KR101780736B1 - 바이오제닉 아민 수산화 효소와 히스타민 산화효소의 연속 반응을 이용한 히스타민 검출방법 - Google Patents

바이오제닉 아민 수산화 효소와 히스타민 산화효소의 연속 반응을 이용한 히스타민 검출방법 Download PDF

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Abstract

식육, 선어 등의 식품 검사나 생체 시료의 측정에 대해 시료 중에 포함되는 히스타민 농도를 두 가지 효소의 연속 효소 반응을 이용해서 특이적으로 고감도로 분석하는 방법으로 히스타민 검출 및 히스타민 센서로 이용하기 위한 히스타민 검출 방법이 개시된다. 본 발명은 (a) 시료에 바이오제닉 아민 수산화 효소를 첨가하여 히스타민을 제외한 바이오제닉 아민에 수산기(-OH)를 부착하는 단계; (b) 상기 (a)단계 이후 시료에 히스타민 산화효소를 첨가하는 단계; 및 (c) 시료에 염료를 첨가하여 히스타민 산화효소에 의하여 발생된 과산화물을 검출하는 단계를 포함하는 히스타민 검출 방법을 제공한다.

Description

바이오제닉 아민 수산화 효소와 히스타민 산화효소의 연속 반응을 이용한 히스타민 검출방법{Histamine Detection Method Using Cascade Enzymes Reaction by Biogenic Amine Hydroxylase and Histamine Oxidase}
본 발명은 바이오제닉 아민 수산화 효소와 히스타민 산화효소의 연속 반응을 이용한 히스타민 검출방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 식육, 선어 등의 식품 검사나 생체 시료의 측정에 대해 시료 중에 포함되는 히스타민 농도를 두 가지 효소의 연속 효소 반응을 이용해서 특이적으로 고감도로 분석하는 방법으로 히스타민 검출 및 히스타민 센서로 이용하기 위한 히스타민 검출 방법에 관한 것이다.
히스타민은 히스티딘의 탈탄산 작용에 의해서 생성되는 생체 아민의 일종이며, 식중독 증상, 고혈압과 두통 구토를 유발하며 특히 알레르기 반응을 일으키며 식육이나 어패류의 부패의 지표물질로도 알려져 있다.현재 시료에서 히스타민의 함량을 분석하는 방법은 시료에서 추출한 히스타민을 유도체화하여 이를 HPLC 또는 LC/MS 등의 분석기기를 이용하여 분석하는 기기적 분석법을 사용하고 있다. 이러한 기기분석법은 민감도가 매우 높으며, 정량 및 정성 분석이 모두 가능하다는 장점이 있다. 하지만, 이러한 기기분석법들을 이용하는 것은 해당 기기들을 구입하는데 소요되는 비용이 엄청나며, 신속한 분석을 이끌어내기 어렵다. 또한, 시료가 식품이라는 점에서 유통기한을 지키는 것과 생산 제조 후 신속히 제품의 검사를 완료하고 밀봉하여 유통해야 하는 식품 관련 분야 현장에서는 사용되기 어렵다는 문제점이 있다. 이러한 기기분석법의 문제점을 극복하기 위하여 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)법이 개발되었다. 이러한 ELISA는 항원 또는 항체에 효소(주로 고추냉이에서 유래한 퍼옥시데이즈)를 중합시킨 후, 효소의 활성을 이용하여 항체와 항원의 결합 정도를 정량적으로 측정하는 방법이다. 그러나 효소면역분석법은 복잡한 실험 과정과 낮은 선택도와 민감도 그리고 높은 가격 등의 문제점이 있다. 이를 위해서 히스타민 탈수소효소를 이용한 효소기반의 검출 키트가 개발되어 있으나 이때 사용하는 발색 염료가 발색 반응에 의한 검출로 한정되고 재현성 및 정밀성 등에 문제점이 있다. 히스타민의 고감도 측정법을 위해서 발색 및 형광 염료를 모두 사용할 수 있는 히스타민 산화효소의 사용은 큰 장점을 가지고 있지만 이 효소는 히스타민에 대한 활성뿐 아니라 티라민에 대한 활성이 높아서 히스타민 고감도 측정법에 사용하기 어렵다는 문제점이 있다. 이를 개선하기 위해서 히스타민에 특이적인 히스타민 산화효소를 탐색하거나 단백질공학적으로 개량하는 연구를 수행하고 있다. 그러나 이러한 방법은 산업적으로 이용하는 데에는 한계적이므로 바로 산업적으로 이용이 가능한 히스타민의 농도를 특이적으로 검출 할 수 있는 기술이 필요하다.
