KR102334576B1

KR102334576B1 - 융합 단백질 및 이를 포함하는 바이오 이미징용 조성물

Info

Publication number: KR102334576B1
Application number: KR1020190098365A
Authority: KR
Inventors: 이창수; 김종원; 이경관
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2021-12-07
Also published as: KR20210019319A

Abstract

본 발명은 표적에 결합 가능한 결합부와 캐리어 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질은 조골세포 및 수산화인회석 중 적어도 어느 하나에 결합 가능한 결합부; 및 캐리어 단백질;을 포함한다. 본 발명에 따른 융합 단백질을 이용하면 골 이미징이 가능한 효과를 나타낼 수 있다.

Description

융합 단백질 및 이를 포함하는 바이오 이미징용 조성물{Fusion protein and bio-imaging composition comprising the same}

본 발명은 표적에 결합 가능한 결합부와 캐리어 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

골은 신체를 구성하는 단단한 장기로, 다양한 장기를 보호하고 신체 구조를 형성하며 지지하는 중요한 역할을 한다. 골은 골을 형성하는 조골세포(Osteoblast)와 골을 분해하는 파골세포(Osteoclast)의 활성화 정도가 균형을 이루어 일정한 골 밀도를 유지하고 있다. 각각의 세포의 활성화 균형이 깨지면 골 밀도가 증가하거나 감소하여 골경화증이나 골다공증 등의 관련 질환을 유발하게 된다. 따라서 골 관련 질환 진단 및 치료제 개발에 있어서 조골세포 및 골을 이루고 있는 무기물인 수산화인회석(Hydroapatite)은 중요한 표적 물질이다.

체내에서 골 관련 질환을 진단하거나 치료하기 위해서는 화학 물질 또는 의약품을 이용하여 조골세포의 활성을 유도하거나 파골세포의 활성을 저해하는 방법이 대표적으로 이용되고 있다. 하지만 이러한 화학 물질들은 표적 특이성이 부여되지 않아 골 외의 장기 및 세포에서 예기치 못한 현상을 발생시킬 수 있다. 따라서 골 질환 관련 표적에 선택적으로 전달할 수 있는 매개체 물질의 개발이 매우 필요한 실정이다.

체내에서 표적에 선택적으로 전달할 수 있는 매개체로 무기물, 리포좀 (liposome), 고분자, 단백질 등 다양한 종류의 나노 입자가 개발되고 있다. 화학적으로 합성되는 나노입자는 대개 생체 적합성이 낮고 세포독성을 보여 체내 응용에 치명적인 단점이 있다. 또한 표적 특이성을 부여하기 위해 추가적인 과정을 거쳐 위와 같은 나노입자에 리간드를 부착해야 한다. 반면 단백질로 구성된 나노입자는 유전자적 변형을 통해 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드 혹은 단백질의 일부분과 융합하여 복잡한 변형 과정 없이 쉽게 생산할 수 있는 장점이 있다. 따라서 유전자적 변형을 통해 골 관련 질환 마커에 선택적으로 결합할 수 있는 기능을 가지는 새로운 전달 매개체의 개발이 가능하다.

위와 같은 배경 하에, 본 발명은 조골세포 및/또는 수산화인회석에 선택적으로 결합하는 새로운 융합 단백질을 제공하고자 한다.

또한, 위와 같은 융합 단백질의 조골세포 및/또는 수산회인회석에 대한 선택적 결합에 의한 바이오 이미징용 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다.

위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조골세포 및 수산화인회석 중 적어도 어느 하나에 결합 가능한 결합부; 및 캐리어 단백질;을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함하는 바이오 이미징용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 PCR로 증폭하는 단계;를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 융합 단백질은 조골세포 및/또는 수산화인회석에 선택적으로 결합하는 특이성을 가지므로 골 이미징에 사용되어 이미징 효율을 더욱 높일 수 있다.

또한, 위와 같은 특이적인 결합으로 인해 종래 골 이미징에 이용되던 화학 물질들의 비특이적인 결합에 의해 야기되는 문제를 최소화할 수 있는 장점이 있다. 뿐만 아니라, 이러한 특징을 기반으로, 골과 연관된 다양한 질환의 진단 또는 치료에 이용될 수 있는 전달체를 개발하는데 활용될 수도 있다.

