KR102565102B1

KR102565102B1 - 금나노입자 및 크레아티닌과의 상호작용을 이용한 크레아티닌 검출용 조성물 및 이를 이용한 크레아티닌 검출방법

Info

Publication number: KR102565102B1
Application number: KR1020200156723A
Authority: KR
Inventors: 박태정; 박종필; 핑수; 백승훈; 박찬영; 펭수휘
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-20
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2023-08-10
Also published as: KR20220070121A

Abstract

본 발명은 금나노입자 및 크레아티닌과의 상호작용을 이용한 크레아티닌 검출용 조성물 및 이를 이용한 크레아티닌 검출방법에 관한 것으로, 낮은 농도의 크레아티닌에서도 특이적으로 결합할 수 있어, 이를 이용하여 높은 민감도로 크레아티닌을 검출할 수 있다.

Description

금나노입자 및 크레아티닌과의 상호작용을 이용한 크레아티닌 검출용 조성물 및 이를 이용한 크레아티닌 검출방법 {COMPOSITION FOR CREATININE DETECTION USING INTERACTION BETWEEN GOLD NANOPARTICLE AND CREATININE AND METHOD FOR CREATININE DETECTION USING THE SAME}

본 발명은 금나노입자 및 크레아티닌과의 상호작용을 이용한 크레아티닌 검출용 조성물 및 이를 이용한 크레아티닌 검출방법에 관한 것이다.

크레아티닌은 하기 구조식을 갖는 염기성 물질로, 크레아틴의 무수물이며 크레아틴 대사의 최종산물이다.

생체 내에서는 주로 근육 중에 크레아틴인산 형태로 존재하지만, 이 크레아틴이 대사과정에서 탈수, 환원된 것이 크레아티닌이고, 요중으로 배설된다. 이는 정상적으로 사구체에서 대부분 여과가 되기 때문에 흔히 혈액내 크레아티닌 농도로써 신장의 기능을 체크하고 있다. 이 크레아티닌 농도가 높다는 것은 사구체에서 정상적으로 여과를 못 시키는 의미이자 신장의 기능이 떨어졌다는 의미이다. 정상적인 성인의 크레아티닌 혈중 농도는 남성: 0.8 ~ 1.2 ㎎/㎗ 및 여성 : 0.5 ~ 1.0 ㎎/㎗ 이다. 최근에는 혈청 크레아티닌 농도를 0.58 mg/mL^-1 수준으로까지 감소시키는 크레아틴 생합성을 하는 신생아에게서 구아니디노아세테이트 메틸트랜스퍼라제 (Guanidinoacetate methyltransferase)의 결핍이 보고되었다. 따라서 매우 낮은 검출 한계를 갖는 정확하고 빠른 크레아티닌 검출법이 더욱 요구되고 있다.

크레아티닌을 측정하는 데에 가장 많이 이용하는 방법은 자페(Jaffe) 반응으로, 크레아티닌과 피크르산염 (picrate)이 결합하여 야노프스키(Janovski) 결합물을 생성하는 반응을 이용하면 분광학적인 방법으로 측정한다. 그러나, 이 방법은 빌리루빈, 우레아, 및 도파민과 같은 다른 혈액 내 대사물질에 의해 심각한 영향을 받으므로 선택성이 부족하고 따라서 샘플에 대한 예비 처리 과정이 요구된다. 다른 한편, 크레아티닌 측정을 위한 효소적 캐스캐이드와의 결합을 기반으로 하는 전기화학적 또는 photonic 방법이 제안되었으나 이들은 비싼 효소 반응, 오랜 분석 시간, 효소의 불안정성, 산화-환원 반응성의 방해 물질들 및 복잡한 센서의 제조 등의 문제점을 안고 있다. 그 외 크레아티닌 측정을 위한 방법에는 크로마토그래픽 방법, 전기화학적 방법, 전위차 적정법, NMR 분광법, 전통적인 자페 반응을 이용한 키네틱 분광광도-플로우-인젝션 방법, 전도율 적정법, 및 전기 화학적 임피던스 분광법이 있다.

더욱 정확한 크레아티닌의 측정을 위하여, MIP를 이용하는 많은 방법들이 제안되었다. 예를들면, 다른 모노머 화합물들을 사용하는 흡수 방법을 구비하는 MIP, 그래파이트 전극 상의 MIP 변형된 졸-겔 필름, 분자-각인된 고체상 추출 고분자 겔, 형광도 측정을 위한 컴퓨터상으로 디자인된 MIP, 정전용량 측정법, 전압 전류법 등이 보고되어 있다.

그러나 전기화학적 센서에서 물질의 인식체로서 MIP를 사용하는 것은 몇 가지 문제점을 내포하고 있는데, 그 중 대표적인 것은 느린 물질 이동 속도 및 낮은 흡착 용량이다. 이에 따라 그래핀, 나노입자, 특히 금 나노입자 (AuNP)와 같은 높은 표면적을 제공하는 물질들을 이용하는 연구가 활발하게 이루어졌다. 그래핀(Grapheneoxide, GO)은 우수한 생체 적합성, 높은 전기적 특성, 및 친양쪽성 특성을 갖는 물질이다. 따라서 빠른 전자 이동을 효과적으로 촉진시킬 수 있도록 GO 및 AuNP 를 포함하는 결합물질 제조에 대한 보고가 많이 되어왔다.

이에, 본 발명자들은 크레아티닌을 검출할 수 있는 수단에 대해 연구한 끝에, 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2015-0107006 A1

본 발명의 일 크레아티닌에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 펩타이드 및 금 나노입자를 포함하는 크레아티닌 검출 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 일 양상은 시료를 상기 펩타이드와 반응하여 반응물을 제조하는 단계 및 상기 반응물을 금 나노입자에 접촉시키는 단계를 포함하는 크레아티닌 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 크레아티닌에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 제공한다.

