WO2024004599A1 - キャリアペプチドフラグメント及びその利用 - Google Patents

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WO2024004599A1
WO2024004599A1 PCT/JP2023/021643 JP2023021643W WO2024004599A1 WO 2024004599 A1 WO2024004599 A1 WO 2024004599A1 JP 2023021643 W JP2023021643 W JP 2023021643W WO 2024004599 A1 WO2024004599 A1 WO 2024004599A1
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WO
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seq
foreign substance
construct
peptide fragment
cell
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Application number
PCT/JP2023/021643
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English (en)
French (fr)
Inventor
菜穂子 ベイリー小林
徹彦 吉田
Original Assignee
東亞合成株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing (transferring) a foreign substance from the outside of a eukaryotic cell into the inside of the cell, and a carrier peptide fragment used in the method.
  • Patent Document 1 describes a construct for introducing a foreign substance that has a carrier peptide fragment consisting of an amino acid sequence known as a nucleolar localization signal (hereinafter also referred to as "NoLS") and a foreign substance. Disclosed. Since such a construct has cell membrane permeability, the foreign substance can be effectively introduced into the target cells.
  • NoLS nucleolar localization signal
  • the present invention was created in response to such a need, and an object of the present invention is to provide a carrier peptide fragment capable of introducing a target foreign substance from the outside of a eukaryotic cell into at least the cytoplasm of the cell. do. Another object of the present disclosure is to provide a construct for introducing a foreign substance that includes such a carrier peptide fragment. Another object of the present disclosure is to provide a method for introducing a target foreign substance from the outside of a eukaryotic cell into at least the cytoplasm of the cell.
  • the method disclosed herein is a method of introducing a target foreign substance from the outside of a eukaryotic cell into at least the cytoplasm of the cell in vitro or in vivo, comprising: (1) The following amino acid sequence: KKRTLRKSNSRKKR (SEQ ID NO: 1); KKRTLRKSSNRKKR (SEQ ID NO: 2); KKRTLRKSNNRKKR (SEQ ID NO: 3); and KKRTLRKNSNRKKR (SEQ ID NO: 4); a carrier peptide fragment consisting of either; the target foreign substance bound to the N-terminus and/or C-terminus of the carrier peptide fragment; a step of preparing a foreign substance introduction construct having (2) supplying the above construct into a sample containing eukaryotic cells of interest; includes.
  • the term "foreign substance” includes inorganic compounds and organic compounds that can be bonded directly or indirectly to the N-terminus or C-terminus of the carrier peptide fragment. , which has the molecular size and chemical properties that can be introduced into eukaryotic cells.
  • a target foreign substance can be efficiently introduced into the cytoplasm from outside the eukaryotic cell (outside the cell membrane) through the cell membrane.
  • the foreign substance may be at least one organic compound selected from the group consisting of polypeptides, nucleic acids, dyes, and drugs.
  • polypeptide refers to a polymer having a structure in which a plurality of amino acids are bonded through peptide bonds. Polypeptides are not limited by the number of peptide bonds (ie, number of amino acid residues). That is, polypeptides include what is generally called a peptide, which has about 10 or more amino acid residues and less than 300 amino acid residues, and what is generally called a protein (a polymeric compound that typically has about 300 or more amino acid residues). . In this field, there is no strict distinction between polypeptides and proteins.
  • nucleic acid refers to a polymer of nucleotides, and includes DNA and RNA.
  • a “nucleic acid” is not limited by the number of bases.
  • the foreign substance may be placed on the C-terminal side of the carrier peptide fragment.
  • the eukaryotic cells into which the foreign substance introduction construct is introduced may be human or non-human mammalian cells.
  • At least eukaryotic cells are accessed from the outside (i.e., outside the cell membrane) of the eukaryotic cells.
  • the construct disclosed herein has the following amino acid sequence: KKRTLRKSNSRKKR (SEQ ID NO: 1); KKRTLRKSSNRKKR (SEQ ID NO: 2); KKRTLRKSNNRKKR (SEQ ID NO: 3); and KKRTLRKNSNRKKR (SEQ ID NO: 4); a carrier peptide fragment consisting of any one of the following, and the target foreign substance bound to the N-terminal side and/or C-terminal side of the carrier peptide fragment. Since such a construct has cell membrane permeability, a target foreign substance can be efficiently introduced into a target eukaryotic cell.
  • the foreign substance can be at least one organic compound selected from the group consisting of polypeptides, nucleic acids, dyes, and drugs.
  • the foreign substance may be placed on the C-terminal side of the carrier peptide fragment.
  • the present disclosure also provides a carrier peptide fragment that can introduce a target foreign substance from outside a eukaryotic cell into at least the cytoplasm of the cell.
  • the carrier peptide fragment disclosed herein has the following amino acid sequence: KKRTLRKSNSRKKR (SEQ ID NO: 1); KKRTLRKSSNRKKR (SEQ ID NO: 2); KKRTLRKSNNRKKR (SEQ ID NO: 3); and KKRTLRKNSNRKKR (SEQ ID NO: 4); Consists of any of the following. Since the carrier peptide fragment exhibits cell membrane permeability, foreign substances can be efficiently introduced into cells.
  • Figure 1 shows the MFI values obtained by adding the constructs (additives) shown in Examples 1 to 5 to the culture medium of NSC-34 cells, culturing them, and then analyzing the cells using a flow cytometer. This is a graph showing.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of the cytotoxicity test for Samples 1 to 3 and Reference Example.
  • Matters other than those specifically mentioned in this specification that are necessary for implementing the present technology for example, matters related to chemical synthesis of peptides, cell culture techniques, preparation of constructs containing peptides or nucleic acids as components
  • General matters can be understood as matters designed by a person skilled in the art based on conventional technology in the fields of cell engineering, physiology, medicine, pharmacy, organic chemistry, biochemistry, genetic engineering, protein engineering, molecular biology, genetics, etc.
  • the technology disclosed herein can be implemented based on the content disclosed in this specification and common technical knowledge in the field.
  • amino acids are expressed using one-letter notation based on the nomenclature for amino acids shown in the IUPAC-IUB guidelines.
  • amino acid residue includes the N-terminal amino acid and C-terminal amino acid of a peptide chain, unless otherwise specified.
  • a "synthetic peptide” refers to a peptide chain whose peptide chain does not stably exist independently in nature, but which is produced by artificial chemical synthesis or biosynthesis (i.e., production based on genetic engineering). refers to a peptide fragment produced by a peptide fragment that can stably exist in a given composition.
  • the term "peptide” used herein refers to an amino acid polymer having multiple peptide bonds, and is not limited by the number of amino acid residues.
  • amino acid residues constituting the amino acid sequences shown in this specification may be in the L-configuration or the D-configuration. That is, each amino acid residue constituting the carrier peptide fragment disclosed herein may be in the L-configuration or the D-configuration. In other words, the amino acid sequence constituting the peptide or protein may have L-form amino acid residues and D-form amino acid residues.
  • the left side always represents the N-terminal side and the right side represents the C-terminal side.
  • the carrier peptide fragment disclosed herein has the following amino acid sequence: KKRTLRKSNSRKKR (SEQ ID NO: 1); KKRTLRKSSNRKKR (SEQ ID NO: 2); KKRTLRKSNNRKKR (SEQ ID NO: 3); and KKRTLRKNSNRKKR (SEQ ID NO: 4); Consists of any of the following.
  • Carrier peptide fragments containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1-4 may be permeable to cell membranes. Therefore, such a carrier peptide fragment can impart cell membrane permeability to a construct having the carrier peptide fragment.
  • carrier peptide fragment typically has the same amino acid sequence as the above amino acid sequence, but includes modified sequences of such amino acid sequences as long as they do not impair cell membrane permeability.
  • modified sequence refers to an amino acid sequence formed by substitution, deletion, and/or addition (insertion) of one or several (typically two or three) amino acid residues ( modified amino acid sequence).
  • Such a slightly modified sequence can be easily utilized by a person skilled in the art based on the information disclosed herein, and therefore may be included in the "carrier peptide fragment” as a technical concept disclosed herein.
  • modified sequences in this specification include, for example, sequences resulting from so-called conservative amino acid replacement in which one, two, or three amino acid residues are replaced conservatively, and sequences where a predetermined amino acid Examples include sequences in which one, two, or three amino acid residues are added (inserted) or deleted.
