CN112543807A - 片段化的grs多肽、其变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及片段化的GRS多肽及其变体及其应用，更具体地涉及：由8‑170个连续氨基酸组成的分离的多肽，其包含SEQ ID NO:1所的氨基酸序列的第531‑538位氨基酸，或者由与所述多肽具有80％或更高的序列同源性的变体组成的多肽；包含所述多肽的融合蛋白及复合物；编码所述多肽的多核苷酸；及其在预防和治疗赘生性疾病、检测癌细胞、成像和药物输送中的应用。

Description

片段化的GRS多肽、其变体及其应用
技术领域
本申请要求于2018年5月23日提交的韩国专利申请No.10-2018-0058647的优先权权益，其全部内容引入本文。
本发明涉及片段化的GRS多肽、其变体及其应用。更具体地，本发明涉及由8-170个连续氨基酸组成的分离的多肽，其含有SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列的第531-538位的氨基酸；或者与所述分离的多肽具有80％或更高的序列同源性的变体，包含所述多肽的融合蛋白以及包含所述多肽的复合物，编码所述多肽的多核苷酸，及其在预防和治疗赘生性疾病、检测癌细胞、对癌细胞进行成像以及将药物输送至癌细胞中的应用。
背景技术
催化tRNA分子氨酰化的氨酰基tRNA合成酶(ARS或AARS)对于翻译过程中的遗传信息解码至关重要。每个真核tRNA合成酶均由核心酶(与原核对应物密切相关)和额外的结构域(附加于核心酶的氨基或羧基末端)组成。因此，在真核生物和原核生物之间，所述酶的组成存在显著差异。例如，人酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)的羧基末端结构域不是原核和低等真核TyrRS分子的一部分。
最近已经证实了几种氨酰基-tRNA合成酶具有不同于其参与翻译的非常规功能。即，发现ARS蛋白的一些片段保留了与氨酰化无关的出乎意料的活性，因此表现出超出翻译之外的不同类型的细胞外信号传导调节途径。这种出乎意料的活性经常可用于治疗特定疾病，但是在大多数情况下，反而可能具有引起人体疾病发作的风险。例如，赖氨酰-t-RNA合成酶(KRS)被鉴定为具有促进转移的活性(韩国专利No.10-1453141)。此外，小酪氨酰tRNA合成酶(mini-TRS)是被多形核细胞弹性蛋白酶和纤溶酶裂解的TyrRS的N末端结构域(对应于氨基酸残基1-364)，具有在全长蛋白质中未发现的非常规生物学活性。在体外，显示mini-TyrRS刺激内皮细胞增殖和迁移(Wakasugi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.99:173-177(2002))，且在小鼠基质胶测定中具有促血管生成作用。通常，促进血管生成的功能与癌症转移密切相关。
这种出乎意料的活性在天然的全长氨基酸序列中可能观察不到(或者在全长蛋白质水平上仅示出不显著的作用)，但在截短形式中可能会突显。此外，在截短的蛋白质中的特定活性可能保留治疗上不合适的性质。为了克服不可预测性的问题及利用这个蛋白家族的治疗潜力，需要鉴定其它氨酰基-tRNA合成酶蛋白的生物学相关形式。
在制药工业中，存在从过去的天然产物或化学合成药物向蛋白质或肽药物变化的发展趋势。在世界药物市场中，蛋白质或肽类药物的市场规模从2006年的437亿美元扩大到2011年的885亿美元。2006年，韩国国内蛋白质药物市场占世界市场的3％，预计到2021年将增长至7％。蛋白质或肽类药物因其副作用少且比合成药物更有效而被评估是药物学革新。
当前，生物医药在主要制药公司的管线中的重要性正在增加，但是在某些生物医药如肽问世之前，存在重大技术问题。例如，到靶位点的低输送率、长链肽合成等是商业化的障碍。通常，肽由大约50个或更少的氨基酸组成。成功作为肽类药物的关键取决于对短链和活性肽的利用，即从全长蛋白中挖掘具有生物活性的最小单位(基序)。长肽需要很高的生产成本，不容易合成，且呈现出机体吸收的问题。
当观察到一种蛋白质具有该蛋白质家族中尚未报道的新活性时，要找出导致所述新活性的生物学活性的基序是一项具有显著困难的艰难任务(Salma Aouled El HajMohamed et al.,Motif Discovery in Protein Sequences,Pattern Recognition-Analysis and Applications,December 14,2016,pp.1-134)。
发明详述
技术问题
本发明人鉴定了GRS(甘氨酰-tRNA合成酶)蛋白的癌细胞杀伤活性，并且首次揭示了各自保持GRS抗癌活性的结构域和核心基序。本发明人进行了深入细致的研究，结果发现，构建为预定长度的含有所述基序的GRS多肽片段及其变体在癌症杀伤活性方面远远优于全长蛋白质和结构域单位，从而导致本发明。
因此，本发明的目的是提供一种多肽，其包含：由连续的8-170个氨基酸残基组成的分离的多肽，其含有由SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列的第531-538位的氨基酸；或者与所述分离的多肽具有80％或更高的序列同源性的变体。
本发明的另一个目的是提供所述多肽的PEG化形式。
本发明的另一个目的是提供一种融合蛋白，其包括所述多肽和异源融合伴侣。
本发明的另一个目的是提供包括至少一个所述多肽的二聚体或多聚体复合物。
本发明的另一个目的是提供编码所述多肽的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供一种包含所述多核苷酸的表达载体。
本发明的另一个目的是提供一种包含所述表达载体的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其包含生理学可接受的载体和选自以下的至少一种：
(i)本发明的多肽，
(ii)包含(i)的多肽和异源融合伴侣的融合蛋白，
(iii)包含至少一个(i)的多肽的二聚体或多聚体复合物，
(iv)编码(i)至(iii)的多核苷酸，
(v)包含(iv)的表达载体，和
(vi)包含(v)的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其包含所述多肽或多核苷酸作为活性成分，以预防或治疗赘生性疾病。
本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其由所述多肽或多核苷酸组成作为活性成分，以预防或治疗赘生性疾病。
本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其基本上由所述多肽或多核苷酸组成作为活性成分，以预防或治疗赘生性疾病。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定抗癌剂的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
(a)形成含有(i)和(ii)的反应混合物：
(i)选自本发明的多肽和多核苷酸的成分，和
(ii)测试化合物；及
(b)确定在存在所述测试化合物条件下所述成分的抗癌活性增加，其中确定在存在所述测试化合物条件下的抗癌活性与在不存在测试化合物条件下的抗癌活性相比的变化，从而鉴定活性测试化合物。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其包含所述多肽作为活性成分，用于检测癌细胞或对癌细胞进行成像。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其由所述多肽(作为活性成分)组成，用于检测癌细胞或对癌细胞进行成像。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其基本上由所述多肽(作为活性成分)组成，用于检测或对癌细胞进行成像。
本发明的另一个目的是提供一种检测癌细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将所述多肽与生物学样品混合；(b)除去未结合或非特异性结合的多肽；(c)确定所述多肽是否结合以及在何处结合。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其包含所述多肽作为活性成分，用于进行癌细胞特异性药物输送。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其由所述多肽(作为活性成分)组成，用于进行癌细胞特异性药物输送。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其基本上由所述多肽(作为活性成分)组成，用于进行癌细胞特异性药物输送。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其包含所述多肽及与其结合的抗癌剂作为活性成分，用于预防和治疗癌症。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其由所述多肽和与其结合的抗癌剂(作为活性成分)组成，用于预防和治疗癌症。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其基本上由所述多肽和与其结合的抗癌剂(作为活性成分)组成，用于预防和治疗癌症。
本发明的另一个目的是提供了所述多肽或多核苷酸在制备预防和治疗赘生性疾病的制剂中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种预防和治疗赘生性疾病的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的包含所述多肽或多核苷酸作为活性成分的组合物的步骤。
本发明的另一个目的是提供所述多肽在制备用于检测癌细胞的制剂、对癌细胞进行成像的制剂或输送癌细胞特异性药物的制剂中的应用。
本发明的另一个目的是提供用于对癌细胞进行成像或用于癌细胞特异性药物输送的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的包含所述多肽作为活性成分的组合物的步骤。
本发明的另一个目的是提供所述多肽和与其结合的抗癌剂在制备用于预防和治疗癌症的制剂中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种预防或治疗癌症的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的包含所述多肽和与其结合的抗癌剂的组合物的步骤。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种多肽，其包含：由连续的8-170个氨基酸残基组成的分离的多肽，其包含由SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列的第531-538位的氨基酸；或者与所述分离的多肽具有80％或更高的序列同源性的变体。
为了实现另一个目的，本发明提供了所述多肽的PEG化形式。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种融合蛋白，其包含所述多肽和异源融合伴侣。
为了实现另一个目的，本发明提供了包含至少一个所述多肽的二聚体或多聚体复合物。
为了实现另一个目的，本发明提供了编码所述多肽的多核苷酸。
为了实现另一个目的，本发明提供了包含所述多核苷酸的表达载体。
为了实现另一个目的，本发明提供了包含所述表达载体的宿主细胞。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种组合物，其包含生理学可接受的载体和选自以下的至少一种：
(i)本发明的多肽，
(ii)包含(i)的多肽和异源融合伴侣的融合蛋白，
(iii)包含至少一个(i)的多肽的二聚体或多聚体复合物，
(iv)编码(i)至(iii)的多核苷酸，
(v)包含(iv)的表达载体，和
(vi)包含(v)的宿主细胞。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种药物组合物，其包含所述多肽或多核苷酸作为活性成分，用于预防和治疗赘生性疾病。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种药物组合物，其由的所述多肽或多核苷酸(作为活性成分)组成，用于预防和治疗赘生性疾病。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种药物组合物，其基本上由所述多肽或多核苷酸(作为活性成分)组成，用于预防和治疗赘生性疾病。
为了实现另一个目的，本发明提供一种鉴定抗癌剂的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
(a)形成含有(i)和(ii)的反应混合物：
(i)选自本发明的多肽和多核苷酸的成分，
(ii)测试化合物；及
(b)确定在存在所述测试化合物条件下所述成分的抗癌活性增加，其中确定在存在所述测试化合物条件下的抗癌活性与在不存在测试化合物条件下的抗癌活性相比的变化，从而鉴定活性测试化合物。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种组合物，其包含所述多肽作为活性成分，用于检测癌细胞或对癌细胞进行成像。。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种组合物，其由所述多肽(作为活性成分)组成，用于检测癌细胞或对癌细胞进行成像。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种组合物，其基本上由所述多肽(作为活性成分)组成，用于检测或对癌细胞进行成像。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种检测癌细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将所述多肽与生物学样品混合；(b)除去未结合或非特异性结合的多肽；及(c)确定所述多肽是否结合以及在何处结合。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种组合物，其包含所述多肽作为活性成分，用于进行癌细胞特异性药物输送。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种组合物，其由所述多肽(作为活性成分)组成，用于进行癌细胞特异性药物输送。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种组合物，其基本上由所述多肽(作为活性成分)组成，用于进行癌细胞特异性药物输送。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种组合物，其包含所述多肽及与其结合的抗癌剂作为活性成分，用于预防和治疗癌症。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种组合物，其由所述多肽和与其结合的抗癌剂(作为活性成分)组成，用于预防和治疗癌症。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种组合物，其基本上由所述多肽和与其结合的抗癌剂(作为活性成分)组成，用于预防和治疗癌症。
为了实现另一个目的，本发明提供了所述多肽或多核苷酸在制备用于预防和治疗赘生性疾病的制剂中的应用。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种预防或治疗赘生性疾病的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的包含所述多肽或多核苷酸作为活性成分的组合物的步骤。
为了实现另一个目的，本发明提供了所述多肽在制备用于检测癌细胞的制剂、对癌细胞进行成像的制剂或癌细胞特异性药物输送的制剂中的应用。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种用于对癌细胞进行成像或者用于癌细胞特异性药物输送的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的包含作为活性成分的所述多肽的组合物的步骤。
为了实现另一个目的，本发明提供了所述多肽和与其结合的抗癌剂在制备预防和治疗癌症的制剂中的应用。
为了实现另一个目的，本发明提供了一种预防或治疗癌症的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的包含所述多肽和与其结合的抗癌剂的组合物的步骤。
将在下文中详细解释本发明。
除非有明确相反的指示，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的分子生物学和重组DNA技术的常规方法，为了示例目的在下文中描述了其中许多方法。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请均以其全部内容引入本文。
在整个申请中，本发明的各个实施方案或条件可以以范围形式给出。除非另有说明，否则发明描述中的范围值是指包括相应的边界值，即从下限到上限的所有值。应当理解，以范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的硬性限制。因此，应该将范围的描述视为已明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对例如从7至170的范围描述应被视为已明确公开了子范围，例如从10至127、从23至35、从80至100、从50至169等，以及在该范围内的各个数字，例如9、27、35、101和155。无论范围的广度如何，此均适用。
本发明的术语“包含”与“含有”或“其特征在于”同义使用，且不排除在所述组合物或方法中未提及的其它组分要素或方法步骤。术语“由...组成”是指排除没有提及的其它要素、步骤或组分。术语“基本上由……组成”是指除了所述组分要素或步骤之外，还涵盖基本上不影响其基本性质的组分要素或步骤等。
如本文所用，单数形式“一(a、an)”、和“所述”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
术语“多肽”或“蛋白质”以其常规含义使用，即用于氨基酸序列。多肽不限于产物的特定长度，但在本发明的上下文中通常指全长蛋白质的片段。这个术语还旨在涵盖多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的其它修饰(天然存在的和非天然存在的)。可以使用本领域已知的任何各种重组和/或合成技术制备本发明的多肽和蛋白质，其示例的实施方案将在下面另外描述。
如本文所述，“(氨基酸单字母)(氨基酸位置)(另一个氨基酸单字母)”是指在原始多肽(例如本申请中的全长GRS序列)的相应氨基酸位置的前一种氨基酸被后一种氨基酸取代。例如，E536D是指野生型多肽序列(SEQ ID NO:1的GRS)的第536位的谷氨酰胺残基被天冬氨酸取代。
观察到与甘氨酰-tRNA合成酶(GRS)和GRS-衍生的特定多肽相关的非常规和治疗相关活性导致了本发明。
如本文所用，“非常规活性”通常是指本发明的GRS多肽具有的除了将甘氨酸加在tRNA分子上的活性之外的活性。如本文所述，在某些实施方案中，本发明的GRS多肽表现出的非常规生物学活性可以包括但不限于细胞增殖的调节、细胞凋亡的调节、细胞迁移的调节、细胞信号传导的调节，和/或细胞因子产生和/或分泌的调节。在一个具体的实施方案中，所述活性可以包括Akt介导的细胞信号传导的调节、Erk1/2介导的细胞信号传导的调节以及GPCR介导的细胞信号传导的调节、内皮细胞管形成的调节以及细胞结合的调节。在另一个实施方案中，所述活性可包括CD71和/或CD80的调节。在另一个实施方案中，所述活性可包括细胞因子产生和/或释放的调节，其中所述细胞因子可以选自TNF-α、IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MIP1-α、MIP-1β、GRO-α、MCP-1和IL-1ra。
根据本发明的一个方面，本发明不仅提供了具有至少一种非常规生物学活性的分离的GRS多肽，而且还提供了基本上保留非常规活性的活性片段及其变体。
详细地，本发明人示出GRS(甘氨酰-tRNA合成酶)可以通过ERK的去磷酸化来抑制ERK信号传导，从而诱导肿瘤细胞的凋亡(Park MC,et al.(2012)Secreted human glycyl-tRNA synthetase implicated in defense against ERK-activatedtumorigenesis.Proc Natl Acad Sci U S A 109(11):E640-647.)。简而言之，甘氨酰-tRNA合成酶(GRS)从巨噬细胞中分泌，并与肿瘤细胞上表达的钙粘着蛋白6(CDH6)结合。GRS与CDH6结合并从CDH6释放磷酸酶2A(PP2A)。ERK信号传导参与肿瘤细胞的生长。释放的PP2A随后通过ERK的去磷酸化抑制ERK信号传导并诱导肿瘤细胞凋亡。
随后，本发明人揭示了覆盖GRS蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列上第511至685位氨基酸残基的蛋白质区域是具有针对肿瘤(癌)细胞的凋亡活性的结构域(以下称为“GRS-F4”)，首次报道了实质上导致细胞凋亡活性的基序是GRS蛋白质的氨基酸序列上从第532位至第538位氨基酸残基的区域。还发现具有预定长度并含有所述基序的多肽片段及其变体在活性方面显著优于常规蛋白质和结构域。在本发明中首次公开了GRS抗癌活性的核心基序。