상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산으로 이루어진 펩타이드는 크레아티닌에 특이적으로 결합하는 것으로, 후술되는 바와 같이 시료에 크레아티닌이 있는 경우 존재하는 크레아티닌과 상기 펩타이드가 결합하고, 크레아티닌 결합 펩타이드가 금 나노입자와 결합하거나 (서열번호 1 또는 2의 펩타이드), 금나노입자들의 응집을 방해함으로써 (서열번호 3의 펩타이드) 크레아티닌이 없는 경우와 다른 발색양상을 나타낸다. 구체적으로 서열번호 1 또는 2의 펩타이드를 사용하는 경우 크레아티닌과 상기 펩타이드가 결합하고 크레아티닌 결합 펩타이드가 금 나노입자와 결합하여 푸른 빛을 나타내어 크레아티닌이 없는 경우 펩타이드가 금 나노입자와 결합하여 붉은 빛을 나타내는 것과 구별된다. 또한, 서열번호 3의 펩타이드를 사용하는 경우 크레아티닌과 상기 펩타이드가 결합하고 크레아티닌 결합 펩타이드가 금나노입자의 응집을 방해하여 붉은 빛을 나타내어 금 나노입자가 응집하여 푸른 빛을 나타내는 것과 구별된다 (도 1 참조).

본 발명에서 사용되는 용어 "펩타이드"는 일반적으로 대략 아미노산 수십개 전 후로 이루어지는 비교적 작은 펩타이드를 의미하고, 보다 구체적으로 본 발명에서는 상술한 펩타이드를 구성하는 10개 및 25개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 의미한다. 본 발명에 따른 펩타이드는 항체에 비해 상대적으로 대량 생산이 용이하고, 독성이 거의 없는 장점이 있다. 또한 크레아티닌에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 결합시켜 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 제작한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif,1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990. 본 발명의 펩타이드는 N-말단의 아미노 말단의 반응성 제거를 위한 공지된 변성이 가능하고, 예를 들어 아세틸화(Acetylation)가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명인 펩타이드의 타겟인 크레아티닌은 크레아틴 대사의 최종산물이고, 신장 질환의 판단을 위한 표준이 되는 물질이다. 만성 신장 질환뿐만 아니라 신생아에서부터 신장 질환이 확인되기 때문에 매우 낮은 검출 한계를 갖는 정확하고 빠른 크레아티닌 검출법이 더욱 요구되고 있다.

본 발명의 펩타이드는 크레아티닌에 대해 높은 선택성과 민감도를 높이고, 구체적으로 서열번호 1의 펩타이드는 탐지 한계 (LOD)가 0.025ppm, 서열번호 2는 0.657ppm, 서열번호 3은 0.346ppm 로 높은 선택성과 민감도를 가지는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 사용되는 크레아티닌 검출에서는 낮은 농도의 크레아티닌에 대해서도 반응하여 육안에서도 간이하게 확인 가능하다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 폴리뉴클레오티드는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990))

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 본 발명인 크레아티닌 표적용 펩타이드의 변화를 가져올 수도 있다. 본 발명인 펩타이드의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명인 크레아티닌에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다. 본 발명인 크레아티닌에 특이적으로 결합하는 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 펩타이드 및 금 나노입자를 포함하는 크레아티닌 검출 키트를 제공한다.

본 발명의 "금 나노입자 (Au nanoparticle, AuNP)"는 화학적으로 안정할 뿐만 아니라, 다양한 개질이 용이하고, 플라즈모닉 특성을 비롯한 우수한 광학적 성질을 나타내므로 바이오물질 검지에서 프로브 등으로 다양하게 활용되고 있다. 그러나, 금 나노입자를 프로브로써 사용할 경우 가시적인 신호 세기를 얻기 위해서는 매우 높은 밀도 및/또는 개수로 표지하는 것이 요구되며, 이는 별도의 증폭 과정 없이는 바이오물질에 대한 검출한계가 근본적으로 낮음을 의미한다. 보다 낮은 검출 한계를 달성하기 위하여 표면증강라만산란법(surface-enhanced Raman scattering; SERS), 전도율 측정법 (conductometric), 전기화학적 박리법(stripping) 등의 검출방법이 개발되고 있으나 별도의 장비와 여러 단계를 통한 측정 방법이 필요하다는 단점이 있다. 따라서, 현장현시검사(point of care testing)와 같은 기술적 요구에 대하여, 검지에 활용된 금 나노입자에 은 또는 금 나노껍질(shell)을 추가로 도입하여 프로브의 광학적 산란신호를 증폭하는 방법이 사용되고 있으나 재현성 및 민감도 등의 측면에서 한계가 있다.

본 발명의 일 구체예로서 상기 펩타이드는 금 나노입자의 표면에 결합되는 것일 수 있다. 전술한 바와 같이 상기 서열번호 1 내지 3의 아미노산으로 이루어진 펩타이드는 크레아티닌에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라 금 나노입자 표면에도 결합하기 때문에, 시료에 크레아티닌이 있는 경우 존재하는 크레아티닌과 상기 펩타이드가 결합하고, 크레아티닌 결합 펩타이드가 금 나노입자와 결합하거나 (서열번호 1 또는 2의 펩타이드), 금나노입자들의 응집을 방해함으로써 (서열번호 3의 펩타이드) 크레아티닌이 없는 경우와 다른 발색양상을 나타낸다 (도 1 참조).

전술한 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 크레아티닌에 대해 높은 선택성과 민감도를 높이고, 구체적으로 서열번호 1의 펩타이드는 탐지 한계 (LOD)가 0.025ppm, 서열번호 2는 0.657ppm, 서열번호 3은 0.346ppm로 높은 선택성과 민감도를 가지는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 사용되는 크레아티닌 검출에서는 낮은 농도의 크레아티닌에 대해서도 반응하여 육안에서도 간이하게 확인 가능하다.

