KR101818152B1 - 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 g에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

쥐 또는 토끼의 면역글로불린 g에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G에 결합하는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 폴리펩티드를 생산하는 방법 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 면역분석용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 폴리펩티드는 쥐 또는 토끼 각각의 면역글로불린 G에 특이적으로 결합하고 기존의 값비싼 이차 면역글로불린 G를 대체하며 다양한 생물학적 면역분석법에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩티드와 면역글로불린 G의 혼성체를 이용하여 다양한 면역 센서/면역 칩 제작 및 약물 스크리닝에 유용하다.

Description

쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드 및 이의 용도 {Novel polypeptide selective binding with mouse immunoglobulin G or rabbit immunoglobulin G and uses thereof}
본 발명은 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G에 결합하는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 생산하는 방법 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 면역분석용 조성물에 관한 것이다.
면역글로불린은 바이러스나 박테리아 등의 외부 항원을 중화시키는 항체의 기능을 담당하는 당단백질로 혈액이나 조직액에 들어있다. 면역글로불린 G는 면역글로불린 중 가장 많이 존재하며 외부물질과의 결합으로 면역 반응을 불러일으킴으로써 신체를 보호하는 중요한 물질이다.
면역글로불린 G와 외부물질간의 결합을 면역반응이라고 하며 이러한 특성을 이용하여 특정 항원을 인식하는 일차 면역글로불린 G의 생산 및 일차 면역글로불린 G에 결합하는 이차 면역글로불린 G를 동물 종으로 가장 많이 사용되는 쥐 또는 토끼의 면역학적 반응을 통해 생산하여 생물학적 면역분석법에 활용되고 있다.
그러나 일차 면역글로불린 G에 결합하는 이차 면역글로불린 G의 제작에 있어 실험동물의 사용, 하이브리도마 제작 및 배양에 필요한 경제적, 시간적 문제점이 있다. 또한 신호 검출을 위한 효소 및 형광 표지자를 화학적 반응을 통해 결합해야하는 후처리 과정이 필요하다. 이 과정에서 이차 면역글로불린 G 구조의 불안정성에 의한 최종 산물의 효율이 감소되는 문제점이 있다. 그리고 이차 면역글로불린 G의 비특이적 반응성 및 교차반응에 의한 검출 한계가 나타나고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 리피바디 (repebody)라는 단백질을 이용하여 기존의 이차 면역글로불린 G를 대체할 수 있는 새로운 폴리펩티드를 설계하였다. 상기 리피바디는 LRR (Leucin-rich repeat)의 구조를 갖는 인터날린 B의 N-말단과 VLR의 구조의 유사성을 바탕으로 융합하여 컨센시스 디자인으로 최적화시킨 폴리펩티드를 의미한다. 리피바디는 크기가 항체의 1/5 수준이고 대장균에서 대량생산이 가능하여 생산 단가를 낮출 수 있고, 열 및 pH 안정성이 매우 우수하여 산업적인 사용에 큰 장점을 가지고 있다. 또한 표적 물질에 대한 결합력을 pico-mole 수준까지 매우 용이하게 증대시킬 수 있으며 표적 물질에 대한 특이성이 매우 탁월함을 입증한 바가 있다.
본 발명자들은 대한민국 특허 제10-2013-0081009호에서 사람 면역글로불린 G에 대해 특이적으로 결합하는 리피바디를 개발한 바 있다. 하지만, 상기 특허에서 개발한 리피바디는 사람 면역글로불린 G에만 특이성이 있어, 일반적인 생물학적 면역분석법에 활용되는 이차면역글로불린으로 사용되는 쥐 또는 토끼의 면역글로불린G에는 결합하지 않는 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고, 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G에 특이적인 결합 단백질 (Specific protein binder)을 개발하기 위해, 예의 노력한 결과, 리피바디를 이용하여 돌연변이 라이브러리를 제작하고, 모듈 기반 결합력 증대를 통해 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G에 특이적인 결합력을 갖는 신규한 폴리펩티드를 선별할 경우, 선별된 리피바디가 다양한 면역분석법에서 기존의 이차면역글로불린G에 비하여 탁월한 효과를 발휘한다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G에 특이적으로 결합하는 리피바디(Repebody); 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터가 도입된 재조합 미생물; 및 상기 재조합 미생물를 이용해 상기 리피바디를 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 리피바디를 이용하여 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G를 고정 또는 정제하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 리피바디를 함유하는 면역분석용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 및 7 내지 12 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되고, 토끼의 면역글로불린 G에 선택적으로 결합하는 리피바디(repebody)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 상기 재조합 미생물을 배양하여 리피바디를 발현시키는 단계; 및 (ii) 상기 발현된 리피바디를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 리피바디의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 상기 리피바디를 흡착시킨 컬럼에 토끼의 면역글로불린 G 항체를 함유하는 혼합물을 처리하는 단계; 및 (ii) 상기 단계 (i)의 컬럼에 부착된 항체를 용출하는 단계를 포함하는 토끼의 면역글로불린 G 항체의 정제방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 상기 리피바디를 고체기판에 부착하는 표면처리 단계; 및 (ii) 상기 표면처리된 고체기판에 면역글로불린 G를 결합시키는 단계를 포함하는 토끼의 면역글로불린 G의 고정화 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 리피바디로 표면처리된 고체기판에 상기 리피바디를 매개로 토끼의 면역글로불린 G가 고정된 면역센서를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 면역센서에 토끼의 면역글로불린 G에 대한 결합능을 갖는 물질을 함유하는 시료를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 면역센서의 결합유무를 확인하는 단계를 포함하는 상기 리피바디를 이용한 토끼의 면역글로불린 G에 대한 결합능을 가지는 물질을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 리피바디를 포함하고, 토끼의 면역글로불린 G의 ELISA용 조성물; 웨스턴 블로팅용 조성물; 및 면역화학염색용 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 4 내지 6 및 13 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되고, 쥐의 면역글로불린 G에 선택적으로 결합하는 리피바디(repebody)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 상기 재조합 미생물을 배양하여 리피바디를 발현시키는 단계; 및 (ii) 상기 발현된 리피바디를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 리피바디의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 상기 리피바디를 흡착시킨 컬럼에 쥐의 면역글로불린 G 항체를 함유하는 혼합물을 처리하는 단계; 및 (ii) 상기 단계 (i)의 컬럼에 부착된 항체를 용출하는 단계를 포함하는 쥐의 면역글로불린 G 항체의 정제방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 상기 리피바디를 고체기판에 부착하는 표면처리 단계; 및 (ii) 상기 표면처리된 고체기판에 면역글로불린 G를 결합시키는 단계를 포함하는 쥐의 면역글로불린 G의 고정화 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 리피바디로 표면처리된 고체기판에 상기 리피바디를 매개로 쥐의 면역글로불린 G가 고정된 면역센서를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 면역센서에 쥐의 면역글로불린 G에 대한 결합능을 갖는 물질을 함유하는 시료를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 면역센서의 결합유무를 확인하는 단계를 포함하는 상기 리피바디를 이용한 쥐의 면역글로불린 G에 대한 결합능을 가지는 물질을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 리피바디를 포함하고, 쥐의 면역글로불린 G의 ELISA용 조성물; 웨스턴 블로팅용 조성물; 및 면역화학염색용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 폴리펩티드는 쥐 또는 토끼 각각의 면역글로불린 G에 특이적으로 결합하고 기존의 값비싼 이차 면역글로불린 G를 대체하며 다양한 생물학적 면역분석법에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩티드와 면역글로불린 G의 혼성체를 이용하여 다양한 면역 센서/면역 칩 제작 및 약물 스크리닝에 유용하다.