  • conservative substitutions include sequences in which a basic amino acid residue is replaced with another basic amino acid residue (for example, mutual substitution of a lysine residue and an arginine residue), or a sequence in which a hydrophobic amino acid residue is Examples include sequences in which hydrophobic amino acid residues are substituted (for example, mutual substitution of leucine residues, isoleucine residues, and valine residues).
  • construct for introducing a foreign substance disclosed herein comprises a carrier peptide fragment disclosed herein, and an N-terminal and/or C-terminal side of the carrier peptide fragment. It has a foreign substance bound to it.
  • the construct disclosed herein can be designed by linking (linking) a desired foreign substance directly or indirectly to the N-terminus and/or C-terminus of the carrier peptide fragment. ⁇ Can be constructed.
  • the linker is not particularly limited, but may be a peptidic linker or a non-peptidic linker.
  • the amino acid sequence constituting the peptidic linker is preferably a flexible amino acid sequence that does not cause steric hindrance.
  • the peptidic linker contains, for example, one or more amino acid residues selected from glycine, alanine, serine, etc., and contains 10 or less (more preferably 1 to 5, such as 1 or 2) , 3, 4, or 5 amino acid residues).
  • ⁇ -alanine may be used as such a linker.
  • the non-peptide linker is not particularly limited, but for example, an alkyl linker, a PEG (polyethylene glycol) linker, an aminohexanoyl spacer, etc. can be used.
  • the foreign substance can be, for example, an organic compound such as a polypeptide, a nucleic acid, a dye, a drug, etc.
  • a peptide chain is designed to include the amino acid sequence constituting the polypeptide and the amino acid sequence constituting the carrier peptide fragment, and the peptide chain is biosynthesized or chemically synthesized. By doing so, a construct for introducing a foreign substance of interest can be prepared.
  • anti-tumor agents including various nucleic acids such as DNA or RNA, dyes (for example, various fluorescent dye compounds such as FAM and FITC), or drugs (for example, nucleic acid-based anti-tumor agents such as 5-fluorouracil (5FU)),
  • An organic compound that functions as an antiviral agent such as azidothymidine (AZT) is directly or indirectly bound to the N-terminal side and/or C-terminal side of the carrier peptide fragment described above by various conventionally known scientific methods.
  • the construct can be prepared by Although not particularly limited, the functions of foreign substances include, for example, promotion of differentiation induction of stem cells (stem cell differentiation inducing activity), suppression of growth of tumor cells (antitumor activity), and suppression of growth of virus-infected cells (antiviral activity). activity) etc.
  • the number of foreign substances that bind to the carrier peptide fragment is not particularly limited.
  • one or more foreign substances may be attached to one carrier peptide fragment.
  • a polypeptide, a nucleic acid, a drug, etc. may be bound to the C-terminus of one carrier peptide fragment, and a dye may be bound to the N-terminus. Binding a dye to a carrier peptide fragment is preferable because it facilitates evaluation of the efficiency of introduction of the construct into eukaryotic cells and its localization within the cell.
  • the polypeptide (amino acid sequence) to be employed is not particularly limited.
  • substances with a relatively large number of amino acid residues such as polypeptides or proteins with about 100 to 1000 amino acid residues, can also be employed as foreign substances.
  • the total number of amino acid residues constituting a synthetic peptide prepared as a construct for introducing a foreign substance is several to several tens (for example, 10) or more, and is suitably 1000 or less, preferably 1000 or less. It is 600 or less, more preferably 500 or less, and particularly preferably 300 or less (for example, 10 to 300).
  • Polypeptides of such length are easy to synthesize (biosynthesis, chemical synthesis) and easy to use.
  • Foreign substances include mature forms or precursors (pro-forms) of polypeptides that are involved in functions such as development, differentiation, proliferation, canceration, homeostasis, and metabolic regulation of various cells and tissues (organs). , including pre-pro type) are preferred.
  • the method for introducing a foreign substance disclosed herein can be carried out in order to introduce a polypeptide whose function has not been previously known into a cell and elucidate the function of the polypeptide in the cell (inside a living tissue). You can also do it.
  • the eukaryotic cells to which the foreign substance is introduced are human or other mammalian stem cells, use of mature forms or precursors thereof of polypeptides that have various physiological activities involved in inducing differentiation of the stem cells.
  • stem cells include somatic stem cells, embryonic stem cells, and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the eukaryotic cells to be introduced are bacterially or virus-infected cells
  • various polypeptides that are involved in inducing apoptosis in the infected cells or suppressing the proliferation of bacteria or viruses in the infected cells are added. It is preferable to use polypeptides that can suppress the spread of bacterial or viral infection from the infected cells.
  • the polypeptide as a foreign substance is formed by substituting, deleting, and/or adding (inserting) one or several amino acid residues as long as it retains its function. It may also contain modified amino acid sequences.
  • the ⁇ -amino group of the amino acid residue at the N-terminal side of the carrier peptide fragment is preferably acetylated.
  • the ⁇ -amino group of the N-terminal amino acid of many proteins in eukaryotic cells is modified by acetylation, so this structure increases the stability of the construct within the cell. can be improved.
  • the C-terminal amino acid residue of the construct is amidated.
  • Amidating the carboxyl group of an amino acid residue can improve the structural stability (eg, protease resistance) of such constructs in the cytoplasm and within the nucleolus.
  • the solubility of the construct in an aqueous solvent can be improved.
  • aqueous solvents include water, various buffer solutions, physiological saline (eg, PBS), and cell culture solutions.
  • the carboxyl group of the amino acid residue at the C-terminal side of the carrier peptide fragment is amidated.
  • the foreign substance is a polypeptide and such polypeptide is bonded to the C-terminal side of the carrier peptide fragment, it is preferable to amidate the carboxyl group of the C-terminal amino acid residue of the polypeptide.
  • those with relatively short peptide chains can be easily produced according to general chemical synthesis methods.
  • any of the conventionally known solid phase synthesis method or liquid phase synthesis method may be employed.
  • a solid phase synthesis method using Boc (t-butyloxycarbonyl) or Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) as a protecting group for an amino group is suitable.
  • the above-mentioned peptide chain having a desired amino acid sequence and modification can be synthesized by solid-phase synthesis using a commercially available peptide synthesizer. Note that only a portion of the peptide chain may be synthesized by the above method, for example, a peptide chain containing only a carrier peptide fragment or a carrier peptide fragment and a peptidic linker portion may be synthesized.
  • the peptide portion may be produced by biosynthesis based on genetic engineering techniques. That is, a polynucleotide (typically DNA) having a nucleotide sequence (including the ATG start codon) encoding the desired amino acid sequence is synthesized. Various regulatory elements (including a promoter, a ribosome binding site, a terminator, an enhancer, and various cis elements that control the expression level) are used to express the synthesized polynucleotide (DNA) and the amino acid sequence in host cells. ) A recombinant vector carrying an expression gene construct consisting of the following is constructed depending on the host cell.
  • This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (eg, yeast, insect cell, plant cell) by a common technique, and the host cell or a tissue or individual containing the cell is cultured under predetermined conditions.
  • a predetermined host cell eg, yeast, insect cell, plant cell
  • the desired peptide moiety can be obtained by isolating the peptide moiety from the host cell (in the medium if secreted) and performing refolding, purification, etc. as necessary.
  • the method for constructing a recombinant vector and the method for introducing the constructed recombinant vector into a host cell may be any method conventionally used in the field, and such methods themselves are particularly characteristic of the present technology. Since this is not a complete description, a detailed explanation will be omitted.
  • a fusion protein expression system can be used for efficient large-scale production within host cells. That is, a gene (DNA) encoding the amino acid sequence of a polypeptide of interest is chemically synthesized, and the synthetic gene is used in an appropriate fusion protein expression vector (for example, the pET series provided by Novagen, or the pET series provided by Amersham Biosciences).
  • the vector is introduced into a suitable site of a GST (Glutathione S-transferase) fusion protein expression vector such as the pGEX series that has been developed.
  • a host cell typically E. coli
  • the obtained transformant is cultured to prepare the desired fusion protein.
  • the protein is then extracted and purified.
  • the obtained purified fusion protein is cleaved with a predetermined enzyme (protease), and the liberated target peptide fragment (ie, the designed artificial polypeptide) is recovered by a method such as affinity chromatography.
