KR102389169B1 - 암 특이적 에피토프와 연결된 단백질 나노입자 및 이를 포함하는 암 면역치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 특이적 에피토프가 표면에 융합발현된 단백질 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 면역치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 암 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 표면에 암 특이적 에피토프가 융합발현되어 있는 단백질 나노입자와 이의 제조방법, 상기 단백질 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 면역치료용 조성물에 대한 것으로서, 본 발명에 따른 단백질 나노입자는 표면에 암 특이적 에피토프가 올바른 배향성을 갖고, 고집적으로 표출이 가능하며, 이를 유효성분으로 포함하는 암 면역치료용 조성물은 기존의 나노입자 기반 조성물에 비하여 암 면역 치료효과가 매우 뛰어나다.

Description

암 특이적 에피토프와 연결된 단백질 나노입자 및 이를 포함하는 암 면역치료용 조성물{Protein nanoparticle linked with cancer specific epitope and composition for cancer immunotherapy comprising it}
본 발명은 암 특이적 에피토프와 연결된 단백질 나노입자 및 이를 포함하는 암 면역치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물, 인간 훼리틴 중쇄 단백질에 암 특이적 에피토프가 표면에 융합발현되어 있는 단백질 나노입자와 제조방법 및 이를 포함하는 암 면연치료용 조성물에 대한 것으로서, 본 발명에 따른 단백질 나노입자를 포함한 암 면역치료용 조성물은 구조적으로 안정하며, 체내 독성이 전혀 없어 암 면역치료 요법에 매우 유용하다.
현대에 들어서 많은 질병들이 치료가 쉽게 가능하게 되었고, 치료가 불가능한 병은 거의 없어졌지만, 암은 다른 질병치료와는 달리 매우 힘들고 복잡한 치료가 요구되고 있으며, 그 복잡한 치료들 또한 완벽하게 효과적이지 못하다. 현재 암 치료에 사용되고 있는 방법은 크게 수술, 방사선 치료와 화학치료가 있다. 암에 걸리면 암을 제거하기 위하여 수술을 하게 되는데, 암이 멀리 퍼지지 않고 국소적으로만 있을 경우에는 수술로도 완치가 가능하다. 하지만 환자의 70%이상이 암 전이가 일어나는 경향이 있어서 보조 치료요법들이 병행된다. 보조 치료요법 중 하나인 방사선 치료는 고 에너지 방사선을 이용하여 암세포를 죽이는 치료법으로서 방사선을 암에 쪼일 경우, 암세포를 즉각 죽이지는 못하나 암세포가 증식하는 기능을 파괴하여 새로운 암세포가 생성되지 못하고 더 이상 분열하지 못하게 한다. 하지만 이 방법은 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 영향을 끼친다는 부작용이 존재한다. 화학치료는 수술 후에 약을 사용하여 암세포를 죽이는 보조 치료법으로서 눈에 보이지 않는 암세포를 죽이기 위해 시행한다. 하지만 화학요법 역시 화학요법을 시행하면 구토, 설사, 탈모 등의 부작용이 뒤따를 수 있다.
이러한 부작용들을 최소화 하고자, 최근 면역치료 방법이 대두되고 있다. 또한 앞서 언급했듯이 암 전이율은 전체환자의 70%가 넘기 때문에 전이암을 치료하는 것이 암을 완치하는 데에 있어서 필수적이라 볼 수 있고, 면역치료는 이러한 면에서 매우 효과적인 치료 방법이다.
면역치료는 환자 체내의 면역반응을 이용하여 암을 치료하는 방법이다. 이 면역치료 방법을 통하여 암의 예방까지도 꾀할 수 있다. 암 면역치료는 백신의 원리와 같이 암의 원인이 되는 항원을 투여하여 암에 특이적인 면역세포들을 활성화 시킨 후, 활성화된 면역세포들이 체내에서 암을 특이적으로 공격하게 하여 치료하는 방법이다. 또한, 암에 걸리지 않은 상태에서 암에 특이적인 항원을 몸 속에 투여하면, 활성화 되지 않았던 면역세포들이 암 특이적 기억면역세포로 활성화 되면서, 암에 걸렸을 시 암 세포를 특이적으로 공격하게 된다.