因此，本发明提供了由8-170个连续氨基酸残基组成的分离的多肽，其含有由SEQID NO:1定义的氨基酸序列的第531-538位的氨基酸；或者
与所述分离的多肽具有80％或更高的序列同源性的变体。
此外，本发明提供了由8-170个连续氨基酸残基组成的分离的多肽，其基本上含有由SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列的第531-538位的氨基酸；或者
与所述分离的多肽具有80％或更高的序列同源性的变体。
在其一个特定的实施方案中，本发明提供了由7-170个连续氨基酸残基组成的分离的多肽，其含有在SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列的第532至538位的氨基酸；或者
与所述分离的多肽具有80％或更高的序列同源性的变体。
另外，本发明提供了由7-170个连续氨基酸残基组成的分离的多肽，其基本上含有SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列的第532至538位的氨基酸；或者
与所述分离的多肽具有80％或更高的序列同源性的变体。
如本文所用，术语“分离的多肽”是指GRS蛋白的截短形式。本发明的分离的GRS多肽是全长人GRS蛋白的连续片段。在另一个特定的实施方案中，GRS多肽是SEQ ID NO:1定义的人GRS蛋白的氨基酸序列上的连续片段。
所述片段的长度可以是任意的，且也可以保持(保留)至少一种感兴趣的非常规生物学活性。详细地，只要本发明的分离的GRS多肽由7-170个连续氨基酸组成，其包含SEQ IDNO:1定义的氨基酸序列上从第532至538位的氨基酸(以下称为“细胞凋亡基序”)，则可以赋予其任何序列长度。更特别地，只要本发明的分离的GRS多肽由8-170个连续氨基酸组成，其包含SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列上第531至538位的氨基酸，则可以赋予其任何序列长度。
本发明的分离的多肽包含覆盖由SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列上的第532至538位的氨基酸区域作为细胞凋亡基序。更特别地，本发明的分离的多肽包含覆盖由SEQ IDNO:1定义的氨基酸序列上的第531至538位的氨基酸区域。在本发明的一个实施方案中，对代表本发明建议的各个多肽的示例多肽GRS-DP-B(SEQ ID NO:2)、GRS-DP-A线性(SEQ IDNO:3，GRS 531-555aa)、GRS-DP(SEQ ID NO:4，GRS 531-600aa)和GRS-F4-NT-1(SEQ ID NO:6，GRS 526-685aa)测定其抗癌活性和靶向能力，并示出测定结果。结果，发现GRS-DP-B包含重要的活性基序。因此，报道只要含有所述基序，任何片段均可以实现本发明预期的非常规生物学活性(特别是细胞凋亡活性)。此外，观察到GRS-DP-B多肽具有特异性靶向癌细胞的卓越效果。因此，含有GRS-DP-B区域的任何片段均可达到本发明想要的显著的癌细胞靶向水平。
根据实施方案，可以理解的是本发明的分离的多肽包含SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列上第526至685位、531至685位、531至600位、531至555位或者531至538位的氨基酸残基。换句话说，本发明的分离的多肽包含选自SEQ ID NO:2-6的氨基酸序列。
特别地，本发明的分离的多肽可以基本上由选自SEQ ID NO:2-6和SEQ ID NO:15-36的氨基酸序列组成。更特别地，本发明的分离的多肽可以由选自SEQ ID NO:2-6和SEQ IDNO:15-36的氨基酸序列组成。
鉴于多肽的长度，本发明的分离的多肽可以由含有所述细胞凋亡基序的7-160个连续氨基酸组成。更特别地，本发明的分离的多肽可以由含有所述细胞凋亡基序的7-100个连续氨基酸组成。进一步地，本发明的分离的多肽可以由含有所述细胞凋亡基序的7-50个连续氨基酸组成。作为本发明的分离的多肽成员的氨基酸的数目可以是例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165或170，其中包含细胞凋亡基序。
更特别地，本发明的分离的多肽可以由含有所述细胞凋亡基序的7-20个连续氨基酸组成。更特别地，本发明的分离的多肽可以由含有所述细胞凋亡基序的7-10个连续氨基酸组成。
在一个更特别的实施方案中，本发明的分离的多肽可以由含有所述细胞凋亡基序的8-160个连续氨基酸组成。更特别地，本发明的分离的多肽可以由含有所述细胞凋亡基序的8-100个连续氨基酸组成。更特别地，本发明的分离的多肽可以由含有所述细胞凋亡基序的8-50个连续氨基酸组成。
更特别地，本发明的分离的多肽可以由含有所述细胞凋亡基序的8-20个连续氨基酸组成。更特别地，本发明的分离的多肽可以由含有所述细胞凋亡基序的8-10个连续氨基酸组成。
可以使用本领域已知的可用技术制备本发明中的“分离的多肽”，即“截短的GRS多肽”。例如，可以使用各种蛋白酶制备。蛋白酶的具体示例包括无色肽酶、氨基肽酶、安克洛酶、血管紧张素转化酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、钙蛋白酶I、钙蛋白酶II、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶P、羧肽酶W、羧肽酶Y、胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶11、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、木瓜凝乳蛋白酶、糜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、补体C1r、补体C1s、补体因子D、补体因子I、黄瓜素、二肽肽酶IV、白细胞弹性蛋白酶、胰腺弹性蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C、肠激酶、因子Xa、无花果蛋白酶、弗林蛋白酶、颗粒酶A、颗粒酶B、HIV蛋白酶、IGase、组织激肽释放酶、亮氨酸氨基肽酶(一般)、亮氨酸氨基肽酶(细胞溶质)、亮氨酸氨基肽酶(微粒体)、基质金属蛋白酶、甲硫氨酸氨基肽酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤溶酶、脯氨酸二肽酶(prolidase)、链霉蛋白酶E、前列腺特异抗原、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的嗜碱蛋白酶、来自曲霉的蛋白酶、来自Aspergillussaitoi的蛋白酶、来自酱油曲霉(Aspergillus sojae)的蛋白酶、来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)蛋白酶(碱性或碱性蛋白酶)、来自多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)的蛋白酶、来自芽孢杆菌物种的蛋白酶、来自根霉物种的蛋白酶、蛋白酶S、蛋白酶体、来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶A、蛋白酶K、蛋白C、焦谷氨酸氨基肽酶、肾素、链激酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、组织纤溶酶原激活剂、胰蛋白酶、类胰蛋白酶和尿激酶。考虑到待构建的片段的化学特异性，本领域技术人员可以容易地确定哪种蛋白酶是合适的。
本文所述多肽可以使用本领域技术人员已知的任何合适方法制备，例如通过重组技术制备。除重组技术外，本发明的多肽还可以使用固相技术通过直接肽合成方法产生(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。
固相肽合成(SPPS)方法可以通过将称为接头的功能单元连接在小多孔珠上起始合成，在所述珠上诱导生成肽链。与液相方法不同，所述肽共价结合于所述珠，以防止其通过过滤而脱落，直至新生链被某些反应物如三氟乙酸(TFA)裂解为止。SPPS通过重复以下循环来实现：保护，其中固定在固相上的肽的游离N末端氨基与N末端保护的氨基酸单元偶联；脱保护；及偶联，其中将新显示的游离N-末端氨基重新偶联至另一个氨基酸单元(脱保护-洗涤-偶联-洗涤)。SPPS方法可以借助微波辐射进行。通过在肽合成过程中施加热能，微波辅助的肽合成可以减少每个循环中偶联和脱保护所需的时间。热能可以防止延伸的肽链折叠或聚集，及可以促进化学键合。
此外，可以使用固相肽合成方法合成本发明的肽。至于具体方法，可参考以下文献：美国专利No.5,516,891。此外，本发明的肽可以通过各种方法合成，例如固相和液相合成方法的组合，所述制备方法不限于本文所述的方法。
蛋白质合成可以使用人工技术或通过自动化合成。例如，可以使用AppliedBiosystems 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)实现自动化合成。或者，可以分别化学合成各种片段，并使用化学方法组合以产生所需分子。
本发明的多肽包含与来自GRS的分离的多肽具有80％或更高的序列同源性的GRS变体。如本文所用，术语“GRS变体”是指分离的多肽片段的活性变体，其中所述活性变体保留其源多肽的至少一种想要的非常规活性(即细胞凋亡活性)。在一个实施方案中，本发明的变体，无论是天然存在的还是人工产生的，其可以是具有至少一种本文所述非常规活性的剪接变体。在另一个实施方案中，所述变体，无论是天然存在的还是人工产生的，其包含针对野生型GRS多肽的至少一个点突变，所述突变多肽保留例如本文所述的至少一种非常规活性。即，所述变体(或术语“活性变体”)应理解为是所述“分离的多肽”的功能等同物。
更具体地，所述变体(GRS变体)是与上述任何“分离的(GRS)多肽”序列沿着其长度具有至少80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或者99％或更高的序列同源性。
在本发明的一个实施方案中，测定了从分离的多肽构建的变体的活性，特别是示出GRS-DP-A环状变体(SEQ ID NO:7，GRS-DP-A线性的变体)具有极佳的抗癌细胞的凋亡活性。因此，鉴于80％或更高的序列同源性，本发明的分离的GRS多肽片段可呈现出本发明想要的非常规生物学活性(特别是细胞凋亡活性)。另外，鉴定了变体如GRS-DP-A环状具有显著的癌细胞靶向能力。
在一个实施方案中，本发明的变体可包含与SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列上第526至685位、531至685位、531至600位、531至555位或531至538位的氨基序列具有80％或更高的序列同源性的序列。换句话说，所述变体可包含与选自SEQ ID NO:2-6的一个氨基酸序列具有80％或更高的序列同源性的序列。
特别地，本发明的分离的多肽可以基本上由与选自SEQ ID NO:2-6和SEQ ID NO:15-36的任一序列具有80％或更高序列同源性的序列组成。更特别地，本发明的分离的GRS多肽可以由与选自SEQ ID NO:2-6和SEQ ID NO:15-36的任何氨基酸序列具有80％或更高的序列同源性的序列组成。
最特别地，本发明的变体可以是包含由SEQ ID NO:7定义的氨基酸序列的多肽，或者基本上由SEQ ID NO:7定义的氨基酸序列组成的多肽，更特别地是由SEQ ID NO:7定义的氨基酸序列组成的多肽。
所述变体得自“分离的多肽”中的任何修饰，其可以是至少一个取代、缺失、添加和/或插入。所述变体可以是天然存在的突变体，或者可以是合成(例如通过改变或修饰本发明的至少一个多肽序列并测定其生物学活性)产生的。
在某些实施方案中，变体包含保守取代。“保守取代”是其中一个氨基酸被另一个具有相似性质的氨基酸取代，由此本领域技术人员可以预期所述多肽的二级结构和亲水性质(疏水性或亲水性)基本上不变。天然存在的氨基酸保守取代的实例如下所示：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；及(5)phe、tyr、trp、his。
可以对本发明的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，仍然获得功能分子，其编码具有想要的特征的变体或衍生多肽。当需要改变多肽的氨基酸序列以产生本发明的GRS多肽的等同或甚至改良的变体时，本领域技术人员例如可以基于本领域已知的蛋白质密码子信息改变一个或多个密码子。
蛋白质结构中某些氨基酸可以被其它氨基酸取代，而不明显丧失与诸如抗体的抗原结合区、底物分子上的结合位点等结构的相互作用结合能力。由于蛋白质的相互作用能力和性质通常决定了蛋白质的生物学功能活性，因此可以在蛋白质序列，当然也可以在其基础的DNA编码序列中，进行某些氨基酸序列取代，但是仍然可以获得具有相似性质的蛋白质。
因此，预期可以在所公开的组合物的多肽序列或者编码所述多肽的相应DNA序列中进行各种改变，而不会明显丧失其所需的效用或活性。在产生这种改变时，也可以考虑氨基酸的亲水性(hydropathic)(疏水的或亲水的)指数。本领域通常了解氨基酸亲水性指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能中的重要性(Kyte and Doolittle，1982，引入本文)。例如，已知氨基酸的相对亲水性质有助于所得蛋白质的二级结构，这继而定义了蛋白质与其它分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。基于其疏水性和电荷特性，已为每个氨基酸指定了亲水指数(Kyte and Doolittle，1982)。这些数值是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)；
本领域已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或得分的其它氨基酸取代，仍然产生具有相似生物学活性的蛋白质(即仍然获得生物学功能等同的蛋白质)。在产生这种改变时，优选亲水指数在±2之内的氨基酸取代，特别优选亲水指数在±1之内的那些氨基酸，更特别优选亲水指数在±0.5之内的那些氨基酸。
本领域还理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。如美国专利US4,554,101详细描述，如下亲水性数值指定给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；及色氨酸(-3.4)。应理解，氨基酸可以由具有相似亲水性数值的另一种氨基酸取代，仍然获得生物学等同的蛋白质。在这种改变中，优选亲水性数值在±2之内的氨基酸取代，特别优选亲水性数值在±1之内的那些氨基酸，更特别优选亲水性数值在±0.5之内的那些氨基酸。
如上所述，氨基酸取代可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到前述各种特征的示例性取代是本领域技术人员熟知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性数值的不带电荷的极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
在某些实施方案中，变体包含保守取代。“保守取代”是其中一个氨基酸被另一个具有相似性质的氨基酸取代，由此本领域技术人员可以预期所述多肽的二级结构和亲水性质(疏水性或亲水性)基本上不变。天然存在的氨基酸保守取代的实例如下所示：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；及(5)phe、tyr、trp、his。
变体可以还包含(或者替代地包含)非保守改变。在一个优选的实施方案中，变体多肽与天然序列的区别在于五个或更少的氨基酸的取代、缺失或添加。变体可以还(或替代地)通过例如缺失或添加对所述多肽的二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸而被修饰。
多肽可在蛋白质的N末端包含一个信号(或前导)序列，其共翻译地或翻译后地引导蛋白质的转移。多肽也可以与接头或其它序列缀合，以易于合成、纯化或鉴定多肽(例如聚His)，或增强多肽与固体支持物的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区缀合。
当比较多肽序列时，如下所述，如果进行最大对应性比对时两个序列中的氨基酸序列相同，则这两个序列被称为“相同”。两个序列之间的比较通常是通过在比较窗口上比较序列以鉴定和比较局部区域序列相似性。如本文所用，“比较窗口”是指至少大约20个连续位置的序列区段，通常为30-75、40-50个连续位置，其中可以将序列与相同数目连续位置的参考序列在最佳比对后进行比较。
用于比较的序列的最佳比对可以例如使用Lasergene生物信息学软件套件(DNASTAR,Inc.,Madison,Wis.)中的Megalign程序，使用默认参数进行。
或者，用于比较的序列的最佳比对可以通过局部相同性算法、相同性比对算法、搜索相似性方法、计算机执行程序(GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA，WisconsinGenetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,Wis.)或者通过检测进行。
适于确定序列相同性和序列相似性百分比的算法实例是BLAST和BLAST 2.0算法。BLAST和BLAST 2.0可以例如与本文所述参数一起使用，以确定本发明的多核苷酸和多肽的序列相同性百分比。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公开获得。对于氨基酸序列，可以使用评分矩阵计算累积得分。
当累积比对得分从其最大获得值降低数量X时，停止字串命中(word hits)在每个方向上的扩展；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。
在一个示例方法中，“序列相同性百分比”是通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对的序列而确定，其中比较窗口中的多肽序列部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可包含20％或更低、通常为5-15％或者10-12％的添加或缺失(即缺口)，以最佳比对两个序列。通过确定两个序列中出现相同氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将所述匹配位置数除以参考序列的总位置数(即窗口大小)并乘以100，得出序列相同性的百分比。
作为本发明提供的多肽，从GRS分离的多肽或其变体可以是线性形式或环状形式，这可以参考本文所述的实施例来理解。
作为本发明变体的环状肽的构建可以使用任何熟知的肽环化方法实现，而对具体环化方法和所得环化形式没有特别限制。优选地，本发明的环状肽的构建可以通过对线性肽进行切割或取代，从而使半胱氨酸残基位于每个相对的末端(N末端和C末端)，使得在两个末端的两个半胱氨酸残基之间形成一硫化物(monosulfide)键。
如本文所述，本发明的某些实施方案还考虑使用修饰的多肽，包括改良所述多肽(分离的多肽或其变体)的所需特性的修饰。本发明多肽的示例性修饰包括但不限于在一个或多个组成氨基酸上的化学和/或酶衍生，包括侧链修饰、主链修饰，及N末端和/或C末端修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化，以及碳水化合物或脂质组分、辅因子等的附着。示例的修饰还包括多肽的聚乙二醇化。
在某些方面，化学选择性连接技术可用于修饰本发明的多肽，例如通过以位点特异性和受控方式附着聚合物进行修饰。这种技术通常依赖于通过化学或重组方式将化学选择性锚定物掺入蛋白质主链，并随后用带有互补接头的聚合物进行修饰。结果，可以控制所得蛋白质-聚合物缀合物的组装过程和共价结构，从而能够合理优化药物性质，例如功效和药代动力学性质。
特别地，本发明提供本发明多肽的PEG化形式。
PEG是一种熟知的聚合物，具有在水和许多有机溶剂中的溶解性、无毒性及缺乏免疫原性的特性。其还是透明、无色、无味和化学稳定的。鉴于这些原因和其它原因，已选择PEG作为进行附着的优选聚合物，但仅将其用于说明而非限制。使用其它水溶性聚合物可以获得相似产品，包括但不限于：聚乙烯醇，其它聚烯烃氧化物例如聚丙二醇等，聚(氧乙基化多元醇)例如聚(氧乙基化甘油)等，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三氧杂环己烷，乙烯/马来酸酐和聚氨基酸。本领域技术人员基于所需剂量、循环时间、抗蛋白水解性和其它考虑因素可以选择希望的聚合物。
特别地，可获得各种PEG衍生物且适用于制备PEG缀合物。例如，以商标
