KR102121122B1

KR102121122B1 - 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 이용

Info

Publication number: KR102121122B1
Application number: KR1020180133189A
Authority: KR
Inventors: 민지호; 이근우; 윤지희
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2020-06-09
Also published as: KR20200050301A

Abstract

본 발명은 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 발명으로서, 자세하게는 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 가려움증 또는 알레르기 반응을 일으키는 원인 물질 중 하나인 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하여, 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 확인한 것으로서, 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질 전환된 형질전화, 이를 포함하는 히스타민 검출 및 가려움증 진단용 조성물 및 키트, 이를 포함하는 가려움증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 포함하는 가려움증 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 이용 {Peptides that specifically bind histamine and their use}

본 발명은 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 발명으로서, 자세하게는 Phage display library를 이용하여 가려움증 또는 알레르기 반응을 일으키는 원인 물질 중 하나인 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하여, 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 확인한 것으로서, 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 이를 포함하는 히스타민 검출 및 가려움증 진단용 조성물 및 키트, 이를 포함하는 가려움증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 포함하는 가려움증 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

히스타민은 생체신호 전달물히스타민은 생체신호 전달물질로서 신체 내에서 다양한 대사활동을 중재하는 역할을 한다. 이러한 히스타민은 피부 내에서 종종 과하게 분비 되어 가려움증을 유발하는데, 이를 조절하기 위하여 히스타민 수용체에 작용하여 히스타민의 결합을 막는 항히스타민을 복용하게 된다. 이러한 항히스타민은 히스타민 수용체 말고도 신체 내 다양한 수용체에 작용하여 여러 부작용을 일으킨다. 따라서 히스타민 수용체에 작용하는 게 아닌 히스타민 자체의 활성을 떨어뜨리는 방법을 이용하여 항히스타민의 부작용을 줄이고자 하였다. 예를 들어 한국공개특허번호 제 10-2018-0094915 호에서는 건선, 아토피성 피부염, 만성 두드러기, 항히스타민-내성 가려움증 및 노인성 가려움증의 치료를 위한 암보라 추출물 및 녹차 추출물을 포함하는 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허번호 제 10-2011-0026662호에는 포타스틴 살리실산염, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항히스타민 또는 항 알레르기용 약학적 조성물이 개시되어 있다.

자연계에 존재하는 생물 중 진드기의 경우 숙주동물에의 흡혈 시 숙주동물의 면역반응을 억제시키기 위하여 히스타민 결합 단백질 (히스타민 binding protein; HBP)을 분비한다. 분비된 단백질은 히스타민을 내부에 가두어 히스타민 수용체에 결합하지 못하도록 막는 특징을 가지고 있다. 하지만 HBP의 경우 사이즈가 상당히 큰 단백질이어서 대량 생산이 쉽지 않고, 시간에 따른 안정성에 문제가 있었다.

다양한 분야에서 활용되고 있는 분자진화기술 중 하나인 파지 디스플레이는 박테리오 파지의 캡시드 단백질에 외래 펩타이드와 단백질을 삽입, 융합시켜 파지 표면에 외래 단백질을 발현되도록 하는 기술로써, 펩타이드 라이브러리를 이용하여 타겟 분자에 대해서 높은 결합력을 가지는 펩타이드를 선별하는 기술이다. 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리한 특정 리간드나 펩타이드는 약물 설계 및 백신 개발에 사용될 수 있으며, 새로운 아미노산 서열을 가지는 신규 펩타이드를 발굴하고, 개량화하여 질병조기진단용으로 사용하고자 많은 연구들이 이루어지고 있다.

본 발명자들은 상기 진드기 유래 히스타민 결합 단백질의 단점을 극복하기 위해, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 히스타민을 표적으로 하여 특이적 결합력을 보이는 더 작은 크기의 히스타민 펩타이드를 선별하였고, 상기 선별된 펩타이드는 히스타민과 결합하여 히스타민 활성을 저해 하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

상기의 문제를 해결하고자, 본 발명자들은 phage display 기술을 이용하여 히스타민을 표적으로 하여 특이적 결합력을 보이는 펩타이드를 선별하였고, 상기 선별된 펩타이드는 히스타민과 결합하여 히스타민 활성을 저해 하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열ㅈ번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드를 포함하는 가려움증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드를 제공할수 있다.

