KR100985914B1 - 간암 특이 항원인 알파­페토단백질의 표면발현벡터 및 이에의해 형질전환된 미생물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람의 간암 특이 항원인 알파-페토단백질(alpha-fetoprotein; AFP)의 표면발현용 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환되어 AFP를 표면발현하는 박테리아에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자 및 AFP를 암호화하는 유전자를 포함하는 표면발현벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 박테리아 및 상기 AFP가 표면발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 항원을 유효성분으로 함유하는 간암 치료 또는 예방용 백신 및 건강보조제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 AFP가 표면발현된 박테리아를 환자에 투여할 경우에는 AFP 단독으로 투여하였을 때보다 강한 면역반응을 유발하여, 간암 특이 AFP가 표면발현된 박테리아 및 상기 박테리아로부터 조추출된 간암 특이 AFP를 백신 또는 건강보조제 등으로 사용하면 보다 효과적으로 간암을 치료 및 예방할 수 있다.
alpha-fetoprotein, AFP, 간암특이 항원, 표면발현, 백신, 건강보조제

Description

간암 특이 항원인 알파­페토단백질의 표면발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물{Cell Surface Expression Vector for liver Cancer Specific Antigen Alpha-fetoprotein and Microorganism Transformed by Thereof}
도 1은 간암 특이 항원인 AFP를 표면발현하는 벡터인 pBT:pgsA-mAFP의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 pBT:pgsA-mAFP 형질전환체에서 pgsA와 융합된 mAFP 항원의 융합단백질 발현 양상을 특이 항체로 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다 (레인 1: 형질전환되지 않은 락토바실러스 카세이; 레인 2: pBT:pgsA-mAFP/락토바실러스 카세이).
도 3은 본 발명의 표면발현 전환벡터 pBT:pgsA-mAFP로 형질전환시킨 락토바실러스 카제이를 일정기간 구강으로 투여한 후 마우스의 혈청 내 생성된 mAFP에 대한 항체값을 측정한 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 표면발현 전환벡터 pBT:pgsA-mAFP로 형질전환시킨 락토바실러스 카제이를 일정기간 구강으로 투여한 후 마우스의 비장 및 흉선내 T세포의 mAFP 특이 세포독성 활성을 ELISPOT 방법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 mAFP 항원을 표면발현하는 락토바실러스 카제이를 일정기간 구강으로 투여한 마우스의 비장 및 흉선내 T세포의 mAFP 특이 세포독성 활성을 세포내 IFN-r 염색법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 mAFP 항원을 표면발현하는 락토바실러스 카제이를 일정기간 구강으로 투여한 마우스의 비장 및 흉선내 T세포의 mAFP 특이 세포독성 활성을 MTT방법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다 (A: 비장; B: 흉선).
도 7은 본 발명의 표면발현 전환벡터 pBT:pgsA-mAFP로 형질전환시킨 락토바실러스 카제이를 일정기간 구강으로 투여한 후 마우스에 종양세포를 주입하여 시간경과에 따른 종양증식률을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 표면발현 전환벡터 pBT:pgsA-mAFP로 형질전환시킨 락토바실러스 카제이를 일정기간 구강으로 투여한 후 마우스에 종양세포를 삽입하여 마우스에 나타나는 종양의 크기를 나타낸 사진이다 (레인 1: 형질전환되지 않은 락토바실러스 카세이; 레인 2: pBT:pgsA-mAFP/락토바실러스 카세이).
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본 발명은 사람의 간암 특이 항원인 알파-페토단백질(alpha-fetoprotein; AFP)의 표면발현용 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환되어 AFP를 표면발현하는 박테리아에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자 및 AFP를 암호화하는 유전자를 포함하는 표면발현벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 박테리아 및 상기 AFP가 표면발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 항원을 유효성분으로 함유하는 간암 치료 또는 예방용 백신 및 건강보조제에 관한 것이다.
암정복을 목적으로 대대적인 연구투자에 의한 의학적 진보에도 불구하고, 암은 현재까지도 주요 사망원인으로 꼽히고 있다. 특히 간세포성 암종 (HCC 또는 악성 간암)을 포함하는 간암에 의해서는 전세계적으로 연간 백만 명 이상의 사망자가 발생하고 있으며, 특히 국내를 비롯한 아시아에서 그 발생 빈도가 매우 높은 종양으로 알려져 있다.
간암에 대해서는 간 이식의 활용 및 방사선 요법과 항암제 등의 복합요법과 같은 치료법의 개선이 꾸준이 이루어짐에도 불구하고, 간암 환자 중 소수의 경우만이 수술로 병변을 제거하거나 간 이식 방법에 의해 성공적인 치료효과를 얻을 수 있으며, 특히 암세포가 다른 장기로 전이되거나 여러 병소(foci)에 암종이 발견된 경우 만족스러운 치료법이 없는 실정이어서 새로운 치료법의 개발이 절실히 요망되고 있다.