암 면역치료를 하기 위해서는 면역세포들이 밀집되어 있는 림프절로 암 특이적 항원을 운반하는 것이 중요하다. 또한 체내로 물질을 주입해야 하기 때문에, 체내의 독성을 고려해야 한다.
그러나, 암 특이적 항원 자체만을 림프절로 운반하려는 종래의 시도는 그다지 효과적이지 못했다. 짧은 암 특이적 항원 펩타이드의 길이 때문에 체내에서 강한 면역반응을 일으키지 못했기 때문이다(Xu, Z. et al., J. Control. Release Vol. 172, pp.259-265, 2011; Jewel, C. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vo. 108, 15745-15750, 2011).
또한, 암 특이적 항원의 체내 운반체로서 고분자들이 많이 사용되고 있는 상황이며, 항원의 체내 운반을 위해 고분자의 표면에 암 항원 고정시키는 경우, 입자 표면에 암 특이적 항원을 화학적 결합을 이용하여 노출시켜야 하는데, 이 때 고밀도로 균일하게 노출시키는 부분에서 한계점을 갖는다.
훼리틴(Ferritin)은 무거운 사슬과 가벼운 사슬로 구성된 24개의 동일한 단백질 서브유닛(subunit)으로 구성되며 생체내에서 중공 외피(hollow shell)를 형성한다. 철분과 결합하는 상기 단백질은 철 저장 기능을 가지며, 철 해독(iron detoxification) 기능을 한다(Harrison et al., Biochim Biophys Acta., 1275(3): 161-163, 1996). 상기 단백질은 대부분의 조직의 성장과 생존을 위해 세포 내의 철 균형을 유지하고, 세포 내의 철의 결합으로 인한 산소-자유 라디칼 형성을 최소화시키는 세포 보호 단백질로서 기능을 한다(Lawson et al., Nature, 349: 541-544, 1991). 훼리틴의 분자량은 약 500.000Da으로, 무거운 사슬(Heavy chain)과 가벼운 사슬(Light chain)로 구성되어 있고, 자가 조립 능력이 있어 구형 입자를 형성하는 독특한 특성을 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 암 특이적 항원을 효과적으로 림프절로 운반하려는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 암 특이적 에피토프를 융합한 인간 훼리틴 단백질 단량체를 암호화 하는 발현벡터를 설계, 제작하여 대장균 내에서 발현 할 경우, 암 특이적 에피토프가 단백질 나노입자 표면에 표출된 단백질 나노입자를 개발하고, 상기 단백질 나노입자가 기존의 나노입자들에 비하여, 림프절 타겟팅 능력 뿐만 아니라, 이로 인한 암 면역치료 효과가 탁월하다는 것을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 암 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간 훼리틴 중쇄 단백질에 질병마커 특이적 에피토프가 표면에 융합발현되어 있는 단백질 나노입자 및 상기 단백질 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 단백질 나노입자를 포함하는 암 면역치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 암 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 인간 훼리틴 중쇄 단백질에 암 특이적 에피토프가 표면에 융합발현되어 있는 단백질 나노입자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 훼리틴 단백질 나노입자의 표면에 암 특이적 에피토프가 표현되어 있는 단백질 나노입자를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 단백질 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는, 암 특이적 에피토프가 훼리틴 표면에 융합발현되어 있는 단백질 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 인간 훼리틴 중쇄 단백질에 암 특이적 에피토프가 표면에 융합발현되어 있는 단백질 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 면역치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 단백질 나노입자는 세포 내에서 자연 생합성되는 3차원 나노구조체로서 항상 정확한 4차 구조와 입자 topology를 유지하며 합성되고, 표면에 표출되는 항원성 에피토프의 방향성을 일정하게 유지시킬 수 있으며, 나노독성 문제가 없는 안전한 3차원 생체 나노입자로서 암 면역치료를 위하여 림프절에 높은 효율로 전달되는 장점이 있다.
