CN108486219A - 一种检测离体血清样本是否感染乙型脑炎病毒的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测离体血清样本是否感染乙型脑炎病毒的试剂盒。该试剂盒包括由EIII蛋白和Nano荧光素酶组成的融合蛋白、Nano荧光素酶底物、protein A/G偶联物和未感染乙型脑炎病毒的离体血清样本。实验证明，采用本发明提供的试剂盒可以检测离体血清样本是否感染乙型脑炎病毒，且特异性达到100％，与其它病毒感染血清无交叉反应；灵敏性也达到了100％。本发明具有重大的应用价值。

Description

一种检测离体血清样本是否感染乙型脑炎病毒的试剂盒
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种检测离体血清样本是否感染乙型脑炎病毒的试剂盒。
背景技术
乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科，黄病毒属，是经由蚊虫叮咬传播的一种病毒，可引起脑炎和脑膜炎，并可造成严重的神经系统后遗症。我国曾是乙型脑炎的高发区，自从上世纪80年代乙型脑炎疫苗大规模接种后，乙脑发病率显著下降。JEV感染的诊断主要依靠血清学和病原核酸检测。血清学方法不仅是病毒感染检测的有效手段，而且还可用于JEV感染的流行病学调查、疫苗接种的免疫效果评价。
目前检测JEV的血清学方法，常用的方法是ELISA，即通过采用体外重组表达的包膜糖蛋白(envelope protein，E蛋白)作为检测抗原实现对血清中特异性抗体的检测。E蛋白含有乙型脑炎病毒的多个关键抗原表位和中和抗原表位，由EI、EII和EIII 3个结构域组成。全长E蛋白作为检测抗原易与黄病毒属其它成员(如登革病毒、寨卡病毒等)产生交叉反应，而EIII结构域的蛋白(简称EIII蛋白)的特异性高，与同属其它病毒成员的感染血清不易产生交叉反应，是更为理想的JEV感染血清的特异性诊断抗原。但EIII蛋白分子量小，抗原表位也较少，因此检测灵敏度较低，尤其用于检测抗体效价较低的血清，容易存在漏检的情况。因此，用EIII蛋白作为JEV感染血清的诊断抗原，亟需建立比ELISA更为灵敏的检测方法，从而获得灵敏、特异、准确的检测结果。
基于荧光素酶的免疫捕获系统(Luciferase immuno capture，Luc-IC)通过将检测抗原与荧光素酶重组表达，与待测样本孵育后，通过检测荧光素酶的强度确定待测样本中的抗体含量，具有快速、灵敏的特点和优势。Luc-IC检测系统的优势在于利用哺乳动物细胞表达抗原，真核细胞表达的蛋白在空间构象、结构、功能方面与天然蛋白更接近，检测特异性高，且不需要蛋白的提取和纯化，方法简便；并且检测的时间更短，方法简便，易于操作。
发明内容
本发明的目的为提供一种检测离体血清样本是否感染乙型脑炎病毒的试剂盒，可包括由EIII蛋白和Nano荧光素酶组成的融合蛋白。
上述试剂盒中，所述EIII蛋白可为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
上述试剂盒中，所述Nano荧光素酶可为b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列5自N端起第1-200位所示的蛋白质；
b2)在序列表中序列5自N端起第1-200位所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
b3)将序列表中序列5自N端起第1-200位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
上述试剂盒中，所述融合蛋白可为c1)或c2)或c3)：
c1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；
c2)在序列表中序列5所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c3)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
其中，序列表中序列3由112个氨基酸残基组成，序列表中序列5由329个氨基酸残基组成。
为了a1)或b1)或c1)中的蛋白质便于纯化，可在相应蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述a3)或b3)或c3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a3)或b3)或c3)中的蛋白质，均可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′末端和/或3′末端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述b3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列6自5′末端第1-600位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′末端和/或3′末端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述c3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列6所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′末端和/或3′末端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述试剂盒还可包括Nano荧光素酶底物和/或protein A/G偶联物和/或未感染乙型脑炎病毒的离体血清样本。
