KR20230155895A - 글루타치온-s-전이효소 및 항체 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

글루타치온-s-전이효소 및 항체 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

글루타치온-S-전이효소 및 항체 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 이의 약물 전달체 및 약학적 조성물로서의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 융합 단백질 및 그를 포함하는 약물 전달체에 의하면, 생체 내 잔존 시간을 지속시킬 수 있을 뿐 아니라, 표적 세포로의 표적능이 향상되어 타겟으로 하는 세포로 효과적으로 전달될 수 있으므로, 표적 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

글루타치온-S-전이효소 및 항체 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도{Fusion protein comprising glutathione-S-tranferase and antibody binding domain and uses thereof}
글루타치온-S-전이효소 및 항체 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 이의 약물 전달체 및 약학적 조성물로서의 용도에 관한 것이다.
나노파티클은 생물학적 분포능이 우수하며 약물 방출 정도를 조절할 수 있어 영상화 장비나 표적 치료제 등의 분야에서 유용한 도구로 사용되고 있다. 통상적으로 나노파티클은 200 ㎚의 직경을 가질 때 종양 주위의 혈관 근처로 유출될 수 있으며, 종양 주위에서는 림프관이 형성되지 않아 압력이 낮기 때문에 유출된 나노파티클이 종양 조직 내에 계속 잔존할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 과정은 EPR 효과(enhanced permeability and retention effect)라 하며, 이를 통해 약물 전달체의 투과성 및 잔존성이 개선될 수 있다.
나노 단위의 약물 전달 시스템의 개발에서, 표적화 능력은 치료결과를 최대화하는데 가장 중요한 것으로 간주된다. 다양한 타켓팅 성분 중 항체는 두 개의 서로 다른 영역을 통해 좋은 타켓팅 능력이 장점이다. 즉, Y자형 두 팔(즉, 조각 항원 결함(Fab) 영역)은 특이성과 결합 친화성이 높은 표적을 인식하는 반면, 꼬리 영역(즉, 조각 결정성(Fc) 영역)은 약물 전달 시스템에 결합할 수 있다. 지금까지 항체 관련 표적화 방법은 대부분 약물 전달 시스템 표면에 항체를 화학적으로 고정하는 방법에 의존해 왔으나, 이는 항체를 손상시키고 무작위적 방향으로 결합할 위험이 높은 아주 복잡하고 어려운 합성 과정이 수반되는 것이 불가피하다.
최근 연구에서, 단백질이 나노파티클 표면에 방향적으로 배열(directionally arranged)되는 경우 외부 혈청 단백질(단백질 코로나)의 원치 않은 부착을 방지할 수 있다고 보고했다. 융합 태그 단백질인 HER2-결합성 애피바디는 글루타치온-S-전달효소(GST)와 유전적으로 결합되어있어 나노파티클의 글루타치온(GSH) 변형 표면과 연결된다. 글루타치온-S-전달효소는 특정 결합 부위를 통해 GSH와 결합되기 때문에, 애피바디-GST 단백질은 균일한 표면층을 형성할 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 표적 부위에서 바람직한 치료제로 혈청이 풍부한 생물학적 환경으로부터 입자를 보호하는 단백질 코로나 외층(protein corona shield) 역할을 할 수 있다. 이전 연구에서 더 나아가 본 연구는 자발적 비공유 생체 분자 상호작용을 통해 항체가 직접 연결될 수 있는 표적 약물 전달 시스템을 쉽고 더 효율적인 방법으로 탐구했다.
이 시스템의 기본구조로, 다공성 실리카 나노파티클(Mesoporous silica nanoparticles, MSNs)가 채택되었는데, 그 이유는 그들의 구형 외면이 다양한 기능성 분자로 쉽게 변형될 수 있고 내부 기공에 항암제가 탑재된 수 있기 때문이다. 다공성 실리카 나노파티클(Mesoporous silica nanoparticles, MSNs) 표면의 기능화를 위해, 선천적인 표면 결합 성질에 영향을 주지 않고 항체의 Fc 영역에 배타적으로 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에, 세균 단백질인 단백질 A(Protein A)로부터 유래된 Z 도메인이라고 불리는 항체 결합 도메인(Antibody-binding domain, ABD)을 글루타치온-S-전달효소와 함께 사용하였다. 지금까지 Z 도메인을 갖는 나노파티클은 거의 연구되지 않았으며, 보고된 대부분의 Z도메인과 관련된 표적화 연구는 공유결합으로 통합된 항체-단백질 샘플로 시험관내(in vitro)조건에서 제한적으로 수행되었다. 이는 아마 Z 도메인 결합 나노파티클에 대한 항체 상호 연결의 낮은 안정성에 대한 우려 때문인데, 이는 생체 내(in vivo) 시스템에 적용될 때 관련 없는 혈액 존재 항체에 의해 입자 표면에서 항체의 손쉬운 손실과 빈 결합 부위에 다른 물질이 경쟁적으로 결합할 수 있기 때문이다.
일 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질, 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질을 연결하는 링커를 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질, 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질을 연결하는 링커, 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 약물을 담지하는 입자가 결합된 것을 함유하는 약물 전달체를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질, 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질을 연결하는 링커, 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 항암제를 담지하는 입자가 결합된 것을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질, 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질을 연결하는 링커를 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질은 항체 또는 항체 유사체의 Fc 부위와 결합하는 것일 수 있다.
다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질, 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질을 연결하는 링커, 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 약물을 담지하는 입자가 결합된 것을 함유하는 약물 전달체를 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질은 항체 또는 항체 유사체의 Fc 부위와 결합하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 글루타치온-S-전이효소와 입자의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질과 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 비공유결합으로 연결되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 입자는 다공성 실리카 나노파티클(mesoporous silica nanoparticle, MSN), 골드 나노파티클(gold nanoparticle), 마그네틱 나노파티클(magnetic nanoparticle), 핵산-금속유기 금속체 나노파티클(Nucleic acid-Metal Organic Framework nanoparticle) 및 중합체 나노파티클(polymer nanoparticle)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 입자의 직경이 10 내지 250nm인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 입자에 항암제가 담지된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 약물 전달체의 표면전하가 -30 내지 -1mV인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약물 전달체는 2이상의 서로 다른 종류의 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 동시에 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약물 전달체는 EGFR항체와 HER2항체를 동시에 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약물 전달체는 pH 5.0 내지 pH 7.4의 범위에서 약물이 해리되는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질, 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질을 연결하는 링커, 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 항암제를 담지하는 입자가 결합된 것을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질은 항체 또는 항체 유사체의 Fc 부위와 결합하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 글루타치온-S-전이효소와 입자의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질과 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 비공유결합으로 연결되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 입자는 다공성 실리카 나노파티클(mesoporous silica nanoparticle, MSN), 골드 나노파티클(gold nanoparticle), 마그네틱 나노파티클(magnetic nanoparticle), 핵산-금속유기 금속체 나노파티클(Nucleic acid-Metal Organic Framework nanoparticle) 및 중합체 나노파티클(polymer nanoparticle)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항암제는 캄토테신(camptothecin), 독소루비신 (doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 베라파밀(Verapamil), 플루오로우라실 (fluorouracil), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 다우노루비신(Daunorubicin), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 파클리탁셀(paclitaxel), 카보플라틴(carboplatin), 젬시타빈(Gemcitabine), 메소트렉세이트(Methotrexalte), 도세탁셀(Docetaxel) 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
일 양상에 따른 융합 단백질 및 그를 포함하는 약물 전달체에 의하면, 생체 내 잔존 시간을 지속시킬 수 있을 뿐 아니라, 표적 세포로의 표적능이 향상되어 타겟으로 하는 세포로 효과적으로 전달될 수 있으므로, 표적 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 표적 약물 전달을 위한 항체-결합 나노 파티클의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 일 구체예에 따른 GSH-MSN을 TEM으로 촬영한 사진이다.
도 3은 일 구체예에 따른 GSH-ABD 단백질의 질량 분광학적 동정을 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 GST-ABD에 대한 항체에 결합 시 QCM 공명 주파수 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따른 Z-MSN를 TEM으로 촬영한 사진이다.
도 6은 일 구체예에 따른 MSN, GSH-MSN, Z-MSN 및 I-Z-MSN의 유체역학적 크기를 나타낸 그래프이다.
도 7은 일 구체예에 따른 MSN, GSH-MSN, GST-ABD, Z-MSN 및 I-Z-MSN표면 입자의 제타전위를 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 구체예에 따른 나노 파티클의 GST-ABD 단백질의 표면 밀도별 항체와 결합한 구조의 I-Z-MSN, I-Z-MSN40, 및 I-Z-MSN10을 나타낸 그림이다.
도 9는 일 구체예에 따른 나노 파티클의 GST-ABD 단백질의 표면 밀도별 항체와 결합한 구조의 I-Z-MSN, I-Z-MSN40, 및 I-Z-MSN10이 결합한 IgG의 양을 나타낸 그래프이다.
