JP6655011B2 - 細胞の多核化を誘導するペプチドおよびその利用 - Google Patents

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Description

本発明は、対象細胞を多核化し得る合成ペプチドとその利用に関する。詳しくは、該ペプチドを含む多核化誘導剤（薬学的組成物）ならびに該ペプチドを使用した多核化誘導方法に関する。
なお、本出願は２０１４年６月２３日に出願された日本国特許出願２０１４−１２８４３１号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
ヒトの体を構成する細胞の多くは、通常、１つの細胞内に１つの核を有する細胞（即ち単核細胞）であるが、ある種の細胞では一つの細胞内に複数の核を有すること（即ち多核細胞）が知られている。
生体内に通常存在する多核細胞（多核細胞の形態で正常な機能を発揮する細胞）の例として、巨核球や破骨細胞が挙げられる。破骨細胞は造血幹細胞から分化した多核細胞であって、古い骨組織を破壊（骨吸収）する役割を担う細胞であり、骨の再構築（骨リモデリング）や骨の成長に関与する（非特許文献１）。また、上記骨吸収により骨中のカルシウムを血液中に供給することで、血中カルシウム濃度の調整（恒常性の維持）にも関与する（非特許文献２）。巨核球は、造血幹細胞から分化した多核細胞であり、血小板を産生する役割を担う細胞である。
ところで、血小板とは、血液凝固および止血のために必須の血液成分（血液中の細胞成分）であり、白血病、骨髄移植、外科的手術等において需要が高い。現在、血小板の投与が必要な患者に対する血小板輸血の多くには、献血による血液製剤（血小板製剤）が用いられる。しかし、輸血用の血小板（血小板製剤）は採血後の保存期間（有効期間）が短いことや、献血ドナーの減少から、その供給が不安定になりがちである。そこで、生体（例えば患者）由来、あるいは誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、induced pluripotent stem cellともいう）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞、embryonic stem cellともいう）あるいは造血幹細胞等の幹細胞由来の細胞（例えば巨核球の前駆細胞）から血小板産生性の巨核球を産生する技術および該巨核球から血小板を産生する技術は、献血に依存しない血小板（血小板製剤）の安定供給に重要な技術として期待されている。これに関する技術として、例えば、特許文献１には、特定遺伝子を強制発現することで不死化した巨核前駆細胞株を樹立する技術について記載されている。また、特許文献２には、インビトロにおける巨核球からの機能的な血小板（止血作用など生体内における活性を保持している血小板）の産生量向上のために、特定遺伝子を強制発現させることでより巨核球の多核化を促進する技術について記載されている。
また、腫瘍細胞（がん細胞）の一つの特徴として、正常細胞に比べて細胞分裂が活発であり細胞増殖速度が著しく高いことが挙げられる。従って、腫瘍細胞の死滅若しくは増殖阻害を目的とする抗がん剤の多くは、腫瘍細胞(がん細胞)の細胞分裂を阻害する薬剤が使用されている。このような細胞分裂を阻害する薬剤として、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管作用薬等が挙げられる。アルキル化剤はＤＮＡに作用して二重鎖の塩基どうしを架橋する作用機序、５−ＦＵ等の代謝拮抗剤はＤＮＡ合成を阻害する作用機序、微小管作用薬は微小管の重合または脱重合の阻害により有糸分裂を阻害する作用機序により、それぞれ腫瘍細胞(がん細胞)の細胞分裂を阻害する。現在までに多くの抗がん剤（抗腫瘍組成物）が開発されたが、より効果が高く副作用のリスクが低い薬剤、或いは高効果かつ安価な薬剤等に対する要求は依然として高い。例えば、腫瘍細胞を人為的且つ積極的に多核化させることにより当該腫瘍細胞の細胞分裂を阻害することができれば、新たな抗がん技術（抗がん剤）として利用することができる。
上述した例のように、巨核球、破骨細胞等の生体内において高度に専門化された役割を果たす多核細胞を人為的に産生し得る技術、あるいは、腫瘍細胞（がん細胞）の多核化による細胞分裂阻害を実現する技術の確立は、再生医療あるいはがん治療において重要な一つの課題であり得る。
国際公開第２０１１／０３４０７３号 国際公開第２０１２／１５７５８６号 国際公開第２００９／０９３６９２号
クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）、４５巻（８号）、１９９９年、ｐｐ．１３５３−１３５８ バイオファクター（Biofactors）、３７巻（３号）、２０１１年、ｐｐ．１５９−１６７ カレント・バイオロジー（Current Biology）、１２巻、２００２年、ｐｐ．１２８７−１２９２
そこで本発明は、対象とする細胞を人為的に多核化させ得る技術の開発を課題として創出されたものであり、具体的には、人為的に合成可能な比較的短い鎖長のペプチドであって、対象細胞に対して多核化を誘導する目的に資する人工ペプチドの提供を目的とする。また、そのようなペプチドを含む多核化誘導剤（薬学的組成物）の提供を他の目的とする。また、そのようなペプチドを使用して対象細胞に多核化を誘導する方法の提供を目的とする。
本発明者らは、対象細胞に対して多核化を誘導する目的に資するべく種々のペプチドの研究を鋭意推進した。そして、驚くべきことに、配列番号１または２に示すアミノ酸配列を含むように合成したペプチドを対象細胞に供給することで、当該細胞を多核化させ得る或いは多核化を促進し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明者らは、腫瘍細胞に対して多核化を誘導することによって、正常な細胞分裂が阻害され、対象（標的）とする腫瘍細胞（がん細胞）の増殖を阻止若しくは抑制し得ることを確認した。
本発明によると、上記目的を実現すべく、対象細胞に供給された際（典型的には該細胞を培養している培地に添加された際）に、該細胞を多核化させ得る或いは該細胞の多核化を促進し得る能力（以下、「多核化誘導活性」ともいう）を有することで特徴付けられる人為的に合成されたペプチドが提供される。
即ち、ここで開示される合成ペプチドは、そのペプチド鎖中に、以下の（Ａ）および（Ｂ）のアミノ酸配列：
（Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列；および
（Ｂ）少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する活性を有する多核化誘導性ペプチド配列を構成するＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１）またはＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号２）のいずれかで表されるアミノ酸配列、若しくは、該アミノ酸配列のうちの１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加された改変アミノ酸配列であって、少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する活性を有する多核化誘導性ペプチド配列を構成する改変アミノ酸配列；
を有することを特徴とする少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する活性を有する人為的に合成されたペプチドである。
なお、本明細書において、多核化誘導性ペプチド配列および膜透過性ペプチド配列を含む合成ペプチド（上記改変アミノ酸配列からなるペプチドを含む）、即ち多核化誘導活性を有する合成ペプチドを「多核化誘導性合成ペプチド」とも呼称する。
ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、ペプチド鎖中に上記（Ｂ）に示すとおりの多核化誘導性ペプチド配列を有することを特徴とする。このことにより、該合成ペプチドを対象（標的）とする細胞（典型的には当該細胞を培養する培地中）に供給することにより、該対象細胞に対して多核化を誘導する又は多核化を促進することができる。また、かかる多核化誘導性合成ペプチドは、ペプチド鎖中に上記（Ａ）に示すとおりの膜透過性ぺプチド配列を有するため、該ペプチドを対象（標的）とする細胞（典型的には当該細胞を培養する培地中）に供給することにより、上記多核化誘導性ペプチド配列を該真核細胞の外部(細胞膜の外側)から細胞内に高効率に移送することができる。また、合成ペプチドの供給によって対象細胞に対して多核化を誘導し得るため、遺伝子導入に起因するゲノムへの外来遺伝子の挿入の心配がない。このように、ここで開示される技術によると、対象（標的）とする細胞（典型的には当該細胞を培養する培地中）に多核化誘導性合成ペプチドを供給するという簡易な処理方法による対象細胞の多核化誘導を実現することができる。
