KR20220120910A - Egfr-gst-울리서티닙 복합체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

글루타치온―Ｓ―전이효소 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이의 약물 전달체 및 약학적 조성물로서의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 융합 단백질 및 그를 포함하는 약물 전달체에 의하면, 생체 내 잔존 시간을 지속시킬 수 있을 뿐 아니라, 표적 세포로의 표적능이 향상되어 타겟으로 하는 세포로 효과적으로 전달될 수 있으므로, 표적 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

EGFR-GST-울리서티닙 복합체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{EGFR-GST-Ulixertinib complex, and pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the same}
글루타치온―Ｓ―전이효소 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이의 약물 전달체 및 약학적 조성물로서의 용도에 관한 것이다.
나노파티클은 생물학적 분포능이 우수하며 약물 방출 정도를 조절할 수 있어 영상화 장비나 표적 치료제 등의 분야에서 유용한 도구로 사용되고 있다. 통상적으로 나노파티클은 200 ㎚의 직경을 가질 때 종양 주위의 혈관 근처로 유출될 수 있으며, 종양 주위에서는 림프관이 형성되지 않아 압력이 낮기 때문에 유출된 나노파티클이 종양 조직 내에 계속 잔존할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 과정은 EPR 효과(enhanced permeability and retention effect)라 하며, 이를 통해 약물 전달체의 투과성 및 잔존성이 개선될 수 있다.
현재 상업적으로 사용되는 나노파티클로서, Abraxane 및 Doxil을 대표적인 예로 들 수 있다. 그러나, 이들은 종양마다 혈관의 투과성이 각기 다양하며, 나노파티클을 정맥투여하였을 때 단핵식세포계(mononuclear phagocyte system, MPS)가 이를 제거하기 위해 간과 비장과 같은 세망내피계 조직(reticuloendothelial organ)에 빠르게 축적된다는 제한점을 가질 수 있다. 이로 인해, 나노파티클을 적용하는 표적 치료제는 치료 효과가 저감될 수 있으며, 나노파티클의 독성으로 인해 부작용을 나타낼 수 있다.
이러한 단점을 극복하기 위해서, 폴리에틸렌 글리콜화(poly(ethylene glycol) ylation, PEGylation)하여 나노파티클을 둘러싸는 방법이 개발되었다. 이러한 방법을 사용하였을 때, 생체 내 순환기에서 나노파티클이 순환될 수 있는 시간이 길어질 수 있다는 장점이 있으나, 반대로 표적 세포 내로 유임될 수 있는 가능성이 감소하고 비-특이적인 결합을 통해 표적 세포 이외의 세포를 표적할 수 있어 이 또한 치료 효율이 낮아질 수 있다.
나노파티클을 약물전달체로 사용함에 있어서, 약물 전달을 위한 표적능과 함께 EPR 효과를 증진시키기 위해, 나노파티클의 구조적인 변화를 유도하고자 하는 전략이 제시되고 있다. 구체적으로, 나노파티클의 표면에 암세포에서 과발현되는 수용체와 결합할 수 있는 항체, 단백질 또는 펩티드로 코팅하는 등의 구조적 변화를 유도하여 약물전달체의 표적능을 향상시키고자 하는 시도가 계속되었다. 그러나, 이러한 방법을 통해서도 종양 표적 효율이 효과적으로 증가되지 않고, 오히려 MPS를 통한 체내 면역 반응을 통해 나노파티클이 보다 빠르게 제거될 수 있는 타겟 리간드를 제공하게 되어, 전체적인 종양 치료 효과 면에서 유의적인 치료 효과를 나타내지는 못한다는 한계가 있다.
이론적으로는, 생리적 환경에 노출되었을 때, 엔트로피에 따르는 물분자의 배치, 파티클 표면의 전하의 보정(charge compensation)이나 소수성 부분이 노출되는 점 등이 복합적으로 작용하여 표면 에너지를 낮추는 방향으로 나노파티클의 표면은 자연적으로 다른 생물분자에 의해 둘러싸이게 된다. 이 때, 나노파티클의 표면의 표면에 다양한 생물분자들이 비-특이적으로 흡착되는데, 이러한 형태를 단백질 코로나(protein corona)라고 한다. 단백질 코로나는 다른 분자들에 둘러싸여 본연의 분자적 특징이 변화하고, 표적 세포 또는 기관으로의 표적능과 나노파티클이 나타내는 다양한 생물학적 기능이 차단된다. 때문에, 나노파티클을 표적 치료제로서 임상 수준에서 적용할 수 있도록 단백질 코로나를 조절하고자 하는 연구가 계속 진행되고 있다.