도 10은 일 구체예에 따른 나노 파티클의 GST-ABD 단백질의 표면 밀도별 항체와 결합한 구조의 I-Z-MSN, I-Z-MSN40, 및 I-Z-MSN10의IFITC의 PL의 방출양을 시간의 흐름에 따라 나타낸 그래프이다.
도 11은 일 구체예에 따른 고농도의 혈청 조건에서 나노 파티클의 GST-ABD 단백질의 표면에 항체와 결합한 구조인 I-Z-MSN의IFITC의 PL의 방출양을 시간의 흐름에 따라 나타낸 그래프이다.
도 12는 일 구체예에 따른 GSH-MSN, Z-MSN, 및 I-Z-MSN이 고농도의 혈청 조건에서 입자가 흡수한 단백질의 종류 및 세기를 SDS-PAGE를 통해 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 13은 일 구체예에 따른 사람 유방암 세포(MDA-MB-468, SK-BR-3)를 표적화하는 항체(EGFR, HER2)를 나노 파티클에 결합한 Z-MSN(E-Z-MSN, H-Z-MSN)의 모식도이다.
도 14는 일 구체예에 따른 Z-MSN, H-Z-MSN, 및 E-Z-MSN의 각각 유방암 세포 MDA-MB-468, SK-BR-3에 대한 표적화 여부를 형광현미경을 통해 확인한 사진이다.
도 15는 일 구체예에 따른 Z-MSN, 및 E-Z-MSN의 나노 파티클와 유방암 세포 MDA-MB-468을 공동 배양한 후 유세포분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 일 구체예에 따른 Z-MSN, 및 E-Z-MSN의 유방암 세포 MDA-MB-468에 대한 MTT 세포독성 분석 결과와 Z-MSN, 및 H-Z-MSN의 유방암 세포 SK-BR-3에 대한 MTT 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 일 구체예에 따른 하나의 나노 파티클 Z-MSN에 서로 다른 종류의 항체 EGFR, HER2를 결합한 이중 표적화 나노 파티클 EH-Z-MSN의 모식도이다.
도 18은 일 구체예에 따른 이중 표적화 나노 파티클 EH-Z-MSN의 각각 유방암 세포 MDA-MB-468, SK-BR-3에 대한 표적화 여부를 형광현미경을 통해 확인한 사진이다.
도 19는 일 구체예에 따른 이중 표적화 나노 파티클 EH-Z-MSN의 유방암 세포 MDA-MB-468 및 SK-BR-3에 대한 MTT 세포 독성 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 일 구체예에 따른 유방암 세포SK-BR-3를 주입한 종양 마우스에 Z-MSN과 H-Z-MSN을 정맥 주사로 주입한 후 시간의 흐름에 따라 약물의 형광도를 나타낸 사진이다.
도 21은 일 구체예에 따른 유방암 세포SK-BR-3를 주입한 종양 마우스에 Z-MSN과 H-Z-MSN을 정맥 주사로 주입한 24시간 후, 장기와 종양에서 약물의 형광도를 나타낸 사진이다.
도 22는 일 구체예에 따른 유방암 세포SK-BR-3를 주입한 종양 마우스에 Z-MSN과 H-Z-MSN을 정맥 주사로 주입한 후 시간의 흐름에 따라 약물의 형광 발현 정도를 측정한 그래프이다.
도 23은 일 구체예에 따른 유방암 세포SK-BR-3를 주입한 종양 마우스에 Z-MSN과 H-Z-MSN을 정맥 주사로 주입한 24시간 후, 장기와 종양에서 약물의 형광 발현 정도를 측정한 그래프이다.
일 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질, 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질을 연결하는 링커를 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질", "표적세포 인식능을 갖는 단백질", 또는 "표적 세포 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질"은 세포의 수용체 또는 표적 단백질을 특이적으로 인식하는 또는 세포의 수용체 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포의 수용체 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 특정 항원(예를 들어, CD3 또는 표적 항원(TA))에 특이적으로 결합하거나 또는 이와 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함한다. 또한, 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 면역글로불린 분자를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3인 3개의 도메인을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL1)을 포함한다. 상기 VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는, 더 보존된 영역이 개재된(interspersed), 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는, 초가변 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이는 하기 순서 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 아미노-말단 내지 카르복시-말단에서 배열된다. 본 발명의 상이한 실시예에서, 항-TA 항체 또는 항-CD3 항체(또는 이의 항원-결합 부분)의 상기 FR은 인간 생식계열 서열과 동일할 수 있거나, 또는 천연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통(consensus) 서열은 2개 이상의 CDR의 병렬 분석에 기반하여 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 또한 완전 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 천연적으로 발생하는, 효소적으로 수득 가능한, 합성인, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 예를 들어, 단백질 가수분해 소화와 같은 임의의 적합한 표준 기법, 또는 항체 가변 및 선택적 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 재조합 유전공학적 기법을 사용하여 완전 항체 분자에서 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되고/되거나, 예를 들어, 상업적인 출처인 DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함)에서 용이하게 이용 가능하거나, 또는 합성될 수 있다. 상기 DNA는, 예를 들어, 하나 이상의 가변 도메인 및/또는 불변 도메인을 적합한 구성으로 배열시키기 위해, 또는 코돈을 도입하기 위해, 시스테인 잔기를 생성하기 위해, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키는 등을 위해 화학적으로 또는 분자생물학 기법을 사용함으로써 시퀀싱 및 조작될 수 있다.
항원-결합 단편의 비제한적인 예는 (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 과다가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위를 포함한다. 또한, 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-접합 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈(modular) 면역 약물(SMIP) 및 상어 가변 IgNAR 도메인과 같은 다른 조작된 분자는 본원에 사용되는 바와 같이 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 상기 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있고 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 또는 그 내에서 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 회합된 VH 도메인을 가지는 항원-결합 단편에서, 상기 VH 및 VL 도메인은 서로에 대해 임의의 적합한 배열로 배치될 수 있다. 예를 들어, 상기 가변 영역은 이량체일 수 있고 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "애피바디 분자(affibody molecule)"는 특정 타겟 단백질(수용체)에 결합할 수 있는, 항체 모사체를 의미할 수 있다. 일반적으로 애피바디 분자는 20 내지 150의 아미노산 잔기로 구성되며, 2 내지 10개의 알파 헬릭스로 구성된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 애피바디 분자는 항-ErbB 애피바디 분자(ab31889), HER2-특이적 애피바디 분자(ZHER2:342), 항-EFFR 애피바디 분자(ZEGFR:2377) 등을 포함할 수 있다. 또한, 이에 한정되지 않고, 세포의 특정 수용체 또는 표적 단백질을 인식할 수 있는 애피바디 분자를 모두 포함한다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질은 단백질 A의 면역 글로불린 결합성 도메인인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질 A의 면역 글로불린 결합성 도메인은 E, D, A, B, C 또는 Z 도메인인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “Z 단백질”은 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A에서 얻어진 것으로, 이는 숙주세포 내에 존재하는 항체에 대한 방어 작용에 사용되는 단백질을 의미한다. 상기 Z 단백질은 숙주세포 내 항체의 Fc 부위와 결합하여 마크로파지(macrophage)에 의한 식균작용이 일어나지 못하게 하는 자기 방어 기작으로 사용된다. 단백질 A에서 항체와 결합하는 부위만을 조작하여 만든 탠덤 리피트 다이머(tandem repeat dimer)를 “Z 도메인”이라 한다.
