KR20190101350A - 세포 표적화 및 약물 방출 기능이 있는 약물운반체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 표적화 및 약물방출 기능이 있는 약물운반체에 관한 것으로서,　특정 세포표면에 결합하는 부위, 약물방출 기능을 갖는 부위, 및 표적약물을 포함하는 약물운반체를 제공한다. 본 발명의 약물운반체는 특정 세포표면에 결합하는 물질과　엔도좀 구조 변화를 유도하여 약물방출을 증가시키는 물질에 의하여 간편하게 제조될 수 있고, 특정 세포를 표적화하여 엔도좀에 구획되고 동시에 엔도좀에서 약물의 방출을 증가시킴으로써, 특정 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있어, 이를 제약분야에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

세포 표적화 및 약물 방출 기능이 있는 약물운반체{Drug Delivery System with Cell Targeting and Drug Release Function}
본 발명은 암세포에 특이적으로 분포하는 분자에 특이적으로 강력하게 결합하는 물질과 엔도좀 구조 변화를 유도하는 물질을 포함하는 약물운반체를 사용하여 약물이 암세포에 표적화하고 엔도좀에 포집되고 동시에 엔도좀에서 약물의 방출을 증가시켜 암세포를 사멸시킬 수 있는 상기 약물운반체의 용도에 관한 것이다.
특정 장기, 조직 및 세포 부위로 다양한　약물(예를 들면, 저분자량의 화학적 약물 및 조영제 뿐만 아니라 고분자량의 펩타이드, 단백질 및 유전물질)를 전달하기 위한 효과적인 시스템 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 일반적으로 이런 시스템은 특정 세포에 특이적으로 존재하는 분자에 특이적으로 강력하게 결합하는 물질을 사용하여 완성된다. 전통적인 제형과 다르게, 위치-특이적　치료제는 표적 부위에 전달된 치료제의 생물학적 이용가능성(bioavailability)이 최대화되도록 고안되었고,　낮은 부작용으로 질병을 치료하면서 치료 효과를 높일 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 약물전달 기술은 고부가가치 기술로서 전체 약물 개발 과정에서 갈수록 중요한 부문을 차지하고 있고, 환자들의 약물 순응도와 복용의 편리성을 제고시키는 방법으로 그 활용도가 증가하고 있다.
최근에는 다양한 약물(예: DNA, siRNA, 펩타이드, 단백질)을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위해 막투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP), 엔도좀의 pH를 산성화시키는 펩타이드(pH-dependent membrane-active peptides, PMAP), glycosylated triterpenoids 및 polymer 를 많이 활용하고 있다(Morris et al., Nat. Biotechnol. 19(2001) 1173-1176; Jarver et al., Drug Discov.Today 9(2004) 395-402; Pharmaceuticals 2012, 5, 1177-1209). 그 동안 비침투성 약물전달에 있어 약물로 사용하기 어려웠던 치료용 펩타이드, 단백질 및 유전자와 같은 거대 분자들의 체내 전달 효율을 높일 수 있기 때문에 CPP 또는 PMAP 펩타이드를 이용한 약물전달이 매우 큰　관심을 불러일으키고 있다.
나노입자 약물 전달 시스템 (Nanoparticle drug delivery system; NDD)은 지난 수십 년 동안 광범위하게 연구되어 왔으며 암 표적 치료제 개발에 주요 관심이 되었다. NDD는 부작용을 개선하고 치료 효과를 향상시키기 위해 약물의 생체 분포 및 약물 동태 특성을 변경시킨다. 이러한 긍정적인 효과는 종양 또는 혈관 세포에 특이적인 결합, 향상된 투과성 및 보유 (EPR) 효과, 종양의 고유한 병태생리 및 미세환경 (예 : pH, 산화 환원, 효소, 또는 다른 자극 등에 민감한 나노 입자)을 사용할 수 있는 NDD의 성질에서 기인한다.
본 발명자들은 다양한 표적약물을 특정세포로 특이적으로 운반하고 효과적으로 방출시킬 목적으로 약물운반체를 개발하기 위해 예의 노력한 결과로, 약물운반체들의　다양한 용도를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 특정 세포 표적화와 향상된 약물 방출 기능을 갖는 약물운반체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약물운반체의 구성을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약물운반체를 포함하는 제제를 제공하는 것이다.
본 발명은 표적약물을 표적화하여 특정세포에 운반하고 엔도좀 내재화 과정으로 포집화된 약물운반체 또는 표적약물의 방출을 증가시키는 약물운반체를 제공하고자한다.
본 발명의 약물운반체(drug delivery system)는 최소한 (a) 세포표면에 특이적으로 결합하는 물질로 이루어진 세포 표적화 도메인(Cell Targeting Domain, CTD); (b) 약물의 방출을 유도하는 물질로 이루어진 약물 방출 도메인(Drug Release Domain, DRD); 및 (c) 표적약물을 구성단위로 포함한다(도1 참조).
바람직한 약물운반체는 세포 표면 분자에 대한 친화력을 통해 표적 기능을 제공한다. 상기 세포표면 분자에 특이적으로 결합하는 물질은 항체 또는 이의 특이적 결합 부분, 리간드, 사이토카인, 케모카인 또는 핵산 압타머를 포함하는 군에서 선택되는 하나이다. "특이적 결합 부분"은 항원과 상호작용하는 항체의 펩타이드 도메인으로 한정된다.
바람직하게, 약물 활성을 특이 세포, 조직에 전달하는 방법도 제공된다. 하나의 접근법으로서 생물학적으로 활성이고 세포에 특이적인 본 발명의 약물운반체를 개체에 투여한다. 세포에 특이적인 약물운반체가 개체에 개별적으로 투여되며 상기 약물운반체가 세포표면분자와 비-공유적으로 결합할 때 세포-약물운반체 복합체가 생체 내에서 형성된다. 상기 복합체가 엔도좀포집에 의해 세포내로 유입된 후 엔도좀구조 변화에 의해 세포내에 방출되어 약물 활성이 특이세포에 전달한다.
일부 약물운반체들은 특정 단백질에 결합하는 물질을 이용한 특정세포 표적화 전략, 수용체-매개 엔도사이토시스(receptor-mediated endocytosis)에 의해 세포외 공간에서 세포 내로 이동할 수 있으나, 이들은 적절한 세포 구획(compartment)으로 방출되기보다는 엔도좀(endosome) 내에 포획되어 리소좀(lysosome)에서 분해될 수 있다. 이러한 문제점을 회피하기 위한 전략이 필요하다. 또한, 이 전략들을 사용하여 단백질을 세포 내로 전달할 수 있더라도, 세포 내에서의 약물운반체의 낮은 안정성은 약물운반체의 광범위한 적용을 여전히 방해한다. 다양한 가능성이 있는 불활성화 인자들 중에서, 엔도좀 포획은 중요한 인자이며, 성공적인 세포내 약물운반체 전달을 보장하기 위해 해결해야 할 필요가 있다. 예를들면, 리포솜-피복(liposome-wrapped) 단백질은 낮은 효율로 세포질로 이동시킨다. 최근에, 여러 소분자 양이온성 펩타이드(small cationic peptide),세포-투과 펩티드(cell-penetrating peptide; CPP)가 동정되었으며, 단백질 전달을 보조하기 위해 사용되고 있다. 현저하게 개선된 세포내 전달 효율 및 세포 내에서의 활성 유지로 인해, 이 전략은 약제학적 적용에 있어서 유망하다. 그러나 이런 펩타이드는 부분적으로는 특정세포에 대한 낮은 표적화, 혈청 중에서의 낮은 안정성 및 세포막을 통한 약한 투과성 때문에, 임상 적용에 한계가 있다.
약물운반체의 세포내 사용은 암 및 많은 질환의 치료에 매우 중요하다. 그러나, 세포외 사용목적 약물운반체의 광범위한 적용과 비교하여, 세포내 사용 목적 약물운반체는, 부분적으로는 특정세포에 대한 낮은 표적화, 혈청 중에서의 낮은 안정성 및 세포막을 통한 약한 투과성 때문에, 임상 적용에 한계가 있다.
본 발명자들은 특정세포에 표적약물의 표적화 정도를 높이기 위해 특정 세포표면에 결합하는 세포 표적화 도메인(Cell Targeting Domain, CTD), 엔도좀 구조 변화를 유도하여 엔도좀에서 약물운반체 또는 표적약물의 방출을 증가시키는 약물 방출 도메인(Drug Releasing Domain, DRD) 및 표적약물을 구성성분으로 하는 약물운반체를 제조함으로써, 상기 제조된 약물운반체의 CTD가 특정 세포 표면과 상호 작용하며 표적약물의 특정세포에 대한 표적화 정도를 높이고, 이에 따라, 상기 약물운반체가 엔도좀 형태로 세포내로 유입되며 동시에 상기 약물운반체의 DRD와 엔도좀 사이의 상호 작용으로 엔도좀에서 방출이 증가된 상기 약물운반체의 약물이 원하는 장소에서 원하는 효과를 발휘시킬 수 있음을 발견하여, 세포 표적화 및 약물방출 향상 기능이 있는 약물운반체를 제공하는 것이다.
본 발명은 다양한 적용에 유용한 고유의 특이성과 생물학적 성질을 지닌 약물운반체를 제공하는 것이다.
질환이나 상태가 표적분자를 발현하는 세포, 조직을 포함하는 개체내 질환 또는 증상의 치료 또는 예방 방법이 또한 제공된다. 하나의 접근법으로서, 치료적 유효량의 본 발명의 약물운반체가 개체에 투여된다. 또 다른 접근법에서, 치료적 유효량의 본 발명의 약물운반체가 투여되며 약물운반체가 CTD 결합 부위와 비-공유적으로 결합할 때 약물운반체가 생체 내에 형성된다. 상기 약물운반체는 표적 분자에 특이적이며, 약물은 질환이나 증상에 대해 효과적인 생물학적 활성을 포함한다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 약물운반체와 DRD 와 표적약물 간의 결합은 링커는 통해 이루어지며, 보다 구체적으로는 상기DRD 와 표적약물 각각에 결합된 형광성 모이어티(예컨대, FITC, 바이오틴, 스트렙토마이신, 등)를 통해 이루어진다.
추가로, 세포 또는 세포외 매트릭스가 표적 분자를 발현하는 개체에서 세포 또는 세포외 매트릭스의 영상화 방법도 제공된다. 표적세포 특이적인 약물운반체가 개체에 투여되며 상기 약물운반체가 세포표면에 결합하고 세포내로 유입된 후 엔도좀회피에 의해 세포내에 검출성 표지물이 농축되어 생체 내에 영상화된다.
본 발명의 약물운반체의 구성단위, 또는 스페이서에 신호를 발생시킬 수 있는 이미지결합도메인(Image Binding Domain)을 부가할 수도 있다.
1. 연결
본 발명의 약물운반체는 구성성분들이 선택된 방법으로 구성될 수 있으며 폴리머에 결합될 수도 있다. 바람직하게 CTD/표적약물/DRD이나 다양한 형태로 구성될 수 있다. 구성단위 사이에 링커(linker) 또는 스페이서(spacer)가 삽입될 수도 있다.
본 발명의 약물운반체는 CTD에 공유 또는 비공유 결합된 DRD와 약물을 포함한다. 선형 또는 분지형 링커가 공유 및 비-공유 결합에 바람직하게 사용된다. 링커의 화학적 특징이 기재되어 있다.
통상적으로, 약물운반체를 구성하는 CTD 부위, 약물 부위와 DRD 부위 사이의 결합은 비공유결합 또는 공유결합을 통해 연결되어 구성될 수 있다.
예를 들어, CTD 부위, 약물 부위와 DRD 부위 사이의 결합은 화학적 교차-연결(cross-linking)을 통해 공유결합 약물운반체를 형성하는 것일 수 있다(Zatsepin, TS, et al., Curr. Pharm. Des., 11: 3639-3654(2005)). 본 발명의 CTD 부위, 약물 부위와 DRD 부위로 이루어진 약물운반체는 공유결합 또는 비공유 결합적으로 연결되어 세포 또는 조직 내로 전달시키는 기능을 할 수 있다.
본 발명의 약물운반체의 제조방법 또한 제공된다. 하나의 예로 (a) CTD-링커 화합물, DRD-링커화합물과 약물-링커 화합물을 포함하는 군을 준비하는 단계; (b) 상기 (a) 군에서 선택된 두 개의 화합물에 의해 형성된 링커 화합물들의 군을 준비하는 단계; 및 (c) 상기 (a)군으로부터 선택된 한 종류의 화합물(예를 들어, CTD-링커 화합물)과 상기 선택된 화합물이 없는 (b)군으로부터 선택된 화합물(예를 들어, 약물-DRD-링커 화합물)으로 구성된 화합물 군을 준비하는 단계로 이루어진 방법이다. 각각 화합물들은 이들 사이의 공유 반응을 위한 반응성 그룹을 포함하는 링커에 결합된다.
본 발명의 약물운반체를 제조할 목적으로 공유 결합될 수 있는 CTD-링커 화합물, DRD-링커 화합물, 약물-링커 화합물 또는 DRD-약물-링커 화합물이 또한 제공된다. 일부 양태에서, 링커는 약물운반체의 구성성분의 결합 부위에 공유 결합시키기 위한 반응성 그룹을 포함한다. CTD 결합 부위에의 결합은 결합 부위 내의 반응성 그룹에 의해 수행될 수 있다. 일부 양태에서, 링커 반응성 그룹은 케톤, 디케톤, 베타 락탐, 석신이미드 활성에스테르, 할로케톤, 락톤, 무수물, 에폭사이드, 알데하이드, 할라이드, 설포네이트, 포스포네이트, 구아니딘, 아미딘, 이민, 엔아민, 케탈, 아세탈 또는 말레이미드이다.