대한민국 등록특허 제1423952호에서는 바이오제닉 아민의 함량 분석용 단백질 및 그 제조방법에 관하여 개시하고 있다. 본 발명에서는 특정 서열을 가지는 단백질을 이용하여 식품관련 산업 현장에서 바이오제닉 아민(히스타민 포함)을 직접적으로 검출할 수 있지만, 특정 서열을 가지는 단백질을 제조하는 비용이 많이 소요됨에 따라 제한적인 용도에서만 사용 가능하다는 단점을 가진다.
[문헌1] Characterization of amine oxidases from Arthrobacter aurescens and application for determination of biogenic amines. Jae-Ick Lee, Young-Wan Kim, World J Microbiol Biotechnol. 29: 673-82 (2013) [문헌2] Flow injection and photometric determination of hydrogen peroxide in rainwater with N-ethyl-N-(sulfopropyl)aniline sodium salt. Brooks C. Madsen , Mark S. Kromis, Anal Chem. 56: 2849-2850 (1984)
따라서 본 발명은 상기 문제점을 해결하고자 안출된 것으로, 두 가지 효소의 연쇄반응을 이용하여 히스타민의 함량을 측정함에 따라, 고가의 장치 및 특정 서열을 가지는 단백질을 사용하지 않고도 히스타민의 함량을 정확히 측정 가능한 바이오제닉 아민 수산화 효소와 히스타민 산화효소의 연속 반응을 이용한 히스타민 검출방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, (a) 시료에 바이오제닉 아민 수산화 효소를 첨가하여 히스타민을 제외한 바이오제닉 아민에 수산기(-OH)를 부착하는 단계; (b) 상기 (a)단계 이후 시료에 히스타민 산화효소를 첨가하는 단계; 및 (c) 시료에 염료를 첨가하여 히스타민 산화효소에 의하여 발생된 과산화물을 검출하는 단계를 포함하는 히스타민 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 바이오제닉 아민은 티라민(Tyramine), 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine), 카다베린(Cadaverine), 트립타민(Tryptamine), 페네틸아민(phenylethylamine), 스페르민(Spermine), 스페르미딘(Spermidine), 도파민(Dopamine), 아드레날린(Adrenaline) 또는 세로토닌(Serotonin)인 것을 특징으로 하는 히스타민 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 히스타민 산화효소는 Arthrobacter gloformis에서 분리된 것을 특징으로 하는 히스타민 검출방법을 제공한다.
또한 상기 염료는 발색 염료 또는 형광 염료인 것을 특징으로 하는 히스타민 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 염료는 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine) 또는 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline)인 것을 특징으로 하는 히스타민 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 과산화물은 과산화수소인 것을 특징으로 하는 히스타민 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 시료는 식료품인 것을 특징으로 하는 히스타민 검출 방법을 제공한다.
이러한 본 발명에 따르면 두 가지 효소의 연속 반응을 통하여 식품내의 히스타민만을 선택적으로 검출하므로, 기존의 히스타민 검출 방법에 비하여 정확하고, 고가의 검출 장비나 검출용 시약을 사용하지 않으므로, 효율적인 히스타민 검출에 유용하다.
도 1은 히스타민 산화효소가 히스타민과 반응하여 과산화수소를 생성하고, 상기 과산화수소가 염료(Amplex red)와 반응하여 발색 또는 형광이 검출되는 것을 도시한 모식도,
도 2는 (A) 히스타민 산화효소의 농도에 따른 히스타민의 반응성을 측정한 그래프, (B) 히스타민의 농도에 따른 염료의 발색 정도를 나타낸 그래프,
도 3은 바이오제닉 아민, 히스타민 및 옥토파민이 히스타민 산화효소와 반응하는 경우 활성도를 표시한 그래프.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명자들은 기존의 히스타민 검출 방법이 고가의 검출장비를 사용하거나 특정 서열을 가지는 단백질을 이용하므로, 히스타민 검출에 있어서 많은 비용이 필요한 문제에 주시하고 이를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과 두가지 효소의 연속반응을 이용하는 경우 히스타민만을 선택적으로 검출 가능하다는 것을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명은, (a) 시료에 바이오제닉 아민 수산화 효소를 첨가하여 히스타민을 제외한 바이오제닉 아민에 수산기(-OH)를 부착하는 단계; (b) 상기 (a)단계 이후 시료에 히스타민 산화효소를 첨가하는 단계; 및 (c) 시료에 염료를 첨가하여 히스타민 산화효소에 의하여 발생된 과산화물을 검출하는 단계를 포함하는 히스타민 검출 방법에 관한 것이다.