본 발명에 따른 단백질 나노입자를 포함하는 암 면역치료용 조성물은 구조적으로 안정하고, 체내 독성 문제가 없으며, 기존의 나노입자 기반 면역치료요법에 비해 효과가 뛰어나므로, 암 면역치료에 유용하다.
도 1의 위 패널은 림프절 타겟팅과 백신 플랫폼에 기반한 암 면역치료를 위한 단백질 나노입자들에 대한 전체적인 모식도로서, e. coli DPS(이하 eDPS), human Ferritin heavy chain(이하 hFTN), T. acidopilum proteasome(이하 tPTS), Hepatitis B virus core antigen(이하 HBVC)를 이용하여 림프절 타켓팅 효율을 측정하여, hFTN이 가장 뛰어남을 밝히고, 이를 이용하여, 활성화된 면역세포가 암 세포를 공격하는 것을 나타낸 것이며, 아래 패널은 상기 4종류의 나노입자를 제작한 후, 관찰한 TEM 사진이다.
도 2는 후보 나노입자인 DPS, PTS, HBVC 및 hFTN을 C57BL/6 마우스에 주입한 뒤, 림프절 타겟팅을 한 시간 동안 관찰한 in vivo 근적외선 형광이미지이다.
도 3의 (A)는 긴 시간 동안 도 2와 같은 후보 나노입자들의 림프절 타겟팅을 관찰(1분, 1시간, 4시간, 6시간, 하루, 3일 및 6일)한 근적외선 형광이미지이고, (B)는 (A)의 형광 세기를 나타낸 그래프이다.
도 4의 (A)는 형광으로 label된 hFTN이 마우스의 림프절로 타겟팅 되는 것을 실시간으로 관찰한 사진이고, (B)는 상기 (A)의 림프절을 광학(왼쪽) 및 근적외선으로 촬영한 사진이다.
도 5의 (A)는 암 특이적 에피토프로서 RFP가 표면에 발현된 hFTN 나노입자의 모식도(왼쪽 위), 발현 벡터의 모식도(왼쪽 아래) 및 상기 벡터를 이용하여 대장균에서 합성한 나노입자의 TEM 사진 및 DLS로 측정한 나노입자의 크기를 나타낸 것이고(오른쪽), (B)는 상기 나노입자를 주입한 쥐의 림프절을 광학(왼쪽) 및 근적외선(오른쪽)으로 측정한 결과이다.
도 6의 (A)는 PBS, RFP, hFTN 및 HFTN-FRP를 vaccination 하는 스케줄(윗 패널) 및 최종 주입 후, RFP를 표현하는 B16F10 melanoma cell을 상기 마우스에 주입한 뒤, 암의 크기를 측정한 결과이고, (B)는 상기 (A)의 암 크기를 측정한 그래프이다.
도 7의 위 패널은 각 실험군 및 대조군 별 면역반응이 일어난 뒤 림프절을 관찰한 사진이고, 아래 패널은 상기 림프절을 측정한 그래프이다.
도 8의 (A)는 각 실험군 및 대조군별 B 세포와 T세포의 분포를 관찰한 이중 면역형광 이미지이고, (B)는 각 실험군 및 대조군별 림프절 내 B세포와 T세포의 분포도를 측정한 결과이다.
도 9의 (A)는 각 실험군 및 대조군별로 지라(spleen)에서 IFN-γ를 분비하는 CD8+T세포의 개수를 측정한 FACS 실험결과이고, (B)는 세포 수를 측정한 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 림프절에 암 특이적 에피토르를 효과적으로 전달할 수 있는 단백질 나노입자의 대량생산의 용이성, 균일한 입도 분포, 에피토프 밀도/구조/방향성 제어의 용이성 및 안정성을 확인하고, 이를 포함하는 암 면역치료용 조성물의 암 면역치료 효과를 확인하고자 하였다.
