KR102554337B1 - 인플루엔자 a h5n1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

인플루엔자 a h5n1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 A H5N1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인플루엔자 A H5N1 바이러스의 뉴라민 분해효소(neuraminidase)에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이를 이용한 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 펩타이드는 인플루엔자 A H5N1 바이러스와 매우 높은 특이도 및 친화도로 결합하므로, 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 조성물, 검출 키트 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있으며, 인플루엔자 A H5N1 바이러스 감염이 의심되는 환자로부터 제공된 시료에서 인플루엔자 A H5N1 바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.

Description

인플루엔자 A H5N1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도{Peptide specifically binding to H5N1 subtype of influenza A virus and uses thereof}
본 발명은 인플루엔자 A H5N1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인플루엔자 A H5N1 바이러스의 뉴라민 분해효소(neuraminidase)에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이를 이용한 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 RNA 바이러스로서 오르쏘믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 인플루엔자 바이러스 속에 속하고, 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid, NP)와 기질 단백질(matrix, M)의 항원성 차이에 의해 A, B, C, D형으로 분류된다. 이중 A형은 HA 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H18형까지, NA 단백질의 항원 특성에 따라 N1형에서 N11형의 아형으로 분류된다. 이 바이러스 입자는 외피막을 보유하고 있고 대게 직경이 80 ~ 120 nm 정도인 다형성 구형인데, 유정란 및 감수성 세포에서 분리된 직후의 바이러스는 길이가 400 nm인 실모양의 필라멘트 형태를 가지는 경우도 있다. 바이러스의 외피막에는 특정 당단백질이 존재하는데, A형 바이러스에 존재하는 대표적인 외피막 당단백질은 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라민 분해효소(neuraminidase, NA)이고 이것은 바이러스 표면에 돌출되어 항체 반응에 중요한 역할을 한다.
일반적으로 인플루엔자바이러스 중 감염성과 병원성면에서 가장 대표적인 것은 A형 바이러스이다. 이 바이러스는 조류 및 사람을 포함하여 다양한 종을 감염시킬 수 있다. 이것의 자연 숙주는 야생 철새로 알려져 있으며, 종간감염을 통해 조류로부터 포유류로 전이가 발생하는 것으로 추측한다. 항원 대변이에 의한 A형 바이러스의 유행주기는 약 10 ~ 40 년으로 추정되고, 과거 최소 3번의 인플루엔자 바이러스 대유행 원인이 되었다. 1918년 A/H1N1형에 의한 스페인독감의 출현으로 전 세계적으로 약 5,000만 명이 사망하였고, 1957년에는 A/H2N2형에 의한 아시아 독감으로는 전 세계적으로 200만 명이 사망하였으며 1968년에는 A/H3N2형에 의한 홍콩 독감으로 대유행 중 가장 경미하였지만 전 세계적으로 약 100만 명이 사망하였다. 본 발명에서 검출하고자 하는 신종 인플루엔자 바이러스 (A/H5N1)형은 고병원성 조류 독감을 일으키고 원래 조류끼리만 감염되는 독감이라 알려져 있었지만 1997년 홍콩조류독감으로 6명이 사망하자 조류에서 사람으로 전염된다는 것이 밝혀졌다. 이 바이러스는 현재 조류의 배설물 및 분비물에 직접적으로 접촉해야 전염되지만 WHO는 H5N1가 돌연변이를 하여 사람과 사람 간 전염이 되는 경우, 사스보다 위험하다고 경고했다.
인플루엔자 바이러스 감염으로 나타나는 호흡기 질환은 특이한 양상이 아니므로 호흡기세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus: RSV), 파라인플루인제 바이러스, 아데노바이러스, 라이노바이러스, 폐렴미코플라스마 및 세균에 의한 호흡기 감염과의 감별 진단이 필요하다. 이를 위해 인플루엔자 바이러스 감염의 여러 진단방법이 개발되었으며 그 중 첫 번째로 배양검사가 있다.
