KR100704548B1 - 염증 부위 특이적 고분자 유도체 및 그의 용도 - Google Patents
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-
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Abstract
본 발명은 염증 부위 조직에 특이적인 고분자 유도체, 상기 고분자 유도체를 유효 성분으로 함유하는 약물 전달용 조성물, 상기 고분자 유도체를 유효 성분으로 함유하는 진단용 조성물, 상기 고분자 유도체를 유효 성분으로 함유하는 조영제형 약물 전달용 조성물 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 고분자 유도체는 소수성과 친수성의 균형을 통하여 자기 조립체(self-assembly) 또는 자기 응집체(self-aggregate)를 형성시킬 수 있는 것으로, 염증 조직에서 특이적으로 반응 및/또는 결합할 수 있기 때문에, 상기 질병에 대한 약물 전달체로서 사용 가능하고, 동시에, 검출 가능한 신호를 발생시키도록 할 수 있기 때문에, 염증 관련 질병을 영상화하고 동시에 치료할 수 있는 조영제형 약물 전달체로서 사용 가능하다. 상기 염증 관련 질병은, 예컨대, 죽상 동맥 경화 또는 암일 수 있다.
고분자, 입자, 미셀, 조영제, 약물 전달, 염증, 동맥경화, 암
Description
도 1은 본 발명에서 제조된 효소에 특이적으로 분해되는 펩티드 및 제3 작용기로서의 발색단을 갖는 소수성/친수성의 양친성 블록 고분자에 의하여 형성된 미셀의 모습을 나타낸 것으로, 상기 미셀 내의 소수성 부분에 약물이 봉입되는 과정을 보여주는 것이고;
도 2는 실시예 4에서 제조된 형광체를 갖는 트롬빈 기질과 양친성 고분자와의 결합체(PCL-ThrS[TF]-mPEG)에 대한 입자도로서, 평균 입자 크기가 약 80 nm 정도인 것을 보여주는 것이고;
도 3은 실시예 4에서 제조된 형광체를 갖는 MMP-2 기질과 양친성 고분자와의 결합체(PCL-MMP2S[TF]-mPEG)에 대한 입자도로서, 평균 입자 크기가 약 67 nm 정도인 것을 보여주는 것이고;
도 4는 실시예 4에서 제조된 형광체를 갖는 MMP-9 기질과 양친성 고분자와의 결합체(PCL-MMP9S[TF]-mPEG)에 대한 입자도로서, 평균 입자 크기가 약 66 nm 정도인 것을 보여주는 것이고;
도 5는 실시예 5에서 실시된 PCL-ThrS(TF)-mPEG에 대한 플루오레신의 여기 파장(가)와 발광 파장(나)를 농도에 따라 스캔한 것을 보여주는 것이고;
도 6은 실시예 5에서 실시된 PCL-ThrS(TF)-mPEG에 대한 테트라메틸로드아민의 여기 파장(가)와 발광 파장(나)를 농도에 따라 스캔한 것을 보여주는 것이고;
도 7은 도 5와 6에서의 플루오레신과 테트라메틸로드아민의 최대 여기 및 발광 파장의 비를 농도에 따라 나열한 것으로, 형광 공명 에너지 전이 효율(FRET efficiency)은 플루오레신 최대 발광 파장 580 nm에서의 강도를 플루오레신 발광 파장 518 nm에서의 강도를 나눈 FF, em580/FF, em518과 형광 공명 에너지 전이 지표(FRET index)는 테트라메틸로드아민 최대 발광 파장 580 nm에서의 강도를 테트라메틸로드아민 최대 여기 파장 543 nm에서의 강도로 나눈 FT, em580/FT, ex543, 플루오레신 최대 발광 파장 518 nm에서의 강도를 플루오레신 최대 여기 파장 486 nm에서의 나눈 FF, em518/FF, ex486, 테트라메틸로드아민 최대 여기 파장 543 nm의 강도를 테트라메틸로드아민 최대 여기 파장 486 nm로 나눈 FT, ex543/FT, ex486을 보여주는 것이고;
도 8은 실시예 6-1에서 실시된 50 μg/mL의 농도를 갖는 고분자 용액에 대한 플루오레신의 형광변화를 관찰한 것으로 (가)는 어떤 효소도 없는 경우, (나)는 트롬빈 10 U을 처리한 경우, (다)는 리파제 10 U만을 처리한 경우, (라)는 트롬빈과 리파제를 각각 10 U씩 처리해 준 경우를 보여주는 것이고;
도 9는 실시예 6-1에서 실시된 50 μg/mL의 농도를 갖는 고분자 용액에 대한 테트라메틸로드아민의 형광변화를 관찰한 것으로 (가)는 어떤 효소도 없는 경우, (나)는 트롬빈 10 U을 처리한 경우, (다)는 리파제 10 U만을 처리한 경우, (라)는 트롬빈과 리파제를 각각 10 U씩 처리해 준 경우를 보여주는 것이고;
도 10은 실시예 6-1에서 실시된 50 μg/mL의 농도를 갖는 고분자 용액을 램프를 사용하여 빛에 노출하였을 때의 사진으로 (가)는 어떤 효소도 없는 경우, (나)는 트롬빈 10 U을 처리한 경우, (다)는 리파제 10 U만을 처리한 경우, (라)는 트롬빈과 리파제를 각각 10 U씩 처리해 준 경우를 보여주는 것이고;
도 11은 실시예 6-1에서 실시된 0.5 μg/mL의 농도를 갖는 고분자 용액에 대한 플루오레신의 형광변화를 관찰한 것으로 (가)는 어떤 효소도 없는 경우, (나)는 트롬빈 10 U을 처리한 경우, (다)는 리파제 10 U만을 처리한 경우, (라)는 트롬빈과 리파제를 각각 10 U씩 처리해 준 경우를 보여주는 것이고;
도 12는 실시예 6-1에서 실시된0.5 μg/mL의 농도를 갖는 고분자 용액에 대한 테트라메틸로드아민의 형광변화를 관찰한 것으로 (가)는 어떤 효소도 없는 경우, (나)는 트롬빈 10 U을 처리한 경우, (다)는 리파제 10 U만을 처리한 경우, (라)는 트롬빈과 리파제를 각각 10 U씩 처리해 준 경우를 보여주는 것이고;
도 13은50 μg/mL과 0.5 μg/mL의 고분자 용액에 대한 도 8과 9 및 11과 12에서 플루오레신과 테트라메틸로드아민의 최대 발광 파장에서의 형광 강도(각각 FF, em520과 FT,em580)들의 변화를 시간에 따라 정리한 것으로 (가)는 어떤 효소도 없는 경우, (나)는 트롬빈 10 U을 처리한 경우, (다)는 리파제 10 U만을 처리한 경우, (라)는 트롬빈과 리파제를 각각 10 U씩 처리해 준 경우를 보여주는 것이고;
도 14는 도 8과 9 및 도 10과 11에서 제시된 결과들에 대하여 형광공명에너지전이 효율(FF, em580/FF, em520)과 지표(FT, ex556/FT, ex494)를 보인 것으로 (가)는 50 μg/mL 에서의 효율, (나)는 50 μg/mL에서의 지표, (다)는 0.5 μg/mL에서의 효율, (라)는 0.5 μg/mL에서의 효율을 보여주는 것이다.
본 발명은 염증 부위 조직에 특이적인 고분자 유도체, 상기 고분자 유도체를 유효 성분으로 함유하는 약물 전달용 조성물, 상기 고분자 유도체를 유효 성분으로 함유하는 진단용 조성물, 상기 고분자 유도체를 유효 성분으로 함유하는 조영제형 약물 전달용 조성물 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
염증이 발생한 조직의 표적 방법으로서, 빠른 혈관 생성에 의하여 발생하는 느슨한 혈관벽의 구멍을 이용하여 나노 입자를 축적시키는 수동적인 방법과 엽산 또는 항체 등의 생리 활성 물질을 표지하여 염증 부위의 세포 표면에 특이적 결합을 유도하는 능동적인 방법 등이 사용되고 있다. 특히, 수동적 방법은 염증 조직의 생리학적 특성을 이용하는 것으로, 염증의 발병은 주변 혈관을 느슨하게 만들고 매우 빠르게 신생 혈관을 형성시킴으로써, 정상적인 혈관과 달리, 수십 내지 수백 나노미터 크기의 구멍들이 형성되어 있기 때문에, 300 nm 이하의 나노 입자들이 잘 축적되는 증대된 투과력과 유지력 (EPR, enhanced permeability and retention) 효과를 갖는다 (Hashizume 외, Am. J. Pathol ., 156, 1363-1380, 2000).