상기 Z 도메인은 Z 도메인이 반복된 형태인 Zn (상기 n은 1 이상의 정수이다)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 Z 도메인은 Z 도메인이 2개 반복된 형태인, Z 도메인일 수 있다. 또한, 상기 Z 도메인은 Z 도메인이 3개 반복된 형태인, ZZ 도메인일 수 있다. 일 예시적인 구현예에 따르면, 상기 Z 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ZZ 도메인일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질은 항체 또는 항체 유사체의 Fc(조각 결정성), Fc 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fd 단편 부위와 결합하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 부위"는 항체의 꼬리(tail) 부위로서 Fc 수용체로 불리는 세포 표면 수용체와 상호작용하는 항체의 일 부위를 의미한다. 일반적으로, 파파인으로 전장 항체를 절단하면 Fab 부위와 Fc 부위 두 부위를 얻게 된다. 하나의 클래스에서 모든 항체의 Fc 부위는 거의 동일한 특성이 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 GST 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 링커를 통해 연결되어 있을 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는, 1 내지 400개, 1 내지 200개, 또는 2 내지 200개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 또한 기능적 일부분 사이의 적절한 분리를 달성하기 위하여 또는 필수적인 내부-일부분(inter-moiety)의 상호작용을 유지하기 위한　링커의 최적화를 고려하여 카피 수 “n”을 조절할 수 있다. 해당 기술분야에서 다른 가용성　링커들이 알려져 있는데, 예를 들어 수용성을 향상시키기 위하여 극성 아미노산 잔기를 추가하는 것뿐만 아니라 유연성을 유지하기 위하여 T 및 A와 같은 아미노산 잔기를 추가한 G 및 S　링커가 있을 수 있다. 따라서 일 구체예에 있어서, 상기　링커는 G, S, 및/또는 T 잔기를 포함하는 유연성　링커일 수 있다. 상기　링커는 (GpSs)n 및 (SpGs)n으로부터 선택되는 일반식을 가질 수 있고, 이 경우, 독립적으로, p는 1 내지 10의 정수이고, s = 0 내지 10의 0 또는 정수이고, p + s는 20 이하의 정수이고, 및 n은 1 내지 20의 정수이다. 더욱 구체적으로 링커의 예는 (GGGGS)n (서열번호 2), (SGGGG)n　(서열번호 3), (SRSSG)n (서열번호 4), (SGSSC)n (서열번호 5), (GKSSGSGSESKS)n (서열번호 6), (RPPPPC)n (서열번호 7), (SSPPPPC)n (서열번호 8),　(GSTSGSGKSSEGKG)n (서열번호 9), (GSTSGSGKSSEGSGSTKG)n (서열번호 10),　(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)n　(서열번호 11), 또는 (EGKSSGSGSESKEF)n (서열번호 12)이고, 상기 n은 1 내지 20, 또는 1 내지 10의 정수이다.
또 다른 양상은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
용어 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 자연의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 그의 유사체(analogue)도 포함한다. 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단쇄 폴리뉴클레오티드이다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 실시예에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우, 복제 기원을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 배시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 벡터는 동물세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터를 포함한다. 일 실시예에 따라 적합한 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, U6 프로모터 및 H1 프로모터, MLV(Murine Leukemia Virus) LTR(Long terminal repeat) 프로모터, 아데노바이러스 초기 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터 및 설바이빈 (Survivin) 프로모터를 포함할 수 있다.
또한, 상기 벡터에서, 전술한 융합 단백질은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
또 다른 양상은 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다.
상기 세포, 예를 들면, 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 원생동물 (protozoa), 식물, 고등 식물 및 곤충, 또는 양서류의 세포, 또는 CHO, HeLa, HEK293, 및 COS-1과 같은 포유 동물의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는, 배양된 세포 (인 비트로), 이식된 세포 (graft cell) 및 일차 세포 배양 (인 비트로 및 엑스 비보(ex vivo)), 및 인 비보 (in vivo) 세포, 및 또한 인간을 포함하는 포유동물의 세포 (mammalian cell)일 수 있다. 또한, 상기 유기체는 효모, 곰팡이, 원생동물, 식물, 고등 식물 및 곤충, 양서류, 또는 포유 동물일 수 있다. 또한, 상기 세포는 동물 세포 또는 식물세포일 수 있다.
다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질, 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질을 연결하는 링커, 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 약물을 담지하는 입자가 결합된 것을 함유하는 약물 전달체를 제공하는 것이다.
상기 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 융합 단백질에 대해서는 상기한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases: RTKs)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 수용체 타이로신 카이네이즈는 표피 성장인자 수용체, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 혈관내피 성장인자 수용체, 섬유아세포 성장인자 수용체, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin: CCK) 수용체, 신경영양인자(Neurotrophic factor: NGF) 수용체, 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor: HGF) 수용체, 에프린(Ephrin: Eph) 수용체, 안지오포이에틴 수용체, 및 RYK(related to receptor tyrosine kinase) 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "종양 관련 항원(Tumor-associated antigen, TAA)"은 암과 관련된 단백질, 당단백질, 강글리오사이드, 탄수화물, 지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 항원을 의미한다. 이러한 항원은 악성 세포 상에서 또는 종양 관련 혈관, 세포외 기질, 중간엽 간질, 또는 면역 침윤물과 같은 종양 미세환경에서 발현될 수 있다.
일부 경우, 상기 항원은 종양 관련 항원 또는 종양 세포에 의해 발현된 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 종양 관련 항원은 AFP, ALK, BAGE 단백질, BIRC5(서바이빈), BIRC7, β-카테닌, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, 카르보닉 안하이드라제 IX, 카스파제-8, CALR, CCR5, CD19, CD20(MS4A1), CD22, CD40, CD70, CDK4, CEA, 사이클린-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, GAGE 단백질(예를 들어, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, 글리피칸-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, IL-10, LMP2, MAGE 단백질(예를 들어, MAGE-1, -2, -3, -4, -6, 및 -12), MART-1, 메소텔린, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16(CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA(FOLH1), RAGE 단백질, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, STEAP1, STEAP2, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, 톰슨-뉴벨(Thompson-nouvelle) 항원(Tn), TRP-1, TRP-2, 티로시나제 및 유로플라킨-3으로 구성되는 군에서 선택된다.
추가적으로, 표적 세포 또는 표적 단백질의 예는, 아밀로이드 베타 펩티드, 시누클레인(예를 들면, 알파-시누클레인), 아포리포프로테인(예를 들면, 아포리포프로테인 A1), 보체 인자(Complement factor)(예를 들면, C5), 탄산무수화효소(Carbonic anhydrase)(예를 들면, CAIX), 인터루킨-2 수용체 알파 사슬(IL2RA; CD25), 또는 c-Jun, Factor VIII, 프비르노겐, GP120, Her3, HPV16 E7, IAPP(Human islet amyloid polypeptide), 이뮤노글로불린 A(IgA), IgE, IgM, 인터루킨(예를 들면, IL-1, IL-6, IL-8, IL-17), 스타필로코커스 단백질 A 도메인(Staphylococcal protein A domain), Raf-1, LOV 도메인(Light-oxygen-voltage-sensing domain), 또는 RSV G 단백질일 수 있다. 상기 애피바디에 대한 정보는 Stefan Stahl et al., Affibody Molecules in Biotechnological and Medical Applications, Trends in Biotechnology, August 2017, Vol 35, No 8에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본 명세서에서 포함된다.
일 구체예에 있어서, 상기 입자는 나노 입자인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 입자는 입자 크기가 10nm 내지 250nm인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 글루타치온-S-전이효소와 입자의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것일 수 있다. 즉, 상기 GSH는 글루타치온-S-전이효소의 결합 부위로 작용하여 약물을 담지하는 입자과 글루타치온-S-전이효소를 연결할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 하나의 입자에 상기 글루타치온-S-전이효소, 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질 및 링커가 포함된 단백질이 두개 이상 결합된 것일 수 있다. 즉, 하나의 입자에 두개 이상의 융합 단백질이 결합하여 표적 세포 또는 표적 단백질에 더 용이하게 결합하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질과 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 비공유결합으로 연결되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 입자는 약물이 담지된 또는 약물을 담지할 수 있는 나노파티클일 수 있다. 나노파티클은 종래의 기술에 따라 약물 전달체로서 적용할 수 있는 나노파티클이라면 제한없이 적용될 수 있다. 구체적으로, 다공성 실리카 나노파티클(mesoporous silica nanoparticle, MSN), 골드 나노파티클(gold nanoparticle), 마그네틱 나노파티클(magnetic nanoparticle), 핵산-금속유기 금속체 나노파티클(Nucleic acid-Metal Organic Framework nanoparticle) 및 중합체 나노파티클(polymer nanoparticle)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 또한, 상기 나노파티클의 GSH(Glutathione)이 결합된 것일 수 있다. 이에 의해, 상기 나노파티클은 GST를 포함하는 융합 단백질과 결합할 수 있다. 또한, 구체적으로, 상기 나노파티클은 화학 항암제를 담지할 수 있다.
약물 전달체를 사용하여 개체 내로 전달할 수 있는 약학적 활성 성분의 종류는 항암제, 조영제(염료), 호르몬제, 항호르몬제, 비타민제, 칼슘제, 무기질 제제, 당류제, 유기산 제제, 단백질 아미노산 제제, 해독제, 효소 제제, 대사성 제제, 당뇨 병용제, 조직 부활 용약, 클로로필 제제, 색소제제, 종양 용약, 종양 치료제, 방사성 의약품, 조직 세포 진단제, 조직 세포 치료제, 항생 물질 제제, 항바이러스제, 복합항생물질제제, 화학요법제, 백신, 독소, 톡소이드, 항독소, 렙토스피라혈청, 혈액 제제, 생물학적 제제, 진통제, 면역원성 분자, 항히스타민제, 알레르기 용약, 비특이성 면역원 제제, 마취제, 각성제, 정신 신경 용제, 저분자 화합물, 핵산, 앱타머, 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, siRNA 및 마이크로 RNA 등을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 입자에 항암제가 담지된 것일 수 있다.
