KR101575194B1 - 인간 페리틴 유래 융합폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 페리틴 유래 융합폴리펩티드에 관한 것으로 더욱 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 단편 및 서열번호 6으로 표시되는 인간 유래 페리틴 모노머가 순차적으로 연결된 융합폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 융합폴리펩티드는 단백질 케이지를 형성하여 내부에 유효물질의 봉입이 가능하며, 폴리펩티드 단편의 특정 분자, 세포 또는 조직과의 결합력을 매우 향상시켜 암 및 동맥경화의 진단, 치료 및 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

인간 페리틴 유래 융합폴리펩티드{Fusion polypeptide derived from human ferritin}

본 발명은 인간 페리틴 유래 융합 폴리펩티드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 단편 및 서열번호 6으로 표시되는 인간 유래 페리틴 모노머가 순차적으로 연결된 융합폴리펩티드에 관한 것이다.

IL-4 수용체(receptor)는 여러 가지 인간 암(대장암, 폐암, 자궁암 및 유방암)에서 과발현함이 알려져 있어 IL-4 수용체에 선택적으로 결합하는 활성 폴리펩티드의 개발이 암의 진단 및 치료에 응용되어왔다. 또한, IL-4는 세포부착을 증가시키는 사이토카인(cytokine)으로 동맥경화를 유발시키는 작용을 하므로 IL-4 대신 IL-4 수용체에 결합하여 IL-4와 IL-4 수용체의 결합을 저해하는 동맥경화의 진단 및 치료제가 개발되어져왔다.

한편 케이지(cage) 단백질은 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 단일체 분자량의 수 십에서 수 백배의 거대분자를 형성할 수 있는 단백질이다. 자연계에서 바이러스 capsid 단백질, 페리틴, heat shock protein, Dps 단백질이 이에 해당되며 케이지(cage)를 구성하는 각각의 단일체들은 인접 단일체들과 매우 규칙적이고 정밀한 상호작용을 이루고 있고 케이지(cage)의 내부는 비어있는 구조이다. 상기와 같은 케이지 단백질의 용기(container)와 같은 성질에 의해 내부와 외부가 격리되는 특징을 가지고 있어, 약물 전달체로 의학분야에서 활용 빈도가 높다.

케이지 단백질 응용 물질 수송 분야는 바이러스성 수송체 (viral vector)와 비 바이러스성 수송체 (non-viral vector)에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 현재까지 바이러스성 수송체로는 아데노바이러스 (adenovirus) 등이 많이 연구되고 있고 비 바이러스성 수송체로는 페리틴, heat shock protein 등에 관하여 연구되고 있다. 그러나 기존의 바이러스성 수송체일 경우에는 바이러스 자체가 소유하는 유전자에 의한 체내 안전성 문제가 제기되어 왔다.

페리틴은 단백질은 세포내 단백질의 일종으로 철을 저장하고, 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 일반적으로 생체 내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage) 형태를 하고 있으며, 상기 케이지는 24개의 subunit으로 구성되며, subunit은 그 구조에 따라 heavy chain과 light chain으로 구분된다.

인간유래 페리틴 단백질은 바이러스성 수송체가 가지는 안정성의 문제는 없으나, 임의의 부위에 타겟팅 부위(targeting moiety)를 결합시키는 경우 특이적 결합력이 떨어지거나, 케이지를 형성하지 아니하는 문제가 있다. 따라서 케이지의 형성에 문제가 없으면서, 부착되는 타겟팅 부위의 특이적 친화력을 높여 효과적으로 표적에 전달 할 수 있는 융합폴리펩티드 개발이 시급한 실정이다.

폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내의 단백질 분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질을 안정화시키고 프로테아제 접촉 및 신장 소실을 억제하기 위한 방법으로, 종래에는 폴리(에틸렌 글리콜)(polyethylene glycol: PEG)과 같이 용해도가 높은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어 왔다. 그러나, PEG를 결합시키는 경우에 단백질의 안정성은 증가할 수 있지만 생리활성 단백질의 역가가 현저히 낮아지고, PEG의 분자량이 증가할수록 단백질과의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.

이에 본 발명자들은 진단, 치료 및 예방을 위해 발굴된 AP-1 펩티드의 낮은 결합력, 비안정성, 고면역성 등의 문제점을 극복하기 위하여 AP-1 펩티드를 인간유래 페리틴과 결합하여 인체내 AP-1 펩티드의 결합력과 안정성을 높이면서 면역성을 낮출 수 있는 새로운 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 단편 및 서열번호 6으로 표시되는 인간 유래 페리틴 모노머가 순차적으로 연결된 융합폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티드는 히스티딘이 1 내지 10개가 반복된 히스티딘 반복 태그(tag)가 서열번호1의 폴리펩티드 단편 앞에 연결되는 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티드를 포함하는 페리틴 단백질를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티이드를 포함하는 단백질 나노입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질 나노입자를 포함하는 단백질 칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 단편 및 서열번호 6으로 표시되는 인간 유래 페리틴 모노머가 순차적으로 연결된 융합폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 히스티딘이 1 내지 10개가 반복된 히스티딘 반복 태그(tag)가 서열번호1의 폴리펩티드 단편 앞에 연결되는 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 융합폴리펩티드를 포함하는 페리틴 단백질를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 융합폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 발현벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 융합폴리펩타이드를 포함하는 단백질 나노입자를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 단백질 나노입자를 포함하는 단백질 칩을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 단편 및 서열번호 6으로 표시되는 인간 유래 페리틴 모노머가 순차적으로 연결된 융합폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 융합펩티드는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 단편과 서열번호 6으로 표시되는 인간유래 페리틴 모노머가 순차적으로 융합되는 것을 특징으로 한다.

페리틴(ferritin)은 단백질 세포내 단백질의 일종으로 철을 저장하고, 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 일반적으로 생체 내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage)형태를 하고 있으며, 상기 케이지는 24개의 페리틴 모노머(monomer)로 구성되며, 상기 페리틴 모노머는 그 구조에 따라 heavy chain과 light chain으로 구분된다.

