KR20130096731A - 조건부 활성 치료적 단백질을 평가，확인 또는 진화시키는 방법 - Google Patents

조건부 활성 치료적 단백질을 평가，확인 또는 진화시키는 방법 Download PDF

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랄리타 코단다파니
루이스 하워드 북바인더
그레고리 이안 프로스트
필립 리 셰리단
해롤드 마이클 셰퍼드
게 웨이
레이 황
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Abstract

감소된 유해 부작용을 갖는 치료적 단백질을 진화시키거나 선택하는 방법 및 그 결과인 단백질들이 제공된다. 예를 들어, 본원에서 한 in vivo 환경 내에서 다른 in vivo 환경과 비교하여 더 나은 활성을 나타내는 조건부 활성 치료적 단백질을 확인하기 위한 in vitro 분석이 제공된다. 상기 방법들은 a) 정상 또는 증가된 활성이 희망되는 조건 하에서 활성을 시험하는 단계; b) 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건 하에서 단백질의 활성을 시험하는 단계; 및 c) a)단계에서의 활성을 b)단계에서의 활성과 비교하는 단계; 및 b)단계에서보다 a)단계에서 더 큰 활성을 갖는 단백질을 선택/확인하는 단계를 포함한다. 상기 선택/확인된 단백질은 조건부 활성 단백질이다.

Description

조건부 활성 치료적 단백질을 평가，확인 또는 진화시키는 방법{METHODS FOR ASSESSING AND IDENTIFYING OR EVOLVING CONDITIONALLY ACTIVE THERAPEUTIC PROTEINS}
감소된 유해 부작용을 갖는 치료적 단백질을 진화 또는 선택하는 방법 및 최종적인 단백질들이 제공된다.
단백질들은 암, 혈우병, 빈혈 및 당뇨병과 같은 넓은 범위의 인간 질환의 치료를 위한 약학적 또는 치료적 제제로서 역할을 하며, 수많은 질병들에 대해서 유일하게 효과적인 치료제이다. 따라서, 변형된 또는 개선된 활성 또는 특성들을 가지는 단백질 치료제들을 확인할 필요가 있다. 이러한 단백질들을 확인 또는 생산하기 위한 방법을 제공하는 것이 본원의 목적이다.
관련 출원
우선권의 이익은 Lalitha Kodandapani, Philip Lee Sheridan, Harold Michael Shepard, Louis H. Bookbinder 및 Gregory I. Frost의 "조건부 활성 치료적 단백질을 평가, 확인 또는 진화시키는 방법 및 조건부 활성 치료적 단백질"이라는 제목의 2010. 9. 8.일자에 제출된 미국 가출원 61/402,979호에 대해 주장된다.
요약
조건부 활성 단백질들을 확인/선택하는 방법이 제공된다. 상기 방법에서, 단백질의 활성은 정상 또는 증가된 활성이 희망되는 조건 하에서 시험되고, 단백질의 활성은 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건 하에서 시험된다. 정상 또는 증가된 활성이 희망되는 조건 하에서의 단백질의 활성은 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건 하에서의 단백질의 활성과 비교될 수 있다. 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건과 비교하여 정상 또는 증가된 활성이 희망되는 조건 하에서 더 큰 활성을 갖는 단백질들이 선택되고/선택되거나 확인될 수 있다.
상기 방법에서, 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건 하의 단백질의 활성은 정상에 비교하여 감소될 수 있다. 상기 방법에서, 정상 또는 증가된 활성이 희망되는 조건 및 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건은, 단백질이 조건부 활성이 되도록 하는 조건 또는 조건들을 제외하면, 동일할 수 있다. 본원의 방법에서, 시험되는 활성은 단백질의 표적에 대한 결합일 수 있다. 상기 표적은 고체 지지체상에 부동화될 수 있다. 본원의 방법에서, 결합은 면역분석에 의해 평가될 수 있다. 면역분석들은 ELISA 면역분석, 이질성 면역분석 및 동질성 면역분석을 포함한다.
본원의 방법에서, 단백질의 정상 또는 증가된 활성이 희망되는 조건은 병적 미세환경을 시뮬레이션할 수 있고, 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건은 건강 조직 환경을 시뮬레이션할 수 있다. 건강 조직 환경의 예는 비-종양 조직 환경, 예컨대 전신적 환경 또는 건강 조직이다. 건강 조직의 예는 GI관, 피부, 맥관계, 혈액, 및 세포외 기질이다. 병적 미세환경의 예는 종양 미세환경이다. 종양 또는 병적 미세환경은 중성 pH보다 더 낮은 pH 또는 건강 조직 미세환경보다 더 낮은 pH를 가질 수 있다. 종양 또는 병적 미세환경은 증가된 혈관신생, 저산소증, 저하된 pH, 증가된 간질액압, 종양 또는 기타 질환을 나타내는 변형된 대사체 또는 대사 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양 또는 기타 병적 미세환경은 건강 미세환경과 비교하여 상승된 젖산염 농도 및/또는 증가된 피루브산염을 가질 수 있다.
또한 단백질의 정상 또는 증가된 활성이 희망되는 조건은 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건과 비교하여 중성 pH보다 더 낮은 pH 및 상승된 젖산을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
본원의 방법에서, 시험되는 단백질은 건강 조직에서의 바람직하지 않은 부작용을 나타내는 단백질 및/또는 치료적 단백질일 수 있다. 본원의 방법에서, 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건 하에서 단백질의 활성을 감소시키는 것은 바람직하지 않은 부작용을 개선 또는 예방할 수 있다.
본원의 방법에서, 단백질의 활성은 인간 혈청의 존재하에서 시험될 수 있다. 인간 혈청은 생리적 조건을 시뮬레이션한 양으로 존재할 수 있으며, 정상 또는 증가된 활성이 희망되는 조건 하에 존재하는 혈청의 양은 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건 하에 존재하는 혈청의 양과 동일할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법은 인간 혈청을 부피의 약 25%(플러스 또는 마이너스 10%)를 포함해서, 인간 혈청을 부피의 적어도 약 3 %-30 %, 포함, 또는 5%-30%, 포함, 또는 5%-25%, 포함, 10%-30 %, 포함, 또는 15%-30%, 포함, 또는 15%-25%, 포함하는 존재하에서 수행될 수 있다.
본원에서 제공되는 방법에서, 복수의 단백질들이 정상 또는 증가된 활성이 희망되는 조건 하 및 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건 하에서 시험될 수 있다. 이 특정한 방법에서, 각 단백질은 양 조건 하에서 시험되며, 정상과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 조건 하에서보다 정상 또는 증가된 활성이 희망되는 조건 하에서 더 큰 활성을 갖는 임의의 단백질들이 선택될 수 있다. 일부 예에서, 상기 활성은 미리 결정된 양 또는 비율 만큼 더 크다. 예를 들어, 상기 활성은 적어도 약 5%, 10%, 15% , 20%, 25%, 35%, 50%, 100%, 2 배, 5 배, 10 배, 20 배 또는 그 이상 만큼 증가된다.
본원에서 제공되는 방법에서, 표적 단백질은 리간드에 결합하는 수용체 또는 이의 부분일 수 있다. 표적 단백질의 예는 종양 항원인 수용체이다. 예를 들어, 표적 단백질은 수용체의 Her 패밀리의 일원이거나 표적 단백질은 EGFR 수용체 또는 이의 세포외 도메인이다. 본원에서 제공되는 방법에서, 상기 활성이 시험되는 단백질(시험되는 단백질)은 종양 또는 기타 질환을 치료하는 치료적 단백질일 수 있다. 일부 예에서, 치료적 단백질은 항체, 효소, 호르몬, 사이토카인 또는 이의 활성 부분이고, 본원에서 항체에 대한 언급은 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 지칭한다. 본원에서 제공되는 방법의 다른 예에서, 단백질은 치료적 단백질의 변형된 변이체일 수 있다. 치료적 단백질의 예는 표적 수용체에 대한 리간드이다. 본원에서 제공되는 방법의 일부 예에서, 단백질은 다량체화 도메인, 예컨대, 예를 들어 Fc 도메인 또는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 다량체화 도메인을 포함한다. 예시적인 방법에서, 치료적 단백질은 항체, 효소, 호르몬 또는 사이토카인이다. 예를 들어, 치료적 단백질은 항체이다.
본원에서 제공되는 방법에서, 상기 방법에서 시험되는 단백질은 표 5 (예시적인 항-종양 항체를 열거한 상세한 설명의 표들)에 열거된 것 중으로부터 선택된, 항-종양 항체일 수 있다. 일부 예에서, 상기 항-종양 항체는 건강 조직에서 바람직하지 않은 부작용을 나타낸다. 예를 들어, 항체는 건강 조직에서 바람직하지 않은 부작용을 나타내는 항-EGFR 항체 또는 항-CTLA4 항체이다.
본원에서 제공되는 방법의 다른 예에서, 단백질은 치료적 단백질의 변형된 변이체일 수 있다. 상기 변형된 변이체는 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 변이체의 콜렉션이 시험된다. 일부 예에서, 각 변이체는 야생형 또는 변형되지 않은 단백질 및 단일 아미노산에 의한 모든 다른 변이체와 상이하다. 다른 예에서, 각 변이체는 변형되지 않은 또는 야생형 단백질로부터 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 다른 아미노산을 포함한다. 본원에서 제공되는 방법에서, 변이체의 콜렉션에서, 각 변화되는 위치에서의 아미노산은 원래 아미노산보다 1-19 다른 아미노산까지에 의해 치환된다(replaced by up to 1-19 amino acids other than the original amino acid). 다른 예에서, 히스티딘이 치환 아미노산이거나 상기 단백질 내의 히스티딘들이 비-염기 또는 비-대전된 아미노산에 의해 치환된다. 각 변이체 단백질은 개별적으로 시험될 수 있다. 예를 들어, 각 변이체 단백질은 고처리량 포맷 또는 자동화된 방법에서 시험될 수 있다.
본원에서 제공되는 방법에서, 선택되는 단백질은 비-종양 미세환경과 비교하여 종양 또는 다른 병적 미세환경에서 더 큰 활성을 가지도록 조건부 활성일 수 있다. 본원에서 제공되는 방법은 복수 회 반복될 수 있는데, 각 반복에서, 선택된 단백질 또는 단백질들의 추가적인 변이체가 시험되고, 이에 의해 상기 치료적 단백질은 감소된 독성 또는 유해 부작용을 나타내도록 진화된다. 본원에서 제공되는 방법에서, 변이체 단백질들은 변이체 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로부터의 발현에 의해 생산될 수 있다.
본원에서 제공되는 방법의 일부 예에서, 시험되는 단백질이 CDR 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 항체이다. 특정 예에서, 단백질의 길이를 따라 모든 아미노산, 또는 이의 선택된 부분이, 하나씩 19 다른 아미노산으로 치환된다. 다른 예에서, 상기 단백질은 항체이고 상기 선택된 부분은 CDR이다.
일 예에서, 상기 치료적 단백질은 항-EGFR 항체이고 상기 감소된 유해 부작용은 항체에 대한 전신적 노출과 관련된 감소된 피부 독성이다. 본원에서 제공하는 방법의 일부 예에서, 상기 종양 또는 다른 병적 미세환경의 pH는 약 5.8-6.8을 포함한다. 다른 예에서, 상기 선택된 단백질은 7.3-7.4의 정상 생리적 pH 및 12 mM 아래의 정상 젖산염 농도와 비교하여 5.8-6.8의 감소된 pH 및 약 12-20 mM의 젖산염 농도의 종양 미세환경 내에서 EGFR에 우선적으로 결합하는 항-EGFR 항체이다.
본원에서 조건부 활성인 단백질을 확인하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 EGFR 또는 EGFR ECD로 코팅된 고체 지지체를 약 1 mM 젖산 및 약 25%의 인간 혈청을 포함하는 약 pH 7.3-7.4의 완충액과 접촉하는 단계; 제 2 듀플리케이트(duplicate) 고체 지지체를 12-20 mM, 예컨대 16.6 mM 젖산 및 약 25% 인간 혈청을 포함하는 약 pH 6의 완충액과 접촉하는 단계; 상기 지지체들을 상기에 상응하는 완충액 (pH 6.0 또는 pH 7.4)로 세척하는 단계; 태그된 항-EGFR, 예컨대 FLAG 태그된, 표준을 젖산과 인간 혈청을 포함하는 pH 7.4 완충액 내, 또는 젖산과 인간 혈청을 포함하는 pH 6.0 완충액 내에서 상기 상응하는 지지체에 결합시키는 단계; 및 항-EGFR의 각 지지체에 대한 결합을 검출 또는 정량화하기 위해, 항-EGFR의 EGFR에 대한 결합을 상기 상응하는 완충액 및 효소 기질 내에서 염소-항-Tag-효소, 예컨대 겨자무과산화수소(horse radish peroxidase)를 첨가함으로써 검출하는 단계에 의해 수행된다.
또한 본원에서 본원에서 제공하는 임의의 방법에 의해 선택/확인된 또는 진화된 치료적 단백질이 제공된다. 또한 본원에서 변형되지 않은 항체와 비교하여 감소된 피부 독성을 나타내는 변이체 항-종양 항체가 제공된다. 또한 본원에서 얼비툭스와 비교하여 감소된 피부 독성을 나타내는 항-EGFR 항체가 제공된다.
종양을 치료하고 중성 pH 에서보다 더 낮은 pH에서 더 활성인 치료적 단백질을 확인/선택하는 방법이 제공된다. 상기 방법에서, 단백질의 활성은 낮은 pH를 포함하는 조건 하에서 시험되고, 상기 단백질의 활성은 중성 pH를 포함하는 조건 하에서 시험된다. 낮은 pH를 포함하는 조건 하에서의 단백질의 활성은 중성 pH를 포함하는 조건 하에서의 단백질의 활성과 비교될 수 있다. 낮은 pH에서 높은 pH에서보다 더 활성인 단백질이 선택되고/선택되거나 확인될 수 있다. 낮은 pH는 7.4 미만의 임의의 pH, 예컨대 약 5.8 내지 6.8 사이일 수 있다. 중성 pH는 약 7.2 내지 7.6 사이, 예컨대 7.4일 수 있다.
상기 방법에서, 낮은 pH를 포함하는 조건은 증가된 젖산염 농도, 증가된 피루브산염 농도 및 저산소증 중으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 조건을 포함할 수 있다. 예를 들어, 낮은 pH를 포함하는 조건은 10 mM 내지 20 mM 젖산 또는 15 mM 내지 18 mM 젖산; 또는 적어도 약 16 mM, 16.5 mM 또는 17 mM 젖산 중으로부터 선택된 증가된 젖산염 농도를 포함할 수 있다. 상기 방법에서, 중성 pH를 포함하는 조건은 0.5 내지 5 mM 또는 0.2 mM 내지 4 mM 젖산; 또는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 mM 젖산 중으로부터 선택된 젖산염 농도를 포함할 수 있다.
또한 본원에서 비-종양 미세환경에서보다 종양 미세환경에서 더 활성인 치료적 단백질을 확인/선택하는 방법이 제공된다. 상기 방법에서, 단백질의 활성은 활성이 희망되는 종양 미세환경에는 존재하지만 비-종양 미세환경에는 존재하지 않는 조건 하에서 시험되고, 상기 단백질의 활성은 비-종양 미세환경에 존재하는 조건 하에서 시험된다. 종양 미세환경에 존재하는 조건 하에서의 단백질의 활성은 비-종양 미세환경에 존재하는 조건 하에서의 단백질의 활성과 비교될 수 있다. 비-종양 미세환경에 존재하는 조건 하에서와 비교하여 종양 미세환경에 존재하는 조건 하에서 더 큰 활성을 갖는 단백질이 선택되고/선택되거나 확인될 수 있으며, 이에 의해 비-종양 미세환경에서보다 종양 미세환경에서 더 활성인 단백질을 확인한다. 비-종양 미세환경은 전신적 미세환경 및/또는 건강 조직, 예컨대 위장관(GI tract), 피부, 맥관계, 혈액 또는 세포외 기질일 수 있다.
낮은 pH를 포함하는 조건 하 및 중성 pH를 포함하는 조건 하에서의 단백질의 활성의 시험은 종양 미세환경에는 존재하나 비-종양 미세환경에는 존재하지 않는 조건 또는 조건들을 제외하면, 동일한 조건 하에서 수행될 수 있다. 종양 미세환경에 존재하는 조건의 예는 증가된 혈관신생, 저산소증, 저하된 pH, 증가된 젖산염 농도, 증가된 피루브산염 농도, 증가된 간질액압 및 종양을 나타내는 변경된 대사체 또는 대사와 같은 하나 또는 그 이상의 특성을 포함한다.
종양 미세환경에 존재하는 조건은 중성 pH보다 더 낮은 pH 또는 비-종양 미세환경보다 더 낮은 pH를 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양 미세환경에 존재하는 조건은 7.4 아래의 pH일 수 있다. 일부 예에서, 종양의 pH는 약 5.8-6.8 사이를 포함하고, 종양 미세환경에 존재하는 조건은 약 5.8 내지 6.8 사이의 pH이다. 상기 종양 미세환경에 존재하는 조건은 비-종양 미세환경에 존재하는 조건과 비교하여 상승된 젖산염 농도 및/또는 증가된 피루브산염을 포함할 수 있다.
단백질이 시험되는, 활성이 희망되는 종양 미세환경에는 존재하나 비-종양 환경에는 존재하지 않는 조건은, 단백질이 시험되는 비-종양 미세환경에 존재하는 조건을 포함하는 조건과 비교하여 중성 pH보다 더 낮은 pH 및 상승된 젖산 농도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중성 pH보다 더 낮은 pH는 5.8 내지 6.8 사이, 또는 5.8 내지 6.5 사이를 포함할 수 있다. 상기 단백질이 시험되는, 활성이 희망되는 종양 미세환경에는 존재하나 비-종양 미세환경에는 존재하지 않는 조건은 10 mM 내지 20 mM 젖산 또는 15 mM 내지 18 mM 젖산; 또는 적어도 약 16 mM, 16.5 mM 또는 17 mM 젖산 중으로부터 선택된 증가된 젖산염 농도를 포함할 수 있다. 단백질이 시험되는, 비-종양 미세환경에 존재하는 조건은 0.5 내지 5 mM 또는 0.2 mM 내지 4 mM 젖산; 또는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 mM 젖산 중으로부터 선택된 젖산염 농도를 포함할 수 있다. 상기 방법의 일부 예에서, 단백질은 종양을 치료하는 치료적 단백질이다. 일부 예에서, 치료적 단백질은 항체, 효소, 호르몬, 사이토카인 또는 이의 활성 부분이다. 본원에서 본원의 항체에 대한 언급은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 예에서, 치료적 단백질은 표적 수용체에 대한 리간드, 및/또는 항-종양 항체이다.
본원에서 제공되는 방법에 사용하는 항-종양 항체는 세툭시맙(Erbitux®), 트라스투주맙 (Herceptin®), 리툭시맙 (Rituxan®, MabThera®), 베바시주맙 (Avastin®), 알렘투주맙 (Campath®), 파니투무맙 (Vectibix®), 라니비주맙 (Lucentis®), 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄 (Zevalin®), 토시투모맙, 아이오딘 I131 토시투모맙(BEXXAR®), 카투막소맙(Removab®), 겜투주맙, 겜투주맙 오조가미신 (Mylotarg®), 아바타셉트(CTLA4-Ig, Orencia®), 벨라타셉트(L104EA29YIg; LEA29Y; LEA), 이필리무맙 (MDX-010, MDX-101), 트레멜리무맙(ticilimumab, CP-675,206), PRS-010, PRS-050, 아플리베르셉트(VEGF Trap, AVE005), 볼로식시맙(M200), F200, MORAb-009, SS1P (CAT-5001), 식수투무맙(IMC-A12), 마투주맙(EMD72000), 니모투주맙(h-R3), 잘루투무맙(HuMax-EGFR), 네시투무맙 IMC-11F8, mAb806/ch806, Sym004 및 mAb-425을 포함한다. 일부 예에서, 상기 항-종양 항체는 세툭시맙(Erbitux®)이다.
본원에서 제공되는 방법은 in vitro 또는 in vivo로 수행될 수 있다.
상기 제공되는 방법에서, 복수의 단백질들이 시험될 수 있고, 중성 pH와 비교하여 낮은 pH에서 더 큰 활성을 갖는 단백질들이 선택될 수 있다. 상기 제공되는 방법에서, 복수의 단백질들이 시험될 수 있고 비-종양 미세환경보다 종양 미세환경에 존재하는 조건 하에서 더 큰 활성을 갖는 단백질들이 선택될 수 있다. 상기 복수의 단백질들은 치료적 단백질의 변형된 변이체를 포함할 수 있고, 변이체의 콜렉션이 시험될 수 있다.
치료적 단백질은 다량체화 도메인을 포함할 수 있고, 상기 다량체화 도메인은 Fc 도메인 또는 변형된 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 치료적 단백질은 항체(항-종양 항체 포함), 효소, 호르몬 또는 사이토카인일 수 있다. 상기 제공되는 방법에서, 항-종양 항체는 세툭시맙(Erbitux®), 트라스투주맙 (Herceptin®), 리툭시맙 (Rituxan®, MabThera®), 베바시주맙 (Avastin®), 알렘투주맙 (Campath®), 파니투무맙 (Vectibix®), 라니비주맙 (Lucentis®), 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄 (Zevalin®), 토시투모맙, 아이오딘 I131 토시투모맙(BEXXAR®), 카투막소맙(Removab®), 겜투주맙, 겜투주맙 오조가미신 (Mylotarg®), 아바타셉트(CTLA4-Ig, Orencia®), 벨라타셉트(L104EA29YIg; LEA29Y; LEA), 이필리무맙 (MDX-010, MDX-101), 트레멜리무맙(ticilimumab, CP-675,206), PRS-010, PRS-050, 아플리베르셉트(VEGF Trap, AVE005), 볼로식시맙(M200), F200, MORAb-009, SS1P (CAT-5001), 식수투무맙(IMC-A12), 마투주맙(EMD72000), 니모투주맙(h-R3), 잘루투무맙(HuMax-EGFR), 네시투무맙 IMC-11F8, mAb806/ch806, Sym004 및 mAb-425 중으로부터 선택될 수 있다.
치료적 단백질 또는 복수의 치료적 단백질들의 변형된 변이체는 치료적 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여 아미노산 잔기 또는 잔기들의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 각 변이체 단백질은 치료적 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여 단일 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 각 변이체 단백질은 치료적 항체와 같은 변이체 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 시험되는 단백질은 항체의 변형되지 않은 형태와 비교하여 상보성 결정 영역(CDR) 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 항체이다.
제공되는 방법에서, 각 변화되는 위치에서의 아미노산은 상기 위치에서의 원래 아미노산보다 1-19 다른 아미노산까지로의 치환을 포함하는 치료적 단백질의 변이체가 시험될 수 있고, 치료적 단백질의 길이를 따라 모든 아미노산, 또는 이의 선택된 부분이 치환될 수 있다. 변형된 단백질이 항체이고 변형된 선택된 부분은 CDR인 방법이 제공된다.
치환 아미노산이 상기 치료적 단백질의 상응하는 위치의 아미노산과 상이하다는 것을 전제로, 상기 치환 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val 중으로부터 선택될 수 있다. 치환 아미노산의 일 예는 히스티딘이다. 일부 예에서, 단백질 내의 상기 히스티딘은 비-염기 또는 비-대전된 아미노산에 의해 치환된다. 일부 방법에서, 변형은 Arg, Asp, Glu, His 및 Lys 중으로부터 선택된 아미노산과의 아미노산 치환, 일부 예에서, His로의 치환을 포함한다.
제공되는 방법에서, 각 변이체 단백질, 예컨대 콜렉션 내의 변이체 단백질은 개별적으로, 예컨대, 예를 들어 어드레서블(addressible) 어레이(array)를 포함하는 어레이에서, 시험될 수 있다.
제공되는 방법에서, 시험되는 활성은 치료적 단백질의 표적 단백질에 대한 결합일 수 있다. 결합은 면역분석, 예컨대, 예를 들어 ELISA에 의해 평가될 수 있다. 면역분석의 예는 고체 지지체상의 표적 단백질을 부동화하는 단계; 치료적 단백질을 표적 단백질과 접촉시키는 단계로서, 여기에서 상기 치료적 단백질은 검출가능하게 표지된 것인 단계; 결합하지 않은 치료적 단백질을 제거하는 단계; 및 표적 단백질에 대한 표지된 치료적 단백질의 결합을 검출 또는 측정하는 단계를 포함할 수 있는 이질성 면역분석이다. 상기 면역분석은 치료적 단백질을 표적 단백질과 접촉시키는 단계로서, 여기에서 상기 치료적 단백질은 검출가능하게 표지된 것인 단계; 및 상기 표지된 치료적 단백질의 표적 단백질에 대한 결합을 검출 또는 측정하는 단계를 포함하는, 동질성일 수 있다.
결합 활성이 표면 상에 치료적 단백질을 발현하는 세포 또는 세포들을 포함하는 세포 표면 발현 시스템을 사용하여 평가되는 방법이 제공된다. 치료적 단백질은 세포의 표면상에 발현될 수 있으며, 표적 단백질은 세포의 집단과 접촉될 수 있고; 상기 표적 단백질에 결합하는 세포 또는 세포들은 상기 표적 단백질에 결합이 확인될 수 있고, 이에 의해 결합 활성을 나타내는 치료적 단백질을 확인한다. 상기 표적 단백질은 검출가능하게 표지되거나 검출될 수 있다. 표적 단백질은 형광으로 표지되거나 형광으로 표지된 2차 시약에 의해 검출될 수 있다.
결합은 형광 활성 세포 분류(FACS)에 의해 검출되거나 측정될 수 있다.
결합 활성은 치료적 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 세포 표면 발현 시스템을 사용한 방법에서 시험될 수 있고, 표적 단백질에 결합하는 세포 또는 세포들이 선택될 수 있고 표적 단백질에 결합하지 않는 세포 또는 세포들이 선택될 수 있다. 상기 표적 단백질에 결합하지 않는 선택된 세포 또는 세포들은 분리되고 세포 배양 배지에서 성장되어 표면상에 치료적 단백질을 발현하는 세포의 제 2 집단을 생성할 수 있다. 일부 예에서 결합 활성은 세포들의 제 2 집단으로부터의 세포들이 표적 단백질에 접촉되고, 표적 단백질에 결합하는 세포 또는 세포들이 확인된다.
도 1은 단일클론항체 얼비툭스®(Erbitux®)의 서열이다. 도 1은 얼비툭스®의 서열을 나타낸다(서열번호 1 및 2). 도 1A는 중쇄의 서열을 나타낸다. 도 1B는 경쇄의 서열을 나타낸다. 가변쇄들은 밑줄로 표시하였으며 변형을 위해 선택된 잔기들은 볼드체와 이탤릭 체로 표시하였다.
개요
A. 정의
B. 방법의 개관(OVERVIEW)
C. In Vitro 생리적 민감도 방법(PHYSIOLOGIC SENSITIVE METHOD)
1. 표적 단백질 포함 지지체(Support Containing Target Protein)
2. 시뮬레이션된 결합 상태 하에서의 결합 생체분자 접촉
a. 변이체 단백질의 생산
b. 항체 변이체
예시적인 항체 결합 분자: 항-EGFR 항체
3. 종양-특이적 결합 분자의 검출 및 확인
D. 단백질 발현 방법
1. 벡터
2. 세포 및 발현 시스템
a. 원핵 발현
b. 효모
c. 곤충
d. 포유류 세포
e. 식물
3. 정제
E. 실시예
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 발명(들)이 속한 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원 전체 기술을 통해 언급된 모든 특허들, 특허 출원들, 공개된 출원들 및 출판물, Genbank 서열들, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 공개된 자료들(materials)은 달리 언급되지 않는한, 그의 전체가 참조로서 포함된다. 본원 용어들에 대한 복수의 정의가 존재하는 경우, 본 섹션에 있는 것이 우선된다. URL 또는 기타 그러한 식별자 또는 주소를 언급한 경우, 이러한 식별자들은 바뀔 수 있고, 인터넷 상의 특정 정보는 변천할 수 있지만, 동등한 정보는 인터넷 검색으로 찾을 수 있는 것으로 이해된다. 그곳에서 참고되는 내용은 상기 정보의 이용가능성 및 공개적 보급성을 입증한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 조건부 활성 단백질(conditionally active protein)은 제 1 환경에서, 특히 제 1 의 in vivo 환경에서, 제 2 환경과 비교하여, 더 활성화된다. 예를 들어, 조건부 활성 단백질은 비-종양 환경 내, 예컨대 피부, 위장관(GI tract) 내의 비-종양 환경 또는 다른 비-종양 환경보다 종양 환경 내에서 더 활성화 될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 치료적(therapeutic) 단백질은 질환(disease) 또는 상태(condition)를 가진 대상 치료를 위한 치료에 사용되어 온 단백질이고, 치료를 위해 사용될 수 있거나 치료를 위한 후보군이다. 예를 들어, 치료를 위한 후보군은 치료를 위해 사용되어 온 치료적 단백질의 변이체(예를 들어, 아미노산 변형을 함유)이다. 본원의 목적을 위하여, 치료에 사용되어 왔으며, 치료를 위해 사용될 수 있는, 치료를 위한 후보군인 단백질을 포함하는 치료적 단백질은 하나의 조건 세트 하에서 다른 조건보다 더 활성을 나타내고, 그러므로 조건부 활성인 치료적 단백질을 확인하기 위한 시험 단백질로서 본원의 방법의 실행(practice)에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "시험 단백질(test protein)", "시험된 단백질(tested protein)", "결합 분자(binding molecule)", "결합 단백질(binding protein)" 또는 그것의 다른 변이체들은 본원 방법에 사용된 분자 또는 단백질을 말한다. 임의의 분자 또는 단백질은 비-병적 미세환경에 존재하는 조건 또는 조건들과 비교하여 병적 미세환경(예를 들어, 종양 미세환경)에 존재하는 조건 또는 조건들 하에서 조건부 활성이고 활성을 나타내는 단백질들을 확인하기 위하여 본원의 방법에 사용될 수 있다. 시험된 단백질들의 예시는 조건부 활성과 같은 치료적 단백질을 진화시키기 위한 치료적 단백질이다. 예시적인 시험된 단백질들은 표 3에 나타내었다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체는, 자연의 또는 부분적으로 또는 전적으로 합성된 항체, 예컨대 재조합적으로 생산되었든 아니든, 적어도 항원 결합 부위를 형성하는데 충분한 면역 글로불린 분자의 가변 영역의 부분을 포함하는 이의 임의의 부분을 포함하는, 면역글로불린 및 면역글로불린 부분들을 말한다. 그러므로, 항체 또는 그것의 부분은 면역글로불린 항원 결합 부위에 대하여 상동성 또는 부분적으로 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 예를 들어, 항체는 두 개의 중쇄(H 및 H'으로 표시될 수 있는) 및 두 개의 경쇄(L 및 L'으로 표시될 수 있는)를 포함하는 항체를 나타내고, 각각의 중쇄는 전장(full-length) 면역 글로불린 중쇄 또는 항원 결합 부위를 형성하는데 충분한 그것의 부분(예를 들어, 중쇄는 VH, 쇄(chains), VH-CH1 쇄 및 VH-CH1-CH2-CH3 쇄를 포함하나 이에 제한되지 않는다)이 될 수 있으며, 각각의 경쇄는 전장 경쇄 또는 항원 결합 부위를 형성하기에 충분한 그것의 부분(예를 들어, 경쇄, VL 쇄 및 VL-CL 쇄를 포함하나 이에 제한되지 않는다)이 될 수 있다. 각각의 중쇄(H 및 H')는 하나의 경쇄(각각 L 및 L')와 짝을 이룬다. 전형적으로, 항체들은 최소한 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL)의 전체 또는 적어도 부분을 포함한다. 항체는 또한 불변 영역(constant region)의 전체 또는 부분을 포함할 수 있다.
본원의 목적을 위하여, 용어 항체는 전장 항체 및 항체 단편을 포함하는 그들의 부분, 예컨대, 이에 한정되지 않으나 Fab, Fab', F(ab')2, 단일 쇄(single-chain)Fvs(scFv), Fv, dsFv, 디아바디(diabody), Fd 및 Fd' 단편, Fab 단편, Fd 단편 및 scFv 단편을 포함한다. 다른 알려진 단편은 이에 한정되지 않으나, scFab 단편(Hust et al., BMC Biotechnology (2007), 7:14)을 포함한다. 항체들은 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 임의의 면역 글로불린 클래스의 일원을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 전장 항체는 두 개의 전장 중쇄(예컨대, VH-CH1-CH2-CH3 또는 VH-CH1-CH2-CH3-CH4) 및 두 개의 전장 경쇄(VL-CL) 및 힌지영역(hinge regions)을 갖는 항체, 예컨대, 항체 분비 B 세포들에 의해서 생산된 인간 항체들 및 합성적으로 생산된 동일한 도메인을 갖는 항체들이다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체의 "이의 부분" 또는 "이의 단편"에 관한 항체 단편 또는 항체 부분은 전장보다 짧으나, 항원 결합 부위(예를 들어, 하나 이상의 CDR들)를 형성하기에 충분한 항체 가변 영역의 부분을 적어도 포함하고, 그러므로 전장 항체의 결합 특이성 및/또는 활성을 유지하는 전장 항체의 임의의 부분을 말한다; 항체 단편은 전장 항체의 효소적 처리에 의해 생산된 항체 유도체뿐만 아니라, 합성적으로 예를 들어, 재조합적으로 생산된 유도체를 포함한다. 항체 단편의 예는 이에 제한되지 않으나, Fab, Fab', F(ab')2, 단일 쇄 Fvs(scFv), Fv, dsFv, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편(예를 들어, Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov 참조)을 포함한다. 단편은 함께 연결된, 예컨대 이황화 가교(disulfide bridges)에 의한, 및/또는 펩티드 링커(linker)에 의한, 다중 사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 일반적으로 적어도 약 50개 아미노산 및 전형적으로 적어도 200개 아미노산을 함유한다.
그러므로, "항체 또는 항원 결합 부위를 형성하기에 충분한 그것의 부분"에 관한 언급은 모든 6 CDR들을 포함하는 상응하는 전장 항체의 결합 특이성의 적어도 일부를 유지하기에 충분한 VH 및 VL의 적어도 1 또는 2, 전형적으로 3, 4, 5 또는 모든 6 CDR들을 포함하는 항체 또는 그들의 부분을 의미한다. 일반적으로, 충분한 항원 결합 부위는 적어도 중쇄의 CDR3(CDRH3)를 요구한다. 전형적으로 경쇄의 CDR3(CDRL3)가 더 요구된다. 본원에 기술한 바와 같이, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자는 kabat 또는 Chothia 넘버링에 기초한 CDR들을 인지하고 있고, 확인할 수 있다(예를 들어, Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th 판, 미국보건복지부(U.S. Department of Health and Human Services), NIH 출판번호 91-3242호, 및 Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, 상보성 결정 영역들(CDR들; 또한 초가변(hypervariable) 영역으로도 불림)들은 특이적 항원에 대한 단백질의 친화도와 특이성을 결정하는 항체 내부의 영역이다. 그러므로, CDR은 항원 결정부위(antigenic determinants)에 결합하는 항체의 가변 영역 내에 제한된 영역이다. 항체의 CDR은 알려져 있거나, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 바와 같이 Kabat 또는 Chothia 넘버링에 기초하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항원 결합 부위"는 하나 이상의 상보성 결정영역들(CDR들; 또한 초가변(hypervariable) 영역으로도 불림)에 의해서 형성되는 경계면(interface)을 나타낸다. 각각의 항원 결합 부위는 중쇄 가변 영역 유래의 세 개의 CDR들과 경쇄 가변 영역 유래의 세 개의 CDR들을 포함한다. 항체 분자는 두 개의 항원 결합 부위(antigen combining sites)를 갖고, 각각은 중쇄 가변 영역의 부분 및 경쇄 가변 영역의 부분을 포함한다. 항원 결합 부위는 CDR들 외에도 가변 영역 도메인의 다른 부분을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fv 항체 단편은 비공유 상호작용에 의해 연결된 하나의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 하나의 가변 경쇄(VL) 도메인으로 구성되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, dsFv란 VH-VL 쌍을 안정화 시키는 조작된 분자간 이황화결합을 갖는 Fv를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fd 단편은 항체 중쇄의 가변 도메인(VH) 및 하나의 불변 영역(CH1)을 포함하는 항체의 단편이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Fab 단편"은 파파인을 통한 전장 면역 글로불린의 소화에 기인한 전장 항체의 부분 또는 합성적으로, 예를 들어 재조합적으로 생산된 동일한 구조를 갖는 단편을 포함하는 항체 단편이다. Fab 단편은 경쇄(VL 및 CL 부분을 포함하는) 및 중쇄(VH)의 가변 도메인을 포함하는 다른 쇄 및 중쇄의 하나의 불변 영역 도메인 부분(CH1)을 포함한다; 이것은 재조합적으로 생산될 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, F(ab')2는 pH 4.0-4.5에서 펩신을 통한 면역글로불린의 소화에 기인한 항체 단편이거나, 합성적으로, 예컨대 재조합적으로 생산된 동일한 구조를 갖는 항체이다. F(ab')2는 두 개의 Fab 단편을 포함하나 여기의 각각의 중쇄 부분은 두 개의 단편들을 연결하는 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하는 추가적인 몇 개의 아미노산을 포함한다; 이것은 재조합적으로 생산될 수도 있다.
Fab' 단편은 F(ab')2 단편의 1/2(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄)을 포함하는 단편이다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fd' 단편은 F(ab')2 단편의 하나의 중쇄 부분을 포함하는 항체의 단편이다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fv' 단편은 항체 분자의 VH 및 VL 도메인만을 포함하는 단편이다.
본원에서 사용된 바와 같이, scFv 단편은 임의의 순서로 폴리펩티드 링커에 의하여 공유적으로 연결된 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체 단편을 말한다. 링커(linker)는 두 개의 가변 도메인들이 실질적인 간섭없이 가교되도록 하는 길이를 말한다. 예시적인 링커는 용해도를 증가시키도록 도처에 분산된 일부 Glu 또는 Lys 잔기를 갖는 (Gly-Ser)n 잔기이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 디아바디들은 이량체 scFv이고; 디아바디들은 전형적으로 scFvs보다 짧은 펩티드 링커를 가지며, 그들은 바람직하게는 이량화된다.