본 발명자들은 히스타민에 특이적으로 결합하는상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드를 제공할 수 있다.

본 발명자들은 히스타민에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드를 개발하고자 연구하였다. 그 결과 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 발굴하였고, 상기 펩타이드를 이용하면 히스타민을 특이적으로 검출할 수 있는 것을 확인하였다 (도 2).

본 발명의 서열번호 제 1 내지 서열번호 5의 아미노산 서열은 랜덤 파지 펩타이드 라이브러리 NEB사의 Ph.D. 12 파지 라이브러리 (12 mer 길이의 펩타이드 말단을 가지는 파지 라이브러리)를 이용하여 히스타민 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열을 찾은 것이다.

펩타이드는 일반적으로 대략 아미노산 10개 전 후로 이루어지는 비교적 작은 펩타이드를 의미하고, 보다 구체적으로 본 발명에서는 상술한 펩타이드 라이브러리를 구성하는 12개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 의미한다. 본 발명에 따른 펩타이드는 항체에 비해 상대적으로 대량 생산이 용이하고, 독성이 거의 없는 장점이 있다. 또한 히스타민에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 결합시켜 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 제작한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif,1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990. 본 발명의 펩타이드는 N-말단의 아미노 말단의 반응성 제거를 위한 공지된 변성이 가능하고, 예를 들어 아세틸화(Acetylation)가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명인 펩타이드의 타겟인 히스타민은 외부자극에 대하여 신체가 빠른 방어 행위를 하기 위하여 분비하는 유기 물질 중의 하나이다. 상처가 난 곳이 붉게 부어오르며 통증을 느끼게되는 염증반응(inflammation)이 일어나게 하는 물질이다. 히스타민은 호염구, 비만세포 등에서 분비된다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공 할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 본 발명인 히스타민 표적용 펩타이드의 변화를 가져올 수도 있다. 본 발명인 펩타이드의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명인 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다. 본 발명인 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다. 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5). 펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다. 한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명인 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드 코딩용 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터를 제공할 수 있다.. 본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19 및 pET 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 퍼옥시레독신를 신속하고 용이하게 얻을 수 있다. 한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환체를 제공할 수 있다.. 본 발명의 벡터를 안정하게 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110와 같은 E.coli 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다. 숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 포함하는 히스타민 검출 또는 가려움증 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 펩타이드가 히스타민과 결합을 형성하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 링크는 본 발명의 펩타이드와 검출가능한 표지 사이에 직접 형성되는 것도 가능하지만, 링크를 통해서도 형성 가능하다. 상기 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용 가능하며, 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션에 적용될 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지된다.

