs의 1:3 순차적 희석물로 비처리 또는 처리하였고 이는 A431 세포에 대하여 0.9 ㎍/mL 내지 0.00001 ㎍/mL의 농도를 달성하기 위해 첨가하였다. 케라티노사이트에서는 90 ㎍/mL 내지 0.001 ㎍/mL의 농도에서 ADCs의 각각을 테스트하였다. 각 조건을 3개의 복제(replicate) 웰에서 아세이하였다(즉, 각 조건 당 n=3). 세포를 5% CO2 인큐베이터의 가습 분위기에서 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 제조사의 지침에 따라 CellTiter-Glo® 발광성 세포 생육도 아세이(Promega Cat# G-7571)를 사용하여 세포 성장을 측정하였다. 비처리 세포에 상대적인 생존 세포의 감소의 백분율(퍼센트)로 퍼센트 세포 성장 억제(CGI)를 결정하였다. 비처리 대조 세포의 성장과 비교하여 세포 성장을 50% 억제하는데 필요한 약물 농도를 IC50 값으로 정의하였다.
2. 결과
그 결과는, 세툭시맙-MMAE 및 Y104D-MMAE가 A431 세포의 세포 성장을 억제하였고, 이것이 테스트 약물 간에 거의 동일하였음을 보여준다. 농도를 x-축(LOG (mg/mL)으로 % 세포 성장 억제를 y-축으로 플롯하였을 때, 세툭시맙-MMAE 및 Y104D-MMAE의 처리는 서로 겹치는, S자형 형태의, 농도-의존적 세포 성장 억제를 나타내었다. 약 0.001 ㎍/mL에서 ADCs 양자 모두에서 약 50% CGI가 관찰되었고, 테스트한 보다 높은 농도에서 ADCs 양자 모두에서 약 80%에 이르는 CGI가 관찰되었다.
대조적으로, Y104D-MMAE는 세툭시맙-MMAE와 비교하여 보다 낮은 케라티노사이트 성장 억제를 나타내었다. 농도를 x-축(LOG (㎍/mL)으로 % 세포 성장 억제를 y-축으로 플롯하였을 때, 세툭시맙-MMAE 및 Y104D-MMAE의 처리는 S자형 형태의, 농도-의존적 세포 성장 억제를 나타내었으나, Y104D-MMAE 처리에 대한 커브가 이동하였고 이는 유의적으로 감소된 성장 억제를 의미하는 것이다. 예를 들어, 세툭시맙-MMAE는 약 0.1 ㎍/mL의 농도에서 약 50% CGI를 나타낸 반면, 50% CGI를 달성하기 위해 1 ㎍/mL Y104D-MMAE만 필요하였다. 최대 용량에서, 세툭시맙은 약 80% CGI를 달성하였고, Y104D-MMAE는 약 70%의 CGI를 나타내었다.
따라서, 이러한 결과는 Y104D 항-EGFR의 MMAE ADC 컨주게이트가 Y104D 항-EGFR의 pH-의존적 활성을 보유하여 Y104D-MMAE가 A431 종양 세포보다 피부 케라티노사이트에서 낮은 세포 성장 억제 활성을 나타냄을 확인해 주는 것이다.
실시예 22
키메릭 Y104D - MMAE 또는 인간화 Y104 변이체 항체-약물 컨주게이트(ADCs)의 존재하에서 종양 세포 대(Versus) 케라티노사이트의 pH-의존적 성장의 평가
인간화 항-EGFR 변이체 huY104D-MMAE 및 huY104E-MMAE의 ADC 컨주게이트의 활성을 확인하기 위하여, 실시예 20에 기재된 바와 실질적으로 동일한 과정을 사용하여 EGFR-발현 세포의 성장에 대한 각각의 pH-의존적 효과를 평가하고 키메릭 Y104D-MMAE과 비교하였다. 구체적으로, pH 6.8에서 HT29 종양 세포(ATCC HTB-38), pH 6.8에서 MDA-MB-231 종양 세포(ATCC HTB-26) 또는 pH 7.4에서 케라티노사이트 세포의 세포 성장을 각각 Y104D-MMAE, huY104D-MMAE 또는 huY104E-MMAE의 존재하에서 평가하였다. 테스트한 컨주게이트의 각각은 실시예 18에 기재된 바와 같은 과정을 사용하여 생성하였다. 한편, 케라티노사이트의 세포 성장을 평가하는 연구를 위해, 비(non) 애드세트리스(Adcetris){브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 비-표적 항체 컨주게이션된 MMAE; 상업 약국으로부터 입수함}를 세포 성장 억제의 음성 대조로 또한 테스트하였다.
1. 방법
실시예 21에 기재된 과정과 실질적으로 동일한 과정을 사용하여 세포 성장 아세이를 수행하되, 다만 ADCs를 1:3으로 순차적으로 희석하여 200 내지 0.03 nM 농도가 되게 하였다. HT29 세포 및 MDA-MB-231 세포는 MES-완충된 RPMI+10% FBS(pH 6.8)의 존재하에서 배양 및 아세이한 반면, 케라티노사이트는 Epilife(pH 7.4)에서 배양 및 아세이하였다.
2. 결과
키메릭 Y104D-MMAE, huY104D-MMAE 또는 huY104E-MMAE의 각각으로 처리한 결과 HT29 및 MDA-MB-231 세포 양자 모두에 대하여 유사한 수준의 용량-의존적 세포 성장 억제를 나타내었다. HT29 세포의 경우, ADC로 처리한 결과 대략 22 nM의 농도에서 약 50% 세포 성장 억제를 나타내었고 테스트한 최대 농도에서 약 80% 세포 성장 억제를 나타내었다. MDA-MB-231 세포의 경우, ADC로 처리한 결과 테스트한 최대 용량에서 약 35-40%에 이르는 세포 성장 억제를 나타내었다.
키메릭 Y104D-MMAE는 케라티노사이트의 세포 성장 억제를 나타내었는데, 3.7 nM 키메릭 Y104D-MMAE으로 50% 성장 억제를 달성하였다. 대조적으로, 인간화 변이체 ADCs, huY104D-MMAE 및 huY104E-MMAE의 각각은 키메릭 Y104D-MMAE와 비교하여 감소된 케라티노사이트 성장 억제를 나타내었다. 예를 들어, huY104D-MMAE의 세포 성장 억제의 IC50은 약 17 nM이었고, huY104E-MMAE의 세포 성장 억제의 IC50은 약 5.4 nM 이었다. 이에 비해서, 비-표적 항체 대조인 애드세트리스(Adcetris)의 세포 성장 억제의 IC50은 50 nM 이었다.
따라서, 이러한 결과는 Y104D- 및 Y104E-항-EGFR 변이체의 인간화 형태의 ADC 컨주게이트가 키메릭 Y104D-MMAE 컨주게이트에 비하여 더 높은 pH-의존적 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다. 예를 들어, 이들 각각은 pH 6.8에서 종양 세포 성장을 억제함에 있어서 키메릭 Y104D-MMAE 만큼 효과적인 반면, 이들 각각은 키메릭 Y104D-MMAE와 비교하여 pH 7.4에서는 비-종양 케라티노사이트에 대해 감소된 종양 성장 억제를 나타낸다.
실시예 23
Y104E 항체 약물 컨주게이트 ( ADC ) 제형의 안정성
실시예 20에 기재된 바와 같이 생성한 HuY104E-MMAE ADCs를 표 46에 기재된 바와 같이 상이한 안정화제와 함께 조성물로 제형화하였다. 각 항체 제형을, 3.75 mg/ml의 단백질 농도로, 1.5 mL 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 넣고 2회의 동결-해동 사이클을 수행하여, 튜브를 30분 동안 드라이아이스/에탄올 중에서 동결시키고 이어서 10분 동안 받침대에서 실온에서 해동시켰다. 제형화에 이어서 각 동결-해동 사이클 후, 샘플에 대해 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 함량을, 340　nm에서 흡광도를 측정하여 탁도(응집)를, 그리고 580　nm에서 투과율(T%)을 측정하여 단백광(opalescence)(응집)을 분석하여 제형 안정성을 평가하였다.
초기 값과 비교하여 각 해동 사이클 후 백분율 증가로 표현되는 결과를 하기 표 46에 나타내었다. 하기 결과는 모든 테스트된 안정화제가 PBS 단독보다 더 안정한 제형을 나타낸다는 것을 나타낸다. 특히, 하기 결과는 0.02% 트윈 80 또는 280 mM 트레할로스 안정화제를 포함하는 PBS 제형이 다른 안정화제를 포함하는 제형보다 더 안정하다는 것을 나타낸다.
Figure pct00110
변형이 통상의 기술자에게 명백할 것이기 때문에, 본 발명은 첨부되는 청구항의 범위에 의해서만 한정되는 것으로 의도된다.