所述试剂盒还可包括记载有如下判断标准的载体：采用荧光素酶免疫捕获法检测离体血清样本的荧光素酶强度值；采用荧光素酶免疫捕获法检测未感染乙型脑炎病毒的离体血清样本的荧光素酶强度值，重复3次以上，计算cut off值；cut off值＝未感染乙型脑炎病毒的离体血清样本的荧光素酶强度值的平均值+3×标准差；如果离体血清样本的荧光素酶强度值大于cut off值，则离体血清样本感染了乙型脑炎病毒；如果离体血清样本的荧光素酶强度值为cut off值以下，则离体血清样本未感染乙型脑炎病毒。所述荧光素酶免疫捕获法的操作步骤如下：将血清样本、上述任一所述融合蛋白和protein A/G偶联物混合，孵育；收集沉淀；加入Nano荧光素酶底物，检测荧光素酶强度值。
上述任一所述融合蛋白也属于本发明的保护范围。
编码所述融合蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
上述任一所述融合蛋白的制备方法可包括如下步骤：
(1)将编码所述融合蛋白的核酸分子导入真核细胞，得到重组细胞；
(2)培养所述重组细胞20-100h(20-60h、60-80h、80-100h、24h、48h、72h或96h)，得到所述融合蛋白。
所述制备方法中，所述真核细胞可为cos7细胞。所述培养可为37℃、5％CO2培养。
上述任一所述编码融合蛋白的核酸分子可为如下d1)或d2)或d3)所示的DNA分子：
d1)序列表中序列6所示的DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述融合蛋白的DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述融合蛋白的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子可为编码所述融合蛋白的基因及其调控序列形成的核酸分子。
序列表中序列6由987个核苷酸组成，序列表中序列6所示的核苷酸序列编码序列表中序列5所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的融合蛋白的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码融合蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码融合蛋白的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。
本发明还保护e1)或e2)或e3)或e4)：
e1)上述任一所述融合蛋白在制备检测乙型脑炎病毒的试剂盒中的应用；
e2)上述任一所述融合蛋白在检测乙型脑炎病毒中的应用；
e3)上述任一所述编码融合蛋白的核酸分子在制备检测乙型脑炎病毒的试剂盒中的应用；
e4)上述任一所述编码融合蛋白的核酸分子在检测乙型脑炎病毒中的应用。
本发明还保护一种检测离体血清样本是否感染乙型脑炎病毒的方法，可包括如下步骤(S)和(T)：
所述步骤(S)包括如下步骤：
(S-1)将离体血清样本、上述任一所述融合蛋白和protein A/G偶联物混合，孵育；
(S-2)完成步骤(S-1)后，收集沉淀；
(S-3)完成步骤(S-2)后，加入Nano荧光素酶底物，检测荧光素酶强度值；
所述步骤(T)包括如下步骤：
(T-1)将未感染乙型脑炎病毒的离体血清样本、上述任一所述融合蛋白和proteinA/G偶联物混合，孵育；
(T-2)完成步骤(T-1)后，收集沉淀；
(T-3)完成步骤(T-2)后，加入Nano荧光素酶底物，检测荧光素酶强度值；
(T-4)重复步骤(T-1)至(T-3)3次以上，然后计算cut off值；
cut off值＝未感染乙型脑炎病毒的离体血清样本的荧光素酶强度值的平均值+3×标准差；
如果离体血清样本的荧光素酶强度值大于cut off值，则离体血清样本感染乙型脑炎病毒；如果离体血清样本的荧光素酶强度值为cut off值以下，则离体血清样本未感染乙型脑炎病毒。
上述方法中，所述“将离体血清样本、融合蛋白和protein A/G偶联物混合，孵育”还可为先将离体血清样本和融合蛋白混合，孵育；然后再加入protein A/G偶联物，混合，再次孵育。
上述方法中，所述“将未感染乙型脑炎病毒的离体血清样本、融合蛋白和proteinA/G偶联物混合，孵育”还可为先将未感染乙型脑炎病毒的离体血清样本和融合蛋白混合，孵育；然后再加入protein A/G偶联物，混合，再次孵育。
上述任一所述protein A/G偶联物可为protein A/G磁珠或protein A/G凝胶珠。
实验证明，采用本发明提供的试剂盒可以检测待测血清样本是否感染乙型脑炎病毒，且特异性达到100％，与其它病毒感染血清无交叉反应；灵敏性也达到了100％。本发明具有重大的应用价值。
附图说明
图1为检测融合蛋白的荧光素酶强度。
图2为采用不同孵育方式的荧光素酶免疫捕获法检测乙脑血清。
图3为采用protein A/G磁珠或protein A/G凝胶珠进行荧光素酶免疫捕获法检测乙脑血清。
图4为55个待测血清样本的荧光素酶免疫捕获法检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