따라서, 나노파티클을 기반으로 하는 표적 치료제를 제조하는 과정에서, 나노파티클의 표면에 단백질 코로나를 먼저 형성하여 이를 조절하는 방법이 개발되었다. 이를 위해, 단백질 코로나에 의해 표적능이 차단되는 것을 피하기 위해서, 나노파티클의 표면을 쌍성 이온(zwitterionic), PEG 및 탄수화물 잔기 등으로 변경하여 혈청 내 단백질과의 상호작용을 최소화하고자 하는 방법이 공지된 바 있다. 이 외에도, 나노파티클을 dysopsonic 단백질로 전코팅하여 혈장 내의 원하는 단백질의 순환을 통해 단백질 코로나를 조절할 수 있다. 이에 따라, 단백질 코로나로 전코팅된 나노파티클은 콜로이드 상태의 안정성이 증가되어 MPS에 의해 제거되지 않고 혈액 내에서 순환 시간을 지속할 수 있는 효과를 가진다. 그러나, 이러한 방법을 통하여도 표적으로의 타겟능이 제한될 수 있고, 전코팅에 사용되는 단백질과 나노파티클 간의 생물학적 상호작용을 통한 생물화학적인 작용이 알려지지 않았다는 점에서 임상으로의 적용에서 제한을 가진다.
Monopoli, M. P., Aberg, C., Salvati, A. & Dawson, K. A. Nat Nanotechnol 7, 779-786, doi:10.1038/nnano.2012.207 (2012).
일 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 분자; EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 결합능을 갖는 애피바디(affibody) 또는 다이아바디(diabody) 분자; 상기 글루타치온-S-전이효소와 상기 애피바디 또는 다이아바디를 연결하고, 프로테아제가 결합하지 않는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 GSH(Glutathione) 분자에 의해 결합된 울리서티닙(Ulixertinib) 분자를 함유하는 약물 전달체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 분자; EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 결합능을 갖는 애피바디(affibody) 또는 다이아바디(diabody) 분자; 상기 글루타치온-S-전이효소와 상기 애피바디 또는 다이아바디를 연결하고, 프로테아제가 결합하지 않는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 GSH(Glutathione) 분자에 의해 결합된 울리서티닙(Ulixertinib) 분자를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 분자; EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 결합능을 갖는 애피바디(affibody) 또는 다이아바디(diabody) 분자; 상기 글루타치온-S-전이효소와 상기 애피바디 또는 다이아바디를 연결하고, 프로테아제가 결합하지 않는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 GSH(Glutathione) 분자에 의해 결합된 울리서티닙(Ulixertinib) 분자를 함유하는 약물전달체를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 약물을 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 분자; EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 결합능을 갖는 애피바디(affibody) 또는 다이아바디(diabody) 분자; 상기 글루타치온-S-전이효소와 상기 애피바디 또는 다이아바디를 연결하고, 프로테아제가 결합하지 않는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 GSH(Glutathione) 분자에 의해 결합된 울리서티닙(Ulixertinib) 분자를 함유하는 약물전달체를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 분자; EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 결합능을 갖는 애피바디(affibody) 또는 다이아바디(diabody) 분자; 상기 글루타치온-S-전이효소와 상기 애피바디 또는 다이아바디를 연결하고, 프로테아제가 결합하지 않는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 GSH(Glutathione) 분자에 의해 결합된 울리서티닙(Ulixertinib) 분자를 함유하는 약물 전달체를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "애피바디 분자(affibody molecule)"는 특정 타겟 단백질(수용체)에 결합할 수 있는, 항체 모사체를 의미할 수 있다. 일반적으로 애피바디 분자는 20 내지 150의 아미노산 잔기로 구성되며, 2 내지 10개의 알파 헬릭스로 구성된 것일 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 애피바디 분자는 항-ErbB 애피바디 분자(ab31889), HER2-특이적 애피바디 분자(ZHER2:342), 항-EFFR 애피바디 분자(ZEGFR:2377) 등을 포함할 수 있다. 또한, 이에 한정되지 않고, 세포의 특정 수용체 또는 표적 단백질을 인식할 수 있는 애피바디 분자를 모두 포함한다. 상기 애피바디 분자가 인식할 수 있는 표적 수용체 또는 표적 단백질의 예는, 아밀로이드 베타 펩티드, 시누클레인(예를 들면, 알파-시누클레인), 아포리포프로테인(예를 들면, 아포리포프로테인 A1), 보체 인자(Complement factor)(예를 들면, C5), 탄산무수화효소(Carbonic anhydrase)(예를 들면, CAIX), 인터루킨-2 수용체 알파 사슬(IL2RA; CD25), 세포 표면의 CD 항원(예를 들면, CD28), 또는 c-Jun, Factor VIII, 프비르노겐, GP120, H-Ras, Her2, Her3, HPV16 E7, IAPP(Human islet amyloid polypeptide), 이뮤노글로불린 A(IgA), IgE, IgM, 인터루킨(예를 들면, IL-1, IL-6, IL-8, IL-17), 인슐린, 스타필로코커스 단백질 A 도메인(Staphylococcal protein A domain), Raf-1, LOV 도메인(Light-oxygen-voltage-sensing domain), 또는 RSV G 단백질일 수 있다. 상기 애피바디에 대한 정보는 Stefan Stahl et al., Affibody Molecules in Biotechnological and Medical Applications, Trends in Biotechnology, August 2017, Vol 35, No 8에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본 명세서에서 포함된다.