　
SEQUENCE LISTING <110> Halozyme, Inc. et al. <120> MODIFIED ANTI-EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 33320.03118.US01/3118 <140> Not Yet Assigned <141> Herewith <150> US 61/960,253 <151> 2013-09-12 <160> 394 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cetuximab A119 R216 heavy chain <220> <221> DOMAIN <222> (1)...(119) <223> variable domain <220> <221> DOMAIN <222> (120)...(217) <223> CH1 <220> <221> DOMAIN <222> (218)...(232) <223> hinge region <220> <221> DOMAIN <222> (233)...(342) <223> CH2 <220> <221> DOMAIN <222> (343)...(449) <223> CH3 <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser 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variable domain <220> <221> DOMAIN <222> (120)...(217) <223> CH1 <220> <221> DOMAIN <222> (218)...(232) <223> hinge region <220> <221> DOMAIN <222> (233)...(342) <223> CH2 <220> <221> DOMAIN <222> (343)...(449) <223> CH3 <400> 141 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Glu Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu 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ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtcagcaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 215 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h2 heavy chain amino acid S119 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acacctttca catccagact caccatctcc aaggacacct ccaaaaacca ggtggtcctt 240 acaatgacca acatggaccc tgtggacaca gccacgtatt actgtgccag agccctcacc 300 tactatgatg angagtttgc ttactggggc cctggaacgc tggtcaccgt cagcgca 357 <210> 231 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h4, 8, 12, 16 heavy chain variable domain amino acid A119 <400> 231 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Phe Ser Leu Phe Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Glu Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 232 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h5, 9, 13, 17 heavy chain 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tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtcagcaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 233 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h5, 9, 13, 17 heavy chain amino acid S119 <220> <221> DOMAIN <222> (1)...(119) <223> variable domain <220> <221> DOMAIN <222> (120)...(217) <223> CH1 <220> <221> DOMAIN <222> 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caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgccag agccctcacc 300 tactatgatg angagtttgc ttactggggc cctggaacgc tggtcaccgt cagcgca 357 <210> 237 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h5, 9, 13, 17 heavy chain variable domain amino acid A119 <400> 237 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Leu Phe Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Glu Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 238 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h6 heavy chain nucleic acid S119 <220> <221> 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gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtcagcaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 239 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h6 heavy chain amino acid S119 <220> <221> DOMAIN <222> (1)...(119) <223> variable domain <220> <221> DOMAIN <222> (120)...(217) <223> CH1 <220> <221> DOMAIN <222> (218)...(232) <223> hinge region <220> <221> DOMAIN 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agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgccag agccctcacc 300 tactatgatg angagtttgc ttactggggc cctggaacgc tggtcaccgt cagcgca 357 <210> 243 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h6 heavy chain variable domain amino acid A119 <400> 243 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Leu Phe Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Glu Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 244 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h10, 14, 18 heavy chain nucleic acid S119 <220> <221> variation <222> 312 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tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtcagcaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 245 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h10, 14, 18 heavy chain amino acid S119 <220> <221> DOMAIN <222> (1)...(119) <223> variable domain <220> <221> DOMAIN <222> (120)...(217) <223> CH1 <220> <221> DOMAIN <222> (218)...(232) <223> hinge region <220> <221> DOMAIN <222> 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cgaggacacg gccgtgtatt actgtgccag agccctcacc 300 tactatgatg angagtttgc ttactggggc cctggaacgc tggtcaccgt cagcgca 357 <210> 249 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h10, 14, 18 heavy chain variable domain amino acid A119 <400> 249 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Leu Phe Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Glu Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 250 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h1, 2 light chain nucleic acid Q100 VEIK <220> <221> V_region <222> (1)...(321) <220> <221> C_region <222> (322)...(642) 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light chain variable domain nucleic acid Q100 LELK <400> 262 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gggccagtca gagtattggc acaaacatac actggtacct gcagaagcca 120 gggcagtctc cacagctcct gatctattat gcttctgagt ctatctctgg gatcccagac 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 240 gaagattttg cagtgtatta ctgtcaacaa aataataact ggccaaccac gttcggccaa 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 263 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h3, 4 light chain variable domain amino acid Q100 LELK <400> 263 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp 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tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 279 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FEP-h9, 10, 11, 12, 20 light chain amino acid Q100 VEIK <220> <221> DOMAIN <222> (1)...(107) <223> variable domain <220> <221> DOMAIN <222> (108)...(214) <223> constant domain <400> 279 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr 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agagatgatt caaagaacac ggcgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaaac cgaggacacg gccgtgtatt actgtgccag agccctcacc 300 tactatgatg atgagtttgc ttactggggc cctggaacgc tggtcaccgt cagctcagcc 360 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtcagcaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 388 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FDP-h10, 14, 18 heavy chain amino acid S119 <220> <221> DOMAIN <222> (1)...(119) <223> variable domain <220> <221> DOMAIN <222> (120)...(217) <223> CH1 <220> <221> DOMAIN <222> (218)...(232) <223> hinge region <220> <221> DOMAIN <222> (233)...(342) <223> CH2 <220> <221> DOMAIN <222> (343)...(449) <223> CH3 <400> 388 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Leu Phe Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Asp Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 389 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bryodin <400> 389 Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ser Tyr Gly Val 1 5 10 15 Phe Ile Lys Asn Leu Arg Glu Ala Leu Pro Tyr Glu Arg Lys Val Tyr 20 25 30 Asn Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Ile Ser Gly Arg Tyr Thr Leu Leu 35 40 45 His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp Glu Thr Ile Ser Val Ala Val Asp Val 50 55 60 Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Leu Ala Gly Asp Val Ser Tyr Phe 65 70 75 80 Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ala Lys Phe Val Phe Lys Asp 85 90 95 Ala Lys Lys Lys Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu 100 105 110 Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Tyr Tyr Thr Ala Ser Ser 130 135 140 Ala Ala Ser Ala Leu Leu Val Leu Ile Gln Ser Thr Ala Glu Ser Ala 145 150 155 160 Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr 165 170 175 Phe Leu Pro Ser Leu Ala Thr Ile Ser Leu Glu Asn Asn Trp Ser Ala 180 185 190 Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln Phe Glu 195 200 205 Ser Pro Val Val Leu Ile Asp Gly Asn Asn Gln Arg Val Ser Ile Thr 210 215 220 Asn Ala Ser Ala Arg Val Val Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu Leu Asn 225 230 235 240 Arg Asn Asn Ile Ala 245 <210> 390 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Saporin-6 <400> 390 Val Thr Ser Ile Thr Leu Asp Leu Val Asn Pro Thr Ala Gly Gln Tyr 1 5 10 15 Ser Ser Phe Val Asp Lys Ile Arg Asn Asn Val Lys Asp Pro Asn Leu 20 25 30 Lys Tyr Gly Gly Thr Asp Ile Ala Val Ile Pro Pro Ser Lys Glu Lys 35 40 45 Phe Leu Arg Ile Asn Phe Gln Ser Ser Arg Gly Thr Val Ser Leu Gly 50 55 60 Leu Lys Arg Asp Asn Leu Tyr Val Val Ala Tyr Leu Ala Met Asp Asn 65 70 75 80 Thr Asn Val Asn Arg Ala Tyr Tyr Phe Arg Ser Glu Ile Thr Ser Ala 85 90 95 Glu Ser Thr Ala Leu Phe Pro Glu Ala Thr Thr Ala Asn Gln Lys Ala 100 105 110 Leu Glu Tyr Thr Glu Asp Tyr Gln Ser Ile Glu Lys Asn Ala Gln Ile 115 120 125 Thr Gln Gly Asp Gln Ser Arg Lys Glu Leu Gly Leu Gly Ile Asp Leu 130 135 140 Leu Ser Thr Ser Met Glu Ala Val Asn Lys Lys Ala Arg Val Val Lys 145 150 155 160 Asp Glu Ala Arg Phe Leu Leu Ile Ala Ile Gln Met Thr Ala Glu Ala 165 170 175 Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Gln Asn Leu Val Ile Lys Asn Phe Pro Asn 180 185 190 Lys Phe Asn Ser Glu Asn Lys Val Ile Gln Phe Glu Val Asn Trp Lys 195 200 205 Lys Ile Ser Thr Ala Ile Tyr Gly Asp Ala Lys Asn Gly Val Phe Asn 210 215 220 Lys Asp Tyr Asp Phe Gly Phe Gly Lys Val Arg Gln Val Lys Asp Leu 225 230 235 240 Gln Met Gly Leu Leu Met Tyr Leu Gly Lys Pro Lys Ser Ser Asn Glu 245 250 255 Ala Asn Ser Thr Val Arg His Tyr Gly Pro Leu Lys Pro Thr Leu Leu 260 265 270 Ile Thr <210> 391 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Viral Protein MAP <400> 391 Ala Pro Thr Leu Glu Thr Ile Ala Ser Leu Asp Leu Asn Asn Pro Thr 1 