염증을 특이적으로 표적하여 진단하는 방법은 선진국에서조차 실용화된 것이 드문 실정이고, 현재까지 개발된 치료 방법 또한 약물의 전신 투여를 통한 증세의 호전에 중점을 두고 있다. 염증으로 발병하는 질병 중의 하나인 암은 다른 질병에 비하여 그 연구가 매우 활발하게 이루어져 왔고, 이를 표적으로 하여 진단 및 치료하는 방법이 다양하게 개발되어 왔다. 예컨대, 생체 외에서 생체 내의 암 크기와 분포 및 전이 정도를 측정할 수 있는 방법으로서, 방사성 동위 원소를 이용한 침습적 방법이 많이 이용되고 있으며, 최근에는 플로린-18 포도당 (18fluorine-D-glucose, 18-FDG)을 이용하여 양전자 방출 단층 촬영법 (PET, positron emission tomography)을 통한 진단 방법이 활발하게 연구되고 있다. 하지만 이런 방법들은 침습적인 방법인 것이 대부분으로, 방사선 동위 원소를 사용함으로써 생체 내 조직에 이차적인 손상을 유발시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
최근, 형광 물질을 사용하는 광학 영상법이 활발하게 연구되고 있으며, 주로 근적외선을 방출하는 형광체를 사용하여 작은 동물에서 적용되고 있다. 특히, 질병의 특수한 생리적 환경에서 민감하게 활성화되는 지능형 형광 조영제가 미국을 중심으로 하바드 의대에서 집중적으로 연구되고 있지만, 아직 전 세계적으로 연구하는 그룹은 극소수에 불과하다. 연구의 대부분은 생쥐와 같은 작은 동물 모델을 이용하여 질병을 진단하는 수준에 머물고 있으며, 질병의 진단과 치료를 동시에 달성하는 조영제형 약물 전달체는 아직 개발되지 않고 있다.
따라서, 질병의 진단 및 치료를 위한 조영제형 약물 전달체는 새로운 개념의 차세대형 제제이며, 특히, 전혀 개발된 바 없는 미셀로 된 조영제형 약물 전달체는 독창성을 확보할 수 있으므로 그 개발이 매우 시급하다고 할 수 있다.
본 발명은, 전술한 기존의 염증 관련 질병의 진단시의 문제점을 개선함과 동시에 새로운 진단 및 치료 기술을 개발하는 선도 기술을 확보하기 위한 것으로, 염증 부위 조직에 민감하게 반응하고, 특이적으로 결합하며, 신호를 발생시킬 수 있는 작용기를 사용하여, 염증 특이적인 고분자 유도체를 제조하고, 이를 약물 전달체, 진단제 및 진단과 약물 전달을 동시에 수행할 수 있는 조영제형 약물 전달체로서 사용하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 염증 부위 조직에 특이적인 고분자 유도체, 상기 고분자 유도체를 유효 성분으로 함유하는 약물 전달용 조성물, 상기 고분자 유도체를 유효 성분으로 함유하는 진단용 조성물, 상기 고분자 유도체를 유효 성분으로 함유하는 조영제형 약물 전달용 조성물 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 고분자 유도체는 소수성과 친수성의 균형을 통하여 자기 조립체(self-assembly) 또는 자기 응집체(self-aggregate)를 형성시킬 수 있는 것으로, 염증 조직에서 특이적으로 반응 및/또는 결합할 수 있기 때문에, 상기 질병에 대한 약물 전달체로서 사용 가능하고, 동시에, 검출 가능한 신호를 발생시키도록 할 수 있기 때문에, 염증 관련 질병을 영상화하고 동시에 치료하고, 치료 과정을 모니터링할 수 있는 조영제형 약물 전달체로서 사용 가능하다. 상기 염증 관련 질병은, 예컨대, 죽상 동맥 경화 또는 암일 수 있다.
본 발명은 생체 적합성 고분자에 다음의 작용기 중 한 가지 이상이 결합된 생체 적합성 고분자 유도체에 관한 것이다:
- 염증 부위의 생리학적 및/또는 병리학적 특성에 민감하게 반응할 수 있는 제1 작용기,
- 염증 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 작용기, 및
- 상기 제1 작용기 또는 상기 고분자 자체에 결합되어 생체 외에서 검출 가능한 신호를 발생시키는 제3 작용기.
상기 생체 적합성 고분자는 모든 생체 적합성 수용성 또는 생분해성 고분자일 수 있으며, 예컨대, 키토산(chitosan), 글리콜 키토산(glycolchitosan), 풀루란(pullulan), 덱스트란(dextran), 알지네이트 (alginate), 히아루론산 (hyaluronic acid), 헤파린(heparin), 콘드로이틴 황산염(chodroitin sulfate) 등을 포함하는 탄수화물 및 그의 화학적 유도체들; 인지질 (phospholipid) 및 그 유도체들; 폴리에틸렌글리콜(poly[ethylene glycol]), 폴리-L-락트산(poly[L-lactic acid]), 폴리-D,L-락트산(poly[D,L-lactic acid]), 폴리글리콜릭-락트산 공중합체(poly[glycol-co-lactic acid]), 폴리카프로락톤(poly[caprolactone]) 등을 포함하는 폴리에스테르(polyester) 및 이들 간의 공중합체; 폴리오르쏘에스테르 (polyorthoester), 폴리아미노산(poly[amino acid]), 폴리안하이드라이드(poly[anhydride]) 등을 포함하는 생분해성 고분자 및 그 공중합체; 폴리비닐알콜(poly[vinyl alcohol]), 폴리비닐피롤리돈(poly[vinylpyrrolidone]), 폴리아크릴산(poly[acrylic acid]), 폴리메타크릴산(poly[methacrylic acid]), 폴리메틸메타크릴산(poly[methylmethacrylic acid]), 폴리헤마(poly[HEMA]), 폴리-N-이소프로필아크릴아미드(poly[N- isopropylacrylamide]) 등을 포함하는 약물 제제에 사용되는 고분자; 폴리피롤(poly[pyrrole]), 폴리아닐린(poly[anilin]) 등을 포함하는 전도성 고분자; 및 폴리스티렌(poly[styrene]), 폴리다이비닐벤젠(poly(divinylbenzene]) 등을 포함하는 방향족 탄화수소로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 생체 적합성 고분자는 소수성 고분자와 친수성 고분자와의 양친성 블록 공중합체 형태인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 생체 적합성이 뛰어나고 생분해성을 갖는 동시에 분해된 산물이 생체 내에 존재하는 무해한 단량체인 폴리카프로락톤, 폴리-L-락트산 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군 중에서 선택된 두 가지 고분자로 구성된 양친성 블록 공중합체가 특히, 바람직하다. 특히, 상기 양친성 (소수성 및 친수성) 블록의 분자량은 1000 내지 5000 정도인 것이 미셀형의 입자 형성을 자유롭게 하고, 안정성을 증진시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 상기 고분자 중, 글리콜 키토산과 풀루란은 분자량이 약 20 내지 25 만인 것이 상용화되어 구입하기 쉽고 물에 매우 잘 녹으며 생체 적합성이 좋기 때문에 바람직하고, 특히, 글리콜 키토산의 경우, 탈아세틸화도가 약 80 ~ 90%인 것이 상용화되어 구입하기 좋으므로 바람직하다.
또는, 상기 생체 적합성 고분자는 수용성 고분자에 디옥시콜린산(deoxycholic acid), 타우로디옥시콜린산(taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산(taurocholic acid), 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid), 타우로케노디옥시콜린산(taurochenodeoxycholic acid) 등을 포함하는 담즙산 유도체; 발린(valine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 메티오닌 (methionine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 히스티딘(histidine) 등을 포함하는 소수성 아미노산; 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxolubicin) 등을 포함하는 항암제; 풀루오레신(fluorescein), 테트라메틸로드아민(tetramethylrhodamine), 보디피(BODIPY), 알렉사(Alexa) 등을 포함하는 소수성 형광체 및 이들의 유도체들로 이루어진 군 중에서 선택된 소수성 블록이 도입되어 양친성을 나타내는 것일 수도 있다.
상기 제1 작용기는 염증 부위의 생리학적 및/또는 병리학적 특성에 민감하게 반응할 수 있는 물질로서, 질병 부위에 특이적으로 많이 존재하는 효소에 의하여 분해되는 펩티드 기질; 질병 부위에서 특이적으로 산화-환원 반응이 일어날 수 있는 화합물; 질병 부위에서 특이적으로 전도성을 가질 수 있는 화합물; pH에 민감한 화합물; 질병 부위에서 특이적으로 이온화 정도가 변하는 화합물; 및 질병 부위에서 특이적으로 대사되는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 상기 질병 부위에 특이적으로 많이 존재하는 효소에 의하여 분해되는 펩티드 기질은, 예컨대, MMP (matrixmetalloproteinase), 트롬빈(thrombin), 퓨린(furin), 헤파리나제(heparinase) 등에 의하여 분해되는 모든 종류의 펩티드 기질일 수 있으며; 상기 질병 부위에서 특이적으로 산화-환원 반응을 일으킬 수 있는 화합물은, 예컨대, 글루타치온(glutathione), 시스테인(cysteine) 및 리폰산(lipoic acid) 등과 같은 티올류 화합물일 수 있으며; 상기 질병 부위에서 특이적으로 전도성을 가질 수 있는 화합물은, 예컨대, 폴리피롤(poly[pyrrole]) 및 폴리헴(poly[heme]) 등의 화합물일 수 있으며; 상기 pH에 민감한 화합물은, 예컨대, 설폰아미드 (sulfonamide), 폴리히스티딘(poly(histidine]) 및 폴리아크릴산(poly[acrylic acid)] 등의 화합물일 수 있다.
