KR100472920B1 - 고발현 효과를 갖는 ｄｎａ 백신용 벡터 및 이를 이용하여 만든 간염 백신 - Google Patents

Abstract

본발명은 서열식별번호 1에 개시된 서열을 갖는 DNA 백신용 벡터(수탁번호 KCCM 10369) 및 서열식별번호 2에 개시된 서열을 갖는 간염 예방 및 치료를 위한 DNA 백신용 벡터(수탁번호 KCCM 10370)에 관한 것이다.

Description

고발현 효과를 갖는 ＤＮＡ 백신용 벡터 및 이를 이용하여 만든 간염 백신{VECTOR FOR DNA VACCINE HAVING HIGH EXPRESSION EFFECTS AND VACCINE FOR HEPATITIS USING THE VECTOR}

본 발명은 고발현 효과를 갖는 DNA 백신용 벡터 및 이를 이용하여 만든 간염 백신에 관한 것이다.

Naked DNA를 이용한 DNA 백신 기술은 최근에 개발된 방법으로서 DNA 자체를 이용해 항원특이 면역반응을 유도하고 이러한 방법으로 유도된 면역 반응을 백신 및 면역 치료에 응용하는 기술이다. 기존의 백신은 사균(killed) 백신(예를 들면, 독감 백신)이나 아단위(subunit) 백신(예를 들면, B형 간염 백신)이 주종을 이루는데, 이러한 기존의 백신은 바이러스와 같은 세포내 병원균(intracellular pathogen)을 제거하는데 필수적인 세포성 면역반응(cellular immunity)을 유도할 수 없다는 한계점을 안고 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해서 생 약독화 백신의 필요성이 부각되어 일부 사용되고 있으나 독성, 벡터 면역, 제조상의 시간적 경제적 문제, 보관상의 안정성 등을 포함한 여러 가지 문제들이 걸림돌로 남아있는 실정이다. 이러한 기존 백신의 한계점을 극복하고 장점은 그대로 유지할 수 있는 백신으로 DNA 백신이 차세대 백신으로 최근 소개되었다. 1990년, 플라스미드 DNA를 동물에 주입했을 때 세포 내로 유입된 소량의 DNA에 의해 단백질이 만들어진다는(

Science 1990, 247:1465) 보고에 이어, 이렇게 생성된 소량의 단백질이 항원으로 작용해 면역 반응이 유도된다는(Nature 1992, 356:152) 결과가 발표되면서 DNA 백신에 대한 연구가 폭발적으로 진행되어왔다. DNA 백신은 진핵 발현 벡터를 직접 숙주에 주입하여 세포내에서 발현되는 단백질에 대한 면역반응을 유도하는 방법으로서 기존의 백신과는 달리 단백질이 아닌 유전 정보체인 DNA 자체를 사용한다는 특징을 가지고 있다(ASM news 62:476-479). DNA 백신은 생 약독화 백신과 같이 항원이 세포내에서 발현되는 특징을 가지고 있지만, 병원체 전체를 이용하는 것이 아닌 방어면역을 유발하는데 중요한 부분만을 포함하고 있기 때문에 감염에 대한 위험성이 없다. 또한 바이러스와 같은 세포내 병원균을 제거하는데 필수적인 면역반응으로서 CTL(Cytotoxic T Lymphocyte)을 비롯한 세포성 면역반응을 효율적으로 유도할 수 있다는 점이 기존의 아단위 백신에 비해 우월한 점이다. 이러한 DNA 백신을 이용한 면역기술을 적용한 동물실험 결과가 여러 질병 모델에서 발표되었고, 처음 소개된 지 3년이라는 짧은 기간에 FDA에서 임상 실험을 허가하여, 현재 HIV(Human Immunodeficiency Virus, J. Virol. 1994, 68:5036-44)를 비롯하여 인플루엔자(Science 1993, 259:1745-9), HBV(Hepatitis B Virus, Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92:5307-11), 말라리아, 암, 천식에 대한 임상 실험이 진행되고 있다.

이러한 여러 장점에도 불구하고 DNA 백신은 세포안에서 발현되는 항원의 양이 소량이기 때문에 다량의 DNA를 사용해야 한다는 단점을 가지고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 생체에 DNA를 주입한 후 전기자극을 주거나 리포조옴을 이용하여 세포내로 들어가는 DNA의 효율을 증가시키는 방법들이 연구되고 있다. 하지만 이러한 방법들은 인체에 적용하기에는 아직 효율이나 안전성 검정 등의 많은 문제가 있다.

본발명은 또한 고발현효과를 갖는 간염 예방 및 치료를 위한 DNA 백신용 벡터에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(hepatitis B virus: HBV)는 Hepadna virus에 속하며 약 3.2kb의 원형 DNA로 이루어진 직경 약 42nm의 구형 입자이다. 바이러스 외피는 표면항원 단백질(HBsAg)로 구성되어 있고 중심에는 HBV DNA와 핵단백질(HBcAg)이 위치하고 있다. HBV DNA는 S, C, X, P의 4개의 유전자가 밝혀져 있다(Nature 1985, 317:489-495).