기존의 히스타민 검출 방법의 경우 히스타민을 정량적으로 검출하기 위하여 분석기기를 이용하는 방법이 주로 사용되었다. 하지만 히스타민 검출에 사용되는 분석기기들은 기기의 가격이 고가이며, 크기가 매우 크므로, 현장에서 즉각적인 사용에는 많은 어려움이 있다. 이를 해결하기 위하여 효소 면역 분석을 이용하는 방법이 사용되었지만, 이 분석법은 히스타민이 아닌 다른 바이오제닉 아민에도 효소가 반응함에 따라 낮은 선택도를 보이는 단점을 가지고 있었다. 본 발명에서는 이를 해결하기 위하여, 히스타민을 제외한 바이오제닉 아민을 수산화효소를 이용하여 수산화한 다음, 히스타민 산화효소를 첨가하여 히스타민 만을 선택적으로 산화한다. 이때 산화에 의하여 발생하는 과선화물(과선솨수소)의 양을 측정하는 경우, 히스타민의 함량을 정확히 측정할 수 있다.
도 1에 나타난 바와 같이 본 발명은 히스타민 산화효소가 히스타민에 대한 반응으로 과산화수소와 4-이미다졸알데히드(4-Imidazyolaldehyde)를 생성하고 이때 생성된 과산화수소가 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)에 발색 및 형광 염료인 amplex red를 발색 및 형광으로 검출하여 히스타민을 검출 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오제닉 아민은 티라민(Tyramine), 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine), 카다베린(Cadaverine), 트립타민(Tryptamine), 페네틸아민(phenylethylamine), 스페르민(Spermine), 스페르미딘(Spermidine), 도파민(Dopamine), 아드레날린(Adrenaline) 또는 세로토닌(Serotonin)인 것을 특징으로 할 수 있다. 바이오제닉 아민은 식품의 발효 또는 저장 과정에서 미생물이 단백질은 분해하여 생성되는 물질로, 일종의 부패 산물이다. 이러한 바이오제닉 아민은 다량의 단백질을 가지는 콩이나 우유 등을 발효하는 과정에서 주로 생성되며, 이밖에도 육류나 생선이 부패하는 과정에서도 많이 발생하는 것으로 알려져 있다. 이들중 히스타민은 알레르기 유발의 원인 물질로 알려져 있어 식품의 장기 보관시 특히 주의가 필요하다. 따라서 본 발명은 히스타민을 제외한 다른 종류의 바이오제닉 아민은 바이오제닉 아민 수산화효소를 사용하여 검출되지 않도록 불활성화 하는 것이 바람직하며, 특히 티라민을 불활성화하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 히스타민 산화효소는 Arthrobacter gloformis에서 분리된 것을 특징으로 할 수 있다. 히스타민 산화효소는 히스타민과 반응하여 과산화물을 생성하는 물질로 이때 반응은 산화반응에 해당한다. 또한 상기 산화효소에 의하여 생성되는 과산화물은 검출이 가능한 과산화물이라면 제한없이 생성 가능하지만, 비교적 쉽게 검출 가능하며, 인체 독성이 적은 과산화수소가 생성되는 것이 더욱 바람직하다.
이후 생성된 과산화물은 염료를 첨가하여 측정하며, 염료의 경우 과산화물과 혼합되면 색상이 변하거나 형광을 발생하므로, 과산화물의 농도를 쉽고 빠르게 측정 가능하다. 이때 사용되는 염료는 검출의 용이성을 위하여 발색염료 또는 형광염료인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 형광염료를 사용 가능하다.
또한 상기 염료는 과산화물의 농도에 따라 색상이 변화하는 것이라면 제한 없이 사용 가능하지만 바람직하게는 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine, Amplex Red) 또는 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, DAOS)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 식료품인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명은 주로 단백질의 발효 또는 부패에 의하여 생성되는 바이오제닉 아민인 히스타민을 그 검출 대상으로 하고 있으므로, 시료는 식료품인 것이 바람직하다. 하지만, 히스타민을 발생시킬 수 있는 물질에는 제한없이 사용 가능하며, 혈액내의 히스타민 농도측정 등에도 사용 가능하다.
이하, 본 발명에 따른 구체적인 실시예를 들어 설명한다.
실시예
(1) 히스타민 산화효소의 활성 측정
Arthrobacter gloformis에서 히스타민 산화효소를 분리하고 이의 효소 활성을 바이오제닉 아민 중 히스타민, 티라민, 페네틸아민, 카다베린, 스페르민 및 히스타민의 전구체 아미노산인 히스티딘에 대해 효소 활성을 조사하였다.
그 결과 상기 히스타민 산화효소는 티라민과 히스타민에 대해 높은 효소 활성을 나타내었으며 페네틸아민에 대해서는 매우 낮은 효소 활성을 나타내었다. 또한 나머지 바이오제닉 아민과 히스티딘에 대해서는 활성을 나타내지 않은 것으로 나타났다.