  • a predetermined enzyme protease
  • a desired construct artificial polypeptide
  • a template DNA for a cell-free protein synthesis system i.e., a synthetic gene fragment containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the peptide portion of the construct
  • various compounds ATP, RNA, Polypeptides of interest can be synthesized in vitro using a so-called cell-free protein synthesis system (polymerase, amino acids, etc.).
  • cell-free protein synthesis systems for example, Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755 (2001), Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000) may be helpful.
  • cell-free protein synthesis kits for example, cell-free protein synthesis kits (for example, Cell Free Science Co., Ltd. in Japan) are producing polypeptides on a contract basis. available) are commercially available.
  • a single-stranded or double-stranded polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the peptide portion of the construct and/or a nucleotide sequence complementary thereto can be easily produced (synthesized) by conventionally known methods. That is, by selecting codons corresponding to each amino acid residue constituting the designed amino acid sequence, the nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence can be easily determined and provided. Once the nucleotide sequence is determined, a polynucleotide (single strand) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like.
  • the desired double-stranded DNA can be obtained by using the obtained single-stranded DNA as a template and employing various enzymatic synthesis methods (typically PCR).
  • the polynucleotide may be in the form of DNA or RNA (such as mRNA).
  • DNA can be provided in double-stranded or single-stranded form. When provided as a single strand, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) having a complementary sequence thereto.
  • the polynucleotides thus obtained can be used as materials for constructing recombinant genes (expression cassettes) for peptide production in various host cells or in cell-free protein synthesis systems, as described above. can.
  • the construct can be suitably used as an active ingredient of a composition for use based on the function of a foreign substance.
  • the construct may be in the form of a salt as long as the function of the foreign substance is not lost.
  • acid addition salts obtainable by addition reaction of commonly used inorganic or organic acids according to conventional methods can be used. Accordingly, "constructs" as described herein and in the claims may include such salt forms.
  • the construct can be used as an active ingredient in a composition that can contain various pharmaceutically acceptable carriers depending on the form of use.
  • the carrier for example, carriers commonly used as diluents, excipients, etc. in peptide medicines are preferable.
  • Such carriers may vary depending on the use and form of the construct for introducing a foreign substance, but typically include water, physiological buffers, and various organic solvents.
  • Such carriers can also be aqueous solutions of alcohol (such as ethanol) at appropriate concentrations, glycerol, non-drying oils such as olive oil, or liposomes.
  • alcohol such as ethanol
  • non-drying oils such as olive oil, or liposomes.
  • subsidiary components that may be included in the pharmaceutical composition, various fillers, extenders, binders, humectants, surfactants, pigments, fragrances, etc. can be mentioned.
  • the form of the composition is not particularly limited. Examples include forms such as solutions, suspensions, emulsions, aerosols, foams, granules, powders, tablets, capsules, and ointments. Furthermore, for use in injections, etc., it can be made into a lyophilized product or granulated product by dissolving it in physiological saline or an appropriate buffer solution (for example, PBS) to prepare a drug solution immediately before use.
  • physiological saline or an appropriate buffer solution for example, PBS
  • PBS buffer solution
  • the process itself of preparing drugs (compositions) in various forms using the construct (main component) and various carriers (auxiliary components) may be carried out in accordance with conventionally known methods, and such formulation methods themselves may be based on the present technology. A detailed explanation will be omitted since it is not a characteristic feature.
  • An example of a detailed information source regarding prescriptions is Comprehensive Medicinal Chemistry, supervised by Corwin Hansch, published by Pergamon Press (1990).
  • the present disclosure provides methods for introducing foreign substances in vivo or in vitro using the constructs disclosed herein.
  • this method includes the following steps (1) and (2): (1) A foreign substance having a carrier peptide fragment consisting of an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, and a target foreign substance bound to the N-terminal side and/or C-terminal side of the carrier peptide fragment.
  • preparing a substance introduction construct (2) supplying the above construct into a sample containing eukaryotic cells of interest.
  • the sample supplied with the construct is incubated, and the construct is introduced into the eukaryotic cells in the sample.
  • the method may include the step of introducing the construct.
  • the above-mentioned “eukaryotic cells” include, for example, various tissues, organs, organs, blood, lymph, and the like.
  • the above-mentioned “eukaryotic cells” include, for example, various cell masses, tissues, organs, organs, blood, and lymph fluid extracted from living bodies, cell lines, and the like.
  • the construct disclosed herein or a composition containing the construct can be used in vivo in a manner and at a dose depending on its form and purpose.
  • the desired amount is administered to the affected area (e.g., malignant tumor tissue, virus-infected tissue, inflamed tissue, etc.) of a patient (i.e., living body) by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, or intraperitoneal injection. be able to.
  • a solid form such as a tablet or a gel-like or aqueous jelly-like product such as an ointment may be applied directly to a desired tissue (i.e., an affected area such as a tissue or organ containing tumor cells, virus-infected cells, inflammatory cells, etc.). It can be administered to Alternatively, solid forms such as tablets can be administered orally. In the case of oral administration, it is preferable to encapsulate or apply a protective (coating) material to prevent decomposition by digestive enzymes in the gastrointestinal tract.
  • an appropriate amount of the construct may be supplied at least once to the culture medium of the eukaryotic cells of interest.
  • the amount of supply per time and the number of times of supply are not particularly limited as they may vary depending on conditions such as the type of eukaryotic cells to be cultured, cell density (cell density at the start of culture), passage number, culture conditions, type of medium, etc. .
  • the carrier peptide fragment concentration in the culture solution is approximately within the range of 0.05 ⁇ M or more and 100 ⁇ M or less, for example, 0.5 ⁇ M or more and 50 ⁇ M or less, or for example, 1 ⁇ M or more and 20 ⁇ M or less.
  • the incubation time after addition of the construct is not particularly limited as it may vary depending on the type of eukaryotic cells and various conditions.
  • the duration may be 0.5 hours or more, 1 hour or more, 4 hours or more, 8 hours or more, or 20 hours or more.
  • the incubation conditions may also vary depending on the type of eukaryotic cells, so they are not particularly limited, but for example, incubation can be performed at 37° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
  • An example of the in vitro introduction method is shown in the test example below.
  • the method for evaluating the efficiency of construct introduction is not particularly limited. For example, if a dye (typically a fluorescent dye compound) is attached to the construct, microscopy (e.g. fluorescence microscopy) or flow cytometry may be used to assess the efficiency of introduction into eukaryotic cells. can be evaluated. Furthermore, the introduction efficiency of the above-mentioned construct can also be evaluated by immunochemical techniques (eg, Western blotting, immune cell staining, etc.) using an antibody that specifically recognizes the peptide portion of the above-mentioned construct.
  • immunochemical techniques eg, Western blotting, immune cell staining, etc.
  • Item 1 A method of introducing a target foreign substance from outside a eukaryotic cell into at least the cytoplasm of the cell in vitro, comprising: (1) The following amino acid sequence: KKRTLRKSNSRKKR (SEQ ID NO: 1); KKRTLRKSSNRKKR (SEQ ID NO: 2); KKRTLRKSNNRKKR (SEQ ID NO: 3); and KKRTLRKNSNRKKR (SEQ ID NO: 4); a carrier peptide fragment consisting of either; the target foreign substance bound to the N-terminus and/or C-terminus of the carrier peptide fragment; a step of preparing a foreign substance introduction construct having (2) supplying the above construct into a sample containing eukaryotic cells of interest; How to include.
  • KKRTLRKSNSRKKR SEQ ID NO: 1
  • KKRTLRKSSNRKKR SEQ ID NO: 2
  • KKRTLRKSNNRKKR SEQ ID NO: 3
  • KKRTLRKNSNRKKR
  • Item 2 The method according to Item 1, wherein the foreign substance is at least one organic compound selected from the group consisting of polypeptides, nucleic acids, dyes, and drugs.
  • Item 3 The method according to item 1 or 2, wherein the foreign substance is located on the C-terminal side of the carrier peptide fragment.
  • Item 4 The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the eukaryotic cell into which the construct is introduced is a human or non-human mammalian cell.
  • Item 5 Amino acid sequence below: KKRTLRKSNSRKKR (SEQ ID NO: 1); KKRTLRKSSNRKKR (SEQ ID NO: 2); KKRTLRKSNNRKKR (SEQ ID NO: 3); and KKRTLRKNSNRKKR (SEQ ID NO: 4); a carrier peptide fragment consisting of either; A construct comprising the target foreign substance bound to the N-terminus and/or C-terminus of the carrier peptide fragment.