S 유전자는 표면 항원을 코딩하는 유전자로 앞쪽에 Pre-S 영역이 존재하며 이는 Pre-S1 영역과 Pre-S2 영역으로 나뉘어 있다. 각각 표면 단백의 S 단백, Pre-S1 단백, Pre-S2 단백을 코딩한다. C 유전자는 코어 단백(HBcAg)을 코딩하는 유전자이며 C 유전자에 붙어서 프리코어(precore) 영역이 존재한다. HBcAg의 일부분이 분리된 것이 가용성 항원인 hepatitis B e antigen(HBeAg)이다. X 유전자는 HBx 단백(HBxAg)을 코딩하는 유전자로 아직 그 역할이 명확히 알려져 있지는 않으나, 자기 자신과 다른 바이러스를 복제하는데 관여한다고 생각된다. P 유전자는 DNA를 수리하는 DNA 중합효소를 코딩한다(Annu. Rev. Biochem. 1987, 56:651-693).

이중에서 Pre-S항원은 손상되지 않은 표면항원 입자(HBsAg)에서 발견되는 가장외각에 있는 부위로 B형 간염 바이러스를 구성하고 있는 표면항원의 15~20%를 차지하고 있으며, 체내에 침입한 B형 간염 바이러스가 간으로 침투하는 과정에서 중요한 역할을 하게 된다. B형 간염 바이러스가 체내에 침입하면 가장 외각에 있는 Pre-S항원 부위가 간세포표면에 있는 수용체와 결합하게 된다. 이렇게 바이러스가 간세포에 결합되면 바이러스의 DNA가 간세포내로 침투, 증식되어 완전한 B형 간염 바이러스 형태인 데인 입자(Dane Particle) 및 완전한 형태를 갖추지 못한 과잉의 표면항원 입자들이 혈중으로 배출되어 체내의 혈액을 통하여 증식경로를 반복하거나 여러 전염경로를 거쳐 타인을 전염시키게 된다.

B형 간염은 대부분 비경구적 경로로 감염된다. 오염된 주사기, 주사침 또는 기타 의료기기를 불완전하게 멸균하여 재사용시 이를 통하여 많이 전파되며 피부나 점막에 생긴 사소한 상처를 통해서도 전염된다. B형 간염 바이러스의 감염원으로는 혈액외에 타액, 정액 및 질분비액 등이 있다. 잠복기는 50∼180일(평균60∼90일)정도이다. 전파 경로는 모자감염, 성접촉, 수혈이며 우리나라에서 주로 문제가 되는 것은 모자감염이다.

B형 간염 바이러스는 전세계적으로 약 3억 5천만명이 감염되어 있는 것으로 세계보건기구(WHO)는 추정하고 있다. 성인의 경우 감염되면 약 5~10%, 유아는 약 80% 정도로 만성간염으로 발전하며, 30년 이상의 잠복기를 거쳐 간경변 및 간암을 유발하는 것으로 알려졌다. HBV는 선진국에서는 감염률이 1% 미만으로 드물지만 아프리카와 아시아에서는 10%이상의 감염률을 보이고 있으며, 국내에는 약 300만명의 환자가 있는 것으로 추정되고 있다. 현재 B형 간염 백신이 있기는 하지만 그럼에도 불구하고 전세계 인구의 5% 이상이 B형 간염 바이러스 감염자이며 HBV 증식을 차단하는 라미부딘이라는 치료제가 있으나 HBV는 신속히 이에 내성을 갖게되며 알파인터페론도 치료에 이용되고 있으나 이들 치료제들은 환자의 30% 정도에서만 치료효과가 있는 것으로 알려졌다. 현재 사용되고 있는 B형 간염 바이러스에 대한 예방 백신은 혈장 백신, 유전자 재조합 백신으로 크게 구분이 되며 최근 Pre-S 단백질을 포함한 백신이 개발되어 있다(Viral Hepatitis and Liver Disease 1988, 1017-1024). 이러한 단백질 백신은 HBV 감염률을 크게 감소시키고 있는 것으로 알려졌지만 면역한 사람의 10% 이상에서는 항체반응이 유발되지 않으며 이미 바이러스에 감염된 사람에게는 치료 및 면역 효과가 전혀 없는 것으로 알려져 새로운 예방 및 치료 백신이 요구되고 있다.

HBV의 S 항원을 이용한 DNA 백신은 기존의 재조합 단백질 백신에 대해서 비반응성인 생쥐에 대해서도 면역 반응을 유발할 수 있는 것이 밝혀져 보다 효과적인 백신으로 이용될 수 있는 큰 가능성을 가지고 있다. 생체 내에서 HBV를 제거하기 위해서는 HBV의 핵단백질 및 S 항원에 대한 CTL 등의 T helper type 1 (Th1) 면역 반응이 중요하게 작용하는 것으로 알려졌는데, DNA 면역 방법은 이러한 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있어 치료백신으로서도 큰 가능성을 가지고 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:7213-7218). 또한 면역 보조 인자로서 Cytokine 유전자를 함께 전달하여 세포성, 체액성 면역 반응을 향상시킬 수 있음이 밝혀졌다

(J Virol 1997, 71:169-78).

그러나, 간염용 DNA 백신 또한 세포 안에서 발현되는 항원의 양이 소량이기 때문에 다량의 DNA를 사용해야 한다는 단점을 가지고 있다.

