KR20230077393A - 소 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드 - Google Patents

소 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 펩타이드는 소 로타바이러스와 특이적으로 결합할 수 있어 소 로타바이러스를 정확하게 검출할 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 고정된 바이오칩 또한 소 로타바이러스에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타내는 것을 확인한 바, 이를 기존의 소 로타바이러스 검출용 항체를 대체하는, 더 정확도가 높은 기술로써 유용하게 활용할 수 있다.

Description

소 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드{Novel peptides that specifically bind to bovine rotavirus}
본 발명은 소 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다.
소 로타바이러스는 이중나선 RNA 바이러스(dsRNA viruses)로 로타바이러스라는 이름은 전자 현미경으로 관찰시 마치 바퀴처럼 보인다고 해서 붙여졌다. 상기 바이러스는 신생 송아지 설사증(neonatal calf diarrhea, NCD)의 주된 원인 병원체 중 하나이며, 분변에서 경구 감염으로 전파가 이루어진다. 즉, 바이러스를 포함한 분변이 직접 또는 바이러스에 오염된 물체가 경구적으로 침입함으로써 이루어진다. 또한 모우의 불현성 바이러스도 분변에 배출되어 감염원으로 작용할 가능성도 있다. 축주가 소들을 관리하는 도중에 감염우의 분변을 장화 등에 묻혀 다른 우사의 소들에게 전파시킬 수 있으며, 심지어 사료 운반차에 의해 다른 농장으로 전파되기도 한다.
1주령 미만의 어린 송아지에서 감염되며 대부분 2-3일간의 심한 유백색 설사와 급격한 탈수 증상을 보이며 항생제 치료에도 크게 호전되지 않는다. 1개월 이상 된 송아지에서는 감염되어도 증상이 심하지 않으며 대증요법 치료에 의해서 쉽게 호전된다. 병변은 소장에 한정되며, 병리조직학적으로 관찰해 보면 장융모 상피세포의 팽대, 변성 및 탈락 등이 보인다. 일반적으로 대규모 농장의 경우 계절 분만 프로그램을 시행하거나, 분만 간격이 좁으므로 어린 송아지에서의 유행 양상이 소규모 농장의 경우보다 더 폭발적이며, 특히 늦겨울부터 초봄까지가 심하다. 소 로타바이러스는 임상 증상만으로는 진단이 불가능하며 여러 가지 질병과 감별 진단이 필요하다. 발병 초기의 분변 중에는 다량의 바이러스가 포함되어 있으므로 분변에서 직접 바이러스나 유전자를 검출하든지, 배양세포를 이용하여 바이러스 분리를 시도할 수도 있다. 전자현미경을 이용한 바이러스 입자 검출이 가장 확실한 방법으로 한 번에 다른 설사 관련 바이러스도 검출할 수 있다. 바이러스 항원 특히 공통항원 검출법으로 효소면역검사법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 적혈구 응집반응, 라텍스(latex) 응집반응 등이 응용되고 있다. 소 로타바이러스에 대한 항체검출법으로는 간접 형광항체법, 보체결합방법, ELISA, 중화반응이 있다.