본 발명의 페리틴 모노머는 페리틴 모노머의 구조에 상관없이 모두 가능하며, 바람직하게는 페리틴 라이트 체인(light chain) 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 일 수 있다. 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열은 인간유래 페리틴(ferritin) 단백질의 라이트 체인(light chain)이다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드단편은 바람직하게는 본 발명의 융합 폴리펩티드간 또는 상기 융합 폴리펩티드와 인간 유래 패리틴 모노머간의 결합을 방해하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 융합폴리펩티드는 상기 융합폴리펩티드간 또는 융합폴리펩티드와 다른 페리틴 모노머간의 결합 없이 단독으로 사용이 가능하나, 페리틴과 같이 융합폴리펩티드간 또는 융합폴리펩티드와 다른 페리틴 모노머간의 결합을 통하여 다이머, 트라이머를 형성하거나, 또는 수개의 모노머가 케이지 단백질을 형성하여 새로운 기능을 나타내거나, 다른 물질과의 결합 특이성을 더욱 높일 수 있으므로, 본 발명의 폴리펩티드단편은 상기 융합 폴리펩티드간 또는 상기 융합 폴리펩티드와 인간 유래 패리틴 모노머간의 결합을 방해하지 않는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 융합폴리펩티드는 목적하는 물질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 상기 목적하는 물질은 본 발명 융합폴리펩티드에 융합된 폴리펩티드 단편과 결합친화력(binding affinity)를 보이는 물질을 말한다.

상기 결합친화력(binding affinity)은 생체 분자간 결합하려는 성질의 강도를 말한다.

또한, 상기 목적하는 물질은 어떠한 종류도 가능하며, 생체 내 물질과 생체 외 물질을 모두 포함한다. 생체 내 물질은 생체 내 장기, 조직, 세포, 세포 표면의 수용체(receptor), 효소를 포함한 세포내 단백질, 세포간 물질, 핵산, 외부로부터 들어온 독성물질, 치료물질, 검사용 물질을 모두 포함한다. 생체 외 물질은 다양한 시험을 위한 물질 고정용 지지체(각종 레진, 슬라이드 글라스, 플레이트, 필름) 또는 각종 시험 대상인 유기, 무기 화합물을 모두 포함한다. 바람직하게는 목적 물질이 IL-4 수용체일 수 있다.

한편 본 발명은 본 발명의 융합폴립페티드는 히스티딘이 1내지 10개가 반복된 히스티딘 반복 태그(tag)가 서열번호1의 폴리펩티드 단편 앞에 연결되는 것을 특징으로 하는 융합폴립펩티드를 제공한다.

본 발명에서 히스티딘 태그는 히스티딘이 1개 내지 10개가 반복된 태그일 수 있으며, 바람직하게는 히스티딘이 6개 반복되는 히스티딘 태그 일 수 있다.

한편 본 발명은 본 발명의 융합폴리펩티드를 포함하는 페리틴 단백질을 제공한다.

본 발명의 페리틴 단백질은 본 발명의 융합폴리펩티드가 단위체로서 규칙적으로 배열된 복합 단백질일 수 있으며, 더 바람직하게는 본 발명의 융합폴리펩티드 24개가 3차원적으로 규칙적으로 배열을 통해 형성된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 페리틴 단백질은 페리틴 단백질 모노머의 결합에 의해 만들어지는 것으로 일반적으로 생체 내에서 구형의 케이지 형태를 하고 있다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 융합폴리펩티드(이하 His_AP1_ferritin으로 기재)를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 대장균을 형질 전환시켜 상기 페리틴 단백질을 대량 생산하였다. 이에 대조군으로 본 발명의 융합폴리펩티드가 포함되지 않고 히스티딘 태그만 포함(이하 His_ferritin으로 기재)된 발현 벡터로 상기와 동일한 과정으로 단백질을 생산했다. 그 결과 SDS-PAGE에서 His_AP1_ferritin 단백질 및 His_ferritin 단백질 모두 약 23kDa 크기로 정제된 것을 확인 하였다(도 2).

한편 본 발명은 본 발명의 융합폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

한편 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 발현벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 발현 벡터로는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pET30a, pET30c 및 pGEX-GST), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스 미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등이 있고, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 및 식물 바이러스가 사용될 수 있으며, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수 있다. 당업자라면 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 도입시키는데 적합한 벡터를 선택할 수 있으며, 본 발명에서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 숙주 세포내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다. 그러나 바람직하게는 단백질 발현 유도 및 발현된 단백질의 분리가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터인 pET29a(+) 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 pET29a(+)에 제한효소인 NdeⅠ및 XhoⅠ를 사용하여 37℃에서 1시간동안 처리하고 정제한 후 T4 DNA ligase를 이용해 His_AP1_ferritin 및 His_ferritin을 결합시켰다. 그 결과 His_AP1_ferritin 발현벡터 및 His_ferritin 발현벡터를 얻었다(도 1).

한편 본 발명은 본 발명의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 발현벡터로 형질전환 된 것을 특징으로 한다. 상기 발현벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)를 이용할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

한편 본 발명은 본 발명의 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지를 제공한다.

단백질 케이지(Protein cage)는 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 형성되며, 내부에 공간을 가지는 단백질로 된 케이지이다. 바이러스 capsid 단백질, 페리틴, heat shock protein, Dps 단백질이 이에 해당된다. 본 발명의 단백질 케이지는 본 발명의 융합폴리펩티드를 상기 단백질 케이지를 구성하는 단일체(모노머, monomer)로 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 단백질 케이지는 본 발명의 융합폴리펩티드만으로, 또는 본 발명의 융합폴리펩티드 및 다른 페리틴 단백질 모노머와의 조합으로 구성될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 다른 일실시예에서 제조된 His_AP1_ferritin 및 His_ferritin, 두 가지 단백질과 wild type ferritin에 고속단백질 액체크로마토그래피(FPLC:Fast Protein Liquid Chromatography)를 시행하여 제조된 단백질이 24mer를 잘 형성하는지 확인하였다. 그 결과 그려진 standard curve 그래프에서 wild type ferritin의 curve와 His_AP1_ferritin 및 His_ferritin curve의 크기가 유사하여 24mer 형성이 잘 이루어 진 것으로 확인하였다(도 3).