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系列销售的NOF Corp.的PEG试剂提供了多种PEG衍生物，包括甲氧基聚乙二醇和活化的PEG衍生物，例如甲氧基-PEG胺，马来酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺酯和羧酸，可通过各种方法偶联于AARS多肽的N末端、C末端或者任何内部氨基酸。Nektar Therapeutics的高级PEG化技术还提供了不同的PEG偶联技术，可以潜在地改良基于AARS多肽的治疗剂的安全性和有效性。
对专利、公开的专利申请和相关出版物的搜索也将为阅读本发明公开内容的本领域技术人员提供重要的可能的PEG-偶联技术和PEG-衍生物。例如，美国专利No.6,436,386、5,932,462、5,900,461、5,824,784、和4,904,584；其内容全文引入本文，上述专利描述了这种技术和衍生物及其生产方法。
另外，本发明提供了包含所述多肽和异源融合伴侣的融合蛋白。
融合多肽是指直接或者通过氨基酸接头间接地与至少一个异源序列(融合伴侣)共价键合的本发明多肽。在融合蛋白中，通常通过将C末端与N末端连接而将组成多肽彼此融合；然而，可以通过将C末端与C末端连接、将N末端与N末端连接或者将N末端与C末端连接而构建融合多肽。所述组成多肽在融合蛋白中可以是任意顺序。
根据任何希望的目的从本质上(基本上、原则上)设计并包含融合伴侣。但是，其对于希望的多肽活性没有有害影响。在一个实施方案中，例如，融合伴侣包括帮助蛋白质比天然重组蛋白更高的产量表达的序列(表达增强子)。可以选择其它融合伴侣，以增加多肽的溶解度或使多肽靶向希望的细胞内区室。更进一步地，融合伴侣包括亲和标签，其促进多肽的纯化。
作为优选的示例，融合伴侣可以是抗体或其片段。另外，例如，所述片段可以选自Fc、双抗体、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv和scFv。
改良药代动力学性质的融合蛋白(”PK修饰子”)的实例包括但不限于与人白蛋白、抗体Fc结构域、聚Glu或聚Asp序列和运铁蛋白的融合。此外，与由氨基酸Pro、Ala和Ser(PAS化)或羟乙基淀粉(以商标
Figure GDA0002942415540000111
销售)组成的构象无序的多肽序列融合，提供了增加AARS多肽流体力学体积的简便方式。这种额外的延伸采用了大量随机结构，明显增加了所得融合蛋白的大小。通过这种方式，通常通过肾过滤的较小的AARS多肽的快速清除被延迟了几个数量级。IgG融合蛋白的额外使用也已经示出使得某些融合蛋白可以穿透血脑屏障。
改良渗透通过细胞膜的融合蛋白的实例包括与膜易位序列的融合。在此背景下，术语“膜易位序列”是指天然存在的及合成的氨基酸序列，其能够穿过细胞膜进行膜易位。代表性的膜易位序列包括基于源自Tat蛋白和同源异型转录蛋白Antennapedia的天然存在的膜易位序列的那些序列，以及全部或部分基于聚精氨酸和赖氨酸残基的合成的膜易位序列的那些序列。代表性的膜易位序列包括例如以下专利中揭示的那些序列：US5,652,122，US5,670,617，US5,674,980，US5,747,641，US5,804,604，US6,316,003，US7,585,834，US7,312,244，US7,279,502，US7,229,961，US7,169,814，US7,453,011，US7,235,695，US6,982,351，US6,605,115，US7,306,784，US7,306,783，US6,589,503，US6,348,185，US6,881,825，US7,431,915，WO0074701A2，WO2007111993A2，WO2007106554A2，WO02069930A1，WO03049772A2，WO03106491A2，及WO2008063113A1。
融合多肽通常可以使用标准技术制备。简而言之，可以将编码多肽组分的DNA序列分别组装，并连接于合适的表达载体中。使用或不使用肽接头，将编码一种多肽组分的DNA序列的3'末端与编码第二种多肽组分的DNA序列的5'末端连接，从而使序列的读框同相。这样允许翻译为保留两种组分多肽的生物学活性的单个融合多肽。将连接的DNA序列与合适的转录或翻译调节元件可操作地连接。负责DNA表达的调节元件仅位于编码第一个多肽的DNA序列的5'末端。相似地，翻译和转录终止信号需要的终止密码子仅存在于编码第二个多肽的DNA序列的3'末端。
可以使用肽接头序列将第一和第二多肽组分分开至足以确保每个多肽折叠成其二级和三级结构的距离。使用本领域熟知的标准技术将这种肽接头序列掺入融合多肽中。可以基于以下因素选择合适的肽接头序列：(1)其采用柔性延伸构象的能力；(2)其不能采用可以与第一个和第二个多肽上的功能性表位相互作用的二级结构的能力；及(3)缺乏可能与多肽功能性表位反应的疏水或带电残基。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。其它接近中性的氨基酸如Thr和Ala也可以用于接头序列。可有效地用作接头的氨基酸序列包括如以下文献中揭示的那些序列：Maratea et al.,Gene 40:39 46(1985)；Murphy etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258 8262(1986)；美国专利No.4,935,233和美国专利No.4,751,180。接头序列的长度通常可以是1个至大约50个氨基酸。当第一个和第二个多肽具有可用于分开功能结构域及防止空间干扰的非必需的N末端氨基酸区域时，则不需要接头序列。
通常，多肽和融合多肽(以及编码其的多核苷酸)是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是从其原始环境中移除的多肽或多核苷酸。例如，如果天然存在的蛋白质与天然系统中的某些或全部共存物质分开，则其是分离的。优选地，这种多肽是至少大约90％纯的，更优选是至少大约95％纯的，最优选是至少大约99％纯的。例如，如果将多核苷酸克隆进不是天然环境一部分的载体中，则认为该多核苷酸是分离的。
另外，本发明提供了包含至少一种多肽的二聚体或多聚体复合物。
在一个实施方案中，本发明的多肽可以是二聚体的一部分。二聚体可包括例如两个相同的GRS多肽之间的同源二聚体，两个不同的GRS多肽之间的异源二聚体(例如全长GRS多肽和截短的GRS多肽；或两个不同的截短的GRS多肽)和/或GRS多肽和异源多肽之间的异源二聚体。某些异源二聚体如GRS多肽和异源多肽之间的那些二聚体可以是双重功能的。
此外，本发明的多肽可以是多单元复合物的一部分。本发明的多单元复合物可包括例如至少3、4或5或更多个单体。本发明的单体和/或多单元复合物可以是可溶的，及可以是分离的或纯化为均质。多单元复合物的单体单元彼此可以是不同的、同源的、基本同源的或相同。
共价连接的单体可以是直接连接(通过键合)或者间接连接(例如通过接头)。为了直接连接本文的多肽，修饰多肽以增强二聚体化可能是有益的。例如，可以通过添加或取代一个或多个半胱氨酸以修饰GRS多肽的一个或多个氨基酸残基。产生氨基酸取代如半胱氨酸取代或其它修饰以促进连接的方法是本领域技术人员熟知的。
另外，本发明提供了编码所述多肽的分离的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的组合物。
如本文所用，术语“DNA”和“多核苷酸”及“核酸”是指已分离的不含特定种类的总基因组DNA的DNA分子。因此，编码多肽的DNA区段是指含有一个或多个基本上分离自或纯化自获得所述DNA区段的物种的总基因组DNA的编码序列的DNA区段。术语“DNA区段”和“多核苷酸”包括DNA区段和这种区段的较小片段，以及重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、病毒等。
如本领域技术人员将理解的，本发明的多核苷酸序列可包括表达或可适于表达蛋白质、多肽、肽等的基因组序列、基因组外和质粒编码的序列以及较小的工程化基因区段。这种区段可以是天然分离的，或者是人工合成修饰的。
如本领域技术人员将认识到的，多核苷酸可以是单链的(编码序列或反义序列)或双链的，可以是DNA分子(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。其它编码或非编码序列可以存在于本发明的多核苷酸内，多核苷酸可以但不必与其它分子和/或支持材料连接。
多核苷酸可包含天然序列或可包含这种序列的变体或生物学功能等同物。多核苷酸变体可以包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，如下文进一步描述，优选地使得相对于未修饰的多肽，所述编码的多肽的想要的非常规活性基本上未减弱。通常可以如本文所述评估对编码的多肽活性的影响。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含与甘氨酰-tRNA合成酶相同或互补的各种长度的连续序列区段，其中所述分离的多核苷酸编码本文所述多肽片段。
只要本发明提供的多核苷酸编码本发明的分离的多肽或其变体，则对其具体序列没有特别的限制，而是可以允许碱基序列(核酸序列)的任何组合。例如，SEQ ID NO:2的肽(GRS-DP-B，GRS 531-538)可以表达自含有SEQ ID NO:8的碱基序列的多核苷酸，但不限于此。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:3的肽(GRS-DP-A线性，GRS 531-555)可以表达自含有SEQ ID NO:9的碱基序列的多核苷酸，但不限于此。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:4的肽(GRS-D，GRS 531-600)可以表达自含有SEQ ID NO:10的碱基序列的多核苷酸，但不限于此。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:7的肽(GRS-D-A环状)可以表达自含有SEQ ID NO:11的碱基序列的多核苷酸，但不限于此。
在另一个实施方案中，本发明涵盖了在中等严格条件下可以与本文提供的多核苷酸序列或其片段或其互补序列杂交的多核苷酸。杂交技术为分子生物学领域已知。例如，适合于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸的杂交的中等严格条件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃、5×SSC杂交过夜；然后在65℃下用2x、0.5x和0.2x的含有0.1％SDS的SSC分别洗涤两次，每次20分钟。
本发明的多核苷酸，无论编码序列本身的长度如何，均可以与其它DNA序列例如启动子、聚腺苷酸化信号、额外的限制性酶切位点、多克隆位点、其它编码区段等组合，由此其总长度可能会有很大差异。因此，预期可以使用几乎任何长度的多核苷酸片段，总长度优选地受限于期望的重组DNA方案中的制备和使用的便利性。
本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在众多编码本文所述多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中有一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。然而，本发明特别涵盖了由于密码子用途的差异而变化的多核苷酸(例如人和/或灵长类动物的密码子选择优化的多核苷酸)。
此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是由于一种或多种突变(例如核苷酸的缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。所得的mRNA和蛋白质可以但不必具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定等位基因。
可以使用本领域已知和可获得的各种技术制备、操纵和/或表达多核苷酸及其融合物。例如，编码本发明多肽的多核苷酸序列或其融合蛋白或其功能等同物可用于重组DNA分子中，以指导本发明多肽在适当宿主细胞中的表达。由于遗传密码的固有简并性，可以产生编码基本相同或功能上等同的氨基酸序列的其它DNA序列，这些序列可以用于克隆和表达给定的多肽。
如本领域技术人员将理解的，在某些情况下，产生具有非天然存在的密码子的编码多肽的核苷酸序列可以是有利的。例如，可以选择特定原核或真核宿主优选的密码子以增加蛋白质表达速度或产生具有想要的性质的重组RNA转录物(例如半衰期比从天然存在的序列中产生的转录物的半衰期长)。
此外，本发明的多核苷酸序列可以使用本领域通常已知的方法进行工程化，以便出于多种原因改变多肽编码序列(包括但不限于修饰基因产物的克隆、加工、表达和/或活性的改变)。
另外，本发明提供了包含多核苷酸的表达载体及包含所述表达载体的宿主细胞。
为了表达想要的多肽，可以将编码所述多肽核苷酸序列或其功能等同物插入适当的表达载体(即含有转录和翻译插入的编码序列必需的元件的载体)。可以使用本领域技术人员熟知的方法构建包含编码感兴趣的多肽的序列以及合适的转录和翻译调节元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。
已知多种表达载体/宿主系统，其可用于包含和表达多核苷酸序列。这些载体包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或者动物细胞系统，包括基于病毒的表达系统。
表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的非翻译区(增强子、启动子、5'和3'非翻译区)，它们与宿主细胞蛋白质相互作用，以实现转录和翻译。这些元件的强度和特异性可以是变化的。根据所用的载体系统和宿主，可使用任意数目的适当的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。
例如,当克隆于细菌系统中时，可以使用诱导型启动子，如PBLUESCRIPT噬粒(Stratagene,La Jolla,Calif.)或PSPORT1质粒(Gibco BRI,Gaithersburg,MD)的杂合lacZ启动子等。在哺乳动物细胞系统中，通常优选的是来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生含有多个拷贝的多肽编码序列的细胞系，可以有利地使用含有合适选择性标记的基于SV40或EBV的载体。
在细菌系统中,可以根据所表达多肽的用途选择多种表达载体。例如，当需要大量时，可以使用指导易于纯化的融合蛋白高水平表达的载体。这些载体包括但不限于下述：多功能大肠杆菌克隆和表达载体，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中编码感兴趣多肽的序列可以与β-半乳糖苷酶的氨基末端Met和随后的7个残基的序列同框连接于载体中从而产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.264:5503 5509(1989)；等。pGEX载体(Promega,Madison,Wis.)也可用于将外来蛋白表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合的融合蛋白。通常，这些蛋白是可溶性的，并且可以方便地从裂解细胞纯化，其通过吸附于谷胱甘肽-琼脂糖凝胶珠，随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而纯化。在这类系统中制备的蛋白质可以设计为包括肝素、凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，从而克隆的感兴趣多肽可以如愿从GST部分中释放。
在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用许多含有组成型或诱导型启动子(如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体。
在使用植物表达载体的情况下，编码多肽的序列的表达可以由众多启动子中的任何一个驱动。例如，病毒启动子(例如CaMV的35S和19S启动子)可以单独使用或与TMV的ω前导序列组合使用(Takamatsu,EMBO J.6:307-311(1987))。或者，可以使用植物启动子如RUBISCO的小亚基或热激启动子。通过直接DNA转化或病原体介导的转染可以将这些构建体导入植物细胞中。这种技术为本领域已知。
昆虫系统也可以用于表达感兴趣的多肽。例如，在一个这样的系统中，AcNPV(苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒)被用作载体，以在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。可以将编码多肽的序列克隆进病毒的非必需区域例如多角体蛋白基因等中，并置于多角体蛋白启动子的控制下。多肽编码序列的成功插入将使多角体蛋白基因失活并产生缺乏包被蛋白的重组病毒。然后可以将重组病毒用于感染例如草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，在其中可以表达感兴趣的多肽。
在哺乳动物宿主细胞中，通常可以使用许多基于病毒的表达系统。例如，在将腺病毒用作表达载体的情况下，可以将编码感兴趣多肽的序列连接进由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。插入在病毒基因组的非必需E1或E3区域中可用于获得在感染的宿主细胞中能表达多肽的活病毒(Logan和ShenkProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3655-3659(1984))。另外，转录增强子例如Rous肉瘤病毒(RSV)增强子，可以用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
特异性起始信号也可以用于实现编码感兴趣多肽的序列的更有效翻译。这种信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在将编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入合适的表达载体中的情况下，可能不需要额外的转录或翻译控制信号。然而，在仅插入编码序列或其一部分的情况下，应提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应位于正确的读框中，以确保整个插入序列的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以来自天然和合成的各种来源。通过包含适于所用特定细胞系统的增强子可以提高表达效率。
另外，可以根据宿主细胞的调节插入序列的表达或者以所需方式加工表达的蛋白质的能力选择宿主细胞。多肽的这种修饰包括但不限于翻译后修饰，例如乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。裂解蛋白质的“前原”形式的翻译后加工也可以用于帮助正确插入、折叠和/或功能。可以选择不同的宿主细胞(例如酵母，CHO，HeLa，MDCK，HEK293和W138，其具有或甚至缺乏这种翻译后活性的特异性细胞机器和特征机制)，以确保外源蛋白质的正确修饰和加工。
为了长期、高产量生产重组蛋白，通常优选稳定表达。例如，可以使用表达载体转化稳定表达感兴趣多核苷酸的细胞系，所述表达载体在同一载体或不同载体上可以含有复制病毒起点和/或内源性表达元件和选择标记基因。
在引入载体后，将细胞在富集培养基中生长大约1-2天，之后将其换至选择性培养基中。选择标记的目的是赋予选择抗性，其存在允许成功表达所述导入序列的细胞的生长和回收。稳定转化的细胞的抗性克隆可以使用适合细胞类型的组织培养技术进行增殖。
许多选择系统可以用于回收转化的或转导的细胞系。这些系统包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wigler et al.,Cell 11:223-232(1977))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy et al.,Cell 22:817-823(1990))基因，其可分别用于tk-或aprt-细胞中。
抗代谢物、抗生素或除草剂抗性也可以用作选择的基础；例如，dhfr，其赋予氨甲蝶呤抗性(Wigler et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,77:3567～70(1980))；npt，其赋予氨基糖苷、新霉素和G-418抗性(Colbert-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1～14(1981))；以及als或pat，其分别赋予氯磺隆抗性和草丁膦乙酰转移酶。本领域已经描述了其它选择基因，例如trpB，其使细胞可以利用吲哚代替色氨酸，或者hisD，其使细胞可以利用组氨醇(histinol)代替组氨酸(Hartman and Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8047-51(1988))。可见标记的使用已经普及，例如绿色荧光蛋白(GFP)和其它荧光蛋白(例如RFP，YFP)、花青苷类、β-葡萄糖醛酸苷酶及其底物GUS以及荧光素酶及其底物荧光素，不仅广泛用于鉴定转化体，还可以定量归因于特定载体系统的瞬时或稳定蛋白质表达量(Rhodes et al.,Methods Mol.Biol.55:121-131(1995))。
