KR101189193B1

KR101189193B1 - 저분자열충격단백질이 포함된 융합 단백질, 이에 의해 구성된 케이지 단백질 및 이의 신규한 용도

Info

Publication number: KR101189193B1
Application number: KR1020100059567A
Authority: KR
Inventors: 안형준; 권익찬; 최귀원
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2010-06-23
Filing date: 2010-06-23
Publication date: 2012-10-09
Also published as: WO2011162492A2; US8916685B2; US20130230562A1; WO2011162492A3; KR20110139456A

Abstract

본 발명은 저분자열충격단백질이 포함된 융합 단백질, 이에 의해 구성된 케이지 단백질 및 이의 신규한 용도에 관한 것으로 구체적으로 저분자열충격단백질에 단백질 분해효소의 인식부위 및 히스티딘(histidine) 폴리머가 순차적으로 연결된 융합 단백질, 이에 의해 구성된 케이지 단백질 및 이의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질, 이의 자가 조립성질에 의해 형성된 케이지 단백질은 기존의 분자영상용 단일 펩타이드에 비해 세포 독성이 없으며, 단일 단백질 당 20-50배 이상의 높은 형광 신호를 발할 수 있고 세포투과능력이 매우 우수하여 바이오 센서나 생리활성물질 전달체로 효과적으로 이용할 수 있다.

Description

저분자열충격단백질이 포함된 융합 단백질, 이에 의해 구성된 케이지 단백질 및 이의 신규한 용도{Fusion protein comprising small heat shock protein, cage protein formed thereby, and novel use thereof}

본 발명은 저분자열충격단백질이 포함된 융합 단백질, 이에 의해 구성된 케이지 단백질 및 이의 신규한 용도에 관한 것으로 구체적으로 저분자열충격단백질에 단백질 분해효소의 인식부위 및 히스티딘(histidine) 폴리머가 순차적으로 연결된 융합 단백질, 이에 의해 구성된 케이지 단백질 및 이의 신규한 용도에 관한 것이다.

케이지(cage) 단백질은 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 단일체 분자량의 수 십에서 수 백배의 거대분자를 형성할 수 있는 단백질이다. 자연계에서 바이러스 capsid 단백질, 페리틴, heat shock protein, Dps 단백질이 이에 해당되며 cage를 구성하는 각각의 단일체들은 인접 단일체들과 매우 규칙적이고 정밀한 상호작용을 이루고 있고 cage의 내부는 비어있는 구조이다. 상기와 같은 cage 단백질의 container와 같은 성질에 의해 내부와 외부가 격리되는 특징을 가지고 있어, 약물 전달체로 의학분야에서 활용 빈도가 높다.

특히 저분자열충격단백질(small heat shock protein, HSP)은 분자량에 따라 HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 및 smHSP의 5 족으로 분류된다. 이들은 영양 결핍, 대사 이상, 산소 래디컬 및 세포내 병원체의 감염을 포함한 다른 스트레스 자극에 대해 유도된는 것으로 알려졌다(Welch 1993년 5월, Scientific American 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8: 401-420; Craig, 1993, SCIENCE 260 : 1902-1903; Gething 등 1992, Nature 355: 33-45; 및 Lindquist 등 1988, Annu. Rev. Genetics 22: 631-677 참조).

한편, 단백질 분해효소는 넓은 범위에서 다양한 세포기능을 조절하는 역할을 하고, 이는 생리활성 물질의 분해를 통하여 이루어지기 때문에, 모든 생명체의 생명현상에 대한 단백질분해효소의 기능 및 역할은 매우 중요하다. 예를 들어, 특정 단백질 분해효소의 결핍이나 부족 또는 과다발현은 중대한 결과를 초래하는데, 이는 암, 관절염, 퇴행성 신경질환, 심혈관계 및 자가 면역 염증질환 등으로 나타날 수 있다. 따라서 제약업계에서 보면 단백질 분해효소와 그의 기질 단백질은 신약개발의 주요 표적이며 지대한 관심을 가지고 있는 실정이다.

단백질 분해효소의 다양한 역할과 최근 다양한 게놈 프로젝트의 완결에 기인하여 단백질 분해효소의 세포 및 체내 역할 규명이 활발히 이루어지고 있으며 인간게놈 프로젝트에 따르면 인간의 유전자 중 약 500개 이상의 단백질 분해효소 관련 유전자가 파악되었다. 최근 단백질 분해효소는 암과 치매와 같은 다양한 인간 질병에 중추적인 역할을 하며 원인 제공을 하고 있음이 새로이 밝혀지고 있다.

예를 들어, 기질 금속단백분해효소(matrix metalloprotease, MMP)는 과거 세포 및 체내에서 세포외 기질(extracellular matrix)을 분해하는 인자로 인식되었지만, 다양한 연구를 통해 이들이 인테그린(integrin) 신호전달과 세포주위 기질(pericellular matrix)의 분해에 따른 세포 운동에 관련돼 있음이 밝혀졌다. 또한 MMP는 신규 혈관형성 현상, 암세포의 침윤, 전이 등 암 성장에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있음이 밝혀져 있다.

또한 세포사멸은 최근 십여년간 가장 이목을 받아온 생명과학의 분야로서 embryonic development, immune response, tissue hoemostasis에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있고 (Vaux, D.L. et al. 1999), 세포사멸에서 이상이 발생한 경우 neurodegenerative disorder 혹은 암과 같은 난치성 질환으로 발전한다 (Nicholson, D.W. 1996). 세포사멸은 수많은 효소들이 관련되어 있는데 그 중에서 death receptor가 활성화된 후 활동도가 증가되는 단백질 분해효소인 caspase에 의하여 대표적으로 세포사멸이 시작된다.

