WO2024128081A1 - 合成ペプチド及び構築物 - Google Patents

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WO2024128081A1
WO2024128081A1 PCT/JP2023/043553 JP2023043553W WO2024128081A1 WO 2024128081 A1 WO2024128081 A1 WO 2024128081A1 JP 2023043553 W JP2023043553 W JP 2023043553W WO 2024128081 A1 WO2024128081 A1 WO 2024128081A1
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WO
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amino acid
synthetic peptide
cell
construct
acid sequence
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PCT/JP2023/043553
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English (en)
French (fr)
Inventor
菜穂子 ベイリー小林
徹彦 吉田
Original Assignee
東亞合成株式会社
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  • the present invention relates to a synthetic peptide having cell membrane permeability and a construct comprising the synthetic peptide.
  • CPPs Cell-penetrating peptides
  • Japanese Patent Publication No. 7041853 discloses a carrier peptide fragment that functions as a CPP, and a technology for introducing a foreign substance of interest into a eukaryotic cell by using the carrier peptide fragment.
  • the amino acid sequence constituting a CPP contains basic amino acids (e.g., arginine, lysine), and it is said that basic amino acids can contribute to the efficiency of cell membrane permeability.
  • basic amino acids e.g., arginine, lysine
  • cytotoxicity it is generally known that when the ratio of basic amino acids in a CPP is high, there is a tendency for cytotoxicity to be high.
  • the synthetic peptide disclosed herein is a CPP capable of introducing a foreign substance of interest into at least the cytoplasm of a eukaryotic cell from the outside of the cell.
  • the synthetic peptide has the following amino acid sequence: (1) an amino acid sequence in which two or more minimum building blocks, each of which is a serine residue-alanine acid residue, are linked in series; and (2) an amino acid sequence in which one to three glycine residues are linked to the C-terminus of the amino acid sequence of (1) above; It is composed of either
  • the synthetic peptide of the above configuration does not contain arginine, lysine, or histidine residues, which are known as basic amino acids.
  • arginine, lysine, or histidine residues which are known as basic amino acids.
  • conventional amino acid residues can exhibit high cell membrane permeability because they contain basic amino acids, but the synthetic peptide disclosed here can exhibit high cell membrane permeability despite not containing basic amino acids.
  • the amino acid sequences of (1) and (2) above have 2 to 4 of the above minimum building blocks.
  • the synthetic peptide disclosed herein may have an amino acid sequence in which the above minimum building blocks are repeated 2 to 4 times.
  • the synthetic peptides disclosed herein include, for example, the following amino acid sequence: SASAG (SEQ ID NO: 1); SASASAG (SEQ ID NO: 2); and SASASAG (SEQ ID NO: 3); Any of the above amino acid sequences can exhibit high cell membrane permeability.
  • the present disclosure provides a construct for introducing a foreign substance (hereinafter, also simply referred to as a "construct") that is constructed for introducing a foreign substance of interest into at least the cytoplasm of a eukaryotic cell from the outside of the cell.
  • the construct disclosed herein has the synthetic peptide disclosed herein and the foreign substance of interest bound to the N-terminus and/or C-terminus of the synthetic peptide. Since such a construct has a synthetic peptide that functions as a CPP, it can be efficiently introduced into the interior of a eukaryotic cell, and the foreign substance of interest can be efficiently introduced into the interior of the cell.
  • the exogenous substance may be at least one organic compound selected from the group consisting of a polypeptide, a nucleic acid, a dye, and a drug.
  • polypeptide refers to a polymer having a structure in which multiple amino acids are bound by peptide bonds. Polypeptides are not limited by the number of peptide bonds (i.e., the number of amino acid residues). That is, polypeptides include those generally called peptides having 10 to less than 300 amino acid residues, and those generally called proteins (polymeric compounds typically consisting of 300 or more amino acid residues). In the art, polypeptides and proteins are not strictly distinguished.
  • nucleic acid refers to a polymer of nucleotides, and includes DNA and RNA.
  • Nucleic acid is not limited by the number of bases.
  • the foreign substance may be located at the C-terminus of the synthetic peptide.
  • FIG. 1 is a graph showing MFI values obtained by adding the constructs (additives) shown in Examples 1 to 3 and Reference Example 1 to a culture medium of NSC-34 cells, culturing the cells, and then analyzing the cells using a flow cytometer.
  • Matters other than those specifically mentioned in this specification that are necessary for implementing this technology (for example, general matters related to chemical synthesis of peptides, cell culture techniques, and preparation of constructs containing peptides or nucleic acids as components) can be understood as design matters of a person skilled in the art based on conventional techniques in the fields of cell engineering, physiology, medicine, pharmacology, organic chemistry, biochemistry, genetic engineering, protein engineering, molecular biology, genetics, etc.
  • the technology disclosed here can be implemented based on the contents disclosed in this specification and the technical common sense in the relevant field.
  • amino acids are sometimes represented by one-letter notation in accordance with the nomenclature for amino acids set forth in the IUPAC-IUB guidelines.
  • amino acid residue includes the N-terminal amino acid and the C-terminal amino acid of a peptide chain, unless otherwise specified.
  • synthetic peptide refers to a peptide fragment whose peptide chain does not exist stably in nature independently, but is produced by artificial chemical synthesis or biosynthesis (i.e., production based on genetic engineering) and can exist stably in a given composition.
  • peptide is a term that refers to an amino acid polymer (including dimers, trimers, oligomers, etc.) having peptide bonds, and is not limited by the number of amino acid residues.
  • amino acid residues constituting a peptide or protein may be in the L- or D-form.
  • left side of the amino acid sequences described in this specification always represents the N-terminus and the right side represents the C-terminus.
  • the synthetic peptide has the amino acid sequence shown in (1) or (2) below: (1) an amino acid sequence in which two or more SA (serine residue-alanine acid residue) minimum building blocks are continuously linked in tandem; (2) an amino acid sequence in which 1 to 3 glycine residues are bound to the C-terminus of the amino acid sequence of (1) above; It consists of:
  • linked consecutively in series means that one minimum structural unit is linked to the N-terminus and/or C-terminus of another minimum structural unit via a peptide bond.
  • the minimum building blocks may be, for example, 2 to 10 consecutively linked in series.
  • the minimum building blocks may be 2 to 6, 2 to 4, or 3 to 4 consecutively linked in series.
  • 4 of the minimum building blocks are consecutively linked in series.
  • An amino acid sequence in which 4 of the minimum building blocks are consecutively linked in series may exhibit particularly excellent cell membrane permeability.
  • the synthetic peptide disclosed herein may have 1 to 3 glycine residues bound to the C-terminus of an amino acid sequence in which the minimum building blocks are bound in series, but the number of glycine residues is preferably 1 to 2, and more preferably 1.
  • Glycine residues are neutral amino acids with the smallest side chain among amino acids. Therefore, it can be understood from the common general knowledge in this technical field that if an amino acid sequence in which the minimum building blocks are bound in series has cell membrane permeability, even if 1 to 3 glycine residues are bound to the C-terminus of the amino acid sequence, the cell membrane permeability will not be significantly impaired.
  • the number of amino acid residues in the synthetic peptide disclosed herein is 4 or more, and is 5 or more, 6 or more, 7 or more, or 8 or more, since the synthetic peptide contains at least two of the smallest building blocks.