하지만 송아지는 초유를 통한 이행항체를 보유하고 있기 때문에 항체를 기반으로 한 분석방법은 정확성이 현저히 낮은 문제가 있다. 따라서 소 로타바이러스에 대해 높은 민감도와 정확도를 보유한 기술의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 소 로타바이러스를 정확하게 검출할 수 있는 기술에 대해 연구하던 중, 소 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드를 발굴하고 상기 펩타이드가 소 로타바이러스에 대해 높은 선택성을 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 소 로타바이러스(bovine rotavirus) 검출용 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 소 로타바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 소 로타바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 소 로타바이러스 검출용 바이오칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 소 로타바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 소 로타바이러스(bovine rotavirus) 검출용 펩타이드를 제공한다.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 소 로타바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 소 로타바이러스 검출용 키트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 소 로타바이러스 검출용 바이오칩을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 소 로타바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 소 로타바이러스 검출용 펩타이드는 소 로타바이러스에 대해 높은 정확도 및 민감도를 보이며, 이를 포함하는 바이오칩 또한 소 로타바이러스를 정확하게 검출할 수 있는 바, 이를 기존의 소 로타바이러스 검출용 항체를 대체하여 더 정확도가 높은 기술로써 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 후보군과 소 로타바이러스 항체의 소 로타바이러스에 대한 결합력을 확인 및 비교한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 후보군이 고정된 바이오칩의 소 로타바이러스에 대한 결합력을 확인한 결과로, 도 2 중 A)는 CV(Cyclic voltammetry, 순환 전압 전류법)로 확인한 결과이고, 도 2 중 B)는 EIS(Electrochemical impedance spectroscopy, 전기화학 임피던스 분광법)로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 후보군이 고정된 바이오칩의 소 로타바이러스 농도에 따른 결합력을 확인한 결과로, 도 3 중 A)는 CV로 확인한 결과이고, 도 3 중 B)는 EIS로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 펩타이드를 기반으로 합성된 신규 펩타이드의 바이오칩에 대한 최적화된 고정화 조건을 확인한 결과로, 도 4 중 A)는 펩타이드의 농도에 따른 결과이고, 도 4 중 B)는 고정화 시간에 따른 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 펩타이드를 기반으로 합성된 신규 펩타이드가 고정된 바이오칩의 소 로타바이러스에 대한 선택성을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 펩타이드를 기반으로 합성된 신규 펩타이드가 고정된 바이오칩의 소 로타바이러스 농도에 따른 결과를 확인한 것으로, 도 6 중 A)는 결합력을 확인한 결과이고, 도 6 중 B)는 검출한계를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 소 로타바이러스(bovine rotavirus) 검출용 펩타이드를 제공한다.
WPTSLSWTWFTR(서열번호 1).
WPTSLSWTWFTRGGGSC(서열번호 2).
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열은 박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(phage display peptide library) Ph.D.12(New England BioLab)를 이용하여 소 로타바이러스에 결합하는 서열을 찾아낸 것이다. 상기 Ph.D.12는 M13 박테리오파지의 게놈중에서 외피단백질(coat protein)의 일종인 pⅢ를 생산하는 유전자 말단에 유연성 링커(flexible linker, -GGGS-)와 랜덤 아미노산 서열 12개를 포함한 총 16개 무작위 아미노산 서열의 펩타이드 리셉터가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균 (E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 선형의 펩타이드 리셉터를 발현한 재조합 M13 박테리오파지로 구성되어 있다.
본 발명에서 사용된 상기 M13 박테리아파지는 특정 형질(strain)의 대장균만 감염되는 성질을 지니는 나노크기의 물질이며 돌연변이를 일으켜 인체에 감염될 가능성에 대해서는 현재까지 전혀 보고된 바 없다. 특히 2006년 FDA의 승인을 얻어 인스턴트식품의 세균 오염 방지용 첨가물로 활용되고 있으며, 항생제의 내성 문제를 해결할 수 있는 대체제뿐만 아니라 인체에 무해한 생체 진화형 나노물질로 각광을 받고 있다. 더불어 상기 박테리아파지를 이용하는 경우, 제조 공정이 간단하며 생산성과 안정성의 향상을 기대할 수 있고, 다양한 유전공학적, 화학적 변형을 활용할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 소 로타바이러스 검출용 펩타이드는 당 분야에 공지된 다양한 링커서열 및 바이오칩 또는 검출 키트 고정화를 위한 서열이 부가될 수 있다.
바람직한 구현예로 본 발명의 펩타이드에 있어서, 상기 서열번호 2의 펩타이드는 유연한 결합을 위한 유연성 링커(-GGGS-)와 금 전극 표면 고정화를 위한 시스테인(Cysteine)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 저분자 펩타이드로서 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 거의 없다. 이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다.
