CN112877353B - 一种表达载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种表达载体及其制备方法和应用。本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括SP6启动子和HALO标签，所述表达载体能够在体外表达蛋白，具有拷贝数高，便于提取用于诱导蛋白的质粒，蛋白表达速度快，耗时短的特点。

Description

一种表达载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种表达载体及其制备方法和应用。

背景技术

市面上常见的商业化蛋白表达载体大部分应用于原核生物中，比如应用于大肠杆菌中。

在使用表达载体时，需要考虑宿主菌的选择是否适应外源蛋白的表达，某些特殊的启动子需要特殊的宿主菌才能发挥功能。另一方面，在选择宿主菌的时候需要选用蛋白酶相关基因缺失的菌株作为宿主来减少产物降解，提高产率。同时，为了提高产量，还需要控制各项表达条件，包括培养液成分、温度、诱导与培养时间的长短等。

综上，体内诱导蛋白需要考虑多种多样的因素的影响，在使用时极难控制各种条件的影响，提高目标蛋白的产量。因此，对于现有技术来说，提供一种能脱离宿主菌体而在体外表达的表达载体是非常迫切的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种表达载体及其制备方法和应用。本发明提供的表达载体能够稳定地在体外表达蛋白。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括SP6启动子和HALO标签。

优选的，所述表达载体的骨架载体包括T载体。

优选的，所述SP6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述HALO标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了上述表达载体的制备方法，包括以下步骤：

将SP6启动子和HALO标签连接到骨架载体上，得到表达载体。

优选的，所述的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用SP6启动子的引物进行扩增得到SP6启动子；

(2)将SP6启动子与T载体连接后得到连接有启动子的载体；

(3)利用HALO标签的引物进行扩增得到HALO标签；

(4)将连接有启动子的载体进行线性化处理，得到线性化载体；

(5)将HALO标签与线性化载体连接得到表达载体。

优选的，所述SP6启动子的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

优选的，所述HALO标签的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

优选的，所述线性化处理用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

本发明还提供了上述表达载体或上述制备方法制备得到的表达载体在体外表达蛋白中的应用。

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括SP6启动子和HALO标签。由实施例可知，本发明提供的表达载体能够在体外表达蛋白，具有拷贝数高，便于提取用于诱导蛋白的质粒，蛋白表达速度快，耗时短的特点。

附图说明

图1为HALO标签扩增序列碱基序列及氨基酸序列；

图2为HALO标签蛋白三级结构预测；

图3为最终获得的载体图谱；

图4为目的基因的碱基序列及氨基酸序列；

图5为目的基因蛋白三级结构预测；

图6为载体质粒的碱基序列测序结果的第一部分；

图7为载体质粒的碱基序列测序结果的第二部分；

图8为载体质粒的碱基序列测序结果的第三部分；

图9为载体质粒的碱基序列测序结果的第四部分；

图10为体外蛋白诱导后进行westernblot验证的结果，片段大小为65KDa。

具体实施方式

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括SP6启动子和HALO标签。在本发明中，所述SP6启动子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示；

所述HALO标签的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示，

氨基酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。在本发明中，所述表达载体的骨架载体优选包括T载体。当所述骨架载体为T载体时，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明将SP6启动子和HALO标签串联构建到骨架载体上得到表达载体，得到的表达载体拷贝数高，促使载体质粒更容易获得；另外，SP6启动子具有序列短，易于启动融合基因的特性，HALO标签在Promega公司有对应beads，还有标签蛋白大，易于做Co-IP等实验的优势。因此，本发明提供的表达载体不仅兼顾上述优势，还具有快捷简单运用体外诱导手段获得蛋白的技术效果，并不受植物动物细菌等生物结构的限制，也可以通过原核生物表达蛋白。本发明提供的表达载体具有快捷获得蛋白的优势。在本发明中，所述骨架载体优选包括T载体；本发明选用的T载体具有双抗性，可以为后续的实验提供更多的可能性。