도 1은 (a) 페리틴 단백질의 소단위체 구조, (b) 페리틴 단백질의 전체 구조, 및 (c) 조골세포 또는 수산화인회석 결합 가능한 페리틴 융합 단백질 제조를 위한 벡터 구성의 개략도이다.
도 2는 조골세포 결합 가능한 융합 단백질 1(Ob-Fn) 및 수산화인회석 결합 가능한 융합 단백질 2(HA-Fn)의 전기영동결과의 사진이다.
도 3은 (a) 융합 단백질 1(Ob-Fn)의 TEM 이미지, (b) DLS 측정 결과, (c) 네이티브 겔 전기영동결과 사진이다.
도 4는 융합 단백질 1(Ob-Fn)과 야생형 페리틴 단백질(WT-Fn)의 (a) HeLa에 대한 결합능을 확인한 결과, (b) 미분화 조골세포에 대한 결합능 확인 결과 및 (c) 21일 분화 후 조골세포에 대한 결합능 확인 결과 사진이다.
도 5는 융합 단백질 2(HA-Fn) 및 야생형 페리틴 단백질(WT)의 수산화인회석에 대한 결합능을 평가한 결과 그래프이다.

이하, 본 발명을 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

융합 단백질

본 발명의 융합 단백질은 결합부와 캐리어를 포함한다.

상기 결합부는 조골세포 및 수산화인회석 중 적어도 어느 하나에 결합이 가능하다. 구체적으로는 상기 결합부는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열을 적어도 하나 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 결합부는 캐리어 단백질과 결합의 정확도 및 결합의 안정성의 개선의 측면에서 서열번호 3 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 적어도 하나 포함할 수 있다.

서열번호 1	SDSSD
서열번호 2	DDDDDD
서열번호 3	C SDSSD HHHHHH GSSGSSGSSGSS
서열번호 4	C DDDDDD HHHHHH GSSGSSGSSGSS

상기 캐리어는 생체 조직 또는 생체 물질에 결합 가능한 결합부를 생체 내로 운반하는 역할을 한다. 상기 캐리어는 금속 나노 입자, 아미노산으로만 구성되는 단백질과 같은 고분자가 아닌 고분자, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 폴리알릴아민, 폴리아크릴아미드 등의 고분자 또는 단백질 등일 수 있으나, 특히 단백질일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예들에서는 상기 캐리어 단백질의 대표적인 예로 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 페리틴(Ferritin) 단백질을 이용하여 본 발명의 융합 단백질을 구성하였고, 그 효과를 확인하였다.

특히, 상기 페리틴 단백질은 인간을 포함한 대부분의 생물체에서 보편적으로 생산되는 세포 내 단백질이다. 페리틴은 내부가 비어있는 구형의 구조를 가지고 있어 이 공간을 이용하여 체내에서 철 이온의 농도를 조절하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 인간 유래의 페리틴 단백질은 낮은 면역원성이라는 특성과 10 내지 15 nm 크기, 예를 들어 12 nm 크기의 구형의 단백질이라는 특성은, 상기 결합부를 체내로 전달하기 위한 매개체로 응용되기에 적합하다.

또한, 상기 페리틴 단백질은 동일한 24개의 소단위체가 자기조립(self-assembly)에 의해 하나의 구조체를 형성하므로, 상기 페리틴 단백질이 캐리어 단백질로 이용된 융합 단백질 역시 복수 개의 소단위체들이 하나의 구조체를 형성할 수 있게 된다. 이렇게 복수 개의 융합 단백질들이 형성한 하나의 구조체에는 결합부 역시 복수 개가 노출된 상태로 존재할 수 있게 되므로 조골세포나 수산화인회석에 대한 결합력을 더욱 배가시킬 수 있는 장점이 있다. 또한 상기 페리틴 단백질을 이용하면, 본 발명의 융합 단백질을 대장균에서 대량생산할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 제조되는 융합 단백질이 우수한 구조적 안정성 및 pH 안정성을 달성할 수 있게 되므로, 상기 페리틴 단백질은 본 발명의 융합 단백질을 구성하는 캐리어 단백질로서 매우 적합하다.

한편, 상기 결합부와 캐리어를 포함하는 융합 단백질은 서열번호 6 또는 7로 표시되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

서열번호 5	TTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES
서열번호 6	C SDSSD HHHHHH GSSGSSGSSGSS TTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES
서열번호 7	C DDDDDD HHHHHH GSSGSSGSSGSS TTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES

상기 융합 단백질은 형광 단백질 및 형광 염료 중 적어도 하나를 더 포함하여 형광 표지화될 수 있다.