이처럼 새로운 기질 단백질들이 밝혀짐에 따라 앞으로 여러 가지 단백질 분해 효소군의 생리적 기능이 새롭게 조명될 것이며, 이에 따라 새로운 신약 표적 단백질들이 발굴될 것으로 기대되고 있다.

하지만, 특이적인 단백질 분해효소의 활성 여부를 영상화하여 분석하거나, 생체 내에서 단백질 분해효소 발현 정도를 비침습적으로 영상화하는 기법이 전무하여 관련 기술개발이 시급한 실정이며, 현재 이용되고 있는 대표적인 단백질분해효소의 측정 방법은 2-D 젤과 다단계 액체 크로마토그래피 방법, 효소면역측정법(The Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 또는 단백질분해효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질에 형광체를 결합하여 분광법(spectroscopy)으로 피크 이동(peak shift) 정도를 측정하는 방법 등이 있다.

그러나 이러한 방법들은 다단계의 측정 프로토콜이 필요하여, 특히 펩타이드 자체만을 이용하는 경우 합성 및 정제과정이 번거롭고 비용이 높은 단점이 있으며, 세포 독성이 있고 세포 투과율이 현저히 낮아 효과적이지 못한 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 단백질 분해효소를 검출할 수 있는 바이오 센서에 관하여 연구하던 중, 저분자열충격단백질이 포함된 융합 펩타이드를 제조하고, 이로부터 형성된 케이지(cage) 단백질이 세포 독성이 없고 세포 투과율이 매우 높으며, 표지 인자의 시그널 강도를 높여 바이오 센서로 효과적으로 이용될 수 있음을 밝혀 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 (a) 저분자열충격단백질(small heat shock protein, Hsp)의 카르복실 말단(carboxyl terminal)에 (b) 단백질 분해효소의 인식부위 및 (c) 히스티딘(histidine) 폴리머가 순차적으로 연결된 융합 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 융합 단백질로 구성된 케이지(cage) 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 발현벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 발현벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 케이지 단백질을 유효성분으로 포함하는 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 케이지 단백질의 내부에 생체활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 생체활성물질 전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (a) 저분자열충격단백질(small heat shock protein, Hsp)의 카르복실 말단(carboxyl terminal)에 (b) 단백질 분해효소의 인식부위 및 (c) 히스티딘(histidine) 폴리머가 순차적으로 연결된 융합 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 융합 단백질로 구성된 케이지(cage) 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 발현벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 발현벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 케이지 단백질을 유효성분으로 포함하는 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 케이지 단백질의 내부에 생체활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 생체활성물질 전달체를 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어를 구체적으로 설명하면 하기와 같다.

본 발명에서 저분자열충격단백질(small heat shock protein, Hsp)은 이들 각각이 단위체로써 cage 형태의 복합 단백질을 형성할 수 있는 활성이 있는 단백질이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 Methanococcus jannaschii에서 유래된 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드, 이의 단편 및 이들의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 단편이나 변이체는 cage 형태의 복합 단백질을 형성할 수 있는 활성이 유지되는 한 제한이 없으나, 특히 상기 변이체는 서열번호 6에 포함된 아미노산의 일부 추가, 삭제, 또는 치환에 의해 제조된 것일 수 있다.

상기 cage 형태의 복합 단백질을 형성할 수 있는 활성이 있는 단백질로 HSP를 대신하여 사용될 수 있는 단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 인간에서 유래된 페리틴(ferritin) 단백질(NCBI accession No: NP_002023.2, NP_000137.2), Hepatitis B virus 유래의 캡시드(capsid) 단백질(NCBI accession No: NP_647607.1), Tobacco mosaic virus 유래의 캡시드(capsid) 단백질(NCBI accession No: NP_597750.1) 및 CCMV (Cowpea chlorotic mottle virus) 유래의 캡시드(capsid) 단백질(NCBI accession No: NP_613277.1)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명에서 단백질 분해효소는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 카스파아제(caspase), 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases; MMP), 카텝신 S(cathepsin S), 및 바이러스성 단백질 분해효소(viral proteases)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 카스파아제(caspase)일 수 있다.

본 발명에서 단백질 분해효소의 인식분위는 단백질 분해효소가 해당 기질 단백질을 분해하기 위하여 인식하는 부위로써, 단백질 분해효소의 종류에 따라 다양할 수 있다. 구체적으로 카스파아제(caspase)의 경우 서열번호 8로 표시되는 DEVD(Asp-Glu-Val-Asp)이며, 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases; MMP)의 경우 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 Ile-Pro-Val-Ser-Leu-Arg-Ser일 수 있으며, 카텝신 S(cathepsin S)의 경우 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 Val-Val-Arg-Xaa일 수 있으며, 바이러스성 단백질 분해효소(viral proteases)의 경우 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 Val-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Asn일 수 있다.

상기 단백질 분해효소의 인식부위에 시스테인 잔기가 포함되어 있지 않은 경우 시스테인(cysteine) 잔기를 상기 인식부위의 카르복실 말단이나 아미노 말단에 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다. 이는 시스테인(cysteine) 잔기의 설프 하이드릴(sulf hydryl)과 형광염료, 바람직하게는 형광염료 Cy5.5의 말리이미드(maleimide)과 공유결합을 유도함으로써, 단백질 분해효소의 인식분위를 표지하기 위함이다.

상기 단백질 분해효소의 인식부위의 길이는 이에 한정되지 않지만 4 내지 20의 아미노산 잔기로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 히스티딘(histidine) 폴리머는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 히스티딘이 6 내지 20개로 연속하여 중합된 중합체일 수 있으며 보다 바람직하게는 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.

본 발명에서 케이지(cage) 단백질은 본 발명의 융합 단백질이 단위체로 구성된 복합 단백질을 말하며, 본 발명의 융합 단백질에 포함된 저분자열충격단백질의 자가 조립활성에 의하여, 융합 단백질이 단위체로써 규칙적으로 배열된 복합 단백질일 수 있다.