특히, 본 발명에 있어서, 상기 제1 작용기는 질병 부위에 특이적으로 많이 존재하는 효소에 의하여 분해되는 펩티드 기질인 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 제1 작용기는 MMP-2에 의하여 분해되는 Leu-Ser-Arg-Leu-Thr-Ala(LSRLTA) (서열번호: 1)를 갖는 모든 종류의 펩티드 유도체; MMP-9에 의해 분해되는 Leu-Arg-Tyr-Tyr-Thr-Ala(LRYYTA) (서열번호: 2)를 갖는 모든 종류의 펩티드 유도체; 트롬빈에 의해 분해되는 Phe-Val-Arg-Ser(PVRS) (서열번호: 3)를 갖는 모든 종류의 펩티드 유도체; 및 퓨린에 의해 분해되는 Arg-Arg-Lys-Arg(RRKR) (서열번호: 4)을 갖는 모든 종류의 펩티드 유도체로 이루어진 군 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
상기 제2 작용기는, 염증 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 표적 인자로서, 목적하는 생체 조직 또는 세포에 따라서 달라지며, 바람직하게는, 세포 표면의 수용체에 상응하는 리간드, 항체, 세포 침투성 펩티드, 콜레스테롤, 지방산, 혈관 결합 펩티드 또는 이들의 유도체일 수 있다. 본 발명의 한 구체예에 있어서, 상기 목적하는 생체 조직 또는 세포는 주변의 신생 혈관을 포함하는 동맥경화 또는 암 조직 또는 그 세포들이고, 제2 작용기는 아미노산 서열 Arg-Gly-Asp(RGD) (서열번호: 5)를 포함하는 환형 혈관 결합 펩티드 또는 Arg-Lys-Arg-Leu-Glu-Ala-Arg-Asn-Cys(RKRLDARNC) (서열번호: 6)를 포함하는 환형 펩티드일 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 제2 작용기는 엽산(folate), 비오틴(biotin), 트랜스페린 (transferrin) 등과 같이 세포에 존재하는 수용체와 결합할 수 있는 리간드; 세포 표면의 항원에 반응하거나 염증 부위에 존재하는 단백질 및/또는 효소들과 결합할 수 있는 항체들; TAT(transactivator of transcription), 폴리알지닌 (poly[arginine])등과 같은 세포 침투성 펩티드; 콜레스테롤 및 그 유도체; 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine)을 포함하는 인지질 및 유도체들; 지방산 및 그 유도체들; 혈관 내피 세포에 결합할 수 있는 시아릴 루이스 엑스(Sialyl Lewis X) 및 그 유도체들로 된 군 중에서 선택된 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 제2 작용기는 환형 RGD (서열번호: 5) 또는 환형 RKRLDARNC (서열번호 6)가 바람직하다.
제3 작용기는, 상기 제1 작용기 또는 상기 생체 적합성 고분자 자체에 결합하여 생체내(in vivo) 및 생체외(in vitro)에서 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 물질로서, 바람직하게는, 형광체 또는 방사성 동위 원소일 수 있다. 상기 형광체는 모든 종류의 유기 또는 무기 형광체일 수 있고, 형광 공명 에너지 전이(FRET, fluorescence resonance energy transfer)가 발생하는 형광체 또는 소광 효과(quenching effect)를 발생시키는 형광체를 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 적색 또는 근적외선의 빛을 발광하며 양자 거듭율(quantum yield)이 높은 형광체를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 제1 작용기가 효소에 의하여 가수 분해되는 펩티드 기질인 경우, 상기 펩티드 기질의 효소 특이적 가수 분해에 의하여 상기 제3 작용기의 생체내 및 생체외에서의 광학적 신호가 발생하게 된다 (실시예 6-1 및 도 8 내지 14 참조).
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 제3 작용기는 시아닌(cyanine) 계, 로드아민계(rhodamine-based), 플루오레신계(fluorescein-based), 도피계(dopi-based), 보디피계(BODIPY-based), 알렉사계(Alexa-based) 및 벤젠(benzene) 환이 두 개 이상 치환된 구조의 모든 유도체 등의 유기 형광체; 금, 카드뮴 셀렌(CdSe), 카드뮴 텔루르(CdTe) 등의 무기 교질 입자 또는 양자점(quantum dot); 및 그의 화학적 유도체들일 수 있다.
상기 형광체 중에서, 시아닌계는, 근적외선 빛을 방출 및 흡수하므로 생체 내 조직과 세포 및 분자들과의 간섭 또는 흡수가 적기 때문에, 본 발명에 따른 제3 작용기로서 사용하기에 유리하다. 또한, 테트라메틸로드아민과 플루오레신은, 서로 공명 에너지 전이(resonance energy transfer)가 발생하기 때문에, 본 발명에 따른 제3 작용기로서 사용하기에 유리하다. 예컨대, 플루오레신의 발광 파장대는 테트라메틸로드아민의 여기 파장대와 겹쳐있기 때문에, 플루오레신에 대한 여기 파장을 제공하면 발생하는 플루오레신의 발광 파장이 근접해 있는 테트라메틸로드아민의 여기 파장으로 사용되어, 결국 테트라메틸로드아민도 동시에 발광할 수 있게 된다. 특히, 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 보디피 등은 각 분자들이 서로 근접하였을 때 광소광(photo-quenching) 효과가 발생하므로, 본 발명에 따른 제3 작용기로서 사용하기에 바람직하다.
보다 구체적으로, 본 발명은,
- 생체 적합성 고분자 및
- 질병 부의에 특이적으로 많이 존재하는 효소에 의하여 분해되는 펩티드 기 질, 질병 부위에서만 산화-환원 반응이 특이적으로 일어날 수 있는 화합물, 질병 부위에서 특이적으로 전도성을 가질 수 있는 화합물, pH에 민감한 화합물, 질병 부위에서 특이적으로 이온화 정도가 변하는 화합물 및 질병 부위에서 특이적으로 대사되는 화합물 중에서 선택된 염증 부위의 생리학적 및/또는 병리학적 특성에 민감하게 반응할 수 있는 제1 작용기를 갖는 생체 적합성 양친성 고분자 유도체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 질병은 염증이 발현된 죽상동맥경화 또는 암일 수 있으며, 상기 질병 부위는 염증이 발현된 죽상 동맥 경화 조직 또는 암 조직일 수 있다. 상기 생체 적합성 고분자와 제1 작용기는 상기한 바와 같다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 생체 적합성 양친성 고분자 유도체는 하기 화학식 1을 갖는 고분자일 수 있다:
상기 식 중, A는 엡실론-카프로락톤이고, B는 제1 작용기로서 MMP-2, MMP-9, 트롬빈 또는 퓨린에 의해 특이적으로 분해될 수 있는 펩티드 서열이고, C는 에틸렌글리콜이고;
a는 8 내지 43의 정수, b는 1 내지 5의 정수, c는 22 내지 113의 정수이다.
또한, 본 발명은,
- 생체 적합성 고분자;
- 질병 부위에 특이적으로 많이 존재하는 효소에 의하여 분해되는 펩티드 기질, 질병 부위에서 특이적으로 산화-환원 반응이 일어날 수 있는 화합물, 질병 부위에서 특이적으로 전도성을 가질 수 있는 화합물, pH에 민감한 화합물, 질병 부위에서 특이적으로 이온화 정도가 변하는 화합물 및 질병 부위에서 특이적으로 대사되는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된, 염증 부위의 생리학적 및/또는 병리학적 특성에 민감하게 반응할 수 있는 제1 작용기; 및
- 생체 내 특정 조직에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드, 혈관 결합 펩티드, 세포 표면의 항원에 반응하거나 염증 부위에 존재하는 단백질 및/또는 효소들과 결합할 수 있는 항체, 세포 침투성 펩티드, 콜레스테롤 및 그 유도체, 인지질 및 유도체들, 지방산 및 그 유도체들 및 혈관 내피 세포에 결합할 수 있는 시아릴 루이스 엑스(Sialyl Lewis X) 및 그 유도체들로 이루어진 군에서 선택된 제2 작용기를 갖는 생체 적합성 양친성 고분자 유도체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 질병은 염증이 발현된 죽상동맥경화 또는 암일 수 있으며, 상기 질병 부위 또는 생체내 특정 조직은 염증이 발현된 죽상 동맥 경화 조직 또는 암 조직일 수 있다. 상기 생체 적합성 고분자, 제1 작용기 및 제2 작용기는 상기한 바와 같다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자 유도체는 하기 화학식 2를 갖는 고분자일 수 있다:
상기 식 중, A는 엡실론-카프로락톤이고, B는 제1 작용기로서 MMP-2, MMP-9, 트롬빈 또는 퓨린에 의하여 특이적으로 분해될 수 있는 펩티드 서열이고, C는 에틸렌글리콜이고, D는 제 2 작용기로서 환형 RGD 펩티드(서열 번호: 5) 또는 환형 RKRLDARNC 펩티드(서열 번호: 6)이고;
a는 8 내지 43 사이의 정수, b는 1 내지 5 사이의 정수, c는 22 내지 113 사이의 정수이다.