또한 본 발명의 다른 일실시예에서는 생물 투과현미경을 이용하여 His_AP1_ferritin 및 His_ferritind의 단백질이 케이지를 잘 형성하는 지 확인하였다. 그 결과 상기의 두 가지 단백질이 24mer 케이지를 잘 형성하고 있음을 확인하였다(도 4).

한편 본 발명에서는 본 발명의 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 조성물과 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 진단이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암 또는 동맥경화 존재 또는 특징을 확인하는 것이다. 본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 융합폴리펩티드는 서열번호 1 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며,

본 발명의 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 단편은 IL-4 수용체(receptor)에 특이적으로 결합하는 특성을 가진다.

IL-4(interleukin-4)는 T-헬퍼2(T-helper2, Th2) 림프구, 호산구, 비만세포 등에서 분비되는 다양한 면역조절 기능을 가진 사이토카인이다. IL-4는 나이브 T-헬퍼(naive T-helper, naive Th)를 Th2 림프구로 분화를 유도하고 IL4, IL5, IL9, IL13과 같은 사이토카인들의 생산을 유도한다. 또한 B 림프구에 의한 IgE(immunoglobin E)의 분비를 유도한다. 특히 천식에서는 IL4가 점액단백질인 뮤신(mucin) 유전자의 발현 유도와 점액분비를 촉진시켜 기도 폐색과 염증에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Paul, Blood, 1991; 77:1859-1870;). 이와 같이 IL4는 알레르기성 염증반응의 핵심 물질이며 따라서 IL4에 의해 조절되는 효과를 적절히 저해할 수 있으면 알레르기성 질병의 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

또한, IL-4는 여러 암 조직에서 정상조직 보다 높은 농도로 발견되며, 종양 침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)에서 다량의 IL-4가 생성되는 것이 보고되었다(Shurin, Springer Semin Immunopathol, 1999;21:339). IL-4는 만성 임파성 백혈병 B 세포에 작용하여 이들 세포의 세포사멸에 대한 저항성을 유발한다(Dancescu, J Exp Med, 1992;176:1319). 또한, IL-4는 종양세포 및 암 줄기세포에서도 합성되며, 암세포 표면의 IL-4 수용체를 통하여 세포사멸에 대한 암세포의 저항성을 부여하는 것이 최근 보고되었다(Todaro, Cell Death Differ, 2008;15:762-772; Todaro, Cell Stem Cell, 2007,1:389-402). IL-4 수용체는 비소세포 폐암, 뇌 종양, 유방암, 방광암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 신장암 및 카포시 육종(kaposi's sarcoma) 등의 여러 암세포에서 정상세포에서 보다 훨씬 더 많이 발현된다. IL-4 수용체에 의한 암세포의 항암제 내성 획득 및 암세포에서의 높은 발현 정도를 고려할 때, IL-4 수용체는 암표적을 위한 유망한 표적이라고 볼 수 있다. 현재 IL-4 자체를 일부 변형시킨 다음 이를 슈도모나스 독소(psuedomonas toxin)와 결합한 융합단백질을 이용하여 암세포를 표적하여 세포 내로 독소를 집어 넣어 암세포를 사멸시키는 연구 등이 보고되었다(Joshi, Cancer Res, 2001;61:8058-8061; Garland, J Immunother, 2005;28:376-381; Kioi, Cancer Res, 2005;65:8388-8396; Kawakami, Clin Cancer Res, 2002;8:3503-3511).

또한 IL-4는 동맥경화 조직에서 정상조직 보다 높은 농도로 발견되며, 혈관 내피세포에서 VCAM-1 및 MCP-1의 발현을 유도하여 염증부위로 단핵구, T 림프구, 호염기구 및 호산구 등의 이동을 촉진시킨다(Sasaguri et al., Atherosclerosis, 1998;138:247-253; Lee et al., J Mol Cell Cardiol, 2001;33:83-94). 보다 중요하게는, LDL 수용체 또는 ApoE 단백질이 유전적으로 결핍된 동맥경화모델 쥐에 IL-4를 유전적으로 결핍시키면 대동맥의 동맥경화 병변의 크기가 줄어든다고 보고되었다(Davenport et al., Am J Pathol, 2003;163:1117-1125; King et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2002;22:456-461). 이와 같이 IL-4는 동맥경화 발생과정에 역할을 하며 IL-4의 작용을 길항할 수 있다면 동맥경화의 진단, 치료 또는 예방에 효과가 있을 것이다.

본 발명의 일실시예에서 His_AP1_ferritin 단백질과 His_ferritin 단백질을 IL-4 receptor를 많이 발현하는 A549, Hela 및 4T1 세포에 결합시킨 뒤 형광물질 발현 세포 선별법(FACS:Fluorescence Activated Cell Sorting)로 분석한 결과, His_AP1_ferritin 단백질이 His_ferritin 단백질에 비해 IL-4 receptor에 더 많이 결합하고 있었으며, IL-4 receptor에 따른 결합 정도를 알아보기 위해 A549 세포와 HeLa세포에서 IL-4 receptor blocking 처리하고 결합 결과 His_AP1_ferritin 단백질이 IL-4 receptor에 의존적이라는 것을 확인 하였다(도 5).

본 발명의 다른 일실시예에서는 confocal microscopy를 이용하여 Hela 및 4T1 세포에 His_AP1_ferritin 단백질 및 His_ferritin 단백질의 결합을 직접 관찰한 결과 His_AP1_ferritin 단백질이 His_ferritin 단백질에 비해 더 잘 결합하고 있음을 확인하였다(도 6).

본 발명의 다른 일실시예에서는 z-stack를 이용하여 cell uptake가 일어나는지 확인하였으며, 그 결과 His_AP1_ferritin 단백질은 Hela 및 4T1 세포의 표면에 결합이 증가할 뿐만 아니라, cytoplasm내에 uptake 또한 잘 일어남을 확인하였다(도 7).

따라서 본 발명의 융합폴리펩티드는 IL-4 receptor에 높은 결합친화력을 나타내며, IL-4 receptor에 특이적으로 결합한다. 이러한 융합 폴리펩티드가 동물내에서 안정성을 유지하는지를 확인하기 위하여 동물실험을 진행하였고, 동물의 체중변화와 종양의 크기 변화를 통하여 동물 실험에서의 안정성을 확보하였다.

