KR101093549B1 - 질환의 진단을 위한 표적 펩타이드가 결합된 양친성 키토산나노입자 조영제 - Google Patents

질환의 진단을 위한 표적 펩타이드가 결합된 양친성 키토산나노입자 조영제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 담즙산 유도체 또는 지방산 유도체가 결합된 양친성 키토산 유도체에 형광체 및 질환 표적 펩타이드가 결합된 나노입자 조영제에 관한 것으로서, 상세하게는, 자가 면역 반응에 의한 염증으로 유발되는 신생 혈관의 높은 투과성으로 인하여 염증 부위에 선택적으로 축적이 가능한 담즙산 또는 지방산 유도체와 키토산 및 근적외선 형광체가 결합된 나노입자 복합체에 질환 표적 펩타이드가 결합된 나노입자 조영제에 관한 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 질환 표적 펩타이드가 결합된 나노입자 조영제는 기존의 나노입자 보다 질환에 대한 표적성이 현저히 향상된 것으로, 세포 뿐만 아니라 생체 내에서 특정 질환의 세포 및 조직의 스크리닝 및 질환의 진단, 예방 및 치료의 효율을 현저히 증가시킬 수 있다. 또한, 표적 펩타이드가 결합된 나노입자에 다양한 동위원소, 무기 나노입자 또는 질환 치료제를 등을 결합하거나 봉입할 수 있어서 질환의 진단과 치료를 동시에 할 수 있는 다기능성 나노입자 개발로의 응용이 가능하다.
표적 펩타이드, 고분자 나노입자, 조영제

Description

질환의 진단을 위한 표적 펩타이드가 결합된 양친성 키토산 나노입자 조영제 {A DISEASE TARGETED PEPTIDE-CONJUGATED AMPHIPHILIC CHITOSAN BASED NANOPARTICLE IMAGING AGENT FOR DIAGNOSIS OF DISEASE}
본 발명은 염증성 질환에서 유발되는 신생혈관에 높은 선택성을 가진 담즙산-키토산 나노입자에 특정 질환 조직 및 세포에 특이성, 선택성 및 친화도가 높은 질환 표적 펩타이드가 결합하고, 동시에 근적외선 형광체를 결합하여 염증성 질환의 조기 진단, 예방 및 치료를 위하여 유용하게 사용될 수 있는 질환 표적형 나노입자 조영제에 관한 것이다.
현재까지 고분자 나노입자, 마이셀, 리포좀 및 무기 나노입자인 금 나노입자, 양자점 나노입자, 산화철 나노입자 등 다양한 나노입자들이 개발되고 있다. 현재 개발되고 있는 다양한 나노입자를 이용하여, 질병을 치료할 수 있는 약물 전달체, 질병을 진단할 수 있는 조영제를 함유한 나노입자가 질환의 진단 및 예방 등에 사용되고 있다.
통상적으로, 나노입자는 질환 부위에서 형성되는 신생혈관의 높은 투과성 때문에 EPR(enhanced permeability and retention) 효과에 의해 질환 조직에 선택적 으로 축적된다. 이러한 성질을 이용하여, 암 진단제 및 치료제로써, 방사선 동위원소, 형광체, 항암제 및 다양한 질환 치료제 등을 함유한 나노입자를 개발하고 있다. 그러나, 이러한 나노입자들은 조영제 및 치료제를 수동적으로 전달하기 때문에 질환 부위에 선택적으로 조영제 및 치료제를 전달하는 능력이 낮다.
한편, 질환 조직에 표적성을 갖는 바이오 마커, 일 예로 다양한 항체, 압타머, 엽산 유도체, 질환 표적 펩타이드 등을 탐색 및 발굴되고 있는데, 이러한 질환 표적성 바이오 마커 등이 결합된 나노입자를 사용하여, 다양한 질환 영상 장비, 즉 근적외선 형광 영상장비, PET, CT, MRI 등에 접목하면 기존의 조영제 및 질환 치료제보다 향상된 질환 진단, 예방 및 치료제를 개발할 수 있다. 이에 본 발명자들은 질환 조직에서 신생혈관의 높은 투과율에 의해 질환 조직에 선택적으로 축적되는 지방산 또는 담즙산 유도체-키토산 나노입자에, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 발굴된 특정 질환에 특이성, 선택성 및 친화성이 높은 펩타이드를 결합하고 동시에 근적외선 투시가 가능한 Cy5.5를 화학적으로 결합하여 질환의 조기 진단, 예방, 및 치료를 위한 본 발명에 따른 질환 표적형 신규 나노입자 조영제를 개발하였다.