また、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造することができる。このような多核化誘導性合成ペプチドを用いると、サイトカインに代表される高価な液性因子等を大量に使用することなく（典型的には液性因子等の代替物として）対象細胞を多核化させることができるため、対象（標的）細胞の多核化誘導を低コストで実現することができる。さらに、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、単純な構造（典型的には直鎖状のペプチド鎖）であり、構造安定性が高いため、取扱い性に優れる。
ここで開示される合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）の好ましい一態様では、上記（Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列は、配列番号３〜１１のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列、若しくは、該アミノ酸配列のうちの１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加された改変アミノ酸配列であって膜透過性ペプチド配列を構成する改変アミノ酸配列であることを特徴とする。
配列番号３〜１１に示すアミノ酸配列はいずれも膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列の典型例であり、上記（Ａ）に示す膜透過性ペプチド配列として好適に採用することができる。なかでも、タンパク質を核内の核小体へ局在させるシグナル配列であり核小体局在シグナル（ＮｏＬＳ：Nucleolar localization signal）として知られるいずれかのアミノ酸配列（典型的には配列番号３〜６に示すアミノ酸配列）を採用することが好ましい。特に、配列番号３に示すアミノ酸配列から構成される膜透過性ペプチド配列は、上記ＮｏＬＳの典型例であり、多核化誘導性ペプチド配列を細胞内へ移送する効率の観点から特に好ましい。
また、ここで開示される好ましい一態様の合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）は、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸配列が３０以下であることを特徴とする。このような短いペプチド鎖からなるペプチドは化学合成が容易であり、且つ、比較的製造コストが安価で取扱性に優れる。このため、例えば多核化誘導剤の成分として好ましく使用し得る。
また、ここで開示される合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）の好ましい一態様では、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１２）；および
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号１３）；
のうちのいずれかを有することを特徴とする。
このような多核化誘導性合成ペプチドは、特にヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の細胞に対して多核化を誘導する用途に好適である。
また、本発明は、他の側面として、少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導するために用いられる多核化誘導剤であって、ここで開示されるいずれかの態様の多核化誘導性合成ペプチドと、薬学的に許容可能な担体（例えば上記ペプチドの安定性向上に資する少なくとも１種の基材、或いは生理食塩水や各種の緩衝液等の液状媒体）を含む、多核化誘導剤（薬学的組成物）を提供する。
かかる構成の組成物によると、上記多核化誘導性ペプチド配列を有する合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）を含むため、該組成物（該多核化誘導性合成ペプチド）を対象（標的）とする細胞（典型的には当該細胞を培養する培地中）に供給することにより、該対象細胞の多核化を誘導すること（多核化を促進すること）ができる。
また、ここで開示される多核化誘導剤は、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞を多核化させる目的で好適に使用される。特に好ましい対象細胞として、悪性腫瘍細胞（がん細胞）、例えば扁平上皮癌の細胞や腺癌の細胞が挙げられる。
ここで開示される多核化誘導剤により腫瘍細胞に多核化を誘導することで、該多核化された細胞（多核化細胞）の細胞分裂が阻害され、その結果、腫瘍細胞の増殖を阻止若しくは抑制することができる。換言すると、ここで開示される多核化誘導剤は、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞の増殖を抑制するための組成物として使用することができる。即ち、ここで開示される多核化誘導剤は、対象の腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果を発揮し得るため、抗腫瘍組成物（抗がん剤）として好適に使用することができる。
また、本発明は、他の側面として、少なくとも１種の真核細胞をインビボ（in vivo）又はインビトロ（in vitro）において多核化させる方法を提供する。
好ましい一態様は、インビトロにおいて、少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する方法であって、
インビトロにおいて対象の細胞を含む細胞培養物を準備すること、当該細胞培養物中に、ここで開示されるいずれかの態様の多核化誘導性合成ペプチド（あるいは該合成ペプチドを含む多核化誘導剤）を少なくとも１回供給すること、および、該ペプチドを供給した上記細胞培養物を培養すること、を含む多核化誘導方法である。
かかる多核化誘導方法によると、上述のとおり単純な構成の合成ペプチド（あるいは該合成ペプチドを含む多核化誘導剤）を多核化誘導因子として使用するという簡易な方法によって、目的の細胞（および該細胞からなる組織体）に対して効率的に多核化を誘導すること（多核化を促進すること）ができる。
ここで開示される上記多核化誘導方法は、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞の多核化誘導の目的に好適に実施することができる。ここで開示される多核化誘導方法によると、特に、悪性腫瘍細胞（がん細胞）、例えば扁平上皮癌由来の細胞や腺癌由来の細胞の多核化誘導を容易に実現することができる。即ち、ここで開示される多核化誘導方法により、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞の細胞分裂を阻害し、かかる細胞の増殖を阻止もしくは抑制することができる。したがって、ここで開示される多核化誘導方法は、腫瘍（がん）の治療方法として利用することができる。
ここで開示される多核化誘導性合成ペプチド（あるいは該ペプチドを含む多核化誘導剤）は、多核細胞および多核化前のプレ多核細胞（例えば多核化前の巨核芽球や多核化前の破骨前駆細胞等）に対して多核化を誘導する目的で好適に使用することができる。これにより、多核細胞中の核数の増大（多核化の促進）や多核細胞（例えば巨核球や破骨細胞等）の生産（製造）を実現することができる。
換言すれば、多核細胞および多核化前のプレ多核細胞を対象にここで開示される多核化誘導性合成ペプチドを供給することを特徴とする多核化誘導方法を実施することにより、十分に多核化が誘導（促進）された多核細胞（例えば巨核球や破骨細胞等）を生産（製造）することができる。かかる方法によると、上述のとおり単純な構成の合成ペプチド（即ち、該合成ペプチドを含む多核化誘導剤）を多核化誘導因子として使用するという簡易な方法によって多核細胞を生産（製造）することができるため好ましい。
或いはまた、ここで開示される方法（典型的にはインビトロでの多核化誘導方法）により生産（製造）した多核細胞（例えば巨核球や破骨細胞等）や、該多核細胞より産生される細胞（例えば血小板）および生合成物（例えば分泌タンパク質やホルモン等の生理活性物質等）を再生医療に用いる細胞資源として用いることができる。例えば、ここで開示される方法により生産（製造）した巨核球（即ち、十分に多核化が進んだ巨核球）は、移植用（典型的には骨髄移植用）細胞やインビトロで血小板を産生するための培養細胞株として利用し得る。また、ここで開示される方法で生産（製造）した巨核球より産生される血小板を用いることで、血小板製剤（血液製剤）を製造することができる。これにより、献血に依存しない血小板（血小板製剤）の供給が実現可能となる。