cos7细胞为美国菌种保藏中心(ATCC)的产品，产品目录号为CRL-1651。pNLF-sec质粒和Nano荧光素酶底物均为promega公司的产品，货号分别为N1371和N1110。protein A/G磁珠为Millipore公司产品，货号为16-663。protein A/G凝胶珠为SANTA CRUZ公司的产品，货号为sc2003。DMEM细胞培养基和opti-MEM均为GIBCO公司的产品。Lipofectamine3000为Invitrogen公司的产品。
实施例1、融合蛋白Nano-EIII-opti的制备
一、编码EIII蛋白的基因的优化
选取JEV的EIII蛋白(以下简称EIII蛋白)作为JEV感染血清学检测的诊断抗原。EIII蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示。JEV中，编码EIII蛋白的基因(EIII基因)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
为了使EIII基因的核苷酸序列更适于真核细胞中表达，本发明的发明人经过大量实验，优化了EIII基因的核苷酸序列，优化后的EIII基因(以下简称EIII-opti基因)的核苷酸序列如序列表中序列2所示。EIII-opti基因编码的EIII-opti蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示(与EIII蛋白的氨基酸序列完全一致)。
二、重组质粒的构建
1、重组质粒pNLF-JEV-EIII的构建
向pNLF-sec质粒的限制性内切酶XbaI和NotI之间插入序列表中序列1所示的DNA双链分子，得到重组质粒pNLF-JEV-EIII。
重组质粒pNLF-JEV-EIII中，编码Nano荧光素酶的基因(pNLF-sec质粒自带)和序列表中序列1所示的DNA双链分子融合，形成序列表中序列4所示的融合基因Nano-EIII，表达序列表中序列5所示的融合蛋白Nano-EIII。
2、重组质粒pNLF-JEV-EIII-opti的构建
向pNLF-sec质粒的限制性内切酶XbaI和NotI之间插入序列表中序列2所示的DNA双链分子，得到重组质粒pNLF-JEV-EIII-opti。
重组质粒pNLF-JEV-EIII-opti中，编码Nano荧光素酶的基因(pNLF-sec质粒自带)和序列表中序列2所示的DNA双链分子融合，形成序列表中序列6所示的融合基因Nano-EIII-opti，表达融合蛋白Nano-EIII-opti。融合蛋白Nano-EIII-opti的氨基酸序列如序列表中序列5所示(与融合蛋白Nano-EIII的氨基酸序列完全一致)。
序列表中序列5自N端起，第1-200位为Nano荧光素酶的氨基酸序列，第218-329位为EIII蛋白或EIII-opti蛋白的氨基酸序列，第201-217位为连接肽的序列。
序列表中序列5所示的融合蛋白为EIII-opti蛋白(或EIII蛋白)和Nano荧光素酶的重组表达，每个融合表达的蛋白分子含有一个EIII-opti蛋白(或EIII蛋白)和一个Nano荧光素酶蛋白，因此通过测定荧光素酶的活性即可反应融合蛋白的表达量，酶活性强即融合蛋白表达量高。
三、融合蛋白Nano-EIII-opti的制备及荧光素酶强度的检测
1、将cos7细胞以105个/孔接种于24孔细胞培养板中，每孔1mL DMEM细胞培养基，37℃、5％CO2培养，观察细胞状态，在细胞生长密度达到70％-80％时即可进行转染实验。
2、取2μL Lipofectamine3000，加入25μL opti-MEM，混合均匀，得到溶液1。
3、取0.5μg重组质粒pNLF-JEV-EIII-opti，加入25μL opti-MEM，混合均匀，得到溶液2。
4、将溶液1和溶液2混合均匀，室温静止5min，得到转染复合物。
5、取完成步骤1的所述24孔细胞培养板，加入步骤4得到的转染复合物，37℃、5％CO2培养96h。培养期间，分别于加入转染复合物培养的第24h(即转染第24h)、第48h(即转染第48h)、第72h(即转染第72h)和第96h(即转染第96h)，检测细胞培养上清的荧光素酶强度。
检测细胞培养上清的荧光素酶强度的步骤具体为：取EP管，加入50μL从孔中取出的细胞培养上清和50μL Nano荧光素酶底物，混合均匀；然后将所述EP管置于化学发光检测仪(GLOMAX 20/20 LUMINOMETERER)中，设置检测持续时间为10s，记录其荧光素酶强度值并进行如下操作：若荧光素酶强度值低于106，则细胞在原培养液中继续培养；若荧光素酶强度值为106以上，则取出孔中的细胞培养液，置-70℃冰箱中保存待用，并在孔中加入新鲜的DMEM细胞培养基，继续培养，次日继续检测荧光素酶强度值，直至荧光素酶强度值不再增高为止。
按照上述步骤，将步骤3中的重组质粒pNLF-JEV-EIII-opti替换为重组质粒pNLF-JEV-EIII，其它步骤均不变。
按照上述步骤，将步骤3和步骤4替换为“将溶液1和25μL opti-MEM混合均匀，室温静止5min，得到转染复合物”，其它步骤均不变，作为对照。
部分实验结果见图1和表2。结果表明，转染24h，细胞培养上清中的荧光素酶强度已达到107(已可以用于血清检测)；转染48h，细胞培养上清中的荧光素酶强度达到最大；转染96h后，细胞培养上清中的荧光素酶强度降至107以下。比较转染重组质粒pNLF-JEV-EIII和重组质粒pNLF-JEV-EIII-opti的细胞的荧光素酶强度，结果表明，转染重组质粒pNLF-JEV-EIII-opti的细胞的荧光素酶强度显著提高。