본 발명에서 바이오 센서는 단백질 분해효소의 반응 기작을 이용하여, 단백질 분해효소를 검출하거나 계측할 수 있는 센서를 말한다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 융합 단백질은 (a) 저분자열충격단백질(small heat shock protein, Hsp)의 카르복실 말단(carboxyl terminal)에 (b) 단백질 분해효소의 인식부위 및 (c) 히스티딘(histidine) 폴리머가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 융합 단백질은 케이지(cage) 단백질의 단위체로써 역할을 수행하며, 상기 (a)의 저분자열충격단백질을 포함함으로써 케이지(cage) 형태의 구조를 형성할 수 있다(<실시예 1-3> 참조). 또한 상기 (b)의 단백질 분해효소의 인식부위를 포함함으로써, 특정 단백질 분해효소의 존재여부를 검출할 수 있으며, (<실험예 2> 및 <실험예 4> 참조) 상기 (c)의 히스티딘(histidine) 폴리머를 포함함으로써, 세포투과율이 현저히 높다.(<실험예 1> 참조)

본 발명의 융합 단백질에서 상기 (b)의 단백질 분해효소의 인식부위는 앞서 기술한 바와 같이, 단백질 분해효소가 해당 기질 단백질을 분해하기 위하여 인식하는 부위로써 상기 단백질 분해효소가 카스파아제(caspase), 보다 바람직하게는 카스파아제-3 또는 카스파아제-7, 가장 바람직하게는 카스파아제-3인 경우, 상기 단백질 분해효소의 인식부위는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 DEVD 모티프(motif)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 시스테인(cysteine) 잔기가 포함된 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 저분자열충격단백질(small heat shock protein, Hsp)의 카르복실 말단(carboxyl terminal)에, 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 단백질 분해효소의 인식부위 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 히스티딘(histidine) 폴리머가 순차적으로 연결된 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 융합 단백질일 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 표지인자가 삽입된 것일 수 있으며, 상기 표지인자는 단백질에 공유 또는 비공유로 결합하여 특정 아미노산 서열의 존재여부를 표지할 수 있는 물질로써 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 효소, 형광체, 방사성 동위원소, 소광체 또는 화학물질일 수 있다.

상기 형광체는 적색 또는 근적외선의 형광을 발광하는 것이라면 이에 한정되지 않지만, 바람직하게는 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 알렉사, 보디피 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 형광 염료인 cy5.5일 있다. 상기 형광체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 (b)의 인식부위에 표지될 수 있다.

상기 소광체는 상기 형광체에서 발하는 형광을 소광시킬 수 있는 물질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 블랙홀 소광체(blackhole quencher), 블랙베리(blackberry quencher) 소광체 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택된 것일 수 있으며, 형광체의 종류에 따라 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 보다 바람직하게는 형광체를 cy5.5를 사용하는 경우 소광체로 블랙홀 소광체(blackhole quencher)를 사용할 수 있다. 상기 소광체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 (a)의 저분자열충격단백질에 표지될 수 있으며, 예를 들어 블랙홀 소광체(blackhole quencher)를 사용하는 경우 상기 (a)의 저분자열충격단백질를 구성하는 라이신(lysine) 잔기에 표지될 수 있다.

상기와 같이 형광체를 상기 (b)의 인식부위에 표지하고 소광체를 상기 (a)의 저분자열충격단백질에 표지함으로써, 단백질 분해효소가 존재하지 않은 상태에서 본 발명의 융합 단백질이 소광 현상을 보이나 단백질 분해효소가 상기 (b)의 인식부위를 분해하는 경우 형광 현상을 보임으로써 단백질 분해효소를 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본원발명에 포함된다.(<실시예 1> 참조)

한편 본 발명의 케이지(cage) 단백질은 본 발명의 융합 단백질에 의하여 구성된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 케이지 단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 본 발명의 융합 단백질이 단위체로써 24개가 규칙적으로 배열된 것일 수 있으며 바람직하게는 24개가 규칙적으로 배열된 것일 수 있으며, 평균 분자량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 400 kDa 내지 500 kDa일 수 있다.

본 발명의 케이지 단백질은 본 발명의 융합 단백질 내에 상기 (b)의 단백질 분해효소의 인식부위를 포함함으로써, 특정 단백질 분해효소의 존재여부를 검출할 수 있으며,(<실험예 2> 및 <실험예 4> 참조), 상기 (c)의 히스티딘(histidine) 폴리머를 포함함으로써 세포투과율이 현저히 높아 살아있는 세포의 단백질 분해효소의 존재여부나 발현정도를 실시간으로 영상화할 수 있다.(<실험예 1> 및 <실험예 4> 참조).

나아가, 본 발명의 융합 단백질 내에 포함된 저분자열충격단백질의 자가조립 특성에 의하여, 본 발명의 케이지 단백질은 케이지 외부에 수 많은 단백질 분해효소의 인식부위를 노출시켜, cage 단백질 당 결합되는 단백질 분해효소의 비율이 수 십 내지는 수 백배 증가될 수 있으며, 이러한 높은 결합비율은 단일 단백질 당 발생하는 형광 신호의 강도를 매우 높일 수 있다는 장점이 있다. 특히 본 발명의 케이지(cage) 단백질은 종래 분자영상화 방식에 사용된 단일 펩타이드에 비해 형광 신호의 강도가 20에서 50배 이상 높다.(<실험예 3> 참조)

또한 단백질 기반의 본 발명의 케이지 단백질은 그 재질 특성상 매우 생체 적합적이어서, 무기질 혹은 폴리머 기반의 영상용 프로브에 비해 세포나 생체조직에 독성이 매우 적다.(<실험예 5> 참조)

한편, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 융합 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 Methanococcus jannaschii 에서 유래된 저분자열충격단백질 단백질을 암호화하는 서열번호 1, DEVD 모티프를 암호화하는 서열번호 2, 그리고 histidine 폴리머를 암호화하는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결된 서열번호 4의 염기서열로 표시될 수 있다.(<실시예 1-1> 참조)

또한 본 발명의 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명에서 사용한 가능한 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터(promoter), 오퍼레이터(operator), 개시코돈(initiation codon), 종결코돈(termination codon), 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열(signal sequence) 또는 리더서열(leader sequence)을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

이와 같이 제조된 본 발명의 재조합 발현벡터는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 도 13의 개열지도로 표시될 수 있다.