図１は、ＨｅＬａＳ３細胞の培養液に一実施例に係る多核化誘導性合成ペプチド（サンプル１）を添加して培養した後の当該ＨｅＬａＳ３細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した細胞免疫染色法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図２は、ＨｅＬａＳ３細胞の培養液に一実施例に係る多核化誘導性合成ペプチド（サンプル２）を添加して培養した後の当該ＨｅＬａＳ３細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した細胞免疫染色法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図３は、ＨｅＬａＳ３細胞の培養液に一比較例として膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列のみで構築した合成ペプチド（サンプル３）を添加して培養した後の当該ＨｅＬａＳ３細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した細胞免疫染色法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図４は、ＨｅＬａＳ３細胞を多核化誘導性合成ペプチド無添加で培養した後の当該ＨｅＬａＳ３細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した細胞免疫染色法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示される合成ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬学的組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
本明細書において「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物（例えば対象の細胞に対して多核化を誘導させ得る多核化誘導剤）中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下（好ましくは５０以下、より好ましくは３０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能（例えば上記多核化誘導性合成ペプチドが有する多核化誘導活性や膜透過性ペプチドが有する細胞外から細胞内への移行能）を損なうことなく、１個又は数個（典型的には１〜５個、例えば１個、２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列：例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には１〜５個程度、例えば１個、２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。従って、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドには、各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号に示すアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸残基が置換（例えば上記同類置換）、欠失及び／又は付加したアミノ酸配列で構成される合成ペプチドであって、同様に多核化誘導活性を示す合成ペプチドを包含する。
本明細書において「腫瘍」とは、広義に解釈される用語であり、癌腫及び肉腫或いは血液や造血組織の病変（白血病、リンパ腫等）を含む腫瘍一般（典型的には悪性腫瘍）をいう。また、「腫瘍細胞」とは、そのような腫瘍を形成する細胞をいう。典型的には周辺の正常組織とは独立して異常に増殖を行うに至った細胞（所謂がん化した細胞）をいう。従って、特別に規定しない限り、正常細胞ではなく腫瘍細胞（がん細胞）に区分される細胞であれば、該細胞の起源や性状に関わりなく腫瘍細胞と呼称される。上皮性腫瘍（扁平上皮癌、腺癌等）、非上皮性腫瘍（各種の肉腫、骨肉腫等）、各種の細胞腫（神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫等）、リンパ腫、メラノーマ、等を構成する細胞は、ここでいう腫瘍細胞に包含され得る。
本明細書において「多核細胞」とは、生体内において、通常複数（典型的には２個以上、例えば４個以上）の核を有する細胞として存在する細胞を意味する用語、即ち、生体内での正常な形態が複数の核を有する形態である細胞を意味する用語である。例えば、巨核球、破骨細胞、骨格筋細胞、胎盤の絨毛に存在する合胞体性栄養膜細胞、マクロファージ由来の食細胞である異物巨細胞等が挙げられる。
また、本明細書において「多核化前のプレ多核細胞」とは、多倍体化していない多核細胞をいい、典型的には単核の細胞（有糸分裂期（Ｍ期）に２核となる細胞を含む）をいう。多核化前のプレ多核細胞の具体例として、巨核球の前駆細胞（巨核芽球）、破骨細胞の前駆細胞（破骨前駆細胞）、等が例示される。
本明細書において、「多核化を誘導する」又は「多核化を促進する」とは、多核化を誘導（促進）する前の細胞と比較して、細胞内の核の数を相対的に増大させることをいう。例えば、単核の細胞から２個以上（典型的には４個以上、例えば８個以上）の核を有する細胞を得ること、あるいは、多核細胞内の核数を増大させることを多核化の誘導（促進）ということができる。また、典型的に、細胞内の核数が増大するに伴い倍数性が高くなるので、「多核化を誘導（促進）する」ことを、多核化誘導前の細胞よりも相対的に倍数性が増大させることとして把握することもできる。例えば、染色体数が２Ｎの細胞に本発明を適用することで４Ｎ以上（典型的には８Ｎ以上、例えば１６Ｎ以上）の染色体数を有する細胞を得ることを多核化の誘導（促進）ということができる。
ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、所定の真核細胞（典型的には、ヒトもしくはヒト以外の哺乳類、鳥類、あるいはその他の動物由来の細胞）の培養細胞に供給された際（典型的には該細胞を培養している培地中に添加される）に該細胞に対して多核化を誘導し得る或いは多核化を促進し得る（即ち細胞中の核数を増大させ得る）という作用、即ち多核化誘導活性を有することが、本発明者らによって初めて見出された合成ペプチド（即ち多核化誘導性合成ペプチド）である。また、ここで開示される多核化誘導剤は、対象の細胞に対して多核化を誘導（促進）し得る組成物（薬学的組成物）であり、上記多核化誘導性合成ペプチドの少なくとも１種を有効成分（即ち対象細胞の多核化誘導に関与する物質）として含むことで特徴付けられる。
上述のとおり、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、部分アミノ酸配列（ペプチドモチーフ）として、上記（Ａ）で規定される膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列と、上記（Ｂ）で規定される多核化誘導性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列とを有する。
多核化誘導性合成ペプチドの（Ｂ）多核化誘導性ペプチド配列は、多核化誘導活性を有する配列であり、（Ａ）膜透過性ペプチド配列と組み合わせることにより、良好な多核化誘導活性を有するペプチドを構築し得ることが本発明者らによって見出されたアミノ酸配列（ペプチドモチーフ）である。具体的には、多核化誘導性ペプチド配列は、以下のアミノ酸配列：
ＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１）；および
ＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号２）；
のうちのいずれか若しくはその改変アミノ酸配列からなる。配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列は、本発明者がヒト由来のセントリン２のｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ配列を独自に翻訳して得たアミノ酸配列情報について、Ｎ末端側から１個目、２個目、３個目、４個目、５個目、６個目、７個目、８個目、９個目のアミノ酸残基が、それぞれＣ末端側から１個目、２個目、３個目、４個目、５個目、６個目、７個目、８個目、９個目のアミノ酸残基となるように逆転して再配列することで得られた合計９アミノ酸残基の人為的なアミノ酸配列である。
ここで、セントリンとは、真核生物の中心体に存在し、中心子の構成タンパク質の一つとして中心子の複製や微小管の切断に関与する中心体関連タンパク質であり、セントリン２とは、セントリンファミリー（典型的には、セントリン１、セントリン２、セントリン３等）に属するタンパク質のうちの一つである（非特許文献３）。
ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドの（Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列は、細胞膜及び／又は核膜を通過し得る膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列であれば特に限定なく使用することができる。膜透過性ペプチドとして好適に機能し得る多くのアミノ酸配列（即ち膜透過性ペプチド配列）が知られているが、特にＮｏＬＳ（核小体局在シグナル、Nucleolar localization signal）に関連するアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）が多核化誘導性合成ペプチドの膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列として好ましい。配列番号３〜１１に、上記ＮｏＬＳに関連する膜透過性ペプチド配列および他の膜透過性ペプチド配列（改変アミノ酸配列を含む）の好適例を挙げる。具体的には以下のとおりである。
即ち、配列番号３のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの１種であるヒト内皮細胞に存在するＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）の第４９１番目のアミノ酸残基から第５０３番目のアミノ酸残基までの合計１３アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号４のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子）由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号５のアミノ酸配列は、ＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれる合計８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号６のアミノ酸配列は、アデノウイルスのＰＴＰ（新生末端タンパク質：pre-terminal protein）１及びＰＴＰ２由来の合計１３アミノ酸残基からなるＮｏＬＳに対応する。
配列番号７のアミノ酸配列は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計１１アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号８のアミノ酸配列は、上記ＴＡＴを改変したタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ４）の合計１１アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号９のアミノ酸配列は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体であるAntennapediaのＡＮＴ由来の合計１６アミノ酸配列から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号１０のアミノ酸配列は、ポリアルギニンとして、連続した合計９個のアルギニン残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号１１のアミノ酸配列は、ＭｙｏＤ（筋芽細胞決定因子：myoblast determination）ファミリー阻害ドメイン含有タンパク質由来の合計１９アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
なお、配列表に示した上述の膜透過性ペプチド配列はあくまでも例示であり、使用可能なペプチド配列はこれに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な膜透過性ペプチド配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それら膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
特に、特許文献３にも記載されている配列番号３に示すアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）が膜透過性ペプチド配列として好ましい。かかる配列番号３に示す膜透過性ペプチド配列と上述の多核化誘導性ペプチド配列とを組み合わせることにより、高い多核化誘導活性を有する合成ペプチドを得ることができる。
ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドのペプチド鎖（アミノ酸配列）は、上述したような（Ｂ）多核化誘導性ペプチド配列と、（Ａ）膜透過性ペプチド配列とを適宜組み合わせることにより構築することができる。多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の何れが相対的にＣ末端側（Ｎ末端側）に配置されてもよい。また、多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とは隣接して配置されるのが好ましい。即ち、多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間には、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないか或いは存在していても該残基数が１〜３個程度が好ましい。例えば、多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間にリンカーとして機能する１個又は数個（典型的には１個、２個又は３個）のアミノ酸残基（例えば１個又は数個のグリシン（G）残基）を含むものであり得る。
ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。
また、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、多核化誘導活性を失わない限りにおいて、多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列以外の配列（アミノ酸残基）部分を含み得る。特に限定するものではないが、かかる部分アミノ酸配列としては多核化誘導性合成ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列部分の３次元形状（典型的には直鎖形状）を維持し得る配列が好ましい。該多核化誘導性合成ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下が適当であり、６０以下が望ましく、５０以下が好ましい。例えば３０以下の合成ペプチドが特に好ましい。
このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、安価に多核化誘導性合成ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下（生体外若しくは生体内）で対象の真核細胞に対して多核化を誘導する多核化誘導活性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、多核化誘導剤に適用する多核化誘導性合成ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には５０以下のアミノ酸残基数、特に好ましくは３０以下のアミノ酸残基数）のものが好適である。
全体のアミノ酸配列（ペプチド鎖）に対する多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の占める割合（即ち多核化誘導性合成ペプチドのペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数に占める多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸残基数の個数％）は、対象細胞に対して多核化を誘導する多核化誘導活性を失わない限り特に限定されないが、当該割合は概ね６０％以上が望ましく、８０％以上が好ましい。９０％以上が特に好ましい。多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とから成る（即ち、これらの配列が全アミノ酸配列の１００％であるか或いは１〜数個のリンカーを含む場合は該リンカー以外を占める）ペプチドは好適な一形態である。
なお、本発明の多核化誘導性合成ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、対象の真核細胞に対して多核化を誘導する多核化誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドの好適な一態様は、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１２）；および