도 1은 본 발명에서 토끼의 면역글로불린 G에 결합하는 리피바디 개발을 위해 무작위적인 라이브러리를 구축한 아미노산 잔기들을 표시한 전체 구조를 나타내는 개략도이다.
도 2는 본 발명에서 쥐의 면역글로불린 G에 결합하는 리피바디 개발을 위해 무작위적인 라이브러리를 구축한 아미노산 잔기들을 표시한 전체 구조를 나타내는 개략도이다.
도 3는 본 발명에서 구축한 파지 라이브러리를 이용하여 토끼의 면역글로불린 G에 대한 파지 디스플레이 바이오 패닝을 수행 후 최종적으로 선별된 리피바디 클론의 결합력을 등온 적정 열량측정법 (Isothermal titration calorimetry, ITC)으로 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 구축한 파지 라이브러리를 이용하여 쥐의 면역글로불린 G에 대한 파지 디스플레이 바이오 패닝을 수행 후 최종적으로 선별된 리피바디 클론의 결합력을 등온 적정 열량측정법 (Isothermal titration calorimetry, ITC)으로 측정한 결과이다.
도 5는 ELISA fluorescence를 통해 사람, 쥐, 토끼의 면역글로불린 G에 대해 가장 높은 결합력을 가지는 리피바디 클론들의 특이적인 결합여부를 확인한 결과이다. 본 발명자의 선행 특허(제 10-2013-0081009)에서 개발된 사람 면역글로불린 G에 특이적으로 결합하는 리피바디의 특이성 또한 함께 확인되었다. 모든 클론이 BSA에는 결합하지 않고 각각의 면역글로불린 G에 대해서는 특이적으로 결합함을 확인할 수 있다.
도 6는 ELISA를 통해 기존 이차 면역글로불린 G 효소 결합체와 리피바디 효소 결합체의 표적 단백질 검출 능력을 비교한 결과이다. 면역글로불린 G의 다양한 농도 구간에서 같은 질량의 기존 이차 면역글로불린 G 효소 결합체와 리피바디 효소 결합체를 처리하였을 때 면역글로불린 G 검출 능력이 동등하거나 우수한 결과를 보여줌을 알 수 있다.
도 7은 Western blot을 통해 리피바디 효소 결합체의 표적 단백질 검출 능력을 확인한 결과이다. 표적 단백질은 유방암 세포에서 과발현 되는 상피세포성장인자 수용체 (HER2), 세포 내 가는근육미세섬유 (β-actin), 인산화 키나아제 (phospho-ERK1/2)이다. 다양한 동물 세포 종류의 세포 용해 후 여러 가지 단백질이 섞여 있는 세포 용해물 중 표적 단백질만 인지하는 일차 면역글로불린 G를 선 처리 한 후 일차 면역글로불린 G에 결합하는 리피바디 효소 결합체를 처리하였을 때 표적 단백질만을 특이적으로 검출해내는 것을 알 수 있다.
도 8은 면역화학염색법(Immunocytochemistry)을 통해 리피바디 양자점 (quantum dot) 결합체의 표적 단백질 검출 및 이미징을 확인한 결과이다. 표적 단백질은 암세포에서 과발현 되는 상피세포성장인자 수용체 (EGFR), Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), HER2이다. 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 일차 면역글로불린 G의 처리 후 리피바디 양자점 결합체의 형광 신호를 검출 한 결과 일차 면역글로불린 G를 처리한 군에서만 형광 신호가 검출됨을 알 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 쥐 또는 토끼에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 선별하고, 이의 면역분석학적 활용도를 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 리피바디 개발을 위한 라이브러리에 포함된 폴리펩티드를 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G의 파지미드를 이용한 바이오패닝을 통해 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 선별을 수행하고, 이들의 결합력을 개선하는 작업을 수행하였다. 그 결과 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G에 특이적인 폴리펩티드를 제조하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G와 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 폴리펩티드를 개발하기 위하여, 인터날린 B (Internalin B) 단백질의 Ｎ-말단, 가변 림프구 수용체(Variable Lymphocyte Receptor, VLR) 의 LRR (Leucine-rich repeat) 단백질 부분이 융합된, 폴리펩티드의 반복 모듈을 무작위적으로 포함하는 라이브러리를 구축하였다. 상기 토끼의 면역글로불린 G에 결합하는 리피바디 개발을 위한 라이브러리에 포함된 폴리펩티드는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되거나 또는 해당 폴리뉴클레오티드 서열과 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩될 수 있다. 상기 쥐의 면역글로불린 G에 결합하는 리피바디 개발을 위한 라이브러리에 포함된 폴리펩티드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되거나 또는 해당 폴리뉴클레오티드 서열과 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩될 수 있다.
또한, 상기 라이브러리는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 파지미드의 형태가 될 수 있다. 본 발명의 용어 "파지미드"란, 대장균을 숙주로 하는 바이러스인 파지로 부터 유래된 원형의 폴리뉴클레오티드 분자를 의미하는데, 번식과 증식에 필요한 단백질 및 표면 단백질들의 서열이 포함되어 있다. 재조합 파지미드는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 파지미드는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있고, 주로 원하는 단백질을 파지의 표면 단백질과 융합하여 파지 표면에 표지하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 파지미드의 프로모터는 주로 유도성이며, 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수도 있다. 본 발명의 목적상 상기 파지미드는 상기 라이브러리를 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현 및 분비하기 위한 신호 서열 또는 리더 서열인 MalEss, DsbAss 또는 PelBss를 포함하고, 파지의 표면에 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위한 히스티딘-태그와 파지 표면으로의 발현을 위한 M13 파지의 표면 단백질의 일종인 gp3 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명자의 선행 특허 (제10-2012-0019927호)에 기술된 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명자들은 상기 파지미드를 포함하는 서열번호 1에 해당하는 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 토끼의 면역글로불린 G에 대한 결합력이 우수한 리피바디 형태의 신규한 폴리펩티드(서열번호 3)를 선별하였다. 상기 파지미드를 포함하는 서열번호 2에 해당하는 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 쥐의 면역글로불린 G에 대한 결합력이 우수한 리피바디 형태의 신규한 폴리펩티드(서열번호 4 내지 6)를 선별하였다(도 1 내지 도 2).