또한 종양을 가진 동물에서의 종양 표적성을 확인하기 위한 실시예에서, 융합 폴리펩티드의 종양 표적성이 우월하고, 이러한 종양 표적성은 종양 세포의 IL-4 수용체에 의한 것임을 확인하였다. 추가적으로 그 표적성을 실시간으로 확인하여 24시간까지 지속됨을 확인하였다.

이러한 결과를 바탕으로, 본 발명의 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지는 케이지 내의 물질을 효과적으로 세포내로 전달하므로, 본 발명의 융합폴리펩티드를 이용한 암 및 동맥경화 진단용 조성물 및 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 암 또는 동맥경화 진단용 조성물 및 진단용 키트는 IL-4 매개 염증성 질환인 암 또는 동맥경화를 효과적으로 진단, 예방 및 치료하는 효과를 갖는다.

본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 질환은 암일 수 있다. 상기 암은 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종 일 수 있다. 바람직하게는 폐암, 자궁암 또는 유방암 일 수 있다.

한편, 본 발명에서는 상기 융합폴리펩타이드를 포함하는 단백질 나노입자 및 상기 단백질 나노입자를 포함하는 단백질 칩을 제공한다.

상기 단백질 나노입자란 나노미터(nanometer)크기의 직경을 가지는 구형의 단백질 입자를 의미한다.

본 발명의 단백질 나노입자는 본 발명의 융합폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 단백질 칩은 상기 본 발명의 단백질 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 단백질 나노입자는 IL-4 수용체에 높은 결합 친화력을 가지는 본 발명의 융합폴리펩타이드를 포함하므로써 IL-4 수용체 매개 질환인 암 또는 동맥경화를 진단, 예방 및 치료하는데 효과적이다.

또한 상기 단백질 칩은 특정 생체물질과 반응할 수 있는 수 십 또는 수 천 종류 이상의 서로 다른 펩티드 또는 단백질을 고체표면에 집적화하여 다양한 생체분자와 결합하여 효과적으로 분석하는 바이오 칩을 의미한다. 본 발명의 단백질 칩 제작시 기판은 유리, 변형된 실리콘, 데트라플루오로에틴렌, 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌 등의 중합체나 겔을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 단백질 나노입자를 이용하여 제작한 본 발명의 단백질 칩은 바이오 마커 또는 신약 후보물질 스크리닝 시스템으로 사용할 수 있다. 또한 상기 본 발명의 단백질 칩은 IL-4 수용체 매개 질환인 암 또는 동맥경화를 진단, 예방 및 치료하는데 효과적인 본 발명의 융합폴리펩타이드를 포함하는 단백질 나노입자를 포함하므로써 암 또는 동맥경화를 진단하는데 탁월한 효과를 갖는다.

또한 본 발명은 본 발명의 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 융합폴리펩티드를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 “유효량”이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 암 또는 동맥경화를 치료하기에 충분한 양을 말한다.

상기 '개체(subject)'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다.

상기에서 “약학적으로 허용되는” 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

상기 암은 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종 일 수 있다. 바람직하게는 폐암, 자궁암 또는 유방암 일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 융합폴리펩타이드는 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 제제는 하나 이상의 본 발명의 융합폴리펩티드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.

본 발명의 치료용 조성물을 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, l9th Edition, Alfonso, R., ed, Mack Publishing Co.(Easton, PA: 1995))와 바람직한 순도를 갖는 항체를 혼합하여 저장하기 위해 동결건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 제조할 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충용액, 예를 들어 인산, 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.

또한, 본 발명의 융합폴리펩티드의 인체에 대한 투여는 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 융합폴리펩티드의 투여량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.0001mg 내지 100mg, 가장 바람직하게는 0.001mg 내지 10mg일 수 있다. 투여량은 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 암 또는 동맥경화의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 단편 및 서열번호 6으로 표시되는 인간 유래 페리틴 모노머가 순차적으로 연결된 융합폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 융합폴리펩티드는 단백질 케이지를 형성하여 내부에 유효물질의 봉입이 가능하며, 폴리펩티드 단편의 특정 분자, 세포 또는 조직과의 결합력을 매우 향상시켜 암 및 동맥경화의 진단, 치료 및 예방에 효과적이다.

도 1은 His_ferritin 발현벡터(A)와 His_AP1_ferritin 발현벡터(B)의 구조이다. His_ferritin은 히스티딘 태그 및 서열번호 6의 인간유래 페리틴을 포함하는 발현벡터이고, His_AP1_ferritin은 히스티딘 태그, 서열번호 1의 폴리펩티드 단편 및 서열번호 6의 인간유래 페리틴이 순차적으로 결합된 본 발명의 융합폴리펩티드를 포함하는 발현벡터이다.
도 2는 His_ferritin 단백질 및 His_AP1_ferritin 단백질을 SDS-PAGE에서 확인한 결과이다.
도 3은 His_ferritin 및 His_AP1_ferritin을 wild type ferritin과 고속단백질 액체크로마토그래피로 단백질 크기를 비교한 것이다(Abs@280nm : 280nm파장에서의 흡광도, Flow : 유량(ml), Ferritin(점선) : 야생형 페리틴(wild-type ferritin), His_ferritin(가는 녹색선) : 히스티딘이 결합된 페리틴, His_AP1_ferritin(굵은 적색선) : 히스티딘 및 AP1이 결합된 페리틴
도 4는 생물 투과전자현미경으로 His_ferritin 단백질 및 His_AP1_ferritin 단백질의 24mer cage 형성을 확인한 것이다(His_ferritin: 히스티딘이 결합된 페리틴, His_AP1_ferritin: 히스티딘 및 AP1이 결합된 페리틴).
도 5는 형광물질 발현 세포 선별법을 이용한 세포 결합 정도를 비교한 것이다(A549 : 폐암세포주, HeLa : 자궁암세포주, 4T1 : 유방암세포주, control : 미처리군, His_ferritin : 히스티딘이 결합된 페리틴 처리군, His_AP1_ferritin : 히스티딘 및 AP1이 결합된 페리틴 처리군, His_AP1_ferritin//IL4R blocking : IL4 Receptor blocking Ab를 전처리 한 후 히스티딘 및 AP1이 결합된 페리틴을 처리한 군).
도 6은 confocal microscopy 에서 세포 결합 정도를 확인한 것이다(A549 : 폐암세포주, HeLa : 자궁암세포주, His_ferritin : 히스티딘이 결합된 페리틴 처리군, His_AP1_ferriti : 히스티딘 및 AP1이 결합된 페리틴 처리군).
도 7은 confocal microscopy로 z-stack을 통해 세포 uptake 정도를 확인한 것이다(A549 : 폐암세포주, HeLa : 자궁암세포주, His_ferritin : 히스티딘이 결합된 페리틴 처리군, His_AP1_ferritin : 히스티딘 및 AP1이 결합된 페리틴 처리군).
도 8은 표면 플라즈몬 공명 분석으로 결합친화력을 확인한 것이다(A, B : 표시된 농도별 His-AP1_ferritin 을 분석 장치 표면에 고착화된 IL-4 수용체에 흘려 결합된 양에 비례하는 공명값을 표시. C : Saturation 된 공명값을 각 농도에 따라 plotting 한 후 KaleidaGraph program으로 결합친화력(Kd)를 계산. 대조군은 His-ferritin).
도 9는 폴리펩티드의 안전성을 동물모델에서 확인하기 위한 마우스의 무게 변화와 종양의 크기 변화를 관찰하였다((a) : 마우스의 체중 변화; (b) : 종양 성장 패턴).
도 10은 폴리펩티드의 종양 표적성을 확인하기 위한 공초점 현미경 관찰 결과 사진이다((a) : His_ferritin을 주사한 군의 경우 종양조직; (b) : His_AP1_ferritin을 주사한 군의 경우 종양조직).
도 11은 폴리펩티드의 종양 표적성을 확인하기 위한 소동물 이미징 관찰 결과 사진이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