링커 화합물의 다양한 화학적 특징이 기술된다. 하나의 양태에서, 링커는 화학식 X-Y-Z를 갖고, 여기서, X는 C, H, N, O, P, S, Si, F, Cl, Br 및 I 중 임의의 원자를 포함하는 원자들의 선형 또는 분지형 연결쇄 또는 이의 염이고, 2 내지 100 단위의 반복 에테르 단위를 포함하며; Y는 임의적이고 Z의 1 내지 20개 원자 내에 위치된 단일 또는 융합된 5원 또는 6원 호모- 또는 헤테로카보사이클릭 포화 또는 불포화 환이며; Z는 하나 이상의 DRD, 약물 및 CTD의 결합 부위내 반응성 아미노산의 측쇄에 공유 결합시키기 위한 반응성 그룹이다. 하나 이상의 링커 화합물에 포함될 경우에 링커 화합물은 X 또는 Y에 또는 X와 Y에 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 구성단위체는 서로 다른 종류의 리간드를 붙일 수 있고, 여러 종류의 리간드를 붙여 세포내 도입 효율을 높일 수 있다. siRNA 말단에 아민기, 카르복실기, 티올기, 알데하이드기, 아크릴로일기, 아지드기 등과 같은 관능기를 도입하여 3', 5' 또는 양쪽 말단에 리간드를 도입하며, 3'또는 5' 말단에 선별적으로 관능기를 도입하고 가교제의 종류를 다르게 하여 서로 다른 종류의 리간드를 선별적으로 양쪽 말단에 접합시킬 수 있다. 또한, 상기 관능기의 종류에 따라 가교제 없이 화학적 공유 결합을 만드는 카르보디이미드 커플링 반응(carbodiimide coupling reaction), 마이클 첨가 반응(micheal addition reaction), 클릭 화학(click chemistry) 등과 같은 화학 반응을 통해 리간드를 접합시킬 수 있다.
상기 링커는 본 발명의 CTD의 세포표적 또는 DRD의 약물방출 기능을 최대화하기 위하여 특별하게 선택된 길이 및/또는 서열, 구체적으로는 복수의 아미노산 잔기로 이루어진 링커일 수 있다. 상기 아미노산 서열로 이루어진 링커는 Huston, et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88(1991), 및 Whitlow, et al., Protein Eng., 6: 989(1993)에 개시되어 있다.
주위 환경에 따라, CTD 표적특이성은 DRD나 약물 또는 둘다와의 공유 또는 비공유 결합 뒤에 변형되거나 제거될 수도 있다. 일부 양태에 있어서는, 결합 전 CTD의 표적특이성이 공유 결합 후에도 실질적으로 보유될 수 있다.
본 발명의 약물운반체는 성분 그 자신들 이상의 다양한 장점을 제공한다. 예를 들면, 약물운반체의 CTD과 DRD 부분은 보편적으로 생체 내에서 약물의 반감기를 연장시킬 수 있다. 또한, 특정 약물의 생물학적 효능이나 다른 생물학적 특징도 약물운반체의 CTD과 DRD부분에 의해 제공되는 이펙터 기능 (예를 들면, 보체 매개된 이펙터 기능)의 부가에 의하여 변형시킬 수 있다. 그 밖에도, 약물은 CTD와 DRD와의 결합에 의해 증가된 크기를 통해 약물로 하여금 새로운 역량으로 기능할 수 있게 한다.
추가로, 약물의 적어도 하나의 물리적 또는 생물학적 특징을 변경하는 방법이 또한 제공된다. 하나의 양태로서, 약물은 약물운반체를 생성하기 위하여 DRD 또는 CTD의 결합 부위에 비공유결합이나 공유 결합을 한다. 또한, 링커의 하나 이상의 화학적 특징을 변형시킴으로써 약물운반체의 하나 이상의 물리적 또는 생물학적 성질을 변형시키는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 변형되는 물리적 또는 생물학적 성질에는 약동학, 약력학, 면역원성, 결합 친화성, 분해 감수성, 용해도, 친지성, 친수성, 소수성, 안정성 및 강도가 포함된다.
2. 불안정한 연결(Labile Linkage)
결합 또는 연결기(linker)는 하나 이상의 공유결합을 통해 관심 있는 하나의 화학적 그룹 또는 조각을 관심 있는 다른 화학적 그룹 또는 조각에 결합한 2개의 원자 사이의 연결이다. 예를 들어, 결합은 약물운반체에 DRD와 표적약물을 연결할 수 있다. 결합의 형성은 2개의 별도의 분자를 단일 분자로 연결할 수 있거나 또는 동일한 분자에서 2개의 원자를 연결할 수 있다. 결합은 중성 전하일 수 있거나 또는 양전하 또는 음전하를 가질 수 있다. 가역적인 또는 불안정한 연결은 가역적인 또는 불안정한 결합(bond)을 함유한다. 결합은 2개의 연결된 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서(spacer)를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서는 유연성 및/또는 결합 길이를 더 가할 수 있다. 스페이서는 알킬기, 알케닐(alkenyl)기, 알키닐기(alkynyl), 아릴(aryl)기, 아르알킬(aralkyl)기, 아르알케닐(aralkenyl)기, 아르알키닐(aralkynyl)기를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않으며 각각은 하나 이상의 헤테로원자, 헤테로고리, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 당류를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 해당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 선행 목록이 발명의 범위를 한정하는 것으로 의미하지 않는다.
불안정한 결합은 동일한 분자에서 다른 공유결합을 파괴 또는 절단하지 않을 조건 하에 선택적으로 파괴 또는 절단될 수 있는 수소 원자의 공유결합 외의 공유결합이다. 더 상세하게는, 불안정한 결합은 동일한 분자에서 다른 불안정하지 않은 공유결합보다 적당한 조건 하에 덜 안정하고(열역학적으로) 또는 더 빠르게 파손된(동력학적으로) 공유결합이다. 분자 내 불안정한 결합의 절단은 2개의 분자를 형성할 수 있다. 해당 기술분야의 숙련된 자의 경우, 결합의 절단 또는 불안정성은 일반적으로 결합 절단의 반감기(t½절단하는데 결합의 반이 필요한 시간) 면에서 논의된다. 따라서, 불안정한 결합은 분자에서 다른 결합보다 더 빠르게 선택적으로 절단될 수 있는 결합을 포함한다.
적당한 조건은 불안정한 결합의 유형에 의해 결정되고 유기화학에서 잘 알려져 있다. 불안정한 결합은 pH, 산화 또는 환원조건 또는 시약, 온도, 염 농도, 효소의 존재(뉴클레아제 및 프로테아제를 포함하는 에스터라아제와 같은), 또는 가해진 시약의 존재에 민감할 수 있다. 예를 들어, 증가 또는 감소된 pH는 pH-불안정한 결합에 적당한 조건이다.
불안정한 기가 변형을 수행할 비율은 불안정한 기를 포함하는 분자의 화학적 성분을 변경함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, 불안정한 기 근처의 특정 화학적 부분(예를 들어, 전자 받개 또는 주개)의 추가는 화학적 변형이 일어날 조건 하에 특정 조건(예를 들어 pH)에 영향을 미칠 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 생리적으로 불안정한 결합은 일반적으로 접하는 조건 또는 포유동물 신체 내에서 접하는 조건과 유사한 조건 하에 절단될 수 있는 불안정한 결합이다. 생리적으로 불안정한 연결 그룹은 이들이 특정 생리적 조건에 존재할 때 화학적 변형(예를 들어, 절단)을 수행하도록 선택된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 세포의 생리적으로 불안정한 결합은 포유동물 세포 내 조건 하에서 절단될 수 있는 불안정한 결합이다. 포유동물 세포 내 조건은 포유동물 세포에서 확인된 pH, 온도, 산화 또는 환원조건 또는 시약, 그리고 염 농도와 같은 화학적 조건 또는 포유동물 세포에서 접하는 것과 유사한 것을 포함한다. 포유동물 세포 내 조건은 또한 단백질 가수분해 또는 가수분해 효소와 같은 포유동물 세포에 일반적으로 존재하는 효소 활성의 존재를 포함한다. 세포의 생리적으로 불안정한 결합은 또한 약학적으로 허용가능한 외인성 물질의 투여에 반응하여 절단될 수 있다. 45분 미만의 반감기를 갖는 적당한 조건 하에 절단되는 생리적으로 불안정한 결합은 매우 불안정하다고 간주된다. 15분 미만의 반감기를 갖는 적당한 조간 하에 절단되는 생리적으로 불안정한 결합은 극도로 불안정하다고 간주된다.
화학적 변형(불안정한 결합의 절단)은 약학적으로 허용가능한 물질을 세포에 첨가하여 개시될 수 있거나 또는 불안정한 결합을 함유하는 분자가 적당한 세포 내 및/또는 세포 외 환경에 도달할 때 자발적으로 발생할 수 있다. 예를 들어, pH 불안정한 결합은 분자가 산성화된 엔도좀으로 들어갈 때 절단될 수 있다. 따라서, pH 불안정한 결합은 엔도좀 절단 가능한 결합(endosomal cleavable bond)으로 고려될 수 있다. 효소 절단성 결합은 엔도좀 또는 리소좀에서 또는 세포질에서 존재하는 것과 같은 효소에 노출되었을 때 절단될 수 있다. 디설파이드 결합(disulfide bond)은 분자가 세포질의 더 환원성 환경에 들어갈 때 절단될 수 있다. 따라서, 디설파이드는 세포질 절단 가능한 결합(cytoplasmic cleavable bond)으로 고려될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, pH-불안정한 결합은 산성 조건(pH<7) 하에 선택적으로 파괴된 불안정한 결합이다. 또한 세포 엔도좀 및 리소좀은 7 미만의 pH를 가지기 때문에, 이러한 결합은 엔도좀에서 불안정한 결합으로 일컫을 수 있다. 용어 pH-불안정한(pH-labile)은 pH-불안정한, 매우 pH-불안정한, 그리고 극도의 pH-불안정한 결합을 포함한다.
매우 pH-불안정한 결합: 매우 pH-불안정한 결합은 pH 5에서 절단에 대해 45분 미만의 반감기를 가진다. 매우 pH-불안정한 결합의 구성은 화학 기술분야에 잘 알려져 있다.
극도로 pH-불안정한 결합: 극도로 pH-불안정 결합은 pH 5에서 절단에 대해 15분 미만의 반감기를 가진다. 극도로 pH-불안정한 결합의 구성은 화학 기술분야에 잘 알려져 있다.
이치환된(Disubstituted) 고리형 무수물은 본 발명의 펩타이드에 표적약물의 결합에 특히 유용하다. 이들은 생리적으로 pH-불안정한 결합을 제공하고, 즉시 아민을 변형시키며, 세포의 엔도좀과 리소좀에서 확인된 감소된 pH에서 절단하여 아민을 회복시킨다. 두 번째, 아민과 반응하여 생성되는, 아민과 반응하여 생성되는 α 또는 β 카복실산기는 중합체에 예상되는 음전하의 약 1/20th만 기여하는 것으로 나타난다(Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003). 따라서, 펩티드와 이치환된 말레익 무수물의 변형은 높은 음전하를 갖는 펩티드를 생성하기보다는 다소 펩티드의 양전하를 효과적으로 중화한다. 중성에 가까운 전달 펩티드는 생체 내 전달에 적합하다.
3. 세포 표적화 도메인(CTD)
본 발명의 약물운반체는 특정 표적세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 물질로 이루어진 세포 표적화 도메인(CTD)을 포함한다. 상기 특이적으로 결합하는 물질은 항체 또는 이의 특이적 결합 부분, 리간드, 사이토카인, 케모카인 또는 핵산 압타머를 포함하는 군에서 선택되어지는 하나이다. "특이적 결합 부분"은 항원과 상호작용하는 항체의 펩타이드 도메인으로 한정된다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 리간드 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다.
다른 예에서, CTD는 VEGF 또는 수용체 결합을 매개하는 것 유래의 아미노산일 수 있다. CTD는 세포의 임의의 부류, 예를 들어 면역 세포, 암 세포, 또는 특정 조직 또는 혈통 유래의 세포와 우선적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에서, CTD는 또한 RGD (Arg-Gly-Asp) 기반 조성물의 내재화를 매개할 수 있다.
본 발명의 임의의 실시형태에서, CTD는 표적 세포의 표면 상에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용할 수 있다. 다른 실시형태에서, CTD는 표적 세포의 외부 표면 상에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용할 수 있다. 다른 실시형태에서, CTD는 표적 세포의 내부 표면 상에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, CTD는 세포 외부에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, CTD는 세포내부에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용할 수 있다. 나노입자는 나노입자가 세포막을 투과성이 되도록 응축할 수 있다. 이와 같은 대안적인 실시형태에서, 나노입자는 세포 내부의 생물학적 분자와 접촉할 수 있다.
다른 실시형태에서, 생물학적 분자는 수용체 분자를 포함한다. 임의의 실시형태에서, 생물학적 분자는 세포 부착 분자를 포함한다. 다른 구체적인 실시형태에서, 생물학적 분자는 피브로넥틴 또는 라미닌을 포함한다. 임의의 실시형태에서, 생물학적 분자는 표적 세포의 외부 표면에 존재하며, 이는 생물학적 분자의 임의의 부분이 전체 또는 부분적으로 세포의 외부에 노출된다는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 암 세포의 표면상의 암 생체지표와 결합하는 CTD를 포함하는 폴리펩타이드를 기술한다.
CTD는 임의의 특정 폴리펩타이드 서열로 제한되지 않는다. CTD는 임의의 원하는 생물학적 분자를 표적화하도록 설계될 수 있다. 구체적인 특정 실시형태에서, 생물학적 분자는 원하는 세포 유형으로 특이적으로 발현된다. 비제한적인 예로서, CTD는 종양 세포에서 발현되지만 비종양 세포에서 발현되지 않는 생물학적 분자를 표적화하도록 설계되었다. 임의의 실시형태에서, 폴리펩타이드의 CTD는 종양 세포에 대하여 특이적인 펩타이드 리간드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 단백질보다 안정성이 훨씬 우수하지만, 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다.
ㅏ람직하게, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 추가적으로 결합될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드의 N-말단은 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형되어 안정성을 증가시킬 수 있다.
상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다. 또한, 상기 변형된 펩타이드는 보호기로 인해 우수한 열안정성을 나타내며, 또한 산과 알칼리 등의 물리화학적 인자에 대한 안정성을 우수하다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 장기 보존성이 뛰어나게 변형될 수 있으므로, 의약품, 의약외품, 화장품 및 구강용품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있다. 상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드 안정성을 크게 개선하는 작용을 하고, 본 명세서에서 언급되는 용어 "안정성"은 인 비보 안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.