本发明还提供了上述表达载体的制备方法，包括以下步骤：

将SP6启动子和HALO标签连接到骨架载体上，得到表达载体。本发明所述制备方法中的连接的方法为本领域技术人员熟知的常规连接的方法，所述连接的顺序无特殊限定。

所述述表达载体的制备方法，优选包括以下步骤：

(1)利用SP6启动子的引物进行扩增得到SP6启动子；

(2)将SP6启动子与T载体连接后得到连接有启动子的载体；

(3)利用HALO标签的引物进行扩增得到HALO标签；

(4)将连接有启动子的载体进行线性化处理，得到线性化载体；

(5)将HALO标签与线性化载体连接得到表达载体。

本发明利用SP6启动子的引物进行扩增得到SP6启动子；所述SP6启动子的引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述扩增的方法包括：取浓度为10μmol的SP6启动子的引物，每条引物取10μl进行变性复性反应处理。

本发明将SP6启动子与T载体连接后得到连接有启动子的载体；所述连接有启动子的载体的序列如SEQ ID NO:11所示。

本发明利用HALO标签的引物进行扩增得到HALO标签；所述HALO标签的引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

本发明将连接有启动子的载体进行线性化处理，得到线性化载体；所述线性化处理用引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

本发明将HALO标签与线性化载体连接得到表达载体；所述连接的方法优选为：将上文中扩增得到的HALO标签与线性化载体置于的反应体系中，反应获得反应液，将反应液直接转化大肠杆菌，操作方法如上文中SP6启动子与T载体连接时的操作相同，制备得到的表达载体序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了上述表达载体或上述制备方法制备得到的表达载体在体外表达蛋白中的应用。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种表达载体及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)利用SP6启动子的引物进行变性复性处理得到SP6启动子；SP6启动子的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

变性复性处理的方法包括：取浓度为10μmol的SP6启动子的引物，每条引物取10μl进行变性复性反应处理，反应条件如表1所示。

表1反应条件

(2)将得到的SP6启动子与T载体连接后得到连接有启动子的载体；连接操作为：向PCR管中加入上述扩增得到的SP6启动子4μl和T载体(购自全式金公司的

-BluntSimple Cloning Kit)1μl，轻轻混合后置于PCR仪中25℃反应5min，反应结束后得到含有连接产物的PCR管，将含有连接产物的PCR管置于冰上，将连接产物与50μl Trans1-T1感受态细胞轻弹混匀，冰浴20min，冰浴结束后42℃水浴热激30s，热激结束后立即置于冰上2min，加250μl LB液体培养基，200rpm、37℃培养1h，培养结束后取200μl菌液均匀的涂在kana抗性平板上，在37℃培养箱中过夜培养。用M13F通用引物测序得到含有SP6启动子的载体。

(3)利用HALO标签的引物进行扩增得到HALO标签；HALO标签的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。HALO标签的扩增体系如表2所示(模板为常规的具有HALO标签载体，利用NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_350461384)网站得到)，HALO标签的扩增条件如表3所示，扩增得到的HALO标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，HALO标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。HALO标签的氨基酸与核苷酸序列的对应图如图1所示，HALO标签蛋白三级结构预测图如图2所示。

表2 HALO标签的扩增体系

表3 HALO标签的的扩增条件

(4)将连接有启动子的载体进行线性化处理，得到线性化载体；线性化处理用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。线性化处理的体系如表4所示，线性化处理的条件同表3。

表4线性化连接有启动子的载体的体系

(5)将HALO标签与线性化载体连接得到表达载体；连接的方法为：将上文中扩增得到的HALO标签与线性化载体置于如表5所示的反应体系中，反应条件为50℃15min，冰上1min，反应获得反应液，将反应液直接转化大肠杆菌，操作方法如上文中SP6启动子与T载体连接时的操作相同，制备得到的表达载体序列如SEQ ID NO:4所示。获得的表达载体图谱如图3所示。

表5反应体系

(6)取苗龄1个月左右的毛果杨组培苗全株，经无菌水冲洗、吸干表面水分后加液氮迅速研磨成粉末，采用CTAB法提取植株的总RNA，用超微量分光光度计(产品型号：MicroDrop)检测RNA的浓度，获得RNA模板。根据cDNA反转录试剂盒的操作说明，在PCR仪上进行反转录，合成cDNA并放在-20℃冰箱内保存备用。