이를 위해 인플루엔자 바이러스 감염의 여러 진단방법이 개발되었으며 그 중 첫 번째로 배양검사가 있다. 이것은 동물세포 및 수정란을 이용하여 채취한 검체(인플루엔자바이러스)를 항생제로 처리한 후 배양하며 세포병변효과(cytopathic effect, CPE) 관찰, 혈구응집법(Hemagglutination Test)으로 항원 검출, 역전사중합효소연쇄반응법(RT-PCR), 실시간 역전사중합효소연쇄반응법(Real-time RT-RCR)으로 인플루엔자바이러스의 특이 유전자를 확인하는 방법이다. 두 번째는 유전자 검출검사인데 이는 인플루엔자바이러스에 특이적인 유전자(HA 또는 NA 부위)를 증폭시켜 인플루엔자바이러스의 형(type) 및 아형(subtype)을 분석하는 방법이며, 세포배양을 통해 분리된 인플루엔자바이러스의 형과 아형 분석을 위해 HA (hemagglutination assay), HI (hemagglutination inhibition assay) 방법 등을 실시하고 있다. 이외에 RT-PCR (reverse transcription- polymerase chain reaction), Real-time RT-RCR, EIA (enzyme linked immuno assay) 방법을 사용하여 A, B 형과 아형을 결정하고 염기서열 분석법으로 인플루엔자바이러스 분리주의 HA 또는 NA 유전자에 대한 염기서열을 분석하여 백신주 및 외국 분리주와 비교 분석하는 진단 방법이 있다. 세 번쩨로 인플루엔자바이러스의 혈청학적 진단은 급성기(발병 1주 이내)와 회복기(발병 2~4주) 혈청간 IgG 인플루엔자 특이 항체가 4배 이상 유의하게 증가되면 진단 가능하다. 하지만 이러한 진단 방법들은 과정이 복잡하고 오래 걸리며 전문가의 도움을 필요로 하고 있다. 마지막으로 신속 인플루엔자 진단 검사(Rapid influenza diagnostic tests (RIDTs))는 인플루엔자바이러스 항원을 검출하는 방법으로 최근 새로운 진단 시약들이 개발되어 진료실에서 환자의 검체를 채취하여 30분 이내 진단함으로써 항바이러스제 투여 여부를 신속하게 결정할 수 있다. 그러나 PCR보다 민감도가 낮으며, 바이러스 항원 특성 규명이 안되고 가격이 비싼 것이 단점이다. 또한 RIDTs에서 음성일 경우라도 인플루엔자 감염을 완전히 배제할 수 없으므로 필요시 세포배양이나 유전자 검사가 필요하다는 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 인플루엔자 바이러스 A H5N1을 신속, 정확하게 검출할 수 있는 진단방법을 개발하기 위해 연구를 진행한 결과, 인플루엔자 바이러스 A/H5N1 외피막 당단백질인 뉴라민 분해효소(neuraminidase, NA)에 높은 민감도 및 정확도를 가지는 신규 펩타이드를 발굴하였고, 이를 이용하여 인플루엔자 바이러스 A H5N1을 조기진단할 수 있는 시스템을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 6로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 인플루엔자 A H5N1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다음 단계를 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다: (a) 제1항의 따른 펩타이드와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 펩타이드와 검출 대상 시료에 포함된 인플루엔자 A H5N1 바이러스의 결합 여부를 확인하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 독감 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 6로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 인플루엔자 A H5N1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다음 단계를 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출 방법을 제공한다: (a) 제1항의 따른 펩타이드와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 펩타이드와 검출 대상 시료에 포함된 인플루엔자 A H5N1 바이러스의 결합 여부를 확인하는 단계.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 독감 진단용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 6로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 인플루엔자 A H5N1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 범위는 서열번호 1 내지 6로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 상기 펩타이드의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 내지 6로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 펩타이드는 인플루엔자 A H5N1 바이러스의 뉴라민 분해효소(neuraminidase)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하며, 다른 아형의 인플루엔자 A 바이러스에는 결합하지 않는 높은 특이도를 나타낸다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 제작한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning;
A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982.