본원에서 사용된 바와 같이, hsFv는 Fab 단편 내에 정상적으로 존재하는 불변 도메인이 헤테로 이량체 코일드-코일 도메인(heterodimeric coiled-coil domain)으로 치환된 항체 단편을 말한다(예를 들면, Arndt et al. (2001) J Mol Biol. 7:312:221-228 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, 항체와 관련하여 "가변 도메인"은 다른 항체들간 다양한 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 특이적 Ig 도메인이다. 각각의 경쇄 및 각각의 중쇄는 하나의 가변 영역 도메인을 갖는다(VL 및 VH). 가변 도메인은 항원 특이성을 제공하고, 그러므로 항원 인식에 책임이 있다. 각각의 가변 영역은 항원 결합 부위 도메인의 일부인 CDR 및 프레임워크 영역들(FR)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 가변 중쇄(VH) 또는 가변 경쇄(VL)(또한 VH 도메인 또는 VL 도메인으로 말함)에 대한 언급은 항체의 가변 도메인을 구성하는 폴리펩티드 쇄를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이 프레임워크(FR)들은 베타시트 내에 위치하는 항체 가변 영역 도메인 내부의 영역이며; FR 영역은, 그들의 아미노산 서열과 관련하여 초가변 영역보다 비교적 더 보존적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 불변 도메인은 가변 영역 도메인보다 항체들 중에서 비교적으로 더 보존된 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 또는 경쇄 내부의 도메인이다. 각각의 경쇄는 단일 경쇄 불변 영역(CL) 도메인을 갖고, 각각의 중쇄는 하나 또는 그 이상의 중쇄 불변 영역(CH) 도메인을 포함하고, 이것은 CH1, CH2, CH3 및 CH4을 포함한다. 전장 IgA, IgD 및 IgG 아형(isotypes)은 CH1, CH2, CH3 및 힌지 영역을 포함하는 반면, IgE 및 IgM은 CH1, CH2, CH3 및 CH4을 포함한다. CH1 및 CL 도메인은 항체 분자의 Fab 팔로 연장되므로 항원과 항체 팔 회전의 상호작용에 기여한다. 항체 불변 영역은 이펙터(effector) 기능, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 항체가 특이적으로, 예를 들어 다양한 세포들, 생체분자들 및 조직들간의 상호작용을 통하여 결합하여 항원, 병원체 및 독소의 제거를 제공할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 형태는 항체의 특정 구조를 말한다. 본원의 항체들은 전장 항체 및 그들의 부분 예컨대, 예를 들어, Fab 단편 또는 다른 항체 단편과 같은 부분을 포함한다. 그러므로, Fab는 항체의 특정 형태이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 "상응 형태(corresponding form)"에 관한 언급은 두 개의 항체의 특성 또는 활성을 비교할 때, 동일한 형태의 항체를 사용하여 특성이 비교되는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체가 제 1 항체의 상응하는 형태의 활성과 비교하여 적은 활성을 갖는다고 언급된다면, 특정 형태, 예컨대 그 항체의 Fab가 제 1 항체의 Fab 형태와 비교하여 적은 활성을 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상응하는 잔기와 관련한 상응, 예를 들면, "상응하는 아미노산 잔기"는 연관된 서열인(예를 들어, 대립형질 변이체, 동일 과(family)의 유전자, 종 변이체) 두 개의 폴리펩티드 사이 또는 폴리펩티드들 간 비교되는 잔기를 말한다. 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자는 폴리펩티드 사이 또는 폴리펩티드 간 상응하는 잔기들을 쉽게 확인할 수 있다. 예를 들어, 두 개 서열의 배열에 의하여, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자는 보존된 및 동일한 아미노산을 가이드로 사용하여 상응하는 잔기들을 확인할 수 있다. 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자는 수동으로 서열을 배열시킬 수 있거나, 또는 임의의 이용가능한 많은 수의 배열 프로그램(예를 들어, BLAST)을 사용할 수 있다. 그러므로, 서로 상응하는 아미노산 잔기 또는 위치는 특정 기준 폴리펩티드를 이용한 서열 및/또는 구조적 배열에 기초하여 서로 상응하도록 결정된 그들의 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같이, "링커" 또는 "스페이서" 펩티드는 두 개의 폴리펩티드 서열들(또는 이러한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산)을 연결시키는 짧은 아미노산 서열을 말한다. "펩티드 링커"는 두 개의 폴리펩티드 서열들을 연결시키는 짧은 아미노산 서열을 말한다. 폴리펩티드 링커의 예시는 펩티드 전달 도메인을 항체에 연결하는 링커 또는 2개의 항체 쇄를 합성 항체 단편, 예컨대 scFv 단편 내에 결합하는 링커이다. 링커들은 잘 알려져 있고, 임의의 알려진 링커들은 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 폴리펩티드 링커의 예는 용해도를 증가시키도록 도처에 분산된 일부 Glu 또는 Lys 잔기를 갖는 (Gly-Ser)n 아미노산 서열이다. 다른 예시적 링커들은 본원에 기술된다; 임의의 이들 및 다른 알려진 링커들이 상기 제공된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인간 혈청"은 수혈에 의해 감염될 수 있는 임의의 질환이 없는 사람으로부터의 응고된 전체 혈액의 액체 부분의 거의 동등한 양을 모음(pooling)으로써 수득될 수 있는 정상 혈청을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "검출가능한(detectable)" 또는 "검출가능하게 표지된(detectably labeled)"에 대한 언급은 원자, 분자 또는 조성물을 말하며,여기서 상기 원자, 분자 또는 조성물의 존재는 직접적으로 또는 간접적으로 측정될 수 있다. 검출가능한 표지들은 본원에서 제공되는 방법에서 하나 또는 그 이상의 단백질을 확인하는데 사용될 수 있다. 검출가능한 표지들은 본원에서 제공되는 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 검출가능한 표지들은 예를 들어, 화학발광 모이어티, 생체발광 모이어티, 형광 모이어티, 방사선 핵종, 및 금속을 포함한다. 표지를 검출하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 표지는 예를 들어, 시각적 조사에 의해, 형광분광(학)에 의해, 반사율 측정에 의해, 그리고 유동 세포 계수법(flow cytometry)에 의해 검출될 수 있다. 간접적인 검출은 검출가능한 표지에 직접적 또는 간접적으로 결합하는 원자, 분자 또는 조성물의 물리적 현상, 예컨대 검출가능한 표지에 직접적 또는 간접적으로 결합하는 원자, 분자 또는 조성물의 에너지 또는 입자 방출 또는 흡수와 같은 것을 측정하는 것을 말한다. 제한되지 않는 간접적 검출의 예에서, 검출가능한 표지는 비오틴이 될 수 있고, 이는 아비딘에 대한 결합에 의해서 검출될 수 있다. 그러므로, 검출가능한 표지 또는 검출가능한 모이어티의 범위 내에 포함되는 것은 검출가능한 표지 또는 결합가능한 모이어티이고, 이는 원자, 분자 또는 조성물을 말하며, 상기 원자, 분자 또는 조성물의 존재는 다른 원자, 분자 또는 조성물에 결합하는 표지 또는 모이어티의 결과에 의해서 검출될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 표지는 분자 또는 이들과 관련있는 것에 직접적 또는 간접적으로 부착 또는 연결될 수 있는 검출가능한 마커이다. 검출 방법은 본 분야에 잘 알려진 임의의 방법이 될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "스크리닝"은 활성 또는 특성의 결정에 기초하여 단백질, 예컨대 복수의 항체, 예컨대 항체 및/또는 이의 부분의 콜렉션(collection) 또는 라이브러리(library)로부터 항체 또는 이의 부분의 확인 또는 선택을 말한다. 스크리닝은 임의의 다양한 방법으로 수행될 수 있고, 일반적으로 표적 단백질 또는 항원과 콜렉션 일원의 접촉 및 활성 또는 특성의 평가, 예를 들어 표적 단백질에 대한 항체의 직접 결합 평가 분석(예컨대, 결합 친화도) 또는 표적 단백질의 활성의 변경(modulation)을 평가하는 기능적 분석에 의한 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "평가" 또는 "시험"은 항체 또는 이의 부분과 표적 단백질의 결합 및/또는 항체 또는 이의 부분에 의한 표적 단백질 활성의 변경에 대한 절대값의 획득 및 및 또한 결합 또는 활성 수준을 표시하는 지수(index), 비율(ratio), 백분율(percentage), 시각 또는 다른 값의 획득과 관련한 정량적 및 정성적 결정을 포함하는 것을 의도한다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있다. 예를 들어, 결합은 항체 또는 그들의 부분을 검출가능한 표지로 직접적으로 표지함으로써 및/또는 그 자신이 표지된 이차 항체를 이용함으로써 결정될 수 있다. 이에 더하여, 기능적인 활성은 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 다양한 분석, 예를 들어, 중화 분석(neutralization assays) 및 본원에서 기술된 것과 같은 다른 분석, 및 항체 또는 그들의 부분의 부재와 대비한 존재 시의 막-연관 항원(예를 들어, 바이러스와 같은 세포)의 활성 비교를 이용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "고처리량(high-throughput)"은 많은 수의 분자 또는 화합물들, 일반적으로 수십 내지 수백 내지 수천의 화합물들의 처리를 가능하게 하는 큰 규모의 방법 또는 공정을 말한다. 예를 들어, 정제 및 스크리닝의 방법이 고처리량이 되도록 할 수 있다. 고처리량 방법은 수동적으로 수행될 수 있다. 그러나, 일반적으로, 고처리량 방법은 자동화, 로봇 또는 소프트웨어를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표적 단백질" 또는 "단백질의 표적"은 시험 분자 또는 단백질과 결합 또는 상호작용 할 수 있는 단백질, 항원 또는 기질이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "질환"은 이에 제한되지 않으나, 감염, 후천적 상태, 유전적 상태 및 인식가능한 증상에 의하여 특정되는 것을 포함하는 원인 또는 상태로부터 기인한 유기체에서의 병리학적인 상태를 말한다. 질환은 암 및 종양을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "병적 미세환경(diseased microenvironment)"은 정상 조직과 비교하여 병적 조직에서의 변경된 또는 변화된 특정한 미세환경에서의 특정한 조건을 말한다. 이러한 조건은, 예를 들어, 변경된 또는 상승된 또는 변화된 혈관신생, 저산소증, 변경된 pH, 보조인자(co-factors), 간질액(interstitial fluid) 압, 및 변경된 대사체 수준 예컨대 변경된 젖산염(lactate) 또는 피루브산염 수준을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비-병적 미세환경(non-diseased microenvironment)" 또는 "건강 조직 환경"의 조건은 정상 생리적 조건 하에서 존재하는 조건을 말한다. 예를 들어, 정상 생리적 조건 하의 비-병적 미세환경, 예컨대 비-병적 조직의 pH는 중성일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 병적 또는 비-병적 미세환경을 "시뮬레이션한 조건(condition that simulate)"은, in vivo 환경에 존재하는 조건 또는 조건들에 상응하는 in vitro 또는 in vivo 분석 조건을 말한다. 예를 들어, 만약 미세환경이 낮은 pH에 의해서 특징지워 진다면, 상기 미세환경을 시뮬레이션하는 조건은 낮은 pH를 갖는 분석 조건 또는 완충액을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 종양 미세환경 내 존재하는 조건은 비-종양 환경(예를 들어, 건강한 또는 비-병적 세포 또는 조직)과 비교하여 그 안에 존재하는 조건을 포함한다. 종양 미세환경에 존재하는 조건은 종양을 나타내는 증가된 혈관 신생, 저산소증, 낮은 pH, 증가된 젖산염 농도, 증가된 피루브산염 농도, 증가된 간질액 압 및 변경된 대사체 또는 대사를 포함한다. 예를 들어, 종양 미세환경 내에 존재하는 조건은 pH 7.4 이하의 낮은 pH, 전형적으로 약 5.6 내지 6.8, 예컨대 약 pH 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 또는 6.8 이하이다. 또 다른 예에서, 종양 미세환경 내에 존재하는 조건은 약 5 mM 내지 20 mM 젖산, 예를 들어, 10 mM 내지 20 mM 젖산, 예컨대 15 mM 내지 18 mM, 및 특히 적어도 약 16 mM, 16.5 mM 또는 17 mM의 높은 젖산 농도이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 비-종양 미세환경에 존재하는 조건은 종양 미세환경에 존재하지 않는 조건 또는 조건들을 포함한다. 본원의 목적을 위하여, 조건 또는 조건들은 종양 미세환경 및 비-종양 미세환경에 존재하는 상응하는 특성 또는 특징, 예컨대 pH, 젖산염 농도 또는 피루브산염 농도이나, 이것들은 두 미세환경 사이에 차이가 있다. 비-종양 미세환경에 존재하는 조건은 pH 약 7.0 내지 약 7.8, 예컨대 적어도 약 pH 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7 또는 7.8(예를 들어, 미국 특허번호 7781405호 참조)의 pH 이고, 일부 예시에서 pH는 7.4이다. 비-종양 미세환경에 존재하는 조건은 0.5 내지 5mM 젖산염, 예컨대, 예를 들어 0.2 mM 내지 4 mM 젖산, 예컨대 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 mM 젖산의 젖산염 농도이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단백질의 콜렉션(collection of protein)" 또는 "항체의 콜렉션(collection of antibody)"은 적어도 10개의 다른 단백질 및/또는 그들의 활성 부분을 포함하는 콜렉션을 말하고, 일반적으로 적어도 50, 100, 500, 1000, 104, 105 또는 그 이상의 일원들을 포함하는 콜렉션을 말한다. 콜렉션은 전형적으로 활성에 대해 스크리닝될 단백질을 포함한다. 콜렉션에 포한된 것들은 자연적으로 발생한 단백질(또는 그들의 활성 부분) 및/또는 변형된 단백질들, 특히 항체 변이체 또는 그들의 활성 단편이다. 변형은 단백질의 길이에 따른 무작위의 돌연변이 및/또는 선택된 또는 표적된 영역에서의 변형(즉, 집중 돌연변이(focused mutations))을 포함한다. 변형은 특정한 좌위 또는 모든 좌위 또는 그들의 서브세트(subsets)에서의 모든 아미노산의 치환에 의하여 조합될 수 있으며 모든 순열을 포함할 수 있다. 콜렉션은 전장 또는 이보다 짧은 단백질들을 포함할 수 있다. 콜렉션 및 특정 콜렉션의 크기는 사용자에 의하여 결정될 수 있다. 본원의 용어 콜렉션은 용어 "라이브러리(library)"와 교대하여 사용되며, 같은 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주형 단백질" 또는 "돌연변이를 포함하지 않는 단백질"은 돌연변이 생성을 위해 사용되는 아미노산의 서열을 갖는 단백질을 말한다. 주형 단백질은 야생형 단백질의 서열일 수 있거나, 또는 추가적인 돌연변이를 만들기 위한 변이체 단백질의 서열일 수 있다,
본원에서 사용된 바와 같이, "선택" 또는 그들의 문법적 변이들은 단백질의 하나 또는 그 이상의 활성들에 기초하여 단백질을 선발하거나 선택하는 것을 말한다. 선택은 단백질의 절대적인 활성에 기초할 수 있거나, 또는 선택은 다른 조건 하에서 다른 단백질, 다른 조건 하에서 동일한 단백질, 또는 다른 조건 하에서 다른 단백질과 비교한 단백질의 상대적인 활성의 비교에 기초할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "확인(identify)" 및 그들의 문법적 변이들은 희망하는 조건 하에서 정의된 활성을 갖는 단백질의 인지 또는 인식을 말한다. 전형적으로 본원의 방법에서, 비-병적 또는 정상 생리적 환경과 비교한 병적 환경을 시뮬레이션하는 조건 하에서 그것의 우선적인 결합에 의하여 단백질이 확인된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 검출 또는 분리를 위해 표지된 분자는 예컨대 정제 또는 분리(isolation) 또는 격리(separation)를 위하여 분자, 예컨대 항체 또는 단백질이 검출가능한 표지, 예컨대 형광단과 연관되거나 또는 태그 또는 다른 모이어티와 연관된 것을 의미한다. 검출가능하게 표지된 것은 검출(detection) 또는 격리(separation)를 위하여 표지된 분자를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 에피토프(epitope) 태그는 에피토프 태그된 단백질 또는 펩티드의 차후의 생화학적 및 면역학적인 분석을 용이하게 하기 위한 에피토프에 상응하는 짧은 신장의 아미노산 잔기를 말한다. 에피토프 태그는 적절한 발현 벡터에서 에피토프 태그 서열을 단백질-암호화 서열에 추가함으로써 달성될 수 있다. 에피토프 태그된 단백질은 태그에 대한 고 특이적 항체를 이용하여 친화도 정제가 될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 반응 혼합물과 관련된 동질성(homogeneous)은 반응물이 용액 또는 현탁액을 포함하는 혼합물로서 액체상에 존재하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 반응 혼합물과 관련된 이질성(heterogeneous)은 반응물이 용액 또는 현탁액을 포함하는 혼합물로서 액체상에 존재하거나 또는 고체상에 존재하는 것을 의미한다. 이질성 반응 혼합물의 예시는 ELISA 분석이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변이체 단백질", "변형된 단백질" 또는 "뮤테인(mutein)" 또는 그들의 변이체들은 야생형 또는 주형 단백질과 비교하여 일차 서열에서 하나 또는 그 이상의 변형을 가진 폴리펩티드(단백질)를 말한다. 하나 또는 그 이상의 돌연변이는 하나 또는 그 이상의 아미노산 교체(치환), 삽입, 결실 및 그들의 임의의 조합일 수 있다. 변형된 단백질의 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 변형된 위치를 가진 것들을 포함한다. 변형된 단백질은 전장 단백질, 예컨대 전장 항체일 수 있으며, 그들의 항체 단편일 수 있다. 변경된 단백질은 전형적으로, 돌연변이를 포함하지 않는 야생형 또는 스캐폴드(scaffold) 단백질에 상응하는 아미노산 서열과 60%, 70%, 80 %, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "결정적인 아미노산 잔기"는 변화되었을 때(예를 들어, 아미노산 치환) 단백질의 활성이 감소하거나 제거되는 단백질의 잔기를 말한다. 전형적으로, 활성은 변화 또는 치환된 아미노산을 포함하지 않는 변형되지 않은 단백질의 활성보다 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하 또는 그 이하로 감소된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "핵심 잔기(key residue)"는 결정적인 아미노산과 인접하거나 근처에 있고, 변화되었을 때(예를 들어, 아미노산의 치환에 의하여), 바람직하지 않거나 미리 결정된 활성 또는 조건을 나타내는 단백질을 야기하지 않는, 예를 들어 바람직하지 않은 조건 하에서 단백질의 발현 또는 활성이 감소되거나 없는(예를 들어, pH 7.4에서 활성이나 pH 6.0에서는 아닌), 잔기들이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 활성은 전장(완전한) 단백질과 연관된 폴리펩티드 또는 이의 부분의 기능적 활성 또는 활성들을 말한다. 기능적인 활성은 이에 제한되는 것은 아니나, 생물학적 활성, 촉매적 또는 효소적 활성, 항원성(항-폴리펩티드 항원에 대한 결합을 위하여 폴리펩티드와 경쟁하거나 결합하는 능력), 면역원성, 다량체(multimers)를 형성할 수 있는 능력 및 폴리펩티드에 대한 리간드 또는 수용체에 특이적으로 결합하는 능력을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 결합 능력은 분자, 예를 들면, 폴리펩티드의 하나 이상의 결합 파트너와 결합하는지 여부 및 어떻게 하는지와 관련된 특성을 말한다. 결합 활성은 결합 파트너(들)과 결합하는 능력, 결합 파트너와 결합하는 친화도(예를 들어, 높은 친화도), 결합 파트너와 결합하는 결합활성(avidity), 결합 파트너와의 결합 강화 및 결합 파트너와의 결합을 위한 특이성을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "결합(bind)", " 결합된(bound)" 또는 그들의 문법적 변이들은 다른 분자와의 임의의 끌어당기는 상호작용에서의 분자의 참여를 말하며, 안정한 회합(association)을 초래하여 두 개의 분자들이 서로 매우 가까이에 있게 된다. 결합은 이에 제한되는 것은 아니나, 비공유 결합, 공유 결합(예컨대 가역적 또는 비가역적인 공유 결합)을 포함하며, 및 분자들, 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 및 저분자들, 예컨대 약물을 포함하는 화학적 화합물과 같은 분자 사이의 상호작용을 포함한다. 결합의 예는 항체-항원 상호작용 및 수용체-리간드 상호작용이다. 항체가 특정 항원과 "결합" 되었을 때, 결합은 항체 결합 부위에서의 동족 항체-항원 상호작용을 통한 항체에 의한 항원의 특이적 인식을 말한다. 결합은 또한 폴리펩티드의 다중 쇄의 연합, 예컨대 이황화 결합을 통한 항체 쇄들의 상호작용을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 "특이적 결합" 또는 "면역특이적 결합"들은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 항체의 항체 결합 부위(들) 및 항원 사이의 비공유적 상호작용에 의한 항체 또는 항원-결합 단편의 동족 항원과 하나 이상의 비공유 결합을 형성하는 능력을 말한다. 전형적으로, 항원에 면역특이적으로 결합(또는 특이적인 결합)하는 항체는 약 또는 1x107M-1 또는 1x108M-1 또는 그 이상인 친화 상수(affinity constant) Ka(또는 1x10-7M-1 또는 1x10-8M 또는 그보다 작은 해리 상수(Kd))를 가지고 항원과 결합하는 것이다. 친화 상수는 항체 반응을 위한 표준 동역학 방법론(standard kinetic methodology), 예를 들어, 면역분석, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance; SPR)(Rich 및 Myszka (2000) Curr . Opin . Biotechnol 11:54; Englebienne (1998) Analyst. 123:1599), 등온 적정 칼로리 측정법(isothermal titration calorimetry; ITC) 또는 본 발명의 분야에서 알려진 다른 동역학 상호작용 분석에 의해서 결정될 수 있다(예를 들어 Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, pages 332-336 (1989) 참조; 또한 예시적 SPR 및 ITC 방법의 기술을 위한 미국 특허번호 7,229,619호 참조). 결합 비율의 실시간 검출 및 감시를 위한 기기 및 방법은 알려져 있고 그들은 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Sweden and GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335).
본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 제공된 폴리펩티드 또는 항체와 관련된 용어 "선택적으로 결합(bind selectively)" 또는 "선택적으로 결합(selectively bind)" 은 다른 에피토프, 항원 또는 기질에 대해 실질적으로 결합함이 없이 에피토프, 항원 또는 기질과 결합하는 폴리펩티드 또는 항체를 의미한다. 전형적으로, 선택된 에피토프에 선택적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편들은 특이적으로 예컨대, 약 1x107M-1 또는 1x108M-1 또는 그 이상의 친화 상수 Ka를 가지고 에피토프와 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "친화도" 또는 "결합 친화도"는 항체 분자 또는 그들의 부분이 표적 단백질 또는 항원의 에피토프와 결합하는 강도를 말한다. 친화도는 종종 평형 결합 상수(equilibrium association constant; KA) 또는 평형 해리 상수(equilibrium dissociation constant; KD)에 의해서 측정된다. 낮은-친화도의 항체-항원 상호작용은 약하며, 분자들이 급속하게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은 친화도의 항체-항원 결합은 강하고 분자들이 더 긴 시간 동안 결합된 채로 남아있다. 높은 항체 친화도는 항체가 표적 단백질에 약 106 M-1 이상, 약 107 M-1 이상, 약 108 M-1이상 또는 약 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 또는 1012 M-1이상의 평형 결합 상수(KA)를 가지고 특이적 결합하는 것을 의미한다. 항체는 또한 10-4 M, 10-6 M 내지 10-7 M, 또는 10-8 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M 또는 이보다 낮은 평형 해리 상수(KD)에 의해 특징화될 수 있다. 일반적으로, 나노몰 또는 서브-나노몰 해리 상수를 갖는 항체들은 높은 친화도 항체로 여겨진다. 이러한 친화도는 종래 기술, 예컨대 평형 투석(equilibrium dialysis)에 의하여; 제작자에 의해 윤곽을 잡은 일반적 공정을 사용한 BIAcore 2000 기기의 사용에 의하여; 방사선 표지된 표적 항원을 이용한 방사선면역측정법(radioimmunoassay)에 의하여; 또는 본 분야의 기술자에게 알려진 또다른 방법에 의한 종래기술을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. 친화도 데이터는 예를 들어, Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)의 방법에 의하여 분석될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "어드레서블(addressable)"은 일원이 확인가능하거나 선험적으로 인식되는, 예를 들어, 그들의 어드레스(address), 공간적 어레이(spatial array), 예컨대 미세적정 플레이트(microtiter plate)의 웰(well) 또는 고체상 지지체 상에서의 위치에 의해 확인 가능한, 또는 확인 가능한 또는 검출가능한 표지, 예컨대 색깔, 형광, 전기적 신호(즉, RF, 마이크로파 또는 관심있는 분자들의 상호작용을 실질적으로 변경시키지 않는 다른 진동수), 바코드 또는 다른 기호, 화학적 또는 다른 이같은 표지에 의해서 인식할 수 있는 일원을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어드레서블 어레이는 어레이의 일원이 고체상의 표면 상에 인식가능한 좌위에 위치하고 있거나, 확인가능한 표지, 예컨대 마이크로스피어(microsphere) 또는 다른 미립자 지지체(particulate support)(본원에서 비드로 언급된)에 부착된 및 용액 내 현탁되거나 표면 상에 퍼뜨려진 표지에 직접적 또는 간접적으로 연결되어 있거나 이 외에도 연관된 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 형광활성세포분류(fluroescence activated cell sorting; FACs)는 형광에 기초한 세포의 확인 또는 분류 방법을 말한다. 예를 들어, FACS에서, 세포들은 하나 또는 그 이상의 형광 마커로 염색되거나 발현된다. 본 방법에서, 세포들이 마커(들)로부터 형광을 들뜨게 하고 검출하는 장치를 통과한다. 세포에 의한 주어진 부분의 스펙트럼에서의 형광의 검출을 통해, FACS 장치는 형광 스펙트럼을 발현하지 않는 부분으로부터 세포들이 격리되도록 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "세포 표면 발현 시스템" 또는 "세포 표면 전시 시스템"에 관한 언급은 세포 표면상에 단백질 또는 이의 부분의 전시 또는 발현을 말한다. 전형적으로, 세포-표면 단백질과 융합된 관심있는 단백질이 발현되는 세포들이 생산된다. 예를 들어, 단백질은 막관통 도메인과의 융합 단백질로서 발현된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "다량체화 도메인(multimerization domain)"은 각각이, 제 1 도메인과 안정한 다량체를 형성하기 위한 동일하거나 상이한 다량체화 도메인일 수 있는 상보적인 다량체화 도메인을 포함하는, 폴리펩티드 분자와 하나 이상의 추가적인 폴리펩티드 분자의 안정한 상호작용을 증진시키는 아미노산 서열을 말한다. 일반적으로, 폴리펩티드는 직접적 또는 간접적으로 다량체화 도메인에 연결된다. 예시적인 다량체화 도메인은 면역글로불린 서열 또는 이의 부분, 류신 지퍼, 소수성 영역, 친수성 영역, 및 양립가능한 단백질-단백질 상호작용 도메인을 포함한다. 다량체화 도메인은, 예를 들어, 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인, 예컨대, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형(subtype)을 포함하는 IgG, IgA, IgE, IgD 및 IgM로부터의 Fc 도메인 또는 이의 부분, 및 이의 변형된 형태가 될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 인간 단백질은 모든 대립 형질 변이체 및 이의 보존적 변이체들을 포함하는 인간의 유전체에 존재하는 핵산 분자, 예컨대 DNA에 의해서 암호화된다. 단백질의 변이체 또는 변형은 변형이 인간 단백질의 야생형 또는 우세형 서열(predominant sequence)에 기초하더라도 인간 단백질이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 자연적으로 발생된 α-아미노산의 잔기들은 자연에서 발견되는 20개 α-아미노산의 잔기로 인간에서 그것의 동족 mRNA 코돈과 대전된 tRNA 분자의 특이적 인식에 의하여 단백질에 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 유전적으로 암호화되지 않은 아미노산을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵산은 DNA, RNA 및 펩티드 핵산(PNA) 및 이의 혼합물을 포함하는 이의 유사체를 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 예컨대 검출가능한 표지, 예컨대 형광체 또는 방사선 표지로 선택적으로 표지된, 프로브 또는 프라이머에 관해 언급할 때, 단일 가닥 분자들이 고려된다. 이러한 분자들은 그들의 표적이 통계적으로 독특하거나 라이브러리를 프로빙 또는 프라이밍하기에 낮은 복제수(전형적으로 5 미만, 일반적으로 3 미만)가 되도록 하기 위한 전형적인 길이이다. 일반적으로 프로브 또는 프라이머는 관심있는 유전자와 동일하거나 상보적인, 적어도 14, 16 또는 30개의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상 길이의 핵산이 될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 펩티드는 2 내지 40 아미노산 길이의 폴리펩티드를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 그들의 알려진, 세 개의 문자 또는 한 개의 문자 표기(표 1)에 따라 본원에서 제공하는 아미노산의 다양한 서열에서 나타나는 아미노산이 확인될 수 있다. 다양한 핵산 단편에서 나타나는 뉴클레오티드는 본 발명의 분야에서 일반적으로 사용되는 표준의 한 문자 표기법에 의해서 표기된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산"은 아미노기와 카르복시산기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 두 개 또는 그 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적을 위하여, 아미노산은 스무 개의 자연적으로 발생한 아미노산, 비-자연적으로 발생한 아미노산 및 아미노산 유사체(즉, α-탄소가 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 이것의 펩티드 연결에서 폴리펩티드의 화학적 소화(가수분해)에 의해 형성되는 아미노산을 말한다. 본원에서 기술되는 아미노산 잔기는 "L" 이성체 형태인 것으로 추정된다. "D" 이성체 형태로 표기된 잔기는 폴리펩티드에 의하여 원하는 기능적 특성이 유지되는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 치환될 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 자유 아미노기를 말한다. COOH는 폴리펩티드의 카르복실 말단에 존재하는 자유 카르복실기를 말한다. J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968)에 기술된 표준 폴리펩티드 명명법 및 채택된 37 C.F.R.§§ 1.821-1.822에 따른 아미노산 잔기에 대한 약어는 표 1에 나타내었다.
[표 1] 대응표
Figure pct00001
본원에서 나타낸 모든 아미노산 잔기 서열들은 아미노-말단으로부터 카르복실-말단으로의 통상적인 방향인 좌측에서 우측으로의 방향성을 갖는 방식에 의함을유의해야 한다. 또한, 어구 "아미노산 잔기" 는 대응표(표 1)에 열거된 아미노산 및 변형되고 일반적이지 않은 아미노산, 예컨대 37 C.F.R.§§ 1.821-1.822 에서 언급되고 본원에서 참조로서 포함된 아미노산을 포함하는 것으로 넓게 정의된다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 부분 또는 말단에서의 대쉬(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열에, 아미노-말단기 예컨대 NH2 또는 카르복실-말단기, 예컨대 COOH에 대한 펩티드 결합을 나타내는 것임을 유의해야한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "자연적으로 발생하는 아미노산"은 폴리펩티드에서 나타나는 20개의 L-아미노산을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비-자연 아미노산"은 자연적 아미노산과 구조적으로 유사하나 자연적 아미노산의 구조 및 반응성과 유사하도록 구조적으로 변형된 유기 화합물을 말한다. 비-자연적으로 발생한 아미노산은 그러므로, 예를 들어 20개 자연적으로 발생한 아미노산 이외에 아미노산 또는 아미노산의 유사체를 포함하며, 이에 제한되지 않으나, 아미노산의 D-이소입체이성질체(D-isostereomer)를 포함한다. 예시적인 비-자연 아미노산들이 본원에서 기술되어 있으며, 본 발명이 속하는 분야의 기술자에게 알려져 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 등운동에너지(isokinetic) 혼합물은 아미노산의 분자 비가 그들의 보고된 반응 속도에 기초하여 조절된 것이다(예를 들어 Ostresh et al., (1994) Biopolymers 34:1681 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, 변형은 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열의 변형과 관련되며, 각각 핵산 및 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 및 치환을 포함한다. 폴리펩티드 변형 방법은 본 발명이 속하는 분야의 기술자에게 일상적이며, 예컨대 재조합 DNA 방법론에 의할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산의 적절한 보존적 치환은 본 발명이 속하는 분야의 기술자에게 알려져 있으며 일반적으로 최종 분자의 생물학적인 활성을 바꾸지 않고도 제조될 수 있다. 본 발명이 속하는 분야의 기술자들은, 일반적으로, 폴리펩티드의 비-필수적 영역에서의 단일 아미노산 치환은 실질적으로 생물학적 활성을 변경하지 않는다고 인식한다(예를 들어 Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th 판, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224 참조). 이러한 치환은 다음 표 2에 나타낸 바에 따라 만들어질 수 있다.
[표 2]
Figure pct00002
다른 치환 또한 허용 가능하며, 경험적으로 또는 알려진 보존적 치환에 따라 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, DNA 구축물은 자연에서 발견되지 않는 방식으로 조합 및 병치된 DNA 분절을 포함하는 단일 또는 이중 가닥, 선형 또는 환형의 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간 조작의 결과로서 존재하고, 클론 및 조작된 분자의 다른 복제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, DNA 분절은 특정 속성을 가진 더 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들면, 특정 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분절은 더 큰 DNA 분자, 예컨대, 5'에서 3' 방향으로 해독될 때, 특정 폴리펩티드의 아미노산의 서열을 암호화하는 플라스미드 또는 플라스미드의 단편의 부분이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3' 말단으로 해독되는 데옥시리보클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중- 가닥 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 이것은 자연 공급원으로부터 분리되거나, in vitro에서 합성되거나 또는 자연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 본원에서 뉴클레오티드("nt"로 약기) 또는 염기쌍("bp"로 약기)으로 주어진다. 용어 뉴클레오티드는 문맥이 허용하는 경우 단일- 및 이중-가닥 분자에 사용된다. 용어가 이중-가닥 분자에 적용되는 경우, 이것은 전체 길이를 나타내기 위해 사용되며, 용어 염기쌍과 동등한 것으로 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 두 개 가닥은 길이에 있어서 약간 다를 수 있으며 이의 말단이 엇갈리게 배치될 수 있고; 그러므로 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내의 모든 뉴클레오티드가 쌍을 이루지 않을 수 있다는 것이 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 인식될 것이다. 이러한 쌍을 이루지 않은 말단은, 일반적으로, 20개 뉴클레오티드 길이를 초과하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 두 개의 단백질 또는 핵산 사이의 "유사성"은 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열 사이의 연관도(relatedness)를 말한다. 유사성은 잔기들의 서열 및 그 안에 포함된 잔기들의 동일성 및/또는 상동성의 정도에 기초될 수 있다. 단백질 또는 핵산 사이의 유사성의 정도를 평가하는 방법은 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 서열 유사성을 평가하는 일 방법에서, 두 개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 서열 간 최대 수준의 동일성을 제공하는 방식으로 배열된다. "동일성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 변함없는 정도를 말한다. 아미노산 서열의 배열(alignment) 및 어느 정도까지의 뉴클레오티드 서열의 배열은 또한 아미노산 (또는 뉴클레오티드) 에서의 보존적 차이(conservative difference) 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보존적 차이는 관련된 잔기들의 물리화학적 특성을 보존하는 것들이다. 배열은 전체적(서열의 전장에 대하여 그리고 모든 잔기들을 포함하는, 비교되는 서열의 배열)이거나 또는 국소적(가장 유사한 영역 또는 영역들만을 포함하는 서열들의 부분 배열) 일 수 있다.
"동일성"은 그 자체로 기술로 인식되는 의미를 갖고, 공개된 기술을 이용하여 계산될 수 있다(예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.편저, Oxford University Press, 뉴욕, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 편저, Academic Press, 뉴욕, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H. G. 편저, Humana Press, 뉴저지, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysus Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J. 편저, M Stockton Press, New York, 1991 참조). 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드들 사이의 동일성을 측정하는 수많은 방법들이 있지만, 용어 "동일성" 은 당 분야에 속하는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
본원에 사용된 바와 같이, (핵산 및/또는 아미노산 서열과 관련하여) 상동인(homologous)은 약 25% 이상의 서열 상동성, 전형적으로는 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 상동성을 의미하고; 필요한 경우, 정확한 백분율이 특정될 수 있다. 본원에서의 목적을 위해, 용어 "상동성" 및 "동일성" 은 달리 표시되지 않는 한, 종종 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 백분율 상동성 또는 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최고 수준의 매칭이 수득되도록 배열된다(예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. 편저 Oxford University Press, 뉴욕, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 편저, Academic Press, 뉴욕, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G. 편저, Humana Press, 뉴저지, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J. 편저, M Stockton Press, 뉴욕, 1991 ; Carillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073 참조). 서열 상동성에 의해, 보존된 아미노산의 수가 표준 배열 알고리즘 프로그램에 의해 결정되고, 각각의 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티(default gap penalty)를 가지고 이용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 관심있는 핵산의 길이를 내내 따라, 전형적으로는 중간 정도의 엄격성(moderate stringency)으로 또는 고도의 엄격성(high stringency)으로 혼성화한다. 또한 혼성화 핵산 분자 내 코돈들을 대신해 축퇴성 코돈을 포함하는 핵산 분자가 또한 고려된다.
임의의 두 분자가 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 "동일한" 또는 "상동인" 인 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 갖는지 여부는, 공지의 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어, Pearson 등의 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 55:2444에서와 같은 디폴트 파라미터들을 이용하는 "FASTA" 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다(기타 프로그램에는 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., 등, Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. 등, J Molec Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop 편저, Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48:1073 가 포함됨). 예를 들어, 생명공학 정보를 위한 국립센터(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스의 BLAST 함수가 동일성 결정에 이용될 수 있다. 기타 상업적으로 또는 대중적으로 이용가능한 프로그램에는, DNAStar "MegAlign" 프로그램(Madison, WI) 및 위스콘신 대학 유전학 컴퓨터 그룹(University of Wisconsin Genetics Computer Group; UWG) "Gap" 프로그램(Madison WI)이 포함된다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 백분율 상동성 또는 동일성은 예를 들어 GAP 컴퓨터 프로그램(예를 들어, Needleman 등 (1970) J. Mol. Biol. 48:443, 이는 Smith 및 Waterman에 의해 개정(1981) Adv. Appl. Math. 2:482)을 이용하는 서열 정보 비교에 의해 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은, 두 서열 중 더 짧은 것 내의 기호의 총 갯수로 나눈, 유사한, 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 갯수로서 정의한다. GAP 프로그램에 대한 디폴트 파라미터는 다음을 포함할 수 있다: (1) 1진법 비교 매트릭스(동일성에 대해서는 1의 값을, 비-동일성에 대해서는 0의 값을 포함) 및 Schwartz 및 Dayhoff, 편저, ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, 국립 생물의학 연구 재단(National Biomedical Research Foundation), pp. 353-358(1979)에 의해 기술된 것과 같은 Gribskov 등(1986) Nucl. Acids Res. 14:6745의 편중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대해서는 3.0의 페널티 및 각각의 갭 내 각 기호에 대해서는 추가적인 0.10의 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대한 페널티 없음.
따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성" 또는 "상동성"은 시험 및 기준 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 적어도 "90% 동일한"은 폴리펩티드의 기준 핵산 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 90 내지 99.99의 백분율 동일성을 말한다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예증 목적을 위하여 100개 아미노산 길이의 시험 및 기준 폴리펩티드를 비교함을 가정했음을 표시한다. 시험 폴리펩티드 내 10%(즉, 100개 중 10개) 이하의 아미노산이 기준 폴리펩티드의 것과 상이하다. 유사한 비교를 시험 및 기준 폴리뉴클레오티드 사이에 행할 수 있다. 이러한 차이는 폴리펩티드의 전장에 걸쳐 무작위로 분포하는 점 돌연변이로서 나타날 수 있거나, 또는 최대 허용가능한 범위, 예를 들어 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 길이를 달리하는 하나 이상의 위치에서 무리를 이룰 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 약 85 내지 90% 이상의 동일성 또는 상동성 수준에서, 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트에 독립적이어야 하고; 이러한 높은 수준의 동일성은, 종종 소프트웨어에 의지하지 않고 수동적인 배열에 의해서도 쉽게 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 배열된 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열 내에 상응하는 위치에 배열하기 위한 상동성(유사성 및/또는 동일성)의 이용을 말한다. 전형적으로는, 50% 이상의 동일성으로 연관되어 있는 2개 이상의 서열이 배열된다. 서열들의 배열된 세트는 상응하는 위치에서 배열되는 2개 이상의 서열을 말하며, EST와 같은 RNA 및 게놈 DNA 서열과 배열되는 다른 cDNA로부터 유래한 배열 서열(aligning sequences)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머" 는 적절한 조건 하(예를 들어, 4 가지 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합화제, 예컨대 DNA 폴리머라아제, RNA 폴리머라아제 또는 역전사 효소의 존재 하)에, 적절한 완충액 및 적절한 온도에서의 주형-유도(template-directed) DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머"로서 제공될 수 있음이 인식될 것이다. 그러나, 프라이머는 신장을 위한 3' 히드록실기를 갖는다. 프라이머는, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), 역전사효소(RT)-PCR, RNA PCR, LCR, 다중 PCR, 팬핸들(panhandle) PCR, 캡춰(capture) PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 제자리(in situ) PCR, 라이게이션-매개 PCR 및 기타 증폭 프로토콜을 포함하는 다양한 방법에서 이용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머 쌍"은 (예를 들어 PCR에 의해)증폭시킬 서열의 5' 말단과 혼성화하는 5'(상류) 프라이머 및 증폭시킬 서열의 3' 말단에서 상보물과 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머들의 세트를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 혼성화한다" 는, 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 상보적 염기-쌍(base-pairing)에 의한 어닐링을 말한다. 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자는 특이적 혼성화에 영향을 주는 in vitro 및 in vivo 파라미터들, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성에 친숙하다. in vitro 혼성화에 특히 관련된 파라미터에는 추가로, 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성 및 염 농도를 포함한다. 높은 엄격성에서 비특이적으로 결합된 핵산 분자를 제거하기 위한 예시적인 세척 조건은, 0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65℃이고, 보통 엄격성(medium stringency)에서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃이다. 동등한 엄격성 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특별한 적용을 위해 적절한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위하여 상기 파라미터들을 쉽게 조정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 산물(product)과 실질적으로 동일함이란, 관심있는 특성이 충분히 변하지 않아 실질적으로 동일한 산물이 상기 산물을 대체하여 사용될 수 있을 정도로 충분하게 유사한 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "유사한" 은 관련 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 맥락에 따라 변경되는 것으로도 또한 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 대립형질 변이체 또는 대립형질 변이는 동일한 염색체 좌위를 차지하는 유전자의 임의의 2가지 이상의 대안적인 형태(alternative forms)를 지칭한다. 대립형질 변이체는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 집단내 표현형 다형질성(phenotypic polymorphism)을 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵적일 수 있거나(암호화되는 폴리펩티드에 변화가 없음) 또는 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 용어 "대립형질 변이체"는 또한 본원에서 유전자의 대립형질 변이체에 의해 암호화되는 단백질을 나타내기 위해 본원에서 이용된다. 전형적으로 유전자의 기준 형태는 집단 또는 한 종의 기준 일원으로부터의 폴리펩티드의 야생형 형태 및/또는 우세형 형태를 암호화한다. 전형적으로는, 대립형질 변이체는 종간 변이체를 포함하며, 동일한 종 유래 야생형 및/또는 우세형과 전형적으로 적어도 80%, 90%, 또는 더 큰 아미노산 동일성을 가지며; 동일성의 정도는 유전자, 및 비교가 동종간 또는 이종간인지 여부에 따라 좌우된다. 일반적으로, 종내 대립형질 변이체들(intraspecies allelic variants)은, 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우세형과, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 포함하여, 야생형 및/또는 우세형과 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성 또는 그 이상의 동일성을 갖는다. 본원에서 대립형질 변이체에 대한 언급은 일반적으로 동종 일원간 단백질 내 변이를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 "대립형질 변이체"와 상호교환적으로 사용되는 "대립 형질(allele)"은, 유전자 또는 이의 부분의 대안적인 형태를 말한다. 대립형질은 상동 염색체에서 동일한 좌위 또는 위치를 차지한다. 대상이 한 유전자 의 2개의 동일한 대립형질을 갖는 경우, 상기 대상은 그 유전자 또는 대립형질에 대해 동형접합성(homozygous)이라고 일컫는다. 대상이 유전자의 2개의 상이한 대립형질을 갖는 경우, 상기 대상은 상기 유전자에 대해 이형접합성(heterozygous)이라고 일컫는다. 특정 유전자의 대립형질은 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있고, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립형질은 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 종 변이체는, 예컨대 마우스 및 인간과 같은 상이한 포유류를 포함하는, 상이한 종들 간의 폴리펩티드에서의 변이체를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 스플라이스 변이체는 한 가지를 초과하는 유형의 mRNA를 초래하는, 게놈 DNA의 1차적인 전사물의 차별적인 공정(differential processing)에 의해 생산되는 변이체를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 펩티도미메틱(peptidomimetic)은 특정 펩티드의 생물학적 활성 형태의 입체구조(conformation) 및 특정 입체화학적 특징을 모방한 화합물이다. 일반적으로, 펩티도미메틱은 화합물의 특정 희망되는 특성을 모방하도록 설계되나, 생물학적 활성 입체구조의 손실 및 결합 파괴를 가져오는 예컨대 유연성(flexibility)과 같은 바람직하지 않은 특성들은 모방하지 않도록 설계된다. 펩티도미메틱은 바람직하지 않은 특성에 영향을 주는 특정 기 또는 결합을 등배전자(bioisosteres)로 교체함에 의하여 생물학적 활성 화합물로부터 준비될 수 있다. 등배전자는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 메틸렌 등배전자 CH2S는 엔케팔린(enkephalin) 유사체에서 아미드 치환으로서 사용될 수 있다(예를 들어, Spatola (1983) pp. 267-357, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, Weinstein, Ed. 7권, Marcel Dekker, 뉴욕 참조). 경구적으로 투여될 수 있는 모르핀은 펩티드 엔도르핀(endorphin)의 펩티도미메틱인 화합물이다. 본원의 목적을 위하여, 사이클릭 펩티드들은, 하나 이상의 펩티드 결합이 모방체에 의해 교체된 폴리펩티드와 같은 펩티도미메틱 중에 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 기준 폴리펩티드에 나타난 특정 백분율의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 폴리펩티드와 기준 폴리펩티드 사이에 공유되는 인접한 동일한 아미노산의 비율을 말한다. 예를 들어, 147개 아미노산을 열거한 서열번호 XX로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 기준 폴리펩티드로 표시되는 아미노산의 70%를 포함하는 아형은 기준 폴리펩티드가 서열번호 XX의 아미노산 서열로 나타낸 적어도 103개의 인접한 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 프로모터는, RNA 폴리머라아제의 결합 및 전사의 개시를 제공하는, DNA 서열을 포함하는 유전자의 부분을 의미한다. 프로모터 서열은 항상은 아니나 일반적으로, 유전자의 5' 비-코딩(암호화) 영역에서 발견된다.
본원에 사용된 바와 같이, 분리된 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분은, 상기 단백질이 유래한 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염성 단백질이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제제는, 순도를 측정하기 위하여 당업자에 의해 사용되는 분석 표준 방법, 예컨대 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 결정되어, 쉽게 검출 가능한 불순물이 없는 것으로 나타나거나, 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 특성, 예컨대 상기 물질의 효소 및 생물학적 활성을 검출가능하게 변경하지 않을 만큼 충분히 순수하다면, 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그런 경우, 추가 정제는 화합물의 특이적 활성을 증가시킬 수 있다.