본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 T-BOC(tert-butyloxycarbonyl) 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서 N 말단 또는 C 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호한 형태일 수 있다. 즉, 상기 펩타이드의 C 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형되는 것일 수 있다. 또한 상기 펩타이드의 N 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시카르보닐(Fmoc)기, 포르밀(Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기, 스테아릴(Stearyl)기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 기로 변형되는 것일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하며, N 말단 혹은 C 말단에 다양한 기능기를 포함할 수 있다.
상기 다양한 기능기의 예시로서, N 말단의 기능기는 자유아민(free amine), 아세틸화(acetylation), 바이오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, C 말단의 기능기는 유리산(free acid), 아미드화(amidation), 비오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 검출 또는 동정을 위하여 표지될 수 있으며, 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발색효소는 예를 들어, 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)일 수 있고, 상기 방사성 동위원소는 예를 들어, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S일 수 있으며, 상기 발광물질 또는 형광물질은 예를 들어, FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots) 등일 수 있다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.
만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography, FMT)으로 소 로타바이러스에 결합한 펩타이드의 형광 패턴을 관찰할 수 있고, 형광이 관찰되는 패턴에 따라, 소 로타바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명의 소 로타바이러스 검출용 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 소 로타바이러스 검출용 펩타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 소 로타바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 소 로타바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 소 로타바이러스 검출용 키트에는 소 로타바이러스 검출을 위한 펩타이드의 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있고, 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 4℃로 유지된 상태로 제공될 수 있다.
소 로타바이러스에 결합한 본 발명에 따른 펩타이드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 키트에 포함되는 펩타이드는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 생체 내에서 소 로타바이러스와의 결합 정도 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 일 구체예로서 본 발명의 키트는 소 로타바이러스와 관련된 질환의 진단을 위하여 사용될 수 있고, 상기 진단은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 진단을 실시할 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 소 로타바이러스 검출용 바이오칩을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 바이오칩으로 사용 가능한 다양한 칩 (금(gold), 은(silver), 자성 비드(magnetic bead), 실리카(silica), 그래핀(graphene), 탄소 나노튜브(carbon nanotube) 등) 상에 특이적으로 고정될 수 있다. 다만, 본 발명의 특징은 전술한 펩타이드의 특징과 관련되며 이와 같이 펩타이드를 바이오칩으로 제조하는 것은 공지기술에 따라 할 수 있는 부분이다.
본 발명에 따른 소 로타바이러스 검출용 바이오칩을 이용하여 단백질과 단백질 간의 반응, 단백질과 반응리간드 간의 반응, 목적리간드와 반응단백질 간의 반응 또는 목적리간드와 반응리간드간의 반응을 검출할 수 있다.
상기 반응리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 생체물질, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응단백질은 효소 또는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응 검출은 표지 혹은 비표지체를 이용하여 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 소 로타바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물(예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함하는 의미이다. 더불어 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry), 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry), 펄스차이 전압전류법(Different pulse voltammetry), 시간대전류법(Chronoamperometry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 생물층 간섭계(Bio-layer interferometry), 수정 진동자 마이크로밸런스(Quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA(Lateral flow assay)/VFA(Variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 소 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 발굴
M13 박테리오파지 디스플레이를 이용한 바이오패닝을 통해 소 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 발굴하였다. 이를 위하여, 항체의 Fc 부위가 단백질 A에 강하게 결합하는 성질을 가진 Mouse 유래 IgG2a를 소 로타바이러스 항체로 사용하였다(메덱스 사에서 제공받음).