상기 형광 단백질은 물리적 조건 변화, 화학적 처리에 의해 빛을 발생하는 물질을 의미한다. 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP), 황색 형광 단백질(Yellow fluorescent protein, YFP), 적색 형광 단백질(Red fluorescent protein, RFP) 등과 같은 형광 단백질(fluorescent protein) 또는 발광 단백질(Photoprotein) 또는 루시퍼라제(Luciferase)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에서 사용되는 형광 물질은 모두 포함될 수 있다.

상기 형광 염료는 예를 들어 방사선의 방출(방사능)에 의해 또는 상호작용에 의해 본질적으로 검출 가능한 표지가 될 수 있는 물질이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 시아민 등일 수도 있으며, 일 측면에서 유기형광염료인 Atto 488, Alexa Flour 488, Dy505, Rhodamine 123, Atto 520, Dy 530, ATTO 532, Alexa Fluor 532, Fluorescein, FITC, Cy2, Cy3B, Alexa Flour 568, TAMRA, Cy3, Cy3.5, SNAP-Cell TMR-Star, Atto 565, Atto 590, Alexa Fluor 647, Cy5, Atto 647, Atto 647N, Dyomics 654, Atto 655, TMP-ATTO 655, Atto 680, Cy5.5, Atto 680, Alexa Fluor 680, Atto 700, Alexa Fluor 700, DyLight 750, Cy7, Alexa Flour 750, Atto 740, Alexa Flour 790 또는 IRDye 800 CW로부터 선택될 수도 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 형광 단백질 및 형광 염료 중 적어도 하나는 상기 캐리어 단백질, 구체적으로 페리틴 단백질의 C-말단, N-말단 또는 C-말단 및 N-말단에 결합될 수 있다. 일 실시예에서, 페리틴 단백질의 소단위체 구조의 N-말단에 시스테인(Cys)을 이용하여 형광 표지한 벡터를 이용하여 융합 단백질을 제조하였다.

상기 융합 단백질의 크기는 특별히 제한되는 것은 아니나 바이오 이미징에 사용하기 위해 이동성 및 이미징의 정확성 개선의 측면에서 그 평균 크기가 450 내지 600 kDa, 예를 들어 562 내지 567 kDa의 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예들 및 실험예들에서는, 조골세포 및 수산화인회석에 특이적인 결합을 하는 서열번호 1, 2의 펩타이드를 페리틴 단백질에 융합하여 조골세포 및 수산화인회석에 특이적인 결합이 가능한 융합 단백질을 제조하였고, 상기 융합 단백질에 형광 염료를 부착하여 각각의 융합 단백질의 표적에 대한 특이적인 결합을 확인하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 융합 단백질은 조골세포 및/또는 수산화인회석에 대한 선택적 및 특이적 결합을 형성할 수 있음을 확인하였다.

융합 단백질의 제조 방법

상기 융합 단백질의 제조 방법은 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 PCR로 증폭하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 발명자들은 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터의 증폭 시 서열번호 8 또는 9 중 적어도 하나의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 이용하여 수행함으로써 PCR의 효율성을 개선할 수 있음을 확인하였다.

서열번호 8	ACGTGCCATATG TGT TCTGATTCATCTGAT CATCACCATCAC
서열번호 9	ACGTGCCATATG TGT GATGACGATGACGATGAT CATCACCATCAC
서열번호 10	TCGTATCTCGAG TTAGCTTTCATTATCACTGTCTCCCAG

본 발명의 융합 단백질은 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 재조합 벡터에 도입한 후에, 재조합 벡터를 이용하여 단백질을 수득하는 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 재조합 벡터를 미생물에 도입하여 재조합 미생물을 수득한 후, 재조합 미생물을 배양하여 융합 단백질을 발현시킨 후에 발현된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.

상기 미생물의 배양에 있어서, 배지 성분, 배양 온도 및 배양 시간 등의 조건은 적절히 조절될 수 있으며, 구체적으로 배양 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분 등과 같은 미생물의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 포함할 수 있다. 또한 배지의 pH를 적절히 조정할 수 있고, 항생제 등의 성분을 포함할 수 있다. 또한, 유도제(inducer)를 처리하여　단백질의 발현을 유도할 수 있으며, 처리되는 유도제의 종류는　벡터　시스템에 따라 결정될 수 있으며, 유도제 투여 시간 및 투여량 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.

바이오 이미징용 조성물

상기 바이오 이미징용 조성물은 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함한다.