또한, 상기 항암제는 캄토테신(camptothecin), 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 베라파밀(Verapamil), 플루오로우라실(fluorouracil), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 다우노루비신(Daunorubicin), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 파클리탁셀(paclitaxel), 카보플라틴(carboplatin), 젬시타빈(Gemcitabine), 메소트렉세이트(Methotrexalte), 도세탁셀(Docetaxel), 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA 773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소테레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이들의 혼합물 등을 포함할 수 있다. 이 때, 해당 화학 항암제가 사멸 유도하고자 하는 암 조직 세포에 대하여 특이적으로 인식하는 단백질이 상기 표적세포 인식능을 가지는 단백질로서 해석될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약물 전달체의 표면 전하가 -30 내지 -1mV인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약물 전달체는 2이상의 서로 다른 종류의 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 동시에 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 유방암 세포인 MDA-MB-468세포와 SK-BR-3를 표적화 하는 EGFR와 HER2의 항체를 동시에 나노 파티클의 표면에 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약물 전달체는 pH 5.0 내지 pH 7.4의 범위에서 약물이 해리되는 것일 수 있다. 상기 약물 전달체는 세포 침입 후 약물의 세포질 방출을 가능하게 하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질, 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합하는 부위를 제공하는 단백질을 연결하는 링커, 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 항암제를 담지하는 입자가 결합된 것을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질, 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 항암제, 입자에 대해서는 상기한 바와 같다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 포유동물은 쥣과, 원숭이, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완동물을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 생체내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 엔티티(entity)의 조직, 세포 및 그들의 자손도 또한 포함된다.
용어 "치료제" 또는 "약학적 조성물"는, 대상체로의 투여 시에 몇몇 유리한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 유리한 효과는 진단적 결정을 가능하게 하는 것; 질병, 증상, 장애 또는 병태의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병태의 대응을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화하는" 또는 "개선하는"은 상호교환 가능하게 사용된다. 이들 용어는 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하나 이들에 한정되지 않는 유리한 또는 요망되는 결과를 수득하는 방법을 지칭한다. 치료 이익은 치료 하의 하나 이상의 질병, 질환 또는 증상의 임의의 치료적으로 유의미한 개선 또는 그에 대한 효과를 의미한다. 예방 이익에 있어서, 조성물은 특정 질병, 질환 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 또는 질병, 질환 또는 증상이 아직 나타나지 않을지라도, 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유리한 또는 요망되는 결과를 야기하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료되는 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 용어는 본원에 기술된 영상화 방법 중 임의의 것에 의한 검출을 위한 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 작용제, 뒤따르는 투여 요법, 그것이 다른 화합물과 병용하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 영상화되는 조직 및 그것을 운반하는 신체 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
상기 암은 폐암(예를 들면, 비소세포성 폐암), 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 또는 자궁암일 수 있다. 또한, 상기 암은 항암제에 대한 내성(예를 들면, 다제 내성)을 갖는 위암, 유방암, 폐암, 간암, 식도암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(Nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(Carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 글루타치온(Glutathione)과 같은 항산화제(Antioxidants), 킬레이트화제(Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 유효용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. 실시예들은 다양한 변환을 가할 수 있는 바, 실시예들은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있다.
참조예 1. 다공성 실리카 나노파티클(MSN)의 합성
약물 전달체의 기본 구조로서, 다공성 실리카 나노파티클(mesoporous silica nanoparticle, MSN)을 합성하기 위해, CTAB(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB) 1.53 g과 TEAH(Tetraethylammonium hydroxide, TEAH) 0.3 g을 증류수 100 g에 용해하고 80°C에서 1시간 교반하여 이를 용해시켰다. CTAB가 완전히 용해되면, 계면활성제로서 4.7 g의 TEOS(tetraethyl orthosilicate, 98%)를 가하고 2 시간 동안 800 rpm으로 추가 교반하였다. 교반된 교반액이 백색의 고체상을 나타내면 이를 진공 필터로 여과한 다음, 탈이온수(DI water)로 세척하고, 70 ℃의 공기중에서 건조시켜 건조물을 수득하였다. 수득한 건조물은 마노 절구(agate mortar)에서 균질화한 다음, 550 ℃에서 5 시간 동안 하소(calcine)하여 최종적으로 MSN을 수득하였다.
참조예 2. 글루타치온 - 다공성 실리카 나노파티클(GSH-MSN)의 제조
본 발명의 단백질 GST-ABD을 가지는 나노파티클을 제조하기 위한 과정으로서, 표면에 글루타치온(glutathione, GSH)을 티올-엔 클릭 화학반응(thiol-ene click chemistry)으로 결합시킨 나노파티클(GSH-Mesoporous silica nanoparticle, GSH-MSN)을 제조하였다.
구체적으로, 상기 참조예1.에서 제조한 MSN 100 ㎎ 및 1 ㎖의 3-(트리메톡시실일)프로필 아크릴레이트(3-(trimethoxysilyl) propyl acrylate)를 18 ㎖ 톨루엔에 혼합하였다. 혼합된 혼합액은 60 ℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응 후, 에탄올 및 탈이온수로 반응된 MSN를 세척한 다음, 16 ㎖의 DMF에 가하여 MSN을 준비하였다. 외층을 이루기 위한 GSH는 100 ㎎의 GSH를 2 ㎖의 탈이온수에 용해하여 준비하였다. 그런 다음, 상기 준비한 MSN 포함 용액 및 GSH 수용액을 혼합하고, 40 ㎕의 피리딘을 가하여 볼텍싱하여 교반하였다. 교반 후, 혼합액은 실온에서 72 시간 동안 방치하여 반응을 유도하였다. 반응 종료 후, 나노파티클을 에탄올로 3 회 세척하고 실온에서 진공 건조하여, GSH가 표면에 결합된 나노파티클(GSH-MSN)을 최종적으로 수득하였다.
약물 또는 염료 분자를 담지하기 위해, 5.0 mg의 GSH-MSN을 약물 또는 염료 분자(CPT 10 mg 또는 DiI 또는 DiD 1.5 mg)를 포함하는 DMSO 1 mL에 분산시켰다. 상온에서 48 시간 동안 교반한 후, 원심분리에 의해 입자를 수집하였다.
참조예 3. 글루타치온-S-전달효소 항체 결합 도메인(GST-ABD)의 제조
글루타치온-S-전이효소 항체 결합 도메인(GST-ABD) 단백질(Z domain)을 합성하기위해 먼저, 항체 결합 도메인(Antibody binding domain, ABD) 암호화 유전자는 N 말단에 58개의 아미노산과 여분의 링커(GGGLVPRGSGGGCGGGGTGGGSGGG) (서열번호 1)로 합성된 후, 글루타치온-S-전달효소(GST)의 C 말단으로 유전자 융합을 위해 IPTG 유도 pETDuet 발현 벡터(Invitrogen)를 넣고, 글루타치온-S-전달효소(GST)의 N말단에서 6개의 히스티딘을 넣었다. 이를 통해 얻어진 DNA를 중합효소 연쇄반응을 실시하고 적격 대장균 균주 BL21(DE)에 삽입하였고, 여기서 GST-ABD 단백질은 30°C에서 하룻밤 동안 과발현되었다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 라이소자임으로 처리하고, 30초 간격으로 10분 동안 초음파 처리하였다. 세포를 다시 원심분리하여 상층액 용액에 포함된 GST-ABD 단백질을 수집하였다. 단백질을 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 및 투석에 의해 추가로 정제하였다.
참조예 4. Z도메인 기능화된 다공성 실리카 나노파티클(Z-MSN)의 제조
본 발명의 단백질 GST-ABD의 밀도에 따른 항체 결합의 안정성을 평가하기 위해 세 종류의 Z-MSN(Z domain-functioned MSN, Z-MSN)을 제조하였다. 글루타치온-S-전이효소 항체 결합 도메인(GST-ABD) 단백질 1mg을 포함하는 중성 PBS 5 mL에 GSH-MSN 1mg을 분산시킨 후 4°C에서 1시간 동안 교반하였다. Z-MSN은 원심분리에 의해 채취하여 PBS로 3회 세척한 후 2 mL의 PBS로 재분산하였다. Z-MSN40 및 Z-MSN10의 제조에는 각각 0.4 mg 및 0.1 mg의 글루타치온-S-전이효소 항체 결합 도메인(GST-ABD)을 사용하였다.
참조예 5. Z 도메인 기능화된 다공성 실리카 나노파티클(Z-MSN)와 항체의 결합
항체가 흡착된 Z-MSN은 모든 실험 전에 새로 만들어졌다. 500μg의 항체(IgG, EGFR 항체 또는 HER2 항체)를 PBS 500μL에 분산시킨 후 Z-MSN 0.5 mg이 함유된 중성 PBS 1 mL에 첨가하여 상온에서 15분간 교반한 후 PBS로 2회 세척한 후 원심법으로 입자를 채취하여 1 MBS에 재분산하였다. EGFR과 HER2 항체를 동시에 Z-MSN에 고정하기 위해 각 항체의 250μg을 PBS 250μL에 분산시킨 후 Z-MSN 0.5 mg을 포함하는 PBS 1 mL에 첨가하였다.