收集重组质粒pNLF-JEV-EIII-opti转染第24h、转染第48h、转染第72h或转染第96h的细胞培养上清(即含有融合蛋白Nano-EIII-opti的溶液)，-70℃保存待用。
收集重组质粒pNLF-JEV-EIII转染第24h、转染第48h、转染第72h或转染第96h的细胞培养上清(即含有融合蛋白Nano-EIII的溶液)，-70℃保存待用。
表2
实施例2、荧光素酶免疫捕获法检测乙脑血清条件的优化
缓冲液A：含20mM Tris、150mM NaCl、5mM MgCl2和1％(v/v)Triton X-100的水溶液。
抗原使用液：取实施例1收集的重组质粒pNLF-JEV-EIII-opti转染第48h的细胞培养上清(即含有融合蛋白Nano-EIII-opti的溶液)，加入缓冲液A稀释荧光素酶强度至1×107luc/50μL。
一、采用不同孵育方式检测乙脑血清
检测样本使用液：由1体积份检测样本和50体积份缓冲液A混匀得到。检测样本分别为3份临床确诊的JEV感染的阳性人血清(依次命名为阳性样本1、阳性样本2和阳性样本3)和1份健康人血清(命名为阴性样本)。
1、分开孵育
(1)取EP管，加入50μL抗原使用液和50μL检测样本使用液，混合，置于37℃温箱中震荡孵育30min。
(2)完成步骤(1)后，取所述EP管，加入5μL protein A/G磁珠，置于37℃温箱中继续震荡孵育30min，3000rpm离心1min。
(3)完成步骤(2)后，取所述EP管，弃上清，获得磁珠沉淀。
(4)完成步骤(3)后，取所述EP管，先用缓冲液A洗涤磁珠沉淀3次，再用pH7.2、10mM的PBS缓冲液洗涤凝胶珠沉淀2次。
(5)完成步骤(4)后，取所述EP管，加入50μL Nano荧光素酶底物，混合均匀；然后将所述EP管置于化学发光检测仪(GLOMAX 20/20LUMINOMETERER)中，设置检测持续时间为10s，记录各个检测样本的荧光素酶强度值。
2、同时孵育
(1)取EP管，加入50μL抗原使用液、50μL检测样本使用液和5μL protein A/G磁珠，混合，置于37℃温箱中震荡孵育30min，3000rpm离心1min。
(2)完成步骤(1)后，取所述EP管，弃上清，获得磁珠沉淀。
(3)完成步骤(2)后，取所述EP管，先用缓冲液A洗涤磁珠沉淀3次，再用pH7.2、10mM的PBS缓冲液洗涤磁珠沉淀2次。
(4)完成步骤(3)后，取所述EP管，加入50μL Nano荧光素酶底物，混合均匀；然后将所述EP管置于化学发光检测仪(GLOMAX 20/20 LUMINOMETERER)中，设置检测持续时间为10s，记录各个检测样本的荧光素酶强度值。
部分实验结果见表3和图2。结果表明，两种孵育方式获得了基本相似的检测结果，由于同时孵育操作简便且时间短，因此，后续的实验中均采用将抗原、抗体和凝胶珠同时孵育进行检测的方法。
表3.采用不同孵育方式检测荧光素酶强度
二、protein A/G凝胶珠和protein A/G磁珠在Luc-IC检测中的效果
检测样本使用液：由1体积份检测样本和50体积份缓冲液A混匀得到。检测样本分别为1份临床确诊的JEV感染的阳性人血清(命名为JEV阳性血清)和1份健康人血清(即临床确诊的JEV感染的阴性人血清，命名为JEV阴性血清)。
1、protein A/G凝胶珠在Luc-IC检测中的效果
实验重复两次取平均值，每次重复的步骤如下：
(1)取EP管，加入50μL抗原使用液、50μL检测样本使用液和5μL protein A/G凝胶珠，混合，置于37℃温箱中震荡孵育30min，3000rpm离心1min。
(2)完成步骤(1)后，取所述EP管，弃上清，获得凝胶珠沉淀。
(3)完成步骤(2)后，取所述EP管，先用缓冲液A洗涤凝胶珠沉淀3次，再用pH7.2、10mM的PBS缓冲液洗涤凝胶珠沉淀2次。
(4)完成步骤(3)后，取所述EP管，加入50μL Nano荧光素酶底物，混合均匀；然后将所述EP管置于化学发光检测仪(GLOMAX 20/20 LUMINOMETERER)中，设置检测持续时间为10s，记录各个检测样本的荧光素酶强度值。
2、protein A/G磁珠在LIPS检测中的效果
实验重复两次取平均值，每次重复的步骤如下：
(1)取EP管，加入50μL抗原使用液、50μL检测样本使用液和5μL protein A/G磁珠，混合，置于37℃温箱中震荡孵育30min。
(2)完成步骤(1)后，取所述EP管，用磁力架将磁珠吸附至EP管底部，弃上清，获得磁珠沉淀。
(3)完成步骤(2)后，取所述EP管，先用缓冲液A洗涤磁珠沉淀3次(每次用200μL缓冲液A洗涤，然后磁力架吸附)，再用pH7.2、10mM的PBS缓冲液洗涤磁珠沉淀2次。
(4)完成步骤(3)后，取所述EP管，加入50μL Nano荧光素酶底物，混合均匀；然后将所述EP管置于化学发光检测仪(GLOMAX 20/20 LUMINOMETERER)中，设置检测持续时间为10s，记录各个检测样本的荧光素酶强度值。
实验结果见表4和图3。结果表明，采用protein A/G凝胶珠和protein A/G磁珠进行检测均获得了预期的检测结果，JEV阳性血清的荧光素酶强度显著高于JEV阴性血清。protein A/G凝胶珠检测JEV阳性血清的荧光素酶强度高于磁珠组，但用ProteinA/G-磁珠检测JEV阴性血清的背景值更低(仅为protein A/G凝胶珠的1/20)，且ProteinA/G-磁珠的P/N值更高，结果更易于判断。因此，与protein A/G凝胶珠相比，protein A/G磁珠更适于进行Luc-IC检测。