암을 치료하는 방법 중에는 유전자 요법을 포함하는 면역학적 접근방법들이 연구되고 있는데, 특정 유전자를 암세포에 주입하여 암세포를 제거하는 방법과 특정항원을 주입하여 그 항원을 타겟으로 항원에 대한 체내의 세포성 면역반응을 유도함으로서 암의 증식 및 전이를 막는 방법을 대표적으로 들 수 있다. 이러한 방법은 간암을 포함하는 암에서, 보다 특이적이며 표적화된 암 치료법에 적용이 될 수 있으며, 비특이적이며 때로는 심각한 독성까지도 유발하는 종래의 암 치료법과는 대조적으로 건강한 세포는 무상으로 남겨두면서 악성세포만을 선택적으로 억제 또는 사멸시키기 위해 직접 혹은 체내의 면역시스템을 유도하여 보다 특이적으로 암을 치료하는 방법이다.
간암 특이 항원인 알파-페토단백질(alpha-fetoprotein; AFP)은 종양을 일으키는 태아의 단백질로서, 이 단백질은 주로 내피세포 기원의 발생 조직 (난황낭, 태아의 간, 및 소화관)에서 제한적으로 발현된다. AFP 항원의 혈청 농도는 대부분의 간암 환자에서 상승되며, 암 진행단계가 상당히 진전된 환자일수록 고수준의 AFP가 검출되기 때문에 임상적으로 중요한 인자로 인식되고 있다. 환자의 혈청 내 AFP 농도는 주변의 정상적인 간에서가 아니라 간세포 암종에서의 AFP 발현에 의하여 조절되는 것으로 여겨지기 때문에, AFP 항원은 간암세포-특이적 발현으로 조절되는 것으로 생각되며, 이러한 간암 특이적 항원을 대상으로 간암의 면역치료를 위한 연구가 진행되고 있다.
미생물의 세포표면에 원하는 단백질을 부착하여 발현시키는 기술을 세포표면발현 (cell surface display)기술이라 한다. 이 세포표면발현기술은 박테리아나 효모 등 미생물의 표면 단백질을 표면발현 모체 (surface anchoring motif)로 사용하여 외래 단백질을 표면에 발현시키는 기술로서 어떤 단백질을 세포 표면에 발현시키는가에 따라 그 응용범위가 결정되며, 따라서 세포표면발현기술을 이용한 산업적 응용 잠재력은 상당하다고 할 수 있다.
성공적인 세포표면발현기술을 위해서는 표면발현 모체가 가장 중요하다. 따라서 얼마나 효과적으로 외래단백질을 세포표면에 발현시킬 수 있는 모체를 선정하고 개발하느냐가 이 기술의 핵심이 된다. 지금까지 알려져 사용되고 있는 표면발현 모체로는 세포 외막 단백질, 지질 단백질 (lipoprotein), 분비 단백질 (secretory protein), 편모 단백질과 같은 표면기관 단백질로 크게 4가지를 들 수 있다.
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그람음성균 (Gram negative bacteria)의 경우 LamB, PhoE (Charbit et al., J. Immunol., 139:1658, 1987; Agterberg et al., Vaccine, 8:85, 1990), OmpA 등과 같은 세포 외막 단백질, TraT (Felici et al., J. Mol. Biol., 222:301, 1991), PAL (peptidoglycan associated lipoprotein) (Fuchs et al., Bio/Technology, 9:1369, 1991) 및 Lpp (Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 489:2713, 1992) 등의 지질단백질, FimA나 1 형 (type 1) 핌브리아 (fimbriae)의 FimH 어드헤신 (adhesin)과 같은 핌브리아 단백질 (Hedegaard et al., Gene, 85:115, 1989), 및 PapA 필루 (pilu) 서브유닛과 같은 필리 (pili) 단백질 등을 대표적인 세포 표면발현 모체로서 외래 단백질의 발현에 이용되었다. 이 외에도 빙핵활성 단백질 (ice nucleation protein) (Jung et al., Nat. Biotechnol., 16:576, 1998; Jung et al., Enzyme Microb. Technol., 22:348, 1998; Lee et al., Nat. Biotechnol., 18:645, 2000), 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiela oxytoca)의 풀루라나제 (pullulanase) (Kornacker et al., Mol. Microl., 4:1101, 1990), 니세리아 (Neiseria)의 IgA 프로테아제 (Klauser et al., EMBO J., 9:1991, 1990), 대장균의 adhesin인 AIDA-1, shigella의 VirG 단백질, Lpp와 OmpA의 fusion 단백질 등이 표면발현 모체의 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.
그람양성균 (Gram positive bacteria)을 이용하는 경우에는 스타필로코쿠스 오레우스 (Staphylococcus aureus)유래의 protein A 및 FnBPB 단백질, 젖산 박테리아의 표면 코트 (coat) 단백질, Streptococcus pyogenes 유래의 M6 단백질 (Medaglini, D et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92:6868, 1995), Bacillus anthracis의 S-layer protein EA1, 및 Bacillus subtilis CotB 등이 그람양성 박테리아의 대표적인 표면 단백질을 모체로 알려져 있다.
