KR20230060196A - 삭시톡신에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드 - Google Patents

삭시톡신에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 펩타이드는 삭시톡신과 특이적으로 결합할 수 있어 삭시톡신을 정확하게 검출할 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 고정된 바이오칩 또한 삭시톡신에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타내는 것을 확인한 바, 이를 이용하여 다양한 대상, 예를 들어 식품 및 이의 원재료의 삭시톡신 보유 여부를 확인할 수 있어, 안전한 식품 공급에 기여할 수 있다.

Description

삭시톡신에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드{Novel peptides that specifically bind to saxitoxin}
본 발명은 삭시톡신에 특이적으로 결합하는 신규 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다.
현재 전세계적으로 발생 빈도가 증가하고 있는 적조현상(Harmful Algal Blooms(HABs), red tide)은 유독화, 조밀화되고 있어 수산자원, 해양환경, 및 공중보건에도 심각한 위협이 되고 있어 이에 대한 대책이 요구되고 있다. 최근 들어 우 리나라 근해, 특히 남해안에서 주로 발생하는 적조현상은 대체로 유독성 편모조류에 의한 것으로, 우리나라 총 어업생산의 30 %를 차지하는 양식산업에 막대한 피해를 주고 있는 실정이다. 이에 따라 국내 연구소 뿐만 아니라 대학 등에서도 적조방제를 위한 다각적인 노력을 기울이고 있다.
적조에 의한 어패류의 피해로는, 식물 플랑크톤의 대발생으로 인해 해수 내의 용존산소가 감소되는 경우와, 식물 플랑크톤이 아가미 등에 모이면서 어패류의 사멸을 유도하는 경우가 일반적으로 알려져 있으나, 더욱 커다란 문제는 일부 유해 적조생물들에 의해 합성되어 분비 또는 세포내 함유되는 독성물질로 인한 피해라 할 수 있다. 이와 같이 유독 식물 플랑크톤에 의해 합성, 분비되는 독성물질은 크게 PSP(Paralytic Shellfish Poison), DSP(Diarrhetic Shellfish Poison), ASP(Amnestic Shellfish Poison) 등으로 분류되는데, 최근에 국내외적으로 중요하게 다루어지고 있는 독성물질로는 PSP 중 삭시톡신(saxitoxin) 계열을 들 수 있다.
국내에서 환경 오염물질을 검출할 수 있는 바이오센서의 개발은 수질 모니터링, 토양독성 모니터링, 가스독성 모니터링 등을 위해 연구되고 있다. 특히 생물학적인 바이오센서로는 물벼룩, 해조류, 어류 등을 이용하는 방법과, 대장균, 바실러스, 슈도모나스, 살모넬라 등의 미생물에서 비롯된 유전자 재조합 미생물을 이용하는 방법 등이 주를 이루고 있다. 이중에서 물벼룩, 해조류, 어류 등을 이용하는 방법은 생물체의 유지, 보관 등의 문제로 인하여 일회용 탐지기능만을 제공할 수밖에 없다는 단점이 있다. 한편, 유전자 재조합 미생물을 이용하는 방법에 있어서는 현재까지 생물학적 빛(bioluminescence)과 녹색형광(green fluorescence)을 표지유전자로 사용하는 연구가 활발히 진행 중에 있다. 그리고, 최근에는 DNA 칩을 이용한 마이크로어레이(microarray) 기법도 적용되고 있다.
그러나, 상기와 같은 바이오센서 관련 연구들은 환경호르몬, 내분비계 장애물질 등과 같은 유해 화학물질과 중금속 등에 국한되어 있을 뿐, 유독 식물 플랑크톤에 의해 합성, 분비되어 어패류 뿐만 아니라 인간에게까지 치명적인 영향을 미치는 독성물질에 대해서는 전혀 연구 개발이 이루어지지 않고 있는 실정이다.