본 발명자들은 세포내 저발현이라는 기존의 DNA 백신의 문제점을 해결하기 위한 연구를 계속한 결과, 서열식별번호 3에 개시된 아데노바이러스의 TPL 서열 및 서열식별번호 4에 개시된 합성 인트론을 포함하는 벡터는 항원 DNA와 재조합하여 인체에 투여하였을 때 발현 수준이 높은 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 또한, 본발명자들은 이러한 고발현 효과를 갖는 DNA 벡터를 이용한 DNA 백신의 제조에 있어서, 항원이 HBV의 S항원일 경우, HBV 자체의 신호 서열 대신 herpes simplex virus(HSV)의 gD 단백질의 신호 서열(gDs)로 대체하였을 때, 항원의 발현 수준이 현저히 향상됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 첫번째 면은 서열식별번호 1에 개시된 서열을 갖는 DNA 백신용 벡터(ACP30 벡터)를 제공한다.

ACP30 벡터는 ACP10 벡터의 프로모터 말단부에 adenovirus의 major late promoter 부분의 tripartite leader sequence (TPL) 과 합성 인트론(Mol Cells 31;7(4):495-501) 그리고 여러 제한 효소 부위를 mRNA의 5' 비번역 부위(untransla

ted region)에 삽입하여 제조한다.

TPL의 구체적인 서열은 서열식별번호 3에 기재된 바와 같다.

합성 인트론이 구체적인 서열은 서열식별번호 4에 기재된 바와 같다.

상기 ACP10 벡터는 pSUB201 로부터 얻은 Inverted terminal repeats 부분(ITR), pSKHCMV로부터 얻은 HCMV 프로모터 부분, 그리고 Rc/CMV로부터 BGH(Bovine Growth Hormone) Poly A 부분을 각각 조합하여 제조한다.

이렇게 제조된 ACP30 벡터의 유전자 지도는 도 1과 같다.

ACP30 벡터의 제조방법은 도 3에 모식적으로 나타내었다.

구체적으로, ACP30 벡터는 다음과 같이 제조한다.

pSUB201을 XbaI(348, 4489)과 EcoRI(1766, 1984)로 절단하여 AAV의 구조 유전자 부분을 제거한 후 Inverted terminal repeats부분을 양쪽으로 포함하는 backbone(4489~348)을 얻는다. 이 DNA 절편을 Klenow 효소를 처리하여 평활 말단화한다. 한편 pSKHCMV 플라스미드는 pUHD15.1을 XhoI(1), EcoRI(767)으로 절단하여 얻은 CMV 프로모터 서열을 포함하는 DNA 절편을 pBluescriptSK+의 multicloning site의 XhoI, EcoRI 위치에 삽입하여 얻는다. HCMV의 프로모터 부분을 얻기위하여 pSKHCMV 플라스미드를 XhoI, XbaI으로 절단한 후 DNA Polymerase를 이용하여 Filling을 통해 평활 말단화한 다음 위의 pSUB201에서 얻은 절편과 결합한다. 이 결과물을 AAV-HCMV로 명명한다. Rc/CMV를 BamHI(908, 1285)으로 절단하여 Bovine Growth Hormone(BGH) 유전자의 Poly A 말단부분을 포함하는 DNA 절편을 얻어 이를 AAV-HCMV의 BamHI 위치에 삽입한다. 이렇게 얻은 플라스미드를 EcoRI으로 절단한 후 자기 결찰(self ligation)을 시켰고 이렇게 얻어진 플라스미드를 ACP10 벡터라고 명명한다. ACP10벡터에 CMV 프로모터의 3 말단부분, adenovirus의 major late promoter의 tripartite leader sequence (TPL) 과 합성 인트론(Mol Cells 31;7(4):495-501.) 그리고 여러 제한 효소 부위를 NcoI, EcoRI 위치에 삽입하여 ACP30벡터를 제조한다.

본 발명에 따른 ACP30 벡터는 2002년 4월 10일자로 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM-10369호로 기탁되었다.

본발명의 두번째 면은 서열식별번호 2에 기재된 서열을 갖는 간염 예방 및 치료를 위한 DNA 백신용 벡터(ACP30gDsS 벡터)를 제공한다.

본발명에 따른 간염 예방 및 치료를 위한 DNA 백신용 벡터인 ACP 30gDsS 벡터의 유전자 지도는 도 2와 같다.

본발명자는 본발명에 따른 ACP30 벡터에 HBV의 S항원을 포함시켜 간염 백신을 제조할 때, HBV 자체의 신호서열 대신 herpes simplex virus (HSV)의 gD 단백질의 신호 서열(gDs)을 삽입시킬 경우, HBV의 S 항원의 발현이 더욱 증가됨을 발견하였다. HSV의 gD 단백질의 신호 서열 삽입에 의해 S 항원의 발현이 증가되는 기전은 gDs가 S 항원의 세포외 분비 효율을 증가시키기 때문으로 추측된다. HBV의 S 항원 유전자는 gDs의 3' 방향으로 클로닝된다.

본 발명에 따른 ACP30gDsS 벡터는 2002년 4월 10일자로 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM-10370 호로 기탁되었다.