본 발명의 다른 일 양상은 시료를 상기 펩타이드와 반응하여 반응물을 제조하는 단계 및 상기 반응물을 금 나노입자에 접촉시키는 단계를 포함하는 크레아티닌 검출 방법을 제공한다.

상기 검출 방법은 전술한 펩타이드를 사용함으로써, 전술한 원리를 통해 시료의 크레아티닌을 검출할 수 있다.

본 발명의 펩타이드 및 이를 포함하는 크레아티닌 검출 키트는 낮은 농도의 크레아티닌에서도 특이적으로 결합할 수 있어, 이를 이용하여 높은 민감도로 크레아티닌을 검출할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 크레아티닌의 검출의 기전을 나타낸 도면이다.
도 2는 BSA 및 크레아티닌의 농도 별 ((a) 4:1, (b) 2:1 및 (c) 1:1)BSA 및 BSA-크레아티닌에 대한 아가로스 겔 이미지이다.
도 3는 BSA 및 BSA-크레아티닌의 MALDI-TOF 스펙트럼이다.
도 4는 BSA, 크레아티닌 및 BSA-크레아티닌의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명에서 사용되는 금 나노 입자에 대한 데이터이고, 구체적으로 (a) 금 나노입자의 UV-vis 스펙트럼, (b) 금 나노입자의 제타포텐셜 및 (c) 금 나노입자의 TEM이미지이다.
도 6은 본 발명의 펩타이드과 금 나노입자의 광학 스펙트럼 결과로서, 구체적으로 (a) 는 APC01C (서열번호 1) (b)는 APC02C (서열번호 2) 및 (c)는 APC03C 펩타이드를 사용한 것이고, 크레아티닌이 존재/부존재시의 결과이다.
도 7은 크레아틴 존재/부존재시 금 나노입자와 APC03C의 제타포텐설 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 (a) 금 나노입자, (b) 금 나노입자+APC03C, (c) 금 나노입자+APC03C+NaCl, (d) 금 나노입자+크레아티닌+NaCl 및 (e) GNPs+APC03C+크레아티닌+NaCl 의 경우이다.
도 8은 다양한 펩타이드 ((a) APC01C (서열번호 1), (b) APC02C (서열번호 2) 및 (c) APC03C (서열번호 3))와 금 나노입자를 사용한 크레아티닌 검출의 반응시간을 나타낸 것이다.
도 9는 다양한 pH 의 PBS에서 다양한 펩타이드 ((a) APC01C (서열번호 1), (b) APC02C (서열번호 2) 및 (c) APC03C (서열번호 3))와 금 나노입자를 사용한 크레아티닌 검출의 흡수 변화를 나타낸 것이다.
도 10은 다양한 펩타이드 ((a) APC01C (서열번호 1), (b) APC02C (서열번호 2) 및 (c) APC03C (서열번호 3))와 금 나노입자를 사용한 크레아티닌의 검출에서 0-100ppm 범위에서의 캘리브레이션 그래프를 나타낸 것이다.
도 11은 다양한 펩타이드 ((a) APC01C (서열번호 1), (b) APC02C (서열번호 2) 및 (c) APC03C (서열번호 3))와 금 나노입자 및 다른 분석물질 (크레아티닌, 요산, PBS, 요소 BSA; 50ppm)의 흡수 비율을 나타낸 것이다.
도 12는 다양한 펩타이드 ((a) APC01C (서열번호 1), (b) APC02C (서열번호 2) 및 (c) APC03C (서열번호 3))와 금 나노입자를 사용하여 스파이크 소변 샘플에서 크레아티닌 검출을 하기 위한 0-100ppm 범위에서의 캘리브레이션 그래프를 나타낸 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

화학물질

인산버퍼식염수 (PBS, pH 7.4), 소혈청 알부민 (BSA),　1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디미드염산염수(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, (EDC), 크레아티닌 및 금 (III) 염화 수화물은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 2-(N-모르폴리노) 에탄설포닉산 (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid, MES) 및 염화암모늄 (NH₄Cl)은 alfa aesar (Ward Hill, MA, USA)에서 구매하였다. 염화나트륨은 덕산 (Ansan, Korea)에서 구매하였다. 에탄올은 대정케미컬 (Siheung, Korea)에서 얻었다. 염화칼슘 (CaCl₂) 및 요소는 삼천 (Seoul, Korea)에서 얻었다. 황산 마그네슘 (MgSO₄), 염화칼륨 (KCl) 및 황산나트륨(Na₂SO₄)은 덕산 (Ansan, Korea)에서 얻었다. 중탄산나트륨 (NaHCO₃)은 DC 케미컬 (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 인산 수소 나트륨 (Na₂HPO₄) 및 인산 이수소 나트륨 (NaH₂PO₄) 은 간토 케미컬에서 구입하였다 (Tokyo, Japan). 구연산 나트륨과 요산은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. SMART^TM BCA 단백질 검사 키트는 iNtRON Biotechnology (Seongnam, Korea)에서 구매하였다. 아가로스는 타카라 (Shiga, Japan)에서 구매하였다. 수크로스, EDTA, 황산 및 글라이신은 준세이 (Tokyo, Japan)에서 구매하였다. Luria-Bertani (LB) 배지 (리터당 10 g 박토-트립톤(bacto-tryptone), 5 g 효모 추출물, 5 g NaCl) 는 BD Bioscience (San Jose, CA, USA)에서 구매하였다. Escherichia coli ER2738 균주 및 Ph.D.¹² phage-display library kit는 New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)에서 구매하였다.