참조예 6. 항체 결합의 안정성
항체-입자 결합 안정성은 형광표지 IgG, IFITC를 이용하여 조사하였으며, 이 중 형광방출은 Z-MSN 샘플에 결합 시 광발광(PL) 분광법에 의해 모니터링되었다. IFITC를 제조하기 위해 DMSO 20μL에 100μg의 FITC를 탄산수소나트륨-비카보네이트 완충용액(0.1 M, pH 9.0) 5mL에 분산시킨 IgG 5mg과 혼합한 후 상온에서 5분간 교반한 후 중성 PBS에 투석하여 하룻밤동안 실온에 두었다. 상기 IgG가 결합된 입자들(I-Z-MSNs, I- Z-MSNs40, and Z-MSNs10)을 IFITC 0.5 mg이 포함된 PBS(pH 7.4) 1 mL에 현탁하고 8시간 동안 교반하였다. 상기 용액의 액량을 0, 1, 2, 4, 8h로 취하였으며, 각 용액에 포함된 입자는 원심분리에 의해 회수하여 중성 PBS 1 mL로 재분산하였다. 이러한 입자 샘플의 PL 방출은 형광 분광 광도계(Hitachi, F7000)로 측정되었다(FITC의 경우 최대 = ~ 524 nm). 혈청 존재 시 항체 결합 안정성을 평가하기 위해 IFITC 결합 입자(IFITC-Z-MSNs, IFITC-Z-MSNs40, IFITC-Z-MSNs10)를 혈청 함유 중성 PBS(50% FBS) 1 mL에 매달아 동일한 프로토콜로 처리하였다.
참조예 7. 세포 배양
인간 유방암 세포주인 SK-BR-3 세포와 MDA-MB-468 세포를 준비하였다. 준비한 SK-BR-3 세포는 DMEM 배지(11995065, Invitrogen, S.Korea)에서, MDA-MB-468 세포는 Leibovitz-L-15 media (Invitrogen)에서 배양하였다. 배지에는 10% 우태아혈청(FBS), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 페니실린을 첨가하였고, 배양 기간 중에는 배지를 매일 한 번씩 교체하였다. 배양 환경은 37℃의 5% CO2 배양기로 유지하였다. 세포 접종 후 세포가 85% 포화도로 증식되면, 부착 배양된 세포를 분리하여 실험에 사용하였다. SK-BR-3 세포를 분리하여, 96 웰 플레이트(Thermo Scientific Inc. Korea)에 5×103 세포/웰의 농도로 각각의 세포를 접종하고 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다.
참조예 8. 암세포 내로 흡수(Cellular uptake)
세포 내로 약물이 유입되는지 여부를 함께 확인하기 위해서, Dil을 담지한 나노파티클을 사용하였다. SK-BR-3 세포 및 MDA-MB-468 세포를 4×104 세포/웰의 밀도로 8 웰 플레이트에 접종한 다음 10% FBS로 24시간 배양했다. 37℃에서 24 시간 동안 세포를 배양하였다. 그런 다음, Z-MSN 샘플에 DiI 염료(60 μg/mL)가 로드된 FBS 함유 매체로 세포를 3시간 동안 배양하였다. 이 후, LSM780 공초점 현미경으로 공초점 형광 이미징을 통해 입자의 세포 흡수를 관찰했다. 세포 흡수의 유동 세포계 분석을 위해 세포는 6-웰 플레이트에서 웰당 2 × 105 셀의 밀도로 분주되었다. 24시간 배양 후 DiI가 부하된 입자(60 μg/mL)로 세포를 처리하여 3시간 동안 배양하였으며, 트립신화 후 BD FACS Verse flow cytometer(BD Bioscience, 미국 BD Bioscience)를 이용하여 유동 세포측정법으로 세포를 채취하여 분석하였다.
참조예 9. 세포 독성
세포는 시약 처리 24시간 전에 96-well 플레이트에서 웰당 5×103 셀의 밀도로 분주하였다. 다음으로, 세포는 50% FBS 및 CPT-loaded 입자 샘플(Z-MSN, E-Z-MSN, H-Z-MSN, EH-Z-MSN)로 처리되었다(0-4 μg/mL CPT). 24시간 후, 세포들을 3(4,5-디메틸-티조일-2-일)2,5 디페닐테트라졸륨브로마이드(MTT)로 4시간 동안 배양한 후 ELISA 플레이트 리더로 가져가 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 생존 가능한 세포의 평균 백분율 ± 표준 편차(n = 3)로 표현하였다.
참조예 10. 인비보 이미징
종양 이종이식 모델 확립을 위해 BALB/c 누드 암컷 마우스(한국 오리엔트바이오)의 오른쪽 측면에 SK-BR-3 세포를 주입하고 종양을 최대 150mm3까지 성장시켰다. 종양이 있는 마우스(n = 3)에는 DiD(약 8 중량% 로딩 용량) 또는 자유 DiD(0.1 mg/mL)가 로드된 입자가 정맥 주사되었으며, 이후 생체내 광학 이미징 시스템(Bruker Xtreme 모델)을 사용하여 여러 시점(0, 2, 4, 8, 24시간)에서 형광 영상을 획득하였다(ex = 630 nm, 700 nm). 각 샘플의 생체분포는 주사 후 24시간 동안 마우스에서 추출한 장기와 종양에서 생체외 영상촬영을 통해 평가되었다.
실시예 1. 비공유결합으로 항체 결합을 위한 Z 도메인 기능화된 다공성 실리카 나노파티클의 준비
투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM)과 질소 흡착(Nitrogen gas sorption)으로 GSH-MSN 및 Z-MSN의 모양 및 크기를 관찰하였다. 그 결과를 도 2및 도 5에 나타내었다. 스케일 바는 50nm이다.
도 2 및 도 5에 나타낸 바와 같이, GSH-MSN은 구형 모양의 입자에 평균적으로 2.4nm의 작은 내부 구멍들과 표면에는 큰 구멍(~553m2g-1)이 있는 다공성 실리카 나노파티클의 형태적 특성을 확인할 수 있다. 글루타치온에 의해 변형된 다공성 실리카 나노파티클은 여전히 구형의 모양을 가지고 있으나, 표면의 면적이(~322m1g-1)으로 그리고 구멍의 크기가(평균적으로 2.1nm)으로 줄어들었다. Z-MSN은 초기 합성된 MSN과 GSH-MSN에서 구형의 모형을 그대로 가져온다. Z-MSN의 내부의 다공성 구조는 표면을 덮고 있는 GST-ABD단백질에 의해 거의 보이지 않게 된다.
항체 결합 도메인은(Antibody-binding domain, ABD)은 글루타치온-S-전달효소(GST)와 유전적으로 결합하였고, 그 결과인 GST-ABD(35.9 kDa,> 99.0%)은 전기분사이온화법의 time-of-flight 방식으로 질량분광법에 의했으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
GST-ABD와 항체 간의 상호작용을 실시간으로 확인하기 위해 수정진동자저울(Quartz Crystal Microbalance, QCM) 및 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 이는 항체 IgG의 존재하에서 GST-ABD로 공명주파수의 급격한 감소를 보였다. GST-ABD와 접합 후 항체의 고유한 표적화 활성(targeting activity)은 해당 항체와 함께 배양된 세포의 공초점 형광 영상을 사용하여 검증되었다.
이어서, GSH-ABD가 함유된 PBS 용액에서 GSH-MSN을 입자와 단백질의 1:1 질량비로 4℃에서 1시간 동안 현탁하고 교반하였다. 순차적으로 이어지는 변형 과정을 통해, 나노 파티클의 유체역학적 크기를 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 나노 파티클은 유체역학적 크기에 따라 PBS에 잘 분산된 상태를 유지하였으며, 각각 MSNs, GSH-MSNs, and Z-MSNs 은 68 ± 14, 78 ± 18, and 130 ± 25 nm으로 측정되었다.
GST-ABD의 표면 전하를 확인하고자, 생리적 pH 환경에 분산된 나노파티클의 제타전위(zeta-potential)을 측정하여 약물 전달체의 표면 전하를 확인하였다. 상기 참조예에서 제조한 약물 전달체인 GSH-MSN, Z-MSN, IgG, 및 I-Z-MSN의 표면 전하를 함께 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, Z-MSN의 제타 전위는 0에 가까웠으며 (-4.3 ± 2.1 mV), 이는 GST-ABD 부착 전 입자와 구별되는 자유 GST-ABD (-3.3 ± 2.6 mV)와 거의 같았다. GST-ABD의 입자당 양은 약 210 μg/mg으로 BCA 분석에 의해 확인되었다. 규산염 골격의 2.0 g/cm3 밀도를 가정함으로써, 이 값은 한 입자의 표면이 ~ 408 GST-ABD 단백질으로 덮여 있음을 의미한다.