本领域已知使用特异于产物的任一多克隆或单克隆抗体检测和测量多核苷酸编码产物的表达的各种方案。实例包括ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、FACS(荧光激活细胞分选)等。这些及其它测定法为本领域熟知。各种标记和缀合技术为本领域技术人员所已知，其可以用于各种核酸和氨基酸测定中。产生标记的杂交或PCR探针以检测与多核苷酸相关的序列的手段包括寡核苷酸标记、切口平移、末端标记或使用标记的核苷酸进行PCR扩增。或者，可将序列或其任何部分克隆进载体中以产生mRNA探针。这种载体是本领域已知的，可商购获得，并且可以通过添加适当的RNA聚合酶(例如T7、T3或SP6)和标记的核苷酸用于体外合成RNA探针。这些程序可以通过使用各种可商购试剂盒进行。可以使用的合适的报告分子或标记包括放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或生色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。
可以将用感兴趣的多核苷酸序列转化的宿主细胞在适于表达和从细胞培养物中回收蛋白质的条件下培养。取决于所使用的序列和/或载体，由重组细胞产生的蛋白质可以被分泌或包含在细胞内。
如本领域技术人员将理解的，可以将携带本发明多核苷酸的表达载体设计成包含指导所编码的多肽通过原核或真核细胞膜分泌的信号序列。可以使用其它重组构建体将编码感兴趣的多肽的序列与编码多肽结构域的核苷酸序列连接，这将有助于纯化和/或检测可溶性蛋白质。
除重组生产方法外，本发明的多肽及其片段可以使用固相技术通过直接肽合成法产生。蛋白质合成可以使用人工技术或通过自动化进行。例如，可以使用AppliedBiosystems431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)实现自动化合成。或者，可以单独化学合成各种片段，并使用化学方法组合以产生想要的分子。
根据本发明的另一方面，编码本发明多肽的多核苷酸可以例如使用基因治疗技术在体内递输送给患者。基因治疗通常是指将异源核酸移至患有寻求这种治疗的疾病或病症的哺乳动物特别是人的某些细胞、靶细胞中。以一定方式将核酸导入选择的靶细胞中，由此异源DNA被表达以及产生由此编码的治疗产物。
如本文所公开的，可用于基因治疗的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、AAV(腺相关病毒)，或优选RNA病毒，例如逆转录病毒。优选地，逆转录病毒载体是鼠或禽逆转录病毒的衍生物，或者是慢病毒载体。优选的逆转录病毒载体是慢病毒载体。其中可插入单个外源基因的逆转录病毒载体的实例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)，哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)，SIV，BIV，HIV和Rous肉瘤病毒(RSV)。许多其它逆转录病毒载体可以掺入多个基因。所有这些载体均可以转移或掺入选择标记的基因，从而可以鉴定和产生转导的细胞。通过将感兴趣的锌指衍生的DNA结合多肽序列与例如编码特定靶细胞上受体的配体的另一个基因一起插入病毒载体，可以使载体成为靶特异性的载体。
逆转录病毒载体可以通过插入例如编码多肽的多核苷酸而成为靶特异性载体。示例的靶向可通过使用靶向逆转录病毒载体的抗体而实现。本领域技术人员无需过多实验即可容易地确定的特定多核苷酸序列，其可插入逆转录病毒基因组中以允许靶特异性输送含有锌指核苷酸结合蛋白多核苷酸的逆转录病毒载体。
由于重组逆转录病毒是有缺陷的，因此需要辅助才能产生感染性载体颗粒。例如，可以通过使用辅助细胞系提供这种辅助，所述辅助细胞系包含在LTR内的在调节序列控制下编码逆转录病毒所有结构基因的质粒。这些质粒缺少使包装机制可以识别RNA转录物以封装的核苷酸序列。具有包装信号缺失的辅助细胞系包括但不限于例如PSI.2、PA317和PA12。由于没有包装的基因组，这些细胞系产生空心病毒体。如果将逆转录病毒载体导入包装信号完整但是结构基因被其它感兴趣基因取代的这种细胞中，则载体可以被包装并产生载体病毒体。然后可以将通过这种方法产生的载体病毒体用于感染组织细胞系(例如NIH3T3细胞)以产生大量的嵌合逆转录病毒体。
也可以使用用于基因治疗的“非病毒”输送送技术，包括例如DNA-配体复合物、腺病毒-配体-DNA复合物、直接注射DNA、CaPO4沉淀、基因枪技术、电穿孔、脂质体、脂质转染等。任何这些方法均可为本领域技术人员广泛利用，以及适用于本发明。其它合适的方法对于本领域技术人员也是可用的，应当理解可以使用任何可用的转染方法完成本发明。可通过将分离的DNA分子封装在脂质体颗粒内并将该脂质体颗粒与靶细胞的细胞膜接触而完成脂质体转染。脂质体是自组装的胶体颗粒，其中由两亲性分子如磷脂酰丝氨酸或磷脂酰胆碱组成的脂质双层封装周围介质的一部分，由此使脂质双层包围了亲水性内部。可以构建单层或多层脂质体，由此内部含有所需的化学品、药物，或者如在本发明中，含有分离的DNA分子。
另外，本发明提供了一种组合物(以下称为”GRS组合物”)，其包含生理上可接受的载体和选自以下的至少一种：
(i)本发明的多肽，
(ii)包含(i)的多肽和异源融合伴侣的融合蛋白，
(iii)包含至少一个(i)的多肽的二聚体或多聚体复合物，
(iv)编码(i)至(iii)的多核苷酸，
(v)包含(iv)的表达载体，和
(vi)包含(v)的宿主细胞。
本发明的组合物(例如多肽、多核苷酸等)可以在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中配制，以单独或者与一种或多种其它治疗形式组合施用于细胞或动物。也应理解，如果需要，本发明的组合物也可以与其它制剂(例如其它蛋白质或多肽或各种药学活性剂)组合施用。对于也可以包括在组合物中的其它组分没有限制，只要所述额外的制剂不会不利地影响期望达到的调节作用或其它作用即可。
在本发明的药物组合物中，药学上可接受的赋形剂和载体溶液的制剂是本领域技术人员熟知的，本领域技术人员也熟知在各种治疗方案中使用本文所述特定组合物的合适剂量和治疗方案的开发，包括例如口服、肠胃外、静脉内、鼻内、皮下和肌内施用和配制。
在某些应用中，本文公开的药物组合物可以通过给对象口服施用。这样，可以用惰性稀释剂或可吸收的可食用载体配制所述组合物，或者可以将组合物封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可以将组合物压制成片剂，或者可以将组合物直接掺入饮食中。
在某些情况下，想要的是，经胃肠外、静脉内、肌内或腹膜内输送本文公开的药物组合物。对于这种施用途径，可以参考美国专利No.5,543,158；美国专利No.5,641,515和美国专利No.5,399,363所述。活性化合物(作为游离碱或药理学上可接受的盐)的溶液可以在水中与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合而制备。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物及在油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物的生长。
适用于注射应用的药物形式包括无菌水性溶液或分散液和用于即时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(参见美国专利No.5,466,468)。在所有情况下，所述形式均应是无菌的，且应具有易于注射的程度的流动性。其在生产和储存条件下应是稳定的，且应对于微生物例如细菌和真菌的污染作用具有防腐性。所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂而维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，促进对微生物作用的预防。在许多情况下，优选包括等渗剂(例如糖或氯化钠)。通过在组合物中使用延迟吸收的制剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射组合物的吸收时间。
例如，对于在水性溶液中的肠胃外施用，如果需要，溶液应适当地缓冲，且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液特别适合于经静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这种情况下，本领域技术人员将知晓可以使用的无菌水性介质。例如，可以将一剂溶解在1ml等渗NaCl溶液中，及或者加入1000ml皮下灌注液中，或者在建议的输注部位注射。根据治疗对象的状况，对剂量需要做一些改变。在任何情况下，负责施用的人员将确定个体对象的适当剂量。此外，对于人体施用，制备物应符合FDA生物学办公室标准所要求的无菌性、热原性以及一般安全性和纯度标准。
可以通过将需要量的活性化合物与上述各种其它成分根据需要掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌以制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌运载体中制备分散液，所述无菌运载体包含基本分散介质和以上列举的那些需要的其它成分。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这是从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
本文公开的组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，其是与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱(例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物)和有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。配制后，以与剂型相容的方式和治疗有效量施用所述溶液。可以以各种剂型例如可注射溶液、药物释放胶囊等形式便利地施用所述配制物。
如本文所用，术语“载体”是指涵盖任何及所有溶剂、分散介质、运载体、包被物、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。这种介质和制剂用于药物活性物质是本领域熟知的。除非任何常规介质或制剂与所述活性成分不相容，否则均考虑将其用于治疗组合物中。也可以将补充活性成分掺入组合物中。
短语“药学上可接受的”是指当给人施用时，分子实体和组合物不会产生过敏或类似的不良反应。制备包含蛋白质作为活性成分的水性组合物的方法为本领域熟知。通常，这种组合物被制备成注射剂，如液体溶液或悬浮液；还可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮在液体中的固体形式。所述制备物也可以是经乳化的。
在某些实施方案中，药物组合物可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气雾形式输送载体输送。经由鼻气雾喷雾途径将基因、多核苷酸和肽组合物直接输送至肺的方法已在例如美国专利No.5,756,353和美国专利No.5,804,212中描述。同样，使用经鼻内微粒树脂(Takenaga et al.,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利No.5,725,871)输送药物的方法在制药领域也是熟知的。同样，对于以聚四氟乙烯支持基质形式的经粘膜药物输送，可以参考美国专利No.5,780,045。
在某些实施方案中，可以通过使用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等进行输送，以将本发明组合物导入合适的宿主细胞中。特别地，可以将本发明的组合物配制为包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等中进行输送。这种输送载体的配制和使用可以使用已知和常规技术进行。
另外，可以使用本领域已知的方法配制本发明的药物组合物，以在给予哺乳动物后提供活性成分的立即、持续或延迟释放。如上所述，通过上述方法配制的药物组合物可以通过包括经口服、透皮、皮下、静脉或肌肉等各种途径以有效量施用。在此，“有效量”是指当将药物组合物以药用给予患者时使得可以追踪诊断或治疗效果的物质量。包含本发明多肽的药物组合物可以根据疾病的严重程度包含不同量的活性成分，对于成人，可以施用0.1μg-10,000mg，优选1mg-5,000mg，的单次剂量，一天多次。然而，考虑到所用的施用途径、年龄、性别、体重、医学状况和/或对象的其他个人差异，可以适当地选择本发明药物组合物的剂量。这些技术为本领域技术人员熟知。
另一方面，本发明提供了一种在细胞、组织或对象中使用本发明的组合物(例如多核苷酸、多肽等)的方法，以实现想要的细胞效应和/或治疗效果。可以通过本发明治疗或调节的细胞或组织优选哺乳动物细胞或组织，或更优选人细胞或组织。这种细胞或组织可以是健康状态或患病状态。
在某些实施方案中，提供了一种调节治疗相关的细胞活性的方法，包括但不限于细胞代谢、细胞分化、细胞增殖、细胞摄取、细胞分泌、细胞死亡、细胞动员、细胞迁移、细胞信号传导、细胞因子产生和/或分泌的调节、基因转录、mRNA翻译、细胞阻抗等，所述方法包括将细胞与本文所述的GRS组合物接触。在另一个特定的实施方案中，由本发明调节的细胞活性可包括例如AKT介导的细胞信号传导、ERK1/2介导的细胞信号传导、GPCR介导的细胞信号传导、内皮细胞管形成和细胞结合。在另一个实施方案中，所述细胞活性可包括CD71和/或CD80的调节。在另一个实施方案中，所述细胞活性可包括细胞因子产生和/或释放的调节，所述细胞因子可以选自TNF-α、IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MIP1-α、MIP-1β、GRO-α、MCP-1和IL-1ra。在另一个特定的实施方案中，细胞活性可包括例如通过葡萄糖、胰高血糖素、甘油和/或游离脂肪酸的细胞调节进行的代谢调节。在另一个特定的实施方案中，细胞活性可包括例如神经发生或神经保护的调节。因此，GRS组合物可用于治疗将受益于一种或多种这种活性的调节的基本上任何细胞或组织或对象。
GRS组合物也可用于多种治疗背景的任一种，包括例如与治疗或预防以下疾病的那些：赘生性疾病、免疫系统疾病或病症(例如自身免疫疾病和炎症)、感染性疾病、代谢性疾病、神经元/神经学疾病、肌肉/心血管疾病、与异常造血相关的疾病、与异常肌生成相关的疾病、与异常神经发生相关的疾病、与异常脂肪生成相关的疾病、与异常骨生成相关的疾病、与异常血管生成相关的疾病、与异常细胞存活相关的疾病等。
例如，在某些示例的实施方案中，本发明的GRS组合物可用于例如通过调节内皮细胞增殖和/或信号传导而调节血管生成。可以使用合适的细胞系(例如HMVEC-L(人微血管内皮肺细胞)和HUVEC(人脐静脉内皮细胞))及使用合适的测定法(例如内皮细胞迁移测定、内皮细胞增殖测定、管形成测定，基质胶塞测定等)监测内皮细胞的增殖和/或信号传导，其中许多技术是本领域已知的。
因此，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的多肽或多核苷酸作为活性成分，用于预防或治疗赘生性疾病。
如本文实施例部分所证实，包含本发明中揭示的基序的一定长度的多肽片段(分离的GRS多肽及其变体)表现出卓越的细胞凋亡活性，特别是卓越的针对异常细胞生长的抑制活性。这个效果优于在全长GRS蛋白质水平或结构域水平的效果。因此，本发明提供了本发明的多肽或多核苷酸在赘生性疾病中的治疗应用。
所述赘生性疾病可以选自结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、Kaposi肉瘤、卵巢癌、白血病、骨髓增生异常综合症、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、实体瘤和与血管生成有关的疾病。
因此，在相关的实施方案中，本发明的组合物可用于治疗基本上受益于血管生成调节的任何细胞或组织或对象。例如，在一些实施方案中，可将经历或易于发生血管生成(例如过度的血管生成状况)的细胞或组织或对象与本发明的合适组合物接触以抑制血管生成状况。在其他实施方案中，可将经历或易于发生血管生成不足(例如血管生成抑制状况)的细胞或组织与本发明的合适组合物接触，以干扰血管生成抑制活性和/或促进血管生成。
血管生成相关疾病，即不适当的血管生成状况，可以选自与年龄相关的黄斑变性(AMD)、癌症(实体癌和血液肿瘤)、发育异常(器官形成)、糖尿病失明、子宫内膜异位、眼新血管形成、皮肤变色(例如血管瘤、鲜红斑痣、单纯痣等)、糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、新生血管性青光眼、皮肤红变、增生性视网膜病变、银屑病、血友病性关节病、动脉粥样硬化斑块中的毛细血管增生、瘢痕瘤、伤口肉芽、血管狭窄、类风湿性关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩氏病、再狭窄、动脉粥样硬化性动脉硬化、猫抓病、溃疡、肾小球肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病、肾小球病和炎症，但不限于这些疾病。
在其他实施方案中，本发明的ARS组合物可用于调节细胞增殖和/或存活，及因此用于治疗或预防特征在于异常的细胞增殖和/或存活的疾病、病症或状况。例如，在某些实施方案中，所述ARS组合物可用于调节细胞凋亡和/或治疗与异常细胞凋亡相关的疾病或病症。凋亡是用于描述称为程序化细胞死亡的细胞信号级联的术语。对于诱导凋亡(例如癌症)的分子以及抑制凋亡(例如中风、心肌梗塞、败血症等)的分子存在各种治疗适应症。可以通过本领域已知和可获得的任何众多可用技术监测细胞凋亡，包括例如测量DNA片段化、膜不对称性改变、凋亡的半胱天冬酶激活和/或细胞色素C和AIF释放的测定法。
与细胞存活增加或凋亡抑制有关的示例性疾病包括但不限于癌症(例如滤泡性淋巴瘤、癌和激素依赖性肿瘤，包括结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胶质母细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、神经母细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、Kaposi肉瘤和卵巢癌)；自身免疫性疾病(例如多发性硬化症、干燥综合征、Graves病、桥本甲状腺炎、自身免疫性糖尿病、胆汁性肝硬化、白塞氏病、克罗恩氏病、多发性肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关的肾小球性肾炎、自身免疫性胃炎、自身免疫性血小板减少性紫癜和类风湿性关节炎)，以及病毒感染(例如疱疹病毒、痘病毒和腺病毒)，炎症，移植物抗宿主病(急性和/或慢性)，急性移植排斥和慢性移植排斥。
与细胞存活增加相关的进一步示例性疾病或状况包括但不限于恶性肿瘤和相关病症如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病，包括成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红细胞性白血病)和慢性白血病(例如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、骨髓增生异常综合征、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金氏病和非霍奇氏病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链疾病和实体瘤的进展和/或转移。实体瘤可包括但不限于肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilm肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
本发明的组合物也可以用作免疫调节剂，以通过调节直接或间接介导自身免疫和/或炎性疾病、状况和病症的细胞而治疗抗炎或促炎适应征。本发明的组合物作为免疫调节剂的效用可以使用本领域已知的任何众多技术进行监测，所述技术包括例如迁移测定(例如使用白细胞、淋巴细胞、单核细胞)、细胞存活测定(例如使用B细胞、T细胞、单核细胞、NK细胞)等。
可以根据本发明治疗的免疫系统疾病、病症或状况例如包括但不限于原发性免疫缺陷，免疫介导的血小板减少，川崎综合征，骨髓移植(例如成人或儿童的骨髓移植)，慢性B细胞淋巴细胞性白血病，人免疫缺陷病毒(HIV)感染(例如成人或小儿HIV感染)，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病，输血后紫癜等。
另外，可根据本发明治疗的其他疾病、病症和状况包括格林-巴利综合征，贫血(例如与细小病毒B19相关的贫血)，具有高感染(例如复发感染)风险的稳定多发性骨髓瘤患者，自身免疫性溶血性贫血(例如温热型自身免疫性溶血性贫血)，血小板减少症(例如新生儿血小板减少症)和免疫介导的中性粒细胞减少症，移植(例如巨细胞病毒(CMV)阴性受体-CMV阳性器官)，低丙种球蛋白血症(例如具有感染或发病风险的低丙种球蛋白血症新生儿)，癫痫症(例如顽固性癫痫)，系统性血管炎综合征，重症肌无力(例如重症肌无力代偿失调)，皮肌炎，和多肌炎。