5 10 15 Thr Tyr Leu Ser Phe Ile Thr Asn Ile Arg Thr Lys Val Ala Asp Lys 20 25 30 Thr Glu Gln Cys Thr Ile Gln Lys Ile Ser Lys Thr Phe Thr Gln Arg 35 40 45 Tyr Ser Tyr Ile Asp Leu Ile Val Ser Ser Thr Gln Lys Ile Thr Leu 50 55 60 Ala Ile Asp Met Ala Asp Leu Tyr Val Leu Gly Tyr Ser Asp Ile Ala 65 70 75 80 Asn Asn Lys Gly Arg Ala Phe Phe Phe Lys Asp Val Thr Glu Ala Val 85 90 95 Ala Asn Asn Phe Phe Pro Gly Ala Thr Gly Thr Asn Arg Ile Lys Leu 100 105 110 Thr Phe Thr Gly Ser Tyr Gly Asp Leu Glu Lys Asn Gly Gly Leu Arg 115 120 125 Lys Asp Asn Pro Leu Gly Ile Phe Arg Leu Glu Asn Ser Ile Val Asn 130 135 140 Ile Tyr Gly Lys Ala Gly Asp Val Lys Lys Gln Ala Lys Phe Phe Leu 145 150 155 160 Leu Ala Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Ser 165 170 175 Asp Lys Ile Pro Ser Glu Lys Tyr Glu Glu Val Thr Val Asp Glu Tyr 180 185 190 Met Thr Ala Leu Glu Asn Asn Trp Ala Lys Leu Ser Thr Ala Val Tyr 195 200 205 Asn Ser Lys Pro Ser Thr Thr Thr Ala Thr Lys Cys Gln Leu Ala Thr 210 215 220 Ser Pro Val Thr Ile Ser Pro Trp Ile Phe Lys Thr Val Glu Glu Ile 225 230 235 240 Lys Leu Val Met Gly Leu Leu Lys Ser Ser 245 250 <210> 392 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shiga Toxin A-Chain <400> 392 Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45 Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60 Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80 Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95 His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125 Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140 His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg 165 170 175 Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190 Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205 Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile 210 215 220 Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu 225 230 235 240 Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255 Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His 260 265 270 Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg 275 280 285 Arg Thr Ile Ser Ser 290 <210> 393 <211> 319 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shiga-Like Toxin Subunit A (Verotoxin 2) <400> 393 Met Lys Cys Ile Leu Phe Lys Trp Val Leu Cys Leu Leu Leu Gly Phe 1 5 10 15 Ser Ser Val Ser Tyr Ser Arg Glu Phe Thr Ile Asp Phe Ser Thr Gln 20 25 30 Gln Ser Tyr Val Ser Ser Leu Asn Ser Ile Arg Thr Glu Ile Ser Thr 35 40 45 Pro Leu Glu His Ile Ser Gln Gly Thr Thr Ser Val Ser Val Ile Asn 50 55 60 His Thr Pro Pro Gly Ser Tyr Phe Ala Val Asp Ile Arg Gly Leu Asp 65 70 75 80 Val Tyr Gln Ala Arg Phe Asp His Leu Arg Leu Ile Ile Glu Gln Asn 85 90 95 Asn Leu Tyr Val Ala Gly Phe Val Asn Thr Ala Thr Asn Thr Phe Tyr 100 105 110 Arg Phe Ser Asp Phe Thr His Ile Ser Val Pro Gly Val Thr Thr Val 115 120 125 Ser Met Thr Thr Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Ala 130 135 140 Leu Glu Arg Ser Gly Met Gln Ile Ser Arg His Ser Leu Val Ser Ser 145 150 155 160 Tyr Leu Ala Leu Met Glu Phe Ser Gly Asn Thr Met Thr Arg Asp Ala 165 170 175 Ser Arg Ala Val Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg 180 185 190 Phe Arg Gln Ile Gln Arg Glu Phe Arg Gln Ala Leu Ser Glu Thr Ala 195 200 205 Pro Val Tyr Thr Met Thr Pro Gly Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp 210 215 220 Gly Arg Ile Ser Asn Val Leu Pro Glu Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Val 225 230 235 240 Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Asn Asn Ile Ser Ala Ile Leu Gly Thr 245 250 255 Val Ala Val Ile Leu Asn Cys His His Gln Gly Ala Arg Ser Val Arg 260 265 270 Ala Val Asn Glu Glu Ser Gln Pro Glu Cys Gln Ile Thr Gly Asp Arg 275 280 285 Pro Val Ile Lys Ile Asn Asn Thr Leu Trp Glu Ser Asn Thr Ala Ala 290 295 300 Ala Phe Leu Asn Arg Lys Ser Gln Phe Leu Tyr Thr Thr Gly Lys 305 310 315 <210> 394 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trichosanthin <400> 394 Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Val 1 5 10 15 Phe Ile Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr 20 25 30 Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ala 35 40 45 Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile 50 55 60 Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ala Lys Tyr Val Phe 85 90 95 Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu 100 105 110 Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly 115 120 125 Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala 130 135 140 Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 Ala Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp 165 170 175 Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp 180 185 190 Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln 195 200 205 Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn Ala Gln Asn Gln Arg Val Thr 210 215 220 Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu 225 230 235 240 Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala 245

Claims (147)

  1. 비변형 항-상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR) 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄(VH)에서 서열번호 2 또는 7에 기재된 아미노산 위치를 참고로 하여 104번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)으로의 치환에 상응하는 아미노산 치환을 포함하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    아미노산 위치는 상기 항체의 가변 중쇄와 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄의 정렬에 의해 식별되고;
    상기 비변형 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 ⅰ) 내지 ⅲ) 중에서 선택되며:
    ⅰ) 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 4, 9 또는 11에 기재된 가변 경쇄를 포함하는 세툭시맙(cetuximab) 또는 이의 항원-결합 단편;
    ⅱ) 상기 ⅰ)의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대하여 적어도 80% 서열 동일성을 나타내는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및
    ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ)의 인간화된 형태;
    상기 변형된 항-EGFR 항체는 상피세포 성장인자 수용체(EGFR) 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, ⅰ)의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비변형 항-EGFR 항체가 서열번호 2에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄를 포함하거나; 또는 서열번호 7에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 9 또는 11에 기재된 가변 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인간화된 것임을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 인간화된 비변형 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 14에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 15에 기재된 가변 경쇄를 포함하거나; 또는 서열번호 16에 기재된 가변 중쇄 및 서열번호 17에 기재된 가변 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 전장의 항체인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, 단일-쇄 Fv(scFv), Fv, dsFv, 이중체(diabody), Fd 및 Fd' 단편 중에서 선택되는 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열번호 74 또는 75에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 74 또는 75에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH); 및
    b) 서열번호 4, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 4, 9 또는 11에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열번호 72에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 72에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 포함하는 중쇄; 및
    b) 서열번호 3, 8, 10 또는 13에 기재된 아미노산 서열, 또는 이들 서열에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하며,
    전장의 IgG 항체인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    변형된 항체가 중쇄의 104번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)으로의 치환 외에 서열번호 74 또는 75에 기재된 가변 중쇄 내 및/또는 서열번호 4, 9 또는 11에 기재된 가변 경쇄 내에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개까지의 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    변형된 항체가 중쇄의 104번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)으로의 치환 외에 서열번호 72에 기재된 중쇄 내 및/또는 서열번호 3, 8, 10 또는 13에 기재된 경쇄 내에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개까지의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2 또는 7에 기재된 위치를 참고로 하여, T023K, T023H, T023R, T023A, T023C, T023E, T023G, T023I, T023M, T023N, T023P, T023S, T023V, T023W, T023L, V024R, V024A, V024F, V024G, V024I, V024M, V024P, V024S, V024T, V024L, V024E, S025H, S025R, S025A, S025C, S025D, S025E, S025F, S025G, S025I, S025M, S025P, S025Q, S025T, S025V, S025L, G026H, G026R, G026D, G026F, G026M, G026N, G026P, G026Q, G026S, G026Y, G026L, F027H, F027R, F027A, F027D, F027E, F027G, F027M, F027P, F027Q, F027S, F027T, F027V, F027W, F027Y, F027L, S028K, S028H, S028R, S028A, S028D, S028I, S028M, S028P, S028Q, S028V, S028W, S028L, S028C, L029K, L029H, L029A, L029D, L029G, L029I, L029M, L029N, L029S, L029V, T030H, T030R, T030D, T030G, T030I, T030M, T030N, T030P, T030S, T030V, T030W, T030Y, N031K, N031H, N031D, N031E, N031G, N031I, N031T, N031V, N031L, Y032H, Y032R, Y032C, Y032M, Y032N, Y032T, Y032V, Y032L, G033E, G033M, G033S, G033T, G033Y, V034A, V034C, V034I, V034M, V034P, V034L, H035I, H035Q, W036K, W036A, W036I, W036V, W036Y, V050K, V050H, V050A, V050D, V050E, V050G, V050I, V050N, V050Q, V050T, V050L, I051K, I051H, I051A, I051C, I051E, I051G, I051N, I051Q, I051S, I051V, I051Y, I051L, W052I, W052N, W052Y, S053H, S053R, S053A, S053C, S053G, S053I, S053M, S053P, S053Q, S053L, S053T, S053V, S053Y, G054H, G054R, G054A, G054C, G054D, G054P, G054S, G055H, G055R, G055M, G055S, G055Y, N056K, N056A, N056P, N056S, N056V, N056G, T057H, T057R, T057L, T057A, T057C, T057D, T057F, T057M, T057N, T057Q, T057W, T057Y, D058L, D058G, D058M, D058N, D058Q, Y059H, Y059R, Y059A, Y059C, Y059D, Y059E, Y059G, Y059I, Y059P, Y059Q, Y059S, Y059T, Y059V, Y059W, N060K, N060A, N060C, N060D, N060F, N060G, N060P, N060Q, N060S, N060T, N060Y, T061N, T061Q, P062G, F063H, F063R, F063L, F063A, F063C, F063D, F063G, F063M, F063N, F063Q, F063S, F063V, F063P, T064R, T064L, T064C, T064F, T064G, T064N, T064Q, T064V, S065H, S065R, S065L, S065C, S065E, S065F, S065G, S065I, S065M, S065N, S065P, S065Q, S065T, S065W, S065Y, R066L, R066A, R066C, R066E, R066F, R066N, R066P, R066Q, R066S, R066T, R066V, R066G, L067A, L067C, L067D, L067E, L067I, L067M, L067Q, L067S, L067T, L067V, L067Y, L067G, S068K, S068H, S068R, S068L, S068C, S068D, S068E, S068F, S068G, S068I, S068N, S068Q, S068T, S068V,I069A, I069C, I069G, 