Z-MSN이 표적약물을 표적하는 곳에 운반하기 위하여, MSN에 항체 결합 능에 대한 측정은 혈청 단백질에 풍부하게 존재하는 IgG를 이용하였다. 항체의 결합은 입자 표면의 Z도메인과 IgG사이에 생체 분자 반응을 통해서 직접적인 과정에 의해 이루어진다. 변형되지 않은 IgG는 중성의 PBS에서 4℃에서 1시간 동안 (부드럽게-gentle)교반하여 Z-MSN과 직접 반응시켰다. BCA 분석을 통해, Z 도메인에 결합한 IgG의 입자당 양은 ~188μg/mg으로 측정되었다. 이 측정값을 GST-ABD 함량(~ 210 μg/mg)과 함께 사용하여 항체 대 GST-ABD의 비율이 1:4.66으로 동일함이 추론되었다. 이는 평균적으로 거의 5개의 GST-ABD 단백질이 입자 표면의 하나의 항체에 결합할 수 있음을 나타낸다. IgG-고정된-Z-MSNs(I-Z-MSNs)은 처리되지 않은 Z-MSN에 비해 더욱 큰 크기를 나타냈고(215 ± 30 vs. 130 ± 25 nm by DLS, 도6), 이의 표면 전하(-8.3 ± 1.2 mV)는 Z-MSNs(-4.3 ± 2.1 mV) 보다 더욱 음전하를 띠었으며, 이는 IgG (-9.8 ± 3.2 mV)가 음전하를 띠기 때문이다.
도 2는 일 구체예에 따른 GSH-MSN을 TEM으로 촬영한 사진이다.
도 3은 일 구체예에 따른 GSH-ABD 단백질의 질량 분광학적 동정을 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 GST-ABD에 대한 항체에 결합 시 QCM 공명 주파수 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따른 Z-MSN를 TEM으로 촬영한 사진이다.
도 6은 일 구체예에 따른 MSN, GSH-MSN, Z-MSN 및 I-Z-MSN의 유체역학적 크기를 나타낸 그래프이다.
도 7은 일 구체예에 따른 MSN, GSH-MSN, GST-ABD, Z-MSN 및 I-Z-MSN표면 입자의 제타전위를 나타낸 그래프이다.
실시예 2. 항체 결합에 Z 도메인 표면의 영향
항체 결합에 있어서 GST-ABD의 농도의 영향을 확인하기 위해, 비교실험을 위해 ABD의 양이 작은 2개의 샘플을 추가로 준비하였다. GST-ABD와 ABD가 없는 GST가 섞여있는 용액을 사용하여, 입자의 표면을 약 40% 또는 약 10%의 GST-ABD가 포함되도록(Z-MSNS40과 Z-MSNS10, 각각)구성하여 GST-ABD로 표면이 덮혀 있도록 한 Z-MSN(100% GST-ABD)과 비교하였다. 각 입자의 표면의 GST-ABD의 밀도별 모식도를 도 8에 나타내었다.
BCA Protien assay측정을 이용해 IgG 분자를 포획하기 위해 처리되었고, 표면의 IgG의 양을 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 표면에 묶여있는 IgG의 양이 I-Z-MSN에 비해 상당히 감소(I-Z-MSNs, I-Z-MSNs40, I-Z-MSNs10의 경우 각각 ~188, ~104 및 ~51μg/mg)함을 알 수 있었다. 두 대조군 입자에 대한 IgG 양이 예상보다 약간 높아서, 주요 부위별 상호작용 외에도 항체와 Z도메인 사이에 비특이적 접착 상호작용이 존재할 수 있음을 암시하였다. 그럼에도 불구하고, 이 결과는 Z-MSN의 항체 결합 용량이 ABD의 본질적인 합체 결합 특성과 잘 일치하여 GST-ABD 양에 의해 유의하게 지배된다는 것을 명확히 했다.
각 시료의 광발광(PL) 방출량을 측정하여 IFITC만 부착된 대조군 입자와 각각 비교하였다(IFITC-Z-MSNs, IFITC-Z-MSNs40, and IFITC-Z-MSNs10, λem. max. = ~ 524 nm). 유리 IgG 분자가 포함된 중성 PBS에 입자를 매달아 8시간 동안 약한 흔들림 아래 두었으며, 지정된 시점(1,2,4,8시간)에서 용액을 취하였으며, 이후 원심분리를 통해 입자를 회수하여 신선한 PBS에 재분산하여 표면 항체의 구성 및 수의 변화를 측정하였다. 이러한 대조군 입자의 PL 방출 강도는 항체 결합 용량이 다르기 때문에 각 입자마다 항체 결합 용량이 다르기 때문에 동일하지 않다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 10을 참조하여 설명하면, I-Z-MSN은 1시간에서 매우 약한 형광을 방출하고 8시간까지 강도 상승만 거의 나타내지 않아, 초기에 부착되어 있던 IgG분자의 대부분이 주변 IFITC 분자에 의해 대체되지 않고 안정적으로 입자 표면에 잔류하고 있음을 알 수 있다. 이에 반해, I-Z-MSN40은 1시간에서 높은 형광성을 띠게 되었고, 결국 IFITC-Z-MSN40과 거의 동일한 PL강도를 나타내었다. 또한 I-Z-MSN10은 훨씬 더 빠른 PL 방출을 거쳤으며, 1시간 동안 만에 대조군 샘플과 유사한 수준에 빠르게 도달하였다. 실제로, 이러한 결과는 항체 결합이 충분한 양의 표면 GST-ABD 단백질로 인해 운동학적으로 안정화될 수 있음을 시사한다.
도 11을 참조하여 설명하면, 일관되게 IFITC-Z-MSN을 혈청이 풍부한 PBS용액(50% FBS)에 분산시켰을 때, 8시간까지 초기 PL방출 강도가 약간 감소하는 것에 그쳐 혈청 단백질과 항체가 존재하더라도 견고한 항체 고정화를 보였다.
I-Z-MSN과 혈청 단백질 사이에 계면상호작용을 추가로 조사하였다. 50% FBS로 8시간동안 배양한 입자는 입자에 붙어있지 않은 유리 혈청 단백질을 제거하기 위해 원심 분리에 의한 정제 후, SDS-PAGE 분석 통해 분리한 단백질의 순도 및 분자량을 분석하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 혈청 알부민에 해당되는 ~67Kd의 단백질 밴드는 GSH-MSN 대조군에 비해 굉장히 낮은 강도(~4배 낮은 강도)로 검출되었다. 항체와 결합하기 전인 Z-MSN은 I-Z-MSN과 유사한 단백질 강도를 보였다. 이러한 경향은 GST-ABD로 코팅된 입자 표면에 대한 혈청 단백질의 흡착이 크게 감소하였음을 명확히 했으며, 이는 단백질 코로나 외층으로서 GST-ABD로 사전 코팅된 나노 파티클에 대한 이전에 보고된 관찰과 유사하다.
도 8은 일 구체예에 따른 나노 파티클의 GST-ABD 단백질의 표면 밀도별 항체와 결합한 구조의 I-Z-MSN, I-Z-MSN40, 및 I-Z-MSN10을 나타낸 그림이다.
도 9는 일 구체예에 따른 나노 파티클의 GST-ABD 단백질의 표면 밀도별 항체와 결합한 구조의 I-Z-MSN, I-Z-MSN40, 및 I-Z-MSN10이 결합한 IgG의 양을 나타낸 그래프이다.
도 10은 일 구체예에 따른 나노 파티클의 GST-ABD 단백질의 표면 밀도별 항체와 결합한 구조의 I-Z-MSN, I-Z-MSN40, 및 I-Z-MSN10의IFITC의 PL의 방출양을 시간의 흐름에 따라 나타낸 그래프이다.
도 11은 일 구체예에 따른 고농도의 혈청 조건에서 나노 파티클의 GST-ABD 단백질의 표면에 항체와 결합한 구조인 I-Z-MSN의IFITC의 PL의 방출양을 시간의 흐름에 따라 나타낸 그래프이다.
도 12는 일 구체예에 따른 GSH-MSN, Z-MSN, 및 I-Z-MSN이 고농도의 혈청 조건에서 입자가 흡수한 단백질의 종류 및 세기를 SDS-PAGE를 통해 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
상기 결과는 단백질이 풍부한 세포 환경에서 표적 전달을 위한 항체 플러그 가능 플랫폼으로 Z-MSN의 충분한 견고성을 입증하였다.