더불어 M13박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(M13 bacteriophage display peptide library)는 Ph.D.-12(New England BioLab)를 사용했다. 이는 M13 박테리오파지의 게놈중에서 외피단백질(coat protein)의 일종인 pⅢ를 생산하는 유전자 말단에 유연성 링커(flexible linker, -GGGS-)와 랜덤 아미노산 서열 12개를 포함한 총 16개 무작위 아미노산 서열의 펩타이드 리셉터가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균 (E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 선형의 펩타이드 리셉터를 발현한 재조합 M13 박테리오파지로 구성되어 있다
바이오패닝을 통한 선별과정은 단백질 A(protein A)가 코팅되어 있는 평판(Protein A coated 96 well plates, 15130, Thermo scientific사에서 구입)을 사용하였다. 세척용액으로 PBST (0.1 mol PBS with Tween 0.05%, pH 7.4)를 제조하고, 세척용액 200 μL로 3회 반복하여 플레이트를 충분히 적셔주었다. 용액을 제거한 후 충분히 적셔진 플레이트에 100 μL의 소 로타바이러스 항체(농도: 1 μg/mL)를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 용액을 제거하고 0.05% PBST 200 μL를 넣고 3회 반복 세척하였다. 세척 용액을 깨끗이 제거하고, 100 μL의 PBS (0.1 mol, pH 7.4)를 이용해 105 copies/mL 농도로 희석된 소 로타바이러스를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 용액을 제거하고 0.05% PBST 200 μL로 3회 반복 세척하였다. M13박테리오파지 라이브러리를 PBS(0.1 mol, pH 7.4)에 1011 PFU/mL 농도로 희석한 후 플레이트에 100 μL 넣고 150 rpm으로 교반하면서 1시간 동안 반응하였다. 세척용액으로 0.1% PBST(0.1 mol PBS with Tween 0.1%, pH 7.4)를 제조하고, 세척용액 200 μL로 10회 세척한 후 100 μL의 글리신/HCl(Glycine/HCl (0.2 mol, pH 2.2))을 넣고 150 rpm으로 교반하면서 10분 동안 반응시켜 소 로타바이러스에 결합된 M13박테리오파지를 용해시켜 주었다. 플레이트의 상층액(용출된 M13 박테리오파지)을 마이크로튜브로 옮긴 후, M13 박테리오파지의 변성을 막기 위해 Tris-HCl(1 mol, pH 9.1) 15 μL를 넣어 중화하였다. 용출된 M13 박테리오파지 용액은 4℃에서 보관하였다. 또한 소 로타바이러스에 특이적인 M13 박테리오파지를 얻기 위해서 반응 회차가 진행될수록 세척용액의 트윈-20(Tween-20) 농도를 0.1, 0.3, 0.5% 순으로 증가시켜 주었다.
더불어 2, 3, 4 회차의 바이오패닝을 시작하기 전에 M13 박테리오파지 라이브러리를 소 로타바이러스 항체가 결합된 플레이트와 150 rpm으로 교반하면서 30분동안 반응시켜 음성 선택(Negative selection)을 수행하였다.
상기 과정은 4회씩 반복 수행하였으며, DNA 서열 분석을 통해 반복적으로 나타나는 펩타이드 리셉터 서열을 포함하는, 하기 표 1의 M13 박테리오파지를 선별하였다.
후보군 아미노산 서열(N→C term) 빈도수
Rv R3 1 DHAQRYGAGHSG 5
Rv R3 15 WPTSLSWTWFTR 13
Rv R3 25 QMGFMTSPKHSV 5
Rv R3 32 HFVKTPARWAWG 6
Rv R3 34 LTPWIPGLVRDP 1
실시예 2. ELISA를 이용한 박테리오파지 후보군의 소 로타바이러스에 대한 결합력 확인
상기 실시예 1을 통해 선별된 5개의 박테리오파지 후보군의 소 로타바이러스에 대한 결합력을 ELISA(enzymed-linked immunosorbent assay)를 이용하여 확인하였다. 상기 ELISA는 스트렙트아비딘(streptavidin)이 코팅되어 있는 플레이트 (Streptavidin high binding capacity coated 96-Well plates, 15501, Thermo scientific 사에서 구입)를 사용하여 수행하였다. 더불어 상기 실시예 1에서 사용한 소 로타바이러스 항체를 사용하였으며, 상기 항체는 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit (21425, Thermo scientific 사에서 구입)을 사용하여 바이오틴화(biotinylation) 과정을 거치고 PierceTM BCA Protein Assay Kit(23227, Thermo scientific 사에서 구입)을 사용하여 농도를 정량한 후 사용 전까지 -20 ℃에 보관하였다.