본 발명에서는 암 면역치료에 사용하기 위해 적당한 암 항원 운반체를 선택하기 위하여, 림프관을 통과하여 림프절에 전달 가능한 10-80nm사이의 크기를 지닌 e. coli DPS (이하 eDPS), human Ferritin heavy chain (이하 hFTN), T. acidopilum proteasome (이하 tPTS), Hepatitis B virus core antigen (이하 HBVC)를 이용하여 림프절 타켓팅을 수행하였다. 그 결과, hFTN이 면역세포인 B-cell의 TIM2-receptpor와 특이적으로 결합하여 림프절 타켓팅 능력이 다른 입자들에 비해 뛰어나다는 것을 확인하였고(도 1 내지 도 4), hFTN의 표면에 암 특이적 에피토프가 발현 되도록 제작한 나노입자가 림프절에 높은 효율로 전달된다는 것을 확인하였으며(도 5), 생체 내에서 암 특이적 에피토프를 표면에 표출한 hTFN 나노입자를 이용한 암 면역치료 요법에 의해, 종양의 크기가 감소하는 것을 확인하였다(도 6 내지 도 9).
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 암 특이적 에피토프가 나노입자 표면에 융합·발현되는 단백질 나노입자의 대량생산의 용이성, 균일한 입도 분포, 에피토프 밀도/구조/방향성 제어의 용이성 및 안정성을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명은 일 관점에서, 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 암 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
인간 훼리틴은 중쇄(heavy chain, 21kDa) 및 경쇄(light chain, 19kDa) 훼리틴 단량체 24개가 세포 내에서 4-3-2 symmetry 위상으로 자가조립(self-assembly)되어 만들어지는 단백질 나노입자인데, 인간 중쇄 훼리틴 단량체는 대장균 세포 내에서도 높은 발현율과 수용도로 생합성 되면서도 자가조립 특성에 의해 약 12nm 직경의 나노입자를 형성한다. 나노입자를 형성하고 있는 활성형의 인간 중쇄 훼리틴은 아미노 말단(N-term.)이 입자 외부로 표출되어 있고, 카르복실 말단(C-term.)은 외래 단백질 또는 펩타이드를 융합시킬 경우 입자 외부로 쉽게 표출될 수 있는 구조적 flexibility를 가지고 있기 때문에 검출 프로브 기능의 펩타이드 또는 단백질을 아미노- 또는 카르복실 말단에 유전자 재조합 기술을 이용하여 융합시키면 훼리틴 나노입자의 표면특성 개질을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, PL(λ) 프로모터, PR(λ) 프로모터, lac(TS) 프로모터, PSPA 프로모터, ibpfxs 프로모터, groES 프로모터, groEL 프로모터, clpB 프로모터, dnaK 프로모터 및 dnaJ 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 벡터는 인간 훼리틴 중쇄 단백질과 암 특이적 에피토프 사이에 링커 서열이 추가적으로 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커 서열은 에피토프에 유연성을 부여하여 단백질 나노입자 표면 표출성을 높이기 위한 서열이면 제한이 없으나, 바람직하게는 G3SG3TG3SG3인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 고형암인 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 피부암, 흑색종 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 흑색종인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암 특이적 에피토프는 생체 내 림프절에서 항원표지세포(Dendritic cells, DC)와 결합하여 DC를 APC(Antigen-Presenting Cells)로 활성화 시킬 수 있는 에피토프이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 melanoma B16F10 항원, gp100 peptide 및 Lymphoma cell line EL4 항원으로 구성된 군에서 선택되는 에피토프일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 표면에 암 특이적 에피토프가 융합발현되어 있는 단백질 나노입자에 대한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 기능성 단백질 나노입자는 직경이 10-40nm인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 고형암인 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 피부암, 흑색종 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 흑색종인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암 특이적 에피토프는 생체 내 림프절에서 항원표지세포(Dendritic cells, DC)와 결합하여 DC를 APC(Antigen-Presenting Cells)로 활성화 시킬 수 있는 에피토프이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 melanoma B16F10 항원, gp100 peptide 및 Lymphoma cell line EL4 항원으로 구성된 군에서 선택되는 에피토프일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 훼리틴 단백질 나노입자의 표면에 암 특이적 에피토프가 표현되어 있는 단백질 나노입자를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 단백질 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는, 암 특이적 에피토프가 훼리틴 표면에 융합발현되어 있는 단백질 나노입자의 제조방법에 대한 것이다. 상기 생산 방법은 미생물을 이용함으로 비용 면에서 효율적이며, 단백질 나노입자의 대량생산이 가능하게 한다.