기구

BSA-크레아티닌은 Voyager DE-STR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization and time of flight mass spectrometry)로 식별하였다. Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT, USA) 기구를 이용하여 UV-vis 흡수 스펙트럼을 확인하였다. DLS 및 제타포텐셜 측정은 particle size analyzer (ELSZ-1000 system, Photal OTSUKA Electronics, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. multi-mode microplate reader (BioTek Synergy H1)를 이용하여 UV-vis 흡광 정보를 얻었다. Fourier transform-infrared (FT-IR) 스펙트럽은 FT-IR spectrometer (Jasco 6600FV, Jasco, and Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다.

크레아티닌 및 BSA (BSA-크레아티닌)의 합성

2.0mg의 저온 BSA는 200μL의 MES 버퍼 (0.1 M MES, pH 5.0)에 용해시켰다. 다양한 농도의 크레아티닌을 상기 200μL의 MES 버퍼에 용해시키고 BSA 용액과 혼합하였다. BSA 및 크레아티닌의 최종 농도 비율은 4:1, 2:1 및 1:1이었다. BSA의 결합을 달성하기 위해 10mg/mL EDC 용액 100μL가 첨가되었고, 혼합한 뒤 상온에 3시간 두어 반응시켰다. 결합물은 수 일간 투석을 이용하고 정제하였고, 4℃의 무균 용기에 보관하였다.

BSA-크레아티닌의 특성 분석

BSA-크레아티닌의 확인은 아가로스 겔 전기영동, MALDI-TOD 및 FT-IR 분석을 통해 수행하였다. 분자량 및 헵텐의 정확한 크기를 확인하기 위해 아가로스 겔 전기영동 (N-AGE)26 및 MALDI-TOF 분석을 사용하여 비부정화 방법을 채용하였다. 즉, TAE 버퍼 (40 mM Tris-acetic acid, 2 mM EDTA)를 준비하였고, 전기영동 버퍼에 사용하였고, 4℃에서 보관하였다. 로딩 버퍼는 6.67% (w/v) 수크로스, 20 mM EDTA, 0.04% (w/v) BPB (bromophenol blue) 및 1% 아가로스 겔을 이용하여 준비하였다. 10 μL 의 각 샘플 (0.2 mg/mL) 및 10 μL 의 로딩버퍼 혼합물은 겔에 첨가하였고, 이어서 상기 샘플들은 240 V의 포텐셜 4°C에서 30분간 분리하였다. 상기 겔은 20%의 크리클로로아세트산을 이용하여 20분간 고정하였고, 이어서 코마시 블루 염색 용액으로 염색한 후 탈염색 용액 (10 vol% acetic acid and 5 vol% ethanol)으로 탈염색하였다. 이는 맑은 용액이 얻어질 때까지 물을 교체하면서 계속 이루어졌다. 겔의 이미지는 ChemiDocTM MP imaging system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 촬영하였다.

BSA-크레아티닌을 이용한 파지-디스플레이 스크리닝

0.1M NaHCO₃ 내 100μg/mL의 BSA 및 BSA-크레아티닌은 96-웰 플레이드에 4℃ 밤새 처리하였다. TBST [50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 150 mM NaCl and 0.1% Tween 20]로 3회 세척한 뒤, 플레이트는 파지 블로킹 버퍼 [0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/mL BSA, filter sterilized]로 로 2시간 동안 블록 하였고, TBST로 6회 세척하였다. 다음으로 BSA 결합된 플레이트는 100μL의 파지 라이브러리 (1Х10¹¹ pfu/mL)로 25℃에서 40분간 코팅하였고, 이어서 결합되지 않은 파지는 제거하고 BSA-크레아티닌 결합된 플레이트에 위치시키고 25℃에서 40분간 배양하였다. BSA-크레아티닌 플레이트는 TBST로 12회 세척하였고 100μL의 0.2M 글라이신-HCl (pH2.2)으로 25℃에서 20분간 처리하였다. 15μL의 1.0M Tris-HCl(pH9.1)을 용액에 첨가하고 깨끗한 튜브 (도1)로 옮겼다.

파지 DNA의 추출 및 시퀀싱

E. coli ER2738는 테트라사이클린을 포함하는 LB 배지에 0.1mg/mL 37℃에서 접종하였다. 먼저 단일 플라크는 LB 배지에 (600 nm에서 광학 밀도는 약 0.01) 접종하였고, 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 그리고, 용액은 4℃에서 18,341xG에서 30분간 원심분리하였다. 이서서 80%의 상층액은 새로운 튜브로 옮겼고 500μL의 용액은 제거하고, PEG 8000/2.5 M NaCl 용액을 첨가하였다. 상온에서 20분간 배양한 뒤 4℃ 18,341xG에서 10분간 원심분리하였다. 상등액은 완전히 제거되었고, 펠릿은 요오드 버퍼 [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA 및 4 M 염화요오드]에 용해시켰으며, 이어서 99% 에탄올을 첨가하고 상온에서 20분간 배양하였다. 그리고, 용액은 4℃에서 18,341xG에서 30분간 원심분리하였다. 이어서 펠렛은 70%에탄올로 세척하고 상층액은 동일한 조건으로 옮겼다. 마지막으로, 펠릿은 TE버퍼 [10 mM Tris (pH 8.0) 및 1.0 mM EDTA]에 용해시켰다. 또한, 파지 DNA는 -20℃에서 저장되었고, Cosmo Genetech (Seoul, Korea).에 의해 DNA 시퀀싱을 수행하였다.

금 나노입자 (gold nanoparticles, GNPs)의 합성

금 나노입자는 HAuCl₄용액을 이용하는 구연산 나트륨 환원방법을 통해 합성되었다. 여기서 4.0mL의 38.8mM trisodium citrate가 40mL의 끓는 1.0mM HAuCl₄ 용액에 첨가하였다. 이는 15분간 계속 가열, 저어주었다. GNPs가 합성된 뒤 용액의 색은 붉은 색으로 변화되었다.