더불어 M13 박테리오파지의 증폭(Amplification)을 수행하였다. 이를 위하여 대장균(ER 2738) 콜로니를 20 mL LB 배지에 넣고 210 rpm으로 교반하면서 37℃에서 밤새 배양하였다. 그 후 흡광도(Optical density, OD)값이 0.03 - 0.05가 되도록 LB 배지를 이용하여 대장균 배양액을 희석하였다. 희석된 용액 20 mL에 10 μL의 M13 박테리오파지 후보군의 용출용액을 접종하고 210 rpm으로 교반하면서 37℃에서 4시간 30분간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 4℃에서 12,000 g 속도로 10분간 원심분리하여 대장균을 제거해 주었다. 이후 상층액을 취하고, 이에 20% PEG(polyethylen glycol)/2.5 mol NaCl 3.3 mL을 넣어준 뒤 4℃에서 6시간 동안 보관하였다. 4℃에서 12,000 g 속도로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 남은 침전물(Pellet)을 1 mL의 PBS(0.1 mol, pH7.4)에 녹이고 4℃에서 14,000 rpm 속도로 5분 동안 원심분리하여 남아있는 불순물을 제거하였다. 원심분리가 끝난 후 상층액을 취하고, 이에 166.7 μL의 20% PEG/2.5 mol NaCl을 넣은 후, 1시간 동안 얼음에서 보관하였다. 그 후 14,000 rpm 속도로 10분 동안 원심분리하고 침전물을 수득한 후, 이를 200 μL PBS (0.1 mol, pH7.4)에 녹인 후 파지 적정(Titration)을 실시하고 하기 수학식 1을 통해 파지의 농도(PFU/mL: Plaque forming units/mL)를 계산하였다.
[수학식 1]
파지 농도(PFU/mL) = Plaque수 ×희석배수 ×mL로 환산한 접종량
상기와 같이 증폭시킨 박테리오파지 후보군들을 이용하여 ELISA를 수행하였다. 스트렙토아비딘 플레이트에 바이오틴화된 소 로타바이러스 항체 100 μL(농도: 1 μg/mL)를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 200 μL의 0.05% PBST(0.1 mol PBS with Tween 0.5%, pH 7.4)로 3회 반복 세척하였다. 더불어 소 로타바이러스를 PBS(0.1 mol, pH 7.4)에 희석하여 100 μL(농도: 105 copies/mL)를 플레이트에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 플레이트의 상층액을 모두 제거하고, NaHCO3 (pH 8.6) 10 mL에 BSA 0.5 mg을 넣어 제조한 블로킹(blocking) 용액 200 μL을 넣고 밀봉한 후 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 PBST 200 μL로 반응이 완료된 플레이트를 6회 반복 세척하였다. 앞서 증폭된 박테리오파지 후보군 용액을 PBS(0.1mol, pH7.4)를 이용하여 1012 PFU/mL 농도로 희석하였다. 희석된 박테리오파지 후보군 용액 100 μL를 세척된 플레이트에 넣고 150 rpm으로 교반하면서 1시간 동안 반응시켰다. 상층액을 제거하고 0.5% PBST 200 μL로 6회 반복 세척하였다. 더불어 블로킹 용액 5 mL에 Anti-M13 박테리오파지 항체-HRP (Sinobio, China)를 2 μL을 넣어 검출 용액을 제조하였다. 검출 용액 200 μL를 파지가 고정화되어 있는 플레이트에 넣고 150 rpm으로 교반하면서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 PBST 200 μL로 6회 반복 세척하였다. ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 용액 7 mL과 H2O2 12 μL를 혼합한 직후 이의 200μL를 플레이트에 넣고 405 nm에서 OD 값을 측정하였다. 이때 대조군으로 소 로타바이러스 항체를 대조군으로 설정하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, Rv R3 15, Rv R3 32 및 Rv R3 34 후보군에서 소 로타바이러스 항체만 고정화되어 있는 플레이트에 비해 소 로타바이러스가 고정화된 플레이트에서 더 높은 결합력을 나타내었으며, Rv R3 15 및 Rv R3 34 후보군에서는 바이러스 농도에 따라 증가하는 경향을 나타내었다.