상기 표지는 구체적으로 예를 들면, 발색효소에 해당하는 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)); 방사성 동위원소에 해당하는 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S; 크로모포어(chromophore); 발광물질 또는 형광물질에 해당하는 FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)일 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다. 상기 검출 가능한 표지를 포함하는 펩타이드는 각각의 표지에 대하여 종래 공지된 검출 방법을 이용하여 검출하는 것이 가능하다. 구체적으로 예를 들어 형광 신호 FITC를 표지로 이용하는 경우, 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation : 495 nm, Emission : 520 nm)에서 각 펩타이드 농도에 대한 형광세기를 측정하는 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 포함하는 히스타민 검출 또는 가려움증 진단 키트를 제공할 수 있다. 본 발명인 히스타민 검출 또는 가려움증 진단용 키트는 히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산분자를 포함할 수 있으며, 상기 펩타이드 또는 핵산분자는 앞서 기재한 바와 같이 화학적 또는 유전공학적 방법에 의해 수득된 것일 수 있다. 상기 펩타이드에 관해서는 본 발명의 다른 일 양태들에 대한 설명을 위해 상술한 바와 동일하다. 본 발명의 키트에는 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃ 유지된 상태로 제공될 수 있다. 본 발명인 히스타민 검출 또는 가려움증 진단용 키트는 기존 PCR 방법에 비하여 빠르고 편리하게 현장에서 진단이 가능하고, 히스타민의 형광 검출 키트 형태로 제공될 수 있다. 종래 공지된 다른 프로브들에 대하여 본 발명의 펩타이드를 연결하여 히스타민 대한 민감도를 증가시킬 수 있고, 히스타민만을 특이적으로 검출이 가능하며, 형광현미경을 통하여 히스타민을 이미지화하여 검출 할 수 있는 시스템의 형태로 제공될 수 있다.히스타민 검출 및 가려움증의 진단을 용이하게 하기 위하여, 발명의 검출 키트에 포함되는 펩타이드는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명인 히스타민 검출 또는 가려움증 진단용 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 검출 대상에 포함된 히스타민과의 결합여부 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 진단은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 본 발명의 진단을 실시할 수 있다. 예를 들어, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay)는 ELONA(enzyme-linked oligonucleotide assay)로 조금 변형하여 실시될 수 있다. 또한 본 발명인 진단용 키트의 펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 대상 시료를 접종하여 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 대상 시료에 포함된 히스타민과 펩타이드의 결합을 관찰함으로써 히스타민을 검출할 수 있다. 본 발명의 히스타민 검출 및 가려움증 진단용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 또한 용기는 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드를 포함하는 가려움증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드을 포함하는, 가려움증 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공 할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드을 포함하는, 가려움증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 phage display를 이용하여 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드 5종을 확인하였다. 상기 펩타이드 5종은 히스타민과 특이적으로 결합하여, 활성을 저해시키고, 나아가 피부 내 가려움증을 치료 및 개선 시키는 효과가 있다.

도 1은 phage display library를 이용한 펩타이드 선별을 위한 biopanning 과정의 모식도이다.
도 2는 히스타민에 대해 특이적으로 결합하는 펩타이드의 서열 분석을 나타낸 결과이다. 라운드간 반복되는 서열들은 따로 색상을 통해 표시하였다.
도 3은 히스타민에 대해 특이적 결합하는 펩타이드를 대상으로 binding assay이를 수행한 결과이다.

이하에서 본 발명을 더 자세하게 설명한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 히스타민의 마그네틱 비드에의 고정

본 실시예에서는 히스타민을 magnetic bead에 결합시켰으며, 결합 방법은 다음과 같다. 히스타민을 magnetic bead에 고정시키기 위하여 Dynabeads^® M-270 Carboxylic Acid (Invitrogen)을 이용하였다. 20㎕의 magnetic bead를 25mM MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 1ml을 이용하여 2회 세척한 후 자석을 이용하여 비드를 침전시켰다. 가라앉은 비드에 100mM MES 250㎕, 1,000ppm의 히스타민 100㎕를 첨가시켜 준 후, 증류수 647㎕를 더해준 뒤, 교반기를 이용하여 실온에서 30분동안 반응시켰다. 다음으로 100mg/ml EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 3㎕를 첨가해준 뒤 교반기를 이용하여 4℃에서 2시간동안 반응시켰다. 자석을 이용하여 상층 액을 제거하였다. 50mM Tris (pH 7.4) 1ml을 넣어준 뒤, 교반기를 이용하여 실온에서 15분동안 반응시켜 준 뒤 자석을 이용하여 상층 액을 제거하였다. 50mM Tris로 세척해준 뒤 상층 액을 다시 제거해주며 이 세척과정을 총 4회 반복하였다. 이렇게 얻어진 비드에 히스타민이 반응 후 고정되었으며, 이를 이용하여 파지 display 실험을 수행하였다.