  • the upper limit of the number of amino acid residues in the synthetic peptide is not particularly limited, and may be, for example, 21 or less, 19 or less, 17 or less, 15 or less, 13 or less, 12 or less, 11 or less, 10 or less, or 9 or less. If the synthetic peptide has too many amino acid residues, the synthetic peptide may become too bulky, which may reduce cell membrane permeability.
  • synthetic peptides disclosed herein include the amino acid sequences shown in (2) above, such as SASAG (SEQ ID NO: 1), SASAG (SEQ ID NO: 3), and SASASASAG (SEQ ID NO: 4).
  • amino acid sequences shown in (1) above include SASA (SEQ ID NO: 4), SASAS (SEQ ID NO: 5), and SASASASA (SEQ ID NO: 6). All of the synthetic peptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 can exhibit cell membrane permeability.
  • the synthetic peptide disclosed herein may be a modified sequence of the amino acid sequence shown in (1) or (2) above, so long as the modified sequence does not significantly impair cell membrane permeability.
  • the "modified sequence” refers to an amino acid sequence (modified amino acid sequence) formed by substituting, deleting and/or adding (inserting) one or several (typically two or three) amino acid residues.
  • modified sequences in this specification include sequences resulting from conservative substitution of one, two, or three amino acid residues, so-called conservative amino acid replacement, and sequences in which one, two, or three amino acid residues are added (inserted) or deleted from a given amino acid sequence, etc.
  • conservative substitutions include sequences in which alanine residues, which are nonpolar amino acids, are replaced with other nonpolar amino acid residues such as glycine residues.
  • the synthetic peptides disclosed herein as described above can have cell membrane permeability, and therefore can be used to introduce a foreign substance of interest from outside a eukaryotic cell into at least the cytoplasm (and even into the nucleus) of the cell. Therefore, the present disclosure provides a construct for introducing a foreign substance that includes the synthetic peptides disclosed herein.
  • the construct disclosed herein has the synthetic peptide disclosed herein and a foreign substance of interest bound to the N-terminus and/or C-terminus of the synthetic peptide.
  • the constructs disclosed herein can be designed and constructed by binding (linking) a desired foreign substance directly or indirectly via a suitable linker to the N-terminus and/or C-terminus of the above-mentioned synthetic peptide.
  • the linker is not particularly limited, but may be a peptidic linker or a non-peptidic linker.
  • the amino acid sequence constituting the peptidic linker is preferably an amino acid sequence that does not cause steric hindrance and is flexible.
  • the peptidic linker may be, for example, a linker consisting of 10 or less amino acid residues (more preferably 1 to 5, for example, 1, 2, 3, 4, or 5 amino acid residues) containing one or more amino acid residues selected from glycine, alanine, serine, etc.
  • ⁇ -alanine may be used as such a linker.
  • the non-peptidic linker although not particularly limited, for example, an alkyl linker, a PEG (polyethylene glycol) linker, an aminohexanoyl spacer, etc. may be used.
  • the exogenous substance can be, for example, an organic compound such as a polypeptide, a nucleic acid, a dye, or a drug.
  • a peptide chain is designed to include the amino acid sequence constituting the polypeptide and the amino acid sequence constituting the synthetic peptide, and the peptide chain is biosynthesized or chemically synthesized to prepare a construct for introducing a foreign substance of interest.
  • a construct can be prepared by directly or indirectly binding various nucleic acids such as DNA or RNA, dyes (e.g., various fluorescent dye compounds such as FAM and FITC), or organic compounds that function as drugs (e.g., antitumor agents including nucleic acid-based antitumor agents such as 5-fluorouracil (5FU) and antiviral agents such as azidothymidine (AZT)) to the N-terminus and/or C-terminus of the synthetic peptide described above by various scientific techniques known in the art.
  • the function of the foreign substance may be, for example, promotion of stem cell differentiation induction (stem cell differentiation induction activity), inhibition of tumor cell proliferation (antitumor activity), inhibition of virus-infected cell proliferation (antiviral activity), etc.
  • the number of foreign substances bound to the synthetic peptide is not particularly limited.
  • one or more foreign substances may be bound to one synthetic peptide.
  • a polypeptide, nucleic acid, drug, etc. may be bound to the C-terminus of one synthetic peptide, and a dye may be bound to the N-terminus. Binding a dye to a synthetic peptide is preferable because it makes it easier to evaluate the efficiency of introduction of the construct into eukaryotic cells and its localization within the cells.
  • the polypeptide (amino acid sequence) to be adopted is not particularly limited.
  • a foreign substance having a relatively large number of amino acid residues such as a polypeptide or protein having about 100 to 1000 amino acid residues, may be adopted.
  • the total number of amino acid residues constituting a synthetic peptide prepared as a construct for introducing a foreign substance is several to several tens or more (e.g., 10 or more), and is suitably 1000 or less, preferably 600 or less, more preferably 500 or less, and particularly preferably 300 or less (e.g., 10 to 300).
  • Polypeptides of such a length are easy to synthesize (biosynthesis or chemical synthesis) and are easy to use.
  • Preferred foreign substances are mature or precursor (including pro and prepro forms) of polypeptides involved in functions such as the development, differentiation, proliferation, canceration, homeostasis, and metabolic regulation of various cells and tissues (organs).
  • the foreign substance introduction method disclosed herein can also be carried out to introduce a polypeptide whose function has not been previously known into a cell and elucidate the function of the polypeptide within the cell (within a living tissue).
  • the eukaryotic cells to which a foreign substance is introduced are human or other mammalian stem cells, it is preferable to use mature polypeptides or their precursors having various physiological activities involved in the differentiation induction of the stem cells.
  • stem cells include somatic stem cells, embryonic stem cells, and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • a polypeptide as a foreign substance may contain a modified amino acid sequence formed by substitution, deletion and/or addition (insertion) of one or several amino acid residues, so long as it retains its function.
  • the ⁇ -amino group of the amino acid residue on the N-terminus of the synthetic peptide is acetylated.
  • the ⁇ -amino group of the amino acid on the N-terminus of many proteins in eukaryotic cells is acetylated, so this type of configuration can improve the stability of the construct within the cell.
  • the construct is preferably amidated at the C-terminal amino acid residue.
  • Amidation of the carboxyl group of an amino acid residue can improve the structural stability (e.g., protease resistance) of the construct in the cytoplasm and nucleolus.
  • amidation of the carboxyl group improves the hydrophilicity of the construct, thereby improving the solubility of the construct in aqueous solvents.
  • aqueous solvents include water, various buffer solutions, physiological saline (e.g., PBS), cell culture medium, and the like.
  • the carboxyl group of the amino acid residue at the C-terminus of the synthetic peptide is amidated.
  • the carboxyl group of the C-terminal amino acid residue of the polypeptide is amidated.
  • relatively short peptide chains can be easily produced according to general chemical synthesis methods.
  • any of the conventionally known solid-phase synthesis methods or liquid-phase synthesis methods may be adopted.
  • Solid-phase synthesis methods using Boc (t-butyloxycarbonyl) or Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) as the protecting group for the amino group are preferable.
  • the above-mentioned peptide chains having the desired amino acid sequence and modified portions can be synthesized by solid-phase synthesis using a commercially available peptide synthesizer. Note that only a portion of the peptide chain may be synthesized by the above-mentioned method, for example, a peptide chain containing only a synthetic peptide or a synthetic peptide and a peptidic linker portion can be synthesized.