바람직하게, 본 발명에서 약물운반체는 표적세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 염기서열을 가지는 핵산분자 리간드를 포함한다. 핵산분자 리간드는 표적 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 염기서열과 여분의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
바람직하게, 상기 핵산분자 리간드는 압타머(aptamer, Ap)이다. 압타머는 단백질, 뉴클레오티드, 항생제, 저-분자 유기 또는 무기 화합물, 및 심지어 높은 친화도 및 특이성을 갖는 전체 세포를 비롯한 폭넓은 범위의 분자에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드-기재 기술의 상대적으로 새로운 부류이다. 압타머는 높은 특이성 및 친화성을 가지고 타겟 항원에 결합할 수 있도록 독특한 컨포메이션으로 폴딩되는 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드이다. 이러한 압타머는 SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법에 의해 얻을 수 있다(Tuerk and Gold, Science, 249:505-510(1990)).
본 발명의 다른 측면에서, 표적 세포에 대해 약물 제제를 표적화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 약물방출도메인(DRD), 약물결합 도메인(), 및 세포 표적 도메인(CTD)을 포함하는 하나 이상의 약물운반체를 사용하는 단계; 약물 제제를 하나 이상의 와 접촉시키는 단계; 하나 이상의 DRD, CTD 를 결합시켜 형성된 약물운반체를 생성하는 단계; 제조된 약물운반체를 표적 세포와 접촉시키는 단계; 및 제조된 약물운반체의 CTD를 표적 세포의 외부에 존재하는 생물학적 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 물질이 획득되는 방식은 임의의 구체적인 공정으로 제한되지 않는다. 임의의 실시형태에서, 제조된 약물운반체는 약물 제제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 제조된 약물운반체는 응축되어 나노입자를 형성할 수 있다. 다른 실시형태에서, 제조된 약물운반체는 약물 제제와 응축되어 나노입자를 형성할 수 있다.
임의의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 약물 제제를 원하는 세포로 표적화한다. 임의의 세포는 표적화를 위해 선택될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 표적 세포는 진핵세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물 세포이며, 가장 바람직하게는 설치류 또는 인간 세포이다. 특정 실시형태에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 본 발명에 의해 고려되는 종양 세포의 비제한적인 예는 인간 방광 세포, 인간 유방 세포, 인간 결장 세포, 인간 간세포, 인간 폐세포, 인간 신경아세포, 인간 난소 세포, 인간 췌장 세포, 인간 전립선 세포, 또는 인간 피부 세포를 포함한다. 추가적으로, 표적 세포는 본 발명의 방법에 의해 치료되어야 하는 환자가 이환된 질환 또는 병태에 기초하여 선택될 수 있다.
일부 약물운반체들은 특정 단백질에 결합하는 물질을 이용한 특정세포 표적화 전략, 수용체-매개 엔도사이토시스(receptor-mediated endocytosis)에 의해 세포외 공간에서 세포 내로 이동할 수 있으나, 이들은 적절한 세포 구획(compartment)으로 방출되기보다는 엔도좀(endosome) 내에 포획되어 리소좀(lysosome)에서 분해될 수 있다. 이러한 문제점을 회피하기 위한 전략이 필요하다. 또한, 이 전략들을 사용하여 단백질을 세포 내로 전달할 수 있더라도, 세포 내에서의 약물운반체의 낮은 안정성은 약물운반체의 광범위한 적용을 여전히 방해한다. 다양한 가능성이 있는 불활성화 인자들 중에서, 엔도좀 포획은 중요한 인자이며, 성공적인 세포내 약물운반체 전달을 보장하기 위해 해결해야 할 필요가 있다.
예를들면, 리포솜-피복(liposome-wrapped) 단백질은 낮은 효율로 세포질로 이동시킨다. 최근에, 여러 소분자 양이온성 펩타이드(small cationic peptide),세포-투과 펩티드(cell-penetrating peptide; CPP)가 동정되었으며, 단백질 전달을 보조하기 위해 사용되고 있다. 현저하게 개선된 세포내 전달 효율 및 세포 내에서의 활성 유지로 인해, 이 전략은 약제학적 적용에 있어서 유망하다. 그러나 이런 펩타이드는 부분적으로는 특정세포에 대한 낮은 표적화, 혈청 중에서의 낮은 안정성 및 세포막을 통한 약한 투과성 때문에, 임상 적용에 한계가 있다.
4. 약물방출 도메인(DRD)
기존 약물운반체는 다양한 세포 표적화 방법으로 표적약물을 특정 세포의 막 장벽을 효율적으로 극복하고 엔도좀으로 흡수할 수 있으나, 엔도좀에 대부분 내재화되고 세포질로 극히 일부만 방출된다. 실제로, 표적약물을 세포에 전달하는 효율적인 방법이 존재하지만, 대부분의 다른 유형의 거대 분자는 전달하기가 더 어렵다. 이러한 거대 분자는 기존의 세포 흡수 메커니즘으로 유도될 수도 있지만, 엔도좀의 투과성 또는 분열이 없는 경우, 종종 세포질로의 흡수없이 이들의 리소좀 분해 또는 재활용으로 이어지는 기존 경로 내에 구획화한다.
pH 민감성 막투과성 펩타이드는 엔도좀 산성화시에 작동하여 엔도좀 구획으로부터 세포질로의 흡수되는 극성 분자의 방출을 촉진시킬 수 있다. 이러한 전략은 일반적인 극성 화합물, 특히 단백질 및 기타 거대 분자의 세포로의 전달에 대한 오랜 장벽을 극복하는 방법이다. 본 발명에서는 엔도좀 내재화를 극복하기 위해 약물방출 도메인을 제안하고 있다.
상기 전략을 위한 펩타이드의 요구조건은 (i) 유효농도(EC) 이상 높은 펩타이드 농도에서 생리학적 pH 7에서 막 투과성이 거의 없으며, (ii) 산성 pH 5 및 유효농도(EC) 이하 낮은 펩타이드 농도에서 막에 거대 분자 크기의 결함을 효율적으로 형성 할 수 있는 펩타이드의 개발이다. 이러한 펩타이드는 정상 세포 pH에서 세포막에 영향을 미치지 않지만, 생리학적으로 적절한 산성 pH에 의해 거대 분자 크기의 공극을 형성할 것이다.
바람직하게, 엔도좀 내재화는 본 발명의 약물운반체를 구성하는 DRD의 본질적인 속성으로 표적약물은 엔도좀에서 방출될 수 있으며 다른 진정한 세포내 표적에 작용할 수 있다. 막 활성, 융해 펩타이드와 공동 전달은 엔도좀의 용해로 인해 전달된 표적약물의 엔도좀 배출을 향상시킨다. 실제로, 엔도좀 막을 용해하는 메커니즘은 CPP를 이용하여 전달된 표적약물의 엔도좀 배출을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 약물 방출 도메인(DRD)은 세포 투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP), supercharged peptides, supercharged proteins, virus-like particle, nanocarrier, liposomes, polymer,및 nanoparticle-stabilized nanocapsule 등을 포함한다.
CPP에 의한 세포투과기전은 clathrin-mediated, caveolae-mediated, macropinocytosis 등의 endocytosis와 inverted micelle, carpet, pore formation, membrane thinning 등의 direct translocation 이다.
일반적으로, CPP은 라이신/아르기닌 등 기본 아미노산 잔기들을 주로 포함하고 있어서 이와 융합된 단백질들을 세포막을 투과하여 세포내로 침투시키는 역할을 한다. 상기 CPP은 HIV-1 Tat 단백질, 드로소필라 안테나페디아의 호메오도메인(페네트라틴), HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유도된 MTS 펩타이드, 트랜스포탄 또는 Pep-1 펩타이드에서 유래된 서열 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같이, 바이러스 또는 양이온성 펩타이드로부터 동정/합성된 다양한 CPPs(예를 들어, TAT48-60, 페네트라틴(pAntp)43-58, 폴리아르기닌, Pep-1, 트랜스포르탄, 등)은 생물학적 활성 물질은 약물운반체들의 이동을 매개하기 위해 세포 내재화(internalization)가 가능한 활성을 가진다.
대표적인 막투과성 펩타이드인 항 세균 펩타이드는 항균, 항 곰팡이 및 항 바이러스 활성이 광범위한 효능이 있는 ?은 펩타이드이다. 예를 들어, cathelicidin 계열의 Cecropin A와 B, Magainin, Melittin, Hylin a1, Tachyplesin I과 PR-39는 좋은 항종양 활성이 있다. 그러나, 그들의 응용은 생체내 용혈에 국한된다. 항균 펩타이드의 서열은 용혈 활성을 감소시키도록 변형할 수 있다. 그러나 변형 후에는 항균 펩타이드의 항종양 활성이 용혈 활성과 함께 감소되거나보다 강한 용혈 활성을 희생시키면서 강화되므로 서열의 변형만으로는 바람직한 결과를 거의 얻지 못한다.
바람직하게, 세포 밖이나 내부에서만 세포투과능이 활성화되는 CPP(Activable CPP)의 일환으로 pH-sensitive system, enzyme-sensitive system, light-sensitive system, oxygen-sensitive system 등을 활용하여 특정 pH, 효소활성, 빛, 산소 환경에 따라 CPP의 세포투과 효능이 발현되어 특이적인 전달을 가능하게 하는 부위 혹은 물질을 더 포함할 수 있으나 상기 예시에 제한되지 않는다.
잘 설계된 CPP은 원형질막 장벽(plasma membrane barrier)을 투과하고, 세포 안으로 표적약물을 수송할 수 있는 짧은 펩타이드로. 매개된 세포 내 표적약물의 전달은 새로운 방식의 표적약물의 높은 선택성 및 다양성의 장점을 보유할 수도 있다. 막투과성 펩타이드(CPP)는 지질 이중층에 의해 생기는 장벽을 극복하는 능력이 있으나, 실제 적용을 가능하게하기 위해서는 우선 특정 환경에서만 기능하도록 설계하거나 특정 인자에 응답하도록 설계해야한다. 하나의 잠재적으로 유용한 특정인자는 세포소기관에서 공간적으로 그리고 시간적으로 특정한 방법으로 변하고 또는 암을 포함한 어떤 병리학적 조건하에서 조직에서 국소적으로 변하는 pH이다.
본 발명의 약물운반체의 DRD는 엔도좀의 산성 pH에서 활성화되어 엔도좀 막의 변화를 유도하는 PMAP(pH-Dependent Membrane Active Peptides)로 구성될 수 있다. 엔도좀의 산성화가 엔도좀에 포집화되는 고분자를 세포질로 방출되는 endocytosis를 통해 세포 내로 거대 분자를 전달하는 것이 유용할 수 있습니다. pH 민감성 막활성 펩타이드는 또한 종양 세포를 표적화 할 수 있는데, 막 투과성은 고형 종양 근처에서 발생하는 pH 감소에 의해 유발될 수 있다.
상기 설계된 PMAP로 이루어진 DRD를 구성성분으로 하는 본 발명의 약물운반체는 세포에 특이적으로 존재하는 결합하는 물질로 이루어진 CTD에 의해 표적세포의 분자에 결합하여 엔도좀으로 내재화되고 엔도좀이 pH가 산성화되면서 DRD의 PMAP가 활성화되고 약물운반체의 PMAP와 엔도좀이 상호작용하여 약물운반체를 방출시키는 단계로 작용하는 약물운반체이다.
본 발명은 상기의 항 세균 펩타이드 또는 이들을 기초하여 새로이 설계된 펩타이드를 이용하여 엔도좀에서 약물을 효율적으로 방출을 증가시키는 약물방출 도메인(DRD)을 완성하였다.
본 발명은 강력한 항 세균효과가 있는 18개의 아미노산으로 이루어진, alpha-helical 구조인 Hylin a1 및 그의 변이체 펩타이드를 사용할 수도 있다(Castro, MS., et al., Peptides. 2009, 30(2):291-6.).
Hylin a1: H2N-IFGAILPLALGALKNLIK-COOH(아미노산 서열 1)
멜리틴(melittin)은 꿀벌(Apis mellifera)의 독에서 유래 된 잘 알려진 용혈성 펩티드 중 하나로 멜리틴은 양이온 C 말단 부분과 소수성 나선형 부분으로 구성된 26 아미노산 펩타이드이다. 막의 존재 하에서, 양이온 세그먼트는 막 표면에서 지질 헤드 그룹과 강하게 상호 작용하고 지질 이중층에 소수성 나선 세그먼트를 삽입하여 막 공극을 형성한다.
멜라틴：　H2N-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-COOH(아미노산 서열 2)
본 발명에서는 멜라틴(melittin)에서 기초한 펩타이드를 설계, 합성 및 사용하였다. 멜라틴에서 기초한 pH 선택적 용질 펩타이드인 LP의 구조적 특성과 정전기적 특성은 광범위한 pH 범위에서도 변하지 않기 때문에 LP는 산성에서 중성 조건의 용질 활성을 보유한다. LP는 약산성 범위에서 실제로 작용하고 pH 반응성을 특성화하는 pH 선택적 펩타이드이다. 구체적으로, 소수성 부분의 루이신 잔기를 글루탐산으로 대체하였으며, 글루탐산으로 치환하면 중성 pH의 친수성 랜덤 코일에서 산성 pH 범위의 소수성 나선 구조로 구조적 변화가 일어난다. 리포좀 표면과 상호 작용하는 LP가 넓은 pH 범위에서 지질 이중층에서 소수성 나선형을 형성한다.
LP: H2N-GWWLALALALALALALASWIKRKRQQ-COOH(아미노산 서열 3)
또한, 엔도좀 산성 pH에서 막 용해 특성이 개선된 LP 유사체로 상기 LP에서 나선구조 형성을 촉진하는 소수성 분절(helix-promoting hydrophobic segment)을 아래와 같이 변화시킨 LPE3-1은 활성 공극을 형성하는 멜리틴 또는 LP와 유사하게 pH 5.0에서 지질 막과 효과적인 상호 작용을 한다(Kashiwada A. et al., Org Biomol Chem. 2016, 14(26):6281-8.).
또한, 엔도좀 산성 pH에서 막 용해 특성이 개선된 LP 유사체로 상기 LP에서 나선구조 형성을 촉진하는 소수성 분절(helix-promoting hydrophobic segment)을 아래와 같이 변화시킨 LPE3-1은 활성 공극을 형성하는 멜리틴 또는 LP와 유사하게 pH 5.0에서 지질 막과 효과적인 상호 작용을 한다(Kashiwada A. et al., Org Biomol Chem. 2016, 14(26):6281-8.).