실시예 3. 향상된 약물 전달을 위해 항체와 특이적인 Z 도메인 기능화된 다공성 실리카 나노 파티클의 세포 흡수
항체가 있는 Z-MSN의 세포 표적화 행동과 그에 따른 치료 성능을 실험관 내에서 입증하기 위해 주변 혈청 농도에 관계없이 표면에 노출되어 있는 표적 항체에 의해 효율적인 세포 침입을 거치는지 여부를 확인하였다.
인간 유방암 세포 MDA-MB-468세포를 이용하여 혈청 조건이 서로 다른 상황에서 세포 흡수 효율을 평가하였다. 혈청이 풍부한 생물학적 환경에서 파티클의 표적화 능력에 초점을 맞추기 위해 다른 인간의 암세포 세포주인 SK-BR-3을 사용하고 표면 수용체 항체로 HER2(H-Z-MSN)을 이용하여 50% 혈청조건으로 동일한 실험을 진행하였다. 그 모식도를 도 13에 나타내었다.
나노파티클의 세포 표적화능을 평가하기 위해 형광 염료인 DiI를 파티클 구멍에 로드한 후, MDA-MB-468 세포막에 과발현된 표피성장인자 수용체(EGFR)의 항체를 부착했고, 세포 입자의 공초점 형광 이미지 촬영을 했다. Z-MSN에 EGFR과 HER2 항체를 동시에 부착함으로써 이중 표적화하여 동일한 실험을 반복하였고, 그 결과 각각 도 14및 도 18에 나타내었다. 스케일 바는 10nm이다.
도 14및 도 18에 나타낸 바와 같이, 세포는 표피성장인자수용체(EGFR)의 항체와 DiI가 로드된 Z-MSN의 존재하에서 10% 또는 50%의 FBS에서 3시간 동안 배양되었다. E-Z-MSN을 가진 세포는 두 농도의 FBS 모두에서 세포질 영역에서 DiI의 밝은 형광 신호를 방출했지만, 그러한 신호는 표적화 하지 않은 Z-MSN과 함께 배양된 세포에서는 검출되지 않았다. MDA-MB-468세포에서 관찰된 바와 같이, SK-BR-3 세포에서도 H-Z-MSN으로 처리한 후 강한 형광을 방출하였다. 또한, MDA-MB-468 표적하는 E-Z-MSN을 처리한 후, SK-BR-3세포에서 형광이 검출되지 않으며, 그 반대의 경우도 형광이 검출되지 않았는바, 이는 선택된 항체에 따른 파티클의 우수한 세포 선택 표적화 활성을 뒷받침한다. 이러한 결과는 Z-MSN이 세포 생체 고분자에도 불구하고 표면에 항체의 결합을 안정적으로 유지하는 것을 검증하며, 성공적으로 표적 세포 안으로 파티클의 침입을 유도함을 알 수 있다.
세포 내로 약물이 유입되는지 여부를 함께 확인하기 위해서, Dil을 담지한 나노파티클을 사용하였다. SK-BR-3 세포 및 MDA-MB-468 세포를 1×106 세포/웰의 밀도로 6 웰 플레이트에 접종한 다음, 37℃에서 24 시간 동안 세포를 배양하였다. 그런 다음, Dil을 담지한 나노파티클을 세포에 처리하고 배양하였다. 이 때 Dil의 최종 농도는 0.20 ㎍/㎖가 되도록 처리하였다. 세포를 배양한 후, 각각의 세포에 트립신을 처리하여 세포를 수득한 다음, PBS로 세척 및 재현탁하여 이를 BD-FACS Caliber가 장착된 유세포 분석기에 주입시켜 세포 내의 Dil 염료의 발색 정도를 확인하였다. 이 때의 세포 내 리소좀은 리스트래커 그린(Lysotracker green FM DND-26, Invitrogen)을 사용하여 염색하였다. Dil 염료의 형광 발색을 확인하기 위해 최소 10,000 세포를 유세포분석기에 주입하여 분석하였고, 수득한 결과는 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였으며, 그 결과는 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 유세포 분석에서도 Z-MSN과 함께 배양된 세포와 달리 E-Z-MSN과 함께 배양된 세포에서 급격한 DiI-형광을 나타나는 세포의 급격한 증가를 보였다. 이러한 결과는 높은 혈청 농도에서도E-Z-MSN에서 향상된 세포 침입은 파티클의 표면의 EGFR항체가 초기에 세포를 표적하기 위해 부착되었을 때와 같이 매우 안정적으로 유지됨을 의미한다.
나노파티클의 치료용 성능은 항암제인 캄토테신(CPT)를 구멍(입자 질량에 대하여 = 32 중량%)안으로 미리 로드시켜 확인하였다. 다양한 농도(0 내지 4 μg/mL CPT)의 입자로 세포를 24시간 배양한 후 MTT분석을 사용하여 세포 생존성을 평가하였다. Z-MSN에 EGFR과 HER2 항체를 동시에 부착함으로써 이중 표적화하여 동일한 실험을 반복하였고, 그 결과 각각 도 16 및 도 19에 나타내었다.
도 16 및 도 19에 나타낸 바와 같이, 항암제인 캄토테신(CPT)를 로드하지 않은 모든 Z-MSN은 모든 농도에서 세포에 독성이 없는 것으로 나타났으며, 이는 약물 전달체의 수단으로 생체적합성이 높다는 것을 나타낸다. 항암제 CPT를 로드한 Z-MSN은 세포생존력이 다소 줄어들었는데, 이는 파티클의 세포 흡수 후에 CPT의 세포간 방출에 의한 것이다. 더욱 중요한 것은, CPT를 실은 E-Z-MSN 또는 H-Z-MSN이 비표적 Z-MSN에 비해 농도 의존적으로 상당한 세포사를 유발했다. 구체적으로, E-Z-MSN은 MDA-MB-468세포의 생존율이 50%까지 떨어뜨렸으며, 이는 비표적 Z-MSN이 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 ~82% 생존율을 보이는 것과 대비된다. 이는 E-Z-MSN의 매우 향상된 세포 흡수에 기인한 것이다. H-Z-MSN과 함께 처리된 SK-BR-3 세포의 세포독성 실험에서도 동일한 경향이 관찰되었으며(도 19), 이는 효과적인 암치료를 위해 모든 항체와 함께 작동할 수 있는 범용 표적 전달 플랫폼으로 Z-MSN의 큰 가능성을 시사하는 것이다.
범용 표적 전달 플랫폼은 위에서 설명한 것과 동일 절차를 거쳐 Z-MSN에 EGFR과 HER2 항체를 동시에 부착함으로써 이중 표적화 시스템으로도 기능할 수 있도록 설계하였다. 그 모식도를 도 17에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 두 항체를 모두 부착한 EH-Z-MSN은 MDA-MB-468과 SK-BR-3 모두에 세포 내부화의 명백한 징후를 보였다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 로드된 항암제 CPT와 함께 각 세포 샘플에서 감소된 세포 생존력이 관찰되어, 두 개의 서로 다른 항체를 모두 결합한 단일 Z-MSN이 표적 세포를 선택적으로 인식할 수 있음을 확인하였다.
도 13은 일 구체예에 따른 사람 유방암 세포(MDA-MB-468, SK-BR-3)를 표적화하는 항체(EGFR, HER2)를 나노 파티클에 결합한 Z-MSN(E-Z-MSN, H-Z-MSN)의 모식도이다.
도 14는 일 구체예에 따른 Z-MSN, H-Z-MSN, 및 E-Z-MSN의 각각 유방암 세포 MDA-MB-468, SK-BR-3에 대한 표적화 여부를 형광현미경을 통해 확인한 사진이다.
도 15는 일 구체예에 따른 Z-MSN, 및 E-Z-MSN의 나노 파티클와 유방암 세포 MDA-MB-468을 공동 배양한 후 유세포분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 일 구체예에 따른 Z-MSN, 및 E-Z-MSN의 유방암 세포 MDA-MB-468에 대한 MTT 세포독성 분석 결과와 Z-MSN, 및 H-Z-MSN의 유방암 세포 SK-BR-3에 대한 MTT 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 일 구체예에 따른 하나의 나노 파티클 Z-MSN에 서로 다른 종류의 항체 EGFR, HER2를 결합한 이중 표적화 나노 파티클 EH-Z-MSN의 모식도이다.
도 18은 일 구체예에 따른 이중 표적화 나노 파티클 EH-Z-MSN의 각각 유방암 세포 MDA-MB-468, SK-BR-3에 대한 표적화 여부를 형광현미경을 통해 확인한 사진이다.