본 발명의 목적은 담즙산 유도체 또는 지방산 유도체가 결합된 양친성 키토산 유도체에 형광체 및 질환 표적 펩타이드가 결합된 나노입자 조영제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 담즙산 유도체 또는 지방산 유도체가 결합된 양친성 키토산 유도체에 형광체 및 질환 표적 펩타이드가 결합된 나노입자 조영제에 소수성 약물이 봉입된 약물전달체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 담즙산 유도체 또는 지방산 유도체가 결합된 양친성 키토산 유도체에 형광체 및 질환 표적 펩타이드가 결합된 나노입자 조영제로, 상기 질환표적 펩타이드는 동맥경화 플라크 또는 IL-4 수용체 표적 펩타이드, 사멸세포의 표적 펩타이드, 방광암 세포 표적 펩타이드, 압타머, 엽산, 염증성 질환 조직내 혈관의 혈관내피세포에서 발현하는 인테그린 표적펩타이드인 Arg-Gly-Asp의 서열을 포함하는 펩타이드 유도체, 트렌스페린, 글루코스 및 이들의 유도체로 구성된 군에서 선택되는 것인 나노입자 조영제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 질환 표적형 펩타이드는 서열번호 1로 구성된 동맥경화 플라크 또는 IL-4 수용체 표적 펩타이드, 서열번호 2로 구성된 사멸 세포 표적 펩타이드 및 서열번호 3으로 구성된 방광암 세포 표적 펩타이드로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노입자에 방사선 동위원소, 양자점(quantum dot) 또는 MRI 조영제를 더 포함하는 것일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 나노입자 조영제에 소수성 약물이 봉입된 편평상피세포암, 자궁암, 자궁 경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암 및, 담낭암로 구성된 군에서 선택된 암 치료용 약물전달체, 또는, 골 관절염, 류마티스 관절염, 전신성 경피증 (Progressive systemic sclerosis), 췌장세포 항체에 의한 인슐린 의존성 소아기 당뇨병, 만성 갑상선 염, 궤양성 대장염, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역성 뇌척수염 또는 섬유조직염 (Fibromyalgia syndrome) 및 동맥경화로 구성된 군에서 선택된 염증질환 치료용 약물전달체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 소수성 약물은 다우노마이신(daunomycin), 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라틴 (cis-platin), 캠토세신 (camptothecin), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(Anasterozole), 글리벡(Gleevec), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드(Leuprolide), 플로타미드(Flutamide), 졸레드로네이트(Zoledronate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈(Gemcitabine), 스트렙토조토신(Streptozocin), 카보플라틴(Carboplatin), 토포테칸(Topotecan), 벨로테칸(Belotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 히도록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 레티노익 산 (retinoic acid) 계열, 메소트렉세이트(Methotrexate), 메클로레타민(Meclorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 부술판(Busulfan), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 마이토마이신(Mitomycin), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantron), 아스피린 (aspirin) 및 살리실레이트 (salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone), 코르티코스테로이드(corticosteroid) 등이 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 질환 표적 펩타이드가 결합된 나노입자 조영제는 기존의 나노입자 보다 질환에 대한 표적성이 현저히 향상된 것으로, 세포 뿐만 아니라 생체내에서 특정 질환의 세포 및 조직의 스크리닝 및 질환의 진단, 예방 및 치료의 효율을 현저히 증가시킬 수 있다. 또한, 표적 펩타이드가 결합된 나노입자에 다양한 동위원소, 무기 나노입자 또는 질환 치료제를 등을 결합하거나 봉입할 수가 있어서 질환의 진단과 치료를 동시에 할 수 있는 다기능성 나노입자 개발로의 응용이 가능하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 담즙산 유도체 또는 지방산 유도체가 결합된 양친성 키토산 유도체에 형광체 및 질환 표적 펩타이드가 결합된 나노입자 조영제를 제공한다.
상기 양친성 키토산 고분자 나노입자는 소수성과 친수성의 균형을 통해 나노크기의 자기조립체 (self-assemblｙ)를 형성시킬 수 있고, 질환 조직에 선택적으로 축척될 수 있다. 또한, 고분자 나노입자에 근적외선 투시가 가능한 근적외선 형광체의 화학적 개질이 용이하고, 근적외선 투시에 질환 조직에 선택적인 강한 근적외선 형광을 나타내어야 한다.