  • Item 6 The construct according to Item 5, wherein the foreign substance is at least one organic compound selected from the group consisting of polypeptides, nucleic acids, dyes, and drugs.
  • Item 7 The construct according to item 5 or 6, wherein the foreign substance is located on the C-terminal side of the carrier peptide fragment.
  • Item 8 Amino acid sequence below: KKRTLRKSNSRKKR (SEQ ID NO: 1); KKRTLRKSSNRKKR (SEQ ID NO: 2); KKRTLRKSNNRKKR (SEQ ID NO: 3); and KKRTLRKNSNRKKR (SEQ ID NO: 4); A carrier peptide fragment consisting of either
  • a construct having a synthetic peptide consisting of the amino acid sequence shown in Table 1 was prepared.
  • a construct having peptide 1 is designated as sample 1, a construct having peptide 2 as sample 2, a construct having peptide 3 as sample 3, and a construct having peptide 4 as sample 4.
  • Samples 1 to 4 were all synthesized and prepared by Eurofin Genomics Co., Ltd.
  • the ⁇ -amino groups of the amino acid residues on the N-terminal side of peptides 1 to 4 were all acetylated.
  • the fluorescent dye FAM C 21 H 12 O 7 :5(6)-Carboxyfluorescein, molecular weight 376.3, excitation wavelength 495 nm, fluorescence wavelength 520 nm
  • Samples 1 to 4 were each diluted with dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare sample solutions 1 to 4 each having a sample concentration of 2 mM.
  • NSC-34 cells were cultured in a general culture medium, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Cat No. 044-29765)) containing 10% FBS (fetal bovine serum). After washing the NSC-34 cells adhered to the culture plate with PBS, a 0.25% trypsin/EDTA solution was added and incubated at 37°C for 3 minutes. After the incubation, the above 10% FBS-containing DMEM was added to inactivate trypsin, followed by centrifugation at 150 xg for 5 minutes to precipitate the cells.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Cat No. 044-29765)
  • FBS fetal bovine serum
  • the above 10% FBS-containing DMEM was added to the precipitate (cell pellet) to prepare a cell suspension of approximately 2 ⁇ 10 5 cells/mL. 1 mL of the cell suspension was added to the wells of a commercially available 6-well plate (manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd.), and cells were seeded (approximately 2 ⁇ 10 5 cells/well). Further, the above 2mM sample solution 1 was diluted with the above 10% FBS-containing DMEM to prepare a sample solution 1 having a concentration of sample 1 of 20 ⁇ M.
  • the culture supernatant was removed from the wells, and the cells in the wells were washed twice with 1 mL of PBS.
  • 200 ⁇ L of 0.25% trypsin/EDTA solution was added to the wells and incubated at 37° C. for 3 minutes.
  • trypsin was inactivated by adding 400 ⁇ L of the above 10% FBS-containing DMEM to the wells, and then the cell suspension in the wells was transferred to a tube and the cells were collected. Thereafter, 600 ⁇ L of PBS was further added to the wells to wash the wells. Then, by transferring the PBS in the well to the tube, the cells remaining in the well were collected into the tube.
  • This tube was centrifuged at 4° C. and 210 ⁇ g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, the precipitate (cell pellet) was suspended (washed) in 1 mL of PBS, and centrifugation was performed under the same conditions as above. After repeating this operation twice, the supernatant was removed to obtain cells (cell pellets) cultured in the sample 1-containing medium.
  • the cell membrane permeability of Sample 1 was analyzed using a flow cytometer.
  • a flow cytometer On-Chip Flowcytometer (manufactured by On-Chip Biotechnologies Co., LTD.) was used.
  • the cell pellet obtained above was suspended in 100 ⁇ L of On-Chip T buffer to prepare a cell suspension for analysis.
  • Example 2 The same procedure as Example 1 was carried out except that Sample Solution 1 was replaced with Sample Solution 2 prepared above.
  • Example 3 The same procedure as Example 1 was carried out except that Sample Solution 1 was replaced with Sample Solution 3 prepared above.
  • Example 4 The same procedure as in Example 1 was carried out except that sample solution 1 was replaced with sample solution 4 prepared above.
  • Example 5 Example 1 was carried out in the same manner as in Example 1, except that sample solution 1 was a FAM solution diluted with DMSO.
  • concentration of the FAM solution was used so as to be the same as the concentration of the sample 1 solution (ie, the FAM concentration of the culture solution in the well was 10 ⁇ M, and the DMSO concentration was 0.5%).
  • FIG. 1 is a graph showing the MFI values in each example.
  • Examples 1 to 4 had higher MFI values than Example 5. That is, it can be seen that binding of at least one of peptides 1 to 4 to FAM, which is a foreign substance, imparts cell membrane permeability to the construct and introduces more FAM into the cells.
  • FAM FAM
  • the present inventor's studies have shown that constructs having any of peptides 1 to 4 are suitable for constructs containing any of peptides 1 to 4, regardless of whether the foreign substance is not only a fluorescent dye but also a polypeptide, a nucleic acid, or a drug. However, it was confirmed that such foreign substances are efficiently introduced into the cytoplasm from outside the cell.
  • sample solutions 1 to 3 were diluted with the above culture medium to prepare sample solutions 1 to 3 of 12.5 ⁇ M, 25 ⁇ M, 50 ⁇ M, and 100 ⁇ M. Furthermore, as a reference example, a construct comprising a carrier peptide fragment having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and exhibiting cell membrane permeability was prepared. The reference example had the same structure as Samples 1 to 3 except for the amino acid sequence constituting the carrier peptide fragment. Regarding the reference example, a solution containing 12.5 ⁇ M to 100 ⁇ M of the reference example (hereinafter also referred to as "solution (reference example)”) was prepared in the same manner as sample solutions 1 to 3.
  • solution reference example
  • a 0.25% trypsin/0.53 mM EDTA solution was added and incubated at 37°C for 3 to 5 minutes. After the incubation, the above culture medium was added to inactivate the trypsin, followed by centrifugation at 900 rpm for 5 minutes at room temperature to precipitate the cells. After removing the supernatant produced by centrifugation, the above culture medium was added to the precipitate (cell pellet) to prepare a cell suspension of approximately 1 ⁇ 10 5 cells/mL.
  • 100 ⁇ L of the cell suspension was added to the wells of a commercially available 96-well plate (manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd.), and cells were seeded (approximately 1 ⁇ 10 4 cells/well) at 37° C. in 5% CO 2 . Incubation was performed for 24 hours in an incubator. After the incubation, the medium in the wells was removed, and 90 ⁇ L of 12.5 ⁇ M, 25 ⁇ M, 50 ⁇ M, and 100 ⁇ M sample solutions 1 to 3 and solutions (reference examples) prepared above were added to 3 wells (i.e., in triplicate). ).
  • Cell proliferation/cytotoxicity kit Cell Counting Kit-8 (CCK-8, manufactured by Dojindo Laboratories) was added to each well. Thereafter, incubation was performed for 1.5 hours in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 , and the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader. Then, the arithmetic mean of the absorbance of three wells was calculated for each type and concentration of solution added to the culture medium. Cell viability was determined by setting the average value of the absorbance of 3 wells in which cells were cultured in the above culture medium without DMSO as 100%. The results are shown in Figure 2. The horizontal axis of the graph in FIG.
  • a target foreign substance can be introduced into the cytoplasm from the outside of eukaryotic cells (particularly various animal cells represented by humans and other mammals that do not have a cell wall). Artificially produced carrier peptide fragments and constructs having the carrier peptide fragments are provided. By using such a construct, a foreign substance of interest can be introduced into target cells more safely and effectively, and cells into which the foreign substance has been introduced as well as biological tissues such as organs containing cells containing the foreign substance can be introduced. Obtainable. Additionally, the low cytotoxicity of the carrier peptide fragment may allow the use of higher concentrations of the construct than previously possible, thereby allowing the introduction of high concentrations of foreign substances. Furthermore, by utilizing such constructs, therapeutic agents for diseases can be provided.