其他自身免疫性疾病、病症和状况包括但不限于自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性新生儿血小板减少症，特发性血小板减少性紫癜，自身免疫性血细胞减少症，溶血性贫血，抗磷脂综合征，皮肤炎，过敏性脑脊髓炎，心肌炎，复发性多发性软骨炎，风湿性心脏病，肾小球肾炎(例如IgA肾病)，多发性硬化症，神经炎，葡萄膜炎，眼炎，多发性内分泌病，紫癜(例如Henloch-Scoenlein紫癜)，Reiter氏病，僵人综合症，自身免疫性肺部炎症，格林-巴利综合征，胰岛素依赖型糖尿病，和自身免疫性炎性眼病。
其他自身免疫性疾病、病症或状况包括但不限于自身免疫性甲状腺炎；甲状腺功能减退症，包括桥本氏甲状腺炎和甲状腺炎，其特征在于例如细胞介导的和体液性甲状腺细胞毒性；SLE(通常特征在于例如循环和局部产生的免疫复合物)；Goodpasture综合征(通常特征在于例如抗基底膜抗体)；天疱疮(通常特征在于例如表皮皮肤棘层松解性抗体)；受体自身免疫性，例如Graves病(通常特征在于例如针对甲状腺刺激激素受体的抗体)；重症肌无力(通常特征在于例如乙酰胆碱受体抗体)；胰岛素抵抗(通常特征在于例如胰岛素受体抗体)；自身免疫性溶血性贫血(通常特征在于例如抗体致敏的红细胞的吞噬作用)；及自身免疫性血小板减少性紫癜(通常特征在于例如抗体致敏的血小板的吞噬作用)。
其他自身免疫性疾病、病症或状况包括但不限于类风湿关节炎(通常特征在于例如关节中的免疫复合物)；具有抗胶原蛋白抗体的硬皮病(通常特征在于例如核仁抗体和其他核抗体)；混合性结缔组织病(通常特征在于例如针对可提取的核抗原例如核糖核蛋白的抗体)；多发性肌炎/皮肌炎(通常特征在于例如非组蛋白抗核抗体)；恶性贫血(通常特征在于例如抗壁细胞、抗微粒体和抗内因子抗体)；特发性阿迪森氏病(通常特征在于例如体液和细胞介导的肾上腺细胞毒性)；不孕症(通常特征在于例如抗精子抗体)；肾小球肾炎(通常特征在于例如肾小球基底膜抗体或免疫复合物)；原发性肾小球肾炎，IgA肾病；大疱性类天疱疮(通常特征在于基底膜中的IgG和补体)；干燥综合征(通常特征在于例如多种组织抗体和/或特异性非组蛋白抗核抗体(SS-B))；糖尿病(通常特征在于例如细胞介导的体液胰岛细胞抗体)；及肾上腺素能药物抗性，包括具有哮喘或囊性纤维化的肾上腺素能药物抗性(通常特征在于例如β-肾上腺素能受体抗体)。
进一步的自身免疫性疾病、病症或状况包括但不限于慢性活动性肝炎(通常特征在于例如平滑肌抗体)；原发性胆汁性肝硬化(通常特征在于例如抗线粒体抗体)；其他内分泌腺衰竭(特征在于例如在某些情况下的特定组织抗体)；白癜风(通常特征在于例如抗黑素细胞抗体)；血管炎(通常特征在于例如血管壁中的免疫球蛋白和补体和/或低血清补体)；心肌梗塞后状况(通常特征在于例如抗心肌抗体)；心脏切开术综合征(通常特征在于例如抗心肌抗体)；荨麻疹(通常特征在于例如针对IgE的IgG和IgM抗体)；特应性皮炎(通常特征在于例如针对IgE的IgG和IgM抗体)；哮喘(通常特征在于针对IgE的IgG和IgM抗体)；炎性肌病；及其他炎性、肉芽肿性、退行性和萎缩性病症。
此外，另外的实施方案涉及本发明组合物在治疗代谢障碍例如肾上腺脑白质营养不良、Krabbe病(球形细胞样脑白质营养不良)、异染性脑白质营养不良、Alexander病、Canavan病(海绵样脑白质营养不良)、Pelizaeus-Merzbacher病、Cockayne综合征、Hurler病、Lowe综合征、Leigh病、Wilson病、Hallervorden-Spatz病、Tay-Sachs病等中的应用。可以使用本领域已知和可获得的多种技术的任一种监测本发明组合物在调节代谢过程中的效用，所述技术包括例如测量脂肪细胞脂肪生成或脂肪细胞脂解的测定法。
在其他特定的实施方案中，本发明的GRS组合物可以用于例如通过激酶途径(例如Akt、Erk1/2等)调节细胞信号传导。可以使用众多的测定法的任一种监测细胞信号传导。例如，可以通过改变各种靶蛋白的磷酸化模式监测一般细胞信号传导事件的诱导。因此，检测应答用HRS多肽处理细胞的细胞信号传导活性可作为不同生物学效应的指征。可以选择用于这个测定的靶蛋白，以涵盖主要细胞信号传导级联的关键成分，从而提供细胞信号传导情况及其治疗相关性的概貌。通常，这种测定涉及用HRS多肽处理细胞，然后用特异性检测靶蛋白磷酸化(激活)形式的抗体进行免疫检测。
可用于监测与治疗相关的细胞信号传导事件的示例性靶蛋白可包括但不限于：p38MAPK(促分裂原激活的蛋白激酶；由细胞应激和炎性细胞因子激活；参与细胞分化和凋亡)；SAPK/JNK(应激激活蛋白激酶/Jun-氨基末端激酶；由细胞应激和炎性细胞因子激活)；Erk1/2、p44/42MAPK(促分裂原激活的蛋白激酶Erk1和Erk2；由多种细胞外信号激活；参与细胞生长和分化的调控)；和Akt(由胰岛素和各种生长因子或存活因子激活；参与抑制凋亡，调节糖原合成，调节细胞周期和细胞生长)。酪氨酸残基的一般磷酸化也可以作为由磷酸化介导的细胞信号传导变化的一般指标进行监测。
当然，要意识到也可以测定其他类别的蛋白质例如细胞粘附分子(例如钙黏着蛋白，整合蛋白，紧密连接蛋白(claudin)，连环蛋白，选择蛋白等)和/或离子通道蛋白，以监测由本发明的组合物调节的细胞事件或活性。
在其他方面，本发明的多核苷酸、多肽和/或其他组合物可基本上用于本领域已知和可获得的任何类型的筛选测定中。例如，本发明的组合物(例如多肽和/或多核苷酸)可以与基本上任何已知的筛选方法结合使用，以鉴定激动剂、拮抗剂、结合伴侣、竞争性抑制剂，以及细胞效应子，其直接或间接介导或调节本发明组合物的非常规活性。例如，在一个特定的实施方案中，提供了一种筛选方法，用于鉴定测试化合物作为本发明的组合物与其进行调节的一种或多种结合伴侣、细胞效应物和/或细胞类型之间相互作用的抑制剂或增强剂。
因此，本发明提供一种鉴定抗癌剂的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
(a)形成含有(i)和(ii)的反应混合物：
(i)选自由本发明的多肽和多核苷酸的成分，
(ii)测试化合物；及
(b)确定在存在所述测试化合物条件下所述成分的抗癌活性增加，其中确定在存在所述测试化合物条件下的抗癌活性与在不存在测试化合物条件下的抗癌活性相比的变化，从而鉴定活性测试化合物。
与不存在测试化合物的情况相比，在存在测试化合物的情况下，活性和/或调节均统计学显著变化(增加或减少)，这归因于潜在的激动剂(模拟物或增强剂)或拮抗剂(抑制剂)。
本文提供的筛选方法可以利用来自通过组合化学产生的小分子文库的测试化合物。化合物和/或生物混合物例如真菌、细菌或藻类提取物文库为本领域已知，可以用本发明的任何测定法筛选。
化合物的文库可以存在于溶液中或珠上、在芯片、细菌、孢子上(美国专利No.5,223,409，1993)、质粒或在噬菌体上(美国专利No.5,223,409，1993)。本发明的实施方案包括使用不同的文库鉴定一种或多种GRS蛋白质片段的小分子调节剂、其细胞结合伴侣和/或其相关的非常规活性。可用于本发明目的的文库包括但不限于(1)化学文库，(2)天然产物文库和(3)由随机肽、寡核苷酸和/或有机分子组成的组合文库。
化学文库由已知化合物的结构类似物或通过天然产物筛选鉴定为“命中”或“先导”的化合物组成。天然产物文库来自微生物、动物、植物或海洋生物的集合，其用于产生混合物以进行筛选，通过(1)发酵和提取来自土壤、植物或海洋微生物的培养液，或者(2)提取植物或海洋生物产生。天然产物文库包括聚酮化合物、非核糖体肽及其变体(非天然存在的变体)。组合文库可以由大量肽、寡核苷酸或有机化合物的混合物组成。其相对易于通过传统的自动合成方法、PCR、克隆或专有合成方法制备。更具体地说，组合化学文库是通过化学合成或生物合成、通过组合许多化学“构建模块”例如试剂而产生的各种化学化合物的集合。例如，线性组合化学文库如多肽文库是通过以对于给定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数目)的每种可能方式组合一系列化学构件模块(氨基酸)而形成。通过这种组合混合化学构建模块可以合成数百万种化合物。这种组合化学和由其产生的文库在本领域是熟知的。
本文提供的多肽(即分离的GRS多肽或GRS变体)表现出特异性靶向癌细胞的显著效果。在本发明的一个实施方案中，即使当以全身方式施用时，本发明的多肽也被鉴定为特异性累积在肿瘤部位中。因此，本发明提供了包含本发明的多肽作为活性成分的组合物，用于检测癌细胞。
在本发明中，癌细胞可以是钙粘着蛋白6(CDH6)阳性癌细胞，具体的癌细胞种类如上所述。
本发明的多肽可以以标记状态提供，以便于鉴定、检测和定量多肽与肿瘤细胞的结合。换句话说，多肽可以与可检测的标记连接(例如通过共价键合或交联连接)。所述可检测标记可以是显色酶(例如过氧化物酶，碱性磷酸酶)，放射性核素(例如18F，123I，124I，125I，32P，35S，67Ga)，生色团，发光剂或荧光剂(例如FITC，RITC，荧光蛋白(GFP(绿色荧光蛋白)；EGFP(增强型绿色荧光蛋白)，RFP(红色荧光蛋白)；DsRed(香菇珊瑚(Discosoma sp.)红色荧光蛋白)；CFP(青色荧光蛋白)，CGFP(青绿色荧光蛋白)，YFP(黄色荧光蛋白)，Cy3，Cy5和Cy7.5))，或者磁共振材料(例如钆(Gd)，超顺磁性颗粒或者超超顺磁性颗粒)。
根据标记的检测方法在本领域中是众所周知的，但是可以例如通过以下方法进行。可用作为可检测标记的荧光物质使用免疫荧光染色。例如，可以将用荧光物质标记的本发明的肽与样品反应，并且可以去除未结合的或非特异性结合产物，然后在荧光显微镜下观测所述肽的荧光性。在使用酶作为可检测标记的情况下，可以通过底物通过酶反应的显色反应来测量吸光度。对于放射性物质，可以测量发射的辐射量。另外，根据检测标记使用已知的成像方法对检测结果成像。因此，本发明的肽可用作组合物的活性成分以使癌细胞成像。
另外，本发明提供了一种检测癌细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)多肽与生物学样品混合；
(b)去除未结合或非特异性结合的多肽；及
(c)定所述多肽是否结合以及在何处结合。
就这一点而言，可以如上所述或根据本领域已知的方法进行步骤(c)中多肽的检测以确定多肽是否结合以及在何处结合。
在本发明中，术语“样品”是指生物学样品，包括血液和生物学来源的其他液体样品、活检样品、固体组织样品如组织培养物，或者从中衍生的细胞。样品可得自动物，优选哺乳动物。样品可以在用于检测之前进行预处理。这种预处理可以包括例如提取、浓缩、灭活干扰组分以及添加试剂。
由于本发明多肽具有特异性结合肿瘤细胞的卓越效果，因此可以用作智能药物输送载体以将药物选择性地输送至肿瘤细胞。因此，本发明提供了一种包含本发明多肽作为活性成分的组合物，以进行癌细胞特异性药物输送。另外，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的多肽和与其结合的抗癌剂作为活性成分，以预防和治疗癌症。
更具体地，包含在药物输送组合物中的本发明肽可以将与其相关连的常规抗肿瘤(癌)剂仅选择性输送至肿瘤细胞，从而提高药物效用，同时显著降低对正常组织的副作用。
只要是熟知的肿瘤治疗剂，任何抗肿瘤剂均可以与本发明的肽结合。抗肿瘤剂的实例包括紫杉醇，阿霉素，长春新碱，柔红霉素，长春碱，放线菌素-D，多西紫杉醇，依托泊苷，替尼泊苷，比生群，高三尖杉酯碱，格列卫(STI-571)，顺铂，5-氟尿嘧啶，阿霉素，氨甲蝶呤，白消安，苯丁酸氮芥，环磷酰胺，美法仑，氮芥，亚硝基脲，链激酶，尿激酶，阿替普酶，血管紧张素II抑制剂，醛固酮受体抑制剂，促红细胞生成素，NMDA(N-甲基-d-天冬氨酸)受体抑制剂，洛伐他汀，雷帕霉素，塞来昔布，ticlopin，马马斯他和trocade。
所述制剂和本发明肽之间的结合可以使用本领域已知方法如共价相互作用、交联等产生。就这一点而言，如果需要，可以对本发明的肽进行化学修饰到其活性不丧失的程度。本发明的组合物中本发明肽的含量取决于治疗剂的种类和量。本发明的多肽可以通过共价键、特别是接头与抗癌剂连接，但不限于此。
本发明提供了所述多肽或多核苷酸在制备用于预防和治疗赘生性疾病的制剂中的应用。
本发明提供了一种预防和治疗赘生性疾病的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的包含所述多肽或多核苷酸作为活性成分的组合物的步骤。
本发明提供了所述多肽在制备用于检测癌细胞、对癌细胞进行成像或癌细胞特异性药物输送的制剂中的应用。
本发明提供了一种用于对癌细胞进行成像或者用于癌细胞特异性药物输送的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的包含所述肽作为活性成分的组合物的步骤。
本发明提供了所述多肽和与其结合的抗癌剂在制备预防和治疗癌症的制剂中的应用。
本发明提供了一种预防和治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：将有效量的包含多肽和与其结合的抗癌剂作为活性成分的组合物给予需要其的对象。
如本文所用，术语“有效量”是指当给对象施用时显示出对癌症的减轻、预防、检测或诊断效果的量。如本文所用，术语“对象”是指动物，优选地哺乳动物，包括人，或者是指源自动物的细胞、组织或器官。在此，对象可以是需要所述效果的患者。
如本文所用，术语“治疗”总体上是指减轻癌症或癌症症状的任何作用，例如可包括治愈、实质上预防疾病或减轻癌症状况。所述治疗可包括减轻、治疗或预防一种癌症症状或大多数癌症症状的任何作用，但不限于此。
有益效果
本文公开的多肽(分离自GRS的多肽及其变体)含有本发明中首次发现的GRS细胞凋亡基序，并以具有一定长度的截短形式提供。所述多肽表现出比全长蛋白质和结构域更高的活性和靶向能力，发现了医药工业中很高的工业实用性。
附图说明
图1a示出全长GRS蛋白和具有重要意义的代表性片段(GRS-F4，GRS-F4-NT-1，GRS-F4-NT2和GRS-F4-NT3)的3D结构，所述片段是从GRS蛋白的C末端区域构建的肽片段成员。
图1b示出代表性片段(GRS-DP，GRS-DP-A线性，GRS-DP-B，GRS-DP-C和GRS-DP-A环状)的3D结构和特征，所述片段是从GRS蛋白的C端区域构建的肽片段成员及其变体，且具有抗癌基序相关的重要意义。
图2示出在用预定浓度的所述肽处理SN12C(CDH6阳性肾癌细胞)之后，所述肽的相对癌细胞凋亡活性。
图3a示出通过热位移测定(全长GRS蛋白作为对照)测量的本发明的GRS-DP多肽的Tm(解链温度)。
图3b示出通过热位移测定(全长GRS蛋白作为对照)测量的GRS-DP-A环状、GRS-DP-A线性、GRS-DP-B和GRS-DP-C的Tm(解链温度)。
图4示出所述片段的CD(圆二色性)光谱。
图5a示出用GRS-DP(200nM)处理后CDH6阳性和pERK阳性细胞(CDH6+/pERK+)或阴性细胞的细胞存活力，以确定CDH依赖性作用(100nM阿霉素用作阳性对照)。
图5b示出在用100nM或200nM的GRS-DP(GRS 100nM作为阳性对照)处理SN12C(CDH6阳性)细胞后，pERK的去磷酸化程度。
图5c示出在用100nM或200nM的GRS-DP(GRS 100nM作为阳性对照)处理RENCA(CDH6阴性)细胞后，pERK的去磷酸化程度。
图5d示出通过SPR(表面等离振子共振)测量的本发明的GRS-DP多肽对CDH6的亲和力。
图5e示出通过SPR(表面等离振子共振)测量的本发明的GRS-DP-A线性多肽对CDH6的亲和力。
图5f示出通过SPR(表面等离振子共振)测量的本发明的GRS-DP-A环状多肽对CDH6的亲和力。
图6a是用于评估GRS、GRS-DP和衍生自其中的代表性片段(GRS-DP-B或GRS-DP-A环状片段)通过肿瘤内注射在体内诱导肿瘤消退能力的实验方案。简而言之，将SN12C(CDH6阳性)细胞皮下注射进BALB/c裸鼠中，然后生长5天至平均肿瘤大小为100mm3。在第5天和第7天，将PBS或测试材料分别以20μg的剂量注射进肿瘤中(n＝5只动物/组)。根据公式“最大直径×最小直径2×0.52”计算肿瘤体积。
图6b是在异种移植肿瘤细胞后第21天牺牲的每个测试组中的实验动物中切除的肿瘤图像。
图6c示出随时间推移在每个测试组中肿瘤体积的监测结果。
图6d示出在异种移植肿瘤细胞后第21天牺牲的每个测试组的实验动物中最终获得的肿瘤重量。
图6e示出随时间推移在每个测试组中实验动物体重的监测结果。
图7a是从异种移植肿瘤细胞后第21天牺牲的每个测试组的实验动物切除的肿瘤图像，示出通过静脉注射评估GRS、GRS-DP及自其衍生的代表性片段(GRS-DP-B或GRS-DP-A环状)在体内诱导肿瘤退行的能力的结果。简而言之，将SN12C(CDH6阳性)细胞皮下注射进BALB/c裸鼠中，然后生长5天至平均肿瘤大小为100mm3。在第5天和第7天，将PBS或测试材料分别以5MPK的剂量进行静脉内注射(n＝5只动物/组)。根据公式“最大直径×最小直径2×0.52”计算肿瘤体积。
图7b示出随时间推移在每个测试组中肿瘤体积的监测结果。
图7c示出在异种移植肿瘤细胞后第21天牺牲的每个测试组的实验动物中最终获得的肿瘤重量。
图7d示出随时间推移在每个测试组中实验动物体重的监测结果。
图8a是从测试组实验动物中切除的肿瘤图像，示出在荧光标记强度方面GRS、GRS-DP和自其衍生的代表性片段(GRS-DP-B或GRS-DP-A环状)特异性靶向癌细胞的能力的比较。在实验中，将B16F10细胞皮下注射进C57BL/6小鼠中，然后生长14天。在第14天，经静脉内注射1MPK剂量的PBS或荧光标记的测试材料，在注射后24小时切除肿瘤。
图8b示出了从图8a的每个测试组切除的肿瘤的相对荧光ROI值。
具体实施方式
在下文提供了对本发明的详细描述。
尽管上文已经描述了本发明中使用的方法，但是下文更详细地描述了所使用的技术。提供的这些实施例只是例证本发明，不应理解为限制之意。
实施例1：GRS C末端衍生多肽的构建和抗癌活性的测定
1-1.GRS C末端片段的构建及癌细胞凋亡活性的测定
从全长GRS蛋白(1-685，SEQ ID NO:1)的C-末端区域，构建各种多肽片段。在下表1中，列出了各种多肽片段(基本上是线性多肽)。在表1的各种多肽中，鉴于3D结构在图1a和1b中示出一些具有重要意义的代表性片段。多肽片段是由中国上海GL生物化学有限公司(中国上海市闵行区紫月路519号，200241)使用固相合成法构建的。
测定所述多肽片段的癌细胞凋亡活性。具体实验步骤如下：将H460、HCT116、MCF7、HeLa、SN12C或RENCA细胞各自以5,000个细胞/mL的密度接种于96孔板(Corning,New York,USA)中，并与100nM的每个多肽片段和全长GRS蛋白温育24小时。然后，将每个样品用10μlCCK8试剂处理2小时(Dojindo Molecular Technologies Inc.Kumamoto,Japan)，之后在微板读取仪上(TECAN,Mannedorf,Swiss)于570nm读取吸光度。
表1
Figure GDA0002942415540000261
Figure GDA0002942415540000271
癌细胞凋亡测定的结果表明，多肽片段GRS-F4、GRS-F4-NT-1、GRS-DP、GRS-DP-A(线性)、GRS-DP-B及包含其区域的那些片段具有与全长GRS蛋白相似的癌细胞凋亡活性，鉴定出在GRS-DP-B的第531-538aa区域中与抗癌活性相关的基序的存在。另外，这个区域表明仅简单通过结构分析难以预测抗癌活性基序。
1-2.GRS C端片段变体的构建及癌细胞凋亡活性的测定
通过对实施例1-1的多肽片段进行修饰(添加、缺失或取代)以构建变体。这样，根据修饰方法制备了环状形式和线性形式的肽。
首先，由中国上海GL生物化学有限公司(中国上海市闵行区紫月路519号，200241)使用固相合成法合成线性多肽变体。对于环状变体，通过将线性肽以10-3-10-4M的浓度溶解在水中及用稀释的氨水将酸度调节至pH 8，使线性肽自发环化。通过比较在反应前后的所述肽的质谱检测环化结构。
作为代表性实例，从GRS-DP-A(线性)肽制备变体序列CYTVFEHTFHVREGDEQRTFFSFPC(25个氨基酸，SEQ ID NO:7)，然后环化。所得的环状形式在本文中被称为“GRS-DP-A环状”。“GRS-DP-A环状”是环状形式，其中在相对的末端的半胱氨酸残基之间形成一硫化物键。
1-3.多肽间的体外抗癌活性比较
在实施例1-1和1-2的多肽构建体间比较癌细胞凋亡活性。每种多肽以1μg或2μg的量使用，以与实施例1-1相同的方式进行测定。
图2示出在各种多肽中的一些代表性多肽(GRS-DP，GRS-DP-A线性，GRS-DP-A环状，GRS-DP-B和GRS-DP-C)的实验结果。从图2中可以看出，在GRS-DP-C中未检测到癌细胞凋亡作用，但在GRS-DP、GRS-DP-A线性、GRS-DP-A环状和GRS-DP-B中检测到显著的癌细胞凋亡作用。典型地，就抗癌细胞凋亡作用而言，变体GRS-DP-A环状片段优于其起始肽GRS-DP-A。