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号１３）；
のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列または該選択されたアミノ酸配列の改変アミノ酸配列を特に好ましく含有する。配列番号１２又は配列番号１３に示すアミノ酸配列は、上記配列番号１又は配列番号２に示す多核化誘導性ペプチド配列と、上記配列番号３に示すＬＩＭキナーゼ２のＮｏＬＳ由来のアミノ酸配列とを、２個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカーを介して組み合わせることにより構築された合計２４アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、Intavis AG社、Protein Technologies社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
或いは、遺伝子工学的手法に基づいて多核化誘導性合成ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望する多核化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の多核化誘導性合成ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的の多核化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズ及びアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出し、精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計した多核化誘導性合成ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。また、必要に応じて適当な方法によってリフォールディングする。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち多核化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、多核化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、多核化誘導性合成ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、上記多核化誘導活性を損なわない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、上記多核化誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
ここで開示される多核化誘導剤は、有効成分である多核化誘導性合成ペプチドをその多核化誘導活性が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の（少なくとも一種以上の）担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。多核化誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、多核化誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
多核化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、多核化誘導性合成ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
ここで開示される多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）の適用対象細胞は特に制限されず、種々の生物種の真核細胞に対して多核化を誘導する(若しくは多核化の誘導を促進する)ことが可能である。特に、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には脊椎動物、特に哺乳動物）の細胞が適用対象として好ましい。医学上の利用価値の観点から、腫瘍細胞、特に、悪性腫瘍細胞（がん細胞）、例えば扁平上皮癌の細胞や腺癌の細胞が対象細胞として好適である。或いはまた、医学上の利用価値の観点（特に再生医療への応用の観点）から、多核細胞（例えば、巨核球や破骨細胞）又は多核化前のプレ多核細胞、例えば、巨核球若しくは破骨細胞又は多核化前の巨核球の前駆細胞（例えば多核化前の巨核芽球）若しくは多核化前の破骨細胞の前駆細胞（破骨前駆細胞）が対象細胞として好適である。
ここで開示される多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、生体外（インビトロ）で培養（継代）している対象細胞（例えば、腫瘍細胞、又は多核細胞若しくは多核化前のプレ多核細胞等）に対して多核化を誘導する場合は、ここで開示される多核化誘導剤（即ち多核化誘導性合成ペプチド）の適当量を、多核化を行う対象の培養細胞（細胞培養物）に対し、培養過程のいずれかの段階（好ましくは所定期間の培養（増殖）や継代を行った後）で培地に少なくとも１回供給するとよい。上記培養細胞の例としては、樹立細胞株および初代培養細胞、あるいは生体から一時的に又は永久的に摘出した細胞材料（細胞、あるいは生組織や細胞塊等)、あるいは幹細胞(例えばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、造血幹細胞等）から分化誘導して得られる細胞材料（組織、細胞塊、器官等を含む、典型的には細胞）等が挙げられる。
多核化誘導剤（即ち多核化誘導性合成ペプチド）の供給量及び供給回数は、培養細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。例えば、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には脊椎動物、特に哺乳動物）由来の細胞を培養する場合、培地中の多核化誘導性合成ペプチド濃度が概ね０．１μＭ〜１００μＭの範囲内、好ましくは０．５μＭ〜８０μＭ（例えば１μＭ〜５０μＭ）の範囲内となるように、培養細胞（細胞培養物）に対して１〜複数回供給する（例えば培養開始時ならびに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加供給する）ことが好ましい。
或いはまた、生体内（インビボ）で対象細胞（例えば、腫瘍細胞、又は多核細胞若しくは多核化前の多核細胞等）の多核化を誘導する場合においては、ここで開示される多核化誘導剤（即ち多核化誘導性合成ペプチド）の適当量を液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔への注射によって患者（即ち生体内）に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを、直接、目的の組織（例えば腫瘍の患部、あるいは骨髄や骨などの目的細胞の多核化が起こる組織）あるいは該組織の近傍に投与することができる。或いは経口投与若しくは座薬の形態で投与してもよい。これにより、生体内の細胞、典型的には目的の組織又はその周辺に存在する目的細胞に対して多核化を誘導することができる。なお、多核化誘導剤（即ち多核化誘導性合成ペプチド）の投与量及び投与回数は、多核化を誘導する目的細胞の種類、存在部位、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。
また、ここで開示される多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）は、対象細胞の種類や目的に応じ、液性因子（例えばサイトカイン等）や組成物（例えば阻害剤等）等を併用することができる。
例えば、腫瘍細胞に対して多核化を誘導する場合であれば、他の抗腫瘍効果を有する組成物（抗がん剤）と併用することができる。かかる抗がん剤としては、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管作用薬、白金製剤、抗がん性抗生物質、ホルモン剤、分子標的治療薬等が挙げられる。