발현벡터 제조 및 정제

<1-1> 발현벡터의 제조

human ferritin light chain에 AP1 펩타이드가 연결된 융합 단백질을 제조하기 위하여 유전자 재조합 방법을 이용하였다.

구체적으로 N term 방향인 SSQIR 앞쪽에 Histidine 6개가 반복되는 His Tag 과 AP1 아미노산 서열(서열번호 1)을 삽입한 His_AP1_ferritin 과, 이에 대한 대조군으로 His Tag 만 삽입된 His_ferritin을 제조하였다. 발현벡터는 대장균의 발현벡터인 pET29a(+)를 사용하였다.

AP1 펩타이드의 염기서열을 합성하기 위하여 아래의 표 1과 같이 올리고머를 주문한 후, molar ratio를 1:1로 하여 섞은 후 최종 농도가 1pmol/ul가 되게 희석하였다. 그리고 섞은 염기서열을 95℃에 5분정도 heat block에서 incubation한 후 서서히 온도를 상온까지 내려 pET29a(+) 발현벡터를 NdeI, XhoI 제한효소 (TAKARA 구입)를 이용하여 37℃에서 1시간동안 처리를 하고 정제를 한 후 T4 DNA ligase를 이용하여 상기 AP1 유전자를 결합시켰다(도 1).

	프라이머	프라이머 서열	서열번호
S1_AP1_ ferritin	정방향 프라이머	gatccatatgcatcatcaccaccatcacggcagccgaaaacggctcgacaggaacggcagcatgagctcccagattcgtca	2
	역방향 프라이머	gatcctcgagttagtcgtgcttgagagtgagcc	3
WT_ ferritin	정방향 프라이머	gatccatatgcatcatcaccaccatcacggcagcatgagctcccagattcgtca	4
	역방향 프라이머	gatcctcgagttagtcgtgcttgagagtgagcc	5

<1-2> 벡터의 발현 및 분리정제

제조된 발현벡터로 대장균을 형질 전환시켜 융합단백질을 대량 생산하였다. 구체적으로 His Tag 이 삽입된 His_ferritin 과 His Tag과 AP1 peptide 가 삽입된 His_AP1_ferritin 발현벡터를 BL21 숙주세포에 형질변환을 시키고, LB배지에서 37℃에서 키운 후 OD₆₀₀값이 0.5에 도달하면 IPTG 0.5mM을 이용하여 발현을 유도하였다. 다시 18℃에서 18시간을 더 배양한 후 세포를 수거하고 lysis 버퍼 (50mM Tris, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1% tripton X-100, 1mM PMSF, 1mM DTT)를 이용하여 세포를 파괴한 후 원심분리(4도, 13000rpm, 30분)를 시행하였다. His_ferritin은 원심 분리 후 상층액만을 affinity 크로마토그래피 정제에 이용하였고, His_AP1_ferritin은 가라앉은 pellet만을 affinity 크로마토그래피 정제에 이용하였다.

His_ferritin 의 경우, 상층액을 Ni-NTA bead 와 binding 시킨 후 Ni-NTA 컬럼에 단백질을 로딩하였으며, wash 버퍼(20mM Tris, 500mM NaCl, 20mM imidazole)를 흘려준 후 elution 버퍼（50mM Tris, 100mM NaCl, 200mM Histidine)로 bead에 붙어있는 단백질을 용출시킨 후 SDS 전기영동(15% acrylamide gel) 을 통하여 확인하였다.

His_AP1_ferritin 의 경우, 원심분리 후 가라앉은 pellet을 8M urea가 들어간 binding 버퍼（20mM Tris, 500mM NaCl, 5mM imidazole)로 용해한 후, 8M urea를 추가한 wash, elution 버퍼를 이용하여 동일한 과정으로 정제하였다. 추후 8M urea를 제거하기 위하여 dialysis를 진행하였고, 15% acrylamide gel 에 단백질 전기영동을 시행하였다.

그 결과 두 단백질 모두 약 23kDa의 크기로 정제된 것을 SDS-PAGE에서 확인할 수 있었다(도 2).

< 실시예 2>

AP1 펩타이드 삽입 ferritin의 Cage 형성 테스트

<2-1> 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography)를 이용한 ferritin 단백질 형성 테스트

His_ferritin 과 His_AP1_ferritin 단백질이 24mer를 잘 형성하는지 여부를 확인하기 위하여 젤 퍼미에이션 액체크로마토그래피(GPC) 를 시행하였다.

