TWI812706B - 肽以及其使用 - Google Patents
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Abstract
係由通式(I)所示之胺基酸序列所構成,且對消化系統的癌細胞或是癌組織具有高度的累積性。(通式(I)中,X11係由以下的(a)或是(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基;(a)序列編號1至3中任一者所示之胺基酸序列;(b)序列編號1至3中任一者所示之胺基酸序列中,含有1或是2個的胺基酸缺失、取代或是加成之序列之胺基酸序列;Y11係胺基酸數1以上至10以下的胺基酸殘基所構成之肽連接體,前述胺基酸殘基係各自獨立,為甘胺酸殘基、脯胺酸殘基、絲胺酸殘基、半胱胺酸殘基或是離胺酸殘基;X12係由前述(a)或是前述(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基、或是該等的逆反型肽殘基。n11為1以上至9以下的整數。)
X11-(Y11-X12)n11 (I)
Description
本發明係關於肽以及其使用。具體而言,本發明係關於對消化系統的癌細胞或是癌組織具有高度的累積性之肽、編碼前述肽之核酸、含有前述肽之肽-藥物-共軛物、含有前述肽-藥物-共軛物之醫藥組成物、含有前述肽之標記肽、含有前述標記肽之成像組成物、以及具有前述核酸之載體、肽-藥物-共軛物表現載體、以及標記肽表現載體。本申請基於2018年5月2日於日本特願2018-088811號主張其優先權,在此援引該內容。
胰臟癌(浸潤性胰腺導管癌),平均存活時間為診斷後約6個月前後,在惡性腫瘤之中亦是最難治癒的。根據日本厚生勞動省發表的人口動態統計,因胰臟癌所致之年間死亡人數逐年增加,平成28年(2016年)統計為33475人。此外,胰臟癌所致之死亡係佔全癌症死亡的9%,在肺癌、大腸癌、胃癌之後排名第4位。根據日本全國胰臟癌登記調查報告(2007年度),胰臟癌的可切除病例為全病例的約40%,進而切除病例的3年存活率低至23.2%。
胰臟癌的治療困難的理由在於,主觀症狀少故難以早期發現,在大多數的病例之中,發現時已不適合手術或是限於姑息性手術之晚期癌症的狀態。此外,治療困難的其它理由可列舉:浸潤性胰腺導管癌的組織構建係在背景伴隨強的纖維化之硬癌(scirrhous)、胰臟癌細胞本身係增殖能力或抗藥性高的生物學上高惡性度者、進而胰臟癌從早期即具有容
易浸潤或是轉移之性質等。伴隨高度的纖維化之胰臟癌中特徵性的間質成為妨礙抗癌劑對癌細胞充分的浸透之屏障,綜合上述所列舉之問題點,現在並不存在可以大幅改善這種狀態之有效的抗癌劑,期待將來的開發。
另外,肽作為生物材料而活用之醫療領域中的動向,著眼於Tat、穿透素(Penetratin)、聚精胺酸(poly-arginin)等細胞膜通透性(細胞吸收性)肽。然而,這些肽會被正常細胞或是正常組織與腫瘤細胞或是腫瘤組織沒有區別而廣泛且非選擇性地吸收。因此,應用於需要標的選擇性的藥劑輸送之以固形癌為首的患者惡性腫瘤的治療DDS(Drug delivery system;藥物輸送系統)工具,由於會引發嚴重的副作用的方面而言難以利用。尤其已知世界性的實驗系中廣泛使用之Tat等細胞膜通透性(細胞吸收性)肽,係有引發累積在肝臟之性質(例如參照非專利文獻1)。
相對於此,cyclic RGD(cyclic Arginylglycylaspartic acid;環精甘天冬胺酸肽)係唯一醫藥化之肽。cyclic RGD係以據報導在構成新生血管或是現有血管之血管內皮細胞(以及一部份的腫瘤細胞)中高度表現之αvβ3整合素(integrin)作為標的,在血管通透性亢進中具有其作用點,可期待EPR(enhanced permeability and retention;高滲透長滯留)效果(隔介血管之物質的擴散效果)的增強所致之藥劑輸送效果。因此,cyclic RGD並非單獨,而是與其它醫藥同時併用的形式而作為成像劑或DDS劑來應用(例如參照專利文獻1)。然而,cyclic RGD對癌細胞本身之浸透性以及作用非常低,主要仍是以隔介血管之藥劑的擴散效果為主,係大幅依賴腫瘤組織的構建(血管的發達以及分布)之系統。由這些情況來看,在以癌細胞本身的直接的殺傷所致之抗癌治療作為目標的情況下無法期待充分的效果。
為了解決如以上這種課題,發明人至今開發了一種肽,係直接作用於胰臟癌細胞或是胰臟癌組織,且藉由高度地轉移之吸收性而直接作用於腫瘤(被攝入)(例如參照專利文獻2)。
一般而言,數個至二十個前後左右的胺基酸所構成之寡肽,已知在生物體內,藉由存在於人血漿中或細胞內之多種類的蛋白分解酶而急速的分解、易受代謝以及排泄影響,在投予生物體內在數分鐘至數十分鐘以內消失,該易分解性被認為是將肽作為實用醫藥應用於生物體的情況下的大課題。實際上,專利文獻2所記載之肽雖然對胰臟癌細胞或是胰臟癌組織具有高度的累積性,但在血漿存在下在投予後數分鐘以內,構成胺基酸開始分解,20分鐘左右發生完全地變性,故基於實用的觀點在生物體內之抗分解性的方面而言有改良的空間。
專利文獻1:日本專利第5721140號公報。
專利文獻2:國際公開第2017/08609號。
非專利文獻1:Vives E., et al., A Truncated HIV-1 Tat Protein Basic Domain Rapidly Translocates through the Plasma Membrane and Accumulates in the Cell Nucleus, J. Biol. Chem., 272, 16010-16017, 1997.
本發明係有鑑於對於上述的醫療上的實用化之重大的課題的現狀所完成,係提供具有對含有胰臟癌之消化系統的癌細胞或是癌組織
高度的累積性以及生物體內優異之抗分解性之新穎之肽、編碼前述肽之核酸、含有前述肽之肽-藥物-共軛物、含有前述肽-藥物-共軛物之醫藥組成物、含有前述肽之標記肽、含有前述標記肽之成像組成物、以及具有前述核酸之載體、肽-藥物-共軛物表現載體、以及標記肽表現載體。
本發明人為達成上述目標而反覆深入研究的結果,發現將胺基酸序列與根據該序列之肽設計優化之新穎的肽,對於不僅是胰臟癌細胞或是胰臟癌組織、甚至對於消化系統的癌細胞或是癌組織,均可一邊保有高度的累積性,一邊在生物體內具有卓越之抗分解性以及作用持續性,進而完成本發明。
亦即本發明係包括以下的態樣。
本發明的第一態樣之肽,係由以下的通式(I)所示之胺基酸序列所構成,且對消化系統的癌細胞或是癌組織具有高度的累積性。
X11-(Y11-X12)n11 (I)
(通式(I)中,X11係由以下的(a)或是(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基;(a)序列編號1至3中任一者所示之胺基酸序列;(b)序列編號1至3中任一者所示之胺基酸序列中,含有1或是2個的胺基酸缺失、取代或是加成之序列之胺基酸序列;Y11係胺基酸數1以上至10以下的胺基酸殘基所構成之肽連接體,前述胺基酸殘基係各自獨立,為甘胺酸殘基、脯胺酸殘基、絲胺酸殘基、半胱胺酸殘基或是離胺酸殘基;X12係前述(a)或是前述(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基、或是該等的逆反(retro-inverso)型肽殘基。n11為1以上至9以下的整數。)
上述第一態樣之肽中,前述Y11係胺基酸數1以上至10以下的肽連接體,前述胺基酸殘基係各自獨立,為甘胺酸殘基、半胱胺酸殘基或是離胺酸殘基之肽連接體。
上述第一態樣之肽中,前述n11可為1以上至4以下的整數。
上述第一態樣之肽中,前述X11以及前述X12為由相同的胺基酸序列所構成之肽殘基、或是前述X12可為前述X11的逆反型肽殘基。
上述第一態樣之肽,係可由序列編號15至31中任一者所示之胺基酸序列所構成。
本發明的第二態樣之核酸係編碼上述第一態樣之肽。
本發明的第三態樣之肽-藥物-共軛物係含有上述第一態樣之肽以及生理活性物質。
本發明的第四態樣之醫藥組成物係含有上述第三態樣之肽-藥物-共軛物。
上述第四態樣之醫藥組成物亦可用於消化系統的癌治療用途。
上述第四態樣之醫藥組成物可用於胰臟癌治療用途。
前述生理活性物質亦可為抗癌劑。
本發明的第五態樣之標記肽係含有上述第一態樣之肽以及標記物質。
前述標記物質可為穩定同位素、放射性同位素或是螢光物質。
本發明的第六態樣之成像組成物係含有上述第五態樣之標記肽。
上述第六態樣之成像組成物亦可為消化系統的癌用途。
上述第六態樣之成像組成物亦可為胰臟癌診斷用途。
本發明的第7態樣之載體係具有上述第二態樣之核酸。
本發明的第8態樣之肽-藥物-共軛物表現載體係具有編碼上述第二態樣之核酸以及生理活性物質之核酸。
本發明的第9態樣之標記肽表現載體係具有編碼上述第二態樣之核酸以及標記物質之核酸。
上述態樣的肽係具有對消化系統的癌細胞或是癌組織(尤其是胰臟癌細胞或是胰臟癌組織)之高度的累積性、以及生物體內之優異的抗分解性。
圖1係表示參考例1中使用了PCPP11之人血漿所致之分解試驗的MALDI-TOFMS法的分析結果之圖形。
圖2係表示試驗例1中使用了LL肽之人血漿所致之分解試驗的MALDI-TOFMS法的分析結果之圖形。
圖3係表示試驗例1中使用了LLL肽之人血漿所致之分解試驗的MALDI-TOFMS法的分析結果之圖形。
圖4係表示試驗例1中使用了FAM-L肽之人血漿所致之分解試驗的MALDI-TOFMS法的分析結果之圖形。
圖5係表示試驗例1中使用了Ld肽之人血漿所致之分解試驗的MALDI-TOFMS法的分析結果之圖形。
圖6係表示試驗例1中使用了NmLd肽之人血漿所致之分解試驗的MALDI-TOFMS法的分析結果之圖形。
圖7係比較了試驗例1中各種肽的抗分解性之圖形。
圖8A係試驗例2中添加了FAM-PCPP11(FAM-L肽)、FAM-LL肽以及FAM-Ld肽之各種細胞的螢光顯微鏡影像。
圖8B係表示試驗例2中由添加了FAM-PCPP11(FAM-L肽)以及FAM-LL肽之各種胰臟癌細胞以及其它癌細胞所檢測出之螢光加以定量化,並將由各自添加了肽之人非小細胞肺癌系的源自腺癌的細胞株之H2110細胞所檢測出之螢光設為1.0時,由各細胞所檢測出之螢光強度的比率之圖形。
圖8C係試驗例2中添加了FAM-PCPP11(FAM-L肽)、FAM-LL肽以及FAM-NmLL肽之各種細胞的螢光顯微鏡影像。
圖9A係試驗例3中投予了各螢光標記型肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的腫瘤表面、腫瘤切片、肝臟切片以及肺切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖9B係試驗例3中投予了各螢光標記型肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各組織切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖10A係比較了試驗例3中投予了FAM-PCPP11(FAM-L肽)之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各組織之螢光強度之圖形。
圖10B係比較了試驗例3中投予了FAM-LL肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各組織之螢光強度之圖形。
