KR102522579B1

KR102522579B1 - 히스타민 특이 결합 펩타이드 및 이를 이용한 히스타민 검출용 조성물

Info

Publication number: KR102522579B1
Application number: KR1020210017829A
Authority: KR
Inventors: 박태정; 전향숙; 박찬영; 박종필; 문귀임; 김형수; 박은미
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 대한민국(식품의약품안전처장)
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2023-04-18
Also published as: KR20220114386A

Abstract

본 발명은 히스타민 결합 펩타이드, 이를 포함하는 히스타민 검출용 조성물, 이를 포함하는 히스타민 검출용 키트 및 이를 이용한 히스타민 측정방법에 관한 것으로, 본 발명은 히스타민 결합 펩타이드는 낮은 농도의 히스타민에서도 특이적으로 결합할 수 있어, 이를 이용하여 높은 민감도로 히스타민 검출 또는 식품 오염을 감지할 수 있다.

Description

히스타민 특이 결합 펩타이드 및 이를 이용한 히스타민 검출용 조성물 {PEPTIDE BINDING HISTAMINE SPECIFICALLY AND COMPOUND FOR DETECTING HISTAMINE USING THE SAME}

본 발명은 히스타민 결합 펩타이드 및 이를 이용한 히스타민 검출용 조성물에 관한 것이다.

히스타민은 히스티딘의 탈탄산 작용에 의해서 생성되는 생체 아민의 일종으로, 식중독 증상, 고혈압과 두통 구토를 비롯한 알레르기 반응을 일으키며, 식육 및 어패류 부패의 지표물질로도 알려져 있다. 현재 시료에서 히스타민의 함량을 분석하는 방법은 시료에서 추출한 히스타민을 유도체화하여 이를 HPLC 또는 LC/MS 등의 분석기기를 이용하여 분석하는 기기적 분석법을 사용하고 있다. 이러한 기기분석법은 민감도가 매우 높으며, 정량 및 정성 분석이 모두 가능하다는 장점이 있다. 하지만, 이러한 해당 분석 기기들을 구입하는데 소요되는 비용이 엄청나며, 신속한 분석 결과를 도출하기 어렵다는 문제가 있다. 또한, 검출 대상이 식품이라는 점에서 생산 제조 후 신속히 제품의 검사를 완료하고 밀봉하여 유통해야 하는 시간적 제약이 있어, 현장에서 사용되기 어렵다는 문제점이 있다. 이러한 기기분석법의 문제점을 극복하기 위하여 효소면역분석 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)법이 개발되었다. 이러한 ELISA법은 항원 또는 항체에 효소(주로 고추냉이에서 유래한 과산화효소)를 중합 시킨 후, 항원의 농도에 따라 나타나는 효소의 활성도를 측정해 항체와 항원의 결합 정도를 정량적으로 측정하는 방법이다. 그러나 효소면역분석법은 복잡한 실험 과정과 낮은 선택도와 민감도 그리고 높은 분석 비용과 같은 문제점이 있다. 이를 개선하기 위해서 히스타민 탈수소효소를 이용한 효소기반의 검출 키트가 개발되어 있으나 이때 사용하는 발색 염료가 발색 반응에 의한 검출로 한정되고 재현성 및 정밀성 등에 문제점이 있다. 히스타민의 고감도 측정법을 위해서 발색 및 형광 염료를 모두 사용할 수 있는 히스타민 산화효소의 사용은 큰 장점을 가지고 있지만, 이 효소는 히스타민에 대한 활성뿐 아니라 티라민에 대한 활성이 높아서 히스타민 고감도 측정법에 사용하기 어렵다는 문제점이 있다. 이를 개선하기 위해서 히스타민에 보다 특이적인 히스타민 산화 효소를 탐색하거나 단백질 공학적으로 개량하는 연구를 수행하고 있다. 그러나 이러한 방법은 산업적으로 이용하는 데에 한계가 있어 바로 산업적으로 적용 가능한 히스타민의 농도를 특이적으로 검출할 수 있는 기술이 필요하다.

대한민국 등록특허 제1423952호에서는 바이오제닉 아민의 함량 분석용 단백질 및 그 제조방법에 관하여 개시하고 있다. 본 발명에서는 특정 서열을 가지는 단백질을 이용하여 식품관련 산업 현장에서 바이오제닉 아민(히스타민 포함)을 직접적으로 검출할 수 있지만, 특정 서열을 가지는 단백질을 제조하는 비용이 많이 소요됨에 따라 제한적인 용도에서만 사용 가능하다는 단점을 가진다.

이에, 본 발명자들은 식품의 부패여부를 신속하게 판별할 수 있는 수단에 대해 연구한 끝에, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제1423952호

본 발명의 일 양상은 히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 2의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 일 양상은 형광물질 (Fluorescence material) 및 상기 형광물질 표면에 부착된 상기 펩타이드를 포함하는 히스타민 검출용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 조성물을 포함하는 히스타민 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 일 양상은 (a) 상기 조성물을 준비하는 단계, (b) 전처리한 시료를 반응시키는 단계 및 (c) 시료 반응 전 용액의 흡광도 또는 형광도와 시료 반응 후 용액의 흡광도 또는 형광도를 비교하는 단계를 포함하는 히스타민 측정방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 2의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 제공한다.

상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산으로 이루어진 펩타이드는 히스타민에 특이적으로 결합 바이오 물질로, 후술되는 바와 같이 탄소 양자점의 표면에 부착되었을 때 탄소 양자점의 형광이 소광 되고, 이후 시료를 가했을 때 히스타민이 있는 경우 존재하는 히스타민과 펩타이드가 결합하면서 부착되었던 탄소 양자점에서 탈리 되어 탄소 양자점이 드러나면서 형광 검출이 가능 하게 된다 (도 1 참조).

본 발명에서 사용되는 용어 "펩타이드"는 일반적으로 대략 아미노산 수십 개 전 후로 이루어지는 비교적 작은 펩타이드를 의미하고, 보다 구체적으로 본 발명에서는 상술한 펩타이드를 구성하는 13개 및 25개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 의미한다. 본 발명에 따른 펩타이드는 항체에 비해 상대적으로 대량 생산이 용이하고, 독성이 거의 없는 장점이 있다. 또한 히스타민에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 결합시켜 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 제작한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동 가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환 시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩 된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 바이오 물질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif,1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990. 본 발명의 펩타이드는 N-말단의 아미노 말단의 반응성 제거를 위한 공지된 변성이 가능하고, 예를 들어 아세틸화(Acetylation)가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명인 펩타이드의 타겟인 히스타민은 히스티딘의 탈탄산 작용에 의해서 생성되는 생체 아민의 일종이며, 식중독 증상, 고혈압과 두통 구토를 유발하며 특히 알레르기 반응을 일으키며 식육이나 어패류의 부패 지표물질로도 알려져 있다.