본 발명자들은 바실러스 속 균주 유래의 폴리 감마 글루탐산의 합성 복합체 유전자 (pgsBCA)를 새로운 표면발현 모체로 활용하여, 외래단백질을 박테리아의 표면에 효과적으로 발현시킬 수 있는 신규의 표면발현용 벡터와 상기 벡터로 형질전환된 미생물의 표면에 외래단백질을 다량 발현시키는 방법을 개발한 바 있다 (한국등록특허 10-0469800). 또한 상기에서 열거된 표면발현 모체들을 이용하여 병원체의 항원 또는 항원 결정기를 유전공학적 방법을 통해 대량 생산이 가능한 세균에서 안정하게 발현시키고자 하는 많은 연구가 시도되었다.
비병원성 박테리아의 표면에 외래 면역원을 발현시켜 살아있는 상태로 경구투여를 할 경우 종래의 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 이용한 백신들보다 더 지속적이고 강한 면역반응을 유도할 수 있으며, 이는 박테리아의 표면 구조물들이 표면발현된 외래단백질의 항원성 (antigenicity)을 증가시키는 보조제 (adjuvant) 역할을 하기 때문이며, 살아있는 상태의 균에 대한 체내의 면역 반응에 의한 것으로 알려져 있다.
이러한 표면발현 시스템을 이용하여 간암과 같은 고형암의 특이 항원을 체내에 전달함으로서 특이 항원에 대한 체내의 세포성 면역유도 방법 및 이를 이용한 간암 치료 또는 예방용 백신의 개발은 주목할 만하다.
이에 본 발명자들은 사람의 간암을 치료 및 예방하기 위한 백신을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자를 이용하여 간암 특이항원인 AFP를 박테리아의 표면에 발현하는 AFP 표면발현용 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 박테리아를 제조하고, 상기 박테리아를 이용하여 간암을 효과적으로 치료 및 예방할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 간암 특이 항원인 알파-페토단백질(AFP)을 암호화하는 유전자 또는 그 단편과 pgsA, pgsB 및 pgsC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자를 함유하고, 상기 알파-페토단백질(AFP) 항원을 암호화하는 유전자의 단편은 포유류에서 알파-페토단백질에 대하여 체액성 면역반응을 유도할 수 있는 단편인 것을 특징으로 하는 알파-페토단백질(AFP) 항원 표면발현용 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 박테리아를 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 또한, 상기 형질전환된 박테리아를 배양하여 수득되는 알파-페토단백질(AFP)을 상기 박테리아 표면에 발현시키는 것을 특징으로 하는 알파-페토단백질(AFP)의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 또한, 상기 박테리아 배양에 의해 수득된 알파-페토단백질(AFP)이 표면발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 간암 특이 알파-페토단백질(AFP) 항원을 유효성분으로 함유하는 간암 치료 또는 예방용 백신 및 건강보조제를 제공하는 데 있다.
본 발명은 간암 특이 항원인 알파-페토단백질(AFP)을 암호화하는 유전자 또는 그 단편과 pgsA, pgsB 및 pgsC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자를 함유하고, 상기 알파-페토단백질(AFP) 항원을 암호화하는 유전자의 단편은 포유류에서 알파-페토단백질에 대하여 체액성 면역반응을 유도할 수 있는 단편인 것을 특징으로 하는 알파-페토단백질(AFP) 항원 표면발현용 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 박테리아를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 형질전환된 박테리아를 배양하여 수득되는 알파-페토단백질(AFP)을 상기 박테리아 표면에 발현시키는 것을 특징으로 하는 알파-페토단백질(AFP)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 박테리아 배양에 의해 수득된 알파-페토단백질(AFP)이 표면발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 간암 특이 알파-페토단백질(AFP) 항원을 유효성분으로 함유하는 간암 치료 또는 예방용 백신 및 건강보조제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 간암 특이 항원인 알파-페토단백질(AFP)을 미생물의 세포 표면에 발현시키기 위하여, pgsA, pgsB 및 pgsC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자 및 간암 특이 알파-페토단백질(AFP) 항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 표면발현용 재조합 벡터 pBT:pgsA-mAFP를 제작하였다. 또한 상기 표면발현벡터 pBT:pgsA-mAFP를 사용하여 유산균인 락토바실러스 카세이를 형질전환시켜 알파-페토단백질(AFP)의 표면발현을 유도하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 간암 특이 항원인 알파-페토단백질(AFP)을 암호화하는 유전자 또는 그 단편과 pgsA, pgsB 및 pgsC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자를 함유하고, 상기 알파-페토단백질(AFP) 항원을 암호화하는 유전자의 단편은 포유류에서 알파-페토단백질에 대하여 체액성 면역반응을 유도할 수 있는 단편인 것을 특징으로 하는 알파-페토단백질(AFP) 항원 표면발현용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 박테리아에 관한 것이다.