본 발명의 세번째 면은 ACP30 벡터를 포함하는 DNA 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 네번째 면은 ACP30gDsS 벡터를 포함하는 간염의 예방 및 치료용 DNA 백신을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 간염의 예방 및 치료용 DNA 백신의 구체적인 투여 방법 및 제형은 일반적인 백신, 특히 DNA 백신의 투여 방법 및 제형을 따르며, 바람직하게는 근육 주사를 통해 생체 내에 투여된다. 본 발명의 DNA 백신용 벡터는 주사제에 사용되는 무균 수성 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 주사용 백신으로 제조될 수 있다. 주사용 수성액으로는 예컨대 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약을 포함한 등장액 등이 사용되고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알콜(예,에탄올), 폴리알콜(예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면활성제(예, 폴리소르베이트80) 등과 병용할 수도 있다. 유성액으로는 예컨대 올리브유, 참깨유, 대두유, 땅콩유, 면실유, 옥수수유 등과 같은 식물유, 프로필렌글리콜 등이 사용되고, 용해보조제로 벤조산벤질, 벤질알콜 등을 병용할 수도 있다. 또한, 완충제(예컨대, 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액 등), 무통화제(예컨대, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제(예컨대, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제(예컨대, 벤질알코올, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다. 본 발명에 따른 간염 백신의 투여량은 바람직하게는 1-10 mg/kg이다.

본 발명은 아래의 실시예에 의해 보다 상세히 설명된다. 이러한 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예1 : ACP30 벡터의 제조

pSUB201(J. Virol. 61(10): 3096-3101, Samulski et al, 저자로부터 입수)을 XbaI(348, 4489)과 EcoRI(1766, 1984)로 절단하여 AAV의 구조 유전자 부분을 제거한 후 Inverted terminal repeats부분을 양쪽으로 포함하는 backbone(4489~348)을 얻었다. 이 DNA 절편을 Klenow 효소(Roche, 독일)를 처리하여 평활 말단화하였다. 한편 pUHD15.1(PNAS, 89, 5547-5551, Gossen M. and Bujard H., 저자로부터 입수)을 XhoI(1), EcoRI(767)으로 절단하여 얻은 CMV 프로모터 서열을 포함하는 DNA 절편을 pBluescriptSK+(Stratagene)의 multicloning site의 XhoI, EcoRI 위치에 삽입하여 pSKHCMV 플라스미드를 얻었다. HCMV의 프로모터 부분을 얻기 위하여 본 발명자는 pSKHCMV 플라스미드를 XhoI, XbaI으로 절단한 후 DNA Polymerase를 이용하여 Filling을 통해 평활 말단화한 다음 상기에서 제조한 pSUB201로부터의 절편과 결합하여 AAV-HCMV 플라스미드를 얻었다. Rc/CMV(Invitrogen Inc. 미국)를 BamHI(908, 1285)으로 절단하여 Bovine Growth Hormone 유전자의 Poly A 말단부분을 포함하는 DNA 절편을 얻어 이를 AAV-HCMV의 BamHI 위치에 삽입하였다. 이렇게 얻은 플라스미드를 EcoRI으로 절단한 후 자기 결찰(self ligation)시켜 ACP10 벡터를 얻었다. ACP10벡터에 CMV 프로모터의 3' 말단부분, adenovirus의 major late promoter의 tripartite leader sequence (TPL) 과 합성 인트론 (Mol Cells 31;7(4):495-501.) 그리고 여러 제한효소 부위를 NcoI, EcoRI 위치에 삽입하여 ACP30벡터를 제조하였다.

실시예2 : ACP30gDsS 벡터의 제조

실시예1에서 제조한 ACP30 벡터의 PstI, EcoRI 위치(1375, 2191)에 HSV의 gD 단백질의 신호 서열 부분(Genebank에 등록된 HSV의 gD 단백질의 신호 서열 정보에 근거하여 합성됨)과 HBV의 S 항원 유전자(ATCC, 미국)를 삽입하여 ACP30gDsS 벡터를 제조하였다.

시험예 1: ACP30 벡터의 in vitro에서의 항원 발현 수준 시험

실시예 1에서 제조한 ACP30 벡터와 ACP30벡터의 중간체에 해당하는 ACP10벡터 및 공지의 벡터인 pTV2(특허출원 제 99-55129호)의 in vitro에서의 유전자 발현을 비교한다. 구체적으로, pTV2, ACP10 및 ACP30 벡터의 multicloning site에 쥐의 IL-12 유전자(이하, "mIL-12"라 함, ATCC, 미국)를 삽입하여 pTV2-mIL-12, ACP10-mIL-12 및 ACP30mIL-12인 재조합 벡터를 만들었다. 각각의 재조합 벡터를 COS-7 세포에 도입하여 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 배양한 후, 발현된 mIL-12의 양을 다음과 같이 측정하였다.

COS-7 세포를 10% 가열 불활성화된 태아 소혈청(heat inactivated fetal bovine serum)이 들어 있는 Dulbeccos modified Eagles 배지에서 키우다 약 5 ×10⁶ 개의 세포에 pTV2-mIL-12, ACP10-mIL-12 및 ACP30mIL-12 각 20 ㎍과 internal control로 pNEB-SEAP (New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts) DNA 각 2 ㎍을 250 V, 960 ℉로 전기영동(Bio-gammaad) 하였다. 36 시간 후 pTV2-mIL-12, ACP10-mIL-12 및 ACP30mIL-12 각각의 상등액을 얻어 mIL-12p70에 대한 ELISA (R&D systems, Minneapolis, Minnesota)를 수행하였다.