LPE3-1: H2N-GWWLALAEAEAEALALASWIKRKRQQ-COOH(아미노산 서열 3)
pH 민감성 막 결합, 삽입 및 투과성을 갖는 막 활성 펩타이드 중 하나인 pHLIP는 중성 pH의 단량체 무작위 코일이지만, 약 6.0의 명백한 pKa를 갖는 산성화시 단량체 막-스패닝 알파- 헬릭스로서 막에 삽입되나 pHLIP는 막 투과성을 없다. 인플루엔자 바이러스의hemagglutinin의 HA-2 subunit의 N-terminal segment인 GALA라 불리는 조성학적으로 유사한 펩타이드도 마찬가지로 중성 pH의 무작위 코일이지만 뚜렷한 pKa가 약 5.5인 활성이 높지만 막에 작은 모공 정도를 형성한다. 이 두 개의 pH 의존성 막활성 펩타이드, pHlip 및 GALA의 특성을 이용하여 설계된 MelP5 펩타이드는.지질 이중층에 결합하고 pH 의존적인 방식으로 2차 구조를 형성하였으며 또한, 지질 소포가 낮은 pH에서만 작은 분자를 방출하도록 pH 의존적 방식으로 이중층을 불안정화시키는 특징이 있다(Gregory W. et al., Biochim Biophys Acta. 2015, 1848(4): 951957).
MelP5: H2N-GIGAVLKVLATGLPALISWIKAAQQL-COOH(아미노산 서열 4)
MelP5의 변이체 pHD15, pHD24와 pHD108 펩타이드를 사용할 수도 있다(Wiedman GJ., et al., Am Chem Soc. 2017;139(2):937-945)
pHD15: H2H-GIGEVLHELADDLPDLQEWIHAAQQ-COOH(아미노산 서열 5)
pHD24: H2N-GIGDVLHELAADLPELQEWIHAAAQQ-COOH(아미노산 서열 6)
pHD108:H2N-GIGEVLHELAEGLPELQEWIHAAQQ-COOH(아미노산 서열 7)
바람직하게, 지질 이중층에서 고분자 크기의 공극을 형성하기 위해 낮은 pH에 의해 유발되는 막 활성 펩타이드은 엔도좀으로부터 거대 분자의 방출을 촉진시키는 암 치료제 또는 약물운반체에 광범위하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상기에 있는 리포좀 표면에서 막 용해 특성이 있는 멜라틴, LP, Hylin a1, LPE3-1과 pHD24 펩타이드를 사용한 DRD로 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 DRD는 상기 표적약물 혹은 약물운반체의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 혹은 부위를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 본 발명의 운반체는 상기 DRD 대하여 면역 반응이 일어나는 것을 억제하는 임의의 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 면역억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물 또는 제제는 상기 DRD를 포함하는 약물운반체가 목적하는 세포로 전달되기 전까지 표적약물이 체내에서 분해되지 않도록 하는 제형화될 수 있다. 예를 들어, 상기 표적약물이 소장 상피에서 흡수되도록 하는 것이 목적인 경우, 상기 DRD를 포함하는 약물운반체가 소화관에 소장 상피에 도착하기까지 분해되거나 다른 임의의 세포로 흡수되지 않도록 제형화될 수 있다. 또 다른 예로서, 본 발명의 조성물을 피하주사 또는 근육 주사하는 경우로서 상기 표적약물이 혈관 내로 들어가도록 하는 것이 목적인 경우, 상기 조성물이 피부 세포, 근육 세포, 지방 세포에 흡수되는 정도를 낮추도록 제형화될 수 있다. 상기 언급한 것은 예시적인 것으로서, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
5. 표적약물
본 발명의 약물운반체는 표적약물을 특별하게 제한되지 않으며, 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블, 화학약물, 바이오약물 또는 나노입자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약물운반체에서 표적약물과 다른 구성성분들 사이의 결합은 공유결합 또는 비공유결합 방식으로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적약물"는 공유결합 또는 비공유결합을 통해 본 발명의 CTD 부위 또는 DRD부위와 컨쥬게이트를 이루어 세포 내로 운반될 물질을 의미하며, 예를 들어, 화학물질, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 및 PNA(peptide-nucleic acid)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화학약물은 예를 들어, 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제, 항정신병약물, 신경안정제, 항불안제, 마약길항제, 항파킨스 질환 약물, 콜린성 아고니스트, 항암제, 항혈관신생억제제, 면역억제제, 면역촉진제, 항바이러스제, 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제, 피임약, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환 치료제, 진단제, 미용성분(예컨대, 주름개선제, 피부노화 억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게, 상기 약물은 항암제, 항생제, 항바이러스제, 면역촉진제 또는 진단제이다.
또한, 본 발명의 약물운반체는 다양한 목적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 약물운반체는 표적약물의 표적화에 따라, 질병 또는 질환의 치료, 특정 세포의 검출, 질병(예컨대, 암)의 진단, 특정 세포의 위치추적 및 인 비보 이미징 등에 이용될 수 있다.
상기 바이오의약물은 생물학적으로 활성이 있는 단백질이다. 적당한 단백질로는 의학, 농업 및 기타 다른 과학 및 산업 분야에서 관심의 것들, 특히 예를 들어 리스로포이에틴, 인터페론, 인슐린, 단클론 항체, 혈액 인자, 콜로니 자극 인자, 성장 호르몬, 인터루킨, 성장 인자, 치료용 백신, 칼시토닌, 종양 괴사 인자(TNF), 및 효소와 같은 치료용 단백질을 포함한다. 이와 같은치료용 단백질의 구체적인 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만 대체 요법에서 이용되는 효소 동물에서의 장, 또는 세포 배양에서의 세포 성장을 촉진하는 호르몬 및 다양한 적용, 예컨대 생명공학 또는 의학 진단에서 사용되는 활성 단백질계 물질을 포함한다. 구체적인 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만 과산화물제거효소, 인터페론, 아스파라기나제, 글루타마제, 아르기나제, 아르기닌 디아미나제, 아데노신 디아미나제 리보뉴클레아제, 트립신, 크로모트립신, 파핀(papin), 인슐린, 칼시토닌, ACTH, 글루카곤, 소마토신, 소마트로핀, 소마토메딘, 부갑상선 호르몬, 에리스로포이에틴, 시상하부 방출 인자, 프로락틴, 갑상선 자극 호르몬, 엔도르핀, 엔케팔린, 및 바소프레신을 포함한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 표적약물에는 치료용 폴리펩타이드 도메인을 포함한다.
본 발명의 임의의 측면에서, 상기의 표적약물은 siRNA 분자를 포함한다. 임의의 실시형태에서, 약물 제제는 발암유전자로부터 발현된 RNA의 부분을 인식하는 서열이 있는 뉴클레오티드를 포함한다.
본 출원은 이중 가닥 RNA(dsRNA) 및 RNAi에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "dsRNA"는 RNA 간섭(RNAi)이 가능한 이중 가닥 RNA분자, 예를 들어 siRNA를 말한다. 추가적으로, RNAi는, 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 특이적인 후전사 방식으로 유전자 발현을 차단한다. RNAi는 시험관내 또는 생체내에서 유전자 발현을 억제하거나 감소시키는 유용한 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "짧은 간섭 RNA", "siRNA" 또는 "짧은 간섭 핵산"은 세포에 의해 적절하게 가공될 때 RNAi 또는 유전자를 매개할 수 있는 임의의 핵산을 말한다. 예를 들어, siRNA는 자기 상보성(self complementary) 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자일 수 있는데, 여기에서 안티센스 영역은 표적 유전자에 대한 상보성을 포함한다. siRNA는 자기 상보성 센스 및 안티센스 영역을 가지는 일 가닥 헤어핀 폴리뉴클레오티드일 수 있는데, 여기에서 안티센스 영역은 표적 유전자에 대한 상보성을 포함한다. siRNA는 자기 상보성 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 줄기 및 2개 이상의 루프 구조를 가지는 원형의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있는데, 여기에서 안티센스 영역은 표적 유전자에 대한 상보성을 포함하며, 원형의 폴리뉴클레오티드는 생체내 또는 시험관내에서 가공되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성 siRNA를 생성할 수 있다. 또한 siRNA는 표적 유전자에 대한 상보성을 가지는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 여기에서 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 말단 인산기, 예를 들어 5'-인산염, 또는 5',3'-이인삼염을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 실시형태에서, siRNA는 표적 핵산에 결합하는 비효소적 핵산이며 표적 핵산의 활성을 변경시킨다. siRNA의 결합 및/또는 활성은 하나 이상의 단백질 또는 단백질 복합체, 예를 들어 RNA 유도 침묵 복합체(RNA Induced Silencing Complex, 또는 RISC)와의 상호작용에 의해 용이하게 될 수 있다. 임의의 실시형태에서, siRNA는 siRNA분자의 하나의 가닥의 단일 인접 서열을 따라 표적 서열에 대한 상보적인 서열을 포함한다.
선택적으로, 본 출원의 siRNA는 생리적 조건 하에서(예컨대, 세포 환경에서) 억제될 유전자("표적" 유전자)에 대한 mRNA 전사체의 적어도 일부분의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이중 가닥 RNA는 단지 RNAi를 매개하는 능력을 가지는 천연 RNA와 충분히 유사할 것을 필요로 한다. 따라서, 본 출원은 유전적 돌연변이, 균주 다형성 또는 진화적 분기로 인하여 예상될 수 있는 서열 변화를 용인할 수 있는 이점을 가진다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포 표적화 도메인(CTD)뿐만 아니라 약물 결합 도메인을 포함하는 하나 이상의 약물운반체를 포함하는 나노입자를 기술한다. 임의의 실시형태에서, 나노입자는 약물 제제를 추가로 포함한다.
나노입자는 전형적으로 뉴클레오티드 또는 약물 제제를 보유하고 혈액 중 셸 구조로 분자를 화학적으로 안정화시키는 관점에 기반을 둔다. 나노입자는 종종 당, 엑스트란, 인산칼슘, 키노산, 펩타이드 및/또는 플라스틱 중합체를 포함한다. 암 약물 전달을 위한 약물 제제-부하 나노입자는 바람직하게 다음의 특성이 있다: 1) 수율과 순도가 높은 몇 단계로 합성하기 용이함 2) 크기가 100㎚ 미만인 단분산 약물-부하 나노입자로 조립함 3) 다양한 약물의 캡슐화를 가능하게 함 4) 유리한 약동학 및 종양 축적을 나타냄 5) 반응속도론이 제어되고 조정가능한 약물을 방출 6) 치료 반응을 일으킴 7) 비독성 성분으로 분해되어 불리한 독성이 없이 신체로부터의 소거를 가능하게 함. 수많은 상이한 나노규모 전달 시스템이 암 치료법에 대하여 제안되었지만, 대부분은 이들 기준을 만족하지 못 하였다.
임의의 실시형태에서, 제제는 진단용 또는 영상화 제제이다. 본 발명은 영상화 또는 치료를 위하여 정확한 표적화가 가능하게 한다. 용어 "영상화 제제"는 포유동물에서 특정 생리학 또는 병태생리학을 표적화하도록 설계된 화합물을 의미하며, 이는 생체내 또는 시험관내에서 투여 후에 검출될 수 있다. 영상화 제제의 비제한적인 예는 형광 표지이다. 기타 다른 표지는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 어떤 구현 예에서 구성단위, 또는 스페이서의 물성이 핵산분자일 수도 있다. 상기 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584(1990)). 예를 들어, 형광물질[예컨대, 플루오레신, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-약물boxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린(Coumarin)], 형광 단백질(fluorescence protein; GFP, RFP, CFP, YFP, BFP, 루시퍼라제 또는 이의 변이체), 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 화학물질(예컨대, 바이오틴), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함한다. 본 발명의 약물운반체가 방사능동위원소를 포함하여 구성되는 경우(즉, 동위원소로 표지된 본 발명의 펩타이드 및 siRNA 복합체), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT, Single Photon Emission Computed Tomography) 또는 양전자 방출 단층촬영(PET, Positron Emission Tomography)에 적용되어 조직의 이미징에 이용될 수도 있다.
검출가능한 신호를 발생시키는 레이블은 형광물질[예컨대, 플루오레신, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-약물boxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린(Coumarin)], 형광 단백질(fluorescence protein; GFP, RFP, CFP, YFP, BFP, 루시퍼라제 또는 이의 변이체), 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 화학물질(예컨대, 바이오틴), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함한다. 본 발명의 약물운반체가 방사능동위원소를 포함하여 구성되는 경우(즉, 동위원소로 표지된 본 발명의 펩타이드 및 siRNA 복합체), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT, Single Photon Emission Computed Tomography) 또는 양전자 방출 단층촬영(PET, Positron Emission Tomography)에 적용되어 조직의 이미징에 이용될 수도 있다.
6. 기타
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 약물운반체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 표적약물의 세포 내 전달방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 약물운반체를 포함하는 표적약물 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 상술한 CTD, DRD 및 표적약물을 포함하는 약물운반체를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
최적의 약학 조성물은, 예를 들어 투여의 의도된 경로, 전달 포맷 및 원하는 투여량에 따라서 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기와 동일]을 참조한다. 이와 같은 조성물은 본 발명의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출률 및 생체내 소거율에 영향을 미칠 수 있다.
약학 조성물에서 1차 운반 수단 또는 담체는 이에 제한되는 것은 아니지만 주사용 증류수, 생리적 식염수 또는 인공 뇌척수액을 포함할 수 있으며, 가능하게는 비경구 투여에 대하여 조성물에서 공통적인 기타 다른 물질로 보충된다. 중성으로 완충된 염분 또는 혈청 알부민과 혼합된 염분은 추가적인 예시적 비히클이다. 약학 조성물은 약 pH 7.0 내지 8.5인 트리스 완충액, 또는 약 pH 4.0 내지 5.5인 아세트산염 완충액을 포함할 수 있으며, 이는 솔비톨 또는 이에 대한 적당한 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 동결건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 원하는 순도인 선택된 조성물을 선택적인 제형 제제와 혼합함으로써(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기와 동일) 저장용으로 제조될 수 있다. 또한, 나노입자는 수크로스와 같은 적절한 부형테를 사용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
제형 성분은 투여 부위에 허용가능한 농도로 존재한다. 완충액은 유리하게 생리적인 pH로 또는 약간 더 낮은 pH로, 전형적으로는 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내로 조성물을 유지하는데 사용된다.