실시예 3. 전기화학(Electrochemical) 분석법을 이용한 박테리오파지 후보군의 소 로타바이러스에 대한 결합력 확인
본 발명에 따른 후보군을 고정시킨 바이오칩의 소 로타바이러스에 대한 결합력을 확인하였다. 이를 위하여 CV(Cyclic voltammetry, 순환 전압 전류법)와 EIS(Electrochemical impedance spectroscopy, 전기화학 임피던스 분광법)를 사용하였다. 상기 CV는 전해질상에서 작업 전극에 전압을 주사하면 이에 따른 전류의 값에 의해서 전극표면 근처에서 발생하는 표면물질의 전기화학적 반응에 의한 열역학 및 속도론적인 파라미터를 구하는 분석방법이며, 상기 EIS는 높은 주파수에서 낮은 주파수로 차례로 시료에 가하여 시료에서 나오는 진폭과 위상의 변화를 측정한 후 임피던스를 분석하는 방법이다. 더불어 CHI 660E (Electrochemical Workstation)장비를 사용(CH Instruments사에서 구입)하였으며, 전극으로 Metrohm사의 SPCEs-SA(Screen-printed carbon electrodes (SPCEs) modified with streptavidin)를 사용하였다.
먼저 SPCEs-SA를 3차 증류수로 깨끗이 세척한 후 질소를 이용하여 건조시켰다. 그 후 SPCEs-SA의 작업전극 부분에 5 μL의 PBS (0.1mol, pH7.4)를 이용하여 희석한 바이오틴화된 소 로타바이러스 항체(농도: 2 μg/mL)를 올린 후 밀봉하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나고 3차 증류수로 충분히 씻고 질소를 이용하여 건조하였다. 소 로타바이러스 항체가 고정화된 작업전극에 5 μL의 소 로타바이러스(105 copies/mL)를 올린 후 밀봉하고 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나고 3차 증류수로 5회 반복하여 세척한 후 전해질 용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3) 10 mL을 넣고 CV와 EIS를 측정하였다.
더불어 전해질 용액을 제거하고 3차 증류수로 깨끗이 세척한 후 5 μL의 M13 박테리오파지 용액(1012 PFU/mL)을 작업전극에 올리고 1시간동안 반응시켰다. 이 후 3차 증류수로 깨끗이 세척한 후 전해질 용액 10 mL을 넣고 M13 박테리오파지와 소 로타바이러스의 결합력을 측정하였다. CV에서 얻은 전류값은 하기 수학식 2를 통해 산출하였고, EIS에서 얻은 임피던스(Impedance) 값은 하기 수학식 3을 통해 산출하였다. 이때 소 로타바이러스 항체를 대조군으로 설정하였다.
[수학식 2]
ΔI(%) = (Ib-Ia)/Ib×100
[수학식 3]
ΔRct(%) = (Rctb-Rcta)/Rctb×100
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, CV와 EIS 모두에서 Rv R3 15 후보군이 대조군에 비해 소 로타바이러스에서 2배 이상 더 높은 결합력을 나타내는 것이 확인되었다. 반면 Rv R3 32 및 Rv R3 34 후보군에서는 상기 실시예 2의 ELISA 결과와는 다르게 소 로타바이러스가 아닌, 소 로타바이러스 항체에 대하여 높은 결합력이 확인되었다.