圖10C係比較了試驗例3中投予了FAM-LLL肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各組織之螢光強度之圖形。
圖10D係比較了試驗例3中投予了FAM-Ld肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各組織之螢光強度之圖形。
圖11係比較了試驗例3中投予了各螢光標記型肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的腫瘤之螢光強度之圖形。
圖12A係試驗例3中投予了FAM-Ld肽或是NmLd-FAM肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各組織切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖12B係比較了試驗例3中投予了FAM-Ld肽或是NmLd-FAM肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的腫瘤之螢光強度之圖形。
圖13A係試驗例3中投予了FAM-NmLd肽或是NmLd-FAM肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的腫瘤表面以及腫瘤切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖13B係比較了試驗例3中投予了FAM-NmLd肽或是NmLd-FAM肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的腫瘤之螢光強度之圖形。
圖14A係參考例2中投予了螢光素27μg或是200μg之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各織切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖14B係比較了參考例2中投予了螢光素27μg或是200μg之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各組織之螢光強度之圖形。
圖15A係表示試驗例4中肽(LL肽)-藥物(抗腫瘤劑之艾黴素(doxorubicin))-共軛物(PDC;Peptide-Drug Conjugate)的結構的示意構成圖。
圖15B係表示試驗例4中投予了單獨艾黴素或是PDC之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的整體影像(左)、腫瘤表面的明視野影像(中央)以及螢光影像(右)。
圖15C係表示試驗例4中投予了單獨艾黴素或是PDC之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各組織切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖16係表示參考例3中添加了PCPP11以及其部分缺失肽之各種細胞的螢光顯微鏡影像。
圖17係表示試驗例5中添加了各種肽之各種細胞的螢光顯微鏡影像。
圖18A係表示試驗例6中投予了FAM-LL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠的腫瘤的明視野影像(左以及正中央)、以及螢光影像(右)。
圖18B係表示試驗例6中從投予了FAM-LL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠所摘除之各組織以及腫瘤組織的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖18C係表示試驗例6中從投予了FAM-LL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠所摘除之各種腫瘤組織的明視野影像(左)以及暗視野影像(右)。上段係表面的成像,下段係切片的成像。
圖18D係表示試驗例6中人浸潤性胰腺導管癌(PDAC;Pancreatic ductal adenocarcinoma)細胞與人間葉系幹細胞(hMSC;human mesenchymal stem cell)所形成之腫瘤組織的蘇木精-伊紅(HE;Hematoxylin eosin)染色影像(左)以及螢光影像(右)。
圖18E係表示試驗例6中人PDAC細胞與hMSC所形成之腫瘤組織的HE染色影像。
圖18F係表示試驗例6中人PDAC細胞與hMSC所形成之腫瘤組織的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖19A係表示試驗例7中硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用BxPC3細胞)的腫瘤的明視野影像。
圖19B係表示試驗例7中投予了FAM-NmLL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用BxPC3細胞)所摘除之各組織以及腫瘤組織的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖19C係表示試驗例7中投予了FAM-NmLL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用BxPC3細胞)的主病灶的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖19D係表示試驗例7中投予了FAM-NmLL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用BxPC3細胞)的肝轉移灶的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖19E係表示試驗例7中投予了FAM-NmLL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用BxPC3細胞)的肝轉移灶的切片的HE染色影像(左)以及螢光影像(右)。
圖19F係表示試驗例7中投予了FAM-NmLL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用BxPC3細胞)的腸系膜淋巴節轉移灶的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖20A係表示試驗例7中投予了FAM-NmLL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用MIA-Paca2細胞)所摘除之各組織以及腫瘤組織的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖20B係表示試驗例7中投予了FAM-NmLL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用MIA-Paca2細胞)的肝轉移灶的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖20C係表示試驗例7中投予了FAM-NmLL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用MIA-Paca2細胞)的肝轉移灶的切片的HE染色影像(左)以及螢光影像(右)。
圖21係表示試驗例7中投予了FAM-NmLL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用AsPC1細胞)的肝轉移灶以及腸系膜淋巴節轉移灶的螢光影像。肝轉移灶的螢光影像中,右側的圖像為左側的圖像的放大圖像。
圖22A係表示試驗例7中投予了FAM-NmLL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用Capan-2細胞)所摘除之各組織以及腫瘤組織的螢光影像。
圖22B係表示試驗例7中投予了FAM-NmLL肽之硬癌性胰臟癌模型小鼠(使用Capan-2細胞)的肝轉移灶的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
圖23係表示試驗例8中添加了各種肽之各種細胞的螢光顯微鏡影像。
<對消化系統的癌細胞或是癌組織具有高度的累積性之肽>
本實施形態的肽係由以下的通式(I)所示之胺基酸序列所構成,且對消化系統的癌細胞或是癌組織具有高度的累積性。
X11-(Y11-X12)n11 (I)
(通式(I)中,X11係由以下的(a)或是(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基;(a)序列編號1至3中任一者所示之胺基酸序列;(b)序列編號1至3中任一者所示之胺基酸序列中,含有1或是2個的胺基酸缺失、取代或是加成之序列之胺基酸序列;Y11係胺基酸數1以上至10以下的胺基酸殘基所構成之肽連接體,前述胺基酸殘基係各自獨立,為甘胺酸殘基、脯胺酸殘基、絲胺酸殘基、半胱胺酸殘基或是離胺酸殘基;X12係前述(a)或是前述(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基、或是該等的逆反型肽殘基。n11為1以上至9以下的整數。)
發明人迄今所開發之PCPP11肽(例如參照國際公開第2017/086090號)(以下有時簡稱為「PCPP11」),相較於正常組織以及正常細胞,對胰臟癌細胞或是胰臟癌組織具有高度地轉移之累積性,但在實用化時,在生物體內的穩定性(抗分解性)上存在課題。為了解決該課題,發現一種新穎的肽,如後述的實施例所示,分析PCPP11的分解試驗所獲得之分解產物,而優化胺基酸序列與基於該胺基酸序列之肽設計,藉此一邊保有對包含胰臟癌細胞或是胰臟癌組織之消化系統的癌細胞或是癌組織之高度的累積性,一邊具有在生物體內卓越之抗分解性以及作用持續性,進而完成本發明。
本說明書中,所謂「消化系統的癌」,係指由消化器官所發生之惡性腫瘤。
作為消化系統的癌具體而言,可列舉例如:食道癌、膽道癌、肝細胞癌、胰臟癌、胃癌、大腸癌等。
此外,所謂「膽道癌」係指膽管癌、膽囊癌以及十二指腸乳頭部癌膽管癌所構成之癌。進而,所謂膽管癌,係指由膽管的上皮所發生之惡性腫瘤
,根據該發生之膽管的部位,可分為肝外膽管癌之肝門部區域膽管癌以及遠端膽管癌、以及肝內膽管癌(膽管細胞癌)。所謂膽囊癌,係指由膽囊與膽囊管所發生之惡性腫瘤。十二指腸乳頭部係由乳頭部膽管、乳頭部胰腺導管、共同管部、大十二指腸乳頭所構成,所謂十二指腸乳頭部癌,係指在上述的部位所發生之癌。此外,病理組織學的分類中係指腺癌、腺鱗狀上皮癌、肝內膽管細胞癌。
此外,所謂「胰臟癌」,係指由胰臟所發生之腫瘤,亦稱為胰臟癌。
胰臟係由產生胰液之腺泡、運送胰液之胰腺導管、以及內分泌腺之蘭氏小島(islets of Langerhans)等所構成,癌可由任何組織發生,但各自表示完全不同性質之腫瘤。作為胰臟癌(胰臟癌)的種類而言,可列舉例如:浸潤性胰腺導管癌(Invasive ductal carcinoma)、胰腺導管內乳頭黏液性腫瘤(Intraductal papillary mucinous neoplasm;IPMN)、胰腺導管內管狀乳頭腫瘤(Intraductal tubulopapillary neoplasm;ITPN)、胰內分泌腫瘤、胰腺導管內乳頭黏液性腫瘤、黏液性囊胞腫瘤、腺泡細胞癌、漿液性囊腺癌、轉移性胰臟癌等。其中,浸潤性胰腺導管癌係在胰臟的腫瘤性病變中占80%至90%。