실험 결과는 도 4에 나타낸 바와 같다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, mIL-12의 상대적인 발현 수준은 ACP10이 pTV2 보다 10배정도 높았고, ACP30은 ACP10 보다도 약 1.8배정도 높았다.

따라서, ACP30 벡터는 공지의 벡터인 pTV2에 비해 mIL-12 항원에 대해 훨씬 높은 수준으로 발현시킴이 입증되었다.

시험예 2 : ACP30gDsS 벡터에 의한 in vitro에서의 S항원 발현수준 시험

실시예 2에서 제조한 ACP30gDsS 벡터의 S항원 발현율을, HSV의 gD 단백질의 신호서열 대신 HBV 자체의 S항원 신호서열을 함유한 벡터(ACP30S 벡터) 및 공지의 pTV2 벡터에 HBV의 S2 및 S 항원 서열을 삽입한 pTV2S2S의 S 항원 발현율과 비교한다.

먼저, 실시예1에서 제조한 ACP30 벡터의 PstI, EcoRI 위치에 HBV S항원 자체의 신호서열과 HBV의 S 항원 유전자(ATCC, 미국)를 삽입하여 ACP30S을 제조하였다.

또한, 대조를 위하여, pTV2 벡터에 HBV의 S2 및 S 항원(ATCC, 미국)을 삽입하여 pTV2S2S를 제조하였다.

실시예 2에서 제조한 ACP30gDsS 및 상기에서 제조한 ACP30S 및 pTV2S2S를 인간 U2OS 세포( Human osteogenic sarcoma cell)에 형질감염시키고 형질전환된 세포를 배양한 후, 발현된 S 항원의 양을 다음과 같이 측정하였다.

U2OS 세포를 10% 가열 불활성화된 태아 소혈청(heat inactivated fetal bovine serum)이 들어 있는 Dulbeccos modified Eagles 배지에서 키우다 약 5 ×10⁶ 개의 세포에 ACP30gDsS, ACP30S 및 pTV2S2S 각각 20 ㎍과 internal control로 pNEB-SEAP (New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts) DNA 각 2 ㎍을 250 V, 960 ℉로 전기영동(Bio-gammaad) 하였다. 36 시간 후 ACP30gDsS, ACP30S 및 pTV2S2S 각각의 상등액을 얻어 HBV의 S 단백에 대한 ELISA(GENEDIA HbsAg ELISA 3.0, Korea Green Cross)를 수행하였다.

실험 결과는 도 5에 나타낸 바와 같다.

도 5에서 알 수 있는 바와 같이, ACP30gDsS 벡터의 S 항원 발현 수준은 gD 단백질의 신호 서열이 아닌 S 항원의 신호서열이 삽입된 ACP30S보다 약 2.7 배 정도 더 높았다. 하지만 pTV2S2S에서는 S가 세포 밖으로 전혀 분비되지 않는 것을 관찰할 수 있었다. 시험예 1에서, ACP30의 상대적 발현 수준이 ACP10보다 1.8 배 높았던 것을 고려할 때, ACP30gDsS는 ACP10벡터에 HBV의 신호서열 및 S항원을 삽입하여 제조된 ACP10S에 비해 약 5배 정도 더 높은 S 항원 발현 수준을 나타낸다고 추론할 수 있다.

시험예 3 : ACP30gDsS 벡터에 의한 in vivo 면역 반응 시험

(1) 생쥐에서 면역반응 유발

① 그룹I

각 군이 6마리인 세 개의 군의 female BALB/c 생쥐에 ACP30, pTV2S2S 및 ACP 30gDsS 벡터를 각각 50㎍씩 근육 주사하였다. 4주 후 동일한 방법으로 pTV2S2S 및 ACP30gDsS 벡터를 2차 근육 주사하였다.

② 그룹 II

각 군이 6마리인 또다른 세 개의 군의 female BALB/c 생쥐에 ACP30, ACP30S 및 ACP 30gDsS 벡터를 각각 50㎍씩 근육 주사하였다.

(2) 면역 반응 시험 방법

a) Total IgG 반응

그룹 I 및 그룹 II의 면역된 생쥐로부터 면역 후 4주 후에 eye-bleeding 방법을 통해 혈청을 얻어 생성된 항체를 ELISA 방법으로 조사하였다. 그룹 II의 생쥐의 경우, 1차 면역 후 (ACP30, pTV2S2S(X1), ACP30gDsS(X1)) 및 2차 면역 후 (pTV2S2S(X2), ACP30gDsS(X2)) 모두에서 혈청을 얻었다. 96-웰 플레이트에 항원 단백질을 100 ng/well씩 밤새 코팅한 뒤 면역된 생쥐로부터 얻어진 혈청을 1/100으로 희석하여 단백질과 반응시켰다. 그 후 형성된 S-특이적 IgG에 Horseradish peroxidase(HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG 2차 항체(Pharmingen)를 반응시킨 뒤 ABTS 기질을 첨가함으로써 발색반응을 시켰고 2N 황산을 동량 첨가한 뒤 ELISA 판독기 (BioTek)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

b) 혈청전환율

Total IgG의 흡광도 값이 콘트롤 벡터인 ACP30만을 주입한 생쥐보다 2배가 넘을 때 혈청전환(seroconversion) 되었다고 정의할 때, 혈청전환율을 계산하였다.

c) 생쥐의 비장 세포로부터 cytokine (IL-4 및 인터페론-감마) 측정

Th-1 세포는 활성화되었을 때 인터페론-감마를 분비하고 Th-2 세포는 IL-4를 분비한다고 알려진 바, IL-4 및 인터페론-감마의 측정에 의해 Th-1 면역 및 Th-2 면역을 측정할 수 있다.