表4.比较磁珠和凝胶珠的检测效果
实施例3、荧光素酶免疫捕获法检测乙型脑炎临床血清样本的特异性和灵敏性
缓冲液A：含20mM Tris、150mM NaCl、5mM MgCl2和1％(v/v)Triton X-100的水溶液。
待测血清样本使用液：由1体积份待测血清样本和50体积份缓冲液A混匀得到。待测血清样本分别为20个JEV阳性血清样本(包括10个临床确诊的JEV感染的病人血清样本和10个接种过JEV疫苗的健康人血清样本)、10个健康人血清样本、10个临床确诊的蜱传脑炎病毒感染的病人血清样本(TBEV血清样本)、2个WNV兔血清样本(WNV血清样本)、10个临床确诊的登革病毒感染的病人血清样本(登革血清样本)和3个临床确诊的茲卡病毒感染的病人血清样本(ZIKV血清样本)。
抗原使用液：取实施例1收集的重组质粒pNLF-JEV-EIII-opti转染第48h的细胞培养上清(即含有融合蛋白Nano-EIII-opti的溶液)，加入缓冲液A稀释至荧光素酶的强度为1×107luc/50μL。
1、取EP管，加入50μL抗原使用液、50μL待测血清样本使用液和5μL protein A/G磁珠，混合，置于37℃温箱中震荡孵育30min。
2、完成步骤1后，取所述EP管，用磁力架将磁珠吸附至EP管底部，弃上清，获得磁珠沉淀。
3、完成步骤2后，取所述EP管，先用缓冲液A洗涤磁珠沉淀3次(每次用200μL缓冲液A洗涤，然后磁力架吸附)，再用pH7.2、10mM的PBS缓冲液洗涤磁珠沉淀2次。
4、完成步骤3后，取所述EP管，加入50μL Nano荧光素酶底物，混合均匀；然后将所述EP管置于化学发光检测仪(GLOMAX 20/20 LUMINOMETERER)中，设置检测持续时间为10s，记录各个待测血清样本的荧光素酶强度值，然后进行如下判断：以健康人血清样本的荧光素酶强度值的平均值加上三倍的标准差作为cut off值，如果待测血清样本的荧光素酶强度值大于cut off值，则待测血清样本为阳性；如果待测血清样本的荧光素酶强度值在cutoff值以下，则待测血清样本为阴性。
部分实验结果见表5和图4(JEV为JEV阳性血清样本，健康人为健康人血清样本，TBEV为TBEV血清样本，WNV为WNV血清样本，登革为登革血清样本，ZIKV为ZIKV血清样本)。结果表明，cut off值为152.86，20个JEV阳性血清样本均为阳性，10个健康人血清样本、10个TBEV血清样本、2个WNV血清样本、10个登革血清样本和3个ZIKV血清样本均为阴性。由此可见，荧光素酶免疫捕获法检测乙型脑炎临床血清样本的特异性达到100％，与其它病毒感染血清无交叉反应；灵敏性也可达100％。
表5.待测样本的荧光素酶强度(luc)
实施例4、不同方法检测乙型脑炎临床血清样本的效果
待测血清样本同实施例3，共计55个血清样本。
一、通过荧光素酶免疫捕获法检测
实验步骤同实施例3。
实验结果如下(见表6中第1行)：20个JEV阳性血清样本均鉴定为阳性，10个TBEV血清样本、10个健康人血清样本、10个登革血清样本、3个ZIKV血清样本和2个WNV血清样本均鉴定为阴性。结果表明，通过荧光素酶免疫捕获法检测乙型脑炎临床血清样本具有较高的特异性和灵敏性。
表6
P/P.N. P/N.N.
荧光素酶免疫捕获法 20/20 0/35
ELISA 16/20 0/35
免疫荧光法 20/20 8/35
注：P/P.N.指真阳性样本中检测到阳性的数量，
P/P.N.指真阴性样本中检测到的阳性样本数量。
二、EIII-ELISA
以EIII蛋白作为检测抗原，采用ELISA分别检测待测血清样本是否感染乙型脑炎病毒(实验方法具体参考如下文献：郑旸，康晓平，李裕昌，吴晓燕，张晓松，杨银辉，乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白的表达纯化及在Array-ELISA方法中的应用，中华微生物学和免疫学杂志，2013，33，954-959)。
实验结果如下(见表6中第2行)：20个JEV阳性血清样本中4个鉴定为阴性、16个鉴定为阳性，10个TBEV血清样本、10个健康人血清样本、10个登革血清样本、3个ZIKV血清样本和2个WNV血清样本均鉴定为阴性。结果表明，EIII-ELISA具有较高的特异性，但灵敏性低。
黄病毒各个成员之间，蛋白序列具有一定的同源性，因此与不同病毒抗体容易出现交叉反应，EIII蛋白仅有112个氨基酸，与全病毒抗原相比，含有较少的抗原表位，因而可结合的抗体谱也比较狭窄，对于抗体滴度较低的血清样本，易出现弱阳性甚至阴性结果。因此，以EIII蛋白作为检测抗原，必须提高技术本身的灵敏性才能获得可靠的结果。
三、免疫荧光法
采用JEV的全病毒培养物作为检测抗原，分别检测待测血清样本是否感染乙型脑炎病毒(实验方法具体参考如下文献：郑旸，康晓平，李裕昌，吴晓燕，张晓松，杨银辉，乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白的表达纯化及在Array-ELISA方法中的应用，中华微生物学和免疫学杂志，2013，33，954-959)。
实验结果如下(见表6中第3行)：20个JEV阳性血清样本均鉴定为阳性，10个TBEV血清样本和10个健康人血清样本均鉴定为阴性，10个登革血清样本中4个鉴定为阴性、6个鉴定为阳性，3个ZIKV血清样本中2个鉴定为阴性、1个鉴定为阳性，2个WNV血清样本中1个鉴定为阴性、1个鉴定为阳性。结果表明，采用JEV的全病毒培养物作为检测抗原，尽管可涵盖广泛的抗体谱并产生较高的灵敏性(达100％)，但易与同属其它病毒抗体产生交叉反应，特异性仅达到77％。