이후, 토끼의 면역글로불린 G에 대한 결합력을 증대시키기 위하여 위치지정 돌연변이(site directed mutagenesis)를 수행한 결과 결합력이 증대된 신규한 폴리펩티드(서열번호 7 내지 12)를 선별하였다. 또한, 쥐의 면역글로불린 G에 대한 결합력을 증대시키기 위하여 위치지정 돌연변이(site directed mutagenesis)를 수행한 결과 결합력이 증대된 신규한 폴리펩티드(서열번호 13 내지 15)를 선별하여, 그 결합력이 매우 높은 것을 확인할 수 있었다(도 3 내지 도 4).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 3 및 7 내지 12 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되고, 토끼의 면역글로불린 G에 선택적으로 결합하는 리피바디(repebody)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 4 내지 6 및 13 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되고, 쥐의 면역글로불린 G에 선택적으로 결합하는 리피바디(repebody)에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "리피바디(Repebody)"란, LRR 구조를 갖는 인터날린의 N-말단과 VLR 구조의 유사성을 바탕으로 융합하여 컨센서스 디자인으로 최적화시킨 폴리펩티드이다. 리피바디 단백질은 구조상 오목한 지역(concave)과 볼록한 지역(convex)으로 나누어 질 수 있다 (도 1 내지 도 2). 여기서 오목한 지역은 서열의 다양성이 높으며 단백질 상호작용에 중요한 부위로 알려져 있다. 이와 반대로 볼록한 지역은 보존성이 높은 서열을 바탕으로 단백질의 전체구조를 안정하게 유지하는 역할을 수행한다. 리피바디 단백질은 반복 모듈을 갖는 LRR 패밀리에 속하는 모든 단백질을 상기 방법으로 수용성 발현 및 단백질의 생물리화학적 성질을 향상 시킨 융합 LRR 패밀리 단백질을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "가변 림프구 수용체(Variable Lymphocyte Receptor, VLR)"란, 먹장어와 칠성장어에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종을 의미하는데, 먹장어와 칠성장어에서 발현되는 면역 기능 단백질로 다양한 항원 물질에 결합할 수 있는 골격으로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 인터날린 B 단백질의 N-말단 및 VLR 단백질이 융합된 폴리펩티드는 인터날린 B 단백질이 융합되지 않은 VLR 단백질보다 수용성 및 발현양이 증가하므로, 이를 기반으로 한 신규 단백질 치료제 제조에 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "LRR(Leucine Rich Repeat) 단백질"이란, 루이신이 일정한 위치에 반복되는 모듈의 조합으로 이루어진 단백질을 의미하는 것으로, (i) 하나 이상의 LRR 반복 모듈을 갖고 있고, (ii) 상기 LRR 반복 모듈은 20 내지 30개의 아미노산으로 이루어져 있고, (iii) LRR 반복 모듈은 보존 패턴으로 "LxxLxxLxLxxN"을 갖고 있으며, 여기서 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산을, N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌을, x는 임의의 아미노산을 의미하며, (iv) LRR 패밀리 단백질은 말발굽과 같은 삼차원 구조를 갖고 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 LRR 패밀리 단백질은 이미 그 서열이 알려져 있거나, 생체 내에서 새로 유도된 mRNA나 cDNA를 이용하여 찾아낸 것과 더불어 컨센서스 디자인(consensus design) 등의 설계를 통하여 자연계에 알려지지 않은 서열을 가지면서 반복모듈의 골격 구조가 있는 변이체를 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "인터날린 B 단백질"이란, 리스테리아(Listeria) 균주에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종으로, 다른 소수성 코어가 전 분자에 걸쳐서 일정하게 분포되어 있는 다른 LRR 패밀리 단백질들과는 상이한 N-말단 구조를 가지고 있어 미생물에서도 안정적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 이러한 인터날린 단백질의 N-말단은 반복 모듈의 접힘(folding)에 가장 중요한 N-말단 부위가 미생물 유래일 뿐만 아니라 그 형태가 알파 나선을 포함하는 안정적인 모양을 가졌기에 미생물에서 LRR 패밀리 단백질들의 안정적인 발현을 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "인터날린 단백질의 N-말단"은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단을 의미하며 알파 나선형 캡핑 모티프(capping motif) 및 인터날린 단백질의 반복 모듈을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단을 제한 없이 포함하며, 그 예로 알파 나선형 캡핑 모티프인 "ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNE" 및 반복 모듈을 포함할 수 있다. 또한 반복 모듈 패턴은 "LxxLxxLxLxxN"을 포함할 수 있다. 반복 모듈 패턴 중 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 또는 트립토판; N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌, x는 임의의 친수성 아미노산을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 융합될 수 있는 LRR 패밀리 단백질의 종류에 따라 높은 구조 유사도를 갖는 N-말단이 선택될 수 있으며 결합 에너지 등의 계산을 통해 가장 안정적인 아미노산을 선택하여 해당 모듈의 아미노산의 변이가 가능하다.
본 발명의 용어, "면역글로불린 G (IgG)"는 혈청 등의 체액 중에 함유되는 항체활성을 갖는 글로불린 단백질의 한 종류로 면역글로불린의 약 70%를 차지하고 있다. 분자량은 약 160,000인 당단백질로서, 분자모형은 Y자형이고 2개의 상단이 항원과 결합하고 하단 (Fc 부분)은 항원과 결합하는 항체가 보체나 세포와 결합하여 생물활성을 가지도록 하며 전반적인 면역반응에 관여하여 독소나 바이러스의 중화, 침강, 응집반응이 일어나도록 한다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 서열번호 3 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 상기 폴리뉴클레오티드와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질 전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pET-21a, pET-32a 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pET-21a, pET-32a 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "재조합 미생물"이란, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 세포를 의미하며, 진핵세포, 원핵세포 등의 모든 세포가 될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 숙주세포는 특별히 제한되는 것이 아니나, 바람직하게는 대장균을 숙주 세포로 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 대장균 BL21(DE3), OrigamiB(DE3)를 숙주 세포로 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"이란, 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질 전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (Expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (ⅰ) 상기 재조합 미생물을 배양하여 리피바디를 발현시키는 단계; 및 (ⅱ) 상기 발현된 리피바디를 회수하는 단계를 포함하는 리피바디의 생산 방법에 관한 것이다.
상기 방법에 있어서, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 상기 폴리펩티드는 배지중으로 분비되거나 세포내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 폴리펩티드를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 리피바디를 회수할 수 있다.
한편, 본 발명의 리피바디를 이용할 경우, 다양한 면역분석법 및 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G의 정제에 활용될 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 리피바디-효소 결합체 또는 리피바디-양자점 결합체 제조한 후, 이를 면역분석법에 활용한 결과, 기존의 이차 면역글로불린 G-효소 복합체 또는 이차 면역글로불린 G-양자점 결합체 보다 탁월하게 뛰어난 정확도 및 민감도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 5 내지 도 8).