본 발명에서는 간암특이 항원 유전자로, 마우스 AFP 유전자(1818bp)를 사용하였으나, AFP에 대하여 체액성 면역반응을 유발할 수 있는 여느 포유동물로부터 유래된 AFP 유전자 단편이라면 제한없이 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 알파-페토단백질(AFP) 항원 표면발현용 벡터는 SlpA7 프로모터를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 또한 상기 박테리아는 생체 적용 시 독성이 없거나 약독화된 (attenuated) 미생물이라면 그람음성균인 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라 등을 사용할 수 있으며, 그람양성균인 바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 스테필로코커스, 리스테리아 모노싸이토제네스, 스트랩토코커스 등을 어느 것이라도 사용 가능하며, 바람직하게는 식용이 가능한 미생물 (유산균, 바실러스 서브틸리스 등)을 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 형질전환된 박테리아를 배양하여 수득되는 알파-페토단백질(AFP)을 상기 박테리아 표면에 발현시키는 것을 특징으로 하는 알파-페토단백질(AFP)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 유산균에 알파-페토단백질을 발현하도록 형질전환시켜, 상기 알파-페토단백질이 표면발현된 유산균을 마우스에 섭취시키고, 일정 시일 경과 후 마우스 혈청내 알파-페토단백질(AFP)에 대한 항체를 측정하였으며, 그 결과 알파-페토단백질이 표면발현된 유산균을 섭취한 마우스에서 알포-페토단백질에 대한 항체가가 높다는 것을 확인하였고, 마우스의 비장 및 흉선내 T세포의 hAFP 특이 세포독성 활성을 ELISPOT, MTT 그리고 세포내 IFN-γ(gamma) 염색법으로 측정한 결과 비장 및 흉선내 T세포가 mAFP에 대하여 특이적인 세포독성 활성을 나타내었다.
또한, 상기의 형질전환체를 마우스에 섭취시키고, 일정 시일 경과 후 마우스에 알파-페토단백질(AFP)을 과발현하는 종양세포를 주입하여 시간경과에 따른 종양증식률을 측정하였으며, 그 결과, 대조군에 비해 간암 특이 알파-페토단백질(AFP) 항원이 표면발현된 미생물을 처리한 군에서 종양세포의 증식률이 지연됨을 확인하였으며, 결론적으로 본 발명에 따른 간암 특이 알파-페토단백질(AFP) 항원이 발현된 박테라이는 간암에 대해 치료 또는 예방 효과를 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
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따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 박테리아 배양에 의해 수득된 알파-페토단백질(AFP)이 표면발현된 박테리아 또는 상기 박테리아로부터 조추출된 간암 특이 알파-페토단백질(AFP) 항원을 유효성분으로 함유하는 간암 치료 또는 예방용 백신 및 건강보조제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 백신은 경구용 또는 식용으로 섭취하는 것을 특징으로 할 수 있고, 피하 또는 복강 주사용인 것을 특징으로 할 수 있고, 비강 투여용인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
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실시예 1: mAFP의 표면발현용 벡터 pBT:pgsA-mAFP의 제작
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바실러스 속 균주에서 유래한, 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 (pgsA, pgsB 및 pgsC) 중에서 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 간암 특이적 항원인 알파-페토단백질(AFP)을 표면발현할 수 있는 벡터 pBT:pgsA-mAFP을 제작하였다.
벡터의 표면발현을 증가시키기 위해, 그람음성 및 그람양성 범용 벡터인 pAT를 백본으로 하는 pHCE2LB:pgsA-HPVL1 (KCTC 10349BP: pHCE2LB:pgsA-HPVL1로 형질전환된 대장균)의 HCE 프로모터 부분을 항시적 고발현 프로모터인 SlpA7 (서열번호 1) 프로모터로 교체하고, 제한효소 BamHI 및 KpnI으로 처리하여 HPVL1 유전자를 제거하고 여기에 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 중 pgsA 유전자를 삽입하여 표면발현벡터 pBT:pgsA를 준비하였다.
상기 SlpA7 프로모터는 HCE 프로모터 유래의 124 bp의 염기서열과 유산균에서 알려진 S-layer protein을 코딩하는 slpA 유전자의 프로모터들에서 나타나는 보존 서열을 바탕으로 선택된 90 bp 부위가 연속적으로 연결된 총 214 bp의 염기서열(서열번호 1)을 가진다.
본 발명에 있어서, pAT 벡터는 그람양성 미생물 범용 벡터로 널리 알려져 있 으나 (Trieu-Cuot, et al ., Gene, 29:99, 1991; Zhou and Johnson, Biotech . Lett., 29:121, 1993), 본 발명이 해당하는 분야에서는 그람음성 미생물을 이용한 형질전환 미생물 제조시 형질전환 벡터를 제조하기 위한 back-bone 벡터로도 이용되고 있다 (US 2002/309560, US 2002/217613, US 2002/197153, Jung C.M., et al., J. Bacteriology, 181:2816, 1999).
상기에서 준비된 표면발현벡터 pBT:pgsA에 간암 특이 mouse AFP (mAFP) 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위하여, 약 1818bp의 AFP 유전자(서열번호 2)를 함유하는 pGEM T 벡터의 mAFP 유전자를 주형으로 사용하고, 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 mAFP 유전자를 수득하였다.