  • the peptide portion may be produced by biosynthesis based on genetic engineering techniques. That is, a polynucleotide (typically DNA) of a nucleotide sequence (including an ATG start codon) encoding a desired amino acid sequence is synthesized. Then, a recombinant vector having an expression gene construct consisting of the synthesized polynucleotide (DNA) and various regulatory elements (including promoters, ribosome binding sites, terminators, enhancers, and various cis elements that control the expression level) for expressing the amino acid sequence in a host cell is constructed according to the host cell.
  • DNA synthesized polynucleotide
  • various regulatory elements including promoters, ribosome binding sites, terminators, enhancers, and various cis elements that control the expression level
  • This recombinant vector is introduced into a given host cell (e.g., yeast, insect cell, or plant cell) using a common technique, and the host cell or a tissue or individual containing the cell is cultured under given conditions. This allows the target peptide to be produced within the cell. The peptide portion is then isolated from the host cell (or from the medium if secreted), and the target peptide portion can be obtained by, if necessary, refolding, purification, or the like.
  • a given host cell e.g., yeast, insect cell, or plant cell
  • the method of constructing a recombinant vector and the method of introducing the constructed recombinant vector into a host cell may be any method conventionally used in the field, and since the method itself does not particularly characterize the present technology, a detailed description thereof will be omitted.
  • a fusion protein expression system can be used to efficiently produce a large amount of the polypeptide in a host cell. That is, a gene (DNA) encoding the amino acid sequence of the polypeptide of interest is chemically synthesized, and the synthetic gene is introduced into a suitable site of a suitable fusion protein expression vector (for example, a GST (Glutathione S-transferase) fusion protein expression vector such as the pET series provided by Novagen and the pGEX series provided by Amersham Biosciences). Then, a host cell (typically Escherichia coli) is transformed with the vector. The obtained transformant is cultured to prepare the desired fusion protein. The protein is then extracted and purified.
  • a suitable fusion protein expression vector for example, a GST (Glutathione S-transferase) fusion protein expression vector such as the pET series provided by Novagen and the pGEX series provided by Amersham Biosciences.
  • a host cell typically Escherichia
  • the obtained purified fusion protein is then cleaved with a specific enzyme (protease), and the released peptide fragment of interest (i.e., the designed artificial polypeptide) is recovered by a method such as affinity chromatography.
  • a specific enzyme protease
  • the desired construct artificial polypeptide
  • a template DNA for a cell-free protein synthesis system i.e., a synthetic gene fragment containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the peptide portion of the construct
  • various compounds ATP, RNA polymerase, amino acids, etc.
  • ATP ATP, RNA polymerase, amino acids, etc.
  • cell-free protein synthesis systems for example, Shimizu et al.'s paper (Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001)) and Madin et al.'s paper (Madin et al., Proc. Natl.
  • a single-stranded or double-stranded polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the peptide portion of the construct and/or a nucleotide sequence complementary to said sequence can be easily produced (synthesized) by a conventional method. That is, by selecting a codon corresponding to each amino acid residue constituting a designed amino acid sequence, a nucleotide sequence corresponding to said amino acid sequence can be easily determined and provided. Once the nucleotide sequence is determined, a polynucleotide (single-stranded) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like.
  • the obtained single-stranded DNA can be used as a template to obtain the desired double-stranded DNA by employing various enzymatic synthesis means (typically PCR).
  • the polynucleotide may be in the form of DNA or in the form of RNA (mRNA, etc.).
  • the DNA can be provided in a double-stranded or single-stranded form. When provided in a single-stranded form, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) of a sequence complementary thereto.
  • the polynucleotides thus obtained can be used as materials for constructing recombinant genes (expression cassettes) for peptide production in various host cells or in cell-free protein synthesis systems, as described above.
  • constructs disclosed herein may be suitably used as active ingredients in compositions for applications based on the function of the foreign substance.
  • the constructs may be in the form of a salt, so long as the function of the foreign substance is not lost.
  • acid addition salts that can be obtained by addition reaction of commonly used inorganic or organic acids according to standard methods can be used. Therefore, the "constructs" described in this specification and claims may include those in such salt form.
  • the construct can be used as an active ingredient of a composition which can contain various medicamentally (pharmacologically) acceptable carriers depending on the form of use.
  • the above-mentioned carrier is preferably a carrier generally used in peptide medicines as a diluent, excipient, etc.
  • the carrier may vary depending on the purpose and form of the construct for introducing a foreign substance, but typically includes water, physiological buffer solutions, and various organic solvents.
  • the carrier may be an aqueous solution of alcohol (such as ethanol) at an appropriate concentration, glycerol, a non-drying oil such as olive oil, or a liposome.
  • secondary components that may be contained in the pharmaceutical composition include various fillers, bulking agents, binders, wetting agents, surfactants, dyes, fragrances, etc.
  • compositions may be in the form of a liquid, suspension, emulsion, aerosol, foam, granule, powder, tablet, capsule, ointment, etc.
  • the composition may be in the form of a freeze-dried product or granules that are dissolved in physiological saline or a suitable buffer solution (e.g., PBS) immediately before use to prepare a drug solution for injection or the like.
  • physiological saline e.g., PBS
  • PBS physiological saline
  • the process of preparing various forms of drugs (compositions) using constructs (main components) and various carriers (secondary components) may be in accordance with conventionally known methods, and detailed explanations of such formulation methods are omitted since they do not characterize the present technology.
  • Comprehensive Medicinal Chemistry edited by Corwin Hansch, published by Pergamon Press (1990) is an example of a detailed information source regarding formulations.
  • synthetic peptides disclosed herein do not contain basic or acidic amino acids, it may be possible to create constructs equipped with foreign substances that were difficult to combine with conventional CPPs due to issues such as charge.
  • the construct disclosed herein may be used to introduce a foreign substance in vivo or outside the body (in vitro).
  • the method of introduction may broadly include a step of preparing the construct disclosed herein (preparation step) and a step of supplying the construct into a sample containing the target eukaryotic cells (supply step).
  • the method may further include a step of incubating the sample to which the construct has been supplied after the supply step, and introducing the construct into the eukaryotic cells in the sample (introduction step).
  • eukaryotic cells include, for example, various tissues, organs, blood, and lymph fluids in vivo.
  • the above-mentioned “eukaryotic cells” include, for example, various cell masses, tissues, organs, blood, and lymph fluids extracted from living organisms, as well as cell lines, etc. in vitro.
  • composition containing the construct disclosed herein can be used in vivo in a manner and dosage appropriate for its form and purpose.
  • a liquid formulation it can be administered in a desired amount to the affected area (e.g., malignant tumor tissue, virus-infected tissue, inflammatory tissue, etc.) of a patient (i.e., a living body) by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, or intraperitoneal injection.
  • a solid form such as a tablet or a gel or aqueous jelly such as an ointment can be administered directly to a specific tissue (i.e., an affected area such as a tissue or organ containing, for example, tumor cells, virus-infected cells, inflammatory cells, etc.).
  • a solid form such as a tablet can be administered orally.
  • an appropriate amount of the construct may be supplied at least once to the culture medium of the eukaryotic cells being cultured outside the body (in vitro).
  • the amount and number of times of supply per time are not particularly limited because they may vary depending on the type of eukaryotic cells to be cultured, cell density (cell density at the start of culture), number of passages, culture conditions, type of medium, and other conditions.