해수 중의 유독 프랑크톤 수가 1 mL 당 200 개 이상일 경우에는 독소에 의한 피해가 예상되므로, 패독(貝毒) 발생을 대비한 광범위한 실태 조사와 함께 채취 시기의 지도 및 조기 수확 등 적절한 사전관리가 필요하게 된다. 그러나, 단순히 유독 프랑크톤의 수를 기준으로 하여 독소 발생을 예측하는 것은 매우 어려운 일이 될 수밖에 없다. 식품의약품안전청에서는 해수에 기준치 이상(80 ㎍/g 이상)의 독소성분이 검출될 경우 발생지역에서 생산되는 조개류에 대한 판매 금지 및 가공식품 원료 사용 금지를 취하고 있다. 그러나, 이처럼 독소 발생 지역을 발표하는 것은 정확한 검정법이 될 수 없으므로, 대상으로부터 독소를 정확하게 검출할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 삭시톡신을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술에 대해 연구하던 중, 삭시톡신에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드를 발굴하고 상기 펩타이드가 삭시톡신만 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 삭시톡신(saxitoxin) 검출용 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 삭시톡신 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 삭시톡신 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 삭시톡신 검출용 바이오칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 삭시톡신 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 삭시톡신에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 삭시톡신(saxitoxin) 검출용 펩타이드를 제공한다.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 삭시톡신 검출용 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 삭시톡신 검출용 키트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 삭시톡신 검출용 바이오칩을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 삭시톡신 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삭시톡신과 운반체 단백질이 결합한 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하는 단계;를 포함하는 삭시톡신에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 삭시톡신 검출용 펩타이드는 삭시톡신에 대해 높은 정확도 및 민감도를 보이며, 이를 포함하는 바이오칩 또한 삭시톡신을 정확하게 검출할 수 있는 바, 이를 이용하여 다양한 대상, 예를 들어 식품 및 이의 원재료의 삭시톡신 보유 여부를 확인할 수 있어, 안전한 식품 공급에 기여할 수 있다.
도 1은 삭시톡신과 운반체 단백질인 오브알부민(ovalbumin, OVA)의 결합 여부를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 2는 삭시톡신과 운반체 단백질인 오브알부민(ovalbumin, OVA)의 결합 여부를 MALDI-TOF 분석으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지 후보군의 삭시톡신에 대한 결합력을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지 후보군의 파지 입자 농도에 따른 삭시톡신에 대한 결합력을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지 후보군이 고정된 바이오칩의 삭시톡신에 대한 결합력을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지 후보군이 고정된 바이오칩의 삭시톡신 및 운반체 단백질이 결합된 복합체에 대한 결합력을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 삭시톡신을 특이적으로 검출할 수 있는 펩타이드에 대한 것으로, 하기 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 삭시톡신(saxitoxin) 검출용 펩타이드를 제공한다.
HYPTWQAMKTTW(서열번호 1).
TYWQSVLSLKQD(서열번호 2).
GTNPIKK(서열번호 3).
상기 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열은 박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(phage display peptide library) Ph.D.-C7C(New England BioLab) 또는 Ph.D.-12(New England BioLab)를 이용하여 삭시톡신에 결합하는 서열을 찾아낸 것이다. 상기 Ph.D.-C7C 또는 Ph.D.-12는 각각 M13 박테리오파지의 게놈중에서 외피단백질(coat protein)의 일종인 pⅢ를 생산하는 유전자 말단에 7개의 무작위 아미노산이 서열 말단에 시스테인(cysteine) 잔기 간 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 고리 모형을 갖는 펩타이드 또는, 12개의 무작위 아미노산 서열을 갖는 선형의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균 (E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 M13 박테리오파지로 구성되어 있다.