일 구체예에 있어서, 상기 링커는, 1 내지 400개, 1 내지 200개, 또는 2 내지 200개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 또한 기능적 일부분 사이의 적절한 분리를 달성하기 위하여 또는 필수적인 내부-일부분(inter-moiety)의 상호작용을 유지하기 위한　링커의 최적화를 고려하여 카피 수 "n"을 조절할 수 있다. 해당 기술분야에서 다른 가요성　링커들이 알려져 있는데, 예를 들어 수용성을 향상시키기 위하여 극성 아미노산 잔기를 추가하는 것뿐만 아니라 유연성을 유지하기 위하여 T 및 A와 같은 아미노산 잔기를 추가한 G 및 S　링커가 있을 수 있다. 따라서 일 구체예에 있어서, 상기　링커는 G, S, 및/또는 T 잔기를 포함하는 유연성　링커일 수 있다. 상기　링커는 (GpSs)n 및 (SpGs)n으로부터 선택되는 일반식을 가질 수 있고, 이 경우, 독립적으로, p는 1 내지 10의 정수이고, s = 0 내지 10의 0 또는 정수이고, p + s는 20 이하의 정수이고, 및 n은 1 내지 20의 정수이다. 더욱 구체적으로 링커의 예는 (GGGGS)n (서열번호 2), (SGGGG)n　(서열번호 3), (SRSSG)n (서열번호 4), (SGSSC)n (서열번호 5), (GKSSGSGSESKS)n (서열번호 6), (RPPPPC)n (서열번호 7), (SSPPPPC)n (서열번호 8),　 (GSTSGSGKSSEGKG)n (서열번호 9), (GSTSGSGKSSEGSGSTKG)n (서열번호 10),　(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)n　(서열번호 11), 또는 (EGKSSGSGSESKEF)n (서열번호 12)이고, 상기 n은 1 내지 20, 또는 1 내지 10의 정수이다.
또 다른 양상은 상기 GST 분자와 HER2에 결합능을 갖는 애피바디 또는 다이아바디 분자가 결합된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 자연의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 그의 유사체(analogue)도 포함한다. 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단쇄 폴리뉴클레오티드이다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 실시예에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 벡터를 함유 하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우, 복제 기원을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 배시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 벡터는 동물세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터를 포함한다. 일 실시예에 따라 적합한 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, U6 프로모터 및 H1 프로모터, MLV(Murine Leukemia Virus) LTR(Long terminal repeat) 프로모터, 아데노바이러스 초기 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터 및 설바이빈 (Survivin) 프로모터를 포함할 수 있다.
또한, 상기 벡터에서, 전술한 융합 단백질은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
또 다른 양상은 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다.
상기 세포, 예를 들면, 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 원생동물 (protozoa), 식물, 고등 식물 및 곤충, 또는 양서류의 세포, 또는 CHO, HeLa, HEK293, 및 COS-1과 같은 포유 동물의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는, 배양된 세포 (인 비트로), 이식된 세포 (graft cell) 및 일차 세포 배양 (인 비트로 및 엑스 비보(ex vivo)), 및 인 비보 (in vivo) 세포, 및 또한 인간을 포함하는 포유동물의 세포 (mammalian cell)일 수 있다. 또한, 상기 유기체는 효모, 곰팡이, 원생동물, 식물, 고등 식물 및 곤충, 양서류, 또는 포유 동물일 수 있다. 또한, 상기 세포는 동물 세포 또는 식물세포일 수 있다.
상기 글루타치온-S-전이효소와 울리서티닙의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것일 수 있다. 즉, 상기 울리서티닙은 GSH(Glutathione)가 결합된 울리서티닙일 수 있다. 상기 GSH는 글루타치온-S-전이효소의 결합 부위로 작용하여 울리서티닙과 글루타치온-S-전이효소를 연결할 수 있다.
약물 전달체를 사용하여 개체 내로 전달할 수 있는 약학적 활성 성분의 종류는 항암제, 조영제(염료), 호르몬제, 항호르몬제, 비타민제, 칼슘제, 무기질 제제, 당류제, 유기산 제제, 단백질 아미노산 제제, 해독제, 효소 제제, 대사성 제제, 당뇨 병용제, 조직 부활 용약, 클로로필 제제, 색소제제, 종양 용약, 종양 치료제, 방사성 의약품, 조직 세포 진단제, 조직 세포 치료제, 항생 물질 제제, 항바이러스제, 복합항생물질제제, 화학요법제, 백신, 독소, 톡소이드, 항독소, 렙토스피라혈청, 혈액 제제, 생물학적 제제, 진통제, 면역원성 분자, 항히스타민제, 알레르기 용약, 비특이성 면역원 제제, 마취제, 각성제, 정신 신경 용제, 저분자 화합물, 핵산, 앱타머, 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, siRNA 및 마이크로 RNA 등을 포함할 수 있다.
상기 울리서티닙은 항암제일 수 있으며 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 울리서티닙은 울리서티닙이 담지된 또는 울리서티닙을 담지할 수 있는 나노파티클일 수 있다. 나노파티클은 종래의 기술에 따라 약물 전달체로서 적용할 수 있는 나노파티클이라면 제한없이 적용될 수 있다. 구체적으로, 다공성 실리카 나노파티클(mesoporous silica nanoparticle, MSN), 골드 나노파티클(gold nanoparticle), 마그네틱 나노파티클(magnetic nanoparticle), 핵산-금속유기 금속체 나노파티클(Nucleic acid-Metal Organic Framework nanoparticle) 및 중합체 나노파티클(polymer nanoparticle)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 또한, 상기 나노파티클에 GSH(Glutathione)이 결합된 것일 수 있다. 이에 의해, 상기 나노파티클은 GST를 포함하는 융합 단백질과 결합할 수 있다.