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (i) 본 발명에 따른 리피바디를 흡착시킨 컬럼에 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G 항체를 함유하는 혼합물을 처리하는 단계; 및 (ii) 상기 단계 (i)의 컬럼에 부착된 항체를 용출하는 단계를 포함하는 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G 항체의 정제방법에 관한 것이다.
이때, 단계 (i)에서 리피바디를 컬럼에 직접적으로 흡착시키는 대신에, 리피바디가 부착된 비드를 컬럼에 패킹할 수도 있다. 상기 본 발명에 따른 리피바디는 토끼의 경우에는 서열번호 3 및 7 내지 12의 아미노산 서열 중 하나일 수 있고, 쥐의 경우에는 서열번호 4 내지 6 및 13 내지 15의 아미노산 서열 중 하나 일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (i) 본 발명에 따른 리피바디를 고체기판에 부착하는 표면처리 단계; 및 (ii) 상기 표면처리된 고체기판에 면역글로불린 G를 결합시키는 단계를 포함하는 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G의 고정화 방법에 관한 것이다. 상기 본 발명에 따른 리피바디는 토끼의 경우에는 서열번호 3 및 7 내지 12의 아미노산 서열 중 하나일 수 있고, 쥐의 경우에는 서열번호 4 내지 6 및 13 내지 15의 아미노산 서열 중 하나 일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 고체기판은 CM-5 Au 센서 칩, 자성미세입자, 유리판, 금나노입자, PLGA 등 생분해성 유기 고분자나노입자 또는 각종 (미세)웰플레이트[(micro)well plate]으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 면역글로불린 G는 인간인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 (i) 단계에서의 표면처리에 의하여 고체기판은 배향성이 조절되도록 단백질을 결합할 수 있으며, 고체기판 표면의 균일성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 리피바디를 이용한 면역글로불린 G의 고정화 방법은 기존의 항체결합 단백질(단백질A, 단백질G, 단백질A/G 또는 단백질 L)을 사용한 방법에 비해 물리·화학적으로 안정하며, 그 용도가 매우 광범위할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 기존의 저분자 화합물 또는 protein A를 사용한 방법에 비해 경제적임을 그 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 리피바디로 표면처리된 고체기판에 상기 리피바디를 매개로 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G가 고정된 면역센서에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 면역센서에 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G에 대한 결합능을 갖는 물질을 함유하는 시료를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 면역센서의 결합유무를 확인하는 단계를 포함하는 본 발명의 리피바디를 이용하여 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G에 대한 결합능을 가지는 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 면역센서는 고체기판에 면역글로불린 G의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 리피바디로 표면처리한 후 검출하고자 하는 면역글로불린 G를 고정화함으로써 수득할 수 있다. 상기 면역센서를 이용한 항원-항체 반응을 이용한 결합유무의 확인은 고체기판의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 상기 고체기판이 자성미세입자인 경우 상기 자성미세입자 자체를 완충용액에서 끓인 후, PAGE 방법으로 측정할 수 있다. 아울러, 상기 고체기판이 유리판인 경우 형광 표지된 면역글로불린 G를 리피바디에 처리함으로써 형광을 측정하여 측정할 수 있다. 또한, 효소-면역글로불린 G 복합체를 처리하여, 효소 반응에 의해 색의 전개가 관찰되는 육안 검출법 또는 반사광 또는 투과광이 흡광도의 변화를 측정하는 분광학적 검출법 및 항원-항체 반응 생성물에 의해 간접적으로 발생된 전류 또는 전위를 측정하는 전기화학적 방법으로도 검출할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 리피바디를 포함하고, 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G의 ELISA용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, ELISA용 조성물은 효소와 결합된 항체를 이용하여 목적하는 표적물질의 검출 또는 정량분석을 수행하기 위하여 사용되는데, 상업적으로 판매되는 ELISA용 조성물은 민감도 및 특이도를 향상시키기 위하여 대체로 샌드위치 ELISA용 조성물의 형태로 제조된다. 상기 샌드위치 ELISA용 조성물은 표적물질에 결합할 수 있는 두 종류의 항체를 포함하는데, 하나는 고정화기판에 결합된 형태이고, 다른 하나는 효소와 결합되어 발색반응을 수행하기 위하여 사용된다.
상기 샌드위치 ELISA용 조성물을 사용하는 방법은, 항체가 결합된 고정화기판에 시료를 가하여 시료에 존재하는 항원을 상기 기판에 결합된 항체에 결합시켜 기판-항체-항원 복합체를 형성한 다음, 상기 기판에 발색반응을 수행하는 효소가 결합된 다른 항체를 가하여 반응시켜서 기판-항체-항원-항체-효소의 복합체를 형성하고, 이에 상기 효소에 의해 발색되는 기질을 가하여 반응시키고, 상기 기질로부터 발색여부를 확인하거나 또는 발색수준을 측정함으로써, 상기 시료에 목적하는 항원(표적물질)이 존재하는 지 또는 상기 항원의 양이 얼마나 되는지를 확인하게 된다. 만일, 상기 시료에 목적하는 항원이 없다면, 기판-항체-항원-항체-효소의 복합체가 형성되지 않으므로, 상기 기질을 가하여도 발색반응이 일어나지 않는다.
종래의 ELISA용 조성물에서는 HRP가 직접적으로 결합된 항체를 사용할 수 없는데, 약 44kDa의 크기를 갖는 HRP를 100 내지 200kDa의 항체에 직접 결합시키면, HRP로 인하여 항체의 구조가 변화되어 정상적인 항체의 기능을 수행할 수 없기 때문이다. 따라서, 종래의 ELISA용 조성물은 HRP가 결합된 2차 항체를 사용하거나 또는 바이오틴-스트렙타비딘 링커를 이용하여 간접적으로 HRP가 결합된 항체를 포함하도록 제작되어, 시간과 비용이 많이 드는 단점이 있었다.