본 발명에서 사용된 상기 M13 박테리아파지는 특정 형질(strain)의 대장균만 감염되는 성질을 지니는 나노크기의 물질이며 돌연변이를 일으켜 인체에 감염될 가능성에 대해서는 현재까지 전혀 보고된 바 없다. 특히 2006년 FDA의 승인을 얻어 인스턴트식품의 세균 오염 방지용 첨가물로 활용되고 있으며, 항생제의 내성 문제는 해결할 수 있는 대체제뿐만 아니라 인체에 무해한 생체 진화형 나노물질로 각광을 받고 있다. 더불어 상기 박테리아파지를 이용하는 경우, 제조 공정이 간단하며 생산성과 안정성의 향상을 기대할 수 있고, 다양한 유전공학적, 화학적 변형을 활용할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 펩타이드는 저분자 펩타이드로서 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 거의 없다. 이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다.
본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 T-BOC(tert-butyloxycarbonyl) 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서 N 말단 또는 C 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호한 형태일 수 있다. 즉, 상기 펩타이드의 C 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형되는 것일 수 있다. 또한 상기 펩타이드의 N 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시카르보닐(Fmoc)기, 포르밀(Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기, 스테아릴(Stearyl)기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 기로 변형되는 것일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하며, N 말단 혹은 C 말단에 다양한 기능기를 포함할 수 있다.
상기 다양한 기능기의 예시로서, N 말단의 기능기는 자유아민(free amine), 아세틸화(acetylation), 바이오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, C 말단의 기능기는 유리산(free acid), 아미드화(amidation), 비오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 검출 또는 동정을 위하여 표지될 수 있으며, 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발색효소는 예를 들어, 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)일 수 있고, 상기 방사성 동위원소는 예를 들어, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S일 수 있으며, 상기 발광물질 또는 형광물질은 예를 들어, FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots) 등일 수 있다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.
만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography, FMT)으로 삭시톡신에 결합한 펩타이드의 형광 패턴을 관찰할 수 있고, 형광이 관찰되는 패턴에 따라, 삭시톡신을 검출할 수 있다.
본 발명의 삭시톡신 검출용 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 삭시톡신 검출용 펩타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 삭시톡신 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 삭시톡신 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 삭시톡신 검출용 키트에는 삭시톡신 검출을 위한 펩타이드의 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있고, 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 4℃로 유지된 상태로 제공될 수 있다.
삭시톡신에 결합한 본 발명에 따른 펩타이드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 키트에 포함되는 펩타이드는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 생체 내에서 삭시톡신과의 결합 정도 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 일 구체예로서 본 발명의 키트는 다양한 대상, 예를 들어 농산물 또는 수산물의 삭시톡신 보유 여부를 확인하기 위하여 사용될 수 있고, 삭시톡신을 보유한 물질의 섭취 여부를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 확인은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 진단을 실시할 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 삭시톡신 검출용 바이오칩을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 바이오칩으로 사용 가능한 다양한 칩 (금(gold), 은(silver), 자성 비드(magnetic bead), 실리카(silica), 그래핀(graphene), 탄소 나노튜브(carbon nanotube) 등) 상에 특이적으로 고정될 수 있다. 다만, 본 발명의 특징은 전술한 펩타이드의 특징과 관련되며 이와 같이 펩타이드를 바이오칩으로 제조하는 것은 공지기술에 따라 할 수 있는 부분이다.
본 발명에 따른 삭시톡신 검출용 바이오칩을 이용하여 단백질과 단백질 간의 반응, 단백질과 반응리간드 간의 반응, 목적리간드와 반응단백질 간의 반응 또는 목적리간드와 반응리간드간의 반응을 검출할 수 있다.
상기 반응리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 생체물질, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응단백질은 효소 또는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응 검출은 표지 혹은 비표지체를 이용하여 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 삭시톡신 검출 방법을 제공한다.