此外,胰臟癌之中,已知浸潤性胰腺導管癌與上述膽道癌,在癌的發生以及進行的機轉類似。
本實施形態的肽,在上述之消化系統的癌之中,尤其對胃癌、胰臟癌以及膽道癌的細胞或是組織具有高度的累積性。此外,發明人亦確認到,關於前列腺癌的細胞或是組織亦具有同樣的高度的累積性。因此,本實施形態的肽,推測係以共同存在於這些癌的細胞表面之特定的受體作為標的。進而、本實施形態的肽係如後述之實施例所示,最適合用於胰臟癌、尤其最適合用於除了胰內分泌腫瘤與轉移性胰臟癌以外之胰臟癌
細胞或是胰臟癌組織。因此,如後所述,藉由將本實施形態的肽作為傳遞劑而使用,可高靈敏度且選擇性地檢測出實際的消化系統的癌患者(尤其胰臟癌患者)中大部分的病例的癌細胞或是癌組織。進而,可治療消化系統的癌(尤其胰臟癌)。此外,其中由作為在胰臟產生之腫瘤性病變之最高頻率之觀點來看,本實施形態的肽尤佳適用於針對浸潤性胰腺導管癌。
本說明書中,所謂「對消化系統的癌細胞或是癌組織之高度的累積性」,係指與生物體內的正常組織以及其它系統的惡性腫瘤細胞作比較,而在消化系統的癌細胞或是癌組織(尤其胰臟癌細胞或是胰臟癌組織)內被高度地吸收且累積之性質。
<胺基酸序列(I)>
本實施形態的肽,係由以下的通式(I)所示之胺基酸序列(以下有時稱為「胺基酸序列(I)」)所構成。
X11-(Y11-X12)n11 (I)
〔X11〕
通式(I)中,X11係由以下的(a)或是(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基。
(a)序列編號1至3中任一者所示之胺基酸序列、(b)序列編號1至3中任一者所示之胺基酸序列中,含有1或是2個的胺基酸缺失、取代或是加成之序列之胺基酸序列。
上述(a)中序列編號1、2或是3所示之胺基酸序列為下述的胺基酸序列。
RXPTTWHKP (序列編號1)
AXXYTWIRA (序列編號2)
RXWRQCRWR (序列編號3)
另外,序列編號1中X為R(精胺酸殘基)或是mR(甲基化精胺酸殘基)。亦即序列編號1所示之胺基酸序列為下述的胺基酸序列。
RRPTTWHKP (序列編號4)
RmRPTTWHKP (序列編號5)
此外,序列編號2中X為R(精胺酸殘基)或是mR(甲基化精胺酸殘基)。亦即序列編號2所示之胺基酸序列為下述的胺基酸序列。
ARRYTWIRA (序列編號6)
AmRRYTWIRA (序列編號7)
ARmRYTWIRA (序列編號8)
AmRmRYTWIRA (序列編號9)
此外,序列編號3中X為A(丙胺酸殘基)或是mA(甲基化丙胺酸殘基)。亦即序列編號3所示之胺基酸序列為下述的胺基酸序列。
RAWRQCRWR (序列編號10)
RmAWRQCRWR (序列編號11)
通式(I)中,X11係作為與上述(a)的胺基酸序列所構成之肽殘基在機能上同等的肽殘基,亦可為下述(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基。
(b)序列編號1至3中任一者所示之胺基酸序列中,含有1或是2個的胺基酸缺失、取代或是加成之序列之胺基酸序列。
另外,本說明書中,所謂「取代」係指以具有化學上相同的側鏈之其它胺基酸殘基來取代。具有化學上相同的胺基酸側鏈之胺基酸殘基的基團,係以本實施形態的製造方法所獲得之多肽所屬的技術領域所熟知者。可分類為例如:酸性胺基酸(天冬胺酸以及麩醯胺酸)、鹼性胺基酸(離胺酸、精胺酸以及組胺酸)、中性胺基酸中具有烴鏈之胺基酸(甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸以及脯胺酸)、具有羥基之胺基酸(
絲胺酸以及蘇胺酸)、含有硫之胺基酸(半胱胺酸以及蛋胺酸)、具有醯胺基之胺基酸(天冬醯胺以及麩醯胺)、具有亞胺基之胺基酸(脯胺酸)、具有芳香族基之胺基酸(苯丙胺酸、酪胺酸以及色胺酸)等。作為一般可能發生之胺基酸的取代而言,可列舉例如:丙胺酸/絲胺酸、纈胺酸/異白胺酸、天冬胺酸/麩醯胺酸、蘇胺酸/絲胺酸、丙胺酸/甘胺酸、丙胺酸/蘇胺酸、絲胺酸/天冬醯胺、丙胺酸/纈胺酸、絲胺酸/甘胺酸、酪胺酸/苯丙胺酸、丙胺酸/脯胺酸、離胺酸/精胺酸、天冬胺酸/天冬醯胺酸、白胺酸/異白胺酸、白胺酸/纈胺酸、丙胺酸/麩醯胺酸、天冬胺酸/甘胺酸等。
更具體而言,例如假想序列編號1或是4所示之胺基酸序列中,由N末端算來第一個的精胺酸為甘胺酸、丙胺酸、離胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或是組胺酸所取代,或是由C末端算來第二個的離胺酸為甘胺酸、丙胺酸、精胺酸、組胺酸、絲胺酸或是蘇胺酸所取代,或是由C末端算來第一個的脯胺酸以甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、白胺酸或是異白胺酸等所取代。
作為上述(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基具體而言,可列舉例如:序列編號13或是序列編號14所示之胺基酸序列所構成之肽殘基等。如後述之實施例所示,以序列編號4所示之胺基酸序列中,由「R-P-T-T-W-H」(序列編號12)所構成之胺基酸殘基必須對消化系統的癌細胞或是癌組織有高度的累積性。因此,X11為由序列編號13或是序列編號14所示之胺基酸序列所構成之肽殘基,藉此可發揮對消化系統的癌細胞或是癌組織之高度的累積性。
RPTTWHKP(序列編號13)
RRPTTWH(序列編號14)
此外,由上述(a)或是上述(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基,亦可為L-胺基酸、D-胺基酸、或是這些組合所構成。其中,X11較佳為L-胺基酸所構成之肽殘基。
L-胺基酸係存在於天然之胺基酸,D-胺基酸係L-胺基酸殘基的對掌性相反者。此外,為了提高對消化系統的癌細胞或是癌組織之高度的累積性或是為了優化其它物性,構成由上述(a)或是上述(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基之胺基酸殘基亦可受到甲基化等化學性修飾。
〔X12〕
通式(I)中,X12係由上述(a)或是上述(b)的胺基酸序列所構成之肽殘基、或是該等的逆反型肽殘基。
本說明書中所謂「逆反型肽殘基」,係指胺基酸序列逆轉、且由鏡像異構物胺基酸殘基所取代之肽殘基。
其中,由更提高對消化系統的癌細胞或是癌組織之高度的累積性之觀點來看,X12較佳係由與X11相同的胺基酸序列所構成之肽殘基。或是由發揮在生物體內之更優異之抗分解性的觀點來看,X12較佳為X11的逆反型肽殘基。
〔Y11〕
通式(I)中,Y11係胺基酸數1以上至10以下的胺基酸殘基所構成之肽連接體。構成Y11之前述胺基酸殘基係各自獨立,為甘胺酸殘基、脯胺酸殘基、絲胺酸殘基、半胱胺酸殘基或是離胺酸殘基。Y11中胺基酸數係1以上至5以下,較佳為1以上至3以下,更佳為1。
其中,Y11係由胺基酸數1以上至10以下的胺基酸殘基所構成之肽連接體,前述胺基酸殘基係各自獨立,較佳為甘胺酸殘基、半胱胺酸殘基或是離胺酸殘基;係由胺基酸數1的胺基酸殘基所構成之肽連接體,前述胺基酸
殘基更佳為甘胺酸殘基、半胱胺酸殘基或是離胺酸殘基。構成Y11之前述胺基酸殘基為半胱胺酸殘基或是離胺酸殘基的情況下,可隔介半胱胺酸殘基的硫醇基(-SH)或是離胺酸殘基的側鏈,將後述之目標物質藉由共價鍵使其結合於本實施形態的肽。
〔n11〕
通式(I)中,n11為1以上至9以下的整數,較佳為1以上至8以下的整數,更佳為1以上至6以下的整數,又更佳為1以上至4以下的整數,尤佳為1以上3至以下的整數,最佳為1以上至2以下的整數。
本實施形態的肽中,作為較佳胺基酸序列(I)具體而言,可列舉例如以下的表1所示之胺基酸序列等。另外,這些胺基酸序列僅為較佳胺基酸序列(I)之一例,較佳胺基酸序列(I)並不限定於這些。另外,表1中的序列編號18、序列編號19、序列編號25、序列編號26、序列編號27以及序列編號28所示之胺基酸序列中,所謂N末端算來第二個的「mR」係指甲基化精胺酸殘基。
本實施形態的肽,係可合適地用作為傳遞劑,係將內在性地包含於該肽中或是與肽結合之目標物質在體內穩定地(約12小時左右保持體內抗分解性之狀態)、簡便且有效率地且持續的傳遞至消化系統的癌細胞或是癌組織。
<肽的製造方法>
本實施形態的肽係可由化學合成法來製造,或是由生物學的方法來製造。作為化學合成法而言,可列舉例如:肽固相合成法(Boc固相合成法、Fmoc固相合成法等)等。作為生物學的方法而言,可列舉例如:使用了具有編碼上述肽之核酸之表現載體所致之無細胞肽合成系統或活細胞肽合成系統之方法等。關於無細胞肽合成系統以及活細胞肽合成系統之詳細如後所述。
<核酸>
本實施形態的核酸係編碼上述實施形態之肽之核酸。
藉由本實施形態的核酸,可獲得對消化系統的癌細胞或是癌組織具有高度的累積性、以及在生物體內之優異之抗分解性之肽。
作為編碼上述的肽之核酸而言,可列舉例如:由序列編號32至34中任一者所示之鹼基序列所構成之核酸;或是含有與序列編號32至34中任一者所示之鹼基序列具有80%以上、例如85%以上、例如90%以上、例如95%以上的相同性,且成為編碼對消化系統的癌細胞或是癌組織具有高度的累積性、以及在生物體內之優異之抗分解性之肽的構成成分之各胺基酸的組合的任何鹼基序列之核酸等。另外,序列編號32所示之鹼基序列,係編碼由上述的序列編號15所示之胺基酸序列所構成之肽之核酸的鹼基序列。序列編號33所示之鹼基序列,係編碼上述的序列編號16所示之胺
基酸序列所構成之肽之核酸的鹼基序列。序列編號34所示之鹼基序列係編碼上述的序列編號17所示之胺基酸序列所構成之肽之核酸的鹼基序列。
此處,對於基準鹼基序列,可以例如以如下的方式來求出對照鹼基序列的序列相同性。首先,排列基準鹼基序列以及對象鹼基序列。此處,各鹼基序列中,可以使序列相同性成為最大的方式而含有間隔(gap)。然後,基準鹼基序列以及對象鹼基序列中,可算出一致之鹼基的鹼基數,根據下述式,求出序列相同性。
「序列相同性(%)」=〔一致之鹼基數〕/〔對象鹼基序列的總鹼基數〕×100
本實施形態的核酸,亦可為包含於載體內之形式。
作為載體而言,較佳為蛋白質表現載體。作為表現載體而言並沒有特別限定,可使用例如:源自大腸桿菌的質體、源自枯草桿菌的質體、源自酵母的質體、噬菌體、病毒載體以及改變了這些之載體等。作為源自大腸桿菌的質體而言,可列舉例如:pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等。作為源自枯草桿菌的質體而言,可列舉例如:pUB110、pTP5、pC194等。作為源自酵母的質體而言,可列舉例如:pSH19、pSH15等。作為噬菌體而言,可列舉例如:λ噬菌體等。作為成為病毒載體的來源之病毒而言,可列舉例如:腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒、肝炎病毒等。
上述表現載體中,作為上述肽表現用啟動子而言並沒有特別限定,亦可為以動物細胞作為宿主之表現用的啟動子,亦可為以植物細胞作為宿主之表現用的啟動子,亦可為以昆蟲細胞作為宿主之表現用的啟動子。作為以動物細胞作為宿主之表現用的啟動子而言,可列舉例如:EF1α啟動子、SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV(巨細胞病毒)啟動