서열번호 3: 5'- cgc ggatcc aag tgg atc aca ccc gct -3'
서열번호 4: 5'- gga tctaga tta tta aac gcc caa agc atc -3'
(서열번호 3 및 4에서 밑줄 친 부분은 각각 BamHI 및 XbaI의 절단부위를 나타낸 것임)
상기 mAFP 유전자를 제한효소 BamHI 및 XbaI으로 처리하고, 표면발현벡터 pBT:pgsA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA의 3' 말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결함으로써, 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 mAFP를 표면발현할 수 있는 벡터 pBT:pgsA-mAFP을 제작하였다 (도 1).
실시예 2: mAFP(Alphafeto-protein)의 세포 표면발현
암특이 단백질 AFP를 세포표면에 발현시키기 위하여, 실시예 1에서 제작된 표면발현벡터 pBT:pgsA-mAFP를 사용하여 락토바실러스 카세이를 형질전환시켜, mAFP를 표면발현하는 형질전환체를 제조하고, 상기 형질전환체를 MRS배지 (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA)를 이용하여 37℃에서 배양하여 표면발현을 유도하였다.
mAFP의 표면발현을 확인하기 위하여, 상기 배양된 형질전환체를 동일한 세포농도로 맞추고, 이중 일정량을 추출하여 단백질을 변성 (denaturation)시켜 시료를 준비한 다음, 이를 SDS-PAGE로 분획하여 얻어진 단백질을 PVDF 멤브레인 (polyvinylidene-difluoride membranes, Bio-Rad)으로 옮겼다. 분획된 단백질이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 블로킹 완충용액 (50mM Tris-HCl, 5% skim milk, pH 8.0)에서 1시간 동안 흔들어 블로킹시킨 다음, 블로킹 용액에 pgsA에 대한 토끼 유래의 폴리클론 1차 항체를 블로킹 완충용액에 1000배 희석하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고, 아비딘-바이오틴 (avidin-biotin) 시약을 1시간 동안 반응시켜 다시 세척한 다음, 기질 (H2O2)과 발색시약 (DAB)을 첨가하여 발색반응을 유도함으로써, 형질전환체에서 융합단백질 (pgsA-hAFP)의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 형질전환체에서 융합단백질 pgsA-mAFP 의 발현을 확인할 수 있었다. 링커가 포함된 pgsA가 약 43.6 kDa이고, mAFP가 각각 약 66.6 kDa이므로, 형질전환체에서 발현된 융합단백질 pgsA-mAFP는 각각 약 110 kDa 에 해당한다.
실시예 3: AFP가 표면발현된 미생물의 항암 효과
실시예 2에서 제조된 AFP를 표면발현하는 락토바실러스 카세이에 대한 동물세포의 면역반응 및 AFP를 표면발현하는 락토바실러스 카세이의 항암 효과를 확인하였다.
(1) 체액성 면역 반응
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AFP가 표면발현된 락토바실러스 카제이 균주를 마우스에 일정시일 동안 경구 투여한 후 AFP를 과발현하는 간암 세포를 피하주사하기 전 마우스 혈액내 AFP에 대한 체액성 면역반응을 조사하였다.
실험군 및 대조군으로 각각 15마리 씩 구성된 두 그룹의 C57BL/6 (대한 바이오 링크, 암컷, 5주령)를 준비하여, 각 실험군에 AFP가 표면발현된 락토바실러스 카세이를 약 1 x 1010/day의 용량으로 첫주에 5일 둘째 주에 5일 총 10일간 경구투여하고, 넷째 주와 여섯째 주에 부스터로 각각 5일간 경구투여를 하였다.
상기 마우스는 AFP이 표면발현된 락토바실러스 카세이를 투여하기전에 면역전(preimmune) 혈청을 채취하였고, 셋째주(1차 혈청), 다섯째주(2차혈청) 그리고 일곱째주(3차혈청)에 각각 혈청을 채취하여 체액성 면역능 분석을 준비하였다. 대 조군 그룹의 마우스에는 AFP를 표면발현하지 않는 락토바실러스 카세이를 약 1 x 1010/day 용량으로 실험군과 동일한 기간에 투여하였다.
상기 실험군 마우스와 대조군 마우스에서의 AFP에 대한 체액성면역 형성여부를 ELISA 방법으로 측정하였다. 우선 AFP 항원(Fitzgerald, 미국)을 96-웰 Nunc-면역 플레이트에 코팅하였다. 각 웰 당 항원이 100ng/100㎕가 되도록 0.1M 바이카보네이트 코팅 버퍼 (pH9.6)에 희석하여 4℃에서 하룻밤 정치하여 AFP항원을 코팅하였다. AFP항원이 코팅된 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후 PBS에 녹인 10% 스킴밀크 (blocking solution)를 이용하여 2시간동안 블로킹하고, 37℃에서 1차 항체 (마우스 혈청)와 2시간 반응시키고, 퍼옥시다아제가 컨쥬게이트 되어있는 2차 항체와 1시간 반응시켰다. 각 단계별로 PBST를 이용하여 5회 세척하였다. OPD 기질용액을 이용하여 실온에서 20분간 반응한 뒤 0.2N H2SO4 정지용액으로 반응을 정지하고, ELISA 측정기를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하여 마우스 혈청내 AFP에 대한 특이적 IgG 항체가를 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, 대조군의 혈청내 AFP에 대한 IgG 항체값은 경구투여 기간 동안 큰 변화가 없었으나 실험군에서는 경구투여 기간 동안 항체가의 상승을 확인할 수 있었다. 이는 마우스 AFP을 표면발현하는 유산균에 의해 마우스 AFP에 대한 체액성 면역반응이 마우스에서 일어났음을 확인하였다.