  • it is preferable to add the synthetic peptide once, twice, or more times so that the concentration of the synthetic peptide in the culture medium is generally within the range of 0.05 ⁇ M to 100 ⁇ M, for example, within the range of 0.5 ⁇ M to 50 ⁇ M, and for example, within the range of 1 ⁇ M to 30 ⁇ M.
  • the incubation time after addition of the construct is also not particularly limited because it may vary depending on the type of eukaryotic cells and various conditions. For example, it may be 0.5 hours or more, 1 hour or more, 4 hours or more, 8 hours or more, or 20 hours or more.
  • the incubation conditions are not particularly limited because they may vary depending on the type of eukaryotic cells, but for example, it can be incubated in a 5% CO 2 atmosphere at 37°C. An example of an in vitro introduction method is shown in the test example described below.
  • the method for evaluating the efficiency of introduction of the construct is not particularly limited.
  • a dye typically a fluorescent dye compound
  • the efficiency of introduction into eukaryotic cells can be evaluated using microscopic observation (e.g., fluorescent microscopic observation) or flow cytometry.
  • the efficiency of introduction of the construct can also be evaluated by immunochemical techniques (e.g., Western blotting, immunocytostaining, etc.) using an antibody that specifically recognizes the peptide portion of the construct.
  • Item 1 A synthetic peptide capable of introducing a foreign substance of interest into at least the cytoplasm of a eukaryotic cell from the outside of the cell,
  • the amino acid sequence (1) an amino acid sequence in which two or more minimum building blocks, each of which is a serine residue-alanine acid residue, are linked in series; and (2) an amino acid sequence in which one to three glycine residues are linked to the C-terminus of the amino acid sequence of (1) above;
  • a synthetic peptide consisting of either Item 2 The synthetic peptide according to Item 1, wherein the amino acid sequences of (1) and (2) above each have 2 to 4 of the minimum structural units.
  • Item 3 A synthetic peptide capable of introducing a foreign substance of interest into at least the cytoplasm of a eukaryotic cell from the outside of the cell, The amino acid sequence: SASAG (SEQ ID NO: 1); SASASAG (SEQ ID NO: 2); and SASASAG (SEQ ID NO: 3); A synthetic peptide consisting of either Item 4: A construct for introducing a foreign substance, which is prepared for introducing a foreign substance of interest into at least the cytoplasm of a eukaryotic cell from the outside of the cell, A synthetic peptide according to any one of items 1 to 3, the foreign substance of interest bound to the N-terminus and/or C-terminus of the synthetic peptide; A construct having the following structure: Item 5: The construct according to Item 4, wherein the foreign substance is at least one organic compound selected from the group consisting of a polypeptide, a nucleic acid, a dye and a drug. Item 6: The construct according to Item 4 or 5, wherein the foreign substance is located
  • item 3 shows a specific example that has the items specified in items 1 or 2, item 3 can be subordinate to item 1 or 2.
  • Test 1 A construct having a synthetic peptide composed of the amino acid sequence shown in Table 1 was prepared.
  • Sample n was a construct having peptide n (n is a natural number from 1 to 3) shown in Table 1, and samples 1 to 3 were obtained from Eurofins Genomics, Inc. Note that in samples 1 to 3, the ⁇ -amino groups of the amino acid residues on the N-terminus of peptides 1 to 3 were all acetylated.
  • peptides 1 to 3 were prepared in which the fluorescent dye FAM (C 21 H 12 O 7 :5(6)-Carboxyfluorescein, molecular weight 376.3, excitation wavelength 495 nm, fluorescence wavelength 520 nm) was bound to the amino acid residues on the C-terminus of peptides 1 to 3 as a foreign substance.
  • FAM fluorescent dye
  • NSC-34 cells (mouse motor neuron-like hybrid cell line) were used as eukaryotic cells, and the cell membrane permeability of peptides 1 to 3 was analyzed.
  • As the culture medium for NSC-34 cells 10% FBS (fetal bovine serum)-containing DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Cat No. 044-29765)) was used.
  • Samples 1 to 3 were each dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare sample solutions 1 to 3 with a sample concentration of 4 mM.
  • the sample solutions were further diluted with the above culture medium to prepare sample solutions 1 to 3 with a concentration of 40 ⁇ M.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • NSC-34 cells were suspended in the above culture medium to prepare a cell suspension of 2 ⁇ 10 5 cells/mL. 1 mL of the cell suspension was added to the wells of a commercially available 6-well plate (manufactured by AGC Technoglass Co., Ltd.) to seed NSC-34 cells at 2 ⁇ 10 5 cells/well. Next, 1 mL of 40 ⁇ M sample solution 1 was added to the wells so that the sample concentration in the culture medium in the wells was 20 ⁇ M. Thereafter, the 6-well plate was placed in a cell culture device and incubated at 37° C. under 5% CO 2 conditions for 20 hours.
  • the culture supernatant was removed from the wells, and the cells in the wells were washed twice with 1 mL of PBS.
  • 100 ⁇ L of 0.25% trypsin/EDTA solution was added to the wells, and the wells were incubated at 37°C for 3 minutes.
  • 900 ⁇ L of the above culture medium was added to the wells to inactivate the trypsin, and the cell suspension in the wells was transferred to a tube and the cells were collected. This tube was centrifuged for 5 minutes at 4°C and 210 ⁇ g.
  • the obtained cells were analyzed for cell membrane permeability of Sample 1 using a flow cytometer.
  • the cell pellet obtained above was suspended in 100 ⁇ L of On-Chip T buffer to prepare a cell suspension for analysis.
  • the above flow cytometer was used to perform gating based on forward scatter (FSC) and side scatter (SSC), set a gate for the cell population to be analyzed, and measured the fluorescence intensity of the cell population within the gate.
  • the analysis was performed so that the cell population had at least 10,000 cells.
  • the fluorescence intensity was measured using the fluorescence detector FL2 (optimum detection wavelength: around 543 nm) of the above flow cytometer, which is capable of detecting the fluorescence wavelength of FAM.
  • the measurement results were analyzed using the commercially available analysis software "FlowJo" (manufactured by TreeStar), and the fluorescence intensity value (mean fluorescence intensity: MFI) of the cell population to be measured was obtained.
  • Example 2 (Examples 2 to 3) The same procedure as in Example 1 was repeated, except that sample solution 1 was replaced with one of the above-prepared sample solutions 2 and 3.
  • the samples (constructs) used in each example are as shown in Table 2.
  • Example 1 The same procedure as in Example 1 was repeated, except that the fluorescent dye FAM was used instead of Sample 1.
  • the FAM concentration in the FAM-containing culture medium was the same as that of Sample 1 in Example 1 (i.e., the FAM concentration in the culture medium in the well was 20 ⁇ M).
  • Examples 1 to 3 had higher MFI values than Reference Example 1.
  • samples 1 to 3 in which either peptide 1 to 3 was bound to FAM were introduced into the cells in greater amounts than when FAM was added alone (Reference Example 1). This shows that peptides 1 to 3 have cell membrane permeability.
  • the technology disclosed herein provides a carrier peptide fragment capable of introducing a foreign substance of interest from the outside into the cytoplasm of a eukaryotic cell (particularly various animal cells such as humans and other mammals that do not have a cell wall) and a construct having the carrier peptide fragment.
