KR20190113886A - 바이러스 또는 vlp의 재표적화 - Google Patents

바이러스 또는 vlp의 재표적화 Download PDF

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KR20190113886A
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옌스 그루버
슈테판 슈나이더
엘렌 에커만-펠클
알리나 모스블레히
아른트 슈토이어나겔
데니스 베게너
율리안 플라가
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도이체스 프리마텐첸트룸 게엠베하(데페체트)-라이프니츠-인스티투트 퓌어 프리마텐포르슝
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Abstract

본 발명은 관심있는 세포에 결합하는 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 바이러스-유사 입자(VLP)를 생성하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를, (i) 적어도 하나의 표적화 분자가, 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화된, 표적화 분자와 접촉시키거나; (ii) 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화된, 제1 상호 작용 분자; 및 제1 상호 작용 분자와 상호 작용할 수 있는 제2 상호 작용 분자에 접합된, 적어도 하나의 표적화 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 관심있는 세포에 결합하는 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 바이러스-유사 입자(VLP)뿐만 아니라 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를 포함하는 조성물, 및 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP, 또는 본 발명의 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

바이러스 또는 VLP의 재표적화
본 발명은 관심있는 세포에 결합하는 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 바이러스-유사 입자(VLP)를 생성하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를, (i) 적어도 하나의 표적화 분자가, 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화된, 표적화 분자와 접촉시키거나; (ii) 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화된, 제1 상호 작용 분자; 및 제1 상호 작용 분자와 상호 작용할 수 있는 제2 상호 작용 분자에 접합된, 적어도 하나의 표적화 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 관심있는 세포에 결합하는 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 바이러스-유사 입자(VLP)뿐만 아니라 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를 포함하는 조성물, 및 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP, 또는 본 발명의 조성물을 포함하는, 키트에 관한 것이다.
본 명세서에서, 특허 출원 및 제조업체의 매뉴얼을 포함하는 다수의 문서가 인용된다. 이들 문서의 개시는, 본 발명의 특허성과 관련된 것으로 간주되지 않지만, 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 더욱 구체적으로, 모든 참고 문서는 각각의 개별 문서가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되어 있는 것과 같이 그와 동일한 정도로 참고로 포함된다.
바이러스 벡터 기반 유전자 요법은 수많은 유전자 질병에 대한 치료제로서의 역할을 할 가능성이 있다. CRISPR/Cas9 게놈 편집 시스템, 유전자 대체 또는 RNA 간섭 요법을 포함한 다양한 치료 도구의 진행 중인 개발과 관련하여, 바이러스 벡터는 다시 한번 유전자 연구의 중심에 있다[1 내지 5]. 그러나, 높은 벡터 생성 비용, 요망되는 세포 유형의 특이적 표적화 및 이에 따른 비표적화된 세포에 대한 피해 방지, 및 표적 세포 내로의 유전 물질의 효율적인 혼입을 포함하는, 임상적 사용을 위한 바이러스 벡터의 한계가 존재한다[6]. 이러한 애로 사항의 대부분은 비바이러스성 전달 도구, 특히 약물 및 유전자 전달을 위한 급속히 확장되는 나노 입자 분야에 대해서도 마찬가지이다[7].
요망되는 세포 유형의 특이적 표적화는 바이러스 향성(tropism)이 세포 유형에 대한 감수성과 일치할 때만 달성될 수 있다. 예를 들어, JC 폴리오마 바이러스(JCV)는 락토시리즈 사당류 c(LSTc) 글리칸 상의 세포 표면 노출된 α2,6-결합 시알산과 조합하여 5-HT2 세로토닌 수용체를 함유하는 표적 세포를 감염시키는 것으로 기술되었으며, 이는 JCV의 자연적 향성을 규정한다[8 내지 11]. JCV의 향성은 성숙한 캡시드의 외부 표면에 위치한 주요 캡시드 단백질 VP1 내의 몇몇 유연한 루프에 의해 규정된다. 이들 루프는 표적 세포의 표면 상에서의 LSTc 결합을 담당하는 것으로 기술되었다[10]. 제2 단계에서, 5-HT2 세로토닌 수용체가 보충되어, 클라트린(clathrin)-의존성 과정으로 바이러스 진입을 촉진시킨다.
밀접하게 관련된 BK 폴리오마 바이러스(BKV) 및 폴리오마 바이러스 시미안 바이러스(SV40)는 표적 세포 인식 및 감염의 유사하지만 구별되는 특징을 보여준다. BKV 및 SV40은 상이한 다른 α2,3- 및 α2,8-결합 시알산 함유 강글리오사이드를 초기 세포-표면 마커로 사용한다: 예를 들어, BKV는 GD2, GD3, GD1b 및 GT1b를 인식하는 한편, SV40은 GM1을 인식한다[10, 12, 13]. 바이러스가 표적 세포를 검출하고 그의 특정 강글리오사이드 또는 LSTc를 통해 접촉을 확립하면, 세포 진입이 발생하는 한편, JCV, BKV 및 SV40은 상이한 경로를 사용한다. BKV와 SV40은 소포(caveolae)-매개 메커니즘에 의해 세포에 진입하는 반면, JCV는 클라트린-의존성 세포내이입을 필요로 한다[14]. 강글리오사이드 인식에 있어서 차이점들의 조합이 이들 바이러스의 상이한 세포 진입 메카니즘의 기초이며 상이한 세포 유형에 대한 그들의 향성을 추가로 결정하는 것으로 추정되었다.
유전 물질을 요법 관련 세포 내로 안전하고 특이적으로 전달하기 위한 목적으로, 유전자 요법을 위해 자연적 바이러스 향성을 변경하기 위한 수많은 연구가 수행되었다. 일반적으로 이러한 재표적화 접근법은 표적-단백질을 바이러스의 외피 내로 혼입시키는 것에 기초하거나 표적-단백질을 바이러스-캡시드 상으로 직접 융합시킴으로써 이루어진다[6].
뮤린 폴리오마 바이러스(MuPyV)의 밀접하게 관련된 VP1을 사용하여, 예를 들어, 항체-결합 모티프(z-단백질)를 사용한 이들 루프 중 하나(HI-Loop)의 변형이 바이러스 향성을 변경시키는 플랫폼으로 작용할 수 있다는 것이 입증되었다[15]. 이 접근법에 기초하여, 인간화된 항체 헤르셉틴(herceptin)을 VLP 표면 상으로 융합시켜, 이를 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2/neu) 양성 세포에 대해 재표적화하는 것이 가능했다[16].
다른 폴리오마 바이러스에 대해서도 재표적화 접근법이 기술되었다. 예를 들어, 폴리오마 바이러스 시미안 바이러스 40(SV40)의 경우, 화학적 가교제(SM [PEG])2를 이용하는 한 가지 재표적화 접근법이 기술되었다. 이를 위해, 시스테인 잔기가 바이러스 캡시드의 외부 표면 상에 도입되었고, 이 잔기는 인간 상피 성장 인자를 VLP 상으로 화학적으로 가교시키기 위해 사용되었다. 이러한 재표적화된 VLP로, 저자들는 A431 세포를 형질도입시키는 데 성공했다[17].
향성을 변경하는 다른 가능한 방식은 비-폴리오마 바이러스 HPV16으로부터 유래된 VLP에 대해 기술되었고[18], 이는 HPV16 L1 캡시드 단백질에서의 바이오티닐화 부위의 도입에 기초한다. 그러나, 바이러스 캡시드 내로의 바이오티닐화 서열의 도입은 바이러스 캡시드의 유의한 변화를 나타낸다. 더욱이, VLP의 바이오티닐화는, 인큐베이션 후에 제거되어야 할 다른 효소인 바이오틴-리가제와의 인큐베이션을 필요로 하고, 이에 따라 추가의 준비 단계의 도입을 필요로 한다.
바이러스 벡터를 특정 표적 세포로 재표적화하는 이러한 현재 이용 가능한 방법들의 한 가지 주요 단점은 이들 방법 모두가, 전형적으로 항체 또는 펩티드 리간드의 혼입 또는 부착을 통해, 바이러스 또는 VLP의 직접적인 변형을 필요로 한다는 것이다. 대부분의 경우, 이러한 변형은 공유결합적 변형이다. 이러한 재표적화 바이러스 벡터의 제조는 종종 적절한 링커의 확인뿐만 아니라 복잡한 정제 과정에 대한 요건과 같은 다양한 문제를 동반하는데, 이러한 문제는 종종 인간에서의 사용에 대한 실용성과 적합성을 제한하는 여러 정제 단계를 수반한다.
더욱이, 상이한 폴리오마 바이러스에 대한 많은 시도가 기술되어 있지만[15, 19, 20], 오히려 큰 단백질을 이용한 이러한 직접적인 변형은 적절한 바이러스 캡시드 조립, 형질도입 효율 및 안정성에 관한 문제와 관련된 채로 남아있다.
EP1270586 A2에서, 표적 세포-특이적 리간드에 대한 앵커링 분자로서 양이온성 중합체의 사용에 기초한 VLP의 재표적화에 대한 접근법이 기술되었다. 적합한 양이온성 중합체로서, 아미노산-기반 중합체(예를 들어, 폴리-라이신) 또는 폴리-알킬렌-이민(예를 들어, 폴리에틸렌이민)이 JCV VP1 VLP에 결합하는 상호 작용 파트너로서 기재되어 있다. 이어서, 표적 세포-특이적 리간드가 양이온성 중합체에 결합된다. 중요하게는, 상기 양이온성 중합체와 VLP 표면의 상호 작용은 특이적인 상호 작용도 제어되는 상호 작용도 아니며, VLP와 양이온성 중합체의 상이한 전하에만 의존한다.
따라서, 특정 세포의 표적화된 트랜스펙션을 위한 적합한 벡터 시스템의 개발에 많은 노력을 현재 기울이고 있다는 사실에도 불구하고, 이들 시스템은 전형적으로 복잡한 취급 및 비용- 및 시간-소모적 제조 공정뿐만 아니라 조립, 효율성 및 안정성 또는 특이성의 결여와 관련된 잠재적 문제를 겪고 있다. 따라서, 간단하고 효율적인 방식으로 특정 세포에 표적화될 수 있고, 바이러스 캡시드 조립, 형질도입 효율 및 안정성에 미치는 영향이 가능한 한 작은 재표적화 분자에 기초한, 바이러스 벡터를 제조하기 위한 신규한 접근법을 여전히 제공할 필요가 있다. 이러한 방법은 가치 있는 연구 및 치료 도구를 나타내며 해당 분야에 엄청난 가치를 제공할 것이다.
이러한 필요는 청구범위에서 특징 지어지는 구현예들의 제공에 의해 다루어진다.
따라서, 본 발명은 관심있는 세포에 결합하는 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 바이러스-유사 입자(VLP)를 생성하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를, (i) 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화된, 적어도 하나의 표적화 분자와 접촉시키거나; (ii) 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화된, 제1 상호 작용 분자; 및 제1 상호 작용 분자와 상호 작용할 수 있는 제2 상호 작용 분자에 접합된, 적어도 하나의 표적화 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다.
폴리오마 바이러스는 천연 숙주가 주로 포유류 및 조류인 바이러스의 패밀리이다. 이들은 직경이 약 40 내지 50 나노미터인 정이십면체 바이러스 캡시드에 패키징된 원형 게놈을 갖는 외피가 없는 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 상기 캡시드는 VP1 단백질의 72개의 오량체로 이루어지며, VP1의 각 분자는 VP2 또는 VP3 중 하나의 분자와 관련된다. 현재, 이 패밀리에는 76개의 인식된 종이 존재한다. 폴리오마 바이러스의 비제한적인 예는, 예를 들어, 다음과 같은 인간 폴리오마 바이러스를 포함한다: BK 폴리오마 바이러스, JC 폴리오마 바이러스, 메르켈(Merkel) 세포 폴리오마 바이러스, 트리코디스플라시아 스피눌로사(trichodysplasia spinulosa) 폴리오마 바이러스, 인간 폴리오마 바이러스 9, 인간 폴리오마 바이러스 12, 뉴저지 폴리오마 바이러스, KI 폴리오마 바이러스, WU 폴리오마 바이러스, 인간 폴리오마 바이러스 6, 인간 폴리오마 바이러스 7, MW 폴리오마 바이러스 및 STL 폴리오마 바이러스. 폴리오마 바이러스의 다른 두드러진 예는 SV40이며, 이는 원숭이와 인간 모두에서 발견되는 폴리오마 바이러스인 시미안 바쿨로에이팅 바이러스(Simian vacuolating virus) 40 또는 시미안 바이러스 40을 지칭한다.
많은 폴리오마 바이러스는 전형적으로 연구된 대부분의 인간 집단에서 무증상이다. 그러나, 일부 폴리오마 바이러스는, 특히 면역-손상 개체에서, 인간 질병과 관련된다. 예를 들어, BK 바이러스는 신장 이식 및 비-신장 고형 장기 이식 환자에서 신장병증과 관련되고, JC 바이러스는 진행성 다초점 백혈병증과 관련되고, 메르켈 세포 바이러스는 메르켈 세포 암과 관련된다.
바이러스-유사 입자는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Tegerstedt et al.]에 기재되어 있다[21]. VLP의 한 가지 주요 이점은 약독화 생 바이러스가 바이러스 벡터로 사용될 때 가능한 바와 같은 임의의 재조립 위험과 관련이 없다는 것이다. VLP 생성은 관심있는 특정 바이러스 균주의 유전자 서열이 이용 가능해지게 되면 전통적인 백신의 생성보다 먼저 시작될 수 있다는 추가의 이점을 갖는다.
사용된 단백질에 따라, 대부분의 VLP는 각각의 바이러스 구조 단백질, 예를 들어, 외피의 구조 단백질 또는 캡시드 내의 구조 단백질의 발현시에 자가 조립될 수 있다. 예를 들어, JCV로부터 수득된 VLP의 경우, 이러한 VLP는 주요 캡시드 단백질 VP1의 발현시에만 자발적으로 형성된다는 것이 당업계에 잘 알려져 있다. VP1의 적합한 서열뿐만 아니라 VLP 형성을 용이하게 하기 위한 적절한 조건은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1997)] 및 문헌[Goldmann et al. (1999)]에 기재되어 있다[22, 23]. VLP로 자가 조립되는 고유 특성을 갖지 않는 캡시드 단백질이 사용되는 경우, 예를 들어, 바이러스 단백질 VP2, VP3뿐만 아니라 핵 세포 추출물과 같은 추가의 보조 인자가 다른 해리 조건 하에서의 VLP 로의 조립을 달성하기 위해 첨가될 수 있으며, 이는 SV 40에 대해 기술된 바와 같다[24]. 바람직하게는, VLP는 생체내 및/또는 시험관내에서 적합한 조건 하에 자가 조립되는 고유 특성을 갖는 단백질로 이루어져, VLP의 형성에 추가의 보조 인자가 필요하지 않다.
본 발명에 따르면, VLP는 폴리오마 바이러스로부터 유래된다. 이와 관련하여 사용된 바와 같은 용어 "유래된"은 VLP가 폴리오마 바이러스 단백질인 바이러스 단백질, 예컨대 폴리오마 바이러스의 캡시드 단백질 VP1, 예를 들어, 인간 폴리오마 JC 바이러스의 캡시드 단백질 VP1로 조립됨을 의미한다.
VLP는 한 유형의 단백질 또는 여러 다른 유형의 단백질로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, VLP는 한 유형의 단백질, 바람직하게는 한 유형의 캡시드 단백질로 이루어진다.
폴리오마 바이러스-유래 VLP는 바이러스로부터 수득될 수 있지만, 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 재조합적으로 또한 생성될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 재조합적 생성은 포유류 세포주, 곤충 세포주, 효모, 원핵 생물 및 식물 세포를 포함하는 다양한 세포 배양 시스템에서 수행될 수 있다.