그룹 I의 면역된 생쥐를 마지막 DNA 주입 후 2주 후에 생쥐를 희생시키고 비장을 적출하여 단일 세포 현탁액을 만들었다. RBC lysis buffer (Sigma)로 RBC를 없앤 뒤에 2 X 10⁵ 개의 비장 세포를 96-웰 플레이트에 넣고 S 단백질(5㎍/ml)을 투여하였다. 이로부터 3일 뒤에 배양 상청액(culture supernatant)을 얻어서 각각 인터페론-감마와 IL-4 수준을 sandwich ELISA로 측정하였다. Anti-mouse 인터페론-감마/ IL-4 capture 단일클론 항체 (mAb)를 ELISA 플레이트에 코팅한 뒤, 배양 상청액과 표준 샘플인 재조합 인터페론-감마/ IL-4를 넣고 배양한다. 이후 차례대로 비오틴-표지된 항-마우스 인터페론-감마/ IL-4 검출 mAb와 HRP-표지된 스트렙트아비딘(streptavidin)을 반응시킨 뒤 테트라메틸벤지딘(TMB)을 기질로 이용하여 발색시켰다. 발색 후 정량은 S 단백질을 처리하지 않은 웰의 값을 제한 후 계산하였다.

(3)시험 결과

① Total IgG 시험 결과

그룹 II의 생쥐에 대한 total IgG 시험 결과, 도 6에서 알 수 있는 바와 같이 ACP30gDsS로 면역한 생쥐가 ACP30S로 면역한 생쥐보다 더 높은 항체 반응을 유발하는 것을 관찰할 수 있었다.

그룹 I의 생쥐에 대한 total IgG 시험 결과, 도 7A에서 알 수 있는 바와 같이, ACP30gDsS를 한번 주입한 생쥐에서 pTV2S2S를 두 번 주입한 것보다 더 높은 항체 반응을 보였다. 또한, ACP30gDsS를 두 번 주입한 생쥐에서는 아주 높은 면역 반응이 유도되었다.

② 혈청전환율

도 7B에서 알 수 있는 바와 같이, pTV2S2S로 한번 면역한 생쥐에서는 거의 면역반응이 유발되지 않아 혈청전환이 일어나지 않았고 두 번 주입 후에도 약 33%의 마우스에서만 면역반응이 유발되었다. 하지만, ACP30gDsS로 면역한 마우스는 한 번의 DNA 주입으로도 약 83%의 마우스에서 혈청전환이 일어났으며 두 번 주입 후에는 모든 마우스가 혈청전환되었다.

③ IL-4 및 인터페론-감마 측정 결과

ACP30gDsS와 pTV2S2S를 두 번 주입한 그룹 I의 생쥐에서 인터페론-감마와 IL-4의 유발을 측정한 결과 IL-4는 두 벡터 모두 유발하지 않았다. 그러나, 인터페론-감마는 도 8에서 알 수 있는 바와 같이 ACP30gDsS로 주입한 마우스에서 월등히 높게 유발되는 것을 관찰할 수 있었다. 위의 결과를 종합해 볼 때 본 발명에 따른 ACP30gDsS가 발현되는 양이 높으며 또한 이의 결과로 생체에서 높은 면역반응을 유발한다는 것을 알 수 있었다.

시험예 4: ACP30gDsS 벡터에 대한 각종 cytokine 유전자의 영향 시험

(1) 생쥐에서 면역반응 유발

ACP30gDsS 벡터에 대한 각종 cytokine 유전자의 영향을 확인하기 위하여, pTV2 벡터에 인간 IL-2(hIL2로 약칭), 쥐 IL-12(mIL-12로 약칭) 및 GM-CSF(GC로 약칭)을 각각 클로닝하여 pTV2hIL2, pTV2-mIL-12 및 pTV2-GC 벡터를 제작한 후, 다음과 같은 조성으로 female BALB/c 생쥐에 각각 50 ㎍ DNA를 근육 주사하였다. 대조를 위해, S 단백은 수산화 알루미늄을 보조제로 하여 3 ㎍씩 주입하였다. 4주 후 동일한 방법으로 다시 각 벡터 및 S 단백을 근육 주사하였다.

그룹명	생쥐수	Immunogen
1	6	ACP30
2	6	ACP30gDsS
3	6	ACP30gDsS + pTV2hIL2
4	6	ACP30gDsS + pTV2-mIL-12
5	6	ACP30gDsS + pTV2-GC
6	6	ACP30gDsS + pTV2hIL2+ pTV2-GC
7	6	ACP30gDsS + pTV2hIL2 + pTV2-mIL-12
8	6	ACP30gDsS + pTV2-mIL-12+ pTV2-GC
9	6	S 단백

(2) 면역 반응 시험

a) Total IgG 반응

상기 시험예 3 a)에서와 동일한 방법으로, 첫번째 DNA 주입 후 및 두번째 DNA 주입 후로부터 4주 후에 total IgG를 측정하였다.

b) IgG isotyping

상기 시험예 3 a)에서 사용한 2차 항체 대신 각각 IgG1 및 IgG2a에 특이적으로 결합하는 HRP-conjugated 2차 항체를 이용하여 ELISA를 수행하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

c) 생쥐의 비장 세포로부터 cytokine (IL-4 및 인터페론-감마) 측정

상기 시험예 3 c)에서와 동일한 방법으로 각 DNA 및 S 단백질 2번 주입한 2주 후에 IL-4 및 인터페론 감마의 양을 측정하였다.