子、HSV-tk啟動子、CAG啟動子等。作為以植物細胞作為宿主之表現用的啟動子而言,可列舉例如:花椰菜嵌紋病毒(CaMV)的35S啟動子、REF(rubber elongation factor)啟動子等。作為以昆蟲細胞作為宿主之表現用的啟動子而言,可列舉例如:多角體蛋白啟動子、p10啟動子等。這些啟動子係根據表現上述肽之宿主的種類,可適當地選擇。
上述表現載體亦可進而具有多重選殖位、增強子、剪接信號、poly A加尾信號、選擇標記、複製起點等。
上述表現載體中,較佳係在編碼上述肽之核酸的上游或是下游附加編碼綠色螢光蛋白(GFP;green fluorescent protein)或谷胱甘肽S-轉移酶(GST;Glutathione S-transferase)等填充蛋白質(該蛋白質本身毒性低,且不發揮固有的機能)之核酸或個別的目標基因。藉此,可更有效率地生成上述肽融合了填充蛋白質之形式的融合蛋白質。此外,當摻入了具有對細胞外之蛋白質分泌型訊號的表現載體的情況下,在培養液中生成加成了上述肽的胺基酸序列之形式的融合蛋白並回收。此外,即使在細胞內表現型載體的情況下,亦可生成同樣的肽加成融合蛋白質。
藉由使用具有本實施形態之核酸之表現載體與合適的宿主細胞,可使得上述肽表現。
<修飾物質>
本實施形態的肽係可與後述之目標物質分別以不同的修飾物質所修飾之形態。作為修飾物質而言,可列舉例如:糖鏈、聚乙二醇(PEG;polyethylene glycol)等。此外,作為修飾物質而言,可使用例如:脂質體、病毒、樹狀體(dendrimer)、抗體(免疫球蛋白)、外泌體(exosome)、聚合微胞(polymeric micelles)等。亦即本實施形態的肽係可以如下的形式使用:結合了脂質體、病毒、外泌體、聚合微胞的表現之形式;在樹狀體的側
鏈部分結合了1個或是2個以上的複數個的上述肽之形式;或是抗體(免疫球蛋白)與上述肽結合之形式。
作為樹狀體而言,可列舉例如:聚(醯胺基胺)(PAMAM;polyamidoamine)樹狀體、聚丙烯亞胺樹狀體、聚離胺酸樹狀體、聚苯醚樹狀體、聚亞苯基樹狀體等。藉由使用這些樹狀體,可將數十價至數百價的上述多肽一次傳遞至消化系統的癌細胞或是癌組織內。
此外,本實施形態的肽係以上述修飾物質修飾,藉此在消化系統的癌細胞或是癌組織內可簡便且有效率地吸收目標物質(例如生理活性物質或標記物質)。經修飾物質修飾之上述肽(以下有時簡稱為「修飾肽」),可使修飾物質與上述肽藉由例如直接或是隔介連接體以物理或是化學性結合並調製。作為具體的結合方法而言,可列舉例如:配位鍵、共價鍵、氫鍵、疏水相互作用、物理吸附等,可採用任一公知的結合、連接體以及結合方法。此外,修飾物質的結合位置可為上述肽的N末端或是C末端任一者。此外,上述肽含有離胺酸殘基的情況下,亦可在該離胺酸殘基的側鏈部位結合修飾物質。
<目標物質>
作為對象的目標物質而言,可根據用途而適當地選擇,例如在為了消化系統的癌細胞或是癌組織的成像而使用的情況中,如後所述,可將標記物質作為目標物質使用。此外,例如在消化系統的疾患(例如癌)的治療用途使用的情況中,如後所述,可將生理活性物質(尤其抗癌劑)作為目標物質使用。本實施形態的肽係可將這些目標物質以1種單獨傳遞,亦可組合2種以上傳遞。
目標物質係可直接或是隔介連接體以物理或是化學性結合上述肽。作為具體的結合方法而言,可列舉例如:配位鍵、共價鍵、氫鍵、疏水相互作
用、物理吸附等,可採用任一公知的結合、連接體以及結合方法。此外,目標物質與本實施形態的肽之結合位置,可根據需要而適當地選擇。進而,即使沒有物理或是化學性的結合的情況,若因立體結構使一方限制另一方的移動而可共同移動的狀態亦包含在本實施形態中已結合之狀態。
此外,目標物質為蛋白質的情況下,含有目標物質與上述肽之融合蛋白質係可藉由例如以下的方法製作。首先,使用含有編碼融合蛋白質之核酸之表現載體,來轉化(transformation)宿主。然後,培養該宿主並表現融合蛋白質。培養基的組成、培養的溫度、時間、誘導物質的添加等條件,係以轉化體生長且有效率地產生融合蛋白質的方式,所屬技術領域中具有通常知識者可根據公知的方法來決定。此外,例如,作為選擇標記而將抗生素抵抗性基因摻入表現載體的情況,藉由在培養基加入抗生素,可選擇轉化體。然後,將宿主所表現之融合蛋白質藉由適當的方法精製,藉此獲得融合蛋白質。
作為宿主而言,只要是可表現含有編碼融合蛋白質之核酸的表現載體之活細胞,並沒有特別限制,可列舉例如:中國倉鼠卵巢(CHO;Chinese hamster ovary)細胞等哺乳類細胞株或病毒(例如腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒、肝炎病毒等病毒等)、細菌(例如,大腸桿菌等)等微生物、酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞等活細胞。
然後,關於含有本實施形態的肽之肽-藥物-共軛物(PDC)、醫藥組成物、標記肽以及成像組成物,以下進行詳細的說明。
<肽-藥物-共軛物(PDC)>
本實施形態的PDC係含有上述肽以及生理活性物質。
藉由本實施形態的PDC,可選擇性地治療消化系統的癌(尤其浸潤性胰腺導管癌)。
本說明書中作為「生理活性物質」而言,只要是對人類癌症的治療有效者,則並沒有特別的限定,可列舉例如:抗癌劑等藥劑、核酸、具有細胞增殖抑制或是細胞殺傷效果之蛋白質、可特異性結合至癌細胞(尤其胰臟癌細胞)的抗體或是該抗體片段(尤其以存在於胰臟癌細胞的細胞膜上之抗原作為標的之抗體或是該抗體片段等)、適體(aptamer)等。
例如,使上述抗體或是該抗體片段隔介連接體等中介物質或是胺基酸序列作為間隔區(spacer)而結合至上述肽的N末端或是C末端,或是使上述肽結合至上述抗體或是該抗體片段的Fc區域之任一部位或是複數的部位,藉此形成抗體-肽複合體。該抗體-肽複合體,除了結合至辨識抗體之細胞膜表面抗原以外,亦可同時結合至辨識上述肽之細胞膜表面受體,因此可增強作為至目標之細胞(本實施形態中為胰臟癌細胞)的傳遞機能。此外,上述抗體或是該抗體片段若為可對細胞內抗原反應的短鏈抗體(ScFv;single-chain antibody)的情況下,藉由在編碼ScFv之核酸上加成編碼上述肽之序列而作成表現載體,藉此可作成具有至作為目標之細胞(本實施形態中為胰臟癌細胞)之傳遞機能的短鏈抗體。
作為「生理活性物質」而言,較佳為抗癌劑之細胞毒性藥或是分子標靶藥物。上述肽相較於正常細胞或是正常組織,由於對消化系統的癌細胞或是癌組織(尤其胰臟癌細胞或是胰臟癌組織)可高度地轉移且被吸收,故作為生理活性物質而言,使用作為以往的抗癌劑所使用的細胞毒性藥作成PDC的情況下,可有效率地傳遞上述細胞毒性藥至癌細胞或是組織。
生理活性物質與上述肽係較佳為形成共軛物並結合。此處所謂「共軛物」,係表示2種以上的物質可同時移動的狀態,且包含該物質間藉由共價鍵結合、藉由離子鍵而靜電結合、或是即使不存在上述結合的情況下因立體結構使一方限制另一方而可共同移動的狀態。例如上述肽經表面經修飾而成之脂質體、病毒、外泌體、聚合微胞等中封入生理活性物質者也包括在形成有「共軛物」。其中,生理活性物質與上述肽之結合,為了抑制在到達該作用部位之前生理活性物質即解離,較佳為由共價鍵所構成。
作為生理活性物質與上述肽之共價鍵的形成方法,具體而言,可列舉例如:在具有或是導入-OH、-SH、-CO2H、-NH2、-SO3H或是-PO2H等官能基之上述肽的任意的部位,藉由與生理活性物質直接或是隔介連接體而進行耦合反應之方法等。更具體而言,例如,肽導入SH基(硫醇基)、生理活性物質導入馬來醯亞胺基(maleimide group)之後,使肽的SH基與生理活性物質的馬來醯亞胺基結合,藉此可使肽與生理活性物質結合。
作為連接體而言,只要可保持生理活性物質與上述肽之機能,可與上述肽一起穿透細胞膜則沒有特別限制。作為連接體而言,具體而言,可列舉例如:長度通常為1殘基以上至5殘基以下、較佳為1殘基以上至3殘基以下左右的肽鏈;或同等長度的聚乙二醇(PEG)鏈等。
作為構成用於上述肽與生理活性物質之共軛物之肽連接體的胺基酸殘基而言,較佳為不帶電荷且為小分子,例如較佳為甘胺酸殘基。此外,在連接體序列的端部、較佳為在兩端部設置用以對結合之兩區域(生理活性物質與上述肽)賦予旋轉自由度的序列。具體而言,為了賦予旋轉的自由度故較佳為含有甘胺酸(G)、作為連接體之脯胺酸(P)之序列,進而
具體而言,由甘胺酸殘基與脯胺酸殘基所構成,例如由甘胺酸(G)-脯胺酸(P)-甘胺酸(G)所構成者尤佳。藉由作成上述構成,可發揮兩區域的機能。或是,由於易於形成共價鍵,故連接體序列的端部較佳為含有半胱胺酸(C)或是離胺酸(K)之序列。可隔介半胱胺酸殘基的硫醇基(-SH)或是離胺酸殘基的側鏈,將生理活性物質結合至上述肽。
生理活性物質為蛋白質的情況下,該生理活性物質與上述肽作成共軛物的情況下,亦可作為融合蛋白質而製作。作為賦予上述肽的位置而言,部位並沒有特別限制,較佳係上述肽呈現在蛋白質的外側,且對融合後蛋白質的活性、機能的影響低,較佳為融合至生理活性物質之蛋白質的N末端或是C末端。作為融合之蛋白質的種類而言並沒有特別限定,但由於為了通過細胞膜若分子量過大的藥物會變成阻礙,分子量例如可設為500,000以下左右,可設為30,000以下左右。
作為生理活性物質所使用之蛋白質,亦可為抗體。上述抗體,例如可在小鼠等囓齒類動物以源自消化系統的癌的肽等作為抗原進行免疫而製作。此外,例如可由噬菌體庫的篩選來製作。抗體亦可為抗體片段,作為抗體片段而言,可列舉如Fv、Fab、scFv等。
作為用作生理活性物質之核酸而言,可列舉例如:siRNA、miRNA、antisense、或是代償該等機能之人工核酸等。
所謂用作生理活性物質之適體,係對消化系統的癌細胞或是癌組織具有特異性結合能力之物質。作為適體而言,可列舉如核酸適體、肽適體等。對消化系統的癌細胞或是癌組織具有特異性結合能力之核酸適體,可藉由例如systematic evolution of ligand by exponential enrichment(SELEX;配體指數增強系統進化技術)法等來選別。此外,對
消化系統的癌細胞或是癌組織具有特異性結合能力之肽適體,可藉由例如使用了酵母之Two-hybrid(雙雜合)法等來選別。
此外,本實施形態的PDC中,上述肽可以如上述的方式以修飾物質來修飾,亦可以進而具備標記物質。
<醫藥組成物>
本實施形態的醫藥組成物係含有上述PDC。
本實施形態的醫藥組成物係可以用於消化系統的癌的治療、或是伴隨消化系統的癌之疾患的治療。作為伴隨消化系統的癌之疾患而言,可列舉例如:以消化系統的癌作為原發灶之轉移性癌(淋巴節轉移、腹膜轉移(播種))等。
<組成成分>
本實施形態的醫藥組成物,係含有治療上有效量的上述PDC、以及藥學上所容許之載體或是稀釋劑。藥學上所容許之載體或是稀釋劑,可列舉如:賦形劑、增量劑、崩散劑、穩定劑、防腐劑、緩衝劑、乳化劑、芳香劑、著色劑、甜味料、增稠劑、矯味劑、輔助媒劑等。藉由使用1種以上的這些載體或是稀釋劑,可調製注射劑、液劑、膠囊劑、懸浮劑、乳劑、或是糖漿劑等形態的醫藥組成物。
此外,亦可使用膠體分散系作為載體。膠體分散系被期望提高上述肽或是PDC的生物體內穩定性之效果、或是提高上述肽或是PDC對消化系統的癌細胞或是癌組織之移行性之效果。作為膠體分散系而言,可列舉如:聚乙二醇、高分子複合體、高分子凝聚物、奈米膠囊、微球、珠、水中油系的乳化劑、微胞、混合微胞、含有脂質體之脂質,較佳為脂質體或人工膜的小胞,具有有效率地輸送上述肽或是PDC至消化系統的癌細胞或是癌組織之效果。
作為本實施形態的醫藥組成物中製劑化之例而言,可列舉如根據需要而作為施加糖衣之錠劑、膠囊劑、酏劑(elixir)、微膠囊劑以口服使用。