GPC는 Superdex 200 10/300 GL column (GE Healthcare)을 이용하였고, injection volume은 50ul 였으며 버퍼는 50 mM Tris-HCl(8.0), 100 mM NaCl, 2000 mM Histidine을 사용하였다. wild-type ferritin (분자량 440KD), BSA (분자량 67KD), ovalbumin(45KD), Chymotrypsin A (25KD), Ribonuclease A (13KD)을 사용하여 standard curve를 만들었고, His_ferritin 과 His_AP1_ferritin을 standard curve 에 비교하여 24mer 형성여부를 확인하였다.

그 결과, wild-type ferritin 과 His_ferritin 과 His_AP1_ferritin의 크기가 유사함을 볼 수 있어, 24mer 가 잘 이루어질 것으로 추측할 수 있었다(도 3).

<2-2> 생물 투과 전자현미경

His_ferritin 과 His_AP1_ferritin 단백질이 cage를 잘 형성하는지 확인하기 위하여 생물 투과전자현미경을 찍었다. 각 sample의 농도는 0.1 mg/ml로 만들어 기초과학지원연구원(KBSI)에 의뢰해 사진을 찍었다, sample은 uranyl acetate로 negative staining을 하고, FEI제조사의 tecnai기계로 시행되었다.

그 결과 His_ferritin 과 His_AP1_ferritin, 두 그룹 모두 24mer cage를 잘 형성하는 것을 확인하였으며, 동일한 농도에서 비슷한 비율로 cage를 이루고 있음을 추가로 확인할 수 있었다(도 4).

< 실시예 3>

세포 결합 테스트

<3-1> FACS 를 이용한 세포 결합 테스트

AP1 peptide를 삽입한 His_AP1_ferritin이 IL-4 receptor에 binding하는지 확인하기 위하여, IL-4 receptor가 많이 발현하고 있는 A549 cell(human lung cancer), Hela cell(Human cervical cancer), 4T1 cell(mouse mammary cancer)을 이용하였다. 먼저 cell을 100파이 플레이트에 confulence가 80%정도 될 때까지 키운다. 플레이트에 부착된 cell을 PBS로 두 번 washing하고, Trypsin/EDTA로 cell을 떼어낸 후, 2x10⁵/100ul cell을 1% bovine serum albumin(BSA)가 포함된 PBS에서 incubation(4℃, 30분) 하였다. A549 cell 에 대해서는 추가적으로 blocking 실험을 진행하였다. human IL-4 Rα antibody (MAB230)를 1% BSA가 포함된 PBS에 1:1000으로 희석하여 incubation(4℃, 1시간)하며 cell의 IL-4 receptor를 blocking하였다. PBS로 두 번 wash한 후 His_ferritin 과 His_AP1_ferritin을 10uM의 농도로 50mM Tris, 100mM NaCl, 2000mM Histidine 버퍼에 희석한 후 binding(4℃, 20분)시켰다. PBS로 두 번 wash한 후 ferritin light chain antibody (D-18,sc-14420)을 1:400의 비율로 1% BSA가 포함된 PBS 버퍼에 희석하여 incubation(4℃, 30분)하였다. PBS로 두 번 wash한 후 Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG(H+L) antibody를 1:200의 비율로 1% BSA가 포함된 PBS 버퍼에 희석하여 incubation(4℃, 30분)하였다. PBS로 두 번 wash한 후 500ul PBS에 cell을 suspention한 후 FACS를 시행하였다.

그 결과 특히, A549 cell과 HeLa cell에서, IL4 Receptor blocking Ab를 preincubation 시킨 후 binding을 시도하였을 때 그 정도가 감소하는 것을 확인함으로써, cell 과 His_AP1_ferritin의 binding 이 IL4 receptor 에 dependent 하다는 것을 확인하였다(도 5).

<3-2> 공초점 현미경( confocal microscope )을 이용한 세포 결합 테스트

His_AP1_ferritin이 Hela cell에 발현하고 있는 IL-4 receptor를 cell에 잘 binding 하는지를 confocal 현미경을 통해 확인하고자 본 실험을 시행하였다.

8 well slide chamber에 1x10⁴/200ul을 seeding하고 overnight으로 키워서 chamber에 잘 부착되도록 한다. PBS로 두 번 wash한 후 His_ferritin과 His_AP1_ferritin을 10uM의 농도로 20mM Tris, 150mM NaCl, 180mM Histidine 버퍼에 희석한 후 37℃에서 1시간 incubation하였다. PBS로 두 번 wash한 후 차갑게 보관된 Methanol을 넣고 20℃에서 20분동안 incubation하여 cell membrane을 permeable하게 만든다. PBS로 두 번 wash한 후 1%가 BSA가 포함된 PBS를 넣고 상온에서 30분동안 blocking하였다. PBS로 두 번 wash한 후 anti His-probe (H-15) Alexa Fluor 647 antibody를 1:40의 비율로 PBS에 희석하여 4℃에서 overnight으로 incubation하였다. PBS로 두 번 wash한 후 어두운 곳에서 DAPI를 3분동안 incubation하여 cell을 염색하고, antifade reagent로 mounting하여 cover glass를 덮고 confocal microscopy를 찍었다. 4T1 cell 도 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.

그 결과 His_AP1_ferritin이 cell surface를 위주로 하여 green signal이 띄어져 있음을 확인하여, His_ferritin 에 비해 더 잘 binding 하고 있음을 알 수 있었다(도 6).

< 실시예 4>

수용체매개 엔도싸이토시스( receptor mediated endocytosis )

His_AP1_ferritin이 Hela cell에 발현하고 있는 IL-4 receptor를 통해 cell 안으로 uptake가 잘 되는지를 확인하고자 본 실험을 시행하였다.