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Abstract

本開示により、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入する方法が提供される。該方法は、（１）以下のアミノ酸配列：ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＳＲＫＫＲ（配列番号１）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＳＮＲＫＫＲ（配列番号２）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＮＲＫＫＲ（配列番号３）、およびＫＫＲＴＬＲＫＮＳＮＲＫＫＲ（配列番号４）のいずれかから成るキャリアペプチドフラグメントと、上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した上記目的の外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、（２）上記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、を包含する。

Description

キャリアペプチドフラグメント及びその利用
　本発明は、真核細胞の外部から該細胞の内部に外来物質を導入（移送）する方法と、該方法に用いられるキャリアペプチドフラグメントに関する。なお、本出願は２０２２年６月３０日に出願された日本国特許出願第２０２２－１０５７２２号に基づく優先権を主張しており、その出願の全内容は本明細書中の参照として組み入れられている。
　従来から、ヒトやそれ以外の哺乳動物等の細胞（真核細胞）内にポリペプチド等の外来物質、とりわけ生理活性物質を導入し、当該細胞（さらには該細胞から成る組織や器官）の形質を転換させること或いは当該細胞の機能を改善・向上させることが行われている。
　例えば、特許文献１には、核小体局在シグナル（Nucleolar localization signal：以下「ＮｏＬＳ」ともいう。）として知られるアミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントと、外来物質とを有する外来物質導入用構築物が開示されている。かかる構築物は、細胞膜透過性を有するため、目的の細胞に当該外来物質を効果的に導入することができる。
国際公開第２０１１／０１３６９９号
　ところで、医療などの観点から、目的とする外来物質を細胞質内へ導入し得る新たなキャリアペプチドフラグメントの開発が望まれている。キャリアペプチドフラグメントの細胞膜透過性は、そのキャリアペプチドフラグメントが導入される細胞種によって効率が変動し得る。そのため、新たなキャリアペプチドフラグメントの開発により、医療の幅が広がり得る。
　そこで本発明は、かかる要望に対応すべく創出されたものであり、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入し得るキャリアペプチドフラグメントを提供することを目的とする。また、本開示は、かかるキャリアペプチドフラグメントを備えた外来物質導入用構築物を提供することを他の目的とする。また、本開示は、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入する方法を提供することを他の目的とする。
　ここで開示される方法は、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質をインビトロまたはインビボにおいて導入する方法であって、
（１）以下のアミノ酸配列：
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＳＲＫＫＲ（配列番号１）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＳＮＲＫＫＲ（配列番号２）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＮＲＫＫＲ（配列番号３）；および
　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＳＮＲＫＫＲ（配列番号４）；
のいずれかから成るキャリアペプチドフラグメントと、
　上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した上記目的の外来物質と、
を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
（２）上記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、
を包含する。
　ここで、「外来物質」とは、上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側またはＣ末端側に直接的または適当なリンカーを介して間接的に結合可能な無機化合物および有機化合物を包含するものであって、真核細胞内に導入可能な分子サイズ及び化学的性質を有するものをいう。
　上記構成の方法によると、目的の外来物質を真核細胞の外部（細胞膜の外側）から細胞膜を通過させて細胞質内に効率よく導入することができる。
　また、ここで開示される方法の一態様では、上記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群から選択される少なくとも１種の有機化合物であり得る。
　ここで、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造を有するポリマーをいう。ポリペプチドは、ペプチド結合の数（即ち、アミノ酸残基数）によって限定されない。即ち、ポリペプチドは、アミノ酸残基数が１０以上３００未満程度の一般にペプチドと呼ばれるものと、一般にタンパク質（典型的には３００以上のアミノ酸残基から成る高分子化合物）と呼ばれるものとを包含する。当該分野においては、ポリペプチドとタンパク質とは厳密に区分されていない。本明細書においては、複数のアミノ酸残基から成るポリマー（オリゴマーを包含する。）を、ポリペプチドと総称する。
　また、「核酸」とは、ヌクレオチドの重合体をいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。「核酸」は、塩基数によって限定されない。
　また、ここで開示される方法の一態様では、上記外来物質が、上記キャリアペプチドフラグメントのＣ末端側に配置され得る。
　また、ここで開示される方法の一態様では、上記外来物質導入用構築物を導入する対象の真核細胞がヒトまたはヒト以外の哺乳動物の細胞であり得る。
　また、本開示では、上記目的を実現するべく、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部（即ち細胞膜の外側）から少なくとも該細胞の細胞質内（好ましくはさらに核内）に目的とする外来物質を導入する（移送する）ことができ得る人為的に作製された外来物質導入用構築物を提供する。
　即ち、ここで開示される構築物は、以下のアミノ酸配列：
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＳＲＫＫＲ（配列番号１）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＳＮＲＫＫＲ（配列番号２）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＮＲＫＫＲ（配列番号３）；および
　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＳＮＲＫＫＲ（配列番号４）；
のいずれかから成るキャリアペプチドフラグメントと、上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した上記目的の外来物質と、を有する。
　かかる構築物は細胞膜透過性を有するため、目的とする真核細胞に目的とする外来物質を効率よく導入することができる。
　ここで開示される構築物の一態様では、上記外来物質はポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群から選択される少なくとも１種の有機化合物であり得る。
　また、ここで開示される構築物の一態様では、上記外来物質が、上記キャリアペプチドフラグメントのＣ末端側に配置され得る。
　また、本開示により、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入し得るキャリアペプチドフラグメントが提供される。ここで開示されるキャリアペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸配列：
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＳＲＫＫＲ（配列番号１）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＳＮＲＫＫＲ（配列番号２）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＮＲＫＫＲ（配列番号３）；および
　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＳＮＲＫＫＲ（配列番号４）；
のいずれかから成る。
　上記キャリアペプチドフラグメントは、細胞膜透過性を発揮するため、外来物質を細胞内に効率よく導入させることができる。
図１は、ＮＳＣ－３４細胞の培養液に対し、例１～５に示す構築物（添加物）を添加して培養した後、当該細胞をフローサイトメータにより解析することで得られたＭＦＩの値を示すグラフである。 図２は、サンプル１～３，および参考例の細胞毒性試験の結果を示すグラフである。
　以下、ここで開示される技術のいくつかの実施形態について説明する。本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって、本技術の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドや核酸を成分として含む構築物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。
　また、ここで開示される技術は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合によってアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記で表す。なお、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
　また、本明細書において、「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成あるいは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。ここで「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、アミノ酸残基の数によって限定されない。
　また、本明細書において示されるアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基は、Ｌ体であってもよく、Ｄ体であってもよい。即ち、ここで開示されるキャリアペプチドフラグメントを構成する各アミノ酸残基は、Ｌ体であってよく、Ｄ体であってよい。換言すれば、ペプチドまたはタンパク質を構成するアミノ酸配列中で、Ｌ体のアミノ酸残基とＤ体のアミノ酸残基とを有していてもよい。
　なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側を表す。
　ここで開示されるキャリアペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸配列：
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＳＲＫＫＲ（配列番号１）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＳＮＲＫＫＲ（配列番号２）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＮＲＫＫＲ（配列番号３）；および
　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＳＮＲＫＫＲ（配列番号４）；
のいずれかから成る。配列番号１～４に示すアミノ酸配列を含むキャリアペプチドフラグメントは、細胞膜透過性を有し得る。そのため、かかるキャリアペプチドフラグメントは、当該キャリアペプチドフラグメントを有する構築物に、細胞膜透過性を付与することができる。