合成的目的基因引物，如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示。

利用PCR扩增的方式，以cDNA为模板，利用目的基因引物对目的基因进行扩增，得到目的基因，反应体系及扩增温度同表2(将表2中的SEQ ID NO:7替换为SEQ ID NO:12，将SEQ ID NO:8替换为SEQ ID NO:13)和表3。

将得到的目的基因利用如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的引物进行测序，目的基因的序列如SEQ ID NO:14所示。

目的基因的碱基序列及氨基酸序列对比如图4所示，图5为目的基因蛋白的三级结构预测图。

(7)将步骤(5)制备得到的表达载体进行线性化处理，得到线性化表达载体，线性化的方法同步骤(4)，将表4中的引物SEQ ID NO:10替换为SEQ ID NO:15。

将线性化的表达载体与步骤(6)获得的目的基因连接，得到载体质粒。连接方法同步骤(5)，将表5中的HALO标签替换为目的基因，目的基因的体积和终量不变。获得的载体质粒的序列如SEQ ID NO:16所示。

载体质粒的碱基序列测序结果如图6～图9所示。图6～图9中下层为对照序列，是实验应该获得的完整序列；上层为测序结果，由图6～图9可知，二者对比完全相同，说明测序结果符合实验预计结果，序列完全正确，可用于后续实验。

(8)将载体质粒利用promega公司的

SP6 High-Yield Wheat Germ ProteinExpression System进行体外诱导蛋白实验，得到诱导的蛋白。诱导反应体系如表6所示，反应条件为25℃静置，2h。

表6体外诱导蛋白反应体系

将诱导的蛋白进行westernblot验证，结果证明本发明提供的表达载体能够在体外成功表达蛋白。蛋白的电泳如图7所示，片段大小为65KDa。

由上可知，本发明提供的表达载体具有拷贝数高，便于提取用于诱导蛋白的质粒，蛋白表达速度快，耗时短的特点，本发明提供的表达载体两个小时即能获得浓度较高的高纯度蛋白。表达载体上连接的HALO标签有商业化的磁珠(promega)，对于下游实验具有极高的适配性。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 一种表达载体及其制备方法和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atttaggtga cactataga 19

<210> 2

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcagaaa tcggtactgg ctttccattc gacccccatt atgtggaagt cctgggcgag 60