또한, 본 발명의 단백질 나노입자는 프로모터의 세기를 달리하여, 둘 이상의 암 특이적 에피토프를 다양한 비율로 표면에 발현 시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 나노입자는 Strong 또는 Weak 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 암 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제1벡터;와 Strong 또는 Weak 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 암 특이적 에피토프 를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제2벡터(단, 제1벡터와 제2벡터의 프로모터와 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자는 상이함)가 도입되어 있는 재조합 미생물을 배양하여 표면에 서로 다른 암 특이적 에피토프가 발현되어 있는 단백질 나노입자를 생성시켜 회수하는 단계를 포함하는 단백질 나노입자의 제조방법으로 제조될 수 있다. 상기 예시의 Strong 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, PL(λ) 프로모터, PR(λ) 프로모터, lac(TS) 프로모터 및 PSPA 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, Weak 프로모터는 ibpfxs 프로모터, groES 프로모터, groEL 프로모터, clpB 프로모터, dnaK 프로모터 및 dnaJ 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 고형암인 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 피부암, 흑색종 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 흑색종인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암 특이적 에피토프는 생체 내 림프절에서 항원표지세포(Dendritic cells, DC)와 결합하여 DC를 APC(Antigen-Presenting Cells)로 활성화 시킬 수 있는 에피토프이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 melanoma B16F10 항원, gp100 peptide 및 Lymphoma cell line EL4 항원으로 구성된 군에서 선택되는 에피토프일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
서열번호 1: Candidate 1: KVPRNQDWL
서열번호 2: Candidate 2: EAQNTTYL
한편, 본 발명에서 제작한 단백질 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 면역치료용 조성물을 이용할 경우, 효과적으로 암 면역치료가 가능할 것으로 예측하였다.
즉, 본 발명의 다른 실시예에서는 PBS, RFP, hFTN 및 HFTN-FRP를 1주일 간격으로 3회 주입 후, RFP를 표현하는 B16F10 melanoma cell을 상기 마우스에 주입한 뒤, 암의 크기를 측정한 결과, hFTN-RFP를 주입한 쥐에서 흑색종의 크기가 획기적으로 감소하는 것을 확인하였고(도 4 A, B), 각 실험군 및 대조군에서의 면역반응을 관찰한 결과, hFTN-RFP를 주입한 군에서 면역반응이 가장 활발히 일어나는 것을 확인 하였다(도 4 C 내지 G).
따라서 본 발명은 다른 관점에서, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 표면에 암 특이적 에피토프가 융합발현되어 있는 단백질 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 면역치료용 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 상기 단백질 나노입자를 포함하는 암 면역치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 상기 단백질 나노입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 면역치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질 나노입자를 포함하는 암 면역치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 암 면역치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 암의 예방 또는 치료용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 치료 방법은 림프절에서 항원표지세포(DC)가 항원을 인식하여 APC로 활성화되고, 이로 인해 면역반응이 발생하는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 후보 단백질 나노입자의 합성을 위한 발현 벡터 제조
하기 표 1에 기재된 벡터 모식도에 따라 PCR을 통하여 단백질 나노입자 DPS, PTS, HBVC, hFTN, and hFTN-RFP를 제작하였다. 제작된 모든 플라즈미드 발현 벡터는 아가로스 젤에서 정제 한 다음, 완전한 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다.
이렇게 만들어진 PCR 산물을 순차적으로 pT7-7이나 pET28a 벡터에 삽입하여 각각의 단백질 나노입자를 발현 할 수 있는 발현 벡터를 구성하였다.
각각의 단백질 나노입자들의 발현용 벡터들은 pT7-DPS, pT7-PTSβ, pET28a-PTSα, pET28a-HBVC, pT7-FTN, pT7-FTN:RFP 로 진행하였다.