이를 통해 시료 내 삭시톡신의 존재 유무를 검출하거나, 삭시톡신의 양을 정량할 수 있고, 삭시톡신을 보유한 물질의 섭취 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함하는 의미이다. 더불어 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다. 또한 한편으로 이는 검체 또는 배양물(예를 들어 미생물 배양물)을 포함할 수 있다. 상기 시료는 농산물 또는 수산물 유래 시료일 수 있다. 상기 수산물 시료에 있어서, 바람직하게는 어패류일 수 있다. 더불어 상기 생물학적 시료는 본 발명에 따른 펩타이드를 이용하여 삭시톡신을 보유한 물질의 섭취 여부를 확인할 때 사용될 수 있으며, 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry), 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 수정 진동자 마이크로밸런스(quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA(Lateral flow assay)/VFA(Variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 삭시톡신에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 스크리닝 방법은 삭시톡신과 운반체 단백질이 결합한 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 복합체는 저분자 물질인 삭시톡신의 파지 디스플레이에 대한 효율성을 증대시키기 위한 것으로, 상기 운반체 단백질은 알부민(albumin) 또는 오브알부민(ovalbumin)일 수 있다.
더불어 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 삭시톡신의 합텐(hapten) 및 삭시톡신 운반체 형성
삭시톡신은 저분자 물질이기 때문에 바로 플레이트에 고정화하여 파지 디스플레이를 수행한다면 효율성이 저하된다. 따라서 펩타이드의 효율적인 발굴을 위하여 삭시톡신을 운반체 단백질에 고정화시켰다. 이를 위하여 운반체 단백질로서 카르복실산(carboxylic acid)과 아민 작용기를 가진 오브알부민(ovalbumin, OVA)을 이용하였다.
이를 위하여 삭시톡신(Saxitoxin), 인산완충 생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.4), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride), 오브알부민(Ovalbumin, OVA), N-히드록시 석신이미드(N-hydroxy succinimide, NHS), 쿠마시 브릴리언트 블루 R(Coomassie Brilliant Blue R)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 메탄올은 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구매하였으며, 빙초산(Glacial acetic acid)은 덕산(안산, 한국)에서 구매하였다. 모든 화합물 및 용액들은 탈이온수(deionized (DI) water)를 이용하여 준비하였다.
구체적으로, 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) 3.1mg과 N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide) 2.4 mg을 5 mL의 3차 증류수에 넣어 완전히 용해시켰다. 이후, 4.8 mg의 오브알부민을 10 mL의 인산염 완충용액(Phosphate buffered saline, 10 mM, pH 7.5)에 용해시켰다. 이를 0.5 mL 취한 뒤, 50 μl의 N-하이드록시석신이미드 용액을 넣고, 1 mL의 삭시톡신(20 ㎍/mL)을 넣었다. 그 후 100 μl의 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드 용액을 투여한 뒤 상온에서 2일간 교반하며 반응을 진행하였다. 그 후, 투석 과정을 통해 반응하지 않은 물질을 제거하고 합텐화된 삭시톡신을 수득하였다. 수득한 삭시톡신의 합텐화 여부는 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) 분석과 더불어 Voyager DE-STR(Applied Biosystems 사)를 사용한 MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization) 분석을 통해 확인하였다.
SDS-PAGE 분석을 위해 탈이온수를 사용하여 BSA 및 획득한 삭시톡신-OVA의 농도를 각각 100 μg/mL로 희석하였다. 상기 용액 5.5 μL와 ELPIS-BIOTECH(대전, 한국)사의 샘플 버퍼(Sample Buffer (Laemmli's buffer 5x)) 2.2 μL, 탈이온수 3.3 μL을 완전히 혼합한 후 100 ℃에서 5분간 가열해 전처리를 했다. 각 10 μL의 전처리된 BSA 및 오카다산-BSA 시료를 12 % SDS-PAGE 겔에서 전기영동을 통해 분리한 뒤, 단백질 착색 용액(0.1 % 쿠마시 브릴리언트 블루 R, 50 % 메탄올, 10 % 빙초산)을 사용해 1시간 가량 염색한 후 탈색 용액(40 % 메탄올, 10 % 빙초산)을 사용하여 시각화하였다. 상기 MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 MALDI-TOF voyager DE-STR (Applied Biosystems)에 기록하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE상 삭시톡신을 결합하기 전 오브알부민의 밴드보다 더 높은 위치에서 밴드가 나타남을 확인하였다. 더불어 도 2와 같이, MALDI-TOF 분석 결과 또한 44.4kDa의 오브알부민 피크가 삭시톡신과 결합하여 합텐 형성 후 50.0kDa 부근에서 넓은 피크로 이동한 것을 통해 삭시톡신의 합텐화가 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다.