이에 반하여, 본 발명의 ELISA용 조성물은 HRP와 직접적으로 결합한 형태의 리피바디를 사용할 수 있는데, 약 29kDa의 크기를 갖는 리피바디는 44kDa의 상대적으로 거대한 크기를 갖는 HRP가 결합되어도 표적물질과의 결합력에 영향을 받지 않기 때문이다. 따라서, 본 발명의 ELISA용 조성물은 특이도와 민감도가 뛰어날 뿐만 아니라, HRP가 직접적으로 결합된 리피바디를 포함하여 그 제작이 간편하다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 리피바디를 포함하고, 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G의 웨스턴 블로팅(Western Blotting)용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 웨스턴 블로팅(western blotting)은 여러 단백질 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 찾아내는 기법으로서, 세포나 조직으로부터 추출한 단백질을 샘플 버퍼(sample buffer)와 섞어 아크릴아미드(acrylamide)로 만든 분자체(molecular sieve)에 올려놓고 전기영동을 하면 샘플 버퍼에 들어있던 SDS(sodium dodecylsulfate, SDS-page)라는 물질이 단백질 전체에 (-) 전기를 띠게 해서 (+) 전기 쪽으로 단백질이 끌려가게 된다. 이때 분자체가 단백질의 진행을 방해하여 작은 분자는 빨리, 큰분자는 느리게 이동하여 여러 크기의 밴드(band)를 형성하게 되는데, 이때 크기에 따라 분리된 젤(gel)위에 멤브레인을 올려놓고 전기를 흘려주면 단백질은 분리된 상태로 멤브레인에 옮겨진다. 여기서 검출하고자 하는 특정 단백질에 대한 일차 항체(primary antibody)를 결합시키고 다시 그 항체에 특이적인 2차 항체(secondary antibody)를 결합시켜 발색 내지는 형광에 의해 나타나는 반응을 X-ray로 이미지화하는 방법을 의미한다. 일반적으로 2차 항체는 면역글로불린 G에 대한 항체를 주로 사용하나, 본 발명에 따른 리피바디를 대신 사용할 경우, 민감도와 특이성이 뛰어나고, 제작이 간편한 장점을 가질 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 형광물질이 결합한 본 발명에 따른 리피바디를 포함하고, 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G의 면역화학염색용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 면역화학 염색법은 항원에 대한 일차 항체를 반응시켜 붙인 다음 직접 효소가 붙은 이차 항체를 붙이고 효소의 기질액을 반응시켜 발색을 시키거나, 바이오틴이 붙은 이차항체를 반응 시키고 이후에 바이오틴과 강력하게 붙는 성질이 있는 아비딘에 효소가 달라붙어있는 시약을 반응 시키고(ABC 법) 이후에 이 효소에 대한 기질액을 반응시켜서 색깔을 발색시켜 현미경하에서 원래 항원의 존재를 관찰하는 방법을 의미한다. 이와 같은 방법은 효소의 반응 정도를 결정짓는 여러 가지 요소들에 의해 최종 발색 정도가 달라지고 특히 가장 흔히 이용되고 있는 ABC 법에서는 여러 단계를 거쳐서 염색하므로 원래 존재하는 항원은 여러 단계로 증폭되어 선명한 색깔의 발색을 얻게 되나 이 모든 단계들이 최종 발색농도에 영향을 미치기 때문에 조직 내 항원 양을 정량적으로 알고자하는 원래의 목적을 이루기에는 부족함이 있는 반면, 본 발명에 따른 리피바디를 포함하는 면역화학염색용 조성물은 이차항체 대신 면역글로불린 G에 특이적으로 결합하고, 형광물질이 결합한 리피바디를 이용하여, 민감도와 정확도가 높고, 간단하게 면역조직화학 염색을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형광물질은 형광염료, 테트라시스테인 형광성 모티프(tetracystein motif) 형광 단백질, 형광 나노입자 또는 양자점(quantum dot)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 파지 디스플레이를 이용한 쥐와 토끼의 면역글로불린 G 특이적 결합 리피바디 선별을 위한 라이브러리 구축
토끼의 면역글로불린 G에 특이적으로 결합하는 리피바디 선별을 위해 선행특허 (제10-2012-0019927호)에서 이미 구축한 라이브러리 파지를 이용하여 파지 디스플레이를 수행하였다 (도 1). 쥐의 면역글로불린 G에 특이적으로 결합하는 리피바디 선별을 위해 선행특허 (제10-2013-0081009호)에서 개발된 사람 면역글로불린 G에 결합하는 리피바디의 폴리펩티드 서열을 기반으로 카르복실기말단 방향에 위치한 여섯 아미노산 잔기 240, 241, 242, 243, 244 그리고 255번을 선택하였다 (도 2). 도 1과 도 2는 무작위적인 라이브러리를 구축하고자 하는 아미노산 잔기들을 표시한 전체 구조를 나타내는 개략도이다.
상기 선택한 아미노산을 NNK 동의코돈 (degenerate codon)으로 치환하도록, 라이브러리 구축을 위한 돌연변이 유발 프라이머 (mutagenic primer)를 합성하였다.
이어, 상기 프라이머들을 이용하여 두 모듈에 대한 겹침 중합효소 연쇄 반응 (overlap PCR)을 수행하며 라이브러리 DNA를 수득하고, 본 발명자의 선행 특허 (제10-2012-0019927호)에 기술된 서열번호 2의 파지미드 pBEL118M에 삽입하여 최종적인 라이브러리 파지미드를 확보하였다.
상기 확보된 라이브러리를 전기천공법 (electroporation)으로 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질전환체를 수득함으로써, 1.0x108 수준의 다양성을 갖는 라이브러리를 구축하였다.
실시예 2: 리피바디 라이브러리의 패닝 과정을 통한 쥐와 토끼의 면역글로불린 G와 결합하는 폴리펩티드 선별
실시예 1에서 구축한 라이브러리를 사용하여 쥐와 토끼의 면역글로불린 G에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 선별하여 정제하였다. 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G와 결합할 수 있는 후보를 선별하기 위하여, 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G를 면역튜브 (Immuno-tube)에 30 ㎍/㎖의 농도로 가하고, 4 ℃에서 12시간동안 코팅하였다. 상기 코팅된 면역튜브를 PBS로 1회 세척하고, 1% BSA와 0.05 % Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBSA)으로 4 ℃에서 2시간동안 블로킹 (Blocking) 하였다. 그런 다음, 상기 정제된 파지를 1012 cfu/ml의 농도로 상기 코팅된 면역튜브에 가하고, 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBS)으로 총 2분간 5번씩 세척하였다. 마지막으로, 1 ml 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2)를 상기 면역튜브에 가하고, 상온에서 12분간 반응시킴으로써, 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 G와 결합할 수 있는 리피바디 후보를 표면에 발현시킨 파지를 용출시켰다. 상기 용출액에 60 ㎕의 1.0 M Tris-HCl (pH 9.0)를 가하여 중화시키고, 숙주세포인 10 ml 대장균 XL1-Blue 용액 (OD600 = 0.5)에 가한 다음, 2xYT 플레이트에 도말하는 바이오패닝 (Bio-panning) 과정을 동일하게 5회 반복하여 수행하였다.
그 결과, 각 패닝 과정을 통해 쥐와 토끼의 면역글로불린 G와 특이적으로 결합하는 파지가 농축됨을 확인하였다. 상기 결과는 쥐와 토끼의 면역글로불린 G와 결합하는 라이브러리 파지가 특이적으로 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 3: 선별된 리피바디의 쥐와 토끼의 면역글로불린 G에 대한 특이적인 결합여부 확인 및 서열 분석
실시예 2의 방법을 통하여 선별한 파지를 쥐와 토끼의 면역글로불린 G와 BSA가 코팅된 96-웰 플레이트를 이용하여 ELISA를 수행하였다. 먼저 토끼의 면역글로불린 G에 결합하는 리피바디를 선별하기 위해 BSA 대비 토끼의 면역글로불린 G의 흡광도(OD450)가 10배 이상 높은 41개의 리피바디 후보들을 선별하고, 이들 각각의 아미노산 서열을 확인한 결과, 상기 선별된 파지에서 모두 같은 서열을 갖는 1 종류의 리피바디 서열을 확인하였다(서열번호 3).