실시예 2. 파지 디스플레이를 이용한 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드 선별

본 실시예에서는 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하였으며, 선별과정의 모식도는 도 1과 같고, 방법은 하기와 같다. 실시예 1에서 히스타민을 magnetic bead에 고정한 뒤, 파지 라이브러리와 혼합한 후, 상온에서 50분간 반응시켰다. 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제외한 결합이 약하거나 결합하지 않은 펩타이드를 제거하기 위하여 TBST 1ml로 총 10회 세척 하였고 세척 과정 사이에 자석을 이용하여 비드를 침전시켜 회수하였다. 결합된 펩타이드를 타겟에서 분리하기 위하여, 10^-4M의 히스타민 용액 1ml과 15분동안 반응시켜 준 후, 혼합용액을 회수하였다. 분리된 라이브러리 파지 500㎕를 파지 증폭용 재조합 균주 E.coli ER2738에 접종시킨 후, 20ml의 LB 배양액에 혼합하여 37℃에서 4.5시간동안 배양시켜 증폭하였다. 배양액을 4℃, 12,000g로 원심 분리하여 상층 액의 80%를 회수한 뒤, 20%부피의 PEG/2.5M NaCl을 혼합하여 4℃에서 15시간동안 반응시켰다. 반응시킨 후 4℃, 12,000g로 원심 분리하여 특이적 펩타이드를 포함하는 라이브러리 파지 만을 침전시켜 회수하였다. 이 후, 일련의 파지 디스플레이 라이브러리 결합 과정은 총 5회 반복되었으며, 4,5 번째 반복 과정에선 세척 과정에서 사용한 버퍼인 TBST의 계면활성제 농도를 높여서, 표적물질인 히스타민과 더욱 특이적으로 결합하는 펩타이드를 얻고자 하였다.

실시예 3. 선별된 라이브러리 파지의 전체 DNA 추출

특이적 펩타이드 선별을 위하여 2 내지 5 라운드 각각에 해당되는 라이브러리 파지를 20개 회수하였으며, 회수한 특이적 펩타이드를 포함하는 라이브러리 파지 내에서 파지 DNA를 추출하기 위한 방법은 다음과 같다. E. coli ER2738을 하룻밤 동안 배양 한 후, 1ml의 LB 배양액에 1:100의 비율로 접종한 뒤 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 후, 14000 rpm으로 1분간 원심 분리하여 숙주인 E. coli 를 제거해준 뒤 파지가 포함된 상층 액 500 ㎕와 20% PEG/2.5M NaCl buffer 200㎕ 와 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켰다. 반응 액을 14000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심 분리하여 상층 액을 제거하고 파지만을 분리하였다. 원심분리를 통해 얻은 파지는 ethanol을 이용하여 외막 단백질을 제거하고 순수한 파지 DNA만을 획득하는 세척 과정을 수행하였다. 획득한 DNA에 Iodide buffer 100 ㎕를 첨가하여 혼합해주고 200 ㎕ 에탄올을 첨가해 15분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 액을 14000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심 분리하여 상층 액을 제거하고 500 ㎕ 70% ethanol로 펩타이드를 세척해준 다음, 한 번 더 원심 분리하여 상층 액을 완전히 제거해 준 뒤, 37℃에서 5분간 건조시켜 ethanol을 완전히 휘발시켰다. 이후 정제된 DNA에 30㎕ TE buffer를 혼합해주었다.

실시예 4. 선별된 라이브러리 파지의 펩타이드를 구성하는 유전자 DNA 증폭

실시예 3에서 얻어진 라이브러리 파지의 DNA를 증폭하여 파지 말단을 구성하는 펩타이드 부분을 분석하기 위하여, 프라이머 (primer) 한 쌍을 바이오니아 (Bioneer, Korea)로부터 합성하였다 [정방향 프라이머: 5''(서열목록 제 6 서열), 역방향 프라이머 5''(서열목록 제 7 서열)]. 상기의 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해 DNA 올리고뉴클레오타이드를 증폭하였으며, 반응 조성은 주형 DNA 5㎕, 10 X PCR 완충용액 5 ㎕, dNTP 혼합물 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2 ㎕, 10 pM 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.2 ㎕ (1unit/㎕)와 31.8 ㎕의 증류수로 구성하였다. DNA의 증폭을 위한 반응 조건은 95℃에서 4분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 42.5℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 30주기 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4㎕를 취하여, 0.7% 아가로오스 겔 전기영동을 통하여 증폭 산물을 확인 한 뒤, PCR 정제 키트 (GeneAll, Korea)를 이용하여 정제하여 증류수 30 ㎕에 회수하였다.