或是可列舉如與水或是其它以外的藥學上所容許之液而成之無菌性溶液、或是以懸浮液劑的注射劑的形式以非口服的方式使用。
進而,可列舉如藥學上所容許之載體或是稀釋劑,具體而言,可列舉:媒液(例如滅菌水或生理食鹽水、植物油)、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、穩定劑、香味劑、賦形劑、防腐劑、結合劑等適當組合,以一般被認可之製藥要求實施之單位用量形態來混合而製劑化。
作為可混合至錠劑或是膠囊劑之載體或是稀釋劑而言,係使用例如:結合劑、賦形劑、膨鬆劑、潤滑劑、甜味劑、香味劑等。作為結合劑而言:可列舉例如:明膠、玉米澱粉、龍膠(tragacanth)、阿拉伯膠等。作為賦形劑而言,可列舉例如結晶性纖維素等。作為膨鬆劑而言,可列舉例如:玉米澱粉、明膠、海藻酸等。作為潤滑劑而言,可列舉例如硬脂酸鎂等。作為甜味劑而言,可列舉例如:蔗糖、乳糖、糖精等。作為香味劑而言,可列舉例如:胡椒薄荷精油、紅珠(Gaultheria adenothrix)油、櫻桃香料等。若調劑單位形態為膠囊的情況下,上述材料可進而含有如油脂般的液狀載體。
用於注射之無菌組成物係使用如注射用蒸餾水般的媒液並根據通常的製劑實施方式進行處方。
作為注射用的水溶液媒液而言,可列舉例如:含有生理食鹽水、葡萄糖或其它佐劑之等張液等,亦可與合適的輔助媒劑、非離子性界面活性劑等併用。作為其它佐劑而言,可列舉例如:D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉等。作為輔助媒劑而言,可列舉例如:醇等。作為醇而言
,可列舉例如:乙醇、多元醇等。作為多元醇而言,可列舉例如:丙二醇、聚乙二醇等。作為非離子性界面活性劑而言,可列舉例如:Polysorbate 80(註冊商標)、HCO-50等。
作為注射用的非水溶液的媒液而言係可列舉如芝麻油、大豆油等,亦可併用苯甲酸芐酯、芐醇作為輔助媒劑。此外,注射用的油性液亦可進而調配緩衝劑、鎮痛劑、穩定劑、氧化防止劑等。作為緩衝劑而言,可列舉例如:磷酸鹽緩衝液、醋酸鈉緩衝液等。作為鎮痛劑而言,可列舉例如鹽酸普魯卡因等。作為穩定劑而言,可列舉例如:芐醇、苯酚等。調製之注射液通常係填充於合適的安瓿。
注射劑的情況下,亦可作為如上述之水性或是非水性的溶液劑、懸浮劑、或是乳濁劑來調製。這種的注射劑的無菌化係可藉由過濾器來過濾滅菌、調配殺菌劑等來進行。注射劑係可作為使用時調製的形態來製造。亦即藉由凍結乾燥法等成為無菌的固體組成物,在使用前溶解於注射用蒸餾水或是其它媒液來使用。
<投予量>
本實施形態的醫藥組成物,係考慮到PDC所含有之生理活性物質的種類、受測動物(包括人或是人以外之動物之各種哺乳動物、較佳為人)的年齡、性別、體重、症狀、治療方法、投予方法、處理時間等而適當調節。
例如,將本實施形態的醫藥組成物藉由注射劑注射至靜脈內(Intravenous:i.v.)的情況下,可對於受測動物(較佳為人),每1次的投予中為每1kg體重投予例如0.1mg以上至1000mg以下左右的量的PDC。
作為投予形態而言,可列舉例如:動脈內注射、靜脈內注射、皮下注射、鼻腔內的、腹腔內的、經支氣管的、肌肉內的、皮下的、
或是口服的方法等所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法,較佳為靜脈內注射或是腹腔內的投予。
<治療方法>
一實施形態中,本發明係提供一種用於消化系統的癌(尤其胰臟癌)的治療或是預防而含有上述PDC之醫藥組成物。
此外,一實施形態中,本發明係提供一種含有治療上有效量的上述PDC、以及藥學上所容許之載體或是稀釋劑之醫藥組成物。
此外,一實施形態中,本發明係提供一種為了製造用於消化系統的癌(尤其胰臟癌)的治療或是預防之醫藥組成物之上述PDC的使用。
此外,一實施形態中,本發明提供一種消化系統的癌(尤其胰臟癌)的治療方法或是預防方法,係包含對患者投予治療上必要之上述PDC的有效量。
<標記肽>
本實施形態的標記肽係含有上述肽以及標記物質。
<標記物質>
作為標記物質而言,可列舉例如:穩定同位素、放射性同位素、螢光物質、正電子發射斷層攝影(Positron Emission Tomography:PET)用核素、單一光子放射斷層攝影(Single photon emission computed tomography:SPECT)用核素、核磁共振成像法(Magnetic resonance imaging:MRI)造影劑、電腦斷層攝影法(Computed Tomography:CT)造影劑、磁性體等。此外,標記物質為蛋白質的情況下,亦可以標記物質與上述肽之融合蛋白質的形態來使用。其中,較佳為穩定同位素、放射性同位素或是螢光
物質。藉由具備上述標記物質,可簡便且高靈敏度地確認標記肽是否傳遞至消化系統的癌細胞或是癌組織。
作為穩定同位素而言,可列舉例如:13C(碳13)、15N(氮15)、2H(氫2)、17O(氧17)、18O(氧18)等。作為放射性同位素而言,可列舉例如:3H(氫3)、14C(碳14)、13N(氮13)、18F(氟18)、32P(磷32)、33P(磷33)、35S(硫35)、67Cu(銅67)、99mTc(鎝99m)、123I(碘123)、131I(碘131)、133Xe(氙133)、201Tl(鉈201)、67Ga(鎵67)等。
標記物質為穩定同位素或是放射性同位素的情況下,亦可使用穩定同位素標記胺基酸或是放射性同位素標記胺基酸來製作上述標記肽。亦即本實施形態的標記肽中,「含有上述肽以及標記物質」的表示方式,係包含由穩定同位素標記胺基酸或是放射性同位素標記胺基酸所構成之上述肽的形態。
作為以穩定同位素或是放射性同位素所標記之胺基酸而言,係20種類的胺基酸(丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、纈胺酸、色胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺、麩醯胺),只要是上述肽所含有之胺基酸即可,沒有特別限定。此外,胺基酸亦可為L型,亦可為D型,可根據需要而適當地選擇。
作為使用穩定同位素標記胺基酸或是放射性同位素標記胺基酸之本實施形態的標記肽的製作方法而言,可藉由將含有編碼上述肽之核酸之載體表現在存在穩定同位素標記胺基酸或是放射性同位素標記胺基酸的系統中來調製。作為存在穩定同位素標記胺基酸或是放射性同位素標記胺基酸的系統而言,可列舉例如:存在穩定同位素標記胺基酸或是放射性同位素標記胺基酸之無細胞肽合成系統或活細胞肽合成系統等。亦即無
細胞肽合成系統中,除了包括穩定同位素標記胺基酸或是放射性同位素標記胺基酸以外,將穩定同位素非標記胺基酸或是放射性同位素非標記胺基酸作為材料來合成肽;或是在活細胞肽合成系統中,在穩定同位素標記胺基酸或是放射性同位素標記胺基酸存在下,培養出以含有編碼上述肽之核酸之載體經轉化而成之細胞,藉此可由含有編碼上述肽之核酸之載體調製出經穩定同位素標記或是放射性同位素標記之上述肽。
使用了無細胞肽合成系統之穩定同位素標記或是放射性同位素標記之上述肽的表現,除了包括含有編碼上述肽之核酸之載體或上述的穩定同位素標記胺基酸或是放射性同位素標記胺基酸以外,可使用在經穩定同位素標記或是放射性同位素標記之上述肽的合成上所必需的穩定同位素非標記胺基酸或是放射性同位素非標記胺基酸、無細胞肽合成用細胞萃取液、能量來源(ATP、GTP、肌胺酸磷酸鹽等高能量磷酸鍵含有物)等來進行。溫度、時間等反應條件,可選擇適當最適的條件來進行,例如溫度可設為20℃以上至40℃以下,較佳為23℃以上至37℃以下。此外反應時間可設為1小時以上至24小時以下,較佳為10小時以上至20小時以下。
本說明書中,所謂「無細胞肽合成用細胞萃取液」,係指來自核糖體、tRNA等參與蛋白質合成之轉譯系統、或是來自含有轉錄系統以及轉譯系統所必需的成分之植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞的萃取液。具體而言,可列舉如:大腸桿菌、小麥胚芽、兔網狀紅血球、小鼠L-細胞、艾氏腹水癌細胞、HeLa細胞、CHO細胞、出芽酵母等細胞萃取液。上述細胞萃取液的調製,可根據例如Pratt,J.M.等人之Transcription and trasnlation-a practical approach(1984),pp.179-209所記載之方法,將上述的細胞使用高壓均質機(French press)、玻璃珠、超音波破碎裝置
等來破碎處理,可加入含有用以將蛋白質成分或核糖體可溶化之數種類的鹽之緩衝液並均質化,以離心分離使不溶成分沉澱來進行。
此外,使用了無細胞肽合成系統之穩定同位素標記或是放射性同位素標記之上述的肽的表現,亦可適當使用例如:具備小麥胚芽萃取液之Premium Expression Kit(CellFree Sciences Co.,Ltd.製)、具備大腸桿菌萃取液之RTS 100,E.coli HY Kit(Roche Applied Science公司製)、無細胞kun Quick(大陽日酸公司製)等市售的套組來進行。表現出之經穩定同位素標記或是放射性同位素標記之上述肽若為不溶性的情況下,亦可使用鹽酸胍鹽、尿素等蛋白質變性劑來適當地可溶化。經穩定同位素標記或是放射性同位素標記之上述肽,進而可藉由分級離心法、蔗糖密度梯度離心法等之分級處理、或使用了親和性管柱、離子交換層析等之精製處理來調製。
使用了活細胞肽合成系統之經穩定同位素標記或是放射性同位素標記之上述肽的表現,可藉由在活細胞導入含有編碼上述肽之核酸之載體,在含有包括營養成分或抗生素等、以及上述穩定同位素標記胺基酸或是放射性同位素標記胺基酸、在穩定同位素標記肽或是放射性同位素標記肽之合成上必要的穩定同位素非標記胺基酸或是放射性同位素非標記胺基酸等的培養液中來培養相關活細胞而進行。在此作為活細胞而言,只要是可使含有編碼上述肽之核酸之載體表現之活細胞即可,並沒有特別限定,可列舉例如:中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等哺乳類細胞株、大腸桿菌、酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞等活細胞,若由簡便性或成本效益的方面來考慮,較佳為大腸桿菌。含有編碼上述肽之核酸之載體的表現,可藉由基因重組技術,摻入至以可在各自的活細胞中表現的方式所設計之表現載體中,藉由將上述表現載體導入活細胞來進行。此外,將含有編碼上述肽
之核酸之載體導入活細胞,可以適用於所使用之活細胞的方法來進行,可列舉例如:電穿孔法、熱激法、磷酸鈣法、脂質體轉染法、DEAE葡聚醣法、顯微注射法、粒子槍法、使用了病毒之方法、或FuGENE(註冊商標)6Transfection Reagent(羅式公司製)、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen公司製)、Lipofectamine LTX Reagent(Invitrogen公司製)、Lipofectamine 3000 Reagent(Invitrogen公司製)等使用了市售的轉染試藥之方法等。
藉由活細胞肽合成系統所表現之經穩定同位素標記或是放射性同位素標記之上述肽,可將含有經穩定同位素標記或是放射性同位素標記之上述肽之活細胞藉由破碎處理或萃取處理來調製。作為破碎處理而言,可列舉例如使用了凍結融解法、高壓均質機、玻璃珠、均質器、超音波破碎裝置等之物理性破碎處理等。此外作為萃取處理而言,可列舉例如使用了鹽酸胍鹽、尿素等蛋白質變性劑之萃取處理等。經穩定同位素標記或是放射性同位素標記之上述肽,係可進而藉由分級離心法、蔗糖密度梯度離心法等之分級處理、或使用了親和性管柱、離子交換層析等之精製處理等來調製。