또한 본 발명의 형질전환체는 상기 발현벡터로 형질 전환된 것으로 바람직하게는 대장균일 수 있다.

상기 형질 전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당업자에게 공지된 형질전환 기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격 유전자 전달법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

또한 본 발명의 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서는 본 발명의 케이지 단백질을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바이오 센서는 본 발명의 케이지 단백질을 유효성분으로 포함함으로써, 단백질 분해효소의 존재여부나 발현 정도를 분석하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질에 포함되는 단백질 분해효소의 인식분위로 DEVD 모티프를 사용하는 경우 카스파아제(caspase)의 존재여부나 발현 정도를 분석할 수 있다. 나아가 이를 통하여 살아있는 세포에서 세포사멸과정을 실시간으로 영상화할 수 있다.(<실험예 4> 참조)

따라서 본 발명의 바이오 센서는 진단용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 진단 대상 질환은 단백질 분해효소의 발현에 따라 유발되는 질환일 수 있다.

예를 들어, 상기 단백질 분해효소가 카스파아제(caspase)인 경우, 본 발명의 바이오 센서는 암, 골 관절염, 류마티스 관절염, 치매, 자가면역 질환 및 뇌졸중 으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 진단에 사용될 수 있다.(MacFarlane, M.; Williams, A. C. EMBO reports 2004, 5(7), 674-678.) 상기 암은 편평 상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암 등을 포함하는 암 등이 바람직하나 이에 한정되지는 않는다.

또한 상기 단백질 분해 효소가 MMP인 경우, 본 발명의 바이오 센서는 암 침윤(cancer invasion), 관절염(arthritis), 및 아테롬성 동맥 경화증 (atherosclerosis)로 이루어진 군에서 선택된 질환의 진단에 사용될 수 있다.(Van Lint, p.; Libert, C. J. Leukoc. Biol. 2007 82(6), 1375-1381.)

또한 상기 단백질 분해 효소가 Cathepsin S인 경우, 본 발명의 바이오 센서는 대장암(colorectal cancer), 치주염(periodontitis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 죽상동맥경화증(atheriosclerosis), 췌장염(pancreatitis) 및 위염(gastritis)으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 진단에 사용될 수 있다.( Kuester, D.; Lippert, H.; Roessner, A.; Krueger, S. Pathol. Res. Pract. 2008, 204(7), 491-500.)

또한 상기 단백질 분해 효소가 viral protease인 경우, 본 발명의 바이오 센서는 에이즈(AIDS) 또는 바이러스 감염 질환일 수 있다.( Brik, A.; Wong, C. H. Org. Biomol. Chem. 2003 1(1), 5-14.)

본 발명의 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 바이오 센서를 유효성분으로써 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

한편 본 발명의 생체활성물질 전달체는 본 발명의 케이지 단백질의 내부에 생리활성물질이 봉입된 것을 특징으로 한다.

상기 생체활성물질은 본 발명의 케이지 단백질 내에 봉입되어 생체 에 투여되는 경우 일정한 활성을 나타내는 물질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 항암제, 항생제, 호르몬, 심혈관계 약물, 위장관계 약물, 및 신경계 약물로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 약물은 저분자 약물, 단백질, 펩타이드, RNA, DNA를 포함하는 핵산 또는 변형 핵산계열, PNA, 합성신약, 백신, 면역 조절제, 및 난용성 약물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

구체적으로 상기 생체활성물질은 본 발명의 케이지 단백질에 포함된 단백질 분해효소와 관련된 것으로 상기 단백질 분해효소에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료 활성이 있는 약물일 수 있다.

예를 들어, 상기 단백질 분해효소가 카스파아제(caspase)인 경우, 상기 생리활성물질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 암, 골 관절염, 류마티스 관절염, 치매, 자가면역 질환, 뇌졸중 등의 질환의 예방 또는 치료제 일 수 있으며, 상기 암은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 편평 상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암 등을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 생리활성물질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라틴(cis-platin), 캠토세신(camptothecin), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(Anasterozole), 글리벡(Gleevec), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드(Leuprolide), 플로타미드(Flutamide), 졸레드로네이트(Zoledronate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈(Gemcitabine), 스트렙토조토신(Streptozocin), 카보플라틴(Carboplatin), 토포테칸(Topotecan), 벨로테칸(Belotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 히도록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 레티노익산(retinoic acid) 계열, 메소트렉세이트(Methotrexate), 메클로레타민(Meclorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 부술판(Busulfan), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 마이토마이신(Mitomycin), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantron), 아스피린(aspirin), 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

또한 상기 단백질 분해효소가 MMP인 경우, 상기 생리활성물질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 암 침윤(cancer invasion), 관절염(arthritis), 및 아테롬성 동맥 경화증 (atherosclerosis)로 이루어진 군에서 선택된 질환의 예방 또는 치료제일 수 있으며, 보다 바람직하게는 독시사이클린(Doxycycline), 미노사이클린(Minocycline), 마리마스탯(marimastat) 및 시페마스탯(cipemastat)으로 이루어진 군에서 선택된 약물일 수 있다.