본 발명의 펩타이드는 히스타민에 대해 높은 선택성과 민감도를 높이고, 구체적으로 서열번호 1 및 2의 펩타이드는 탐지 한계 (LOD)가 각각 0.019ppm 및 0.013ppm 으로 높은 선택성과 민감도를 가지는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 사용되는 히스타민 검출에서는 낮은 농도의 히스타민에 대해서도 반응하여 육안 및/또는 UV 램프 (365nm) 조사 하에서 간이하게 확인 가능하다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 폴리뉴클레오티드는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990))

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 본 발명인 히스타민 표적용 펩타이드의 변화를 가져올 수도 있다. 본 발명인 펩타이드의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명인 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다. 본 발명인 히스타민에 특이적으로 결합하는 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

본 발명의 다른 일 양상은 형광물질 (Fluorescence material) 및 상기 형광물질 표면에 부착된 상기 펩타이드를 포함하는 히스타민 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 형광물질로는 탄소 기반의 양자점 (carbon based quantum dot), 무기물 기반의 양자점 (inorganic quantum dots), 플루오레세인 (fluorescein) 기반의 형광 염료 중 하나 이상으로부터 선택되는 것일 수 있고, 구체적으로 상기 형광물질은 탄소 기반의 양자점으로 탄소 양자점일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "탄소 양자점 (carbon quantum dot, CQD)"은 수 nm 크기의 탄소 나노 입자이며, 입자 크기에 따라 다른 색깔을 띠고, 흡광 및 발광 파장이 달라지는 등 양자점의 특성을 가지고 있다. 유기물 기반의 비정질 탄소나노소재로서 기존과 동일한 광발광(또는 광루미네선스) (Photoluminescence) 및 반도체적 특성을 갖고 있어, 바이오 이미징, 바이오센서, 발광다이오드(LED, light emitting diode), 광촉매, 유기태양전지 등과 같이 많은 분야에서 무기계 양자점의 대안으로 다양하게 응용이 이루어지고 있다.

전술한 바와 같이 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산으로 이루어진 펩타이드는 히스타민에 특이적으로 결합하기 때문에 검체에 히스타민이 있는 경우 존재하는 히스타민과 펩타이드가 결합하면서 탄소 양자점 표면에 부착되었던 펩타이드가 탄소 양자점에서 탈리 되어 탄소 양자점의 형광이 회복되면서 형광 검출이 가능하게 된다 (도 1 참조).

전술한 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 히스타민에 대해 높은 선택성과 민감도를 높이고, 구체적으로 서열번호 1 및 2의 펩타이드는 탐지 한계 (LOD)가 각각 0.019ppm 및 0.013ppm 으로 높은 선택성과 민감도를 가지기 때문에 본 발명의 히스타민 검출용 키트는 낮은 농도의 히스타민에 대해서도 반응하여 육안 및/또는 UV 램프 (365nm) 조사 하에서 간이하게 확인 가능하다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 조성물을 포함하는 히스타민 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에는 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4

유지된 상태로 제공될 수 있다. 본 발명인 히스타민 검출 키트는 기존 PCR 방법에 비하여 빠르고 편리하게 현장에서 진단이 가능하고, 히스타민의 형광 검출 키트 형태로 제공될 수 있다. 종래 공지된 다른 프로브들에 대하여 본 발명의 펩타이드를 사용하여 히스타민 대한 민감도를 증가시킬 수 있고, 히스타민만을 특이적으로 검출이 가능한 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 (a) (i) 형광물질 및 (ii) 상기 펩타이드를 포함하는 히스타민 측정용 시약 조성물과 반응시켜 형광물질의 형광을 소광시키는 단계, (b) 전처리한 시료를 반응시키는 단계 및 (c) 시료 반응 전 용액의 흡광도 또는 형광도와 시료 반응 후 용액의 흡광도 또는 형광도를 비교하는 단계를 포함하는 히스타민 측정방법을 제공한다.

상기 측정방법은 전술한 펩타이드를 포함하는 조성물을 포함함으로써, 전술한 원리를 통해 시료의 히스타민을 검출할 수 있다.

상기 (a) 조성물을 준비하는 단계는 (i) 형광물질 및 (ii) 상기 펩타이드를 포함하는 히스타민 측정용 시약 조성물과 반응시키는 단계로서, 형광물질에 서열번호 1 또는 2의 펩타이드를 부착시키는 단계이고, 그로인해 형광물질의 형광을 소광시킬 수 있다.

상기 (b) 시료를 반응시키는 단계는 상기 조성물과 전처리한 시료를 반응시키는 것으로, 전처리 방법은 시료의 조건에 따라 공지의 방법을 사용할 수 있다.

상기 (c) 흡광도 또는 형광도를 비교하는 단계는 시료 반응 전 용액의 흡광도 또는 형광도와 시료 반응 후 용액의 흡광도 또는 형광도를 비교하는 단계로서, 상기한 본 발명의 조성물의 원리를 통해 시료의 반응 전 후의 흡광도 또는 형광도가 변하게 되고, 이를 통해 히스타민의 측정이 가능하다.

본 발명의 일 구체예로 상기 방법은 식품 오염을 검사하기 위한 것일 수 있고, 그에 따라 상기 시료는 식품일 수 있다.

본 발명의 펩타이드 및 이를 포함하는 히스타민 검출용 조성물은 낮은 농도의 히스타민에서도 특이적으로 결합할 수 있어, 이를 이용하여 높은 민감도로 히스타민 검출 또는 식품 오염을 감지할 수 있다.