상기 융합 단백질은 조골세포 및 수산화인회석 중 적어도 어느 하나에 선택적 또는 특이적으로 결합할 수 있어서, 이를 포함하는 조성물을 대상체의 생체 내로 투여하면 생체 내에 조골세포 및/또는 수산화인회석이 존재하는 조직, 기관 등에 상기 융합 단백질이 결합하게 된다. 특히, 상기 조골세포 및 수산화인회석은 골 내, 골 표면, 골 주변에 존재하므로 상기 융합 단백질을 포함하는 조성물은 골 이미징에 사용할 수 있다.

상기 바이오 이미징용 조성물은 상기 융합 단백질 외에 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함하여 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 예를 들어 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 바이오 이미징용 조성물은 대상체에 경구 또는 비경구적으로 투여될 수 있으며 그 투여 방식에 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 경구 투여를 위해 상기 바이오 이미징용 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등으로 제제화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 비경구 투여는 정맥내 주입, 근육 내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수막강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두개내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 바이오 이미징용 조성물이 투여되는 '대상체'는 인간을 포함한 동물일 수 있으며, 특히 생체 구조 내에 골을 갖는 동물인 것이 바람직하나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 도면, 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 조골세포 또는 수산화인회석 결합 융합 단백질 제조를 위한 벡터 제작

도 1에는 (a) 페리틴 단백질의 소단위체 구조, (b) 페리틴 단백질의 전체 구조, 및 (c) 조골세포 또는 수산화인회석 결합 가능한 페리틴 융합 단백질 제조를 위한 벡터 구성의 개략도가 도시되어 있다.

먼저, 페리틴 단백질의 소단위체 구조에 있어서 N-말단 위치에 형광 염료를 부착하기 위한 시스테인(Cys), 조골세포 또는 수산화인회석에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 융합 단백질의 정제를 위한 His-tag과 구조적 및 기능적 안정성을 위한 링커를 순차적으로 삽입하여 융합하였다.

이후, N-말단 위치에 His-tag과 링커가 순차적으로 삽입되어 있는 인간 유래의 페리틴 유전자를 주형으로 하여 각각 서열번호 8 또는 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 유전자를 증폭하였다. 증폭하여 수득된 유전자를 제한효소 Nde 1, Xho 1을 이용하여 pET-21a 벡터에 클로닝한 후 조골세포 또는 수산화인회석 결합 페리틴 단백질을 코딩하는 염기 서열을 확인하였다. 대조군으로는 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 이용하여 상기 방법과 동일하게 수행하여 조골세포 또는 수산화인회석 결합 펩타이드 서열이 없는 야생형 페리틴 단백질을 수득하였다.

확인된 조골세포 결합 융합 단백질 1(Ob-Fn)의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시하였으며, 수산화인회석 결합 융합 단백질 2(HA-Fn)의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시하였다.

실시예 2. 융합 단백질 1(Ob-Fn) 및 융합 단백질 2(HA-Fn)의 정제

상기에서 제조한 융합 단백질 1 및 2를 코딩하는 벡터를 BL21(DE3) 대장균에 도입하여 형질전환체를 수득한 후, 수득된 형질전달체를 37℃에서 O.D.값이 0.5~0.8에 도달할 때까지 배양하고, 0.5 mM IPTG(Isopropyl-b-D-thio-galactoside)를 배양액에 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다.

이후, 추가로 18℃에서 20시간 동안 배양한 후 대장균 배양액을 4,000 rpm으로 원심분리하여 대장균과 배양액을 분리하고 배양액을 제거한 후, 분리된 대장균을 세포 용해 버퍼 (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)를 이용하여 현탁한 후, 초음파파쇄기를 이용하여 대장균을 용해시켰다.

대장균 용해물을 16,000 rpm으로 원심분리하여 수용성 상층액만 얻은 후, His-tag이 달려있는 페리틴 단백질을 Ni-NTA resin을 이용하여 친화 크로마토그래피 방식으로 최종 정제하였다. 최종 정제된 페리틴 단백질을 15% SDS-PAGE 분석을 통해 단백질 소단위체의 크기를 확인하였다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 24 kDa의 조골세포 또는 수산화인회석 결합 융합 단백질의 소단위체가 발현되었음을 확인하였다.

실험예 1. 융합 단백질 1 및 융합 단백질 2의 특성 분석

먼저, 융합 단백질 1을 2% phosphotungstric acid (ph 7.5)를 이용하여 음성 염색한 후 TEM 이미지를 확인하였다. 도 3 (a)에서 확인한 결과, 융합 단백질 1은 24개의 소단위체가 자가조립되어 가운데 내부가 텅 빈 구형의 나노입자로 형성되었음을 확인하였다.