69Y, N070H, N070R, N070L, N070D, N070E, N070F, N070G, N070I, N070P, N070Q, N070S, N070T, N070V, N070Y, K071H, K071R, K071L, K071A, K071C, K071F, K071G, K071Q, K071S, K071T, K071V, K071W, K071Y, D072K, D072H, D072R, D072L, D072A, D072G, D072I, D072M, D072N, D072Q, D072S, D072V, D072W, D072Y, D072P, N073H, N073R, N073L, N073A, N073C, N073G, N073I, N073M, N073P, N073Q, N073S, N073T, N073V, N073W, N073Y, S074K, S074H, S074R, S074L, S074A, S074C, S074D, S074E, S074G, S074I, S074M, S074P, S074T, S074V, S074Y, K075H, K075R, K075L, K075A, K075C, 75E, K075F, K075M, K075Q, K075T, K075V,K075W, K075Y, K075G, K075P, S076H, S076R, S076L, S076A, S076C, S076D, S076E, S076F, S076M, S076P, S076Q, S076T, S076Y, S076I, S076V, Q077H, Q077R, Q077L, Q077A, Q077E, Q077G, Q077I, Q077M, Q077N, Q077S, Q077V, Q077W, Q077Y, Y093H, Y093V, Y093W, Y094R, Y094L, R097H, R097W, A098P, L099N, L099W, T100H, T100L, T100A, T100D, T100I, T100N, T100P, T100Q, T100S, T100V, T100Y, Y101H, Y101E, Y101F, Y101M, Y101W, Y102R,Y102C, Y102D, Y102I, Y102N, Y102W, D103R, D103L, D103A, D103C, D103I, D103P, D103Q, D103Y, E105H, E105T, F106L, F106V, F106W, F106Y, A107K, A107H, A107R, A107L, A107C, A107D, A107E, A107G, A107N, A107S, A107T, A107Y, Y108K, Y108H, Y108R, Y108L, Y108C, Y108F, Y108I, Y108N, Y108S, Y108T, Y108V, Y108W, W109I, W109M, W109Y, G110R, G110A, G110M, G110P, G110T, Q111K, Q111H, Q111R, Q111L, Q111D, Q111E, Q111G, Q111M, Q111P, Q111S, Q111T, Q111W, Q111Y, Q111V, Q111I, G112A, G112N, G112P, G112S, G112T 및 G112 중에서 선택되는 아미노산 치환에 상응하는 비변형 항체의 가변 중쇄 내 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2 또는 7을 참고로 하여 V24I, V24L, V24E, S25C, S25G, S25I, S25M, S25V, S25Q, S25T, S25L, S25H, S25R, S25A, S25D, F27R, S28C, L29H, T30F, N31H, N31I, N31T, N31V, Y32T, V50L, S53G, G54D, G54S, G54R, G54C, G54P, D58M, Y59E, F63R, F63C, F63G, F63M, F63V, F63P, F63S, T64N, T64V, L67G, S68F, S68Q, D72K, D72L, D72P, D72M, D72W, N73Q, S74H, S74R, S74D, S74G, S74Y, K75H, K75G, K75W, K75P, S76I, S76V, Q77R, Q77E, R97H, T100I, T100P, Y101W, Y105V, A107N, Q111I, Q111P 및 Q111V 중에서 선택되는 아미노산 치환에 상응하는 비변형 항체의 가변 중쇄 내 아미노산 치환을 포함하고, 상기 상응하는 아미노산 위치는 상기 항체의 가변 중쇄와 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄의 정렬에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, V24E, S25C, S25V, F27R, T30F, S53G, D72L, R97H, 및 Q111P 중에서 선택되는 아미노산 치환에 상응하는 비변형 항체의 가변 중쇄 내 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 HC-Y104E/ HC-Q111P; HC-S25C/ HC-Y104E; HC-Y104E/LC-I29S; HC-Y104E/HC-Q111P/LC-I29S; HC-S53G/HC-Y104E; HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S25V/HC-Y104E; HC-S25V/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104E; HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-T30F/HC-Y104E; HC-T30F/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104E; HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-D72L/HC-Y104E; HC-D72L/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S53G/ HC-D72L/HC-Y104E; 또는 HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104E/HC-Q111P인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열번호 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123 중 어느 하나에 대하여 적어도 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH); 및
    b) 서열번호 4, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 4, 9 또는 11에 대하여 적어도 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열번호 74, 77 또는 104에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 74, 77 또는 104에 대하여 적어도 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH); 및
    b) 서열번호 4, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 4, 9 또는 11에 대하여 적어도 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 또는 121 중 어느 하나에 기재된 중쇄 불변 영역, 또는 서열번호 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 또는 121 중 어느 하나에 대하여 적어도 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체; 및
    서열번호 3, 8, 10 또는 13 중 어느 하나에 기재된 경쇄 불변 영역, 또는 서열번호 3, 8, 10 또는 13 중 어느 하나에 대하여 적어도 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 포함하며, 전장의 항체인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제1항 내지 제9항 또는 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 동일성이 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4에 기재된 아미노산 위치를 참고로 하여 D001W, I002C, I002V, I002W, L003D, L003F, L003G, L003S, L003T, L003V, L003W, L003Y, L003R, L004C, L004E, L004F, L004I, L004P, L004S, L004T, L004V, L004W, L004K, L004H, L004R, T005A, T005C, T005D, T005E, T005F, T005G, T005N, T005S, T005W, T005L, T005K, T005H, T005R, T005P, R024A, R024C, R024F, R024L, R024M, R024S, R024W, R024Y, R024G, A025C, A025G, A025L, A025V, S026A, S026C, S026D, S026I, S026M, S026N, S026V, S026W, S026L, S026G, S026H, S026R, Q027A, Q027D, Q027E, Q027F, Q027I, Q027M, Q027N, Q027P, Q027T, S028A, S028D, S028N, S028Q, S028L, S028K, S028H, I029A, I029E, I029F, I029S, I029T, I029R, G030A, G030E, G030F, G030I, G030M, G030P, G030Q, G030S, G030V, G030Y, G030L, G030K, G030H, G030R, T031A, T031F, T031G, T031M, T031S, T031V, T031W, T031L, T031K, T031H, N032G, I033F, I033G, I033M, I033T, I033V, I033H, I048M, I048S, I048L, I048K, K049A, K049E, K049F, K049G, K049N, K049Q, K049S, K049T, K049V, K049Y, K049L, K049H, K049R, A051T, A051L, S052A, S052C, S052D, S052E, S052G, S052I, S052M, S052Q, S052V, S052W, S052R, S052K, E053G, S054M, I055A, I055F, S056G, S056L, S056A, S056C, S056D, S056E, S056F, S056N, S056P, S056Q, S056V, S056W, S056H, S056R, S056K, Y086F, Y086M, Y086H, Y087L, Y087C, Y087D, Y087F, Y087G, Y087I, Y087N, Y087P, Y087S, Y087T, Y087V, Y087W, Y087K, Y087H, Y087R, Q089E, N091L, N091A, N091C, N091I, N091M, N091S, N091T, N091V, N091H, N091R, N092C, N092D, N092L, N092M, N092S, N092T, N092V, N092W, N092Y, N092H, N092K, N092R, N093T, T096L, T096C, T096M, T096V, T097L, T097A, T097D, T097G, T097Q, T097S, T097V, T097K, T097R, F098A, F098M, F098S, F098V, F098Y, G099L, G099D, G099E, G099F, G099I, G099M, G099N, G099S, G099T, G099V, G099K, G099H, Q100C, Q100D, Q100E, Q100F, Q100I, Q100M, Q100N, Q100P, Q100T, Q100V, Q100W, Q100Y, Q100K, Q100H 또는 Q100R 중에서 선택되는 아미노산 치환에 상응하는 비변형 항체의 가변 경쇄 내 아미노산 치환을 포함하고, 상기 상응하는 아미노산 위치는 상기 항체의 가변 경쇄와 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄의 정렬에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4를 참고로 하여 L4C, L4F, L4V, T5P, R24G, I29S, S56H 및 N91 중에서 선택되는 아미노산 치환에 상응하는 비변형 항체의 가변 경쇄 내 아미노산 치환을 포함하고, 상기 상응하는 아미노산 위치는 상기 항체의 가변 경쇄와 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄의 정렬에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4를 참고로 하여 아미노산 치환 I29S에 상응하는 비변형 항체의 가변 경쇄 내 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 HC-Y104E/LC-I29S 또는 HC-Y104E/HC-Q111P/LC-I29S인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 116, 117, 119, 120, 122, 또는 123에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH); 및
    b) 서열번호 125, 126 또는 127에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 125, 126 또는 127에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 72, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 또는 121에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 72, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 또는 121에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 포함하는 중쇄; 및
    서열번호 124에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 124에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하며,
    전장의 IgG 항체인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 서열 동일성이 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 104번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)으로의 아미노산 치환을 포함하고 인간화된 것임을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 제26항에 있어서,
    가변 중쇄가 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄에 대하여 85% 미만의 서열 동일성 및 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄에 대하여 65% 초과의 서열 동일성을 나타내고; 및
    가변 경쇄가 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄에 대하여 85% 미만의 서열 동일성 및 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄에 대하여 65% 초과의 서열 동일성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 서열번호 61 또는 63에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 61 또는 63에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 제28항에 있어서, 중쇄의 104번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)으로의 치환 외에 서열번호 61 또는 63에 기재된 가변 중쇄 내 및/또는 서열번호 183, 184 또는 186에 기재된 가변 경쇄 내에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개까지의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 59에 기재된 중쇄 또는 서열번호 59에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 181에 기재된 경쇄 또는 서열번호 181에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 아미노산 서열을 포함하며, 전장의 IgG 항체인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  31. 