あるいは、多核細胞または多核化前のプレ多核細胞に対して多核化を誘導する場合であれば、他の多核化誘導因子および分化誘導因子等や、多核化誘導効果を有する組成物と併用することができる。かかる多核化誘導因子としては、巨核球（若しくは多核化前の巨核球）に対して多核化を誘導（促進）する場合であれば、例えば、トロンボポエチン（Thrombopoietin、ＴＰＯ）、各種インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１１等）、ＧＭ−ＣＳＦ（granulocyte macrophage colony-stimulating factor、顆粒球単球コロニー刺激因子）、ＥＰＯ（Erythropoietin、エリスロポエチン）、ＳＣＦ（stem cell factor、幹細胞因子）、その他のサイトカインファミリーに属する因子、ＲＯＣＫ（Rho-associated coiled-coil forming kinase、Rho結合キナーゼ）阻害剤、ＨＤＡＣ（histone deacetylase、ヒストン脱アセチル化酵素）阻害剤等が挙げられる。また、破骨細胞（若しくは多核化前の破骨細胞）に対して多核化を誘導（促進）する場合であれば、例えば、ＲＡＮＫＬ（receptor activator of NF-κB ligand）等のＴＮＦ（tumor necrosis factor、腫瘍壊死因子）スーパーファミリーに属する因子、Ｍ−ＣＳＦ（macrophage colony stimulating factor）、ＴＧＦ−β１等のＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する因子、その他のサイトカインファミリーに属する因子、等が挙げられる。
例えば、ここで開示される多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）を腫瘍（がん）の患部に供給されるように投与することにより、その多核化誘導活性によって、腫瘍細胞を多核化し、該腫瘍細胞の細胞分裂を抑制（阻害）して腫瘍細胞の細胞増殖を抑制（阻害）することができる。換言すると、ここで開示される多核化誘導剤は、腫瘍の治療（がん治療）に使用可能な薬学的組成物（抗腫瘍組成物、抗がん剤）として使用することができる。
また、例えば、ここで開示される多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）を生体内の多核細胞（例えば巨核球や破骨細胞等）が多核化する組織に供給されるように投与することにより、その多核化誘導活性によって、多核細胞(例えば巨核細胞および破骨細胞等）または多核化前のプレ多核細胞 (例えば多核化前の巨核芽球、多核化前の破骨前駆細胞等）に対して多核化を誘導することができる。これにより、多核細胞（例えば巨核球や破骨細胞）が生体内において担う機能の増強、例えば、血小板の産生効率の向上または骨代謝の調整および血中Ｃａ濃度の維持等を実現することに資する薬学的組成物として使用することができる。
或いはまた、対象細胞（例えば多核細胞又は多核化前のプレ多核細胞等）に、適当量の多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）を付与し、対象細胞に多核化が誘導されるまで培養することによって（即ち、ここで開示される多核化誘導方法を採用することによって）、対象細胞の多核化誘導を生体外(インビトロ)で効率よく行うことができる。これにより、多核細胞を効率よく生産することが可能であり、また、多核細胞中の核数を増大させること（多核化の促進）も可能である。なお、上記対象細胞としては、例えば、生体から一時的に又は永久的に摘出した細胞材料（生組織や細胞塊、例えば細胞の培養物)、あるいは、インビトロで培養（継代）している幹細胞(例えばｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等)から分化誘導して得られる所定の細胞（該細胞により構成される組織、器官等を含む）等を用いることができる。
また、ここで開示される多核化誘導方法（インビトロでの多核化誘導方法）や多核化誘導性合成ペプチドを採用することによって生体外（インビトロ）で効率よく多核化を誘導（促進）された目的細胞（即ち、ここで開示される技術によって生産された多核細胞、又は細胞内の核数を増大された多核細胞）を該細胞が機能する組織（即ち患者の生体内）に導入することにより、該細胞の多核化に要する時間を短縮することができる。
或いはまた、インビトロ培養系で大量に生産した多核細胞材料(多核細胞、あるいは多核細胞を含む細胞塊や組織）を利用することで、該細胞より産生される細胞および生合成物（例えば分泌タンパク質やホルモン等の生理活性物質等）等を生産することができる。例えば、ここで開示される技術は、巨核球から血小板を産生する方法に好適に利用することができる。十分に多核化した巨核球は多核化が不十分な巨核球と比較して１細胞あたりが産生する血小板数が極めて多い（数十〜数百倍）ため、巨核球１細胞あたりの血小板の産生量の増大には巨核球の多核化促進が重要である。このため、ここで開示する技術によって十分に多核化を誘導した巨核球を利用することで、高効率に血小板を産生することができる。また、本発明により産生（製造）した血小板を用いて血液製剤（血小板製剤）を製造することができる。
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
＜実施例１：ペプチド合成＞
合計３種類のペプチド（サンプル１〜３）を後述するペプチド合成機を用いて製造した。表１には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列等の情報を列挙している。
表１に示すように、サンプル１および２に係るペプチドは、ペプチド鎖のＣ末端側に多核化誘導性合成ペプチド配列を有し、そのＮ末端側に、２個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカー領域を介して膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号３）を有する多核化誘導性合成ペプチドである。
即ち、サンプル１のペプチド（配列番号１２）は、多核化誘導性合成ペプチド配列として配列番号１に示すアミノ酸配列を有する合計２４アミノ酸残基のペプチドである。
また、サンプル２のペプチド（配列番号１３）は、多核化誘導性合成ペプチド配列として配列番号２に示すアミノ酸配列を有する合計２４アミノ酸残基のペプチドである。
また、サンプル３に係るペプチドは、表１に示すように、膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号３）のみから成る合計１３アミノ酸残基のペプチドである。
ここで、上記サンプル１〜３に係る合成ペプチドは直鎖状のペプチドであり、上記合成ペプチドは市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
合成したサンプル１〜３に係るペプチドは、ＰＢＳ（−）又はＤＭＳＯに溶かし、ペプチドストック液を調製した。
＜実施例２：腫瘍細胞に対する合成ペプチドの多核化誘導活性評価試験−１＞
上記実施例１で得られた多核化誘導性合成ペプチド（サンプル１およびサンプル２）の多核化誘導活性について、細胞質のマーカーとしてカルレティキュリンを採用した細胞免疫染色（蛍光免疫染色）を行うとともに、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）による核染色を行うことで評価した。供試細胞としてヒト子宮頸癌由来の培養細胞株であるＨｅＬａＳ３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＣＬ２．２）を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
ＨｅＬａＳ３細胞を細胞数が１ウェルあたり凡そ１×１０３個となるように、４穴（ウェル）の細胞培養スライド（チャンバーともいう）の各ウェル中に播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータで一晩培養を行った。培地は一般的なＤＭＥＭ培地、即ち、ここではＤＭＥＭ（和光純薬社製、Cat No. 043-30085）に１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有したものを用いた。その一晩培養後、培養容器中の培地を、上記ＦＢＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地に更にペプチド濃度５０μＭとなる量のサンプル１、サンプル２、サンプル３のうちのいずれかのペプチドを含有させた培地に交換し、同条件で４日間培養を継続した。なお、コントロール区として、サンプル添加区に添加したペプチドストック液と同容量のＰＢＳ（−）のみを添加したペプチド無添加区を設けた。
上記培養終了後、各試験区の細胞における多核化状態を、以下の細胞免疫染色により調べた。
まず、各試験区の細胞を固定し、その後ブロッキング処理を行った。具体的には、まず、各試験区の培養容器中の培地を除去し、冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。次いで、メタノール１容量とアセトン１容量とを混和した溶液（メタノール／アセトン＝１：１溶液）を添加し、氷上に１５分静置してＨｅＬａＳ３細胞を固定した。その後、メタノール／アセトン＝１：１溶液を除去し、冷ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。そして、３％のＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）（３％のＢＳＡを含むＰＢＳ（−））を添加して室温で１時間のブロッキング処理を行った。所定時間経過後、３％のＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を除去し、冷ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。