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(2) 세포 매개성 면역 반응
AFP가 표면발현된 락토바실러스 카세이 균주를 마우스에 일정시일 동안 경구 투여한 후 마우스 비장 및 흉선내 T 세포의 AFP에 대한 세포성 면역반응을 조사하였다.
락토바실러스 카세이 균주에 표면발현된 AFP에 대한 세포성 면역반응을 측정하기 위하여, 우선 상기 (1)의 마우스 그룹의 15마리 중에서 5마리씩을 선택하여 각각의 마우스에서 비장 및 흉선을 적출하여, 15ml RPMI 배지(Gibco BRL, USA))가 담겨진 튜브에 각각 옮겨 담았다. 멸균된 페트리디쉬에 상기 비장 및 흉선조직을 옮기고, 멸균된 2장의 슬라이드글라스를 이용하여 상기 비장과 흉선을 각각 갈아 조직 피막으로부터 각각의 세포를 분리하였다. 상기 페트리디쉬 내의 모든 내용물을 50ml 튜브에 옮기고 RPMI 배지로 가득 채운 후, 상기 튜브를 얼음에 15-20분간 방치한 후, 상층액 40-45ml를 새로운 50ml 튜브에 옮겼다. 각 튜브를 1600~2000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거한 펠렛에, 적혈구를 용혈시키기 위하여, 37℃로 미리 데워진 TAC 버퍼[NH4Cl, Tris-Cl(pH7.4) 10mM] 10ml을 첨가하여 세포를 부유시키고, 37℃ 수조에서 10분간 방치하였다. 튜브를 유리피펫으로 저어 용혈된 적혈구를 유리피펫에 흡착시켜 제거한 후, RPMI 배지로 튜브를 가득 채웠다. 상기 튜브에 포함된 세포를 RPMI 배지로 2회 세척한 후, RPMI 1640 배지에 부유시켜 비장세포(splenocyte) 및 흉선세포(thymocyte)를 분리하였다.
상기에서 분리된 AFP가 표면발현된 락토바실러스 카세이 균주로 면역된 마우스 및 AFP 비처리군 마우스의 비장세포 및 흉선세포를 이용하여, 하기의 세가지 방 법으로 AFP에 대한 세포매개성 면역반응을 확인하였다.
① ELISPOT 어세이
세포성 면역반응의 측정 방법 중 ELISPOT 어세이를 가장 먼저 수행하였다. ELISPOT 플레이트 (BD ELISPOT Mouse IFN γ Set, USA) 에 PBS (pH 7.2)로 1:200 비율로 희석한 IFN-γ 특이 항체를 코팅하여 하룻밤 정치시켰다. 상기에서 분리한 비장세포 및 흉선세포를 2 x 106/ml의 농도로 하여 100㎕씩 각 웰에 분주하고, 2시간동안 반응시킨 후, AFP(Fitzgerald, 미국)를 7㎍/ml 씩 각 웰에 넣고 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 각 웰을 PBST로 5회 세척하고, 1:250 비율로 희석한 biotinylated 2차 항체 (BD Biosciences, 미국)를 100㎕/웰 씩 분주하고, 상온에서 2시간 반응시켰다. 이후 각 웰을 PBST로 5회 세척한 후, 1:200 비율로 희석된 효소 컨쥬게이트(streptoavidin-HRP) 시약 (BD Biosciences, 미국)을 100㎕/웰 씩 넣고 1시간 반응시킨 후, 다시 PBST와 PBS로 5회 세척하고 기질용액 (BD AEC Substrate Reagent Set, USA)으로 발색을 유도한 후 나타나는 스팟의 수를 ELISPOT 플레이트 측정기(BD Biosciences, 미국)를 이용하여 판독하였다 (도 4).
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 실험군의 스팟수가 현저히 증가되어 있음을 확인하였다. 이로써, AFP가 표면발현된 락토바실러스 카세이 균주를 섭취한 마우스의 흉선 및 비장내 T 세포가 AFP에 대하여 세포성 면역이 활성화되었음을 확인할 수 있다.