상기 키토산 고분자 이외에도, 생체적합성을 갖는 모든 고분자가 사용될 수 있으며, 특히 질환 조직에서 생성되는 신생혈관을 통하여 조직 축적 효율이 높고 항암제의 약물전달체로 사용되는 생체고분자인 덱스트란 (dextran), 키토산 (chitosan), 글라이콜 키토산 (glycol chitosan), 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine), 폴리아스파르트산 (poly-aspartic acid) 등이 있으며, 합성 고분자로서는 폴리(N-2-(하이드록시프로필)메타아크릴아마이드)(poly(N-2-(hydroxypropyl)methacrylamide), 폴리(디비닐 에테르-코-말레익 언하이드라이드)(poly(divinyl ehter-co-maleic anhydride)), 폴리(스틸렌-코-말레익 언하이드라이드)(poly(styrene-co-maleic anhydride)), 폴리(에틸렌 글라이콜)(poly(ethylene glycol)) 등이 있다. 상기의 고분자 나노입자는 생체 내에서 생체적합성/생분해성이 우수해야 하며, 생체내의 안정성이 우수하여 혈액 내에서의 생체분포도가 높아서 충분한 시간동안 암 조직에 계속적으로 축적되는 특성이 필요하다. 특히, 글라이콜 키토산은 고분자 사슬 내에 양전자를 많이 함유하고 있어 나 노입자 제조시 암 조직 축척 효율이 매우 높으며, 고분자의 아민기는 소수성 물질 및 근적외선 형광체의 화학적 개질을 유도할 수 있다.
본 발명에서, "질환 특이적 표적 펩타이드"란 파지디스플레이 기법을 이용하여 특이질환 세포 및 조직에서 특이적으로 결합하는 파지의 탐색을 3-4회 반복 시행하여 펩타이드가 삽입된 파지클론들을 특이 표적성, 특이성 및 선택성을 측정함으로써 발굴되는 펩타이드를 의미한다.
상기 고분자 나노입자에 결합이 되는 질환 표적형 펩타이드로는, 파지 디스플레이 방법을 이용하여 탐색 및 발굴된, 동맥경화 플라크 또는 IL-4 수용체 표적 펩타이드 (서열번호 1: CRKRLDRNC) 및 이의 유도체, 사멸(apoptotic) 세포에 표적 펩타이드 (서열번호 2: CQRPPR) 및 이의 유도체, 방광암 세포 표적펩타이드 (서열번호 3: CSNRDARRC) 및 이들의 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드 유도체 등이 결합될 수 있다.
여기서, 동맥경화 플라크란, 동맥경화와 같은 관상동맥 질환은 콜레스테롤과 같은 지방성분이 체내에 축적되면서 발생하는데, 이 지방성분이 혈관내에 침착될 경우 혈관벽이 두꺼워지고 혈전(핏덩어리)이 끼어서 혈관은 자연히 좁아져 원활한 혈액순환에 지장을 받게 되며, 이러한 지방분의 축적을 동맥경화 병변, 일명 플라크(plaque)라고도 한다.
이 외에도, 기존에 다양한 문헌(Jae Hyung Park et al, Progress in polymer science, 33, 113-137, 2008; Peptides International. Inc.)통하여 알려진 암 표적에 사용될 수 있는 물질로 염증성 질환에서 혈관 내피세포 표면에서 발현하는 인 테그린을 표적할 수 있는 RGD 펩타이드 및 그의 유도체로서, 예를 들면 cyclic RGDfV (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)), cyclic RGDfK (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)), cyclic RGDfC (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)), cyclic RGDfE (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Glu)), cyclic RGDyK (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)), cyclic RGDyE (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Glu)), RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser), GRGDS (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser) 등이 있다. 상기 RGD 펩타이드들에 관한 자세한 내용은 하기 표 1과 같다.
[표 1]
Figure 112008067566754-pat00001
Figure 112008067566754-pat00002
Figure 112008067566754-pat00003
(출처: Peptides International, Inc.)
또한, 전립선 암에 표적성이 높은 RNA 또는 DNA 구조를 갖는 압타머 (Aptamer)가 결합될 수 있으며, 직장, 폐, 전립선, 자궁, 뇌 등 다양한 암 세포 및 암 조직에서 과다 발현되는 엽산 수용체 (Folate receptor)와 표적친화력 및 선택성이 높은 엽산 (Folic acid)도 결합이 될 수 있다.
또한, 트랜스페린 (Transferrin)은 간에서 합성되고 혈장내로 분비가 되는 단백질로서 체내에 존재하는 철(iron)에 결합하여 철-트랜스페린 킬레이드를 형성하며, 세포에 철분을 공급해 주는 중요한 요인이다. 트랜스페린 수용체는 악성종양 세포 표면에서 과발현 되며, 철-트랜스페린 킬레이트를 인지하여 엔도사이토시스에 의해 세포내로 흡수되며, 암 치료에 적용이 된다. 트랜스페린 단백질도 암 표적성을 갖고 있어 나노입자에 결합이 될 수 있다. 그 외에도 특이질환에 사용되는 각종 바이오마커가 결합가능하다.