또한 상기 단백질 분해효소가 Cathepsin S인 경우, 상기 생리활성물질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 대장암(colorectal cancer), 치주염(periodontitis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 죽상동맥경화증(atheriosclerosis), 췌장염(pancreatitis) 및 위염(gastritis)으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 예방 또는 치료제일 수 있으며, 보다 바람직하게는 Z-Phe-Gly-NHO- Bz-pMe일 수 있다.

또한 상기 단백질 분해효소가 viral protease인 경우, 상기 생리활성물질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 에이즈(AIDS) 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료제 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 사퀴나비르(Saquinavir)일 수 있다.

상기 본 발명의 케이지 단백질의 내부에 생리활성물질이 봉입되는 방식은 cage 안쪽의 잔기에 말레이미드(maleimide) 반응기를 이용하는 결합, 요오드아세틸(iodoacetyl) 반응기를 이용하는 결합 또는 피리딜 디설피드(pyridyl disulfide) 반응기를 이용하는 결합, charge-charge interaction을 이용한 결합 등이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

특히 본 발명의 생체활성물질 전달체는 세포투과능력이 매우 우수한 본 발명의 케이지 단백질을 이용한 것이므로 세포 내로 생체활성물질을 효과적으로 전달할 수 있다.

따라서 본 발명의 생체활성물질 전달체는 단백질 분해효소의 발현에 따라 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있으며, 상기 약학적 조성물에 대한 구체적인 사항은 앞서 기재한 바와 같다.

본 발명의 융합 단백질, 이의 자가 조립성질에 의해 형성된 케이지 단백질은 기존의 분자영상용 단일 펩타이드에 비해 세포 독성이 없으며, 단일 단백질 당 20-50배 이상의 높은 형광 신호를 발할 수 있고 세포투과능력이 매우 우수하여 바이오 센서나 생리활성물질 전달체로 효과적으로 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 융합 단백질의 자가조립성질에 의하여 cage 나노파티클을 형성한 모식도(A), 단일체로써의 융합 단백질의 분자모델(B), 및 세포사멸 영상화 모식도(C)를 나타낸 것이다.
도 2는 pET22b(+) 발현벡터에 HSP, HSP-histidine tag, HSP-DEVD motif, HSP-DEVD motif-histidine tag 및 HSP-DEVG motif-histidine tag를 삽입한 경우의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 융합 단백질이 삽입된 벡터로 형질 전환된 대장균에서, 상기 융합 단백질이 발현된 모습을 전기영동으로 확인한 결과이다.(T: total fraction, S: soluble fraction, I-: IPTG, I+: no IPTG).
도 4는 본 발명의 융합 단백질에 형광체(Cy5.5) 및 소광체(BHQ3)를 결합시키는 것을 나타낸 보여주는 모식도(A) 및 표지인자가 결합된 본 발명의 융합단백질이 cage 구조를 형성함을 size exclusion chromatography를 이용해서 확인한 결과, TEM 분석을 통해 cage 구조가 형성됨을 보여주는 결과, 12 bit CCD 카메라 (KODAK, Japan)을 이용하여 형광체만이 결합된 케이지 단백질과 형광체와 소광체가 모두 결합된 케이지 단백질의 모습을 나타낸 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 5는 히스티딘 폴리머가 결합된 HSP 또는 ApoHSP의 다양한 세포에 대한 세포 투과능력을 보여주는 사진이다.
도 6는 본 발명의 케이지 단백질이 caspase-3과 caspase-7에 특이적으로 반응하고 다른 caspase에는 형광을 발생하지 않으며, 특히 caspase-3 저해제를 첨가했을 경우 전혀 형광이 발생하지 않으므로 caspase-3와 caspase-7에 특이적임을 보여주는 사진이다.
도 7은 상기 도 6의 반응물에서 발생하는 형광을 각각 형광분광기를 이용하여 측정하여 비교한 그래프이다.
도 8은 단일 펩타이드 형태의 프로브와 본 발명의 케이지 단백질을 동일 농도에서 발생하는 형광량을 비교한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 cage 단백질의 생체적합성을 검증하기 위해 MTT 에세이를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 cage 단백질을 이용하여 세포사멸을 실시간 영상화한 도이다.(좌측 상단에서 우측방향으로: 정상세포 사진, 세포사멸 10분 후, 세포사멸 30분 후, 좌측 하단에서 우측방향으로: 세포사멸 1시간 후, 세포사멸 2시간 후, ApoHsp 대신 MockHsp를 처리했을 때)
도 11은 세포사멸 유도제에 의하여 세포내에서 활성화되는 caspase-3의 활성도와 발현량을 추적하기 위하여 항체를 이용하여 웨스턴 블랏한 결과이다.
도 12는 본 발명의 융합 단백질의 아미노산 서열을 Methanococcus jannaschii 에서 유래된 Hsp 단백질의 아미노산 서열과 비교한 결과이다.
도 13은 본 발명의 융합 단백질이 삽입된 발현벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

Hsp 에 DEVD 모티프와 histidine 폴리머가 연결된 융합 단백질의 제조

<1-1> 발현벡터 제조

Hsp(small heat shock protein)에 DEVD 모티프 및 histidine 폴리머가 순차적으로 연결된 융합 단백질을 제조하기 위하여 유전자 재조합 방법을 이용하였다.　구체적으로 대장균 (E. coli)의 발현벡터인 pET22b(+)(Novagen, US)를 사용하고, NdeI 및 XhoI 제한 효소를 이용하여 상기 융합 단백질을 발현시키는 염기서열을 삽입하였다.

상기 융합 단백질을 발현시키는 염기서열은 서열번호 4로 표시되며, 구체적으로 Methanococcus jannaschii 에서 유래된 Hsp(small heat shock protein) 단백질을 암호화하는 서열번호 1, DEVD 모티프를 암호화하는 서열번호 2, 그리고 histidine 폴리머를 암호화하는 서열번호 3이 순차적으로 연결된 것이다.