실시예 2. 삭시톡신에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 발굴
상기 실시예 1에서 제조한 삭시톡신 운반체(삭시톡신-OVA 복합체라 기재)와 박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(phage display peptide library)를 이용하여 삭시톡신에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 발굴하였다.
박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(phage display peptide library)는 Ph.D.-C7C 및 Ph.D.-12(New England BioLab)를 사용했다. 이들은 각각 M13 박테리오파지의 게놈중에서 외피단백질(coat protein)의 일종인 pⅢ를 생산하는 유전자 말단에 7개의 무작위 아미노산이 서열 말단에 시스테인(cysteine) 잔기 간 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 고리 모형을 갖는 펩타이드 또는, 12개의 무작위 아미노산 서열을 갖는 선형의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균 (E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 M13 박테리오파지로 구성되어 있다.
바이오패닝을 통한 선별과정은 단백질 A(protein A, Thermo scientific사에서 구입)가 코팅되어 있는 평판(Protein A coated 96 well plates, 15130)을 사용하였다. 세척용액으로 PBST (0.1 M PBS with Tween 0.05%, pH 7.4)를 제조하고, 세척용액 200 μL로 플레이트를 충분히 적셔주었다. 용액을 제거 후 충분히 적셔진 플레이트에 1 μg/mL의 삭시톡신 항체(Anti-STX (AS11-1690), Agrisera사에서 구입) 100 μL를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 용액을 제거하고 세척용액 200 μL를 넣고 3회 반복 세척하였다. 세척 용액을 깨끗이 제거하고, 삭시톡신-OVA를 PBS (0.1 M, pH 7.4)에 희석하여 100 μL(25 μg/mL 농도)를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 용액을 제거하고 세척용액 200 μL를 넣고 3회 반복 세척하였다. M13박테리오파지 라이브러리를 PBS(0.1 M, pH 7.4)에 1011 PFU/mL 농도로 희석한 후 플레이트에 100 μL 넣고 150 rpm으로 교반하면서 1시간 동안 반응하였다. 그 후 PBST(0.1 M PBS with Tween 0.1%, pH 7.4) 200 μL로 10회 세척한 후 100 μL의 글리신/HCl(Glycine/HCl (0.2 M, pH 2.2))을 넣고 150 rpm으로 교반하면서 10분 동안 반응시켜 삭시톡신-OVA에 결합된 M13박테리오파지를 용해시켜 주었다. 플레이트의 상층액(용출된 M13 박테리오파지)을 마이크로튜브로 옮긴 후, M13 박테리오파지의 변성을 막기 위해 Tris-HCl(1 M, pH 9.1) 15 μL를 넣어 중화하였다. 용출된 M13 박테리오파지 용액은 4℃에서 보관하였다. 또한 삭시톡신에 특이적인 M13 박테리오파지를 얻기 위해서 반응 회차가 진행될 수록 세척용액의 트윈-20(Tween-20) 농도를 0.1, 0.3, 0.5% 순으로 증가시켜 주었다.