제30항에 있어서, 중쇄의 104번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)으로의 치환 외에 서열번호 59에 기재된 중쇄 내 및/또는 서열번호 181에 기재된 경쇄 내에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개까지의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2 또는 7에 기재된 위치를 참고로 하여, T023K, T023H, T023R, T023A, T023C, T023E, T023G, T023I, T023M, T023N, T023P, T023S, T023V, T023W, T023L, V024R, V024A, V024F, V024G, V024I, V024M, V024P, V024S, V024T, V024L, V024E, S025H, S025R, S025A, S025C, S025D, S025E, S025F, S025G, S025I, S025M, S025P, S025Q, S025T, S025V, S025L, G026H, G026R, G026D, G026F, G026M, G026N, G026P, G026Q, G026S, G026Y, G026L, F027H, F027R, F027A, F027D, F027E, F027G, F027M, F027P, F027Q, F027S, F027T, F027V, F027W, F027Y, F027L, S028K, S028H, S028R, S028A, S028D, S028I, S028M, S028P, S028Q, S028V, S028W, S028L, S028C, L029K, L029H, L029A, L029D, L029G, L029I, L029M, L029N, L029S, L029V, T030H, T030R, T030D, T030G, T030I, T030M, T030N, T030P, T030S, T030V, T030W, T030Y, N031K, N031H, N031D, N031E, N031G, N031I, N031T, N031V, N031L, Y032H, Y032R, Y032C, Y032M, Y032N, Y032T, Y032V, Y032L, G033E, G033M, G033S, G033T, G033Y, V034A, V034C, V034I, V034M, V034P, V034L, H035I, H035Q, W036K, W036A, W036I, W036V, W036Y, V050K, V050H, V050A, V050D, V050E, V050G, V050I, V050N, V050Q, V050T, V050L, I051K, I051H, I051A, I051C, I051E, I051G, I051N, I051Q, I051S, I051V, I051Y, I051L, W052I, W052N, W052Y, S053H, S053R, S053A, S053C, S053G, S053I, S053M, S053P, S053Q, S053L, S053T, S053V, S053Y, G054H, G054R, G054A, G054C, G054D, G054P, G054S, G055H, G055R, G055M, G055S, G055Y, N056K, N056A, N056P, N056S, N056V, N056G, T057H, T057R, T057L, T057A, T057C, T057D, T057F, T057M, T057N, T057Q, T057W, T057Y, D058L, D058G, D058M, D058N, D058Q, Y059H, Y059R, Y059A, Y059C, Y059D, Y059E, Y059G, Y059I, Y059P, Y059Q, Y059S, Y059T, Y059V, Y059W, N060K, N060A, N060C, N060D, N060F, N060G, N060P, N060Q, N060S, N060T, N060Y, T061N, T061Q, P062G, F063H, F063R, F063L, F063A, F063C, F063D, F063G, F063M, F063N, F063Q, F063S, F063V, F063P, T064R, T064L, T064C, T064F, T064G, T064N, T064Q, T064V, S065H, S065R, S065L, S065C, S065E, S065F, S065G, S065I, S065M, S065N, S065P, S065Q, S065T, S065W, S065Y, R066L, R066A, R066C, R066E, R066F, R066N, R066P, R066Q, R066S, R066T, R066V, R066G, L067A, L067C, L067D, L067E, L067I, L067M, L067Q, L067S, L067T, L067V, L067Y, L067G, S068K, S068H, S068R, S068L, S068C, S068D, S068E, S068F, S068G, S068I, S068N, S068Q, S068T, S068V, I069A, I069C, I069G, 69Y, N070H, N070R, N070L, N070D, N070E, N070F, N070G, N070I, N070P, N070Q, N070S, N070T, N070V, N070Y, K071H, K071R, K071L, K071A, K071C, K071F, K071G, K071Q, K071S, K071T, K071V, K071W, K071Y, D072K, D072H, D072R, D072L, D072A, D072G, D072I, D072M, D072N, D072Q, D072S, D072V, D072W, D072Y, D072P, N073H, N073R, N073L, N073A, N073C, N073G, N073I, N073M, N073P, N073Q, N073S, N073T, N073V, N073W, N073Y, S074K, S074H, S074R, S074L, S074A, S074C, S074D, S074E, S074G, S074I, S074M, S074P, S074T, S074V, S074Y, K075H, K075R, K075L, K075A, K075C, 75E, K075F, K075M, K075Q, K075T, K075V, K075W, K075Y, K075G, K075P, S076H, S076R, S076L, S076A, S076C, S076D, S076E, S076F, S076M, S076P, S076Q, S076T, S076Y, S076I, S076V, Q077H, Q077R, Q077L, Q077A, Q077E, Q077G, Q077I, Q077M, Q077N, Q077S, Q077V, Q077W, Q077Y, Y093H, Y093V, Y093W, Y094R, Y094L, R097H, R097W, A098P, L099N, L099W, T100H, T100L, T100A, T100D, T100I, T100N, T100P, T100Q, T100S, T100V, T100Y, Y101H, Y101E, Y101F, Y101M, Y101W, Y102R, Y102C, Y102D, Y102I, Y102N, Y102W, D103R, D103L, D103A, D103C, D103I, D103P, D103Q, D103Y, E105H, E105T, F106L, F106V, F106W, F106Y, A107K, A107H, A107R, A107L, A107C, A107D, A107E, A107G, A107N, A107S, A107T, A107Y, Y108K, Y108H, Y108R, Y108L, Y108C, Y108F, Y108I, Y108N, Y108S, Y108T, Y108V, Y108W, W109I, W109M, W109Y, G110R, G110A, G110M, G110P, G110T, Q111K, Q111H, Q111R, Q111L, Q111D, Q111E, Q111G, Q111M, Q111P, Q111S, Q111T, Q111W, Q111Y, Q111V, Q111I, G112A, G112N, G112P, G112S, G112T 및 G112 중에서 선택되는 아미노산 치환에 상응하는 비변형 항체의 가변 중쇄 내 아미노산 치환을 포함하고, 상기 상응하는 아미노산 위치는 상기 항체의 가변 중쇄와 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄의 정렬에 의해 식별되며; 및/또는
    서열번호 4에 기재된 아미노산 위치를 참고로 하여, D001W, I002C, I002V, I002W, L003D, L003F, L003G, L003S, L003T, L003V, L003W, L003Y, L003R, L004C, L004E, L004F, L004I, L004P, L004S, L004T, L004V, L004W, L004K, L004H, L004R, T005A, T005C, T005D, T005E, T005F, T005G, T005N, T005S, T005W, T005L, T005K, T005H, T005R, T005P, R024A, R024C, R024F, R024L, R024M, R024S, R024W, R024Y, R024G, A025C, A025G, A025L, A025V, S026A, S026C, S026D, S026I, S026M, S026N, S026V, S026W, S026L, S026G, S026H, S026R, Q027A, Q027D, Q027E, Q027F, Q027I, Q027M, Q027N, Q027P, Q027T, S028A, S028D, S028N, S028Q, S028L, S028K, S028H, I029A, I029E, I029F, I029S, I029T, I029R, G030A, G030E, G030F, G030I, G030M, G030P, G030Q, G030S, G030V, G030Y, G030L, G030K, G030H, G030R, T031A, T031F, T031G, T031M, T031S, T031V, T031W, T031L, T031K, T031H, N032G, I033F, I033G, I033M, I033T, I033V, I033H, I048M, I048S, I048L, I048K, K049A, K049E, K049F, K049G, K049N, K049Q, K049S, K049T, K049V, K049Y, K049L, K049H, K049R, A051T, A051L, S052A, S052C, S052D, S052E, S052G, S052I, S052M, S052Q, S052V, S052W, S052R, S052K, E053G, S054M, I055A, I055F, S056G, S056L, S056A, S056C, S056D, S056E, S056F, S056N, S056P, S056Q, S056V, S056W, S056H, S056R, S056K, Y086F, Y086M, Y086H, Y087L, Y087C, Y087D, Y087F, Y087G, Y087I, Y087N, Y087P, Y087S, Y087T, Y087V, Y087W, Y087K, Y087H, Y087R, Q089E, N091L, N091A, N091C, N091I, N091M, N091S, N091T, N091V, N091H, N091R, N092C, N092D, N092L, N092M, N092S, N092T, N092V, N092W, N092Y, N092H, N092K, N092R, N093T, T096L, T096C, T096M, T096V, T097L, T097A, T097D, T097G, T097Q, T097S, T097V, T097K, T097R, F098A, F098M, F098S, F098V, F098Y, G099L, G099D, G099E, G099F, G099I, G099M, G099N, G099S, G099T, G099V, G099K, G099H, Q100C, Q100D, Q100E, Q100F, Q100I, Q100M, Q100N, Q100P, Q100T, Q100V, Q100W, Q100Y, Q100K, Q100H 및 Q100R 중에서 선택되는 아미노산 치환에 상응하는 비변형 항체의 가변 경쇄 내 아미노산 치환을 포함하고, 상기 상응하는 아미노산 위치는 상기 항체의 가변 경쇄와 서열번호 4에 기재된 가변 경쇄의 정렬에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2 또는 7을 참고로 하여 V24I, V24L, V24E, S25C, S25G, S25I, S25M, S25V, S25Q, S25T, S25L, S25H, S25R, S25A, S25D, F27R, S28C, L29H, T30F, N31H, N31I, N31T, N31V, Y32T, V50L, S53G, G54D, G54S, G54R, G54C, G54P, D58M, Y59E, F63R, F63C, F63G, F63M, F63V, F63P, F63S, T64N, T64V, L67G, S68F, S68Q, D72K, D72L, D72P, D72M, D72W, N73Q, S74H, S74R, S74D, S74G, S74Y, K75H, K75G, K75W, K75P, S76I, S76V, Q77R, Q77E, R97H, T100I, T100P, Y101W, Y105V, A107N, Q111I, Q111P 및 Q111V 중에서 선택되는 아미노산 치환에 상응하는 비변형 항체의 가변 중쇄 내 아미노산 치환을 추가로 포함하고, 상기 상응하는 아미노산 위치는 상기 항체의 가변 중쇄와 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄의 정렬에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, V24E, S25C, S25V, F27R, T30F, S53G, D72L, R97H, 및 Q111P 중에서 선택되는 아미노산 치환에 상응하는 비변형 항체의 가변 중쇄 내 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 HC-Y104E/ HC-Q111P; HC-S25C/ HC-Y104E; HC-Y104E/LC-I29S; HC-Y104E/HC-Q111P/LC-I29S; HC-S53G/HC-Y104E; HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S25V/HC-Y104E; HC-S25V/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104E; HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-T30F/HC-Y104E; HC-T30F/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104E; HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-D72L/HC-Y104E; HC-D72L/HC-Y104E/HC-Q111P; HC-S53G/ HC-D72L/HC-Y104E; 또는 HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104E/HC-Q111P인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  36. 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 HC-Y104E/ HC-Q111P 또는 HC-T30F/HC-Y104E/HC-Q111P인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  37. 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 a) 내지 hh) 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    a) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 155, 156 또는 158에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 155, 156 또는 158에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    b) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 162, 163 또는 165에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 162, 163 또는 165에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    c) 서열번호 137 또는 139에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 137 또는 139에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 155, 156 또는 158에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 155, 156 또는 158에에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    d) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 169, 170 또는 172에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 169, 170 또는 172에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    e) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 176, 177 또는 179에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 176, 177 또는 179에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    f) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    g) 서열번호 137 또는 139에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 137 또는 139에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    h) 서열번호 131 또는 133에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 131 또는 133에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 190, 191 또는 193에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 190, 191 또는 193에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    i) 서열번호 143 또는 145에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143 또는 145에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 183, 184 또는 186에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 183, 184 또는 186에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    j) 서열번호 149 또는 151에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 149 또는 151에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 197, 198 또는 200에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 197, 198 또는 200에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    k) 서열번호 143 또는 145에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143 또는 145에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 197, 198 또는 200에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 197, 198 또는 200에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    l) 서열번호 149 또는 151에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 149 또는 151에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 204, 205 또는 207에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 204, 205 또는 207에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    m) 서열번호 143 또는 145에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 143 또는 145에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 204, 205 또는 207에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 204, 205 또는 207에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    n) 서열번호 211 또는 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211 또는 213에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 253, 254 또는 256에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 253, 254 또는 256에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    o) 서열번호 217 또는 219에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 217 또는 219에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 253, 254 또는 256에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 253, 254 또는 