각 나노입자 별 발현 벡터 구성
단백질 나노입자 발현 벡터
DPS NH2-NdeI-(His)6-DPS-HindIII-COOH
PTS NH2-NdeI-PTSα-HindIII-COOH,
NH2-NdeI-PTSβ-(His)6-HindIII-COOH
HBVC NH2-NdeI-HBVC-HindIII-COOH
hFTN NH2-NdeI-(His)6-hFTN-HindIII-COOH
hFTN-RFP NH2-NdeI-(His)6-hFTN-XhoI-linker(G3SG3TG3SG3)-RFP-HindIII-COOH
실시예 2. 후보 단백질 나노입자의 생합성
대장균 균주 BL21(DE3)[F-ompThsdSB(rB-mB-)]를 상기 제조된 발현 벡터로 각각 형질 전환하고, 앰피실린-저항성 형질 전환체를 선택하였다. 형질 전환된 대장균을 50 mL의 Luria-Bertani (LB) 배지(100 mg L-1앰피실린 함유)를 함유하는 플라스크(250 mL Erlenmeyer flasks, 37 ℃, 150 rpm)에서 배양하였다. 배지 탁도(O.D600)가 약 0.5-0.7에 도달할 때, IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) (1.0 mM)을 주입하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. 20 ℃에서 16~18 시간 배양한 후, 배양한 대장균을 4,500 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체 침전물을 회수한 후 5 ㎖의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 초음파 파쇄기(Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액을 추후 실험에 이용하였다.
실시예 3. hFTN-RFP 단백질 나노입자의 정제 및 형광물질 부착
상기 실시예 2에서 획득한 상등액을 3단계의 과정을 거쳐 정제하였다. 먼저 1) 재조합 단백질에 융합 발현된 히스티딘과 니켈의 결합을 이용한 Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피를 진행한 후, 2) 재조합 단백질을 농축하고 버퍼 교환을 통하여 형광물질을 부착하였으며, 3) 마지막으로 형광물질이 부착된 자가 조립된 단백질 나노입자만을 분리하기 위하여 수크로스 구배 ultracentifugation을 진행하였다. 각 단계별 상세한 기재는 아래와 같다.
1) Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피
재조합 단백질을 정제하기 위하여 상기 명시된 동일한 방법으로 배양된 대장균을 회수하여 그 세포 펠렛을 5 mL 라이시스 버퍼(pH 8.0, 50 mMsodium phosphate,300 mM NaCl, 20 mM imidazole)에 재부유하고 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액만 분리한 후 각 재조합 단백질을 Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 각각 분리하였다 (세척 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate,300 mM NaCl, 80 mM imidazole / 용출 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300mM NaCl, 200 mM imidazole).
2) 농축과 버퍼교환 및 형광물질 부착과정
Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피를 거쳐 용출된 3ml의 재조합 단백질을 Ultracentrifugal filter (Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, MA) 에 담아 5,000 g로 컬럼 위에 1ml 의 용액이 남을 때까지 5,000 g 로 원심 분리를 진행하였다. 그 후에 NIR 형광 물질인 cy5.5를 부착하기 위하여 단백질 입자를sodium bicarbonate (0.1 M, pH 8.5) 버퍼로 버퍼교환을 해주었고, 상온에서 12시간 형광물질을 부착하였다.
3) 수크로스 구배 초고속 원심 분리
PBS(2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 2 mM KH2PO4,10mMNa2HPO4,pH7.4) 버퍼에 수크로스를 농도별로 각각 첨가하여 40%, 35%, 30%, 25%, 20%의 수크로스를 포함하는 용액을 각각 준비한 후 초고속 원심 분리용 튜브 (ultraclear 13.2ml tube, Beckman) 에 각 농도별 (45~20%) 수크로스 용액을 농도가 높은 용액부터 2 ml씩 담은 다음, 준비된 자가조립용 버퍼에 존재하는 재조합 단백질 용액을 1ml 채운 후 35,000rpm으로 16시간 동안 4°C 로 초고속 원심 분리를 시행하였다 (Ultracentrifuge L-90k, Beckman). 원심 분리 후 조심스럽게 파이펫을 이용하여 위 층 (20-25% 수크로스 용액 부분)을 2) 에 명시된 바와 같이 ultracentrifugal filter와 PBS 버퍼를 이용하여 재조합 단백질의 버퍼를 교체해 주었다.