본 발명의 약학 조성물은 비경구적으로 전달될 수 있다. 비경구 투여가 고려되는 경우, 본 발명에서의 사용을 위한 치료용 조성물은 발열 물질이 없는, 본 발명의 원하는 나노입자를 포함하는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 수 있다. 제조는 제제, 예를 들어 이후에 데포 주사를 통해 전달될 수 있는 제품의 제어 또는 지속된 방출을 제공할 수 있는, 주사용 마이크로스피어, 생체침식성 입자, 중합성 화합물(예를 들어 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과 함께 원하는 분자의 제형을 수반할 수 있다. 히알루론산이 있는 제형은 순환에 있어서 지속된 기간을 촉진하는 효과가 있다. 이식가능한 약물 전달 장치는 원하는 분자를 도입하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 소화관을 통해, 예를 들어 경구로 전달될 수 있다. 이와 같은 약학적으로 허용가능한 조성물의 제조는 당업계의 기술 범위 내에 있다. 이러한 방식으로 투여된 나노입자는 고체 투여 형태의 조제, 예를 들어 정제 및 캡슐에 관습적으로 사용된 담체와 함께 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 생물학적 이용 가능성이 최대화되고 전전신성(pre-systemic) 분해는 최소화되는 경우 캡슐은 위장관 내 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 추가적인 제제는 본 명세서에 개시된 나노입자의 흡수를 용이하게 하도록 포함될 수 있다. 희석제, 착향제, 저융점 왁스, 식물성 기름, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제, 결합제가 또한 이용될 수 있다.
약학 조성물은 정제의 제조에 적당한 비독성 부형제와의 혼합물에 본 명세서에 개시된 효과적인 양의 나노입자를 포함할 수 있다. 멸균수, 또는 다른 적절한 비히클에 정제를 용해시킴으로써, 용액은 단위-용량 형태로 제조될 수 있다. 적당한 부형제는 이에 제한되는 것은 아니지만, 불활성 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 탄산수소나트륨, 락토스, 또는 인산칼슘 또는 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아 또는 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크를 포함한다.
추가적인 약학 조성물, 예를 들어 지속된 전달 또는 제어된 전달 제형에 본 발명의 나노입자 또는 화합물을 포함하는 제형은 당업자에게 명백하다. 다양한 기타 다른 지속된 전달 또는 제어된 전달 수단, 예를 들어 리포좀체, 생체 침식성 마이크로입자 또는 다공성 비트 및 데포 주사를 제형화하는 기법은 또한 당업자에게 알려져다. 예를 들어, PCT 출원 제PCT/US93/00829호를 참조하며, 이는 약학 조성물의 전달을 위한 다공성 중합체 마이크로입자의 제어된 방출을 기술한다. 지속된 방출 제조물은 형상화된 물품의 형태인 반투과성 중합체 매트릭스, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐, 폴리에스터, 하이드로겔, 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호 및 EP 제058,481호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-556), 폴리(2-하이드록시에틸-메트아크릴레이트)(Langer et al., 1981 , J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer et al., id.) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시뷰티르산(EP 제133.988호)을 포함할 수 있다. 지속된 방출 조성물은 또한 리포좀을 포함할 수 있으며, 이는 당업계에 알려진 여러 가지 방법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 문헌[Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692; EP 제036,676호 EP 제088,046호 및 EP 제143,949 호]을 참조한다.
생체내 투여에 사용될 약학 조성물은 전형적으로 멸균되어 있다. 임의의 실시형태에서, 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 조성물이 동결건조되는 경우, 이 방법을 사용하는 멸균은 동결건조 및 재구성화 이전 또는 이후에 수행될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 비경구 투여용 조성물은 동결건조된 형태로 또는 용액 중에 저장될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 포함하는 용기, 예를 들어 피하 주사기 주사 바늘에 의해 관통가능한 스토퍼(stopper)를 포함하는 정맥주사용 용액 백 또는 바이알에 위치된다.
일단 본 발명의 약학 조성물이 제형화되었다면, 약학 조성물은 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체로서 멸균 바이알 내에, 또는 탈수 또는 동결건조된 분말로서 저장될 수 있다. 이와 같은 제형은 즉시 사용가능한(ready-touse)형태 또는 투여 전에 재구성되는 형태(예컨대, 동결건조된 형태)로 저장될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 피내주입, 병변내(intralesional) 주입, 근육내 주입, 복강내 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 결정될 수 있으며 일반적으로 0.0001-100 mg/kg의 범위일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 포유동물, 보다 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이에 적용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 약물운반체를 포함하며 상기 약물운반체의 약물이 항암제인 것을 특징으로 하는 항암 약제학적 조성물을 제공한다.
상술한 연구들은 종결되거나 현재 진행형이지만 아직까지 임상적으로 승인되지 않은 상태인데, 이러한 측면에서 세포투과 펩타이드 연구에서 중요한 점은 세포독성 및 혈청에서의 분해율, 등을 꼽을 수 있다. 특히, 혈청에서의 펩타이드 분해율은 목적 약물을 세포에 전달하기 위해 매우 중요하다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 약물운반체를 구성하는 CTD의 세포 표적화 기능과 DRD의 엔도좀 방출으로 인해 이와 결합된 표적약물을 세포질로 효과적으로 이동시킬 수 있다.
본 발명은 생체적합성 고분자 캐리어를 이용하는 약물운반체를 제공할 수 있다. 약물운반체를 구성하는 CTD, DRD 및 표적약물이 생체적합성 고분자에 비공유 또는 공유결합으로 결합할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “생체적합성 고분자”는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 가지고 있는 고분자를 의미한다.
바람직하게는, 본 발명에 적합한 생체적합성 고분자 케리어는 합성 중합체 또는 천연 중합체이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 고분자로서의 합성 중합체는 폴리에스테르, 폴리하이드록시알카노에이트(PHAs), 폴리(α-하이드록시액시드), 폴리(β-하이드록시액시드), 폴리(3-하이드로식부티레이트-co-발러레이트; PHBV), 폴리(3-하이드록시프로프리오네이트; PHP), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트; PHH), 폴리(4-하이드록시액시드), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(4-하이드록시발러레이트), 폴리(4-하이드록시헥사노에이트), 폴리(에스테르아마이드), 폴리카프로락톤, 폴리락타이드, 폴리글리코라이드, 폴리(락타이드-co-글리코라이드; PLGA), 폴리디옥사논, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리(글리콜산-co-트리메틸렌카보네이트), 폴리포스포에스테르, 폴리포스포에스테르 우레탄, 폴리(아미노산), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(이미노카보네이트), 폴리(타이로신 카보네이트), 폴리카보네이트, 폴리(타이로신 아릴레이트), 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리포스파젠스, PHA-PEG, 에틸렌 비닐 알코올 코폴리머(EVOH), 폴리우레탄, 실리콘, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리이소부틸렌과 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 스틸렌-이소브틸렌-스틸렌 트리블록 공중합체, 아크릴 중합체 및 공중합체, 비닐 할라이드 중합체 및 공중합체, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 메틸에테르, 폴리비닐리덴 할라이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리플루오로알켄, 폴리퍼플루오로알켄, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 아로마틱스, 폴리스틸렌, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 아세테이트, 에틸렌-메틸 메타크릴레이트 공중합체, 아크릴로니트릴-스틸렌 공중합체, ABS 수지와 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 폴리아마이드, 알키드 수지, 폴리옥시메틸렌, 폴리이미드, 폴리에테르, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴산-co-말레산 또는 폴리아미노아민이다.
바람직하게, 상기 생체 적합성 중합체로서의 천연 중합체는 키토산, 덱스트란, 셀룰로오스, 헤파린, 히알루론산, 알기네이트, 이눌린, 녹말 또는 글리코겐이다.
바람직하게, 본 발명에 적합한 생체적합성 고분자는 덴드리머 구조를 가지는 중합체이다. 예를 들어, 폴리아미노아민의 덴드리머가 본 발명에서 생체적합성 고분자로 이용될 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 세 구성요소로 이루어진 시험군 약물운반체는 상기 세 구조요소 중 임의의로 선택된 2 구성요소로 이루어진 대조군 약물운반체보다 우수한 표적약물 효과(세포사멸효과)을 나타냈다. 또한 혈청에서의 시험군 약물운반체 분해율의 측면에서 대조군보다 최소 48시간까지 안정적으로 유지되었기 때문에, 본 발명의 약물운반체들도 우수한 혈청 내 안정성을 나타낼 것으로 예측되었다(결과를 보이지 않음).
본 발명의 약물운반체는 CTD, 약물, DRD 등을 최소 포함하고 있어 혈청에서의 분해율이 매우 낮을 것으로 예측돼, 약물운반체로서의 개발 가능성이 매우 높다. 따라서, 본 발명은 (a) 상술한 세포 표적화 부위; (b) 약물 방출 부위; 및 (C) 상기 결합부위 결합된 표적약물를 포함하는 약물운반체를 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명에 따르면 효율적이면서 간편하게 표적지향성 및 약물방출 기능이 향상된 약물운반체를 제공할 수 있다.
(b) 본 발명의 약물운반체는 목적으로 하는 특정 세포로만 약물을 운반하며 엔도좀에서 약물운반체의 방출 기능을 향상시켜 효과적인 치료 효능을 나타낸다.
도 1은 본 발명에 의해 제조되는 약물운반체의 다양한 구성 도면으로 약물운반체를 구성하는 CTD는 세포 표적화 도메인, DRD는 약물 방출 도메인과 Drug은 표적약물을 나타내고, CTD-표적약물-DRD 순으로 연결된 구조체(A), CTD-DRD-표적약물 순으로 연결된 구조체(B)와 폴리머골격에 CTD, DRD 와 표적약물이 결합한 구조체(C) 등이고,
도 2는 PLK1 siRNA의 안티센스가닥(AS) 올리고뉴클레오타이드와 LPE3-1 펩타이드의 접합체를 분석한 결과로 PLK1 siRNA의 AS와 LPE3-1 펩타이드의 반응 혼합물(A), 정제된 접합체(B)의 HPLC 분석결과이며, PLK1 siRNA의 AS(1), PLK1 siRNA의 AS와 LPE3-1펩타이드의 반응 혼합물(2)와 정제된 접합체 (3)의 Denaturing 15% PAGE 전기영동한 이미지(C)이고,
도 3은 HER2가 과발현하는 BT-474와 HER2가 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포주에 HER2 Ap, PLK1 siRNA와 LPE3-1로 구성된 약물운반체를 처리한 결과 이미지이고,
도 4는 PLK1 siRNA의 안티센스가닥(AS) 올리고뉴클레오타이드와 HER2 항체의 반응물과 접합체를 분석한 결과이고,
도 5는 BT0474와 MDA-MB-231 세포주의 HER2 Ap, PLK1 siRNA와 표기된 펩타이드로 구성된 약물운반체에 따른 세포사멸을 조사한 결과이고,
도 6은 BT0474와 MDA-MB-231 세포주의 HER2 Ap, PLK1 siRNA와 LPE3-1로 구성된 약물운반체의 처리시간에 따른 세포사멸을 조사한 결과이고,
도 7은 HER2 Ap, PLK1 siRNA와 LPE3-1로 구성된 약물운반체의 양에 따른 세포주의 사멸을 조사한 결과이고,
도 8은 pH 7.0에서 HER2 Ap, PLK1 siRNA와 표시된 펩타이드로 구성된 약물운반체에 따른 세포주의 미토콘드리아의 전위막 측정에 의한 사멸을 조사한 결과이고,
도 9는 pH 5.5에서 HER2 Ap, PLK1 siRNA와 표시된 펩타이드로 구성된 약물운반체에 따른 세포주의 미토콘드리아의 전위막 측정에 의한 사멸을 조사한 결과이고,
도 10은 다양한 대조군 약물운반체에 따른 HER2 유전자가 과발현되는 BT-474와 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포주의 사멸을 조사한 결과이고,
도 11은 표시된 약물운반체의 처리시간에 따른 HER2 유전자가 과발현되는 BT-474 세포주의 사멸을 조사한 결과이고,
도 12는 표시된 약물운반체 처리시간에 따른 HER2 유전자가 과발현되는 BT-474 세포주의 사멸을 조사한 결과이고,
도 13은 표시된 약물운반체의 양에 따른 HER2 유전자가 과발현되는 BT-474 세포주의 사멸을 조사한 결과이고,
도 14는 표시된 약물운반체의 양에 따른 HER2 유전자가 과발현되는 BT-474 세포주의 사멸을 조사한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 발명은 약물운반체가 특정 세포표면에서 특정 분자와 결합하여 해당 세포에 약물을 효율적으로 표적화하는 기능과 세포내 엔도좀에 구획화된 약물운반체를 세포질로 방출을 향상시키는 기능을 갖는 접합체에 관한 것으로서, 표적약물, CTD 및 DRD 등으로 이루어진 약물운반체가 약물을 효율적으로 세포내에 도입하여 약물로 유효 효과를 극대화하는 것이다.
본 실시례에서 구입처를 미표시된 시약은 미국, SigmaAldrich사에 구입하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
실시예 1. 유용한 DRD 펩타이드 선정을 위한 약물운반체 제조
본 발명의 약물운반체인 CTD/표적약물/DRD 구조에서 CTD는 HER2 Ap, 표적약물은 PLK1 siRNA 그리고 DRD는 <표1> 5종류의 펩타이드를 사용하여 유용한 DRD를 결정하였다. 약물운반체는 펩타이드의 종류로 구분하였으며 펩타이드가 멜라틴인 경우, 멜라틴 운반체, LP인 경우, LP 운반체, LPE3-1인 경우 KSC 운반체, pHD24인 경우, pHD24 운반체, Hylin a1인 경우 Hylin a1 운반체라고 명명하였다.