더불어 삭시톡신 항체에 결합하는 펩타이드 리셉터를 포함한 M13 박테리오파지를 제거하기 위하여, 2, 4 회차의 바이오패닝을 시작하기 전에 M13 박테리오파지 라이브러리를 삭시톡신 항체가 결합된 플레이트와 150 rpm으로 교반하면서 30분동안 반응시켜 음성 선택(Negative selection)을 수행하였다. 또한 운반체 단백질인 OVA에 결합하는 펩타이드 리셉터를 포함한 M13 박테리오파지를 제거하기 위하여, 3, 5 회차의 바이오패닝을 시작하기 전에 M13 박테리오파지 라이브러리를 OVA 단백질이 고정된 플레이트와 180 rpm으로 교반하면서 30분동안 반응시켜 음성 선택을 수행하였다.
상기 과정은 Ph.D.-12 와 Ph.D.-C7C 두 종류의 라이브러리에서 각각 5회씩 반복 수행하였으며, DNA 서열 분석을 통해 반복적으로 나타나는 펩타이드 리셉터 서열을 포함하는, 하기 표 1의 M13 박테리오파지를 선별하였다.
순번 아미노산 서열(N→C term) 빈도수 사용한 라이브러리
1 HYPTWQAMKTTW 2 Ph.D.12
2 TYWQSVLSLKQD 10 Ph.D.12
3 GTNPIKK 4 Ph.D.C7C
실시예 3. 박테리오파지 후보군의 삭시톡신에 대한 결합력 확인
상기 실시예 1을 통해 선별된 3개의 박테리오파지 후보군의 삭시톡신에 대한 결합력을 ELISA(enzymed-linked immunosorbent assay)를 이용하여 확인하였다. 상기 ELISA는 스트렙트아비딘(streptavidin)이 코팅되어 있는 플레이트 (Streptavidin high binding capacity coated 96-Well plates, 15501, Thermo scientific 사에서 구입)를 사용하여 수행하였다. 더불어 상기 실시예 2에서 사용한 삭시톡신 항체를 사용하였으며, 상기 항체는 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit (21425, Thermo scientific 사에서 구입)을 사용하여 바이오틴화(biotinylation) 과정을 거친 후 BCA 분석을 사용하여 농도를 계산한 후, 사용 전까지 -20 ℃에 보관하였다.
M13 박테리오파지는 농도를 동일하게 맞추고 M13 박테리오파지 증폭 (Amplification)과정을 진행하였다. 이를 위하여 대장균(ER 2738) 콜로니를 20 mL LB 배지에 넣고 210 rpm으로 교반하면서 37℃에서 밤새 배양하였다. 그 후 흡광도(Optical density, OD)값이 0.03 - 0.05가 되도록 LB 배지를 이용하여 대장균 배양액을 희석하였다. 희석된 용액 20 mL에 M13 박테리오파지 후보군의 용출용액을 각각 10 μL씩 접종하고 210 rpm으로 교반하면서 37℃에서 4시간 30분간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 4℃에서 12,000 g 속도로 10분간 원심분리하여 대장균을 제거해 주었다. 이후 상층액을 취하고, 이에 PEG(polyethylen glycol)/2.5 mol NaCl 3.3 mL을 넣어준 뒤 4℃에서 12시간 동안 보관하였다. M13 박테리오파지를 침전시키기 위해 4℃에서 12,000 g 속도로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 남은 침전물(Pellet)을 PBS(0.1 M, pH7.4) 1 mL에 녹이고 4℃에서 14,000 rpm 속도로 5분 동안 원심분리하여 남아있는 불순물을 제거하였다. 원심분리가 끝난 후 상층액을 취하고, 이에 20% PEG/2.5 mol NaCl 166.7 μL을 넣은 후, 1시간 동안 얼음에서 보관하였다. 그 후 14,000 rpm 속도로 10분 동안 원심분리하고 침전물을 수득한 후, 이를 200 μL PBS (0.1 M, pH7.4)에 녹인 후 파지 적정(Titration)을 실시하고 하기 수학식 1을 통해 파지의 농도(PFU/mL: Plaque forming units/mL)를 계산하였다.