용어 세포성 물질로부터 실질적으로 유리된은, 상기 단백질 그것이 분리되거나 또는 재조합적으로 제조되는 세포의 세포 성분들로부터 분리되어 있는 단백질들의 제제를 포함한다. 일 실시예에서, 용어 세포성 물질로부터 실질적으로 유리된은, 약 30% (건중량) 미만의 비-프로테아제 단백질(본원에서는 오염 단백질로서 언급함), 일반적으로 약 20% 미만의 비-프로테아제 단백질 또는 10% 미만의 비-프로테아제 단백질 또는 약 5% 미만의 비-프로테아제 단백질을 가진 프로테아제 단백질의 제제를 포함한다. 프로테아제 단백질 또는 이의 활성 부분이 재조합적으로 제조될 때, 그것은 또한 배양 배지로부터 실질적으로 유리되어 있는데, 즉 배양 배지는 프로테아제 단백질 부피의 약 또는 20%, 10% 또는 5% 미만을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 유리된은, 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 기타 화학물질로부터 단백질이 분리되어 있는 프로테아제 단백질의 제제를 포함한다. 상기 용어는 약 30%(건중량) 20%, 10%, 5% 미만 또는 그 미만의 화학적 전구체 또는 비-프로테아제 화학물질 또는 성분들을 가진 프로테아제 단백질의 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드와 관련한 합성은, 재조합 방법 및/또는 화학적 합성 방법으로 제조된 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 이용한 재조합적 수단에 의한 제조는, 클로닝된 DNA에 의해 암호화되는 단백질 발현을 위한 분자생물학의 널리 공지된 방법의 이용을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 이종성(heterologous) 핵산을 이의 발현 또는 복제를 위해 세포내에 도입하기 위해 사용되는 별개의 요소(elements)를 말한다. 벡터는 전형적으로는 에피좀(episome)으로 남지만, 유전자 또는 이의 부분의 게놈 염색체로의 통합(integration)이 실행되도록 설계될 수 있다. 효모 인공 염색체 및 포유류 인공 염색체와 같은 인공 염색체인 벡터도 또한 고려된다. 비히클의 선택 및 이용은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 이러한 DNA 단편의 발현을 실행할 수 있는 조절 서열, 예컨대 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 이러한 추가적인 분절(segments)은 프로모터 및 종결 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선별가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 이들 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 적당한 숙주 세포에 도입시 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는, 예컨대 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 기타 벡터와 같은 재조합 DNA 또는 RNA 구축물을 말한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 진핵 세포 및/또는 원핵 세포 내에서 복제 가능한 것들 및 에피좀으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 (비히클로서 또는 셔틀로서)외인성 유전자를 세포 내로 운반하기 위해 외인성 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 조작된 바이러스이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아데노바이러스는 인간에서 상기도 감염 및 결막염을 유발하는 바이러스를 포함하는 DNA의 임의의 그룹을 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 나출된 DNA(naked DNA)는 백신 및 유전자 치료에 사용될 수 있는 히스톤-결핍 DNA를 말한다. 나출된 DNA는 형질전환으로 불리는 유전자 전달 과정 동안에 세포에서 세포로 이동하는 유전적 물질이다. 형질전환에서, 정제된 또는 나출된 DNA는 수용 세포(recipient cell)에 의해서 수용되고, 수용 세포에 새로운 특징 또는 표현형을 수여할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절 언급시, 작동가능하게 또는 작동가능 하게 연결된은 분절들이 그들의 의도된 목적, 예를 들어 전사가 프로모터에서의 개시되고 코딩(암호화) 분절을 통해 종결자까지 진행을 위하여 그들이 함께 기능하도록 배열되어 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질 결합 서열은 다른 단백질 또는 펩티드 서열, 일반적으로 단백질 또는 펩티드 서열의 세트 또는 특정 단백질 또는 펩티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드 서열을 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 평가는 단백질의 활성에 대한 절대적인 값 및 또한 활성 수준을 나타내는 지수(index), 비율(ratio), 백분율(percentage), 시각 또는 다른 값의 획득이라는 의미에서의 정량적 및 정성적 결정을 포함하는 것을 의도한다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있고, 실제로 검출되는 화학종들이 반드시 활성 산물(activity product)이 될 필요는 없으나, 예를 들어 이의 유도체 또는 어떤 추가 물질일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 대조군은 시험 파라미터로 처리되지 않았다는 것을 제외하고는 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 의미하거나, 또는 만약 그것이 혈장 시료라면, 이것은 관심있는 조건에 영향을 받지 않은 정상 지원자 유래일 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군(internal control)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "하나의", "한" 및 "상기"는 문맥상 명백하게 반대로 구술되지 않는다면 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포외 도메인"을 포함하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인들을 가진 화합물들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 약은 또한 정확한 양까지도 포함한다. 따라서, "약 5개의 염기" 는 "약 5 개의 염기" 및 또한 "5 개 염기" 를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "선택적인(임의적인)" 또는 "선택적으로(임의적으로)" 는 후속 기재되는 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않고, 상기 기재가 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 그것이 발생하지 않는 경우도 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 선택적으로 치환된 기는 상기 기가 비치환이거나 또는 치환된 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 보호기, 아미노산 및 기타 화합물에 대한 약어는, 달리 표시되지 않는 한, 통상적인 사용법에 따라서 공지된 약어, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법을 사용한다(1972)Biochem. 11:1726 참조).
B. 조건부 활성 분자의 확인 방법
본원에서는 예컨대 정상 조직 미세환경보다 병적 미세환경에서 더 활성화되거나 그 반대인 치료적 단백질과 같은 조건부 활성 분자의 확인 또는 선택을 위한 방법이 제공된다. 특히, 상기 방법은 예컨대 정상 미세환경에서보다 종양 미세환경에서 더 활성화되거나 그 반대인 치료적 단백질과 같은 분자 확인을 위한 것이다. 상기 방법에서, 분자, 예컨대 치료적 단백질의 활성은 제 1 세트의 조건 하에서 시험되고, 분자의 활성이 제 1 세트의 조건 하의 활성과 비교하여 감소된 활성이 희망되는 제 2 세트의 조건에서 시험된다. 제 2 세트의 조건과 비교하여 제 1 세트의 조건 하에서 활성인 또는 더 활성인 분자, 예컨대 단백질이 확인될 수 있으므로, 미리 결정된 세트의 조건 하에서 조건부 활성인 분자가 확인된다. 전형적으로, 본 방법에서, 제 1 세트의 조건은 in vivo 병적 미세환경, 예컨대 종양 미세환경에 존재하는 조건을 모방하거나 이를 시뮬레이션한 조건이다. 제 2 세트의 조건은 정상 조직 또는 세포 내의 생리적 조건을 모방하거나 또는 이를 시뮬레이션한 조건이다.
그러므로, 본원의 방법은 병적 미세환경 및 정상 조직 미세환경에 존재하는 미리 결정된 조건을 모방하거나 이를 시뮬레이션하여 설계된 in vitro 분석에서 수행된다. 미리 결정된 조건은 예를 들어, 조건들, 예컨대 pH, 온도, O2 농도 및 젖산염 농도를 포함한다. 예를 들어, 미리 결정된 제 1 세트의 조건은 종양 미세환경에 존재하는 조건을 포함할 수 있고, 제 2 세트의 조건은 정상 환경에 존재하는 조건을 포함할 수 있다. 그러므로, 병적 미세환경, 예컨대 종양에서 주변 정상 조직보다 더 큰 활성을 나타내는 생물학적 효능(유효성)을 가진 분자, 예컨대 치료적 단백질이 확인될 수 있다. 그러므로, 본원에서 제공된 방법은 세트의 조건 하에서 조건부 활성을 가진 변형된 단백질, 예컨대 치료적 단백질을 확인하는데 사용될 수 있다.
이것은 국소 및 전신성 부작용을 포함하는 부작용을 감소 또는 예방하기 위해 오직 병적 조직, 예컨대 종양 조직에 대한 치료를 표적화함으로써 유리하게 될 수 있다. 확인된 치료적 단백질은 전신적 노출과 관련된 부작용을 감소시키면서 암 치료제로서 사용될 수 있다. 감소된 부작용과 관련된 치료적 단백질은 고용량 요법(higher dosing regimens)에 사용될 수 있고, 개선된 효능(유효성) 및 안전성을 가질 수 있다. 감소될 수 있는 부작용들은 임의의 바람직하지 않은 비치료적 효과, 예컨대 구역질, 구토, 흉통, 두통, 및 관련된 심혈관 영향, 예컨대 혈압 불안정 및 동맥 수축, 경피 독성, 골수 억제(bone marrow suppression), 심장독성(cardiotoxicity), 탈모, 신장 기능장애, 구내염, 빈혈, 발작, 면역 반응 예컨대 급성 아나필락시스, 혈청병, 항체의 생성, 감염, 암, 자가면역 질환 및 심장 독성을 포함한다.
방법의 제 1 단계에서, 본원에서 제공된 방법에서 시험될 하나 이상의 분자 또는 단백질들이 선택된다. 분자(들)은 저분자, 펩티드, 단백질, 효소, 항체 또는 다른 생체분자를 포함하는, 생물학적 효능(유효성)을 갖는 임의의 분자(들) 또는 생물학적 효능(유효성)을 갖는 임의의 변형된 분자가 될 수 있다. 분자(들)은 변형되지 않을 수 있거나 본원에서 기술된 임의의 변형을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 분자의 라이브러리가 준비된다. 시험 분자를 제조하는 방법이 당업자에 알려져 있다. 섹션 D는 항체를 포함하는 단백질의 클로닝, 변형 및 제조 방법을 기술한다. 추가로, 변이체 분자의 라이브러리 또는 콜렉션의 돌연변이 유발(mutagenesis) 및 생성 방법이 본원에서 기술되며, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하는 당 분야의 통상의 기술자들에게 알려져 있다.
분자 또는 분자들, 예컨대 단백질 또는 단백질들이 선택되고 준비된 후, 그들은 제 1 세트의 조건 하 및 상이한 제 2 세트의 조건 하에서 활성 또는 특성에 대하여 시험되고 스크리닝 된다. 제 1 및 제 2 세트의 조건들은 각각 병적 또는 정상 조직 또는 미세환경에 생리적으로 존재하는 것을 시뮬레이션하거나 모방한 조건이다. 예를 들어, 병적 조직 또는 병적 미세환경 조건은 종양 미세환경에 존재하는 것일 수 있다. 이러한 조건의 예는, 예를 들어, 화학적 조건, 예컨대 pH 및 화학적 농도, 예컨대 O2 또는 젖산염의 농도; 및 물리적 조건, 예컨대 온도 및 압력을 포함한다. 그러므로, 제 1 및 제 2 조건은 임의의 하나 또는 그 이상의 pH, O2 또는 젖산염의 농도 또는 수준 또는 다른 화학적 조건, 온도 및/또는 압력이 상이할 수 있다.
분자의 시험은 시험되는 분자 또는 단백질의 활성 또는 특성을 검출하고 구별할 수 있는 임의의 in vitro 또는 in vivo 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 전형적으로, 시험은 in vitro에서 수행된다. 사용되는 특정 분석은 시험되는 분자 또는 단백질에 의존적이다. 방법의 예는 본원에 기술된 임의의 방법 또는 본 발명의 분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법을 포함하고, 생화학적 분석 및/또는 세포 기반 분석을 포함한다.
일 예에서, 시험되는 분자들은 수집되고(pooled) 스크리닝될 수 있다. 다른 예에서, 시험되는 분자들은 예컨대 어레이, 예컨대 어드레서블 어레이에서 포맷팅(formatting)함으로써, 물리적으로 분리되고 개별적으로 스크리닝될 수 있다. 또한 제 2 세트의 조건 하의 분자(들)의 시험은 제 1 세트의 조건 하의 스크리닝 전, 후 또는 동시에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 분자들은 제 1 세트 및 제 2 세트의 조건 하에서 동시에 스크리닝 및/또는 선택될 수 있거나, 또는 분자들은 제 1 세트에서 스크리닝 및/또는 선택될 수 있고 그리고 나서 제 2 세트의 조건 하에서 스크리닝 및/또는 선택될 수 있다.
두 가지 세트의 조건 하에서 분자들이 시험된 후에, 하나 또는 양 조건 하의 분자의 활성이 제 2 조건보다 제 1 조건 하에서 더 활성인 최종 분자를 확인하기 위하여 평가된다. 활성은 임의의 관찰가능한 생물학적, 생화학적 또는 생물리학적 현상, 예컨대, 예를 들어, 발광, 효소적 활성 또는 분자 상호작용, 예컨대 동족 생체분자와의 결합을 포함할 수 있다. 활성의 비교는 정량적 또는 정성적일 수 있다.
일 예에서, 분자들이 양 세트 조건 하에서 시험된 후, 양 세트 조건 하의 각각의 분자의 활성이 제 2 조건보다 제 1 조건 하에서 더 활성인(즉, 조건부 활성인) 분자를 확인하기 위해 비교된다.
다른 예에서, 조건부 활성 분자들은 단계적으로 두 개의 다른 조건 하에서 스크리닝 및/또는 선택됨으로서 확인된다. 예를 들어, 조건부 활성 분자는 제 1 세트의 조건 하에서 활성인 분자의 1 차 선택 및/또는 제 1 세트의 조건 하에서 불활성인 분자의 제외(양성 선택((positive selection))에 의해서 확인될 수 있다. 다음 라운드의 스크리닝이 제 2 세트의 조건 하에서 수행될 수 있고, 제 2 세트의 조건보다 제 1 세트의 조건 하에서 더 큰 활성을 나타내는 분자들이 확인된다. 또다른 예에서, 조건부 활성 분자는 제 2 세트의 조건 하에서 활성인 분자의 제외(음성 선택(negative selection))에 의해서 확인될 수 있다. 음성 선택의 예에서, 특정기준을 만족시키지 못하는, 예컨대 활성도에 대한 역치보다 높거나 낮은, 분자들은 다음 라운드의 스크리닝 및/또는 선택으로부터 제거된다. 다음 라운드의 스크리닝이 제 1 세트의 조건 하에서 수행될 수 있다. 그러므로, 제 1 세트의 조건 하에서만 오로지 활성을 나타내는 분자가 확인된다. 그러므로, 제 1 및/또는 제 2세트의 조건 하에서 스크리닝되는 분자들은 다른 세트 조건하에서 스크리닝되는 분자의 전부 또는 서브세트(subset)를 포함할 수 있다. 양성 및 음성 선택은 미리 결정된 조건부 활성을 가진 분자들이 확인될 때까지 반복될 수 있다.
방법은 복수 회로 수행될 수 있고, 이에 따라 상기 방법의 단계들은 1,2,3,4 또는 5회 반복된다. 예를 들어, 제 2 세트의 조건과 비교하여 제 1 세트의 조건 하에서 증가된 활성을 나타내는 것으로서 확인된 시험 분자, 예를 들어 단백질 변이체는 활성의 확인을 위해 재스크리닝 될 수 있다. 본원에서 제공된 방법은 또한 반복된다. 일 예에서, 방법이 수행된 후, 임의의 확인된 조건부 활성 분자들은 조건부 활성의 증가 또는 최적화를 위해 변형되거나 추가적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 1차로 확인된 조건부 활성 단백질에 추가적인 변형을 도입함으로써 제 2 라이브러리가 만들어 질 수 있다. 예를 들어, 조건부 활성의 증가로서 확인된 변형들은 조합될 수 있다. 제 2 라이브러리는 본원에서 기술된 분석 및 방법을 이용하여 시험될 수 있다. 상기 방법의 반복적 측면의 다른 예에서, 조건부 활성을 나타내지 않는 것으로 확인된 분자는, 그들이 활성이 아니거나 또는 제 1세트의 조건 하에서 증가된 활성을 가지지 않으므로, 더 변형될 수 있고, 조건부 활성에 대하여 재시험될 수 있다. 추가적인 변형은 분자의 활성 및/또는 안정성에 관련된 특정한 영역 근처(예를 들어, 특정한 아미노산 잔기)를 표적으로 할 수 있다.
방법의 단계 및 방법의 구성요소들의 기술은 이하의 서브섹션에서 제공된다.
1. 치료적 단백질
조건부 활성 분자를 확인하기 위한 방법의 실행에 사용하기 위한 시험되는 분자는 하나 이상의 특정 질환 또는 상태를 치료하거나 개선하는 것으로 알려진 단백질인 치료적 단백질일 수 있다. 예를 들어, 치료적 단백질은 종양 또는 암을 치료하거나 개선하는 것으로 알려진 단백질이다. 일부 예에서, 시험되는 분자들은 하나 이상의 변형, 예컨대 아미노산의 치환(들), 삽입(들) 또는 결실(들)을 포함하는 치료적 단백질의 변이체이다. 그러므로, 방법은 정상 조직 또는 세포와 비교하여 병적 미세환경, 예컨대 종양 환경에서 조건부 활성인 변이체 치료적 단백질들을 확인하는데 사용될 수 있다. 예시적인 치료적 단백질들이 종양 또는 암 치료제이므로, 상기 방법은 정상 미세환경보다 종양 미세환경에서 더 활성인 조건부 활성 치료제를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
상기 방법의 일부 예에서, 방법은 정상 생리적 조건 하와 비교하여 종양 미세환경에서 변경된 활성을 나타내는 분자를 확인하기 위한 고처리량(high throughput) 스크리닝 방법이다. 그러므로, 방법은 치료적 단백질의 활성, 예컨대 결합 활성을 진화시키는데 사용될 수 있다. 특히, 방법은 정상 조직에서는 아니나, 종양의 병적 미세환경에서 우선적으로 활성인 단백질의 확인을 위하여 기존의(existing) 치료적 단백질의 변이체를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 알려진 독성과 관련이 있는 치료적 단백질은 돌연변이를 포함하지 않는 치료적 제제와 비교하여 종양 미세환경에서만 우선적인 활성에 의하여 감소된 부작용을 가지는 변이체 단백질의 확인을 위하여 본원에서 제공되는 분석에서 돌연변이 유발되고 스크리닝될 수 있다. 그러므로, 상기 방법은 조건부 활성 바이오의약품들(conditionally active biologics; CABs)을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 최종 확인된 CAB들은 암 치료제 후보군이 될 수 있다.
a. 종양 또는 암 치료제
일부 예에서, 시험 분자는 기존의 암 치료제의 변이체 또는 알려진 임상적 후보군 암 치료제의 변이체인 치료적 단백질이다. 알려진 암 치료적 단백질의 변이체는 정상 환경에서보다 병적 미세환경, 예컨대 종양 미세환경에서 더 높은 활성을 나타내는 진화된 치료적 단백질을 확인하기 위하여 본원에서 제공되는 방법으로 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 만약 활성이 결합 활성이라면, 본원에서 제공되는 방법은 정상 미세환경과 비교하여 종양 또는 암 미세환경에서 우선적으로 결합하는 조건부 활성 암 치료적 단백질을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 변이체를 생성하기 위한 스캐폴드(scaffold) 또는 시험 분자로서 사용되는 치료적 단백질은 종양 또는 암 치료의 개입 포인트인 표적 단백질과 상호작용하는 단백질일 수 있다. 이러한 암-촉진 표적 단백질은 암 세포 또는 종양의 증식, 혈관 신생 또는 세포 성장 특성과 관련된 임의의 리간드, 수용체, 효소 또는 다른 제제를 포함한다. 표적 단백질은 치료적 개입의 알려진 표적에 기초하여 선택될 수 있다. 표적은 치료적 단백질에 대한 대리 단백질 항원(surrogate protein antigen) 또는 동족 결합 파트너가 될 수 있다. 알려진 암 치료제에 대한 표적은 알려져 있다. 이러한 표적 단백질의 예는 EGFR, HER2, CD20, VEGF-A, EpCAM, CD3, CD33, CD80, CTLA-4, α5β1 인테그린, 메소텔린(Mesothelin), 또는 IGF-1R을 포함하나 이에 제한되지 않는 표에 열거된 임의의 것이다. 예를 들어, 예시적인 치료적 분자는 EGFR과의 상호작용과 관련된 치료 효과를 갖거나 이와 상호작용하는 분자 또는 단백질이다.
본원의 분석에서 변형된 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있고 스크리닝에 사용될 수 있는 예시적인 종양 또는 암 치료적 단백질은 표 3에 나타내었다. 표는 또한 암 치료제의 표적 단백질, 예컨대 동족 또는 대리 단백질 항원을 나타낸다. 그러므로, 본원에서 제공되는 방법에서 암 치료적 단백질 또는 변형된 암 치료적 단백질(들)은 그들의 동족 표적 단백질, 예컨대 대리 단백질 리간드에 대한 결합에 대하여 스크리닝될 수 있고/있거나 표적 단백질의 변경된 활성에 영향을 주는지에 관해 스크리닝될 수 있다. 종양 미세환경에서 조건부 활성인 것으로 확인되거나 선택된 단백질, 예컨대 돌연변이체 단백질은 정상 생리적 조건과 비교하여 종양 미세환경을 시뮬레이션한 in vitro 조건 하에서 우선적 결합 활성 및/또는 다른 활성을 나타내는 것이다. 일부 예에서, 변형되지 않은 단백질 예를 들어, 돌연변이를 포함하지 않는 치료적 또는 부모(parent) 대조군 항체와 비교하여 종양 미세환경에서 증가된 활성을 나타내는 변형된 단백질이 또한 확인될 수 있다.
[표 3]
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
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b. 변형된 단백질의 라이브러리 생산
본원의 방법에서 사용된 치료적 단백질은 기존 치료제인 변형되지 않은 단백질일 수 있다. 기존 치료제의 라이브러리 또는 콜렉션은 또한 스크리닝 될 수 있다. 다른 예에서, 치료적 단백질은 변형된 단백질, 예컨대 변형된 펩티드, 변형된 효소, 변형된 항체 또는 다른 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 변형된 치료제가 상기 방법의 실행에 사용되는 예에서, 변형되지 않은 단백질을 사용하는 분석이 양성 대조군으로서 수행될 수 있거나, 또는 변형된 단백질을 이용하여 수행된 분석 결과와의 비교를 위해 수행될 수 있다.
치료적 단백질은 단백질의 구조를 변경할 수 있는 당 분야의 기술자에게 알려진 임의의 공정에 의하여 변형될 수 있다. 변형의 예는 변형된 치료적 단백질의 라이브러리 또는 콜렉션을 형성하기 위한 단백질의 하나 이상의 아미노산의 치환, 추가 및 결실을 포함한다. 라이브러리 또는 콜렉션은 조건부 활성 치료적 단백질을 확인하기 위한 병적 미세환경 및 정상 미세환경을 시뮬레이션한 조건 하에서 본원에서 제공되는 분석에 의해 스크리닝될 수 있다.
본원의 방법에 사용하기 위한 변형된 또는 변이체 단백질을 생산하는 것은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 수준 내에 있다. 돌연변이 유발의 방법은 본 발명이 속하는 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 위치 지정 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis) 예컨대 예를 들어 QuikChange (Stratagene) 또는 포화 돌연변이 유발(saturation mutagenesis)을 포함한다. 돌연변이 유발 방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 위치-매개된 돌연변이 유발(site-mediated mutagenesis), PCR 돌연변이 유발, 카세트 돌연변이 유발, 위치-지정 돌연변이 유발, 무작위 점 돌연변이 유발(random point mutagenesis), 우라실 포함 주형을 이용한 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이 유발, 포스포로티오에이트(phosphorothioate)-변형된 DNA 돌연변이 유발, 갭화된(gapped) 이중체 DNA(gapped duplex DNA)를 이용한 돌연변이 유발, 점 미스매치 수선(point mismatch repair), 수선-결핍 숙주를 이용한 돌연변이 유발, 제한-선택 및 제한-정제, 결실 돌연변이 유발, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발, 이중 가닥 절단 수선(break repair), 및 당업자에게 알려진 많은 다른 방법을 포함한다. 본원의 방법에서, 돌연변이 유발은 단백질의 전장에 걸쳐 또는 단백질의 영역 내에서 시행될 수 있다. 돌연변이는 논리적으로 또는 무작위적으로 만들어 질 수 있다.
만약 시험 분자가 단백질이라면, 변형은 단백질의 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 변형은 무작위로 선택된다. 일부 예에서, 변형은 조건부 활성을 가진 분자를 야기하도록 선택된다. 예를 들어, 논리적 돌연변이 유발은 치료적 단백질의 활성 및/또는 구조적 안정성에 중요한 것으로 확인되거나 당업계에 알려진 아미노산의 돌연변이를 포함한다. 중요한 것으로 알려진 잔기의 예는 예를 들어, 결합 포켓(binding pocket) 내 아미노산 또는 활성부위 잔기를 포함한다. 예를 들어, 치료적 단백질의 활성 또는 구조적 안정성에 중요한 아미노산은, 조건부 활성 치료적 단백질을 확인하기 위하여 스크리닝될 수 있는 변형된 치료적 단백질의 라이브러리를 형성하기 위하여 치환되도록 선택될 수 있다. 또한, 돌연변이를 위한 잔기들은 위치-지정 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝, 구조/기능 관계, 상동성 모델링, 이론적 모델링 및 본원에 기술된 임의의 분석을 포함하는 당 분야에 속하는 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의하여 경험적으로 확인될 수 있다. 또한, 라이브러리는 치환된 아미노산을 무작위적으로 선택함으로써 형성될 수 있다. 돌연변이 단백질의 라이브러리 또는 콜렉션은 본원의 방법에서 생성될 수 있으며, 시험 또는 스크리닝 될 수 있다.
병적 조건, 예를 들어, 종양 환경에 존재하는 산성 조건 하에서 더 활성인 조건부 활성 단백질을 확인하기 위하여, 변형된 단백질 내 하나 이상의 아미노산은 두 개의 pH 조건 사이에서 양성자화 상태가 변화될 수 있는 이온화 가능기(group)를 가진 아미노산으로 독립적으로 치환될 수 있다. 아미노산의 특정한 선택은 조건부 활성을 위해 시험되고 있는 특정한 pH 조건에 의존적이다. 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자는 두 개의 다른 pH 값 사이에서 이온화 상태가 변화할 수 있는 이온화 가능기를 포함하는 하나 이상의 치환 아미노산을 선택할 수 있다. 예를 들어, 핸더슨-하셀바흐 공식(Henderson-Hasselbalch equation)(pH = pKa + log ([A-]/[HA])은 본 발명이 속하는 분야에 알려진 임의의 방법(예를 들어, 적정 곡선 및/또는 핵 자기 공명)을 이용하여 측정할 수 있는 측쇄 pKa의 기능으로서 아미노산의 양성자화 및 비양성자화 측쇄의 비율을 결정하는 데 사용될 수 있거나, 또는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법(Davies et al. (2006), BMC Biochem. 7:18; Juffer (1998), Biochem. Cell Biol. 76(2-3):198-209; Sham et al (1997), J. Phys. Chem. B 101(22):4458-4472; Nielsen (2007) J. Mol. Graph. Model. 25(5):691-699; Bas et al. (2008), Proteins 73(3):765-783), 예컨대 분자 동역학 모델링(molecular dynamics modeling)(예를 들어, Li et al. (2005), Proteins, 61:704-721; Bas et al. (2008), Proteins, 73:765-783) 또는 포이슨-볼츠만 공식(the Poisson-Boltzmann equation)(Fogolari et al. (2002) J. Mol. Recognit. 15(6):377-392)을 이용하여 계산될 수 있다. 일부 예에서, 아미노산의 pKa는 아미노산 측쇄에 대한 모델 값을 사용하여 결정된다(예를 들어, Nielsen (2001), Proteins 43(4):403-12 참조). 단백질의 이온화 가능 잔기의 양성자화 상태는 단백질의 하나 이상의 활성(예를 들어, 친화도, 효소적 활성, 용해도, 전하 및 안정성)을 pH-의존적인 방식으로 변경할 수 있다(Rostkowski et al. (2011), BMC Struct. Biol. 11:6). 이러한 잔기의 예는 Asp, Glu, Lys, Arg 및 His이다.
특히, 낮은 pH 종양 미세환경에서 변경된 활성을 가지는 단백질을 확인하기위한 본원에서 제공되는 방법의 목적을 위하여, 치료적 분자의 아미노산 잔기는 히스티딘으로 변화될 수 있다. 예를 들어, 히스티딘 측쇄는 pH 7.0과 비교하여 pH 6.0에서 항체의 pH-의존적 친화도에 관여하는 것으로 확인되어 왔다(예를 들어, Raghavan et al. (1995) Biochemistry, 34:14649-14657 참조).
일부 예에서, 본원에서 제공되는 방법은 단백질이 시험되기 전에 각각의 돌연변이체 단백질의 동일성이 선험적으로 인식되도록 수행된다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법은 돌연변이 유발 및 어드레서블한 스크리닝 또는 시험 방법에 도움이 될 수 있다. 이것은 이중 비교 분석 방법에서, 병적 미세환경 및 정상 미세환경을 시뮬레이션한 활성 분석 조건들, 예컨대 결합 분석 조건들 사이의 비교의 용이를 허용할 수 있다. 예를 들어, 위치-지정 돌연변이 유발 방법은 돌연변이 단백질을 개별적으로 생산하는데 사용될 수 있다. 각각의 생산된 개별적인 돌연변이체가 각각의 단일 돌연변이 유발 반응의 단일 산물이 되도록, 돌연변이 유발은 하나씩(one-by-one) 특이적 표적 위치에서 단일 아미노산 잔기의 치환에 의해서 수행될 수 있다. 즉 개별적으로 각각 생산된 돌연변이는 각각의 단일 돌연변이 유발 반응의 단일 산물이다. DNA 분자 돌연변이체는 예컨대 어드레서블 어레이에서, 개별적으로 설계되고, 돌연변이 유발에 의해 생성되고 클로닝될 수 있으므로, 그들은 물리적으로 서로 분리되며, 각각은 독립적인 돌연변이 유발 반응의 단일 산물이다. 최적화될 특정 단백질 상의 표적 위치를 치환하기 위하여 선택된 아미노산은 남은 19개 아미노산의 전부, 또는 오직 선택된 아미노산만을 포함하는 더 한정된 기일 수 있다. 본원에서 제공되는 일부 방법에서, 치환되는 각각의 아미노산은 남은 아미노산 19개에 의해서 또는 남은 아미노산의 19개 미만, 예컨대 남은 아미노산의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18에 의해서 독립적으로 치환될 수 있다.
변형된 단백질, 예컨대 돌연변이 DNA 분자의 콜렉션으로부터 유래된 돌연변이 단백질 분자는, 예컨대 어레이, 예컨대 어드레서블 어레이에서 포맷팅(formatting)함으로써, 물리적으로 서로 분리될 수 있다. 그러므로, 복수의 변형된 단백질 분자들, 예를 들어, 돌연변이 단백질 분자들이 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법에 사용되는 변형된 단백질은 표적 위치에서의 단일 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 방법은 본원에서 기술된 하나 이상의 분석 조건 하에서 각각의 변형된 단백질에 수행될 수 있다. 일단 병적 미세환경에서 우선적 활성을 나타내는 단일 돌연변이를 포함하는 변형된 단백질들이 확인되면, 단일 아미노산 돌연변이, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 돌연변이들의 일부 또는 전체 순열을 포함하는 조합 돌연변이체가 생산될 수 있다.
(a) 변형된 치료적 항체
일부 예에서, 분석은 변형된 치료적 항체인 변형된 치료적 단백질을 이용하여 수행된다. 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 항체들은 전형적으로 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 또는 항원 결합 부위 형성에 충분한 이의 부분을 포함한다. 그러나, 항체는 또한 불변 중쇄(예를 들어, 하나 이상의 CH 도메인, 예컨대 CH1, CH2, CH3 및 CH4, 및/또는 불변 경쇄(CL))의 전부 또는 부분을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 그러므로, 항체는 전장 항체인 것을 포함할 수 있고 또한 예를 들어 Fab, Fab', F(ab'2), 단쇄 Fvs(scFv), Fv, dsFv, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편, Fab 단편, scFv 단편 및 scFab 단편을 포함하는 이의 부분 또는 단편을 포함할 수 있다. 최종적인 변형된 항체들은 전장 항체 또는 이의 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab'2), 단쇄 Fvs(scFv), Fv, dsFv, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편, Fab 단편, scFv 단편, 및 scFab 단편으로서 생산될 수 있다는 것이 이해된다. 또한, 임의의 아형의 불변 영역은 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 포함하는 전장 또는 부분 항체 단편의 제조에서 사용될 수 있다. 이러한 불변 영역들은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 얻어질 수 있다. 활성 및 결합 친화도는 항체의 구조에 따라 달라질 수 있는 것이 이해된다. 예를 들어, 일반적으로 이가 항체, 예를 들어 이가 F(ab'2) 단편 또는 전장 IgG는, 단가(monovalent) Fab 항체보다 더 나은 결합 친화도를 갖는다. 결과적으로, Fab가 특정한 표적에 대한 특이적 결합 친화도를 가지는 경우, 결합 친화도가 이가인 전장 IgG에 대하여 매우 클 것이 기대된다. 그러므로, 항체들 사이에서 결합 친화도의 비교는 전형적으로 동일한 구조를 가진 항체들 사이에서, 예를 들어, Fab와 Fab의 비교로 만들어진다.
항체 변이체들은 본원에서 제공된 방법으로 제조되고 스크리닝 될 수 있다. 특히, 기존의(existing) 항체 암 치료제의 변이체들, 예컨대 항-EGFR 항체의 돌연변이체 예를 들어 얼비툭스의 돌연변이체가 생산될 수 있다. 일부 예에서, 이 방법은 항체 내 임의의 위치에 위치하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 항체와 함께 수행된다. 본원에서 제공된 방법의 일부 예에서, 변형은 항체의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄에서 만들어진다.
전형적으로, 아미노산 돌연변이들은 항체 내로 하나 이상의 CDR에서 도입된다. 예를 들어, 아미노산 돌연변이는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역을 암호화하는 서열 내에 도입될 수 있다. 일부 예에서, 돌연변이는 또한 항체의 프레임워크(framework region; FR), 특히 항원과 접촉하는데 관여하는 것으로 알려진 FR 잔기에서 만들어 질 수 있다. 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자는 Kabat 또는 Chothia 넘버링(예를 들어, Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th 판, 미국 보건복지부(U.S. Department of Health and Human Services), NIH 출판번호 91-3242호, 및 Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 참조)에 기반한 CDR들 및 FR을 이해하고 확인할 수 있다. 예를 들어, Kabat 넘버링에 기초하여, CDR-L1은 L24-L34 잔기에 상응하고; CDR-L2는 L50-L56 잔기에 상응하고; CDR-L3는 L89-L97 잔기에 상응하고; CDR-H1은 H31-H35, 길이 의존적인 35a 또는 35b 잔기에 상응하고; CDR-H2는 H50-H65에 상응하고; 및 CDR-H3는 H95-H102 잔기에 상응한다. 예를 들어, Kabat 넘버링에 기초하여, FR-L1은 L1-L23 잔기에 상응하고; FR-L2는 L35-L49 잔기에 상응하고; FR-L3는 L57-L88 잔기에 상응하고; FR-L4는 L98-L109 잔기에 상응하고; FR-H1은 H1-H30 잔기에 상응하고; FR-H2는 H36-H49 잔기에 상응하고; FR-H3는 H66-H94 잔기에 상응하며; 및 FR-H4는 H103-H113 잔기에 상응한다.
돌연변이를 포함하는 항체 라이브러리의 제조 방법은 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 에러 유발(error-prone) PCR(Zhou et al., (1991) Nucleic Acids Research 19(21):6052; 및 US 2004/0110294호)을 이용함으로써 in vitro에서 무작위 돌연변이 도입에 의한 주형으로서 알려진 항체를 사용; 하나 이상의 CDR들 또는 FR들의 무작위적 돌연변이(예를 들어, WO 96/07754호; Barbas et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91:3809-3813; Cumbers et al. (2002) Nat. Biotechnol., 20:1129-1134; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226:889-896; Jackson et al., (1995) J. Immunol., 154:3310-3319; Wu et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 6037-6042; McCall et al. (1999) Molecular Immunology, 36:433-445 참조); 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발(Rosok et al., (1998) The Journal of Immunology, 160:2353-2359); 코돈 카세트 돌연변이 유발(Kegler-Ebo et al., (1994) Nucleic Acids Research, 22(9):1593-1599); 2-단계(two-step) PCR 및 중첩(overlap) PCR을 포함하는 축퇴성(degenerate) 프라이머 PCR(미국 특허번호 5,545,142호, 6,248,516호, 및 7,189,841호; Higuchi et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(15):7351-7367; 및 Dubreuil et al., (2005) The Journal of Biological Chemistry 280(26):24880-24887); Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783 (1992)에서 기술된 것과 같은 면역화되지 않은 수여자로부터 얻어지는 자연적으로 발생하는 V 도메인 변이체들의 레파토리들을 가진 파지 디스플레이로부터 선택되는 VH 또는 VL 도메인들의 재조합 및 몇몇 라운드의 쇄 리셔플링(chain reshuffling)에서 더 높은 친화도에 대한 스크리닝에 의한 도메인 셔플링(domain shuffling)을 포함한다. 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이, CDR들 또는 FR 내 잔기의 돌연변이 유발은 어드레서블 포맷에서, 하나씩 이루어질 수 있고 그럼으로써 본원의 이중 분석 방법에서 쉽게 스크리닝될 수 있는 개별적인 돌연변이가 제조된다.
i. 변형된 항-EGFR 치료제
본원에서 제공되는 방법의 일부 예에서, 본원의 방법에 사용되기 위해 변형된 치료적 단백질은 표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR)의 전체 또는 부분과 상호작용하는 것이다. 그러므로, 예를 들어, 본원의 방법에서 돌연변이 유발 및 스크리닝을 위한 치료적 단백질은 EGFR의 세포외도메인, EGFR의 세포질 도메인 또는 EGFR의 내부 티로신 키나아제 도메인과 상호작용할 수 있는 것이다. 일부 예에서, 변형되지 않은 치료적 단백질은 EGFR-매개 신호 전달을 억제하는 것이다. 예를 들어, EGFR과 단백질의 상호작용은 예를 들어 EGF, TGF-α, 암피레귤린(amphiregulin), 해파린-결합 EGF(HB-EGF) 및 베타셀룰린(betacellulin)을 포함하는 EGFR에 대한 하나 이상의 리간드와 EGFR의 상호작용을 막을 수 있다. 특정 예에서, EGFR에 대한 치료적 단백질은 EGFR과 EGF 및/또는 TGF-α의 상호작용을 막는다. 치료적 단백질은 EGFR과 상호작용할 수 있고 다른 EGFR 수용체 서브유닛과의 EGFR 이합체화(즉, EGFR 동형이량체) 또는 다른 생장 인자 수용체와의 이종 이합체화(예를 들어, HER2)를 억제할 수 있다.
일부 예에서, EGFR과 상호작용하는 단백질은 항-EGFR 항체이다. 항-EGFR 항체는 인간화된 항-EGFR 항체일 수 있다. 그러므로, 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 변형된 단백질, 예컨대 본원에서 제공되는 항체 변이체들의 예는 변형된 항-EGFR 항체들이다. 돌연변이 유발될 수 있고 본원에서 제공되는 방법에 사용될 수 있는 항-EGFR 항체들의 예는 Zhu에 의해 설계된 항체 11F8(WO 2005/090407호), EMD 72000 (마투주맙(matuzumab)), Vectibix™(파니투무맙(panitumumab); ABX-EGF), TheraCIM(니모투주맙(nimotuzumab)), 및 Hu-Max-EGFR(잘루투무맙(zalutumumab)) 및 본원에서 기술된 임의의 항-EGFR 항체를 포함한다. 특히, 항-EGFR 항체 얼비툭스®의 변이체는 정상 환경보다 종양 미세환경에서 더 활성인 조건부 활성 단백질에 대한 본원의 방법에 있어서의 스크리닝을 위하여 제공된다.
저분자들 뿐만 아니라 항-EGFR 항체들은 정상 및 종양 세포 모두의 EGF 수용체와 특이적으로 결합할 수 있으며, 그것의 동족 수용체와 표피 생장 인자(EGF)와의 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있다. 이러한 차단은 수용체의 인산화 및 수용체-연관 키나아제 활성의 활성화를 막을 수 있고, 궁극적으로 수용체-매개 세포 신호를 차단하여 세포 사멸을 이끈다. 특이적으로, 항-EGFR 항체 얼비툭스®(세툭시맙(Cetuximab) 또는 C225)(서열번호: 1 및 2)는 대장의 암종 및 편평상피 세포 암종의 치료를 위해 사용되는 EGFR에 대한 키메릭 항체이다. 얼비툭스®는 EGFR의 세포외 도메인에 결합할 수 있으며 리간드 결합을 차단할 수 있는 인간-마우스 키메릭 단일클론 EGFR 길항제 항체이다. EGFR과 결합하는 얼비툭스®는 이합체화를 억제하고, 궁극적으로 종양 성장 및 전이를 억제할 수 있다(Blick et al., (2007) Drugs 67(17):2585-2607). 얼비툭스®는 또한 혈관신생의 억제를 통해서 항종양 효과를 유도할 수 있다. 얼비툭스®는 매우 전이성인 인간 TCC 253JB-V 세포에서 VEGF, IL-8 및 bFGF의 발현을 용량 의존적인 방식으로 억제하고 미세혈관의 밀도를 감소시킨다(Perrotte et al. (1999), Clin. Cancer Res., 5:257-264). 얼비툭스®는 in vitro 및 in vivo에서 종양세포의 VEGF의 발현을 하향 조절할 수 있다(Petit et al. (1997), Am. J. Pathol., 151:1523-1530; Prewett et al. (1998), Clin. Cancer Res.4:2957-2966).
미국에서, 얼비툭스®는 세계적으로 암 사망에서 6번째 주된 원인인 두경부의 편평상피세포 암(SCCHN)의 치료를 위하여 단독으로 또는 방사선 치료와 함께 조합으로 사용되도록 승인되었다. SCCHN을 가진 환자의 약 40%가 전이성 질환을 가진것으로 나타나고, 한 연구에서 5년간 생존 비율은 I기 질환(stage I disease)에 대하여 91%, Ⅱ기에 대하여 77%, Ⅲ기에 대하여 61%, IVa기에 대하여 32%, IVb기에 대하여 25% 및 IVc기 질환에 대하여 4% 미만이였다(Lefebvre (2005) Ann. Oncol. 16(Suppl 6):vi7-vi12). 이리노데칸(irinotecan)과 세툭시맙의 조합은 이리노데칸에 기초한 치료에 난치성인 EGFR-발현 종양을 가진 환자에서 전이성 대장암(mCRC)의 치료에 대하여 승인되었다 (Blick et al., (2007) Drugs 67(17):2585-2607).
항-EGFR 제제, 예컨대 항체 얼비툭스®들은 종종 치료의 중지 및 투여 중단을 이끄는 뚜렷하고 특징적인 유해 사례(adverse events) 예컨대 피부 독성 및 소화 장애(메스꺼움, 구토, 설사를 포함하는)와 관련된다. 얼비툭스는 피부 EGFR 리간드가 미분화된 각질형성세포 상의 수용체에 결합하는 것을 막아, 미분화된 세포들의 축적 및 표피 재생을 위한 성숙한 세포의 결핍을 야기할 수 있다. 이것은 심각한 여드름 유사 피부 발진을 야기할 수 있다(Eng C (2009) Nat. Rev. Clin. Oncol. 6:207-18). 이같은 부작용의 결과로 환자의 76%는 약물 투여 중단과 관련이 있으며, 60%는 투여량의 감소와, 32%는 약물의 중지(불연속)와 관련이 있다. 얼비툭스®의 가능한 다른 가능한 부작용은 심부 정맥 및 동맥 혈전증, 여드름, 호흡곤란, 피로, 복부 통증, 무기력증, 심방세동(atrial fibrillation)을 포함한다(Fakih 및 Vincent, (2010) Curr. Oncol. 17(S1):S18-S30). 일부 경우에서 부작용은 환자가 세툭시맙을 이용한 추가적 치료를 받는 것을 막을 수 있다. 그러므로, 치료적 분자, 예컨대 최소화되거나 제한된 전신성 부작용을 나타내나, 여전히 종양 미세환경 내에서 그들의 표적 결합 활성을 유지하는 치료적 단백질에 대한 요구가 존재한다.
항-EGFR 항체의 항체 변이체는 본원에서 제공되는 분석, 예컨대 병적 및 정상 미세환경을 시뮬레이션하도록 수행되는 이중 분석에서 생산될 수 있고 스크리닝될 수 있다. 본원에서 항-EGFR 항체 얼비툭스®의 가변 경쇄 및 중쇄에서의 단일 아미노산 치환을 포함하는 항-EGFR 항체의 항체 변이체 콜렉션이 제공된다(예를 들어, 실시예 8 및 도 1 참조). 특히, EGFR과의 접촉과 관련있는 프레임워크 잔기 내 및 CDR1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 내의 각각 100개 잔기는 독립적으로 19개까지 다른 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개 아미노산, 및 특히 적어도 또는 적어도 약 15개 이하의 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 항-EGFR 항체 얼비툭스에서, CDR-H1은 서열번호 2의 26-35 또는 31-35 아미노산에 상응하고, CDR-H2는 서열번호 2의 50-65 아미노산에 상응하고, CDR-H3는 서열번호 2의 98-108 아미노산에 상응하고, CDR-L1은 서열번호 1의 24-34 아미노산에 상응하고, CDR-L2은 서열번호 1의 50-56 아미노산에 상응하고, CDR-L3는 서열번호 1의 89-97 아미노산에 상응한다. 변형을 위해 선택되는 아미노산은 서열번호 2의 23-37, 50-77, 93-94 및 96-112 중쇄 잔기 및 서열번호 1의 1-5, 24-34, 48-56, 86-87 및 89-100 경쇄 잔기를 포함한다(도 1 참조). 변이체 항-EGFR 항체들의 콜렉션들에서, 콜렉션의 모든 위치는 부모 얼비툭스 항체 내에 히스티딘이 존재하는 위치를 제외하고 히스티딘으로의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 항-EGFR 항체들의 콜렉션은 어드레서블 어레이(addressable assay)에서 제공될 수 있다.