펩타이드의 종류 및 아미노산 서열
종류 아미노산서열 비고
Melittin GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ 넓은 pH 범위에서 막 활성화
LP GWWLALALALALALALASWIKRKRQQ
Hylin a1 IFGAILPLALGALKNLIK
LPE3-1 GWWLALAEAEAEALALASWIKRKRQQ 산성 pH에서
막 활성
pHD24 GIGAVLKVLATGLPALISWIKAAQQL
HER2는 인간 상피 세포 성장 인자 수용체 (HER / EGFR / ERBB) 계열의 구성원이며 원형질막에 결합된 수용체 티로신 키나아제이다. 이 종양 유전자의 증폭 또는 과발현은 특정 공격적 유형의 유방암의 발생 및 진행에 중요한 역할을 한다. HER2는 유방암 환자의 약 30 %에게 중요한 바이오마커이고 치료 표적이다. HER2는 동일 지역에 위치하고 있으며 대부분의 경우 유방, 고환 세균 세포, 위암, 및 종양과 연관된 종양 유전자인 GRB7 유전자와 함께 증폭된다. HER2 단백질은 종양 형성에 역할을 할 수 있는 세포막에서 클러스터를 형성한다. HER2 유전자는 증폭으로 과발현되고 유방암의 약 15-30 %에서 발생하며 질병 재발의 증가와 예후의 저하와 밀접한 관련이 있다. 과발현은 난소, 위, 폐 선암 및 자궁 장 액성 자궁 내막 암과 같은 공격적 형태의 자궁 암에서도 발생하는 것으로 알려져 있다. HER-2는 위암 환자의 약 7-34 %와 타액선 암의 30 %에서 과발현된다.
본 발명에서는 HER2를 표적분자로 하여 제작된 HER2 압타머(Varmira K. et al., Nucl Med Biol. 2013, 40(8):980-6)와 항체(Ab)를 약물운반체의 세포 표적화 도메인을 구성하였다.
siRNA(small interfering RNA)는 세포 내에서 특정 mRNA와 결합하여 해당 유전자의 발현을 억제시키는 세포독성이 없는 약물로, siRNA에 CTD와 DRD가 도입됨으로써 효율적으로 세포내에 도입되어 타겟으로 하는 유전자의 발현을 저해시키는 효과가 있다.
PLK1은 종양 세포에서 종종 과발현되는 원발암 유전자이다. Aneuploidy와 종양형성(tumorigenesis)는 중심체(centrosome) 비정상(abnormality), 특히 중심체 증폭 결함(centrosome amplification defects)에서 발생할 수 있다. PLK1에 의해 조절되는 중심체 복제와 성숙(duplication and maturation)은 세포분열 후기 S기에서 전기 사이에 발생한다. 비정상 중심체 증폭(Abnormal centrosome amplification)은 다극 방추사들(multipolar spindles)로 이어지고 염색체의 불균일한 분리(unequal segregation)를 초래할 수 있다. PLK1 과발현은 또한 중심체 크기 및/또는 중심체 수를 증가시켜 염색체의 부적절한 분리, 이수배체 및 종양 형성을 유도한다. PLK1의 발암 성질은 세포분열 진행을 촉진시키는 역할을 하고 망막아세포 종양 억제유전자(Retinoblastoma tumor suppressor, RB)와 종양 억제 인자 p53 관련 경로에도 관여한다.
본 발명에서는 PLK1을 표적분자로 하는 PLK1 siRNA(Song WJ. et al.,Small 2010, 6(2), 239246)를 약물운반체의 표적약물로 사용하였다.
본 실시례의 약물운반체는 <염기서열 1>의 HER2 Ap, 스페이서(밑줄이 있는 염기서열)와 PLK1 siRNA의 SS을 지시하는 단일가닥핵산 DNA(한국, 바이오니아사), <염기서열 3>의 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 PLK1 siRNA의 AS(미국, BioSynhesis사)과 <표1>의 펩타이드 등(미국, Biocompare 사)을 각각 주문 제작하여 제조하였다.
HER2 Ap-시페이서-siRNA의 SS(SS): AGC CGC GAG GGG AGG GAA GGG TAG GGC GCG GCT-TTTT-TGA AGA AGA TCA CCC TCC TTA TT (염기서열 1)
PLK1 siRNA의 SS: TGA AGA AGA TCA CCC TCC TTA TT (염기서열 2)
PLK1 siRNA의 AS(AS): TAA GGA GGG TGA TCT TTC TTC A (염기서열 3)
① HER2 Ap/PLK1 siRNA의 센스 가닥의 접합체(Ap-siSS)의 제조
상기 제조된 <염기서열 1>의 DNA 단일가닥핵산을 주형으로 <염기서열 4>의 T7 프로모터가 있는 정방향 프라이머(밑줄이 있는 염기서열)와 <염기서열 5>의 역방향 프라이머를 사용하여 PCR하여 확보한 PCR 산물을 전사체로 하여 DuraScribe®T7 Transcription Kit(미국, Lucigen사)로 체외 전사를 수행하여 HER2 Ap, 스페이서와 센스 PLK1 siRNA의 SS 접합체인 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 복합체(Ap-siSS)를 제조하였다. 본 실시례에서 제조한 전사체는 2'-F-치환 피리미딘을 포함한 RNA로 자연상태의 RNA보다 생체내 안정성이 높아진다.
T7 프로모터가 있는 정방향 프라이머: TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-GG AGC CGC GAG GGG AGG GAA(염기서열 4)
정방향 프라이머: AGC CGC GAG GGG AGG GAA(염기서열 5)
역방향 프라이머: AAT AAG GAG GGT GAT CTT(염기서열 6)
PCR은 1,000 pmoles 단일가닥핵산 전사체, 2,500 pmoles PCR의 프라이머 쌍을 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl(pH 8.3), 3 mM MgCl2, 0.5 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 0.1 U Taq DNA Polymerase (미국, Perkin-Elmer)에서 PCR를 수행한 후 QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(미국, QIAGEN Inc.)으로 정제하였다.
2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA들은 DuraScribe®T7 Transcription Kit(미국, Lucigen사)의 체외 전사로 합성하고 정제하여 준비하였다. 200 pmoles 이중가닥 DNA 전사체, 40 mM Tris-Cl (pH 8.0), 12 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5 U T7 RNA Polymerase 그리고 1 mM ATP, GTP 및 3 mM 2'F-CTP, 2'F-UTP를 37℃ 에서 6 ~ 12시간 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(미국, Bio-Rad Laboratories)으로 정제하였다.
② PLK1 siRNA의 AS/펩타이드 접합체(siAS-P)의 제조
본 발명에서 고분자물질의 아미노 작용기를 반응성이 높은 알데히드 작용기로 전환할 목적으로 <화학식 1>의 S-4FB 링커 또는 <화학식 2> S-SS-4FB를 포함하는 항체 올리고뉴클레오타이드 올인원 접합 키트(미국, Solulink 사)을 사용하였다.
Figure pat00001
[화학식1]
Figure pat00002
[화학식 2]
첫 단계는 S-4FB 링커 또는 S-SS-4FBS-SS-4FB로 주문제작한 NH2-PLK1 siRNA의 SS(siSS)의 말단의 아미노기에 방향족 알데히드 작용기인 4FB를 도입하는 것이다. S-SS-4FB의 디설파이드 결합은 글루타티온에 의해 절단되어 약물 운반체에서 그 캐리어를 분리할 수 있다.
본 실시례 사용되는 약물운반체를 제작하기 위해 5‘에 아미노기가 부착된 <염기서열 2>의 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 PLK1 siRNA의 AS을 주문 제조하였다(한국, 바이오이나사). 항체 올리고뉴클레오타이드 올인원 접합 키트(미국, Solulink 사)을 사용하여 S-4FB로 주문제작한 NH2-PLK1 siRNA의 AS(siAS)의 말단의 아민기에 방향족 알데히드 작용기인 4FB를 도입하는 것이다.
상기 동결건조된 PLK1 siRNA의 AS에 항체 올리고뉴클레오타이드 올인원 접합 키트(미국, Solulink 사)의 100㎕ OligoResuspension Solution을 첨가하여 0.5 OD260/㎕ PLK1 siRNA AS 용액을 준비하였다. 상기 제조한 PLK1 siRNA의 AS 용액을 올리고 탈염용 스핀 컬럼(적색 캡)으로 탈염공정을 수행하였다. 상기 탈염된 PLK1 siRNA의 AS 용액에 DMF에 용해된 S-4FB 용액을 첨가하여 0.5 OD260/㎕ PLK1 siRNA의 AS 용액이 되도록 하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 변형 반응이 종결되면 탈염공정을 수행하고 수집하였다.
<표 1>의 펩타이드(미국, Biocompare 사)를 100mM 인산칼륨 pH5.49 완충 용액으로 교환하여 약 7.1mg/ml로 농축하였다. S-4FB 링커와 연결되어 있는 HER2 Ap를 50% DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용매에 녹여 2.5mg/ml이 되도록 하였다.
그리고 나서 최종 70mM 인산칼륨 pH6.0, 펩타이드 5.0mg/ml, 14% DMSO, Ap 농도 0.3mg/ml, 펩타이드의 α-아민과 변형된 Ap의 몰비가 약 1:2.3(또는 펩타이드와 변형된 Ap의 몰비가 1:9)가 되도록 준비된 펩타이드 용액과 변형된 Ap 용액을 혼합하였다.
상기 반응 용액에 NaCNBH3(Sigma사, 미국)를 최종 20mM이 되도록 첨가한 후, 4℃에서 12시간 동안 서서히 교반시키면서 반응시켰다. 반응하지 않은 펩타이드, 링커와 변형된 Ap를 분리하기 위하여 세파덱스 G-25컬럼(미국, GE 헬스케어사) 또는 리소스페닐 컬럼(미국, GE헬스케어 사)을 사용하였다. 이러한 과정으로 HER2 Ap가 LPE3-1 펩타이드의 아미노 말단에 선택적으로 결합된 형태를 제조하였다. HPLC 분석 및 PLK1 siRNA의 AS/펩타이드 접합체의 형성을 비변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 이온영동법과 SYBR Gold 염색에 의하여 확인하였다(도 2 참조).
③ 약물운반체의 합성
이중 가닥 siRNA를 생성하기 위해, 어닐링 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl 및 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (1 mM))에 있는 상기 제조한 50 μM RNA 복합체(A-siS)와 50 μM Plk1 siRNA AS과 펩타이드복합체(siAS-P)인 혼합물을 95 ℃에서 3 분 동안 열 변성시키고 20℃로 서서히 냉각시켜 (HER2 Ap/PLK1 siRNA/펩타이드) 화합물을 형성하였다. 형성된 (HER2 Ap/PLK1 siRNA/펩타이드) 구조의 탈염 및 필터 정제는 0.22 μm 멸균 여과막으로 Millipore 원심 분리를 사용하여 수행하였다.
(HER2 Ap/PLK1 siRNA/펩타이드) 구조의 형성을 비변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 이온영동법과 브롬화 에티듐 염색에 의하여 확인하였다.
실시례 2. 유용 DRD의 선정
(1) 세포사멸의 측정
실시례1에서 제조한 <표 1> 5종류의 펩타이드로 구성된 약물운반체들의 세포사멸 효능은 PI 또는 phospho-H2AX 방법과 Annexin V FITC Apoptosis detection kit(미국, BD사)로 조사하였다.
HER2 유전자가 과발현하는 BT-474와 발현하지 않는 MDA-MB-231세포를 12-웰 플레이트에 웰당 105 개의 세포를 접종하고 배양하고 37℃ 세포배양기에서 24시간 동안 안정화 과정을 미리 진행하였다. 이후, 실시례1에서 제조한 <표 1> 5종류의 펩타이드로 구성된 약물운반체들을 첨가하고 배양하였다. 72 시간 처리가 끝나기 40 분 전, 간단히 PI와 Hoechst를 각각 1 μg / ml의 최종 농도로 세포에 첨가하였는데, 샘플 플레이트는 HCS(High-Content Screening) 시스템(미국, ThermoFisher Scientific 사)으로 실시간 분석하였다. 세포 사멸의 초기 지표인 phospho-H2AX에 대해 처리된 세포를 2 % paraformaldehyde와 Hoechst 염료로 30 분간 고정시킨 후 Triton X-100으로 투과성으로 만들고 소 혈청 알부민(미국, Sigma-Aldrich)과 마우스 항-인간 phospho-H2AX (미국, Abcom; 1 : 100 희석)을 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 토끼 항 마우스 Alexa Fluor 488 항체 (미국, Invitrogen; 1 : 100 희석)를 첨가하였다. 각 과정 후에 세포를 PBS로 부드럽게 씻어 주었다. 마지막으로 샘플 플레이트를 분석하고 이미지를 HCS 시스템으로 분석하였다.
정상적으로 살아있는 cell은 phospho-H2AX와 PI에 음성이지만, 초기 사멸 과정의 세포은 phospho-H2AX에는 양성이고 PI에는 음성이다. 후기 사멸 과정의 세포는 PI에 양성 반응을 보였다(도 3 참조).
또한, Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit를 이용한 분석을 위해, HER2 유전자가 과발현하는 BT-474와 발현하지 않는 MDA-MB-231세포를 96well 배양용기에 준비한 후 37℃ 세포배양기에서 24시간 동안 안정화 과정을 미리 진행하였다. 이후에, 72시간 동안 5종류의 약물운반체를 50nM를 처리하여 세포사멸을 유도하였다. 상기 처리한 세포를 차가운 PBS로 2 회 세척 한 후, 1 ×106 세포 / ml의 농도로 1X 결합 완충액에 현탁 한 후, 100 ㎕의 용액 (1 ×105 세포 / ml)을 5 ml 배양 튜브에 옮기고, 5 μl의 FITC Annexin V와 5 μl의 PI를 첨가하였다. 용액을 부드럽게 볼텍싱(vortexing)하고 어두운 곳에서 실온 (25 ℃)에서 15 분 동안 배양하였다. 그런 다음 400㎕의 1X Binding Buffer를 각 튜브에 첨가하고 1 시간 이내에 유세포 분석으로 분석하였다. 세포의 이중 형광 신호는 마이크로 모세관 유동 세포 계측기(BD, USA)를 사용하여 분석하였다.
동일한 농도(50nM)와 pH=7.0에서 5종류의 약물운반체들의 항종양 능력을 조사하였다. 상이한 펩타이드로 이루어진 5종류의 약물운반체들은 모두 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 발현하지 않는 MDA-MB-231세포에서 미치는 세포사멸 유도 효과가 유의한 차이를 관찰할 수 있었다. 중요하게도, HER2에 결합하는 HER2 Ap를 구성성분으로 있는 5종류의 약물운반체들은 중 pH 의존성 막 활성 펩타이드인 LPE3-1과 pHD24로 구성된 약물운반체는 모두 HER2 유전자가 발현하지 않는 MDA-MB-231세포보다 과발현하는 BT-474에서 높은 세포사멸을 유도하였다(도 5 참조).