  • a construct having the carrier peptide fragment By using such a construct, it is possible to effectively introduce a foreign substance of interest into a target cell, and obtain cells and biological tissues such as organs into which the foreign substance has been introduced.
  • the carrier peptide fragment disclosed herein can be used in drug delivery technology to provide therapeutic drugs for various diseases.

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Abstract

【課題】細胞膜透過性を有する新たな合成ペプチドを提供する。 【解決手段】ここで開示される合成ペプチドは、次のアミノ酸配列：（１）ＳＡ（セリン残基－アラニン酸残基）を最小構成単位として、該最小構成単位が２以上直列に連続して結合されたアミノ酸配列；および（２）上記（１）のアミノ酸配列のＣ末端側にグリシン残基が１～３個結合したアミノ酸配列；のいずれかから成る。

Description

合成ペプチド及び構築物
　本発明は、細胞膜透過性を有する合成ペプチドと、該合成ペプチドを備える構築物に関する。なお、本出願は２０２２年１２月１６日に出願された日本国特許出願第２０２２－２０１１００号に基づく優先権を主張しており、その出願の全内容は本明細書中の参照として組み入れられている。
　細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ：cell-penetrating peptides）は、細胞の外部から細胞膜を通過し、少なくとも細胞質内に移行可能なペプチドである。日本国特許第７０４１８５３号公報では、ＣＰＰとして機能するキャリアペプチドフラグメントが開示されており、当該キャリアペプチドフラグメントを利用することで、目的の外来物質を真核細胞の内部へ導入する技術が開示されている。
特許７０４１８５３号公報
　ところで、一般的に、ＣＰＰを構成するアミノ酸配列には塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン）が含まれており、塩基性アミノ酸が細胞膜透過性の効率に寄与し得るといわれている。しかしながら、一般的にＣＰＰの塩基性アミノ酸の割合が高い場合等には、細胞毒性が高くなる傾向があることが知られている。
　そこで、本発明は、塩基性アミノ酸を含まない細胞膜透過性を有する新たな合成ペプチドを提供することを主な目的とする。また、当該合成ペプチドを備える構築物を提供することを他の目的とする。
　ここで開示される合成ペプチドは、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入可能なＣＰＰである。当該合成ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
（１）ＳＡ（セリン残基－アラニン酸残基）を最小構成単位として、該最小構成単位が２以上直列に連続して結合されたアミノ酸配列；および
（２）上記（１）のアミノ酸配列のＣ末端側にグリシン残基が１～３個結合したアミノ酸配列；
のいずれかから構成されている。
　上記構成の合成ペプチドは、塩基性アミノ酸として知られるアルギニン残基、リシン残基、およびヒスチジン残基を含まない。上述したように、従来のアミノ酸残基は塩基性アミノ酸を有していることで高い細胞膜透過性を発揮し得ると考えられてきたが、ここで開示される合成ペプチドは塩基性アミノ酸を含まないのにも関わらず、高い細胞膜透過性を発揮することができる。
　ここで開示される合成ペプチドの一態様では、上記（１）および上記（２）のアミノ酸配列が、上記最小構成単位を２以上４以下有している。即ち、ここで開示される合成ペプチドは上記最小構成単位が２回以上４回以下繰り返されたアミノ酸配列を有し得る。
　ここで開示される合成ペプチドは、例えば、以下のアミノ酸配列：
　　ＳＡＳＡＧ（配列番号１）；
　　ＳＡＳＡＳＡＧ（配列番号２）；および
　　ＳＡＳＡＳＡＳＡＧ（配列番号３）；
のいずれかから成る。上記アミノ酸配列はいずれにおいても高い細胞膜透過性を発揮し得る。
　また、本開示により、上記目的を実現するべく、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入するために作製された外来物質導入用構築物（以下、単に「構築物」ともいう）が提供される。ここで開示される構築物は、ここで開示される合成ペプチドと、該合成ペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した上記目的の外来物質と、を有する。かかる構築物は、ＣＰＰとして機能する合成ペプチドを備えているため、真核細胞の内部に効率よく導入され、目的とする外来物質を細胞内部に効率よく導入することができる。
　ここで開示される構築物の一態様では、上記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群から選択される少なくとも１種の有機化合物であり得る。
　ここで、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造を有するポリマーをいう。ポリペプチドは、ペプチド結合の数（即ち、アミノ酸残基数）によって限定されない。即ち、ポリペプチドは、アミノ酸残基数が１０以上３００未満程度の一般にペプチドと呼ばれるものと、一般にタンパク質（典型的には３００以上のアミノ酸残基から成る高分子化合物）と呼ばれるものとを包含する。当該分野においては、ポリペプチドとタンパク質とは厳密に区分されていない。本明細書においては、複数のアミノ酸残基から成るポリマー（オリゴマーを包含する。）を、ポリペプチドと総称する。
　また、「核酸」とは、ヌクレオチドの重合体をいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。「核酸」は、塩基数によって限定されない。
　ここで開示される構築物の一態様では、上記外来物質が、上記合成ペプチドのＣ末端側に配置され得る。
ＮＳＣ－３４細胞の培養液に対し、例１～３、参考例１に示す構築物（添加物）を添加して培養した後、当該細胞をフローサイトメータにより解析することで得られたＭＦＩの値を示すグラフである。
　以下、ここで開示される技術の実施形態について説明する。本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって、本技術の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドや核酸を成分として含む構築物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。また、ここで開示される技術は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合によってアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記で表す。なお、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
　また、本明細書において、「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成あるいは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。ここで「ペプチド」とは、ペプチド結合を有するアミノ酸ポリマー（ダイマー、トリマー、オリゴマー等も含む）を指す用語であり、アミノ酸残基の数によって限定されない。
　また、本明細書において、ペプチドまたはタンパク質を構成するアミノ酸残基は、Ｌ体であってもよく、Ｄ体であってもよい。なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側を表す。
　ここで開示される合成ペプチドの一態様では、合成ペプチドは、次の（１）または（２）に示すアミノ酸配列：
（１）ＳＡ（セリン残基－アラニン酸残基）を最小構成単位として、該最小構成単位が２以上直列に連続して結合されたアミノ酸配列；
（２）上記（１）のアミノ酸配列のＣ末端側にグリシン残基が１～３個結合したアミノ酸配列；
から成る。
　なお、本開示において、「直列に連続して結合された」とは、一の最小構成単位のＮ末端側及び／又はＣ末端側に他の最小構成単位がペプチド結合により結合していることをいう。
　ここで開示される合成ペプチドにおいて、上記最小構成単位は、例えば、２以上１０以下直列に連続して結合しているとよい。また、最小構成単位が２以上６以下、２以上４以下、または３以上４以下直列に連続して結合していてもよい。好ましい一態様では、最小構成単位が４個直列に連続して結合している。最小構成単位が４個直列に連続して結合しているアミノ酸配列は、特に優れた細胞膜透過性を発揮し得る。
　上記（２）に示すように、ここで開示される合成ペプチドは、最小構成単位が直列に連続して結合されたアミノ酸配列のＣ末端側にグリシン残基を１～３個結合していてもよいが、当該グリシン残基の数は、好ましくは１～２個、より好ましくは１個である。グリシン残基は、アミノ酸の中でも側鎖が一番小さく、中性アミノ酸である。そのため、最小構成単位が直列に連続して結合されたアミノ酸配列に細胞膜透過性がある場合に、当該アミノ酸配列のＣ末端側にグリシン残基が１～３個結合していても、細胞膜透過性が著しく損なわれるものではないことが、本技術分野の技術常識から理解され得る。