256에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    p) 서열번호 223 또는 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223 또는 225에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 260, 261 또는 263에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 260, 261 또는 263에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    q) 서열번호 229 또는 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229 또는 231에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 260, 261 또는 263에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 260, 261 또는 263에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    r) 서열번호 235 또는 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235 또는 237에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 267, 268 또는 270에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 267, 268 또는 270에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    s) 서열번호 241 또는 243에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 241 또는 243에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 274, 275 또는 277에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 274, 275 또는 277에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    t) 서열번호 223 또는 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223 또는 225에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 274, 275 또는 277에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 274, 275 또는 277에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    u) 서열번호 229 또는 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229 또는 231에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 274, 275 또는 277에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 274, 275 또는 277에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    v) 서열번호 235 또는 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235 또는 237에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    w) 서열번호 247 또는 249에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247 또는 249에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    x) 서열번호 223 또는 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223 또는 225에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    y) 서열번호 229 또는 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229 또는 231에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    z) 서열번호 235 또는 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235 또는 237에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    aa) 서열번호 247 또는 249에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247 또는 249에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    bb) 서열번호 223 또는 225에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 223 또는 225에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    cc) 서열번호 229 또는 231에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 229 또는 231에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    dd) 서열번호 235 또는 237에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 235 또는 237에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 295, 296 또는 298에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 295, 296 또는 298에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    ee) 서열번호 247 또는 249에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 247 또는 249에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 302, 303 또는 305에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 302, 303 또는 305에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    ff) 서열번호 211 또는 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211 또는 213에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 302, 303 또는 305에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 302, 303 또는 305에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    gg) 서열번호 211 또는 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211 또는 213에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 281, 282 또는 284에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 281, 282 또는 284에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열; 및
    hh) 서열번호 211 또는 213에 기재된 가변 중쇄 또는 서열번호 211 또는 213에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 288, 289 또는 291에 기재된 가변 경쇄 또는 서열번호 288, 289 또는 291에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열.
  38. 제28항, 제30항 또는 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 동일성이 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이고, 가변 중쇄 또는 가변 경쇄가 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  39. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 a) 내지 hh) 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며 전장의 항체인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    a) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 153에 기재된 경쇄 또는 서열번호 153에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    b) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 160에 기재된 경쇄 또는 서열번호 160에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    c) 서열번호 135에 기재된 중쇄 또는 서열번호 135에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 153에 기재된 경쇄 또는 서열번호 153에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    d) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 167에 기재된 경쇄 또는 서열번호 167에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    e) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 174에 기재된 경쇄 또는 서열번호 174에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    f) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 181에 기재된 경쇄 또는 서열번호 181에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    g) 서열번호 135에 기재된 중쇄 또는 서열번호 135에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 181에 기재된 경쇄 또는 서열번호 181에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    h) 서열번호 129에 기재된 중쇄 또는 서열번호 129에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 188에 기재된 경쇄 또는 서열번호 188에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    i) 서열번호 141에 기재된 중쇄 또는 서열번호 141에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 181에 기재된 경쇄 또는 서열번호 181에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    j) 서열번호 147에 기재된 중쇄 또는 서열번호 147에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 195에 기재된 경쇄 또는 서열번호 195에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    k) 서열번호 141에 기재된 중쇄 또는 서열번호 141에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 195에 기재된 경쇄 또는 서열번호 195에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    l) 서열번호 147에 기재된 중쇄 또는 서열번호 147에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 202에 기재된 경쇄 또는 서열번호 202에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    m) 서열번호 141에 기재된 중쇄 또는 서열번호 141에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 202에 기재된 경쇄 또는 서열번호 202에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    n) 서열번호 209에 기재된 중쇄 또는 서열번호 209에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 251에 기재된 경쇄 또는 서열번호 251에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    o) 서열번호 215에 기재된 중쇄 또는 서열번호 215에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 251에 기재된 경쇄 또는 서열번호 251에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    p) 서열번호 221에 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 258에 기재된 경쇄 또는 서열번호 258에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    q) 서열번호 227에 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 258에 기재된 경쇄 또는 서열번호 258에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    r) 서열번호 233에 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 265에 기재된 경쇄 또는 서열번호 265에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    s) 서열번호 239에 기재된 중쇄 또는 서열번호 239에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 272에 기재된 경쇄 또는 서열번호 272에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    t) 서열번호 221에 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 272에 기재된 경쇄 또는 서열번호 272에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    u) 서열번호 227에 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 272에 기재된 경쇄 또는 서열번호 272에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    v) 서열번호 233에 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 279에 기재된 경쇄 또는 서열번호 279에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    w) 서열번호 245에 기재된 중쇄 또는 서열번호 245에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 279에 기재된 경쇄 또는 서열번호 279에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    x) 서열번호 221에 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 279에 기재된 경쇄 또는 서열번호 279에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    y) 서열번호 227에 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 279에 기재된 경쇄 또는 서열번호 279에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    z) 서열번호 233에 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 286에 기재된 경쇄 또는 서열번호 286에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    aa) 서열번호 245에 기재된 중쇄 또는 서열번호 245에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 286에 기재된 경쇄 또는 서열번호 286에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    bb) 서열번호 221에 기재된 중쇄 또는 서열번호 221에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 286에 기재된 경쇄 또는 서열번호 286에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    cc) 서열번호 227에 기재된 중쇄 또는 서열번호 227에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 286에 기재된 경쇄 또는 서열번호 286에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    dd) 서열번호 233에 기재된 중쇄 또는 서열번호 233에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 293에 기재된 경쇄 또는 서열번호 293에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    ee) 서열번호 245에 기재된 중쇄 또는 서열번호 245에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 300에 기재된 경쇄 또는 서열번호 300에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    ff) 서열번호 209에 기재된 중쇄 또는 서열번호 209에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 300에 기재된 경쇄 또는 서열번호 300에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열;
    gg) 서열번호 209에 기재된 중쇄 또는 서열번호 209에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 279에 기재된 경쇄 또는 서열번호 279에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열; 및
    hh) 서열번호 209에 기재된 중쇄 또는 서열번호 209에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 및 서열번호 286에 기재된 경쇄 또는 서열번호 286에 대하여 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열.