结果表明，本发明提供的方法具有高特异性和灵敏性，具有较好的临床应用前景。
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<120> 一种检测离体血清样本是否感染乙型脑炎病毒的试剂盒
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
atggacaaac tggctctgaa aggcacaacc tatggcatgt gtacagaaaa attctcgttc 60
gcgaaaaatc cggtggacac tggtcacgga acagttgtca ttgaactctc ctactctggg 120
agtgatggcc cctgcaaaat tccgattgtt tccgttgcga gcctcaatga catgaccccc 180
gttgggcggc tggtgacagt gaaccccttc gtcgcgactt ccagtgccaa ctcaaaggtg 240
ctggtcgaga tggaaccccc cttcggagac tcctacatcg tagttggaag gggagacaag 300
cagatcaacc accattggca caaagctgga agcacg 336
<210> 2
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
atggacaagc tggccctgaa gggcaccacc tacggcatgt gcaccgagaa gttcagcttc 60
gccaagaacc ccgtggacac cggccacggc accgtggtga tcgagctgag ctacagcggc 120
agcgacggcc cctgcaagat ccccatcgtg agcgtggcca gcctgaacga catgaccccc 180
gtgggccgcc tggtgaccgt gaaccccttc gtggccacca gcagcgccaa cagcaaggtg 240
ctggtggaga tggagccccc cttcggcgac agctacatcg tggtgggccg cggcgacaag 300
cagatcaacc accactggca caaggccggc agcacc 336
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu
1 5 10 15
Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Val Asp Thr Gly His Gly Thr Val
20 25 30
Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro
35 40 45
Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu
50 55 60
Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val
65 70 75 80
Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly
85 90 95
Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr
　　　　　 100 105 110
<210> 4
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg cctgctcctg 60
gtgttgcctg ctgccttccc tgccccagtc ttcacactcg aagatttcgt tggggactgg 120
cgacagacag ccggctacaa cctggaccaa gtccttgaac agggaggtgt gtccagtttg 180
tttcagaatc tcggggtgtc cgtaactccg atccaaagga ttgtcctgag cggtgaaaat 240
gggctgaaga tcgacatcca tgtcatcatc ccgtatgaag gtctgagcgg cgaccaaatg 300
ggccagatcg aaaaaatttt taaggtggtg taccctgtgg atgatcatca ctttaaggtg 360
atcctgcact atggcacact ggtaatcgac ggggttacgc cgaacatgat cgactatttc 420
ggacggccgt atgaaggcat cgccgtgttc gacggcaaaa agatcactgt aacagggacc 480
ctgtggaacg gcaacaaaat tatcgacgag cgcctgatca accccgacgg ctccctgctg 540
ttccgagtaa ccatcaacgg agtgaccggc tggcggctgt gcgaacgcat tctggcgggc 600
tcgagcggcg cgatcgcttc cgaattcaga gctcaaccgc ggatatctag aatggacaaa 660
ctggctctga aaggcacaac ctatggcatg tgtacagaaa aattctcgtt cgcgaaaaat 720