次に、抗カルレティキュリン抗体と該抗体を認識する二次抗体とを用いて、カルレティキュリンに対する細胞免疫染色を行った。まず、抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]抗体（マウス由来、Abcam社製、Cat No. ab22683）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）（１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（−））で４００倍希釈した一次抗体希釈液を上記ＨｅＬａＳ３細胞の培養容器中に添加し、４℃で一晩（約１６〜１８時間）静置した。そして、所定時間経過後、上記一次抗体希釈液を除去し、冷０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）（０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（−））で６回洗浄した。次いで、二次抗体として蛍光色素（Alexa（登録商標）４８８）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ヤギ：Life Technologies社製品、A11029）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）で２００倍希釈した二次抗体希釈液を添加し、室温で２時間静置した。上記所定時間経過後、二次抗体希釈液を除去し、冷０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）で６回洗浄した。
そして、上記の細胞免疫染色を行った各試験区の細胞をＤＡＰＩ含有封入液であるSlow Fade（Life Technologies社製、Cat. No. S36936）とカバーガラスを用いて封入し、共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った。
共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った結果を図１〜図４に示す。これらの図面は各試験区における細胞の多核化状態を調べた蛍光顕微鏡写真であり、上記免疫蛍光抗体法でカルレティキュリンの発現状態を調べた結果を示す蛍光画像とＤＡＰＩによる核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。図１〜図３にはそれぞれ図の番号に対応してサンプル１〜サンプル３添加区の結果を示し、図４にはペプチド無添加区の結果を示す。
上記評価試験の結果、サンプル１またはサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）を添加したＨｅＬａＳ３細胞の蛍光顕微鏡画像（サンプル１添加区については図１、サンプル２添加区については図２）に示されるように、サンプル１添加区およびサンプル２添加区では複数の核が形成された細胞を観察した。これに対し、サンプル３添加区およびペプチド無添加区におけるＨｅＬａＳ３細胞（サンプル３添加区については図３、ペプチド無添加区について図４）では、複数の核が形成された細胞は観察されなかった。即ち、サンプル１およびサンプル２に係る合成ペプチドが、ＨｅＬａＳ３細胞に対して多核化を誘導することを確認した。これらの結果は、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチド（即ち、該ペプチドを含む多核化誘導剤）が真核細胞（例えばヒト由来の腫瘍細胞）に対して多核化を誘導し得ることを示している。なお、サンプル１添加区の多核化細胞の中には、サンプル２添加区で確認されるいくつかの多核化細胞と比較して、１細胞あたりの核数が顕著に多い細胞が存在することを観察した。
＜実施例３：腫瘍細胞に対する合成ペプチドの多核化誘導活性評価試験−２＞
上記実施例１で得られた多核化誘導性合成ペプチド（サンプル１およびサンプル２）について、多核化誘導率を調べた。供試細胞として、実施例２と同様のＨｅＬａＳ３細胞を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
ＨｅＬａＳ３細胞を細胞数が１ウェルあたり凡そ０．５×１０３個となるように、８穴（ウェル）の細胞培養スライド（チャンバーともいう）の各ウェル中に播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータで一晩培養を行った。培地は一般的なＤＭＥＭ培地、即ち、ここではＤＭＥＭ（和光純薬社製、Cat No. 043-30085）に１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有したものを用いた。その一晩培養後、培養容器中の培地を、上記ＤＭＥＭ中に３％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有させたＤＭＥＭ培地中に更にペプチド濃度５０μＭとなる量のサンプル１またはサンプル２を含有させた培地に交換し、同条件で４日間培養を継続した。なお、コントロール区として、サンプル添加区に添加したペプチドストック液と同容量のＰＢＳ（−）のみを添加したペプチド無添加区を設けた。
上記培養終了後、各試験区の細胞について、実施例２と同様にして細胞質マーカー（カルレティキュリン）の細胞免疫染色と核染色を行った。そして、細胞免疫染色と核染色を行った後の各試験区の細胞を共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光観察し、１視野中に観察される細胞について、全細胞数と、２つ以上の核が認められた細胞の細胞数（多核化細胞数）と、を数えた。そして多核化誘導率（顕微鏡観察の１視野中に観察される全細胞数に対し、２個以上の核を有する細胞数の割合：％）を、以下の式：多核化誘導率（％）＝（２つ以上の核を有する細胞数）÷（全細胞数）×１００；により算出した。なお、上記多核化誘導率の評価試験と同様の条件での試験を相互に独立して３回繰り返し、各試験で得られた多核化誘導率を平均して平均多核化誘導率を算出した。結果を表２に示す。
表２に示すように、ペプチド無添加区の多核化誘導率（０％）と比較して、サンプル１添加区またはサンプル２添加区では多核化誘導率が顕著に増大することを確認した。即ち、サンプル１またはサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）は、ペプチド供給後４日以内に、供試腫瘍細胞（ヒト子宮頸癌細胞：ＨｅＬａＳ３細胞）のうちの少なくとも３０％以上（典型的には３５％以上）の細胞に対して多核化を誘導し得ることを確認した。換言すると、サンプル１またはサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）が供試腫瘍細胞（ＨｅＬａＳ３細胞）に対して多核化を誘導する効率（多核化誘導率、多核化誘導頻度）は、少なくとも３０％以上（典型的には３５％以上）であることを確認した。特に、サンプル１に係る合成ペプチドの平均多核化誘導効率は４０％以上であり、サンプル２に係る合成ペプチドよりも高効率に多核化を誘導し得る（即ち、高い多核化誘導活性を有する）ことを確認した。
これらの結果は、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチド（即ち、該ペプチドを含む多核化誘導剤）が真核細胞（例えばヒト由来の腫瘍細胞）に対して高い多核化誘導活性を有することを示している。
＜実施例４：腫瘍細胞に対する合成ペプチドの細胞増殖阻害活性評価試験＞
上記実施例１で得られた多核化誘導性合成ペプチド（サンプル１およびサンプル２）の細胞増殖阻害活性について、ＷＳＴ−８（水溶性テトラゾリウム塩）を用いた吸光度法による細胞増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）を行うことで評価した。供試細胞として、実施例２と同様のＨｅＬａＳ３細胞を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
ＨｅＬａＳ３細胞を細胞数が１ウェルあたり凡そ５×１０３個となるように９６穴（ウェル）プレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータで６時間培養を行った。培地は一般的なＤＭＥＭ培地、即ち２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ（Gibco社製、製品番号11965-092）に１０％のＦＢＳ（Hyclone Laboratories 社製、KSD28662）と、１００ユニット／ｍｇのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンと、を含有させた培地（以下、該培地を「増殖アッセイ用基本培地」ともいう）を用い、１ウェルあたりの培地量を１００μＬとした。