실시예 5. 특이적으로 결합하는 펩타이드를 구성하는 유전자 서열의 분석

히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열을 찾기 위하여 실시예 1에서 히스타민을 magnetic bead에 고정하였으며, 실시예 2와 3을 통해 획득한 특이적 결합력을 보이는 펩타이드를 가지는 파지의 DNA를 선별 및 추출하여 실시예 4에서 증폭 회수한 DNA로 서열 분석(Cosmogenetech, Korea)을 수행하였다. 서열 분석을 통해, 히스타민에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 (서열 목록 1 내지 5)을 확인하였다 (도 2).

실시예 6. 히스타민의 binding assay

히스타민에 대한 binding assay를 실시하기 위하여 먼저 히스타민을 표면이 N-oxysuccinimide로 변형된 96 well plate상에 고정시켰다. 각 웰을 PBS (pH 7.4)로 녹인 1000ppm의 히스타민 용액 100 ㎕와 함께 실온에서 6시간 동안 반응시키고, TBST 0.3%로 6회 세척하였다. 고정 후, 각 웰에 파지를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 각 웰을 0.3% TBST로 6회 세척하였다. 그 다음, 20배 희석된 파지 항체 100㎕를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 각 웰을 다시 TBST 0.3%로 6회 세척하고 항체반응시약 (21㎖ ABTS 원액, 36㎕ 30% H₂O₂) 200 ㎕를 첨가하였다. ABTS의 원액은 azino-bis (3-ethylben-zothiazole sulfonic acid) diammonium salt 22mg을 50mM 구연산 나트륨 (pH 4.0) 100ml에 녹여 제조하였다. 항체반응시약을 50분 동안 반응시킨 후, 405nm에서 플레이트의 흡광도를 측정하였다. 도 3과 같이 H1 (서열 번호 1), H2 (서열 번호 2), H3 (서열 번호 3), B1 (서열 번호 4) 및 D2 (서열 번호 5)가 히스타민과의 binding affinity가 높았으며, 그 중 서열 H3 (서열 번호 3)이 가장 높은 binding affinity를 나타났다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Peptides that specifically bind histamine and their use <130> 1064394 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Histamine-specific peptide-1 <400> 1 Ile Asn Gly Leu His Leu Asn Pro His Thr Asn Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Histamine-specific peptide-2 <400> 2 Ser Leu Phe Asn Tyr Gly Val His Arg Ile Val Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Histamine-specific peptide-3 <400> 3 Phe Gln Ala Arg Trp Glu Pro Pro Arg Leu Leu Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Histamine-specific peptide-4 <400> 4 Ser Tyr Trp Tyr Glu Ala Ser Ser Tyr Thr Gly Val 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Histamine-specific peptide-5 <400> 5 Leu Leu Pro Leu Thr Pro Ile Thr Gln Thr Thr Val 1 5 10 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Seqeunce <400> 6 ccgattcctt tagtggtacc tttctat 27 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 7 ccctcatagt tagcgtaacg 20

Claims

히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드.
제 1항의 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자.
제 2항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 3항의 발현벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체.
제 1항의 펩타이드를 포함하는 히스타민 검출용 조성물.
제 1항의 펩타이드를 포함하는 히스타민 검출용 키트.
제 6항에 있어서, 상기 펩타이드는 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 비오틴, 발광물질, 형광물질(fluorescer)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표지된 것인, 히스타민 검출용 키트.
히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드을 포함하는, 가려움증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드을 포함하는, 가려움증 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물.
히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 펩타이드을 포함하는, 가려움증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제 1항의 펩타이드를 포함하는 가려움증 진단용 조성물.
제 1항의 펩타이드를 포함하는 가려움증 진단용 키트.
제 12항에 있어서, 상기 펩타이드는 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 비오틴, 발광물질, 형광물질(fluorescer)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표지된 것인, 가려움증 진단용 키트.