도 1은 후보 펩타이드의 유효성 검사 과정을 나타내는 도면이다.
도 2는 실제 샘플에서의 히스타민 검출을 위한 전처리 및 검출방법을 나타내는 도면이다.
도 3 (a)는 NAC-CQD에서 얻어진 PL 여기 (검은 선) 및 방출 (붉은 선) 스펙트럼들을 나타내는 도면이고, 도 3 (b)는 NAC-CQD의 2차원 등고선 지도이다.
도 4 (a)는 NAC-CQD의 XRD 분석 결과를 나타내고, 도 4 (b)는 NAC-CQD의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5 (a)는 NAC-CQD의 TEM 대표 이미지이고, 도 5 (b)는 NAC-CQD의 HR-TEM 이미지를 나타낸 것이며, 도 5 (c)는 NAC-CQD의 크기를 나타낸 것이다.
도 6은 다른 펩타이드들의 첨가 후 NAC-CQD의 제타 포텐설 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 NAC-CQD의 형광 스펙트럼을 나타내는 도면으로, 구체적으로는 도 7 (a)는 펩타이드가 없는 상태에서 다른 농도의 히스타민을, 도 7 (b)는 Hisp1, 도 7 (c)는 Hisp2, 도 7 (d)는 Hisp3, 도 7 (e)는 Hisp4 존재 하에 100ppm의 히스타민 첨가 유무에 따른 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 8 은 여러 농도의 NaCl 하에 (a) NAC-CQD 및 (b) NAC-CQD@펩타이드의 형광 강도를 나타낸 것이다 (F_r 은 NAC-CQD의 강도를 나타내고; F 는 펩타이드 첨가 후 NAC-CQD의 강도를 나타낸 것이다).
도 9는 선택성 분석 결과를 나타내고, 구체적으로, NAC-CQD에 (a) Hisp1, (b) Hisp2, (c) Hisp3, (d) Hisp4를 첨가해 형광을 소광 시킨 상태에서 여러 저해제를 투입한 뒤 회복되는 형광 정도를 나타낸 것이다 (F는 히스타민을 비롯한 저해제 존재하에서 형광 강도를 나타내고, F₀는 히스타민을 비롯한 저해제가 없는 경우 형광 강도를 나타낸다).
도 10은 민감도 분석 결과를 나타내고, 구체적으로 (a) Hisp1, (b) Hisp2, (c) Hisp3, (d) Hisp4 펩타이드의 존재 하에서 상이한 히스타민 농도에 따른 NAC-CQD의 형광 회복의 검출한계와 선형 정도를 나타낸다.
도 11은 NAC-CQD 및 NAC-CQD/Hisp3을 사용해 0 내지 50ppm의 히스타민 농도의 첨가에 따른 형광 이미지를 나타낸 것으로, UV 램프 (365nm) 조사 하에서 촬영되었다.
도 12는 개발된 센서의 pH 안정성 테스트 결과를 나타내는 것으로 NAC-CQD, NAC-CQD/Hisp3 및 NAC-CQD/Hisp3/his (50ppm)의 형광 강도를 나타낸 것이다.
도 13은 (a, b) Hisp3-C 및 (c, d) hisp3-2-C의 선택성 및 민감도 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 (a) MNP 및 MNP@Au의 XRD 와 (b) His3-2-C, MNP, MNP@Au 및 MNP@Au@His3-2-C의 UV-가시 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 15는 (a) MNP, (b) MNP@Au NPs의 SEM 이미지이며, 도 15 (c)는 MNP@Au NPs의 대응 EDS 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 15 (d)는 MNP, MNP@Au, 및 MNP@Au@Hisp3-2-C의 유체역학 직경 분포 (Distribution of the hydrodynamic diameter)를 도 15 (e)는 MNP, MNP@Au, 및 MNP@Au@Hisp3-2-C의 제타 포텐셜 분석을 나타낸 것이다.
도 16은 MNP@Au@Hisp3-2-C에 부착된 His3-2-C의 정량분석을 위한 BCA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 히스타민, MNP@Au, MNP@Au@Hisp3-2-C 및 MNP@Au@Hisp3-2/히스타민의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 18은 생선 샘플의 히스타민의 농도 대비 형광 강도의 회복의 선형 그래프이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

화학물질 및 펩타이드

소 혈청 알부빈 (Bovine serum albumin, BSA), 인산식염수 (phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.4), N,N'-디시클루헥실카르보디이미드 (N,N

diimide, DCC), N-아세틸-L-시스테인 (N-acetyl-L-cysteine ,NAC), gold (III) chloride hydrate, N-히드록시 숙신이미드 (N-hydroxy succinimide, NHS), 트립타민 (tryptamine), 스페미딘 (spermidine), 아그마틴 (agmatine), 티라민 (tyramine), 2-페네틸아민 (2-phenethylamine), 푸트레신 (putrescine), 카다베린 (cadaverine) 및 스페민 (spermine)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 히스타민 (Histamine, His), N, N,N-디메틸포름아마이드 (N-dimethylformamide, DMF), 암모늄히드록사이드 (ammonium hydroxide) 및 숙신산 무수물 (succinic anhydride, SA)는 Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA)에서 구매하였다. SMART?? BCA protein assay kit 는 iNtRON Biotechnology (Seongnam, Korea)에서 구매하였다. 아가로스는 Takara Bio (Shiga, Japan)에서 구매하였다. 특별히 기재되지 않는 한, 모든 화합물질 및 용액들은 탈이온수 (deionized (DI) water)를 이용하여 준비하였다.

대장균 균주 ER2738가 증폭(amplification), 적정(titration) 및 DNA 정제(DNA purification)에 사용되었다. 특별히 언급되지 않는 한, 상기 균주는 테트라사이클린 (100 μg/mL)을 함유하는 Luria-Bertani(LB) 아가 배지에서 37℃ 밤새 배양하였다. 증폭 및 적정을 위하여, 단일 콜로니들은 LB배지 [펩톤(1%); 효모 추출물(0.5%), NaCl(0.5%), DI water(w/v)]에서 37℃에서 성장 로그 단계 (log phase)에 도달할 때까지 흔들어주었다. Ph.D. 7?? 및 Ph.D. 12?? phagedisplay peptide library kits는 New England BioLabs (Ipswich, MA, USA) 에서 얻었다.

파지 디스플레이를 위한 히스타민 합텐 (histamine hapten)의 준비

히스타민 합텐으로 His-SA의 합성

숙신산 무수물 (SA, 0.59 g, 5.94 mmol)은 상온 질소 조건에서 DMF 10mL에 용해하였다. 이어서 20mL DMF에 용해된 히스타민 (0.60 g, 5.40 mmol)을 상기 용액에 물방울로 주입한 뒤, 6시간 동안 저어주었다. 용매는 로터리 증발기를 사용하여 제거하였고, 50mL 에탄올을 부어 결정화 하였다. 처음에는 4℃에서 밤새 보관하였고, 여과한 뒤 차가운 에탄올로 세척하였다. 여과물은 상온에서 건조시켰고, 82.1% 수확량으로 백색 고체의 형태로 합텐인 His-SA를 얻었다.