항-EGFR 항체의 항체 변이체, 예를 들어 변이체 얼비툭스 항체는, 암을 치료하기 위한 개선된 변이체 항-EGFR 유사체를 확인하기 위하여 본원의 이중 분석에서 생산될 수 있고 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법은 항-EGFR 변이체 항체들, 예를 들어 변이체 얼비툭스 항체들을 시험하는데 사용될 수 있고, 감소된 pH 및 상승된 젖산염 농도의 종양 미세 환경 내에서는 EGFR과 결합하나, 정상 생리적 pH에서는 그렇지 않은 변이체 또는 변이체들을 확인하는데 사용될 수 있다.
2. 조건부 활성을 위한 두 개의 다른 생리적 조건 하에서의 활성 시험 또는 스크리닝
본원에서 제공되는 방법에서, 하나 이상의 분자, 예컨대 상기 기술된 임의의 것의 활성은 두 개의 다른 생리적 환경에서의 조건 또는 조건들, 예컨대, 예를 들어 병적 미세환경 및 비-병적 미세환경의 정상 생리적 조건을 시뮬레이션하는 두 개의 상이한 세트 조건 하에서 스크리닝되거나 시험된다. 전형적으로, 조건들은 in vitro에서 시뮬레이션될 수 있거나 복제될 수 있는 조건들이다. 세트 조건은 질환과 연관된 미세환경을 시뮬레이션하기 위한 하나 이상의 조건을 포함할 수 있다. 질환들은 세포내 및 세포외 항상성을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 병적 미세환경은 종양 미세환경 또는 암 미세환경 내의 하나 이상의 조건들을 시뮬레이션할 수 있다. 전형적으로, 두 개의 세트 조건 하에서의 활성의 차이 또는 차이들은 분자의 조건부 활성을 야기할 수 있다. 그러므로, 제 2 세트의 조건(예를 들어, 정상 또는 비-병적 환경 내 조건을 시뮬레이션하는)과 비교하여 제 1 세트의 조건(예를 들어, 종양 미세환경 내 조건을 시뮬레이션 하는)하에서 더 큰 활성을 나타내는 분자가 조건부 활성인 후보 분자로서 확인된다.
두 개 세트의 조건들은 두 개의 생리적 환경, 예컨대 본원에서 기술되거나 당 분야에 속하는 통상의 기술자에게 알려진 환경 내에서 상이한, 이에 한정되는 것은 아니나, 화학적 조건, 생물학적 조건 또는 물리적 조건을 포함하는 하나 이상의 파라미터에 의해 달라지도록 선택될 수 있다. 두 개의 세트 조건 사이에서 달라질 수 있는 파라미터들은 압력, 온도, pH, 이온강도, 탁도, 빛에 대한 노출(UV, 적외선 또는 가시광선을 포함), 하나 이상의 용질, 예컨대 전해질의 농도, 젖산의 농도, O2의 농도 및 산화제 또는 환원제의 존재 중에서 선택되는 하나 이상의 조건을 포함할 수 있다. 검량 표준 용액(calibration solutions) 내 전해질 및 완충액 시스템을 변화시킴으로써, 생리적 조건, 예를 들어 pH, 완충능, 이온 환경, 온도, 글루코오스 농도 및 이온 강도는 시뮬레이션될 생물학적 환경의 것으로 조절될 수 있다. 정상 생리 환경을 시뮬레이션한 세트 조건은 본원에서 기술된 하나 이상의 조건에 의해서 병적 미세환경, 예컨대 종양 미세환경을 시뮬레이션하는 세트 조건과 달라지도록 선택될 수 있다.
예를 들어, 하기에서 논의되는 바와 같이, 종양 미세환경의 다양한 파라미터는 비-종양 미세환경과 비교하여 상이한데, 여기에는 산소 농도, 압력, 보조-인자(co-factor)의 존재, pH, 젖산염 농도 및 피루브산염 농도가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이러한 파라미터 중 임의의 파라미터가 비-종양 또는 정상 환경에 존재하는 조건과 비교하여 종양 또는 암 환경에 존재하는 하나 또는 그 이상의 조건을 시뮬레이션하기 위하여 in vitro에 복제될 수 있다. 상기 시뮬레이션될 수 있는 정상 생리적 조건은 GI관, 피부, 맥관계, 혈액 및 세포외 기질과 같은 신체의 임의의 부위의 건강 또는 비 병적 조직에서 발견되는 환경을 포함한다.
전형적으로, 본원의 분석에서, 생리적 조건은 단백질의 활성을 평가하기 위해 사용되는 완충액의 선택에 의해 in vitro에서 시뮬레이션될 수 있다. 예를 들어, 임의의 하나 또는 그 이상의 조건의 병적 미세환경(예컨대 종양 미세환경) 및 비-병적 환경은 상기 분석에서 활성을 평가하기 위해 사용되는 분석 완충액을 서로 상이하게 함으로써 시뮬레이션될 수 있다. 그러므로, 조건부 활성 단백질을 확인하기 위한 본원의 방법에서, 분석 완충액의 구성 요소 또는 구성 요소들 또는 특징 또는 특징들은 제 1 조건 하의 활성을 시험하기 위한 제 1 분석 및 제 2 조건 하의 활성을 시험하기 위하여 제 2 분석에서 서로 상이하도록 변경되거나 만들어진다. 예를 들어, 본원에서 논의되는 바와 같이, 종양 미세환경의 다양한 파라미터들은 비-종양 환경과 비교하여 산소, 압력, 보조-인자의 존재, pH, 젖산염 농도(예컨대 증가된 또는 감소된 젖산염 농도) 및 피루브산염 농도(증가된 또는 감소된 피루브산염 농도를 포함)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 임의의 하나 또는 그 이상의 이들 조건이 특정한 분석 완충액의 선택에 의해 in vitro에서 시뮬레이션될 수 있다.
병적 미세환경에서 변경된 공지되어 있거나 본원에 기술된 하나 또는 그 이상의 조건을 제외하고, 상기 정상 환경을 시뮬레이션한 분석 완충액의 조성물과 동일한 병적 미세환경을 시뮬레이션하는 분석 완충액의 조성물이 선택될 수 있다. 또한, 2 개의 서로 다른 세트의 조건 하에서 하나 또는 그 이상의 시험 분자의 활성을 스크리닝 또는 확인함에 있어서, 일반적으로 상기 분석에서 다양하게 되는 유일한 조건은 in vivo 미세환경을 시뮬레이션하는 완충액 조건과 관련되어 있다. 상기 분석의 또 다른 조건은, 예컨대 시간, 온도, 및 배양 조건은, 양 세트의 조건에서 동일할 수 있다.
전형적으로, 상기 동일한 염기 완충액은 병적 미세환경을 시뮬레이션하는 세트의 조건 및 정상 미세환경을 시뮬레이션하는 세트의 조건에서 사용되지만, 완충액 조성물의 디자인은 하나 또는 그 이상의 파라미터, 예컨대 pH, 산소, 압력, 보조-인자의 존재, pH, 젖산염 농도(예컨대 증가된 또는 감소된 젖산염 농도) 및/또는 피루브산염 농도(증가된 또는 감소된 피루브산염 농도를 포함)가 상이하도록 만들어질 수 있다. 상기 병적 미세환경을 시뮬레이션하는 조건 및 정상 미세환경을 시뮬레이션하는 조건에서, 당업자에게 알려진 임의의 염기 완충액이 사용될 수 있는데, 여기에는 TAPS ((N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노프로판설폰산),), 트리스(트리스(하이드록시메틸)메틸아민), 트리신(N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신, TAPSO(3-[N-트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-2-하이드록시프로판설폰산, HEPES(4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), TES(2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), MOPS (3-(N-모폴리노)프로판설폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), Cacodylate(디메틸비산), SSC(구연산 나트륨 생리식염수), MES(2-(N-모폴리노)에탄설폰산) 및 임의의 Good's 완충액(MES, ADA, PIPES, ACES, 콜라민 염화물, BES, TES, HEPES, 아세타미도글리신, 트리센(Tricene), 글리신아미드 및 비신 (N,N-비스(2-(하이드록시에틸)글리신))이 포함된다.
당업자는 적절한 인자, 예컨대 완충액 pKa; 용해도; 막 불투과성; 완충액 해리에 대한 완충액 농도, 온도 및 매체(medium)의 이온 조성의 최소 효과; 안정성, 낮은 광흡수(예컨대 Good et al., (1966) Biochemistry 5(2):467-477 참조)를 고려함으로써 적절한 완충액을 선택할 수 있다. 사용되는 완충액의 선택은 시뮬레이션되는 특정한 파라미터 또는 파라미터들에 의존하여 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 분석에서 사용될 수 있는 완충액은 pH 범위에 대해 적절한 완충 용량을 갖는 임의의 완충액을 포함한다. 전형적으로, 완충액의 이온강도 또는 농도가 높을수록, 완충 용량도 높다. 전형적으로, 상기 완충액은 생리적 환경을 반영하기 위해 선택된다. 생리적 완충액의 예는, 인산완충식염수(PBS), 행크스 평형염류 용액(HBSS), 링거액(Ringers) 또는 크렙액(Krebs)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원에 기술된 임의의 조건에서, 생리적 환경을 시뮬레이션하기 위해서 인간 혈청이 생리적 조건을 시뮬레이션한 농도로, 예컨대 1-40% 인간 혈청, 일부 예에서 5-30% 인간 혈청, 및 일부 실시예에서 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% 인간 혈청만큼 첨가될 수 있다.
a. 종양 미세환경
예를 들어, 비-종양 미세환경 또는 정상 생리적 조건과 비교하여, 종양 미세환경 내에 세포외 및/또는 세포내 조건(예컨대 종양 미세환경 내의 세포외 기질에서 발견되는 조건)을 시뮬레이션하기 위해, 분석 세트의 조건이 선택될 수 있다. 일부 예에서, 분석에서 사용되는 세트의 조건이 종양 미세환경의 조건, 예컨대 종양과 관련된 또는 종양에 특이적인 조건으로 인한 종양 미세환경의 조건을 시뮬레이션한다. 예를 들어, 암은 변경된 pH 및 증가된 산화 포텐셜, 변경된 혈관신생, 저산소증, 세포외 및 세포 pH, 증가된 간질액압(IFP), 산소 수준, 압력, 젖산염 농도 및 피루브산염 농도, 유도된 보조-인자들(하기 표 4 참조)을 포함하는 수많은 바이오마커와 관련이 있다(Aluri et al. (2009), Adv. Drug. Deliv. Rev. 61(11):940-952; Gerweck 및 Seetharaman (1996), Cancer Res. 56(6):1194-1198; Cook et al. (2004), Semin. Radiat. Oncol. 14(3):259-266; Schafer 및 Buettner (2001); Free Radic. Biol. Med. 30(11):1191-1212). 이러한 조건 중 임의의 하나 또는 그 이상이 분석에서 시뮬레이션될 수 있다.
[표 4]
Figure pct00009
(1) pH
종양 미세환경을 시뮬레이션하기 위한 세트의 조건의 일부 예에서, 하나 또는 그 이상의 완충액들의 pH는 종양의 미세환경을 시뮬레이션하기 위해 조절된다. 변경된 pH 미세환경은 종양 미세환경과 같은 질환 상태에서 가장 일반적으로 발견되는 미세환경이며, 저산소증과 같은 기타 특성들과 비교하여 병적 미세환경 내에서 가장 일관되게 나타난다(예컨대 Fogh Andersen et al. (1995) Clin. Chem., 41:1522-1525; Bhujwalla et al. (2002) NMR Biomed., 15:114-119; Helmlinger et al. (1997) Nature Med., 3:177; Gerweck 및 Seetharaman (1996), Cancer Res. 56(6):1194-1198 참조). 예를 들어, 많은 종양에서 '와버그 효과'는 5.6 내지 6.8 범위의 pH의 미세환경을 만든다. 본원에서 기술된 상기 조건은 정상 생리적 pH 환경과 비교하여 낮은 pH 세포외 미세환경(ECM)을 시뮬레이션하는 조건을 포함한다. 그러므로, 낮은 pH를 시뮬레이션하는 조건 하 및 정상 생리적 pH(예컨대, 중성 pH)를 시뮬레이션하는 조건 하에서의 활성을 측정하는 분석은 종양 미세환경에서 조건부 활성인 생물학적 유효성을 가진 분자를 확인하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 정상 미세환경 조건의 pH는 생리적 조건 하에 존재하는 임의의 pH, 예컨대 약 7.0 내지 약 7.8의 임의의 pH, 예컨대 적어도 약 pH 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7 또는 7.8 (예컨대 미국 특허번호 7781405호 참조), 일부 예에서 pH 7.4일 수 있다.
정상 미세환경보다 더 산성인 pH, 예컨대 약 5.6 내지 6.8의 임의의 pH, 예를 들어 약 pH 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 또는 6.8 이하를 갖는 상기 종양 미세환경의 pH가 선택된다. 그러므로, 정상 미세환경을 시뮬레이션하는 조건의 세트의 pH는 종양 조건보다 더 염기성일 수 있다. 당업자에게 알려진 또는 본원에 기술된 임의의 완충액이 상기 희망되는 pH로 조정될 수 있다.
일부 예에서, 상기 종양의 pH 환경은 분석에 사용된 완충액의 pH를 변경시킴으로써 상기 분석에서 시뮬레이션된다. 상기 pH 및 완충 용량은 분석 조건과 상관 관계가 있고 당업자에 의해 경험적으로 결정되거나 선택될 수 있다. 당업자에게 알려진 임의의 완충액 또는 본원에 기술된 완충액이 상기 희망되는 pH로 조정되고 본원에 기술된 분석에서 사용될 수 있다. 당업자는 HCl과 같은 산, 또는 NaOH와 같은 염기를 첨가함으로써 완충액의 pH를 조정할 수 있다. 전형적으로, 완충액은 분석 조건의 온도에 평형상태가 되도록 하고, 사용 전에 상기 완충액의 pH는 확인되고, 필요한 경우 조정된다.
예를 들어, 크렙스-링거 중탄산염 완충액(KRB)와 같은 생리적 완충액은 약 5.6 내지 6.8 사이, 예컨대 6.0 내지 6.5, 예를 들어 약 6.0의 낮은 pH로 조정될 수 있다. 일부 예에서, 생리적 완충액, 예컨대 KRB는, 약 7.4인 pH로 조정될 수 있다. KRB 완충액은 확립된 세포주 및 인간 일차세포(primary cell)의 구조적 완전성을 유지할 수 있는 평형염류 용액이다. 또한, 중탄산염 완충 시스템은 포유류 혈액의 pH를 유지하기 위해 사용되는 주된 완충 시스템 중 하나이고 점막 보호 및 루미널(luminal) 완충과 관련되어 있다(Kaunitz 및 Akiba (2006), Ailment Pharmacol. Ther. 24(S4):169-176). 그러므로, KRB 완충액은 신체 내에서 발견되는 조건을 시뮬레이션할 수 있는 생리적 완충액이다. 표 5는 PBS와 비교한 크렙스-링거 중탄산염 완충액의 완충액 구성 요소를 나타낸다. 완충액은 1 N HCl로 최종 pH로 조정될 수 있다.
[표 5]
Figure pct00010
(2) 젖산염 농도
정상 환경 및 병적 환경, 예컨대 종양 환경 사이에 상이할 수 있는 조건은 젖산염 농도를 포함할 수 있다. 간의 당신생 기질인 것(Gladden, (2008), Med. Sci. Sports Exerc. 40(3):477-485) 이외에, 젖산염은 상처 회복, 재생, 호기성 대사 (Gladden (2004), J. Physiol.558(Pt 1):5-30)를 포함하는 다수의 생화학적 과정에서 중요한 중재자이다. 당업자는 신체의 건강 조직에서 젖산염의 생산 및 유지에 대한 기전(예컨대 Brooks (2010) J. Appl. Physiol. 108(6):1450-1451 참조), 및 건강 및 병적 조직 둘 다에서 예시적인 젖산염 농도(예컨대, Soliman 및 Vincent (2010), Acta Clin. Belg. 65(3):176-181; Friedman et al. (1995), Crit. Care. Med 23(7):1184-1193; Myburgh et al. (2001), Med. Sci. Sports Exer. 33(1):152-156 참조)에 대해 잘 알고 있다.
다수의 종양에서, '와버그 효과'는 젖산염 농도가 10 내지 15 mM 사이인 미세환경을 만든다. 상승된 젖산염 수준은 두경부, 전이성 대장암, 자궁경부암 및 편평세포암을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 암과 관련하여 발견된다(예컨대, Correlation of High Lactate Levels in Head and Neck Tumors with Incidence of Metastasis. Stefan Walenta, Ahmad Salameh, Heidi Lyng, Jan F. Evensen, Margarethe Mitze, Einar K. Rofstad, 및 Wolfgang Mueller-Klieser. (1997) American Journal of Pathology 150(2): 409-415; Correlation of High Lactate Levels in Human Cervical Cancer with Incidence of Metastasis. Georg Schwickert, Stefan Walenta, Kolbein Suiulfor. Einar K. Rofstad, 및 Wolfgang Mueller-Klieser. (1995) Cancer Research 55: 4757-4759; High Lactate Levels Predict Likelihood of Metastases, Tumor Recurrence, and Restricted Patient Survival in Human Cervical Cancers. Stefan Walenta, Michael Wetterling, Michael Lehrke, Georg Schwickert, Kolbein Sundfor, Einar K. Rofstad, 및 Wolfgang Mueller-Klieser. (2000) Cancer Research 60: 916-921; In Vitro Proton Magnetic Resonance Spectroscopic Lactate and Choline Measurements, 18F-FDG Uptake, and Prognosis in Patients with Lung Adenocarcinoma. JianFei Guo, Kotaro Higashi, Hajime Yokota, Yosinobu Nagao, Yoshimichi Ueda, Yuko Kodama, Manabu Oguchi, Suzuka Taki, Hisao Tonami, 및 Itaru Yamamoto. (2004) J Nucl Med 45: 1334-1339; Lactate and malignant tumors: A therapeutic target at the end stage of glycolysis. Saroj P. Mathupala, Chaim B. Colen, Prahlad Parajuli, Andrew E. Sloan (2007) J Bioenerg Biomembr 39: 73-77; Lactate Metabolism in Patients with Metastatic Colorectal Cancer. Christopher P. Holroyde, Rita S. Axelrod, Charles L. Skutches, Agnes C. Haff, Pavle Paul, 및 George A. Reichard. (1979) Cancer Research 39: 4900-4904; Lactate, not pyruvate, is neuronal aerobic glycolysis end product: an in vitro electrophysiological study. A Schurr 및 R.S. Payne. (2007) Neuroscience 147: 613-619; Tumor lactate content predicts for response to fractionated irradiation of human squamous cell carcinomas in nude mice. Verena Quennet, Ala Yarominab, Daniel Zipsb, Andrea Rosnerb, Stefan Walentaa, Michael Baumannb, Wolfgang Mueller-Kliesera. (2006) Radiotherapy and Oncology 81: 130-135 참조).
본원에 기술된 종양 미세환경을 시뮬레이션한 조건의 세트는 하나 또는 그 이상의 완충액 내의 증가된 수준의 젖산염을 포함할 수 있다. 상기 종양의 젖산염 농도는 하나 또는 그 이상의 완충액에서 젖산의 농도를 조정함으로써 분석에서 시뮬레이션될 수 있다. 예를 들어, 한 분석이 약 5 mM 내지 20 mM 젖산 사이, 예컨대 10 mM 내지 20 mM 젖산, 예를 들어 15 mM 내지 18 mM, 및 특히 적어도 약 16 mM, 16.5 mM 또는 17 mM 젖산을 포함할 수 있는 하나 또는 그 이상의 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 분석에서 사용하기 위한 정상 환경을 시뮬레이션하는 하나 또는 그 이상의 완충액의 젖산염 농도는 약 0.5 내지 5 mM 사이의 젖산염, 예컨대 0.2 mM 내지 4 mM 젖산, 예를 들어 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 mM 젖산으로 조정된다.
(3) 저산소증
정상 환경 및 병적 환경, 예컨대 종양 환경 사이에 상이할 수 있는 세트의 조건의 또 다른 예는, 저산소증을 포함할 수 있다. 저산소증, 즉 감소된 산소 이용 가능성은 대부분의 고형 종양의 특징이며 유방암을 포함하는 몇몇 암 유형에서 불량한 예후와 관련이 있는데(Favaro et al., Genome Med. (2011), 3(8):55), 이는 저산소증이 화학요법내성, 방사선내성, 혈관신생, 맥관신생, 침습성(invasiveness), 전이성, 세포사 내성, 변경된 대사 및 유전적 불안정성에 기여하기 때문이다(Wilson and Hay (2011), Nat. Rev. Cancer 11(6):393-410). 저산소증 및 불량한 예후 사이의 상관관계에 연루된 인자는 전사인자 저산소증 유도인자(HIF)인데, 이 인자는 저산소증에 대한 반응으로 활성화되고 세포 증식 및 생존, pH, 및 이주(migration)를 조절하는 유전자, 세포 불멸화 및 역분화, 줄기세포 유지, 유전적 불안정성, 글루코스 흡수 및 대사, 자가분비 성장/생존, 혈관신생, 침습/전이, 및 화학요법에 대한 내성을 활성화시킬 수 있다(Semenza (2009), Curr. Pharm. Des. 15(33):3839-3843; Patiar and Harris (2006), Endocr. Relat Cancer S1:S61-75). 저산소증은 증가된 공격성 및 장거리 전이와 관련이 있고(Hashimoto et al., (2011) Pathobiology, 78(4):181-192) 종양에서 내성 및 혈관신생을 촉진시킨다(Facciabene et al. (2011), Nature 475(7355):226-230). 종양 저산소증은 부적절한 혈액 공급 및 무질서한 종양 맥관계, 산소의 전달 장애로부터 초래될 수 있다(Carroll and Ashcroft (2005), Expert. Rev. Mol. Med. 7(6):1-16).
저산소 조건은 완충액 가스제거를 포함하는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 분석에서 시뮬레이션될 수 있다. 예를 들어, 비활성 기체는 사용 전에 완충액을 통해 거품이 일게 할 수 있다(예컨대 Nayler et al., (1979), 11(10):1053-1071 참조). 저산소 조건은 N2:CO2의 혼합물로 완충액에 거품이 일게 함으로써 시뮬레이션될 수 있다(19:1 부피/부피(vol/vol)) (Martou et al., (2006) J. Appl. Physiol. 101(5):1335-1342). 또한, 저산소 조건은 분석 동안에 대기에서 대기 산소보다 낮은 산소(O2) 농도, 예컨대 21% 미만의 O2 내에서 반응을 수행함으로써(McCord et al. (2009), Mol. Cancer Res. 7:489-497) 또는 21% 미만의 O2로 공기를 상기 반응에 거품이 일게 함으로써 유지될 수 있다. 저산소 조건은 산소농도가 대기 노출로부터 산소의 평형 농도보다 낮은 임의의 조건을 포함하는데, 예컨대, 0-10% 산소, 예컨대 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 15% 산소를 포함하는, 0-20% 산소를 포함할 수 있다.
또한, 정상 미세환경을 시뮬레이션하는 조건은 생리적 조건 하에서 전형적으로 발견되는 O2 농도에 상응하는 O2 농도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 건강 환경을 시뮬레이션하는 조건 하에 수행되는 분석은 공기(약 21% 기체상 산소)에 노출된 반응에서 수행될 수 있다. 이러한 조건 하에서, 세포는 200μM 또는 그 미만의 용해된 산소 농도에 노출될 수 있다. 그러나, 세포는 200μM 이상 또는 이하의 산소 농도,예컨대 40μM-400μM 에서 성장할 수 있다. 그러므로, 정상 미세환경을 시뮬레이션한 조건은 약 40μM-400μM 사이의 범위 내의 산소 농도, 일부 예에서 40μM-200μM, 및 일부예에서 40μM-140μM을 포함할 수 있다. 만약 필요한 경우, 용해된 산소 농도는 대기 또는 공기/산소 혼합물을 불어넣음으로써 증가될 수 있다(예컨대 Oller et al. (1989), J. Cell Sci. 94:43-49 참조).
3. 조건부 활성 변형된 단백질의 검출 및 확인
상기 방법에서, 조건 또는 조건들을 선택한 후에, 시험 분자, 예컨대 치료적 단백질 또는 변형된 치료적 단백질, 예를 들어 변형된 항-EGFR 항체는 제 1 조건 및 제 2 조건 하에서 활성이 평가된다. 분자 또는 단백질의 활성을 평가하기 위한 다양한 분석이 당업자에게 알려져 있고 특정한 분자 또는 단백질에 대해 의존적이다. 예를 들어, 분석은 결합 분석 또는 기능적 분석을 포함한다. 예시적인 분석은 하기 섹션 C에 기술된다. 예를 들어, 항-EGFR 항체의 활성을 평가하기 위해서, EGFR에 대한 결합이 평가될 수 있다.
그 후 각 조건 하의 결과적인 활성이 비교된다. 제 1 세트의 조건 하에서 더 큰 활성을 나타내는 분자 또는 단백질이 확인되거나 선택되는데, 상기 제 1 세트의 조건은 일반적으로 종양 환경에 존재하는 것과 같은 병적 조건을 시뮬레이션하거나 복제한 조건이다. 예를 들어, 종양 미세환경을 시뮬레이션한 조건 하의 활성(예컨대 결합 활성)은 비-종양 또는 정상 생리적 환경을 시뮬레이션한 조건 하의 동일한 활성(예컨대 결합 활성)과 비교된다. 비교를 위해, 상기 활성은 제 1 세트의 조건 하(예컨대 비-병적 정상 미세환경)와 비교하여 제 2 조건 하의 활성의 비율로서 표현될 수 있다(예컨대 병적 미세환경의 조건). 예를 들어, 제 1 및 제 2 조건 사이에 상이한 파라미터가 pH인 경우, 활성은 산성 pH 대(versus) 더 중성인 pH에서 관찰되는 활성의 비율, 예컨대 pH 6.0/7.4에서의 활성의 비율로서 표현될 수 있다. 1보다 큰 비율을 나타내어 상기 분자가 병적 또는 종양 미세환경에서 더 큰 활성을 나타내는 시험분자, 예컨대 치료적 단백질 또는 변형된 치료적 단백질, 예컨대 항체 또는 변이체 항체, 예를 들어 변형된 항-EGFR 항체가 확인되거나 선택된다. 예를 들어, 상기 비율은 약 1.5 내지 100, 예컨대 2 내지 50, 예를 들어 5 내지 30 또는 그 이상이다. 그러므로, 상기 방법에서, 조건부 활성 단백질 또는 변이체가 확인될 수 있다.
또한, 활성은 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하지 않는 단백질과 비교하여 병적 또는 종양 미세환경에서 증가된 활성을 나타내는 단백질을 확인하기 위해서, 대조군, 예컨대 돌연변이를 포함하지 않는 단백질과 비교될 수 있다. 일부 예에서, 상기 변형된 단백질의 활성은 변경되지 않은 단백질의 활성에 정규화될 수 있다. 그러므로, 변형된 단백질의 조건부 활성은 정규화된 활성에 기초하여 결정될 수 있다. 예증으로서, 변형되지 않은 단백질이 정상 미세환경에서 10의 활성을 갖고 병적 미세환경에서 1의 활성을 각각 갖는다면; 그리고 변형된 단백질이 정상 미세환경에서 2의 활성을 갖고 병적 미세환경에서 1의 활성을 각각 갖는다면, 정상 및 병적 환경에서의 변형된 단백질의 정규화된 활성은 각각 0.2 (2/10) 및 1 (1/1)이다. 그러므로, 이 가설적 예에서, 상기 변형된 단백질은 정상 미세환경에서 병적 미세환경의 두 배 활성이지만, 병적 미세환경에서 조건부 활성일 수 있는데, 이는 병적 미세환경에서의 변형된 단백질의 정규화된 활성이 정상 환경에서의 정규화된 활성의 5배이기 때문이다(1/0.2=5). 그러므로, 본원에서 제공되는 방법은 변형된 단백질의 정규화된 활성의 비율을 변경시킬 수 있는 변형을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
4. 반복적 방법
일 예에서, 상기 방법이 수행된 후에, 임의의 확인된 조건부 활성 분자가 상기 조건부 활성을 증가 또는 최적화시키기 위해 변형 또는 추가적 변형될 수 있다. 예를 들어, 제 2 라이브러리가 상기 확인된 치료적 단백질 또는 변이체를 주형으로서 사용하고 먼저 확인된 조건부 활성 단백질에 추가적 변형을 도입함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 조건부 활성을 증가시키는 것으로 확인된 변형이 결합될 수 있다. 제 2 라이브러리는 본원에 기술된 분석 및 방법을 사용하여 시험될 수 있다.
상기 방법의 반복적 측면의 또 다른 예에서, 선택적으로, 조건부 활성을 나타내지 않는 것으로 확인된, 즉 제 1 세트의 조건 하에서 활성이 없거나 증가된 활성을 갖지 않는 분자가, 조건부 활성을 위해 더 변형되고 재시험될 수 있다. 추가적 변형은 상기 분자의 활성 및/또는 안정성과 관련된 특정한 영역(예컨대 특정한 아미노산 잔기) 근처를 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, 분자의 활성 및/또는 안정성과 관련된 잔기는 일반적으로 결정적 잔기이고 분자의 구조적 폴딩(folding) 또는 기타 활성, 예컨대 결합과 관련이 있다.
결정적 잔기는 확인될 수 있는데, 왜냐하면 이 잔기들에 돌연변이가 일어나면, 단백질의 정상 활성이 제거되거나 감소되기 때문이다. 예를 들어, 결정적 잔기는 돌연변이되면 치료적 단백질의 그의 동족 결합 파트너에 대한 감소된 또는 제거된 결합 활성을 나타냄으로써 확인될 수 있다. 결정적 잔기는 결합 포켓 내에 있는 잔기들을 포함할 수 있다. 특히, 조건부 활성은 pH 차이에 의존적인 본원의 목적상(예컨대 종양 환경의 산성 pH 환경), 단백질 상호작용에 대한 대전 효과(charge effect)가 대전된 아미노산 잔기(예컨대 Asp, Glu, Lys, Arg, 및 His)로 돌연변이가 일어날 때 동족 결합 파트너에 대한 결합이 제거 또는 감소되는 결정적 잔기를 확인함으로써 결정될 수 있다. 그 후 결정적 잔기는 조건부 활성 단백질을 생성하기 위해 돌연변이 유발 표적이 되어서는 안되는 잔기들로서 확인되는데, 이는 이 잔기들은 활성을 위해 필수적이기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 확인된 결정적 잔기에 인접한 또는 근처의 잔기들은 변화될 수 있는 특정한 표적이 될 수 있고 특정한 활성, 예컨대 결합에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 인접한 잔기의 돌연변이는 결합의 포켓에 영향을 줄 수 있는데, 그럼으로써 결합 활성을 변경시킨다.
그러므로, 상기 방법의 선택적 단계의 예에서, 단백질 활성 및/또는 안정성, 특히 결합(예컨대 산성 pH에서)에 중요한 아미노산 잔기로서, 본원에서 결정적 잔기로 명명된 잔기는 확인될 수 있다. 그리고 나서, 상기 확인된 결정적 아미노산 잔기 근처, 예컨대 상기 확인된 결정적 아미노산 인접을 표적으로 하는 아미노산 돌연변이를 갖는 변형된 단백질의 추가적 라이브러리가 생성될 수 있다. 일부 예에서, 돌연변이는 인접한 위치에서 19 다른 아미노산 잔기까지의 임의의 다른 것으로의 아미노산 치환일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 돌연변이는 논리적으로 또는 경험적으로, 예컨대 진화되는 특정 조건부 활성 의존적으로, 만들어질 수 있다. 예를 들어, pH 조건 하에서 조건부 활성이 진화되는 경우에, 결정적 잔기 근처의 또는 인접한 아미노산 잔기의 돌연변이는 대전된 잔기(charged residue)가 될 수 있고, 특히 히스티딘(H) 잔기가 될 수 있는데, 이 경우 약한 극성을 띄고 약 6.5 내지 6.8의 pK를 갖는다. 예를 들어, 각각이 결정적 아미노산 잔기에 인접한 또는 근처의 아미노산 잔기에서 히스티딘으로의 단일 아미노산 치환을 포함하여 생성된 복수의 돌연변이체 또는 변이체 단백질의 단백질 돌연변이의 라이브러리가 생성될 수 있다.
결정적 잔기에 인접한 잔기에서 돌연변이를 포함하는 복수의 신규한 돌연변이체 각각의 활성은 평가되거나 결정될 수 있다. 예를 들어, 추가적 라이브러리의 각 일원은 개별적으로 발현되고 본원에서 상기에서 기술된 바와 같이 제 1 조건 및 제 2 조건에서 활성에 대해 개별적으로 시험될 수 있다. 양 조건 하에서 시험한 후에, 발현되지 않은 단백질 변이체 또는 제 2 조건 하(예컨대, 희망되지 않는(non-desired) 환경, 예를 들어 정상 조직의 생리적 또는 중성 pH 환경)에서 우선적 결합을 나타내는 단백질 변이체는 제외된다. 그러므로, 각 조건 하에서 유사한 활성을 나타내는 변이체(즉, 결합과 같은 활성에 영향을 주지 않는)만이 발현되고/발현되거나 제 1 조건에서 우선적 활성을 나타내는 변이체만이 선택된다. 돌연변이된 잔기의 확인이 결정되고 핵심 잔기로 명명될 수 있다.
그리고 나서, 핵심 잔기 위치에 돌연변이의 조합을 포함하는 추가적인 조합의 라이브러리가 생성된다. 핵심 잔기에서의 19 다른 아미노산 잔기까지의 임의의 다른 것으로의 아미노산 치환일 수 있다. 다른 예에서, 돌연변이는 진화되는 특정한 조건부 활성에 의존적으로 논리적으로 또는 경험적으로 만들어질 수 있다. 예를 들어, pH 조건 하의 조건부 활성이 진화되고 있을 때, 핵심 아미노산 잔기의 돌연변이는 대전된 잔기, 특히 히스티딘(H) 잔기일 수 있다. 예를 들어, 11개의 핵심 잔기가 확인되면, 다양화된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 모든 11개 잔기를 임의의 조합으로 갖는 단백질 변이체를 포함하는 조합의 라이브러리가 생성될 수 있다. 예로서, 조합의 라이브러리가 핵심 잔기만이 히스티딘(H) 잔기로 돌연변이되어 생성된 경우라면, 상기 라이브러리의 돌연변이체 수(라이브러리의 크기)는 211개의 일원 또는 2048 조합 돌연변이체로 계산될 수 있는데, 이는 각 위치가 야생형 아미노산 또는 히스티딘일 수 있고 돌연변이되고 조합될 수 있는 부위가 11개이기 때문이다. 야생형 및 11개의 단일 His 돌연변이를 제외하면(상기에서 이미 시험된), 라이브러리가 2036 조합을 갖는 것으로 이해된다. 라이브러리의 크기는 확인된 핵심 잔기의 수 및 각 핵심 잔기 위치에서 만들어진 아미노산 치환의 수에 의존적으로 증가되거나 감소될 수 있는 것으로 이해된다. 그 후 추가적인 라이브러리가 미리 결정된 위치에서 조건부 활성, 예컨대 비-종양 또는 건강 환경에서보다 종양 환경에서 증가된 활성과 같은 조건부 활성 단백질을 확인하기 위해 상기 기술된 본원의 방법에서 스크리닝될 수 있다.
예를 들면, 정상 미세환경의 조건(예를 들어 pH 7.4)과 비교하여 종양 미세환경을 시뮬레이션한 조건(예를 들어, pH 6.0) 하에서 증가된 활성을 갖는 조건부 활성 변형된 치료적 단백질, 예컨대 치료적 항체, 예를 들어 얼비툭스를 선택하기 위하여, 치료적 단백질의 아미노산은 단일 아미노산 변형 치료적 단백질의 라이브러리를 형성하기 위하여 돌연변이화될 수 있다. 이러한 라이브러리는 돌연변이가 되었을 때, 양 조건 하에서 활성의 손실을 가져오는 결정적인 잔기를 확인하기 위하여 종양 미세환경 및 정상 환경을 시뮬레이션한 조건 하에서 in vitro 분석으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 라이브러리 구성원은 두 개의 pH 조건 사이에서 양성자화 상태가 변화될 수 있는 이온화 가능한 기를 가진 아미노산(예컨대, 예를 들어 Asp, Glu, Lys, Arg, His)으로 독립적으로 치환될 수 있는 변형된 단백질을 포함한다. 단백질에서 이온화 가능한 양성자화 상태는 pH 의존적 방식으로 단백질의 하나 이상의 활성(예컨대 친화도, 효소 활성, 용해도, 전하 및 안정성)을 변경할 수 있다(Rostkowski et al. (2011), BMC Struct. Biol. 11:6). 결정적 잔기는 대전된 아미노산으로 돌연변이 되었을때 양 조건 하에서 활성을 나타내지 않는 아미노산 위치로서 정의될 수 있다. 그러므로, 잔기는 결합 포켓 내의 것 및/또는 이 외에 이들의 동족 결합 파트너에 대한 결합에 대한 전하 효과와 관련된 것이다. 활성 스크리닝, 예컨대 ELISA 스크리닝으로부터, 대전된 잔기로 돌연변이 되었을 때 pH 6.0 및 7.4에서 결합을 잃는 결정적 잔기들이 확인될 수 있다.
제 2 단계에서, 결정적 잔기들이 확인된 후, 결정적 잔기들과 인접한 아미노산의 치환을 포함하는 단백질 변이체의 활성이 확인되거나 평가될 수 있다. 치환 아미노산은 모든 가능한 아미노산에서 또는 모든 가능한 아미노산 잔기의 서브세트(subset)로부터 무작위로 선택될 수 있다. 예를 들어, 치환 아미노산은 상기에 기술된 바와 같이 종양 및 정상 조건 사이에서 이온화 상태가 변화될 수 있는 아미노산, 예컨대 대전된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 인접한 잔기에서 치환된 아미노산은 히스티딘이다. 결정적 잔기와 인접한 잔기에서의 돌연변이를 포함하는 신규한 복수의 돌연변이체의 각각의 활성은 종양 환경(예를 들어, 산성 pH 및/또는 높은 젖산 조건)과 유사한 또는 이를 시뮬레이션한 조건인 제 1 조건 및 비-종양 환경(예를 들어 중성 pH 7.4 및/또는 낮은 젖산 농도 조건)과 유사한 또는 이를 시뮬레이션한 제 2 조건에서 평가되거나 결정될 수 있다. 두 개의 조건(즉, 예컨대 결합과 같은 활성에 영향을 주지 않는) 하에서 유사한 활성을 나타내는 변이체들이 발현되며 및/또는 제 1 조건에서 우선적인 활성을 나타내는 것이 선택된다. 선택된 돌연변이체의 돌연변이 잔기의 확인이 결정되고 핵심 잔기로 표기된다.
그 후, 마지막 단계로, 확인된 핵심 잔기 위치의 돌연변이의 모든 조합을 포함하는 추가적 조합 라이브러리가 제조된다. 정상 미세환경(예를 들어, pH 7.4)과 비교하여 종양 미세환경(예를 들어 pH 6.0)을 시뮬레이션한 조건 하에서 증가된 활성을 갖는 조건부 활성 변형 치료적 단백질, 예컨대 치료적 항체들, 예를 들어 얼비툭스를 선택하기 위하여, 치환하는 아미노산은 두 개의 pH 조건 사이에서 양성자화 상태가 변화될 수 있는 이온화 가능한 기를 갖는 것(예컨대 예를 들어, Asp, Glu, Lys, Arg, His)이다. 예를 들어, 각 핵심잔기에서의 치환하는 아미노산이 히스티딘인 조합 라이브러리가 제조된다. 조합 라이브러리의 각 일원의 활성은 종양 환경과 유사하거나 이를 시뮬레이션한 조건인 제 1 조건(예를 들어 산성 pH의 조건, 예컨대 pH 6.0 및/또는 높은 젖산) 및 비-종양 환경(예를 들어, 중성 pH 7.4 및/또는 낮은 젖산 농도 조건)과 유사하거나 이를 시뮬레이션한 조건인 제 2 조건에서 평가되거나 결정될 수 있다. 조건부 활성 단백질로 제 1 조건에서 증가된 활성을 나타내는 변이체들이 선택되거나 확인된다.
C. 조건부 활성 분자 확인을 위한 분석
조건부 활성 치료적 분자, 예를 들어 치료적 단백질, 예컨대 항체 치료제(예를 들어 변이체 항-EGFR 항체, 예컨대 변이체 얼비툭스 항체)를 선택하거나 확인하기 위하여 상기 섹션 B에서 제공되는 단계들은 생리적 환경과 관련된 하나 이상의 파라미터를 변화 또는 변경할 수 있는 임의의 in vitro 또는 in vivo 분석에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 분석은 in vivo 분석이다. 분석은 검출가능한 또는 이외의 측정가능한 방식으로 제 1 조건 하에서 결정되는 활성 및 제 2 조건 하에서 결정되는 활성이 비교 가능하도록 치료적 분자의 활성을 시험하거나 평가할 수 있는 임의의 분석이 될 수 있다. 그러므로 분석 또는 방법은 두 번 수행되며(즉, 이중 포맷), 이에 의해 제 1 반복 및 제 2 반복 분석에서의 유일한 차이는 제 1 조건(예를 들어, 병적 또는 종양 환경)과 비교하여 제 2 조건(비병적 또는 정상 생리적 환경) 사이에서 다른 파라미터 또는 조건이다. 예를 들어, 제 1 분석은 종양 미세환경에 존재하는 바와 같은 산성 pH 및/또는 높은 젖산염 농도에서 활성을 평가하여 수행될 수 있고 제 2 분석은 비종양 또는 정상 생리적 환경에 존재하는 바와 같은 더 높은 pH(예를 들어, 중성 pH) 및/또는 더 낮은 젖산염 농도에서 활성을 평가하는 것을 제외하고는 제 1 분석과 동일하게 수행된다.
본원에 기술된 임의의 분석은 다른 환경보다 하나의 환경에서 더 활성인 단백질을 생산하고 확인하기 위하여 단백질의 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 예시적 분석들은 치료적 분자와 이들의 동족 결합 파트너의 결합 활성 또는 치료적 분자의 기능적 활성을 평가하는 것이다. 본원에서 제공되는 분석은 많은 수의 시험 분자, 예를 들어 단백질 변이체들을 이중 포맷에서 한번에 평가하기 위하여 고처리량 포맷으로 전개될 수 있다. 본원에서 제공된 것은 본원에서 제공된 방법에서 사용될 수 있는 예시적 분석이다. 분석은 이에 제한되는 것을 의미하는 것이 아니다. 결합을 검출하는 분석 및 기능적 분석을 포함하는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 분석은 본원에서 제공된 방법에서 사용하기 위해 고려된다.