cgcatgcact acgtcgatgt tggtccgcgc gatggcaccc ctgtgctgtt cctgcacggt 120

aacccgacct cctcctacgt gtggcgcaac atcatcccgc atgttgcacc gacccatcgc 180

tgcattgctc cagacctgat cggtatgggc aaatccgaca aaccagacct gggttatttc 240

ttcgacgacc acgtccgctt catggatgcc ttcatcgaag ccctgggtct ggaagaggtc 300

gtcctggtca ttcacgactg gggctccgct ctgggtttcc actgggccaa gcgcaatcca 360

gagcgcgtca aaggtattgc atttatggag ttcatccgcc ctatcccgac ctgggacgaa 420

tggccagaat ttgcccgcga gaccttccag gccttccgca ccaccgacgt cggccgcaag 480

ctgatcatcg atcagaacgt ttttatcgag ggtacgctgc cgatgggtgt cgtccgcccg 540

ctgactgaag tcgagatgga ccattaccgc gagccgttcc tgaatcctgt tgaccgcgag 600

ccactgtggc gcttcccaaa cgagctgcca atcgccggtg agccagcgaa catcgtcgcg 660

ctggtcgaag aatacatgga ctggctgcac cagtcccctg tcccgaagct gctgttctgg 720

ggcaccccag gcgttctgat cccaccggcc gaagccgctc gcctggccaa aagcctgcct 780

aactgcaagg ctgtggacat cggcccgggt ctgaatctgc tgcaagaaga caacccggac 840

ctgatcggca gcgagatcgc gcgctggctg tcgacgctcg ag 882

<210> 3

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu

1 5 10 15

Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly

20 25 30

Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp

35 40 45

Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala Pro

50 55 60

Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe

65 70 75 80

Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly

85 90 95

Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly

100 105 110

Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe

115 120 125

Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe

130 135 140

Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys

145 150 155 160

Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly

165 170 175

Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro

180 185 190

Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu

195 200 205

Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu

210 215 220

Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp

225 230 235 240

Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala

245 250 255

Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn

260 265 270

Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg

275 280 285

Trp Leu Ser Thr Leu Glu

290

<210> 4

<211> 4730

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctgc 240

cctatttagg tgacactata gaatggcaga aatcggtact ggctttccat tcgaccccca 300

ttatgtggaa gtcctgggcg agcgcatgca ctacgtcgat gttggtccgc gcgatggcac 360

ccctgtgctg ttcctgcacg gtaacccgac ctcctcctac gtgtggcgca acatcatccc 420

gcatgttgca ccgacccatc gctgcattgc tccagacctg atcggtatgg gcaaatccga 480

caaaccagac ctgggttatt tcttcgacga ccacgtccgc ttcatggatg ccttcatcga 540

agccctgggt ctggaagagg tcgtcctggt cattcacgac tggggctccg ctctgggttt 600

ccactgggcc aagcgcaatc cagagcgcgt caaaggtatt gcatttatgg agttcatccg 660

ccctatcccg acctgggacg aatggccaga atttgcccgc gagaccttcc aggccttccg 720

caccaccgac gtcggccgca agctgatcat cgatcagaac gtttttatcg agggtacgct 780

gccgatgggt gtcgtccgcc cgctgactga agtcgagatg gaccattacc gcgagccgtt 840

cctgaatcct gttgaccgcg agccactgtg gcgcttccca aacgagctgc caatcgccgg 900

tgagccagcg aacatcgtcg cgctggtcga agaatacatg gactggctgc accagtcccc 960

tgtcccgaag ctgctgttct ggggcacccc aggcgttctg atcccaccgg ccgaagccgc 1020

tcgcctggcc aaaagcctgc ctaactgcaa ggctgtggac atcggcccgg gtctgaatct 1080

gctgcaagaa gacaacccgg acctgatcgg cagcgagatc gcgcgctggc tgtcgacgct 1140

cgagaagggc agcttcaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tggccgtcgt 1200

tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 1260

tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 1320

gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 1380

gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 1440

gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 1500

gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 1560

tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 1620

ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 1680

atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 1740

aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaattcaggg cgcaagggct 1800

gctaaaggaa gcggaacacg tagaaagcca gtccgcagaa acggtgctga ccccggatga 1860

atgtcagcta ctgggctatc tggacaaggg aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag 1920

cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac 1980

cggaattgcc agctggggcg ccctctggta aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga 2040

tggctttctt gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc aagatctgat caagagacag 2100

gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 2160

gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg 2220

ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 2280

gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg 2340

ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg 2400

gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat cccaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 2460

tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 2520

accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc 2580

aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 2640

aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca cggcgatgcc tgcttgccga 2700

atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 2760

cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 2820

aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 2880

ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gaattgaaaa aggaagagta tgagtattca 2940

acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 3000

cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 3060

catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 3120

tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc 3180

cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 3240

accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 3300

cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 3360

ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 3420

accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat 3480

ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 3540

attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 3600

ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 3660

tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 3720

tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 3780

gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 3840

tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 3900

ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 3960

ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 4020

agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 4080

cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 4140

caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 4200

tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 4260

ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 4320

ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 4380

gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 4440

gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 4500

tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 4560

cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 4620

gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 4680

ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 4730

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atttaggtga cactataga 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctatagtgt cacctaaat 19

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgacactata gaatggcaga aatcggtact ggc 33

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaagctgccc ttctcgagcg tcgacagcca gc 32

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagggcagct tcaattcg 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tctatagtgt cacctaaat 19