[수학식 1]
파지 농도(PFU/mL) = Plaque수 × 희석배수 × mL로 환산한 접종량
상기와 같이 증폭시킨 박테리오파지 후보군들을 이용하여 ELISA를 수행하였다. 스트렙토아비딘 플레이트에 바이오틴화된 삭시톡신 항체 100 μL(1 μg/mL 농도)를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 200 μL의 PBST(0.1 M PBS with Tween 0.5%, pH 7.4)로 3회 반복 세척하였다. 더불어 삭시톡신-OVA를 PBS(0.1 M, pH 7.4)에 희석하여 100 μL(25 μg/mL 농도)를 플레이트에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 플레이트의 상층액을 모두 제거하고, NaHCO3 (pH 8.6) 10 mL에 BSA 0.5 mg을 넣어 제조한 블로킹(blocking) 용액 200 μL을 넣고 밀봉한 후 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 PBST 200 μL로 반응이 완료된 플레이트를 6회 반복 세척하였다. 증폭된 박테리오파지 후보군 용액을 PBS(0.1 M, pH7.4)를 이용하여 1012 PFU/mL 농도로 희석하였다. 희석된 박테리오파지 후보군 용액 100 μL를 세척된 플레이트에 넣고 150 rpm으로 교반하면서 1시간 동안 반응시켰다. 상층액을 제거하고 PBST 200 μL로 6회 반복 세척하였다. 더불어 블로킹 용액 5 mL에 Anti-M13 박테리오파지 항체-HRP (Sinobio, China)를 2 μL을 넣어 검출 용액을 제조하였다. 검출 용액 200 μL를 파지가 고정화되어 있는 플레이트에 넣고 150 rpm으로 교반하면서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 PBST 200 μL로 6회 반복 세척하였다. ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 용액 7 mL과 H2O2 12 μL를 혼합한 직후 이의 200 μL를 플레이트에 넣고 405 nm에서 OD 값을 측정하였다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 3가지 후보군 모두 삭시톡신에 대해 우수한 결합력을 보여주었다. 대조군으로 사용한 삭시톡신 항체만 고정화되어 있는 플레이트에 비해 삭시톡신-OVA가 고정화된 플레이트에서 더 높은 결합력을 나타내었으며, 삭시톡신의 농도가 증가할수록 순차적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히 “HYPTWQAMKTTW”와 “TYWQSVLSLKQD”후보군이 삭시톡신에 대해 우수한 선택성을 나타내는 것이 확인되었다.
더불어 상기와 동일한 ELISA 방법으로 삭시톡신-OVA 50 μg/mL농도가 고정화된 플레이트에 3가지 파지 후보군을 1×1011 및 1×1012 PFU/mL농도로 처리하여 그 결합력을 비교하였다. 그 결과 도 4와 같이, 3가지 파지 후보군 모두 농도가 증가함에 따라 삭시톡신에 대한 결합력이 증가되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 박테리오파지 후보군이 고정된 바이오칩의 삭시톡신에 대한 결합력 확인
본 발명에 따른 후보군을 고정시킨 바이오칩의 삭시톡신에 대한 결합력을 확인하였다. 이를 위하여 전해질에 산화/환원 반응이 가능한 상태에서 작업 전극에 빠른 속도로 전압을 주사하면 이에 따른 전류의 값에 의해서 전극표면 근처에서 일어나는 물질의 전기화학 반응의 열역학 및 속도론적인 파라미터를 확인할 수 있는 분석 방법인 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry, SWV)을 수행하였다. 더불어 CHI 660E (Electrochemical Workstation)장비를 사용(CH Instruments사에서 구입)하였으며, 분석은 상온에서 상대전극(Counter Electrode), 기준전극(Reference Electrode), 작업전극(Working Electrode)를 이용한 3전극법으로 수행하였고, 바이오칩으로는 골드칩을 이용하였다.