지금까지, 폴리오마 바이러스 바이러스, 파보비리대(예를 들어, 아데노-관련 바이러스), 레트로 비리대(예를 들어, HIV), 및 플라비비리대(예를 들어, C형 간염 바이러스)를 포함하는 상이한 바이러스 패밀리로부터의 VLP가 생성되었다. 선택된 숙주/벡터 시스템에 따라, 재조합 VLP의 분리는 숙주 세포로부터뿐만 아니라 세포 배양 상층액으로부터 직접 일어날 수 있다. 재조합적으로 VLP를 제조하는 것의 한 가지 이점은 이러한 VLP가 고순도로 그리고 대량으로 수득될 수 있다는 것이다. VP1의 재조합적 합성을 위해 일반적으로 사용되는 발현 시스템은 곤충 세포, 예를 들어 곤충 세포주 Sf 158, 및 바큘로바이러스를 사용함에 의한 VP1을 인코딩하는 DNA의 상기 세포로의 도입에 의존한다.
본 발명의 방법에 따르면, 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하는 바이러스 또는 VLP가 생성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표면 상에"는 표적화 분자가 바이러스 또는 VLP를 둘러싸는 환경에 노출되도록 위치하며, 즉, 표적화 분자가 바이러스 또는 VLP 입자의 외부에 위치한다는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, 용어 "표적화 분자"는 관심있는 모이어티, 예를 들어, 관심있는 세포 상의 (표면) 단백질과 상호 작용할 수 있는 분자를 지칭한다. 이러한 능력으로 인해, 표적화 분자는 바이러스 또는 VLP를 상기 관심있는 모이어티 및 이 모이어티가 존재하는 세포로 유도할 수 있으며, 즉, 표적화 분자는 바이러스 또는 VLP를 상기 세포로 "표적화"시킨다. 예를 들어, 특정 암 세포, 예를 들어, HER2/neu 양성 유방암세포 및 결장직장암세포가 관심있는 세포를 나타내는 경우, HER2/neu와 같은 상기 암세포의 표면 마커가 관심있는 모이어티로서 선택될 수 있다. 본 발명에 따르면, 표적화 분자는, 이하 본원에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 예를 들어, 항체, 리간드 등과 같은 상기 마커(예를 들어, HER2/neu)와 상호 작용할 수 있는 임의의 분자일 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "적어도 하나의 표적화 분자"는 하나 초과의 단일 표적화 분자가 존재할 수 있음을 의미한다. 이는 또한 하나 초과의 분자 유형의 표적화분자(즉, 상이한 유형의 표적화 분자)가 존재할 수 있음을 의미한다. 바꿔 말하면, 용어 "적어도 하나의 이상의 표적화 분자를 표면 상에 보유하는"은 표적화 분자 중 하나 초과의 분자가 존재함을 명시적으로 포함하고, 또한 하나 초과의 분자 유형의 표적화 분자(즉, 하나 초과의 표적화 분자(들))가 본 발명에 따라 존재할 수 있음을 명시적으로 포함한다.
본 발명에 따르면, 표적화 분자는 상기 관심있는 세포, 즉, "표적 세포"에 결합하는 분자이다. 바람직하게는, 표적화 분자는 상기 관심있는 세포에 특이적으로 결합하는 분자이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하는 분자"(본원에서 "특이적으로 상호 작용하는 분자"로도 지칭됨)는 관심있는 각각의 세포에 결합하지만 상이한 유형의 세포와는 교차 반응하지 않거나 본질적으로 교차 반응하지 않는 분자를 지칭한다. 이러한 특이성은 예를 들어 표적 세포에만 존재하고 다른 모든 세포에는 존재하지 않는 관심있는 모이어티를 선택함으로써 달성될 수 있다. 조사 중인 분자 패널의 교차 반응성은, 예를 들어, 통상적인 조건 하에서 상기 분자 패널의 관심있는 세포로뿐만 아니라 다수의 다소 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 밀접하게 관련된 세포로의 결합을 평가함으로써 시험될 수 있다. 관심있는 세포에 결합하지만 임의의 다른 세포에는 결합하지 않거나 본질적으로 결합하지 않는 분자만이 관심있는 세포에 대해 특이적인 것으로 간주된다.
바이러스 또는 VLP의 표면 상에 하나 초과의 분자 유형의 표적화 분자가 존재하는 경우, 상기 상이한 유형의 표적화 분자들은 모두 동일한 관심있는 세포에 대해 특이적인 것이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "본질적으로 교차 반응하지 않는 분자"는 상이한 세포에 대한 친화도보다 적어도 5배 높은 친화도로, 더욱 바람직하게는 적어도 10배 높은 친화도, 예를 들어, 적어도 50배 높은 친화도, 더욱 바람직하게는 적어도 100배 높은 친화도, 예를 들어, 적어도 250배 높은 친화도로 관심있는 세포, 즉, 표적 세포에 결합하는 분자를 지칭한다. 더욱더 바람직하게는, 본질적으로 교차 반응하지 않는 분자는 상이한 세포에 대한 친화도보다 적어도 500배 높은 친화도, 가장 바람직하게는 적어도 1.000배 높은 친화도로 관심있는 세포에 결합한다.
본 발명의 방법은 제1 대안(즉, 대안 (i))에서 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를 적어도 하나의 표적화 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 표적화 분자는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 당단백질 또는 당지질로 글리코실화된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "포함하는"은 언급된 구성 요소들 및/또는 단계들 이외에 추가의 구성 요소 및/또는 단계가 포함될 수 있음을 의미한다. 그러나, 이 용어는 또한 청구된 발명 대상이 정확히 언급된 구성 요소들 및/또는 단계들로 구성됨을 또한 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "접촉시키는" 및 "접촉하게 되는"은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 표적화 분자를, 예를 들어, 현탁액에서, 바이러스/VLP에 첨가하는 것과 같이, 바이러스/VLP를 표적화 분자와 접촉시키는 모든 수단을 포함한다. 표적화 분자가 바이러스/VLP와 접촉하게 되면, 비결합된 표적화 분자를 제거하기 위해 정제 단계가 포함된다는 것이 또한 본원에서 구상된다. 비결합된 표적화 분자의 제거를 수행하는 방법의 비제한적인 예는, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피이다.
본 발명에 따르면, 적어도 하나의 표적화 분자는 글리코실화된다. 이를 위해, 임의의 표적화 분자는 요망되는 글리코실 잔기로 직접 글리코실화될 수 있거나, 요망되는 글리코실 잔기를 포함하는 적어도 하나의 당단백질 또는 당지질과 융합될 수 있다. "글리코실 잔기"는, 적어도 하나의 표적화 분자가 결합될 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되도록 글리코실 잔기가 선택되는 한, 표적화 분자 또는 당단백질 또는 당지질과의 글리코시드 결합을 통해 안정적으로 연결된 임의의 글리코실기일 수 있다. 이와 관련하여, "인식되는"이라는 용어는 각각의 바이러스 또는 VLP가 상기 글리코실 잔기에 대해 자연적 향성을 가지며, 이에 따라 상기 글리코실 잔기를 인식하고 이에 결합한다는 것을 의미한다. 상기 글리코실 잔기가 이러한 하나의 바이러스/VLP에 의해서만 인식될 필요는 없으며; 대신에, 글리코실 잔기는 다양한 바이러스/VLP에 대한 향성을 매개할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 그러나, 하나의 특정 유형의 바이러스/VLP, 예를 들어, JCV에 의해서만 인식되며, 즉, 특이적으로 인식되고, 다른 바이러스, 예컨대 BK 바이러스 또는 SV40 에 의해서는 인식되지 않는 글리코실 잔기가 선택되는 것이 또한 구상된다. 하나 초과의 유형의 표적화 분자가 사용되는 경우, 모든 표적화 분자가 동일한 글리코실 잔기로 글리코실화되는 것이 특히 바람직하다. 이는 본원에 기재된 바와 같은 직접 및 간접 글리코실화를 포함하는 동일하거나 상이한 글리코실화 수단에 의해 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 모든 상이한 유형의 표적화 분자는 동일한 글리코실화 방법을 통해 동일한 글리코실 잔기로 글리코실화된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "적어도", 예를 들어, 용어 "적어도 하나의 글리코실 잔기" 또는 "적어도 하나"는 구체적으로 언급된 수(즉, "하나")를 지칭하지만 또한 구체적으로 언급된 수를 초과하는 수를 지칭한다. 예를 들어, 용어 "적어도 하나의 글리코실 잔기"는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개의 상이한 글리코실 잔기 등을 또한 포함한다. 또한, 이 용어는 정확히 하나, 정확히 2개, 정확히 3개, 정확히 4개, 정확히 5개의 상이한 글리코실 잔기 등도 포함한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 바이러스는 특정 세포 유형에 대한 자연적 향성을 갖는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, JCV는 락토시리즈 사당류 c(LSTc) 글리칸 상의 세포 표면 노출된 α2,6-결합 시알산(SA)과 조합하여 5-HT2 세로토닌 수용체 패밀리 구성원을 함유하는 표적 세포를 감염시키는 것으로 기술되었으며, 이는 JCV의 자연적 향성을 규정한다[8 내지 11]. 추가로, JCV의 상이한 균주로부터 유래된 VLP는 LSTc뿐만 아니라 α2,3- α2,8- α2,6-SA를 함유하는 올리고당류을 갖는 상이한 당지질 및 당단백질과도 상호 작용하는 것으로 기술되었다. 예를 들어, 유전자형 3 균주(WT3)로부터 유래된 VLP는 α2,3- 및 α2,8-SA 아시알로-GM1, GM1, GM2, GD1a, GD1b, GD2, GT1a 및 GT1b를 갖는 강글리오사이드에 결합하는 것으로 밝혀졌다[25]. 또한, mad-1 균주 VLP는 강글리오사이드 GM3, GD2, GD3, GD1b, GT1b 및 GQ1b를 포함하는 α2,3- α2,8- 및 α2,6-SA에 결합하는 것으로 밝혀졌다[26].
유사한 관찰 결과가 BK 바이러스 또는 SV40과 같은 다른 폴리오마 바이러스에 대하여 공표되었다. 예를 들어, 분자 GD2, GD3, GD1b 및 GT1b는 상기 강글리오사이드를 표면 상에 보유하는 표적 세포에 대한 BK 바이러스의 자연적 향성을 매개하는 것으로 기술되었다. 그에 따라 인간 섬유모세포, 인간 상피 세포 및 인간 배아 신장 세포와 같은 세포 유형이 BK 바이러스에 대한 표적 세포일 수 있는 것으로 현재 간주된다[27]. 또한, 분자 GM1은 이 분자를 보유하는 세포에 대한 SV40 바이러스의 자연적 향성을 매개하는 것으로 기술되었다. 따라서, 인간 태아 및 신생아 조직과 같은 세포 유형이 SV40 바이러스에 대한 표적이 될 수 있다고 제안되었다[27].
따라서, 적어도 하나의 표적화 분자를 이러한 글리코실 잔기(들)로 글리코실화하면 상기 글리코실 잔기(들)에 대해 자연적 향성을 갖는 바이러스 또는 VLP로의 상기 표적화 분자(들)의 결합을 가능하게 한다. 글리코실 잔기와 VP1 사이의 상호 작용은 통상적으로 물 매개 수소 결합을 포함하는 직접 또는 간접적 수소 결합, 또는 VP1의 규정된 잔기와의 반데르발스 접촉으로서 형성되기 때문에, 글리코실 잔기(들)가 직접 또는 간접적 수소 결합 또는 반데르발스 접촉을 통한 바이러스 또는 VLP로의 상기 표적화 분자(들)의 결합을 가능하게 하는 것이 특히 바람직하다. 예를 들어, 표적화 분자를 LSTc로 글리코실화함으로써, 상호 작용이 LSTc의 말단 NeuNAc 및 이웃하는 Gal의 α2,6-시알산을 통해 일어난다[10].
결과적으로, 상기 표적화 분자는 표적화 분자(들)을 부착시키기 위해 바이러스 또는 VLP 표면의 공유결합적 변형을 위한 임의의 추가의 필요성없이 JCV에 의해 결합될 수 있다.
본 발명의 표적화 분자와 같은 관심있는 단백질을 글리코실 잔기로 글리코실화하는 수단 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 적절한 발현 시스템을 선택함으로써, 요망되는 글리코실화 패턴을 직접적으로 또는 당단백질 또는 당지질과의 융합을 통해 보유하는 재조합적으로 생성된 표적화 분자가 수득될 수 있다. 필요한 경우, 발현 시스템은, 예를 들어 재조합 생성에 사용되는 숙주 세포, 예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 포유류 세포의 유전자 변경에 의해 변형될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌[Ahmad et al. 2014]에 상세히 기술되어 있다[28]. 대안적으로, 관련 글리코실 잔기는, 예를 들어, NHS-말레이미드, 카르복실-아민 링커, 예를 들어, EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 화학적 링커를 사용함으로써, 확립된 가교 방법을 통해 표적화 분자(들)에 또한 부착될 수 있다. 또한, 이 부착은 표적화 분자(들)로의 글리코실 잔기의 직접적 부착일 수 있거나, 표적화 분자(들)로의 각각의 글리코실 잔기의 (간접적) 부착을 통해, 예를 들어, 각각의 글리코실 잔기를 포함하는 당단백질 또는 당지질을 사용하는 것을 통해 이루어질 수 있다. 적어도 하나의 표적화 분자가 탄수화물인 경우에도, 글리코실화는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 글리코실 잔기는 당 모이어티들 사이의 축합 반응에 의해 표적화 분자(들)에 첨가될 수 있다. 글리코실 잔기를 관심있는 적어도 하나의 표적화 분자에 (직접 또는 간접적으로) 부착시키는 추가의 수단 및 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Komagome et al.]에 기술되어 있다[26].
본 발명에 따르면, 적어도 하나의 글리코실화된 표적화 분자가 적절한 숙주 시스템에서의 발현에 의해 수득되는 것이 바람직하다. 글리코실화된 표적화 분자의 이러한 재조합적 발현은 임의의 추가 변형 단계를 필요로 하지 않으므로 덜 작업 집약적이다.
본 발명의 방법은 다른 대안(즉, 대안 (ii))에서 2개의 상호 작용 분자를 서로 접촉시키는 단계를 포함하며, 2개의 상호 작용 분자는 서로 상호 작용할 수 있다. 제1 상호 작용 분자는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화된다. 제2 상호 작용 분자는 적어도 하나의 표적화 분자에 접합된다. 바람직하게는, 상기 접합은 적어도 하나의 표적화 분자로의 제2 상호 작용 분자의 공유 결합이다.
제1 대안, 특히 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기와의 접촉 및 이에 의한 글리코실화와 관련하여 상기 제공된 정의는 이러한 제2 대안에 준용된다.
이 대안에 따르면, 적어도 하나의 표적화 분자는 글리코실 잔기로 직접 글리코실화되지 않는다. 대신에, 표적화 분자는 하나의 상호 작용 분자에 접합, 바람직하게는 공유 결합되고, 각각의 글리코실 잔기에 의한 글리코실화가 다른 상호 작용 분자 상에 존재한다. 두 상호 작용 분자는 서로 상호 작용하도록 선택된다. 상호 작용시, 표적화 분자는 글리코실 잔기에 간접적으로 연결되므로 글리코실화된다.