　ここで開示される「キャリアペプチドフラグメント」は、典型的には、上記アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列であるが、細胞膜透過性を損なわない限りは、かかるアミノ酸配列の改変配列を包含する。ここで、「改変配列」とは、１個または数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列（改変アミノ酸配列）である。そのような軽微な改変配列は、ここで開示される情報に基づいて当業者にとって容易に利用され得るため、ここで開示される技術的思想としての「キャリアペプチドフラグメント」に包含され得る。
　本明細書における改変配列の典型例としては、例えば、１個、２個または３個のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列や、所定のアミノ酸配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等が挙げられる。同類置換の典型例としては、例えば、塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列（例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）や、疎水性アミノ酸残基が別の疎水性アミノ酸残基に置換した配列（例えばロイシン残基、イソロイシン残基、およびバリン残基の相互置換）等が挙げられる。
　ここで開示される外来物質導入用構築物（本明細書において、単に「構築物」ともいう。）は、ここで開示されるキャリアペプチドフラグメントと、当該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した外来物質とを有する。
　ここで開示される構築物は、上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に、所望する外来物質を直接的または適当なリンカーを介して間接的に結合（連結）することによって、設計・構築され得る。
　リンカーは、特に限定されるものではないが、ペプチド性リンカーであってもよく、非ペプチド性リンカーであってもよい。特に限定されるものではないが、ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸配列は立体障害を生じさせず、かつ、柔軟なアミノ酸配列であることが好ましい。ペプチド性リンカーは、例えば、グリシン、アラニン、およびセリン等から選択されるアミノ酸残基を１種または２種以上含む、１０個以下（より好ましくは１個以上５個以下、例えば１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸残基）のアミノ酸残基からなるリンカーであり得る。また、かかるリンカーとして、βアラニンを用いてもよい。非ペプチド性リンカーとしては、特に限定されるものではないが、例えばアルキルリンカー、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカー、アミノヘキサノイルスペーサ等を用いることができる。
　外来物質は、例えば、ポリペプチド、核酸、色素、薬剤等の有機化合物であり得る。
　外来物質がポリペプチドである場合には、該ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、キャリアペプチドフラグメントを構成するアミノ酸配列とを含むようにペプチド鎖を設計し、該ペプチド鎖を生合成あるいは化学合成することによって、目的の外来物質導入用構築物を作製することができる。また、種々のＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸、色素（例えばＦＡＭやＦＩＴＣ等の種々の蛍光色素化合物）、あるいは薬剤（例えば５－フルオロウラシル（５ＦＵ）等の核酸系抗腫瘍剤を含む抗腫瘍剤やアジドチミジン（ＡＺＴ）等の抗ウイルス剤等）として機能する有機化合物を従来公知の種々の科学的手法により、上述したキャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に直接的もしくは間接的に結合させて構築物を調製することができる。
　特に限定するものではないが、外来物質が有する機能は、例えば、幹細胞の分化誘導の促進（幹細胞分化誘導活性）、腫瘍細胞の増殖抑制（抗腫瘍活性）、ウイルス感染細胞の増殖抑制（抗ウイルス活性）等であり得る。
　ここで開示される構築物において、キャリアペプチドフラグメントと結合する外来物質の数は特に限定されない。例えば、１のキャリアペプチドフラグメントに対して１又はそれ以上の外来物質を結合させてもよい。特に限定するものではないが、例えば、１のキャリアペプチドフラグメントのＣ末端側にポリペプチド、核酸、薬剤等を結合させておき、Ｎ末端側に色素を結合させてもよい。キャリアペプチドフラグメントに色素を結合させることにより、構築物の真核細胞への導入効率および細胞内における局在を評価することが容易となるため好ましい。
　なお、外来物質がポリペプチドの場合、採用するポリペプチド（アミノ酸配列）は、特に限定されない。例えばアミノ酸残基数が１００～１０００程度のポリペプチド若しくはタンパク質のような、比較的アミノ酸残基数が多いものも外来物質として採用し得る。
　典型的には、外来物質導入用構築物として作製する合成ペプチドを構成する総アミノ酸残基数は、数個乃至数十個（例えば１０個）以上であって、１０００以下が適当であり、好ましくは６００以下であり、さらに好ましくは５００以下であり、特に３００以下（例えば１０～３００）が好適である。このような長さのポリペプチドは合成（生合成、化学合成）が容易であり、使用しやすい。
　外来物質としては、種々の細胞や組織（器官）の発生、分化、増殖、がん化、ホメオスタシス（恒常性）、代謝の調節、等の機能にかかわるポリペプチドの成熟型あるいは前駆体（プロ型、プレプロ型を包含する。）が好ましい。また、機能が従来知られていないポリペプチドを細胞内に導入して当該ポリペプチドの細胞内（生体組織内）における機能の解明のために、ここに開示される外来物質導入方法を実施することもできる。
　例えば、外来物質の導入する対象となる真核細胞がヒト又はその他哺乳動物の幹細胞である場合、当該幹細胞の分化誘導に関与する種々の生理活性を有するポリペプチドの成熟型またはその前駆体の利用が好ましい。なお、「幹細胞」は、体性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells：ｉＰＳ細胞）を包含する。また、外来物質の導入する対象となる真核細胞ががん細胞（腫瘍細胞）である場合、当該がん細胞（腫瘍細胞）のアポトーシス誘導に関与する種々のポリペプチドの利用が好ましい。あるいは、この場合においては、がん細胞（腫瘍細胞）が免疫監視機構の機能を抑制することを阻害し得るポリペプチドの利用が好ましい。さらに、導入の対象となる真核細胞が細菌感染細胞やウイルス感染細胞である場合、当該感染細胞のアポトーシス誘導に関与する種々のポリペプチドや、当該感染細胞において細菌もしくはウイルスが増殖することを抑制し得るポリペプチドや、当該感染細胞から細菌もしくはウイルスの感染が拡大することを抑制し得るポリペプチドの利用が好ましい。
　なお、キャリアペプチドフラグメントと同様、外来物質としてのポリペプチドは、その機能を保持する限りにおいて、１個または数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成される改変アミノ酸配列を含んでいてもよい。
　キャリアペプチドフラグメントのＣ末端側に外来物質が結合している構築物では、キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側のアミノ酸残基のα－アミノ基がアセチル化されていることが好ましい。詳細なメカニズムは不明だが、真核細胞中のタンパク質の多くはＮ末端側のアミノ酸のα－アミノ基はアセチル化修飾されるため、このような構成であれば、構築物の細胞内での安定性が向上し得る。
　構築物は、Ｃ末端側のアミノ酸残基がアミド化されていることが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基をアミド化すると、かかる構築物の細胞質内および核小体内における構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）が向上し得る。また、カルボキシル基がアミド化されることで、構築物の親水性が向上するため、かかる構築物の水系溶媒への溶解性を向上させることができる。かかる水系溶媒としては、例えば、水、種々の緩衝液、生理食塩水（例えばＰＢＳ）、細胞培養液等が挙げられる。
　例えば、キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側に外来物質が結合している構築物の場合、キャリアペプチドフラグメントのＣ末端側のアミノ酸残基のカルボキシル基がアミド化されていることが好ましい。また、例えば外来物質がポリペプチドであり、かかるポリペプチドがキャリアペプチドフラグメントのＣ末端側に結合している場合は、当該ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基をアミド化することが好ましい。
　構築物のうちペプチド鎖（外来物質として構成されるポリペプチド、キャリアペプチドフラグメントおよびペプチド性リンカーを包含する）の比較的短いものは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。即ち、市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｎ末端アセチル化、Ｃ末端アミド化等）部分を有する上記ペプチド鎖を合成することができる。なお、上記方法でペプチド鎖の一部のみを合成してもよく、例えば、キャリアペプチドフラグメントのみ、または、キャリアペプチドフラグメントとペプチド性リンカー部分とを含むペプチド鎖を合成し得る。
　或いは、遺伝子工学的手法に基づいてペプチド部分を生合成により作製してもよい。即ち、所望するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
　一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチド部分を単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のペプチド部分を得ることができる。
　なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本技術を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
　例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（即ち設計した人工ポリペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、目的の構築物（人工ポリペプチド）を製造することができる。
　或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち、構築物のペプチド部分のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド部分の合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロで合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能）が市販されている。
　構築物のペプチド部分をコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。即ち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、かかるアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
　こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
　構築物は、外来物質の機能に基づく用途の組成物の有効成分として好適に使用し得る。なお、構築物は、外来物質の機能を失わない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸または有機酸を付加反応させることにより得られ得る酸付加塩を使用することができる。従って、本明細書および請求の範囲に記載の「構築物」は、かかる塩形態のものを包含し得る。
　構築物は、使用形態に応じて医薬（薬学）上許容され得る種々の担体を含み得る組成物の有効成分として使用され得る。
　上記担体としては、例えば、希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。かかる担体としては、外来物質導入用構築物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。また、かかる担体は、適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得、或いはリポソームであってもよい。また、医薬用組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