히스타민 합텐과 BSA의 결합

합텐 (20.0 mg, 0.095 mmol)은 1mL DMF에 용해하였고, 이후 4℃에서 NHS (12.0 mg, 0.10 mmol)를 첨가하였다. 10분간 저어준 후 DCC (21.0 mg, 0.125 mmol)를 첨가하였다. 혼합된 용액은 4℃에서 15시간 냉장하였다. 합텐을 DCC 및 NHS로 활성화하고, 디사이클로헥실유레아를 제거하기 위해 여과하였다. 여과물에 탈이온수 (2mL)에 용해된 BSA(28mg) 용액을 천천히 첨가하고 4℃에서 저어주었다. 15시간 뒤에 혼합물은 15,814g에서 10분간 원심분리하고 3일간 상등액을 투석하였다. 얻어진 BSA-합텐은 MALDI-TOF 분석으로 검증하였다.

파지-디스플레이 바이오패닝 (Phage-display biopanning)

96-웰 이뮤노플레이트 (SPL Life Sciences, Pocheon, Korea)는 0.1M NaHCO₃ (pH.6)에 용해된 100μg/mL의 BSA 및 BSA-합텐으로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트들은 TBST (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) + 150 mM NaCl + 0.1% Tween 20)로 3회 세척하였고, 준비된 블로킹 버퍼 (0.1 M NaHCO₃, 5 mg/mL BSA, pH 8.6)로 4℃에서 2시간동안 블록하였다. 상기 플레이트는 TBST로 6회 세척하였다. 상기 전처리 된 웰에 각각의 펩타이드 라이브러리 (1 Х 1011 pfu/ mL)를 첨가하였고 40분간 25℃에서 배양하였다. 결합되지 않은 파지를 제거하기 위해, 플레이트는 TBST 용액으로 10회 세척하였다. BSA 및 BSA-헵탄에 대하여 3회 바이오패닝을 수행하였다. 세척 후 결합된 파지는 100μL의 0.2M 글라이신-HCl(pH2.2)에 20분 25℃ 조건에서 배양하여 용출하였다. 용출액은 파지의 손상을 예방하기 위해 즉시 15μL의 Tris-HCl(pH9.1) 용액으로 중화시켰다.

파지 증폭 및 DNA 서열분석

용출된 파지는 1.0μL의 파지 현탁액을 0.1mg/mL 테트라사이클린 및 200μL의 대장균 균주 ER2738을 함유한 20mL LB 배지에 접종하고, 37℃에서 5시간만 배양하여 증폭하였다. 배양액은 18,341g, 4℃ 30초간 원심분리하였다. 80%의 상등액은 새로은 튜브에 200μL의 PEG 8000/2.5M NaCl과 함께 옮겼고 얼음에서 15-60분간 두었다. 20분 뒤 18,341g 4℃ 10분간 원심분리하였다. 상등액은 폐기하였고, 펠렛은 100μL의 아이오다이드 버퍼 (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 4.0 M sodium iodide and absolute ethyl alcohol)에 재 현탁하였고, 상온에서 20분간 두었다. 용액은 그리고 4℃, 14,000g, 10분간 원심분리하였고 상등액을 버렸다. 펠렛은 에탄올로 세척하고 원심분리하였다. 펠렛은 -20℃에서 TE 버퍼 (10 nM Tris pH 8.0, 1.0 mM EDTA)로 재 현탁하였다. DNA 서열분석은 Cosmo Genetech (Seoul, Korea)에 의해 수행되었다.

형광 검출 플렛폼에 의한 최적의 펩타이드 선정

NAC-CQD 합성

N-아세틸-L-시스테인 (NAC, 0.08 g, 0.5 mmol) 및 시트르산 (0.13 g, 0.68 mmol)은 탈염수 8mL에 용해하였고 15분간 초음파 처리하였다. 그리고 암모늄 히드록사이드 용액을 pH 7.0으로 조정하기 위해 추가하였다. 이후 20mL 테플론 코팅된 수열합성기에 옮겼고, 200℃ 3시간 처리하였다. 시료를 실온까지 냉각한 뒤 얻은 물질들을 15mL 탈염수에 용해하고 불순물을 제거하기 위해 11,323g에서 15분간 원심분리하였다. 마지막으로, 0.25μm의 기공 크기를 갖는 시린지 필터 (syringe filters)를 사용해 정제한 뒤, 24시간동안 탈이온수에서 투석하였다. 그리고 추후 분석을 위해 4℃에서 보관하였다.

선택성 및 민감도 테스트

히스타민 형광 검출을 위해, 50μL의 다른 후보 펩타이드 (0.1mg/mL)는 100μL의 NAC-CQD에 첨가하였고, 50μL의 다른 농도 (0.1 내지 100ppm)의 히스타민을 첨가하였다. 5분간 정치 후, 450nm에서의 형광 회복이 360nm의 방출 스펙트럼으로 기록하였다. 히스타민을 트립타민 (tryptamine), 스페미딘 (spermidine), 아그마틴 (agmatine), 티라민 (tyramine), 2-페네틸아민 (2-phenethylamine), 푸트레신 (putrescine), 카다베린 (cadaverine) 및 스페민 (spermine)과 같은 서로 다른 생물 유래 아민으로 대체하여 유사한 실험을 수행하여 테스트를 수행하였다.

실제 샘플에서의 자기 분리 및 형광 검출

히스타민 정제 메커니즘

Gold coated magnet nanocomposites (MNP@Au)는 시스테인 결합 펩타이드에 의해 기능화 되었다 (MNP@Au@peptide), 이는 시료 용액으로부터 히스타민을 선택적으로 결합한다. 그리고, 히스타민이 결합된 MNP@Au@peptide는 자기장에 의해 시료로부터 분리하고, 탈염수로 3회 세척하였다. 그리고, 상기 형광 플랫폼에 도입하였다. 혼합 용액에서 자기장으로 분리한 후, NAC-CQD의 형광 방출 회복도를 확인하였다.