적합한 상호 작용 분자는 당업계에 잘 알려져 있다. 비제한적인 예는, 예를 들어 아비딘-바이오틴, 스트렙타비딘-바이오틴 및 뉴트라비딘(NeutrAvidin)-바이오틴을 포함하는 아비딘-바이오틴 시스템뿐만 아니라 항체들 및 이들 각각의 리간드, 글루타티온 및 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스-결합 단백질, FITC 및 항-FITC를 포함하는 시스템, 비가역적 단백질 부착 시스템(IPAS)뿐만 아니라 태그, 예컨대 FLAG-, Myc-, HA-, 1D4-, 폴리Arg-, 칼모듈린(calmodulin), 키틴-결합-, 셀룰로스-결합, S-단백질-, Strep- 및 His-태그 및 이들 각각의 상호 작용 파트너를 포함한다[29]. 추가의 비제한적인 예는 클릭-화학 접근법뿐만 아니라 UV-, 열- 및 pH-의존성 가교를 포함한다[30]. 추가의 비제한적 접근법은 표적화- 및 LSTc-글리코실화 단백질들, 또는 예를 들어 VP1-결합 탄수화물과 표적-세포 구조의 안정적인 상호 작용을 가능하게 하는 이작용성 항체들을 융합시키는 스플릿-단백질(split-protein) 접근법을 포함한다[31 내지 36].
두 대안에서, 본 발명의 방법은 (직접 또는 간접적으로) 글리코실화된 표적화 분자가 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP와 접촉되는 것을 포함한다. 이러한 접촉은 글리코실 잔기를 통한 바이러스 또는 VLP로의 표적화 분자(들)의 결합을 가져온다. 이에 따라 바이러스 또는 VLP는 더 이상 세포 표면 상의 각각의 글리코실 잔기로 표적화되지 않고, 대신에 적어도 하나의 표적화 분자가 결합할 수 있는 관심있는 세포로 재표적화된다.
따라서, 본 발명은 관심있는 세포로의 바이러스 및 바이러스-유사 입자의 표적화를 위한 신규한 접근법을 제공한다. 이 접근법은 특정 글리코실 잔기에 대한 바이러스/VLP의 자연적 향성에 의존하며, 이 특정 글리코실 잔기는 통상적으로 표적 세포 상의 표면 마커로서 작용한다. 이제 이러한 글리코실 잔기는, 상기 바이러스 또는 VLP의 천연 표적 세포와는 완전히 독립적으로, 임의의 관심있는 세포로 표적화될 수 있는 상이한 표적화 분자들의 결합을 매개하는 데 사용된다. 더욱이, 표적화 분자들의 결합은 추가적으로 그들의 천연 표적 세포에 대한 바이러스 또는 VLP 상의 결합 부위를 "마스킹"하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, [15]에 기술된 바와 같은 항체-결합 모티프를 사용한 주요 캡시드 단백질 VP1 내의 유연한 루프 중 하나의 변형과 같은 이전의 접근법은 제1 단계에서 바이러스/VLP의 변형이 필요하다는 문제점이 있었다. 또한, 바이러스 또는 VLP의 표면으로의 표적화 분자의 공유 결합은 제1 단계에서 바이러스 또는 VLP의 이러한 변형을 필요로 한다. 이러한 초기 단계는 시간이 많이 걸릴뿐만 아니라 비용도 많이 드는 추가의 번거로운 절차 단계가 수행되어야 함을 의미한다. 치료 접근법을 위한 바이러스 및 VLP의 제조 공정은 고도로 정교화된 공정 조건 및 분석 모니터링을 필요로 하는 이미 다소 까다로운 공정임에 따라, 절대적으로 필요한 경우가 아니라면 임의의 추가 방법 단계를 피하는 것이 바람직할 것이다. 더욱이, 이러한 변형 단계를 포함한다는 것은 추가의 수고스러운 정제 단계가 필요하다는 것을 또한 의미하며, 이는 제조 공정의 복잡성을 더욱 증가시킨다. 이러한 기술적 한계는 과거에 신규한 재표적화 시스템의 개발을 심각하게 제한했다.
본 발명은 한편으로 종래 기술의 방법이 필요로 하는 바이러스 또는 VLP의 초기의 번거로운 변형 및 정제 단계없이 다수의 상이한 관심있는 세포로 표적화될 수 있는 바이러스 또는 VLP를 생성하는 방법을 제공한다. 이와 같이 수득된 바이러스 및 VLP는 많은 상이한 분야에서 적용될 수 있으며, 예를 들어, 유전자 요법의 경우와 같이 표적 세포를 관심있는 핵산 분자로 형질도입시키기 위한 담체로서 적용되거나 표적 세포로의 물질의 표적화된 전달, 예를 들어, 암세포로의 세포 독성 화합물의 표적화된 전달을 위해 적용될 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 폴리오마 바이러스는 인간 폴리오마 JC 바이러스이거나 VLP는 인간 폴리오마 JC 바이러스로부터 유래된다.
JC 바이러스(존 커닝햄(John Cunningham) 바이러스로도 지칭됨)는 JCV로 약칭되며 BK 바이러스 및 SV40과 유전적으로 유사한 인간 폴리오마 바이러스이다. 이는 진행성 다초점 백혈구병증(PML) 및 기타 질병을 유발하지만, AIDS에서와 같은 면역결핍의 경우 또는 (예를 들어, 장기 이식 환자에서의) 면역억제 약물에 의한 치료 동안에만 유발한다. 14개의 아형 또는 유전자형이 인식되며, 각각은 특정한 지리적 영역과 관련된다. 대안적인 번호매김 체계에서, 유전자형은 추가의 글자와 함께 1 내지 8로 번호가 매겨진다. JCV의 천연 숙주 스펙트럼은 신경 및 관련 조직의 세포, 예를 들어, 희소돌기아교세포, 성상 세포, 및 아교 세포를 포함한다.
폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP와 관련하여 본원에서 앞서 제공된 모든 정의 및 바람직한 구현예는 이러한 바람직한 구현예에 준용된다.
본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, VLP는 인간 폴리오마 JC 바이러스의 캡시드 단백질 VP1을 포함한다.
VLP가 인간 폴리오마 JC 바이러스의 캡시드 단백질 VP1(로 구성되는 대신)을 포함하는 한에 있어서, VLP에 실제 바이러스의 다른 성분, 예를 들어, 실제 바이러스 핵산이 없는 것이 특히 바람직하다. 더욱더 바람직하게는, VLP는 인간 폴리오마 JC 바이러스의 캡시드 단백질 VP1로 "구성"되며, 즉, 다른 바이러스 캡시드 단백질이 존재하지 않는다. VLP가 캡시드 단백질 VP1로 "구성"되는 경우에도,이 VLP는 그럼에도 불구하고 본 발명에 따라 VLP의 표면에 부착된 표적화 분자(들)를 함유한다는 것이 이해될 것이다. 또한, 캡시드 단백질 VP1로 "구성"되는 VLP는, 이하 본원에서 더욱 상세히 정의되는 바와 같은, 추가의 카고(cargo) 분자, 또는 추가의 표적화 모이어티(단, 상기 추가의 표적화 모이어티는 바이러스 캡시드 단백질이 아님)를 선택적으로 함유할 수 있는 것이 선택적으로 구상된다. 바꿔 말하면, VLP가 인간 폴리오마 JC 바이러스의 캡시드 단백질 VP1로 "구성"된다는 정의는 VLP를 형성하는 분자, 즉, 담체(그의 카고 또는 부착된 분자를 지칭하는 것이 아님)가 VP1 단백질만으로 구성됨을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "캡시드 단백질 VP1"은 인간 폴리오마 JC 바이러스의 야생형 균주의 캡시드 단백질 VP1뿐만 아니라 이러한 캡시드 단백질의 변형된 형태, 즉, 돌연변이, 예를 들어, 치환, 삽입, 및/또는 결실에 의해 야생형-캡시드 단백질과 상이한 단백질에 관한 것이다. 인간 폴리오마 JC 바이러스의 야생형 균주의 캡시드 단백질 VP1은 당업계에 알려져 있으며, Gene ID: 1489518(2016년 8월 20일에 NCBI 데이터베이스에서 업데이트된 것) 또는 UniProt ID P03089(2016년 9월 14일에 이용 가능한 것)로 표시된다. VP1의 코딩 서열은 또한 SEQ ID NO: 1로 제시되고, 그의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2로 제시된다.
더욱 바람직한 구현예에서, VLP는 재조합적으로 생성된 캡시드 단백질로 이루어진다. 재조합 VP1을 생성하기 위해, 다음과 같은 것을 포함하고, 바람직하게는 다음과 같은 것으로 구성된 핵산 분자가 사용되는 것이 바람직하다:
(i) SEQ ID NO: 1의 핵산 분자;
(ii) 각각의 티민이 우라실로 대체된, SEQ ID NO: 1의 서열의 핵산 분자;
(iii) 엄격한 조건 하에서 (i) 또는 (ii)의 핵산 분자의 상보적 가닥에 하이브리드화하는 핵산 분자;
(iv) (i)의 핵산 분자에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자; 또는
(v) (i) 내지 (iii)의 핵산 분자와 관련하여 축퇴성인 핵산 분자.
핵산 분자로부터 재조합 단백질을 생성하는 수단 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 핵산 분자 또는 이 핵산 분자를 함유하는 (재조합) 벡터가 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 이어서 숙주 세포가 각각의 핵산 분자의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 배양되고, 단백질이 세포 또는 세포 상층액으로부터 분리된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "엄격한 조건"은 관심있는 핵산 분자의 전장에 걸쳐 관심있는 핵산 분자에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자가 관련되지 않은 핵산 분자와 교차 하이브리드화하지 않는 하이브리드화 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상황에 따라 상이할 것이다. 각 핵산 서열에 대한 적절한 엄격한 하이브리드화 조건은 온도, 핵산 분자의 조성, 염 조건 등과 같은 잘 알려진 파라미터에 대하여 당업자에 의해 확립될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"; CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989] 또는 상기 문헌[Higgins and Hames (eds.)]을 참조하고, 특히 문헌[Britten & Davidson, 3 to 15]의 챕터 "하이브리드화 전략(Hybridization Strategy)"을 참조한다.
상기 열거된 옵션 (iv)에 따르면, VP1-폴리펩티드의 재조합적 생성을 위해 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 것을 사용하는 것이 특히 바람직하고, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 것을 사용하는 것이고, 특히 바람직하게는 적어도 95% 동일한 것을 사용하는 것이고, 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일한 것을 사용하는 것이며, 동일성은 SEQ ID NO: 1의 전장에 걸쳐 결정된다.
SEQ ID NO: 1의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시되어 있다. 앞서 상세히 설명된 바와 같이, VP1 단백질은 또한 변형된 VP1 단백질일 수 있다. 핵산 분자에 대해 이전 단락에서 언급된 서열 동일성의 바람직한 정도는 캡시드 단백질 VP1의 이러한 변형된 형태에 대해 준용되며, 즉, 변형된 VP1 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성된 VP1 단백질에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일한 것이 바람직하며, 동일성은 SEQ ID NO: 2의 전장에 걸쳐 결정된다.
바람직하게는, 변형된 VP1 단백질은 아미노산 서열이 N-말단 영역에서, 예를 들어 N-말단의 25개 아미노산의 영역 내에서 변형된 단백질이다. 특히 바람직한 변형은 이종성 핵 위치 신호(nuclear localization signal)의 도입이다. 바람직한 핵 위치 신호는 아미노산 서열 CPGAAP(SEQ ID NO: 5) 또는 아미노산 서열 X1X2P를 함유하며, X1 및 X2는 임의의 아미노산, 바람직하게는 각각 K를 의미하고, 이들은, 예를 들어, SV40 또는 BKV의 핵 위치 신호의 아미노산 서열에 기초한다. 이러한 바람직한 변형된 VP1 단백질(VP1-Mut2)을 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시되어 있다. 상응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시되어 있다.
본 발명의 방법의 다른 바람직한 구현예에서, 글리코실 잔기는 α2,3- α2,8- 또는 α2,6-SA를 함유하고, 바람직하게는, 락토시리즈 사당류 c(LSTc), GM1, 아시알로-GM1, GM2, GD1a, GD1b, GD2, GT1a, GT1b, GM3, GD3, 및 GQ1b로부터 선택된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 본원에서 LSTc로도 약칭되는 용어 "락토시리즈 사당류 c"는 IUPAC 명칭이 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-[[(3R,4S,5R,6S)-6-[(2R,3S,4R,5R,6S)-5-아세트아미도-6-[(2R,3S,4S,5R,6S)-3,5-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)-6-[(2R,3R,4R,5R)-1,2,4,5-테트라하이드록시-6-옥소헥산-3-일]옥시옥산-4-일]옥시-4-하이드록시-2-(하이드록시메틸)옥산-3-일]옥시-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-일]메톡시]-4-하이드록시-6-[(1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필]옥산-2-카르복실산인 시알릴락토-N-네오테트라오스 c를 지칭하며, PubChem CID 53477861(2016년 10월 18일로 이용 가능한 것)을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "GM1"은 IUPAC 명칭이 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-[(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-5-하이드록시-6-(하이드록시메틸)-4-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-일]옥시옥산-2-일]옥시-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-디하이드록시-6-[(E,2R,3S)-3-하이드록시-2-(이코사노일아미노)이코스-4-엔옥시]-2-(하이드록시메틸)옥산-3-일]옥시-3-하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-4-일]옥시-4-하이드록시-6-[(1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필]옥산-2-카르복실산인 강글리오사이드 모노시알로테트라헥소실강글리오사이드에 관한 것이며, PubChem CID 9963963(2016년 10월 14일에 이용 가능한 것)을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "아시알로-GM1"은 IUPAC 명칭이 N-[(E)-1-[(3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-5-하이드록시-6-(하이드록시메틸)-4-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-일]옥시옥산-2-일]옥시-3,4-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-일]옥시-3,4-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-일]옥시-3-하이드록시옥타데스-4-엔-2-일]옥타데칸아미드인 강글리오사이드 강글리오-N-테트라오실세라마이드에 관한 것이며, PubChem CID 6450363(2016년 10월 18일에 이용 가능한 것)을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "GM2"는 IUPAC 명칭이 5-아세트아미도-2-[[5-[3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-일]옥시-2-[4,5-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)-6-[3-하이드록시-2-(옥타데카노일아미노)옥타데스-4-엔옥시]옥산-3-일]옥시-3-하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-4-일]옥시메틸]-4-하이드록시-6-(1,2,3-트리하이드록시프로필)옥산-2-카르복실산인 강글리오사이드 GM2에 관한 것이며, PubChem CID 92039511(2016년 10월 18일에 이용 가능한 것)을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "GM3"은 IUPAC 명칭이 (2S,4S,5R)-5-아세트아미도-2-[(2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-6-[(E,2S,3R)-2-[[(Z)-도코스-13-에노일]아미노]-3-하이드록시옥타데스-4-엔옥시]-4,5-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)옥산-3-일]옥시-3,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-4-일]옥시-4-하이드록시-6-[(1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필]옥산-2-카르복실산인 강글리오사이드 GM3에 관한 것이며, PubChem CID 53481206(2016년 10월 18일에 이용 가능한 것)을 갖는다.