다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 분자; EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 결합능을 갖는 애피바디(affibody) 또는 다이아바디(diabody) 분자; 상기 글루타치온-S-전이효소와 상기 애피바디 또는 다이아바디를 연결하고, 프로테아제가 결합하지 않는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 GSH(Glutathione) 분자에 의해 연결된 울리서티닙 분자를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 분자; EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 결합능을 갖는 애피바디(affibody) 또는 다이아바디(diabody) 분자; 상기 글루타치온-S-전이효소와 상기 애피바디 또는 다이아바디를 연결하고, 프로테아제가 결합하지 않는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 GSH(Glutathione) 분자에 의해 결합된 울리서티닙 분자를 함유하는 약물전달체를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 약물을 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 분자; EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 결합능을 갖는 애피바디(affibody) 또는 다이아바디(diabody) 분자; 상기 글루타치온-S-전이효소와 상기 애피바디 또는 다이아바디를 연결하고, 프로테아제가 결합하지 않는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 GSH(Glutathione) 분자에 의해 결합된 울리서티닙 분자를 함유하는 약물전달체를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 포유동물은 쥣과, 원숭이, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완동물을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 생체내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 엔티티(entity)의 조직, 세포 및 그들의 자손도 또한 포함된다.
용어 "치료제" 또는 "약학적 조성물"는, 대상체로의 투여 시에 몇몇 유리한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 유리한 효과는 진단적 결정을 가능하게 하는 것; 질병, 증상, 장애 또는 병태의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병태의 대응을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화하는" 또는 "개선하는"은 상호교환가능하게 사용된다. 이들 용어는 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하나 이들에 한정되지 않는 유리한 또는 요망되는 결과를 수득하는 방법을 지칭한다. 치료 이익은 치료 하의 하나 이상의 질병, 질환 또는 증상의 임의의 치료적으로 유의미한 개선 또는 그에 대한 효과를 의미한다. 예방 이익에 있어서, 조성물은 특정 질병, 질환 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 또는 질병, 질환 또는 증상이 아직 나타나지 않을지라도, 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유리한 또는 요망되는 결과를 야기하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료되는 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 용어는 본원에 기술된 영상화 방법 중 임의의 것에 의한 검출을 위한 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 작용제, 뒤따르는 투여 요법, 그것이 다른 화합물과 병용하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 영상화되는 조직 및 그것을 운반하는 신체 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
상기 암은 폐암(예를 들면, 비소세포성 폐암), 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 또는 자궁암일 수 있다. 또한, 상기 암은 항암제에 대한 내성(예를 들면, 다제 내성)을 갖는 위암, 유방암, 폐암, 간암, 식도암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(Nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(Carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 글루타치온(Glutathione)과 같은 항산화제(Antioxidants), 킬레이트화제(Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 유효용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.
또 다른 양상은 하기의 구성을 포함하는, 단백질 코로나 외층(protein corona shield)을 가지는 나노파티클(protein corona shield nanoparticle, PCSN)을 제공한다:
a) 약물을 담지할 수 있는 나노파티클; b) 나노파티클의 표면에 결합된, 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 포함 융합 단백질.
또한, 본 발명은 상기 나노파티클의 내부에 약물이 담지된, 단백질 코로나 외층을 가지는 나노파티클 약물 전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 i) 내지 iii) 단계를 포함하는, 단백질 코로나 외층을 가지는 나노파티클 약물 전달체의 제조 방법을 제공한다:
i) 나노파티클 표면에 링커(예를 들면, GSH)를 결합시키는 단계; ii) 상기 단계 i)에서 링커와 결합된 나노파티클의 내부 또는 표면에 약물을 담지시키는 단계; 및 iii) 상기 단계 ii)에서 약물을 담지한 나노파티클 표면에 GST 융합 단백질을 코팅하여 단백질 코로나 외층(PCS)을 형성시키는 단계.