　ここで開示される合成ペプチドのアミノ酸残基の数は、最小構成単位を少なくとも２個含むことから、４以上であって、５以上、６以上、７以上、または８以上である。また、合成ペプチドのアミノ酸残基の数の上限は特に限定されないが、例えば、２１以下、１９以下、１７以下、１５以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、または９以下であり得る。合成ペプチドのアミノ酸残基の数が多すぎる場合には、合成ペプチドが嵩高くなりすぎてしまい、細胞膜透過性が低下するおそれがある。
　ここで開示される合成ペプチドの具体例としては、例えば、上記（２）に示すアミノ酸配列として、ＳＡＳＡＧ（配列番号１）、ＳＡＳＡＳＡＧ（配列番号３）、ＳＡＳＡＳＡＳＡＧ（配列番号４）等が挙げられる。また、上記（１）に示すアミノ酸配列の具体例として、ＳＡＳＡ（配列番号４）、ＳＡＳＡＳＡ（配列番号５）、ＳＡＳＡＳＡＳＡ（配列番号６）等が挙げられる。配列番号１～６に示すアミノ酸配列から成る合成ペプチドはいずれも細胞膜透過性を発揮し得る。
　なお、ここで開示される合成ペプチドは、細胞膜透過性を著しく損なわない限りにおいて、上記（１）または（２）に示されるアミノ酸配列の改変配列であり得る。ここで、「改変配列」とは、１個または数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列（改変アミノ酸配列）である。
　本明細書における改変配列の典型例としては、例えば、１個、２個または３個のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列や、所定のアミノ酸配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等が挙げられる。同類置換の典型例としては、例えば、非極性アミノ酸であるアラニン残基がグリシン残基等の他の非極性アミノ酸残基に置換した配列等が挙げられる。
　以上説明したここで開示される合成ペプチドは、細胞膜透過性を有し得るため、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内（さらには、核内）に目的とする外来物質を導入することができ得る。そのため、本開示では、ここで開示される合成ペプチドを備える外来物質導入用構築物が提供される。
　ここで開示される構築物は、上述したここで開示される合成ペプチドと、該合成ペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質とを有している。
　ここで開示される構築物は、上記合成ペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に、所望する外来物質を直接的または適当なリンカーを介して間接的に結合（連結）することによって、設計・構築され得る。
　リンカーは、特に限定されるものではないが、ペプチド性リンカーであってもよく、非ペプチド性リンカーであってもよい。特に限定されるものではないが、ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸配列は立体障害を生じさせず、かつ、柔軟なアミノ酸配列であることが好ましい。ペプチド性リンカーは、例えば、グリシン、アラニン、およびセリン等から選択されるアミノ酸残基を１種または２種以上含む、１０個以下（より好ましくは１個以上５個以下、例えば１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸残基）のアミノ酸残基からなるリンカーであり得る。また、かかるリンカーとして、βアラニンを用いてもよい。非ペプチド性リンカーとしては、特に限定されるものではないが、例えばアルキルリンカー、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカー、アミノヘキサノイルスペーサ等を用いることができる。
　外来物質は、例えば、ポリペプチド、核酸、色素、薬剤等の有機化合物であり得る。
　外来物質がポリペプチドである場合には、該ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、上記合成ペプチドを構成するアミノ酸配列とを含むようにペプチド鎖を設計し、該ペプチド鎖を生合成あるいは化学合成することによって、目的の外来物質導入用構築物を作製することができる。また、種々のＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸、色素（例えばＦＡＭやＦＩＴＣ等の種々の蛍光色素化合物）、あるいは薬剤（例えば５－フルオロウラシル（５ＦＵ）等の核酸系抗腫瘍剤を含む抗腫瘍剤やアジドチミジン（ＡＺＴ）等の抗ウイルス剤等）として機能する有機化合物を従来公知の種々の科学的手法により、上述した合成ペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に直接的もしくは間接的に結合させて構築物を調製することができる。
　特に限定するものではないが、外来物質が有する機能は、例えば、幹細胞の分化誘導の促進（幹細胞分化誘導活性）、腫瘍細胞の増殖抑制（抗腫瘍活性）、ウイルス感染細胞の増殖抑制（抗ウイルス活性）等であり得る。
　ここで開示される構築物において、上記合成ペプチドと結合する外来物質の数は特に限定されない。例えば、１の合成ペプチドに対して１又はそれ以上の外来物質を結合させてもよい。特に限定するものではないが、例えば、１の合成ペプチドのＣ末端側にポリペプチド、核酸、薬剤等を結合させておき、Ｎ末端側に色素を結合させてもよい。合成ペプチドに色素を結合させることにより、構築物の真核細胞への導入効率および細胞内における局在を評価することが容易となるため好ましい。
　なお、外来物質がポリペプチドの場合、採用するポリペプチド（アミノ酸配列）は、特に限定されない。例えばアミノ酸残基数が１００～１０００程度のポリペプチド若しくはタンパク質のような、比較的アミノ酸残基数が多いものも外来物質として採用し得る。
　典型的には、外来物質導入用構築物として作製する合成ペプチドを構成する総アミノ酸残基数は、数個乃至数十個以上（例えば１０以上）であって、１０００以下が適当であり、好ましくは６００以下であり、さらに好ましくは５００以下であり、特に３００以下（例えば１０～３００）が好適である。このような長さのポリペプチドは合成（生合成、化学合成）が容易であり、使用しやすい。
　外来物質としては、種々の細胞や組織（器官）の発生、分化、増殖、がん化、ホメオスタシス（恒常性）、代謝の調節、等の機能にかかわるポリペプチドの成熟型あるいは前駆体（プロ型、プレプロ型を包含する。）が好ましい。また、機能が従来知られていないポリペプチドを細胞内に導入して当該ポリペプチドの細胞内（生体組織内）における機能の解明のために、ここに開示される外来物質導入方法を実施することもできる。
　例えば、外来物質の導入する対象となる真核細胞がヒト又はその他哺乳動物の幹細胞である場合、当該幹細胞の分化誘導に関与する種々の生理活性を有するポリペプチドの成熟型またはその前駆体の利用が好ましい。なお、「幹細胞」は、体性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells：ｉＰＳ細胞）を包含する。また、外来物質の導入する対象となる真核細胞ががん細胞（腫瘍細胞）である場合、当該がん細胞（腫瘍細胞）のアポトーシス誘導に関与する種々のポリペプチドの利用が好ましい。あるいは、この場合においては、がん細胞（腫瘍細胞）が免疫監視機構の機能を抑制することを阻害し得るポリペプチドの利用が好ましい。さらに、導入の対象となる真核細胞が細菌感染細胞やウイルス感染細胞である場合、当該感染細胞のアポトーシス誘導に関与する種々のポリペプチドや、当該感染細胞において細菌もしくはウイルスが増殖することを抑制し得るポリペプチドや、当該感染細胞から細菌もしくはウイルスの感染が拡大することを抑制し得るポリペプチドの利用が好ましい。
　なお、合成ペプチドと同様、外来物質としてのポリペプチドは、その機能を保持する限りにおいて、１個または数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成される改変アミノ酸配列を含んでいてもよい。
　合成ペプチドのＣ末端側に外来物質が結合している構築物では、合成ペプチドのＮ末端側のアミノ酸残基のα－アミノ基がアセチル化されていることが好ましい。詳細なメカニズムは不明だが、真核細胞中のタンパク質の多くはＮ末端側のアミノ酸のα－アミノ基はアセチル化修飾されるため、このような構成であれば、構築物の細胞内での安定性が向上し得る。
　構築物は、Ｃ末端側のアミノ酸残基がアミド化されていることが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基をアミド化すると、かかる構築物の細胞質内および核小体内における構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）が向上し得る。また、カルボキシル基がアミド化されることで、構築物の親水性が向上するため、かかる構築物の水系溶媒への溶解性を向上させることができる。かかる水系溶媒としては、例えば、水、種々の緩衝液、生理食塩水（例えばＰＢＳ）、細胞培養液等が挙げられる。
　例えば、合成ペプチドのＮ末端側に外来物質が結合している構築物の場合、合成ペプチドのＣ末端側のアミノ酸残基のカルボキシル基がアミド化されていることが好ましい。また、例えば外来物質がポリペプチドであり、かかるポリペプチドが合成ペプチドのＣ末端側に結合している場合は、当該ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基をアミド化することが好ましい。