또한, 본 발명은,
- 생체 적합성 고분자;
- 질병 부위에 특이적으로 많이 존재하는 효소에 의하여 분해되는 펩티드 기질, 질병 부위에서 특이적으로 산화-환원 반응이 일어날 수 있는 화합물, 질병 부위에서 특이적으로 전도성을 가질 수 있는 화합물, pH에 민감한 화합물, 질병 부위에서 특이적으로 이온화 정도가 변하는 화합물 및 질병 부위에서 특이적으로 대사되는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된, 염증 부위의 생리학적 및/또는 병리학적 특성에 민감하게 반응할 수 있는 제1 작용기; 및
- 상기 제1 작용기 또는 상기 고분자 자체에 결합되어 생체 외에서 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 제3 작용기를 갖는 생체 적합성 양친성 고분자 유도체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 질병은 염증이 발현된 죽상동맥경화 또는 암일 수 있으며, 상기 질병 부위는 염증이 발현된 죽상 동맥 경화 조직 또는 암 조직일 수 있다. 상기 생체 적합성 고분자, 제1 작용기 및 제2 작용기는 상기한 바와 같다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자 유도체는 하기 화학식 3을 갖는 고분자일 수 있다:
상기 식 중, A는 엡실론-카프로락톤이고, B는 제1 작용기로서 MMP-2, MMP-9, 트롬빈 또는 퓨린에 의해 특이적으로 분해가 가능한 펩티드 서열이고, C는 에틸렌글리콜이고, E와 F는 제3 작용기로서 각각 플루오레신 또는 테트라메틸로드아민 중 어느 하나이거나 또는 상기 E와 F 중 어느 하나가 이들 두 가지 모두이고;
a는 8 내지 43 사이의 정수, b는 1 내지 5 사이의 정수, c는 22 내지 113 사이의 정수이다.
또, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자 유도체는 하기 화학식 4을 갖는 고분자일 수 있다:
상기 식 중, A는 엡실론-카프로락톤이고, B는 제1 작용기로서 MMP-2, MMP-9, 트롬빈 또는 퓨린에 의하여 특이적으로 분해될 수 있는 펩티드 서열이고, C는 에틸렌글리콜이고, E와 F는 제3 작용기로서 각각 플루오레신 또는 테트라메틸로드아민 중 어느 하나이거나, 또는 E와 F 중 어느 하나가 상기 두 가지 모두이고, G는 제3 작용기로서 시아닌5.5. 또는 테트라메틸로드아민 중 선택된 것이고;
a는 8 내지 43 사이의 정수, b는 1 내지 5 사이의 정수, c는 22 내지 113 사이의 정수이다.
또한, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자 유도체는 하기 화학식 5을 갖는 고분자일 수 있다:
상기 식 중, A는 엡실론-카프로락톤이고, B는 제1 작용기로서 MMP-2, MMP-9, 트롬빈 또는 퓨린에 의해 특이적으로 분해가 가능한 펩티드 서열이고, C는 에틸렌글리콜이고, E는 제3 작용기로서 각각 플루오레신 또는 테트라메틸로드아민 중 어느 하나이거나, 상기 두 가지 모두이고, G는 제3 작용기로서 시아닌5.5 또는 테트라메틸로드아민이고;
a는 8 내지 43 사이의 정수, b는 1 내지 5 사이의 정수, c는 22 내지 113 사이의 정수이다.
또한, 본 발명은,
- 생체 적합성 고분자;
- 질병 부위에 특이적으로 많이 존재하는 효소에 의하여 분해되는 펩티드 기질, 질병 부위에서 특이적으로 산화-환원 반응이 일어날 수 있는 화합물, 질병 부위에서 특이적으로 전도성을 가질 수 있는 화합물, pH에 민감한 화합물, 질병 부위에서 특이적으로 이온화 정도가 변하는 화합물 및 질병 부위에서 특이적으로 대사되는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된, 염증 부위의 생리학적 및/또는 병리학적 특성에 민감하게 반응할 수 있는 제1 작용기;
- 생체 내 특정 조직에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드, 혈관 결합 펩티드, 세포 표면의 항원에 반응하거나 염증 부위에 존재하는 단백질 및/또는 효소들과 결합할 수 있는 항체, 세포 침투성 펩티드, 콜레스테롤 및 그 유도체, 인지질 및 유도체들, 지방산 및 그 유도체들 및 혈관 내피 세포에 결합할 수 있는 시아릴 루이스 엑스(Sialyl Lewis X) 및 그 유도체들로 이루어진 군에서 선택된 제2 작용기; 및
- 상기 제1 작용기 또는 상기 고분자 자체에 결합되어 생체 외에서 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 제3 작용기를 갖는 생체 적합성 양친성 고분자 유도체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 질병은 염증이 발현된 죽상동맥 경화 또는 암일 수 있으며, 상기 질병 부위 또는 생체내 특정 조직은 염증이 발현된 죽상 동맥 경화 조직 또는 암 조직일 수 있다. 상기 생체 적합성 고분자, 제1 작용기 및 제2 작용기는 상기한 바와 같다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자 유도체는 하기 화학식 6을 갖는 고분자일 수 있다:
상기 식 중, A는 엡실론-카프로락톤이고, B는 제1 작용기로서 MMP-2, MMP-9, 트롬빈 또는 퓨린에 의하여 특이적으로 분해될 수 있는 펩티드 서열이고, C는 에틸렌글리콜이고, D는 제 2 작용기로서 환형 RGD 펩티드(서열 번호: 5) 또는 환형 RKRLDARNC 펩티드(서열 번호: 6)이고, E와 F는 제 3 작용기로서 각각 플루오레신 또는 테트라메틸로드아민 중 어느 하나이거나 또는 E와 F 중 어느 하나가 상기 두 가지 모두이고;
a는 8 내지 43 사이의 정수, b는 1 내지 5 사이의 정수, c는 22 내지 113 사이의 정수이다.
또, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자 유도체는 하기의 화학식 7을 갖는 고분자일 수 있다:
상기 식 중, A는 엡실론-카프로락톤이고, B는 제1 작용기로서 MMP-2, MMP-9, 트롬빈 또는 퓨린에 의하여 특이적으로 분해될 수 있는 펩티드 서열이고, C는 에틸렌글리콜이고, D는 제 2 작용기로서 환형 RGD 펩티드(서열 번호: 5) 또는 환형 RKRLDARNC 펩티드 (서열 번호: 6)이고, E와 F는 제3 작용기로서 각각 플루오레신 또는 테트라메틸로드아민 중 어느 하나이거나 또는 E와 F는 중 어느 하나가 상기 두 가지 모두이고, G는 제3 작용기로서 시아닌5.5. 또는 테트라메틸로드아민이고;
a는 8 내지 43 사이의 정수, b는 1 내지 5 사이의 정수, c는 22 내지 113 사이의 정수이다.
또한, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자 유도체는 하기의 화학식 8을 갖는 고분자일 수 있다:
상기 식 중, A는 엡실론-카프로락톤이고, B는 제1 작용기로서 MMP-2, MMP-9, 트롬빈 또는 퓨린에 의하여 특이적으로 분해될 수 있는 펩티드 서열이고, C는 에틸렌글리콜이고, D는 제2 작용기로서 환형 RGD 펩티드(서열 번호: 5) 또는 환형 RKRLDARNC 펩티드(서열 번호: 6)이고, E는 제3 작용기로서 플루오레신 또는 테트라메틸로드아민 중 어느 하나 또는 이들 모두이고, G는 제 3 작용기로서 시아닌5.5 또는 테트라메틸로드아민이고;
a는 8 내지 43 사이의 정수, b는 1 내지 5 사이의 정수, c는 22 내지 113 사이의 정수이다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 생체 적합성 고분자에 제1 작용기와 제2 작용기 및/또는 제3 작용기를 결합시켜서 본 발명에 따른 생체 적합성 양친성 고분자 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 용매 증발법, 삼투법, 용매 교환법, 용매 여과법, 침전법, 초임계법 등을 사용하여 수행할 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 생체 적합성 고분자 유도체는 자기 조립형(self-assembly) 미셀 또는 자기 응집체(self-aggregation) 형태를 가지며, 평균 입경은 수 십 나노미터에서 수백 나노미터 범위를 갖는다. 본 발명의 고분자 유도체는 생체 적합성이 우수하고 생체내 및 생체외에서의 분해도를 조절할 수 있으며, 수 시간 내지 주 일 동안 체내에서 순환할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 생체 적합성 고분자 유도체는 생체내 특정 조직 또는 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 표적 인자로서의 제2 작용기를 함유하는 경우에는 능동적으로 특정 조직 또는 세포에 결합하고 (능동적 표적화), 이러한 표적 인자를 함유하지 않는 경우에도 염증이 발생한 조직에서의 빠른 혈관 생성에 의하여 생성된 혈관벽의 구멍을 통하여 생체내 및 생체외 축적(수동적 표적화)이 가능한 증진된 투과력과 유지력을 갖는다. 상기와 같은 투과력을 갖기 위해서, 본 발명의 고분자 유도체는 300 nm 이하의 평균 입경 을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 한 구체예에 따른 생체 적합성 고분자 유도체 및 이의 미셀 형성 모습을 도 1에 나타내었다. 도 1은 생체 적합성 고분자로서 (소수성) 생분해성 고분자와 수용성 고분자가 제1 작용기로서 특정 효소에 의하여 분해되는 기질 펩티드로 연결되어 양친성 블록을 형성하고, 상기 기질 펩티드에 제3 작용기로서 형광 물질 또는 방사성 동위 원소가 결합되어 있으며, 상기 수용성 고분자의 제1 작용기와 결합한 반대편 말단에는 제2 작용기로서 표적 인자가 결합되어 있는 본 발명의 생체 적합성 고분자 유도체를 보여준다. 상기 고분자 유도체에 소수성 약물을 첨가하면 자기 조립에 의하여 미셀이 형성된다. 따라서, 본 발명의 고분자 유도체는 소수성 약물을 봉입할 수 있다.