상기와 같이 pET22b(+) 발현벡터에 Hsp, DEVD 모티프, histidine 폴리머를 코딩하는 서열이 융합된 것(pET22b(+)/ApoHsp 부분)을 도식화하여 도 2에 기재하였으며, 본 발명의 융합 단백질이 삽입된 발현벡터의 개열지도를 도 13에 기재하였다.

<1-2> 발현 및 분리 정제

상기 <실시예 1-1>에서 제조된 발현 벡터를 이용하여 융합 단백질을 제조하기 위해 대장균을 형질전환하였다.

구체적으로 상기 <실시예 1-1>에서 제조된 발현벡터로 BL21(DE3) 숙주세포(New England Biolabs Inc)를 형질 전환시킨 후, LB 배지(Sigma-Aldrich Inc.)에 37℃에서 OD600 값이 0.5에 도달할 때가지 배양하고 IPTG(Isopropyl β-D thiogalactoside) 1mM을 첨가하여 발현을 유도하였다.

6시간 동안 추가 배양한 후, 세포를 수거하고 lysis 버퍼(50mM Tris-HCl, 8.0, 100mM NaCl, 1mM PMSF(phenylmethylsulfanylfluoride))를 이용하여 세포를 파괴한 후 soluble한 부분만을 정제에 이용하였다.

상기 정제를 위해, affinity 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 본 발명의 융합 단백질을 순수하게 정제하였고 정제된 단백질의 분자량을 변성 SDS-PAGE (denaturing SDS-PAGE) 전기영동을 통해 확인하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다.

구체적으로 상기 affinity 크로마토그래피는 Ni-NTA 컬럼(GE healthcare)을 사용하였으며 A 버퍼(50mM Tris-HCl, 8.0, 100mM NaCl)로 컬럼 준비와 단백질 로딩 후 washing을 수행한 다음, B 버퍼(50mM Tris-HCl, 8.0, 100mM NaCl, 500mM Immidazole)로 컬럼에 붙어있는 단백질을 용리(elution)하였으며, 전기영동(Laemmli, U. K. Nature 1970, 227, 680-685.)을 통하여 분자량을 확인하였다. 또한 상기 크기 배제 크로마토그래피는 Superdex 200 10/300 GL column (GE Heathcare)을 이용하였고 injection volume은 2mL이였으며 버퍼는 C 버퍼 (PBS, pH 7.4)를 사용하여 수행하였다.

상기 도 3에 기재한 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질은 16.5 kDa의 크기를 가지며, 이를 시퀀싱한 결과 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시됨을 알 수 있다

나아가 도 12에 기재된 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질의 아미노산 서열을 Methanococcus jannaschii 에서 유래된 Hsp 단백질의 아미노산 서열(서열번호 6)과 비교한 결과, Hsp 단백질에 DEVD 모티프 및 histidine 폴리머가 순차적으로 연결되어 있음을 알 수 있다.

<1-3> 표시인자 삽입 및 케이지 ( cage ) 형성

상기 <실시예 1-2>에서 제조된 융합 단백질에 형광염료 Cy5.5(GE Healthcare,)를 표시인자로 삽입하였다. 구체적으로 상기 융합 단백질의 DEVD 모티브에 시스테인(cysteine) 잔기를 포함시켜 제조하였으므로, 이에 형광 염료를 선택적으로 결합시킬 수 있다. 즉 설프 하이드릴(sulf hydryl) 그룹과 선택적으로 공유결합을 할 수 있는 말리이미드(maleimide)를 포함하는 형광염료 Cy5.5를 본 발명의 융합 단백질의 시스테인 잔기와 공유결합시켰다. (도 4A 참조)

구체적으로 Cy5.5를 PBS 버퍼(pH 7.4)에 녹인 후 같은 버퍼에 들어있는 융합 단백질과 몰비 1:2로 Cy5.5를 과량 반응시켰으며 이때 반응온도와 시간은 각각 4C, 4시간으로 하였다.( Fujiwara, K., et al. (1988). J. Immunol. Methods 112, 77-83)

상기 표지인자를 도입한 후, size exclusion chromatography를 이용하여 확인한 결과, 형광염료 Cy5.5가 본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)에 결합하였음을 알 수 있으며 나아가 이러한 결합이 케이지(cage) 형성을 방해하지 않음을 확인하였다(도 4B).

구체적으로 Superdex 200 10/300 GL column (GE Heathcare)을 이용하여 크기배제 크로마토그래피를 수행하였으며 샘플의 injection volume은 2mL이었고 running buffer로 PBS 버퍼(pH 7.4)를 이용하였다. 샘플이 용리되는 부피가 약 9 내지 10mL에 해당됨으로써 융합 단백질이 cage를 형성한다는 것을 확인하였다

또한 Uranyl acetate로 negatively 염색한 후 Transmission electron microscopy에서 관찰한 결과 cage 형태를 확인할 수 있었다. 융합 단백질의 분자량은 대략 19kDa인데 SDS-PAGE 상에서 마커를 통해 일치함을 확인하였다. Special C mount lens와 Cy5.5 bandpass emission filter (680 to 720 nm, Omega Optical)가 장착된 12 bit CCD camera (Kodak, Japan)을 이용하여 샘플을 96-well plate에 담은 후 Cy5.5가 결합된 융합단백질에서는 형광이 발생하지만 BHQ3 소광체를 부착시켰을 경우 형광이 사라지는 것을 확인하였다.,(도 4B)

또한, Cy5.5가 결합된 케이지(cage)에 소광체인 BHQ3(Black Hole Quencher, GE Healthcare)를 결합시켜서 형광시그널이 소광되는 것을 확인하였다(도 4B). 상기 BHQ3는 NHS(N-Hydroxysuccinimide) ester 그룹을 포함하고 있어서 cage 표면에 존재하는 192개의 라이신(lysine) 잔기(서열번호 5의 55, 65, 82, 110, 116, 123, 141, 142번째에 위치 x 24 단일체)의 아민(amine) 그룹을 이용하여 공유결합시켰다. 구체적으로 BHQ3를 PBS 버퍼 (pH 7.4)에 녹인 후 융합 단백질과 몰비 1:2로 과량 넣은 후 4C에서 4시간 반응시켰다.(Fujiwara, K., et al. (1988). J. Immunol. Methods 112, 77-83.)