상기 히스타민 산화효소가 히스타민에 대한 효소 활성을 조사하기 위하여 200ml의 용량을 가지는 마이크로 웰(Micro well)에 1mM의 히스타민을 공급하였으며, 색상의 변화를 조사하기 위하여 0.2mM의 Amplex Red를 공급하였다. 히스타민 산화효소는 각 0, 5, 10, 20, 30, 50㎕를 투입하여 반응을 수행하였다. 반응이 완료된 이후 571nm의 파장을 가지는 빛을 측정하여 활성을 측정하였다.
도 2(A)에 나타난 바와 같이, 히스타민 산화효소의 농도가 높아질수록 히스타민에 대한 반응성이 높아지고 있으며, 일정농도 이상에서는 반응이 완전하게 이루어져 상승 폭이 둔화되는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 일정 농도 이상의 히스타민 산화효소를 공급하는 경우 시료내의 히스타민이 전부 반응하면서 정확한 히스타민 함량을 측정할 수 있는 것으로 나타났다.
(2) 생성된 과산화수소의 함량 측정
상기 히스타민 산화효소에 의하여 히스타민에서 분리된 과산화수소를 정량하기 위하여 200ml의 용량을 가지는 마이크로 웰(Micro well)에 10ml의 히스타민 산화효소를 투입하였으며, 색상의 변화를 조사하기 위하여 0.2mM의 Amplex Red를 공급하였다. 히스타민은 각 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10mM 투입하여 반응을 수행하였다. 반응이 완료된 이후 571nm의 파장을 가지는 빛을 측정하여 활성을 측정하였다.
도 2(B)에 나타난 바와 같이, 히스타민의 양에 따라 색상이 정량적으로 변화하고 있는 것을 알 수 있었다. 이에 따라 염료의 색상변화에 의하여 히스타민의 양을 정략적으로 측정할 수 있음을 확인할 수 있었다.
(3)히스타민 산화효소의 선택도를 높이기 위한 티라민의 변환
상기 Arthrobacter gloformis에서 분리된 히스타민 산화효소의 경우, 히스타민에 높은 활성을 가지고 잇지만, 다른 바이오제닉 아민에도 활성을 가지는 것으로 나타났다. 히스타민 이외의 바이오제닉 아민과 히스타민 산화효소가 반응하는 경우, 히스타민의 양에 비하여 생성되는 과산화물의 양이 많아져 선택도에 문제가 있을 수 있다. 따라서, 다른 바이오제닉 아민, 특히 활성이 높은 티라민을 변환하여 히스타민의 선택도를 높이는 것이 바람직하다.
바이오제닉 아민, 히스타민 및 바이오제믹 아민 수산화 효소에 의하여 티라민으로부터 합성된 옥토파민의 활성을 실험하였다.
200ml의 용량을 가지는 마이크로 웰(Micro well)에 10㎕의 히스타민 산화효소를 투입하였으며, 색상의 변화를 조사하기 위하여 0.2mM의 Amplex Red를 공급하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 히스타민 산화효소는 티라민 및 히스타민에 높은 활성도를 나타냈으며, 옥토파민에는 낮은 활성도를 나타냈다. 이로부터 시료의 히스타민 양을 측정하기 위하여 히스타민 산화효소를 사용하기 이전에 바이오제닉 아민 수산화 효소를 사용하는 경우, 티라민을 옥토파민으로 변환시켜 히스타민의 선택도를 높일 수 있는 것으로 나타났다.
이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 다음의 단계를 포함하는 히스타민 검출방법:
    (a) 시료에 바이오제닉 아민 수산화 효소를 첨가하여 히스타민을 제외한 바이오제닉 아민에 수산기(-OH)를 부착하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계 이후 시료에 히스타민 산화효소를 첨가하는 단계; 및
    (c) 시료에 염료를 첨가하여 히스타민 산화효소에 의하여 발생된 과산화물을 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바이오제닉 아민은 티라민(Tyramine), 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine), 카다베린(Cadaverine), 트립타민(Tryptamine), 페네틸아민(phenylethylamine), 스페르민(Spermine), 스페르미딘(Spermidine), 도파민(Dopamine), 아드레날린(Adrenaline) 또는 세로토닌(Serotonin)인 것을 특징으로 하는 히스타민 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 히스타민 산화효소는 Arthrobacter gloformis에서 분리된 것을 특징으로 하는 히스타민 검출방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 염료는 발색 염료 또는 형광 염료인 것을 특징으로 하는 히스타민 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 염료는 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine) 또는 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline)인 것을 특징으로 하는 히스타민 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 과산화물은 과산화수소인 것을 특징으로 하는 히스타민 검출 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 식료품인 것을 특징으로 하는 히스타민 검출 방법.
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