<210> 11

<211> 3848

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctgc 240

cctatttagg tgacactata gaaagggcag cttcaattcg ccctatagtg agtcgtatta 300

caattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 360

taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 420

cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggacgcgcc ctgtagcggc 480

gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc 540

ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc 600

cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc 660

gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg 720

gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact 780

ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt 840

tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa 900

attcagggcg caagggctgc taaaggaagc ggaacacgta gaaagccagt ccgcagaaac 960

ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa aacgcaagcg 1020

caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac tgggcggttt 1080

tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc 1140

cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa 1200

gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 1260

caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 1320

tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 1380

tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt 1440

ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 1500

gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatcc caccttgctc 1560

ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 1620

ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 1680

aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 1740

aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccacg 1800

gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 1860

gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 1920

ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 1980

ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attgaaaaag 2040

gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 2100

ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 2160

gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 2220

tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 2280

attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 2340

tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 2400

agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 2460

aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 2520

tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 2580

cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 2640

tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 2700

tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 2760

tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 2820

tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 2880

aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 2940

gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 3000

tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 3060

aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 3120

aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 3180

tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc 3240

gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 3300

cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 3360

acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 3420

cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 3480

cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 3540

aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 3600

gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 3660

atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 3720

tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 3780

gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 3840

agcggaag 3848

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcgacgctcg agatgacggc ggcaacatta gag 33

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaagctgccc tttcaaaacg gcttctgcag gt 32

<210> 14

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgacggcgg caacattaga gttaccacca ggtttcaggt tccatccaac ggatgaggag 60