作為螢光物質而言,可列舉例如:公知的量子點、吲哚菁綠、5-氨基乙醯丙酸(5-ALA;代謝產物原卟啉IX(PP IX)、近紅外線螢光色素(Near-Infrared(NIR)dyes)(例如,Cy5.5、Cy7、AlexaFluoro等)、其它公知的螢光色素(例如,GFP、FITC(Fluorescein)、FAM、TAMRA等)等。經螢光物質標記之上述肽,若螢光物質為蛋白質的情況下,無需使用穩定同位素標記胺基酸或是放射性同位素標記胺基酸,只要藉由上述無細胞肽合成系統或是活細胞肽合成系統來調製出含有編碼螢光物質之核酸以及編碼上述肽之核酸之表現載體即可。
作為PET用核素、SPECT用核素而言較佳可列舉例如:11C、13N、15O、18F、66Ga、67Ga、68Ga、60Cu、61Cu、62Cu、67Cu、64Cu、48V、Tc-99m、241Am、55Co、57Co、153Gd、111In、133Ba、82Rb、139Ce、Te-123m、137Cs、86Y、90Y、185/187Re、186/188Re、125I、或是該等的錯合物、或是該等的組合等。以PET用核素或是SPECT用核素標記過之上述肽,可直接或是隔介連接體以物理性或是化學性結合上述肽與上述PET用核素或是SPECT用核素來調製。作為具體的結合方法而言,可列舉例如:配位鍵、共價鍵、氫鍵、疏水相互作用、物理吸附等,可採用任一公知的結合、連接體以及結合方法。
作為MRI造影劑、CT造影劑以及磁性體而言,可列舉例如:釓、Gd-DTPA、Gd-DTPA-BMA、Gd-HP-DO3A、碘、鐵、氧化鐵、鉻、錳、或是其錯合物或是其螯合物等。經MRI造影劑、CT造影劑或是磁性體標記之上述肽,只要直接或是隔介連接體以物理性或是化學性結合MRI造影劑、CT造影劑或是磁性體與上述肽來調製即可。作為具體的結合方法而言,可列舉例如:配位鍵、共價鍵、氫鍵、疏水相互作用、物理吸附等,可採用任一公知的結合、連接體以及結合方法。
<用以成像消化系統的癌之方法以及成像組成物>
本實施形態的方法,係用以成像消化系統的癌細胞或是癌組織之方法,為使用上述標記肽之方法。
此外,本實施形態的成像組成物係含有上述標記肽。
根據本實施形態的方法以及成像組成物,可簡便、高靈敏度且選擇性地檢測出消化系統的癌細胞或是癌組織。
<組成成分>
本實施形態的成像組成物,除了包括上述標記肽以外,根據需要,亦可含有藥學上所容許之載體或是稀釋劑。作為藥學上所容許之載體或是稀釋劑而言,可列舉如上述醫藥組成物中所例示當中之通常用於成像組成物之公知的成分。
例如,將上述標記肽添加至消化系統的癌細胞的情況中,上述標記肽的添加量較佳為培養液中1μM以上至10μM以下。此外,可對於添加後15分鐘以上至3小時以下後是否吸收以及累積至消化系統的癌細胞內進行評價。
此外,例如將具備螢光物質作為標記物質之上述標記肽藉由注射劑注射至靜脈內(Intravenous:i.v.)的情況下,對於受測動物(較佳為人),每1次的投予中為每1kg體重投予例如0.1mg以上至1000mg以下左右的量的標記肽,較佳為投予3mg以上的量的標記肽,更佳為投予3mg以上至20mg以下的量的標記肽,又更佳為投予5mg以上至15mg以下的量的標記肽。
此外,例如,將具備穩定同位素、PET用核素或是SPECT用核素作為標記物質之上述標記肽藉由注射劑注射至靜脈內(Intravenous:i.v.)的情況下,根據使用之穩定同位素、PET用核素或是SPECT用核素的種類之輻射劑量來決定投予量即可。
本實施形態的方法中,作為上述標記肽的檢測出方法而言,可列舉例如:PET、SPECT、CT、MRI、內視鏡之檢測、螢光檢測器之檢測等。
本實施形態的成像組成物係可用於消化系統的癌診斷、消化系統的癌治療效果診斷、病理分析、或是伴隨消化系統的癌之疾患的診斷、病理分析、治療效果診斷。
以下藉由實施例對本發明進行說明,但本發明並不限定於以下的實施例。
〔參考例1〕使用了PCPP11之人血漿所致之分解試驗
使用國際公開第2017/086090號所記載之肽,進行人血漿所致之分解試驗,分析該肽的詳細且經時的變性模式。
具體而言,將序列編號1所示之胺基酸序列所構成之肽(以下有時稱為「PCPP11」)添加至50質量%的濃度的人血漿,在分解試驗開始之後(0分鐘後)、5分鐘後、10分鐘後、20分鐘後、30分鐘後、60分鐘後以及120分鐘後經時地抽樣,藉由基質輔助雷射脫附游離法(MALDI-TOFMS;Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry)來分析試料。結果如圖1以及以下的表2所示。另外,表2中,所謂「UK」為Unknown的縮寫。此外,表2所示之肽的No.係對應圖1所示之圖形的峰值所記載之數值。
由圖1以及表2可知,PCPP11的持續時間(可穩定地存在的時間)係小於20分鐘。由此推測,PCPP11係投予在體內後,小於20分鐘內被完全地分解。
〔試驗例1〕使用了PCPP11的各種抗分解性型設計化肽之人血漿所致之分解試驗
然後,基於參考例1的結果,改變PCPP11的胺基酸序列,藉此嘗試維持對胰臟癌細胞或是胰臟癌組織之高度的累積性,且在生物體內之抗分解性優異之肽的開發。
具體而言,設計了如以下的表3所示之6種的肽。表3中,「FAM-L」係在肽N末端標記螢光物質FAM,且保護N末端之PCPP11。「LL」係以甘胺酸作為間隔區而將PCPP11的胺基酸序列重覆2次之肽。「LLL」係以甘胺酸作為間隔區且將PCPP11的胺基酸序列重覆3次之肽。「Ld」係在前半的胺基酸序列使用L-胺基酸,作為後半的胺基酸序列為使用了光學異構物之連結有逆反序列之L型-D型嵌合型肽。
此外,由參考例1中分解試驗的結果推測,N末端算來第一個以及第二個的2個的精胺酸間的肽鍵容易被分解。因此,「NmLL」係為了對N末端算來第一個以及第二個的2個的精胺酸間的肽鍵賦予抗分解性,而在上述LL肽中,將N末端算來第二個的精胺酸取代為甲基修飾型精胺酸之肽。此外,「NmLd」係為了對N末端算來第一個以及第二個的2個的精胺酸間的肽鍵賦予抗分解性,而在上述Ld肽中,將N末端算來第二個的精胺酸取代為甲基修飾型精胺酸之L型-D型嵌合型肽。
將上述各種肽添加至50質量%的濃度的人血漿,在分解試驗開始之後(0分鐘後)、5分鐘後、10分鐘後、20分鐘後、30分鐘後、60分鐘後以及120分鐘後經時地抽樣,藉由MALDI-TOFMS法來分析試料。結
果如圖2至圖6以及以下的表4至表6所示。此外,參考例1中使用了PCPP11之人血漿所致之分解試驗以及使用了上述各種肽之人血漿所致之分解試驗的彙總數據如圖7以及表7所示。另外,以FAM標記之肽的「序列編號」係表示肽部分的序列編號。此外,表4至表6所示之肽的No.係對應各自圖2至圖6的圖形的峰值所記載之數值。另外,各表中,關於數值分為上段以及下段之記載,上段係表示以MALDI-TOFMS法之分析中相對於全峰值面積之含有2種以上的肽之峰值面積的比率(%)。另一方面,下段係表示含有該2種以上的肽之峰值面積設為100%時之各肽的比率(%)。進而,例如,表4的No.9的肽中,左側的「70.0%」係表示含有No.9~11的肽之峰值面積設為100%時的No.9的肽的比率(%),右側的「65%」係表示藉由MALDI-TOFMS法分析中相對於全峰值面積之No.9的肽的比率(%)。以下的表中亦相同。
此外,表5中,No.13與No.13’、No.14與No.14’係各自以相同胺基酸序列所構成之肽,藉由MALDI-TOFMS法之分析中所屬之峰值不同。
由圖2以及表4可知,LL肽的試驗開始到120分鐘後之抗分解性為65%。另外,「抗分解性」係表示相對於試驗開始時肽的質量(100%),從試驗開始120分鐘後不被分解而保持之肽的質量的比率。
此外,由圖3可知,LLL肽在從試驗開始120分鐘以內未觀察到分解產物。
此外,由圖4以及表5可知,N末端從FAM標記之PCPP11的試驗開始120分鐘後之抗分解性為29%。
此外,由圖5以及表6可知,從Ld肽的試驗開始120分鐘後之抗分解性為32%。
此外,由圖6可知,NmLd肽從試驗開始120分鐘以內未觀察到分解產物。
進而,由圖7以及表7確認到,LL肽、Ld肽、NmLL肽、NmLd肽以及LLL肽相較於PCPP11單體以及FAM-PCPP11,具有優異之抗分解性。
尤其NmLL肽、NmLd肽以及LLL肽,在進行了試驗的120分鐘之間,抗分解性保持在100%的狀態,顯示出抗分解性特別優異。
〔試驗例2〕各肽的胰臟癌細胞以及其它癌細胞之累積性的確認試驗
如以下的表8所示進行各細胞中各肽的累積性的確認試驗。此外,作為肽而言,下述表9所示之中,在試驗例1中使用了FAM-PCPP11與N末端為FAM標記之LL肽(FAM-LL)以及N末端為FAM標記之Ld肽(FAM-Ld)。
表8所示之各細胞中,將FAM-PCPP11、FAM-LL以及FAM-Ld以在各自培養基中成為終濃度2μM的方式添加,將該等的細胞以37℃培養2小時,然後,為了除去培養基中的肽,以不含肽的培養基洗淨3次。然後,以倒立型螢光顯微鏡對各細胞中各肽的攝取進行視覺上評價。另外,在鏡檢之前除去添加了肽之培養上清液並以1×PBS(-)洗淨3次後,經胰蛋白酶處理並將貼壁細胞剝離且立即移入新的96孔板在新的培養液中再懸浮後,進行鏡檢。結果如圖8A所示。圖8A中,「L」係添加了FAM-PCPP11之細胞,「LL」係添加了FAM-LL之細胞,「Ld」係添加了FAM-Ld之細胞。此外,作為胰臟癌細胞之中代表的例子,顯示了BxPC3細胞之螢光影像。
由圖8A可知,任一肽皆在胰臟癌細胞以及胃癌細胞的消化系統的癌細胞中被檢測出強螢光,另一方面,其它癌細胞則幾乎未被檢測出螢光。其它癌細胞的其中,屬於人非小細胞肺癌系的腺癌細胞株之H2110細胞,係與BxPC3細胞、PK-8細胞以及MIA-Paca2細胞為相同的腺癌系細胞,但非胰原發而是肺原發,為原發部位不同的腺癌系統的細胞。H2110細胞中,幾乎未檢測出螢光,由於BxPC3細胞、PK-8細胞、MIA-Paca2細胞以及SCH細胞中被檢測出強螢光,故確認到任一肽皆對特定的腺癌具有高的選擇性吸收性,亦即對胰臟癌細胞以及胃癌細胞的消化系統的癌細胞具有高的選擇性吸收性。此外,胰臟癌細胞以及胃癌細胞的消化系統的癌細胞中,添加了FAM-LL以及FAM-Ld者比添加了FAM-PCPP11者檢測出更強的螢光。
此外,圖8B係將上述圖8A中各細胞所檢測出之螢光加以定量化,各自添加了FAM-PCPP11以及FAM-LL的肽之人非小細胞肺癌系統的源自腺癌的細胞株之H2110細胞所檢測出之螢光設為1.0時的各細胞所檢測出之螢光強度的比率之圖形。
由圖8B可知,添加了FAM-LL之胰臟癌細胞以及胃癌細胞,相較於添加了FAM-PCPP11之胰臟癌細胞以及胃癌細胞,螢光的定量值各自顯著地上升了2.9倍以上。
此外,表8所示之各細胞中,將FAM-PCPP11、FAM-LL以及FAM-NmLL以在各自培養基中成為終濃度2μM的方式添加,將該等的細胞以37℃培養2小時,然後,為了除去培養基中的肽,以不含肽的培養基洗淨3次。然後,以倒立型螢光顯微鏡對各細胞中各肽的攝取進行視覺上評價。另外,在鏡檢之前除去添加了肽之培養上清液並以1×PBS(-)洗淨3次後,經胰蛋白酶處理並將貼壁細胞剝離且立即移入新的96孔板在新的培養液中再懸浮後,進行鏡檢。結果如圖8C所示。圖8C中,「L」係添加了FAM-PCPP11之細胞,「LL」係添加了FAM-LL之細胞,「NmLL」係添加了FAM-NmLL之細胞。此外,作為胰臟癌細胞之中代表的例子,顯示了BxPC3細胞以及PK-8細胞之螢光影像。