크레아티닌의 색도 검출 (detection of creatinine)

GNPs의 저장 용액은 크레아티닌 분석을 위해 준비되었다. 상이한 농도의 크레아티닌 (1-100ppm)은 다양한 펩타이드 및 GNPs의 민감도 한계를 확인하기 위해 일정하게 희석하여 얻었다. 상기 펩타이드들은 APC01C(서열번호 1), APC02C(서열번호 2) 및 ACP03C(서열번호 3)으로 이름지었고, 크레아티닌에 대한 다른 검출 방법을 수행하였다.

APC01C와 APC02C의 경우 다른 농도에서 50μL의 크레아티닌과 함께 10μL의 펩타이드 (0.5mg/mL) 용액이 추가되었다. 이후 크레아티닌의 검출을 위해 100μL의 GNPs가 첨가되었다. 시간이 지날수록 더 많은 크레아티닌과 반응함에 따라 펩타이드-GNP는 푸른 빛으로 변했고, 따라서 응집의 형성을 의미한다. APC03C의 경우, 상기한 동일한 방법을 수행하였다; 다만 50μL의 2M NaCl이 첨가되었다. 이어서 더 많은 크레아티닌과 반응함에 따라 펩타이드-GNPs는 붉은색으로 변했고, 따라서 더 많은 GNP가 분산되었음을 의미한다. 이러한 방식은 결합 모이어티 및 아미노산 서열과 같은 펩타이드 개별 특성에 따른 것이고, 이러한 특성이 검출 시스템에서 다양한 성능을 이끌어낸다. 더욱이 신호 발현에 미치는 GNPs 및 크레아티닌의 영향은 다양한 펩타이드의 존재 하에서 특정되었다; 이는 고정 반응 시간 및 비례적 변화를 정량적으로 연구하기 위한 것이다. 색 변화는 UV-vis 분광도계를 통해 모니터링 되었다. 350nm에서 800nm 사이의 흡수 측정을 수행하였다. 522nm 및 590-690nm의 흡수 값은 각각 분산 및 응집된 GNP 수준에 대응한다.

선택도 시험

펩타이드-GNP 기반 탐짐의 선택성을 시험하기 위해, 동일한 최적 실험 조건하에서 요소 BSA, PBS 및 요산(50ppm)과 같은 인간 소변 내 여러가지 다른 화합물을 검출 여부를 확인하였다.

소변 모방 샘플 검사

펩타이드-GNP 프로브는 모의 샘플에 적용하여 실용성을 확인하였다. 샘플은 다음과 같은 조성으로 되어 있다: CaCl2 (0.178 g), MgSO4 (0.200 g), NaHCO3 (0.068 g), Na2C2O4 (0.006 g), Na2SO4 (0.516 g), NaH2PO4 (0,200 g), Na2HPO4 (0.022 g), NaCl (1.268 g), KCl (0.900 g), NH4Cl (0.322 g), 구연산 나트륨 (0.594 g), 요소 (4.854 g), 요산 (0.068 g), 및 크레아티닌 (0-1,000 ppm)를 400 mL 증류수에 용해시킴

실험결과

BSA-크레아티닌의 특성

크레아티닌은 수용성 EDC를 사용하여 BSA에 직접 결합하였다. 결합 과정에서, BSA는 음전하성 카복시 그룹을 포함하는데, 이는 크레아티닌의 1차 아민 그룹과 아마이드 결합을 형성할 수 있다. 크레아티닌과의 조합에서 BSA의 분자는 연장된다. BSA의 카르복실 크룹이 크레아티닌의 아민 크룹에 의해 교체되기 때문에, BSA-크레아티닌의 전체 전하는 원래 BSA에 비하여 더욱 양전하를 나타낸다. 결합체의 겔 전기영동을 통해 이러한 변화를 확인할 수 있다 (도2). N-AGE에서의 순수한 BSA 및 결합체는 명확한 밴드를 보여준다. BSA-크레아티닌의 교차 결합 양식을 다양한 질량 비율의 BSA, 크레아티닌 농도에서 평가하였다 (도 2). 결합물은 음극 (-) 방향으로 이동하는 반면, BSA는 양극(+) 방향으로 이동하였다. BSA-크레아티닌의 밴드는 크레아티닌의 첨가로 인해 더 분자량이 증가하였기 때문에 이동성이 감소하였고, 더 높은 위치에서 확인되었다. 비교를 위해 질량비 2:1로 고정하였고, 이는 많은 중간 물질 없이 정되된 생산물의 형성을 용이하게 한다. BSA과 크레아티닌의 연관성은 MALDI-TOD 및 FT-IR을 통해 확인하였다 (도 3). BSA-크레아티닌은 BSA에 비하여 delayed retention time 및 넓은 피크를 보여주었다. BSA의 분자량은 66.2kDa이고, MALDI-TOF 스펙트럼에서도 유사하게 나타났다. 그러나 BSA-크레아티닌의 경우, 67.6kDa에서 피크가 확인되었고, 이는 크레아티닌과 BSA의 결합을 의미한다. 크레아티닌의 분자량은 113.12Da로 확인되었다. BSA 및 BSA-크레아티닌의 분자량을 비교할 때 BSA에 결합된 크레아티닌의 분자 수는 10.6개로 예측되었다. 더욱이 BSA의 FTIR스펙트럽은 크레아티닌과 결합하기 전에 확인하였다 (도 4), 스펙트럼에서 3054 cm^-1 및 3292 cm^-1 의 밴드가 각각 크레아티닌의 비대칭 및 대칭 N-H 스트레칭 진동으로 인해 발생되었고, 이는 BSA-크레아티닌에서도 확인되었다.