도 19는 일 구체예에 따른 이중 표적화 나노 파티클 EH-Z-MSN의 유방암 세포 MDA-MB-468 및 SK-BR-3에 대한 MTT 세포 독성 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
실시예 4. 항체가 부착된 Z 도메인 기능화된 다공성 실리카 나노파티클의 향상된 종양의 축적
약물 전달 시스템의 표적화 효율성의 인비보(in vivo) 평가는 누드 마우스에 SK-BR-3을 이종 이식하여 확인하였다. 마우스의 종양에 응집되어 있는 파티클을 형광 이미징하기 위해, Z-MSN 또는 H-Z-MSN을 원적색 형광 염료 DiD로 로딩하고 마우스내 정맥주사하였다(n=3). 나노 파티클이 EPR효과에 의해 결함이 있는 종양 혈관을 통과할 수 있기 때문에, 표적화 하지 않은Z-MSN처리군은 종양부위에서 형광 신호가 검출되는 반면 대조군으로 유리 DiD를 받지 않은 군에서는 종양 형광이 관찰되지 않는다. 시간대 별로 종양 형광을 관찰한 인비보(in vivo)사진을 도 20에 엑스 비보(ex vivo)사진을 도 21에 나타내었으며, 인비보의 형광세기를 측정한 그래프를 도 22 및 도 23에 나타내었다.
도 20에 나타낸 바와 같이, H-Z-MSN 처리군의 종양부위에서 뚜렷한 DiD 형광 방출을 볼 수 있었으며, 시간이 지남에 따라 그 강도는 점차 증가하였다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 마우스에서 추출한 장기 및 종양의 생체 외(ex vivo) 이미지에서, H-Z-MSN을 사용한 종양으로부터 다시 높은 형광 강도가 검출된 방면, 망상내피장기(reticuloendothelial organ)로부터 형광 방출은 상당히 약하거나 검출할 수 없었다. 유리 DiD 또는 비표적화 Z-MSN이 주입된 마우스의 경우, 비 종양 부위(예를 들어, 간, 비장 및 폐)에서 더 높은 형광 강도가 관찰되었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 관찰 기간(24h)동안 종양 형광 신호는 Z-MSN을 처리한 마우스 집단보다 지속적으로 더욱 강한(2배 이상)것으로 관찰되었다.
도 20은 일 구체예에 따른 유방암 세포SK-BR-3를 주입한 종양 마우스에 Z-MSN과 H-Z-MSN을 정맥 주사로 주입한 후 시간의 흐름에 따라 약물의 형광도를 나타낸 사진이다.
도 21은 일 구체예에 따른 유방암 세포SK-BR-3를 주입한 종양 마우스에 Z-MSN과 H-Z-MSN을 정맥 주사로 주입한 24시간 후, 장기와 종양에서 약물의 형광도를 나타낸 사진이다.
도 22는 일 구체예에 따른 유방암 세포SK-BR-3를 주입한 종양 마우스에 Z-MSN과 H-Z-MSN을 정맥 주사로 주입한 후 시간의 흐름에 따라 약물의 형광 발현 정도를 측정한 그래프이다.
도 23은 일 구체예에 따른 유방암 세포SK-BR-3를 주입한 종양 마우스에 Z-MSN과 H-Z-MSN을 정맥 주사로 주입한 24시간 후, 장기와 종양에서 약물의 형광 발현 정도를 측정한 그래프이다.
이러한 결과는 항체가 결합된 Z-MSN이 전신 투여 동안 나노 파티클의 표면인 Z도메인에 결합하는 항체를 안정하게 보존할 수 있고, 표면에 존재하는 항체에 의해 지시된 바와 같이 표적 종양에 쉽게 도달할 수 있으며, 시험관 내(in vitro) 연구의 결과와 일관성 있는 결과를 가질 수 있음을 증명한다. 이러한 결과로 종합하면, 본원 발명의 약물 전달체 시스템은 자발적인 항체-단백질 상호작용을 포함하는 용이한 과정에 의해 제조될 수 있고, 항체-나노 파티클 결합의 결과 안정성이 표적 약물전달 및 치료효과를 향상시키기 위해 유용하게 활용될 수 있음을 입증한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (29)

  1. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST);
    표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인; 및
    상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인을 연결하는 링커를 포함하는 융합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인은 단백질 A의 면역 글로불린 결합성 도메인인 것인 융합 단백질.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 단백질 A의 면역 글로불린 결합성 도메인은 E, D, A, B, C 또는 Z 도메인인 것인 융합 단백질.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인은 항체 또는 항체 유사체의 Fc 부위와 결합하는 것인 융합 단백질.
  5. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST);
    표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인;
    상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인을 연결하는 링커; 및
    상기 글루타치온-S-전이효소와 약물을 담지하는 입자가 결합된 것을 포함하는 약물 전달체.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인은 단백질 A의 면역 글로불린 결합성 도메인인 것인 약물 전달체.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 단백질 A의 면역 글로불린 결합성 도메인은 E, D, A, B, C 또는 Z 도메인인 것인 융합 단백질.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인은 항체 또는 항체 유사체의 Fc 부위와 결합하는 것인 약물 전달체.
  9. 청구항 5에 있어서, 상기 글루타치온-S-전이효소와 상기 입자의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것인 약물 전달체.
  10. 청구항 5에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인과 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편은 비공유결합으로 연결되는 것인 약물 전달체.
  11. 청구항 5에 있어서, 상기 표적 단백질은 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases, RTKs) 또는 종양 관련 항원(Tumor-associated antigen, TAA)이거나, 상기 표적 세포는 종양 관련 항원(Tumor-associated antigen, TAA)을 발현하는 세포인 것인 약물 전달체.
  12. 청구항 5에 있어서, 상기 약물 전달체는 서로 다른 종류의 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 2이상의 항체 또는 항원 결합 단편을 동시에 포함하는 약물 전달체.
  13. 청구항 5에 있어서, 상기 약물 전달체는 EGFR과 HER2의 항체 또는 항원 결합 단편을 동시에 포함하는 약물 전달체.
  14. 청구항 5에 있어서, 상기 입자는 다공성 실리카 나노파티클(mesoporous silica nanoparticle, MSN), 골드 나노파티클(gold nanoparticle), 마그네틱 나노파티클(magnetic nanoparticle), 핵산-금속유기 금속체 나노파티클(Nucleic acid-Metal Organic Framework nanoparticle) 및 중합체 나노파티클(polymer nanoparticle)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 약물 전달체.
  15. 청구항 5에 있어서, 상기 입자의 직경이 10 내지 250nm인 것인 약물 전달체.
  16. 청구항 5에 있어서, 상기 입자에 항암제가 담지된 것인 약물 전달체.
  17. 청구항 5에 있어서, 상기 약물 전달체의 표면전하가 -30 내지 -1mV인 것인, 약물 전달체.
  18. 청구항 5에 있어서, 상기 약물 전달체는 pH 5.0 내지 pH 7.4의 범위에서 약물이 해리되는 것인 약물 전달체.
  19. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST);
    표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인;
    상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인을 연결하는 링커; 및
    상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 항암제를 담지하는 입자가 결합된 것을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인은 단백질 A의 면역 글로불린 결합성 도메인인 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 단백질 A의 면역 글로불린 결합성 도메인은 E, D, A, B, C 또는 Z 도메인인 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인은 항체 또는 항체 유사체의 Fc 부위와 결합하는 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  23. 청구항 19에 있어서, 상기 글루타치온-S-전이효소와 입자의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  24. 청구항 19에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 부위를 포함하는 도메인과 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편은 비공유결합으로 연결되는 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  25. 청구항 19에 있어서, 상기 표적 단백질은 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases, RTKs) 또는 종양 관련 항원(Tumor-associated antigen, TAA)이거나, 상기 표적 세포는 종양 관련 항원(Tumor-associated antigen, TAA)을 발현하는 세포인 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  26. 청구항 19에 있어서, 상기 약물 전달체는 서로 다른 종류의 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 2이상의 항체 또는 항원 결합 단편을 동시에 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  27. 청구항 19에 있어서, 상기 약물 전달체는 EGFR과 HER2의 항체 또는 항원 결합 단편을 동시에 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  28. 청구항 19에 있어서, 상기 입자는 다공성 실리카 나노파티클(mesoporous silica nanoparticle, MSN), 골드 나노파티클(gold nanoparticle), 마그네틱 나노파티클(magnetic nanoparticle), 핵산-금속유기 금속체 나노파티클(Nucleic acid-Metal Organic Framework nanoparticle) 및 중합체 나노파티클(polymer nanoparticle)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  29. 청구항 19에 있어서, 상기 항암제는 캄토테신(camptothecin), 독소루비신 (doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 베라파밀(Verapamil), 플루오로우라실 (fluorouracil), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 다우노루비신(Daunorubicin), 이리노테칸 (irinotecan), 토포테칸(topotecan), 파클리탁셀(paclitaxel), 카보플라틴(carboplatin), 젬시타빈(Gemcitabine), 메소트렉세이트(Methotrexalte), 도세탁셀(Docetaxel) 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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