결국 도 4에 기재한 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)의 고유한 대칭구조로 형광체와 소광체간의 소광현상이 가능하고, 형광체와 소광체간의 근접한 거리도 역시 소광현상이 가능하게 함을 알 수 있다. 상기와 같이 본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)를 ApoHsp라고 명명하였다.

< 실험예 1>

본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)의 세포투과 활성

상기 <실시예 1-3>에서 본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)의 세포 투과성을 확인하기 위하여, mouse colon carcinoma cell line인 CT26(Ojo-Amaize, E. A. et al. World J. Gastroenterol. 2007, 13(34), 4586-4588.), human colon cancer cell line인 HT29(Lu, X. et al. Cancer Research 1992, (52), 3718-3725), human breast cancer cell line인 MDA-MB231(Cassoni, P. et al. Journal of Cancer 1998, 72(2), 340-344.), 인간자궁경부암 유래 HeLa 세포(Qu, X. et al. J. Biochem. Mol. Biol. 2004, 37(4), 445-453.)에 대한 세포투과 실험을 수행 하였다.

구체적으로 histidine 폴리머가 융합된 ApoHsp와 HSP를 상기 세포에 약 10ug/ml로 처리하고 그 결과를 분석하여 도 5에 기재하였다.

보다 구체적으로 histidine 폴리머가 융합된 Hsp-His와 ApoHsp, 그렇지 않은 Hsp의 각각 세 가지에 대하여 maleimide가 있는 Cy5.5를 cage 외부에 위치하는 lysine자리에 결합시킨 후 위에 열거한 세포에 대하여 10ug/ml로 처리하고 시간 별로 현미경으로 관찰하였다. 사용한 현미경은 Achroplan IR40 x/0.80W lens, Cy5.5용 a fluorescence filter(Omega optical), Axiocam black and white CCD camera(Carl Zeiss)가 부착된 Axioskop2 FS plus imaging microscope (ZEISS)이다.

상기 도 5에 기재한 바와 같이 histidine 폴리머가 융합된 ApoHsp와 HSP는 모두 1시간 이내에 우수한 세포 침투 결과를 보였으나, histidine 폴리머가 융합되지 않은 경우에는 세포 내로 침투하지 못함을 알 수 있다.

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 융합 단백질에 도입된 histidine 폴리머가, 자가조립 결과로 형성된 케이지(cage)의 외부에 다중적으로 노출됨으로써 케이지(cage)에 세포투과성을 부여하는 것으로 판단된다.

< 실험예 2>

본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)의 기질 특이성

상기 <실시예 1-3>에서 본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)가 특정 카스파아제(caspase)에만 반응하는지 여부를 확인하기 위하여, 인간 유래의 caspase-3(NCBI accession no: NP_004337.2), caspase-7(NCBI accession no: NP_001218.1.), caspase-8(NCBI accession no: NP_001073593.1), caspase-9(NCBI accession no: NP_001220.2.)의 다양한 caspase에 대하여 본 발명의 융합 단백질이 반응하는지 여부로 확인하여 그 결과를 도 6 및 도 7에 기재하였다.

구체적으로 96-well plate를 이용하여 10ug의 케이지 단백질을 0.1 unit의 caspase-3, -7, -8, -9 (R&D Systems에서 구입) 각각에 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. Special C mount lens와 Cy5.5 bandpass emission filter (680 to 720 nm, Omega Optical)가 장착된 12 bit CCD camera (Kodak, Japan)을 이용하여 형광발생을 관찰하였다. 반응 버퍼의 조성은 25mM HEPES, pH 7.5, 0.1 % CHAPS, 및 10mM DTT이다. Control 반응은 효소가 없는 조건이며 전혀 형광을 발생시키지 않았다.

상기 도 6 및 도 7에 기재된 바와 같이, caspase-3와 반응하였을 때 ApoHsp는 소광 상태와 비교했을 때 약 7배 증가된 형광시그널을 보였으며 caspase-7에서는 약 4배의 형광이 발생했다. 하지만 다른 두 caspase에 대해서는 전혀 형광이 발생하지 않음으로써 caspase-3에 가장 특이적인 반응을 보임을 알 수 있었고, 또한 caspase-3의 저해제인　Z-DEVD-FMK(R&D Systems)을 이용하여 본 발명의 ApoHsp가 형광발생이 현저히 감소하는 것을 통해 caspase-3에 특이적으로 결합할 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 3>

본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)의 형광복원력

본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)인 ApoHsp의 형광복원력, 즉 고효율로 기질과 결합하는지 여부를 확인하기 위해, 종래 분자영상화 방식에 사용된 단일 펩타이드 기반의 프로브를 제조하여 비교하였다.

구체적으로 DEVD 모티프가 포함된 서열번호 7의 폴리펩타이드에 Cy5.5와 BHQ3를 각각 시스테인 잔기와 N-말단의 아민 그룹에 각각 결합시킨 후, caspase-3에 반응하여 발생되는 형광량을 ApoHsp와 비교하고 그 결과를 도 8에 기재하였다.

상기 도 8에 기재한 바와 같이, ApoHsp가 단일 펩타이드에 비하여 20에서 50배 이상 형광시그널이 증가하였다. 이를 통해, 본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)가 종래 분자영상화 방식에 사용된 단일 펩타이드에 비해 고효율로 기질과 결합함을 알 수 있다.