파지-디스클레이 스크리닝

Ph.D.-12?? phage-display peptide library 및 BSA-크레아티닌을 사용하여 3회 바이오패닝이 수행되었다. 전체적인 파지 회복 비율은 바이오패닝이 진행될수록 증가하였다 (표 1)

Sample	Round of panning	Input phage (PFU)	Output phage (PFU)	Phage recovery (output/input, %)
BSA-creatinine (12-mer kit)	1	1.0Х10¹¹	5.9Х10⁵	5.9Х10^-6
	2	1.0Х10¹¹	1.1Х10⁶	1.1Х10^-5
	3	1.0Х10¹¹	3.4Х10⁶	3.4Х10^-5

3회 바이오 패닝 이후, 파지는 용출되었고, DNA가 추출하고 시퀀싱을 수행하였다. 각각의 파지는 고유한 DNA 염기서열을 보존하고, 이는 구체적인 펩타이드를 분류할 수 있다. 표 2는 용출된 파지의 서열 정보를 보여준다.

BSA-creatinine (12-mer kit)

WDMWPSMDWKAE (3 times) 　　　　　(ACP01C, 서열번호1)

VLVRDNLPTTTG 　　　　　　　　　　　　　　(ACP02C, 서열번호 2)

VQVRDNLPTTTG (5 times) 　　　　 (ACP03C, 서열번호 3)

ISVVLCFALGII

GPWYRFSTYEAN

LGYVAVYGWKPE

VDIKSHFSHTGK

LVIPFGRYVSAL

모든 서열은 크레아티닌 특이적 펩타이드 후보물질이고, 이들 중 동일한 펩타이드를 대표하는 클론의 개수는 괄호안에 표시하였다. 펩타이드 서열 'WDMWPSMDWKAE (서열번호 1)', 'VLVRDNLPTTTG (서열번호 2)', 및 'VQVRDNLPTTTG (서열번호 3)'는 3회 바이오패닝 중 3회 얻어졌다. 따라서, 다른 DNA 추출에서 반복적으로 확인되는 세 후보물질들을 선별하였고 합성하여 크레아티닌에 대한 친화력을 추가적으로 검증하였다.

GNPs의 특징

GNP의 주요한 특성은 광학 스펙트럼에서 강한 surface plasmon resonance (SPR)을 처리하는 능력이다. 도 5(a)와 같이 직경 14.8±3.7nm인 GNP의 522nm에서의 최대 흡수량은 이들 입자들이 자연적으로 균일한 등방성 구형임을 나타낸다. GNP의 제타포텐셜은 도 5(b)와 같다. 이 입자들은 구연산에 기초한 캡핑제에 따라 -38.63 mV의 명확하고 높은 음의 제타포텐셜을 가지고 있다. GNP의 형성과 형태는 TEM 이미지에 의해 확인되었다. TEM으로 확인한 GNP의 형태는 구형으로 균일하게 분산되어 있으며, 평균 지름은 15-20nm의 범위 (도5(c))인 것으로 확인되었다. 또한, 수용성 GNP는 동동적 광 산란 분석(dynamic light scattering analysis)에서 시험한 평균 유체 역학 크기는 14.8±3.7 nm (도 5(c))이었다. 게다가 아래의 계산식에 따르면:

c=A₄₅₀/ε₄₅₀

GNP의 농도는 알려진 ε₄₅₀(1.79 Х 108 M/cm)에 기초하여 계산되었으며, 450nm에서의 흡광도는 0.631이었다. 마지막으로 GNP의 농도는 1.79 Х 10^-4mM이었다.

신속 크레아티닌 검출을 위한 색도 측정법

도 1은 크레아티닌의 색도 측정의 주요 원리를 설명한다. GNP와 APC01C(서열번호 1), ACP02C(서열번호 2)를 활용한 크레아티닌 검출을 위한 색도 측정법은 도 1 (a)과 같다. 먼저, GNP는 공유결합에 의해 GNP의 표면에서 흡수되는 펩타이드, APC01C 및 APC02C의 시스테인 (C) 으로 인한 응집을 방지하기 위해 정상적인 상황에서는 안정화된다. 분산된 GNP 용액은 붉은 색을 보여준다. 크레아티닌과 APC01C, APC02C사이의 교차 결합 반응은 GNP와의 응집을 유고하고 푸른빛으로 색의 변화를 유도하였다. 이러한 현상은 현상된 GNP 센서의 UV-visible 결과에서 볼 수 있다. 순수한 구연산으로 캡된 GNP 용액은 겉으로 보기에는 붉은 색으로 보였으며, SPR 피크는 522nm에서 확인되었다. 크레아티닌이 첨가된 APC01C를 구연산 캡 GNP 용액에 추가한 후, 상기 용액은 즉시 빨간색에서 파란색으로 바뀌었고, 이는 SPR 피크가 520에서 592nm로 변경되는 것을 동반하였다 (도 6(a)). 명확한 적색 이동 현상이 APC02와 크레아티닌의 존재에서 확인되었다 (도 6(b)).

APC03C를 사용한 크레아티닌의 검출의 경우 (도 1(b)), GNPs를 다른농도의 크레아티닌을 첨가한 후 APC03C 펩타이드와 혼합하였다. NaCl을 첨가한 후에도 스펙트럼에는 변화가 없었다. 그러나, 크레아티닌이 없는 경우의 역반응 현상은 2M의 NaCl이 첨가되었을 때, 상기 NaCl이 SPR 피크에서 150nm의 상당한 적색 편이를 유도하여 확인되었다. 높은 이온성 환경에서, 용액 내 소금은 GNPs의 표면의 전하를 가리고 (Debye-H