생체 내 광학 투시를 위해서 상기 양친성 고분자에 시아닌, 알로피코시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 보디피, 알렉사 등과 같은 형광체가 화학적으로 도입된다. 상기 형광체는 양친성 고분자 내의 소수성 물질에 결합하게 된다. 형광체 중에서 시아닌계는 근적외선 빛을 방출 및 흡수하므로 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭이 낮아 가장 바람직하며, 좋은 예는 Cy5.5이다. 근적외선 형광체로 개질된 고분자 나노입자는 근적외선 조사를 이용하여 생체 내 자가면역질환 조직의 영상화가 가능하며, 방사선 동위원소, 양자점(quantum dot), MRI 조영제를 동시에 도입할 경우 다양한 복합 분자영상이 가능하다.
본 발명에서 제조한 근적외선 형광체가 결합된 고분자 나노입자는 수계에서 안정한 나노입자 구조를 가지며, 질환 조직 축척 효율이 높은 것이 바람직하다. 또, 근적외선 투시가 질환 조직 표적성을 갖는 높은 근적외선 형광세기를 나타내는 것이 바람직하다.
특히, 본 발명의 일 예로써, 친수성의 글라이콜 키토산 사슬과 소수성인 담즙산 유도체로 이루어진 고분자 나노입자는, 다양한 질환 치료제 등이 나노입자 내에 봉입될 수 있어 사용가능하다. 글라이콜 키토산은 고분자 사슬 내에 양전자를 많이 함유하고 있어 나노 입자를 제조할 경우, 염증성 질환 조직에 축척 효율이 현저히 탁월하며, 글라이콜 키토산의 아민기는 소수성 물질 및 근적외선 형광체의 화학적 개질 유도에 가장 적합하다.
구체적으로, 본 발명에서는 먼저, 키토산 고분자인 친수성 글라이콜 키토산에 소수성 물질을 도입함으로써, 양친성 키토산 유도체를 제조한다. 상기 친수성 고분자에 결합되는 소수성 물질은 담즙산 및 디옥시콜릭산 (deoxycholic acid), 리소콜릭산 (lithocholic acid), 타우로디옥시콜릭산(taurodeoxycholic acid), 타우로콜릭산 (taurocholic acid), 글리코케노디옥시콜릭산 (glycochenodeoxyhoclic acid) 등의 담즙산 유도체; 스테아릭산(stearic acid), 콜레스테롤 (cholesterol), 팔미틱산 (palmitic acid), 올레익산(olelic acid) 등의 지방산 유도체가 사용될 수 있으며, 담즙산을 사용하는 것이 바람직하다.
여기서 양친성 키토산이란, 친수성인 키토산에 상기와 같이 소수성 물질을 도입함으로써 친수성과 소수성의 성질을 함께 가지는 키토산 유도체를 말한다. 상기의 양친성 키토산은 수용액 상태에서 쉽게 나노입자를 형성하며, 고분자 나노입자의 특성에 따라서 질환 조직 주변에서 높은 축적 효율이 나타난다. 경우에 따라 서, 조기진단을 위해서는, 소수성 키토산 복합체에 근적외선 형광체인 Cy5.5을 화학적으로 결합시켜, 근적외선 투시시 생체내에서의 나노입자의 위치 및 정량적 분석이 가능해진다. 또 양친성 키토산 나노입자는 약물전달체로서 사용이 가능하며, 소수성 항암제를 물리/화학적으로 쉽게 봉입이 가능하므로 암 조기진단 뿐만 아니라 암 치료제의 새로운 약물전달 시스템으로 활용이 가능하다. 또한, 질환에 특이성, 선택성 및 친화성이 높은 펩타이드를 결합하여 질환에 표적 효율을 향상시킴으로써, 질환 진단, 예방, 및 치료 효능을 탁월하게 증진 시킬 수 있다.
상기와 같은 고분자 나노입자를 형성하는 표적펩타이드가 결합된 담즙산-키토산-Cy5.5 복합체를 제조하기 위한 바람직한 예를 하기의 화학식 1로 나타낼 수 있다.
Figure 112008067566754-pat00004
상기 식에서 A와 B는 글라이콜 키토산 고분자의 반복구조인 N-aceylglucosamine과 N-glucosamine 유도체로서 이루어지며, C는 친수성 글라이콜 키토산에 소수성기를 도입하기 위하여 N-glucosamine 유도체 아민의 소수성 담즙산, 지방산 등의 소수성 물질이 화학적으로 결합된 유도체이며, D는 N-glucosamine 유도체 아민에 질환 특이적, 선택적 또는 친화적 표적 펩타이드가 결합된 것이며, E는 N-glucosamine 유도체 아민에 생체내 영상을 위하여 N-glucosamine 유도체의 아민에 근적외선 형광체, 방사성 동위원소, 양자점(quantum dot) 등이 화학적으로 결합된 유도체이다. 또한, a와 b는 글라이콜 키토산의 분자량에 따라서 수 각 단량체의 조성은 10-50%의 조성을 가지며, c는 글라이콜 키토산의 나노입자를 제조하기 위하여 소수성의 비율이 10-40%의 조성을 갖는다. 표적 펩타이드를 포함하는 D의 조성 d는 5-20%의 조성을 갖으며, 영상을 위한 E의 조성 e는 0.1-2%의 조성을 갖는다. 다만, 상기 화학식 1은 본 발명에 따른 나노입자 조영제의 구조를 설명하기 위해 대략적인 구조식으로 나타낸 것으로, 상기 화학식 1처럼, A, B, C, D, E의 각 요소가 서로 직렬적으로 결합되는 것은 아니며, 도 1에 나타난 바와 같이, 입체적인 구조로써, 글라이콜 키토산에 담즙산, 형광체, 표적펩타이드가 함께 결합되어 있는 구조를 가진다.