본 발명의 양친성 고분자 유도체는, 자기 조립에 의한 미셀 형성에 유리하도록 하기 위해서, 예커대, 증류수에서, 임계 미셀 형성 농도인 1 ㎍/mL 이상의 농도를 갖도록 제조되는 것이 바람직하다.
본 발명의 고분자 유도체는 상기와 같이 생체내 특정 조직 또는 세포에 표적 인자에 의한 능동 표적화 또는 빠른 혈관 형성으로 인하여 생성된 혈관벽의 구멍에서의 축적에 의한 수동적 표적화가 가능하여, 입자 형성, 표적화, 영상화, 치료 등의 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 고분자 유도체는 생체내(in vivo) 및 생체외(in vitro) 모두 적용 가능하며, 특히, 생체외 실험 또는 동물 실험에 있어서 다양한 용도로 사용 가능하다.
따라서, 본 발명은 상기한 바와 같은 생체 적합성 양친성 고분자 유도체를 함유하는 생체 조직 또는 세포 탐지용 조성물을 제공한다. 상기 조직 또는 세포는 염증이 발생한 조직 또는 세포이며, 보다 바람직하게는 죽상 동맥 경화 또는 암 조직이다.
본 발명의 고분자 유도체는 상기한 바와 같은 제1 작용기 및/또는 제2 작용기의 결합에 의하여 생체내 특정 조직 또는 세포, 특히, 염증 조직에 특이적으로 결합할 수 있고, 양친성이어서 소수성의 약물을 봉입한 미셀 구조의 형성이 가능하여, 소정의 약물을 봉입하여 봉입된 약물을 국부적으로 적용하데 사용 가능하다. 따라서, 본 발명은 소정의 약물과 상기 약물을 봉입한 상기와 같은 본 발명의 생체 적합성 양친성 고분자 유도체를 함유하는 약물 전달용 조성물을 제공한다. 상기 약물은 모든 소수성 염증 치료제일 수 있으며, 바람직하게는, 소수성의 죽상 동맥 경화 또는 암의 치료제이며, 보다 구체적으로는 독소루비신 또는 파클리탁셀 등의 항암제이다.
또한, 본 발명의 고분자 유도체는, 상기한 바와 같은 제3 작용기의 결합에 의하여, 상기한 바와 같은 표적 능동적 또는 수동적 표적화에 의한 질병 부위 (특히, 염증 조직) 특이적 결합 특성 이외에도, 생체내 및 생체외 신호 발생 특성을 갖기 때문에, 이를 실험 동물 모델 또는 인체에 주입시, 직접적이고 비침습적 방법으로 영상을 얻어 간편한 진단이 가능하고, 약물이 봉입된 경우 그 치료 과정을 용이하게 관찰할 수 있다는 이점을 갖는다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 본 발명의 생체 적합성 양친성 고분자 유도체를 함유하는 질병의 진단용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기와 같은 본 발명의 생체 적합성 양친성 고분자 유도체를 함유하여 질병의 진단 및 치료를 동시에 가능하고 치료 과정을 모니터링할 수 있도록 하는 조영제형 약물 전달용 조성물을 제공한다. 상기 질병은 염증 관련 질병이고, 바람직하게는 죽상 동맥 경화 또는 암이다.
이하, 아래의 실시예들에 의하여 본 발명의 보다 구체적으로 예시하겠지만, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 형광체가
결합된
펩티드를 갖는
양친성
블록 공중합체 제조
소수성 고분자로서 분자량 3000을 갖는 폴리카프로락톤, 친수성 고분자로서 분자량 5000을 갖는 폴리에틸렌글리콜, 제 1 작용기로서 MMP-2에 분해될 수 있는 펩티드 Lys-Gly-Gly-Leu-Ser-Arg-Leu-Thr-Ala-Gly-Gly-Cys (KGGLSRLTAGGC; 서열 번호: 7; 본 명세서에 있어서, “MMP2S”라 명명함), MMP-9에 의해 분해되는 Lys-Gly-Gly-Leu-Arg-Tyr-Tyr-Thr-Ala-Gly-Gly-Cys (KGGLRYYTAGGC; 서열 번호: 8; 본 명세서에 있어서, “MMP9S”라 명명함), 트롬빈에 의해 분해되는 Lys-Gly-Gly-Phe-Val-Arg-Ser-Gly-Gly-Cys (KGGPVRSGGC; 서열 번호: 9; 본 명세서에 있어서, “ThrS”라 명명함) 및 제 3 작용기로서 풀루오레신과 테트라메틸로드아민을 이용하여, 형광체가 결합된 펩티드를 갖는 양친성 블록 공중합체를 제조하였다. 얻어진 고분자는 HPLC를 이용하여 확인 및 정제하였다.
실시예
1-1. 형광체가
결합된
펩티드 제조
상기 펩티드는 고형상 합성(solid phase synthesis)방법에 따라 에프목 방법(Fmoc strategy)로 제조하였다. 제조된 각각의 펩티드 10 mg을 2 ml 디메틸포름아미드(DMF, dimethylformaide)에 완전히 녹인 후, 여기에 10 mg의 테트라메틸 로드아민 이소치오시아네이트(TRITC, trimethylrhodamine isothiocyanate)를 넣고 질소를 충전하여, 실온에서 하루 동안 반응시켰다. 반응 후, 플로오레신 말레이미드(fluorescein-maleimide) 10 mg을 넣고 질소를 충전하여, 다시 하루 동안 반응시켰다 (반응식 1). 반응이 끝난 후, 반응 용액을 디에틸에테르(diethyle ether)에 두 번 침전시키고, 얻어진 빨간 색의 침전물을 원심분리를 통하여 수거한 후, 진공 상태에서 건조하여, 형광체가 결합된 펩티드를 제조하였다. 하루 동안 반응시킨 반응 용액은 다시 디에틸에테르에 두 번 침전하고 노란 색의 불순물을 완전히 제거하였다. 진공에서 하루 동안 건조시키고, P2O5를 넣어 다시 3일 간 건조하여 수분을 제거한 뒤, -20 내지 -70 ℃에서 보관한다.
제조된 형광체가 결합된 펩티드는 HPLC를 통하여 확인하였고, 얻어진 형광체가 결합된 MMP2S, MMP9S 및 ThrS를 각각 MMP2S(TF), MMP9S(TF) 및 ThrS(TF)로 명명하였다. 상기 반응을 다음과 같은 반응식 1에 나타내었다.
실시예
1-2. 형광체가
결합된
펩티드와 폴리에틸렌 글리콜 결합체 제조
실시예 1-1에서 제조된, 형광체가 결합된 각각의 펩티드(ThrS[TF] 3 mg, MMP2S[TF] 3 mg, MMP9S[TF] 5 mg)를 1 mL의 무수 디메틸포름아미드에 완전히 녹인 후, 1 mg의 디시클로헥실카보디이미드(DCC, 1,3-dicyclohexylcarbodiimide)와 1 mg의 N-하이드록시숙신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide)를 넣었다. 얻어진 각각의 용액에 순서대로 7.665 mg(ThrS[TF]), 6.783 mg(MMP2S[TF]) 및 10.567 mg(MMP9S[TF])의 α-아미노-ω-메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG, α-amino-ω-methoxy poly[ethylene glycol])를 1 mL의 무수 디메틸포름아미드에 녹여서 넣고, 질소를 충진하여, 실온에서 하루 동안 반응시켰다 (반응식 2).
반응 후, 상기 반응 용액에 약 1.3 mL의 피페리딘(piperidine)을 넣어 최종 농도를 40 %로 맞추고, 실온에서 10 시간동안 반응시켰다. 과량의 디에틸에테르를 사용하여 반응 용액을 반복적으로 침전시켜, 불순물을 제거하고, 질소 기체로 한 시간 동안 건조한 뒤, 진공 하에서 P2O5와 함께 3일 동안 건조하여 수분을 완전히 제거하였다. 최종 산물은 사용 전까지 -20 내지 -70 ℃에서 보관하며, HPLC에 의하여 상기 형광체 결합된 펩티드에 폴리에틸렌글리콜이 결합된 것을 확인하였다.