상기 단백질 코로나 외층(protein corona shield)을 가지는 나노파티클은 융합 단백질로 표면이 전-코팅된 단백질 코로나 외층을 먼저 생성하였기 때문에 체내 환경에서 혈청 단백질에 의해 둘러싸이는 코로나층이 형성되지 않아, 대식 세포에 의한 면역 반응을 회피할 수 있어 스텔스 효과(stealth effect)를 유의적으로 가질 수 있다. 따라서, 상기 단백질 코로나 외층을 가지는 나노파티클(PCSN)은 생체 내 잔존 시간을 지속시킬 수 있을 뿐 아니라, 표적 세포로의 표적능이 향상되어 타겟으로 하는 세포로 효과적으로 전달될 수 있으므로, 표적 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 융합 단백질 및 그를 포함하는 약물 전달체에 의하면, 생체 내 잔존 시간을 지속시킬 수 있을 뿐 아니라, 표적 세포로의 표적능이 향상되어 타겟으로 하는 세포로 효과적으로 전달될 수 있으므로, 표적 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 단백질 코로나 외층을 가지는 나노파티클(protein corona shield nanoparticle, PCSN)을 제조하기 위한 과정을 나타낸다:
도 1a는 생체 내에서 약물 전달체가 표적 세포에 대하여 유의적인 약물 전달능을 나타내지 못하는 한계를 극복하기 위한, 본 발명의 PCSN 제조 전략을 나타내는 모식도이며; 및 도 1b는 GST-Afb 융합 단백질로 코로나 외층이 형성된 PCSN의 제조 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 정제한 융합 단백질의 분자량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 GSH-울리서티닙의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 PDS-울리서티닙의 NMR 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 GSH-울리서티닙의 NMR 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 EGFR-GST-울리서티닙 (EGFR-affibody-GST-GSH-울리서티닙) (KMD120)의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 7은 각 세포주의 EGFR 발현량을 나타낸 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 8은 각 세포주에서의 GSH-울리서티닙 및 울리서티닙의 세포 독성 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 각 세포주에서의 KMD120의 세포 독성 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 애피바디(affibody) 및 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 융합 단백질의 제조
본 발명에서는 약물 전달체로 사용하기 위한 나노파티클의 표면에 단백질 코로나의 외층을 형성시켜, 생체 내 환경에서도 안정성 및 표적능이 향상된 약물 전달체를 제조하고자 하였다. 이를 위해, 먼저 단백질 코로나 외층을 구성할 수 있는 융합 단백질(fusion protein)을 제조하였다. 융합 단백질은 암세포 표면의 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 애피바디(affibody, Afb)와 GST가 결합된 형태가 되도록 발현하였다.
구체적으로, 본 발명에서는 Afb로서 EGFR에 특이적으로 결합하는 EGFR Afb를 사용하였다. GST 단백질은 서열번호 13의 human GSTP1-1 (P09211)을 도입하였으며 GST의 C-terminal 말단에 링커 서열 SGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (서열번호 1)을 결합시킨 다음 서열번호 14의 EGFR-affibody (ZEGFR:2377)를 도입하였다. 서열번호 15의 EGFR-affibody-GST 융합단백질의 아미노산 서열을 기본으로 하여 대장균에서 발현을 유도하기 위한 codon optimization을 수행한 후 Invitrogen GeneArt 유전자 합성(ThermoFisher)을 통해 암호화된 유전자를 합성하고 (서열번호 16) 단백질 발현 플라스미드인 pET302NT-His에 삽입하였다.
상기 구축된 플라스미드를 E. Coli BL21(DE3) 균주에 삽입하여 배양하였다. 융합단백질은 배양액에 IPTG를 처리하여 발현을 유도하였으며 30℃에서 16 시간 동안 배양하고 세포를 원심분리하여 수득하였다. 수득한 배양세포를 50 mM PBS에 현탁한후 고압세포파쇄기를 이용해 세포를 파쇄하였다. 파쇄 후 원심분리하여 융합단백질을 포함한 상등액을 분리 회수한 다음 FPLC 장비를 사용하여 NI-NTA affinity chromatography로 EGFR-affibody-GST를 정제하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE 분석을 통해 단백질의 순도 및 분자량을 분석하였다.
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 GST-EGFR Afb를 발현하고 이의 분자량을 확인하였다.
실시예 2. Glutathione (GSH)이 융합된 저분자 화합물 약물 합성
GSH가 결합된 약물을 제조하였다. EGFR-affibody-GST 단백질을 이용하여 전달하고자 하는 저분자 화합물은 울리서티닙(Ulixertinib) (CAS No. 869886-67-9)을 사용하였다.
구체적으로, 울리서티닙에 GSH을 결합시키기 위하여 도 3에 나타낸 바와 같이, 울리서티닙(1eq)과 DMAP(1.5eq)을 0.025 M dry DCM에 녹인 후 10 분간 교반하고 PDS-NO2(1.5eq)을 첨가하여 실온에서 25 시간 반응시켜 PDS-울리서티닙을 제조하였다. 반응한 PDS-울리서티닙 혼합물은 dichloromethane:methanol=9:1의 혼합용매를 사용하여 실리카 컬럼으로 정제하였다. 제조된 PDS-울리서티닙의 NMR 분석결과를 도 4에 나타내었다.
상기 제조된 PDS-울리서티닙(1eq)를 MeOH(0.025 M)에 먼저 녹인 후 같은 양만큼 PBS를 첨가하고 MeOH에 녹인 GSH를 동일 용량 첨가하여 4℃에서 30분, 실온에서 24 시간 동안 반응시켜 GSH-울리서티닙을 제조하였다. 최종적으로 제조된 GSH-울리서티닙의 NMR 분석결과를 도 5에 나타내었다.
실시예 3. 표적지향형 약물전달체 EGFR-GST-울리서티닙 (EGFR-affibody-GST-GSH-울리서티닙)의 제작
도 6에 모식도로 나타낸 바와 같이 EGFR-affibody-GST와 약물 전구체인 GSH-울리서티닙을 결합시킨 표적지향형 약물전달체를 제조하기 위해, 50 uM EGFR-affibody-GST 단백질(PBS)을 상기 실시예 2에서 제조된 GSH-울리서티닙 100 uM (0.01% DMSO)에 천천히 첨가하면서 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS에서 투석(dialysis)하여 반응하지 않고 남아있는 GSH-울리서티닙을 제거하여 최종적으로 울리서티닙이 결합된 EGFR-GST-울리서티닙 (KMD120)을 제조하였다.