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② 세포 내 싸이토카인 염색(IFN-γ 염색)
상기에서 분리한 비장세포 및 흉선세포를 3 x 106/웰 씩 24 웰플레이트에 분주하고 2시간 동안 37℃ , 5% CO2 조건에서 반응시킨 후, AFP를 7㎍/ml씩 각 웰에 분주하고, 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 골지 STOP 시약 (BD Golgi STOP, USA)을 4㎕/웰 씩 넣은 후, 37℃ , 5% CO2 조건에서 9시간 동안 반응시켰다. AFP로 자극시킨 각 웰의 세포들을 1600 rpm에서 5분간 원심분리하고 FACS 염색버퍼(DPBS, 1% FBS, 0.09% sodium azide)에서 1:200 비율로 CD8-PE 항체(Phycoerythrin; BD Biosciences, 미국)를 희석한 후 각 세포와 혼합한 뒤 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 각 웰을 FACS 염색버퍼로 2회 세척한 후 Fixation/Permeablization 키트 (BD Cytofix/Cytoperm, USA)를 200㎕씩 넣고 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후, BD perm 세척버퍼(BD Cytofix/Cytoperm, USA)로 2회 세척한 후 BD perm 세척버퍼에서 1:200 비율로 IFN-γ-FITC 항체(BD Biosciences, 미국)를 희석한 후 각 세포와 혼합 한 뒤 4℃에서 30분 동안 반응시키고, 2회 세척한 후 FACS 염색버퍼 300㎕에 세포를 부유한 후 FACS 분석장비(Becton Dickinson and company)를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 비장세포 및 흉선세포에서 모두 대조군보다 실험군에서 세포 매개성 면역에 관여하는 CD8+T 세포에서 항암 작용에 관여하는 싸이토카인인 IFN-γ를 보다 많이 발현함을 확인하였다.
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③ 세포 증식능 확인(cell proliferation; MTT assay)
분리된 비장세포와 흉선세포 2 x 106/ml를 96-웰 Nunc-티슈플레이트에 각 웰 당 100㎕씩 분주하고 2시간 동안 반응시킨 후, AFP를 7㎍/ml씩 각 웰에 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서 72시간 동안 반응시켰다. MTT 시약 (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)을 최종 농도 0.5 mg/ml이 되도록 10㎕ 씩 각 웰에 넣고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시킨 후, 고형화 용액(solubilization solution: Roche, 독일)을 100 ㎕씩 분주하고 상기와 동일한 조건에서 하룻밤 반응시켰다. 다음날 보라색의 포마잔 결정(formazan crystals)을 ELISA 측정기를 이용하여 570㎚에서 흡광도로 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 실험군의 비장세포와 흉선세포에서는 AFP에 대한 T-cell의 증식이 더욱 잘 이루어졌음을 확인할 수 있었다.
상기와 같이, ① ELISPOT 어세이, ② 세포 내 싸이토카인 염색(IFN-γ 염색) 및 ③ 세포 증식능 확인의 세 가지 방법에 의해서 AFP가 표면발현된 락토바실러스 균주가 마우스의 비장세포 및 흉선내 T 세포를 자극하여 AFP에 대한 세포성 면역반응을 유도할 수 있음을 확인하였다.
(3) AFP가 표면발현된 미생물의 간암 세포 피하 감염 방어 효과
상기 (1)의 실험군 마우스와 대조군 마우스 각각 10마리의 왼쪽 대퇴부의 피하에 AFP를 과발현하는 간암 세포인 Hepa 1-6 (ATCC CRL-1830) 5 x 106 세포를 30 게이지의 주사기를 이용하여 주입하였다. 주입 후 7주 동안 대조군 및 실험군 마우스의 암 생성여부를 조사하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 암세포 주입 후 6주째 대조군의 마우스들은 평균적으로 왼쪽 대퇴부에 암세포가 1500mm3이상 증식되어 있었으나, AFP가 표면발현된 락토바실러스 균주를 섭취한 실험군 마우스에서는 127mm3 정도의 크기로 형성되었음이 관찰되었으며, 이로써 AFP을 표면발현하는 유산균에 의하여 살아있는 마우스 내에서 간암세포의 증식이 억제될 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 간암을 효과적으로 치료 및 예방할 수 있는 폴리감마글루탐산 합 성 복합체 유전자를 이용하여 간암특이 항원인 AFP를 표면발현하는 벡터를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 AFP가 표면발현된 박테리아를 환자에 투여할 경우에는 AFP 단독으로 투여하였을 때보다 강한 면역반응을 유발하여, 간암 특이 AFP가 표면발현된 박테리아 및 상기 박테리아로부터 조추출된 간암 특이 AFP를 백신 또는 건강보조제 등으로 사용하면 보다 효과적으로 간암을 치료 및 예방할 수 있다.