由圖8C可知,任一肽皆在胰臟癌細胞中被檢測出強螢光,另一方面,其它癌細胞中則幾乎未被檢測出螢光。此外,胰臟癌細胞中,添加了FAM-LL以及FAM-NmLL者比添加了FAM-PCPP11者檢測出更強的螢光。
由此可知,本實施形態的肽相較於其它癌細胞,具有對胰臟癌細胞以及胃癌細胞的消化系統的癌細胞之高度地轉移之累積性。
〔試驗例3〕人胰臟癌細胞移植小鼠的各種組織中各肽的選擇性吸收性的評價試驗
1.螢光標記型肽的調製
如上述的表9所示,準備了試驗例1中所使用之FAM-PCPP11、N末端為FAM標記之LL肽、LLL肽以及Ld肽、以及C末端隔介伸乙基以FAM標記之NmLd肽。此外,以下的試驗以及圖等中,這些FAM標記之各肽有時簡稱為「PCPP11」、「LL」、「LLL」、「Ld」以及「NmLd」。
2.對人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型之各肽的投予
然後,對於人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型(Balb/c nu/nu小鼠、皮下以及腹腔內人胰臟癌細胞移植模型),靜脈注射上述「1.」所調製之各螢光標記型肽200μg。然後,從靜脈注射30分鐘後的肽的體內動態以投予小鼠新鮮解剖檢體來組織分析,藉由螢光訊號的檢測將吸收性定量化。投予了各螢光標記型肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的不同組織的表面以及切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)表示於圖9A,螢光標記型肽的不同種類的組織切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)表示於圖9B。圖9A中,「sc tumor」為subcutaneous tumor的縮寫,為皮下腫瘤。圖9B中,「abd tumor」為abdominal tumor的縮寫,為在腹腔內形成之腫瘤。「br」為腦、「hr」為心臟、「kd」為腎臟、「liv」為肝臟。「liv.meta」為liver metastatic tumor的縮寫,為轉移至肝臟之腫瘤。「panc」為胰臟、「sp」為脾臟。以下的圖中亦使用同樣的縮寫。此外,圖9A中所謂「untreated」係從未投予螢光標記型肽之小鼠所摘除之組織。將各組織中螢光訊號的檢測結果定量化之圖形示於圖10A(FAM-PCPP11)、圖10B(FAM-LL肽)、圖10C(FAM-LLL肽)以及圖10D(FAM-Ld肽)。此外
,比較投予了各螢光標記型肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的腫瘤中螢光強度之圖形示於圖11。
由圖11可知,對胰惡性腫瘤之吸收性,相對於以往的9胺基酸殘基所構成之PCPP11,FAM-LL肽增強為3倍、FAM-LLL肽增強為約6倍、FAM-Ld肽增強為約4倍。
另一方面,由圖10A至圖10D可知,以往的PCPP11具有對標的外正常臟器之非特異性吸收的抑制性能作為其優點,而此於FAM-LL肽、FAM-LLL肽以及FAM-Ld肽任一者皆充分地維持,尤其FAM-LL肽以及FAM-Ld肽係進而抑制以及改善了非特異性吸收。
此外,投予了NmLd肽-FAM或是FAM-Ld肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的不同組織的表面以及切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)示於圖12A。此外,比較投予了NmLd肽-FAM或是FAM-Ld肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的腫瘤中螢光強度之圖形示於圖12B。
由圖12B可知,對胰惡性腫瘤之吸收性,相對於Ld肽,NmLd肽為約1.4倍。另一方面,由圖12A可知,對標的外正常臟器之非特異性吸收的抑制性能即使在NmLd肽中,與Ld肽同樣地亦充分地維持。
此外,螢光物質的標記部位經常影響肽的性能,故進行了NmLd肽-FAM以及FAM-NmLd肽的比較投予試驗。投予了NmLd肽-FAM或是FAM-NmLd肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的不同組織的表面以及切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)如圖13A所示。此外,比較投予了NmLd肽-FAM或是FAM-NmLd肽之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的腫瘤中螢光強度之圖形示於圖13B。
由圖13A以及圖13B可確認到,FAM的標記位置的差異並不會對肽的性能帶來明顯的阻礙。該試驗結果可成為在決定抗癌劑對於肽之結合部位時的重要的情報。
〔參考例2〕螢光物質單獨的體內分布的分析試驗
然後,試驗例2中結果係可證明肽結合至螢光物質(FAM)的情況中,肽獨自的作用。為了確認該情形,對於將螢光素(Fluorescein:FLC)單獨投予至人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的情況進行分析。另外,FLC係在醫療上被認可人體投予之螢光物質,且具有與FAM幾乎同樣的結構以及特性。
具體而言、首先,對於人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型(Balb/c nu/nu小鼠、皮下以及腹腔內人胰臟癌細胞移植模型),靜脈注射螢光素27μg或是200μg。然後,從靜脈注射30分鐘後的FLC的體內動態以投予小鼠新鮮解剖檢體來組織分析,藉由螢光訊號的檢測將吸收性定量化。投予了螢光素27μg(上)或是200μg(下)之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各組織切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)示於圖14A。此外,投予了螢光素27μg(上)或是200μg(下)之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各組織中螢光訊號的檢測結果定量化之圖形示於圖14B。
由圖14A以及圖14B可知,在與試驗例2投予肽時以同樣的螢光分子莫耳比(螢光素27μg)進行投予的情況下,以及配合肽總量而投予FLC的情況(螢光素200μg)之任一情況中,正常肺顯示出與被標的腫瘤組織之吸收為幾乎相同程度(90%至120%)的高度吸收。相對於此,試驗例2的肽投予中,正常肺的吸收量為腫瘤的吸收量的約20%至30%。
此外,正常肝為被腫瘤之吸收量的約50%至60%。相對於此,試驗例2的肽投予中,正常肺的吸收量為腫瘤的吸收量的約2%至10%。
此外,正常腎中,超過被腫瘤之吸收量(180%至250%)、顯示出高度的非特異性全身性吸收。
由以上可知,證明了LL肽、Ld肽、NmLd肽等各肽的特異性的腫瘤選擇性吸收性能。
〔試驗例4〕作為抗癌劑傳遞用組成物的LL肽的腫瘤累積性能的實証試驗
然後,使用LL肽,製作肽-藥物-共軛物(PDC),進行對人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型之投予試驗。
圖15A係試驗例3中所使用之PDC的示意構成圖。隔介連接體將LL肽結合抗腫瘤劑之艾黴素,作成PDC。
作為具體的PDC的合成方法而言,如以下所示。
首先,在15mL離心管中加入艾黴素連接體〔化合物A〕(2mg、2.8μmol)、以及在N,N-二異丙基乙胺(3μL、19μmol)的二甲基亞碸溶液(2mL)對N末端加成「C-G-G-G」所構成之肽連接體而成之LL肽(化合物B、4mg、1.9μmol、序列編號42),並在室溫下振盪一夜。將反應混合物以二乙基醚(10mL)懸浮、離心分離後,捨棄上澄液。將沉澱物溶解於醋酸銨水溶液(10mM、pH7、1mL),藉由尺寸排阻色譜法〔(Sephadex LH-20、φ1.5cmx43cm、溶離液:醋酸銨水溶液(10mM、pH7)〕來分級。將各分級部分以質量分析裝置(ESI-MS)分析後,收集含有化合物C之分級部分,並凍結乾燥。將所獲得之凍結乾燥粉溶解於脫離子水,經再度凍結乾燥之後,獲得化合物C(亦即PDC)(2.3mg)。
ESI-MS m/z C151H217N47O41S〔3378.69〕計算值:〔M+4H〕4+845.7、〔M+5H〕5+676.8、觀測值:845.4、676.5。
然後,對於人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型(Balb/c nu/nu小鼠、皮下以及腹腔內人胰臟癌細胞移植模型),將PDC以肽用量成為200μg的方式靜脈注射。然後,從靜脈注射30分鐘後的PDC的體內動態以投予小鼠新鮮解剖檢體來組織分析,藉由螢光訊號的檢測將吸收性定量化。此外,作為對照,亦準備了單獨投予了沒有肽修飾之艾黴素的小鼠。另外,單獨投予艾黴素中,將艾黴素的投予量配合PDC中的艾黴素的莫耳量來投予。投予了單獨艾黴素或是PDC之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的整體影像(左)、以及、腫瘤表面的明視野影像(中央)以及螢光影像(右)示於圖15B。此外,投予了單獨艾黴素或是PDC之人胰臟癌增殖以及進展小鼠模型的各組織切片的明視野影像(左)以及螢光影像(右)示於圖15C。
由圖15B可知,單獨投予艾黴素群(對照群)以及PDC投予群中任一者中,對標的胰臟癌腫瘤組織之吸收性幾乎相同。另一方面,由圖15C可知,關於對其它正常臟器之非特異性吸收,肝、腦、心、肺、腎任一者中,相較於單獨投予艾黴素群(對照群),PDC投予群中顯示了抑制。
具體的其它正常臟器中螢光強度的定量分析(未圖示)時,PDC投予群中,相較於單獨投予艾黴素群(對照群),抑制肝吸收75%、抑制腦吸收32%、抑制肺吸收33%、抑制心吸收94%、抑制腎吸收60%。
由以上可知,可取得對於本實施形態的肽作為傳遞劑而摻入之PDC抗癌劑的有用性(創造提高對腫瘤之藥劑累積性,大幅減輕全身的副作用之藥劑)的概念驗證(Proof of Concept(POC))。
〔參考例3〕PCPP11以及其部分缺失肽的胰臟癌細胞以及其它癌細胞之累積性的確認試驗
進行了BxPC3細胞、PK-8細胞、AsPC1細胞以及MIA-Paca2細胞(皆為源自人浸潤性胰腺導管癌(pancreatic ductal adenocarcinoma;PDAC)的細胞株)、以及H2110細胞(肺腺癌細胞)中PCPP11以及其部分缺失肽的累積性的確認試驗。此外,作為肽而言,係使用了下述表10所示者。
使用與試驗例2同樣的方法,在各細胞中添加各肽,進行鏡檢。結果如圖16所示。圖16中,「full-length」係添加了FAM-PCPP11之細胞,「trunc-ver1」係添加了trunc-ver1-PCPP11之細胞,「trunc
-ver2」係添加了trunc-ver2-PCPP11之細胞,「trunc-ver3」係添加了trunc-ver3-PCPP11之細胞。此外,FAM-trunc-ver2-PCPP11中觀察到顯著的吸收螢光的減弱。進而,由於添加了FAM-trunc-ver4-PCPP11以及FAM-trunc-ver5-PCPP11之細胞中,幾乎觀察不到胰臟癌細胞中螢光,故省略圖。