MMP2S(TF), MMP9S(TF), ThrS(TF)에 폴리에틸렌글리콜이 결합된 유도체들은 각각 MMP2S(TF)-mPEG, MMP9S(TF)-mPEG, ThrS(TF)-mPEG로 명명하였다. 상기 반응을 하기의 반응식 2에 나타내었다.
실시예
1-3. 형광체가
결합된
펩티드를 갖는
양친성
블록 공중합체 제조
실시예 1-2에서 제조된 형광체를 갖는 펩티드와 폴리에틸렌글리콜과의 결합체(ThrS[TF]-mPEG 3.7 mg, MMP2S[TF]-mPEG 3.6 mg, MMP9S[TF]-mPEG 3.0 mg)를 각각 1 mL의 무수 디메틸포름아미드에 완전히 녹인 후, 여기에 1 μL의 무수 트리에틸아민(TEA, triethylamine)을 첨가하였다. 얻어진 각각의 용액에 차례로 63 μg, 59 μg, 48 μg의 N-하이드록시숙시닌이미드와 170 μg, 159 μg, 130 μg의 디시클로헥실카보디이미드를 넣어서 용해시켰다. 그리고 난 후, 얻어진 각각의 용액에 미리 제조된 폴리카프로락톤(PCL, poly[carprolactone], 분자량 5000 Da)을 각각 1.648 mg(ThrS[TF]-mPEG), 1.545 mg(MMP2S[TF]-mPEG), 1.260 mg(MMP9S[TF]-mPEG)의 양으로 넣어주어, 하기의 반응식 3과 같이 이틀 동안 실온에서 반응시켰다.
반응 후, 얻어진 용액을 과량의 디에틸에테르에 반복적으로 침전시키고, 진공 하에서 P2O5와 함께 건조한 뒤, -20 내지 -70 ℃에서 보관하였다. 얻어진 폴리카프로락톤과 MMP2(TF)-mPEG, MMP9(TF)-mPEG, ThrS(TF)-mPEG과의 결합체를 각각 PCL-MMP2(TF)-mPEG, PCL-MMP9(TF)-mPEG, PCL-ThrS(TF)-mPEG로 명명하였다. 상기 반응을 다음의 반응식 3에 나타내었다.
실시예
2. 제조된 고분자의 정제
실시예 1에서 제조된 형광체가 결합된 펩티드, 형광체를 갖는 펩티드와 폴리에틸렌글리콜의 결합체 및 형광체를 갖는 펩티드와 양친성 블록 공중합체와의 결합체는 RP-HPLC(reverse phase-high performance liquid chromatography, Shimazu HPLC System)를 통하여 정제하였다.
우선, 각각의 물질을 0.1 mg/mL의 농도로 디메틸포름아미드에 녹이고, 0.45 μm의 구멍을 갖는 필터에 통과시켜 여과한 뒤, RF C18 컬럼(Vydac)을 사용하여 유동상으로서 아세토니트릴(AcN)과 증류수의 농도 구배를 5:95에서 100:0까지의 범위로 조정하면서 각각의 화합물 및 불순물을 분리하였다. 이 때, 상기 유동상에 0.1%의 트리풀루오로아스트산(TFA, trifluoroacetic acid)을 첨가하여 존재하는 모든 이온들의 작용을 억제하였고, 광다이오드 어레이 검출기 (220 nm, 520 nm, 580 nm, Shimazu PD-M10A)를 통하여 각각의 펩티드 결합, 풀루오레신, 테트라메틸로드아민을 관찰하였다. 분리된 화합물들은 액체 질소로 얼려서 동결 건조하고, 다시 P2O5와 함께 진공에서 3일 동안 건조시켜서, 최종 산물을 얻었다.
실시예
3. 제조된 고분자의
미셀
형성 및 임계
미셀
농도 결정
실시예 1-3에서 제조되고 실시에 2에서 정제된, 형광체를 갖는 펩티드와 양친성 블록 공중합체와의 결합체를 10 mg/mL의 농도로 클로로포름에 분산시키고, 2 mL의 삼차 증류수에 각각 0.05, 0.075, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 25, 50, 75, 100 μg/mL의 농도가 되도록 희석한 후, 실온에서 하루 동안 교반 하여 클로로포름을 제거하였다. 얻어진 생성물을 1.2×10-9 mole의 피렌(pyrene)이 바닥에 얇게 깔려 있는 바이알에 넣고 다시 하루 동안 교반하였다. 각각의 용액은 형광 측정기(ISS K2 multifrequency phase fluorometer)를 사용하여 여기 파장은 200-400 nm, 발광 파장은 350-500 nm까지 스캔한 뒤, 최고 강도를 나타내는 파장에서의 비율과 로그 농도(LogC)와의 그래프를 그려 두 직선을 구하고, 그 교점을 임계 미셀 농도로 결정하였다.
실시예
4. 제조된 고분자
미셀의
입자도 확인
실시예 1-3에서 제조되고 실시예 2에서 정제된 고분자를 이용하여 실시예 3의 방법으로 증류수에 희석하여 50 μg/mL의 농도로 제조한 뒤, 0.45 μm 필터로 여과하여 광산란법 (Light Scattering, Brookhaven Instrument)으로 입자의 크기를 측정하였다.
도 2는 PCL-ThrS(TF)-mPEG에 대한 입자도로서, 평균 입자 크기가 약 80 nm임을 알 수 있으며, 도 3은 PCL-MMP2(TF)-mPEG에 대한 입자도로서, 평균 입자 크기가 약 67 nm임을 알 수 있으며, 도 4는 PCL-MMP9(TF)-mPEG에 대한 입자도로서, 평균 입자 크기가 약 66 nm임을 알 수 있다.
실시예
5. 제조된 고분자 및 고분자
미셀의
농도에 따른 광학적 특성
상기 실시예 4에서 제조된 용액 중, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100 μ g/mL의 농도의 용액을 플루오레신에 대하여 여기 파장은 400-500 nm, 발광 파장은 450-700 nm로 스캔하고, 테트라메틸로드아민에 대하여 여기 파장은 400-600 nm, 발광 파장은 550-700 nm로 스캔하였다.
도 5와 6은 PCL-ThrS(TF)-mPEG에 대한 플루오레신과 테트라메틸로드아민의 여기 파장(가)과 발광 파장(나)을 나타낸 것으로, PCL-MMP2(TF)-mPEG, PCL-MMP9(TF)-mPEG 및 PCL-ThrS(TF)-mPEG에 대하여 모두 비슷한 양상을 나타내기 때문에, 상기 PCL-ThrS(TF)-mPEG에 대한 그래프를 이들의 대표도로 사용하였고, 하기하는 모든 실시예에서도 상기 PCL-ThrS(TF)-mPEG를 대표도로서 사용하였다.
도 5에서 플루오레신의 여기 파장(가)은 486 nm에서 최대값을 갖고 농도에 따라 증가하지만, 농도가 100 μg/mL에 도달하면 오히려 감소하는 것을 볼 수 있었고, (나)의 발광 파장도 518 nm에서 최대값을 가지면서 농도가 증가함에 따라 형광 강도가 증가하지만, 100 μg/mL의 농도에서 다시 감소하였다. 특히 (나)에서는 테트라메틸로드아민의 최대 발광 파장인 579 nm의 파장에서 어느 정도 형광 강도를 나타내는 것으로 나타나, 두 형광체 사이에 에너지 전이 현상이 발생하고 있음을 알 수 있었다. 이러한 현상은 도 6의 테트라메틸로드아민의 여기 파장(가)에서 더욱 확실하게 나타났는데, 농도가 증가함에 따라 증가하던 여기 파장의 강도가 역시 100 μg/mL에서 약간의 변화를 나타내고, 특히, 테트라메틸로드아민의 최대 여기 파장인 543 nm 이외에도 플루오레신의 최대 여기 파장인 486 nm 근처에서 매우 강한 강도를 나타내었다. (나)에서 테트라메틸로드아민의 발광 파장은 농도가 증가함에 따라 그 형광 강도도 계속적으로 증가하고 있음을 보여주었다.
도 7은 도 5와 6에서의 플루오레신과 테트라메틸로드아민의 최대 여기 및 발광 파장의 비율을 농도에 따라 나열한 것으로, 형광 공명 에너지 전이 효율(FRET efficiency)은 플루오레신의 최대 발광 파장 580 nm에서의 강도를 플루오레신 발광 파장 518 nm에서의 강도로 나눈 FF, em580/FF, em518 값으로 나타냈으며, 형광공명 에너지 전이 지표(FRET index)는 테트라메틸로드아민 최대 발광 파장 580 nm에서의 강도를 테트라메틸로드아민 최대 여기 파장 543 nm에서의 강도로 나눈 FT, em580/FT, ex543 값, 플루오레신 최대 발광 파장 518 nm에서의 강도를 플루오레신 최대 여기 파장 486 nm에서의 나눈 FF,em518/FF,ex486 값 및 테트라메틸로드아민 최대 여기 파장 543 nm의 강도를 테트라메틸로드아민 최대 여기 파장 486 nm로 나눈 FT, ex543/FT, ex486 값으로 나타내었다. 전반적으로 형광 공명 에너지 전이 효율과 지표는 농도가 증가함에 따라 증가하였으며, 특히, 농도가 5-10 μg/mL인 범위 이후에서 그 증가율이 높아지는 것으로 나타났다.