본 발명에 따른 펩타이드는 기존 항체나 앱타머, PNA, 탄수화물, 효소 등을 이용한 검출방법에 비해 제조 수율이 향상되고 제조공정이 간단하여, 분광학적 혹은 전기화학적인 검출기술을 활용할 경우 시료 내 극미량으로 존재하는 인플루엔자 바이러스를 매우 간단하고, 효율적이면서 고민감성과 고특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “DNA”, “폴리뉴클레오타이드” 및 “핵산”은 특정한 종의 총 게놈 DNA에서 단리되어 있는 DNA 분자를 가리킨다. 그러므로, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 조각(부분, segment)이란, 그 DNA 조각을 얻을 수 있는 종(species)의 총 게놈 DNA로부터 실질적으로 단리되거나, 또는 정제되어 있는 하나 이상의 코딩 서열(coding sequence)로 이루어지는 DNA 조각을 가리킨다. 용어 'DNA 조각' 및 ‘폴리뉴클레오타이드’는 DNA 조각 및 상기 조각의 더 작은 단편을 포함하고, 또한 재조합 벡터(예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 살균 바이러스, 바이러스 등을 포함한다)를 포함한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등을 발현하거나, 또는 발현할 수 있도록 개조된 것으로서, 게놈 서열, 게놈 외(extra-genomic) 서열, 플라스미드에 암호화된 서열 및 보다 작은 조작된 유전자 조각 등을 포함한다. 이러한 조각은 자연적으로 단리될 수 있고, 또는 사람의 손에 의해 합성적으로 변형될 수 있다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥(코드서열 또는 안티센스 서열)일 수 있고, 또는 이중 가닥일 수 있으며, 그리고 DNA 분자 (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. 추가의 코딩(coding) 또는 비코딩(non-coding) 서열이 본발명의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있다. 또한 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지 재료에 연결될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 그 코딩 서열 자체의 길이에 관계없이, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 조각(부분, segment) 등과 같은 다른 DNA 서열과 결합될 수 있고, 그 결과 자신의 전체 길이는 상당히 달라질 수 있다. 그러므로 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오티드 단편이 적용될 수 있는 것으로 고려되며, 바람직하게 의도하는 재조합 DNA 프로토콜에서 제조 및 사용의 용이함에 의하여 그 전체 길이가 제한될 수 있다.
더욱이, 유전적 코드의 축중(degeneracy)의 결과로서, 본 명세서에 기재되는 폴리펩타이드를 암호화하는 많은 뉴클레오타이드 서열이 존재한다는 것은, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 자명히 이해될 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 중 몇몇은 임의의 천연 유전자(native gene)의 뉴클레오타이드 서열에 대해서 최소의 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법(codon usage)의 차이로 인해 다른 폴리뉴클레오타이드들(예를 들어 사람 및/또는 영장류의 코돈 선택에 대해서 최적화된 폴리뉴클레오타이드)은 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
원하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해, 폴리펩타이드 또는 기능적 등가물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 적절한 발현 벡터(즉, 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소(엘레먼트)를 포함한 벡터) 내에 삽입할 수 있다. 당업자에게 잘알려진 방법으로 목적(interest)하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 및 적절한 전사 제어 요소(엘레먼트) 및 번역 제어 요소(엘레먼트)를 포함하는 발현벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법들은 in vitro 재조합 DNA 기술들, 합성 기술, 및 in vivo 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 방법들은 하기의 문헌에 기재 되어있다: Sambrook et al., Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1989) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1989).
다양한 발현벡터/숙주 시스템이 공지되어 있으며, 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하고 그리고 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 상기 발현벡터/숙주 시스템은, 이들로서 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환된 세균; 효모 발현벡터로 형질 전환된 효모; 바이러스 발현벡터(예를들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 바이러스 발현 벡터(예를들어, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) 또는 세균 발현 벡터(예를들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 동물세포계 등의 미생물을 포함한다.