  40. 제39항에 있어서, 서열 동일성이 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, 단일-쇄 Fv(scFv), Fv, dsFv, 이중체(diabody), Fd 및 Fd' 단편 중에서 선택되는 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  42. 제41항에 있어서, Fab 또는 scFv인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, pH의 차이를 제외하고는 동일한 조건 하에서 측정시 항체가 약 pH 7.4의 존재하에서와 비교하여 pH 6.0 내지 6.5의 존재하에서 1.0을 초과하는 EGFR에 대한 결합 활성의 비율을 나타내는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체.
  44. 제43항에 있어서, 결합 활성의 비율이 적어도 2.0인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2 또는 7에 기재된 가변 중쇄와 비교하여 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 또는 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 단리 또는 정제된 것임을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  47. 서열번호 57에 기재된 서열의 아미노산 1 내지 119를 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 181에 기재된 서열의 아미노산 1 내지 107을 포함하는 가변 경쇄를 포함하고, 서열번호 57의 104번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(D) 잔기를 포함하는, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  48. 제47항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, 단일-쇄 Fv(scFv), Fv, dsFv, 이중체(diabody), Fd 및 Fd' 단편 중에서 선택되는 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  49. 제47항에 있어서, 전장의 항체인 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  50. 제49항에 있어서, 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 181에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고, 서열번호 57의 104번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(D) 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  51. 표적제(targeted agent)에 직접적 또는 간접적으로 연결된 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 컨쥬게이트.
  52. 제51항에 있어서, 하기 구성요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    (Ab), (L)q, 및 (표적제)m, 여기서:
    Ab는 EGFR에 결합하는 변형된 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고;
    L은 상기 Ab를 상기 표적제에 연결하기 위한 링커이고;
    m은 적어도 1이고;
    q는 수득되는 컨쥬게이트가 EGFR에 결합하는 한 0 또는 그 이상이고; 및
    수득되는 컨쥬게이트는 EGFR에 결합한다.
  53. 제52항에 있어서, m이 1 내지 8이고, q가 0 내지 8인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 컨쥬게이트가 하기 식 Ab-[(L)q-(표적제)m]을 가지는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 표적제가 단백질, 펩티드, 핵산 또는 소분자인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 표적제가 치료적 모이어티(moiety)인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  57. 제56항에 있어서, 치료적 모이어티가 세포독성 모이어티, 방사성 동위원소, 화학요법제, 용균(lytic) 펩티드 또는 사이토카인인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  58. 제57항에 있어서, 치료적 모이어티가 탁솔(taxol); 사이토칼라신 B(cytochalasin B); 그래미시딘 D(gramicidin D); 에티디움 브로마이드(ethidium bromide); 에메틴(emetine); 마이토마이신(mitomycin); 에토포시드(etoposide); 테노포시드(tenoposide); 빈크리스틴(vincristine); 빈블라스틴(vinblastine); 콜히친(colchicine); 독소루비신(doxorubicin); 다우노루비신(daunorubicin); 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione); 메이탄신(maytansine) 또는 이의 유사체 또는 유도체; 오리스타틴(auristatin) 또는 이의 기능적 펩티드 유사체 또는 유도체; 돌라스타틴(dolastatin) 10 또는 15 또는 이의 유사체; 이리노테칸(irinotecan) 또는 이의 유사체; 미톡산트론(mitoxantrone); 미트라마이신(mithramycin); 악티노마이신 D(actinomycin D); 1-데하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone); 글루코코르티코이드(glucocorticoid); 프로카인(procaine); 테트라카인(tetracaine); 리도카인(lidocaine); 프로프라놀롤(propranolol); 퓨로마이신(puromycin); 칼리키아마이신(calicheamicin) 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항대사물질(antimetabolite); 알킬화제(alkylating agent); 백금 유도체; 듀오카마이신 A(duocarmycin A), 듀오카마이신 SA(duocarmycin SA), 라첼마이신(rachelmycin)(CC-1065), 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항생제; 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀(pyrrolo[2,l-c][l,4]-benzodiazepines)(PDB); 독소(toxin); 리보뉴클레아제(ribonuclease)(RNase); 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I), 스타필로코컬 장독소 A(Staphylococcal enterotoxin A); 및 자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 치료적 모이어티가 안사미토신(ansamitocin) 또는 머탄신(mertansine)(DM1) 중에서 선택되는 메이탄시노이드(maytansinoid)인 메이탄신 유도체인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  60. 제59항에 있어서,
    메이탄시노이드가 DM1이고;
    DM1이 하기 구조를 가지고;
    Figure pct00111
    ; 및
    R이 SH인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 링커 L이 N-숙신이미딜-4(2-피리딜티오)프로파노에이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  62. 제61항에 있어서, 링커 L이 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  63. 제62항에 있어서,
    m 및 q가 같고, 컨쥬게이트가 식 Ab-[(L)-(표적제)]p을 가지고; 및
    상기 (L)-(표적제)가 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure pct00112
    .
  64. 제63항에 있어서,
    p가 2 내지 6이고; 및
    컨쥬게이트가 항체 당 2 내지 6개의 DM1 분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  65. 제57항 또는 제58항에 있어서, 치료적 모이어티가 오리스타틴(auristatin) 또는 이의 기능적 펩티드 유사체 또는 유도체에 해당하는 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE) 또는 F(MMAF)인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  66. 제65항에 있어서, 치료적 모이어티가 MMAE이고; 및
    MMAE가 하기 구조를 가지는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 형태인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure pct00113
    .
  67. 제65항에 있어서, 치료적 모이어티가 MMAF이고; 및
    MMAF가 하기 구조를 가지는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 형태인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure pct00114
    .
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서,
    링커가 식 Aa-Yy-Zz-Xx의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 형태이고;
    A는 항체의 설프히드릴기(sulfhydryl group)와 반응할 수 있는 브릿지 유닛(bridge unit)이고;
    a는 0 또는 1이고;
    Y 및 Z 각각은 독립적으로 아미노산 유닛이고;
    y 및 z 각각은 독립적으로 0 내지 12의 정수이고;
    X는 스페이서(Spacer) 유닛이고; 및
    x는 0, 1 또는 2인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  69. 제68항에 있어서, 브릿지 유닛이 말레이미드 그룹 또는 비스-티올 알킬화제(bis-thiol alkylating reagent)를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 브릿지 유닛이 4-(3-토실-2-(토실메틸)프로파노일)벤즈아미드, 말레이미도카프로일 및 말레이미도프로파노일(MP) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 브릿지 유닛이 폴리에틸렌 글리콜 반응성 기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  72. 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 리신, 아세틸 또는 포르밀로 보호된 리신, 아르기닌, 토실 또는 니트로기로 보호된 아르기닌, 히스티딘, 오르니틴(ornithine), 아세틸 또는 포르밀로 보호된 오르니틴, 또는 시트룰린(citrulline)인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  74. 제68항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, Y-Z가 페닐알라닌-리신, 발린-시트룰린 또는 발린-리신인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  75. 제68항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, X가 p-아미노벤질을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  76. 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, X가 하기 식을 갖는 화합물인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure pct00115
    .
  77. 제68항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 6-말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐(MC-vc-PAB) 또는 4-(3-토실-2-(토실메틸)프로파노일)벤즈아미드-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐(TB-vc-PAB)인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  78. 제68항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    m 및 q가 같고, 컨쥬게이트가 식 Ab-[(L)-(표적제)]p를 가지고;
    상기 표적제가 MMAF이고;
    상기 링커가 식 Aa를 가지고, 여기서:
    A는 브릿지 유닛으로 말레이미도카프로일(MC)이고;
    a는 1이고; 및
    상기 (L)-(표적제)가 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure pct00116
    .
  79. 제68항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    m 및 q가 같고, 컨쥬게이트가 식 Ab-[(L)-(표적제)]p를 가지고;
    상기 표적제가 MMAE이고;
    상기 링커가 6-말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐(MC-vc-PAB)이고; 및
    상기 (L)-(표적제)가 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure pct00117
    .
  80. 제68항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    m 및 q가 같고, 컨쥬게이트가 식 Ab-[(L)-(표적제)]p를 가지고;
    상기 표적제가 MMAE이고;
    상기 링커가 4-(3-토실-2-(토실메틸)프로파노일)벤즈아미드-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐(TB-vc-PAB)이고; 및
    상기 (L)-(표적제)가 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure pct00118
    .