제조예 1. 실험 재료 및 실험 준비
<1-1> 실험 재료
실험에 사용된 세포주는 HCT-116(한국세포주은행, No 10247), A549(한국세포주은행, No 10185), MCF-7(한국세포주은행, No 30022), MDA-MB-453(한국세포주은행, No 30131)이고, 사용된 시약은 FBS(Fetal bovine serum, Hyclone), DMEM(Hyclone, No SH30243.01), Penicillin-Streptomycin(Gibco, No 15140122), Proteae/Phosphatase Inhibitor Cockail(Cell signaling, No 5872S), RIPA Lysis and Extraction Buffer(Thermo Scientific, No 89900), Nu-PAGE 4-12% Bis-Tris gel(Invitrogen, No NP0335BOX), cck-8(Dojindo, No CK04), anti-EGFR(Cell signaling, No 4267), anti-beta-actin(Cell signaling, No 4970), anti-rabbit IgG-HRP(Cell signaling, No 7074P2), PVDF membrane(Novex, No LC2002), ECL-select Western Blotting Detection Reagent(Cytiva, No RPN2235), Skim milk(Difco, No 232100)이다.
<1-2> 세포 배양
실험에 사용된 세포주는 인간 대장암 세포주인 HCT-116와 인간 폐암 세포주인 A549, 인간 유방암 세포주인 MCF-7, MDA-MB-453이다. 위 모두 한국세포주은행에서 구입하였다. 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 각 실험에 사용된 세포는 80%-90% 정도의 밀도로 자랐을 때 계대 배양하였다.
실험예 1. 각 세포에서의 EGFR 발현량 확인
상기 실시예 3에서 제조된 EGFR-GST-울리서티닙의 세포 독성을 확인하기 전에 먼저 각 세포주의 EGFR 발현량을 확인하였다.
구체적으로, 실험에 사용한 세포주의 EGFR 발현양을 western blot으로 확인하였다. 배양접시에 80%~90% 정도의 밀도로 자랐을 때, ice-cold PBS로 세포를 2회 세척하였다. Cell scraper로 세포를 떼어서 e-tube에 모은 후 Proteae/Phosphatase Inhibitor가 첨가된 RIPA 버퍼로 세포를 파쇄한 후 원심분리하여 cell lysate를 얻었다. BCA assay로 cell lysate 내의 전체 단백질의 농도를 확인하였다. Nu-PAGE 4-12% Bis-Tris gel에 각 well당 20 ug의 단백질을 loading하여 전개한 후 PVDF membrane에 transfer 하였다. 단백질이 transfer된 PVDF membrane을 5% Skim milk/PBST로 blocking 후, 1차 항체(anti-EGFR 또는 anti-beta actin)와 2차 항체(anti-rabbit IgG-HRP)를 결합시킨 후 HRP의 기질인 ECL-select Western Blotting Detection Reagent를 처리하여 시그널을 확인하였다.
그 결과, HCT-116과 A549는 EGFR을 다량 발현하고 있으며, MCF-7과 MDA-MB-453은 EGFR 발현양이 매우 낮음을 확인하였다(도 7).
실험예 2. EGFR-GST-울리서티닙 (KMD120)의 표적 세포에 대한 세포 독성 확인
EGFR-GST-울리서티닙 (KMD120)의 표적세포로의 약물 전달능을 확인하기 위해 표적 세포에 대한 세포 독성을 확인하였다.
구체적으로, 각각의 세포를 1% fetal bovine serum, 1% stereptomycin-peniciline을 첨가한 DMEM 배지에 현탁하여 96-well plate에 5Х103 cell/90 uL/well로 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. Blank well에는 배지만 100 uL를 분주하였다. KMD120과 EGFR affibody-GST는 PBS를 사용하여 최종 농도의 10배 농도로 준비하여 각 well에 10 uL씩 넣었다. 울리서티닙과 GSH-울리서티닙은 1% DMSO/DW를 사용하여 최종 농도의 10배 농도로 준비하여 각 well에 10 uL씩 넣었다. 대조군 well에는 희석 용액을 10 uL씩 넣었다. 처리 후 72시간 동안 추가 배양한 후, CCK-8 용액을 각 well에 10 μL씩 처리한 후 1시간 동안 배양하였다. CCK-8은 살아 있는 세포에 존재하는 dehydrogenase의 양에 비례하여 450 nm 파장에서 흡광도를 띄는 물질로 전환된다. Microplate reader (Multiskan SkyHigh Microplate Spectrophotometer, Thermo fisher scientific, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하여 하기 식으로 세포 생존률을 계산하였다. 모든 조건은 3well씩 반복 실험하였다.