(3) 시험 결과

① Total IgG 및 IgG1, IgG2a 반응

첫번째 DNA 주입 후 Total IgG 및 IgG1, IgG2a 반응을 측정한 결과는 도9에 나타내었다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 여러 가지 cytokine 중 hIL-2를 함께 면역한 생쥐에서 항체 반응이 높게 관찰되었지만 통계적으로 의미 있는 차이는 나타나지 않았다. 또한, DNA를 주입한 그룹에서는 IgG1이 거의 유도되지 않았으며 IgG2a만이 유도되었다. S단백질로 면역한 그룹에서 항체 반응이 아주 높게 유발되었는데 특이한 것은 IgG1과 IgG2a 둘 높게 유발된다는 것이다. 이것은 S 단백질의 특징으로서 기존에 많이 보고 되어있다.

두번째 DNA 주입 후 Total IgG 및 IgG1, IgG2a 반응을 측정한 결과는 도 10에 나타내었다. 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, cytokine에 의한 항체반응 증진 효과가 거의 사라졌는데 hIL-2가 병행투여된 그룹인 그룹3을 제외하면 오히려 cytokine을 넣지 않은 그룹인 그룹2가 나머지 그룹들보다 항체증진효과가 더 큰 것을 관찰할 수 있었다. 특히 IgG2a는 그룹2가 DNA 백신 그룹 중 가장 높게 유도되었다.

③ IL-4 및 인터페론-감마 측정 결과

도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 생쥐에서 인터페론-감마를 유도하였지만 이들 그룹 간에 의미 있는 차이는 나타나지 않았다. 또한, IL-4는 DNA로 면역한 생쥐에서는 거의 분비되지 않았지만 단백질로 면역한 생쥐에서만 분비되는 것을 확인할 수 있었다. 위의 결과는 DNA로 면역하면 Th1 면역이 주로 유도되지만 단백질로 면역하면 Th1과 함께 Th2 면역반응이 동시에 일어남을 말해준다.

본 발명은 DNA 백신용 고발현 벡터인 ACP30 벡터를 제공하며 또한 B형 간염 바이러스에 대한 예방 및 치료를 위한 ACP30gDsS 벡터를 제공한다. 또한 이 플라스미드를 포함하는 B형 간염의 예방 및 치료용 백신을 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 DNA 백신용 벡터(이하, "ACP30 벡터"라 지칭함)의 유전자 지도이다.

도 2은 본 발명에 따른 간염 예방 및 치료를 위한 DNA 백신용 벡터(이하, "ACP30gDsS 벡터"라 지칭함)의 유전자 지도이다.

도 3는 본 발명에 따른 ACP 30 벡터의 제조과정을 모식도로 나타낸 것이다.

도 4는 시험예 1에 따라, ACP30, pTV2 및 ACP10 벡터에 쥐 IL-12(mIL-12)를 각각 클로닝하여 COS-7 세포에 형질감염시킨 후 mIL-12의 상대적인 발현율을 비교한 그래프이다.

도 5은 시험예 2에 따라, HBV(Hepatis B Virus)의 신호서열을 herpes simplex virus(HSV)의 gD 단백질의 신호서열(gDs)로 대체하였을 경우(ACP30gDsS)와 그렇지 않은 경우(ACP30S)의 S항원의 발현수준를 비교한 그래프이다.

도 6는 시험예 3에 따라, 생쥐에 ACP30, ACP30S 및 ACP30gDsS를 각각 주입한 후 A450에서의 total IgG 흡광도를 나타낸 도면이다.

도 7는 시험예 3에 따라, 생쥐에 ACP30,pTV2S2S 및 ACP30gDsS를 각각 주입한 후 A450에서의 total IgG 흡광도 및 혈청전환율을 나타낸 도면이다.

도 8은 시험예 3에 따라, 생쥐에 ACP30, pTV2S2S 및 ACP30gDsS를 각각 주입한 후 인터페론-감마의 분비량을 나타낸 그래프이다.

도 9은 시험예 4에 따라, ACP30gDsS와 함께 인간 IL-2(hIL2), 쥐 IL-12(mIL-12) 또는 Gm-CSF(GC)를 유전자를 포함하는 플라스미드를 1번 주입한 후 A450에서의 total IgG 흡광도 및 IgG1, IgG2a 흡광도를 나타낸 도면이다.

도 10은 시험예 4에 따라, ACP30gDsS와 함께 인간 IL-2(hIL2), 쥐 IL-12(mIL-12) 또는 Gm-CSF(GC)를 유전자를 포함하는 플라스미드를 2번 주입한 후 A450에서의total IgG 흡광도 및 IgG1, IgG2a 흡광도를 나타낸 도면이다.

도 11는 시험예 4에 따라, ACP30gDsS와 함께 인간 IL-2(hIL2), 쥐 IL-12(mIL-12) 또는 Gm-CSF(GC)를 유전자를 포함하는 플라스미드를 1번 주입한 후 인터페론-감마 및 IL-4 분비량을 나타낸 그래프이다.