실시예 4. 제조된 단백질 나노입자들을 이용한 NIR 이미지 분석
상기 실시예 3에서 제작한 5가지의 단백질 나노입자들을 형광도를 맞춘 후 5 주 된 누드 마우스에 주입하여 DPS, PTS, HBVC, hFTN중 어떤 물질이 가장 림프절에 타겟팅 효율이 좋은지 선별을 한 후, 실제로 hFTN-RFP 입자가 다른입자들에 비해 림프절 타켓팅 효율이 좋은지도 비교하였다. 각각의 입자를 20ul씩 쥐의 오른쪽 발에 주입을 하여 실험을 진행하였고, DPS, PTS, HBVC, hFTN 네 입자는 6일 동안 체내에서 입자들이 빠져나갈 때까지 타겟팅 양상을 Cy5.5 bandpass emission filate r 및 special C-mount lens 또는 IVIS spectrum imaging system(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)을 구비한 Kodak image station (4000MM; kodak, New Haven, CT)로 관찰한 결과, hFTN의 림프절 타겟팅 효율이 가장 높은 것을 확인 하였으며, hFTN-RFP입자가 RFP 항원만 주입했을 때 보다 림프절 타겟팅이 잘됨을 확인하였다(도 2 내지 도 4).
실시예 5. 단백질 입자의 조립 검증
실시예 3에서 제작한 각각의 단백질 나노입자의 정제된 재조합 단백질 나노입자의 구조 분석을 위하여 투과전자현미경 (TEM) 재조합 단백질을 촬영하였다. 먼저 염색하지 않은 정제한 단백질 샘플을 탄소 코팅된 구리 전자 현미경 그리드(grids) 올린 후 자연 건조하였다. 단백질 나노입자의 염색된 이미지를 얻기 위해, 자연 건조된 샘플을 포함하는 전자 현미경 그리드를 2% (w/v) 수성 우라닐 아세테이트 용액과 함께 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 증류수로 3-4회 세척하였다. 단백질 나노입자 이미지를 Philips Technai 120 kV 전자 현미경을 이용하여 관찰한 결과, 각각의 입자들이 구형 또는 원기둥 모양의 나노입자를 형성함을 확인 하였다(도 5 A).
실시예 6. 림프절 분석을 위한 조직 실험
실시예 1 내지 3의 방법으로 대조군인 PBS(버퍼)와 형광 물질을 뺀 RFP, hFTN 입자들과 hFTN-RFP를 제작한 다음 면역반응이 유도 가능한 C57BL/6마우스에 일주일 간격으로 3번 백신주입을 통하여 몸속의 면역세포들을 부스팅 한 후, 실제로 림프절 안의 면역세포들이 암을 괴사시키기에 가능한 T cell로 활성화 되었는지 하기와 같은 방법으로 확인 하였다.
먼저, 각 마우스의 림프절을 분리하여 관찰한 결과, hFTN-RFP가 주입된 마우스의 림프절 크기가 가장 큰 것을 확인하였고(도 7), 각 입자들을 주입한 마우스의 림프절 조직을 5um 두께의 슬라이드 글라스에 고정화 시킨 다음, monoclonal mouse anti human CD79α(1:200 diluted in PBS; DakoCytomation, Carpinteria, CA)로 2시간 동안 반응 시키고, FITC(fluorescein isothiocyanate)가 표지된 goat anti-mouse IgG2b(1:300 iluted in PBS; Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz, CA)로 B cell detection을 위해 40분동안 반응시키고, T cell detection을 위해, polyclonal rabbit anti-human CD3 (1:200 diluted in PBS; DakoCytomation) 및 CFL555로 표지된 mouse anti-rabbit IgG (1:300 diluted in PBS; Santa Cruz biotechnology)를 반응시킨 다음, IX81-ZDC focus drift compensation 현미경으로 관찰한 결과, hFTN-RFP를 주입한 마우스에서 T cell의 분포가 가장 높은 것을 확인하였다(도 8).