발현 벡터 내에 존재하는 “제어 요소(엘레먼트)” 또는 “조절 서열” 은, 전사 및 번역을 실행하도록 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 비번역 영역(인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역)이다. 이러한 요소(엘레먼트)는 그 강도(strength) 및 특이성(specificity)을 달리할 수 있다. 이용되는 벡터계 및 숙주에따라, 얼마든지 적절한 전사 요소 및 번역 요소(항시성 프로모터(constitutive promoter) 및 유도성 프로모터(inducible promoter) 포함)이 이용될 수 있다.
포유동물 숙주 세포에 있어서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 일반적으로 이용 가능하다. 예를들어, 아데노바이러스가 발현 벡터로서 이용될 경우, 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 후기 프로모터(late promoter) 및 3자 리더 서열(tripartite leader)로 구성되는 아데노바이러스 전사/번역 복합체 내에 연결될 수 있다. 바이러스 게놈(genome)의 비필수 E1 또는 E3 영역으로의 삽입을 이용하여, 감염된 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 생존 바이러스를 얻을 수 있다. (Logan 및 Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.81: 3655~3659(1984)). 또한 포유동물 숙주 세포의 발현 증대를 위하여 전사 인핸서(예를들어 Rous Sarcoma Virus(RSV) 인핸서)가 이용될 수 있다.
숙주 세포는, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 또는 원하는 방식으로 발현된 단백질을 처리(프로세싱)하는 그 능력에 따라 선택될 수 있다. 폴리펩타이드의 그러한 변경으로서는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함한다. 단백질의 'prepro' 형태를 절단하는 번역 후 프로세싱(post-translational processing)은, 정확한 삽입, 접힘 및/또는 기능을 촉진시키기 위해 이용될 수 있다. 다른 숙주 세포(예를 들면 CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 W138, 이들은 그러한 번역-후 활성에 대한 특정 세포 기구(machinery) 및 특징적 매커니즘(mechanisms)을 가진다)는 외래 단백질의 정확한 변경(modification) 및 가공(processing)을 보장하기 위해 선택될 수 있다.
장기적으로, 펩타이드의 고수율의 생산을 위해서는, 안정적인 발현이 일반적으로 바람직하다. 예를 들어, 목적하는 폴리뉴클레오타이드를 안정적으로 발현하는 세포주는 발현 벡터를 이용하여 형질전환 될 수 있으며, 상기 발현 벡터는 바이러스복제 기점 및/또는 내인성 발현 요소(엘리먼트), 및 동일한 벡터 또는 별개의 벡터 상에서 선택마커 유전자를 포함할 수 있다.
상기 벡터의 도입 후, 세포는 증식배지(enriched media)에서 1~2일간 증식될 수 있으며, 그 후에 선택 배지(selective media)로 변환된다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것이며, 그리고 이의 존재는 도입된 배열이 성공적으로 발현되고 있는 세포의 성장 및 회수를 허용한다. 안정적으로 형질 전환된 세포의 내성 클론은 그 세포형(cell type)에 적절한 조직배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다.
본 발명은 또한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩타이드가 인플루엔자 A H5N1 바이러스와 결합을 형성하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 링크는 본 발명의 펩타이드와 검출가능한 표지 사이에 직접 형성되는 것도 가능하지만, 링크를 통해서도 형성 가능하다. 상기 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용 가능하며, 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션에 적용될 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지될 수 있다.
상기 표지는 구체적으로 예를 들면, 발색효소에 해당하는 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)); 방사성 동위원소에 해당하는 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S; 크로모포어(chromophore); 발광물질 또는 형광물질에 해당하는 FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.
상기 검출 가능한 표지를 포함하는 펩타이드는 각각의 표지에 대하여 종래 공지된 검출 방법을 이용하여 검출하는 것이 가능하다. 구체적으로 예를 들어 형광 신호 FITC를 표지로 이용하는 경우, 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation: 495 nm, Emission: 520 nm)에서 각 펩타이드 농도에 대한 형광세기를 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출 키트는 서열목록 1 내지 6의 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드는 앞서 기재한 바와 같이 화학적 또는 유전공학적 방법에 의해 수득된 것일 수 있다. 상기 펩타이드에 관해서는 본 발명의 다른 일 양태들에 대한 설명을 위해 상술한 바와 동일하다. 본 발명의 키트에는 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃ 유지된 상태로 제공될 수 있다.