ccggtggaca ctggtcacgg aacagttgtc attgaactct cctactctgg gagtgatggc 780
ccctgcaaaa ttccgattgt ttccgttgcg agcctcaatg acatgacccc cgttgggcgg 840
ctggtgacag tgaacccctt cgtcgcgact tccagtgcca actcaaaggt gctggtcgag 900
atggaacccc ccttcggaga ctcctacatc gtagttggaa ggggagacaa gcagatcaac 960
caccattggc acaaagctgg aagcacg 987
<210> 5
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Phe Thr
20 25 30
Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu
35 40 45
Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu
50 55 60
Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn
65 70 75 80
Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser
85 90 95
Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro
100 105 110
Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val
115 120 125
Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr
130 135 140
Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp
165 170 175
Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg
180 185 190
Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala Gly Ser Ser Gly Ala Ile Ala Ser Glu
195 200 205
Phe Arg Ala Gln Pro Arg Ile Ser Arg Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys
210 215 220
Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn
225 230 235 240
Pro Val Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser
245 250 255
Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu
260 265 270
Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val
275 280 285
Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro
290 295 300
Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn
305 310 315 320
His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr
325
<210> 6
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg cctgctcctg 60
gtgttgcctg ctgccttccc tgccccagtc ttcacactcg aagatttcgt tggggactgg 120
cgacagacag ccggctacaa cctggaccaa gtccttgaac agggaggtgt gtccagtttg 180
tttcagaatc tcggggtgtc cgtaactccg atccaaagga ttgtcctgag cggtgaaaat 240
gggctgaaga tcgacatcca tgtcatcatc ccgtatgaag gtctgagcgg cgaccaaatg 300
ggccagatcg aaaaaatttt taaggtggtg taccctgtgg atgatcatca ctttaaggtg 360
atcctgcact atggcacact ggtaatcgac ggggttacgc cgaacatgat cgactatttc 420
ggacggccgt atgaaggcat cgccgtgttc gacggcaaaa agatcactgt aacagggacc 480
ctgtggaacg gcaacaaaat tatcgacgag cgcctgatca accccgacgg ctccctgctg 540
ttccgagtaa ccatcaacgg agtgaccggc tggcggctgt gcgaacgcat tctggcgggc 600