구체적으로, 도 1에 나타난 바와 같이, 글라이콜 키토산 고분자 유도체는 고분자의 반복구조인 N-aceylglucosamine과 N-glucosamine 유도체로서 이루어지며, 이러한 친수성 글라이콜 키토산에 소수성기를 도입하기 위하여, 상기 글라이콜 키토산에 담즙산, 지방산 등의 소수성 물질이 화학적으로 결합되고, 또한, 상기 글라이콜 키토산에 질환 특이적, 선택적 또는 친화적 표적 펩타이드가 결합된 것이며, 여기에 나노입자의 생체내 영상을 위하여 근적외선 형광체, 방사성 동위원소, 양자점(quantum dot) 등이 화학적으로 결합된 유도체이다.
글라이콜 키토산의 분자량에 따라서, N-aceylglucosamine과 N-glucosamine의 각각의 단량체의 조성의 몰수는 100에서 수 10,000의 값을 가지며, 소수성 물질의 몰수는 글라이콜 키토산의 나노입자를 제조하기 위하여 20-100의 값을 가지며, C는 10-30이다.
상기의 담즙산-키토산-Cy5.5 복합체는 자기조립형 자기응집된 형태의 나노입자로 제조되며 그 크기는 100에서 800 nm 크기를 갖는다. 제조된 고분자 나노입자는 생체적합성이 우수하고 암 조직내 축적효율이 우수하며, 근적외선, PET/SPECT, 및 CCD 카메라에 의해서 생체내에서 영상이 가능하다. 상기의 나노입자에서 Cy5.5를 대신하여 결합가능한 형광체로는 Cy3, TAMRA, Texas Red, ROX, Cy5, Cy5.5, Rhodamine, Alexa Fluor　 568, Alexa Fluor　 594, Alexa Fluor　 610, Alexa Fluor　 647, Alexa Fluor　 660, Alexa Fluor　 680, Alexa Fluor　 700, BODIPY　 493/503, BODIPY　 530/550, BODIPY　 558/568, BODIPY　 581/591, Cy7, Cy7.5 등이 있다.
또한, 담즙산-키토산-Cy5.5복합체는 표면은 친수성 고분자에 내부는 소수성 부분으로 이루어진 양친성을 띄는 나노입자로, 나노입자 내부에 소수성을 띄는 질환 치료제로, 항류마티스제, 항염증제 등의 도입이 가능하며, 특히, 다우노마이신(daunomycin), 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라틴 (cis-platin), 캠토세신 (camptothecin), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(Anasterozole), 글리벡(Gleevec), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드(Leuprolide), 플로타미드(Flutamide), 졸레드로네이트(Zoledronate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈(Gemcitabine), 스트렙토조토신(Streptozocin), 카보플라틴(Carboplatin), 토포 테칸(Topotecan), 벨로테칸(Belotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 히도록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 레티노익산 (retinoic acid) 계열, 메소트렉세이트(Methotrexate), 메클로레타민(Meclorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 부술판(Busulfan), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 마이토마이신(Mitomycin), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantron), 아스피린 (aspirin) 및 살리실레이트 (salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone), 코르티코스테로이드(corticosteroid) 등의 약물 봉입이 가능하며, 골 관절염, 류마티스 관절염, 전신성 경피증 (Progressive systemic sclerosis), 췌장세포 항체에 의한 인슐린 의존성 소아기 당뇨병, 만성 갑상선 염, 궤양성 대장염, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역성 뇌척수염 또는 섬유조직염 (Fibromyalgia syndrome) 및 동맥경화 또는 각종 암 등 다양한 질환 치료제로서 사용이 가능하다.
또한, 본 발명에서 제조한 근적외선 형광체가 결합된 고분자 나노입자는 수계에서 안정한 나노입자 구조를 가지기 때문에, 소수성을 띄며 입자의 크기가 1 내지 20 nm이하의 크기를 갖는 무기 나노입자, 예로 금 나노입자, 산화철 나노입자, 양자점 등을 봉입할 수 있으며, 이들을 이용하여 광학영상 조영제, CT 조영제 및 MRI 조영제로 응용이 가능하다.