세포 생존율(%) = 각 조건의 흡광도/대조군 평균 흡광도 X 100
KMD120은 GSH가 결합된 상태의 울리서티닙을 Prodrug로 사용하는데, 세포 내부(cytoplasm)에는 GSH 농도가 1~10 mM로 매우 고농도이다. 이런 고농도의 GSH에 의해 GSH-울리서티닙에서 GSH가 떨어져 나갈 것으로 예상하였고, KMD120이 치료제로서 작동되려면 GSH-울리서티닙이 세포 내부로 들어간 후 세포 내부의 환경에 의해 GSH가 떨어지고, GSH가 떨어지고 남은 울리서티닙이 세포 독성을 띄어야 한다.
먼저, GSH-울리서티닙과 울리서티닙을 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과, 4종의 세포주 모두에서 GSH-울리서티닙과 울리서티닙이 비슷한 세포 독성이 있음을 확인하였고, 울리서티닙의 세포독성은 KRAS에 돌연변이가 있는 HCT-116과 A549에서 강한 것을 확인하였다 (도 8). 이 결과로 보아 GSH-울리서티닙이 세포 내부에서 예상된대로 처리되었고, 독성 효과가 유지된다는 것을 확인하였다.
그 다음, KMD120을 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과, 세포 표면에 EGFR을 다량 발현하는 HCT-116과 A549에서는 세포 독성이 울리서티닙에 비해 높거나 유사 하였으나 EGFR 발현양이 매우 낮은 MCF-7과 MDA-MB-453에서는 울리서티닙에 비해 세포 독성이 약하였다(도 9). 이러한 결과로 볼 때, KMD120이 EGFR 발현양이 높은 세포에서만 울리서티닙을 세포 내부로 전달하여 세포 독성을 나타내는 경향을 확인하였다. 이를 통해, KMD120이 MAPK/ERK pathway에 돌연변이가 있으면서 EGFR 발현양이 높은 암에 특이적인 치료제로 사용할 수 있다는 가능성을 확인하였다.
<110> Fusion Biotechnology KMD Bio <120> HER2-GST-irinotecan complex, and pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the same <130> PN210277 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker domain <400> 1 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 1 <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 2 <400> 3 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 3 <400> 4 Ser Arg Ser Ser Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 4 <400> 5 Ser Gly Ser Ser Cys 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 5 <400> 6 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 6 <400> 7 Arg Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 7 <400> 8 Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 8 <400> 9 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 9 <400> 10 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 10 <400> 11 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 11 <400> 12 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe 1 5 10 <210> 13 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSTP1-1 <400> 13 Met Pro Pro Tyr Thr Val Val Tyr Phe Pro Val Arg Gly Arg Cys Ala 1 5 10 15 Ala Leu Arg Met Leu Leu Ala Asp Gln Gly Gln Ser Trp Lys Glu Glu 20 25 30 Val Val Thr Val Glu Thr Trp Gln Glu Gly Ser Leu Lys Ala Ser Cys 35 40 45 Leu Tyr Gly Gln Leu Pro Lys Phe Gln Asp Gly Asp Leu Thr Leu Tyr 50 55 60 Gln Ser Asn Thr Ile Leu Arg His Leu Gly Arg Thr Leu Gly Leu Tyr 65 70 75 80 Gly Lys Asp Gln Gln Glu Ala Ala Leu Val Asp Met Val Asn Asp Gly 85 90 95 Val Glu Asp Leu Arg Cys Lys Tyr Ile Ser Leu Ile Tyr Thr Asn Tyr 100 105 110 Glu Ala Gly Lys Asp Asp Tyr Val Lys Ala Leu Pro Gly Gln Leu Lys 115 120 125 Pro Phe Glu Thr Leu Leu Ser Gln Asn Gln Gly Gly Lys Thr Phe Ile 130 135 140 Val Gly Asp Gln Ile Ser Phe Ala Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Leu Leu 145 150 155 160 Leu Ile His Glu Val Leu Ala Pro Gly Cys Leu Asp Ala Phe Pro Leu 165 170 175 Leu Ser Ala Tyr Val Gly Arg Leu Ser Ala Arg Pro Lys Leu Lys Ala 180 185 190 Phe Leu Ala Ser Pro Glu Tyr Val Asn Leu Pro Ile Asn Gly Asn Gly 195 200 205 Lys Gln 210 <210> 14 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-affibody <400> 14 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Trp Ala Ala Trp Glu Glu Ile 1 5 10 15 Arg Asn Leu Pro Asn Leu Asn Gly Trp Gln Met Thr Ala Phe Ile Ala 20 25 30 Ser Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 15 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-affibody-GST <400> 15 Met Pro Pro Tyr Thr Val Val Tyr Phe Pro Val Arg Gly Arg Cys Ala 1 5 10 15 Ala Leu Arg Met Leu Leu Ala Asp Gln Gly Gln Ser Trp Lys Glu Glu 20 25 30 Val Val Thr Val Glu Thr Trp Gln Glu Gly Ser Leu Lys Ala Ser Cys 35 40 45 Leu Tyr Gly Gln Leu Pro Lys Phe Gln Asp Gly Asp Leu Thr Leu Tyr 50 55 60 Gln Ser Asn Thr Ile Leu Arg His Leu Gly