쥐의 면역글로불린 G에 결합하는 리피바디를 선별하기 위해 BSA 대비 쥐의 면역글로불린 G의 흡광도(OD450)가 4배 이상 높은 4개의 리피바디 후보들을 선별하고, 이들 각각의 아미노산 서열을 확인한 후, 동일한 아미노산 서열을 갖는 클론을 제외하였다. 그 결과, 상기 선별된 파지에서 총 3 종류의 리피바디 서열을 확인하였다(서열번호 4 내지 6).
실시예 4: 리피바디의 결합력 증가를 위한 모듈 기반 친화력 증대 방법 수행
다양한 면역분석법에 사용하기 위해서 기존 이차 면역글로불린 G의 일차 면역글로불린 G에 대한 결합력과 비슷한 수준을 갖는 리피바디 개량이 필요하다. 따라서 결합력이 증대된 리피바디를 확보하기 위해 선행특허 (제10-2012-0019927호)에서 구축한 모듈 기반 친화력 증대 기술을 사용하였다. 우선, 상기 실시예 3에서 선별된 토끼의 면역글로불린 G에 결합하는 E2 리피바디의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레이도타이드 서열을 기반으로 첫 번째 라이브러리와 인접한 모듈 (LRRV5, LRRVE)을 선택하여 상기 선행특허 실시예 2와 동일한 방식으로 오목한 지역의 6개 잔기를 돌연변이 시켰다. 다시 총 다섯 번의 패닝 과정을 거쳐 결합력이 증대된 총 6가지 리피바디 클론들을 확보하였고, ITC를 통해 해리상수를 측정한 결과 최종적으로 74 nM 수준의 가장 높은 결합력을 가지는 E2 리피바디를 확보하였다 (도 3).
다음으로, 실시예 3에서 선별된 쥐의 면역글로불린 G에 결합하는 리피바디 총 3가지 클론 중 H12 리피바디의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 기반으로 리피바디 아미노말단 지역의 두 모듈 (LRR1, LRRV2)을 선택하여 상기 선행특허 실시예 2와 동일한 방식으로 오목한 지역의 6개 잔기를 돌연변이 시켰다. 다시 총 다섯 번의 패닝 과정을 거쳐 결합력이 증대된 총 3가지 리피바디 클론들을 확보하였고, ITC를 통해 해리상수를 측정한 결과, A6 리피바디가 16nM 수준으로 가장 높은 결합력을 가지는 것을 확인하였다 (도 4).
실시예 5: 선별된 리피바디의 기존 이차 면역글로불린 G 대체 가능성 분석
실시예 4에서 확보한 2종류의 리피바디와 함께 선행특허 (제10-2013-0081009호)에서 개발한 사람 면역글로불린 G에 결합하는 F4 리피바디를 이용하여 사람, 쥐, 토끼의 면역글로불린 G에 결합하는 기존 이차 면역글로불린 G 대체 가능성을 분석하기 위해, 기존 이차 면역글로불린 G의 단점이었던 비특이적 결합에 의한 신호 검출 및 교차 반응 여부를 Fluorescence ELISA를 통해 확인하였다. 사람, 쥐, 토끼의 면역글로불린 G를 30 ㎍/㎖으로 96-웰 플레이트에 코팅하여 4 ℃에서 10시간 보관하였다. 이후 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBS)으로 1번 세척하였다. 485 nm에서 에너지를 흡수하여 510 nm에서 빛을 방출하는 형광 표지자인 NHS-Fluorescein(NHS-FITC)을 리피바디의 일차 아민기에 결합시켜 리피바디 형광 표지자 결합체(repebody-FITC)를 제작한 후, 10 ㎍/㎖ 의 동일 농도로 상기 코팅된 96-웰 플레이트에 처리하였다. 상온에서 1시간 반응 후 TPBS로 3번 세척하였다.
리피바디 형광 표지자 결합체의 발광 정도를 측정한 결과, F4-FITC는 사람의 면역글로불린 G에서만, A6-FITC는 쥐의 면역글로불린 G에서만, E2-FITC는 토끼의 면역글로불린 G에서만 형광 값을 나타내는 것을 확인하였다 (도 5). 이는 선별된 리피바디가 기존 이차 면역글로불린 G의 비특이적 반응 및 교차반응에 의한 검출 한계를 극복하고 특이적으로 각 동물 종의 면역글로불린 G에만 결합하는 것을 알 수 있으며 기존 이차 면역글로불린 G 대체 가능성하다는 것을 의미한다.
실시예 6: 선별한 리피바디의 ELISA 분석에서의 활용능력 검증
선별한 리피바디를 이용하여 실제 ELISA에 적용하고, 기존 이차 면역글로불린 G와 동일한 조건으로 처리하였을 때 표적 단백질 검출 능력을 비교하는 실험을 수행하였다. 검출을 위한 표지자로 효소를 리피바디에 결합하는 실험을 선행하여 리피바디 효소 결합체 (repebody-HRP)를 제작하였고 결합체 효율은 90% 이상 수득률을 확보하였다. ELISA 실험을 위해 사람, 쥐, 토끼의 면역글로불린 G를 0~30 ㎍/㎖으로 다양한 농도 구간을 설정하여 96-웰 플레이트에 코팅하여 4 ℃에서 10시간 보관하였다. 이후 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBS)으로 1번 세척하였다. F4-HRP, A6-HRP, E2-HRP 및 기존 이차 면역글로불린 G-HRP를 0.5 ㎍/㎖으로 상기 코팅된 플레이트에 처리하였다. 상온에서 1시간 반응 후 TPBS로 1번 세척 후 HRP의 기질인 Tetramethylbenzidine (TMB)를 처리하였고, 반응을 중지하기 위해 황산을 처리하여 형광 값을 측정하였다.
그 결과 기존 이차 면역글로불린 G와 동등한 수준으로 최소 100 ng/ml 까지 사람, 쥐, 토끼의 면역글로불린 G를 검출하는 것을 확인하였다 (도 6). 이는 실제 사용되는 일차 면역글로불린 G의 농도 1~10 ㎍/㎖의 100배 이상 낮은 농도도 검출 할 수 있는 우수한 능력임을 알 수 있다.
실시예 7: 선별한 리피바디의 western blot에서 활용능력 검증
선별한 리피바디를 이용하여 실제 western blot에 적용하여 복잡한 세포 용해물 중 표적 단백질만을 특이적으로 검출하는 능력을 평가하는 실험을 수행하였다. 우선, 사람 면역글로불린 G에 결합하는 F4-HRP의 검출 능력을 확인하였다. 사람 유방암 세포 (MDA-MB-231, SK-Br-3)를 용해 후 용액에 녹아 있는 다양하고 복잡한 단백질 중 HER2를 검출하기 위해 20 ㎍의 세포 용해물을 SDS-PAGE을 통해 단백질의 크기 별로 분리하였고, HER2에 특이적으로 결합하는 일차 사람 면역글로불린 G인 1 ㎍/㎖의 Herceptin을 처리하였다. 상온에서 1시간 반응 후 TPBS로 3번 세척하였다. 이후 2 ㎍/㎖의 F4-HRP를 처리하여 상온에서 1시간 반응 후 TPBS로 3번 세척하였다. 기질을 처리하여 chemiluminescent 신호를 검출한 결과 HER2만을 특이적으로 결합하여 신호가 검출되는 것을 확인하였다(도 7).