　構築物のうちペプチド鎖（外来物質として構成されるポリペプチド、合成ペプチドおよびペプチド性リンカーを包含する）の比較的短いものは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。即ち、市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｎ末端アセチル化、Ｃ末端アミド化等）部分を有する上記ペプチド鎖を合成することができる。なお、上記方法でペプチド鎖の一部のみを合成してもよく、例えば、合成ペプチドのみ、または、合成ペプチドとペプチド性リンカー部分とを含むペプチド鎖を合成し得る。
　或いは、遺伝子工学的手法に基づいてペプチド部分を生合成により作製してもよい。即ち、所望するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
　一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチド部分を単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のペプチド部分を得ることができる。
　なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本技術を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
　例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（即ち設計した人工ポリペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、目的の構築物（人工ポリペプチド）を製造することができる。
　或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち、構築物のペプチド部分のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド部分の合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロで合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能）が市販されている。
　構築物のペプチド部分をコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。即ち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、かかるアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
　こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
　ここで開示される構築物は、外来物質の機能に基づく用途の組成物の有効成分として好適に使用し得る。なお、構築物は、外来物質の機能を失わない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸または有機酸を付加反応させることにより得られ得る酸付加塩を使用することができる。従って、本明細書および請求の範囲に記載の「構築物」は、かかる塩形態のものを包含し得る。
　構築物は、使用形態に応じて医薬（薬学）上許容され得る種々の担体を含み得る組成物の有効成分として使用され得る。
　上記担体としては、例えば、希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。かかる担体としては、外来物質導入用構築物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。また、かかる担体は、適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得、或いはリポソームであってもよい。また、医薬用組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
　組成物の形態は、特に限定されない。例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏などの形態が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水または適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
　構築物（主成分）および種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本技術を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。
　なお、ここで開示される合成ペプチドは、塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸を含まないため、従来のＣＰＰでは電荷等の問題で組み合わせが困難であった外来物質を備えた構築物を作製でき得る。
　また、ここで開示される構築物を用いて、生体内（インビボ）、または、生体外（インビトロ）において外来物質を導入することができ得る。その導入方法は、おおまかにいって、ここで開示される構築物を用意する工程（用意工程）と、該構築物を目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程（供給工程）とを包含し得る。また、さらに、上記供給工程の後に、上記構築物が供給された試料をインキュベートして、該試料中の真核細胞内にかかる構築物を導入する工程（導入工程）を含み得る。
　上記「真核細胞」は、インビボにおいては、例えば種々の組織、臓器、器官、血液、およびリンパ液等を包含する。上記「真核細胞」は、インビトロにおいては、例えば生体から摘出された種々の細胞塊、組織、臓器、器官、血液、およびリンパ液ならびに、セルライン等を包含する。
　ここで開示される構築物を含む組成物は、インビボにおいて、その形態および目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者（即ち生体）の患部（例えば悪性腫瘍組織、ウイルス感染組織、炎症組織等）に所望する量だけ投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを、直接所定の組織（即ち、例えば腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、炎症細胞等を含む組織や器官等の患部）に投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。経口投与の場合は、消化管内での消化酵素分解を抑止すべくカプセル化や保護（コーティング）材の適用が好ましい。
　あるいは、生体外（インビトロ）において培養している真核細胞に対し、構築物の適当量を、少なくとも１回、目的とする真核細胞の培養液に供給するとよい。１回当たりの供給量および供給回数は、培養する真核細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。例えば、培養液中の合成ペプチド濃度が概ね０．０５μＭ以上１００μＭ以下の範囲内、例えば０．５μＭ以上５０μＭ以下の範囲内、また例えば１μＭ以上３０μＭ以下の範囲内となるように１回、２回またはそれ以上の複数回添加することが好ましい。また、構築物添加後のインキュベート時間についても、真核細胞の種類及び各種条件により異なり得るため特に限定されない。例えば、０．５時間以上、１時間以上、４時間以上、８時間以上、２０時間以上であり得る。なお、インキュベートの条件についても、真核細胞の種類により異なり得るため、特に限定されるものではないが、例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃下でインキュベートすることができる。
　なお、インビトロにおける導入方法について、一例を後述の試験例において示している。
　構築物の導入効率を評価する方法は、特に限定されない。例えば、該構築物に色素（典型的には蛍光色素化合物）が結合している場合には、顕微鏡観察（例えば蛍光顕微鏡観察）やフローサイトメトリー等を使用して、真核細胞への導入効率を評価することができる。また、上記構築物のペプチド部分を特異的に認識する抗体を用いた免疫化学的手法（例えばウエスタンブロットや免疫細胞染色等）によっても上記構築物の導入効率を評価し得る。
　以上の通り、ここで開示される技術の具体的な態様として、以下の各項に記載のものが挙げられる。
項１：真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入可能な合成ペプチドであって、
　以下のアミノ酸配列：
（１）ＳＡ（セリン残基－アラニン酸残基）を最小構成単位として、該最小構成単位が２以上直列に連続して結合されたアミノ酸配列；および
（２）上記（１）のアミノ酸配列のＣ末端側にグリシン残基が１～３個結合したアミノ酸配列；
のいずれかから成る、合成ペプチド。
項２：上記（１）および上記（２）のアミノ酸配列が、上記最小構成単位を２以上４以下有する、項１に記載の合成ペプチド。
項３：真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入可能な合成ペプチドであって、
　以下のアミノ酸配列：
　　ＳＡＳＡＧ（配列番号１）；
　　ＳＡＳＡＳＡＧ（配列番号２）；および
　　ＳＡＳＡＳＡＳＡＧ（配列番号３）；
のいずれかから成る、合成ペプチド。
項４：真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入するために作製された外来物質導入用構築物であって、
　項１～３のいずれか一項に記載の合成ペプチドと、