1. 결합 검출 분석
일부 예에서, 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 분석은 시험 분자, 예컨대 치료적 단백질 또는 이의 변이체, 예를 들어 항체 변이체(예를 들어 항-EGFR)와 동족 결합 파트너, 예컨대 수용체, 리간드 또는 항원의 결합을 측정한다. 그러므로, 본원에서 제공되는 것은 두개의 다른 생리적 미세환경 사이의 활성, 예컨대 리간드-결합쌍의 결합 활성을 확인하기 위한, in vitro 생리적 민감도(sensitive) 방법이다. 상기 방법은 하나의 환경에서 다른 환경보다 더 높은 활성, 예를 들어 결합 활성을 나타내는 단백질을 확인하기 위한 비교 방법이다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 in vitro 분석은 1) 종양 미세환경 내 세포외 기질 내에서 발견되는 결합 조건을 시뮬레이션한 조건 및 2) 생리적 결합 조건들, 예컨대 비병적 부위에서 발견되는 조건들을 시뮬레이션한 조건 하에서 개별적으로(예를 들어, 평행으로 또는 연속적으로) 수행되는 결합 분석이다. 상기 방법은 예컨대 피부, 위장관(GI tract) 또는 다른 조직에서 나타나는 비종양 미세환경의 정상 생리적 조건과 비교하여 종양 미세환경의 병적 상태 하에서 이것의 리간드 또는 수용체와 우선적으로 결합하는 임의의 시험분자를 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 이중 분석 비교 방법이며, 이를 통해 동족 결합 파트너(예를 들어, 표적 항원 또는 리간드)는 시험 분자와 두 개의 다른 결합 조건하에서 개별적으로 접촉한다. 상기 분석에서, 각 결합 분자(예컨대 치료적 단백질 또는 변이체)는 양 시뮬레이션 조건 하에서 개별적으로 및 별도로 상기 분자의 동족 결합 파트너(예컨대 표적 단백질)에 대한 결합에 대하여 스크리닝된다. 예를 들어, 치료적 단백질은 동족 결합 파트너, 예컨대 표적 항원에 접촉될 수 있고, 동족 결합 파트너에 대한 치료적 단백질의 결합 활성은 평가되고 비교될 수 있다. 결합을 측정하는 분석의 예는 용액 결합 분석 및 고체 지지체 결합 분석, 예컨대 표면 플라스몬 공명 및 면역분석, 예컨대 ELISA를 포함한다.
본원에서 기술하는 결합 분석에서 사용할 수 있는 동족 결합 파트너의 예로는 저분자, 펩티드, 단백질, 효소, 항체 또는 기타 생분자를 포함한다. 일부 예에서, 상기 동족 결합 파트너는 암세포 및 종양의 증식, 혈관신생 또는 세포 성장 성질과 관련된 임의의 리간드, 수용체, 효소 또는 기타 단백질과 같은, 종양 또는 암의 치료의 개입 포인트이다. 그러므로, 동족 결합 파트너 및 표적 단백질에 대한 언급은 본원에서 교환적으로 사용된다. 표적 단백질은 치료적 개입의 알려진 표적에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 공지의 암 치료제를 위한 대리 표적은 본원의 방법에서 표적 단백질로서 선택될 수 있다. 본원의 결합 분석에서 사용되는 표적 단백질의 선택은 스크리닝되는 시험 분자 표적 단백질에 의존적이다. 표 3은 예시적인 치료적 단백질에 대한 동족 결합 파트너 또는 표적 단백질에 대해 기술한다. 이러한 표적 단백질의 예는 상기 표 3에 기재되어 있고, 예를 들어, EGFR(전장 단백질 또는 세포외 도메인을 포함), HER2/Neu, CD20 (전장 또는 거대 세포외 루프), VEGF-A, CD52 (전장 또는 세포외 도메인), EpCAM(전장 또는 세포외 도메인) CD3 (전장, 세포외 도메인, γ 쇄, ζ 쇄 또는 ε쇄), CD33 (전장 또는 세포외 도메인), CD80 (전장 또는 세포외 도메인), CD86 (전장 또는 세포외 도메인), CTLA-4 (전장 또는 세포외 도메인), PLGF, α5β1 인테그린 (전장, 세포외 도메인, α5 또는 β1), 메소텔린 (전장 또는 세포외 도메인) 및 IGF-1R (전장 또는 세포외 도메인)을 포함한다.
또한, 표적 단백질의 단편이 본원에서 제공되는 분석에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원과 같은 표적 단백질은 가용성 단백질로서 발현될 수 있다. 예를 들어, 표적 단백질로서 사용하기 위한 가용성 EGFR은 가용성 EGF 수용체 세포외 도메인(sECD)이다. 동족 결합 파트너는 또한 세포외 도메인 및/또는 세포내 도메인을 포함하는 본원에 기술되는 임의의 동족 결합 파트너의 세포외 도메인 또는 세포내 도메인을 포함한다.
본원에서 제공되는 방법의 일부 실시예에서, 시험 분자는 항-EGFR 항체 또는 이의 변이체이고 상기 동족 결합 파트너는 예를 들어 가용성 EGFR 수용체와 같은 리간드 또는 이의 가용성 단편이다. 상기 상피 성장 인자 수용체(EGFR, HER1, c-ErbB-1, 서열번호 10)은 다양한 암의 개입 및 치료를 위한 표적이다. EGFR은 EGFR, HER2, HER3 및 HER4를 포함하는 타입 I 수용체 타이로신 키나아제의 아과(subfamily)의 일원인 막관통(transmembrane) 당단백질이다. EGFR은 피부 및 모낭을 포함하는 많은 정상 상피 조직에서 구성요소로서 발현된다. EGFR은 몇몇 상피 기원의 암에서 과발현된다. EGFR의 발현은 두경부, 결장 및 직장의 암을 포함하는 많은 인간 암에서 검출된다. 예를 들어, 두경부의 편평세포암은 EGFR의 과발현과 관련이 있다(Parikh et al., (2011) Indian J Cancer 48:145-147). EGFR은 불량한 환자 예후 및 세포독성 화학요법에 대한 내성과 관련이 있다(Ryan 및 Chabner (2000), Clin. Cancer Res. 6:4607-4609; Fox et al., (1994) Breast Cancer Res. Treat., 29:41-49; Rubin Grandis et al., (1998) J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 90: 824-832; Uhlman et al. (1995) Clin. Cancer Res., 1:913-920; Neal et al., (1990) Cancer (Phila.), 65:1619-1625). EGFR은 종종 상피암에서 과발현되며 EGFR 발현은 세포독성 제제 및 화학요법에 대한 종양 내성과 상관관계가 있을 수 있다(Ryan 및 Chabner (2000), Clin. Cancer Res. 6:4607-4609).
리간드의 EGFR의 세포외 도메인에 대한 결합은 이합체화를 촉진할 수 있고, 내부 타이로신 키나아제 도메인을 활성화시킬 수 있고, 예를 들어 bcl-2를 인산화할 수 있는, 단백질 키나아제 A를 포함하는 하류 신호를 활성화시킬 수 있다(Ryan 및 Chabner (2000), Clin. Cancer Res. 6:4607-4609; Ciardiello 및 Tortora (1998), Clin Cancer Res. 4:821-828).
본원의 특정 예에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 변이체의 EGFR 또는 가용성 EGFR에 대한 결합 활성은 낮은 pH(< 7.4) 및 상승된 젖산 농도의 조건 하, 및 약 7.3 내지 7.4 의 생리적 pH 및 낮은 젖산염 농도의 조건 하에서 평가될 수 있다. 또한, 인간 혈청이 또한 자연 환경을 더욱 시뮬레이션하기 위하여 결합 분석에 포함될 수 있다. 결합 활성은 정상 생리적 조건 하와 비교하여 종양 미세환경 조건 하에서 더 큰 결합 활성을 나타내는 생분자 결합 제제를 확인하기 위해서 두 조건 사이에서 비교될 수 있다. 항-EGFR 항체는 정상 생리적 조건을 시뮬레이션한 조건과 비교하여 종양 미세환경을 시뮬레이션한 조건 하에서 이것의 EGFR 동족 결합 파트너에 대하여 더 큰 결합을 나타내는 것으로 확인될 수 있다.
전형적으로, 시험 분자 또는 동족 결합 파트너는 결합 활성이 평가되고 결정될 수 있도록 검출가능하게 표지된다. 예를 들어, 결합을 검출하기 위해서, 시험 분자, 예컨대 항체 변이체(예컨대 항-EGFR 항체 변이체)와 같은 치료적 단백질은 검출을 용이하게 하기 위해서 검출가능한 모이어티(moiety) 또는 태그로 표지될 수 있다. 당업자는 분석 조건에 대해 적절한 검출가능한 모이어티 또는 태그를 선택할 수 있다. 예를 들어, 일부 2차 시약, 예컨대 항-Ig 항체는 인간 혈청을 포함하는 용액내의 항체인 변형된 단백질의 결합을 검출하는데 사용될 수 없다. 또한, 항-IgG 항체는 항체인 생분자의 결합을 검출하는데 사용될 수 없다.
당업자에게 알려진 검출 또는 확인될 수 있는 임의의 검출가능한 모이어티 또는 기타 모이어티가 사용될 수 있다. 모이어티 또는 태그는 시험 분자, 예컨대 치료적 단백질 또는 항체에, 직접적 또는 간접적으로, 예컨대 링커를 사용하여, 연결될 수 있다. 연결은 치료적 항체의 N- 또는 C- 말단에서 일 수 있다. 본원의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 태그 및 모이어티는 표 6에 기술되는 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[표 6]
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본원에 기술된 치료적 항체에 검출가능한 모이어티를 연결할 수 있는 당업자에게 알려진 임의의 링커가 사용될 수 있다. 예시적인 링커는 글리신 리치 플렉서블 링커(Glycine rich flexible linker)인 (-G4S-)n을 포함하는데, 여기에서 n은 양의 정수, 예컨대 1(서열번호 4), 2(서열번호 70), 3(서열번호 71), 4(서열번호 72), 4(서열번호 73), 또는 그 이상이다.
결합 분석은 용액 내에서 또는 시험 분자 또는 동족 결합 파트너를 고체 지지체에 고정함으로써 수행될 수 있다. 일부 예에서, 동족 결합 분자 또는 시험 분자는 세포로부터 발현되고 결합은 세포 기반 분석에서 평가될 수 있다.
a) 고체 지지체 결합 분석
본원에서 제공되는 방법에서 사용하기 위한 분석은 시험 분자, 예컨대 치료적 단백질 또는 이의 변이체의, 동족 결합 파트너에 대한 결합이 하나 또는 양쪽 다 고체 지지체상에 고정된 조건 하에 측정되는 결합 분석을 포함한다. 예를 들어, 용액 내의 동족 결합 파트너가 고체 지지체상에 부동화된 시험 분자와 상호작용할 수 있고, 또는 용액 내의 시험 분자가 고체 지지체상에 부동화된 동족 결합 파트너와 상호작용할 수도 있다. 고체 지지체 결합 분석은 용액 결합 분석보다 유용할 수 있는데, 고체상에서 부동화는 결합되지 않은 단백질로부터 결합된 단백질의 분리를 용이하게 할 수 있기 때문이다. 당업자에게 알려진 임의의 고체 지지체 결합 분석, 예컨대 표면 플라스몬 공명 및 ELISA를 포함하는 분석이 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위해 고려된다.
예를 들어, 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon resonance (SPR))은 부동화된 분자에 대한 시료 내 분석 분자의 분자적 결합이 발생하는 굴절률(refractive index) 변화를 측정함으로써 고도로 민감한 분석에서 표지되지 않은 분자의 결합을 검출하는데 사용될 수 있다(Piliarik et al., (2009) Methods Mol Biol. 503:65-88). SPR은 금속에서 전자의 집합 진동인 표면 플라스몬 파(wave)가 금속/유전체 접촉면에서 활성화될 때 일어난다. SPR은 각도 및 파장의 특이적 조합에서 반사된 빛 강도를 감소시킨다. 분자 결합은 금속 필름상에서 굴절 지수 및 초-박 유기(유전체)층의 두께를 변화시킬 수 있는데, 이는 SPR 공명 조건을 변화시킬 수 있다. 동족 결합 파트너를 갖는 용액은 부동화된 치료적 단백질 위로 흘려질 수 있거나, 또는 치료적 단백질과의 용액은 부동화된 동족 결합 파트너 위로 흘려질 수도 있다. 결합 속도는 시간과 상관 관계가 있고 SPR 신호를 측정함으로써 측정될 수 있다. 결합 후에, 바탕 시료(blank solution)는 부동화된 치료적 단백질 또는 유사한 파트너 위로 흘려질 수 있고 해리 속도는 시간과 상관 관계가 있고 측정될 수 있다. 결합 및 해리 속도로부터, 평형 결합 상수가 계산될 수 있다(Jecklin et al. (2009), J. Mol. Recognit. 22(4):319-29; Nguyen et al, (2007) Methods. 42(2):150-61; Tanious et al. (2008), Methods Cell Biol. 84:53-77). 따라서, SPR은 치료적 단백질과 동족 결합 파트너 사이의 상호 작용의 동역학 및 열역학을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 치료적 단백질 및 동족 결합 파트너 사이의 결합은 효소결합 면역흡착분석(ELISA)에 의해 검출될 수 있다. ELISA는 단백질/리간드 상호 작용, 예컨대 항체/항원 상호 작용을 검출하기 위해 사용될 수 있는 면역학적 분석이다. 전형적으로, ELISA에서, 항체/항원 상호작용은 항체/항원 복합체에 직접적 또는 간접적으로 연결된 효소 마커로부터의 신호를 측정함으로써 검출된다. 몇몇 ELISA 방법이 당업자에게 알려져 있으며, 당업자에게 알려진 또는 본원에 기술된 임의의 ELISA 방법, 예컨대 직접 ELISA 및 간접 ELISA가 사용될 수 있다. 직접 ELISA에서, 부동화된 분자와 상호작용하는 표지된 일차 항체가 검출된다. 직접 ELISA는 1) 고체상을 시험 분자, 예컨대 항체의 동족 결합 파트너(즉, 리간드 또는 항원)로 코팅하는 단계; 2) 고체상을 고체상의 비특이적 결합 부위를 차단하기 위한 차단 시약과 함께 배양하는 단계; 3) 고체상을 동족 결합 파트너에 결합하는 검출가능한 시험 분자와 배양하는 단계; 및 4) 결합한 검출가능한 시험 분자를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 간접 ELISA에서, 일차 항체와 상호작용하는 표지된 이차 항체가 검출된다. 간접 ELISA는 1) 고체상을 시험 분자, 예컨대 항체의 동족 결합 파트너(즉, 리간드 또는 항원)로 코팅하는 단계; 2) 고체상을 고체상의 비특이적 결합 부위를 차단하기 위한 차단 시약과 함께 배양하는 단계; 3) 고체상을 동족 결합 파트너에 결합하는 검출가능한 시험 분자와 배양하는 단계; 및 4) 이차 검출 제제, 예컨대 치료적 항체에 결합할 수 있는 시험 분자를 검출할 수 있지만 분석 완충액 내에 포함된 인간 혈청 구성요소를 검출할 수 없는 표지된 이차 항체와 함께 배양하는 단계; 및 5) 이차 검출 제제를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 직접 또는 간접 ELISA 방법에서, 하나 또는 그 이상의 세척 단계(예컨대 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 세척 단계)가 상기 방법의 임의의 단계 사이에 포함될 수 있다.
동족 결합 단백질 및 스크리닝되는 생분자에 의존하여 정확한 분석 또는 분석 조건을 경험적으로 결정하는 것은 당업자 수준 내의 일이다. 고체 지지체 결합 분석에서 수행되는 방법의 단계는 1) 동족 결합 단백질을 고체 지지체상에 부동화하는 단계; 2) 시험 분자 또는 분자들(예컨대 항체 변이체)를 동족 결합 단백질과 접촉하는 단계; 및 3) 동족 결합 단백질에 대한 결합 활성을 나타내는 결합된 시험 분자를 검출 및 확인하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 단계들은 시험 분자가 고체 지지체상에 부동화되고 동족 결합 분자가 이에 접촉되도록 수행될 수 있는 것으로 이해된다. 임의의 상기 단계는 2개의 in vivo 생리적 조건을 시뮬레이션한 조건 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 분석이 ELISA라면, 임의의 단계의 ELISA, 예컨대 코팅하는 단계, 차단하는 단계, 시험 분자(예컨대 치료적 항체 또는 이의 변이체)와 배양하는 단계, 또는 검출하는 단계가, 본원에 기술된 조건, 예컨대 종양 미세환경(예컨대 pH 6.0)을 시뮬레이션한 조건, 또는 정상 미세환경을 시뮬레이션한 조건(예컨대 pH 7.4) 또는 기타 당업자에게 알려진 적절한 조건 하에서 수행될 수 있다.
일반적인 분석 방법의 기술은 하기에 면역분석-기반 포맷과 관련하여 제공된다. 당업자는 다른 고체 지지체 포맷, 예컨대 표면 플라스몬 공명에서 결합 분석을 수행할 수 있도록 단계 또는 단계들을 적응시킬 수 있다. 상기 섹션 B에 기술된 임의의 시험 분자, 예컨대 치료적 단백질 또는 변이체가 본원에 기술된 그것의 동족 결합 단백질에 대한 결합 활성에 대해 시험될 수 있다. 특히, 항-EGFR 항체의 변이체, 예컨대 변이체 얼비툭스 항체가 감소된 pH 및 상승된 젖산염 농도의 종양 미세환경 내에서 EGFR에 결합하지만 정상 생리적 pH에서 결합하지 않는 암 치료를 위한 개선된 변이체 항-EGFR 유사체를 확인하기 위해, 본원의 이중 분석에서 생산되고 스크리닝될 수 있다.
1) 고체 지지체상에의 부동화
상기 방법의 제 1 단계로서, 관심있는 동족 결합 단백질(예컨대 리간드 또는 항원)은 결합된 분자의 검출 또는 확인이 추후 성취되도록 할 수 있도록 결합된 분자의 포획을 용이하게 하기 위해 사용되도록 조정된다. 포획을 용이하게 하기 위해서, 스크리닝을 위한 상기 동족 결합 단백질이 용액 내, 현탁액 내에서 제공될 수 있거나, 또는 상기 분석 방법을 위해 적합한 고체 지지체에 부착될 수도 있다. 예를 들어, 동족 결합 단백질은 고체 지지체에 부동화된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 시험 분자는 포획을 용이하게 하도록 변형될 수 있다. 예를 들어 상기 시험 분자는 고체 지지체상에 부동화되거나 기타 검출 가능하도록 표지될 수 있다. 일반적으로, 상기 결합 분석은 고체 지지체상에서 이루어질 수 있다.
본원에서 제공되는 결합 분석에서 사용될 수 있는 고체 지지체는 분자, 예컨대 시험 분자 또는 리간드, 수용체 또는 항원과 같은 단백질의 동족 결합 파트너와 부착될 수 있는 임의의 담체를 포함한다. 전형적으로, 변이체 시험 분자(예컨대, 항-EGFR 항체 변이체와 같은 항체 변이체의 라이브러리 또는 콜렉션)의 고처리량 스크리닝을 용이하게 하기 위해서, 동족 결합 파트너가 고체 지지체상에 부착된다. 본원에서 제공되는 방법에서 고체 지지체로서 사용할 수 있는 담체의 예는, 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀로오스, 자연적 및 변형된 셀룰로오스, 폴리아크릴아마이드, 아가로스 및 자성 고체 지지체, 예컨대 마그네타이트를 포함하는 고체 지지체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 고체 지지체는 하나 또는 그 이상의 비드(bead) 또는 입자, 마이크로스피어(microsphere), 튜브 또는 플레이트의 표면, 필터 막, 및 기타 당업계에 알려진 고체 지지체일 수 있다. 예시적인 고체 지지체 시스템은 이에 제한되지 않으나, 예컨대 유리, 실리콘, 금속, 나일론, 셀룰로오스, 플라스틱 또는 합성물로 구성된 평평한 표면, 예컨대 다중 웰 플레이트 또는 막을 포함하거나; 또는 실리카 겔, 제어세공 유리(controlled pore glass), 자성(Dynabead) 또는 셀룰로오스 비드와 같은 비드의 형태일 수 있다. 또한, 이러한 방법은 현탁액 내 또는 칼럼의 형태 내에서 사용하기 위해 조정(adapt)될 수 있다.
특정한 분석 조건에 의존적으로 적합한 고체 지지체를 선택하는 것은 당업자의 수준 내이다. 예를 들어, 니켈 코팅된 마이크로플레이트가 His-태그된 단백질의 결합에는 덜 적합할 수 있는데, 이는 완충액 pH가 Ni 코팅된 플레이트에 항원을 코팅하는데 영향을 줄 수 있으나 고-결합 플레이트에는 영향을 주지 않기 때문이다.고체 지지체가 다양한 pH 조건에 사용하는데 적합한지 여부를 결정하는 것은 당업자의 수준 내이다.
시험 분자 또는 동족 결합 파트너는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해서 고체 지지체상에 부동화될 수 있다. 부착을 위해 공유 또는 비공유 방법이 사용될 수 있다. 전형적으로, 시험 분자 또는 동족 결합 파트너(예컨대 리간드 또는 항원)이 수성 매체(medium)로부터 흡착에 의해 부동화된다. 일부 예에서, 흡착은 병적 미세환경(예컨대 종양 또는 암 미세환경)을 시뮬레이션한 조건 하, 정상 미세환경을 시뮬레이션한 조건 하, 또는 당업자에게 알려진 표준 조건 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 흡착은 약 6.0 내지 7.4 사이의 범위의 pH를 갖는, 일부 실시예에서 약 pH 7.4인, 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 흡착이 이루어지게 하기 위하여, 고 결합 마이크로플레이트가 고체 지지체로서 사용될 수 있다. 고 결합 플레이트는 당업자에게 알려져 있고, 다양한 제조자로부터 쉽게 이용가능하다(예컨대 eBioscience, San Diego, CA, Cat. No. 44-2404-21로부터 이용가능한 Nunc Maxisorp 플랫-바텀(flat-bottom) 플레이트; Costar 96-well EIA/RIA Stripwell plate, Costar 2592 참조).
다른 부착 방식, 예컨대 공유결합 커플링 또는 기타 잘 알려진 고체 매트릭스(matrix)에 대한 표적 단백질의 부착 방법이 사용될 수 있다. 치료적 단백질 및/또는 동족 결합 파트너의 부착의 공유결합 방법은 화학적 가교결합 방법을 포함한다. 반응 시약이 지지체 및 단백질 또는 동족 결합 파트너의 작용기 사이에 공유결합을 만들어 낼 수 있다. 화학적으로 반응될 수 있는 작용기의 예로는 아미노, 티올 및 카르복실 기가 있다. N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide), 아이오도아세타마이드(iodoacetamide), N-하이드로숙시니미드(N-hydrosuccinimide), 및 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)가 작용기와 반응하는 시약의 예이다. 다른 예에서, 시험 분자 및/또는 동족 결합 파트너는 예컨대, 이에 제한되지 않으나, 면역친화성 또는 리간드-수용체 상호작용(예컨대 비오틴-스트렙타비딘 또는 글루타치온 S-트랜스퍼라제-글루타치온)과 같은 방법에 의해 간접적으로 고체 지지체에 결합될 수 있다. 예를 들어, 시험 분자는 ELISA 플레이트, 또는 기타 유사한 어드레서블(addressible) 어레이(array)에 코팅될 수 있다.
일 예에서, 고체 지지체, 예컨대 마이크로플레이트의 웰은 친화성 포획 제제(affinity capture agent)로 코팅될 수 있는데, 친화성 포획 제제는 시험 분자 또는 동족 결합 파트너가 고체 지지체에 부착되도록 시험 분자 또는 동족 결합 파트너와 결합하고 포획한다. 상기 시험 분자 및/또는 동족 결합 파트너는 임의의 선택된 친화성 포획 제제와 양립가능한 태그를 포함하도록 변형될 수 있다. 본원의 분석에서 사용될 수 있는 예시적인 태그 또는 모이어티는 His, T7, Myc, HA, VSV-G, 또는 Flag 태그(예컨대 서열번호 3, 5, 7, 15-16, 25 참조)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 태그는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 비오틴화된 항-His 항체는 His 태그를 포함하는 동족 결합 파트너 또는 시험분자의 포획을 용이하게 하도록 스트렙타비딘을 포함하는 플레이트에 코팅될 수 있다. 스트렙타비딘 및 친화성 포획 제제로 코팅된 플레이트는 제조자들로부터 이용가능하고(예컨대 Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL; Catalog No. 15500 참조), 또는 당업자에 의해 준비될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 흡착 또는 부동화 기술의 선택은 일반적으로 다양한 pH 환경에 양립가능하도록 선택된다.
동족 결합 파트너가 고체 지지체에 부착되는 본원의 예에서, 동족 결합 파트너(예컨대 sEGFR)의 고체 지지체에 대한 부착은 스크리닝되는 시험 분자 또는 시험 분자의 라이브러리와의 접촉 전, 접촉 중, 접촉 다음에 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 동족 결합 파트너가 고체 지지체, 예컨대 크로마토그래피 칼럼 또는 마이크로플레이트의 웰에, 시험 분자와 배양하기 전에 전-흡착될 수 있다. 다른 예에서, 동족 결합 파트너 및 시험 분자는 용액 내에서 접촉되고 그 다음 고체 지지체상에서 동족 결합 파트너가 포획된다.
이중 포맷 또는 이반복적(duplicate) 분석에서, 상기 부동화 제제(immobilized agent), 전형적으로 동족 결합 파트너는 동일한 표준 조건 하에서 부동화된다. 전형적으로, 양 조건 하의 흡착 또는 부동화를 가능케 하기 위해 사용되는 완충액은 중성 또는 생리적 완충액이다. 생리적 완충액의 예시는, 인산완충식염수(PBS), 행크스 평형염류 용액(HBSS), 링거액(Ringers) 또는 크렙액(Krebs)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 pH 및 완충 용량은 분석 조건과 상관 관계가 있고, 당업자에 의해 경험적으로 결정되거나 선택될 수 있다. 예시적인 생리적 완충액은 크렙-링거 중탄산염(KRB) 완충액(Sigma Aldrich, Catalog No. K4002)이다. 또한, 부동화 제제, 전형적으로 동족 결합 파트너의 고체 지지체상의 흡착 또는 부동화는, 인간 혈청을 포함하지 않는 완충액내에서 이루어지는데, 이는 인간 혈청이 자연 환경 조건을 시뮬레이션하기 위해 접촉 단계 또는 스크리닝 단계에서 사용되기 때문이다.
예를 들어, KRB 완충액 또는 기타 유사한 생리적 완충액 내의 동족 결합 파트너, 예컨대 항원의 다양한 농도는 고체 지지체상에 흡착될 수 있다. 예를 들어, KRB 완충액 또는 기타 유사한 생리적 완충액 내에서 약 1 내지 50 nM, 예컨대, 3 내지 30 nM, 예컨대 5 내지 20 nM, 예를 들어 약 3, 6, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 또는 50 nM의 동족 결합 파트너(예컨대 sEGFR과 같은 항원)가 흡착될 수 있다. 상기 흡착될 표적 항원의 양은 결합 제제와 상관 관계가 있고 경험적으로, 예컨대 표적 항원에 결합하는 공지의 대조군을 사용하여 결정될 수 있다. 흡착은 동족 결합 단백질이 고체 지지체상의 결합 부위에 결합하도록 하는 임의의 희망되는 길이의 시간 동안 및 온도에서 진행될 수 있다. 예를 들어, 흡착은 일반적으로 4℃-37℃, 예컨대 4℃, 실온 (즉 22℃) 또는 37℃에서 수행된다. 흡착 시간은 일반적으로 30분 내지 48시간 또는 그 이상이고, 온도의 함수로서 달라질 수 있다. 예를 들어, 동족 결합 단백질은 고체 지지체, 예컨대 고-결합 마이크로웰 플레이트에, 4 ℃에서 6 시간 내지 48시간 동안, 예컨대 12 시간 내지 36 시간 동안, 그리고 전형적으로 밤새, 예컨대 12 시간 내지 24시간 동안, 흡착될 수 있다. 또 다른 예에서, 동족 결합 단백질은 고체 지지체, 예컨대 고-결합 마이크로웰 플레이트에서 실온에서 30분 내지 4시간 동안, 예컨대 1시간 내지 2시간 동안, 특히 2시간 동안 흡착된다. 고체 지지체는 1회 또는 그 이상의 횟수, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 횟수로, 흡착을 위해 사용한 것과 동일한 완충액으로, 임의의 결합되지 않은 표적 항원을 제거하기 위해 세척될 수 있다.
2) 시뮬레이션 조건 하에서 접촉
상기 분석에서, 결합 파트너 및 제제의 결합은 두 개의 서로 다른 생리적 조건, 즉 병적 미세환경 및 비-병적 미세환경의 정상 생리적 조건을 시뮬레이션한 조건 하에서 이루어진다. 예를 들어, 상기 병적 미세환경은 종양 미세환경 내 조건을 시뮬레이션할 수 있다. 그러므로, 표적 항원의 지지체에 대한 부착에 이어, 상기 방법의 다음 단계는 일반적으로 두 개의 별개의 분석으로서 수행된다. 따라서, 각 표적 항원에 대해서, 상기 항원은 상기 기술된 바와 같이 듀플리케이트(duplicate) 고체 지지체상에 흡착되고, 부착되고, 또는 부동화된다. 이어서, 상기 듀플리케이트 지지체는 두 개의 서로 다른 분석 조건, 즉 하나는 종양 미세환경을 시뮬레이션하고 다른 하나는 정상 생리적 환경을 시뮬레이션하는 조건 하에서 결합 분석을 수행하기 위해 개별적으로 처리된다. 이러한 조건은 섹션 B에 기술된다. 상기 섹션 B에서 논의된 바와 같이, 별도의 분석을 수행함에 있어서 다양해지는 유일한 조건은, in vivo 미세환경을 시뮬레이션하는 완충액 조건과 관련된다. 시간 및 온도 배양 조건은 일반적으로 평형 분석 사이에서 동일하다.
예를 들어, 본원에 기술된 방법에서, 두개의 별도 분석에서 시험 분자가 동족 결합 단백질과 결합 활성을 시험하기 위해 접촉된다. 한 분석에서, 상기 시험 분자는 상기 기술된 종양 미세환경을 시뮬레이션한 완충액의 존재하에서 동족 결합 단백질과 접촉 또는 배양된다. 두 번째 분석에서, 상기 시험 결합 분자는 상기 기술된 정상 생리적 조건을 시뮬레이션한 완충액의 존재하에서 상기 동족 결합 단백질과 접촉 또는 배양된다. 일반적으로, 배양 반응은 시험 분자 또는 단백질이 동족 결합 파트너(예컨대 항원)가 결합할 수 있도록 하는 임의의 희망되는 길이의 시간 및 온도에서 진행될 수 있다. 예를 들어, 결합은 일반적으로 4-37 ℃, 예컨대 4 ℃, 실온 또는 37 ℃에서 수행된다. 결합 시간은 일반적으로 30분 내지 48시간 또는 그 이상이고, 온도와 상관 관계가 있을 수 있다. 일반적으로, 결합 분자 또는 단백질의 결합은 실온에서 일 수 있고 또는 약 30분 내지 4시간, 예컨대 1시간 내지 2시간, 예를 들어 1시간이다. 임의의 결합되지 않은 표적 항원을 제거하기 위해 고체 지지체는 결합을 위해 사용된 것과 동일한 완충액으로 세척될 수 있다.
예를 들어, 접촉은 비-종양 또는 미세환경을 시뮬레이션하기 위해 1mM 젖산, pH 7.4, 및 25% 인간 혈청과 함께 수행될 수 있다. 별도로, 상기 접촉 단계는 종양 미세환경을 시뮬레이션하기 위해 16.5 mM 젖산, pH 6.0, 25% 인간 혈청과 함께 수행될 수 있다. 각 접촉 반응에서, 접촉은 1시간 동안 실온(즉 22 ℃)에서 일 수 있다.
그러므로, 각 분석 조건에서, 시험 분자, 예컨대 치료적 항체 또는 항체 변이체(예컨대 항-EGFR 항체 변이체)는 동족 결합 파트너, 예컨대 표적 항원과 함께, 필요한 완충액 조건(예컨대 병적 또는 정상 미세환경)의 존재하에서 결합이 일어날 수 있도록 하는 적절한 길이의 시간 및 온도에서 배양될 수 있다. 미세환경을 시뮬레이션하는 완충액 조건을 제외하면, 상기 분석 조건(시간 및 온도)는 동일하다. 상기 분석은 다양한 농도의 시험 분자의 존재하에서 수행될 수 있다. 동족 결합 단백질(예컨대 항원)과 접촉되는 시험 분자의 양은, 예를 들어, 동족 결합 단백질 및 시험 분자(예컨대 EGFR 및 항-EGFR 또는 변이체), 및 특정한 결합 조건과 상관 관계가 있고, 경험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 다양한 농도가 연속희석물에서 시험된다. 전체 상청액, 희석된 상청액 또는 정제된 단백질이 시험될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 상기 시험 분자는 결합 활성을 평가하기 위한 결합된 항원-결합 분자 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 검출가능한 모이어티 또는 태그로 표지된다.
일부 예에서, 시험 분자(예컨대 변형된 치료적 단백질)를 동족 결합 단백질(예컨대 표적 항원)과 접촉시키기 전에, 고체 지지체의 표면상의 비특이적 단백질 결합 부위는 전형적으로 차단된다. 그러므로, 치료적 항체 또는 이의 변이체(예컨대 항-EGFR 변이체) 및 동족 결합 파트너(예컨대 EGFR 또는 sEGFR)을 접촉시키는 단계는 전형적으로 차단 단계 후에 수행될 수 있다. 고체 지지체의 차단은 고체 지지체에 대한 비특이적 결합을 감소시킬 수 있고, 배경 신호를 감소시킬 수 있고, 흡착된 단백질에 대한 비특이적 결합을 감소시킬 수 있고, 흡착된 단백질을 안정화시킬 수 있다. 차단을 위한 조건의 선택은 당업자의 능력 내이다. 당업계에 기술된 임의의 차단 조건은 본원에서 제공되는 방법에 사용될 수 있다.
그러므로, 예를 들어, 표적 항원과 같은 동족 결합 파트너가 결합된 고체상의 흡착 후, 항원 분자에 의해 점거되지 않은 표면 상의 단백질 결합 부위에서 항원-포함 고체 지지체의 표면 상에 혼합된 단백질을 흡착하기 위해, 분석 간섭(interferance) 단백질이 없는 수용액이 고체상과 혼합될 수 있다. 예를 들어, 차단 용액은 인간, 소, 말 또는 기타 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 것들을 포함한다. 일반적으로, 상기 차단 용액은 인간 혈청을 포함한다. 고체 지지체, 예컨대 플레이트의 차단은, 하나 또는 그 이상의 차단 제제가 첨가되는 결합 분석 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 차단 제제는 1-5% 소혈청 알부민, 1-5% 비-지방 건조유 및 25% 인간 혈청을 포함한다. 세제(detergent), 예컨대 트윈 20, 및 보존제, 예컨대 티메리졸이 차단 용액에 첨가될 수 있다. 결합 분석 완충액은 즉 종양 미세환경 완충액 또는 정상 생리적 완충액을 포함한다. 수성 단백질 용액-고체 지지체 혼합물은 전형적으로 30분, 1시간, 또는 그 이상의 시간 동안 유지되고, 온도의 함수로서 달라질 수 있다. 차단 반응은 임의의 온도에서 수행될 수 있고, 일반적으로 4 ℃-37 ℃, 예컨대 4 ℃, 실온(즉 22 ℃) 또는 37 ℃에서 수행될 수 있다. 일부 예에서, 상기 반응은 약 4 ℃-37 ℃의 온도에서 적어도 한 시간동안 진행되도록 한다. 예를 들어, 차단은 실온에서 한 시간 동안 달성될 수 있다. 배양 및 차단 후에, 시험 분자(예컨대 치료적 단백질 또는 항체 또는 이의 변이체)와 접촉시키기 전에 결과적인 고체상은 결합되지 않은 단백질이 없게 씻어질 수 있다.
3) 조건부 활성 시험 분자의 검출 또는 확인
시험 분자, 예컨대 치료적 단백질, 예를 들어 동족 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 항체 변이체(예컨대 항-EGFR 항체)가 선택되거나 확인될 수 있다. 결합되지 않은 단백질을 세척한 후에, 상기 치료적 단백질은 당업자에게 알려진 임의의 분석 또는 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 검출은 형광의, 방사성의 또는 기타 검출가능한 모이어티의 존재에 의해 용이하게 될 수 있다. 전형적으로, 시험 분자(예컨대 치료적 단백질, 예를 들어 항체 변이체)는 태그되고, 검출은 항-태그 시약을 사용하여 이루어진다. 항-태그 시약의 선택은 결합 분자 또는 단백질과 사용되는 태그와 상관 관계가 있다. 또한, 분석에서 사용되는 환경 조건(예컨대 pH)과 양립하는 항-태그 시약이 선택된다. 이러한 시약을 확인하거나 선택하고, 분석 조건과 그들의 양립가능성을 시험하는 것은 당업자의 수준 내이다. 예를 들어, 실시예는 이러한 절차(procedure)를 예시한다.
항-태그 시약은 상업적 출처 또는 기타 출처로부터 쉽게 이용가능하다. 본원의 방법에서 검출에 사용될 수 있는 예시적인 항-태그 시약은 항-FLAG 항체 또는 항-Myc 항체(Abcam, Cambridge, MA; GeneTex, Irvine, CA와 같은 판매회사들로부터 이용가능)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
전형적으로, 본원의 방법에서, 상기 결합된 복합체의 검출 방법은 활성 수준이 평가될 수 있도록 정량화가 가능한 것이다. 예를 들어, 표지는 신호, 예컨대 비색 신호, 화학발광 신호, 화학형광 신호 또는 방사성 신호를 생산할 수 있다. 상기 수준의 성질에 의존적으로, 다양한 기술이 상기 표지의 검출 또는 검출 및 정량화를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 정량화 방법은 분광광도적, 형광 및 방사성 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
효소 표지의 예는 겨자무과산화효소(horse radish peroxidase), 알칼라인 포스파타제, 및 베타-D-갈락토시다제를 포함한다. 신호를 발생(develop)시키기 위해 첨가될 수 있는 효소 기질의 예는 PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt), ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt), OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride), 및 Sureblue TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 1-구성(KPL, #52-00-03)을 포함하는 TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) (SOMA Labs, Romeo, Mich.)를 포함한다. 적합한 파장(즉 450 nm)에서의 흡광도(absorbance)가 결정될 수 있다.
형광의 경우, 다수의 형광측정기를 이용할 수 있다. 겨자무과산화효소(HRP)와 같은 화학 발광의 경우, 발광분석기(luminometers) 또는 필름이 이용가능하다. 효소와 함께, 형광, 화학발광 또는 염색된(colored) 제조품이 형광측정적으로, 발광측정적으로, 분광광도적으로 또는 시각적으로 결정되거나 측정될 수 있다. 예를 들어, 항-태그 시약이 겨자무과산화효소(Horseradish Peroxidase, HRP) 또는 기타 검출가능한 시약과 컨쥬게이션될 수 있다.
전형적으로, 배양 반응은 결합 분자 또는 단백질의 검출을 가능케하는 임의의 희망되는 길이의 시간 및 온도에서 진행될 수 있다. 예를 들어, 검출은 일반적으로 4-37 ℃, 예컨대 4 ℃, 실온 또는 37 ℃에서 수행된다. 결합을 위한 시간은 일반적으로 30분 내지 48시간 또는 그 이상이고, 온도와 상관 관계가 있다. 일반적으로, 결합 분자 또는 단백질의 결합은 실온에서, 약 30분 내지 4시간, 예컨대 1시간 내지 2시간, 예를 들어 약 1시간이다. 고체 지지체는 임의의 결합되지 않은 표적 항원을 제거하도록 결합에 사용되는 것과 동일한 완충액으로 세척될 수 있다.
일단 결합 활성이 각 분석 조건 하에서 결정되면, 제 1 조건(예컨대 병적 환경, 예를 들어 종양 환경)하 및 제 2 조건(예컨대 비-병적 또는 정상 환경)하에서의 결합 활성이 상기 섹션 B.3.에서 기술된 것과 같이 비교된다. 제 1 조건 하에서 제 2 조건 하에서보다 더 큰 활성, 예컨대 약 1.5 내지 100 사이, 예컨대 2 내지 50, 예를 들어 5 내지 30 또는 그 이상인 활성의 비율을 나타내는 조건부 활성 분자가 확인된다.
b. 용액 결합 분석
본원에서 제공되는 방법에서 사용하기 위한 분석은 치료적 단백질의 동족 결합 파트너에 대한 결합이 용액 내에서 측정되는 분석을 포함한다. 당업자는 본원에서 제공되는 방법에서 사용하기 위한 용액 결합 분석을 선택할 수 있다. 하기는 본원에서 제공되는 방법에 사용될 수 있는 예시적인 용액 결합 분석의 간단한 기술이다. 그러나, 이들은 제한하기 위한 것이 아니며, 당업자에게 알려진 임의의 용액 결합 분석이 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위해 고려되는데, 이는 평형 투석, 경쟁적 결합 분석(예컨대 Myers et al., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72(9):3683-3686), 방사선표지된 결합 분석(예컨대 Feau et al., (2009) J. Biomol. Screen. 14(1):43-48), 열량측정(예컨대 등온 적정 열량측정(ITC) 및 시차 주사 열량측정(Perozzo et al., (2004) J. Recept Signal. Transduct Res. 24(1-2):1-52; Holdgate (2001) Biotechniques 31(1):164-166, 168, 170), Celej et al. (2006) Anal. Biochem. 350(2):277-284)을 포함), 및 형광 공명 에너지 전이 분석을 포함하는 분광 형광 분석을 포함한다. 용액 내의 결합 활성이 결정되는 본원의 방법에 대한 조건은 본원에 기술된 바에 기초하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 조건은 고체 지지체상에서 수행되는 결합 분석에 대해 상기에 기술된 조건으로부터 적응될 수 있다.
1) 등온 적정 열량측정(ITC)
ITC에서, 한 결합 파트너는 또 다른 결합 파트너를 포함하는 용액 내로 적정됨으로써, 열을 생산 또는 흡수하는데, 이는 열량측정기에 의해 정량화된다. ITC는 나노몰 또는 그 이하의 양의 반응물로부터의 열 효과를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 등온 적정 열량측정 분석은 치료적 단백질의 동족 결합 파트너에 대한 결합과 관련된 결합의 자유 에너지(△G), 엔탈피 (△H), 및 결합의 엔트로피(△S), 및 열용량 변화 (△Cp)를 포함하는 모든 열역학 파라미터들을 측정하기 위해 수행될 수 있다. 이러한 특징들의 분석은 치료적 단백질 및 동족 결합 파트너 사이의 결합의 기전 및 열역학 파라미터를 설명하는 것을 도울 수 있다(Perozzo et al., (2004) J. Recept. Signal. Transduct. Res. 24(1-2):1-52).
2) 분광학적 분석
당업자에게 알려진 임의의 분광학적 분석이 본원에서 제공하는 방법에서 치료적 단백질의 결합을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 변형된 단백질 및 동족 결합 파트너 사이의 상호작용은 당업자에게 알려진 임의의 분광학적 분석, 예컨대 UV-vis 분광학적 기술, 형광 공명 에너지 전이 분석 및 형광 소광 분석(Wu (2007), J. Pharm. Biomed. Anal.44(3):796-801)과 같은 형광 분석에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 치료적 단백질의 동족 결합 파트너에 대한 결합의 결과로서 형광 또는 UV/vis 흡수의 변화, 예컨대 고유형광의 소광(quenching)이 검출될 수 있다. 일부 예에서, 상기 치료적 단백질 및/또는 동족 결합 파트너는 형광 표지 또는 UV/vis 표지로 표지될 수 있다. 분광학적 신호를 측정한 후에, 관찰된 결합 상수가 계산될 수 있다(예컨대, Zhang et al. (2009) Spectrochim Acta A Biomol. Spectrosc. 72(3):621-626).
c. 세포 기반 분석
치료적 단백질의 동족 결합 파트너에 대한 결합을 검출하기 위해 본원에서 제공되는 방법에서 사용하기 위한 분석은 세포 기반 분석, 특히 세포 표면 전시(display) 시스템, 예컨대 포유류 세포 표면 전시 시스템을 사용하여 수행되는 분석을 포함한다. 예시적인 방법에서, 변형된 치료적 단백질의 라이브러리를 포함하는, 치료적 단백질 또는 변이체 치료적 단백질을 암호화하는 핵산은 세포, 예컨대 포유류 세포에서 발현하기에 적합한 벡터로 도입될 수 있다. 세포는 그 후 벡터로 형질감염되며, 치료적 단백질들은 세포에 의해 발현된다. 표면 발현된 치료적 단백질을 포함하는 세포의 라이브러리는 가용성 또는 표면 결합 동족 결합 파트너를 포함하는 용액과 접촉될 수 있다. 결합 활성은 세포의 표면에 대한 결합을 검출할 수 있는 임의의 분석을 사용하여 검출될 수 있다. 활성은 또한 시험 분자 또는 치료적 단백질의 기능적 활성을 평가함으로써 평가될 수 있다. 당업자에게 알려진 임의의 세포 기반 분석이 본원에서 제공되는 방법에서 사용하기 위해 고려되는데, 이러한 방법은 세포 증식 분석, 세포 사멸 분석, 유동 세포 계수법, 세포 분리 기술, 형광 활성 세포 분류(FACS), 위상차 현미경 관찰법, 형광 현미경 관찰법, 수용체 결합 분석, 세포 신호 분석, 면역세포화학 및 리포터 유전자 분석을 포함한다. 일부 예에서, 상기 분석은 형광 활성 세포 분류(FACS) 분석이다.