본 발명의 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출 키트는 기존 PCR 방법에 비하여 빠르고 편리하게 현장에서 진단이 가능하고, 인플루엔자 A H5N1 바이러스를 포함하는 인플루엔자 형광 검출 키트 형태로 제공될 수 있다. 종래 공지된 다른 프로브들에 대하여 본 발명의 펩타이드를 연결하여 인플루엔자에 대한 민감도를 증가시킬 수 있고, 인플루엔자만을 특이적으로 검출이 가능하며, 형광현미경을 통하여 인플루엔자 이미지화하여 검출할 수 있는 시스템의 형태로 제공될 수 있다.
인플루엔자 A H5N1 검출을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 검출 키트에 포함되는 펩타이드는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명인 인플루엔자 A H5N1 검출 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 검출 대상에 포함된 인플루엔자 A H5N1 바이러스와의 결합여부 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 진단은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 본 발명의 진단을 실시할 수 있다. 예를 들어, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay)는 ELONA(enzyme-linked oligonucleotide assay)로 조금 변형하여 실시된다.
또한 본 발명의 펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 대상 시료를 접종하여 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 대상 시료에 포함된 인플루엔자 A H5N1 바이러스와 펩타이드의 결합을 관찰함으로써 인플루엔자 A H5N1 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명의 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 또한 용기는 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다.
본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출 방법을 제공한다:
(a) 제1항의 따른 펩타이드와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 펩타이드와 검출 대상 시료에 포함된 인플루엔자 A H5N1 바이러스의 결합 여부를 확인하는 단계.
본 발명의 "검출 대상 시료"는 인플루엔자 A H5N1 바이러스가 존재할 가능성이 있으며, 그 존재 여부를 확인할 필요가 있는 대상 시료를 의미한다. 구체적으로 예를 들면, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 단계(b)에서의 결합 여부 확인은 본 발명의 다른 양태인 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 조성물에 관하여 상술한 내용을 참조할 수 있고, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 독감 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 독감은 인플루엔자 A H5N1 바이러스 감염에 의한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 진단용 조성물에는 본 발명의 상기 펩타이드 외에 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출에 사용될 수 있는 기타 부성분들이 포함될 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바가 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명이 제공하는 펩타이드는 인플루엔자 A H5N1 바이러스와 매우 높은 특이도 및 친화도로 결합하므로, 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 조성물, 검출 키트 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있으며, 인플루엔자 A H5N1 바이러스 감염이 의심되는 환자로부터 제공된 시료에서 인플루엔자 A H5N1 바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명에 사용된 펩타이드의 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA에 대한 고특이적 결합을 효소면역측정법을 활용하여 확인한 실험 결과이다.
도 2는 본 발명에 사용된 펩타이드의 농도에 따른 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA에 대한 결합력을 효소면역측정법으로 실험한 결과이다.
도 3은 본 발명에 사용된 펩타이드의 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA의 농도 변화에 대한 결합력을 효소면역측정법으로 실험한 결과이다.
도 4는 본 발명에 사용된 펩타이드의 특이도를 확인하기 위해 A/H1N1/Beijing/22808/2009/HA, A/H5N1/Anhui/1/2005/HA와 타겟 단백질인 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA에 대한 결합력을 효소면역측정법으로 비교한 결과이다.