골드칩을 연마(Polishing)하기 위해 에탄올(100%)에 5분 동안 담근 후 3차 증류수로 씻어주었다. 이 후 과산화수소 (H2O2)와 황산 (H2SO4)를 3:7 비율로 혼합하여 제조한 피라냐 용액(Piranha solution) 200 μL를 도포하여 10분 동안 상온에서 반응시켰다. 이 후 3차 증류수로 깨끗이 씻어준 후 질소를 이용하여 건조시켜주었다. 그 후 골드칩을 에탄올(100%)을 이용하여 희석한 1 mmol의 11-MUA (11-Mercaptoundecanoic acid)에 담근 후 밤새 반응시킨 후 3차 증류수로 충분히 씻고 질소를 이용하여 건조한 후 골드칩 전용 셀에 고정하였다. 고정된 골드칩에 800 mmol의 EDC (1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)와 200 mmol NHS (N-hydroxysuccinimide)를 1:1비율로 희석하여 제조한 혼합액 50 μL을 넣고 1시간동안 반응시켜 주었다. 3차 증류수로 5회 반복하여 세척한 후 1012 PFU/mL의 박테리오파지 후보군을 골드칩에 넣어주고 1시간동안 반응시켰다. 반응이 끝나고 3차 증류수로 5회 반복하여 세척한 후 전해용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3)을 넣고 SWV를 측정하였다. 전해용액을 제거하고 3차 증류수로 5회 반복 세척한 후 50 μL의 삭시톡신-OVA(25 μg/mL)를 골드칩에 넣어주고 1시간동안 반응시켰다. 3차 증류수로 5회 반복 세척한 후 전해용액 2 mL을 넣고 박테리오파지 후보군과 삭시톡신의 결합력을 측정하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, MUA/EC/NHS, 박테리오파지 후보군 및 삭시톡신-OVA 도포 순서에 따라 전류 값이 감소하는 것이 관찰된 바, MUA/EC/NHS, 박테리오파지 후보군 및 삭시톡신-OVA가 골드칩 표면에 순차적으로 고정화되었음을 확인하였다.
더불어 OVA를 대조군으로 설정하고, 본 발명에 따른 박테리오파지 후보군의 선택성을 상기와 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 6과 같이, 본 발명에 따른 박테리오파지 후보군 모두 대조군인 OVA에 비해 삭시톡신-OVA에서 높은 결합력을 보여주었다. 특히 “HYPTWQAMKTTW”와 “TYWQSVLSLKQD”서열을 가지는 박테리오파지 후보군이 대조군에 비해 삭시톡신-OVA에서 2배 이상 더 높은 결합력을 나타내는 것을 확인하였다.
종합적으로, 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 본 발명의 펩타이드는 삭시톡신과 특이적으로 결합할 수 있어 삭시톡신을 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 고정된 바이오칩도 삭시톡신에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타내는 것을 확인하였다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Novel peptides that specifically bind to saxitoxin <130> 1-98P <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide1 for specific detection of saxitoxin <400> 1 His Tyr Pro Thr Trp Gln Ala Met Lys Thr Thr Trp 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide2 for specific detection of saxitoxin <400> 2 Thr Tyr Trp Gln Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide3 for specific detection of saxitoxin <400> 3 Gly Thr Asn Pro Ile Lys Lys 1 5

Claims (11)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 삭시톡신(saxitoxin) 검출용 펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 삭시톡신 검출용 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 삭시톡신 검출용 키트.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 삭시톡신 검출용 바이오칩.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 삭시톡신 검출 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry), 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 수정 진동자 마이크로밸런스(quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA(Lateral flow assay)/VFA(Variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 삭시톡신과 운반체 단백질이 결합한 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하는 단계;를 포함하는 삭시톡신에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 스크리닝 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 운반체 단백질은 알부민(albumin) 또는 오브알부민(ovalbumin)인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
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