Arg Thr Leu Gly Leu Tyr 65 70 75 80 Gly Lys Asp Gln Gln Glu Ala Ala Leu Val Asp Met Val Asn Asp Gly 85 90 95 Val Glu Asp Leu Arg Cys Lys Tyr Ile Ser Leu Ile Tyr Thr Asn Tyr 100 105 110 Glu Ala Gly Lys Asp Asp Tyr Val Lys Ala Leu Pro Gly Gln Leu Lys 115 120 125 Pro Phe Glu Thr Leu Leu Ser Gln Asn Gln Gly Gly Lys Thr Phe Ile 130 135 140 Val Gly Asp Gln Ile Ser Phe Ala Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Leu Leu 145 150 155 160 Leu Ile His Glu Val Leu Ala Pro Gly Cys Leu Asp Ala Phe Pro Leu 165 170 175 Leu Ser Ala Tyr Val Gly Arg Leu Ser Ala Arg Pro Lys Leu Lys Ala 180 185 190 Phe Leu Ala Ser Pro Glu Tyr Val Asn Leu Pro Ile Asn Gly Asn Gly 195 200 205 Lys Gln Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn 225 230 235 240 Lys Glu Met Trp Ala Ala Trp Glu Glu Ile Arg Asn Leu Pro Asn Leu 245 250 255 Asn Gly Trp Gln Met Thr Ala Phe Ile Ala Ser Leu Val Asp Asp Pro 260 265 270 Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 275 280 285 Gln Ala Pro Lys 290 <210> 16 <211> 876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence of EGFR-affibody-GST <400> 16 atgcctccgt ataccgttgt ttattttccg gttcgtggtc gttgtgcagc actgcgtatg 60 ctgctggcag atcagggtca gagctggaaa gaagaagttg ttaccgttga aacctggcaa 120 gaaggtagcc tgaaagcaag ctgtctgtat ggtcagctgc cgaaatttca ggatggtgat 180 ctgacactgt atcagagcaa taccattctg cgtcatctgg gtcgtaccct gggcctgtat 240 ggtaaagatc agcaagaagc agcactggtt gatatggtta atgatggtgt tgaagatctg 300 cgctgcaaat atatcagcct gatctatacc aattatgagg caggcaaaga tgattacgtt 360 aaagcactgc caggtcagct gaaaccgttt gaaaccctgc tgagccagaa tcaaggtggt 420 aaaaccttta ttgtgggtga tcagattagc ttcgcagatt ataacctgct ggatctgctg 480 ctgattcatg aagttctggc accgggttgt ctggatgcat ttccgctgct gagcgcctat 540 gttggtcgtc tgagcgcacg tccgaaactg aaagcatttc tggcaagtcc ggaatatgtt 600 aacctgccga ttaatggtaa tggtaaacag agcggtggtg gttcaggtgg tggtagcggt 660 ggcggtagtg gcggtggcag tggcggaggt tctggtggcg gtgttgataa caaatttaac 720 aaagaaatgc gcaacgccta ttgggaaatt gcactgctgc cgaatctgaa taatcagcag 780 aaacgtgcat ttatccgtag cctgtatgat gatccgagcc agagcgcaaa tctgctggcc 840 gaagcaaaaa aactgaatga tgcacaggca ccgaaa 876

Claims (6)

  1. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 분자;
    EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 결합능을 갖는 애피바디(affibody) 또는 다이아바디(diabody) 분자;
    상기 글루타치온-S-전이효소와 상기 애피바디 또는 다이아바디를 연결하고, 프로테아제가 결합하지 않는 링커; 및
    상기 글루타치온-S-전이효소와 GSH(Glutathione) 분자에 의해 결합된 울리서티닙(Ulixertinib) 분자를 함유하는 약물 전달체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 울리서티닙은 나노파티클에 담지된 것인 약물 전달체.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 나노파티클은 다공성 실리카 나노파티클(mesoporous silica nanoparticle, MSN), 골드 나노파티클(gold nanoparticle), 마그네틱 나노파티클(magnetic nanoparticle), 핵산-금속유기 금속체 나노파티클(Nucleic acid-Metal Organic Framework nanoparticle) 및 중합체 나노파티클(polymer nanoparticle)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 약물 전달체.
  4. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 분자;
    EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 결합능을 갖는 애피바디(affibody) 또는 다이아바디(diabody) 분자;
    상기 글루타치온-S-전이효소와 상기 애피바디 또는 다이아바디를 연결하고, 프로테아제가 결합하지 않는 링커; 및
    상기 글루타치온-S-전이효소와 GSH(Glutathione) 분자에 의해 연결된 울리서티닙(Ulixertinib) 분자를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 울리서티닙은 나노파티클에 담지된 것인 약학적 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 나노파티클은 다공성 실리카 나노파티클(mesoporous silica nanoparticle, MSN), 골드 나노파티클(gold nanoparticle), 마그네틱 나노파티클(magnetic nanoparticle), 핵산-금속유기 금속체 나노파티클(Nucleic acid-Metal Organic Framework nanoparticle) 및 중합체 나노파티클(polymer nanoparticle)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Monopoli, M. P., Aberg, C., Salvati, A. & Dawson, K. A. Nat Nanotechnol 7, 779-786, doi:10.1038/nnano.2012.207 (2012).

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