본 발명에 따르면,용어 "GD1a"는 IUPAC 명칭이 (2R,4S,5R,6R)-2-[[(2R,3S,4S,5R,6S)-4-[(2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-4-하이드록시-6-[(1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필]옥산-2-일]옥시-6-[(2R,3R,4R,5R,6S)-5-아세트아미도-6-[(2R,3R,4R,5R,6S)-6-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)-6-[(E,2S,3R)-3-하이드록시-2-(옥타데카노일아미노)옥타데스-4-엔옥시]옥산-3-일]옥시-4,5-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)옥산-3-일]옥시-4-하이드록시-2-(하이드록시메틸)옥산-3-일]옥시-3,5-디하이드록시옥산-2-일]메톡시]-4-하이드록시-5-[(2-하이드록시아세틸)아미노]-6-[(1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필]옥산-2-카르복실산인 강글리오사이드 GD1a에 관한 것이며, PubChem CID 102601600(2016년 10월 18일에 이용 가능한 것)을 갖는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "GD1b"는 IUPAC 명칭이 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-[(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-5-하이드록시-6-(하이드록시메틸)-4-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-일]옥시옥산-2-일]옥시-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)-6-[(E)-3-하이드록시-2-(옥타데카노일아미노)옥타데스-4-엔옥시]옥산-3-일]옥시-3-하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-4-일]옥시-6-[(1S,2R)-2-[(2S,4S,5R,6R)-2-카르복시-4-하이드록시-5-[(2-하이드록시아세틸)아미노]-6-[(1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필]옥산-2-일]옥시-1,3-디하이드록시프로필]-4-하이드록시옥산-2-카르복실산인 GD1b-강글리오사이드를 지칭하며, PubChem CID 92132037(2016년 10월 18일에 이용 가능한 것)을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "GD2"는 IUPAC 명칭이 (2R,4R,5S,6S)-2-[3-[(2S,3S,4R,6S)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-일]옥시-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)-6-[(E)-3-하이드록시-2-(옥타데카노일아미노)옥타데스-4-엔옥시]옥산-3-일]옥시-3-하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-4-일]옥시-3-아미노-6-카르복시-4-하이드록시옥산-2-일]-2,3-디하이드록시프로폭시]-5-아미노-4-하이드록시-6-(1,2,3-트리하이드록시프로필)옥산-2-카르복실산인 GD2-강글리오사이드에 관한 것이며, PubChem CID 6450346(2016년 10월 18일에 이용 가능한 것)을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "GD3"은 IUPAC 명칭이 5-아세트아미도-6-[(1S,2R)-2-[5-아세트아미도-2-카르복실레이토-4-하이드록시-6-[(1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필]옥산-2-일]옥시-1,3-디하이드록시프로필]-2-[2-[4,5-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)-6-[(E,2S,3R)-3-하이드록시-2-(트리코사노일아미노)옥타데스-4-엔옥시]옥산-3-일]옥시-3,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-4-일]옥시-4-하이드록시옥산-2-카르복실레이트인 강글리오사이드 GD3에 관한 것이며, PubChem CID 16760459(2016년 10월 18일에 이용 가능한 것)를 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "GT1a"는 IUPAC 명칭이 (2R,4S,5R,6R)-2-[(2S,3S,4R,5R,6S)-2-[(2R,3S,4S,5S,6S)-3-아세트아미도-2-[(2S,3R,4S,5S,6R)-4-[(2R,4S,5R,6R)-5-아미노-2-카르복시-4-하이드록시-6-(1,2,3-트리하이드록시프로필)옥산-2-일]옥시-6-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)-6-[(E)-3-하이드록시-1-(옥타데카노일아미노)옥타데스-4-엔-2-일]옥시옥산-3-일]옥시-5-하이드록시-2-(하이드록시메틸)옥산-3-일]옥시-5-하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-4-일]옥시-3,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-4-일]옥시-5-아미노-6-[2-[(2R,4S,5R,6R)-5-아미노-2-카르복시-4-하이드록시-6-(1,2,3-트리하이드록시프로필)옥산-2-일]옥시-1,2-디하이드록시에틸]-4-하이드록시옥산-2-카르복실산인 폴리시알로강글리오사이드에 관한 것이며, PubChem CID 6450319(2016년 10월 18일에 이용 가능한 것)를 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "GT1b"는 IUPAC 명칭이 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-2-[(2R,3S,4R,5R,6S)-4-[(2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-[(1S,2R)-2-[(2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-4-하이드록시-6-[(1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필]옥산-2-일]옥시-1,3-디하이드록시프로필]-2-카르복시-4-하이드록시옥산-2-일]옥시-6-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)-6-[(E,2S,3R)-3-하이드록시-2-(옥타데카노일아미노)옥타데스-4-엔옥시]옥산-3-일]옥시-5-하이드록시-2-(하이드록시메틸)옥산-3-일]옥시-5-하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-4-일]옥시-3,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-4-일]옥시-4-하이드록시-6-[(1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필]옥산-2-카르복실산인 GT1b 강글리오사이드(C36)에 관한 것이며, PubChem CID 14181654(2016년 10월 18일에 이용 가능한 것)를 갖는다.
본 발명의 방법의 특히 바람직한 구현예에서, 글리코실 잔기는 락토시리즈 사당류 c(LSTc)이다.
본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 표적화 분자는 단백질, 펩티드 또는 탄수화물로부터 선택된다. 하나 초과의 표적화 분자가 사용되는 경우, 상기 표적화 분자는 단백질, 펩티드 및 탄수화물로부터 독립적으로 선택될 수 있으며, 즉, 이들은 서로 상이할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "펩티드"는 최대 30개의 아미노산으로 구성된 분자들의 그룹을 기술하는 한편, "단백질"은 30개 초과의 아미노산으로 구성된다. 펩티드 및 단백질은 이량체, 삼량체 및 더 고급인 올리고머, 즉, 동일하거나 동일하지 않을 수 있는 하나 초과의 분자로 구성된 것을 추가로 형성할 수 있다. 상응하는 고차 구조는 결과적으로 동종이량체 또는 이종이량체, 동종삼량체 또는 이종삼량체 등으로 명명된다. 용어 "펩티드"및 "단백질"(여기서 "단백질"은 "폴리펩티드"와 상호 교환적으로 사용됨)은 변형이 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등에 의해 수행되는 자연적으로 변형된 펩티드/단백질을 또한 지칭한다. 이러한 변형은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, 아미노산(들) 및/또는 펩티드 결합(들)이 기능적 유사체로 대체된 이러한 펩티드 및 단백질의 펩티도미메틱이 또한 본원에 포함된다. 이러한 기능적 유사체는 20개의 유전자-인코딩 아미노산 이외의 모든 알려진 아미노산, 예컨대 셀레노시스테인(selenocysteine)을 포함한다. 적합한 단백질 또는 펩티드의 구체적이고 바람직한 예는 이하 본원에서 상세히 설명된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "탄수화물"은 임의의 유형의 탄수화물을 지칭한다. 자연 발생적 탄수화물뿐만 아니라 화학적으로 변형된 탄수화물도 이 용어에 포함된다. 탄수화물은 전형적으로 단당류, 이당류, 올리고당류, 및 다당류의 네 가지 화학적 그룹으로 나뉜다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 탄수화물은 임의의 이당류 또는 올리고당류뿐만 아니라 그의 알코올이다. 이당류 및 올리고당류의 바람직한 성분은 글루코스, 만노스, 푸코스, 갈락토스, N-아세틸갈락토사민, 및 풀룰란(pullulan)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
몇몇 세포-표면 분자는 탄수화물, 특히 이당류 또는 올리고당류에 결합할 수 있다. 예를 들어, 렉틴은 상이한 탄수화물 모이어티를 인식할 수 있어, 각각의 분자의 흡수를 가져온다. 또한, 간 실질 세포와 같은 간 세포는 아시알로당단백질 수용체(ASGP-R)를 발현하며, 이 수용체는 β-D-갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기를 함유하는 매우 다양한 탈시알릴화 당단백질 및 네오글리코프로테인(neoglycoprotein)뿐만 아니라, 다른 당류 잔기, 예컨대 만노스, 락토스 또는 프룩토스 및 그로부터 유래된 산, 예를 들어, 락토비온산을 인식할 수 있다[37 내지 39].
표적화 분자로서 적절한 탄수화물을 선택함으로써, 각각의 수용체를 보유하는 표적 세포, 예를 들어, 인간 간세포 암종 세포가 표적화될 수 있다.
본 발명의 방법의 더욱 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 표적화 분자는 항체, 트랜스페린, 표피 성장 인자(EGF) 패밀리 구성원, 사이토카인, 부분적 바이러스 당단백질, CD9, var2csa, 인슐린 또는 GABA에 대한 리간드로부터 선택된 단백질이다. 또한, 하나 초과의 표적화 분자가 사용되는 경우, 상기 표적화 분자는 언급된 단백질들로부터 독립적으로 선택될 수 있으며, 즉, 이들은 서로 상이할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 발명에 따른 항체는, 예를 들어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 구현예들, 예컨대 키메라(인간 불변 도메인, 비-인간 가변 도메인), 단일 사슬 및 인간화된 항체(비-인간 CDR을 제외한 인간 항체)뿐만 아니라 특히 Fab, Fab', Fd, F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편과 같은 항체 단편 또는 나노바디, 즉, 단일 단량체 가변 항체 도메인을 또한 포함하며, 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988] 및 문헌[Harlow and Lane "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999]을 참조한다. 항체 생성을 위한 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 상기 문헌[Harlow and Lane (1988)] 및 상기 문헌[Harlow and Lane (1999)]에 기술되어 있다.
바람직하게는, 항체는 암 세포 마커, 예를 들어, Her2/neu, 암배아성 항원, CD33, CD34, 또는 콘드로이틴 설페이트 A에 결합할 수 있는 항체이다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "트랜스페린"은 혈장 단백질로서 철에 결합함으로써 세포 철 이온 전달에 관여하는 당단백질에 관한 것이다. 2개의 트랜스페린 수용체인 트랜스페린 수용체 1(TfR1)(UniProtKB-P02786) 및 트랜스페린 수용체 2(TfR2)(UniProtKB-Q9UP52)가 인간에서 기술되어 있다. 두 수용체는 막 관통 당단백질이며, TfR1은 편재적으로(ubiquitously) 발현되는 수용체이고 TfR2는 간세포 및 적혈구로 제한된다[40].
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "표피 성장 인자(EGF) 패밀리 구성원"은 표피 성장 인자 수용체와 상호 작용하는 인간 표피 성장 인자 단백질의 패밀리에 관한 것이다. 패밀리 구성원의 비제한적인 예는, 예를 들어, EGF(UniProtKB P01133), 형질전환-성장 인자 α(UniProtKB-P01135) 또는 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자(UniProtKB-Q99075)를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "사이토카인"은 세포 증식 및 분화를 제어하는 펩티드에 관한 것이다. 사이토카인의 비제한적인 예는 인터루킨(예를 들어, IL-2, IL-6, IL-10), 인터페론(예를 들어, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ, 콜로니 자극 인자(CSF) 및 종양 괴사 인자(TNF)를 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "부분적 바이러스 당단백질"은 각각의 막- 또는 캡시드-앵커가 없는 바이러스 당단백질의 에피토프-인식 서열을 지칭한다. 부분적 바이러스 당단백질의 비제한적인 예는 EnvA, VSV-G 또는 HIV-1 GP160을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "EnvA"는 조류 백혈병 바이러스의 외피 당단백질 gp95에 관한 것이며, UniProtKB-P03397(2016년 10월 14일에 이용 가능한 것)로 표시된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "VSV-G"는 소포성 구내염 바이러스의 스파이크 당단백질 g에 관한 것이며, UniProtKB-P04882(2016년 10월 14일에 이용 가능한 것)로 표시된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "HIV-1 GP160"은 인간 면역결핍 바이러스 유형 1의 외피 당단백질 gp160에 관한 것이며, UniProtKB-P03375(2016년 10월 14일에 이용 가능한 것)로 표시된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "CD9"는 테트라스파닌(tetraspanin)-패밀리 구성원 CD9에 관한 것이다. CD9는 수탁 번호 UniProtKB-P21926(2016년 10월 14일에 이용 가능한 것)을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "var2csa"는 플라스모디움 팔시파룸 var2 유전자 패밀리 구성원 PfEMP1(2016년 10월 14일에 이용 가능한 UniProtKB-O96108)을 지칭하며, 그의 유전자 생성물은 콘드로이틴-설페이트 A에 결합할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "인슐린"은 인간 인슐린에 관한 것이며, UniProtKB-P01308(2016년 10월 14일에 이용 가능한 것)로 표시된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "GABA에 대한 리간드"는 GABA-수용체 패밀리 구성원, 즉, GABAA-ρ 또는 GABAB 중 하나 (이상)에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 임의의 분자에 관한 것이다. GABA에 대한 적합한 리간드의 비제한적인 예는 이미다졸-4-아세트산, 무시몰(muscimol), 이소구바신(isoguvacine) 및 THIP를 포함한다[41].
상기 열거된 표적화 분자를 사용함으로써, 바이러스 또는 VLP는 질병-관련 표적 세포로 재표적화될 수 있다. 예를 들어, 항체의 사용은, 바이러스 또는 VLP를, 상기 항체에 대한 항원을 발현하는 임의의 세포로, 예를 들어, 항-Her2/neu 항체를 사용할 때 Her2/neu-발현 암세포로 표적화하기에 적합하다. 유사하게, 표적화 분자로서, EGF 패밀리 구성원, 예를 들어, 표피 성장 인자(EGF) 자체의 사용은 VLP가 EGF-수용체-발현 암세포를 표적화할 수 있게 한다. 트랜스페린은 트랜스페린-수용체를 발현하는 세포로의 VLP-표적화를 가능하게 하고, 이에 따라 매우 광범위하게 다양한 표적 세포 및 조직의 표적화를 허용한다. 무손상 또는 부분적 인슐린의 이용은 베타-세포 및 인슐린 수용체를 노출시키는 다른 세포 유형으로의 VLP-표적화를 가능하게 한다. 사이토카인은 이의 각각의 수용체와 상호 작용하기에 알맞고, 표적화 분자(들)로서 사용될 때, 이는 골수 또는 림프 계통의 다양한 세포 유형으로의 흡수를 매개할 수 있다. GABA 리간드는 말초 또는 중추 신경계 내의 세포로의 VLP의 특이적 표적화를 매개할 수 있다. 최종적으로, 부분적 바이러스 당단백질을 사용함으로써, 바이러스 또는 VLP는 상응하는 바이러스가 숙주 감염을 위해 이용하는 각각의 수용체로 재표적화될 수 있고, 이에 따라 이러한 재표적화된 VLP의 이용은 바이러스 감염을 치료 또는 예방할 수 있게 한다. 요약하면, 이렇게 재표적화된 바이러스 또는 VLP는 치료 및 연구 적용을 포함하는 광범위한 용도를 제공한다. 예를 들어, 그리고 이하에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 유전자 요법 접근법, RNA 간섭 접근법뿐만 아니라 DNA-기반 종양 백신접종 접근법을 위해 예를 들어 관련 카고 분자를 보유하는 이러한 바이러스 또는 VLP를 사용함으로써 수많은 질병이 연구자들에 의해 조사되고/되거나 임상의에 의해 치료될 수 있다.
본 발명의 방법의 다른 더욱 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 표적화 분자는 물질-P, 오피오이드 또는 세포-침투 펩티드로부터 선택된 펩티드이다. 또한, 하나 초과의 표적화 분자가 사용되는 경우, 상기 표적화 분자들은 이러한 펩티드들로부터 독립적으로 선택될 수 있으며, 즉, 이들은 서로 상이할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "물질-P"는 서열 RPKPQQFFGLM(SEQ ID NO: 6)을 갖는 뉴로키닌 올리고펩티드-패밀리 구성원에 관한 것이다. 물질 P는 뉴런 조직을 포함하는 뉴로키닌 타입 1 수용체(NK1R)를 노출시키는 세포 및 결장직장 암종을 포함한 특정 유형의 암 내로의 카고의 전달을 보조하는 데 특히 적합하다[42, 43]. 따라서, 표적화 분자로서의 물질 P 이용은 말초 또는 중추 신경계의 세포와 관련된 장애의 치료 및 NK1R을 노출시키는 암 유형의 치료를 가능하게 하도록 구상된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "오피오이드"는 오피오이드 수용체, 예를 들어, 델타 오피오이드 수용체(DOR), 카파 오피오이드 수용체(KOR), 뮤 오피오이드 수용체(MOR), 노시셉틴 수용체(NOR) 또는 제타 오피오이드 수용체(ZOR)에 작용하는 임의의 물질에 관한 것이다. 오피오이드는, 예를 들어 모르핀을 포함하는, 아편으로부터 유래된 화합물뿐만 아니라 반합성 및 합성 화합물, 예를 들어, 하이드로코돈, 옥시코돈 및 펜타닐, 길항제 화합물, 예를 들어, 날록손, 또는 내인성 펩티드, 예컨대 엔도르핀을 포함한다. 오피오이드 수용체는 뇌에 널리 분포되어 있지만, 척수 및 소화관에서도 발견된다.