도 5는 본 발명에 사용된 합성된 펩타이드의 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA에 대한 고특이적 결합을 전기화학적측정법을 활용하여 확인한 실험 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: M13 박테리오파지 디스플레이를 이용한 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA 단백질에 고특이적, 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 발굴
본 발명에서 사용된 타깃 단백질은 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA 로, Sino biological사로부터 구입해 사용하였으며 Thermo scientific사의 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit을 사용하여 biotinylation 과정을 거친 후 BCA assay에 의해 농도를 계산하고, 사용 전까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
본 발명에서 사용된 박테리오파지 랜덤 펩타이드 라이브러리 (Phage display peptide library)는 Ph.D.-12 (New England BioLab)로, 이는 M13 박테리오파지의 게놈 중에서 코트 단백질 (coat protein)의 일종인 pIII를 생산하는 유전자 말단에 12개의 무작위 아미노산 서열의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균 (E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 박테리오파지로 구성되어 있다.
총 4회의 패닝 (panning)을 수행하였으며, 패닝에는 스트렙트아비딘(streptavidin)이 도포되어 있는 평판 (Streptavidin High Binding Capacity Coated 96-Well Plates (Thermo scientific, Cat. No. 15501)을 사용하였다.
먼저, 스트렙트아비딘이 도포된 평판을 PBS (인산염 완충 식염수)로 3회, 5분 동안 씻어준 후, 바이오틴이 달린 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA 단백질 0.5 μM을 100 μL 용량으로 넣고 1시간 동안 상온에서 고정하였다. 이후 0.1 mM biotin으로 목적 단백질이 결합하지 않고 남은 스트렙트아비딘 부분을 블로킹(blocking)해주고, 12-mer 펩타이드가 달린 M13 박테리오파지 1×1011 PFU/mL을 100 μL 첨가하여 1시간 동안 상온에서 목적 단백질과 반응시켜주었다. 이 과정 후 결합력이 없는 박테리오파지는 200 μL의 PBS (인산염 완충 식염수) 중의 0.1% Tween-20으로 10번 반복하여 씻어주었으며, 최종적으로 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA에 특이적으로 결합하는 파지는 100 μL의 0.2M Glycin-HCl (pH 2.2) 용액에 용출되었고, pH의 중화(neutralization)를 위해 15 uL의 Tris-HCl (pH 9.0)이 첨가되었다. 상기의 과정으로 총 4회 반복실험을 통하여 A/H5N1/Hubei/1/2011/HA에 결합하는 박테리오파지들은 DNA sequencing을 통해 아미노산 서열을 확인하였고, 그 중 반복적으로 결합하는 3개의 박테리오파지 후보군을 1차적으로 선별하였다(표 1)
Figure 112020100834002-pat00001
실시예 2: 효소면역측정법 (ELISA)을 이용한 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA에 고특이적, 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 프로브를 포함하고 있는 박테리오파지 후보군의 결합력 측정
4회 박테리오파지 디스플레이를 거쳐서 선별된 3개의 박테리오파지 후보군을 ELISA 실험에 이용하기 위해 각 파지의 증폭을 진행하였다. 파지 스톡 (stock)을 미리 배양해둔 E.coli ER2738과 함께 20 mL LB 배지에 넣은 후 37℃, 190rpm에서 4-5시간 동안 배양하였다. 배양된 박테리오파지 후보군은 12,000g 속도로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 회수한 후 20% PEG/2.5 M NaCl을 상층액 용량의 6분의 1 (3.3 mL) 첨가하여 4℃ 냉장고에서 24시간 방치하였다. 이를 12,000g 속도로 15분 동안 다시 원심분리하여 얻어진 침전물은 1 mL PBS (인산염 완충 식염수)에 녹인 후 다시 14,000rpm에 5분 동안 원심분리하고 상층액을 새로운 1.5 mL-micro tube에 옮긴 후 상층액 용량의 6분의 1 (약 166.7 μL) 20 % PEG/2.5 M NaCl를 첨가한 후 1시간 동안 얼음에 방치한다. 그 후 다시 14,000rpm 속도로 10분 동안 원심분리하여 얻어진 침전물은 200 μL PBS (인산염 완충 식염수)에 녹인 후 파지 Titration을 실시하여 파지의 농도 (PFU/mL: Plaque forming units/mL)를 계산하였다.