MNP@AU로 변이된 펩타이드의 제조

MNP@AU 나노파티클은 Calatayud et al., 2013; Wang et al., 2015의 방법으로 제조하였다. 티올-변이 2반복 펩타이드 (Hisp3-2-C)는 Au 표면과 펩타이드 사이에 Au-S 공유결합을 통해 MNP@AU와 결합하였다. 간략히 설명하면 MNP@AU (0.1mg/mL)는 Hisp3-2-C(0.5mg/mL)와 함께 상온, PBS(pH 7.4)에서 2시간동안 두었다. 제조된 MNP@Au@Hisp3-2-C 결합제는 탈이온수로 고자기장 하에서 5회 이상 세척하였고, 결합체의 최종 농도를 0.5mg/mL로 맞추었고, 이하에서 사용하였다.

고등어에서의 히스타민 추출은 Mao et al., 2019에 따라 수행되었다. 히스타민 정량 분석을 위해 MNP@Au@Hisp3-2-C를 사용하였고, 칼리브레이션은 외부 표준화로 수행하였다. 먼저, 히스타민은 검체에서 희석하였고, 이는 1 내지 640ppm의 다양한 농도로 희석한 것이다. 그리고 1.0mL의 MNP@Au@Hisp3-2-C를 1.0mL의 표준용액에 첨가하고, 결합을 시키기 위해 20분간 두었고, 자기장을 이용하여 분리하고 1.0mL의 탈이온수로 분산시켰다. 그리고, 50μL의 hisp3 (0.1mg/mL)는 100μL의 NAC-CQD에 첨가하고 50μL의 정제된 시료를 넣고, 20분간 두었다. 분리를 위해 자기장을 이용하였고, 형광정도 및 히스타민 농도 사이의 선형 곡선을 얻었다. 미지의 샘플에 대한 정량을 위해 유사한 방법을 수행하였고, 농도를 표준곡선을 이용하여 계산하였다. 그리고 HPLC 분석 결과를 비교하여 타당성을 입증하였다.

특성분석 (Characterization)

핵자기공명 (Nuclear magnetic resonance, NMR) 스펙트럼은 Varian Unity VNS 600 NMR spectrometer (¹H and ¹³C at 600 MHz, Varian, Palo Alto, CA, USA)에 기록되었다. 기체크로마토그래피/고해상도 질량분석기 (Gas chromatography/high-resolution mass spectrometry, GC/HRMS)는 기체크로마토그래프 (6890N, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 탑재한 MS-700 (JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하여 수행하였다. MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 MALDI-TOF voyager DE-STR (Applied Biosystems)에 기록되었다. 제타 포텐셜 및 DLS 측정은 particle size analyzer ELSZ-1000 system (Photal OTSUKA Electronics, Tokyo, Japan)에 의해 수행되었다. FT-IR 스펙트럼은 FT-IR spectrometer (Jasco 6600FV, Jasco, Tokyo, Japan)을 사용하였고. 형광 강도는 multi-mode microplate reader (BioTek Synergy H1, Winooski, VT, USA)에 기록되었다. HR-TEM 이미지는 high-resolution transmission electron microscope (HR-TEM, 300 kV, JEM-3010, Jeol)를 통해 확인하였다. Field-emission scanning electron microscope (FE-SEM, S-4800, Hitachi, Tokyo, Japan)이 사용되었고, NAC-CQD의 양자 수율은 표준시료로 퀴닌 설페이트를 사용하여 계산되었다 (QY = 54% in 0.1 M H2SO4) (Zhu et al., 2013).

실험결과

합텐의 특성

His-SA(합텐 1)와 관련하여 ¹H NMR, ¹³C NMR 및 GC/HRMS로부터 구조적 특징에 대한 데이터를 확인하였다. 그 결과 합텐 1이 성공적으로 합성된 것을 확인하였다. HRMS (EI) m/z 는 C₉H₁₄N₃O₃ [M+H] 212.1039로 계산되었고, 212.1035에서 확인되었다. ¹H NMR (DMSO-d ₆ , 600 MHz)는 δ: 2.30 (t, J = 7.02 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 6.98 Hz, 2H), 2.61 (t, J = 7.49 Hz, 2H), 3.21-3.27 (m, 2H), 6.78 (s, 1H), 7.53 (d, J = 1.12, 1H), 7.91 (t, J = 5.7 Hz, 1H)에서 확인되었고, ¹³C NMR (DMSO-d ₆ , 600 MHz)는 δ: 27.36; 29.70 (2C); 30.54; 40.25 (2C); 117.33; 135.00; 171.26; 174.32에서 확인되었다. 합텐 1과 BSA의 관계 (BSA-hapten)은 MALDI-TOF로 추가 검증되었다. BSA 분자량 (MW)는 66.2kDa이며, MALDI-TOF 스펙트럼에서도 유사하게 표현되었다. BSA-합텐 최고점은 67.8kDa로 관측되었으며, 이는 합텐이 BSA에 성공적으로 결합되었음을 나타낸다. 합텐의 MW는 211.22Da이기 때문에, BSA에 결합된 합텐의 수는 약 7.6개인 것을 예측할 수 있다.

파지-디스플레이 스크리닝

BSA-합텐과 Ph.D. 7^TM and Ph.D. 12^TM phage-display peptide library를 이용하여 3회 바이오패닝을 수행하였다. 전체 파지 회복 비율은 진행됨에 따라 증가하였다 (표 1 참조).

Sample	Round of panning	Input phage (PFU)	Output phage (PFU)	Phage recovery ratio (%)
BSA-histamine (7-mer)	1	1.0Х10¹¹	2.23Х10⁵	2.23Х10^-6
	2	1.0Х10¹¹	9.40Х10⁴	9.40Х10^-7
	3	1.0Х10¹¹	1.10Х10⁶	1.10Х10^-5
BSA-histamine (12-mer)	1	1.0Х10¹¹	2.40Х10⁵	2.40Х10^-6
	2	1.0Х10¹¹	5.70Х10⁵	5.70Х10^-6
	3	1.0Х10¹¹	1.06Х10⁶	1.06Х10^-5

각 파이오패닝의 수행 후에, 파지는 희석되었고, DNA 추출되었고, 서열분석되었다. 각각의 파지는 후보 펩타이드 정보에 전달될 수 있는 고유한 DNA 서열을 보존하고 있었다. 희석된 파지의 서열정보는 표 2와 같다.