따라서, 표적화 분자로서 적절한 오피오이드를 선택함으로써, 예를 들어 말초 감각 뉴런(DOR, MOR, KOR에 대한 표적 세포), 뇌의 기저핵 및 신피질 영역(DOR에 대한 표적 세포)[44], 척수(KOR, MOR, NOR에 대한 표적 세포) 또는 심장, 골격근 및 간 세포(ZOR에 대한 표적 세포)[45, 46]와 같은 오피오이드 수용체를 보유하는 표적 세포가 표적화될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "세포-침투 펩티드"(CPP)는 안테나 전달체, TAT, 트랜스포탄(transportan) 및 폴리아르기닌과 같은 짧은 양이온성 펩티드에 관한 것이며, 이는 펩티드 전달을 위한 도구로서 당업계에 기술되어 있다[47]. CPP는 세포막을 가로 지르는 부착된 카고의 이동을 매개할 수 있고, 이에 따라 VLP 및 바이러스에 대한 표적화 및/또는 진입 분자로서 작용하기에 특히 적합하다.
본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 제1 및 제2 상호 작용 분자는 아비딘 및 바이오틴, 스트렙타비딘 및 바이오틴, 또는 뉴트라비딘 및 바이오틴이다.
변이형인 스트렙타비딘-바이오틴 및 뉴트라비딘-바이오틴을 포함하는 상호 작용 분자들의 아비딘-스트렙타비딘 시스템은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Dundas et al. 2013]에 기술되어 있다. 스트렙타비딘은 그의 상호 작용 파트너인 바이오틴에 높은 선택성 및 nM 범위의 kD로 결합한다. 더욱이, 스트렙타비딘은 고온에 대해 그리고 광범위한 pH에 걸쳐 안정적이다. 최근의 개선은 단일-도메인 스트렙타비딘-단백질을 생성시켰고, 이는 결합-화학량론의 측면에서 더욱 제어된 접근법을 가능하게 하였다[48].
이 바람직한 구현예에 따르면, 제1 및 제2 상호 작용 분자의 선택은 언급된 순서로 제한되지 않는다. 바꿔 말하면, 제1 및 제2 상호 작용 분자가 아비딘 및 바이오틴인 경우, (i) 아비딘이 제1 상호 작용 분자이고 바이오틴이 제2 상호 작용 분자이거나; (ii) 바이오틴이 제1 상호 작용 분자이고 아비딘이 제2 상호 작용 분자인 것이 구상된다. 상호 작용 분자들의 다른 언급된 조합, 즉, 스트렙타비딘 및 바이오틴뿐만 아니라 뉴트라비딘 및 바이오틴에 대해서도 동일한 것이 준용된다.
본 발명의 방법의 다른 바람직한 구현예에서, 바이러스 또는 VLP는 바이러스 또는 VLP 내에 하나 이상의 카고 분자를 추가로 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "하나 이상"은 정확히 하나뿐만 아니라 하나를 초과하는 임의의 수, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등도 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 또는 VLP는 최대 400개의 카고 분자를 포함하고, siRNA의 경우 바람직하게는 최대 300개의 분자를 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "카고 분자"는 본 발명의 바이러스 또는 VLP에 의해 운반될 분자에 관한 것이다. 카고 분자의 비제한적인 예는 핵산 분자, 특히 조절 핵산 분자, 독소, 단백질, 예를 들어, 효소, 펩티드뿐만 아니라 다른 소분자, 예를 들어, 프로피디움-요오다이드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 카고 분자는 치료 또는 연구 목적을 위한 약학 화합물 또는 약물이다.
바이러스 또는 VLP에 카고 분자를 포함시키는 수단 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Tunissen et al. 2013]에 기술되어 있다[49]. 더욱 구체적으로, 핵산 분자를 위한 약물 전달 시스템으로서의 VLP의 사용은, 예를 들어, WO2009/036933호에 상세히 기술되어 있다. VLP를 통한 단백질 및 저분자량 물질의 전달은 예를 들어 문헌[Abbing et al. 2004]에 기술되어 있다[50]. 이 참고 문헌에 기술된 바와 같이, 예를 들어 카고 분자와 VP2의 상호 작용을 보장함으로써, 카고 분자를 VLP의 내부 표면에 커플링시키는 것이 유리하다. 이들 접근법은, 예를 들어, 문헌[Abbing et al. 2004]으로부터 당업자에게 잘 알려져 있다[50].
바람직한 구현예에서, 카고 분자는 핵산 분자이다. 적합한 핵산 분자의 비제한적인 예는 백신접종 목적을 위한 핵산 분자뿐만 아니라 RNA 간섭 유도 분자와 같은 조절 핵산 분자도 포함한다.
바람직하게는, RNA 간섭 유도 분자는 RNA, 예를 들어, (예를 들어 siRNA를 포함하는) dsRNA, miRNA, shRNA 또는 그의 전구체, 및/또는 RNA 유사체이다. 대안적으로, RNA 간섭 유도 분자는 (예를 들어, siRNA 포함하는) dsRNA, miRNA, shRNA 또는 그의 전구체를 인코딩하는 DNA 및/또는 DNA 유사체인 것이 바람직하다. 이러한 DNA 분자는 표적 세포에서의 RNA 간섭 유도 분자의 발현을 보장하는 추가의 조절 요소를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
카고 분자로서 적합한 이러한 핵산 분자는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, WO2009036933호에 기술되어 있다. WO2009036933호에 또한 기술된 바와 같이, VLP 대 RNA 간섭 유도 분자의 질량 비는 1:100 내지 100:1, 더욱 바람직하게는 1:50 내지 50:1, 더욱더 바람직하게는 1:20 내지 20:1, 가장 바람직하게는 1:1 내지 20:1의 범위인 것이 특히 바람직하다. 바이러스 대 RNA 간섭 유도 분자의 질량 비에 대해 동일한 비가 준용된다.
다른 더욱 바람직한 구현예에서, 카고 분자는 효소, 예를 들어, 표적화된 조직의 근처로 이동된 세포독성제를 유리시키거나 활성화시킬 수 있는 효소, 예를 들어 전구-약물 활성화를 위한 효소, 예를 들어, 카르복시-펩티다제, 글루쿠로니다제 및 글루코시다제로 구성된 군에서 선택된 효소이다(문헌[Bagshawe, K.D. [2009] Curr. Drug Targets 10:152-157]; 문헌[Chen, K.-C. [2011] Bioconjugate Chem. 22:938-948]). 카고 분자는 또한 영상화제로서 사용하기에 적합한 효소, 예를 들어, 발색, 화학발광 또는 형광 반응을 촉매할 수 있는 효소, 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 루시퍼라제, β-갈락토시다제 및 알칼리 포스파타제(AP)일 수 있다.
영상화 목적을 위한 카고 분자의 추가의 비제한적인 예는 형광 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 적색 형광 단백질(RFP), 시안 형광 단백질(CFP) 또는 적외선 형광 단백질(IFP)뿐만 아니라 형광 염료, 예를 들어, 플루오레세인(Fluorescein), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 또는 Cy 염료를 포함한다. 이러한 카고 분자는, 다른 것들 중에서, 예를 들어 수술 동안 형광 표지된 구조를 검출하는 데 이용되는 의료 영상화 기법인 형광 영상-유도 수술(FIGS)에서, 형광 트레이서로서 유용하게 사용된다(문헌[van Dam, G.M. et al. [2011] Nat. Med. 17:1315-1319]; 문헌[Mondal, S.B. et al. [2014] Adv. Cancer Res. 124:171-211]).
생체내 진단법을 포함하는 영상화를 위해 방사성 모이어티가 카고 분자에 추가적으로 부착될 수 있다. 이러한 방사성 모이어티는 예를 들어 감마-방출 동위원소 그룹, 예를 들어, 99mTc, 123I, 125I, 111In 및 양전자 방출체 그룹, 예를 들어, 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I, 89Zr을 포함한다. 베타-방출체 그룹, 예를 들어, 131I, 90Y, 177Lu, 67Cu 및 알파-방출체 그룹, 예를 들어, 213Bi, 211At는, 생체내 또는 시험관내 영상화 또는 검출과는 별도로, 방사성 면역 요법(RIT)에서의 적용에 추가적으로 적합하다.
또한, 카고 분자는 감광제, 예를 들어, 비스(트리에탄올아민)Sn(IV)클로린 e6(SnChe6)일 수 있다. 또한, 카고 분자는 또한 피로피디움 요오다이드일 수 있으며, 이는 바이러스 또는 VLP로의 카고의 전달을 보장하기 위한 대조군으로서의 역할을 할 수 있다.
카고 분자는 또한 그 자체가 독성 화합물, 바람직하게는 작은 유기 화합물 또는 폴리펩티드일 수 있다. 독성 화합물에 대한 비제한적인 예는 칼리키아마이신(calicheamicin), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 에스페라마이신(esperamicin), 다이네마이신(dynemicin), 케다르시딘(kedarcidin), 마두로펩틴(maduropeptin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 아우리스타틴(auristatin), 마이탄신(maitansine), 리신-A(Ricin-A) 사슬, 모데신(modeccin), 트렁케이션된 슈도모나스 엑소톡신 A(truncated Pseudomonas exotoxin A), 디프테리아 독소 및 젤로닌(gelonin)으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함한다.
본원에 논의된 바와 같이, VLP가 인간 폴리오마 JC 바이러스의 캡시드 단백질 VP1로 구성되는 것이, 즉, VLP를 형성하는 다른 단백질이 존재하지 않는 것이 본 발명의 일 구현예에 따라 특히 바람직하다. 이러한 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 이에 따라 관심있는 세포에 (특이적으로) 결합하는 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하고, 추가로 하나 이상의 카고 분자를 보유하는, 인간 폴리오마 JC 바이러스의 캡시드 단백질 VP1로 구성된 VLP를 생성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 바이러스 또는 VLP는 바이러스 또는 VLP의 표면 상에 추가의 이종성 분자를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이종성 분자"는 바이러스 또는 VLP의 표면에 존재하는 단백질로서, 상기 바이러스의 표면에 정상적으로 존재하지 않는 단백질에 관한 것이다. 예를 들어, 바이러스 또는 VLP는 추가의 표적화 모이어티로서 작용하거나 바이러스 또는 VLP의 투여 후 숙주에서 면역 반응을 향상시키는 분자를 표면 상에 보유할 수 있다.
숙주에서 면역 반응을 향상시키는 분자의 비제한적인 예는 리포폴리사카라이드(LPS)뿐만 아니라 톨-유사 수용체, 예를 들어, LPS와의 결합을 모방하는 TLR-4 상호 작용 펩타이드와 상호 작용하는 펩타이드를 포함한다. 이러한 펩티드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Shanmugam et al. 2012, Synthetic Toll Like Receptor-4 (TLR-4) Agonist Peptides as a Novel Class of Adjuvants; PLoS ONE 7(2): e30839]에 기재되어 있다. 그 문헌에 기재된 펩티드는 예시적인 펩티드로서 서열 Gln-Glu-Ile-Asn-Ser-Ser-Tyr(SEQ ID NO: 7)을 갖는 펩티드 RS01, 서열 Ser-His-Pro-Arg-Leu-Ser-Ala(SEQ ID NO: 8)을 갖는 RS02, 서열 Ser-Met-Pro-Asn-Pro-Met-Val(SEQ ID NO: 9)을 갖는 RS03, 서열 Gly-Leu-Gln-Gln-Val -Leu-Leu(SEQ ID NO: 10)을 갖는 RS04, 서열 His-Glu-Leu-Ser-Val-Leu-Leu(SEQ ID NO: 11)을 갖는 RS05, 서열 Tyr-Ala-Pro-Gln-Arg-Leu-Pro(SEQ ID NO: 12)을 갖는 RS06, 서열 Thr-Pro-Arg-Thr-Leu-Pro-Thr(SEQ ID NO: 13)을 갖는 RS07, 서열 Ala-Pro-Val-His-Ser -Ser-Ile(SEQ ID NO: 14)을 갖는 RS08, 서열 Ala-Pro-Pro-His-Ala-Leu-Ser(SEQ ID NO: 15)을 갖는 RS09, 서열 Thr-Phe-Ser-Asn-Arg-Phe-Ile(SEQ ID NO: 16)을 갖는 RS10, 서열 Val-Val-Pro-Thr-Pro-Pro-Tyr(SEQ ID NO: 16)을 갖는 RS11 및 서열 Glu-Leu-Ala-Pro-Asp-Ser-Pro(SEQ ID NO: 18)을 갖는 RS12를 포함한다. 예를 들어, T 세포의 직접적 자극을 위한 B7(CD86)의 단편이 추가로 구상된다[51].
예를 들어, 이러한 추가의 표적화 모이어티는, 예를 들어, 문헌[Verheije and Rottier 2012]에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 바이러스의 외피 내로 혼입되거나 바이러스-캡시드 상으로 직접 융합되는 표적화 모이어티와 같은, 당업계에 이미 알려진 통상적인 수단에 의해 결합된 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 더욱이, 이러한 이종성 분자는 또한 표적화 분자와 동일한 접근법에 의해, 즉, (i) 이종성 분자와 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기에 의한 이종성 분자의 글리코실화를 통해; 또는 (ii) 상기 기재된 바와 같은 상호 작용 시스템, 즉, 제1 상호 작용 분자는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화되고, 제2 상호 작용 분자는 상기 이종 분자에 접합되고, 제2 상호 작용 분자는 제1 상호 작용 분자와 상호 작용할 수 있는 상호 작용 시스템의 사용을 통해 바이러스 또는 VLP에 결합될 수 있다.
바람직하게는, 이러한 이종성 분자를 이미 보유하는 바이러스 또는 VLP가 본 발명의 방법에 사용되어, 바이러스/VLP를 추가로 변형시킬 필요가 없게 한다.
따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 구현예에 따르면, VLP는 관심있는 세포에 결합하는 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하고, 선택적으로, 추가의 이종성 분자(들)을 표면 상에 보유하는, 인간 폴리오마 JC 바이러스의 캡시드 단백질 VP1로 구성될 수 있으며, 상기 추가의 이종성 분자는 바이러스 캡시드 단백질이 아니다.
본 발명은 추가로 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 관한 것으로, 바이러스 또는 VLP는 관심있는 세포에 결합하는 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하고, 적어도 하나의 표적화 분자는 다음과 같은 것을 통해 바이러스 또는 VLP의 표면에 결합되어 있다:
(i) 적어도 하나의 글리코실 잔기에 의한 적어도 하나의 표적화 분자의 글리코실화로서, 상기 적어도 하나의 글리코실 잔기는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되어 결합되는, 글리코실화; 또는
(ii) 적어도 2개의 상호 작용 분자 사이의 상호 작용으로서, 제1 상호 작용 분자는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화되고, 상기 적어도 하나의 글리코실 잔기는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되어 결합되며; 적어도 하나의 표적화 분자는 제1 상호 작용 분자와 상호 작용할 수 있는 제2 상호 작용 분자에 접합되는, 상호 작용.
바꿔 말하면, 상기 구현예는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 바이러스-유사 입자(VLP)에 관한 것으로, 바이러스 또는 VLP는 관심있는 세포에 결합하는 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하고, 적어도 하나의 표적화 분자는 다음과 같은 것을 통해 바이러스 또는 VLP의 표면에 결합되어 있다:
(i) 적어도 하나의 표적화 분자의 적어도 하나의 글리코실 잔기로서, 상기 적어도 하나의 글리코실 잔기는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되어 결합되는, 적어도 하나의 글리코실 잔기; 또는
(ii) 적어도 2개의 상호 작용 분자 사이의 상호 작용으로서, 제1 상호 작용 분자는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화되고, 상기 적어도 하나의 글리코실 잔기는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되어 결합되며; 적어도 하나의 표적화 분자는 제1 상호 작용 분자와 상호 작용할 수 있는 제2 상호 작용 분자에 접합되는, 상호 작용.