ckel effect), APC03C-변형된 GNP 사이의 반발로 야기된 에너지 장벽을 극복하기 위해 GNPs의 응집을 유도한다. 크레아티닌이 증가할수록 GNP는 분산되었다. 이는 크레아티닌의 인식 전후에 APC03의 구고적 변화로 인해 발생한 것이다. 일정량 이상의 크레아티닌 존재하에서, NaCl에 의한 응집은 크레아티닌과 APC03C에 의해 억제된다. 도 6(c)에서 확인되는 바와 같이, 522nm에서의 오리지널 피크가 존재함으로 나타나는 것과 같이 NaCl으로 유도되는 응집은 크레아티닌과 APC03C의 첨가 후에 확인되었다. 이러한 결과를 검증하기위해 다른 조건에서 GNPs의 제타 포켄셜을 평가하였다 (도 7). 제타포텐셜은 NaCl이 없는 경우 강한 음전하를 나타낸 반면, NaCl 및 APC03C 또는 크레아티닌이 존재하는 경우 양전하가 나타났고, 이를통해 GNP의 응집을 유도한다. 이는 NaCl이 GNP 표면의 전하를 차단하는 것을 암시한다. APC03C 및 크레아티닌이 GNP에 동시에 도입되었을 때 AP03C 및 크레아티닌에 의해 약한 음전하를 보여주고 NaCl 유도 응집을 억제하는 것을 확인할 수 있다.

최적의 검출시간을 조사하기 위해 다른 시간 간격으로 흡수 신호를 기록하였다. APC01C의 경우, GNP 센서가 안정적이고 검출 가능한 신호에 도달하는 데 약 40분이 걸렸다 (도 8(a)). 마찬가지로, ACP02C 가 존재하는 상태에서 안정적으로 유지되기 위해서는 최소 16분의 반응시간이 필요한 것으로 확인되었다(도8(b)). 따라서 GNP 복합제의 분산 또는 응집 상태는 590-700nm 범위에서 522nm (A590-700/A522)의 흡수비율로 나타낼 수 있다. ACP03C의 경우, GNP는 처음 650nm의 SPR 피크로 응집되지만; 금이 크레아티닌 점가 이후 다시 분산되고, 이는 SPR을 522nm로 이동시킨다. 이러한 변화는 2분 이내에 관찰되었다 (도8(c)). 한편, pH 환경의 영향을 받은 색도 프로브의 민감도를 측정하기 위해, 크레아티닌 색도탐지에 pH가 미치는 영향을 조사하였고, 도9에 나타내었다. 4 내지 11의 pH 수준의 다양한 용액에서 일련의 센서가 일정양의 크레아티닌 존재하에서 (50ppm) 실험되었다. 예측한바와 같이, 흡수 비율은 명확하게 변화한 것은 아니었다. 따라서, 실제 샘플에서의 실현가능성을 시험하기 위해, 이하에서는 pH7.0을 선택하여 실험을 하였다.

다양한 크레아티닌 농도를 첨가하여 정략적 분석을 실시하였다. 크레아티닌을 GNP와 ACP01C 또는 CP02C 혼합물에 첨가한 후, GNPs의 응집이 확인되었고, 592nm 및 681nm의 흡수 각각이 점진적으로 증가하였다. 반면, ACP03C의 존재하에서는 상황이 반전되지만, 522nm의 흡수는 독립적으로 감소하였다. 도 10(a)에서 확인되는 바와 같이 APC01C를 사용한 정량분석을 위해, 농도는 색도 반응 분석 (A592/A522)에 의거해 맞추었다. A592/A522값은 크레아티닌 농도가 1-100ppm으로 증가하였다. 1-100ppm 범위에서 A592/A522 값과 크레아티닌 농도 사이에는 선형관계가 있는 것을 확인할 수 있다. 검출한계는 0.025ppm (S/N-3)으로 확인되었다. 또한, GNPs의 색은 크레아티닌 농도 (도 10(a)의 내부 사진)에 따라 붉은색에서 보라색-청색으로 점차 변화하여 펩타이드-GNP의 응집이 크레아티닌 농도에 의존한 것을 확인할 수 있다.

마찬가지로 APC02C와 GNPs의 존재하에서 응집의 정도를 나타내는 흡수율 (A681/A522)을 계산하였다. 도 11 (b)에서 확인되는 바와 같이 크레아티닌 농도가 1-00ppm일 때 A681/A522 값은 명확하게 증가하였다. 이러한 생깔 변화는 육안으로도 확인 가능하다 (도 10 (b)의 내부사진).

APC03C의 경우, 크레아티닌 농도를 증가시켜 흡수율 A650/A522 (650 및 522nm에서의 흡수 비율)을 측정하였다. 농도 의존적 반응은 도 10 (c)에서 확인이 가능하다. A650/A522 값이 높을수록 GNPs응집은 적었고; 이는 크레아티닌 농도와 일치하였다. A650/A522 값 사이의 선형 관계를 얻었고, 더 적은 GNPs의 응집이 발생하였고, 이는 크레아티닌의 농도와 일치하였다. 회귀계수가 0.96인 크레아티닌 농도 0-100ppm 범위에서 A650/A522값과 크레아티닌 농도의 로그값 사이에서 양호한 선형 직선을 도출할 수 있다. 검출한계는 0.346ppm (S/N=3)으로 계산되었다. 용액의 색깔에서 명확한 변화가 흡수 스펙트럼과 같이 육안으로 확인되었다 (도 10 (c) 내부 사진).

소변 모방 샘플에서의 선택성 및 검출 실험

크레아티닌에 대한 GNP/펩타이드 시스템의 특수성과 실제 샘플에서의 실용성을 평가하기 위해, 생물학적 액체에 존재하는 다양한 분자를 각기 다른 펩타이드와 GNPs가 존재하는 상태에서 50ppm의 농도로 분석하였다. 여기서, 크레아티닌을 제외하고 다른 음이온 및 금속들은 흡수비율에서 구별가능한 변화를 보이지 않았고, 이는 크레아티닌에 대한 GNPs/펩타이드의 높은 특이성을 확인시켜주는 것이다. 소변에는 수많은 불순물이 포함되어 있어 소변 샘플에 대해 수행한 분석의 정확성을 확인하는 것이 매우 중요하다. 복잡한 생물학적 액체 샘플에 존재하는 이러한 간섭물들은 크레아티닌의 정량 분석에 있어 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다 (도 11). 따라서, 소변 모방 샘플에서 크레아티닌 농도의 평가가 성공적으로 이루어짐을 확인하였다.