다음으로 쥐의 면역글로불린 G에 결합하는 A6-HRP의 검출 능력을 확인하였다. 다양한 종류의 동물 암세포 A431, HeLa, Panc-1, HT-29, U2OS의 세포 용출액 중 β-actin을 검출하기 위해 20 ㎍의 세포 용해물을 SDS-PAGE을 통해 단백질의 크기 별로 분리하였고, β-actin에 특이적으로 결합하는 일차 쥐 면역글로불린 G인 0.2 ㎍/㎖의 anti-β-actin mouse IgG을 처리하였다. 상온에서 1시간 반응 후 TPBS로 3번 세척하였다. 이후 0.5 ㎍/㎖의 A6-HRP를 처리하여 상온에서 1시간 반응 후 TPBS로 3번 세척하였다. 기질을 처리하여 chemiluminescent 신호를 검출한 결과 β-actin만을 특이적으로 결합하여 신호가 검출되는 것을 확인하였다 (도 7).
마지막으로 토끼의 면역글로불린 G에 결합하는 E2-HRP의 검출 능력을 확인하였다. 다양한 종류의 동물 암세포 HeLa, Panc-1, HCC827의 세포 용출액 중 인산화 키나아제 (phospho-ERK1/2)을 검출하기 위해 20 ㎍의 세포 용해물을 SDS-PAGE을 통해 단백질의 크기 별로 분리하였고, phospho-ERK1/2에 특이적으로 결합하는 일차 토끼 면역글로불린 G인 1 ㎍/㎖의 anti-phospho-ERK1/2 rabbit IgG을 처리하였다. 상온에서 1시간 반응 후 TPBS로 3번 세척하였다. 이후 2 ㎍/㎖의 E2-HRP를 처리하여 상온에서 1시간 반응 후 TPBS로 3번 세척하였다. 기질을 처리하여 chemiluminescent 신호를 검출한 결과 phospho-ERK1/2만을 특이적으로 결합하여 신호가 검출되는 것을 확인하였다 (도 7).
실시예 8: 선별한 리피바디의 immunocytochemistry에서 활용능력 검증
면역화학염색법(Immunocytochemistry)을 통해 리피바디 양자점 (quantum dot) 결합체(repebody-QD)의 표적 단백질 검출 및 세포 이미징을 수행한 결과이다. 표적 단백질은 암세포에서 과발현 되는 상피세포성장인자 수용체 (EGFR), Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), HER2이다. F4-QD, A6-QD, E2-QD를 만들기 위해 카르복시기가 노출된 QD와 리피바디의 일차 아민그룹을 결합시키는 NHS/EDC 링커를 도입하여 결합체를 제작하였다. 결합체 수득률은 99%로 매우 높은 효율로 결합체를 확보하였다. 이 때 QD는 525 nm 파장 대에서 초록을 발광하는 것으로 사용하였다.
세포 배양액(RPMI-1640)에 존재하는 상기 동물 세포를 8-웰 세포 배양 챔버에 48시간 배양하여 표면에 부착한 후, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 일차 면역글로불린 G인 2 ㎍의 Cetuximab, anti-EpCAM mouse IgG, anti-HER2 rabbit IgG의 처리 후 4도씨에서 1시간 동안 결합시켰다. 이후 DPBS로 2번 세척한 후 20 nM의 F4-QD, A6-QD, E2-QD를 처리 후 4도씨에서 1시간 동안 결합시켰다. 이후 DPBS로 2번 세척한 후 핵 염색 및 슬라이드 글라스 부착을 위해 DAPI 용액을 떨어트려 주었다. 컨포칼 현미경을 이용하여 표적 단백질에 결합된 repebody-QD의 형광 신호를 검출 한 결과 일차 면역글로불린 G를 처리한 군에서만 형광 신호가 검출되는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 5 내지 8에서 확인한 리피바디의 면역분석법 적용 실험 결과 기존 이차 면역글로불린 G의 비특이적 반응, 교차 반응에 따른 검출 한계 및 높은 생산 단가 등의 단점들을 극복하고, 표적 단백질에 대한 결합이 특이적이며 교차 반응이 현저히 낮음을 알 수 있고 대장균에서 대량 생산이 가능하다는 점에서 고가의 생산 단가를 기존 이차 면역글로불린 G의 10분의 1로 낮출 수 있는 신규하고 혁신적인 단백질이다. 이의 용도로서 다양한 면역분석법에 적용하였을 때 충분한 표적 단백질 검출 능력을 보여줌으로써 면역 센서/면역 칩 및 약물전달용 표적지향형 DDS 수송체 및 생물학적 의약품 제조에 활용이 가능하다는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Novel polypeptide selective binding with mouse immunoglobulin G or rabbit immunoglobulin G and uses thereof <130> P16-B009 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 798 <212> DNA <213> Repebody-Libraray1 <220> <221> misc_feature <222> (139)..(140) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (145)..(146) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (148)..(149) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (205)..(206) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (211)..(212) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (214)..(215) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg accagatcnn kgcgnnknnk tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtta cctgnnkctg nnknnkaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg attctgaccg gtaaccaact gcagagcctg 300 ccgaatggcg tctttgataa actgacgaac ctgaaagaac tggtgctggt tgaaaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggacgg tgtcttcgat aaactgacca acctgacgta cctgaatctg 420 gctcacaacc aactgcagag tctgccgaaa ggcgtgtttg acaaactgac caatctgacg 480 gaactggatc tgtcctataa ccaactgcag tcactgccgg aaggtgtttt cgacaaactg 540 acccagctga aagatctgcg cctgtaccag aatcagctga aatcggtccc ggacggcgtg 600 tttgatcgtc tgaccagcct gcagtatatc tggctgcatg ataacccgtg ggattgcacc 660 tgtccgggta ttcgctacct gtctgaatgg atcaataaac acagtggcgt tgtccgtaac 720 tccgcgggtt cagttgcccc ggattcggcg aaatgctccg gcagcggtaa accggtgcgt 780 agcattattt gcccgacc 798 <210> 2 <211> 798 <212> DNA <213> Repebody-Libraray2 <220> <221> misc_feature <222> (718)..(719) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (721)..(722) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (724)..(725) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (727)..(728) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (730)..(731) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (733)..(734) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg accagatcat tgcgaataac tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtta cctggccctg ggtggcaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg attctgaccg gtaaccaact gcagagcctg 300 ccgaatggcg tctttgataa actgacgaac ctgaaagaac tggtgctggt tgaaaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggacgg tgtcttcgat aaactgacca acctgacgta cctgaatctg 420 gctcacaacc aactgcagag tctgccgaaa ggcgtgtttg acaaactgac caatctgacg 480 gaactggatc tgtcctataa ccaactgcag tcactgccgg aaggtgtttt cgacaaactg 540 acccagctga aagatctgcg cctgtaccag aatcagctga aatcggtccc ggacggcgtg 600 tttgatcgtc tgaccagcct gcagtatatc tggctgcatg ataacccgtg ggattgcacc 660 tgtccgggta ttcgctacct gtctgaatgg atcaataaac acagtggcgt tgtccgtnns 720 nnsnnsnnsn nsnnsgcccc ggattcggcg aaatgctccg gcagcggtaa accggtgcgt 780 agcattattt gcccgacc 798 <210> 3 <211> 266 <212> PRT <213> Repebody-E7 <400> 3 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Met Ala 35 40 45 Met Gln Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Phe Leu Phe Gln Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Ile Leu Thr Gly Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Val Leu Val Glu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr 145 150 155 160 Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265 <210> 4 <211> 266 <212> PRT <213> Repebody-rME9 <400> 4 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Glu Leu Lys Trp Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ile Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Val Leu Asn Ser Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Glu Leu Cys Gly Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Leu 225 230 235 240 Phe Thr Trp Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265 <210> 5 <211> 266 <212> PRT <213> Repebody-rMF1 <400> 5 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Glu Leu Lys Trp Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ile Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Val Leu Asn Ser Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Glu Leu Cys Gly Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Leu 225 230 235 240 His Ser Phe Pro Met Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys 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Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Leu 225 230 235 240 Met Ser Ser Leu Met Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265 <210> 7 <211> 264 <212> PRT <213> Repebody-C9 <400> 7 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Gln Leu Thr Pro Asn Gln 85 90 95 Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Pro Leu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp 115 120 125 Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln Leu Gln 130 135 140 Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu 145 150 155 160 Asp Leu Thr Ala Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp 165 170 175 Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Lys 180 185 190 Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile 195 200 205 Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr 210 215 220 Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala 225 230 235 240 Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro 245 250 255 Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 <210> 8 <211> 264 <212> PRT <213> Repebody-C10 <400> 8 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Gln Leu Thr Pro Asn Gln 85 90 95 Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Arg Thr Asn Leu Lys Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Pro Leu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp 115 120 125 Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln Leu Gln 130 135 140 Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu 145 150 155 160 Asp Leu Ser Tyr Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp 165 170 175 Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Ile Phe Asn Gln Leu Lys 180 185 190 Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile 195 200 205 Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr 210 215 220 Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala 225 230 235 240 Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro 245 250 255 Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 <210> 9 <211> 264 <212> PRT <213> Repebody-E2 <400> 9 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Gln Leu Thr Pro Asn Gln 85 90 95 Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Pro Leu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp 115 120 125 Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln Leu Gln 130 135 140 Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu 145 150 155 160 Asp Leu Gly Arg Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp 165 170 175 Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Asp Ala Asn Gln Leu Lys 180 185 190 Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile 195 200 205 Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr 210 215 220 Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala 225 230 235 240 Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro 245 250 255 Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 <210> 10 <211> 264 <212> PRT <213> Repebody-rRE9 <400> 10 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Gln Leu Thr Pro Asn Gln 85 90 95 Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Pro Leu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp 115 120 125 Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln Leu Gln 130 135 140 Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu 145 150 155 160 Asp Leu Ser Tyr Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp 165 170 175 Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Val Phe Asn Gln Leu Lys 180 185 190 Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile 195 200 205 Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr 210 215 220 Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala 225 230 235 240 Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro 245 250 255 Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 <210> 11 <211> 264 <212> PRT <213> Repebody-rRF1 <400> 11 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Gln Leu Thr Pro Asn Gln 85 90 95 Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Pro Leu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp 115 120 125 Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln Leu Gln 130 135 140 Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu 145 150 155 160 Asp Leu Thr Tyr Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp 165 170 175 Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Lys 180 185 190 Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile 195 200 205 Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr 210 215 220 Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala 225 230 235 240 Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro 245 250 255 Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 <210> 12 <211> 264 <212> PRT <213> Repebody-F10 <400> 12 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Gln Leu Thr Pro Asn Gln 85 90 95 Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Pro Leu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp 115 120 125 Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln Leu Gln 130 135 140 Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu 145 150 155 160 Asp Leu Thr Gly Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp 165 170 175 Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Lys 180 185 190 Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile 195 200 205 Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr 210 215 220 Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val 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Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265

Claims (26)

  1. 삭제
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  14. 서열번호 4 내지 6 및 13 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되고, 쥐의 면역글로불린 G에 선택적으로 결합하는 리피바디(repebody).
  15. 제14항의 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  16. 제15항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  17. 제15항의 폴리뉴클레오티드 또는 제16항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
  18. (i) 제17항의 재조합 미생물을 배양하여 리피바디를 발현시키는 단계; 및
    (ii) 상기 발현된 리피바디를 회수하는 단계를 포함하는, 서열번호 4 내지 6 및 13 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되고, 쥐의 면역글로불린 G에 선택적으로 결합하는 리피바디의 제조방법.
  19. (i) 제14항의 리피바디를 흡착시킨 컬럼에 쥐의 면역글로불린 G 항체를 함유하는 혼합물을 처리하는 단계; 및
    (ii) 상기 단계 (i)의 컬럼에 부착된 항체를 용출하는 단계를 포함하는 쥐의 면역글로불린 G 항체의 정제방법.
  20. (i) 제14항의 리피바디를 고체기판에 부착하는 표면처리 단계; 및
    (ii) 상기 표면처리된 고체기판에 면역글로불린 G를 결합시키는 단계를 포함하는 쥐의 면역글로불린 G의 고정화 방법.
  21. 제14항의 리피바디로 표면처리된 고체기판에 상기 리피바디를 매개로 쥐의 면역글로불린 G가 고정된 면역센서.
  22. 하기 단계를 포함하는, 쥐의 면역글로불린 G에 대한 결합능을 가지는 물질을 검출하는 방법:
    (a) 제21항의 면역센서에 쥐의 면역글로불린 G에 대한 결합능을 갖는 물질을 함유하는 시료를 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 면역센서의 결합유무를 확인하는 단계.
  23. 제14항의 리피바디를 포함하고, 쥐의 면역글로불린 G의 ELISA용 조성물.
  24. 제14항의 리피바디를 포함하고, 쥐의 면역글로불린 G의 웨스턴 블로팅(Western Blotting)용 조성물.
  25. 형광물질이 결합된 제14항의 리피바디를 포함하고, 쥐의 면역글로불린 G의 면역화학염색용 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 형광물질은 형광염료, 테트라시스테인 형광성 모티프(tetracystein motif) 형광 단백질, 형광 나노입자 및 양자점(quantum dot)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 면역화학염색용 조성물.
KR1020160012183A 2016-02-01 2016-02-01 쥐 또는 토끼의 면역글로불린 g에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드 및 이의 용도 KR101818152B1 (ko)

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