BSA-histamine (7-mer)	Frequency	BSA-histamine (12-mer)	Frequency
QVPESRH	10/10	GSWNTFRAQPTI	1/12
		YPVRAPNQSGQ	1/12
		SAHPSRVNVHSL	2/12
		DIDRAGKASHWP	1/12
		DIARTAKPSHWP	1/12

이들 중 펩타이드 서열 'QVPESRH'의 10개 복제들이 3회 바이오패닝 중에서 획득하였다. 유사하게, 펩타이드 서열'SAHPSRVNVHSL'의 2개 복제들이 바이오패닝 중에서 확인되었다. 이외에도, 유사한 서열 'DIDRAGKASHWP' 및'DIARTAKPSHWP'이 확인되었다. 따라서, 바이오패닝의 다른 회차로부터 반복되는 4가지의 후보물질이 선정되었고 (표 3 참조), 히스타민에 대한 선호도를 추가 검증하기 위해 합성하였다.

Name	Sequence (N->C)	MW (g/mol)	pI values
Hisp1	QVPESRH-NH₂	1103.15	7.68
Hisp2	SAHPSRVNVHSL-NH₂	1301.70	10.58
Hisp3	DIDRAGKASHWP-NH₂	1350.68	7.98
Hisp4	DIARTAKPSHWP-NH₂	1376.73	10.15
Hisp3-C	DIDRAGKASHWPC	1853.10	7.09
Hisp3-2-C	DIDRAGKASHWPDIDRAGKASHWPC	3116.46	7.18

NAC-CQD의 구조적 특성 (Structural characterizations of NAC-CQDs)

구연산 및 NAC를 수열처리 한 뒤 세척하여 갈색 분산액 형태의 NAC-CQD를 얻었고 이는 상온에서 2달 간 석출 또는 응집이 없는 등 높은 물 용해도 및 안정성을 보였다. NAC-CQD의 양자 수율은 표준 시료로서 퀴닌 설페이트를 사용하였을 때 19.4%로 계산되었다.

NAC-CQD의 광학적 특성은 형광 스펙트럼을 통해 조사되었다. 도 3 (a)에서는 물에서의 NAC-CQD의 흥분 및 방출 스펙트럼을 보여준다. NAC-CQD의 흥분 독립 발광 특성은 도 3(b)와 같이 등고선 지도(topographical contour map)로 표현되었다. 최대 흥분 파장은 흥분 파장을 300nm에서 400nm로 변화되었을 때 360nm로 관측되는 반면 NAC-CQD 수용액은 최대 방출 파장은 450nm으로 확인되었다. 강한 발광 방출은 NAC-CQD의 표면에 결합된 S원자 및 N원자에 기인한 것으로 판단된다.

합성된 NAC-CQD의 위상 구조와 결정성을 조사하기 위해 X선 회절 (XRD) 분석을 실시하였다. 그 결과 NAC-CQD의 X선 회절에서 2θ = 25˚에서 넓은 피크의 존재를 확인하였고 (도 4a), 이는 NAC-CQD의 무정형성 특징에 기여하였다. 비교해보자면, 준비된 NAC-CQD의 XRD 패턴은 흑연 및 그래핀에 비해 넓은 피크를 가지고 있고, 이는 NAC_CQD의 작은 결정 크기에 기여하는 것이다 (Li et al., 2019). 또한, 준비된 NAC-CQD의 FT-IR 스펙트럼에서 1068 cm^-1에서의 피크는 C-O 결합에 의한 것이고 (Liu et al., 2012), C-O-C 스트레칭, 진동은 1350.08 cm^-1에서 확인되었다 (도 4b). 게다가 3433.42 cm^-1에서의 넓은 밴드는 -OH 및 -NH₂그룹의 존재로 확인되었으며, C-H 스트레칭 진동 때문에 2930 cm^-1의 밴드가 확인되었다 (Luo et al., 2014). NAC-CQD의 대표적인 TEM 분석 이미지를 확인할 때 응집이 확인되지 않았고 (도 5(a) 참조), 이는 물에서의 NAC-CQD의 좋은 분산성을 반증한다. NAC-CQD의 HR-TEM 이미지를 통해 자연적으로는 무정형이고, 잘 분해된 격자 평면이 없는 것을 확인하였다 (도 5(b)). DLS 데이터를 통해 NAC-CQD의 입자 크기가 3.3nm 이상임을 확인하였다 (도 5(c)). 또한 CD의 제타 포텐셜이 -37.75mV인 것을 확인하였다 (도 6). NAC의 pKa 값이 3.24이므로 NAC-CQD는 중성 pH에서 강한 음극 표면 전하를 띄며, 이는 카복실그룹의 deprotonation에 의한 것임을 나타낸다. 안정제로 사용되는 시스테아민 (CA) 및 L-시스테인 (L-Cys)은 아민 그룹이 있기 때문에 중성 pH에서 양전하를 나타낸다 (Shi et al., 2017). 그러나 NAC는 카복실그룹으로 인해 중성 pH에서 음극을 만들어낸다. 이러한 결과로부터 상기 펩타이드는 정전기 상호작용을 통해 NAC-CQD 표면으로 흡수될 수 있으며, 이는 NAC-CQD에서 펩타이드로 전자 이동에 의한 형광 소광 (fluorescence quenching)을 촉진한다.

히스타민 검출

NAC-CQD 및 히스타민 결합 펩타이드 후보물질의 상호작용

다른 펩타이드의 추가에 따른 NAC-CQD의 형광 스펙트럼을 측정하였다. NAC-CQD의 형광 강도는 히스타민 농도의 차이에 따라 변화하지 않았다 (도 7(a)). NAC-CQD의 형광 방출 정도는 네 종류의 펩타이드에서 감소되었고 (도 7(b)-(e)), 다른 농도의 히스타민 첨가 이후의 형광 방출 정도의 증가가 있었다.