  81. 제57항 또는 제58항에 있어서, 치료적 모이어티가 메토트렉세이트(methotrexate), 6 머캅토퓨린(mercaptopurine), 6 티오구아닌(thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 플루다라빈(fludarabine), 5 플루오로우라실(fluorouracil), 데카르바진(decarbazine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 아스파라기나제(asparaginase), 젬시타빈(gemcitabine), 및 클라드리빈(cladribine) 중에서 선택되는 항대사물질인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  82. 제57항 또는 제58항에 있어서, 치료적 모이어티가 메클로레타민(mechlorethamine), 티오테파(thiotepa), 클로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카무스틴(carmustine)(BCNU), 로무스틴(lomustine)(CCNU), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 다카르바진(dacarbazine)(DTIC), 프로카르바진(procarbazine) 및 미토마이신 C(mitomycin C) 중에서 선택되는 알킬화제인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  83. 제57항 또는 제58항에 있어서, 치료학적 모이어티가 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)인 백금 유도체인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  84. 제57항 또는 제58항에 있어서, 치료학적 모이어티가 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin) 및 안트라마이신(anthramycin)(AMC) 중에서 선택되는 항생제인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  85. 제57항 또는 제58항에 있어서, 치료학적 모이어티가 디프테리아 독소(diphtheria toxin) 및 이의 활성 단편 및 혼성체 분자, 라이신 독소(ricin toxin), 콜레라 독소, 쉬가-유사 독소(Shiga-like toxin), LT 독소, C3 독소, 쉬가 독소(Shiga toxin), 백일해 독소(pertussis toxin), 파상풍 독소(tetanus toxin), 대두 보먼-버크 프로테아제 억제제(soybean Bowman-Birk protease inhibitor), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin), 알로린(alorin), 사포린(saporin), 모데신(modeccin), 젤라닌(gelanin), 아브린 A 쇄(abrin A chain), 모데신 A 쇄(modeccin A chain), 알파-사르신(alpha-sarcin), 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 자리공과 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질, 여주(momordica charantia) 억제제, 커신(curcin), 크로틴(crotin), 젤로닌(gelonin), 미토질린(mitogillin), 리스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin) 및 에노마이신(enomycin) 독소 중에서 선택되는 독소인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  86. 제51항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 및 표적제가 직접적으로 연결된 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  87. 제51항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 및 표적제가 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  88. 제87항에 있어서, 링커가 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 화학적 링커인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 링커가 절단가능한 링커 또는 비-절단가능한 링커인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 항체 상의 하나 이상의 유리 티올에 컨쥬게이트된 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  91. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 항체 상의 하나 이상의 일차 아민에 컨쥬게이트된 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  92. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 핵산 분자.
  93. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 어느 하나의 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 핵산 분자.
  94. 제92항 또는 제93항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  95. 제94항의 벡터 또는 벡터들을 포함하는 세포.
  96. 제95항에 있어서, 세포가 원핵세포 또는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  97. 적절한 숙주 세포 내에서 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제94항의 벡터 또는 벡터들로부터 암호화된 중쇄 또는 경쇄를 발현하는 단계 및 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법.
  98. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제51항 내지 제90항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트; 및
    화학요법제 또는 항암제를 포함하는 조합물(combination).
  99. 제98항에 있어서, 화학요법제가 알킬화제, 니트로소우레아(nitrosoureas), 토포아이소머라제 저해제, 및 항체 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조합물.
  100. 제99항에 있어서, 화학요법제가 이리노테칸(irinotecan), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 5-플루오로우라실(5-FU), 젤로다(Xeloda), 캠토사(Camptosar), 엘록사틴(Eloxatin), 아드리아마이신(Adriamycin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine) 및 카보플라틴(carboplatin) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조합물.
  101. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제가 제1 항체와는 상이한 추가의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 조합물.
  102. 제101항에 있어서, 추가의 항-EGFR 항체가 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 및 이의 항원-결합 단편 또는 이의 변이체 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조합물.
  103. 하나 이상의 용기 내에, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제51항 내지 제90항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 제98항 내지 제102항 중 어느 한 항의 조합물; 및
    사용을 위한 지침서를 포함하는 키트.
  104. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제51항 내지 제90항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트; 및
    약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  105. 제104항에 있어서, 겔, 연고, 액체, 용액, 현탁액, 에어로졸, 정제, 환제(pill), 산제(powder) 또는 동결건조제로 제형화된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 전신적, 국소적(topical), 경구, 점막, 비강내, 피하(subcutaneous), 에어로졸화, 정맥내, 기관지, 폐, 질, 외음질(vulvovaginal), 식도(esophageal), 또는 구강식도 투여용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  107. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 투여량 투여용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  108. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 투여량 투여용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  109. 제104항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 서방성 제형인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  110. 제104항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산, 아미노산 유도체, 아민, 당, 폴리올, 염 및 계면활성제 중에서 선택되는 안정화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  111. 제110항에 있어서, 안정화제가 글리세롤, 소르비톨, 만니톨, 이노시톨, 수크로스 및 트레할로스(trehalose) 중에서 선택되는 당 또는 폴리올인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  112. 제110항 또는 제111항에 있어서, 안정화제가 수크로스 또는 트레할로스인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  113. 제111항 또는 제112항에 있어서, 당 또는 폴리올의 농도가, 각 경계값을 포함하여, 약 100 mM 내지 500 mM, 100 mM 내지 400 mM, 100 mM 내지 300 mM, 100 mM 내지 200 mM, 200 mM 내지 500 mM, 200 mM 내지 400 mM, 200 mM 내지 300 mM, 250 mM 내지 500 mM, 250 mM 내지 400 mM, 250 mM 내지 300 mM, 300 mM 내지 500 mM, 300 mM 내지 400 mM, 또는 400 mM 내지 500 mM인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  114. 제110항에 있어서, 안정화제가 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 폴록사머 및 폴리소르베이트 중에서 선택되는 계면활성제인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  115. 제114항에 있어서, 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  116. 제114항 또는 제115항에 있어서, 계면활성제의 농도가 제형 중 질량 농도(w/v)의 백분율(%)로서, 각 경계값을 포함하여, 약 0.005% 내지 1.0%, 0.01% 내지 0.5%, 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 또는 0.01% 내지 0.02%인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  117. 제114항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 80인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  118. 제104항 내지 제117항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 약제학적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태를 치료하는 방법.
  119. 제118항에 있어서, 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태가 종양, 암 또는 전이(metastasis)인 것을 특징으로 하는 방법.
  120. 제119항에 있어서, 종양이 EGFR을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 종양이 고형 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  122. 제118항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태가 두경부암, 비-소세포 폐암 또는 대장암(colorectal cancer)인 것을 특징으로 하는 방법.
  123. 제118항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태가 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
  124. 제118항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 항-EGFR 치료에 저항성(resistance)을 부여하는 마커를 포함하지 않는 종양을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  125. 제124항에 있어서, 마커가 KRAS, NRAS 또는 BRAF 내 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
  126. 제118항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 KRAS 돌연변이-음성 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)-발현 대장암을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  127. 제118항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
  128. 제118항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  129. 제118항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이 국소적(topically), 비경구적, 국부적(locally), 또는 전신적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  130. 제118항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이, 비강내, 근육내, 진피내, 복강내, 정맥내, 피하적, 경구적, 또는 폐 투여에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  131. 제118항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항암제 또는 항암 치료의 투여를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  132. 제131항에 있어서, 항암제 또는 항암 치료가 이리노테칸(irinotecan), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 5-플루오로우라실(5-FU), 젤로다(Xeloda), 캠토사(Camptosar), 엘록사틴(Eloxatin), 아드리아마이신(Adriamycin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine), 카보플라틴(carboplatin) 및 방사선 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  133. 제118항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  134. 제133항에 있어서, 하나 이상의 추가의 항-EGFR 항체가 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 및 이의 항원-결합 단편 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  135. 제131항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물 및 항암제가 단일 조성물 또는 별개의 조성물로 제형화된 것을 특징으로 하는 방법.
  136. 제131항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물 및 항암제가 순차적으로, 동시에 또는 간헐적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  137. 제118항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 약 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 0.5 mg/kg 내지 50 mg/kg, 5 mg/kg 내지 50 mg/kg, 1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 10 mg/kg 내지 80 mg/kg, 또는 50 mg/kg 내지 100 mg/kg의 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  138. 제118항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 약 0.01 mg/m2 내지 약 800 mg/m2의 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  139. 제118항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 적어도 또는 적어도 약 또는 약 0.01 mg/m2, 0.1 mg/m2, 0.5 mg/m2, 1 mg/m2, 5 mg/m2, 10 mg/m2, 15 mg/m2, 20 mg/m2, 25 mg/m2, 30 mg/m2, 35 mg/m2, 40 mg/m2, 45 mg/m2, 50 mg/m2, 100 mg/m2, 150 mg/m2, 200 mg/m2, 250 mg/m2, 300 mg/m2, 400 mg/ m2, 500 mg/ m2, 600 mg/ m2 또는 700 mg/ m2의 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  140. 제104항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태를 치료하기 위한 것인 약제학적 조성물.
  141. 대상체에서 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태를 치료하기 위한 약제의 제형(formulation)을 위한, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 또는 제51항 내지 제90항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트의 용도.
  142. 대상체에서 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태를 치료하기 위한, 제114항 내지 제117항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도.
  143. 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태가 종양, 암 또는 전이인 것을 특징으로 하는, 제140항의 약제학적 조성물 또는 제141항 또는 제142항의 용도.
  144. 제143항에 있어서, 종양이 EGFR을 발현하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물 또는 용도.
  145. 제143항 또는 제144항에 있어서, 종양이 고형 종양인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물 또는 용도.
  146. 제140항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태가 두경부암, 비-소세포 폐암 또는 대장암(colorectal cancer)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물 또는 용도.
  147. 제140항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFR 항체를 이용한 치료에 반응성인 상태가 유방암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물 또는 용도.
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