먼저 8 well slide chamber에 1x10⁴/200ul을 seeding하고 overnight으로 키워서 chamber에 잘 부착되도록 한다. PBS로 두 번 wash한 후 His_ferritin과 His_AP1_ferritin을 10uM의 농도로 20mM Tris, 150mM NaCl, 180mM Histidine 버퍼에 희석한 후 37℃에서 1시간 incubation하였다. PBS로 두 번 wash한 후 차갑게 보관된 Methanol을 넣고 20℃에서 20분동안 incubation하여 cell membrane을 permeable하게 만든다. PBS로 두 번 wash한 후 1%가 BSA가 포함된 PBS를 넣고 상온에서 30분동안 blocking하였다. PBS로 두 번 wash한 후 anti His-probe (H-15) Alexa Fluor 647 antibody를 1:40의 비율로 PBS에 희석하여 4℃에서 overnight으로 incubation하였다. PBS로 두 번 wash한 후 어두운 곳에서 DAPI를 3분동안 incubation하여 cell을 염색하고, antifade reagent로 mounting하여 cover glass를 덮고 confocal microscopy를 찍었다. 4T1 cell 도 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 또한 cytoplasm 내에 uptake를 확인하기 위하여 confocal microscopy를 이용하여 Z-stack을 통하여 관찰하였다. cell이 plate 바닥에 붙어있긴 하지만, 입체적인 모양을 띄고 있기 때문에, Z-stack을 통하여 관찰하지 않으면, ferritin 이 cell surface 에 붙은 것인지, uptake 된 것인지 구분하기 어렵기 때문에 Z-stack을 cell 의 가장 낮은 부위부터 높은 부위까지 연속적으로 관찰하였다.

그 결과, His_AP1_ferritin의 경우, Hela cell, 4T1 두 cell에서 모두 cell surface binding이 증가하였지만, Z-stack을 같이 살펴본 결과 cytoplasm 내에 uptake 또한 잘 일어남을 확인하였다(도 7).

< 실시예 5>

활성 폴리펩티드의 결합력 분석

<5-1> 표면 플라스몬 공명( SPR : Surface plasmon resonance ) 분석

SPR 실험시 시료의 반응을 두가지 channel에서 동시에 실험하여 left channel에는 반응시키고자하는 단백질 (IL-4 receptor)을 coating하고 right channel에는 그의 대조군을 coating하거나 혹은 coating 하지 않으며 대조군surface를 substract 한 값을 측정함으로서 비특이적인 반응성을 제외할 수 있다. 본 실험에서는 다른 단백질을 coating 하지는 않고 ethanolamine으로 activated 된 surface를 blocking 한 비어있는 상태를 대조 channel로 사용하였다. carboxymethyl dextran chip에 left channel은 0.7mg/ml농도의 IL-4 receptor 단백질 50ul에 200mM NaOAC pH 4.0용액을 50ul넣어서 섞어준 다음 25ul/min의 속도로 7분동안 흘려주어서 코팅하고, right channel은 미 반응된 표면을 비특이적 흡착을 줄이기 위해 1M ethanol amine pH8.5용액으로 25ul/min의 속도로 7분동안 흘려서 blocking하였다. 모든 실험은 25℃의 온도에서 진행하였고, 흐름속도는 25ul/min으로 하였다. 버퍼는 20mM Tris-HCl pH8.0, 150mM NaCl, 180mM Histidine을 filtering, degasing을 하여 사용하였고, His_ferritin과 His_AP1_ferritin을 각각 0.651 nM, 2.604 nM, 5.208 nM, 10.416 nM, 20.833 nM, 41.666 nM의 농도로 3분 동안 흘려주고, 모든 과정동안 2M NaCl을 20ul씩 흘려서 binding한 단백질을 씻어주는 regeneration을 하였다. His_AP1_ferritin이 IL-4 receptor 와 특이적으로 결합함으로서 Surface plasmon resonance의 변화를 일으키며 나타내는 각도의 변화를 resonance unit (RU)로 환산하여 각 농도당의 변화 그래프 (sensorgram)를 얻었다. 각 농도에서 나타난 left channel 값에서 right channel 값을 빼서 특이적인 binding 값을 graph로 나타내었다. Saturation된 RU와 단백질 농도를 KaleidaGraph에서 plotting한 후 simple bimolecular model을 적용하여 동적 결합상수를 (Kd)를 계산 하였다. 세 번 실험의 평균과 편차를 표시하였다.

그 결과, His_ferritin 의 경우 IL4 receptor 에 binding 하지 않았고 His_AP1_ferritin의 경우 (3.68±1.3)×10^-9M 의 강한 binding affinity를 가짐을 확인하였다(도 8).

< 실시예 6>

동물 종양 모델에서의 안정성 분석

<6-1> 마우스의 체중 및 종양의 크기 변화 분석

balb/c nude mouse 의 flank site 에 HeLa 세포(1*10⁷/PBS 150ul) 를 피하주입하고, 종양의 부피가 100mm³ 정도까지 자라기를 4주 정도 기다린다. 마우스를 두 그룹으로 나누어 한 그룹은 아무런 처치를 하지 않고, 다른 한 그룹에만 His_AP1_ferritin (2mg/kg) 을 꼬리 정맥을 통하여 이틀에 한번씩 정맥 주사한다. 정맥 주사한 폴리펩티드에 의한 안정성을 확인하기 위하여, 15일 동안 마우스의 체중변화와 종양의 부피변화를 관찰하였고, 두 그룹간의 결과를 비교, 분석하였다(도 9).

그 결과 [도 9]에서 보는 바와 같이, 두 그룹 간 체중 및 종양의 성장은 차이가 없는 것으로 확인되었다.

< 실시예 7>

동물 종양 모델에서의 종양 표적성 분석

<7-1> 폴리펩티드의 종양 표적성 확인

balb/c nude mouse 의 flank site 에 HeLa 세포(1*10⁷/PBS 150ul) 를 피하주입하고, 종양의 부피가 200mm³ 정도까지 자라기를 5주 정도 기다린다. 마우스를 두 그룹으로 나누어, 한 그룹에는 His_ferritin 폴리펩티드를, 다른 한 그룹에는 His_AP1_ferritin 폴리펩티드(2mg/kg)를 꼬리 정맥을 통하여 정맥 주사하였다. 정맥주사 2시간 후 마우스를 마취하여 종양을 떼어내고, 마우스는 사체처리를 시행하였다. 떼어낸 종양은 PBS buffer에서 washing을 시행하고, 4% paraformaldehyde에서 12시간 경과 후 OCT compound를 이용하여 cryo-block을 만들었다. cryotome 기기를 이용하여 8um의 두께로 동결절편을 시행한 후 면역염색을 시도하였다. His-Tag (HHHHHH)에 대한 Ab (mouse anti-His Tag Ab-FITC, ab77825, abcam)를 이용하여 폴리펩타이드와 결합 반응을 시켰고, Ab에 결합되어 있는 FITC를 confocal microscopy를 통하여 관찰하였다.