상기 나노입자 조영제에서, 친수성 고분자는 키토산으로, 소수성 물질은 담즙산으로, 근적외선 형광체는 Cy5.5으로 하여 제조된 담즙산-키토산-Cy5.5 복합체는 자기조립형 또는 자기응집된 형태의 나노 입자로 제조되며 그 크기는 수십에서 수백 나노미터의 크기를 갖는다. 상기 고분자 나노입자의 복합체는 생체적합성이 우수하고 자가면역질환, 암 조직 내의 축적 효율이 우수하며, 근적외선, PET/SPECT 및 CCD 카메라에 의해서 생체 내에서 영상이 가능하다.
또한, 상기 담즙산-키토산-Cy5.5 복합체는 일반 저분자량의 조영제에 비하여 염증 조직의 EPR 효과에 의해 염증 조직에 대한 선택성이 높아 염증성 질환 조직의 축적 효율이 현저히 탁월하며, 생체 내의 체류 기간이 저분자량의 조영제보다 크게 증가되어 다양한 염증성 질환 조직 및 암 조직의 장기적인 영상이 가능하다.
본 발명에서 개발된 질환 표적펩타이드가 결합된 나노입자는 다양한 염증성 질환의 진단, 예방 치료에 응용이 가능하며, 다양한 염증성 질환의 예로, 골 관절염, 류마티스 관절염 및 그 외 자가 면역질환 질병, 및 편평상피세포암, 자궁암, 자궁 경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암 등을 포함하는 암, 또는 치매, 뇌졸중 등을 포함하는 난치성 질환의 진단, 예방 및 치료에 응용이 가능하다. 상기 고분자 나노 입자는 소수성과 친수성의 균형을 통해 나노 크기의 자기조립체 (self-assemblｙ)를　형성할 수 있으며, 염증성 질환 조직에 선택적으로 축적될 수 있다. 또한, 본 발명의 고분자 나노 입자는 근적외선 투시가 가능한 근적외선 형광체의 화학적 개질에 용이하며, 근적외선 투시에 의해 염증성 질환 조직의 선택적인 강한 근적외선 형광을 나타낼 수 있다.
상기 고분자 나노 입자는 생체 내에서 생체적합성/생분해성이 우수하며, 생체내의 안정성이 우수하여 혈액 내에서의 생체 분포도가 높아서 충분한 시간 동안 염증성 질환 조직 부위에 축적이 되는 특성이 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 의하여 제한되지는 않는다.
실시예 1. 본 발명에 따른 나노입자 조영제의 제조
1-1. 담즙산-글라이콜키토산-Cy5.5 복합체의 제조
500mg의 글라이콜 키토산을 60㎖의 물에 용해시키고 90㎖의 메탄올을 가한 후, 100㎖의 메탄올에 담즙산(5-β-cholanic acid) 260mg을 용해시켜 글리콜 키토산 용액에 천천히 적하하였고, 280mg의 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필) 카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide; EDC)와 420mg의 N-하이드로숙신이미드(N-hydrosuccinimide;NHS)를 50㎖의 메탄올에 녹여 반응액에 가한 다음 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 반응액을 2일 동안 투석하여 미반응 담즙산을 제거한 후 동결 건조하여, 담즙산-글라이콜 키토산 복합체를 제조 하였다.
상기에서 제조된 담즙산-글라이콜 키토산 복합체 100mg를 20㎖의 물에 녹이고 20㎖의 DMSO을 가한 후, 2mg의 근적외선 형광체 Cy-5.5-NHS(monoreactive hydroxysuccimimide ester of Cy5.5)를 첨가하여 6시간 동안 반응시킨 후, 용액을 2일 동안 투석하여 미반응 Cy5.5를 제거하고, 동결 건조하여, 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5 복합체를 제조하였으며, 이의 제조과정은 하기 반응식 1에서 보는 바와 같다.
Figure 112008067566754-pat00005
1-2. 질환 표적펩타이드가 결합된 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5 유도체 합성
담즙산, 키토산 및 Cy5.5로 구성된 복합체 80 mg를 pH가 8.0인 증류수 32 ml 에 분산을 시킨 후, 1 ml의 dimethyl sulfoxide에 7 mg의 N-succinimidyl 4-(maleimidomethyl) cyclohexane carboxylate (SMCC)가 녹여진 용액을 첨가한다. 그 후, 혼합용액을 pH 6.7로 맞춘 후, 1 ml의 증류수에 표적 펩타이드를 녹인 용액을 첨가하여 2시간 동안 반응한 후, 투석 및 동결건조 한다. 담즙산-키토산 유도체 1몰에 결합된 표적 펩타이드의 몰수는 다음 표 2와 같다.