실시예 7. CD 8+ T cell assay를 통한 특정 사이토카인 분비 확인 실험
실시예 1 내지 3의 방법으로 PBS(버퍼)와 RFP, hFTN, hFTN-RFP 입자들을 만들어 C57BL/6에 일주일 간격으로 3번 백신주입을 통하여 림프절 속의 면역세포들의 면역반응을 부스팅 한 다음, 그 면역세포들이 모이는 비장을 적출하여 분쇄하였다. 그 후 분쇄한 비장 안에서 RFP 모형 암 항원에 특이적으로 면역반응이 유도된 CD8+T cell들을 추출해 낸 후, in vitro 상에서 면역반응을 일으킨다고 알려져 있는 RFP의 특정 부분 항원 펩타이드(S111 to I119 또는 SSLQDGCFI)를 이용하여, T cell과 반응시켜 RFP에 특이적인 사이토카인이 분비되는 지 여부를 확인한 결과, hFTN-RFP를 주입한 마우스의 비장에서 추출한 CD8+T cell에서 사이토카인이 가장 많이 분비되는 것을 확인하였다 (도 9)
실시예 8. 암 성장 저해 실험
hFTN-RFP (10 μM), hFTN (10 μM), RFP (10 μM) 단백질들과 그리고PBS 버퍼만 있는 샘플을 각각 C57BL/6 마우스에 1주일 간격으로 3번 주입한 후, 1주일 동안 면역반응이 일어나도록 시간을 둔 후, 각각의 마우스에 RFP-B16F10(RFP 항원이 표출된 흑색종)을 심고 암이 자라는 성장속도를 관찰하였다. 암 세포의 크기는 하기의 식으로 계산하였다: (tumor volume)=(major axis) X (minor axis) X 0.52. 그 결과 대조군들에 비하여 hFTN-RFP를 주입하여 면역치료를 한 마우스 실험군의 암이 대조군들에 비해 암이 현저하게 덜 자라는 것을 확인 하였다(도 6).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Korea University Research and Business Foundation KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Protein nanoparticle linked with cancer specific epitope and composition for cancer immunotherapy comprising it <130> P15-B306 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Candidate 1 <400> 1 Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Candidate 2 <400> 2 Glu Ala Gln Asn Thr Thr Tyr Leu 1 5

Claims (21)

  1. 인간 훼리틴 중쇄 단백질 표면에 암 특이적 에피토프가 융합 발현되어 있는 단백질 나노입자를 포함하는 암 면역 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 나노입자의 직경이 10-40nm인 것을 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암은 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 피부암, 흑색종 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암 특이적 에피토프는 melanoma B16F10 항원, gp100 peptide 및 Lymphoma cell line EL4 항원으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 암 특이적 에피토프는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물.
  6. 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 암 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 배양하여 훼리틴 단백질 나노입자의 표면에 암 특이적 에피토프가 표현되어 있는 단백질 나노입자를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 단백질 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는, 암 면역 치료용 조성물의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, PL(λ) 프로모터, PR(λ) 프로모터, lac(TS) 프로모터, PSPA 프로모터, ibpfxs 프로모터, groES 프로모터, groEL 프로모터, clpB 프로모터, dnaK 프로모터 및 dnaJ 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물의 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물의 제조 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 벡터는 인간 훼리틴 중쇄 단백질과 질병마커 특이적 에피토프 사이에 링커 서열이 추가적으로 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 링커 서열은 G3SG3TG3SG3인 것을 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물의 제조 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 고형암은 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 피부암, 흑색종 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물의 제조 방법.
  13. 제6항에 있어서, 상기 암 특이적 에피토프는 melanoma B16F10 항원, gp100 peptide 및 Lymphoma cell line EL4 항원으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암 특이적 에피토프는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 면역 치료용 조성물의 제조 방법.
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  21. 제1항에 있어서, 상기 암 면역치료는 상기 단백질 나노입자가 림프관으로 이동한 다음, 표면의 암 특이적 에피토프로 면역세포를 활성화시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 암 면역치료용 조성물.
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