代表性的多肽GRS-DP-A线性、GRS-DP-A环状、GRS-DP-B和GRS-DP-C，如图2所示其示出典型显著抗癌活性，在图1b中描绘了其特征。简而言之，“GRS-DP-A线性”是一个25个氨基酸的多肽片段，覆盖了GRS-DP N末端第1-25位氨基酸(对应于GRS的第531-555aa)，由SEQID NO:3定义，分子量为3.079kDa。SEQ ID NO:7定义的“GRS-DP-A环状”是通过用半胱氨酸取代N末端甲硫氨酸和C末端丙氨酸而衍生自GRS-DP-A线性片段。在相对的末端的半胱氨酸残基形成单硫键而形成环状形式。其分子量为3.083kDa。由SEQ ID NO:2定义的”GRS-DP-B”是8个氨基酸的片段，其覆盖来自GRS-DP-A线性多肽N末端的第1-8位氨基酸(对应于GRS上的第531-538aa)，且分离自α螺旋结构区域。由SEQ ID NO:12定义的“GRS-DP-C”是15个氨基酸的片段，其覆盖来自GRS-DP-A线性多肽N末端的第8-22位氨基酸(对应于GRS上的第538-552aa)，分离自环结构区域。“GRS-DP-B”和“GRS-DP-C”的分子量分别为1.027kDa和1.855kDa。
充分考虑实施例1-1的结果，其中抗癌活性基序包含在对应于GRS-DP-B(SEQ IDNO:2)的第531-538位氨基酸的区域中，以及在图2的数据中，示出抗癌活性的GRS-DP-A环状多肽是用半胱氨酸取代GRS-DP-A线性(第531-555位氨基酸)的N末端甲硫氨酸而获得的，全长GRS蛋白(SEQ ID NO:1)上第532-538位氨基酸区域最终被鉴定是抗癌活性至关重要的基序。
1-4.多肽的解链温度(Tm)
使用热位移测定法，以全长GRS多肽作为对照，测量在实施例1-3中被鉴定为具有卓越抗癌活性的一些代表性多肽的解链温度(Tm)。具体实验方法如下文所述。
根据制造商的手册，使用ProteoStat热位移稳定性测定法(Enzo Life Sciences,Farmingdale,NY)进行实验。简而言之，将全长GRS蛋白或本发明的多肽均以2mg/mL的浓度与10X PROTEOSTAT TS检测试剂混合。将每个样品以0.2℃/分钟的线性梯度条件从25℃加热到99℃，使用Thermal Cycler DiceTM Real Time系统(Takara，Shiga，Japan)在480nm激发和615nm发射的条件下一式三份测量荧光。
如图3a和3b所示，GRS-DP、GRS-DP-A线性、GRS-DP-A环状和GRS-DP-B示出其Tm与全长GRS蛋白的Tm相似或更高。另外，作为对照的GRS-DP-C也示出与GRS相似的Tm。因此，鉴定了GRS-DP-A线性、GRS-DP-A环状、GRS-DP-B或含有其的各个多肽与全长GRS蛋白一样稳定或更稳定。
1-5.多肽的CD(圆二色性)光谱
通过CD(圆二色性)光谱分析了在实施例1-3中被鉴定为具有卓越抗癌活性的一些代表性多肽的结构特征。如下所述进行CD光谱测定。使用0.1cm路径长度的石英SUPRASIL单元(Hemlla，Germany)，记录全长GRS蛋白和多肽样品的远UV CD光谱平均值。J-815圆二色谱仪(JASCO,Oklahoma City,USA)，光谱分辨率为1.0nm，带宽为1nm和2.0s。在后，将600μl的各1.0mg/mL的样品的光谱的3次扫描减去空白后取平均值。
图4示出GRS-DP-A线性、GRS-DP-A环状和GRS-DP-B的CD分析结果，这些多肽是典型代表肽且具有卓越的抗癌活性。观测全长GRS蛋白中的α-螺旋形式结构、GRS-DP-A线性和GRS-DP-B中的N延伸螺旋形式结构以及GRS-DP-A环状多肽中实施例1中预期的环状形式结构(见Ion mobility-mass spectrometry applied to cyclic peptide analysis:conformational preferences of gramicidin S and linear analogs in the gasphase Journal of the American Society for Mass Spectrometry Volume 15,Issue6,June 2004,Pages870-878/Chemical Synthesis and Folding Pathways of LargeCyclic Polypeptides:Studies of the Cystine Knot Polypeptide KalataB1Biochemistry,Vol.38,No.32,1999 10606)。
实施例2：体外抗癌活性机制
2-1.CDH6依赖性
为了检验本发明的多肽是否以CDH6依赖性方式呈现活性，测量了在存在本发明的多肽条件下CDH6(钙黏着蛋白-6)阳性和pERK(蛋白激酶R样内质网激酶)阳性细胞(CDH6+/pERK+)或阴性细胞的细胞存活力。作为肽的代表，在实验中使用GRS-DP(100nM)。简而言之，将H460(CDH6+/pERK+)、HeLa(CDH6+/pERK+)、SN12C(CDH6+/pERK+)、RENCA(CDH6-/pERK+)、MCF7(CDH6-/pERK-)细胞与全长GRS(100nM)或GRS-DP(100nM)一起温育1小时。温育后，将细胞用PBS洗涤两次，并在裂解缓冲液(150mM NaCl，2mM EDTA，1％Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，10mM NaF，1mM原钒酸盐，10％甘油，蛋白酶混合物)中裂解。每种蛋白质30μg进行SDS/PAGE，然后用购自Cell Signaling Technology(Danvers,MA,USA)的ERK抗体和购自Abcam(Cambridge,UK)的抗钙粘着蛋白6(K-钙粘着蛋白)抗体进行western印迹。
如图5a所示，GRS-DP多肽仅降低CDH6阳性细胞的细胞存活力。因此，发现本发明的多肽以CDH6依赖性方式起作用。
2-2.GRS-DP的抗癌活性机制
为了检验本发明的多肽是否通过与CDH6结合或不结合而使pERK去磷酸化，用本发明的多肽(通常为100nM或200nM的GRS-DP)处理SN12C(CDH6阳性)细胞或RENCA(CDH6阴性)细胞，并分析pERK的去磷酸化。在这方面，将全长GRS 100nM用作阳性对照。简而言之，将细胞用全长GRS或GRS-DP洗涤1小时，用冷PBS洗涤两次，并在裂解缓冲液(150mM NaCl，2mMEDTA，1％Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，10mM NaF，1mM原钒酸盐，10％甘油，蛋白酶混合物)中裂解。每种蛋白质30μg进行SDS/PAGE，然后用购自Cell Signaling Technology(Danvers,MA,USA)的ERK抗体和购自Abcam(Cambridge,UK)的抗钙粘着蛋白6(K-钙粘着蛋白)抗体进行western印迹。
如图5b和5c所示，发现GRS-DP多肽通过诱导CDH6依赖性pERK去磷酸化而介导癌细胞凋亡。
2-3.与CDH6相互作用的比较
比较本发明的肽对CDH6的亲和力。使用SR7500DC,Reichert AnalyticalInstrument(Depew NY)，通过表面等离子体共振(SPR)分析GRS和GRS衍生肽与钙黏着蛋白6(CDH6)-fc融合蛋白的结合。将CDH6通过芯片表面上的游离羧基固定在[CMDH芯片]羧甲基葡聚糖传感器芯片上，然后以5μL/min的流速注射0.1M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺，获得活化的琥珀酰亚胺酯修饰的表面。将各种浓度的GRS和GRS衍生的肽以30μL/min的流速注入基于磷酸盐的盐水中，然后以相同流速注入流动相缓冲液以确定解离速率。使用Software Scrubber 2.0(Biological Software,Australia)分析数据。
图5d-5f示出本发明肽的亲和力测定结果的代表性实例。观测到GRS-DP肽具有KD＝83.9nM，而其较短的片段GRS-DP-A线性示出与KD＝61.2nM的更好的亲和力。具体而言，经测量衍生自GRS-DP-A线性多肽的GRS-DP-A环状多肽具有KD＝51.3nM，呈现出对CDH6更好的亲和力。通过实验，发现含有抗癌基序的多肽片段当其长度较短时对CDH6具有更高的亲和力。特别地，当是环状形式结构时，其表现出出乎意料的效果。
实施例3：肽之间的体内抗癌活性和癌细胞靶向能力的比较
3-1.多肽之间的体内抗癌活性比较_IT注射
在实施例1-3中鉴定出具有卓越抗癌活性的一些代表性肽(GRS-DP，GRS-DP-B和GRS-DP-A环状)用作测试物质，全长GRS蛋白用作对照。
体内抗癌活性测定的实验程序在图6a中示意性地示出。简而言之，将1x107 SN12C(CDH6阳性)细胞经皮下注射至8周龄的雌性BALB/c小鼠的右侧腹部(Dooyeol BiotechCo.Ltd，Seocho-gu，Seoul)，然后生长5天至平均肿瘤大小为100mm3。在第5天和第7天，将PBS(对照)或测试材料(包括对照)均以20μg的剂量注射进肿瘤中(n＝5只动物/组)。在监测肿瘤21天后，在第21天牺牲小鼠并切除肿瘤。根据公式“最大直径×最小直径2×0.52”计算肿瘤体积。测试结果示于图6b-6e。
如图6b-6d所示，在最短的片段GRS-DP-B(8个氨基酸)组中，肿瘤大小(体积)和重量最明显地降低。特别地，与全长GRS蛋白和GRS-DP的那些作用相比，这种肿瘤退行作用更高。与完整蛋白相比，发现分离自全长GRS蛋白的含有本发明首次揭示的抗癌基序(第532-538位氨基酸)的短片段具有更好的抗癌活性。还观察到GRS-DP-A环状在体内呈现明显的抗癌作用(见图6b-6d)。
如图6e所示，与对照组相比，每个测试组中的小鼠体重均未发生明显变化。总之，在这个测试中获得的数据表明本发明中构建的多肽片段在体内没有毒性。
3-2.多肽的体内抗癌活性-静脉内注射
与实施例3-1中的直接瘤内注射相反，在这个实施例中通过静脉内注射评估效果。在实施例1-3中鉴定出具有卓越抗癌活性的一些代表性肽(GRS-DP，GRS-DP-B和GRS-DP-A环状)用作测试物质，全长GRS蛋白用作对照。
体内抗癌活性测定的实验程序在图6a中示意性地示出。简而言之，将1x107 SN12C(CDH6阳性)细胞经皮下注射至8周龄的雌性BALB/c小鼠的右侧腹部(Dooyeol BiotechCo.Ltd，Seocho-gu，Seoul)，然后生长5天至平均肿瘤大小为100mm3。在第5天和第7天，分别以5MPK的剂量静脉内注射PBS(对照)或测试材料(包括对照)(n＝5只动物/组)。在监测肿瘤21天后，在第21天牺牲小鼠并切除肿瘤。根据公式“最大直径×最小直径2×0.52”计算肿瘤体积。测试结果示于图7a-7d。
如图所示，在GRS-DP-B组中，肿瘤大小(体积)和重量最明显地降低。特别地，与全长GRS蛋白和GRS-DP的那些作用相比，这种肿瘤退行作用更高(图7a-7c)。鉴于全身性施用例如静脉内注射，重要的是将特定的药物特异性靶向肿瘤部位，以在当全身性施用时获得有利的抗癌作用而无副作用。还观测到GRS-DP-A环状具有在体内显著水平的抗癌作用(见图7a-7c)。
如图7d所示，与对照组相比，每个测试组中的小鼠体重均未发生明显变化。总之，在这个测试中获得的数据表明本发明中构建的多肽片段在体内没有毒性。
3-3.GRS-DP衍生的小片段靶向癌细胞的能力_静脉注射
即使以全身方式施用，在实施例3-2中也观测到GRS-DP-B呈现出最显著的抗癌作用。因此，评估了当以全身方式施用时GRS-DP-B在实施中靶向肿瘤的能力。为此，测定了GRS-DP-B、GRS-DP-A环状、GRS-DP和全长GRS蛋白的体内肿瘤靶向能力。简而言之，将B16F10细胞(5x106个细胞)经皮下注射至8周龄的C57BL/6小鼠的右侧腹部。在第14天，将用Alexafluor 488标记的全长GRS和本发明多肽均以1mg/kg小鼠体重的剂量静脉内注射，在24小时后切除肿瘤。使用IVIS Lumina Series III(PerkinElmer,Massachusetts,USA)测量肿瘤的荧光信号，以分析感兴趣区域(ROI)。
如图8a和8b所示，与全长GRS蛋白和GRS-DP多肽相比，从GRS-DP-B组检测到显著高的肿瘤特异性靶向能力。因此，GRS-DP-B本身可以用作抗癌药。另外，所述片段特异性靶向肿瘤部位的能力使得可以在治疗肿瘤的同时对肿瘤进行检测和成像。进一步地，当与抗癌药缀合时，所述片段在抗癌治疗上呈现出协同作用。因此，本发明的多肽具有非常有利的价值。
工业实用性
如上所述，本发明涉及片段化的GRS多肽、其变体及其应用，更具体地，本发明涉及由8-170个连续氨基酸组成的分离的多肽，其包含SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列第531-538位的氨基酸；或者与所述分离的多肽具有80％或更高的序列同源性的变体，包含所述多肽的融合蛋白和包含所述多肽的复合物，编码所述多肽的多核苷酸，及其在预防和治疗赘生性疾病、检测癌细胞、对癌细胞进行成像以及将药物输送至癌细胞中的应用。
本文公开的多肽(分离自GRS的多肽及其变体)含有本发明中首次发现的GRS细胞凋亡基序，并以具有一定长度的截短形式提供。所述多肽表现出比全长蛋白质和结构域更高的活性和靶向能力，在医药工业中发现了很高的工业实用性。
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<220>
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<400> 1
Met Asp Gly Ala Gly Ala Glu Glu Val Leu Ala Pro Leu Arg Leu Ala
1 5 10 15
Val Arg Gln Gln Gly Asp Leu Val Arg Lys Leu Lys Glu Asp Lys Ala
20 25 30
Pro Gln Val Asp Val Asp Lys Ala Val Ala Glu Leu Lys Ala Arg Lys
35 40 45
Arg Val Leu Glu Ala Lys Glu Leu Ala Leu Gln Pro Lys Asp Asp Ile
50 55 60
Val Asp Arg Ala Lys Met Glu Asp Thr Leu Lys Arg Arg Phe Phe Tyr
65 70 75 80
Asp Gln Ala Phe Ala Ile Tyr Gly Gly Val Ser Gly Leu Tyr Asp Phe
85 90 95
Gly Pro Val Gly Cys Ala Leu Lys Asn Asn Ile Ile Gln Thr Trp Arg
100 105 110
Gln His Phe Ile Gln Glu Glu Gln Ile Leu Glu Ile Asp Cys Thr Met
115 120 125
Leu Thr Pro Glu Pro Val Leu Lys Thr Ser Gly His Val Asp Lys Phe
130 135 140
Ala Asp Phe Met Val Lys Asp Val Lys Asn Gly Glu Cys Phe Arg Ala
145 150 155 160
Asp His Leu Leu Lys Ala His Leu Gln Lys Leu Met Ser Asp Lys Lys
165 170 175
Cys Ser Val Glu Lys Lys Ser Glu Met Glu Ser Val Leu Ala Gln Leu
180 185 190
Asp Asn Tyr Gly Gln Gln Glu Leu Ala Asp Leu Phe Val Asn Tyr Asn
195 200 205
Val Lys Ser Pro Ile Thr Gly Asn Asp Leu Ser Pro Pro Val Ser Phe
210 215 220
Asn Leu Met Phe Lys Thr Phe Ile Gly Pro Gly Gly Asn Met Pro Gly
225 230 235 240
Tyr Leu Arg Pro Glu Thr Ala Gln Gly Ile Phe Leu Asn Phe Lys Arg
245 250 255
Leu Leu Glu Phe Asn Gln Gly Lys Leu Pro Phe Ala Ala Ala Gln Ile
260 265 270
Gly Asn Ser Phe Arg Asn Glu Ile Ser Pro Arg Ser Gly Leu Ile Arg
275 280 285
Val Arg Glu Phe Thr Met Ala Glu Ile Glu His Phe Val Asp Pro Ser
290 295 300
Glu Lys Asp His Pro Lys Phe Gln Asn Val Ala Asp Leu His Leu Tyr
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Ala Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Ser Ala Arg Lys Met
325 330 335
Arg Leu Gly Asp Ala Val Glu Gln Gly Val Ile Asn Asn Thr Val Leu
340 345 350
Gly Tyr Phe Ile Gly Arg Ile Tyr Leu Tyr Leu Thr Lys Val Gly Ile
355 360 365
Ser Pro Asp Lys Leu Arg Phe Arg Gln His Met Glu Asn Glu Met Ala
370 375 380
His Tyr Ala Cys Asp Cys Trp Asp Ala Glu Ser Lys Thr Ser Tyr Gly
385 390 395 400
Trp Ile Glu Ile Val Gly Cys Ala Asp Arg Ser Cys Tyr Asp Leu Ser
405 410 415
Cys His Ala Arg Ala Thr Lys Val Pro Leu Val Ala Glu Lys Pro Leu
420 425 430
Lys Glu Pro Lys Thr Val Asn Val Val Gln Phe Glu Pro Ser Lys Gly
435 440 445
Ala Ile Gly Lys Ala Tyr Lys Lys Asp Ala Lys Leu Val Met Glu Tyr
450 455 460
Leu Ala Ile Cys Asp Glu Cys Tyr Ile Thr Glu Ile Glu Met Leu Leu
465 470 475 480
Asn Glu Lys Gly Glu Phe Thr Ile Glu Thr Glu Gly Lys Thr Phe Gln
485 490 495
Leu Thr Lys Asp Met Ile Asn Val Lys Arg Phe Gln Lys Thr Leu Tyr
500 505 510
Val Glu Glu Val Val Pro Asn Val Ile Glu Pro Ser Phe Gly Leu Gly
515 520 525
Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly
530 535 540
Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro Phe
545 550 555 560
Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met Pro Phe
565 570 575
Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser His Lys
580 585 590
Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala Arg Thr Asp
595 600 605
Glu Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp Thr Val Asn
610 615 620
Lys Thr Pro His Thr Ala Thr Leu Arg Asp Arg Asp Ser Met Arg Gln
625 630 635 640
Ile Arg Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro Ser Ile Val Gln Asp Leu Ala
645 650 655
Asn Gly Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val Glu Ala Arg Tyr Pro Leu Phe
660 665 670
Glu Gly Gln Glu Thr Gly Lys Lys Glu Thr Ile Glu Glu
675 680 685
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-DP-B(GRS 531-538)
<400> 2
Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr
1 5
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-DP-A linear (GRS 531-555, linear)
<400> 3
Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu
1 5 10 15
Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala
20 25
<210> 4
<211> 70
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-DP (GRS 531-600)
<400> 4
Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu
1 5 10 15
Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro Phe Lys Cys
20 25 30
Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met Pro Phe Val Lys
35 40 45
Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser His Lys Val Asp
50 55 60
Asp Ser Ser Gly Ser Ile
65 70
<210> 5
<211> 155
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS 531-685
<400> 5
Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu
1 5 10 15
Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro Phe Lys Cys
20 25 30
Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met Pro Phe Val Lys
35 40 45
Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser His Lys Val Asp
50 55 60
Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala Arg Thr Asp Glu Ile
65 70 75 80
Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp Thr Val Asn Lys Thr
85 90 95
Pro His Thr Ala Thr Leu Arg Asp Arg Asp Ser Met Arg Gln Ile Arg
100 105 110
Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro Ser Ile Val Gln Asp Leu Ala Asn Gly
115 120 125
Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val Glu Ala Arg Tyr Pro Leu Phe Glu Gly
130 135 140
Gln Glu Thr Gly Lys Lys Glu Thr Ile Glu Glu
145 150 155
<210> 6
<211> 160
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-F4-NT-1(GRS 526-685)
<400> 6
Gly Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val
1 5 10 15
Arg Glu Gly Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val
20 25 30
Ala Pro Phe Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe
35 40 45
Met Pro Phe Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val
50 55 60
Ser His Lys Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala
65 70 75 80
Arg Thr Asp Glu Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp
85 90 95
Thr Val Asn Lys Thr Pro His Thr Ala Thr Leu Arg Asp Arg Asp Ser
100 105 110
Met Arg Gln Ile Arg Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro Ser Ile Val Gln
115 120 125
Asp Leu Ala Asn Gly Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val Glu Ala Arg Tyr
130 135 140
Pro Leu Phe Glu Gly Gln Glu Thr Gly Lys Lys Glu Thr Ile Glu Glu
145 150 155 160
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-DP-A cyclic (GRS-DP-A variant cyclic)
<400> 7
Cys Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu
1 5 10 15
Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Cys
20 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> neucleotide sequence of GRS-DP-B(GRS 531-538)
<400> 8
atgtatacgg tatttgaaca taca 24
<210> 9
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> neucleotide sequence of GRS-DP-A linear (GRS 531-555, linear)
<400> 9
atgtatacgg tatttgaaca tacattccat gtacgagaag gagatgaaca gagaacattc 60
ttcagtttcc ctgct 75
<210> 10
<211> 210
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> neucleotide sequence of GRS-DP (GRS 531-600)
<400> 10
atgtatacgg tatttgaaca tacattccat gtacgagaag gagatgaaca gagaacattc 60
ttcagtttcc ctgctgtagt tgctccattc aaatgttccg tcctcccact gagccaaaac 120
caggagttca tgccatttgt caaggaatta tcggaagccc tgaccaggca tggagtatct 180
cacaaagtag acgattcctc tgggtcaatc 210
<210> 11
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> neucleotide sequence of GRS-DP-A cyclic (GRS-DP-A variant
cyclic)
<400> 11
tgttatacgg tatttgaaca tacattccat gtacgagaag gagatgaaca gagaacattc 60
ttcagtttcc cttgt 75
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-DP-C (GRS 538-552)
<400> 12
Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser
1 5 10 15
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> neucleotide sequence of GRS-DP-C (GRS 538-552)
<400> 13
acattccatg tacgagaagg agatgaacag agaacattct tcagt 45
<210> 14
<211> 175
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-F4
<400> 14
Leu Tyr Val Glu Glu Val Val Pro Asn Val Ile Glu Pro Ser Phe Gly
1 5 10 15
Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg
20 25 30
Glu Gly Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala
35 40 45
Pro Phe Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met
50 55 60
Pro Phe Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser
65 70 75 80
His Lys Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala Arg
85 90 95
Thr Asp Glu Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp Thr
100 105 110
Val Asn Lys Thr Pro His Thr Ala Thr Leu Arg Asp Arg Asp Ser Met
115 120 125
Arg Gln Ile Arg Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro Ser Ile Val Gln Asp
130 135 140
Leu Ala Asn Gly Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val Glu Ala Arg Tyr Pro
145 150 155 160
Leu Phe Glu Gly Gln Glu Thr Gly Lys Lys Glu Thr Ile Glu Glu
165 170 175
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-1
<400> 15
Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-2
<400> 16
Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-3
<400> 17
Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-4
<400> 18
Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val
1 5 10
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-5
<400> 19
Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp
1 5 10 15
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-6
<400> 20
Gly Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val
1 5 10 15
Arg Glu Gly Asp
20
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-7
<400> 21
Ser Phe Gly Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr
1 5 10 15
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-8
<400> 22
Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His
1 5 10
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-9
<400> 23
Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu
1 5 10 15
Gln Arg Thr Phe
20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-10
<400> 24
Asn Val Ile Glu Pro Ser Phe Gly Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val
1 5 10 15
Phe Glu His Thr
20
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-11
<400> 25
Phe Gly Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His
1 5 10 15
Val
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-12
<400> 26
Leu Tyr Val Glu Glu Val Val Pro Asn Val Ile Glu Pro Ser Phe Gly
1 5 10 15
Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His
20 25 30
<210> 27
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-14
<400> 27
Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg
1 5 10 15
Glu Gly Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala
20 25 30
Pro Phe Lys
35
<210> 28
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-19
<400> 28
Val Val Pro Asn Val Ile Glu Pro Ser Phe Gly Leu Gly Arg Ile Met
1 5 10 15
Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu Gln
20 25 30
Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro Phe Lys Cys Ser
35 40 45
Val Leu
50
<210> 29
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-20
<400> 29
Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu
1 5 10 15
Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro Phe Lys Cys
20 25 30
Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met Pro Phe Val Lys
35 40 45
Glu Leu
50
<210> 30
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-21
<400> 30
Phe Gly Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His
1 5 10 15
Val Arg Glu Gly Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val
20 25 30
Val Ala Pro Phe Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu
35 40 45
Phe Met
50
<210> 31
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-22
<400> 31
Val Ile Glu Pro Ser Phe Gly Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe
1 5 10 15
Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe
20 25 30
Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro Phe Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu
35 40 45
Ser Gln
50
<210> 32
<211> 76
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-23
<400> 32
Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu
1 5 10 15
Gly Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro
20 25 30
Phe Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met Pro
35 40 45
Phe Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser His
50 55 60
Lys Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg
65 70 75
<210> 33
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-25
<400> 33
Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly
1 5 10 15
Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro Phe
20 25 30
Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met Pro Phe
35 40 45
Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser His Lys
50 55 60
Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala Arg Thr Asp
65 70 75 80
Glu Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp Thr Val Asn
85 90 95
Lys Thr Pro His
100
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-27
<400> 34
Leu Tyr Val Glu Glu Val Val Pro Asn Val Ile Glu Pro Ser Phe Gly
1 5 10 15
Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg
20 25 30
Glu Gly Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala
35 40 45
Pro Phe Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met
50 55 60
Pro Phe Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser
65 70 75 80
His Lys Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala Arg
85 90 95
Thr Asp Glu Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp Thr