<110> BioLeaders Corp. <120> Cell Surface Expression Vector for liver Cancer Specific Antigen Alpha-fetoprotein and Microorganism Transformed by Thereof <130> P06-B124 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 214 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 1 ttgatctctc cttcacagat tcccaatctc ttgttaaata acgaaaaagc atcaatcaaa 60 acggcggcat gtctttctat attccagcaa tgttttatag gggacatatt gatgaagatg 120 ggtattagta tttttcggtc attttaactt gctatttttt gaagaggtca gtaaatatga 180 atcgtggtaa gtattttcac acttctggaa aaag 214 <210> 2 <211> 1818 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgaagtgga tcacacccgc ttccctcatc ctcctgctac atttcgctgc gtccaaagca 60 ttgcacgaaa atgagtttgg gatagcttcc acgttagatt cctcccagtg cgtgacggag 120 aagaatgtgc ttagcatagc taccatcacc tttacccagt ttgttccgga agccaccgag 180 gaggaagtga acaaaatgac tagcgatgtg ttggctgcaa tgaagaaaaa ctctggcgat 240 gggtgtttag aaagccagct atctgtgttt ctggatgaaa tttgtcatga gacggaactc 300 tctaacaagt atggactctc aggctgctgc agccaaagtg gagtggaaag acatcagtgt 360 ctgctggcac gcaagaagac tgctccggcc tctgtcccac ccttccagtt tccagaacct 420 gccgagagtt gcaaagcaca tgaagaaaac agggcagtgt tcatgaacag gttcatctat 480 gaagtgtcaa ggaggaaccc cttcatgtat gccccagcca ttctgtcctt ggctgctcag 540 tacgacaagg tcgttctggc atgctgcaaa gctgacaaca aggaggagtg cttccagaca 600 aagagagcat ccattgcaaa ggaattaaga gaaggaagca tgttaaatga gcatgtatgt 660 tcagtgataa gaaaatttgg atcccgaaac ctccaggcaa caaccattat taagctaagt 720 caaaagttaa ctgaagcaaa ttttactgag attcagaagc tggccctgga tgtggctcac 780 atccacgagg agtgttgcca aggaaactcg ctggagtgtc tgcaggatgg ggaaaaagtc 840 atgacatata tatgttctca acaaaatatt ctgtcaagca aaatagcaga gtgctgcaaa 900 ttacccatga tccaactagg cttctgcata attcacgcag agaatggcgt caaacctgaa 960 ggcttatctc taaatccaag ccagtttttg ggagacagaa attttgccca attttcttca 1020 gaggaaaaaa tcatgttcat ggcaagcttt cttcatgaat actcaagaac tcaccccaac 1080 cttcctgtct cagtcattct aagaattgct aaaacgtacc aggaaatatt ggagaagtgt 1140 tcccagtctg gaaatctacc tggatgtcag gacaatctgg aagaagaatt gcagaaacac 1200 atcgaggaga gccaggcact gtccaagcaa agctgcgctc tctaccagac cttaggagac 1260 tacaaattac aaaatctgtt ccttattggt tacacgagga aagcccctca gctgacctca 1320 gcagagctga tcgacctcac cgggaagatg gtgagcattg cctccacgtg ctgccagctc 1380 agcgaggaga aatggtccgg ctgtggtgag ggaatggccg acattttcat tggacatttg 1440 tgtataagga atgaagcaag ccctgtgaac tctggtatca gccactgctg caactcttcg 1500 tattccaaca ggaggctatg catcaccagt tttctgaggg atgaaaccta tgcccctccc 1560 ccattctctg aggataaatt catcttccac aaggatctgt gccaagctca gggcaaagcc 1620 ctacagacca tgaaacaaga gcttctcatt aacctggtga agcaaaagcc tgaactgaca 1680 gaggagcagc tggcggctgt cactgcagat ttctcgggcc ttttggagaa gtgctgcaaa 1740 gcccaggacc aggaagtctg tttcacagaa gagggtccaa agttgatttc caaaactcgt 1800 gatgctttgg gcgtttaa 1818 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgcggatcca agtggatcac acccgct 27 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggatctagat tattaaacgc ccaaagcatc 30

Claims (10)

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  3. 간암 특이 항원인 알파-페토단백질(AFP)을 암호화하는 유전자 또는 그 단편과 pgsA, pgsB 및 pgsC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리감마글루탐산 합성 복합체 유전자를 함유하고, 상기 알파-페토단백질(AFP)을 암호화하는 유전자의 단편은 포유류에서 알파-페토단백질에 대하여 체액성 면역반응을 유도할 수 있는 단편인 것을 특징으로 하는 알파-페토단백질(AFP) 항원 표면발현용 벡터로 형질전환된 유산균.
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  6. 제3항의 형질전환된 유산균을 배양하여 알파-페토단백질(AFP)을 상기 유산균표면에 발현시키는 것을 특징으로 하는 특이 알파-페토단백질(AFP)의 제조방법.
  7. 제3항의 형질전환된 유산균을 배양하여 수득된 알파-페토단백질(AFP)이 표면발현된 유산균을 유효성분으로 함유하는 간암 치료 또는 예방용 백신.
  8. 제7항에 있어서, 경구용 또는 식용으로 섭취할수 있는 것을 특징으로 하는 백신.
  9. 삭제
  10. 제3항의 형질전환된 유산균을 배양하여 수득되는 알파-페토단백질 (AFP)이 표면발현된 유산균을 유효성분으로 함유하는 건강보조제.
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