또한, DLS를 이용하여 융합 단백질 1의 실제 크기를 측정하는 실험을 수행하였다. 대조군으로 사용된 야생형 페리틴 단백질은 11 내지 12 nm의 크기를 갖는 것으로 알려져 있으며, 융합 단백질 1은 인간 유래의 페리틴 단백질의 N-말단에 추가적인 결합 펩타이드라 삽입한 것이고, 삽입된 펩타이드가 외부로 노출되어 있으므로 야생형 페리틴 단백질에 비해 크기가 더 클 것으로 예상되었으며, 실제 DLS 측정 결과 융합 단백질 1의 크기는 14 nm로서 위의 예측에 부합함을 확인하였다(도 3 (b)).

마지막으로, 융합 단백질 1과 야생형 단백질을 이용하여, SDS(sodium dodecyl sulfate)를 넣지 않은 6% 네이티브 겔을 이용하여 전기영동 실험을 통해 융합 단백질 1의 유무에 따른 단백질의 크기 및 전하를 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 소단위체 당 5개의 아미노산 서열 개수 밖에 차이나지 않아 비슷한 위치에서 염색 띠를 관찰하였다(도 3 (c)).

실시예 3. 형광 표지된 융합 단백질의 제조

버퍼(20 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7.5)에서 위 실시예 2.의 실험에서 정제한 융합 단백질 1, 2 각각과 Cy5-maleiminde를 1:30 당량의 비율로 실온에서 4시간 혼합 반응시킨 후, 반응이 끝난 후 PD-10 탈염 컬럼을 이용하여 반응하지 않은 Cy5-maleimide를 제거한 후 원심분리기를 이용하여 농축하여, 융합 단백질의 N-말단 가장 끝에 위치하는 시스테인에 Cy5 형광 염료를 표지하였다.

분광계를 이용하여 분석한 결과, 최종적으로 제조된 융합 단백질 하나에 평균 4개의 Cy5 형광 염료가 표지되었음을 확인하였다.

실험예 2. 융합 단백질 1의 조골세포 결합능 평가

위 실험예 4.에서 수득한 형광 표지된 융합 단백질 1의 조골세포에 대한 선택적인 결합을 확인하기 위해 쥐 유래 미분화 조골세포인 MC3T3-E1을 이용하여 실험을 수행하였으며 그 결과를 도 4에 도시하였다.

구체적으로, MC3T3-E1 분화를 위해 분화 유도제인 50 μg/ml ascorbic acid와 10 mM β-glycerophosphate를 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% streptomycin/penicillin이 포함된 α-MEM 배지에 첨가하여 2 내지 3일 간격으로 갈아주며 3주간 배양하였다.

융합 단백질 1을 FBS가 없는 α-MEM 배지에 10 μg/ml 농도로 1시간 반응한 한 후 DPBS 용액으로 2번 세척하였다. 4% paraformaldehyde를 이용하여 15분 동안 세포를 고정화 시키고 2번 세척한 후 DAPI(2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine)를 이용해 핵 염색을 하여 형광 현미경으로 관찰하였다.

대조군인 자궁경부암 세포 HeLa와 미분화 MC3T3-E1는 2일간 배양시킨 후 상기 방법과 동일하게 수행하였다. 그 결과, 3주간 분화시킨 MC3T3-E1 세포에서 강한 형광 신호가 검출되었고 미분화 MC3T3-E1 세포와 HeLa 세포에서는 형광 신호가 검출되지 않음을 확인하였다.

페리틴의 선택적인 결합을 추가적으로 확인하기 위한 방법으로 야생형 페리틴 단백질을 이용하여 상기 방법과 동일하게 수행하였다. 그 결과, 미분화 MC3T3-E1 세포, HeLa 세포뿐만 아니라 3주간 분화시킨 MC3T3-E1 세포에서도 형광 신호가 검출되지 않음을 확인하였다. 따라서 조골세포 결합 페리틴 나노입자가 조골세포에 선택적으로 결합하는 것을 확인하였다.

실험예 3. 융합 단백질 2의 수산화인회석 결합능 평가

위 실시예 3.에서 수득한 형광 표지된 융합 단백질 2의 수산화인회석에 대한 선택적인 결합을 확인하기 위해 200 nm 보다 작은 입자 크기를 가지는 수산화인회석을 이용하여 실험을 수행하였으며 그 결과를 도 5에 도시하였다.