　組成物の形態は、特に限定されない。例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏などの形態が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水または適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
　構築物（主成分）および種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本技術を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。
　本開示により、ここで開示される構築物を用いて、生体内（インビボ）、または、生体外（インビトロ）において外来物質を導入する方法が提供される。当該方法では、おおまかにいって、以下の（１）～（２）の工程：
（１）配列番号１～４のいずれかに示されるアミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的とする外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
（２）上記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と
を包含する。また、ここで開示される方法では、さらに、上記（２）の工程の後、（３）の工程として、上記構築物が供給された試料をインキュベートして、該試料中の真核細胞内にかかる構築物を導入する工程を含み得る。
　上記「真核細胞」は、インビボにおいては、例えば種々の組織、臓器、器官、血液、およびリンパ液等を包含する。上記「真核細胞」は、インビトロにおいては、例えば生体から摘出された種々の細胞塊、組織、臓器、器官、血液、およびリンパ液ならびに、セルライン等を包含する。
　ここで開示される構築物または該構築物を含む組成物は、インビボにおいて、その形態および目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者（即ち生体）の患部（例えば悪性腫瘍組織、ウイルス感染組織、炎症組織等）に所望する量だけ投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを、直接所定の組織（即ち、例えば腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、炎症細胞等を含む組織や器官等の患部）に投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。経口投与の場合は、消化管内での消化酵素分解を抑止すべくカプセル化や保護（コーティング）材の適用が好ましい。
　あるいは、生体外（インビトロ）において培養している真核細胞に対し、構築物の適当量を、少なくとも１回、目的とする真核細胞の培養液に供給してもよい。１回当たりの供給量および供給回数は、培養する真核細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。例えば、培養液中のキャリアペプチドフラグメント濃度が概ね０．０５μＭ以上１００μＭ以下の範囲内、例えば０．５μＭ以上５０μＭ以下の範囲内、また例えば１μＭ以上２０μＭ以下の範囲内となるように１回、２回またはそれ以上の複数回添加することが好ましい。また、構築物添加後のインキュベート時間についても、真核細胞の種類及び各種条件により異なり得るため特に限定されない。例えば、０．５時間以上、１時間以上、４時間以上、８時間以上、２０時間以上であり得る。なお、インキュベートの条件についても、真核細胞の種類により異なり得るため、特に限定されるものではないが、例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃下でインキュベートすることができる。
　なお、インビトロにおける導入方法について、一例を後述の試験例において示している。
　構築物の導入効率を評価する方法は、特に限定されない。例えば、該構築物に色素（典型的には蛍光色素化合物）が結合している場合には、顕微鏡観察（例えば蛍光顕微鏡観察）やフローサイトメトリー等を使用して、真核細胞への導入効率を評価することができる。また、上記構築物のペプチド部分を特異的に認識する抗体を用いた免疫化学的手法（例えばウエスタンブロットや免疫細胞染色等）によっても上記構築物の導入効率を評価し得る。
　以上の通り、ここで開示される技術の具体的な態様として、以下の各項に記載のものが挙げられる。
項１：真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質をインビトロにおいて導入する方法であって、
（１）以下のアミノ酸配列：
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＳＲＫＫＲ（配列番号１）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＳＮＲＫＫＲ（配列番号２）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＮＲＫＫＲ（配列番号３）；および
　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＳＮＲＫＫＲ（配列番号４）；
のいずれかから成るキャリアペプチドフラグメントと、
　上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した上記目的の外来物質と、
を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
（２）上記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、
を包含する方法。
項２：上記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群から選択される少なくとも１種の有機化合物である、項１に記載の方法。
項３：上記外来物質が、上記キャリアペプチドフラグメントのＣ末端側に配置されている、項１または２に記載の方法。
項４：上記構築物を導入する対象の真核細胞がヒトまたはヒト以外の哺乳動物の細胞である、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
項５： 
　以下のアミノ酸配列：
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＳＲＫＫＲ（配列番号１）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＳＮＲＫＫＲ（配列番号２）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＮＲＫＫＲ（配列番号３）；および
　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＳＮＲＫＫＲ（配列番号４）；
のいずれかから成るキャリアペプチドフラグメントと、
　上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した上記目的の外来物質と、を有する構築物。
項６：上記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群から選択される少なくとも１種の有機化合物である、項５に記載の構築物。
項７：上記外来物質が、上記キャリアペプチドフラグメントのＣ末端側に配置されている、項５または６に記載の構築物。
項８：
　以下のアミノ酸配列：
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＳＲＫＫＲ（配列番号１）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＳＮＲＫＫＲ（配列番号２）；
　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＮＲＫＫＲ（配列番号３）；および
　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＳＮＲＫＫＲ（配列番号４）；
のいずれかから成る、キャリアペプチドフラグメント。
　以下、ここで開示される技術に関するいくつかの試験例を説明するが、ここで開示される技術をかかる試験例に示すものに限定することを意図したものではない。
＜外来物質導入用構築物の作製＞
　表１に示すアミノ酸配列で構成された合成ペプチドを有する構築物を用意した。ペプチド１を有する構築物をサンプル１、ペプチド２を有する構築物をサンプル２、ペプチド３を有する構築物をサンプル３、および、ペプチド４を有する構築物をサンプル４とする。サンプル１～４は、いずれもユーロフィンジェノミクス株式会社に合成を依頼して準備した。
　なお、構築物１～４において、ペプチド１～４のＮ末端側のアミノ酸残基のα－アミノ基はいずれもアセチル化されたものを準備した。また、ペプチド１～４のＣ末端側のアミノ酸残基に、外来物質として蛍光色素であるＦＡＭ（Ｃ２１Ｈ１２Ｏ７：5(6)-Carboxyfluorescein、分子量３７６．３、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を結合したものを準備した。そして、サンプル１～４をそれぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、サンプル濃度が２ｍＭのサンプル溶液１～４をそれぞれ調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［試験１］
＜フローサイトメトリーによる細胞膜透過性評価＞
　真核細胞としてＮＳＣ－３４細胞（mouse motor neuron-like hybrid cell line）を使用し、構築物１～４の細胞膜透過性を解析した。例１～４では、上記調製したサンプル１～４をそれぞれ用い、例５では、ＦＡＭ溶液を用いた。
（例１）
　ＮＳＣ－３４細胞を一般的な培養培地である１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）含有ＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium（富士フィルム和光純薬株式会社製、Cat No.044-29765））で培養した。
　培養プレートに接着したＮＳＣ－３４細胞をＰＢＳで洗浄後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加し、３７℃中で３分間インキュベートを行った。該インキュベート後、上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを加え、トリプシンを不活性化させた後、１５０×ｇで５分間の遠心分離を行い細胞を沈殿させた。遠心分離によって生じた上清を取り除いた後、沈殿（細胞ペレット）に上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを加え、凡そ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液を市販の６穴（ウェル）プレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製）のウェルに１ｍＬ加え、細胞を播種した（凡そ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル）。また、上記２ｍＭサンプル溶液１を上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで希釈し、サンプル１の濃度が２０μＭのサンプル溶液１を準備した。そして、該ウェルに上記２０μＭサンプル溶液１を１ｍＬ添加した（即ち、ウェル中の培養液のサンプル１の濃度が１０μＭ、ＤＭＳＯ濃度が０．５％となるようにした）。その後、細胞を５％ＣＯ２条件下で、３７℃で２０時間インキュベートを行った。
　２０時間のインキュベート後、ウェルから培養上清を取り除き、１ｍＬのＰＢＳでウェル中の細胞を２回洗浄した。次に、ウェルに２００μＬの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加し、３７℃中で３分間インキュベートを行った。該インキュベート後、ウェルに４００μＬの上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加することでトリプシンを不活性化した後、ウェル中の細胞懸濁液をチューブに移し、細胞を回収した。その後、さらにウェルに６００μＬのＰＢＳを添加し、ウェルを洗浄した。そして、ウェル中のＰＢＳを上記チューブへと移すことにより、ウェル中に残った細胞を上記チューブへと回収した。このチューブを４℃、２１０×ｇの条件で５分間遠心分離を行った。遠心分離後、上清を取り除き、沈殿（細胞ペレット）を１ｍＬのＰＢＳで懸濁（洗浄）し、上記と同じ条件で遠心分離を行った。この操作を２回繰り返した後、上清を取り除き、サンプル１含有培地で培養した細胞（細胞ペレット）を得た。
　上記得られた細胞（細胞ペレット）について、フローサイトメータを用いてサンプル１の細胞膜透過性の解析を行った。フローサイトメータとして、Ｏｎ－Ｃｈｉｐ　Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ(On-Chip Biotechnologies Co., LTD.）製）を使用した。