선별된 파지와 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA의 결합력을 비교하기 위하여 다음과 같이 ELISA를 진행하였다. 먼저 biotinylated A/H5N1/Hubei/1/2011/NA와 biotinylated BSA (Bovine serum albumin) 100 μL (농도: 0.25 μM)을 스트렙트아비딘이 코팅되어있는 평판에 상온에 1시간 동안 고정하고 5% BSA로 블로킹을 해주었다. 그 후 PBS (Phosphate buffered saline) 중의 0.1% Tween-20로 6번 씻어주고 100 μL의 파지 후보군들 (농도: 1×1011 PFU/mL)을 단백질들이 고정된 평판에 넣고 상온에 150 rpm으로 교반하며 1시간 동안 결합하도록 반응하였다. 단백질과 파지의 반응 후 PBS (인산염 완충 식염수) 중의 0.1% Tween-20로 6번 씻어주고 anti M13-HRP 항체 : 5% BSA in NaHCO3를 1 : 5000으로 희석한 용색을 200 μL 넣고 상온에서 1시간 동안 교반해주었다. 이 과정 후에도 PBS (Phosphate buffered saline) 중의 0.1% Tween-20로 6번 씻어준 후, ABTS를 이용한 발색 과정을 통해 405nm에서 흡광도(OD)값을 측정하였다.
그 결과 Hubei R3#13과 Hubei R3#43 파지가 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA에 특이적으로 결합하고 BSA에는 상대적으로 결합력이 낮게 나타나는 것으로 관찰되었다(도 1).
상기와 동일한 ELISA 방법으로 같은 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA 단백질(농도: 0.5 μM)을 고정한 평판에 Hubei R3#13과 Hubei R3#43를 파지 농도별(1×1011 ~ 1×1012 PFU/mL)로 처리하여 그 결합력을 비교하였다. 그 결과 2종류 모두 파지의 농도 증가에 비례하여 결합력이 증가함을 관찰하였고, Hubei R3#43 파지가 Hubei R3#13 파지보다 타겟에 높은 결합력을 나타내었다(도 2).
상기와 동일한 ELISA 방법으로 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA 농도 (62 ~ 1000 nM) 변화에 따른 Hubei R3#43의 결합력을 측정 비교한 결과, Hubei R3#43의 결합력은 타겟 단백질의 농도 증가에 비례하여 결합력이 증가함을 확인하였다(도 3).
상기와 동일한 ELISA 방법으로 타겟 단백질에 대한 Hubei R3#43의 특이도를 확인하기 위해 A/H1N1/Beijing/22808/2009/HA, A/H5N1/Anhui/1/2005/HA와 타겟 단백질인 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA에 대한 결합력을 비교하였다. 그 결과, Hubei R3#43는 다른 단백질에 비해 상대적으로 타겟 단백질에 대한 결합력이 높았다 (도4)
이 결과들은 선택된 파지 Hubei R3#43가 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA에 특이적으로 잘 결합함을 보여주는 것이며, Hubei R3#43가 가지고 있는 12개의 펩타이드 서열 ‘MPLRYPTQVTLD’이 펩타이드 유래 인플루엔자바이러스 감염 조기 진단키트 등에 이용될 수 있음을 보여준다.
실시예 3: M13 박테리오파지 디스플레이를 통해 발굴된 아미노산 서열 기반 펩타이드 합성
3회 박테리오파지 디스플레이를 거쳐서 발굴된 아미노산 서열 Hubei R3#43(MPLRYPTQVTLD)를 바탕으로 총 6개의 펩타이드 합성을 Peptron사에 의뢰하여 제작하였다(표 2). 합성 후 정제 및 동결 건조된 펩타이드를 PBS(인산염 완충 식염수)에 고농도로 희석한 후 소분하여 사용 전까지 -20℃냉동고에 보관하였다.
Figure 112020100834002-pat00002
실시예 5: 펩타이드 기반 분자결합자의 타깃단백질에 대한 전기화학적 분석법(SWV)을 이용한 결합력 측정
CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국)장비를 사용하여 분자결합자의 타깃 단백질에 대한 결합능을 측정하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 스트렙트아비딘이 도포된 탄소칩(Streptavidin modified screen-printed carbon electrode, Metrohm, 스위스)을 사용하였다.