NAC-CQD 및 펩타이드 관계에서의 형광 감소는 NAC-CQD에서 펩타이드로 전자 이동의 방해에 기인한 것으로 이는 무시할 수 있는 형광 변화를 유발한다. NAC-CQD 및 펩타이드 사이의 상호작용에 대해 다양한 분석이 수행되었다. 제타 포텐셜 분석에서 NAC-CQD는 카복실 그룹에 작용하여 처음에는 강한 음전하를 나타내었으나, 다른 펩타이드를 첨가한 뒤에 제타 전위가 양전하로 바뀌었다 (도 6). 이로부터, 감소효과는 카복실 그룹과 펩타이드의 친수성 잔기 사이의 정전기 효과 또는 수소결합 때문으로 추측되었다. 이는 NAC-CQD에 대한 Hisp2의 적은 감소효과에서도 알 수 있다. 또한, 강한 이온 강도는 소수성 공정에 유리하지만 정전기 결합에 저해되기 때문에 (Si et al., 2018), 펩타이드와 NAC-CQD 사이의 결합 방식을 구별하기 위해 이온 강도를 조절하였다. 이들 사이의 결합 효과를 확인하기 위하여 형광 강도의 변화를 NaCl 농도별로 비교하였다. NAC-CQD의 형광 강도는 NaCl 농도의 변화에 따라 변화가 없었다 (도 8). 반면에 높은 이온 농도에서는 형광 정도가 덜 줄어들었다. 이러한 차이는 이들 사이의 정전기적 상호작용에서 기인한다. 많은 연구들은 대부분의 펩타이들에서의 리간드 결합 위치들은 소수성이고, 소수성 상호작용은 작은 분자 리간드의 펩타이드에 대한 주요한 열역학적 구동력 (thermodynamic driving force)을 구성하는 것을 보여준다. 따라서, 목적 펩타이드의 소수성 영역에 대한 히스타민의 결합은 NAC-CQD로부터 펩타이드의 이탈 및 형광성을 회복하는 것을 유도한다 (Maity et al., 2019).

펩타이드 후보군을 평가하기 위한 선택성 테스트

구조적으로 유사한 다른 화합물의 유사한 농도 와는 대조적으로 (도 9), NAC-CQD와 펩타이드 시스템의 형광 강도는 히스타민 존재 시 현저한 증가를 나타내었으며, 이는 본 검사의 선택성을 나타낸다. 히스타민에 대한 선택성을 위해 선택된 모든 펩타이드들을 비교하였을 때, Hisp2를 제외하고는, 다른 펩타이드들은 히스타민에 대해 좋은 선택성을 보였다. 이들 중 카타베린에 대한 낮은 반응을 보여주었다. 히스타민 과 카다베린 사이의 pKa 값이 유사하다는 점을 고려하였을 때, 히스타민 내 일차 아민 그룹이 바이오리셉터 인식 위치로서 중요한 역할을 가지고 있음을 확인하였다 (Dwidar and Yokobayashi, 2019).

후보 펩타이드들을 평가하기 위한 민감도 평가

히스타민의 실제적 검출을 위한 방법을 평가하기 위해 히스타민 농도 별 (0.1-100 ppm) 반응에 기초한 표준 곡선을 설정하였다 (도 10). Hisp2의 경우 히스타민 농도와 탄소 양자점의 형광 회복 사이에 명확한 선형관계가 확인되지 않았다. 반면, Hisp1, Hisp3 및 Hisp4는 히스타민 농도의 증가에 따라 형광 강도가 나란히 증가되는 것을 확인하였다. 이들 중 Hisp3는 형광 강도 회복 (F-F₀) 와 히스타민 농도 범위 0.1 내지 100ppm 에서의 로그값 사이에 회귀 방정식 y=484.01x-0.12이 도출되었다 (도 10(c)). 검정곡선의 상관 계수는 0.9966 이었다. 검출 한계 (LOD = 3 N/S, 여기서 N은 바탕용액의 표준편차이며, S는 검량곡선의 기울기이다)는 21.15ppb였다. 히스타민 검출방법들과 비교하였을 때, 상기 방법은 높은 민감도와 선택성을 나타 내었다. 또한, 히스타민은 NAC-CQD/Hisp3 색도 측정 시스템 (colorimetry system)에 의해 측정되었다 (도 11). NAC-CQD의 형광도는 Hisp3의 첨가 이후에 급격하게 감소된 반면, 히스타민의 첨가 농도에 따라 회복되는 현상이 UV(365 nm) 하에서 육안으로 구별되었다.

바이오 센서의 안정성 평가

다양한 pH 조건에서 PBS용액 내 NAC-CQD의 형광 강도를 비교하여 개발된 바이오센서의 안정성을 개선하였다. NAC-CQD 기반 히스타민 세서는 pH 내성이 높고, NAC-CQD의 최대 형광 방출 강도는 더 높은 pH 값에서 확인되었다 (도 12). Hisp3 존재하에서 NAC-CQD의 형광 강도는 pH 6, 7에서 급격히 감소하였다가 히스타민 첨가와 함께 증가하였다. 더욱이, pH가 6-11 범위일 때 형광 강도가 안정적으로 유지하여 개발된 바이오 센서가 넓은 pH 범위에서 우수한 안정성을 가지고 있음을 알 수 있다.

실제 샘플에서의 분석

제조된 펩타이드들의 유효성 검사 (Validation)

상기한 바와 같이, 펩타이드 Hisp3가 히스타민에 대한 높은 선택성과 민감도를 보인다는 것을 확인하였고, 히스타민의 효율적인 결합에 필요한 유연한 링크를 구조적으로 야기했기 때문일 수 있다. 히스타민에 대한 특정 서열의 영향을 확인하기 위해, 시스테인 (Cys)이 결합된 서열 His3-C(DIDRAGKASHWPC) 및 시스테인 및 2 반복 서열 His3-2-C (DIDRAGKASHWPDIDRAGKASHWPC)이 합성되었다. Hisp3-2-C의 민감도는 13.0ppb의 낮은 LOD를 보여주었고, 민감도는 유지되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 특정 서열들은 히스타민에 대해 우수한 친화력을 보이는 것을 의미한다 (도 13).

MNP@Au@Hisp3-2-C의 특성 확인

XRD 및 흡광도 확인을 통해 성공적인 Au 코팅을 확인하였고, 구체적으로 MNP 및 MNP@Au의 XRD 패턴을 확인하였다 (도 14(a)). MNP의 피크는 (311), (440), (220) 및 (511) 평면으로 표시되었고, 이는 Fe₃O₄에 대응한다 (JCPDS No. 19.0629). 한편, MNP@AuNP는 금 껍질에서 날카로은 피크를 보여주고, 이는 JCPDS No. 04-0784를 참조하여 표준 금 하이브리드의 (200), (220) 및 (111) 면과 같이 표시된다. 이러한 결과는 MNP@Au 자석 나노 조성물의 형성을 의미한다. 물에 현탁 된 입자의 광학적 성질은 UV-Vis 분광법을 통해 비교하였다 (도 14(b)). MNP와 비교하면, 표면 플라스몬 공명 현상 (surface plasmon resonance phenomenon)은 AuNPs 층이 MNP 표면에 부착될 때 스펙트럼 (~552nm) 피크에서 흡수를 일으킨다. 이는 MNP@AuNPs의 제작 절차가 성공적으로 수행되었음을 보여준다 (Wang et al., 2015). 이는 290nm의 특정 피크를 가지고 있는데, 이는 방향족 아미노산 잔기에 의한 것이다. 이러한 결과는 자기 나노입자의 표면에 펩타이드가 성공적으로 부착 되었음을 보여준다.