본 발명의 방법과 관련하여 상기 본원에 제공된 정의 및 바람직한 구현예는 이 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 준용된다. 예를 들어, 본 발명의 이러한 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP는 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 카고 분자(들)를 추가로 포함할 수 있고/있거나 상기 기재된 바와 같은 추가의 이종성 분자를 표면 상에 추가로 포함할 수 있음이 명백히 구상된다.
본 발명의 이러한 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP는 연구 및 전임상 적용, 특히, 특정 분자(예를 들어, 상기 논의된 카고)의 표적 세포로의 표적화된 전달을 필요로 하는 적용에서뿐만 아니라 이하 본원에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같은 의료 적용에서도 특히 유용하다. 연구 및 전임상 적용의 비제한적인 예는, 예를 들어, 세포의 트랜스펙션, 1차 세포의 처리, 혼합-세포-배양물에서의 선택적 형질도입, 생체외 물질에 대한 시험, 유기형 슬라이스 배양물에 대한 시험, 동물에서의 시험 등을 포함한다. 추가의 비제한적인 전임상 적용은 표적 검증 및 화합물 시험을 위한 스크리닝 검정을 포함한다. 더욱이, 재표적화된 바이러스 또는 VLP는 또한 예를 들어 매트릭스 내로 끼워 넣어지거나 비드에 결합함으로써 고정화될 수 있고, 표적 세포를 풀다운(pull-down)하거나 상호 작용 연구를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP의 바람직한 구현예에서, 바이러스 또는 VLP는 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 용어 "조성물"은 적어도 본 발명의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를 포함하는 조성물뿐만 아니라 추가의 화합물, 예를 들어, 이에 의해 본 발명의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP의 특성을 변경시킬 수 있는, 예를 들어, 그의 기능을 안정화, 지연, 조절 및/또는 활성화시킬 수 있는 분자, 또는 대안적으로 적어도 하나의 용기를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 고체, 액체 또는 기체 형태일 수 있고, 특히 분말(들), 정제(들), 용액(들) 또는 에어로졸(들) 형태일 수 있다.
조성물은 본 발명에 따른 하나 초과 유형의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를 추가로 포함할 수 있다. 그 경우, 조성물에 포함된 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP는, 바이러스 또는 VLP 표면 상에 상기 정의된 바와 같은 상이한 표적화 분자, 상이한 추가의 이종성 분자 및/또는 상이한 카고 분자를 포함하는 것이 특히 바람직하다.
하나의 바람직한 구현예에서, 조성물은 약학 조성물이다.
본 발명에 따르면, 용어 "약학 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 언급된 화합물(들)을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 선택적으로 그리고 추가적으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. "약학적으로 허용되는 담체"는 임의의 유형의 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형 보조제를 의미한다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며, 포스페이트-완충 염화나트륨 용액과 같은 염화나트륨 용액, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액, 유기 용매 등을 포함한다. 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 종종 소량의 첨가제, 예컨대 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질을 함유한다. 이러한 물질은 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트, 아세트산, 및 다른 유기산 또는 이들의 염; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 펩티드, 예를 들어, 폴리아르기닌 또는 트리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 추가의 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루탐산, 아스파르트산, 또는 아르기닌; 단당류, 이당류, 및 셀룰로오스 또는 그의 유도체, 포도당, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 반대 이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면 활성제, 예컨대 폴리소르베이트, 폴록사머, 또는 PEG를 포함한다. 또한, 키토산은, 예를 들어, 투여시에 바이러스 또는 VLP의 방출을 지연시키는 데 사용하기 위해, 약학 조성물에 포함될 수 있다.
약학 조성물은 약학 조성물의 의도된 용도에 따라 추가의 작용제, 예를 들어, 종양 치료에 사용하기 위한 항종양제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여는 상이한 방식에 의해, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 피내, 비강내 또는 기관지내 투여에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 약학적으로 허용되는 담체는 이러한 투여 방식에 적합한 담체인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 담체는 수용자의 혈액 또는 조직액과 등장성인 용액이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다. 일반적으로, 제형은 약학 조성물의 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 긴밀하게 접촉시킴으로써 제조된다. 이어서, 필요한 경우, 생성물은 요망되는 제형으로 성형된다. 본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여 방식은 정맥내, 근육내 또는 복강내 주사에 의한 것뿐만 아니라 에어로졸 또는 하이드로겔, 예를 들어, 키토산-기반 하이드로겔을 통한 전달에 의한 것이다.
약학 조성물은 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 투여 요법은 주치의와 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 전반적인 건강, 및 동시에 투여되는 약물을 포함하는 많은 요인에 좌우된다. 주어진 상황에 대한 치료적 유효량은 일상적인 실험에 의해 쉽게 결정될 것이며, 일반 임상의 또는 의사의 숙련도 및 판단력에 속한다. 약학 조성물은 1회 투여 또는 장기간에 걸친 규칙적인 투여를 위한 것일 수 있다. 일반적으로, 약학 조성물의 투여는, 단일 용량의 경우, 예를 들어 1 ㎍/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중의 범위 내에 있어야 하고, 바람직하게는 약 0.5 mg/kg 체중이어야 한다. 그러나, 더욱 바람직한 투여량은 10 ㎍/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 더욱더 바람직하게는 100 ㎍/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중, 더욱더 바람직하게는 500 ㎍/kg 체중 내지 5 mg/kg 체중의 범위일 수 있다.
치료적 투여에 사용될 약학 조성물의 성분은 멸균되어야 한다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과 막(예를 들어, 0.2 μm 막)을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
약학 조성물은 이하 개시된 바와 같이 유전자 요법 접근법으로 치료될 수 있는 종양 및/또는 질병의 치료에 특히 유용할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 진단 조성물이다.
본 발명에 따르면, 용어 "진단 조성물"은 환자가 특정 질병, 예를 들어 암에 걸려 있는지를 진단하기 위한 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 바이러스 또는 VLP를 (예를 들어, 상기 논의된 바와 같이) 검출 가능한 모이어티로 표지하고 이를 암세포-특이적 마커 분자로 표적화함으로써, 환자 내의 암성 세포의 존재 및 위치가 검출될 수 있다. 본 발명의 진단 조성물은 생체내에서뿐만 아니라 당업계에 잘 알려져 있는 시험관내 또는 생체외 진단 실험 설계에서도 사용될 수 있다. 본 발명의 진단 조성물은 본 발명에 따른 적어도 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를 포함한다. 진단 조성물은 적절한 완충제(들) 등을 추가로 포함할 수 있다.
약학 또는 진단 조성물의 성분은 하나의 용기 또는 복수의 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰풀 또는 바이알에, 수용액 또는 재구성을 위한 동결 건조 제형으로 패키징될 수 있다. 바람직하게는, 조성물의 성분은 사용 설명서와 함께 패키징된다. 동결 건조 제형의 예로서, 10 ml 바이알에 5 ml의 1%(w/v) 또는 10%(w/v) 수용액이 채워지고, 생성된 혼합물이 동결 건조된다. 사용을 위한 용액은 예를 들어, 치료적 사용을 위한 주사용수 또는 진단 목적을 위한 다른 요망되는 용매, 예를 들어, 완충제를 사용하여 동결 건조 화합물(들)을 재구성함으로써 제조된다. 방부제 및 다른 첨가제, 예를 들어, 항미생물제, 산화방지제, 킬레이트제, 및 비활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP 또는 본 발명의 조성물에 관한 것이다.
예를 들어, 본 발명의 바이러스 또는 VLP는 상기 본원에서 논의된 바와 같은 조절성 또는 면역원성 핵산과 같은 카고 분자를 관심있는 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 이러한 카고 분자는 예를 들어 유전자 요법 접근법, RNA 간섭 접근법뿐만 아니라 DNA-기반 종양 백신접종 접근법에 적합할 수 있다.
유전자 요법은 생체외 또는 생체내 기법에 의해 생식계열 세포 내로 유전자 결함을 교정하기 위한 치료적 핵산 작제물, 전형적으로 DNA 작제물을 도입하는 것에 기초한다. 따라서, 유전자 요법은 현재 유전자 전달의 가장 중요한 적용들 중 하나이다. 시험관내 또는 생체내 유전자 요법을 위한 적합한 방법은 문헌에 기술되어 있으며, 당업자에게 알려져 있다[6, 52 내지 54]. 유전자 요법으로 치료하기에 적합한 질병의 비제한적인 예는 중증 복합 면역 결핍(ADA-SCID), 만성 육아종성 장애(CGD) 또는 혈우병과 같은 유전적 장애를 포함한다. 또한, 유전자 요법에 의해 치료될 수 있는 후천성 질병은 암(예를 들어, 폐암, 유방암, 결장직장암), 신경퇴행성 질병(예를 들어, 파킨슨병 또는 헌팅턴병) 및 다른 후천성 장애, 예컨대 바이러스 감염, 심장병 및 당뇨병을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
RNA 간섭 접근법은 병원성 유기체로부터의 핵산의 발현에 의해, 또는 내인성 핵산의 비정상적인 발현, 즉, 증가된 양의 발현 또는 그의 원치 않는 발현에 의해 야기되는 질병의 치료에 사용하기에 특히 관심을 끈다. 예를 들어 WO2009036933호에 기술된 바와 같이, 이러한 핵산의 발현을 하향 조절하기 위해 RNA 간섭이 사용될 수 있다. 예를 들어, VLP 또는 바이러스는, HIV-1(인간 면역결핍 바이러스), 간염, KSHV(카포시 육종-관련 포진 바이러스), EBV(엡스타인-바르 바이러스) 및 추가로 폴리오마 JC 바이러스를 포함하지만 이로 제한되지 않는 바이러스 유전자의 발현을 억제하는 RNAi 이펙터를 전달할 수 있다.
DNA-기반 종양 백신접종 접근법은 또한 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Fioretti et al. 2010]에 기술되어 있다[55]. DNA 백신접종은 일반적으로, 예를 들어, 바이러스, 박테리아 및 기생충의 외래 유전 물질에 대한 숙주의 면역 반응을 유도하는 데 사용된다. 부수적인 면역 효과를 최소화하기 위해, 플라스미드의 미생물학적 증폭을 위한 저항-카세트 및 ori 서열은 최소로 감소되어야 한다. 특히 적합한 한 가지 접근법은 최소화된 DNA 카세트인 MIDGE 벡터의 사용을 포함하며, 그의 단부는 헤어핀에 의해 폐쇄되어 선형화된 단분자 DNA를 생성한다[56]. 상기 언급된 바와 같은 유전자 요법 설정에서의 이러한 최소화된 벡터의 이용 이외에, 이들 벡터는 예를 들어 DNA 구동된 종양 백신접종 접근법에 특히 유용하다.
본 발명은 추가로 본 발명의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 바이러스-유사 입자(VLP), 또는 본 발명의 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
용어 "키트"는 그의 가장 넓은 의미에서 언급된 성분 이외의 임의의 다른 화합물의 존재를 요구하지 않지만, 본 발명의 키트와 관련하여 용어 "포함하는"은 추가의 성분이 키트에 존재할 수 있음을 나타낸다. 이러한 추가의 성분의 비제한적인 예는 방부제, 완충제, 효소 등을 포함한다.
여러 성분이 키트에 포함되는 경우, 키트의 다양한 성분은 하나 이상 용기, 예컨대 하나 이상의 바이알에 패키징될 수 있다. 결과적으로, 키트의 다양한 성분은 분리 또는 조합 상태로 존재할 수 있다. 용기 또는 바이알은, 성분 이외에, 저장용 방부제 또는 완충제 및 조립용 완충제를 포함할 수 있다. 또한, 키트에는 사용 설명서가 들어 있다.
이 키트는, 앞서 상세히 설명된 바와 같이, 특히 연구 및 의학에서 수많은 적용이 발견된다. 키트는 표적 세포로의 카고 분자의 전달을 위한 키트인 것이 특히 바람직하다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 특허 명세서가 우선할 것이다.
본원에 인용된 데이터베이스 수탁 번호를 통해 접근 가능한 모든 서열은 본 발명의 범위 내에 있으며, 과학의 지속적인 진보로 인해 발생할 수 있는 각각의 데이터베이스의 목록에서의 장래의 정정 및 수정을 설명하기 위해 데이터베이스에서의 장래의 업데이트를 또한 포함한다.
본원에 제공된 모든 아미노산 서열은, 당업계에서 관례적으로 행해지는 바와 같이, 가장 N-말단의 잔기로부터 출발하여 가장 C-말단의 잔기로 종료되고(N->C), 본 발명 전반에 걸쳐 아미노산을 확인하기 위해 사용되는 바와 같은 1-문자 또는 3-문자 코드 약어는 아미노산에 일반적으로 사용되는 것에 상응한다.
본 명세서에서, 특히 청구범위에서, 특징 지어지는 구현예들에 관하여, 종속 청구항에 언급된 각각의 구현예는 상기 종속 청구항이 인용하는 각각의 (독립 또는 종속) 청구항의 각 구현예와 조합되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 3개의 대안인 A, B 및 C를 언급하는 독립 청구항 1, 3개의 대안인 D, E 및 F를 언급하는 종속 청구항 2 및 청구항 1 및 2를 인용하며 3개의 대안인 G, H 및 I를 언급하는 종속 청구항 3의 경우, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본 명세서는 조합들, 즉, A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I에 상응하는 구현예들을 분명하게 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
유사하게, 그리고 독립 청구항 및/또는 종속 청구항이 대안을 언급하지 않는 경우에도, 종속 청구항이 복수의 선행 청구항을 재인용하면, 이에 의해 포함되는 발명 대상의 임의의 조합이 명시적으로 개시된 것으로 간주된다. 예를 들어, 독립 청구항 1, 독립 청구항 1을 재인용하는 종속 청구항 2, 및 청구항 2와 청구항 1 모두를 재인용하는 종속 청구항 3의 경우, 청구항 3과 청구항 1의 발명 대상의 조합은 청구항 3, 청구항 2 및 청구항 1의 발명 대상의 조합인 것과 같이 명확하고 분명하게 개시되어 있는 것이 된다. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나를 인용하는 추가의 종속 청구항 4가 존재하는 경우, 제4항과 제1항의 발명 대상의 조합, 제4항, 제2항 및 제1항의 발명 대상의 조합, 제4항, 제3항 및 제1항의 의 발명 대상의 조합뿐만 아니라 제4항, 제3항, 제2항 및 제1항의 발명 대상의 조합이 분명하게 개시된 것이 된다.
상기 고려 사항은 모든 첨부된 청구항들에 준용된다. 비제한적인 예를 제공하자면, 청구항 10, 청구항 9 및 청구항 6의 조합이 청구항 구조의 관점에서 명확하고 분명하게 구상된다. 동일한 것이 예를 들어 청구항 12, 청구항 9 및 청구항 7의 조합, 또는 청구항 12, 청구항 9 및 청구항 4의 조합 등에 적용된다.
도 1: JCV VLP의 개괄적 구조 및 표적화 단백질의 부착.
VP1 단백질은 EGTA 및 DTT(각각 15mM)의 첨가 후 올리고머 분획들로 해리된다. CAG-GFP 발현 카세트의 존재 하에, VP1에 CaCl2를 첨가하면서 EGTA 및 DTT가 투석에 의해 제거되어, 캡시드 형성 및 DNA의 혼입을 가져온다. 좌측 하단의 개략도에서, HER2/neu scFv 단편은 확립된 방법을 통해 폴리링커(NHS-PEG6-말레이미드)에 의해 캡시드 상으로 가교되어, 설프히드릴- 및 이소펩티드-공유결합을 생성한다. 우측 하단의 개략도에서, HER2/neu-스트렙타비딘 scFv는 LSTc-바이오틴을 통해 바이러스 캡시드 상으로 결합된다.