　上記合成ペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した上記目的の外来物質と、
を有する構築物。
項５：上記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群から選択される少なくとも１種の有機化合物である、項４に記載の構築物。
項６：上記外来物質が、上記合成ペプチドのＣ末端側に配置されている、項４または５に記載の構築物。
　なお、上記項３は、項１または２で特定される事項を備えた具体例を示しているため、項３は項１または２に従属し得る。
　以下、ここで開示される技術に関するいくつかの試験例を説明するが、ここで開示される技術をかかる試験例に示すものに限定することを意図したものではない。
［試験１］
＜構築物の作製＞
　表１に示すアミノ酸配列で構成された合成ペプチドを有する構築物を用意した。表１に示すペプチドｎ（ｎは１～３の自然数）を有する構築物をサンプルｎとして、ユーロフィンジェノミクス株式会社からサンプル１～３を得た。なお、サンプル１～３において、ペプチド１～３のＮ末端側のアミノ酸残基のα－アミノ基はいずれもアセチル化されたものを準備した。また、ペプチド１～３のＣ末端側のアミノ酸残基に、外来物質として蛍光色素であるＦＡＭ（Ｃ２１Ｈ１２Ｏ７：5(6)-Carboxyfluorescein、分子量３７６．３、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）が結合したものを準備した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜フローサイトメトリーによる細胞膜透過性評価＞
　真核細胞としてＮＳＣ－３４細胞（mouse motor neuron-like hybrid cell line）を使用し、ペプチド１～３の細胞膜透過性を解析した。ＮＳＣ－３４細胞の培養培地には、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）含有ＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium（富士フィルム和光純薬株式会社製、Cat No. 044-29765））を使用した。また、サンプル１～３をそれぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、サンプル濃度が４ｍＭのサンプル溶液１～３をそれぞれ調製した。さらに、当該サンプル溶液を上記培養培地で希釈し、４０μＭのサンプル溶液１～３をそれぞれ調製した。例１～３では、上記調製したサンプル溶液１～３をそれぞれ用い、参考例１では、ＦＡＭ溶液を用いた。
（例１）
　ＮＳＣ－３４細胞を上記培養培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。市販の６穴（ウェル）プレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製）のウェルに当該細胞懸濁液を１ｍＬ加えて、ＮＳＣ－３４細胞が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう播種した。次に、ウェルに４０μＭのサンプル溶液１を１ｍＬ加え、ウェル中の培養培地中のサンプル濃度が２０μＭとなるようにした。その後、当該６ウェルプレートを細胞培養装置に静置し、５％ＣＯ２条件下で、３７℃で２０時間インキュベートした。
　２０時間のインキュベート後、ウェルから培養上清を取り除き、１ｍＬのＰＢＳでウェル中の細胞を２回洗浄した。次に、ウェルに１００μＬの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加し、３７℃中で３分間インキュベートを行った。該インキュベート後、ウェルに９００μＬの上記培養培地を添加することでトリプシンを不活性化した後、ウェル中の細胞懸濁液をチューブに移し、細胞を回収した。このチューブを４℃、２１０×ｇの条件で５分間遠心分離を行った。遠心分離後、上清を取り除き、沈殿（細胞ペレット）を１ｍＬのＰＢＳで懸濁（洗浄）し、上記と同じ条件で遠心分離を行った。この操作を２回繰り返した後、上清を取り除き、サンプル１含有の培養培地で培養した細胞（細胞ペレット）を得た。
　上記得られた細胞（細胞ペレット）について、フローサイトメータを用いてサンプル１の細胞膜透過性の解析を行った。フローサイトメータとして、Ｏｎ－Ｃｈｉｐ　Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ(On-Chip Biotechnologies Co., LTD.）製）を使用した。
　かかる解析のために、上記得られた細胞ペレットを１００μＬのＯｎ－Ｃｈｉｐ　Ｔ　ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、解析用の細胞懸濁液を用意した。
　上記のフローサイトメータを用いて前方散乱（ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳＣ）および側方散乱（ｓｉｄｅ　ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳＣ）に基づくゲーティングを行い、解析対象とする細胞集団についてのゲートを設定し、かかるゲート内の細胞集団について、蛍光強度を測定した。なお、該細胞集団の細胞数が少なくとも１００００個以上となるように解析を行った。蛍光強度の測定には、ＦＡＭの蛍光波長を検出可能な上記フローサイトメータの蛍光検出器ＦＬ２（最適検出波長５４３ｎｍ付近）を使用した。かかる測定結果について、市販の解析ソフト「ＦｌｏｗＪｏ」（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いて解析を行い、測定対象細胞集団の蛍光強度の値（ｍｅａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）を得た。
（例２～３）
　サンプル溶液１を上記調製したサンプル溶液２～３のいずれかに変更した以外は例１と同様に実施した。なお、各例で使用したサンプル（構築物）は表２のとおりである。
（参考例１）
　サンプル１の代わりに蛍光色素ＦＡＭとした以外は例１と同様に実施した。なお、ＦＡＭ含有の培養培地におけるＦＡＭ濃度は、例１におけるサンプル１の濃度と同じになるように用いた（即ち、ウェル中の培養培地のＦＡＭ濃度が２０μＭ）。
　例１～３および参考例１について得られた結果を表２および図１に示す。図１は、各例におけるＭＦＩの値を示すグラフである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２および図１に示すように、例１～３は、参考例１よりもＭＦＩの値が高かった。即ち、ＦＡＭを単独加えた場合（参考例１）よりも、ＦＡＭにペプチド１～３のいずれかを結合したサンプル１～３の方が細胞内により多く導入された。このことから、ペプチド１～３は、細胞膜透過性を有していることがわかる。
　以上、ここで開示される技術の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、請求の範囲を限定するものではない。請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
　ここで開示される技術によると、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部から細胞質内に目的とする外来物質を導入可能なキャリアペプチドフラグメント及び該キャリアペプチドフラグメントを有する構築物が提供される。かかる構築物を利用することにより、目的の細胞に目的の外来物質を効果的に導入させ、該外来物質が導入された細胞並びに器官等の生体組織を得ることができる。また、ここで開示されるキャリアペプチドフラグメントをドラッグデリバリー技術に利用し、各種疾患に対する治療薬を提供することができ得る。

Claims (6)

  1. 　真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入可能な合成ペプチドであって、
    　以下のアミノ酸配列：
    （１）ＳＡ（セリン残基－アラニン酸残基）を最小構成単位として、該最小構成単位が２以上直列に連続して結合されたアミノ酸配列；および
    （２）前記（１）のアミノ酸配列のＣ末端側にグリシン残基が１～３個結合したアミノ酸配列；
    のいずれかから成る、合成ペプチド。
  2. 　前記（１）および前記（２）のアミノ酸配列が、前記最小構成単位を２以上４以下有する、請求項１に記載の合成ペプチド。
  3. 　以下のアミノ酸配列：
    　　ＳＡＳＡＧ（配列番号１）；
    　　ＳＡＳＡＳＡＧ（配列番号２）；および
    　　ＳＡＳＡＳＡＳＡＧ（配列番号３）；
    のいずれかから成る、合成ペプチド。
  4. 　真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入するために作製された外来物質導入用構築物であって、
    　請求項１～３のいずれか一項に記載の合成ペプチドと、
    　前記合成ペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した前記目的の外来物質と、
    を有する構築物。
  5. 　前記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群から選択される少なくとも１種の有機化合物である、請求項４に記載の構築物。
  6. 　前記外来物質が、前記合成ペプチドのＣ末端側に配置されている、請求項４に記載の構築物。
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