上記所定時間の培養後、培養容器中の培地を、上記増殖アッセイ用基本培地に更にペプチド濃度５０μＭとなる量のサンプル１または２に係るペプチドを含有させた培地に交換した。なお、コントロール区として、サンプル添加区に添加したペプチドストック液と同容量のＰＢＳ（−）のみを添加したペプチド無添加区を設けた。
上記のようにしてサンプルペプチドを添加した後、９６穴（ウェル）プレートを、ＣＯ２インキュベータ内に配置し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で静置培養した。そして、ペプチド添加時（処理開始時、Ｄａｙ０）およびペプチド存在下での培養開始から１日（２４時間）経過時点（Ｄａｙ１）において、供試細胞の生存状態（生細胞数）を市販の発色測定キット（Cell counting kit-8、同仁化学研究所社製）を使用して測定した。即ち、生細胞の酵素活性により試薬中のテトラゾリウム塩が還元されて水溶性ホルマザンが生成されることを利用し、培地中の水溶性ホルマザン量を吸光度法（測定波長：４５０ｎｍ、参照波長：６５０ｎｍ）により測定して生細胞数を測定した。なお、以下に詳述する操作以外は上記測定キットに添付のマニュアルどおりに行った。
具体的には、上記所定の培養時間が経過した細胞培養ウェル中に、発色基材として「水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−８）」含む試薬を１ウェルあたり１０μＬ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で１時間インキュベートした。その後、該発色試薬を添加した細胞培養液について、波長４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）および波長６５０ｎｍの吸光度（Ａ６５０）を分光光度計（マイクロプレートリーダ）を用いて測定し、Ａ４５０をＡ６５０で補正した値Ａ４５０-６５０を算出した。そして、ペプチド無添加区における細胞生存率を１００％としたときの各サンプル添加区の細胞生存率（％）を、以下の式：細胞生存率（％）＝｛（サンプル添加区Ｄａｙ１のＡ４５０-６５０）／（サンプル添加区Ｄａｙ０のＡ４５０-６５０）｝÷｛（ペプチド無添加区Ｄａｙ１のＡ４５０-６５０）／（ペプチド無添加区Ｄａｙ０のＡ４５０-６５０）｝×１００；により算出した。そして、ペプチド無添加区の細胞生存率（％）を基準として、各サンプル添加区の細胞生存率の減少率を細胞増殖阻害率（％）として算出した。即ち、以下の式：細胞増殖阻害率（％）＝１００−（サンプル添加区の細胞生存率）；より細胞増殖阻害率を算出した。結果を表３に示す。
表３に示すように、サンプル１添加区またはサンプル２添加区の供試腫瘍細胞（ヒト子宮頸癌細胞：ＨｅＬａＳ３細胞）は、ペプチド無添加区の細胞と比較して、細胞増殖が顕著に抑制されることを確認した。即ち、サンプル１またはサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）は、何れも供試腫瘍細胞（ＨｅＬａＳ３細胞）に対して多核化を誘導することで、該多核化された細胞（多核化細胞）の細胞分裂を阻害し、その結果、腫瘍細胞の増殖を阻止若しくは抑制し得ることを確認した。
また、サンプル１およびサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）の供試腫瘍細胞（ＨｅＬａＳ３細胞）に対する細胞増殖阻害率は少なくとも２０％以上であることを確認した。特に、サンプル１に係る合成ペプチドの細胞増殖阻害率は３０％以上であり、サンプル２に係る合成ペプチドよりも高い細胞増殖阻害活性を有することを確認した。
これらの結果は、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチド（即ち、該ペプチドを含む多核化誘導剤）が腫瘍細胞（例えばヒト由来の腫瘍細胞）に対して高い抗腫瘍活性（腫瘍細胞増殖阻害活性）を有することを示している。
＜実施例５：顆粒剤の調製＞
上記サンプル１およびサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドを主成分とする顆粒剤（顆粒状組成物）を得た。
上述のように、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、対象とする真核細胞を多核化させる多核化誘導活性を有しているため、対象とする真核細胞（特にヒト由来の細胞）に対して多核化を誘導する目的に好適に使用し得る。例えば、腫瘍細胞に対して多核化を誘導することによって、腫瘍細胞の増殖を抑制する目的に使用し得る。或いはまた、多核化前の巨核球（即ち巨核球前駆細胞）に対して多核化を誘導することによって、巨核球の成熟を促進し、延いては血小板の産生を促進する目的に使用し得る。したがって、ここで開示される多核化誘導剤は、例えば再生医療用途の組成物やがんの治療用途の組成物として好適に利用することができる。
配列番号１〜１３ 合成ペプチド

Claims (9)

  1. ペプチド鎖中に、以下の（Ａ）および（Ｂ）のアミノ酸配列：
    （Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列；および
    （Ｂ）少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する活性を有する多核化誘導性ペプチド配列を構成するＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１）またはＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号２）のいずれかで表されるアミノ酸配列；
    を有する、少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する活性を有する人為的に合成されたペプチド。
  2. 前記（Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列は、配列番号３〜１１のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列である、請求項１に記載の合成ペプチド。
  3. 前記（Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列：
    ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３）
    である、請求項１または２に記載の合成ペプチド。
  4. ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が３０以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
  5. 以下のアミノ酸配列：
    ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１２）；および
    ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号１３）；
    のうちのいずれかを有する、請求項４に記載の合成ペプチド。
  6. 少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導するために用いられる多核化誘導剤であって、
    請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成ペプチドと、
    薬学的に許容可能な担体と、
    を含む、多核化誘導剤。
  7. 前記真核細胞がヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞である、請求項６に記載の多核化誘導剤。
  8. インビトロにおいて、少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する方法であって、
    インビトロにおいて対象の細胞を含む細胞培養物を準備すること、
    前記細胞培養物中に、請求項１〜５の何れか一項に記載の合成ペプチドのいずれかを少なくとも１回供給すること、および
    該ペプチドを供給した前記細胞培養物を培養すること、
    を含む、多核化誘導方法。
  9. 前記真核細胞がヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞である、請求項８に記載の多核化誘導方法。
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