도 2: VLP의 표면으로의 LSTc의 친화도를 연구하기 위한 SPR(표면 플라즈몬 공명) 설정의 개략도.
도 2a) SPR-측정의 전반적인 셋업: 검정 1은 LSTc-바이오틴이 고정되고 VP1-VLP가 이동상에 존재하여 고정된 LSTc 상으로의 VP1-VLP의 결합시에만 고정되는 셋업을 도시한다. 검정 2는 VP1-VLP가 고정되고 뉴트라비딘::LSTc-바이오틴이 이동상에 존재하여 고정된 VP1-VLP 상으로의 LSTc의 결합시에 고정되는 셋업을 보여준다. 도 2b) 고정된 VP1로의 뉴트라비딘:: LSTc-바이오틴 복합체의 주입; 사용된 최고 농도는 5 μM이었음. 수득된 결합 패턴은 높은 결합력(avidity)의 상호 작용의 특징이다. 도 2c) 이동상 분석물로서의 뉴트라비딘::PEG.바이오틴의 대조-실험으로서, 고정된 VP1과의 상호 작용이 검출되지 않았음을 보여줌.
도 3: 재조합 VLP 및 JCV 캡소머에 대한 LSTc의 친화도를 입증하기 위한 SPR 측정.
도 3a) 높은 로딩 밀도 및 낮은 로딩 밀도를 갖는 뉴트라비딘::LSTc-바이오틴 매트릭스-표면. siRNA-로딩 VLP의 결합은 최대 32 nM의 농도로 모니터링되었다. 신호 패턴과 안정성은 기하 급수적 거동을 나타내며 강한 결합력 효과를 보여준다. 도 3b) 높은 로딩 밀도 및 낮은 로딩 밀도를 갖는 뉴트라비딘::LSTc-바이오틴 매트릭스-표면. siRNA-로딩 VLP의 결합은 최대 98 nM의 농도로 모니터링되었다. 신호 패턴과 안정성은 지수적 거동을 다시 보여주며, 이는 강한 결합력 효과를 뒷받침한다.
도 4: 관련 인간 세포주에서의 HT2R 아형(a, b 또는 c) 발현을 조사하기 위한 인간 세포주에서의 5HT2R(세로토닌 수용체) 발현 분석. 막대는 사용된 세포주(Hela, SW480 및 Skbr3)에 대해 수득된 qRT-PCR 분석 결과를 보여주고, 5-HT2 세로토닌 수용체 아이소형 a, b, 및 c의 상대적인 발현뿐만 아니라 HER2/neu의 상대적인 발현도 도시한다.
도 5: SKBR3 세포의 형질도입.
도 5a) CAG-GFP 발현 카세트가 로딩된 본래의 VLP(좌측에 "재표적화 없음" 또는 "비재표적화됨(unretargeted)"으로 표시됨)에 의한 형질도입 후, 및 CAG-GFP 발현 카세트가 로딩된 재표적화된 VLP에 의한 형질도입 후의 GFP-발현을 위한 SKBR3의 위상차- 및 UV-사진. HER2/neu scFv로의 가교는 NHS-PEG6-말레이미드로 수행되었고, HER2/neu-스트렙타비딘 scFv가 LSTc-바이오틴에 의해 VLP 상으로 결합되었다(스케일 바: 200 μm, 노출 시간 1 초). 도 5b) SKBR3의 FACS 분석은 비재표적화된 VLP 및 재표적화된 VLP의 사용에 의한 GFP-양성 집단의 상이한 백분율을 보여주었다(재표적화 없음: 50%, NHS-PEG6-말레이미드: 55%, LSTc-바이오틴: 55%).
도 6: SW480 세포의 형질도입.
도 6a) CAG-GFP 발현 카세트가 로딩된 본래의 VLP(좌측에 "재표적화 없음" 또는 "비재표적화됨"으로 표시됨)에 의한 형질도입 후, 및 CAG-GFP 발현 카세트가 로딩된 재표적화된 VLP에 의한 형질도입 후의 GFP-발현을 위한 SW480의 위상차- 및 UV-사진. HER2/neu scFv로의 가교는 NHS-PEG6-말레이미드로 수행되었고, HER2/neu-스트렙타비딘 scFv가 LSTc-바이오틴에 의해 VLP 상으로 결합되었다(스케일 바: 200 μm, 노출 시간 1 초). 도 6b) SW480의 FACS 분석은 비재표적화된 VLP 및 재표적화된 VLP의 사용에 의한 GFP-양성 집단의 상이한 백분율을 보여주었다(재표적화 없음: 20%, NHS-PEG6-말레이미드: 55%, LSTc-바이오틴: 65%).
하기 실시예는 본 발명을 예시한다:
실시예 1 : 재료 및 방법
GFP-발현 카세트 생성
CAG-GFP 발현 작제물을 pAAV-CAG-GFP 플라스미드(Addgene #28014)(정방향 5'-3' GATCGTACCATTGACGTCAATAATG(SEQ ID NO: 19), 역방향 5'-3' TCTCCCCCTGAACCTGAAAC(SEQ ID NO: 20))로부터 증폭시켰다. 앰플리콘을 TA-클로닝을 통해 pGEM®-T Easy 벡터(Promega) 내로 전달하였다. 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 번역후 조절 요소(WPRE) 서열을 플라스미드의 PCR-증폭에 의해 제거한 후, 자가-리게이션시켰다(정방향 5'-3'p-TCGATACCGTCGACCCG(SEQ ID NO: 21), 역방향 5'-3' p-TTATCGATAAGCTTGATATCGAATTC(SEQ ID NO: 22)). 선형 발현 카세트를 SacI/SphI 분해에 의해 생성시켜, 1946bp 작제물을 만들어 내었다. 선형 DNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 QIAquick® 겔 추출 키트(Qiagen)로 정제하였다.
VLP 생성 및 로딩
JC 폴리오마 바이러스-유사 입자를 다른 문헌에 기술된 바와 같이 생성하였다[57]. 형질도입을 위해, 요망되는 양의 VLP를 해체 완충제(150 mM NaCl 및 각각 15 mM EGTA 및 DTT를 함유하는, 10 mM HEPES[pH 7.4])에서 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 25 ㎍의 VLP 당, 총 500 ng의 선형화된 GFP-발현 작제물을 첨가하고, 실온에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 밤새 일정한 교반 하에 4℃에서 5 L의 재조립 완충제(150 mM NaCl 및 1 mM CaCl2를 함유하는, 10 mM HEPES[pH 7.4])에 대해 투석함으로써 VLP를 재조립하였다.
ScFv 생성 및 가교
HER2/neu ScFv DNA를 피치아 파스토리스에서의 발현을 위한 코돈-최적화 작제물로서 다른 문헌[58, 59]에 공표된 서열에 기초하여 Geneart로부터 주문하였고, XbaI/XhoI 앰플리콘으로서 pPICZαA-벡터(Invitrogen) 내로 전달하였다. 스트렙타비딘을 pTSA-c 플라스미드(Addgene # 17329)로부터 scFv의 c-말단까지 중첩 연장 PCR에 의해 융합시켰다. 선형화된 플라스미드를 인간화된 P. 파스토리스 SuperMan5 균주(his+)로 형질전환시키고, 표준 조건 하에서 성장시켰다. 간략하게 말하면, 24시간마다 1%의 최종 농도로 메탄올을 공급하면서 BMMH 풀(full) 배지에서 28℃ 및 160 rpm에서 작제물의 발현을 수행하였다. 3일 후, 상층액을 원심 분리(30분, 10000 x g, RT)로 수거하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다. 고정된 금속 이온 친화도 크로마토그래피(IMAC)에 의해 HER2/neu scFV 및 HER2/neu-스트렙타비딘 scFv를 상층액으로부터 부화(enrichment)시켰다. ScFv-함유 용리액 분획을 일정한 교반 하에 4℃에서 재조립 완충제에 대해 밤새 투석하고, 후속하여 4℃에서 비바스핀(Vivaspin) 컬럼(MWCO 5 kDa)을 사용하여 0.5 내지 1 mg/mL의 요망되는 농도로 농축시켰다.
HER2/neu scFv와의 가교를 위해, 요망되는 양의 HER2/neu scFv를 5 mM의 최종 농도의 DTT와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 가교를 위해 N-말단 시스테인을 환원시켰다. 과량의 DTT를 겔 여과(PD10 탈염 컬럼)에 의해 제거하고, HER2/neu ScFv를 비바스핀 컬럼(MWCO 5 kDa)에 의해 농축시켰다.
요망되는 양의 CAG-GFP 로딩된 VLP를 제조업체의 프로토콜에 따라 NHS-PEG6-말레이미드(독일 드라이아이히 소재의 Invitrogen)와 인큐베이션하였다. 실온에서 1시간의 인큐베이션 후, 잔류 NHS-PEG6-말레이미드를 겔여과(재조립 완충액으로 평형이 이루어진 PD10 탈염 칼럼)에 의해 제거하고, 코팅된 VLP를 비바스핀 칼럼(MWCO 30 kDa)을 사용하여 농축시켰다.
이어서, 코팅된 VLP를 형질도입에 사용하기 전에 환원된 HER2/neu ScFv와 함께 1:5(10㎍ VLP/50㎍ scFv)의 최종 비로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
본 발명의 방법을 통한 HER2/neu-스트렙타비딘의 가교를 위해, 300 ㎍의 HER2/neu scFv(0.5 mg/mL)를 160 μM의 최종 농도의 락토시리즈 사당류 c(LSTc)-바이오틴과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 과량의 LSTc-바이오틴을 겔여과(PD10 탈염 컬럼)에 의해 제거하고, LSTc-바이오틴-접합 HER2/neu-스트렙타비딘 scFv를 비바스핀 컬럼(MWVA 5 kDa)에 의해 농축시켰다. VLP를 형질도입에 사용하기 전에 LSTc-바이오틴-접합 HER2/neu-스트렙타비딘 scFv와 함께 1:2(10㎍ VLP/20㎍ scFv)의 최종 비로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
형질도입 실험
VLP 형질도입 실험의 경우, 세포주 SKBR3 및 SW480을 24-웰 플레이트에서 25,000개 세포/웰의 밀도로 FCS(10%) 및 Pen/Strep(1%)을 함유하는 DMEM 배지에 시딩하고, 표준 배양 조건 하에서 밤새 성장시켰다. 형질도입 전에, 배지를 Pen/Strep(1%)을 함유하는 FCS 비함유 DMEM으로 변경하였다. 웰당, 500 ng의 CAG-GFP 발현 카세트로 패키징된, 25 ㎍의 wt, NHS-PEG6-말레이미드 HER2/neu scFv, 또는 LSTc-바이오틴 HER2/neu-스트렙타비딘 scFv 코팅된 VLP를 첨가하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, FCS 함유 DMEM을 첨가하고, 세포를 추가로 48시간 동안 인큐베이션하였다. 형질도입 후 3일째에, 세포를 현미경검사 및 FACS에 의해 GFP-발현에 대해 분석하였다.
정량적 PCR 분석
제조 프로토콜(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 Thermo Fisher Scientific의 Trizol)에 따라 페놀/클로로포름 추출을 통해 총 RNA를 분리하였다. 시너지 시스템(synergy system)(미국 버몬트주 위누스키 소재의 Biotek)에 의해 RNA를 측정하고, 1000 ng의 총 RNA를 센시패스트(Sensifast) cDNA 합성 키트(영국 런던 소재의 Bioline)를 사용하여 역전사하고, 1μL의 수득된 cDNA를 ABI 스텝원플러스(StepOnePlus) 시스템(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 Applied biosystems)에서의 정량 분석을 위해 사용하였다. 5-HT2a, 5-HT2b 및 5-HT2c의 상대적 발현은 하우스키핑(housekeeping) 유전자로서 β2M을 사용하여 ΔΔCT-방법을 통해 계산하였다. 5-HT2a 아이소형의 분석을 위해, SKBR3- 및 SW480-세포에서 이러한 아이소형의 낮은 발현으로 인해 HeLa 세포를 정규화에 사용하였다.
Figure pct00001
유세포 분석
세포를 트립신처리하고, PBS 중의 2% PFA로 4℃에서 20분 동안 고정시켰다. 유세포 분석은 BD LSR II 기기(BD Biosciences)를 사용하여 수행하였고, GFP에 사용된 필터는 488 nm 레이저를 사용하는 (505LP-BP530/30)이었다. 플로잉(flowing) 소프트웨어인 플로우 코어 바이오컨덕터 패키지(flow Core Bioconductor package) 및 GraphPad 소프트웨어(미국 캘리포니아주 라호야 소재의 GraphPad Software의 윈도우즈용 GraphPad Prism 버전 7.00)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 막대그래프를 위해, 게이팅(gating)되고 비닝(binning)된 데이터를 플로잉 소프트웨어로부터 추출하고, % max(모든 비닝된 데이터로부터의 bin 값/max 값)에 의해 정규화하고, GraphPad를 사용하여 플로팅하였다.
실시예 2 : VLP의 재표적화
인간 JC 폴리오마 바이러스의 재조합적으로 발현된 VP1을 다른 문헌에 기술된 바와 같이 균질하게 되도록 정제하였다. 정제 후, VLP를 시험관내 DNA 패키징 공정에 적용하였다. VLP는 환원제 및 킬레이트제(DTT 및 EGTA)의 존재 하에 더 작은 단량체 및 올리고머(도 1)로 해리되는 것으로 알려져 있다. 이들 분획은 CaCl2의 존재 하에 기능적 VLP로 재조립될 수 있는 한편 첨가된 DTT 및 EGTA를 투석에 의해 회수할 수 있다. 이 공정 동안, 핵산과 같은 카고 분자가 첨가되어, 로딩된 VLP를 생성할 수 있다. 본 실험에서, CAG-GFP 발현 카세트가 로딩된 VLP를 사용하였다.
VLP의 향성을 변경하기 위해, LSTc에 결합하는 VLP 능력에 기초한 본 발명의 재표적화 접근법을 이용하였다. LSTc를 바이오틴에 융합시킴으로써, scFv-스트렙타비딘 융합 작제물을 VLP 상으로 부착시키는 것이 가능하였다. 비교 실험에서, scFv를 입자의 표면 상으로 공유 결합시켰다. 이 접근법을 위해, VLP의 외부 표면의 유연한 루프에 위치한 2개의 리신-잔기(K60 및 K164)를 이용하였다. 더욱이, scFv는 c-말단 시스테인을 보유하였고, 이 c-말단 시스테인은 각 단부에 2개의 상이한 작용기를 갖는 폴리링커(SM-PEG6-말레이미드)의 사용이 리신-잔기를 scFv와 연결시킬 수 있게 하였다.
이어서, 이렇게 재표적화된 VLP를 HER2/neu 양성 포유류 유방암 및 결장직장암 세포주(SKBR3 및 SW480)를 형질도입시키기 위해 사용하였다.
실시예 3: 5-HT2 세로토닌 수용체 발현 및 Her2/neu 발현의 분석
코팅되지 않은 VLP는 세포를 형질도입시키기 위해 5-HT2 세로토닌 수용체를 필요로 하기 때문에, 본원에 사용된 세포 SKBR3 및 SW480에서의 3개의 5-HT2 아이소형 a, b 및 c의 발현을 초기에 분석하였다(도 4). HeLa 세포를 5-HT2a 아이소형에 대한 대조군으로서 사용하였는데, 이는 SKBR3 및 SW480이 이 아이소형의 낮은 발현(HeLa의 1/5 내지 1/10)만을 나타내기 때문이다. 5-HT2b 아이소형은 HeLa 세포와 비교할 때 SKBR3 세포에서 수백배의 과발현을 나타낸다. 따라서, 데이터의 정규화를 위해 SKBR3을 선택하였다. HeLa, SW480 및 Raji 세포에서의 5-HT2b 아이소형의 발현율의 상응하는 정규화는 배경 수준에 가까운 상대 값을 가져왔다. 동일한 결과가 5-HT2c 아이소형으로 수득되었다.