<110> CHEILJEDANG CO., LTD. <120> VECTOR FOR HEPATITIS VIRUS <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5632 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP30 <400> 1 cagcagctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg 60 acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc 120 atcactaggg gttccttgta gttaatgatt aacccgccat gctacttatc tacgtagcca 180 tgctctagtc gaggagcttg gcccattgca tacgttgtat ccatatcata atatgtacat 240 ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat tgattattga ctagttatta 300 atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 360 acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 420 aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 480 gtatttacgc taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 540 ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 600 atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 660 gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 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1560 tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 1620 ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 1680 tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 1740 tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc tggggctcga ggggggatcc 1800 actagttcta gctagagcat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta atcattaact 1860 acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg 1920 aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg 1980 agcgagcgcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag 2040 ttgcgcagcc tgaatggcga atggaaaatt tccagacgat tgagcgtcaa aatgtaggta 2100 tttccatgag cgtttttcct gttgcaatgg ctggcggtaa tattgttctg gatattacca 2160 gcaaggccga tagtttgagt tcttctactc aggcaagtga tgttattact aatcaaagaa 2220 gtattgcgac aacggttaat ttgcgtgatg gacagactct tttactcggt ggcctcactg 2280 attataaaaa cacttctcag gattctggcg taccgttcct gtctaaaatc cctttaatcg 2340 gcctcctgtt tagctcccgc tctgattcta acgaggaaag cacgttatac gtgctcgtca 2400 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actcactata gggagaccca agctcgatac tctcttccgc atcgctgtct 960 gcgagggcca gctgttgggc tcgcggttga ggacaaactc ttcgcggtct ttccagtact 1020 cttggatcgg aaacccgtcg gcctccgaac ggtactccgc caccgaggga cctgagcgag 1080 tccgcatcga ccggatcgga aaacctctcg actgttgggg tgagtactcc ctctcaaaag 1140 cgggcatgac ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca 1200 cctggcccgc ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcgtccat ctggtcagaa aagacaatct 1260 ttttgttgtc aagcttgagg tgtggcaggc ttgagatctg gccatacact tgagtgacaa 1320 tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc caggtccaac tgcaggtctc 1380 tttgtgtggt gcgttccggt atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt 1440 ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctg 1500 gcgcgccaat ggagaacatc gcatcaggac tcctaggacc cctgctcgtg ttacaggcgg 1560 ggtttttctt gttgacaaaa atcctcacaa taccacagag tctagactcg tggtggactt 1620 ctctcaattt tctaggggga acacccgtgt gtcttggcca aaattcgcag tcccaaatct 1680 ccagtcactc accaacctgt tgtcctccaa tttgtcctgg ttatcgctgg atgtgtctgc 1740 ggcgttttat catcttcctc tgcatcctgc tgctatgcct catcttcttg ttggttcttc 1800 tggactatca aggtatgttg cccgtttgtc ctctaattcc aggatcatca acaaccagca 1860 ccggaccatg caaaacctgc acaactcctg ctcaaggaac ctctatgttt ccctcatgtt 1920 gctgtacaaa acctacggac ggaaactgca cctgtattcc catcccatca tcttgggctt 1980 tcgcaaaata cctatgggag tgggcctcag tccgtttctc ttggctcagt ttactagtgc 2040 catttgttca gtggttcgta gggctttccc ccactgtctg gctttcagtt atatggatga 2100 tgtggttttg ggggccaagt ctgtacaaca tcttgagtcc ctttatgccg ctgttaccaa 2160 ttttcttttg tctttgggta tacatttaag aattcgaatt ctgagatatc catcacactg 2220 gcggccgctc gagcatgcat ctagagggcc ctattctata gtgtcaccta aatgctagag 2280 ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2340 ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2400 aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2460 acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2520 tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctcgagggg ggatccacta gttctagcta 2580 gagcatggct 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ggcccgcggt gatgcctttg agggtggccg cgtccatctg 120 gtcagaaaag acaatctttt tgttgtcaag cttg 154 <210> 5 <211> 119 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 5 tttgtgtggt gcgttccggt atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt 60 ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctct 119 <210> 6 <211> 681 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 6 atggagaaca tcgcatcagg actcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60 ttgttgacaa aaatcctcac aataccacag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120 tttctagggg gaacacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtcccaaat ctccagtcac 180 tcaccaacct gttgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240 atcatcttcc tctgcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 300 caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcat caacaaccag caccggacca 360 tgcaaaacct gcacaactcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcatg ttgctgtaca 420 aaacctacgg acggaaactg cacctgtatt cccatcccat catcttgggc tttcgcaaaa 480 tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 540 cagtggttcg 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Claims (4)

1. 서열식별번호 1에 개시된 서열을 갖는 DNA 백신용 벡터(수탁번호 KCCM 10369).
2. 서열식별번호 2에 개시된 서열을 갖는 간염 예방 및 치료를 위한 DNA 백신용 벡터(수탁번호 KCCM 10370).
3. 제 1항에 따른 벡터를 포함하는 간염의 예방 및 치료용 DNA 백신.
4. 제 2항에 따른 벡터를 포함하는 간염의 예방 및 치료용 DNA 백신.