실시예
6. 제조된 고분자 및 고분자
미셀의
효소 특이적 분해에 의한 광학적 특성 변화
상기 실시예 1-3에서 제조된 고분자 중, PCL-ThrS(TF)-mPEG를 대표로 실험을 하였으며, ThrS에 특이적으로 작용하는 효소인 트롬빈과 PCL에 대하여 분해능을 갖는 효소인 리파제(lipase)를 이용하여 고분자 농도 또는 효소 농도를 달리하여 시간에 따른 광학적 특성을 관찰하였다.
실시예
6-1. 제조된 고분자의 농도에 따른 효소 특이적 분해에 의한 광학적 특성 변화
상기 실시예 1-1에서 제조된 고분자를 실시예 4와 같은 방법으로 0.5 μg/mL과 50 μg/mL의 농도로 제조하였다. 여기에 트롬빈 10 U와 리파제 10 U 혹은 트롬빈과 리파제 각각 10 U을 동시에 넣어주고, 실시예 5와 같은 방법으로 시간에 따른 형광 강도를 측정하였다. 각각의 용액은 효소를 포함하여 총 2 mL씩 준비하였고, PBS(7.4)와 트롬빈 반응 용액 (20 mM Tris?HCl, 150 mM NaCl, 25 mM CaCl2)을 1:1로 섞어서 제조하였다. 제조된 용액은 37도의 온도하에서 빛을 차단하여 반응시켰다.
도 8은 50 μg/mL의 농도를 갖는 고분자 용액에 대한 플루오레신의 형광 변화를 관찰한 것으로, (가)는 어떤 효소도 사용되지 않은 경우로 시간에 따른 형광 변화가 관찰되지 않았으며, (다)는 리파제 10 U을 처리해 준 경우로, 이 또한 시간에 따른 형광 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 트롬빈 10 U을 처리해 준 경우 (나)와 트롬빈 10 U 및 리파제 10 U을 동시에 처리해 준 경우 (라)는 시간에 따른 형광의 변화가 급속히 관찰되었다. 이는, 트롬빈에 의해 제1 작용기인 트롬빈에 특이적으로 분해되는 펩티드가 가수분해되고, 차례로 제3 작용기인 플루오레신의 플루오레신 또는 테트라메틸로드아민에 대한 형광 공명 에너지 전이가 소실됨으로써 더 많은 형광을 나타내게 됨을 말해주는 것이다.
도 9는 50 μg/mL의 농도를 갖는 고분자 용액에 대한 테트라메틸로드아민의 형광 변화를 관찰한 것으로, 형광의 변화는 전반적으로 도 8의 플루오레신의 형광 변화와 비슷한 경향을 보였다. 효소를 사용하지 않은 경우 (가)와 리파제 10 U만 처리해 준 경우 (다)는 약간의 시간에 따른 형광 변화만이 관찰되는데 반하여 트롬빈 10 U를 처리해 준 경우 (나)와 트롬빈 및 리파제를 각각 10 U 씩 동시에 처리해 준 경우 (라)는 시간에 따른 여기 및 발광 형광의 강도가 급격히 변화하고, 시간이 지남에 따라 그 증가율은 서서히 감소하는 것으로 관찰되었다. 이는, 제조된 고분자의 제3 작용기 중 하나인 테트라메틸로드아민이 또 다른 제 3 작용기인 플루오레신의 발광 파장만을 흡수하는 것이 아니라 테트라메틸로드아민 자체로서 서로 형광 공명 에너지 전이가 발생하고 있다는 것, 즉, 광소광(photo-quenching) 효과가 매우 지배적으로 발생하고 있다는 것을 말해주는 것으로, 트롬빈에 의한 제1 작용기인 ThrS의 가수 분해가 이러한 광소광 효과를 상당히 제거해주는 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 동시에 테트라메틸로드아민의 최대 여기 파장인 556 nm 이외에도 플루오레신의 최대 여기 파장인 494 nm에서도 그 여기 에너지 강도가 변하는 것으로 보아, 테트라메틸로드아민은 트롬빈에 의한 ThrS의 분해에도 불구하고 계속적으로 플루오레신과 형광 공명 에너지 전이 현상이 이루어지고 있다는 것을 알 수 있다.
도 10은 50 μg/mL의 농도를 갖는 고분자 용액을 램프를 사용하여 빛에 노출시켰을 때의 사진으로, 대조군 (가)와 리파체 10 U을 처리해 준 경우 (다)는 트롬빈 10 U을 처리해 준 경우 (나)와 트롬빈과 리파제를 각각 10 U씩 처리해 준 경우 (라)에 비하여 약한 초록색만 발하고 비교적 투명하다는 것을 알 수 있다. (나)와 (라)에서는 트롬빈에 의하여 제1 작용기가 가수분해 됨으로써 제3 작용기들 중의 하나인 플루오레신의 발광이 크게 증가하였다.
도 11은 0.5 μg/mL의 농도를 갖는 고분자 용액에 대한 플루오레신의 형광 변화를 관찰한 것으로, 도 8과 전반적으로 비슷한 경향을 나타내었지만, 트롬빈 10 U와 리파제 10 U을 처리한 (라)의 경우가 트롬빈 10 U만을 처리한 (나)보다 더 높은 형광 강도의 변화를 나타내었다. 대조군 (가)와 리파제 10 U만을 처리한 (다)에 있어서는 시간이 지나도 큰 형광 강도의 변화가 관찰되지 않았다. 따라서, 제3 작용기들인 플루오레신과 테트라메틸로드아민 간의 형광 공명 에너지 전이 효과는 제1 작용기의 가수 분해에 의하여 감소한다는 사실을 알 수 있었다.
도 12는 0.5 μg/mL의 농도를 갖는 고분자 용액에 대한 테트라메틸로드아민의 형광 변화를 관찰한 것으로, 도 9와 전반적으로 비슷한 경향을 나타내었지만, 트롬빈 10U와 리파제 10 U을 동시에 처리해 준 (라)의 경우가 트롬빈 10U만을 처리해 준 (나)의 경우보다 더 높은 형광 강도의 변화를 나타내었고, 대조군(가)와 리파제 10 U만을 처리해준 (다)에서는 시간이 지나도 형광 강도의 변화는 미비하였다. 특히, 시간이 지남에 따라 테트라메틸로드아민의 최대 여기 파장인 580 nm에서의 강도가 494 nm에서의 강도보다 그 증가폭이 높은 것으로 관찰되어, 형광 공명 에너지 전이 현상이 제1 작용기인 ThrS의 가수분해에 의하여 약해지고 있음을 알 수 있었고, 동시에 테트라메틸로드아민의 발광 강도도 증가하는 것으로 보아 광소광 효과도 동시에 약해짐을 알 수 있었다.
도 13은 50 μg/mL과 0.5 μg/mL의 고분자 용액에 대한 도 8과 9 및 11과 12에서 플루오레신과 테트라메틸로드아민의 최대 발광 파장에서의 형광 강도(각각 FF, em520과 FT,em580)들의 변화를 시간에 따라 나타낸 것이다. (가)와 (나)에 있어서, 약 5 시간 경과한 후에는 더 이상의 형광 강도의 변화는 관찰되지 않았으며, 플루오레신은 최대 약 2.5 배 및 테트라메틸로드아민은 최대 약 3.5 배의 형광 강도 변화를 나타내었다. (다)와 (라)는 각각 0.5 μg/mL에서의 FF, em520과 FT, em580로서, 여기서도 역시 효소 처리 후 약 5 시간이 지나면 형광 강도의 변화가 사라졌으며, 이에 의하여 거의 모든 제1 작용기인 ThrS가 가수분해 되었음을 짐작할 수 있고, 플루오레신은 최대 약 2.5 배 및 테트라메틸로드아민은 최대 약 4 배의 형광 강도의 증가를 보였다.
특히, 저농도의 고분자 용액에서는 트롬빈만 처리한 경우보다 트롬빈과 리파제를 동시에 처리해 준 경우가 형광 강도의 증가율이 약간 더 높게 나타났는데, 이는 리파제에 의하여 폴리카프로락톤 소수성 고분자가 분해됨에 따라 소수성 상호작용이 약화되어 테트라메틸로드아민 간의 광소광 효과가 줄어들고 동시에 약간은 소수성을 나타내는 플루오레신도 서로 간의 광소광 효과가 줄어들었음을 나타내는 것이다. 이로써 저농도의 고분자 용액에서는 소수성인 폴리카프로락톤이 리파제에 의하여 분해될 수 있는 조건이 형성되었고, 도 8과 9에서 보이는 고농도의 고분자 용액에서는 폴리카프로락톤이 리파제에 분해될 수 없는 조건, 즉 미셀이 형성되어 있음을 간접적으로 알 수 있다. 또한, 도 8과 도 10에 나타난 트롬빈 처리에 의한 플루오레신의 형광 강도 변화로부터 또 다른 제3 작용기인 테트라메틸로드아민과의 형광 공명 에너지 전이 효과 이외에도 플루오레신 자체 사이의 광소광 효과가 존재 하고 있었음을 알 수 있다.