그 결과 [도 10] (a) 에서 보는 바와 같이, His_ferritin을 주사한 군의 경우 종양조직에서 His-ferritin을 관찰할 수 없었으나, His_AP1_ferritin을 주사한 군의 경우 종양조직에서 His-AP1_ferritin 이 많이 남아있음을 FITC signal을 통해 관찰할 수 있었다. 따라서 본 발명 융합폴리펩티드가 종양 표적성을 가짐을 확인하였다.

<7-2> IL -4 수용체에 의한 종양 표적성 확인

His_AP1_ferritin 폴리펩티드의 종양 표적성이 종양 세포의 IL-4 수용체에 의한 것인지를 확인하기 위하여 추가 실험을 진행하였다. HeLa 세포 종양 조직을 동일한 방법으로 동결절편을 시행한 후 면역염색을 시도하였다. His_AP1_ferritin 폴리펩티드는 His-Tag Ab ( mouse anti-His Tag Ab-FITC, ab77825, abcam )를 이용하고, 종양세포의 IL-4 receptor는 IL-4R Ab (rabbit polyclonal Ab to IL4R, ab61099, abcam; goat anti-rabbit Ig-G TR, sc-2780, santacruz)를 이용하여 면역염색을 시도하였다. 면역 염색된 슬라이드를 confocal microscpy를 이용하여 형광관찰 후 비교, 분석하였다.

그 결과 [도 10] (b)에서 보는 바와 같이, 종양 조직에 존재하는 His_AP1_ferritin 폴리펩티드 (green signal) 는 종양 세포의 IL-4 receptor (red signal) 와 그 위치가 일치함을 확인하였다. 이를 통해 IL-4 receptor를 발현하는 종양 동물실험에서도, His_AP1_ferritin 폴리펩티드가 IL-4 receptor 에 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

<7-3> 종양 표적성을 24시간까지 실시간으로 확인

His_AP1_ferritin 폴리펩티드의 종양 표적성 및 bio-distribution을 확인하기 위하여 소동물 이미징 장비인 IVIS spectrum을 이용한 관찰을 계획하였다. His_AP1_ferritin 폴리펩티드를 형광염료 (FNR 566)와 화학적 방법을 통하여 conjugation 시켰다. 이후 투석을 통하여 conjugation 되지 않은 형광 염료를 분리해 내고, 남은 합성물질에 대해 protein 정량을 시행 후 사용하였다. 호흡마취제인 Isoflurane을 이용하여 HeLa cell 종양을 가진 마우스를 마취하고, 꼬리정맥을 통하여 His_AP1_ferritin-FNR566 합성 폴리펩티드(2mg/kg)를 꼬리정맥에 주사하였다. 주사전에 IVIS spectrum 을 이용하여 형광 이미지를 획득하였고, 주사 2시간 후부터 24시간까지 마우스 전체의 이미지를 획득하여, His_AP1_ferritin 폴리펩티드의 bio-distribution 및 종양표적성을 실시간으로 확인하였다.

그 결과 [도 11]에서 보는 바와 같이, 24시간까지 종양부위에서 형광염료가 detection되는 것을 확인하였다. 이로서, 본 발명의 융합폴리펩티드는 체내에서 안정적으로 장시간 활성을 유지하는 것을 확인하였다.

본 발명은 인간 페리틴 유래 융합폴리펩티드에 관한 것으로 더욱 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 단편 및 서열번호 6으로 표시되는 인간 유래 페리틴 모노머가 순차적으로 연결된 융합폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 융합폴리펩티드는 단백질 케이지를 형성하여 내부에 유효물질의 봉입이 가능하며, 폴리펩티드 단편의 특정 분자, 세포 또는 조직과의 결합력을 매우 향상시켜 암 및 동맥경화의 진단제 및 치료제 개발에 효과적이어서 산업상 이용가능성이 높다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Fusion polypeptide derived form human ferritin <130> NP13-0113 <150> KR 2012/0155222 <151> 2012-12-27 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AP1 <400> 1 Arg Lys Arg Leu Asp Arg Asn 1 5 <210> 2 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1_AP1_ferritin_F <400> 2 gatccatatg catcatcacc accatcacgg cagccgaaaa cggctcgaca ggaacggcag 60 catgagctcc cagattcgtc a 81 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1_AP1_ferritin_R <400> 3 gatcctcgag ttagtcgtgc ttgagagtga gcc 33 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WT_ferritin_F <400> 4 gatccatatg catcatcacc accatcacgg cagcatgagc tcccagattc gtca 54 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WT_ferritin_R <400> 5 gatcctcgag ttagtcgtgc ttgagagtga gcc 33 <210> 6 <211> 175 <212> PRT <213> Human ferritin light chain <400> 6 Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala 1 5 10 15 Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu 20 25 30 Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln 65 70 75 80 Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala 85 90 95 Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu 100 105 110 Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp 115 120 125 Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys 130 135 140 Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala 145 150 155 160 Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp 165 170 175 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His_AP1_ferritin <400> 7 catcatcacc accatcacgg cagccgaaaa cggctcgaca ggaacggcag c 51 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His_ferritin <400> 8 catcatcacc accatcacgg cagc 24

Claims (12)

1. 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 단편 및 서열번호 6으로 표시되는 인간 유래 페리틴 모노머가 순차적으로 연결된 융합폴리펩티드.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 융합폴리펩티드는 히스티딘이 1 내지 10개가 반복된 히스티딘 반복 태그(tag)가 서열번호1의 폴리펩티드 단편 앞에 연결되는 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
   
3. 제1항의 융합폴리펩티드를 포함하는 페리틴 단백질.
   
4. 제1항의 융합폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
   
5. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
   
6. 제5항의 발현벡터로 형질 전환된 형질전환체.
   
7. 제1항의 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지.
   
8. 제1항의 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 조성물.
   
9. 제1항의 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 키트.
   
10. 제1항의 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 나노입자.
    
11. 제10항의 단백질 나노입자를 포함하는 단백질 칩.
    
12. 제1항의 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 예방 또는 치료용 조성물.

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