100 105 110
Val Asn Lys Thr Pro His Thr Ala
115 120
<210> 35
<211> 150
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-28
<400> 35
Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp
1 5 10 15
Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro Phe Lys
20 25 30
Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met Pro Phe Val
35 40 45
Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser His Lys Val
50 55 60
Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala Arg Thr Asp Glu
65 70 75 80
Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp Thr Val Asn Lys
85 90 95
Thr Pro His Thr Ala Thr Leu Arg Asp Arg Asp Ser Met Arg Gln Ile
100 105 110
Arg Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro Ser Ile Val Gln Asp Leu Ala Asn
115 120 125
Gly Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val Glu Ala Arg Tyr Pro Leu Phe Glu
130 135 140
Gly Gln Glu Thr Gly Lys
145 150
<210> 36
<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-29
<400> 36
Glu Val Val Pro Asn Val Ile Glu Pro Ser Phe Gly Leu Gly Arg Ile
1 5 10 15
Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu
20 25 30
Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro Phe Lys Cys
35 40 45
Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met Pro Phe Val Lys
50 55 60
Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser His Lys Val Asp
65 70 75 80
Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala Arg Thr Asp Glu Ile
85 90 95
Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp Thr Val Asn Lys Thr
100 105 110
Pro His Thr Ala Thr Leu Arg Asp Arg Asp Ser Met Arg Gln Ile Arg
115 120 125
Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro Ser Ile Val Gln Asp Leu Ala Asn Gly
130 135 140
Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val Glu Ala Arg Tyr Pro Leu Phe Glu Gly
145 150 155 160
Gln Glu Thr Gly Lys Lys Glu Thr Ile Glu
165 170
<210> 37
<211> 148
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-F4-NT-2
<400> 37
Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe
1 5 10 15
Pro Ala Val Val Ala Pro Phe Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln
20 25 30
Asn Gln Glu Phe Met Pro Phe Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr
35 40 45
Arg His Gly Val Ser His Lys Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly
50 55 60
Arg Arg Tyr Ala Arg Thr Asp Glu Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr
65 70 75 80
Ile Asp Phe Asp Thr Val Asn Lys Thr Pro His Thr Ala Thr Leu Arg
85 90 95
Asp Arg Asp Ser Met Arg Gln Ile Arg Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro
100 105 110
Ser Ile Val Gln Asp Leu Ala Asn Gly Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val
115 120 125
Glu Ala Arg Tyr Pro Leu Phe Glu Gly Gln Glu Thr Gly Lys Lys Glu
130 135 140
Thr Ile Glu Glu
145
<210> 38
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-F4-NT-3
<400> 38
Ala Pro Phe Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe
1 5 10 15
Met Pro Phe Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val
20 25 30
Ser His Lys Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala
35 40 45
Arg Thr Asp Glu Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp
50 55 60
Thr Val Asn Lys Thr Pro His Thr Ala Thr Leu Arg Asp Arg Asp Ser
65 70 75 80
Met Arg Gln Ile Arg Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro Ser Ile Val Gln
85 90 95
Asp Leu Ala Asn Gly Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val Glu Ala Arg Tyr
100 105 110
Pro Leu Phe Glu Gly Gln Glu Thr Gly Lys Lys Glu Thr Ile Glu Glu
115 120 125
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-0
<400> 39
Gly Leu Gly Arg Ile Met
1 5
<210> 40
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-13
<400> 40
Leu Tyr Val Glu Glu Val Val Pro Asn Val Ile Glu Pro Ser Phe Gly
1 5 10 15
Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe
20 25
<210> 41
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-15
<400> 41
His Val Arg Glu Gly Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala
1 5 10 15
Val Val Ala Pro Phe Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln
20 25 30
<210> 42
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-16
<400> 42
Val Val Ala Pro Phe Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln
1 5 10 15
Glu Phe Met Pro Phe Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His
20 25 30
Gly Val Ser His Lys Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg
35 40 45
Tyr Ala Arg Thr Asp Glu Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp
50 55 60
Phe Asp Thr Val Asn Lys Thr Pro His Thr Ala Thr Leu Arg Asp Arg
65 70 75 80
Asp Ser Met Arg Gln Ile Arg Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro Ser Ile
85 90 95
Val Gln Asp Leu Ala Asn Gly Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val Glu Ala
100 105 110
Arg Tyr Pro Leu Phe Glu Gly Gln Glu Thr Gly Lys Lys Glu Thr Ile
115 120 125
Glu Glu
130
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-17
<400> 43
Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu Gln Arg
1 5 10 15
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-18
<400> 44
Phe Gly Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val
1 5 10
<210> 45
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-24
<400> 45
Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser His Lys
1 5 10 15
Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala Arg Thr Asp
20 25 30
Glu Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp Thr Val Asn
35 40 45
Lys Thr Pro His Thr Ala Thr Leu Arg Asp Arg Asp Ser Met Arg Gln
50 55 60
Ile Arg Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro Ser Ile Val Gln Asp Leu Ala
65 70 75 80
Asn Gly Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val Glu Ala Arg Tyr Pro Leu Phe
85 90 95
Glu Gly Gln Glu Thr Gly Lys Lys
100
<210> 46
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRS-EX-26
<400> 46
Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly Asp Glu Gln Arg
1 5 10 15
Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro Phe Lys Cys Ser Val
20 25 30
Leu Pro Leu Ser Gln
35

Claims (42)

1.一种多肽，其由以下组成：
分离的多肽，其由连续的8-170个氨基酸残基组成，其含有在SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列的第531-538位的氨基酸；或者
与所述分离的多肽具有80％或更高的序列同源性的变体。
2.权利要求1的多肽，其中所述分离的多肽或变体特异性靶向癌细胞。
3.权利要求1的多肽，其中所述分离的多肽包含选自SEQ ID NO:2-6的氨基酸序列。
4.权利要求1的多肽，其中所述变体包含与选自SEQ ID NO:2-6的任何一氨基酸序列具有80％或更高的序列同源性的序列。
5.权利要求1的多肽，其中所述变体包含SEQ ID NO:7定义的氨基酸序列。
6.权利要求1的多肽，其中所述分离的多肽由8-160个连续氨基酸组成，其含有SEQ IDNO:1定义的氨基酸序列的第531-538位的氨基酸。
7.权利要求1的多肽，其中所述分离的多肽由8-100个连续氨基酸组成，其含有SEQ IDNO:1定义的氨基酸序列的第531-538位的氨基酸。
8.权利要求1的多肽，其中所述分离的多肽由8-50个连续氨基酸组成，其含有SEQ IDNO:1定义的氨基酸序列的第531-538位的氨基酸。
9.权利要求1的多肽，其中所述分离的多肽由8-20个连续氨基酸组成，其含有SEQ IDNO:1定义的氨基酸序列的第531-538位的氨基酸。
10.权利要求1的多肽，其中所述分离的多肽由8-10个连续氨基酸组成，其含有SEQ IDNO:1定义的氨基酸序列的第531-538位的氨基酸。
11.权利要求1的多肽，其中所述分离的多肽或变体为线性或环状形式。
12.权利要求1的多肽的PEG化形式。
13.一种融合蛋白，其包含权利要求1的多肽和异源融合伴侣。
14.权利要求13的融合蛋白，其中所述异源融合伴侣是抗体或其片段。
15.权利要求14的融合蛋白，其中所述片段选自Fc、双抗体、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv和scFv。
16.二聚体或多聚体复合物，其包含至少一个权利要求1的多肽。
17.一种多核苷酸，其编码权利要求1的多肽。
18.一种表达载体，其包含权利要求17的多核苷酸。
19.一种宿主细胞，其包含权利要求18的表达载体。
20.一种组合物，其包含生理上可接受的载体和选自以下的至少一种：
(i)权利要求1的多肽，
(ii)融合蛋白，其包含(i)的多肽和异源融合伴侣，
(iii)二聚体或多聚体复合物，其包含至少一个(i)的多肽，
(iv)编码(i)至(iii)的多肽的多核苷酸，
(v)包含(iv)的多核苷酸的表达载体，和
(vi)包含(v)的表达载体的宿主细胞。
21.药物组合物，其包含权利要求1的多肽或权利要求17的多核苷酸作为活性成分，用于预防或治疗赘生性疾病。
22.权利要求21的药物组合物，其中所述赘生性疾病选自选自结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、Kaposi's肉瘤、卵巢癌、白血病、骨髓增生异常综合症、真性红细胞增多症、淋巴瘤、子宫颈癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、实体瘤和与血管生成相关的疾病。
23.权利要求22的药物组合物，其中所述血管生成相关的疾病选自与年龄相关的黄斑变性、糖尿病失明、子宫内膜异位、眼新血管形成、血管瘤、鲜红斑痣、单纯痣、糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、新生血管性青光眼、皮肤红变、增生性视网膜病变、银屑病、血友病性关节病、动脉粥样硬化斑块中的毛细血管增生、瘢痕瘤、伤口肉芽、血管狭窄、类风湿性关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、克罗恩氏病、再狭窄、动脉粥样硬化性动脉硬化、猫抓病、溃疡、肾小球肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病、肾小球病和炎症。
24.鉴定抗癌剂的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
(a)形成含有(i)和(ii)的反应混合物：
(i)选自权利要求1的多肽和权利要求17的多核苷酸的成分，
(ii)测试化合物；及
(b)确定在存在所述测试化合物的条件下所述成分的抗癌活性增加，其中确定在存在所述测试化合物条件下的抗癌活性与在不存在测试化合物的条件下的抗癌活性相比的变化，从而鉴定有活性的测试化合物。
25.一种组合物，其包含权利要求1的多肽作为活性成分，用于检测癌细胞或对癌细胞进行成像。
26.权利要求25的组合物，其中用选自显色酶、放射性核素、生色团、发光物质、荧光剂、超顺磁性颗粒或超超顺磁性颗粒的至少一种标记所述多肽。
27.一种检测癌细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将权利要求1的多肽与生物学样品混合；
(b)除去未结合或非特异性结合的多肽；及
(c)确定所述多肽是否结合以及在何处结合。
28.一种组合物，其包含权利要求1的多肽作为活性成分，用于对癌细胞进行成像。
29.权利要求28的组合物，其中用选自显色酶、放射性核素、生色团、发光物质、荧光剂、超顺磁性颗粒或超超顺磁性颗粒的至少一种标记所述多肽。
30.一种组合物，其包含权利要求1的多肽作为活性成分，用于癌细胞特异性药物输送。
31.权利要求30的组合物，其中所述药物选自紫杉醇、阿霉素、长春新碱、柔红霉素、长春碱、放线菌素-D、多西紫杉醇、依托泊苷、替尼泊苷、比生群、高三尖杉酯碱、格列卫(STI-571)、顺铂、5-氟尿嘧啶、阿霉素、氨甲蝶呤、白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、氮芥、亚硝基脲、链激酶、尿激酶、阿替普酶、血管紧张素II抑制剂、醛固酮受体抑制剂、促红细胞生成素、NMDA(N-甲基-d-天冬氨酸)受体抑制剂、洛伐他汀、雷帕霉素、塞来昔布、ticlopin、马马斯他和trocade。
32.一种组合物，其包含权利要求1的多肽和与其结合的抗癌剂作为活性成分，用于预防和治疗癌症。
33.权利要求17的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:8-11的核酸序列。
34.权利要求1的多肽或权利要求17的多核苷酸在制备用于预防和治疗赘生性疾病的制剂中的应用。
35.一种预防和治疗赘生性疾病的方法，所述方法包括给有需要的对象使用有效量的包含权利要求1的多肽或权利要求17的多核苷酸作为活性成分的组合物的步骤。
36.权利要求1的多肽在制备用于检测癌细胞的制剂中的应用。
37.权利要求1的多肽在制备用于对癌细胞进行成像的制剂中的应用。
38.一种对癌细胞进行成像的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的包含权利要求1的多肽作为活性成分的组合物的步骤。
39.权利要求1的多肽在制备用于输送癌细胞特异性药物的制剂中的应用。
40.一种癌细胞特异性药物输送的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的包含权利要求1的多肽作为活性成分的组合物的步骤。
41.权利要求1的多肽和与其结合的抗癌剂在制备用于预防和治疗癌症的制剂中的应用。
42.一种预防或治疗癌症的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的包含权利要求1的多肽和与其结合的抗癌剂的组合物的步骤。
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