[표 2]
샘플 입자크기 (nm) 담즙산-키토산 유도체 1몰에 결합된 표적 펩타이드 몰수
CRKRLDRNC-HGC-Cy5.5 298 5.5
CQRPPR-HGC-Cy5.5 305 4.5
CSNRDARRC-HGC-Cy5.5 310 4.2
실험예 1. 동맥경화 플라크 표적펩타이드가 결합된 CRKRLDRNC-HGC-Cy5.5 나노입자의 혈관 내피세포에서의 세포 친화도 분석
동맥경화 플라크 표적 펩타이드는 IL-4 수용체에 결합력이 뛰어나고, 동맥경화 플라크에서는 사이토카인 TNF-alpha가 분비가 되며, TNF-alpha에 의해 혈관 내피세포는 활성화가 되며 세포 표면에서 IL-4R를 과다 발현한다.
CRKRLDRNC-HGC-Cy5.5가 IL-4R이 과다 발현되는 세포에서의 결합력을 확인하기 위하여, laminar flow chamber에 104개의 Bovine aortic endothelial cell (BAEC)을 넣고 세포가 chamber에서 약 80% 정도 찰 때까지 배양하였다. 그 후, TNF-alpha를 10 ng/ml의 농도처리하여 1시간 처리하여 BAEC를 활성화시켜 준 후, CRKRLDRNC-HGC-Cy5.5 또는 HGC-Cy5.5 나노입자를 100 μg/ml 농도를 함유하는 배양 액을 펌프를 사용하여 flow chamber에 약 2시간 정도 흘려주었다. 2시간 후, 세포를 배양액으로 세척한 후 고정액을 사용하여 세포를 고정한 후 형광현미경을 통하여 나노입자의 결합력을 분석하였다.
도 2에 나타난 바와 같이 HGC-Cy5.5 나노입자는 TNF-alpha가 처리되지 않거나 또는 처리된 세포에 결합하지 않았다. 한편, CRKRLDRNC-HGC-Cy5.5입자는 TNF-alpha가 처리되지 않은 비활성화된 BAEC 세포에서 결합이 되지 않았으나, TNF-alpha가 처리된 활성화된 BAEC에서는 잘 결합되는 것을 확인하였다. 이는, 사이토카인 TNF-alpha에 의해 IL-4R을 과다 발현하는 활성화된 BAEC에 CRKRLDRNC-HGC-Cy5.5 나노입자가 선택적으로 결합함을 의미하며, 따라서, 세포에서 질환 진단 스크리닝에도 적용이 가능할 것이다.
실험예 2. 동맥경화 쥐에서의 동맥경화 플라크 영상화
동맥경화 쥐 (LDLr-/-)와 정상 쥐의 죽상동맥에서 CRKRLDRNC-HGC-Cy5.5 나노입자의 동맥경화 플라크 영상을 관찰하였다. 동맥경화 쥐 및 정상 쥐에 CRKRLDRNC-HGC-Cy5.5 나노입자를 5 mg/kg로 하여 꼬리 정맥주사를 하였으며, 6 시간 후에 동맥경화 쥐 및 정상 쥐의 죽상동맥이 드러나게 한 후 eXplore Optix를 이용하여 영상화하였다.
그 결과, 도 3a와 같이 동맥경화 쥐 (3a-1)의 죽상동맥에서는 정상 쥐 (3a-2) 죽상동맥에서 형광이 강하게 나타남을 확인하였다. 도 3b는 정상쥐와 비교하여 동맥경화 죽상동맥에서 플라크가 형성되어 있음을 Oil red-O 염색법으로 확인하였 으며, 도 3c는 정상 쥐와는 달리 동맥경화쥐의 죽상동맥에서 형성된 플라크에 CRKRLDRNC-HGC-Cy5.5 나노입자가 현저히 결합력이 높음을 확인할 수 있었다.
상기 결과로 볼 때, CRKRLDRNC-HGC-Cy5.5 나노입자가 동맥경화 진단 조영제로서 이용 가능할 것이다.
실험예 3. IL-4R이 과다발현하는 암에서의 표적성 평가
동맥경화 표적 나노입자 조영제인 CRKRLDRNC-HGC-Cy7.5가 다른 염증성 질환에서도 표적 효율 높음을 증명하기 위하여, IL-4R이 과다 발현하는 암세포인 H226를 이용하여 동물 모델을 확립하였다. H226세포 (3 × 106개)를 마우스 옆구리 부분에 피하로 이식하여, 암 크기가 약 5-7 mm의 크기가 되었을 때 CRKRLDRNC-HGC-Cy7.5를 5 mg/kg로 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다. 대조군으로는 HGC-Cy7.5를 투여하였다.