더불어 상기와 동일한 방법으로 Rv R3 15 후보군의 소 로타바이러스의 농도에 따른 영향을 CV 및 EIS를 이용하여 확인하였다. 이때 소 로타바이러스는 104-106 copies/mL의 농도로 처리하였다.
그 결과 도 3과 같이, 소 로타바이러스의 농도가 증가함에 따라서 Rv R3 15 후보군의 결합력이 증가함을 확인하였다.
따라서 Rv R3 15 후보군이 소 로타바이러스에 대하여 다른 후보군보다 현저히 높은 결합력을 보임을 확인하였다. 또한 ELISA 결과에 있어서, Rv R3 32 및 Rv R3 34 후보군은 Rv R3 15 후보군에 비해 더 강력한 소수성 성질을 가지고 있기 때문에 폴리스티렌(Polystyrene) 플레이트 사용으로 인한 소수성 결합에 의한 비특이적인 결합에 영향을 받은 것을 판단되었다.
실시예 4. 선별된 후보 펩타이드를 기반으로 한 신규 펩타이드 리셉터의 합성
상기 실시예를 통해 선별된 Rv R3 15 후보 펩타이드(WPTSLSWTWFTR)를 기반으로, 유연한 결합을 위한 유연성 링커(-GGGS-)와 금 전극 표면 고정화를 위한 시스테인(Cysteine)을 포함하여 펩타이드를 디자인하여 하기 표 2의 펩타이드 리셉터를 합성하였다(Peptron사에 의뢰).
펩타이드 명칭 아미노산 서열(N→C)
Rv BP1 WPTSLSWTWFTRGGGSC
합성 후 정제 및 동결 건조된 펩타이드를 DMSO (Dimethyl sulfoxide)에 소량에 희석한 후 PBS(0.1 mol, pH 7.4)를 이용하여 고농도로 제조하고 사용 전까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다.
실시예 5. 전기화학 분석법을 이용한 펩타이드 리셉터의 소 로타바이러스에 대한 결합력 확인
상기 실시예 4에서 합성한 Rv BP1의 농도 및 고정화 시간에 따른 소 로타바이러스에 대한 결합력을 SWV(Square Wave Voltammetry, 사각파형(구형파) 전압전류법)를 사용하여 확인하였다. 상기 SWV는 전해질에 산화/환원 반응이 가능한 상태에서 작업 전극에 빠른 속도로 전압을 주사하면 이에 따른 전류의 값에 의해서 전극표면 근처에서 일어나는 물질의 전기화학 반응의 열역학 및 속도론적인 파라미터를 확인할 수 있는 분석 방법이다.
CHI 660E (Electrochemical Workstation)장비를 사용(CH Instruments사에서 구입)하였으며 분석은 상온에서 상대전극(Counter Electrode), 기준전극 (Reference Electrode), 작업전극 (Working Electrode)를 이용한 3전극법으로 수행하였고, 1회용 골드칩을 사용하였다.