다른 펩타이드를 사용한 감지능력을 확인하기 위해 다음과 같은 방법을 적용하여 소변 모방 샘플의 크레아티닌 농도를 측정하였다. 먼저, 인공적으로 다른 농도의 크레아티닌 (0~1000ppm)을 첨가하였고, 이는 사용 전 탕이온수로 10배 더 희석 시켰고, 이를 통해 크레아티닌 농도가 계산될 수 있다. 도 12에서와 같이 소변 샘플에서 각 펩타이드의 성능을 평가하였다. APC01C의 경우 A592/A522 값과 크레아티닌 농도 사이의 명확한 선형관계 (R2=0.9929)를 1-100ppm 범위에서 얻었으며, 선형 회귀 방정식은 y = 0.2518x + 0.5388로 평가되었다. APC02C와 APC03C에 대한 측정을 검증하기 위해 유사한 시험을 실시하였다. A681/A522의 비율은 ACP02C가 존재하는 상태에서 크레아티닌 농도와 함께 점진적으로 증가하였으며, 선형 회귀 방정식은 상관계수가 0.9845인 y = 0.2393x + 0.0407로 평가되었다. ACP03C의 경우 선형 회귀방정식은 y = -0.2778x + 1.0034로서 A650/A522와 0.9796의 크레아티닌 농도 사이에서 잘 맞았다. 즉, 모든 결과에서 소변 모방 샘플에서 탁월한 성능을 확인하였다.

더욱이, 이러한 선형관계를 검증하기위해 서로 다른 크레아티닌 농도 (80 ppm, 100 ppm, 및 120 ppm)를 첨가한 3가지 소변 샘플을 준비하였다. 표 3에서 정리한 바와 같이, 크레아티닌의 검출 결과는 샘플값과 가까웠으며, 검출 회복값은 85.27-115.39%으로 높았다.

Sample	[Creatinine] added (ppm)	[Creatinine] detected by APC01C (ppm)	Recovery (%)
1	80	74.31	92.89
2	100	90.65	90.65
3	120	138.46	115.39
Sample	[Creatinine] added (ppm)	[Creatinine] detected by APC02C (ppm)	Recovery (%)
1	80	75.93	94.91
2	100	94.45	94.45
3	120	130.98	109.15
Sample	[Creatinine] added (ppm)	[Creatinine] detected by APC03C (ppm)	Recovery (%)
1	80	68.27	85.27
2	100	104.91	104.91
3	120	114.80	95.66

더욱이, 본 발명의 방법을 종래 다른 크레아티닌 측정 방법과 비교한 결과 다음과 같은 장점을 확인하였다: (1) 다른 생체분자보다 크레아티닌에대한 선택성이 매우 높다 (2) 민감도 측면에서는 종래 방법과 동등 또는 우수하다 (3) 간이하게 확인이 가능하다.

이를 정리하면 표 4와 같다.

Sensor		LOD	Reaction time (min)	Sample
Ag Nanoparticles		0.46 mg/dL (4.520 ppm)	<5	Blood
Enzyme-amperometric sensor		0.06 mg/dL (0.989 ppm)	-	Serum
Photonic crystal sensor		6.0 μM (0.678 ppm)	30	Serum
Colorimetric Detection via plasmonic Nanoparticles		0.13 mM (15.25 ppm)	-	Urine
Colorimetric Detection via PEG/Hg ²⁺-AuNPs		0.451 μM (0.070 ppm)	-	Urine
Portable microfluidic sensor by Laiwattanapaisal		3.3 mg/L (3.300 ppm)	2	Urine
Specific binding peptide and gold nanoparticles (본 발명)	APC01C APC02C APC03C	0.025 ppm 0.657 ppm 0.346 ppm	40 16 2	Urine

결론

요약하면, 무작위 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 BSA-크레아티닌에 선책적으로 결합하는 12mer 펩타이드 3종을 입수하여 편향 선택 전략 (biased selection strategy)을 수행하였다. GNP와 펩타이드 등을 이용한 크레아티닌 검출에 대해 간단하고 민감도 높은 색도 분석 검사가 가능함을 입증하였다. 크레아티닌의 존재는 GNP와 펩타이드의 상호작용을 유발하여 GNP의 응집을 유도하였다. 이러한 응집은 용액의 색을 변화시켰는데, 이는 육안으로도 관찰이 가능하다. 이러한 결과는 개발된 APC01C가 크레아티닌의 검출한계가 24.9ppb로 매우 낮게 나타났으며, APC03C는 종래 방법과 비교하여 빠른 검출 시간 (2분)을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> CHUNG-ANG UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR CREATININE DETECTION USING INTERACTION BETWEEN GOLD NANOPARTICLE AND CREATININE AND METHOD FOR CREATININE DETECTION USING THE SAME <130> PN200283 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP01C <400> 1 Trp Asp Met Trp Pro Ser Met Asp Trp Lys Ala Glu 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP02C <400> 2 Val Leu Val Arg Asp Asn Leu Pro Thr Thr Thr Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP03C <400> 3 Val Gln Val Arg Asp Asn Leu Pro Thr Thr Thr Gly 1 5 10

Claims

크레아티닌에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산으로 이루어진 펩타이드.
제1항의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제1항의 펩타이드 및 금 나노입자를 포함하는 크레아티닌 검출 키트.
제3항에 있어서,
상기 펩타이드는 금 나노입자의 표면에 결합되는 것인 크레아티닌 검출 키트.
시료를 제1항의 펩타이드와 반응하여 반응물을 제조하는 단계; 및
상기 반응물을 금 나노입자에 접촉시키는 단계
를 포함하는 크레아티닌 검출 방법.