由圖16可知,任一肽皆在源自PDAC的細胞株中被檢測出強螢光,另一方面,即使與源自PDAC的細胞株同為腺癌系但原發部位不同的H2110細胞(肺腺癌細胞)則幾乎未檢測出螢光。此外,胰臟癌細胞中,如以下所示之順序被檢測出強螢光。
full-length≧trunc-ver3>trunc-ver1>>trunc-ver2
由此可知,對胰臟癌細胞具有高度地轉移之累積性之PCPP11肽中,由「R-P-T-T-W-H」(序列編號12)所構成之胺基酸殘基為必需,由C末端的「K-P」所構成之胺基酸殘基則不一定為必需的。
〔試驗例5〕各種肽的胰臟癌細胞之累積性的確認試驗
進行了如以下的表11所示之各細胞中各肽的累積性的確認試驗。此外,作為肽而言,係使用了如下述表12所示者。
在表11所示之各細胞中,係將各肽以在各自培養基中成為終濃度2μM的方式添加,將該等的細胞以37℃培養2小時,然後,為了除去培養基中的肽,以不含肽的培養基洗淨3次。然後,以倒立型螢光顯微鏡對各細胞中各肽的攝取進行視覺上評價。另外,在鏡檢之前除去添加了肽之培養上清液並以1×PBS(-)洗淨3次後,經胰蛋白酶處理並將貼壁細胞剝離且立即移入新的96孔板在新的培養液中再懸浮後,進行鏡檢。結果如圖16所示。圖17中,「L」為添加了FAM-PCPP11之細胞,「d」為添加了FAM-d之細胞,「LL」為添加了FAM-LL之細胞,「LL2」為添加了FAM-LL2之細胞,「dd」為添加了FAM-dd之細胞。
由圖17可知,FAM-LL以及FAM-LL2相較於其它肽,任一胰臟癌細胞中皆被檢測出強螢光,FAM-LL尤其被檢測出強螢光。
〔試驗例6〕硬癌性胰臟癌模型小鼠的各種組織中FAM-LL的選擇性吸收性的評價試驗
對作為硬癌之胰臟癌模型小鼠投予FAM-LL,並確認小鼠的各種組織中FAM-LL的選擇性吸收性。作為形成豐富的癌間質之硬癌性癌的硬癌性胰臟癌模型小鼠,根據參考文獻1(Saito K et al.,“Stromal mesenchymal stem cells facilitate pancreatic cancer progression by regulating specific secretory molecules through mutual cellular interaction.”,Journal of Cancer,Vol.9,No.16,p2916-2929,2018.)所記載之方法來製作。具體而言,將6週齡的NOD/SCID小鼠(CLEA Japan Inc,Japan)在無病原體條件下來飼育。將BxPC3細胞(2×105cells)、以及BxPC3細胞(1×105cells)與人間葉系幹
細胞(hMSC)(1×105cells)之混合細胞各自注射至小鼠的皮下。從細胞注射後飼育6週,藉此獲得具有僅由人胰臟癌細胞所構成之腫瘤、模仿人胰臟癌患者組織而發展出豐富癌間質的腫瘤之硬癌性胰臟癌模型小鼠。
對所獲得之硬癌性胰臟癌模型小鼠從尾靜脈注射FAM-LL(200μg)。然後,從投予30分鐘後的肽的體內動態以肽投予小鼠新鮮解剖檢體組織來分析。結果如圖18A至圖18F所示。圖18A係硬癌性胰臟癌模型小鼠的腫瘤的明視野影像(左以及正中央)、以及螢光影像(右)。圖18B係從硬癌性胰臟癌模型小鼠所摘除之各組織以及腫瘤組織的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。圖18C係從硬癌性胰臟癌模型小鼠所摘除之各種腫瘤組織的明視野影像(左)以及暗視野影像(右)。上段係各種腫瘤組織的表面的成像,下段係各種腫瘤組織的切片的成像。圖18D係人PDAC細胞與hMSC所形成之腫瘤組織的蘇木精-伊紅(HE)染色影像(左)以及螢光影像(右)。圖18E係人PDAC細胞與hMSC所形成之腫瘤組織的HE染色影像。圖18F係人PDAC細胞與hMSC所形成之腫瘤組織的明視野影像(左)以及螢光影像(右)。
由圖18A至圖18C可知,FAM-LL觀察到對腫瘤組織(尤其由人胰臟癌細胞與hMSC所形成之腫瘤組織)之強吸收。此外,由圖18D至圖18F確認到,人PDAC細胞與hMSC所形成之腫瘤組織係形成了模仿人胰臟癌患者組織而發展出豐富的癌間質的腫瘤,該腫瘤由高密度地累積之核的癌細胞本身所構成之癌胞灶部分、以及包圍該癌胞灶且在周圍發展之纖維母細胞群的增殖帶所構成。進而,FAM-LL係在腫瘤組織內的癌胞灶部分觀察到強吸收。
〔試驗例7〕硬癌性胰臟癌模型小鼠的各種組織中FAM-NmLL的選擇性吸收性的評價試驗
對作為硬癌性癌之胰臟癌模型小鼠投予FAM-NmLL,確認了小鼠的各種組織中FAM-NmLL的選擇性吸收性。作為形成豐富的癌間質之硬癌性癌之硬癌性胰臟癌模型小鼠,係根據上述參考文獻1所記載之方法所製作。具體而言,在無病原體條件下飼育如下小鼠:6週齡的NOD/SCID小鼠(CLEA Japan Inc、Japan)、在K-Ras具有突變之Pdx1-Cre/KRASG12D(KC)小鼠、或是在胰臟癌特異性K-Ras以及p53具有突變之Pdx1-Cre/KRASG12D;p53R172H(KPC)小鼠。對如下之小鼠的皮下各自注射:BxPC3細胞(1×105cells)與hMSC(1×105cells)之混合細胞注射至NOD/SCID小鼠的皮下;MIA-Paca2細胞(1×105cells)與hMSC(1×105cells)之混合細胞、或是AsPC1細胞(1×105cells)與hMSC(1×105cells)之混合細胞注射至KPC小鼠的皮下;或是源自人PDAC的細胞株之Capan-2細胞(1×105cells)與hMSC(1×105cells)之混合細胞注射至KC小鼠的皮下。從細胞注射後飼育6週,藉此獲得具有模仿人胰臟癌患者組織之豐富的癌間質發達之腫瘤之硬癌性胰臟癌模型小鼠。
對所獲得之硬癌性胰臟癌模型小鼠從尾靜脈注射FAM-NmLL(200μg)。然後,從投予30分後的肽的體內動態以肽投予小鼠新鮮解剖檢體來組織分析。使用了BxPC3細胞以及hMSC的混合細胞之硬癌性胰臟癌模型小鼠的結果如圖19A至圖19F所示。圖19C中,「peritoneal diss.」為peritoneal disseminated tumor的縮寫,為腹膜播種性腫瘤。圖19F中,「mesenteric LN meta」為mesenteric lymph nodes metastatic tumor的縮寫,為轉移至腸系膜淋巴節之腫瘤。以下的圖中亦使用同樣的縮寫。使用了MIA-Paca2細胞以及hMSC的混合細胞之硬癌性胰臟癌模型小鼠中結果如圖20A至圖20C所示。使用了AsPC1細胞以及hMSC的混合細胞
之硬癌性胰臟癌模型小鼠中結果如圖21所示。使用了Capan-2細胞以及hMSC的混合細胞之硬癌性胰臟癌模型小鼠中結果如圖22A至圖22B所示。
由圖19A至圖22B可知,FAM-NmLL係在任一模型小鼠中皆在腫瘤組織(主病灶以及轉移灶)觀察到強吸收。此外,FAM-NmLL係在任一模型小鼠中皆觀察到在腫瘤組織內的癌胞灶部分的強吸收。
〔試驗例8〕各肽的胰臟癌細胞以及其它癌細胞之累積性的確認試驗
進行了如以下的表13所示之各細胞中各肽的累積性的確認試驗。此外,作為肽而言,係使用了如下述表14所示者。
在表13所示之各細胞中,係將各肽以在各自培養基中成為終濃度2μM的方式添加,將該等的細胞以37℃培養2小時,然後,為了除去培養基中的肽,以不含肽的培養基洗淨3次。然後,以倒立型螢光顯微鏡
對各細胞中各肽的攝取進行視覺上評價。另外,在鏡檢之前除去添加了肽之培養上清液並以1×PBS(-)洗淨3次後,經胰蛋白酶處理並將貼壁細胞剝離且立即移入新的96孔板在新的培養液中再懸浮後,進行鏡檢。結果如圖23所示。圖23中,「pep(-)」為未投予肽之控制組的細胞,「single PCPP11」為添加了FLC(螢光素)-PCPP11之細胞。此外,「mal」為馬來醯亞胺基,係半胱胺酸殘基的硫醇基(-SH)與導入至FLC之馬來醯亞胺基反應而形成共價鍵藉此使肽與FLC結合。
由圖23可知,FLC-NmLL、NmL-Cys(-FLC)-L、NmL-Cys(-FLC)LL、L(-R)L-Cys(-FLC)-L、L(-R)-Cys(-FLC)-L-Cys(-FLC)-L、L(-R)L-Lys(-FLC)-L相較於FLC-PCPP11,在任一胰臟癌細胞中皆檢測出強螢光。另一方面,即使與源自PDAC的細胞株同為腺癌系但原發部位不同的H2110細胞(肺腺癌細胞)則幾乎未檢測出螢光。此外,NmL-Cys(-FLC)LL、L(-R)L-Cys(-FLC)-L、L(-R)-Cys(-FLC)-L-Cys(-FLC)-L、L(-R)L-Lys(-FLC)-L中,任一胰臟癌細胞亦檢測出特別強螢光。
本實施形態的肽,係對消化系統的癌細胞或是癌組織具有高度的累積性、以及在生物體內之優異之抗分解性。藉由本實施形態的肽,可將目標物質簡便且有效率地傳遞至消化系統的癌細胞或是癌組織。
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Claims (17)
- 一種肽,係由以下的通式(I)所示之胺基酸序列所構成,且對包含胰臟癌細胞以及胃癌細胞之消化系統的癌細胞或是癌組織具有高度的累積性:X11-(Y11-X12)n11 (I)通式(I)中,X11係序列編號1、12~14中任一者所示之胺基酸序列所構成之肽殘基;Y11係胺基酸數1以上至3以下的胺基酸殘基所構成之肽連接體,前述胺基酸殘基係各自獨立,為甘胺酸殘基、半胱胺酸殘基或是離胺酸殘基;X12係序列編號1、12~14中任一者所示之胺基酸序列所構成之肽殘基、或是該等的逆反型肽殘基;n11為1以上至3以下的整數。
- 如請求項1所記載之肽,其中前述X11以及前述X12為由相同的胺基酸序列所構成之肽殘基、或是前述X12為前述X11的逆反型肽殘基。
- 如請求項1所記載之肽,係由序列編號15至25、以及27至31中任一者所示之胺基酸序列所構成。
- 一種核酸,係編碼請求項1至3中任一項所記載之肽。
- 一種肽-藥物-共軛物,係含有如請求項1至3中任一項所記載之肽、以及生理活性物質;前述生理活性物質為抗癌劑、核酸、具有細胞增殖抑制或是細胞殺傷效果之蛋白質、或是可特異性結合至癌細胞的抗體、該抗體片段或適體。
- 一種醫藥組成物,係含有如請求項5所記載之肽-藥物-共軛物。
- 如請求項6所記載之醫藥組成物,係胰臟癌或是胃癌治療用 途。
- 如請求項6或7所記載之醫藥組成物,係胰臟癌治療用途。
- 如請求項6或7所記載之醫藥組成物,其中前述生理活性物質為抗癌劑。
- 一種標記肽,係含有如請求項1至3中任一項所記載之肽、以及標記物質。
- 如請求項10所記載之標記肽,其中前述標記物質為穩定同位素、放射性同位素或是螢光物質。
- 一種成像組成物,係含有如請求項10或11所記載之標記肽。
- 如請求項12所記載之成像組成物,係消化系統的癌用途。
- 如請求項12或13所記載之成像組成物,係胰臟癌診斷用途。
- 一種載體,係具有如請求項4所記載之核酸。
- 一種肽-藥物-共軛物表現載體,係具有如請求項4所記載之核酸、以及編碼生理活性物質之核酸;前述生理活性物質為具有細胞增殖抑制或是細胞殺傷效果之蛋白質、或是可特異性結合至癌細胞的抗體、該抗體片段或肽適體。
- 一種標記肽表現載體,係具有如請求項4所記載之核酸、以及編碼標記物質之核酸。
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