도 4에 나타난 바와 같이 펩타이드가 결합되지 않는 나노입자보다 CRKRLDRNC-HGC-Cy7.5를 투여한 그룹에서 암 표적성이 증가함을 알 수 있었다. 이는, 표적 펩타이드를 결합할 경우, 기존의 나노입자 보다 질환 표적 효율을 현저히 증가시킬 수 있으며, 이로 인하여 다양한 염증성 질환의 진단, 예방, 및 치료 효능을 향상시킬 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에서 제조된 질환 표적 펩타이드와 결합되고, 형광체와도 결합되어 있는 글라이콜키토산-담즙산 고분자 복합체 나노입자 및 그 제조방법을 나타낸 것이다.
도 2은 동맥경화플라크 표적펩타이드가 결합된 글라이콜 키토산-담즙산-Cy5.5 나노입자 (2 b) 와 펩타이드가 결합되지 않은 글라이콜 키토산-담즙산 나노입자 (2 a) 가 사이토카인인 TNF-alpha 처리 유무에 따라 관상동맥혈관내피세포에 결합력을 관찰한 세포 이미지를 나타낸 것이다.
도 3는 동맥경화를 유발한 쥐 (LDLr-/-) (3a-1)와 정상 쥐 (3a-2)에서 동맥경화플라크 표적펩타이드가 결합된 글라이콜 키토산-담즙산-Cy5.5 나노입자의 죽상동맥에서의 플라크에 대한 표적성 및 근적외선 영상을 나타낸 것이며, 3b는 동맥경화 유발 쥐와 정상쥐에서 적출한 죽상동맥을 Oil red-O 염색을 하여 플라크 형성을 관찰한 사진이며, 3c는 동맥경화 유발 쥐와 정상쥐에서 적출한 죽상동맥을 조직 절편을 만들어 형광현미경을 이용하여 나노입자의 존재 유무를 확인한 그림이다.
도 4는 인터루킨 4-수용체 (IL-4R)가 다량으로 발현하는 암 조직에서의 동맥경화플라크 표적펩타이드가 결합된 글라이콜 키토산-담즙산-Cy7.5 나노입자와 펩타이드가 결합되지 않은 나노입자의 암 표적성을 비교한 근적외선 영상을 나타낸 것이다.
<110> KIST <120> A DISEASE TARGETED PEPTIDE-CONJUGATED AMPHIPHILIC CHITOSAN BASED <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atheroscleroti plaque-homing peptide <400> 1 Cys Arg Lys Arg Leu Asp Arg Asn Cys 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> apoptotic cell target peptide <400> 2 Cys Gln Arg Pro Pro Arg 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bladder cancer target peptide <400> 3 Cys Ser Asn Arg Asp Ala Arg Arg Cys 1 5

Claims (5)

  1. 담즙산 유도체 또는 지방산 유도체가 결합된 양친성 키토산 유도체에 형광체 및 질환 표적 펩타이드가 결합된 나노입자 조영제로,
    상기 질환표적 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 동맥경화 플라크 또는 IL-4 수용체 표적 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 사멸세포의 표적 펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 방광암 세포 표적 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 것인 나노입자 조영제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 나노입자에 방사선 동위원소, 양자점(quantum dot) 또는 MRI 조영제를 더 포함하는 것인 나노입자 조영제.
  3. 제1항에 따른 나노입자 조영제에 소수성 약물이 봉입된, 골 관절염, 류마티스 관절염, 전신성 경피증 (Progressive systemic sclerosis), 췌장세포 항체에 의한 인슐린 의존성 소아기 당뇨병, 만성 갑상선 염, 궤양성 대장염, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역성 뇌척수염 또는 섬유조직염 (Fibromyalgia syndro me) 및 동맥경화로 구성된 군에서 선택되는 염증질환 치료용 약물전달체.
  4. 제1항에 따른 나노입자 조영제에 소수성 약물이 봉입된, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁 경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암 및, 담낭암로 구성된 군에서 선택된 암 치료용 약물전달체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 소수성 약물은, 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantron), 아스피린 (aspirin) 및 살리실레이트 (salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 다우노마이신(daunomycin), 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라 틴 (cis-platin), 캠토세신 (camptothecin), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(Anasterozole), 글리벡(Gleevec), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드(Leuprolide), 플로타미드(Flutamide), 졸레드로네이트(Zoledronate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈(Gemcitabine), 스트렙토조토신(Streptozocin), 카보플라틴(Carboplatin), 토포테칸(Topotecan), 벨로테칸(Belotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 히도록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 레티노익산 (retinoic acid) 계열, 메소트렉세이트(Methotrexate), 메클로레타민(Meclorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 부술판(Busulfan), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 또는 마이토마이신(Mitomycin)인 것인 치료용 약물전달체.
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