요컨대, 본 발명의 실시예에서 제조된 형광체를 갖는 펩티드와 양친성 블록 고분자와의 결합체는 플루오레신과 테트라메틸로드아민의 두 형광체를 모두 갖는 것으로, 각각의 형광체는 자체적으로 광소광 효과를 보이며, 두 형광체 사이에는 형광 공명 에너지 전이 효과가 존재하여, 임계 미셀 형성 농도 이상에서는 이러한 효과들이 복합되어 두 형광체 모두 발광 강도가 최소화되고 트롬빈에 의해 제 1 작용기인 펩티드가 가수분해 될 때, 이러한 효과들이 약화되어 발광 강도가 높아지며, 더불어 소수성 블록인 폴리카프로락톤이 분해되었을 때, 더 높은 형광을 발광할 수 있는 것이다.
도 14는 도 8과 9 및 도 10과 11에서 제시된 결과들에 대한 형광 공명 에너지 전이 효율(FF, em580/FF, em520)과 지표(FT, ex556/FT, ex494)를 나타낸 것이다. (가)의 50 μg/mL에서의 효율이 (다)의 0.5μg/mL의 효율보다 전반적으로 약간 높지만, 그 차이는 미비하다고 할 수 있으며, 트롬빈 처리 후의 시간에 따른 효율 변화도 미비하다고 할 수 있다. 따라서, 기존에 간편하게 사용되던 형광 공명 에너지 전이 효율을 얻는 방법이 본 발명에서는 크게 의미가 없음을 말해주고 있다. 대신, 형광 공명 에너지 전이 지표는 (나)의 50 μg/mL와 (라)의 0.5 μg/mL에서 모두 큰 폭의 변화를 보이고 있으며, 동시에, 트롬빈 처리 후 급속한 감소를 보임으로써, 본 발명에서 구성된 형광체들의 형광 공명 에너지 전이 효과를 표현하기에 적합하다는 것을 알 수 있다. 특히, (라)의 저농도에서 형광 공명 에너지 전이 효율과 지표의 변화 량이 (나)의 고농도에서의 변화량보다 크다는 것을 알 수 있는데, 이는 고농도에서는 고분자가 미셀의 형태로 존재하며 트롬빈 기질이 가수분해 되어도 자유롭게 돌아다니는 형광체가 또 다른 형광체를 만날 확률이 높기 때문에 광소광 효과와 에너지전이 효과가 완전히 소멸되지 않기 때문이다.
상기 살펴본 바와 같이, 본 발명의 고분자 유도체는 염증 특이적 효소에 의해 분해되는 펩티드 등의 작용기를 갖는 고분자가 소수성과 친수성의 균형에 의해 수십 나노미터 크기의 입자로 제조된 것으로, 형광체 등이 도입되어 효소 특이적으로 발광 강도가 강해지는 특징을 갖는다. 표적 인자를 갖지 않는 고분자 유도체는 수동적 표적 방법으로 생체 내 염증 부위의 느슨한 혈관에 많이 축적되어 증가된 광학적 신호를 발할 수 있으며, 표적 인자를 갖는 고분자 나노 입자는 생체 외 또는 생체 내에서 염증 특이적 세포에 많이 결합되어 죽상동맥경화나 암의 진단에 유용하게 사용될 수 있고, 소수성 약물이 봉입된 경우에는 치료의 목적을 동시에 달성할 수 있다.
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Claims (17)
- 생체 적합성 고분자 및 상기 생체 적합성 고분자에 결합된 염증 부위의 생리학적 또는 병리학적 특성에 민감하게 반응할 수 있는 제1 작용기 및 상기 제1 작용기 또는 상기 고분자 자체에 결합되어 생체내 또는 생체외에서 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 제3 작용기를 포함하는 생체 적합성 고분자 유도체로서,상기 생체 적합성 고분자는 폴리에틸렌 글리콘, 폴리-L-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리(글리콜-락트산) 공중합체; 폴리카프로락톤; 및 이들의 공중합체 중에서 선택되는 것이고,상기 제1작용기는 MMP (matrixmetalloprotein), 트롬빈 또는 퓨린에 의해 분해되는 펩티드 기질이며;상기 제3작용기는 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민 및 보디피로 구성된 군에서 선택되는 한 가지 이상의 형광체인 것인 생체 적합성 고분자 유도체.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자가 소수성 고분자와 친수성 고분자와의 양친성 블록 공중합체이며, 소수성 및 친수성의 양친성을 갖는 고분자 유도체.
- 제1항에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자가 폴리카프로락톤, 폴리-L-락트산 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군 중에서 선택된 두 가지 고분자로 구성된 양친성 블록 공중합체로서 분자량이 1000 내지 5000인 것인 고분자 유도체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 제1 작용기는 질병 부위에 존재하는 효소에 의하여 분해되는 펩티드 기질로서, MMP-2에 의하여 분해되는 Leu-Ser-Arg-Leu-Thr-Ala(LSRLTA)(서열 번호: 1)를 갖는 펩티드 유도체; MMP-9에 의해 분해되는 Leu-Arg-Tyr-Tyr-Thr-Ala(LRYYTA)(서열 번호: 2)를 갖는 펩티드 유도체; 트롬빈에 의해 분해되는 Phe-Val-Arg-Ser(PVRS)(서열 번호: 3)를 갖는 펩티드 유도체; 및 퓨린에 의해 분해되는 Arg-Arg-Lys-Arg(RRKR)(서열 번호: 4)을 갖는 펩티드 유도체로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 고분자 유도체.
- 제8항에 있어서, 상기 제1 작용기가 MMP-2에 분해될 수 있는 펩티드 Lys-Gly-Gly-Leu-Ser-Arg-Leu-Thr-Ala-Gly-Gly-Cys (KGGLSRLTAGGC; 서열 번호: 7), MMP-9에 의해 분해되는 Lys-Gly-Gly-Leu-Arg-Tyr-Tyr-Thr-Ala-Gly-Gly-Cys (KGGLRYYTAGGC; 서열 번호: 8) 및 트롬빈에 의해 분해되는 Lys-Gly-Gly-Phe-Val-Arg-Ser-Gly-Gly-Cys (KGGPVRSGGC; 서열 번호: 9)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 고분자 유도체.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 염증 관련 질병이 죽상 동맥 경화 또는 암인 고분자 유도체.
- 제1항에 있어서, 평균 입경 300 nm 이하의 입자 형태인 고분자 유도체.
- 제1항에 있어서, 증류수 내에서 임계 미셀 형성 농도인 1 내지 100㎍/㎖의 농도를 갖도록 제조되어 자기 조립에 의한 미셀 형성이 유리한 고분자 유도체.
- 제1항에 있어서, 다음의 화학식 3을 갖는 생체 적합성 고분자 유도체:[화학식 3]
상기 식 중, A는 엡실론-카프로락톤이고, B는 제1 작용기로서 MMP-2, MMP-9, 트롬빈 또는 퓨린에 의해 분해가 가능한 펩티드 서열이고, C는 에틸렌글리콜이고, E와 F는 제3 작용기로서 각각 플루오레신 또는 테트라메틸로드아민 중 어느 하나이거나 또는 상기 E와 F 중 어느 한 쪽이 이들 두 가지 모두이고;a는 8 내지 43 사이의 정수, b는 1 내지 5 사이의 정수, c는 22 내지 113 사이의 정수이다. - 제1항에 있어서, 다음의 화학식 4를 갖는 양친성 고분자 유도체:[화학식 4]
상기 식 중, A는 엡실론-카프로락톤이고, B는 제1 작용기로서 MMP-2, MMP-9, 트롬빈 또는 퓨린에 의해 분해가 가능한 펩티드 서열이고, C는 에틸렌글리콜이고, E와 F는 제3 작용기로서 각각 플루오레신 또는 테트라메틸로드아민 중 어느 하나이거나, 또는 E와 F 중 어느 한 쪽이 상기 두 가지 모두이고, G는 제3 작용기로서 시아닌5.5. 또는 테트라메틸로드아민 중 선택된 것이고;a는 8 내지 43 사이의 정수, b는 1 내지 5 사이의 정수, c는 22 내지 113 사이의 정수이다. - 제1항에 있어서, 다음의 화학식 5를 갖는 양친성 고분자 유도체:[화학식 5]
상기 식 중, A는 엡실론-카프로락톤이고, B는 제1 작용기로서 MMP-2, MMP-9, 트롬빈 또는 퓨린에 의해 분해가 가능한 펩티드 서열이고, C는 에틸렌글리콜이고, E는 제3 작용기로서 각각 플루오레신 또는 테트라메틸로드아민 중 어느 하나이거나, 상기 두 가지 모두이고, G는 제3 작용기로서 시아닌5.5 또는 테트라메틸로드아민이고;a는 8 내지 43 사이의 정수, b는 1 내지 5 사이의 정수, c는 22 내지 113 사이의 정수이다.
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