동시에 나노 입자의 형태학과 구조는 FE-SEM 및 DLS 각각을 이용하여 조사하였다 (도 15). SEM 이미지와 DLS 분석으로 확인된 MNP의 평균 지름은 164.8 ± 36.5 nm 인 것을 확인하였다(도 15(d)). 한편, 에너지 분산 X-레이 분광법 (Energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDS) 분석으로부터 MNP@AuNP의 Au, Fe, O 원소의 조합을 확인할 수 있고 (도 15(c)), 이는 AuNP 및 MNP 사이의 성공적인 결합을 제시한다. AuNP 코팅으로 입자의 지름이 197.7±56.2 nm로 증가한 것을 DLS 분석을 사용하여 확인하였다. 제타 포텐설 분석으로부터, 제조 중 PEI 기능화로 MNP 표면에 양전화가 있으며, 이는 AuNP 코팅 뒤에 - 31.66 mV로 역전되었다. 또한, Hisp3-2-C의 결합으로 최종 평균 크기가 200.8 ± 35.9 nm로 증가하였고 제타 포텐셜은 - 27.97 mV로 변화하였다 (Wang et al., 2015).

생선 시료에의 적용

실제 샘플의 히스타민 검출에 본 발명의 물질을 적용할 수 있는지를 확인하기 위해, 히스타민이 자연적으로 함유된 블랙피쉬 (black fish) 샘플을 이용하여 정량화 하였다. 히스타민은 MNP@Au 및 Hisp3-2-C 자석 나노 조성물을 이용하여 최적화된 절차를 이용하여 분리되었다. 분리된 히스타민은 NAC-CQD 및 Hisp3와 혼합되었다. 이는 결합이 형광 신호로 변환되었다. 히스타민의 농도는 검량곡선 (linear calibration plot)에 측정된 형광 강도를 대입하여 결정하였고 (도 18), 결과는 표 4에 표시하였다.

Real sample No.	Found (ppm)	Reference (HPLC)	Recoveray (%)
1	1.64±0.71	1.86	88.17
2	179.72±9.86	231.00	84.37
3	573.91±11.15	523.05	109.72

제안된 방법으로 얻어진 결과 (n=3)는 HPLC에 의해 얻어진 것과 통계적으로 동일하였다. MNP@AuNP 및 Hisp3-2-C 자석 나노 조성물 시스템은 생선에서 민감한 히스타민 검출의 가능성을 보여준다. 현재 생선에서의 50mg/kg의 히스타민 수준은 주의 수준으로 간주된다. 따라서, 상기 조성물 및 이를 이용한 방법은 히스타민 검출용 수단으로 활용할 수 있다. 비교를 위하여, 발견된 펩타이드들의 LOD는 표 5에 정리하였다. 결론적으로 본 발명의 방법에서 얻은 LOD는 현저히 낮았고, 본 발명의 시스템의 분리 방식이 편리하고 효과적인 것을 알 수 있다.

Peptide No.	LOD (ppm)
Hisp1	0.038
Hisp3	0.023
Hisp4	0.071
Hisp3-C	0.019
Hisp3-2-C	0.013

결론

요약하면, 본 발명의 히스타민과 특이적으로 결합하는 펩타이드들은 파지 디스플레이 방법에 의해 선정되었고, 이들의 결합 능력을 검증하기 위해, NAC-CQD와 펩타이드에서 방출되는 형광 강도의 증가를 측정하였고, 이를 통해 히스타민의 함량을 간접적으로 측정할 수 있음을 확인하였다. NAC-CQD 및 펩타이드 시스템의 시스템을 이용할 때 히스타민은 0.1 내지 100ppm의 낮은 농도로 분석되었으며, LOD는 13.0ppb이었다. 본 발명의 시스템은 생선 샘플의 히스타민 분석에 사용할 수 있고, 이는 식품 안전 및 인류 건강에 도움을 주는 수단으로 활용될 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> CHUNG-ANG UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> PEPTIDE BINDING HISTAMINE SPECIFICALLY AND COMPOUND FOR DETECTING HISTAMINE USING THE SAME <130> PN200267 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hisp3-C <400> 1 Asp Ile Asp Arg Ala Gly Lys Ala Ser His Trp Pro Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hisp3-2-C <400> 2 Asp Ile Asp Arg Ala Gly Lys Ala Ser His Trp Pro Asp Ile Asp Arg 1 5 10 15 Ala Gly Lys Ala Ser His Trp Pro Cys 20 25 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hisp1 <400> 3 Gln Val Pro Glu Ser Arg His 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hisp3 <400> 4 Asp Ile Asp Arg Ala Gly Lys Ala Ser His Trp Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hisp4 <400> 5 Asp Ile Ala Arg Thr Ala Lys Pro Ser His Trp Pro 1 5 10

Claims

히스타민에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 2의 아미노산으로 이루어진 펩타이드.
제1항의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
형광물질 (Fluorescence material); 및
상기 형광물질 표면에 부착된 제1항의 펩타이드를 포함하는 히스타민 검출용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 형광물질로는 탄소 기반의 양자점 (carbon based quantum dot), 무기물 기반의 양자점 (inorganic quantum dots), 플루오레세인 (fluorescein) 기반의 형광 염료 중 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 히스타민 검출용 조성물.
제3항의 조성물을 포함하는 히스타민 검출용 키트.
(a) 제3항의 조성물을 준비하는 단계;
(b) 상기 조성물과 전처리한 시료를 반응시키는 단계; 및
(c) 시료 반응 전 용액의 흡광도 또는 형광도와 시료 반응 후 용액의 흡광도 또는 형광도를 비교하는 단계를 포함하는 히스타민 측정방법.
제6항의 방법은 식품 오염을 검사하기 위한 것인 방법.