단백질은 분비된, 가용성 분자, 세포 표면 분자 또는 세포내 항체로서 포유류 세포에 의해 발현될 수 있다. 예시적인 방법에서, 세포는 대부분 또는 전체 세포가 세포 표면상에 앵커링된 단백질 라이브러리의 일원을 전시하는 조건 하에서 단백질의 라이브러리로 형질감염될 수 있다. 선택적으로, 발현 시스템은 대부분의 포유류 세포 형질감염체가 그들의 게놈에 통합된 오직 하나의 플라스미드를 갖는 곳에 사용될 수 있다. 그러므로, 대부분(즉, 적어도 약 70% 또는 약 80% 또는 약 90%)의 형질감염체가 하나 또는 그 이상의 치료 단백질 분자를 발현한다. 이는 예를 들어 개별적 형질감염체를 분리 및 배양하고; 발현된 서열이 단일 서열을 갖고 있는지 여부를 결정하기 위해 발현된 서열을 증폭하고 시퀀싱함으로써 입증될 수 있다.
본원에서 제공되는 방법의 일부 예에서, 상기 치료적 단백질은 포유류 세포의 표면상에 전시되는 항체이다. 본원에 기술된 임의의 항체는 포유류 세포의 표면상에 발현될 수 있으며, 전장, 2가(bivalent), 기능적 항체, 예컨대 IgG 항체를 포함한다. 항체는, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 단편일 수 있다. 항체는 Fc 영역, 예컨대 scFv-Fc 또는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함하는 전장 항체를 포함할 수 있다. 당업자는 적합한 항체 단편을 선택할 수 있다. 예를 들어, 포유류 세포에서 만들어진 ScFv-Fc 및 전장 항체는 scFv-Fc's 또는 Fab 단편에 대하여 그들의 다량체화 속성 및 그들의 더 긴 in vivo 반감기, 항원에 대한 더 높은 친화성, 및 응집체를 형성하는 더 작은 경향을 포함하는 몇몇 유리한 점을 가질 수 있다. 예를 들어, 항-EGFR 변이체 항체는 세포의 표면상에 전시되고, 동족 결합 파트너에 대한 활성(예컨대 EGFR 또는 가용성 EGFR)이 평가된다.
(a) 시험 분자의 세포 표면 발현
시험 분자, 예컨대 항체 변이체(예컨대 항-EGFR 항체 변이체)와 같은 치료적 분자는 세포의 표면상에 발현될 수 있다. 치료적 단백질과 같은 시험 분자를 암호화하는 핵산은 적합한 벡터, 예컨대 본원에 기술된 벡터에 삽입되고 형질감염 세포로 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 세포주는 당업계에 기술된 임의의 세포주 또는 American Type Culture Collection과 같은 저장소로부터 얻을 수 있는 세포주를 포함한다. 당업자는 희망되는 성질을 가진 세포주를 선택할 수 있다. 예를 들어, 포유류 세포에서 만들어진 항체는 원핵세포에서 만들어진 항체보다 더 적절하게 접히고 글리코실화되는 경향이 있다. 일부 예에서, 상기 치료적 단백질은 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현된다.
항체와 같은 단백질을 포유류 세포 표면상에 전시하기 위해 당업계에 알려진 임의의 벡터가 본원에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있다(예컨대 Zhou et al. (2010), MAbs 2(5):508-518 참조). 예를 들어, 상기 벡터는 치료적 단백질을 분비되는 단백질, 가용성 단백질 또는 세포 표면 단백질로서 암호화하는 핵산을 발현할 수 있다. 선택적으로, 벡터는 포유류 형질감염을 위한 적절한 순도 및 양의 핵산을 제조하기 위한 목적을 위해 세포에서의 발현에 적합하다. 이러한 세포는 예를 들어 박테리아 세포, 예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilus), 또는 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 진균 세포일 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 의해 형질전환된 라이브러리로부터 오직 한 유형의 치료적 단백질이 발현되도록 선택될 수있다. 세포의 형질감염 방법은 당업자에게 알려져 있고(예컨대 Hahn 및 Scanlan (2010) Top. Curr. Chem. 296:1-13), 예를 들어, 다가양이온 사이클로덱스트린 벡터(예컨대 Cryan et al, (2004) Eur J Pharm Sci. 21(5):625-33) 및 양이온 리포좀(예컨대 Gao 및 Huang (1995) Gene Ther. 2(10):710-722)을 포함하는 리포좀 복합체와 같은 화학적 방법을 포함한다. 미국 특허번호 7989606호에 기술된 것들을 포함하여 사용될 수 있는 양이온 리포좀의 예시는, 3-베타-[N-(N',N'-디메틸-아미노에탄)-1-카바모일]-콜레스테롤(DC-Chol), 1,2-비스(올레오일옥시-3-트리메틸암모니오-프로판(DOTAP)(예컨대, WO 98/07408 참조), 라이시닐포스파티딜에탄올 아민(L-PE), 리포폴리아민, 예컨대 리포스퍼민, N-(2-하이드록시에틸)-N,N-d-디메틸-2,3-비스(도데사이클록시) 1-프로판아미니움 브로마이드, 디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드(DDAB), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE), 디올레오일포스파티딜 콜린(DOPC), N(1,2,3-디올레일옥시) 프로필-N,N,N-트리에틸암모늄(DOTMA), DOSPA, DMRIE, GL-67, GL-89, 리포펙틴, 및 리포펙타민(Thiery, et al. Gene Ther. (1997); Felgner, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. (1995); Eastman, et al., Hum. Gene Ther. (1997))를 포함한다. 형질감염의 방법은 또한 비화학적인 방법을 포함하는데, 예컨대 전기천공(electroporation)(Chu et al. (1987), Nucl. Acid. Res. 15(3) 1311-1326.), 초음파천공(sonoporation)(예컨대 Kumon, et al (2009), Ultrasound Med Biol. 35(3):494-506), 유전자 총(예컨대 O'Brien 및 Lummis (2004) Methods 33(2):121-125) 및 바이러스 형질도입(예컨대, Flotte 및 Carter (1995), Gene Ther. 2(6):357-362)을 포함한다.
일부 예에서, 형질감염체는 치료적 단백질을 세포 표면 단백질로서 발현할 수 있다. 당업자는 본원에 기술된 변형된 단백질을 발현하기 위한 벡터를 선택할 수 있다. 예를 들어, 포유류 세포주의 게놈 내의 특이적 부위에 통합되는데 벡터가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 벡터의 일 예는 FLP-IN™ 벡터(Invitrogen)이며, 이 벡터는 부위-특이적 염색체 통합을 위한 적절한 부위를 포함하고 있는 세포 내로 형질감염될 수 있다. 상기 FLP-IN™ 벡터는 FLP 재조합 표적(FRT) 부위를 포함하도록 유전적으로 조작된 포유류 세포주의 게놈의 특이적 부위에, 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)의 FLP 재조합효소를 사용하여 통합될 수 있다 (예컨대 미국 특허번호 5,654,182호; 5,677,177호; 5,885,836호; 6,956,146호; 및 7,884,054호; 및 O'Gorman et al. (1991), Science 251:1351-1355). 사용될 수 있는 기타 벡터 시스템은 Cre-LoxP 시스템이다(Trinh 및 Morrison (2000), J. Immunol. Methods 244:185-193). Cre 재조합효소는 두 개의 LoxP 부위 사이에 재조합을 촉매할 수 있다. 일부 실시예에서, 서로 약간 상이한 서열을 가진 두 개의 LoxP 부위(상기 두 개의 상이한 부위 사이의 재조합이 Cre 재조합효소에 의해 촉매될 수 없도록)가 동일한 두 개의 상이한 LoxP 부위에 인접한 변형된 항체-암호화 서열로 형질감염된 포유류 세포에 존재할 수 있다. 이 상황에서, 항체-암호화 서열은 두 개의 상이한 LoxP 부위 사이에 Cre 재조합효소에 의해 또한 절단될 가능성 없이 삽입될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 LoxP 부위는 동일할 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 Cre 재조합효소의 발현 또는 활성은 조건부 조절가능할 수 있다.
벡터에 사용되는 조절 서열은 전형적으로 포유류, 미생물, 바이러스 및/또는 곤충 유전자로부터 유래된다. 조절 서열의 예는 전사적 프로모터, 작동자, 및 인핸서, 리보솜 결합 부위(예컨대 Kozak (1991), J. Biol. Chem. 266:19867-19870), 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site), 전사 및 번역 개시 및 종결을 조절하기 위한 적절한 서열, 폴리아데닐화 신호(예컨대 McLauchlan et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16:5323-5333 참조), 및 기질 및 스캐폴드(scaffold) 부착 부위(Phi-Van et al. (1988), Mol. Cell. Biol. 10:2302-2307; Stief et al. (1989), Nature 341:343-345; Bonifer et al. (1990), EMBO J. 9:2843-2848 참조)를 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 조절 서열이 폴리펩티드 코딩(암호화) 서열에 기능적으로 관련된 때 작동적으로 연결된다. 그러므로, 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 프로모터 뉴클레오티드 서열이 코딩(암호화) 서열의 전사를 통제한다면 폴리펩티드 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
발현 벡터는 전형적으로 포유류 세포에서 치료적 단백질을 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함할 것이다. 종종 상기 프로모터는 고수준의 전사가 일어나도록 할 수 있을 것이다. 발현 벡터는 FLP-IN™ 유형 벡터와 비교하면 결합을 검출하기 위해서 고수준의 발현이 요구되는 상황에서 유리할 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 CMV 및 SV40 바이러스 프로모터, 포유류 액틴 프로모터, 라우스 육종 바이러스의 3' 장 말단 반복(long terminal repeat) 내에 포함된 프로모터, 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터, 또는 메탈로티오닌 유전자의 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 즉시 초기 유전자 1(immediate early gene 1)의 인간 CMV 프로모터/인핸서가 사용될 수 있다(예컨대 Paterson et al. (1994), Applied Microbiol. Biotechnol. 40:691-698 참조). SV40 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA 서열, 예를 들어 SV40 기원, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위는, 포유류 숙주 세포에서 구조적 유전자의 발현을 위한 기타 유전적 요소(genetic elements)를 제공하는데 사용될 수 있다. 바이러스 초기 및 후기 프로모터는 둘 다 바이러스 게놈에서 단편으로서 쉽게 획득될 수 있기 때문에 특히 유용한데, 상기 단편은 또한 바이러스의 복제 기점을 포함할 수 있다(Fiers et al. (1978), Nature 273:113; Kaufman (1990), Meth. in Enzymol. 185:487-511). SV40 바이러스 복제기점 부위 내에 위치하는 Hind III 부위로부터 Bgl I 부위에 이르는 약 250 bp가 포함된다면, 더 작은 또는 더 큰 SV40 단편도 사용될 수 있다.
기타 고 발현 포유류 유전자로부터의 프로모터들이 또한 사용될 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 박테리아의 DNA 복제기점, 박테리아에 대해 양성적으로 선택될 수 있는 유전자 산물을 암호화하는 서열, 폴리아데닐화 부위, 리보솜 결합 부위, 및 선택적으로, 포유류 세포에 대해 양성적으로 선택되는 유전자 산물을 암호화하는 서열, 예컨대, 하이그로마이신, 네오마이신 또는 G418에 대한 내성을 부여하는 서열을 포함한다. 발현 벡터의 예는 pDC302 (Mosley et al. (1989), Cell 59:335-348)이다. 기타 발현 벡터의 예는 pTriE™-4 Ek/LIC 벡터 (Novagen, Wis., USA) 또는 pGEN 벡터 (Promega, Wis., USA)와 같은 상업적으로 이용가능한 벡터를 포함한다.
일부 예에서, 치료적 단백질은 세포 표면상에 전시를 위하여, 하나 또는 그 이상의 막관통 도메인과 함께 발현되는데, 예컨대 상기 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 막관통 도메인의 부착에 의해 발현된다. 본원에서 제공되는 방법에서 막 연합 서열(membrane association sequence)로서 사용될 수 있는 막관통 도메인은 본원에서 기술된, 당업계에 알려진, 또는 예측될 수 있는 임의의 막관통 도메인을 포함한다(예컨대 Kahsay et al. (2005) Bioinformatics 21(9):1853-1858 참조). 예시적인 막 연합 서열은 당업계에 알려진 막관통 도메인 및 글리코포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커 서열을 포함한다(예컨대 Udenfriend 및 Kodukula (1995), Methods Enzymol. 250:571-582 참조). 치료적 단백질에 막관통 도메인을 부착할 수 있는 예시적인 벡터는 벡터 FVTM을 포함한다(Zhou et al. (2010), MAbs 2(5):508-518).
당업자는 치료적 단백질의 발현을 위해 제공하는 기타 발현 시스템을 선택할 수 있다. 예를 들어, 치료적 단백질이 항체라면, 벡터는 항체의 발현에 적합한 것으로 선택될 수 있다. 세포 표면상에 항체의 포유류 발현을 위한 다수의 벡터가 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 코딩(암호화) 서열이 개별적으로 전사 및 번역되는 벡터가 선택될 수 있거나 중쇄 및 경쇄 코딩(암호화) 서열이 함께 전사되고 번역될 수 있는 벡터가 선택될 수도 있다. 막 연합 서열, 예컨대 막관통 도메인이 중쇄 또는 경쇄에 부착될 수 있거나, 또는 막관통 도메인이 경쇄 및 중쇄에 부착될 수도 있다. 상기 막 연합 서열은 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다.
(b) 형광 활성 세포 분류(FACS)에 의한 결합 및 검출
형광 활성 세포 분류(FACS)는 형광 세포를 비-형광 세포로부터 구별하는 세포 분리 기술이다(Current Protocols in Cytometry, Robinson et al., eds., John Wiley & Sons (2004); Edidin (1989), Methods in Cell Biology 29:87-102; Herzenberg et al., (1976) Sci. Am. 234(3):108-117, 미국 특허번호 5,968,738호 및 5,804,387호). 유동 분류기(flow sorters)가 라이브러리 삽입체를 포함하는 다수의 개별적 세포를 빠르게 검사할 수 있다(예컨대, 시간당 천만-1억개의 세포)(Shapiro et al., Practical Flow Cytometry, 1995). 요약하면, 현탁액 내의 세포들은 각각 단일한 세포를 포함하는 방울(droplet)로서 레이저 앞을 지나간다. 상기 방울에 전하가 적용되고 정전 편향 시스템(electrostatic deflection system)이 대전된 방울들을 적절한 콜렉션 튜브에 수집한다(Basu et al. (2010), J. Vis. Exp (41):1546). 생물학적 세포의 분류 및 검사를 위한 유동 세포 계수기는 당업계에 잘 알려져 있다. 공지의 유동 세포 계수기는, 예를 들어, 미국 특허번호 4,347,935 호; 5,464,581호; 5,483,469호; 5,602,039호; 5,643,796호; 및 6,211,477호에 기술된다. 다른 공지의 유동 세포 계수기는 Becton Dickinson and Company에 의해 제조된 FACS Vantage™ 시스템이 있고, Union Biometrica에 의해 제조된 COPAS™ 시스템이다.
FACS는 희망하는 결합 성질을 가진 단백질을 전시하는 세포들을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에서, 조건부 활성 시험 분자, 예컨대 단백질이 상이한 조건 하에서 동족 결합 파트너에 결합하는 단백질을 스크리닝함으로써 FACS 분석에 의해 확인될 수 있다. 예시적인 방법에서, 세포는 세포 표면상에 전시되는 단백질에 대해 암호화하는 벡터로 형질 감염된다. 세포는 그 후 동족 결합 파트너에 접촉된다. 세포 표면상에 전시되는 단백질의 동족 결합 파트너에 대한 결합은 세포-관련된 형광을 야기할 수 있다. 형광 세포는 비-형광 세포로부터 분리되며, 동족 결합 파트너에 결합하는 활성 단백질을 발현하는 세포들이 동족 결합 파트너에 결합하지 않는 단백질을 발현하는 세포들로부터 분리된다. 동족 결합 파트너와 상호작용하는 단백질을 확인하기 위해 활성 및/또는 비활성 단백질을 암호화하는 핵산이 분리될 수 있고 시퀀싱될 수 있다. 또한, 분리된 세포는 추가적인 분석, 예컨대 추가적인 FACS 분석을 포함하여 본원에서 기술되는 분석을 받을 수 있다.
전형적으로, 동족 결합 파트너는 검출을 돕도록 검출가능하게 표지된다. 대안적으로, 동족 결합 파트너는 표지되지 않지만, 2차 제제를 사용함으로써 검출될 수 있다. 2차 시약의 동족 결합 파트너에 대한 표지는 형광 표지(예컨대, Francisco et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10444-10448) 또는 형광 2차 표지와 상호작용하는 표지를 포함한다. 당업자에게 알려진 임의의 형광단(fluorophore)이 형광 표지, 예컨대 동족 결합 파트너 상의 형광 표지 또는 2차 표지로서 사용될 수 있다. 예시적인 형광단은 플루오르세인, 로다민 또는 텍사스 레드, FLUOR X®, ALEXA FLUOR, OREGON GREEN, TMR (테트라메틸로다민), ROX (X-로다민), BODIPY 630/650 및 Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech of Piscataway, N.J. 또는 Molecular Probes Inc. of Eugene, Oreg.로부터 이용가능한), 또는 당업자에게 알려진 임의의 기타 형광 표지를 포함한다 (예컨대, Giepmans et al. (2006), Science Apr 14;312(5771):217-24 참조). 형광 시료를 분석할 때 고려해야 하는 기준은 Alexay et al. (1996) The PCT International Society of Optical Engineering 2705/63에 요약되어 있다.
추가적인 예에서, 상기 2차 시약과의 상호 작용을 돕기 위하여, 동족 결합 파트너는 형광 2차 표지와 상호작용하는 표지를 포함할 수 있다. 동족 결합 파트너 상의 표지와 상호작용하는 임의의 2차 표지가 사용될 수 있다. 일부 예에서, 동족 결합 파트너, 예컨대 EGFR 또는 EGFR sECD는 당업자에게 알려진 또는 본원에 기술된 링커와 함께 비오틴으로 표지되고, 상기 세포는 비오틴과 상호작용하는 분자, 예컨대 스트렙타비딘에 부착된 형광 2차 표지와 혼합된다. 일부 예에서, 상기 2차 표지는 플루오르세인에 부착된 스트렙타비딘이다.
일 예에서, FACS 분석은 동시에 또는 평행으로 수행되는 상이한 세트의 조건 하에서 두 개의 별도의 분석으로서 수행될 수 있다. 일 예에서, 상기 분석은 평행으로 수행되고 시험 분자 또는 치료적 단백질을 발현하는 세포 집단은 두 집단으로 나뉜다. 한 집단은 활성이 희망되는 제 1 조건(예컨대 병적 미세환경 또는 종양 미세환경)을 시뮬레이션하는 분석 완충액 내에서 상기 시험 분자 또는 치료적 단백질과 접촉된다. 두 번째 집단은 활성이 희망되지 않는 조건(예컨대 생리적으로 정상인 환경)을 시뮬레이션하는 분석 완충액 내에서 시험 분자와 접촉된다. FACS 분석에서, 임의의 단계, 예컨대 접촉 단계가 병적 미세환경, 예컨대 종양을 시뮬레이션하는 조건 하, 또는 정상 미세환경을 시뮬레이션하는 조건 하에서 수행될 수 있다. 종양 미세환경을 시뮬레이션하는 예시적인 조건은 16.5 mM 젖산, pH 6.0, 25% 인간 혈청과 같은 세트의 조건이다. 정상 미세환경을 시뮬레이션하는 예시적인 세트의 조건은 1 mM 젖산, pH 7.4, 및 25% 인간 혈청과 같은 비-종양 미세환경을 시뮬레이션하기 위한 세트의 조건이다.
예를 들어, 상기 치료적 단백질을 발현하는 세포는 예컨대, 동족 결합 파트너를 포함하는 용액 또는 완충액과 함께 혼합함으로써 표지된 동족 결합 파트너와 접촉될 수 있는데, 이때 결합 완충액은 희망되는 조건(본원에서 희망되는 바와 같은 제 1 조건 또는 제 2 조건)을 모방하거나 시뮬레이션하는 것이다. 개별적으로(동시에 수행되거나 본원에 기술되는 바와 같이 양성 또는 음성 선택 후에 반복적 단계로서 수행되도록), 예컨대 표지된 동족 결합 파트너를 포함하는 용액 또는 완충액을 혼합함으로써, 분석되는 치료적 단백질을 발현하는 제 2 동일한 집단의 세포가 표지된 동족 결합 파트너와 접촉될 수 있는데, 여기에서 상기 결합 완충액은 나머지 다른 조건을 모방하거나 시뮬레이션한 것이다. 각 단계에서 접촉 단계는 특정한 결합 완충액 또는 용액을 제외하면 동일하다. 접촉 단계는 세포 표면 단백질이 동족 결합 파트너(예컨대 항원)에 결합하도록 하는 임의의 희망되는 길이의 시간 및 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 결합은 일반적으로 4℃-37℃, 예컨대 4℃, 실온 또는 37℃에서 수행된다. 결합 시간은 일반적으로 30분 내지 48시간 또는 그 이상이고, 온도와 상관 관계가 있을 수 있다. 전형적으로, 결합 분자 또는 단백질의 결합은 실온에서 약 30분 내지 4시간 사이, 예컨대 1시간 내지 2시간, 예를 들어 약 1시간이다. 상기 세포는 임의의 결합되지 않은 동족 결합 파트너를 제거하기 위해 결합에 사용되는 동일한 완충액으로 세척될 수 있다. 추가적으로, 최적화를 위해 다양하게 될 수 있는 특이적 파라미터는 동족 결합 파트너의 농도, 동적 경쟁(kinetic competition) 시간 및 FACS 엄격성(stringency)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, FACS 스크리닝은 평형 또는 동적 조건 하에서 수행될 수 있다.
2차 시약이 검출 단계에서 사용된다면, 결합되지 않은 동족 결합 파트너를 제거하기 위해 세포를 세척한 후, 상기 세포는 적절한 2차 시약과 접촉된다. 이 추가적인 접촉 단계는 상기 2차 시약이 동족 결합 단백질에 결합되도록 하는 임의의 희망되는 길이의 시간 및 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 결합은 일반적으로 4℃-37℃, 예컨대 4℃, 실온 또는 37℃에서 수행된다. 결합 시간은 일반적으로 5분 내지 2시간 또는 그 이상이고, 온도와 상관 관계가 있을 수 있다. 전형적으로, 2차 시약과 세포의 결합은 실온에서 약 30분 내지 4시간 사이, 예컨대 1시간 내지 2시간, 예를 들어 약 1시간이다. 세포는 임의의 결합되지 않은 2차 시약을 제거하기 위해 결합에 사용한 것과 동일한 완충액으로 세척될 수 있다.
형광 세포는 동족 결합 파트너에 결합하는 단백질을 전시하는 세포들을 동족 결합 파트너에 결합하지 않는 단백질을 전시하는 세포들로부터 분리하기 위해 비 형광 세포로부터 분리될 수 있다. 핵산은 분리된 형광 세포 및 비 형광 세포들로부터 분리될 수 있고, 상기 핵산은 동족 결합 파트너와 상호작용하거나 상호작용하지 않는 발현된 단백질을 확인하기 위해 시퀀싱될 수 있다.
전형적으로, 결합 분석은 양성 또는 음성 선택 단계를 먼저 수행함으로써 수행된다. 상기 유동 분류기는 특정의 형광 성질을 갖는 세포를 수집 또는 분류할 수 있다. 이 특징은 결합을 나타내고/나타내거나 결합을 나타내지 않는 것으로 확인된 제 1 세포 집단을, 희망되는 특정한 결합 특성에 의존적으로 선택 또는 제외하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 양성 선택 단계에서, 상기 접촉 및 결합 반응은 상기 기술된 바와 같이 수행되고, 세포는 세트의 조건 하에서 동족 결합 파트너에 결합하는 단백질을 발현하는 세포를 풍부하게 하기 위해 분리된다. 전형적으로, 양성 선택 단계에서, 접촉, 표지 및 분류는 단백질의 활성이 희망되는 생리적 조건을 시뮬레이션한 세트의 조건 하에서 수행된다. 양성 선택 단계에 대한 조건의 예는 종양 미세환경의 생리적 조건을 시뮬레이션하는 조건이다. 음성 선택 단계에서, 세트의 조건 하에서 동족 결합 파트너에 대한 결합이 거의 없거나 없는 단백질을 전시하는 세포를 분리 및/또는 풍부하게 하기 위해 세포가 분리된다. 전형적으로 음성 선택 단계에서, 접촉, 표지 및 분류는 단백질의 활성이 희망되지 않는 생리적 조건을 시뮬레이션한 세트의 조건 하에서 수행된다. 음성 선택 단계에 대한 조건의 예는 정상 미세환경의 생리적 조건을 시뮬레이션한 조건이다.
선택 단계 또는 일련의 대안적 선택 단계들이 1회 또는 수 회, 예컨대 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회 수행될 수 있다. 희망된다면, 2회 또는 그 이상의 상이한 선택 단계가 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 음성 선택 단계가 양성 선택 단계 다음에 따라올 수 있고, 양성 선택 단계 및 음성 선택 단계의 조합이 조건부 활성 단백질을 전시하는 세포를 분리하기 위해 필요한 만큼 자주(as often as necessary) 반복될 수 있다. 일부 예에서, 당업자에게 알려진 또는 본원에 기술된 임의의 FACS 선택 파라미터는 선택의 엄격성을 증가 또는 감소시키기 위해 조율될 수 있다. 예를 들어, 선택의 엄격성은 최초 선택 라운드에서 낮을 수 있고 조건부 활성 단백질을 발현하는 세포 집단으로 세포가 풍부하게 됨에 따라 나중 라운드(later round)에서 증가될 수 있다. 분류 게이트는 동족 결합 파트너에 대한 최고의 친화성 또는 최저의 친화성을 보여주는 세포를 선택하기 위해 확립될 수 있다. 분류 게이트는 당업자에 의해 경험적으로 확립될 수 있다. 또한, 라이브러리는 희소한 클론을 분리할 가능성을 증진시키기 위해 적어도 10배 분량으로 과-샘플링될 수 있다.
선택의 각 라운드 사이에 세포는 세포 표면상에 단백질 발현이 회복되고/되거나 증가하도록 다시 성장되고/성장되거나 유도될 수 있다. 특정한 작용 방식에 구속되고자 의도하지 않음에도 불구하고, 이 반복적인 공정은 조건부 활성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 풍부하게 하는 것을 돕는다.
D. 단백질 발현 방법
본원의 스크리닝 분석에 사용하기 위한 시험 분자, 및 특히 치료적 단백질 또는 항체가 표준 세포 배양 및 기타 당업계에 알려진 발현 시스템을 사용하여 발현될 수 있다. 스크리닝 방법에서 사용하기 전에, 단백질은 정제될 수 있다. 대안적으로, 전체 상청액 또는 희석된 상청액이 본원의 이중 분석에서 스크리닝될 수 있다.
본원의 방법에서 사용되는 결합 분자, 단백질 및 표적 항원은 재조합적으로 제조될 수 있거나 상업적 판매자들로부터 구입될 수 있다. 예를 들어, 항체와 같은 결합 분자는 당업자의 범위 내에 있는 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다. 관심있는 단백질을 암호화하는 DNA는 합성적으로 생산될 수 있거나 통상의 절차를 사용하여 쉽게 분리되고 시퀀싱될 수 있다(예컨대 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써). 예를 들어, 관심 있는 단백질 또는 항체를 생산하거나 발현하는 공지의 세포원(cell source)은 이러한 DNA의 선호되는 기원으로서 작용할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 일단 항체를 암호화하는 DNA의 서열이 결정되면, 핵산 서열은 유전자 합성 기술을 사용하여 구축될 수 있다.
또한, 임의의 단백질의 변이체 형태를 생산하기 위해 돌연변이 유발 기술이 이용될 수 있다. DNA는 또한 변형될 수 있다. 예를 들어, 유전자 합성 또는 일상적인 분자 생물학 기술이 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 부가 또는 치환을 일으키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 뉴클레오티드 서열이 핵산 서열에 연결될 수 있다. 일 예에서, 합성 유전자를 벡터, 예컨대 단백질 발현 벡터에 클로닝하기 위한 목적으로, 링커 서열이 부가될 수 있는데, 이러한 링커 서열은 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 부위를 포함한다. 또한, 기능적 DNA 요소(elements)를 명시하는 부가적인 뉴클레오티드 서열이 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 서열의 예는, 세포내 단백질 발현을 용이하게 하도록 설계된 프로모터 서열 및 단백질 분비를 수행하기 위한 리더(leader) 펩티드 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
항체와 같은 단백질은 전장 단백질 또는 전장보다 짧은 길이의 단백질로서 발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편이 발현될 수 있다. 본원에서 제공되는 핵산 분자 및 단백질은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 절차들은 당업자에게 일상적인 것이고 잘 알려져 있다. 그들은 유전자 합성, PCR, 라이게이션(ligation), 클로닝, 형질 감염 및 정제 기술을 포함하는 일상적인 분자 생물학 기술을 포함한다. 이러한 절차들의 기술은 하기 제공된다.
일단 분리되면, 상기 DNA는 발현 벡터에 배치될 수 있는데, 발현벡터는 그 후 숙주 세포에 형질 감염된다. 벡터의 선택은 희망되는 적용에 의존적이다. 예를 들어, 핵산의 삽입 후에, 벡터는 전형적으로 숙주 세포를 형질전환시키는데, 예를 들어 복제 및/또는 이의 발현을 위해 단백질 유전자를 증폭시키는 데, 사용된다. 이러한 예에서, 고수준 발현에 적합한 벡터가 사용된다.
항체의 발현을 위해서, 일반적으로, 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산은 벡터 내로 클로닝되고 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산은 벡터 내로 클로닝된다. 상기 유전자는 이의 이중 발현을 위해 단일한 벡터에 클로닝될 수 있거나, 또는 별개의 벡터에 클로닝될 수도 있다. 희망된다면, 벡터는 또한 형태를 생성하기 위하여 추가적인 불변 영역 또는 힌지 영역을 암호화하는 서열을 더 포함할 수 있다. 벡터는 숙주 세포에 형질감염되고 발현될 수 있다. 발현은 당업자에게 알려진 임의의 세포 발현 시스템에서 있을 수 있다. 예를 들어, 재조합 숙주 세포에서 항체의 합성을 획득하기 위해, 숙주 세포는 그 외에는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 세포를 포함한다. 예를 들어, 숙주 세포는 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 293FS 세포, HEK293-6E 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. NSO 세포 또는 기타 골수종 세포. 기타 발현 벡터 및 숙주 세포가 하기 기술된다.
일 예에서, 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산은 제 1 발현 벡터 내로 라이게이션되고 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산은 제 2 발현 벡터 내로 라이게이션된다. 발현 벡터는 일반적으로 이로부터 단백질(중쇄 및 경쇄)의 비교가능한 발현이 가능하도록 충분히 양립가능함에도 불구하고, 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 제 1 및 제 2 발현 벡터는 일반적으로 숙주 세포 내에, 전형적으로 1:1 비율로 공동-형질감염된다. 예시적인 벡터는 pγ1HC 및 pκLC를 포함하나 이에 제한되지 않는다 (Tiller et al. (2008) J Immunol. Methods, 329:112-24). 기타 발현 벡터는 경쇄 발현 벡터 pAG4622 및 중쇄 발현 벡터 pAH4604를 포함한다(Coloma et al. (1992) J Immunol. Methods, 152:89-104). 상기 pAG4622 벡터는 gpt 선별 마커 및 인간 κL 쇄의 C-영역 도메인을 암호화하는 게놈 서열을 포함한다. 상기 pAH4604 벡터는 hisD 선별 마커 및 인간 H 쇄 γl C-영역 도메인을 암호화하는 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 중쇄 및 경쇄는 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대한 발현 카세트를 가진 단일한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
그러므로, 본원에서 제공되는 항체는 전장 항체로서, 또는 전장 보다 짧은 항체, 예컨대 Fab, Fab 힌지 단편, scFv 단편, scFv 텐덤 단편(tandem fragment) 및 scFv 힌지 및 scFv 힌지 (△E) 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 항체로서 생성되거나 발현될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체(intact antibody)의 단백질 가수분해 소화에 의해 유래되었다(예컨대 Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117; Brennan et al. (1985) Science, 229:81 참조). 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv, 및 scFv 항체 단편은 모두 숙주 세포, 예컨대 E. coli 에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있고, 따라서 이들 단편의 많은 양의 용이한 생산을 가능하게 한다. 또한, Fab'-SH 단편은 F(ab')2 단편을 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있다 (Carter et al. (1992) Bio/Technology, 10:163-167). 또 다른 접근에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 다른 예에서, 선택되는 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv)이다(예컨대 WO93/16185호; 미국 특허번호 5,571,894호 및 미국 특허번호 5,587,458호 참조). Fv 및 sFv는 불변 영역이 결여된 온전한 결합 부위(intact coupling sites)를 갖는 유일한 종이다; 따라서, 그들은 in vivo 사용 동안에 감소된 비특이적 결합에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 이펙터(effector) 단백질의 융합을 만들도록 구축될 수 있다. 항체 단편은 또한 선형 항체(예컨대 미국 특허번호 5,641,870호 참조)일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적(monospecific) 또는 이중특이적(bispecific)일 수 있다. 항체 단편 생산을 위한 기타 기술이 당업자에게 알려져 있다.
예를 들어, 발현에 있어서, 항체 중쇄 및 경쇄는 전장 항체 또는 이의 단편을 형성하기 위해 이황화 결합에 의해 쌍을 이룬다. 예를 들어, 전장 Ig의 발현을 위해, VH-CH1-힌지-CH2-CH3를 암호화하는 서열이 제 1 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있고 VL-CL 도메인을 암호화하는 서열이 제 2 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. VL-CL 도메인을 암호화하는 제 2 발현 벡터와의 공동-발현으로, 전장 항체가 발현된다. 또 다른 예에서, Fab를 생성하기 위해서, VH-CH1을 암호화하는 서열이 제 1 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있고 VL-CL 도메인을 암호화하는 서열이 제 2 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 중쇄는 경쇄와 쌍을 이루고 Fab 모노머가 생성된다. 다양한 IgG 아형의 CH1, 힌지, CH2 및/또는 CH3가 당업자에게 알려져 있다(예컨대 미국 공개번호 20080248028호 참조). 유사하게, CL의 서열, 람다 또는 카파 또한 알려져 있다(예컨대 미국 공개번호 20080248028호 참조).
전체 항체 및 항체 단편의 발현을 위해 벡터 내로 삽입될 수 있는 예시적인 서열은 표 3에 제공되는 항체 단편의 서열을 포함한다. 예를 들어, Erbitux®(세툭시맙)의 중쇄 및 경쇄 서열(각각 서열번호 2 및 1) 또는 임의의 다른 항체의 중쇄 및 경쇄 서열(즉, 각각 서열번호 74 및 75, (Herceptin®);각각 서열번호 76 및 77, (Rituxan®); 각각 서열번호 78 및 79, (Avastin®); 각각 서열번호 80 및 81, (Cempath®); 각각 서열번호 82 및 83, (Vectibix®); 각각 서열번호 41 및 42, (Ibritumomab®); 각각 서열번호 43 및 44, (Tositumomab®); 각각 서열번호 45 및 46, (Volociximab); 각각 서열번호 47 및 46, (F200); 또는 각각 서열번호 48 및 49, (Cixutumumab)이 IgG 항체의 발현을 위해 본원에 기술된 또는 당업자에게 알려진 적절한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 또한, VH-CH1 및 VL-CL 서열, 예컨대 각각 서열번호 84 및 85, (Lucentis®)이 Fab 분자의 발현을 위해 적절한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인(즉, 서열번호 29 및 30, 각각(Herceptin®); 각각 서열번호 31 및 32, (Rituxin®); 각각 서열번호 33 및 34, (Avastin®); 각각 서열번호 35 및 36, (Campath®); 각각 서열번호 37 및 38, (Vectibix®); 및 각각 서열번호 39 및 40, (Lucentis®)이 가변 중쇄 및 가변 경쇄 사이의 링커를 암호화하는 벡터와 같은 적절한 발현 벡터 내에서 발현될 수 있다. 예시적인 링커는 글리신 리치 플렉서블 링커(Glycine rich flexible linkers ) (-G4S-)n을 포함하며, 여기서 n은 양의 정수, 예컨대 1(서열번호 4), 2(서열번호 70), 3(서열번호 71), 4(서열번호 72), 5(서열번호 73), 또는 그 이상이다.
1. 벡터
벡터의 선택은 희망되는 적용에 의존적일 수 있다. 재조합 항체 또는 이의 부분의 발현을 위한 많은 발현 벡터들이 이용가능하고 당업자에게 알려져 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현 시스템의 선택에 의해 영향을 받는다. 이러한 선택은 당업자의 기술의 범위 내에 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터 및 선택적으로 인핸서, 번역 신호, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함할 수 있다. 안정한 형질전환을 위해 사용되는 발현 벡터는 일반적으로 형질전환된 세포의 선택 및 유지를 가능하게 하는 선별 마커를 가진다. 일부 경우에서, 복제 기점은 세포에서 벡터의 복제수(copy number)를 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 벡터는 또한 일반적으로 라이게이션된 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 추가적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다(예컨대 His 태그, Flag 태그). 항체와 함께 적용하기 위해서, 벡터는 일반적으로 불변 영역을 암호화하는 서열을 포함한다. 그러므로, 항체 또는 이의 부분은 또한 단백질 융합으로서 발현될 수 있다. 예를 들어, 융합은 추가적인 기능성(functionality)을 폴리펩티드에 추가하기 위하여 생성될 수 있다. 융합 단백질의 예는 신호 서열, 예컨대 국소화(localization)를 위한 에피토프 태그, 예컨대 his6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제를 위한 태그, 예컨대 GST 융합, 및 단백질 분비 및/또는 막 연합(membrane association)을 지시하는 서열의 융합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 단백질의 발현은 당업계에 알려진 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 적절한 박테리아 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있고 하기에 기술된다. 포유류 세포, 효모 세포 및 곤충 세포를 위한 적절한 프로모터는 당업계에 알려져 있고 일부는 하기에 예시된다. 이종성(heterogenous) 핵산의 직접적 발현을 지시하는데 사용되는 프로모터의 선택은 특정한 적용에 의존적이다. 사용될 수 있는 프로모터는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: SV40 초기 프로모터(early promoter)(Bernoist 및 Chambon, Nature 290:304-310(1981)), 라우스육종(Rous sarcoma) 바이러스의 3' 장 말단반복(long terminal repeat) 내에 포함된 프로모터(Yamamoto 등 Cell 22:787-797(1980)), 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터(Wagner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445(1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절서열(Brinster et al, Nature 296:39-42(1982))을 포함하는 진핵 발현 벡터; 원핵 발현벡터, 예컨대 β-락타마제 프로모터(Jay et al,(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) 또는 택(tac) 프로모터(DeBoer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25(1983)); 또한 [Scientific American 242:79-94(1980)] 내 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria" 참조; 노팔린 합성효소(nopaline synthetase) 프로모터(Herrar-Estrella et al, Nature 303:209-213(1984)) 또는 꽃양배추 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner et al, Nucleic Acids Res. 9:2871(1981)), 및 광합성효소 리불로스이인산 카르복실라제(ribulose bisphosphate carboxylase)의 프로모터(Herrera-Estrella et al, Nature 310:115-120(1984))를 포함하는 식물 발현 벡터; 효모 및 다른 진균 유래 프로모터 요소, 예컨대 Gal4 프로모터, 알콜탈수소효소 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 및 조직특이성을 보이고 트랜스제닉 동물에서 사용되어온 다음의 동물 전사조절영역: 췌장 샘포세포(pancreatic acinar cells)에서 활성인 엘라스타제 I(elastase I) 유전자 조절영역(Swift et al, Cell 38:639-646(1984); Ornitz et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409(1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515(1987)); 췌장 베타세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절영역(Hanahan et al, Nature 315:115-122(1985)), 림프구양 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절영역(Grosschedl et al, Cell 38:647-658(1984); Adams et al, Nature 318:533-538(1985); Alexander et al, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444(1987)), 고환 세포, 유방 세포, 림프구양 세포 및 비만세포에서 활성인 마우스 유선암 바이러스 조절영역(Leder et al, Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절영역(Pinckert et al, Genes 및 Devel. 1:268-276(1987)), 간에서 활성인 알파-태아단백질(fetoprotein) 유전자 조절영역(Krumlauf et al, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648(1985); Hammer et al, Science 235:53-58(1987)), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 조절영역(Kelsey et al, Genes and Devel. 1:161-171(1987)), 골수세포에서 활성인 베타글로빈 유전자 조절영역(Magram et al, Nature 315:338-340(1985); Kollias et al, Cell 46:89-94(1986)), 뇌의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에서 활성인 수초염기성단백질(myelin basic protein) 유전자 조절영역(Readhead et al, Cell 48:703-712(1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절영역(Shani, Nature 314:283-286(1985)), 및 시상하부의 성선자극세포(gonadotrophs)에서 활성인 성선자극방출호르몬 (Mason 등, Science 234:1372-1378(1986)).
프로모터 이외에, 발현 벡터는 전형적으로 숙주세포 내에서 항체, 또는 이의 부분의 발현을 위해 요구되는 모든 추가적 요소(elements)를 포함하는 발현 카세트 또는 전사 유닛을 포함한다. 전형적인 발현 카세트는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 리보솜 결합 부위 및 번역 종결에 필요한 신호를 포함한다. 상기 카세트의 추가적인 요소는 인핸서를 포함할 수 있다. 또한, 카세트는 전형적으로 효율적인 종결을 제공하기 위한 구조적 유전자(structural gene)의 하류의 전사 종결 영역을 포함한다. 종결 영역은 프로모터 서열로서 동일한 유전자로부터 획득될 수 있거나 또는 상이한 유전자들로부터 획득될 수도 있다.
일부 발현 시스템은 티미딘 키나아제 및 디하이드로폴레이트 리덕타제와 같은 유전자 증폭을 제공하는 마커를 가진다. 대안적으로, 유전자 증폭이 수반되지 않는고수율 발현 시스템, 예컨대 곤충 세포 내의 폴리헤드론(polyhedron) 프로모터 또는 다른 강력한 배큘로바이러스 프로모터의 지시 하에 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 배큘로바이러스 벡터의 이용이 또한 적절하다.
항체들 또는 항체 변이체의 발현과 관련된 본원의 목적을 위하여, 항체의 r 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 항체의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 벡터가 제공된다. 벡터는 CH1, CH2, 힌지, CH3 또는 CH4 및/또는 CL 중 어느 하나 또는 모두를 위한 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 예컨대 Fab의 발현을 위하여, 벡터는 CH1 또는 CL (카파 또는 람다 경쇄)를 위한 서열을 포함한다. 불변 영역 또는 힌지 영역의 서열은 당업자에게 알려져 있다(예컨대 미국 공개번호 20080248028호 참조).