각각 6.25, 12.5, 25 μg/ml의 융합 단백질 2와 2.5 mg/ml의 수산화인회석 입자를 0.05% Tween-20이 포함된 300 μl 용액에서 1시간 반응하고 2번 세척한 후, 플레이트 형광 리더기로 600 nm 여기시켜 670 nm 방출 신호를 측정하였다.

그 결과, 12.5 μg/ml의 페리틴 나노입자를 처리한 수산화인회석에서 72%의 결합율로 가장 좋은 결과를 보였다. 반면, 대조군인 야생형 페리틴 나노입자는 10%의 결합율이 관찰되었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Fusion protein and bio-imaging composition comprising the same <130> 2019-DPA-3177 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> osteablast and/or hydroxyapatite binding amino acid <400> 1 Ser Asp Ser Ser Asp 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> osteablast and/or hydroxyapatite binding amino acid <400> 2 Asp Asp Asp Asp Asp Asp 1 5 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> osteablast and/or hydroxyapatite binding amino acid <400> 3 Cys Ser Asp Ser Ser Asp His His His His His His Gly Ser Ser Gly 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser 20 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> osteablast and/or hydroxyapatite binding amino acid <400> 4 Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asp His His His His His His Gly Ser Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser 20 25 <210> 5 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ferritin protein <400> 5 Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr 20 25 30 Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu 35 40 45 Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu 50 55 60 His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile 65 70 75 80 Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly 85 90 95 Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln 100 105 110 Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His 115 120 125 Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala 130 135 140 Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala 145 150 155 160 Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly 165 170 175 Asp Ser Asp Asn Glu Ser 180 <210> 6 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> osteoblast and/or hydroxyapatite binding amino acid <400> 6 Cys Ser Asp Ser Ser Asp His His His His His His Gly Ser Ser Gly 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val 20 25 30 Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile 35 40 45 Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr 50 55 60 Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu 65 70 75 80 His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu 85 90 95 Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro 100 105 110 Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu 115 120 125 His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu 130 135 140 Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His 145 150 155 160 Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val 165 170 175 Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr 180 185 190 Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser 195 200 205 <210> 7 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> osteoblast and/or hydroxyapatite binding amino acid <400> 7 Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asp His His His His His His Gly Ser Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln 20 25 30 Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln 35 40 45 Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr 50 55 60 Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe 65 70 75 80 Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys 85 90 95 Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys 100 105 110 Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala 115 120 125 Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys 130 135 140 Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr 145 150 155 160 His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His 165 170 175 Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala 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primer <400> 11 Ala Cys Gly Thr Gly Cys Cys Ala Thr Ala Thr Gly Thr Gly Thr Cys 1 5 10 15 Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 20 25 30 Cys

Claims

조골세포 및 수산화인회석 중 적어도 어느 하나에 결합 가능한 결합부; 및 캐리어 단백질;을 포함하는 융합 단백질로서,
상기 결합부는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열을 적어도 하나 포함하며,
상기 캐리어 단백질은 페리틴(Ferritin) 단백질이며,
상기 결합부 및 상기 캐리어 단백질은 (GSS)4의 아미노산 서열을 포함하는 링커에 의해 결합된 것인, 융합 단백질.
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 적어도 하나 포함하는 것인, 융합 단백질.
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 페리틴 단백질은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
청구항 1에 있어서,
서열번호 6 또는 7로 표시되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
청구항 1에 있어서,
형광 단백질 및 형광 염료 중 적어도 하나를 더 포함하는 것인, 융합 단백질.
청구항 7에 있어서,
상기 형광 단백질 및 형광 염료 중 적어도 하나는 상기 캐리어 단백질의 C-말단, N-말단 또는 C-말단 및 N-말단에 결합된 것인, 융합 단백질.
청구항 1에 있어서,
상기 융합 단백질은 평균 크기가 450 내지 600 kDa인 것인, 융합 단백질.
청구항 1, 3, 5 내지 9 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 PCR로 증폭하는 단계;를 포함하는, 융합 단백질의 제조 방법.
청구항 10에 있어서,
상기 PCR은 서열번호 8 또는 9 중 적어도 하나의 정방향 프라이머와, 서열번호 10의 역방향 프라이머를 이용하여 수행하는 것인 융합 단백질의 제조 방법.
청구항 1, 3, 5 내지 9 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 바이오 이미징용 조성물.
청구항 12에 있어서,
상기 바이오 이미징은 골 이미징인 것인 바이오 이미징용 조성물.