ctcgttctgc actatctctg ccgtaaatgc tcatcgcagc ccattgctgt gcctattatt 120

gctgaaattg atctctacaa gtttgaccca tgggatctcc ccggtatagc cttgtatgga 180

gaaaaggaat ggtacttttt taccccgaga gacaggaagt accctaacgg atcgagaccg 240

aatcgtgctg cagggagggg ctactggaaa gccacgggag ccgacaagcc gattgggcag 300

ccgaagacag ttggaatcaa gaaagctttg gtattttacg cggggaaagc tcctaaggga 360

gagaaaacga actggattat gcacgagtat cgtctagccg acgtggatcg ctcggctcgc 420

aagaagaaca gcttaaggct ggatgattgg gtactctgtc gcatatacaa caagaaaggt 480

acagttgaga agcaagaaca gcatcttagc gtcaagaaag cgaatccgac ggagattgag 540

gaggatgaga agaagcaggt tgttttgctg ccgccaccac aagctccgtc ctcggcgaca 600

ggaacggtga atgattacat gtactttgac acgtcagact ccgtgccgag gatgcacacg 660

gattcgagct gctcggagca tgtggtgtcg ccggaattca cgtgcgaggt gcagagtgag 720

cctaggtgga aggaatgggg aaacgtaaat gccctcgata atccttacaa ttacctggat 780

gccacaatgg atattccatt tgcgtctcag ttgcaggggg ataatcagat gtcgccgctt 840

caggatatat ttatgcacct gcagaagccg ttttga 876

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcgagcgtc gacagccagc g 21

<210> 16

<211> 5606

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctgc 240

cctatttagg tgacactata gaatggcaga aatcggtact ggctttccat tcgaccccca 300

ttatgtggaa gtcctgggcg agcgcatgca ctacgtcgat gttggtccgc gcgatggcac 360

ccctgtgctg ttcctgcacg gtaacccgac ctcctcctac gtgtggcgca acatcatccc 420

gcatgttgca ccgacccatc gctgcattgc tccagacctg atcggtatgg gcaaatccga 480

caaaccagac ctgggttatt tcttcgacga ccacgtccgc ttcatggatg ccttcatcga 540

agccctgggt ctggaagagg tcgtcctggt cattcacgac tggggctccg ctctgggttt 600

ccactgggcc aagcgcaatc cagagcgcgt caaaggtatt gcatttatgg agttcatccg 660

ccctatcccg acctgggacg aatggccaga atttgcccgc gagaccttcc aggccttccg 720

caccaccgac gtcggccgca agctgatcat cgatcagaac gtttttatcg agggtacgct 780

gccgatgggt gtcgtccgcc cgctgactga agtcgagatg gaccattacc gcgagccgtt 840

cctgaatcct gttgaccgcg agccactgtg gcgcttccca aacgagctgc caatcgccgg 900

tgagccagcg aacatcgtcg cgctggtcga agaatacatg gactggctgc accagtcccc 960

tgtcccgaag ctgctgttct ggggcacccc aggcgttctg atcccaccgg ccgaagccgc 1020

tcgcctggcc aaaagcctgc ctaactgcaa ggctgtggac atcggcccgg gtctgaatct 1080

gctgcaagaa gacaacccgg acctgatcgg cagcgagatc gcgcgctggc tgtcgacgct 1140

cgagatgacg gcggcaacat tagagttacc accaggtttc aggttccatc caacggatga 1200

ggagctcgtt ctgcactatc tctgccgtaa atgctcatcg cagcccattg ctgtgcctat 1260

tattgctgaa attgatctct acaagtttga cccatgggat ctccccggta tagccttgta 1320

tggagaaaag gaatggtact tttttacccc gagagacagg aagtacccta acggatcgag 1380

accgaatcgt gctgcaggga ggggctactg gaaagccacg ggagccgaca agccgattgg 1440

gcagccgaag acagttggaa tcaagaaagc tttggtattt tacgcgggga aagctcctaa 1500

gggagagaaa acgaactgga ttatgcacga gtatcgtcta gccgacgtgg atcgctcggc 1560

tcgcaagaag aacagcttaa ggctggatga ttgggtactc tgtcgcatat acaacaagaa 1620

aggtacagtt gagaagcaag aacagcatct tagcgtcaag aaagcgaatc cgacggagat 1680

tgaggaggat gagaagaagc aggttgtttt gctgccgcca ccacaagctc cgtcctcggc 1740

gacaggaacg gtgaatgatt acatgtactt tgacacgtca gactccgtgc cgaggatgca 1800

cacggattcg agctgctcgg agcatgtggt gtcgccggaa ttcacgtgcg aggtgcagag 1860

tgagcctagg tggaaggaat ggggaaacgt aaatgccctc gataatcctt acaattacct 1920

ggatgccaca atggatattc catttgcgtc tcagttgcag ggggataatc agatgtcgcc 1980

gcttcaggat atatttatgc acctgcagaa gccgttttga aagggcagct tcaattcgcc 2040

ctatagtgag tcgtattaca attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 2100

ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 2160

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 2220

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 2280

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 2340

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 2400

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 2460

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 2520

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 2580

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 2640

aacgcgaatt ttaacaaaat tcagggcgca agggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga 2700

aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga 2760

caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat 2820

agctagactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct 2880

ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct 2940

gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 3000

aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 3060

actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 3120

ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 3180

aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 3240

ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 3300

tgtcatccca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 3360

tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 3420

gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 3480

aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg 3540

atctcgtcgt gacccacggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 3600

tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 3660

tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 3720

tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 3780

tcttctgaat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 3840

cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 3900

agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 3960

taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 4020

tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 4080

catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 4140

ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 4200

ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 4260

catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 4320

aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 4380

aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 4440

taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 4500

atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 4560

gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 4620

tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 4680

ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 4740

gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 4800

agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 4860

aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 4920

agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 4980

tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 5040

atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 5100

taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 5160

gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 5220

gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 5280

aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 5340

tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 5400

gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 5460

cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 5520

ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 5580

cgagtcagtg agcgaggaag cggaag 5606

Claims (6)

1.一种表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将SP6启动子和HALO标签连接到骨架载体上，得到表达载体；

所述表达载体的骨架载体包括T载体；

所述SP6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述HALO标签的核苷酸序列如SEQID NO:2所示；

所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用SP6启动子的引物进行扩增得到SP6启动子；

(2)将SP6启动子与T载体连接后得到连接有启动子的载体；

(3)利用HALO标签的引物进行扩增得到HALO标签；

(4)将连接有启动子的载体进行线性化处理，得到线性化载体；

(5)将HALO标签与线性化载体连接得到表达载体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述SP6启动子的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述HALO标签的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述线性化处理用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

6.权利要求1～5任一项所述的制备方法制备得到的表达载体在体外表达蛋白质中的应用。

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