먼저 골드칩을 연마(Polishing)하기 위해 에탄올에 5분 동안 침지한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 황산(H2SO4)과 과산화수소(H2O2)를 7:3 비율로 혼합하여 제조한 피라냐 용액(Piranha solution)을 250 μL씩 도포하고 10분 동안 상온에 서 방치한 후 다시 3차 증류수로 세척하였다. 이 후 3차 증류수에 5분간 침지하여 잔류한 황산용액을 제거하고 3차 증류수로 세척한 후 질소를 이용하여 건조하였다. 그 후 골드칩을 전용셀에 고정하고 50μL의 Rv BP1 펩타이드(농도: 0.7, 7 또는 70 μg/mL)를 넣고 2시간 동안 상온에서 150 rpm으로 반응시켰다. 반응이 종료된 후 3차 증류수로 5회 세척한 뒤 전해질 용액 2 mL을 넣고 SWV를 측정하였다. 전해질 용액을 제거하고 3차 증류수로 5회 세척한 후 20 μL의 소 로타바이러스(105 copies/mL)를 펩타이드 리셉터가 고정화된 골드칩에 넣어주고 1시간동안 반응시켰다. 이 후 3차 증류수로 5회 반복 세척한 후 전해질 용액 2mL을 넣고 펩타이드 리셉터와 소 로타바이러스의 결합력을 측정하였다. SWV에서 얻은 전류값은 수학식 2를 통해 계산하여 그 결과를 도 4 중 A)에 나타내었다.
더불어 본 발명에 따른 펩타이드의 골드칩 고정화 시간에 따른 결합력을 확인하였다. 이때 상기와 동일한 방법으로 수행하였으며, Rv BP1 펩타이드는 7 μg/mL의 농도로 넣어주었고, 30분, 60분, 120분 또는 300분의 펩타이드의 고정화 시간에 따른 차이를 확인하여 도 4 중 B)에 나타내었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 Rv BP1 펩타이드 리셉터의 농도에 따른 영향과 고정화 시간에 따른 영향을 확인하여 펩타이드 리셉터의 고정화 조건을 최적화해 주었다. 그 결과 본 발명에 따른 펩타이드 리셉터는 농도 7 μg/mL에서 2시간(120분)동안 반응시켰을 때 가장 효율적으로 금 전극 위에 고정화되는 것을 확인하였다.
더불어 상기와 동일한 방법으로 소 코로나바이러스(메덱스에서 제공받음)를 대조군으로 이용하여 Rv BP1 펩타이드 리셉터의 소 로타바이러스에 대한 선택성을 확인하였다. 그 결과 도 5와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 리셉터는 소 코로나바이러스보다 소 로타바이러스에서 더 높은 결합력을 나타내는 것을 확인하였다.
또한 상기와 동일한 방법으로 Rv BP1 펩타이드 리셉터의 소 로타바이러스 농도 변화에 따른 결합력을 측정하였다. 이때 소 로타바이러스는 100-105 copies/mL의 농도로 처리하였다.
그 결과 도 6 중 A)와 같이, 소 로타바이러스의 농도 증가에 비례하여 결합력이 증가하는 것을 확인하였으며, 도 6 중 B)와 같이, 검출한계(Limit of detection, LOD)는 100.73 copies/mL인 것을 확인하였다.
종합적으로, 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 본 발명의 펩타이드는 소 로타바이러스와 특이적으로 결합할 수 있어 소 로타바이러스를 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 고정된 바이오칩도 소 로타바이러스에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타내는 것을 확인하였다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Novel peptides that specifically bind to bovine rotavirus <130> 1-99P <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide1 for specific detection of bovine rotavirus_Rv R3 15 <400> 1 Trp Pro Thr Ser Leu Ser Trp Thr Trp Phe Thr Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide2 for specific detection of bovine rotavirus_Rv BP1 <400> 2 Trp Pro Thr Ser Leu Ser Trp Thr Trp Phe Thr Arg Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Cys

Claims (8)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 소 로타바이러스(bovine rotavirus) 검출용 펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 소 로타바이러스 검출용 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 소 로타바이러스 검출용 키트.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 소 로타바이러스 검출용 바이오칩.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 소 로타바이러스 검출 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic voltammetry), 사각파전압전류법(Square wave voltammetry), 펄스차이 전압전류법(Different pulse voltammetry), 시간대전류법(Chronoamperometry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 생물층 간섭계(Bio-layer interferometry), 수정 진동자 마이크로밸런스(Quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA(Lateral flow assay)/VFA(Variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.














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