SWV(Square Wave Voltammetry, 사각파형(구형파) 전압전류법)는 전해질에 산화/환원 반응이 가능한 화학정이 존재하는 상태에서 작업 전극에 빠른 속도로 전압을 주사하면 이에 따른 전류의 값에 의해서 전극표면 근처에서 일어나는 물질의 전기화학 반응의 열역학 및 속도론적인 파라미터를 구하는 분석방법이다.
먼저 3차 증류수로 씻어주고 질소가스를 흘려준 후 15 μL 바이오틴이 달린 펩타이드 후보군들(INA BP1 ~ BP5, 농도: 100 μg/mL)을 상온에서 1시간 동안 탄소칩과 반응하도록 하였다. 반응 후에 3차 증류수로 6회 씻어 준 뒤 다시 질소가스를 흘려주고 전해용액(
Figure 112020100834002-pat00003
+
Figure 112020100834002-pat00004
in
Figure 112020100834002-pat00005
)에 넣어 SPCE칩의 상대전극(Counter Electrode), 기준전극(Reference Electrode), 작업전극(Working Electrode)를 이용하여 SWV를 측정하였다. 그 다음 15 μL의 목적단백질인 A/H5N1/Hubei/1/2011/NA(농도: 0.25 μM = 15.75 μg/mL)와 비특이적으로 결합하는 BSA(농도: 0.25 μM = 16.25 μg/mL)를 INA 펩타이드가 고정화된 탄소칩과 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 전해용액을 넣고 펩타이드와의 결합능을 SWV로 측정하였다.
이에 대한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는A/H5N1/Hubei/1/2011/NA에 대한 각각의 INA BP1~BP5펩타이드 결합능을 전기화학적 신호변화로 측정한 것이며 SWV에서 얻은 전류값을 계산(ΔI(%) = (I a -I b )/I a ×100)하였다.
본 발명이 제공하는 펩타이드는 인플루엔자 A H5N1 바이러스와 매우 높은 특이도 및 친화도로 결합하므로, 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 조성물, 검출 키트 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있으며, 인플루엔자 A H5N1 바이러스 감염이 의심되는 환자로부터 제공된 시료에서 인플루엔자 A H5N1 바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Peptide specifically binding to H5N1 subtype of influenza A virus and uses thereof <130> NP20-0065 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hubei R3#7 <400> 1 Asp Gly Ser Met Leu Asn Arg Met Arg Gly Phe Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hubei R3#13 <400> 2 Lys Val Val Gly Ser Gly Tyr Val Gly His Arg Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hubei R3#43 (INA BP1) <400> 3 Met Pro Leu Arg Tyr Pro Thr Gln Val Thr Leu Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INA BP3 <400> 4 Glu Pro Glu Arg Tyr Pro Thr Gln Val Thr Glu Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INA BP4 <400> 5 Cys Gly Met Pro Leu Arg Tyr Pro Thr Gln Val Thr Leu Asp Gly Cys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INA BP5 <400> 6 Cys Gly Met Pro Leu Arg Tyr Pro Thr Gln Val Thr Leu Asp Gly Cys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser 20

Claims (11)

  1. 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진, 인플루엔자 A H5N1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 인플루엔자 A H5N1 바이러스의 뉴라민 분해효소(neuraminidase)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제1항의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  5. 제4항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  6. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출용 키트.
  9. 다음 단계를 포함하는 인플루엔자 A H5N1 바이러스 검출 방법:
    (a) 제1항의 따른 펩타이드와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 펩타이드와 검출 대상 시료에 포함된 인플루엔자 A H5N1 바이러스의 결합 여부를 확인하는 단계.
  10. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 독감 진단용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 독감은 인플루엔자 A H5N1 바이러스 감염에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
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CN110684079A (zh) * 2019-10-22 2020-01-14 华东理工大学 一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及应用

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