　かかる解析のために、上記得られた細胞ペレットを１００μＬのＯｎ－Ｃｈｉｐ　Ｔ　ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、解析用の細胞懸濁液を用意した。
　上記のフローサイトメータを用いて前方散乱（ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳＣ）および側方散乱（ｓｉｄｅ　ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳＣ）に基づくゲーティングを行い、解析対象とする細胞集団についてのゲートを設定し、かかるゲート内の細胞集団について、蛍光強度を測定した。なお、該細胞集団の細胞数が少なくとも１００００個となるように解析を行った。蛍光強度の測定には、ＦＡＭの蛍光波長を検出可能な上記フローサイトメータの蛍光検出器ＦＬ２（最適検出波長５４３ｎｍ付近）を使用した。かかる測定結果について、市販の解析ソフト「ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）」（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いて解析を行い、測定対象細胞集団の蛍光強度の中央値（ｍｅｄｉａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）を得た。
（例２）
　サンプル溶液１を上記調製したサンプル溶液２とした以外は例１と同様に実施した。
（例３）
　サンプル溶液１を上記調製したサンプル溶液３とした以外は例１と同様に実施した。
（例４）
　サンプル溶液１を上記調製したサンプル溶液４とした以外は例１と同様に実施した。
（例５）
　サンプル溶液１をＤＭＳＯで希釈したＦＡＭ溶液とした以外は例１と同様に実施した。なお、かかるＦＡＭ溶液の濃度はサンプル１溶液の濃度（即ち、ウェル中の培養液のＦＡＭ濃度が１０μＭ、ＤＭＳＯ濃度が０．５％）と同じになるように用いた。
　例１～５について得られた結果を表２および図１に示す。図１は、各例におけるＭＦＩの値を示すグラフである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２および図１に示すように、例１～４は、例５よりもＭＦＩの値が高かった。即ち、外来物質であるＦＡＭにペプチド１～４のうち少なくとも１つが結合していることで、構築物に細胞膜透過性が付与され、細胞内により多くのＦＡＭが導入されることがわかる。
　なお、詳細なデータは示していないが、本発明者の検討によって、ペプチド１～４のいずれかを有する構築物は、外来物質が蛍光色素のみならず、ポリペプチド、核酸、および薬剤のいずれであっても、かかる外来物質は、効率よく細胞の外部から細胞質内に導入されることが確認された。
［試験２］
＜キャリアペプチドフラグメントの細胞毒性評価＞
　真核細胞としてＷＳ－１細胞（human skin fibroblastoid cell line、American Type Culture Collectionより入手、ATCC No.CRL-1502）を使用し、上記ペプチド１～３の細胞毒性を評価した。培養培地としては、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）含有ＤＭＥＭ(富士フィルム和光純薬株式会社製、Cat No.044-29765））を使用した。試験２では、サンプル１～３をそれぞれＤＭＳＯで溶解し、６ｍＭサンプル溶液１～３を調製した。６ｍＭサンプル溶液１～３を上記培養培地で希釈し、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭのサンプル溶液１～３を調製した。また、参考例として、配列番号５に示すアミノ酸配列から成る、細胞膜透過性を発揮するキャリアペプチドフラグメントを備える構築物を準備した。参考例は、キャリアペプチドフラグメントを構成するアミノ酸配列以外は、サンプル１～３と同様の構成となるようにした。参考例についても、サンプル溶液１～３と同様にして、１２．５μＭ～１００μＭの参考例を含む溶液（以下、「溶液（参考例）」ともいう。）を調製した。
　培養プレートに接着したＷＳ－１細胞をＰＢＳで洗浄後、０．２５％トリプシン／０．５３ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液を添加し、３７℃中で３～５分間インキュベートを行った。該インキュベート後、上記培養培地を加え、トリプシンを不活性化させた後、室温で９００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い細胞を沈殿させた。遠心分離によって生じた上清を取り除いた後、沈殿（細胞ペレット）に上記培養培地を加え、凡そ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液を市販の９６穴（ウェル）プレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製）のウェルに１００μＬ加え、細胞を播種し（凡そ１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータで２４時間のインキュベートを行った。該インキュベート後、ウェル中の培地を取り除き、上記調製した１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭのサンプル溶液１～３、溶液（参考例）をそれぞれ３ウェルに９０μＬずつに加えた（即ち３連で試験した）。また、コントロールとして、１．６７％ＤＭＳＯ含有の上記培養培地（１００μＭサンプル溶液添加ウェル中のＤＭＳＯ濃度と同じ）を３ウェルに９０μL加えた。また、ＤＭＳＯ非含有の上記培養培地を３ウェルに９０μＬずつ加えた。その後、さらに５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータで２４時間のインキュベートを行った。該インキュベート後、各ウェルの培地を取り除き、各ウェルにＤＭＳＯ非含有の上記培養培地を１００μＬ加えた。なお、このときブランクとして、細胞を播種していないウェルにも上記培養培地を１００μＬ加えた。さらに、各ウェルに細胞増殖／細胞毒性キット：Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８、Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を各ウェルに１０μＬずつ加えた。その後、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータで１．５時間のインキュベートを行い、マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍの吸光度を測定した。そして、培養培地に添加された溶液の種類および濃度ごとでそれぞれ３ウェルの吸光度の算術平均を算出した。ＤＭＳＯ非含有の上記培養培地で細胞を培養した３ウェルの吸光度の平均値を１００％として、細胞生存能（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を求めた。結果を図２に示す。図２のグラフの横軸は培養培地中のサンプル濃度を示し、縦軸は細胞生存能を示す。なお、コントロールとして試験した１．６７％ＤＭＳＯ含有の上記培養培地で培養した例は、サンプル濃度１００μＭの位置にプロットした。
　図２に示すように、サンプル１～３では、サンプル濃度が１００μＭであっても、１．６７％ＤＭＳＯを加えた例と比較して、細胞生存能が低下していなかった。即ち、サンプル１～３は、１００μＭという高濃度であっても、細胞毒性がほとんど観察されないことがわかる。
　以上、ここで開示される技術の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、請求の範囲を限定するものではない。請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
　ここで開示される技術によると、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部から細胞質内に目的とする外来物質を導入するために人為的に作製されたキャリアペプチドフラグメント及び該キャリアペプチドフラグメントを有する構築物が提供される。かかる構築物を利用することにより、目的の細胞に目的の外来物質をより安全に且つ効果的に導入させ、該外来物質が導入された細胞並びに該外来物質を含む細胞を含む器官等の生体組織を得ることができる。また、キャリアペプチドフラグメントの細胞毒性が低いことで、従来よりも高濃度の構築物を使用でき得るため、外来物質を高濃度で導入することが可能となり得る。また、かかる構築物を利用することにより、疾患に対する治療薬を提供することができる。

Claims (8)

  1. 　真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質をインビトロにおいて導入する方法であって、
    （１）以下のアミノ酸配列：
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＳＲＫＫＲ（配列番号１）；
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＳＮＲＫＫＲ（配列番号２）；
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＮＲＫＫＲ（配列番号３）；および
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＳＮＲＫＫＲ（配列番号４）；
    のいずれかから成るキャリアペプチドフラグメントと、
    　前記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した前記目的の外来物質と、
    を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
    （２）前記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、
    を包含する方法。
  2. 　前記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群から選択される少なくとも１種の有機化合物である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記外来物質が、前記キャリアペプチドフラグメントのＣ末端側に配置されている、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記構築物を導入する対象の真核細胞がヒトまたはヒト以外の哺乳動物の細胞である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 　以下のアミノ酸配列：
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＳＲＫＫＲ（配列番号１）；
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＳＮＲＫＫＲ（配列番号２）；
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＮＲＫＫＲ（配列番号３）；および
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＳＮＲＫＫＲ（配列番号４）；
    のいずれかから成るキャリアペプチドフラグメントと、
    　前記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した前記目的の外来物質と、
    を有する構築物。
  6. 　前記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群から選択される少なくとも１種の有機化合物である、請求項５に記載の構築物。
  7. 　前記外来物質が、前記キャリアペプチドフラグメントのＣ末端側に配置されている、請求項５または６に記載の構築物。
  8. 　以下のアミノ酸配列：
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＳＲＫＫＲ（配列番号１）；
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＳＮＲＫＫＲ（配列番号２）；
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＮＲＫＫＲ（配列番号３）；および
    　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＳＮＲＫＫＲ（配列番号４）；
    のいずれかから成る、キャリアペプチドフラグメント。
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