HER2 Ap, PLK1 siRNA, LPE3-1로 이루어진 약물운반체의 pH7.0에서 처리시간 및 양에 따른 HER2유전자가 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포주의 세포사멸에는 거의 영향이 없으나 HER2유전자가 과발현하는 BT-474 세포주에는 처리시간 및 양에 따라 증가함을 관찰할 수 있었다(도 6와 도 7 참조).
(2) 미토콘드리아 막 전위 변화 측정
Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit(미국, BD 사)를 사용하여 미토콘드리아 막 전위 변화를 감지하는 데 사용하였다. 세포 샘플의 준비는 세포 사멸 분석에서와 동일하다. 1 ml 세포 용액 (1 x 106 cells/ml)을 15 ml의 배양 튜브에 옮기고, 800 rpm에서 5 분간 원심 분리하고, 상층액을 제거한 후, 0.5 ml의 JC-1 용액을 첨가 하고 어두운 곳에서 실온 (25 ℃)에서 15 분 동안 배양하였다. 침전물을 1 ml의 1x Assay Buffer로 800 rpm에서 5 분 동안 세척한 다음 재원심 분리했다. 이 과정을 두 번 반복한 다음, 0.5 ml의 1x Assay Buffer를 가하여 침전물을 재현탁했다. 마지막으로, 0.5 mL용액의 이중 형광 신호는 마이크로 모세관 유동 세포 계측기micro capillary flow cytometer (미국, BD사)를 사용하여 분석하였다. 또한, 세포 배양 배지의 pH는 pH 의존성 실험에서 산 및 알칼리 용액으로 조정하였다.
Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit는 세포의 미토콘드리아 막 전위 변화를 측정하여 그 결과를 세포 사멸로 표시하며, 세포사멸은 종종 Δψ의 탈분극과 관련되어 FL-2 채널에서 JC-1 형광이 감소된 세포 수가 증가한다. 즉, 아폽토시스 집단은 종종 음성 대조군보다 낮은 적색 형광 신호 강도 (FL-2 축)를 나타낸다. 일부 apoptotic 시스템에서, FL-1에서 측정된 녹색 형광의 수준의 변화가 또한 관찰되었다.
pH 의존성 방출을 확인하기 위해, 5종류의 약물운반체들을 처리 후 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474와 세포발현하지 않는 MDA-MB-231세포의 미토콘드리아 막 전위 변화를 측정한 결과는 24 시간 동안 멜라틴, LP, Hylin a1, LPE3-1, 와 pHD24 운반체의 처리로 <도 8>과 <도 9>에 표시된 바와 같이, MDA-MB-231세포의 미토콘드리아 막 잠재력은 pH=7.0에서 멜라틴, Hylin a1와 LP운반체는 평균 22.0%이고, LPE3-1 와 MeP5 운반체는 평균 6.0%이고, BT-474은 멜라틴, Hylin a1와 LP운반체는 평균 23.0%이고 LPE3-1 와 MeP5 운반체는 평균 28.0%이다. MDA-MB-231세포의 미토콘드리아 막 잠재력은 pH=5.5에서 멜라틴, Hylin a1와 LP운반체는 평균 25.0%이고 LPE3-1 와 MeP5 운반체는 평균 27.0%이고, BT-474은 멜라틴, Hylin a1와 LP운반체는 평균 25.0%이고 LPE3-1 와 MeP5 운반체는 평균 28.0%이다.
Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit에 의한 세포사멸 분석결과는 상기 Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit로 분석한 결과와 유사한 양상임을 알 수 있었다.
상기 실시예들을 통해, pH 의존성 막 활성 펩타이드(LPE3-1와 pHD24)로 구성된 약물운반체는 pH7.0에서 특정세포에 있는 HER2에 결합하는 HER2 Ap를 이용하여 선택적으로 약물운반체가 특정세포에만 더 높은 효과를 낼 수 있음을 의미한다. 즉, pH 의존성 막활성 펩타이드로 구성된 약물운반체(예를 들어 LPE3-1과 pHD24를 포함하는 약물운반체)를 통해 항암치료의 부작용 경감 및 항암제의 효과 증대를 달성할 수 있으며, 이를 통해 큰 항암 효과를 낼 수 있음을 시사한다고 할 수 있다.
결론적으로 특정세포에 있는 분자에 결합하는 Ap와 pH의존성 막투과성 펩타이드를 이용하여 선택적으로 약물을 특정세포에만 효율적으로 이송하고 pH 의존적으로 약물들이 세포 투과도 증가로 더 높은 효과를 보일 수 있는 데에 기여할 수 있음을 예측할 수 있다.
실시례 3 약물운반체의 제조
본 발명의 설계된 시험군 약물운반체는 (HER2Ap/PLK1siRNA/LPE3-1) 화합물, (HER2Ab/PLK1siRNA/LPE3-1) 화합물, (HER2Ap/PAX/LPE3-1) 화합물과 (HER2 Ab/PAX/LPE3-1) 화합물이다.
본 발명에서 화학물질로 사용하는 파클리탁셀(Paclitaxel, PAX)은 유방암, 자궁암 등의 항암 치료제로 널리 사용되고 있는 디텔페노이드(Diterpenoid)계 화합물로서, 현재 유방암이나 자궁암 이외에 다른 종류의 암치료제로도 임상실험이 진행되고 있는 효과적인 항암 치료제이다.
3-1. 시험군 약물운반체 제조
(1) (HER2Ap/PLK1siRNA/LPE3-1) 화합물의 제조
본 발명의 시험군 약물운반체은 CTD인 HER2에 대한 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA Ap, 표적약물인 PLK1 siRNA, 및 DRD인 LPE3-1 펩타이드 등으로　구성할　수　도　있다. 본 실시례에서 사용하는 시험군 약물운반체인 HER2 Ap/PLK1 siRNA/LPE3-1 화합물은 실시례 1에서 기술한 방법으로 제조하였다.
(2) (HER2Ab/PLK1siRNA/LPE3-1) 화합물의 제조
본 발명의 시험군 약물운반체은 CTD인 HER2에 대한 항체(미국, ABCAM 사), 표적약물인 PLK1 siRNA, 및 DRD인 LPE3-1 펩타이드 등으로　구성할　수　도　있다.
2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 <염기서열 2>의 아미노-PLK1 siRNA의 SS을 주문 제작하였다(미국, BioSynhesis사).
UGA AGA AGA UCA CCC UCC UUA UU (염기서열 2)
상기 동결건조된 아미노-PLK1 siRNA의 SS에 항체 올리고뉴클레오타이드 올인원 접합 키트(미국, Solulink 사)의 OligoResuspension Solution을 첨가하여 0.5 OD260/㎕ Ap 용액을 준비하였다. 상기 제조한 아미노-PLK1 siRNA의 SS 용액을 올리고 탈염용 스핀 컬럼(적색 캡)으로 탈염공정을 수행하였다. 상기 탈염된 아미노-PLK1 siRNA의 SS 용액에 DMF에 용해된 S-SS-4FB 용액을 첨가하여 0.5 OD260/㎕ 올리고 용액이 되도록 하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 변형 반응이 종결되면 탈염공정을 수행하고 수집하였다.
HER2 항체를 100mM 인산칼륨 pH5.49 완충 용액으로 교환하여 약 7.1mg/ml로 농축하였다. 이후 S-SS-4FB 링커가 도입된 PLK1 siRNA의 SS를 50% DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용매에 녹여 2.5mg/ml이 되도록 하였다. 그리고 나서 최종 70mM 인산칼륨 pH6.0, 펩타이드 5.0mg/ml, 14% DMSO, SS 농도 0.3mg/ml HER2 Ab의 α-아민과 PLK1 siRNA의 SS의 몰비가 약 1:2.3(또는 HER2 Ab와 PLK1 siRNA의 SS의 몰비가 1:9)가 되도록 준비된 HER2 Ab 용액과 변형된 PLK1 siRNA의 SS 용액을 혼합하였다. 상기 반응 용액에 NaCNBH3(Sigma사, 미국)를 최종 20mM이 되도록 첨가한 후, 4℃에서 12시간 동안 서서히 교반시키면서 반응시켰다. 반응하지 않은 HER2 Ab 및 링커와 PLK1 siRNA의 SS을 분리하기 위하여 세파덱스 G-25컬럼(GE 헬스케어, 미국) 또는 리소스페닐컬럼(Resource Phe, GE헬스케어, 미국)을 사용하였다. 이러한 과정으로 PLK1 siRNA의 SS이 HER2 Ab의 아미노 말단에 선택적으로 결합된 형태를 제조하였다.
PLK1 siRNA의 AS(si-AS)/LPE3-1의 접합체(siAS-P)은 실시례 1-의 기술내용으로 제조하였다.
이중 가닥 siRNA를 생성하기 위해, 어닐링 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl 및 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (1 mM))에 50 μM Ab-siSS 와 50 μM siAS-P 접합체로 이루어진 혼합물을 95 ℃에서 3 분 동안 열 변성시키고 20℃로 서서히 냉각시켜 (HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1) 화합물을 형성하였다. 형성된 (HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1) 화합물의 탈염 및 필터 정제는 0.22 μm 멸균 여과막으로 Millipore 원심 분리를 사용하여 수행되었습니다.
(HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1) 구조의 형성을 비변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 이온영동법과 브롬화 에티듐 염색에 의하여 확인하였다. (HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1) 화합물의 양은 λ=260 ㎚에서 계산된 몰 흡수 계수를 근거로 분광광도계로 측정하였다. RPHPLC에 의한 HER2 Ab-PLK1 siRNA-LPE3-1 구조인 약물운반체의 순도 분석을 하였다.
(3) (HER2Ap/PAX/LPE3-1) 화합물의 제조
본 발명의 시험군 약물운반체은 CTD인 HER2에 대한 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA Ap, 표적약물인 PAX 및 DRD인 LPE3-1 펩타이드 등으로　구성할　수　도　있다.
본 실시레의 약물운반체는 먼저 Ap와 LPE3-1 교합체를 제조하고, PAX을 제조된 교합체에 합하는 순서로 목적하는 약물운반체를 제조하였다.
① (HER2 Ap/LPE3-1)의 교합체(Ap-P) 제조
본 실시례 사용되는 약물운반체를 제작하기 위해 <염기서열 1>의 HER2 Ap와 스페이서를 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA를 주문 제조하였다.
AGC CGC GAG GGG AGG GAA GGG UAG GGC GCG GCU-UUUU (염기서열 1)
HER2 Ap/LPE3-1 펩타이드의 교합체(Ap-P)의 제조는 실시례 1-의 PLK1 siRNA의 AS(si-AS)/LPE3-1 펩타이드의 접합체(siAS-P)에서 제시한 제조방법에서 PLK1 siRNA의 AS(si-AS) 대신에 HER2 Ap와 S-4FB를 사용하고 나머지는 동일하게 실시하였다.
*사용 직전에 2mg SPDP(미국, Pierce Biotechnology사)을 320μL DMSO에 녹여 20mM SPDP 시약 용액을 준비하였다. 1.0mL PBS-EDTA 에 용해 된 2-5mg의 Ap-P에 25μL의 20mM SPDP 용액을 첨가하여 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 탈염 칼럼을 PBS-EDTA로 평형화하고, 완충액을 교환하여 반응 부산물 및 과량의 비반응 SPDP시약을 제거하였다.
23mg DTT를 PBS-EDTA에 용해시켜 150mM DTT 용액을 만들었다. SPDP로 개질된 단백질 1 mL 당 0.5 mL DTT 용액을 첨가하여(최종 농도 50 mM DTT) 30 분 동안 반응시켰다. 탈염 컬럼을 PBS-EDTA로 평형화하고 DTT를 제거하기 위해 단백질을 탈염하였다(현재 sulfhydryl-modified).
② 말레이미드(Maleimide)가 도입된 PAX의 합성
Ap-P과 PAX(Sigma-Aldrich Inc., USA St Louis)의 접합(conjugation)을 위해 링커(4-Maleimidobutyric acid)를 PAX에 도입하여 티올(Thiol) 반응성이 있는(reactive) 말레이미드 작용기를 도입하였다.
PAX 1g (1.17mmol, 1 eq), 4-Maleimidobutyric acid 210 mg (1.17mmol, 1eq), 디메칠아미노피리딘(DMAP) 140mg(2.34mmol, 2eq), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 480mg(1.17mmol, 1eq)을 100ml 둥근 플라스크(Round flask)에 담고, 메틸렌 클로라이드(Methylene chloride) 50ml를 넣은 후, 상온에서 교반하여 반응 시켰다.
반응의 진행은 TLC(Thin Layer Chromatography)법을 이용하여 관찰하고 반응이 끝나면, 증류수(DW) 50ml를 넣어 흔들어 섞었다(Work up). (Rf Value = 0.43, Hexane : Ethyl acetate = 1 : 1)
유기용매 층을 모아 마그네슘 설파이드(Magnesium sulfide)로 수분을 제거한 후, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography)를 이용하여 분리하였다. (Hexane : Ethyl acetate = 1 : 1) 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻은 물질을 농축하여 말레이미드가 도입된 PAX의 화합물 620mg을 얻었다.
③ 말레이미드가 도입된 PAX과 티올(Thiol) 변형된 Ap-P의 교합체의 제조
상기 합성한 말레이미드가 도입된 PAX 100mg(98mol, 1eq)과 상기 합성한 티올 변형된 Ap-P 100mg(48mol, 2eq)을 각각 1ml DMSO에 녹인 후, 두 용액을 혼합하였다. 여기에 DIPEA(Diisopropyl ethyl amine) 2~3 방울을 넣은 후, Vortex에서 5분간 반응 시켰다. 반응의 종결은 Elman 시약으로 확인하고, 노란빛이 사라지면, 얻어진 혼합물에 냉각 디에틸에테르(Cooling diethyl ether)를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 화합물을 침전시켰다. Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 분말(powder)로 만들었다.
(4) (HER2 Ab/PAX/LPE3-1)화합물의 제조
본 발명의 시험군 약물운반체은 CTD인 HER2에 대한 항체(미국, ABCAM 사), 표적약물인 PAX 및 DRD인 LPE3-1 펩타이드 등으로　구성할　수　도　있다.