예시적인 발현 벡터는 임의의 포유류 발현 벡터, 예컨대, 예를 들어 pCMV를 포함한다. 박테리아 발현을 위해서, 이러한 벡터는 pBR322, pUC, pSKF, pET23D, 및 MBP, GST 및 LacZ와 같은 융합 벡터를 포함한다. 기타 진핵 벡터, 예를 들어 진핵세포 바이러스(eukaryotic virus)로부터의 조절 요소를 포함하는 임의의 벡터가 진핵 발현 벡터로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어, SV40 벡터, 파필로마(papilloma) 바이러스 벡터, 및 엡스타인-바(Epstein-Bar) 바이러스로부터 유래된 벡터를 포함한다. 기타 예시적인 진핵 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMT010/A+, pMAMneo-5, 배큘로바이러스(baculovirus) pDSCE, 및 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥐 유선암 바이러스(murine mammary tumor virus) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus ) 프로모터, 다면체(polyhedron) 프로모터, 또는 기타 진핵생물 내에서의 발현에 효과적인 것으로 나타난 프로모터의 지시 하에 단백질의 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터를 포함한다.
DNA 단편의 벡터 내로의 삽입을 위한 당업자에게 알려진 임의의 방법은 단백질 또는 항체 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 구축하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 in vitro 재조합 DNA 및 합성 기술 및 in vivo 재조합체(유전자 재조합)을 포함할 수 있다. 클로닝 벡터 내로의 삽입은, 예를 들어, DNA 단편을 상보적 접착성 말단(cohesive termini)을 갖는 클로닝 벡터 내로 라이게이션함으로써 달성될 수 있다. 상기 DNA를 단편화하는데 사용되는 상보적 제한 부위가 클로닝 벡터 내에 존재하지 않는다면, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 희망되는 임의의 부위가 뉴클레오티드 서열(링커)을 DNA 말단에 라이게이션함으로써 생산될 수 있다; 이들 라이게이션된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 암호화하는 특이적인 화학적으로 합성된 핵산을 포함할 수 있다.
2. 세포 및 발현 시스템
벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 일반적으로, 이종성 DNA를 발현하도록 조작될 수 있고 분비 경로를 가지는 임의의 세포 유형이 적절하다. 발현 숙주는 원핵 및 진핵생물, 예컨대 박테리아 세포(예컨대 E. coli), 효모 세포, 진균 세포, 고세균(Archea), 식물 세포, 곤충 세포 및 인간 세포를 포함하는 동물 세포를 포함한다. 발현 숙주는 발현된 단백질상에 존재하는 번역후 변형의 유형뿐만 아니라 그들의 단백질 생산 수준이 다를 수 있다. 또한, 발현 숙주의 선택은 종종 사용되는 벡터 및 전사 및 번역 요소의 선택과 관련된다. 예를 들어, 발현 숙주의 선택은 종종 활용되는 전구체 서열(precursor sequence)의 선택에 의존적이나, 언제나 그런 것은 아니다. 예를 들어, 다수의 이종성 신호 서열은 동일한 종의 숙주 세포에서만 발현될 수 있다(즉, 곤충 세포 신호 서열은 곤충 세포에서 최적으로 발현된다). 이와 대조적으로, 예를 들어 효모, 곤충 또는 포유류 숙주 세포에서 잘 작동하는 인간 혈청 알부민(hHSA) 신호 서열 및 곤충 및 포유류 세포에서 기능하는 것으로 입증되어온 조직 플라스미노겐 활성자 프리(pre)/프로(pro) 서열과 같은, 다른 신호 서열이 이종의 숙주에서 사용될 수 있다(Tan et al., (2002) Protein Eng. 15:337). 발현 숙주의 선택은 이들 인자들 및 다른 인자들, 예를 들어 조절 및 안전성(safety) 고려사항, 생산 비용 및 정제의 필요성 및 방법에 기초하여 이루어질 수 있다. 그러므로, 벡터 시스템은 사용되는 숙주 세포와 양립가능해야만 한다.
진핵 숙주에서의 발현은 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모, 드로소필라(Drosophila) 세포 및 인시류(lepidopteran) 세포와 같은 곤충 세포, 담배, 옥수수, 쌀, 조류(algae), 및 개구리밥(lemna)과 같은 식물 또는 식물 세포에서의 발현을 포함할 수 있다. 발현을 위한 진핵생물 세포는 또한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 새끼(baby) 햄스터 신장(BHK) 세포와 같은 포유류 세포주를 포함한다. 진핵 발현 숙주는 또한 혈청, 젖 및 알에서의 생산을 포함하는 트랜스제닉 동물에서의 생산을 포함한다.
재조합 분자는 유전자 서열의 수많은 복제를 생성하도록, 예를 들어, 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 감염, 전기천공 및 초음파천공을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 표준 형질감염 방법은 대량의 항체 쇄를 발현하는 박테리아, 포유류, 효모, 또는 곤충 세포주를 생산하기 위해 사용되는데, 생산된 항체 쇄는 그 후 표준 기술을 사용하여 정제된다(예컨대 Colley et al. (1989) J. Biol. Chem., 264:17619-17622; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed.), 1990 참조). 진핵 및 원핵 세포의 형질전환은 표준 기술에 따라 수행된다(예컨대 Morrison (1977) J. Bact. 132:349-351; Clark-Curtiss 및 Curtiss (1983) Methods in Enzymology, 101, 347-362 참조). 예를 들어, 외래(foreign) 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 잘 알려진 절차 중 임의의 절차가 사용될 수 있다. 이들은 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌(polybrene), 원형질체(protoplast) 융합, 전기천공, 유전자 총(biolistics), 리포솜(liposomes), 미세주입(microinjection), 플라스마 벡터(plasma vectors), 바이러스 벡터 및 클론된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 기타 외래 유전 물질을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 기타 잘 알려진 방법의 사용을 포함한다. 일반적으로, 항체의 발현 목적을 위해, 숙주 세포는 적어도 VH 쇄를 암호화하는 제 1 벡터 및 적어도 VL쇄를 암호화하는 제 2 벡터로 형질감염된다. 그러므로, 항체 폴리펩티드, 또는 이의 변형된 형태를 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 적어도 양 유전자를 성공적으로 도입할 수 있는 사용되는 특정 유전공학 절차가 유일하게 필요하다.
cDNA를 통합한 재조합 DNA 분자 또는 합성된 DNA 서열을 이용한 숙주 세포의 형질전환은 상기 유전자 다중 복제물의 생성을 가능하게 한다. 따라서, 상기 유전자는 형질전환체를 성장시키고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 분리하고, 필요시, 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수함으로으로써, 유전자는 대량으로 획득될 수 있다.
항체 및 이의 부분을 포함하는 단백질이 in vitro 및 in vivo 방법, 예컨대, 예를 들어 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 숙주 세포 또는 숙주 동물 내로의 도입 및 in vitro에서 재조합된 항체를 암호화하는 핵산 분자로부터 발현을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 방법에 의한 고처리량 접근법을 사용하여 생산될 수 있다. 원핵생물, 특히 E. coli는 재조합된 항체 또는 이의 부분의 대량 생산을 위한 시스템을 제공하며, 단백질의 고처리량 발현 및 정제의 적용에 특히 바람직하다. E. coli의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 단순하고 신속한 기술이다. 고처리량 발현을 위한 E. coli 숙주 균주는 BL21 (EMD Biosciences) 및 LMG194(ATCC)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 E. coli 숙주 균주는 BL21이다. 고처리량 발현을 위한 벡터는, pBR322 및 pUC 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
a. 원핵 발현
원핵생물, 특히 E. coli는 대량의 재조합된 항체 또는 이의 부분을 생산하기 위한 시스템을 제공한다. E. coli의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 간단하고 신속한 기술이다. E. coli를 위한 발현벡터는 고수준의 단백질 발현 유도 및 숙주세포에 어떤 독성을 나타내는 단백질 발현에 유용한 유도성 프로모터(inducible promoter)를 포함할 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7 및 SP6 RNA 프로모터 및 온도 조절 λPL (temperature regulated λPL)프로모터를 포함한다.
항체 또는 이의 부분을 포함하는 단백질은 E. coli의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 상기 세포질은 환원성 환경(reducing environment)이고, 일부 분자에 대하여, 이는 불용성 봉입체(inclusion bodies) 형성을 초래할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올 및 변성제(예를 들어, 예컨대 구아니딘-HCl 및 요소)가 단백질을 재용해하는데 사용될 수 있다. 예시적인 대안적 접근은 산화성 환경(oxidizing environment) 및 샤페로닌-유사 및 다이설파이드 이소머라제(disulfide isomerases)를 제공하여, 가용성 단백질의 생산을 야기할 수 있는, 박테리아의 주변세포질공간(periplasmic space) 내에서 재조합된 항체 또는 이의 단편의 발현이다. 전형적으로, 단백질을 주변세포질로 지시하는 리더서열이 발현될 단백질에 융합된다. 이어서, 리더는 주변세포질 내의 신호 펩티다아제에 의해 제거된다. 발현된 단백질을 주변세포질 내로 전위시키기 위한 3개의 주된 경로, 즉 Sec 경로, SRP 경로 및 TAT 경로가 있다. 주변세포질-표적 리더서열의 예는 펙테이트 리아제(pectate lyase) 유전자로부터의 pelB 리더, StⅡ 리더 서열, 및 DsbA 리더 서열을 포함한다. 예시적인 리더 서열은 DsbA 리더 서열이다. 일부 경우에서, 주변세포질 발현은 배양배지 내로 발현된 단백질의 유출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 신속하고 간단한 정제를 가능케 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투압성 용해에 의해 주변세포질로부터 획득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우에서 단백질은 불용성이 될 수 있으며, 용해(solubilization) 및 리폴딩(refolding)을 용이하게 하기 위해 변성제와 환원제를 사용할 수 있다. 유도 및 성장 온도는 또한 발현수준 및 가용성에 영향을 줄 수 있다. 전형적으로 25℃와 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 돌연변이는 또한 발현되는 단백질의 가용성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 박테리아는 비당화된(aglycosylated) 단백질을 생산한다. 따라서, 만약에 단백질이 기능하는데 당화(glycosylation)를 필요로 한다면, 숙주세포로부터 정제 후 in vitro에서 당화가 추가될 수 있다.
b. 효모
효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아료위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)가 재조합된 항체 또는 이의 부분에 대한 유용한 발현숙주이다. 효모는 에피솜 복제 벡터(episomal replicating vectors)로 형질전환되거나 또는 동종성 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해서 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 유도성 프로모터는 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 이러한 프로모터의 예는 AOX1, GAL1, GAL7 및 GAL5, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1을 포함한다. 발현벡터는 종종 형질전환된 DNA의 선택 및 유지를 위한 선별마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 종종 가용성이다. 샤페로닌, 예컨대 Bip 및 단백질 다이설파이드 이소머라제와의 공동-발현은 발현수준 및 가용성을 개선시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 분비 신호 펩티드 융합, 예컨대 사카로마이세스 세레비제로부터의 효모 교배형 알파-인자 분비 신호(yeast mating type alpha-factor secretion signal), 및 효모 세포표면 단백질, 예컨대 Aga2p 교배 부착수용체(mating adhesion receptor) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adreninivorans) 글루코아밀라제와의 융합을 이용하여 분비되도록 지시될 수 있다. Kex-2 프로테아제와 같은 프로테아제 절단 부위는 분비 경로가 종료될 때, 발현된 폴리펩티드로부터 융합된 서열을 제거되도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 당화가 가능하다.
c. 곤충
특히 배큘로바이러스 발현을 이용하는, 곤충세포는 항체 또는 이의 부분을 발현하는 데 유용하다. 곤충세포는 고수준의 단백질을 발현하고, 고등 진핵생물에 의해 이용되는 번역 후 변형 대부분이 가능하다. 배큘로바이러스는 안전성을 개선하고, 진핵발현의 조절 우려(regulatory concerns)를 감소시키는 제한적인 숙주범위를 가진다. 전형적인 발현벡터는 고수준 발현을 위한 프로모터, 예컨대 배큘로바이러스의 다각체(polyhedrin) 프로모터 및 p10 프로모터를 사용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 배큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcNPV), 및 누에나방(Bombyx mori) 핵다각체병 바이러스(BmNPV) 및 곤충세포주, 예컨대 도둑나방(Spodoptera frugiperda)으로부터 유래된 Sf9, 양배추금무늬나방(Trichoplusia ni)로부터 유래된 TN을 포함한다. 고수준의 발현을 위하여, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 다각체 개시코돈의 바로 하류에 융합된다. 인간 항체를 발현할 수 있는 배큘로바이러스 재조합체를 생성하기 위해, 이중발현 전달(dual-expression transfer), 예컨대 pAcUW51(PharMingen)이 활용된다. 포유류 분비 신호는 곤충세포에서 정확히 프로세싱되고, 발현된 단백질을 배양배지 내로 분비하기 위하여 이용될 수 있다.
곤충세포에 있어서의 대안적인 발현시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. 세포주, 예컨대 도둑나방(Spodoptera frugiperda)으로부터 유래된 Sf9, 양배추금무늬나방(Trichoplusia ni)로부터 유래된 TN이 발현에 사용될 수 있다. 배큘로바이러스 즉시 초기(immediate early) 유전자 프로모터 IE1은 안정된 수준의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 전형적인 발현벡터는 pIE1-3 및 pI31-4 전달 벡터(Novagen)을 포함한다. 발현벡터는 선별마커, 예컨대 네오마이신 및 하이그로마이신의 사용에 의해 전형적으로 유지된다.
d. 포유류 세포
포유류 발현 시스템은 항체 또는 이의 부분을 포함하는 변형된 단백질 발현에 이용될 수 있다. 발현 구축물(construct)은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염에 의하여, 또는 리포솜, 인산칼슘, DEAE-덱스트란과 같은 직접적인 DNA 전달(transfer)에 의하여, 및 전기천공과 미세주입과 같은 물리적인 수단에 의하여 포유류 세포로 전달될 수 있다. 포유류 세포를 위한 발현벡터는 전형적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 번역 개시 서열(Kozak 컨센서스(consensus) 서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. 이러한 벡터는 종종 고수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV)의 장 말단 반복(long terminal repeat)을 포함한다. 이들 프로모터-인핸서는 많은 세포 유형에서 활성이다. 조직 및 세포-유형 프로모터 및 인핸서 영역은 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터/인핸서 영역은 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유선암 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질(fetoprotein), 알파 1 항트립신, 베타글로빈, 수초 염기성 단백질, 미오신 경쇄 2, 및 성선자극방출호르몬 유전자 조절과 같은 유전자 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선별마커는 발현 구축물을 가진 세포를 선택하고 유지하는데 사용될 수 있다. 선별마커 유전자의 예는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 디아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체는 전형적으로 NeoR/G418 시스템, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 시스템 또는 글루타민 합성효소(GS) 시스템을 사용하여 생산된다. GS 시스템은 공통-발현 벡터(joint-expression vector), 예컨대 pEE12/pEE6을, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 발현하기 위해 사용한다. 세포표면 신호 분자, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ와의 융합은 세포표면에서 활성상태인 단백질 발현을 지시할 수 있다.
많은 세포주가 마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함한 포유류 발현에 이용가능하다. 예시적인 세포주는 CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비성) 및 다른 골수종(myeloma) 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유아세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포배양 배지로부터 분비된 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 적응된 세포주 또한 이용가능하다. 이러한 예 중 하나는 무혈청 EBNA-1 세포주이다(Pham ,(2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42).
e. 식물
트랜스제닉 식물세포 및 식물이 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 항체 또는 이의 부분을 발현하는데 이용될 수 있다. 발현 구축물은 전형적으로 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 원형질체 내로의 PEG-매개 전달과 같은 직접적인 DNA 전달을 이용, 및 아그로박테리움-매개 형질전환으로 식물로 전달된다. 발현벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사 종결 요소 및 번역 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현벡터 및 형질전환 기술은 보통 쌍자엽 식물(dicot) 숙주, 예컨대 애기장대(Arabidopsis) 및 담배(tobacco), 및 단자엽 식물(monocot), 예컨대 옥수수와 쌀 사이에서 나뉜다. 발현을 위해 사용되는 식물 프로모터의 예는 꽃양배추 모자이크 (cauliflower mosaic) 바이러스 CaMV 35S 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, 리보스이인산 카르복실라제 프로모터, 및 옥수수 유비퀴틴-1(ubi-1) 프로모터 프로모터를 포함한다. 선별마커, 예컨대 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제가 종종 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물세포는 세포, 응집체(캘러스 조직)로서 배양물 내에서 유지될 수 있거나 전체 식물로 재생될 수 있다. 트랜스제닉 식물세포는 또한 프로테아제 또는 변형된 프로테아제를 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다(예를 들어 Mayfield et al. (2003) PNAS 100:438-442 참조). 식물은 포유류 세포와 다른 당화 패턴을 가지므로, 이는 이들 숙주 내에서 생산되는 단백질 선택에 영향을 미칠 수 있다.
3. 정제
항체 및 이의 항원 결합 부분을 포함하는 단백질은 당업자에게 알려진 임의의 절차를 통해 정제된다. 단백질은 SDS-PAGE, 크기분획(size fraction) 및 크기배제(size exclusion) 크로마토그래피, 암모늄 술페이트 침전, 킬레이트(chelate) 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 또는 칼럼 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 알려진 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 상당한 순도로 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체는 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 항체를 정제하기 위한 방법의 예는 칼럼 크로마토그래피를 사용하는 것인데, 여기서 고체 지지체 칼럼 재료가 면역글로불린과 고 친화성으로 결합하는 단백질인 스트렙토코커스(Streptococcus)로부터의, 세포 표면-연합 단백질(cell surface-associated protein)인 단백질 G에 연결된다. 상기 항체는 60%, 70%, 80% 순도 및 전형적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 순도로 정제될 수 있다. 순도는 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색과 같은 표준 방법에 의해 평가될 수 있다.
숙주세포로부터, 항체 또는 이의 부분을 포함하는 단백질의 정제방법은 선택된 숙주세포 및 발현시스템에 의존한다. 분비된 분자를 위하여, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양배지로부터 정제된다. 세포내 발현을 위하여, 세포는 용해되고, 단백질은 추출물로부터 정제될 수 있다. 트랜스제닉 유기체, 예컨대 트랜스제닉 식물 및 동물이 발현을 위해 사용될 때, 용해된 세포추출물을 만들기 위하여 조직 또는 기관이 출발물질로서 사용될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물 생산은 젖 또는 알에서의 폴리펩티드 생산을 포함할 수 있으며, 이는 수집될 수 있고, 더 필요하다면, 당업계의 표준방법을 이용하여 단백질이 추출되고 더 정제될 수 있다.
단백질이 형질전환된 박테리아에 의해 대량으로 발현될 때, 일반적으로 프로모터 유도 후에, 비록 발현이 구성될 수 있을지라도, 폴리펩티드는 불용성 응집체를 형성할 수 있다. 당업자에게 알려진 폴리펩티드 봉입체의 정제를 위해 적절한 몇몇 프로토콜이 있다. 수많은 변형이 당업자에게 자명하다.
예를 들어, 일 방법에서, 세포 현탁액은 일반적으로 원심분리되고 봉입체를 포함하는 펠렛은 봉입체를 용해하지 않지만 세척하는 완충액, 예컨대 20 mM Tris-HCL (pH 7.2), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl 및 2% Triton-X 100, 비이온 세제에 재현탁된다. 가능한 한 많은 세포 잔해(debris)를 제거하기 위해 상기 세척 단계를 반복하는 것이 필수적일 수 있다. 상기 봉입체의 잔류하는 펠렛은 적절한 완충액(예컨대 20 mM 인산 나트륨, pH 6.8, 150 mM NaCl)에 재현탁될 수 있다. 다른 적절한 완충액이 당업자에게 자명하다.
대안적으로, 단백질은 박테리아 주변세포질로부터 정제될 수 있다. 상기 폴리펩티드가 박테리아의 주변세포질 내로 내보내지는 경우, 상기 박테리아의 주변세포질 분획이 기타 당업자에게 알려진 방법 이외에 냉 삼투압 충격(cold osmotic shock)에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 일 방법에서, 재조합 폴리펩티드를 주변세포질로부터 분리하기 위하여, 박테리아 세포는 펠렛을 형성하도록 원심분리된다. 상기 펠렛은 20% 수크로오스를 포함하는 완충액 내에 재현탁된다. 세포를 용해하기 위하여, 상기 박테리아는 원심분리되고 상기 펠렛은 얼음처럼 찬(ice-cold) 5mM MgSO4에 재현탁되고 얼음 수조에 약 10분간 보관된다. 상기 세포 현탁액은 재현탁되고 상청액은 가만히 부어지고(decant) 모아진다. 상기 상청액 내에 존재하는 재조합 폴리펩티드는 당업자에게 잘 알려진 표준 분리 기술에 의해 상기 숙주 단백질로부터 분리될 수 있다. 이러한 방법은 다음 단계를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 용해도 분별(solubility fractionation), 크기 분별 여과(size differential filtration), 및 칼럼 크로마토그래피.
E. 실시예
다음 실시예는 예증적 목적만을 위하여 포함된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1
벡터 및 발현 플라스미드
이 실시예에서, CHO 포유류 세포에서 EGF 수용체 항원을 생산하기 위한 발현 구조물(constructs), 및 CHO 포유류 세포 내의 얼비툭스®(Erbitux®) 항-EGFR 항체들이 생산되었다. CHO 세포들의 사용은 항체의 ㎍/ml 양의 생산 및 관련된 번역후 변형(예를 들어, 글리코실화(glycosylation))을 가능하게 한다.
EGFR 항원(서열번호 10)은 완전한 ECD(N-말단 640 아미노산, 서열번호 13, 서열번호 12로 표시되는 DNA 세트)를 포함하는 가용성 세포외 도메인(soluble extracellular domain; sECD)으로서 제조되었다. 히스티딘 태그(His-tag, 서열번호 7)는 정제를 위하여 C-말단 도메인에서 결합되었다. 플라스미드는 추가적으로 고유선도 서열(native leader sequence)(서열번호 11) 또는 IgG HC(서열번호 6) 선도서열, 코작 컨센서스(Kozak consensus) 서열 및 선택적으로 EGFR 세포외 도메인 및 태그 사이의 Gly4Ser 링커(서열번호 4)를 포함한다.
얼비툭스® 항-EGFR 항체(각각 서열번호 1 및 2, 서열번호 9 및 8로 표시되는 DNA 세트, 경쇄 및 중쇄) 플라스미드는 친화성 태그(c-Myc, 서열번호 5 또는 FLAG, 서열번호 3)가 얼비툭스® 항-EGFR 항체의 Fc 도메인의 C-말단에 연결되게 생산되었다. 플라스미드는 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자를 포함하므로, 발현된 때 IgG 항체가 제조되었다. 플라스미드는 선택적으로 Fc 도메인과 친화성 태그 사이에 Gly4Ser 링커를 포함한다. 플라스미드 기술은 아래 표 7로 표시된다.
[표 7]
Figure pct00012
실시예 2
결합 분석 개발
이 실시예에서, ELISA 분석이 상업적으로 이용가능한 시약을 사용한 예비 결합 분석으로서 개발되었다. 이 분석에서, 가용성 EGFR 수용체들은 96-웰 플레이트에 부착되었고, 얼비툭스® 항-EGFR 항체가 추가되어 결합되도록 하였고, 결합은 토끼 항-인간-Fc-HRP(rabbit anti-human-Fc-HRP) 컨쥬게이트 이차 항체를 사용하여 검출되었다. 완충액 pH가 1) Hi-결합 또는 Ni-코팅된 플레이트에 대한 가용성 EGFR 수용체의 결합, 2) 이차 항체 결합 및 3) 가용성 EGFR 수용체-얼비툭스® 항-EGFR 항체 결합에 대한 이것의 영향에 대하여 평가되었다.
상업적 시약을 이용한 표준 직접 ELISA 프로토콜;
96-웰 Hi-결합 플레이트(Hi 결합, Costar #2592)는 PBS 내에서, 12nM(1.32㎍/ml)의 100㎕ sEGFR-H6 항원(Sino Biologics, Cat #10001-H08H)으로 4℃에서 하룻밤동안 코팅되었다. 플레이트는 그 후 PBS 250㎕/웰로 3회 세척되었고, 그 후 1시간동안 PBS/BSA(PBS, pH 7.4, 5 mg/mL BSA) 250㎕로 RT에서 차단되었다. 얼비툭스® 항-EGFR 항체의 연속 희석물(3x, 시작 농도 500ng/mL, 그 후 1:3 희석)이 PBS/BSA에서 준비되었고, 웰 당 100㎕이 추가되었으며, 플레이트는 1시간 동안 RT에서 배양되었다. 플레이트는 그 후, 250㎕/웰 PBS/BSA로 3회 세척되었다. 100㎕/웰 토끼 항-인간-Fc-HRP 컨쥬게이트 이차 항체(PBS/BSA에서 1:5000으로 희석된)는 각각의 웰에 추가되었고 플레이트는 RT에서 1시간 동안 배양되었다. 플레이트는 그 후 250㎕/웰 PBS/BSA로 3회 세척되었다. 마지막으로, 100㎕ HRP 기질을 각각의 웰에 추가하였고 플레이트들은 RT에서 15분 동안 현상(develop)되도록 하였다(빛 차단). 반응은 100㎕ 종결용액(stop solution)을 추가하여 정지되었고 플레이트는 마이크로플레이트 분광광도계(Microplate Spectrophotometer)(Molecular Devices, Spectra Max M2)를 이용하여 OD450nM에서 30분 이내에 측정되었다. 동적범위(dynamic range)는 ~3 logs 이고, 민감도는 ~50pg(5 mg/mL BSA 포함 PBS, pH 7.4)이다.
96-웰 플레이트에 대한 EGFR sECD-H6 항원 코팅에 미치는 완충액 pH의 영향
상기에 기술된 분석은 하기의 변형을 가하여 수행되었다: (1) Hi 결합 또는 Ni 코팅된 플레이트들을 사용하였다; (2) sEGFR-H6 항원을 3, 6, 12 및 24nM로 PBS 또는 KRB(Krebs-Ringer bicarbonate buffer), pH 7.4에서 코팅하였다; (3) 플레이트를 PBS 또는 KRB, pH 7.4, 6.5 또는 6.0에서, 5mg/mL BSA로 차단하였다; 및 (4) 얼비툭스® 항-EGFR 항체가 5 mg/mL BSA를 포함하는 PBS 또는 KRB, pH 7.4에서 250ng/ml 추가되었다.
결과는 완충액 pH가 EGFR sECD-H6와 Hi-결합 플레이트의 결합 능력에 영향을 주지 않았으나, His-태그(H6)를 통한 니켈 플레이트에 대한 결합에는 영향을 주었다는 것을 보여준다.
이차 항체 검출에 대한 완충액 pH의 영향
이차 항체 결합에서의 완충액 pH의 영향을 상기 기술된 내용으로부터 변형된 분석에서 평가하였고, 얼비툭스® 항-EGFR 항체가 직접적으로 Hi-결합 플레이트에 코팅된 이차 항체 결합은 5mg/mL BSA를 포함하는 PBS, pH 7.4 또는 KRB pH 7.4, 6.5 또는 6.0에서 평가하였다. 결과는 얼비툭스® 항-EGFR 항체의 이차 항체 검출은 pH 6.0 내지 7.4에서 영향을 받지 않았다는 것을 보여준다.
EGFR sECD-얼비툭스® 항-EGFR 항체 결합의 완충액 pH의 영향
EGFR sECD-얼비툭스® 항-EGFR 항체 결합의 완충액 pH의 영향을 평가하기 위하여, 완충액 pH 뿐만 아니라 분석에서의 얼비툭스® 항-EGFR 항체의 농도를 다양화하였다. 얼비툭스® 항-EGFR 항체의 3배(3x) 연속 희석이, KRB에서 pH 7.4, 6.5 또는 6.0, 100ng/mL에서 시작하여, 상기 기술된 분석에 사용되었다. 결과는 높은 얼비툭스® 항-EGFR 항체 농도(즉, 3 ng/mL 이상)에서, 결합에서의 변이가 각각의 pH에서 나타나며, pH 7.4에서는 pH 6.0에서의 결합보다 더 나은 결합을 가지는 것을 보여주었다.
실시예 3
ELISA에서 인간 혈청 추가의 영향
이 실시예에서, ELISA 결합 분석에서의 인간 혈청 추가의 영향이 결정되었다. 인간 혈청이 모방한(mimic) 종양 미세환경에 추가되었다. ELISA는 상기 실시예 2에서 기술된 바와 같이 수행되었다. 정상 인간 혈청은 완충액의 5% 수준으로 추가되었다. IgG-감소된(IgG-depleted) 인간 혈청이 완충액의 1% 또는 5%로 추가되었다. 대조군으로 오(5)mg/ml BSA가 추가되었다. 모든 실험은 KRB, pH 7.4에서 수행되었다.
결과는 정상 또는 IgG-감소된 인간 혈청의 추가가 유의하게 ELISA 분석에 영향을 주었다는 것을 보여주었다. 인간 혈청이 IgG를 포함하고 따라서 염소 항-인간-Fc-HRP 컨쥬게이트 이차 항체가 얼비툭스® 항-EGFR 항체뿐만 아니라 혈청에 결합 때문에, 5 % 인간 혈청의 추가는 KD를 증가시키는 결과를 나타내었다. IgG-감소된 인간 혈청의 추가는 분석에 대하여 30% 감소된 동적범위를 초래하였다.
실시예 4
항-마우스 Fab 이차 항체의 사용의 영향
이 실시예에서, 6개의 다른 항-마우스 Fab 항체들이 상기 실시예 2에 기술된 분석에서 이차 항체로서 사용하기 위하여 평가되었다. 얼비툭스® 항-EGFR 항체는 원래 마우스에서 생산되었던 키메라 항체(chimeric antibody)이다. 이들 이차 항체들은 분석에서 인간 혈청이 사용될 때, 다른 이차 항체가 염소 항-인간-Fc 이차의 상호작용을 피하기 위하여 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 평가되었다.
항-마우스 이차 항체들 중 어떤 것도 ELISA 분석에서 얼비툭스® 항-EGFR 항체를 인식하지 않음이 관찰되었다.
실시예 5
태그된-대리 단백질 간접 ELISA
이 실시예에서, 태그된-대리 단백질 간접 ELISA 분석이 에피토프-태그 특이적 간접 ELISA의 개발을 위한 모델로 사용되었다. 분석에서 시약/완충액으로서 인간 혈청의 사용을 가능하도록 하기 위하여 에피토프-태그 특이적 간접 ELISA의 사용이 평가되었다. 인간 혈청은 항체들을 포함하므로, 항-인간-Fc 이차 항체의 사용은 혈청뿐만 아니라, 항체, 즉, 얼비툭스에 대한 결합으로부터 신호를 야기할 것이다. 이 분석에서, 항-EGFR 항체는 직접적으로 그것의 C-말단에서 단백질 태그와 컨쥬게이트되었고 얼비툭스® 항-EGFR 항체의 태그와 결합하는 항-에피토프 태그 항체는 이차 항체로 사용되었다. 일반적인 단백질 에피토프 태그들은 하기 표 8에 나타내었다. 분석 시약 및 조건, 즉, 완충액 pH, 및 실현가능성이 평가되었다.
[표 8]
Figure pct00013
분석 시약 및 조건은 단순화된 태그된-대리 단백질 간접 ELISA를 사용하여 평가하였으며, 여기서 96-웰 플레이트는 태그된-대리 단백질로 직접적으로 코팅되었고 태그된-대리 단백질에 대한 이차 항-태그 항체의 결합이 검출되었다. 3개의 에피토프 태그된 대리 단백질들이 사용되었다(하기 표 9를 참조). 6개 에피토프 태그들을 항-myc 항체(GenScript, #A00173, Abcam, #ab1326 또는 Abcam, #1261), 항-FLAG 항체 (GenScript, #A01428), 항-HA 항체(GenScript, #A00169) 및 항-VSV-G 항체(GenScript, #A00872)를 포함하는 상업적으로 이용가능한 항-태그 항체들을 사용하여 평가하였다.
[표 9]
Figure pct00014
태그 검출 항체의 시험
항-태그 항체들에 의한 검출을 시험하기 위하여, 상기 표 8에 따라 Hi 결합 96-웰 플레이트가 PBS에서 희석된 태그된 대리 단백질로 코팅되었다. 플레이트들은 5 mg/mL BSA로 차단되었다. 에피토프 태그들은 그 후 5 mg/mL BSA을 가진 PBS에서 1000, 500, 250, 120 및 0 ng/mL의 농도로 희석된 항-태그-항체로 검출되었다.
결과는 항-HA 및 항-FLAG 항체들이 항-Myc 항체들보다 더 높은 신호를 주었다는 것을 입증하였다.
Hi 결합 플레이트 상에 태그된 단백질 코팅에 대한 완충액 pH의 영향
Hi 결합 플레이트 상에서 태그된 단백질 코팅에 대한 완충액 pH의 효과를 시험하기 위하여, c-Myc-, FLAG 및 다중융합- 태그된 단백질들이 PBS, pH 7.4 또는 Krebs-Ringers 완충액(KRB), pH 7.4에서 10, 5, 2.5 및 1㎍/ml의 농도로 코팅되었다. 플레이트들은 그 후 PBS 또는 KRB, pH 7.4, 6.5 및 6.0에서 5 mg/mL BSA로 차단되었다. 에피토프 태그들은 PBS 또는 KRB, pH 7.4에서 희석된 항-태그 Ab(5 mg/mL BSA를 갖는 500 ng/mL)로 검출되었다.
PBS 또는 KRB, pH 7.4, 6.5 또는 6.0에서 차단된 플레이트들 사이에 차이점들이 관찰되지 않았기 때문에, 결과는 완충액 pH가 Hi 결합 플레이트 상에서 태그된 단백질의 코팅 안정성에 영향을 주지 않았다는 것을 입증하였다.
Hi 결합 플레이트 상에 태그된 단백질의 검출에 대한 완충액 pH의 영향
태그된 단백질의 검출에 대한 완충액 pH의 영향을 시험하기 위하여, Hi 결합 플레이트들은, PBS 또는 KRB, pH 7.4에서 10㎍/ml의 농도에서 시작하여 연속적으로 2배(2x) 희석된 c-Myc- 및 FLAG-태그된 단백질들로 코팅되었다. 플레이트들은 PBS 또는 KRB, pH 7.4, 6.5 및 6.0에서 5 mg/mL BSA로 차단되었다. 에피토프 태그들은 PBS 또는 KRB, pH 7.4, 6.5 및 6.0에서 희석된 항-태그 Ab(1㎍/mL의 항-c-Myc-태그 Ab, 0.5㎍/mL의 항-FLAG-태그 Ab, 5 mg/mL BSA와 함께)로 검출되었다.
결합이 pH 6.5 및 6.0과 비교하여 pH 7.4에서 약간 감소되었기 때문에, 결과는 완충액 pH가 항-FLAG-태그 항체에 의한 에피토프 태그 검출에 작은 영향을 갖는 다는 것을 입증하였다. 동일한 전체적 영향이 항-c-Myc-태그 항체에 대해서도 관찰되었다.
항-Myc-태그 항체들의 pH 민감도
세 개의 항-Myc-태그 항체들(GenScript, #A00173, Abcam, #ab1326 또는 Abcam, #1261)이 그들의 pH 민감도에 대하여 추가적으로 평가되었다. Hi 결합 플레이트들은 PBS 또는 KRB, pH 7.4에서 250ng/ml의 농도에서 시작하여 4배(4x) 연속 희석된 다중융합 태그 단백질로 코팅되었다. 플레이트들은 PBS 또는 KRB, pH 7.4, 6.5 및 6.0에서, 5mg/mL BSA로 차단되었다. 태그된 단백질은 PBS 또는 KRB, pH 7.4, 6.5 및 6.0에서 염소 또는 토끼 항-c-Myc 태그 Ab(200 또는 500 ng/mL)로 검출되었다.
결과는 Abcam 항체들이 GenScript 항체보다 더 민감한 것을 보여준다. 추가적으로, 완충액 pH는 Abcam 유래의 염소 또는 토끼 항-c-myc 항체들에 의한 에피토프 태그 검출에 대해 오직 최소의 영향만을 가졌다.
항-c-Myc 항체들에 대한 완충액 pH의 영향
완충액 pH가 Abcam 항-c-Myc 항체(Abcam, #ab1326 또는 Abcam, #1261)의 결합에 미치는 영향을 추가적으로 평가하였다. Hi 결합 플레이트들은 PBS, pH 7.4에서 250ng/ml의 농도에서 시작하여 3배(3x) 연속 희석된 다중융합 태그 단백질로 코팅되었다. 플레이트들은 KRB, pH 7.4, 6.5 및 6.0에서 5 mg/mL BSA로 차단되었다. 태그된 단백질은 KRB, pH 7.4, 6.5 및 6.0에서 염소 또는 토끼 항-c-Myc 태그 Ab(200 또는 500 ng/mL)로 검출되었다.
결과는 완충액 pH가 Abcam 유래 염소 또는 토끼 항-c-myc 항체들에 의한 에피토프 태그 검출에 대해 오직 최소의 영향만 나타내었다는 것을 입증하였다.
추가적인 항-Myc 항체의 평가
세 개의 추가적인 항-Myc-태그 항체들이 평가되었고 Abcam 항-Myc-태그 항체들(Abcam, #ab1326 또는 Abcam, #1261) 및 항-VSV-G 항체(Genscript, #A00872)와 비교되었다. 항체들은 염소 항-c-Myc 태그 Ab(GeneTex, Cat # GTX21261), 토끼 항-c-Myc 태그 Ab(GeneTex, Cat # GTX19312) 및 염소 항-c-Myc 태그 Ab (Alpha Diagnostics, Cat #MYC13-HRP)이었다. Hi 결합 플레이트들은 PBS, pH 7.4에서 250ng/ml 농도로 다중융합 태그 단백질로 코팅되었다. 플레이트들은 PBS, pH 7.4에서 5 mg/mL BSA로 차단되었다. 태그된 단백질은 PBS, pH 7.4에서 염소 또는 토끼 항-c-Myc 태그 Ab(250ng/mL에서 시작, 연속 희석)로 검출되었다.
결과는 Abcam 항체들과 GeneTex 유래의 염소 항-c-Myc 태그 Ab가 약간 더 낮은 친화도를 갖는 GeneTex의 토끼 항-c-Myc 태그 Ab와 비슷한 친화도를 갖고 다중융합 단백질에 모두 결합한다는 것을 입증하였다. 항-VSV-G 항체 및 Alpha Diagnostics 유래의 염소 항-c-Myc 태그 Ab는 양자 모두 다른 시험된 항체들에 비하여 약 5배 낮은 친화도를 갖는다.
항-c-Myc 대(versus) 항-HA 항체에 대한 차단 물질로서 인간 혈청의 영향
5% 인간 혈청의 존재 하에서의 결합에 대하여 다섯 개의 항-c-myc 항체들(상기 참조)들을 항-HA-태그 항체(GenScript, #A00169)와 비교하였다. Hi 결합 플레이트들은 PBS, pH 7.4에서 250ng/ml의 농도에서 시작하여 3배(3x) 연속 희석된 다중융합-태그된 마커 단백질로 코팅되었다. 플레이트들은 KRB, pH 7.4에서 5% 인간 혈청으로 차단되었다. 태그된 단백질은 KRB, pH 7.4에서 염소 또는 토끼 항-c-Myc 태그 Ab 또는 염소 항-HA-항체(250ng/mL에서 시작, 3x 희석)로 검출되었다.
결과는 5% 인간 혈청의 존재하에서 항-c-Myc 항체뿐만 아니라 항-HA 항체가 결합하지 않았다는 것을 나타내었다. Abcam 및 GeneTex 항-c-myc 항체들은 모두 비슷한 친화도를 가졌다. 결과는 또한 인간 혈청이 이차 항체에 의한 태그된 단백질의 검출에 간섭을 하지 않았다는 것을 나타내었다.
25% 혈청의 존재하에서 태그된 단백질의 검출
항-FLAG 항체(Abcam, ab1238)가 KRB 완충액, pH 6.0 및 7.4 내 25% 인간 혈청의 존재 하에서 FLAG-태그 단백질의 이들의 검출에 대하여 평가되었다. pH 7.4 에서 KD 는 거의 224ng/mL인 반면, pH 6.0 에서 KD는 거의 135ng/mL이었다.
항-myc 항체(Abcam, ab1326)도 KRB 완충액, pH 6.0 및 7.4 내 25% 인간 혈청의 존재 하에서 myc-태그 단백질의 이들의 검출에 대하여 평가되었다. pH 7.4에서 KD는 거의 7.98ng/mL인 반면, pH 6.0에서 KD는 거의 7.73ng/mL이었다.
항-Myc 항체(Abcam, ab1326)는 KRB 완충액, pH 7.4 내 25% 인간 혈청의 존재 하에서 다중융합 태그 단백질의 이들의 검출에 대하여 평가되었다. KD는 거의 20ng/mL이었다.
실시예 6
항-EGFR-FL MAb pH 민감 ELISA에 대한 인간 혈청의 영향
이 실시예에서, 인간 혈청의 양 증가의 영향이 FLAG-태그된 얼비툭스® 항-EGFR 항체 및 염소 항-FLAG-HRP 컨쥬게이트 이차 항체를 사용하여 평가되었다. 실험은 5% 또는 25% 인간 혈청을 포함하는 KRB, pH 7.4 또는 6.0를 사용하고 젖산의 양을 달리하여 수행되었다(하기 표 9를 참조). 인간 혈청 및 젖산은 모방한 종양 미세환경에 추가되었다.
간단하게, 96-웰 Hi-결합 플레이트(Costar　 #2592)는 KRB, pH 7.4에서 12nM(1.32㎍/ml)의 100㎕ sEGFR-H6 항원(Sino Biologics, Cat #10001-H08H)으로 4℃에서 하룻밤동안 코팅되었다. 플레이트는 그 후 KRB, pH 7.4 250㎕/웰로 3회 세척되었고, 그 후 1시간 동안 인간 혈청 및 젖산을 포함하는 KRB, pH 7.4 및 6.0 250㎕로 RT에서 차단되었다(하기 표 9에 나타내었다). FLAG-EGFR MAb 표준 또는 시험 표준의 연속 희석물(3x, 시작 농도 100ng/mL, 그 후 1:3 희석)이 인간 혈청 및 젖산을 포함하는 KRB, pH 7.4 및 6.0에서 준비되었으며, 웰당 100㎕가 추가되었고, 플레이트는 1시간 동안 RT에서 배양되었다. 플레이트는 그 후 인간 혈청 및 젖산을 포함하는 250㎕/웰 KRB, pH 7.4 및 6.0로 3회 세척되었다. 100㎕/웰 염소 항-FLAG-HRP 컨쥬게이트 이차 항체(25% 인간 혈청 및 젖산을 포함하는 KRB, pH 7.4 및 6.0에서 1:2000로 희석된)는 각각의 웰에 추가되었고 플레이트는 RT에서 1시간 동안 배양되었다. 플레이트는 그 후 인간 혈청 및 젖산을 포함하는 250㎕/웰 KRB, pH 7.4 및 6.0로 3회 세척되었다. 마지막으로, 100㎕ Sureblue 마이크로웰 퍼옥시다아제 기질 1-구성(KPL, #52-00-03) 용액을 각각의 웰에 추가하였고 플레이트들은 RT에서 15분 내지 20분 동안 현상되도록 하였다(빛 차단). 반응은 100㎕ TMB 종결용액(KPL, #50-85-06)을 각각의 웰에 추가함으로써 정지되었고 플레이트는 마이크로플레이트 분광광도계(Microplate Spectrophotometer)(Molecular Devices, Spectra Max M2)를 이용하여 OD450nM에서 30분 이내에 측정되었다.