tcgagcggcg cgatcgcttc cgaattcaga gctcaaccgc ggatatctag aatggacaag 660
ctggccctga agggcaccac ctacggcatg tgcaccgaga agttcagctt cgccaagaac 720
cccgtggaca ccggccacgg caccgtggtg atcgagctga gctacagcgg cagcgacggc 780
ccctgcaaga tccccatcgt gagcgtggcc agcctgaacg acatgacccc cgtgggccgc 840
ctggtgaccg tgaacccctt cgtggccacc agcagcgcca acagcaaggt gctggtggag 900
atggagcccc ccttcggcga cagctacatc gtggtgggcc gcggcgacaa gcagatcaac 960
caccactggc acaaggccgg cagcacc 987

Claims (10)

1.一种检测离体血清样本是否感染乙型脑炎病毒的试剂盒，包括由EIII蛋白和Nano荧光素酶组成的融合蛋白。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述EIII蛋白为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
所述Nano荧光素酶为b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列5自N端起第1-200位所示的蛋白质；
b2)在序列表中序列5自N端起第1-200位所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
b3)将序列表中序列5自N端起第1-200位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述融合蛋白为c1)或c2)或c3)：
c1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；
c2)在序列表中序列5所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c3)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
4.如权利要求1至3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Nano荧光素酶底物和/或protein A/G偶联物和/或未感染乙型脑炎病毒的离体血清样本。
5.权利要求1至4中任一所述融合蛋白。
6.编码权利要求5所述融合蛋白的核酸分子。
7.如权利要求1至4任一所述的试剂盒或权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的制备方法包括如下步骤：
(1)将编码所述融合蛋白的核酸分子导入真核细胞，得到重组细胞；
(2)培养所述重组细胞20-100h，得到所述融合蛋白。
8.如权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的试剂盒或权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于：所述编码融合蛋白的核酸分子为如下d1)或d2)或d3)所示的DNA分子：
d1)序列表中序列6所示的DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述融合蛋白的DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述融合蛋白的DNA分子。
9.e1)或e2)或e3)或e4)：
e1)权利要求5、7或8任一所述融合蛋白在制备检测乙型脑炎病毒的试剂盒中的应用；
e2)权利要求5、7或8任一所述融合蛋白在检测乙型脑炎病毒中的应用；
e3)权利要求6或8所述编码融合蛋白的核酸分子在制备检测乙型脑炎病毒的试剂盒中的应用；
e4)权利要求6或8所述编码融合蛋白的核酸分子在检测乙型脑炎病毒中的应用。
10.一种检测离体血清样本是否感染乙型脑炎病毒的方法，包括如下步骤(S)和(T)：
所述步骤(S)包括如下步骤：
(S-1)将离体血清样本、权利要求5、7或8任一所述融合蛋白和protein A/G偶联物混合，孵育；
(S-2)完成步骤(S-1)后，收集沉淀；
(S-3)完成步骤(S-2)后，加入Nano荧光素酶底物，检测荧光素酶强度值；
所述步骤(T)包括如下步骤：
(T-1)将未感染乙型脑炎病毒的离体血清样本、权利要求5、7或8任一所述融合蛋白和protein A/G偶联物混合，孵育；
(T-2)完成步骤(T-1)后，收集沉淀；
(T-3)完成步骤(T-2)后，加入Nano荧光素酶底物，检测荧光素酶强度值；
(T-4)重复步骤(T-1)至(T-3)3次以上，然后计算cut off值；
cut off值＝未感染乙型脑炎病毒的离体血清样本的荧光素酶强度值的平均值+3×标准差；
如果离体血清样本的荧光素酶强度值大于cut off值，则离体血清样本感染乙型脑炎病毒；如果离体血清样本的荧光素酶强度值为cut off值以下，则离体血清样本未感染乙型脑炎病毒。
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