10mg/ml의 HER2 Ab와 10mg/ml 주문 제작한 LPE3-1 펩타이드(미국, Biocompare 사)를 0.1M MES(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 완충액(pH5)에 각각 녹였다. EDAC(1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide)를 10mg/ml로 증류수에 녹였다. 2mg LPE3-1 펩타이드를 2mg HER2 Ab에 첨가하였다. HER2 Ab/LPE3-1 펩타이드 혼합물에 0.5-1mg의 EDAC를 첨가하였다. 실내 온도에서 2-3 시간 동안 반응시켰다. 탈염(즉, CelluSep 투석을 사용) 및 적절한 완충액의 교환 (일반적으로 PBS # UP30715)을 하여 저장하였다.
HER2 Ab/LPE3-1 펩타이드 화합물의 작용기화는 실시례3-(3)에서 제시한 Ap-P의 작용기화 방법에서 Ap-P 화합물대신에 상기에서 제조한 HER2 Ab/LPE3-1 펩타이드 화합물을 사용하였고 나머지는 동일하게 실시하였다.
실시례 3-(3)-②에서 제조한 말레이미드(Maleimide)가 도입된 PAX와 상기에서 제조한 작용기화된 Ab-P 교합체 100mg(48mol, 2eq)을 1ml DMSO에 녹인 후, 이 용액을 1)에서 준비한 용액에 첨가하여 실시례3-(3)-③의 과정으로 HER2 Ab/PAX/LPE3-1의 교합체(Ab-P)를 제조하였다.
3-2. 대조군 약물운반체의 제조
설계된 대조군 약물운반체는 (HER2 Ap/LPE3-1) 화합물, (HER2 Ab/LPE3-1) 화합물, (HER2 Ap/PLK1 siRNA) 화합물, (HER2 Ap/PAX) 화합물, (HER2 Ab/PLK1 siRNA) 화합물, (HER2 Ab/PAX) 화합물, (LPE3-1/PLK1 siRNA) 화합물, (LPE3-1/PAX) 화합물을 제조하였다.
(1) (HER2 Ap/LPE3-1) 화합물의 제조
실시례3-(3)-①에서 제시한 Ap/펩타이드 화합물 제조방법으로 실시하였다.
(2) (HER2 Ab/LPE3-1) 화합물의 제조
실시례3-(4)에서 제시한 Ab/펩타이드 화합물 제조방법으로 실시하였다.
(3) (HER2 Ap/PLK1 siRNA) 화합물의 제조
먼저 실시례 1-에 제시한 방법으로 HER2 Ap/PLK1 siRNA의 SS의 접합체(Ap-siSS)를 제조하였다.
표준 고체상 합성 방법들을 이용하여 PLK1 siRNA의 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA의 AS은 주문 합성하였다(미국, BioSynhesis사).
이중 가닥 siRNA를 생성하기 위해, 실시례 1-에 제시한 방법으로 약물의 합성을 실시하였다. 이중 가닥 siRNA 접합체의 형성을 비변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 이온영동법과 브롬화 에티듐 염색에 의하여 확인하였다.
(4) (HER2 Ap/PAX) 화합물의 제조
<염기서열 1>의 SH-HER2 Ap를 주문 제작하였다(미국, BioSynhesis사).
PAX(미국, Sigma-Aldrich 사)와 4-Maleimidobutyric acid 링커를 반응시켜 티올(Thiol) 반응성이 있는(reactive) 말레이미드 작용기를 도입된 PAX의 제조는. 실시례 3-(3)-②에서 제시한 방법으로 실시하였다.
상기 합성한 말레이미드가 도입된 PAX와 상기 작용기화 HER2 Ap의 접합은 실시례 3-(3)-③에서 제시한 방법으로 실시하였다.
(5) (HER2 Ab/PLK1 siRNA) 화합물의 제조
실시례 3에 기술한 방법에 따라 HER2Ab와 PLK2 siRNA의 SS(siSS)의 접합체를 제조하였다.
표준 고체상 합성 방법들을 이용하여 PLK1 siRNA의 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA AS 각각 주문 합성하였다(미국, BioSynhesis사).
이중 가닥 siRNA를 생성하기 위해, 실시례 1-의 약물의 합성에서 제시한 제조방법으로 실시하였다. 이중 가닥 siRNA 접합체의 형성을 비변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 이온영동법과 브롬화 에티듐 염색에 의하여 확인하였다.
(6) (HER2 Ab/PAX) 화합물의 제조
구입한 HER2 Ab의 작용기화는 실시례3-(3)에서 제시한 Ap-P의 작용기화 방법에서 Ap-P 화합물 대신에 HER2 Ab를 사용하였고 나머지는 동일하게 실시하였다.
PAX(미국, Sigma-Aldrich 사)와 4-Maleimidobutyric acid 링커를 반응시켜 티올(Thiol) 반응성이 있는(reactive) 말레이미드 작용기를 도입된 PAX의 제조는. 실시례 3-(3)-②에서 제시한 방법으로 실시하였다.
상기 합성한 말레이미드가 도입된 PAX와 상기 작용기화 HER2 Ab의 접합은 실시례 3-(3)-③에서 제시한 방법으로 실시하였다.
(7) (LPE3-1/PLK1 siRNA) 화합물의 제조
LPE3-1 펩타이드/PLK2 siRNA의 SS(siSS)의 접합체 제조는 구입한 LPE3-1 펩타이드와 주문 제작한 5‘에 아미노기가 있는 PLK1 siRNA의 SS(siSS)(미국, BioSynhesis사)을 사용하여 실시례 3-(3)-에서 제시한 Ap/펩타이드 화합물 제조방법으로 실시하였다.
표준 고체상 합성 방법들을 이용하여 Plk1 siRNA의 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA AS 각각 주문 합성하였다(미국, BioSynhesis사).
이중 가닥 siRNA를 생성하기 위해, 실시례 1-의 약물의 합성에서 제시한 제조방법으로 실시하였다. 이중 가닥 siRNA 접합체의 형성을 비변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 이온영동법과 브롬화 에티듐 염색에 의하여 확인하였다.
(8) (LPE3-1/PAX) 화합물의 제조
LPE3-1 펩타이드의 작용기화는 실시례3-(3)의 Ab-P 화합물의 작용기화 과정에서 제시하는 방법에서 Ab-P 대신에 LPE3-1 펩타이드를 사용하였고 나머지는 동일하게 실시하였다.
PAX(미국, Sigma-Aldrich 사)와 4-Maleimidobutyric acid 링커를 반응시켜 티올(Thiol) 반응성이 있는(reactive) 말레이미드 작용기를 도입된 파클리탁솔의 제조는. 실시례 3-(3)-②에서 제시한 방법으로 실시하였다.
상기 합성한 말레이미드가 도입된 PAX와 상기 작용기화 LPE3-1 펩타이드의 접합은 실시례 3-(3)-③에서 제시한 방법으로 실시하였다.
실시례 4. 다양한 약물운반체의 항암 활성
(1) 세포주 배양
BT-474와 MDA-MB-231세포주는 상기 실시예 3에서 언급한 세포 배양방법으로 실시하였다.
(2) 항암 활성 확인
시험군 약물운반체 HER2 Ap/PLK1 siRNA/LPE3-1, HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1, HER2 Ap/PAX/LPE3-1, HER2 Ab/PAX/LPE3-1화합물, 대조군 약물운반체 HER2 Ap/LPE3-1, HER2 Ab/LPE3-1, HER2 Ap/PLK1 siRNA,, HER2 Ap/PAX, HER2 Ab/PLK1 siRNA, HER2 Ab/PAX, LPE3-1/PLK1 siRNA, LPE3-1/PAX 화합물 별로 투여량에 따른 암세포주 에서의 세포 사멸 정도를 Annexin V FITC 아폽토시스 검출 키트(미국, BD 사)로 측정하여 확인하였다.
BT-474와 MDA-MB-231세포주를 96well 배양용기에 준비한 후 37℃ 세포배양기에서 24시간 동안 안정화 과정을 미리 진행하였다. 이후에, 72시간 동안 표적약물을 PLK1 siRNA로 구성된 HER2 Ap/PLK1 siRNA/LPE3-1, HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1 약물운반체(0 nM, 1.0 nM, 5.0 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM) 그리고 PAX로 구성된 HER2 Ap/PAX/LPE3-1, HER2 Ab/PAX/LPE3-1 약물운반체(0 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 1,000 nM, 2,000 nM)를 각 처리한 후, 실시례 2. <세포사멸의 측정>에 기술한 방법으로 다양한 약물운반체에 의해 유도된 세포 사멸을 조사하였다.
대조군 약물운반체 HER2 Ap/LPE3-1, HER2 Ab/LPE3-1은 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474와 발현하지 않는 MDA-MB-231세포 모두에서 항암효과가 없었으며 HER2 Ap/PLK1 siRNA,, HER2 Ap/PAX, HER2 Ab/PLK1 siRNA, HER2 Ab/PAX 화합물 모두가 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474에만 항암효과가 있었다. LPE3-1/PLK1 siRNA, LPE3-1/PAX 화합물은 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474와 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포 모두에 항암효과가 없었다. 이런 결과는 대조군 약물운반체 실험으로 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474에 압타머와 항체가 결합하여 엔도좀으로 내재화되고 엔도좀이 산화되면서 일부의 약물운반체가 세포질로 방출되어 45~62%의 세포사멸을 관찰할 수 있었음을 시사한다(도 12 참조).
4가지 시험군 약물운반체 모두가 MDA-MB-231세포주에는 항암효능이 거의 없었으며(자료 미제시), BT-474 세포주에 4가지 시험군 약물운반체에 대한 항암 활성 확인 실험들의 결과는 표적약물이 PLK1 siRNA로 구성된 HER2 Ap/PLK1 siRNA/LPE3-1과 HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1 약물운반체는 EC50이 10nM 이상 투여 구간에서 암세포 사멸이 나타났고 78% 세포사멸을 관찰하였다. PAX로 구성된 HER2 Ap/PAX/LPE3-1과 HER2 Ab/PAX/LPE3-1약물운반체는 EC50이 100nM 이상 투여 구간에서 나타났으며 77%, 75% 세포사멸을 관찰하였다(도 13, 도 14, 도 15와 도 16 참조).
상기 실시예들에서 제시된 모든 항암 활성 확인 실험들의 결과는 세포 표적화 도메인이 있는 시험군 약물운반체들이 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474에 큰 항암 효과가 있으며 발현하지 않는 MDA-MB-231세포주에 항암효과가 거의 없어 적은 양의 항암제(PLK1 siRNA, 파클리탁셀)로 특정분자가 있는 세포에 제한적으로 큰 항암 효과를 낼 수 있음을 의미하고, 이를 통해 항암치료의 부작용 경감 및 항암제의 효과 증대를 달성할 수 있음을 시사한다고 할 수 있다.
상기 결과를 토대로 세포 표적화 도메인(CTD), 표적약물과 약물방출 도메인(DRD)으로 구성된 시험군 약물운반체들의 투여는 대조군 약물운반체 투여와 비교할 때 적은 농도의 투여로도 암세포 특이적인 전달이 가능하다는 결론을 내릴 수 있다.
본 발명은 그의 일부 특별한 구체예들을 참고하여 설명 및 예시되며, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 방법 또는 프로토콜의 다양한 개조(adaption), 변화, 변형, 치환, 삭제 또는 부가가 이루어질 수 있는 것으로 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항들의 범위에 의해 정의되며, 그와 같은 청구항들은 합리적인 범위에서 넓게 해석되어야 하는 것으로 의도된다.

Claims (15)

  1. 다음을 최소 구성단위로 포함하는 약물운반체(drug delivery system):
    (a) 특정 세포표면에 결합하는 세포 표적화 도메인(Cell Targeting Domain, CTD);
    (b) 엔조좀 구조의 변화를 유도하여 약물방출을 증가시키는 약물방출 도메인(Drug Release Domain, DRD); 및
    (c) 표적약물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CTD는 세포 표면에 있는 특정분자를 인식하여 세포에 결합하는 항체(Ab) 또는 이의 특이적 결합 부분, 리간드, 사이토카인, 케모카인 또는 핵산 압타머(Ap) 등으로 구성된 군에서 선택되어진 하나를 특징으로 하는 약물운반체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DRD는 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP), supercharged peptides, supercharged proteins, virus-like particle, nanocarrier, liposomes, polymer,및 nanoparticle-stabilized nanocapsule 등으로 구성된 군에서 선택어지는 어느 하나를 특징으로 하는 약물운반체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)는 환경인자에 의해 세포투과성을 활성화하는 것을 특징으로 하는 약물운반체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 환경인자가 pH인 것을 특징으로 하는 약물운반체.
  6. 제4항에 있어서, 상기 펩타이드는 (a) 유효농도(EC)이상의 높은 펩타이드 농도와 생리학적 pH 범위(pH 7.0)에서 막 투과성이 거의 없으며, (b) 엔도좀의 산성 pH 범위(pH5.5)와 유효농도(EC)이하 낮은 펩타이드 농도에서 막에 거대 분자 크기의 결함을 효율적으로 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 약물운반체.
  7. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포막투과를 증가시키는 도메인과 pH 의존성 막활성 도메인으로 구성된 펩타이드를 특징으로 하는 약물운반체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 표적약물은 화학물질, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 PNA 등으로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 약물운반체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 CTD, DRD 와 표적약물 사이에 서로 공유결합 또는 비교유결합을 하는 것을 특징으로 하는 약물운반체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 CTD, DRD 와 표적약물이 생체적합성 고분자 캐리어에 결합하는 것을 특징으로 하는 약물운반체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 DRD와 표적약물은 상기 약물운반체에 생리적으로 불안전한 연결을 하는 것을 특징으로 하는 약물운반체.
  12. 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자 캐리어는 덴드리머 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 약물운반체.
  13. 표적약물을 특정세포에 표적화하는 방법으로서,
    상기 CTD, 표적약물 및 DRD 구성단위를 최소한 포함하는 복합체를 제조하는 단계;
    상기 제조된 복합체와 상기 표적 세포와 접촉시키는 단계; 및
    상기 복합체의 CTD를 상기 표적 세포표면에 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  14. 상기 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 약물운반체를 포함하며 상기 약물운반체의 약물이 항암제인 것을 특징으로 하는 항암 약제학적 조성물.
  15. 상기 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 약물운반체를 포함하며 상기 약물운반체의 약물이 영상화 감지물질인 것을 특징으로 하는 영상화제제 조성물.
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