[표 10]
Figure pct00015
결과는 인간 혈청의 농도에도 불구하고 각각의 시험된 pH에 대해서 일정하였다. 예를 들어, 25% 인간 혈청, pH 6.0에서의 항-EGFR 항체의 결합에 대한 KD는 2.21ng/mL인 반면, 5% 인간 혈청, pH 6.0을 이용하는 분석에 대해서는 KD가 2.12 ng/mL이었다. 동일한 영향이 pH 7.4에서도 관찰되었다. 이런 결과는 세명의 다른 실험자들에 의하여 각각 수행된 세 개의 실험으로 확인되었다. 결과들이 인간 혈청의 두 개의 백분율 사이에서 차이를 나타내지 않으며, 25%가 더 근접하게 유사한 생리적 조건이기 때문에, 추가적인 실험을 위하여 25%가 선택되었다. 5% 및 25% 인간 혈청 모두를 위한 완건성(robustness)에 대한 적합 기준들을 하기 표 11-12에 나타내었다.
[표 11]
Figure pct00016
(α-EGFR-FLAG 항체)1.0 Log의 농도의 변화는 OD ~ 2.5. 변화에 대응한다.
[표 12]
Figure pct00017
LLOQ: 최저정량 한계; ULOQ: 최고정량 한계; (α-EGFR-FLAG 항체)1.0 Log의 농도의 변화는 OD ~ 2.5.변화에 대응한다.
실시예 7
종양 미세환경 및 정상 생리적인 조건을 시뮬레이션한 ELISA
이 실시예에서, 평행, 고처리량(high throughput) pH 민감 간접 ELISA를 개발하였고, 종양 미세환경, 예컨대 낮은 pH(pH <7.4, 예를 들어 6.0), 상승된 젖산농도(12-20 mM) 및 인간 혈청 존재 내의 세포외 기질의 결합 조건을 시뮬레이션 하는 결합 조건을 시험하는데 사용하였다. 이와 동시에, 정상의 생리(예컨대 pH 7.4, 1 mM 젖산, 25 % 인간 혈청)를 시뮬레이션하는 조건이 또한 시험되었다. 이 방법에서, 항체, 예컨대 정상 생리적인 조건보다 종양 미세환경에서 나타나는 조건에서 표적 단백질에 우선적으로 결합하는, 다른 곳 및 하기 실시예 8에 기술된 방법을 이용하여 제조된 변이체 항체들이 확인될 수 있다.
Krebs-Ringer 중탄산염(bicarbonate) 완충액은 생리적인 완충액을 가장 근접하게 나타내기 때문에 스크리닝을 위한 완충액으로 선택되었다. 젖산은 특이적 농도로 분석 완충액에 포함되었고, 완충액의 pH는 1N HCl을 이용하여 7.4 또는 6.0으로 조절되었다. 또한 인간 혈청이 스크리닝에 사용되었기 때문에, 표준 및 쉽게 이용가능한 항-인간 IgG1 Fc 항체들은 인간 혈청에서 발견되는 IgG의 양 때문에 사용될 수 없었다(상기 실시예 3 참조). 그러므로, FLAG-태그된 항-EGFR 부모 항체가 분석에서 표준으로 사용되었다.
간단하게, EGF 수용체의 세포외 도메인(EGFR sECD)은 96 웰 플레이트에 부동화되었다. 이 항원 코팅 단계는 pH 7.4 완충액을 사용하여 수행된다. 결합된 항원은 그 후 FLAG-태그된 항-EGFR 항체 변이체들을 포함하는 세포 배양 상청액의 미리 결정된 희석물과 함께 배양되었다. 태그된 항체 변이체들은 HRP-컨쥬게이트된 항-FLAG 항체의 결합 후에 검출되었다. 초기 차단, FLAG-항체 변이체의 결합, 세척 및 컨쥬게이트된 항-FLAG 이차 항체에 의한 검출은 하기에 기술된 바와 같은 pH 7.4 또는 pH 6.0을 갖는 평행 조건하에서 수행되었다.
분석:
96-웰 Hi-결합 플레이트(Costar　 #2592)는 완충액 A(Krebs-Ringer Buffer (KRB, Sigma Aldrich, # K4002), pH 7.4, 무 인간 혈청)에서, 12nM(1.32㎍/ml)의 100㎕ EGFR sECD-H6 항원(실시예 1에서 기술된 바와 같이 준비된 또는 sEGFR-H6(Sino Biologics, Cat #10001-H08H))으로 4℃에서 하룻밤 동안 또는 실온(RT)에서 2시간 동안 코팅된다. 플레이트들은 그 후 완충액 A 250㎕/웰로 3번 세척되었고 그 후 pH 7.4 완충액 B(1 mM 젖산/ 25 % 인간 혈청) 또는 pH 6.0 완충액 C(16.6 mM 젖산 / 25 % 인간 혈청) 250㎕를 이용하여 RT에서 1시간 동안 차단되는 동시에 덮어졌다. 항-EGFR-FLAG 항체 표준의 연속 희석물(3x, 시작 농도 100ng/ml, 그 후 1:3 희석)이 pH 7.4 완충액 B(KRB, pH 7.4, 1 mM 젖산/ 25 % 인간 혈청) 또는 pH 6.0 완충액 C(KRB, pH 6.0, 16.6 mM 젖산/ 25 % 인간 혈청)에서 준비되었으며 100㎕가 웰마다 추가되었다. 희석 후, 항-EGFR-FLAG 항체의 농도는 666.67pM(100 ng/mL), 222.22pM(33.33ng/mL), 74.07pM(11.11ng/mL), 24.69pM(3.70ng/mL), 8.23 pM(1.23ng/mL), 2.74pM(0.41ng/mL), 0.91pM(0.137ng/mL) 및 0 이었다. 시험 시료 희석물이, 항체 표준을 위한 상기 기술과 같이 준비되었고, 100㎕가 웰마다 추가되었다. 항-EGFR-FLAG 항체 표준 및 시험 샘플들은 덮어졌고 1시간 동안 RT에서 배양되었다. 플레이트는 그 후 pH 7.4 완충액 B 또는 pH 6.0 완충액 C 250㎕/웰로 3회 세척된다. pH 7.4 완충액 B 또는 pH 6.0 완충액 C에서 500ng/mL로 100㎕/웰 염소 항-FLAG-HRP 검출 항체(Abcam, #ab 1238)가 각각의 웰에 추가되고 플레이트는 덮어졌고 1시간 동안 RT에서 배양되었다. 플레이트는 그 후 pH 7.4 완충액 B 또는 pH 6.0 완충액 C 250㎕/웰로 3회 세척되었다. 마지막으로, 100㎕ Sureblue 마이크로웰 퍼옥시다아제 기질 1-구성(KPL, #52-00-03) 용액을 각각의 웰에 추가하였고 플레이트들은 RT에서 15분 내지 20분 동안 현상되도록 하였다(빛 차단). 반응은 100㎕ TMB 종결용액(KPL, #50-85-06)을 각각의 웰에 추가함으로써 정지되었고 플레이트는 마이크로플레이트 분광광도계(Microplate Spectrophotometer)(Molecular Devices, Spectra Max M2)를 이용하여 OD450nM에서 30분 이내에 측정되었다.
각각의 플레이트는 항-EGFR-FLAG 항체 표준, 양성 대조군(부모 항체) 및 음성 대조군 형질을 포함하였다. ELISA가 3회 수행되었다.
정상 생리적 조건보다 종양 미세환경을 시뮬레이션한 조건에서 표적 단백질에 우선적으로 결합하는 항체, 예컨대 변이체 항체를 확인하기 위한 선택 기준은, pH 6.0/pH 7.4에서 결합하는 항체 변이체의 비율 및 부모 대조군 항체 대비 특이도 배수 증가로서 결정되었다. 부모 대조군 항체, 예컨대 태그된 얼비툭스® 항-EGFR 항체 대조군 항체와 비교하여 pH 6.0에서 강한 결합 활성을 가지며 pH 중성 7.4에서 결합이 감소하는 이들 항체, 예컨대 변이체 항체들은 관심 있는 항체이다.
실시예 8
항- EGFR 항체 돌연변이체의 생산
이 실시예에서, 얼비툭스® 항-EGFR 항체의 단일 점 돌연변이의 CPE(comprehensive positional evolution)의 라이브러리를 구축하고 생산하였다. CPE 라이브러리 구축을 위한 위치는 항원 인식에서 중요한 역할을 할 수 있는 추가적 아미노산을 포함하여 얼비툭스® 항-EGFR 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 CDR들에 집중되었다. 얼비툭스®의 중쇄 또는 경쇄(각각 서열번호 2 및 1)의 가변 영역 내의 각각의 100개 아미노산 위치에서 적어도 15개 아미노산 변이체를 포함하는 단일 점 돌연이체들의 라이브러리가 만들어졌다(도 1 참조). 히스티딘 아미노산은 각각 위치에서 15개 변이체들 중에 포함되었다. 라이브러리 일원의 글리세롤 모액(stocks)이 준비되었고 -80℃에서 저장되었다.
라이브러리의 각 일원은 서열분석되었고, IgG 항체로서 CHO 세포에서 발현되었고, 96-웰 플레이트 내 어드레서블 어레이(addressable array)에 배열되었으며, 부모 태그된-얼비툭스® 항-EGFR 대조군 항체와 비교하여 6.0의 낮은 pH에서 결합 활성을 갖고 pH 7.4에서 결합 활성이 감소하는 항체를 확인하기 위하여, 실시예 7에 기술된 바와 같이 종양 미세환경 조건을 시뮬레이션하는 조건 하 및 정상 생리적 조건을 시뮬레이션하는 조건 하에서 EGFR 항체의 가용성 세포외 도메인 결합에 대해 ELISA를 이용하여 시험하였다.
추가적으로, SEAP 또는 정량적 분석이 사용될 것이다. 이 분석에서, 세포 배양 상청액 내 분비된 알카리성 포스페이트(SEAP)의 활성들이 측정될 것이다. SEAP 활성/항체 단백질 농도는 트랜스펙션/발현 효율 변이를 보완하기 위해서 및 야생형에 대한 항체 변이체 결합 활성을 정규화하기 위하여 사용될 것이다. CPE 스크린에서 확인된 양성 클론들은 낮은 pH(6.0) 조건하에서 EGFR sECD에 대한 증가된 결합을 가진 뮤테인(mutein)의 스크리닝을 하기 위한 CPS 라이브러리의 구축을 통한 추가적 진화를 위해 고려될 것이다.
실시예 9
항- EGFR 항체 돌연변이체의 조건부 활성
표 8에 기술된 얼비툭스® 항-EGFR 항체의 단일 점 돌연변이체 CPE 라이브러리의 일원이 표 7에 기술된 조건부 활성 변이체를 확인하기 위하여 pH 6.0 및 pH 7.4에서의 EGFR sECD-H6 항원에 대한 결합을 측정하기 위하여 ELISA를 이용하여 평가되었다. 결과를 표 13에 나타내었다. 시험된 1501개 얼비툭스® 돌연변이체 중 248개의 돌연변이체가 조건부 활성이었다(pH　7.4에서 >0.4 및 pH　6.0에서 <0.4의 정규화된 특이적 활성을 갖는 209개 돌연변이체 및; pH　6.0에서 >0.4 및 pH 7.4에서 <0.4의 정규화된 특이적 활성을 갖는 39개 돌연변이체). 나머지 돌연변이체 중 283개는 낮은 발현 수준(<20　ng/ml)을 가졌고, 149개는 pH 6.0 또는 pH 7.4에서 결합 활성을 갖지 않았으며, 737개 돌연변이체는 pH 6.0 및 pH 7.4에서 >0.4의 정규화된 특이적 활성을 가졌다.
[표 13]
Figure pct00018
변경들은 당 분야의 통상의 기술자에게 분명하기 때문에, 본 발명은 첨부된 청구항의 범위만으로 제한되는 것을 의도하지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Halozyme, Inc. Kodandapani, Lalitha Sheridan, Phillip Lee Shepard, Harry Michael Bookbinder, Louis H. Huang, Lei Wei, Ge Frost, Gregory I. <120> METHODS FOR ASSESSING AND IDENTIFYING OR EVOLVING CONDITIONALLY ACTIVE THERAPEUTIC PROTEINS <130> 33320.03083.WO01/3083PC <140> Not yet assigned <141> Herewith <150> 61/402,979 <151> 2010-09-08 <160> 85 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Erbitux LC (Cetuximab, IMC-C225) <400> 1 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Ala 210 <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Erbitux HC (Cetuximab, IMC-C225) <400> 2 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 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Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 83 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Panitumumab LC <400> 83 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 84 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ranibizumab HC <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 <210> 85 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ranibizumab LC <400> 85 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu 210

Claims (114)

  1. 종양을 치료하고 중성 pH에서보다 낮은 pH에서 더 활성인 치료적 단백질을 확인/선택하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 낮은 pH를 포함하는 조건 하에서 단백질의 활성을 시험하는 단계;
    b) 중성 pH를 포함하는 조건 하에서 단백질의 활성을 시험하는 단계;
    c) a) 단계에서의 활성을 b) 단계에서의 활성과 비교하는 단계; 및
    d) b) 단계와 비교하여 a) 단계에서 더 큰 활성을 갖는 단백질을 선택/확인함으로써 높은 pH에서보다 낮은 pH에서 더 활성인 단백질을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1항의 방법에 있어서, 낮은 pH는 7.4 미만인 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 방법에 있어서, 낮은 pH는 약 5.8 내지 6.8 사이인 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 중성 pH는 약 7.2 내지 7.6 사이인 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 중성 pH는 약 7.4인 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 a) 단계의 조건은 증가된 젖산염(lactate) 농도, 증가된 피루브산염 농도 및 저산소증 중으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 조건을 포함하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 방법에 있어서,
    상기 a) 단계의 조건은 10 mM 내지 20 mM 젖산(lactic acid) 또는 15 mM 내지 18 mM 젖산; 또는 적어도 약 16 mM, 16.5 mM 또는 17 mM 젖산 중으로부터 선택된 증가된 젖산염 농도를 포함하고/포함하거나;
    상기 b) 단계의 조건은 0.5 내지 5 mM 또는 0.2 mM 내지 4 mM 젖산; 또는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 mM 젖산 중으로부터 선택된 젖산염 농도를 포함하는 방법.
  8. 비-종양 미세환경에서보다 종양 미세환경에서 더 활성인 치료적 단백질을 확인/선택하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 활성이 희망되는 종양 미세환경에 존재하지만 비-종양 환경에 존재하지 않는 조건 하에서 단백질의 활성을 시험하는 단계;
    b) 비-종양 미세환경에 존재하는 조건 하에서 단백질의 활성을 시험하는 단계;
    c) a) 단계에서의 활성과 b) 단계에서의 활성을 비교하는 단계; 및
    d) b) 단계와 비교하여 a) 단계에서 더 큰 활성을 갖는 단백질을 선택/확인함으로써, 비-종양 미세환경에서보다 종양 미세환경에서 더 활성인 단백질을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제 8항의 방법에 있어서, 상기 비-종양 미세환경은 전신적 미세환경인 방법.
  10. 제 8항 또는 제 9항의 방법에 있어서, 상기 비-종양 미세환경은 건강 조직인 방법.
  11. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 건강 조직은 위장관(GI tract), 피부, 맥관계(vasculature), 혈액 또는 세포외 기질인 방법.
  12. 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, a) 단계 및 b) 단계 각각은, 종양 미세환경에 존재하지만 비-종양 미세환경에는 존재하지 않는 조건 또는 조건들을 제외하면 동일한 조건 하에서 수행되는 방법.
  13. 제 8항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 종양 미세환경에 존재하는 조건은 증가된 혈관 신생, 저산소증, 저하된 pH, 증가된 젖산염 농도, 증가된 피루브산염 농도, 증가된 간질액압, 및 종양을 나타내는 변경된 대사체 또는 대사 중으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 특성을 포함하는 방법.
  14. 제 8항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 종양 미세환경에서 존재하는 조건은 중성 pH보다 낮은 pH 또는 비-종양 미세환경보다 낮은 pH를 포함하는 방법.
  15. 제 8항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 종양 미세환경에 존재하는 조건은 7.4 아래의 pH를 포함하는 방법.
  16. 제 8항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 종양의 pH는 약 5.8 내지 6.8을 포함하고, 상기 종양 미세환경에 존재하는 조건은 약 5.8 내지 6.8 사이의 pH를 포함하는 방법.
  17. 제 8항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 종양 미세환경에서 존재하는 조건은 비-종양 미세환경에서 존재하는 조건과 비교하여 상승된 젖산염 농도 및/또는 증가된 피루브산염 농도를 포함하는 방법.
  18. 제 8항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 a) 단계의 조건은 b) 단계의 조건과 비교하여 중성 pH 보다 더 낮은 pH 및 상승된 젖산염 농도를 포함하는 방법.
  19. 제 18항의 방법에 있어서, 상기 pH는 5.8 내지 6.8 사이를 포함하거나, 5.8 내지 6.5 사이를 포함하는 방법.
  20. 제 8항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 a) 단계의 조건은 10 mM 내지 20 mM 젖산 또는 15 mM 내지 18 mM 젖산; 또는 적어도 약 16 mM, 16.5 mM 또는 17 mM 젖산 중으로부터 선택된 증가된 젖산염 농도를 포함하고/포함하거나;
    상기 b) 단계의 조건은 0.5 내지 5 mM 또는 0.2 mM 내지 4 mM 젖산; 또는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 mM 젖산 중으로부터 선택된 젖산염 농도를 포함하는 방법.
  21. 제 8항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 단백질은 종양을 치료하는 치료적 단백질인 방법.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 방법은 in vitro에서 수행되는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질은 항체, 효소, 호르몬, 사이토카인 또는 이의 활성 부분이고, 여기에서 항체에 대한 언급은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭하는 방법.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질은 표적 수용체에 대한 리간드인 방법.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 종양을 치료하는 치료적 단백질은 항-종양 항체인 방법.
  26. 제 25항의 방법에 있어서, 상기 항-종양 항체는 세툭시맙(Erbitux®), 트라스투주맙 (Herceptin®), 리툭시맙 (Rituxan®, MabThera®), 베바시주맙 (Avastin®), 알렘투주맙 (Campath®), 파니투무맙 (Vectibix®), 라니비주맙 (Lucentis®), 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄 (Zevalin®), 토시투모맙, 아이오딘 I131 토시투모맙(BEXXAR®), 카투막소맙(Removab®), 겜투주맙, 겜투주맙 오조가미신 (Mylotarg®), 아바타셉트(CTLA4-Ig, Orencia®), 벨라타셉트(L104EA29YIg; LEA29Y; LEA), 이필리무맙 (MDX-010, MDX-101), 트레멜리무맙(ticilimumab, CP-675,206), PRS-010, PRS-050, 아플리베르셉트(VEGF Trap, AVE005), 볼로식시맙(M200), F200, MORAb-009, SS1P (CAT-5001), 식수투무맙(IMC-A12), 마투주맙(EMD72000), 니모투주맙(h-R3), 잘루투무맙(HuMax-EGFR), 네시투무맙 IMC-11F8, mAb806/ch806, Sym004 및 mAb-425 중으로부터 선택된 항-종양 항체인 방법.
  27. 제 25항 또는 제 26항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 항-종양 항체는 세툭시맙(Erbitux®)인 방법.
  28. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 방법은:
    복수의 단백질들이 a) 단계 및 b) 단계 각각에서 시험되고;
    각 단백질이 a) 단계 및 b) 단계 각각에서 시험되고;및
    b) 단계와 비교하여 a) 단계에서 더 큰 활성을 갖는 임의의 단백질이 선택되는 방법.
  29. 제 28항의 방법에 있어서, 상기 복수의 단백질들은 치료적 단백질의 변형된 변이체를 포함하거나 치료적 단백질의 변형된 변이체이고, 변이체들의 콜렉션(collection)이 a) 단계 및 b) 단계 각각에서 시험되는 방법.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질은 다량체화 도메인을 포함하는 방법.
  31. 제 30항의 방법에 있어서, 상기 다량체화 도메인은 Fc 도메인 또는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 방법.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질은 항체, 효소, 호르몬 또는 사이토카인인 방법.
  33. 제 32항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질은 항체인 방법.
  34. 제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질은 항-종양 항체인 방법.
  35. 제 34항의 방법에 있어서, 상기 항-종양 항체는 세툭시맙(Erbitux®), 트라스투주맙 (Herceptin®), 리툭시맙 (Rituxan®, MabThera®), 베바시주맙 (Avastin®), 알렘투주맙 (Campath®), 파니투무맙 (Vectibix®), 라니비주맙 (Lucentis®), 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄 (Zevalin®), 토시투모맙, 아이오딘 I131 토시투모맙(BEXXAR®), 카투막소맙(Removab®), 겜투주맙, 겜투주맙 오조가미신 (Mylotarg®), 아바타셉트(CTLA4-Ig, Orencia®), 벨라타셉트(L104EA29YIg; LEA29Y; LEA), 이필리무맙 (MDX-010, MDX-101), 트레멜리무맙(ticilimumab, CP-675,206), PRS-010, PRS-050, 아플리베르셉트(VEGF Trap, AVE005), 볼로식시맙(M200), F200, MORAb-009, SS1P (CAT-5001), 식수투무맙(IMC-A12), 마투주맙(EMD72000), 니모투주맙(h-R3), 잘루투무맙(HuMax-EGFR), 네시투무맙 IMC-11F8, mAb806/ch806, Sym004 및 mAb-425 중으로부터 선택된 항-종양 항체인 방법.
  36. 제 29항 내지 제 35항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 변형된 변이체는 치료적 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여 아미노산 잔기 또는 잔기들의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 방법.
  37. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 시험되는 단백질은 상기 항체의 변형되지 않은 형태와 비교하여 상보성 결정 영역(CDR)에 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 항체인 방법.
  38. 제 29항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 각 변이체 단백질은 치료적 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여 단일 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  39. 제 29항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 각 변이체 단백질은 상기 치료적 항체의 변형되지 않은 형태와 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  40. 제 29항 내지 제 39항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 방법은:
    상기 콜렉션에 있어서 각 변화되는 위치에서의 아미노산은 상기 위치에서의 원래 아미노산보다 1-19 다른 아미노산까지에 의해 치환되고; 및
    상기 치료적 단백질의 길이를 따라 모든 아미노산, 또는 이의 선택된 부분이 치환되는 방법.
  41. 제 29항 내지 제 40항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 치환 아미노산이 상기 치료적 단백질의 상응하는 위치의 아미노산과 상이하다는 것을 전제로, 상기 치환 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val 중으로부터 선택되는 방법.
  42. 제 29항 내지 제 41항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 히스티딘이 치환 아미노산이거나 상기 단백질 내의 히스티딘들이 비-염기 또는 비-대전된(uncharged) 아미노산에 의해 치환되는 방법.
  43. 제 29항 내지 제 42항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 변형은 Arg, Asp, Glu, His 및 Lys 중으로부터 선택된 아미노산으로의 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  44. 제 29항 내지 제 43항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 변형은 His으로의 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  45. 제 29항 내지 제 44항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 단백질은 항체이고 변형된 선택된 부분은 CDR인 방법.
  46. 제 29항 내지 제 45항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 콜렉션에서의 각 변이체 단백질은 개별적으로 시험되는 방법.
  47. 제 29항 내지 제 46항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 각 변이체 단백질은 어레이(array)에서 시험되는 방법.
  48. 제 29항 내지 제 46항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 시험되는 각 변이체 단백질은 어드레서블(addressible)한 방법.
  49. 제 1항 내지 제 48항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 시험되는 활성은 치료적 단백질의 표적 단백질에 대한 결합인 방법.
  50. 제 49항의 방법에 있어서, 결합은 면역분석에 의해 평가되는 방법.
  51. 제 49항 또는 제 50항의 방법에 있어서, 상기 면역분석은 ELISA를 포함하는 방법.
  52. 제 50항 또는 제 51항의 방법에 있어서, 상기 면역분석은 이질성(heterogeneous)이고,
    고체 지지체상에 표적 단백질을 부동화하는 단계;
    치료적 단백질을 표적 단백질과 접촉하는 단계로서, 여기에서 상기 치료적 단백질은 검출가능하도록 표지된 것인 단계;
    결합하지 않은 치료적 단백질을 제거하는 단계; 및
    표지된 치료적 단백질의 표적 단백질에 대한 결합을 검출 또는 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  53. 제 50항 또는 제 51항의 방법에 있어서, 상기 면역분석은 동질성(homogenous)이고,
    치료적 단백질을 표적 단백질과 접촉하는 단계로서, 여기에서 치료적 단백질은 검출가능하게 표지된 것인 단계; 및
    표지된 치료적 단백질의 표적 단백질에 대한 결합을 검출 또는 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  54. 제 1항 내지 제 53항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 결합 활성은 표면상에 치료적 단백질을 발현하는 세포 또는 세포들을 포함하는 세포 표면 발현 시스템을 사용하여 평가되는 방법.
  55. 제 54항의 방법에 있어서,
    상기 치료적 단백질은 세포의 표면상에 발현되고;
    표적 단백질은 상기 세포의 집단과 접촉되고; 및
    상기 표적 단백질에 결합한 세포 또는 세포들이 확인됨으로써, 결합 활성을 나타내는 치료적 단백질을 확인하는 방법.
  56. 제 55항의 방법에 있어서, 상기 표적 단백질은 검출가능하게 표지되거나 검출될 수 있는 방법.
  57. 제 56항의 방법에 있어서, 상기 표적 단백질은 형광으로 표지되거나 형광으로 표지된 2차 시약으로 검출되는 방법.
  58. 제 49항 내지 제 57항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 결합의 검출 또는 측정은 형광 활성 세포 분류(FACS)에 의한 방법.
  59. 제 1항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 방법에 있어서,
    치료적 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 세포 표면 발현 시스템을 사용하여 조건 b) 하에서 결합 활성이 먼저 시험되고, 이에 의해 표적 단백질에 결합하는 세포 또는 세포들이 선택되고 표적 단백질에 결합하지 않는 세포 또는 세포들이 선택되며;
    상기 표적 단백질에 결합하지 않는 선택된 세포 또는 세포들이 분리되고 세포 배양 배지에서 성장되어 표면 상에 치료적 단백질을 발현하는 세포의 제 2 집단을 생성하고;
    조건 a) 하에서 결합 활성이 시험되고, 이에 의해 상기 세포들의 제 2 집단으로부터의 세포들은 상기 표적 단백질과 접촉되고; 및
    상기 표적 단백질에 결합하는 세포 또는 세포들이 확인되고, 이에 의해 조건 a) 하에서는 결합 활성을 나타내나 조건 b) 하에서는 결합 활성을 나타내지 않는 치료적 단백질을 확인하는 방법.
  60. 제 1항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 방법에 있어서,
    치료적 단백질을 발현하는 세포들의 집단을 포함하는 세포 표면 발현 시스템을 사용하여 조건 a) 하에서 결합 활성이 먼저 시험되고, 이에 의해 표적 단백질에 결합하는 세포 또는 세포들이 선택되고 표적 단백질에 결합하지 않는 세포 또는 세포들이 선택되고;
    상기 표적 단백질에 결합하는 선택된 세포 또는 세포들이 분리되고 세포 배양 배지에서 성장되어 세포들의 제 2 집단을 생성하고;
    결합 활성이 조건 b) 하에서 시험되고, 이에 의해 상기 세포들의 2차 집단으로부터의 세포들은 상기 표적 단백질과 접촉되고; 및
    상기 표적 단백질에 결합하지 않는 세포 또는 세포들이 확인되고, 상기 표적 단백질에 결합하는 세포 또는 세포들이 확인되며;
    상기 표적 단백질에 결합하지 않는 세포 또는 세포들이 선택되고, 이로 인해 결합 활성을 나타내는 치료적 단백질을 확인하는 방법.
  61. 제 1항 내지 제 60항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질의 대상에 대한 투여는 하나 또는 그 이상의 유해 부작용과 관련된 방법.
  62. 제 61항의 방법에 있어서, 조건 a)와 비교하여 조건 b)에서의 단백질의 활성 감소는 유해 부작용을 개선 또는 예방하는 방법.
  63. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 조건 a) 및 조건 b)에서의 치료적 단백질의 활성은 인간 혈청의 존재하에 시험되는 방법.
  64. 제 1항 내지 제 63항 중 어느 한 항의 방법에 있어서,
    상기 조건 a) 및 조건 b)에서의 치료적 단백질의 활성은 생리적 환경하에 존재하는 양의 인간 혈청의 존재하에서 시험되고; 및
    상기 조건 a)에서의 혈청 농도는 조건 b)에서의 혈청 농도와 동일한 방법.
  65. 제 1항 내지 제 64항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 조건 a) 및 조건 b)는, 부피의, 적어도 약 3%-30%, 포함; 5%-30%, 포함; 5%-25%, 포함; 10%-30%, 포함; 15%-30%, 포함; 및 15%-25%, 포함 사이 중으로부터 선택되는 인간 혈청의 존재하에서 수행되는 방법.
  66. 제 65항의 방법에 있어서, 상기 인간 혈청의 농도는 부피의 약 25%(플러스 또는 마이너스 10%) 또는 15%-35%인 방법.
  67. 제 1항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료적 단백질의 표적 단백질은 리간드에 결합하는 수용체 또는 이의 부분인 방법.
  68. 제 67항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질의 표적 단백질은 종양 항원인수용체인 방법.
  69. 제 68항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질의 표적 단백질은 수용체의 Her 패밀리의 일원인 방법.
  70. 제 69항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질의 표적 단백질은 EGFR 수용체 또는 이의 세포외 도메인인 방법.
  71. 제 1항 내지 제 70항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 조건 a)에서의 활성은 조건 b)에서의 활성보다 미리 결정된 양 또는 비율만큼 더 큰 방법.
  72. 제 71항의 방법에 있어서, 상기 활성은 적어도 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 그 이상의 비율만큼 더 큰 방법.
  73. 제 1항 내지 제 72항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 조건 a)에서의 활성은 조건 b)에서보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, 50%, 100%, 2 배, 5 배, 10 배, 20 배 또는 그 이상 더 큰 방법.
  74. 제 1항 내지 제 73항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 항-종양 항체의 투여는 하나 또는 그 이상의 유해 부작용과 관련된 방법.
  75. 제 74항의 방법에 있어서, 상기 항체는 항-EGFR 항체 또는 항-CTLA4 항체인 방법.
  76. 제 1항 내지 제 75항 중 어느 한 항의 방법은 고처리량 포맷(High throughout format)으로 수행되는 방법.
  77. 제 1항 내지 제 76항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 방법은 자동화된 방법.
  78. 제 1항 내지 제 77항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 비-종양 환경과 비교하여 종양 미세환경에서 더 큰 활성을 가지도록 선택되는 단백질이 조건부 활성인 방법.
  79. 제 1항 내지 제 78항 중 어느 한 항의 방법은 복수 회 반복되고, 각 반복에서, 선택된 단백질 또는 단백질들의 추가적인 변이체들이 생성되어 시험되고, 이에 의해 상기 치료적 단백질은 비-종양 환경과 비교하여 종양 미세환경에서 증가된 활성을 나타내도록 진화되어 이로 인하여 감소된 독성 또는 감소된 유해 부작용을 나타내는 방법.
  80. 제 61항 내지 제 79항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질은 항-EGFR 항체이고 상기 감소된 유해 부작용은 항체에 대한 전신적 노출과 관련된 감소된 피부 독성인 방법.
  81. 제 1항 내지 제 80항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 7.3-7.4의 정상 생리적 pH 및 12 mM 아래의 정상 젖산염 농도의 조건 b) 하에서와 비교하여 상기 선택된 단백질은 5.8-6.8의 감소된 pH 및 약 12-20 mM의 젖산염 농도의 종양 미세환경인 조건 a) 하에서 EGFR에 우선적으로 결합하는 항-EGFR 항체 변이체인 방법.
  82. 제 1항 내지 제 81항 중 어느 한 항의 방법에 있어서,
    a)-d) 단계 전에, 상기 방법은:
    e) 제 1 고체 지지체 및 제 2 듀플리케이트(duplicate) 고체 지지체를 EGFR 또는 EGFR 세포외 도메인(ECD)과 약 pH 7.4를 포함하는 완충액 내에서 접촉하는 단계;
    f) 상기 제 1 및 제 2 지지체를 약 pH 7.4를 포함하는 완충액으로 세척하는 단계;
    g) 상기 제 1 및 제 2 고체 지지체에 25% 또는 약 25%의 인간 혈청을 포함하는 완충액을 첨가하는 단계; 여기에서:
    i) 상기 제 1 고체 지지체에 첨가된 완충액에 대한 조건은 약 12-20 mM 젖산, 약 pH 6.0을 포함하고; 및
    ii) 상기 제 2 고체 지지체에 첨가된 완충액에 대한 조건은 1 mM 또는 약 1 mM 젖산, 약 pH 7.4를 포함하고;
    h) 상기 고체 지지체로부터 c) 단계에 첨가된 완충액을 제거하는 단계; 및 e)-h) 단계를 수행한 후에, a)-d) 단계를 수행하는 단계, 여기에서:
    a) 단계는:
    검출가능하게 표지된 변형된 항-EGFR 항체를 상기 제 1 지지체에 12-20 mM젖산, 25% 인간 혈청, pH 6.0을 포함하는 결합 완충액 내에서 첨가하는 단계;
    12-20 mM 젖산, 약 pH 6.0을 포함하는 완충액으로 상기 제 1 지지체를 세척하는 단계; 및
    결합된 변형된 항-EGFR을 검출하기 위해 상기 제 1 고체 지지체에 시약을 첨가하고, 상기 제 1 고체 지지체상의 EGFR 또는 EGFR ECD에 대한 변형된 단백질의 결합을 검출하는 단계를 포함하며; 및
    b) 단계는:
    검출가능하게 표지된 변형된 항-EGFR 항체를 1 mM 젖산, 25% 인간 혈청, pH 7.4를 포함하는 결합 완충액 내에서 제 2 지지체에 첨가하는 단계;
    1 mM 또는 약 1 mM 젖산, 약 pH 7.4를 포함하는 완충액으로 상기 제 2 지지체를 세척하는 단계; 및
    결합된 변형된 항-EGFR을 검출하기 위해 상기 제 2 고체 지지체에 시약을 첨가하고, 상기 제 2 고체 지지체상의 EGFR 또는 EGFR ECD에 대한 변형된 단백질의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
  83. 제 82항의 방법에 있어서, 상기 항-EGFR 항체는 항-FLAG-TAG 효소 시약으로의 검출을 용이하게 하기 위한 FLAG-태그를 포함하는 방법.
  84. 제 82항 또는 제 83항의 방법에 있어서, 상기 결합 검출은 분광광도적 측정을 포함하는 방법.
  85. 제 2 세트의 조건보다 제 1 세트의 조건에서 더 활성인 치료적 단백질을 확인/선택하는 방법으로서,
    상기 제 1 세트의 조건은 비-종양 미세환경과 비교하여 종양 미세환경에 존재하는, 낮은 pH, 증가된 젖산염 농도, 증가된 피루브산염 농도 및 저산소증 중으로부터 선택된, 하나 또는 그 이상의 조건을 포함하고; 및
    상기 제 2 세트의 조건은 비-종양 미세환경에 존재하는 상기에 상응하는 조건을 포함하고; 및
    상기 방법은:
    a) 제 1 및 제 2 세트의 조건 하에서 활성에 관하여 복수의 단백질들을 시험하는 단계; 여기에서:
    복수의 단백질들은 치료적 단백질의 변형된 변이체를 포함하거나 치료적 단백질의 변형된 변이체이고; 및
    변이체의 제 1 콜렉션은 제 1 및 제 2 세트의 조건 각각에서 시험된다;
    b) 하기를 갖는 단백질들을 선택/확인하는 단계:
    변형되지 않은 치료적 단백질과 비교하여 제 1 세트의 조건 하에서 감소된 활성; 및
    변형되지 않은 치료적 단백질과 비교하여 제 2 세트의 조건 하에서 감소된 활성;
    c) 변형된 아미노산 위치를 확인하기 위해 b) 단계에서 선택/확인된 단백질들을 분석하는 단계로서, 이에 의해 상기 아미노산이 결정적인 아미노산 위치로서 확인되는 단계;
    d) 결정적인 아미노산 위치에 인접한 또는 근처의 아미노산 잔기의 치환 아미노산으로의 치환을 포함하는 변이체 단백질의 제 2 콜렉션을 생성하는 단계로서, 여기에서 상기 라이브러리의 각 일원은 치료적 단백질과 비교하여 단일 아미노산 치환을 포함하는 단계;
    e) 제 1 세트의 조건 하 및 제 2 세트의 조건 하에서 변형된 단백질들의 제 2 콜렉션의 일원의 활성을 시험하고; 제 2 세트의 조건 하에서와 비교하여 더 크거나 거의(about) 동일한 활성을 나타내는 제 2 콜렉션의 일원을 선택/확인하는 단계;
    f) 치환된 아미노산 위치를 확인하기 위해 e) 단계에서 선택/확인된 단백질들을 분석하는 단계로서, 여기에서 상기 확인된 위치는 핵심 잔기 위치로 명명되는 단계;
    g) 변이체 단백질들의 제 3 콜렉션을 생성하는 단계로서, 여기에서 각 일원은 하나 또는 그 이상의 핵심 잔기 위치의 치환 아미노산으로의 치환을 포함하는 단계;
    h) 제 1 세트의 조건 하에서 및 제 2 세트의 조건 하에서 조합 라이브러리의 일원의 활성을 시험하고, 제 2 세트의 조건과 비교하여 제 1 세트의 조건 하에서 더 큰 활성을 갖는 제 2 라이브러리의 일원을 선택/확인함으로써, 제 2 세트의 조건에서보다 제 1 세트의 조건에서 더 활성인 치료적 단백질을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  86. 제 85항의 방법에 있어서, h) 단계는:
    1) 제 1 세트의 조건 하에서 제 3 콜렉션의 일원의 활성을 시험하고 미리 결정된 활성보다 더 큰 활성을 갖는 단백질을 선택/확인하는 단계; 및
    2) 제 2 세트의 조건 하에서 1) 단계에서 선택/확인된 단백질의 활성을 시험하고 미리 결정된 활성보다 더 낮은 활성을 갖는 단백질을 선택/확인하는 단계를 포함하는 방법.
  87. 제 85항의 방법에 있어서, h) 단계는:
    1) 제 2 세트의 조건 하에서 제 3 콜렉션 라이브러리의 일원의 활성을 시험하고 미리 결정된 활성보다 더 낮은 활성을 갖는 단백질을 선택/확인하는 단계; 및
    2) 제 1 세트의 조건 하에서 1) 단계에서 선택/확인된 단백질의 활성을 시험하고 미리 결정된 활성보다 더 큰 활성을 갖는 단백질을 선택/확인하는 단계를 포함하는 방법.
  88. 제 85항 내지 제 87항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, g) 단계는 복수 회 반복되고, 각 반복에 있어, 선택/확인된 단백질이 시험되는 방법.
  89. 제 88항의 방법에 있어서, 상기 g) 단계는 1, 2, 3, 또는 4회 반복되는 방법.
  90. 제 85항 내지 제 89항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질은 항체, 효소, 호르몬, 사이토카인 또는 이의 활성 부분이고, 여기에서 항체에 대한 언급은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭하는 방법.
  91. 제 85항 내지 제 90항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질은 표적 수용체에 대한 리간드인 방법.
  92. 제 85항 내지 제 91항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 치료적 단백질은 종양을 치료하는 단백질인 방법.
  93. 제 92항의 방법에 있어서, 상기 종양을 치료하는 치료적 단백질은 항-종양 항체인 방법.
  94. 제 93항의 방법에 있어서, 상기 항-종양 항체는 세툭시맙(Erbitux®), 트라스투주맙 (Herceptin®), 리툭시맙 (Rituxan®, MabThera®), 베바시주맙 (Avastin®), 알렘투주맙 (Campath®), 파니투무맙 (Vectibix®), 라니비주맙 (Lucentis®), 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄 (Zevalin®), 토시투모맙, 아이오딘 I131 토시투모맙(BEXXAR®), 카투막소맙(Removab®), 겜투주맙, 겜투주맙 오조가미신 (Mylotarg®), 아바타셉트(CTLA4-Ig, Orencia®), 벨라타셉트(L104EA29YIg; LEA29Y; LEA), 이필리무맙 (MDX-010, MDX-101), 트레멜리무맙(ticilimumab, CP-675,206), PRS-010, PRS-050, 아플리베르셉트(VEGF Trap, AVE005), 볼로식시맙(M200), F200, MORAb-009, SS1P (CAT-5001), 식수투무맙(IMC-A12), 마투주맙(EMD72000), 니모투주맙(h-R3), 잘루투무맙(HuMax-EGFR), 네시투무맙 IMC-11F8, mAb806/ch806, Sym004 및 mAb-425 중으로부터 선택된 항-종양 항체인 방법.
  95. 제 93항 또는 제 94항의 방법에 있어서, 상기 항-종양 항체는 세툭시맙(Erbitux®)인 방법.
  96. 제 85항 내지 제 95항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 시험되는 활성은 표적 단백질에 대한 결합인 방법.
  97. 제 96항의 방법에 있어서, 상기 결합 활성은 면역분석에 의해 시험되는 방법.
  98. 제 97항의 방법에 있어서, 상기 면역분석은 ELISA를 포함하는 방법.
  99. 제 85항 내지 제 98항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 결합 활성은 세포 기반 분석에서 시험되는 방법.
  100. 제 85항 내지 제 99항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 결합 활성은 세포 표면 발현 시스템에서 시험되는 방법.
  101. 제 85항 내지 제 100항 중 어느 한 항의 방법에 있어서,
    상기 제 2 라이브러리의 일원은 세포의 표면상에 발현되고;
    표적 단백질은 세포의 집단과 접촉되고; 및
    상기 표적 단백질에 결합한 세포 또는 세포들이 확인되고, 이에 의해 결합 활성을 나타내는 단백질을 확인하는 방법.
  102. 제 99항 내지 제 101항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 방법.
  103. 제 99항 내지 제 102항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 세포 기반 분석은 형광 활성 세포 분류(FACS)인 방법.
  104. 제 96항 내지 제 103항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 표적 단백질은 검출가능하게 표지된 또는 검출될 수 있는 방법.
  105. 제 96항 내지 제 104항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 표적 단백질은 형광으로 표지되거나 형광으로 표지된 2차 시약에 의해 검출되는 방법.
  106. 제 96항 내지 제 105항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 결합의 검출 또는 측정은 형광 활성 세포 분류(FACS)에 의한 방법.
  107. 제 96항 내지 제 106항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 표적 단백질은 수용체의 Her 패밀리의 일원인 방법.
  108. 제 96항 내지 제 107항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 표적 단백질은 EGFR 수용체 또는 이의 세포외 도메인인 방법.
  109. 제 85항 내지 제 108항 중 어느 한 항의 방법에 있어서,
    상기 제 1 세트의 조건은 7.4 아래의 낮은 pH를 포함하고; 및
    결정적인 아미노산은 대전된(charged) 잔기로 이루어진 아미노산 치환을 포함하는 단백질 변이체들로부터 선택된 방법.
  110. 제 109항의 방법에 있어서, 상기 대전된 잔기는 Arg, Asp, Glu, His 및 Lys 중으로부터 선택된 방법.
  111. 제 85항 내지 제 110항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 제 2 및 제 3 콜렉션 내의 아미노산 치환은 아미노산의 His로의 치환인 방법.
  112. 제 85항 내지 제 111항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 제 1 세트의 조건은 약 5.8-6.8의 pH를 포함하는 방법.
  113. 제 85항 내지 제 112항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 제 2 세트의 조건과 비교하여 제 1 세트의 조건은 중성 pH보다 더 낮은 pH 및 상승된 젖산 농도를 포함하는 방법.
  114. 제 85항 내지 제 113항 중 어느 한 항의 방법에 있어서,
    상기 제 1 세트의 조건은 약 12-20 mM 젖산, 약 pH 6.0을 포함하고; 및
    상기 제 2 세트의 조건은 약 1 mM 젖산, 약 pH 7.4를 포함하는 방법.

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