< 실험예 4>

본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)의 세포사멸 실시간 영상화

본 발명의 ApoHsp를 사용하여 살아있는 세포에서 세포사멸을 영상화하고 그 결과를 도 10에 기재하였다.

구체적으로 커버슬립(coverslip)에서 키운 HeLa cell (1 x 10⁵)을 100㎍/mL CaCl₂ 과MgCl₂이 포함된 PBS 버퍼에서 10㎍/mL ApoHsp을 37℃에서 1시간 반응시킨 후 DMEM(dulbecco's modified eagle's medium)에서 1시간 동안 안정화시켰다. 세포사멸유도리간드(TRAIL) 50ng/mL을 처리하여 세포사멸을 유도한 후 12 bit CCD camera CoolSNAP fx (Photometrics)가 부착된 형광현미경 IX81-ZDC (OLYMPUS)을 이용하여 관찰하였다. 영상분석은 MetaMorph (Molecular Devices)을 사용하였다.

상기 도 10에 기재한 바와 같이, ApoHsp를 처리한 세포에 대하여 세포사멸 유도제인 TRAIL(R&D Systems)을 처리해서 세포사멸을 유도할 때 약 10분 경과부터 형광이 관찰되면서 1시간 이내에 최대의 형광을 관찰하였다. 하지만 DEVD 모티프가 변형되어 caspase를 인식하지 못하는 MockHsp의 경우 전혀 형광이 관찰되지 않았다.

나아가 TRAIL을 이용한 세포사멸에서 caspase-3 효소가 활성화되는지를 확인하기 위하여, 활성화된 caspase-3만을 인식하는 항체(anti-caspase-3 antibody, Cell Signaling Technology Inc.)를 사용하여 Western blotting을 수행했을 때, TRAIL 처리 후 시간에 따른 활성화된 caspase-3의 증가를 확인하였다 (도 11).　

구체적으로 HeLa cell을 TRAIL로 처리한 후 lysis buffer(1 % SDS, 10 % glycerol, 10 % 2-mercaptoethanol, 0.001 % Bromophenol Blue, 50 mM Tris/HCl, pH 6.8)을 이용하여 세포 파괴하였다. 약 10ug의 샘플을 18% SDS polyacrylamide gel에 로딩하여 전기 영동한 후 니크로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)에 전이(trasfer)시켰다. 구체적인 방법은 인용문헌(Scaffidi, C.; Fulda, S.; Srinivasan, A. EMBO J. 1998, 17, 1675-1687.)을 참조하였다.

< 실험예 5>

본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage)의 생체 적합성

상기 <실시예 1-3>에서 본 발명의 융합 단백질로 형성된 케이지(cage), ApoHsp의 생체 적합성을 평가하기 위해, MTT 분석을 수행하고 그 결과를 도 9에 기재하였다.

구체적으로 기하급수적인 증가 단계(Exponential growth phase)에 있는 HeLa cell을 96-well plate에서 20000cells/well이 되도록 키운 후, ApoHsp을 1에서 100ug/mL 농도로 각 well에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. MTT 용액 (0.5mg/mL)을 well 당 200uL씩 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 후 DMSO 200uL를 넣고 10분간 반응시키고 570nm 파장에서 ELISA를 이용하여 측정하였다. 보다 구체적인 과정은 인용문헌(Choi, Y. H.; Liu, F.; Kim, J. S.; Choi, Y. K.; Park, J. S.; Kim, S. W. J. Control. Rel. 1998, 54, 39-48.)을 참조하였다.

상기 도 9에 기재한 바와 같이, ApoHsp의 농도가 100ug/ml까지 증가했음에도 불구하고, 세포수는 ApoHsp가 처리되지 않은 것과 비교할 때 전혀 감소되지 않았으며 이것은 본 발명의 ApoHsp가 매우 생체 적합하여 독성을 가지지 않음을 보여준다. 반면 폴리머 기반의 세포사멸 프로브(Kim, K.M. et al. 2006)의 경우 20ug/ml이상의 농도에서 세포 독성을 보이며 약 100ug/ml에서는 약 50 %의 세포만이 살아남았다고 보고된 바 있다.

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(a) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 저분자열충격단백질(small heat shock protein, Hsp)의 카르복실 말단(carboxyl terminal)에,
(b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 단백질 분해효소의 인식부위 및
(c)서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 히스티딘(histidine) 폴리머
가 순차적으로 연결된,
서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 융합 단백질.
제9항에 있어서, 상기 융합 단백질은 표지인자가 삽입된 것인 융합 단백질.
제10항에 있어서, 상기 표지인자는 형광체 및 형광체에 특이적인 소광체인 것인 융합 단백질.
제11항에 있어서, 상기 형광체는 상기 (b)의 인식부위에 표지되고, 상기 소광체는 상기 (a)의 저분자열충격단백질에 표지된 것인 융합 단백질.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 융합 단백질로 구성된 케이지(cage) 단백질.
제13항에 있어서, 상기 케이지 단백질은 융합 단백질이 단위체로써 규칙적으로 배열된 것인 케이지 단백질.
제9항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제15항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 표시되는 것인 폴리뉴클레오티드.
제15항의 폴리뉴클레오티드가 도입된 발현벡터.
제17항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 13의 계열지도로 표시되는 것인 발현벡터.
제17항의 발현벡터로 형질 전환된 형질전환체.
제19항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균인 것인 형질전환체.
제13항의 케이지 단백질을 유효성분으로 포함하는 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서.
제21항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 카스파아제(caspase), 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases; MMP), 카텝신 S(cathepsin S), 및 바이러스성 단백질 분해효소(viral proteases)로 이루어진 군에서 선택된 것인 바이오 센서.
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