SW480 및 SKBR3 세포에서의 Her2/neu의 발현 분석은 본원에 사용된 세포 상에서의 이 수용체의 존재를 추가적으로 확인해 주었다. SKBR3과 SW480 둘 모두는 수용체의 높은 발현을 나타내는데, SKBR3은 2배 더 높은 발현율을 나타내었다.
실시예 4: VLP에 의한 HER2/neu 양성 세포주 SKBR3 및 SW480의 형질도입
재표적화되지 않고(즉, "비재표적화된 VLP") CAG-GFP 발현 카세트가 로딩된 VLP를 사용하여, SKBR3 및 SW480 세포를 형질도입시키는 것이 가능하였다(도 5 및 도 6, 도면들의 좌측). FACS 분석은 시험된 세포주에 대한 GFP-양성 세포의 상이한 값(SKBR3: 50%, SW480: 20%)을 드러내면서 이 결과를 뒷받침하였다.
HER2/neu 양성 세포주를 더욱 효율적으로 형질도입시키기 위해, JCV 유래 VLP의 세로토닌성 향성을 변경시켰다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 재표적화된 VLP를 사용하여, 둘 모두의 재표적화 접근법으로 사용된 CAG-GFP 발현 카세트로 SW480 및 SKBR3 세포를 형질도입시키는 것이 가능하였다(도 5 및 도 6, 도면들의 중간 및 우측). 이러한 발견은 FACS 분석(NHS-PEG6-말레이미드: SKBR3: 55%, SW480: 55%; LSTc-바이오틴: SKBR3: 55%, SW480: 65%)에 의해 뒷받침되었다.
SKBR3 세포는 Her2/neu뿐만 아니라 본래의 JCV 수용체도 발현하기 때문에, JCV의 비재표적화된 VLP와 재표적화된 VLP 둘 모두는 이들 세포를 형질도입시킬 수 있다. 그러나, SW480 세포는 Her2/neu만을 발현하므로, 형질도입 효율의 유의한 증가가 상기 기술된 실험에서 관찰되었다. 더욱이, 본 발명의 재표적화 접근법은 덜 번거롭고 시간이 덜 소요되는 재표적화 방법을 나타낼뿐만 아니라, 효율의 추가의 증가(즉, SW480 세포에서 20%에서 65%로의 증가)도 가져왔다.
참고 문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> Deutsches Primatenzentrum GmbH (DPZ) - Leibniz-Institut fuer Primatenforschung <120> Retargeting of Viruses or VLPs <130> Z2186 PCT <150> EP 17 15 4380.4 <151> 2017-02-02 <160> 32 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 1065 <212> DNA <213> JC polyomavirus <220> <223> VP1 capsid protein coding sequence <400> 1 atggccccaa caaaaagaaa aggagaaagg aaggaccccg tgcaagttcc aaaacttctt 60 ataagaggag gagtagaagt tctagaagtt aaaactgggg ttgactcaat tacagaggta 120 gaatgctttt taactccaga aatgggtgac ccagatgagc atcttagggg ttttagtaag 180 tcaatatcta tatcagatac atttgaaagt gactccccaa atagggacat gcttccttgt 240 tacagtgtgg ccagaattcc actacccaat ctaaatgagg atctaacctg tggaaatata 300 ctcatgtggg aggctgtgac cttaaaaact gaggttatag gggtgacaag tttgatgaat 360 gtgcactcta atgggcaagc aactcatgac aatggtgcag ggaagccagt gcagggcacc 420 agctttcatt ttttttctgt tgggggggag gctttagaat tacagggggt gctttttaat 480 tacagaacaa agtacccaga tggaacaatt tttccaaaga atgccacagt gcaatctcaa 540 gtcatgaaca cagagcacaa ggcgtaccta gataagaaca aagcatatcc tgttgaatgt 600 tgggttcctg atcccaccag aaatgaaaac acaagatatt ttgggacact aacaggagga 660 gaaaatgttc ctccagttct tcatataaca aacactgcca caacagtgtt gcttgatgaa 720 tttggtgttg ggccactttg caaaggtgac aacttatact tgtcagctgt tgatgtctgt 780 ggcatgttta caaacaggtc tggttcccag cagtggagag gactctccag atattttaag 840 gtgcagctaa ggaaaaggag ggttaaaaac ccctacccaa tttctttcct tcttactgat 900 ttaattaaca gaaggactcc tagagttgat gggcagccta tgtatggcat ggatgctcaa 960 gtagaggagg ttagagtttt tgagggaaca gaggagcttc caggggaccc agacatgatg 1020 agatacgttg acaaatatgg acagttgcag acaaaaatgc tgtaa 1065 <210> 2 <211> 354 <212> PRT <213> JC polyomavirus <220> <223> Major capsid protein VP1 <400> 2 Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Arg Lys Asp Pro Val Gln Val 1 5 10 15 Pro Lys Leu Leu Ile Arg Gly Gly Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr 20 25 30 Gly Val Asp Ser Ile Thr Glu Val Glu Cys Phe Leu Thr Pro Glu Met 35 40 45 Gly Asp Pro Asp Glu His Leu Arg Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile 50 55 60 Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met Leu Pro Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Ala Arg Ile Pro Leu Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr 85 90 95 Cys Gly Asn Ile Leu Met Trp Glu Ala Val Thr Leu Lys Thr Glu Val 100 105 110 Ile Gly Val Thr Ser Leu Met Asn Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr 115 120 125 His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr Ser Phe His Phe 130 135 140 Phe Ser Val Gly Gly Glu Ala Leu Glu Leu Gln Gly Val Leu Phe Asn 145 150 155 160 Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Thr Ile Phe Pro Lys Asn Ala Thr 165 170 175 Val Gln Ser Gln Val Met Asn Thr Glu His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys 180 185 190 Asn Lys Ala Tyr Pro Val Glu Cys Trp Val Pro Asp Pro Thr Arg Asn 195 200 205 Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr Leu Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro 210 215 220 Pro Val Leu His Ile Thr Asn Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu 225 230 235 240 Phe Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys Gly Asp Asn Leu Tyr Leu Ser Ala 245 250 255 Val Asp Val Cys Gly Met Phe Thr Asn Arg Ser Gly Ser Gln Gln Trp 260 265 270 Arg Gly Leu Ser Arg Tyr Phe Lys Val Gln Leu Arg Lys Arg Arg Val 275 280 285 Lys Asn Pro Tyr Pro Ile Ser Phe Leu Leu Thr Asp Leu Ile Asn Arg 290 295 300 Arg Thr Pro Arg Val Asp Gly Gln Pro Met Tyr Gly Met Asp Ala Gln 305 310 315 320 Val Glu Glu Val Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu Glu Leu Pro Gly Asp 325 330 335 Pro Asp Met Met Arg Tyr Val Asp Lys Tyr Gly Gln Leu Gln Thr Lys 340 345 350 Met Leu <210> 3 <211> 1089 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyoma VP1-Mut2 <400> 3 atggccccaa caaaaagaaa aggagaatgt ccaggggcag ctcccaaaaa accaaaggac 60 cccgtgcaag ttccaaaact tcttataaga ggaggagtag aagttctaga agttaaaact 120 ggggttgact caattacaga ggtagaatgc tttttaactc cagaaatggg tgacccagat 180 gagcatctta ggggttttag taagtcaatt tctatatcag atacatttga aagtgactcc 240 ccaaataagg acatgcttcc ttgttacagt gtggccagaa ttccactacc caatctaaat 300 gaggatctaa cctgtggaaa tatactaatg tgggaggctg tgaccttaaa aactgaggtt 360 ttaggggtga caactttgat gaatgtgcac tctaatggtc aagcaactca tgacaatggt 420 gcaggaaagc cagtgcaggg caccagcttt catttttttt ctgttggggg ggaggcttta 480 gaattacagg gggtggtttt taactacaga acaaagtacc cagatggaac aatttttcca 540 aagaatgcaa cagtgcaatc tcaagtaatg aacacagagc acaaggcgta cctagataag 600 aacaaagcat atcctgttga atgttgggtt cctgatccca ccagaaatga aaacacaaga 660 tattttggga cactaacagg aggagaaaat gttcctccag ttcttcatat aacaaacact 720 gccacaacag tgctgcttga tgaatttggt gttgggccac tttgcaaagg tgacaacttg 780 tatttgtcag ctgttgatgt ttgtggaatg tttactaaca gatctggtac ccagcagtgg 840 agaggactgt ccagatattt taaggttcag ctgagaaaaa ggagggttaa aaacccctac 900 ccaatttctt tccttcttac tgatttgatt aacagaagga cccctagagt tgatgggcag 960 cctatgtatg gtatggatgc tcaggtagag gaggttagag tttttgaggg gacagaggaa 1020 cttccagggg acccagacat gatgagatat gttgacagat atggacagtt gcaaacaaag 1080 atgctgtaa 1089 <210> 4 <211> 362 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1-Mut2 <400> 4 Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Cys Pro Gly Ala Ala Pro Lys 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Pro Val Gln Val Pro Lys Leu Leu Ile Arg Gly Gly 20 25 30 Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr Gly Val Asp Ser Ile Thr Glu Val 35 40 45 Glu Cys Phe Leu Thr Pro Glu Met Gly Asp Pro Asp Glu His Leu Arg 50 55 60 Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser 65 70 75 80 Pro Asn Lys Asp Met Leu Pro Cys Tyr Ser Val Ala Arg Ile Pro Leu 85 90 95 Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr Cys Gly Asn Ile Leu Met Trp Glu 100 105 110 Ala Val Thr Leu Lys Thr Glu Val Leu Gly Val Thr Thr Leu Met Asn 115 120 125 Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro 130 135 140 Val Gln Gly Thr Ser Phe His Phe Phe Ser Val Gly Gly Glu Ala Leu 145 150 155 160 Glu Leu Gln Gly Val Val Phe Asn Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro Asp Gly 165 170 175 Thr Ile Phe Pro Lys Asn Ala Thr Val Gln Ser Gln Val Met Asn Thr 180 185 190 Glu His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys Asn Lys Ala Tyr Pro Val Glu Cys 195 200 205 Trp Val Pro Asp Pro Thr Arg Asn Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr 210 215 220 Leu Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro Pro Val Leu His Ile Thr Asn Thr 225 230 235 240 Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Phe Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys 245 250 255 Gly Asp Asn Leu Tyr Leu Ser Ala Val Asp Val Cys Gly Met Phe Thr 260 265 270 Asn Arg Ser Gly Thr Gln Gln Trp Arg Gly Leu Ser Arg Tyr Phe Lys 275 280 285 Val Gln Leu Arg Lys Arg Arg Val Lys Asn Pro Tyr Pro Ile Ser Phe 290 295 300 Leu Leu Thr Asp Leu Ile Asn Arg Arg Thr Pro Arg Val Asp Gly Gln 305 310 315 320 Pro Met Tyr Gly Met Asp Ala Gln Val Glu Glu Val Arg Val Phe Glu 325 330 335 Gly Thr Glu Glu Leu Pro Gly Asp Pro Asp Met Met Arg Tyr Val Asp 340 345 350 Arg Tyr Gly Gln Leu Gln Thr Lys Met Leu 355 360 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuclear localization signal <400> 5 Cys Pro Gly Ala Ala Pro 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substance-P <400> 6 Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Toll Like Receptor-4 (TLR-4) Agonist Peptide <400> 7 Gln Glu Ile Asn Ser Ser Tyr 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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aacctgaaac 20 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for woodchuck hepatitis virus posttranslational regulatory element (WPRE) <400> 21 tcgataccgt cgacccg 17 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for woodchuck hepatitis virus posttranslational regulatory element (WPRE) <400> 22 ttatcgataa gcttgatatc gaattc 26 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b2m forward primer <400> 23 tgtgctcgcg ctactctctc t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b2m reverse primer <400> 24 cggatggatg aaacccagac a 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ht2a forward primer <400> 25 aactccagaa ctaaggcatt t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ht2a reverse primer <400> 26 cttaaagacc ttcgaatcgt c 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ht2b forward primer <400> 27 cacgggctac agcattcatc a 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ht2b reverse primer <400> 28 ccaaaacgtt cctttgtcag c 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ht2c forward primer <400> 29 ccgagtccgt ttctcgtcta g 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ht2c reverse primer <400> 30 gatggcgtca gttggcctat g 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Her2/neu forward primer <400> 31 cctctgacgt ccatcgtctc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Her2/neu reverse primer <400> 32 cggatcttct gctgccgtcg 20

Claims (15)

  1. 관심있는 세포에 결합하는 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하는 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 바이러스-유사 입자(VLP)를 생성하는 방법으로서, 상기 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를,
    (i) 상기 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화된, 상기 적어도 하나의 표적화 분자와 접촉시키거나;
    (ii) 상기 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화된, 제1 상호 작용 분자; 및
    상기 제1 상호 작용 분자와 상호 작용할 수 있는 제2 상호 작용 분자에 접합된, 상기 적어도 하나의 표적화 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리오마 바이러스가 인간 폴리오마 JC 바이러스이거나, 상기 VLP가 인간 폴리오마 JC 바이러스로부터 유래되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 VLP가 인간 폴리오마 JC 바이러스의 캡시드 단백질 VP1을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코실 잔기가 락토시리즈 사당류 c(LSTc), GM1, 아시알로-GM1, GM2, GD1a, GD1b, GD2, GT1a, GT1b, GM3, GD3, 및 GQ1b로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 표적화 분자가 단백질, 펩티드, 또는 탄수화물로부터 선택되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 표적화 분자가 항체, 트랜스페린, 표피 성장 인자(EGF) 패밀리 구성원, 사이토카인, 부분적 바이러스 당단백질, CD9, CD63, var2csa, 인슐린 또는 GABA에 대한 리간드로부터 선택된 단백질인, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 표적화 분자가 물질-P, 오피오이드 또는 세포-침투 펩티드로부터 선택된 펩티드인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 상호 작용 분자가 아비딘 및 바이오틴, 스트렙타비딘 및 바이오틴, 또는 뉴트라비딘(NeutrAvidin) 및 바이오틴인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 또는 VLP가 상기 바이러스 또는 VLP 내에 하나 이상의 카고(cargo) 분자(들)를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 또는 VLP가 상기 바이러스 또는 VLP의 표면 상에 추가의 이종성 분자를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 바이러스-유사 입자(VLP)로서, 상기 바이러스 또는 VLP는 관심있는 세포에 결합하는 적어도 하나의 표적화 분자를 표면 상에 보유하고, 상기 적어도 하나의 표적화 분자는 다음과 같은 것을 통해 상기 바이러스 또는 VLP의 표면에 결합되어 있는, 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP:
    (i) 적어도 하나의 글리코실 잔기에 의한 상기 적어도 하나의 표적화 분자의 글리코실화로서, 상기 적어도 하나의 글리코실 잔기는 상기 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되어 결합되는, 글리코실화; 또는
    (ii) 적어도 2개의 상호 작용 분자 사이의 상호 작용으로서, 제1 상호 작용 분자는 적어도 하나의 글리코실 잔기로 글리코실화되고, 상기 적어도 하나의 글리코실 잔기는 상기 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP에 의해 인식되어 결합되며; 상기 적어도 하나의 표적화 분자는 상기 제1 상호 작용 분자와 상호 작용할 수 있는 제2 상호 작용 분자에 접합되는, 상호 작용.
  12. 제11항에 있어서, 상기 바이러스 또는 VLP가 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는, 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP.
  13. 제11항 또는 제12항의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP를 포함하는, 조성물.
  14. 의약으로서 사용하기 위한, 제11항 또는 제12항의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 VLP 또는 제13항의 조성물.
  15. 제11항 또는 제12항의 폴리오마 바이러스 또는 폴리오마 바이러스-유래 바이러스-유사 입자(VLP), 또는 제13항의 조성물을 포함하는, 키트.
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