KR101581487B1 - 신규 융합 단백질과 상기 단백질의 ｃ형 간염 백신으로의 사용 - Google Patents

신규 융합 단백질과 상기 단백질의 ｃ형 간염 백신으로의 사용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역원성의 융합 단백질에 관한 것으로 상기 단백질은 적어도, C 말단 측에서 isolate HBV의 N 말단에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)이 제거된 S 단백질로 구성된 첫 번째 펩티드와, N 말단 측에서 isolate HCV의 적어도 하나의 막 단백질의 엑토도메인(ectodomain)과 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)으로 구성된 두 번째 펩티드로 구성된다. 발명의 주제는 또한, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 하이브리드 핵산분자, 상기 하이브리드 핵산분자로 구성된 벡터, 상기 융합 단백질로 구성된 서브바이러스 입자(subviral particles), 적어도 상기 융합 단백질로, 또는 적어도 상기 하이브리드 핵산분자, 또는 적어도 상기 서브바이러스 입자(subviral particles)로 구성된 면역원성의 조성물과 상기 융합 단백질, 또는 상기 하이브리드 핵산분자 또는 상기 서브바이러스 입자(subviral particles)를 생산하는 세포주에 관한 것이다.

Description

신규 융합 단백질과 상기 단백질의 Ｃ형 간염 백신으로의 사용{NOVEL FUSION PROTEINS AND USE THEREOF FOR PREPARING HEPATITIS C VACCINES}
본 발명은 신규 융합 단백질과 상기 단백질의 이용, 특히 C형 간염에 대한 예방 및/또는 치료목적의 이용, 또는 C형 간염과 B형 간염의 예방 및/또는 치료 목적의 이용에 관한 것이다. 또한 키메라 서브바이러스(chimeric subviral)의 피막입자를 HBV와 HCV 사이에서 얻는 것에 관한 내용도 포함한다.
1989년, C형 간염 바이러스가 복제되고 염기서열도 밝혀졌으나, 상기 바이러스의 전 세계적인 확산과 만성이 되어 가는 계속적인 진화로, 현재까지 C형 간염 바이러스는 공공보건에 있어 심각한 문제이다. WHO에 따르면, 2000년에 세계인구의 3%에 해당하는 1억 7천만이 C형 간염 바이러스에 감염된 것으로 조사되었다,
HCV는 만성적인 간염을 유발하는데, 이것은 간경변이나 간세포암으로 발전할 수 있다. HCV에 의해 유발된 만성적 간염의 기본적인 치료법으로 인터페론(interferon)과 리바비론(ribaviron)이 사용되지만, 상기 치료법은 효과가 충분치 않고, 심각한 부작용을 갖는다. 유용한 치료법은 값이 비싸고, 상대적으로 독성을 나타내며 감염중 절반의 경우에만 효과를 보인다.
수년 동안 모든 게놈(genom)과 바이러스의 단백질이 밝혀지고 있으나, 바이러스의 구조 및 형태형성은 가설에 그치고 있다. C형 간염을 완치하는 백신이 없고 계속적인 백신후보군에 관한 연구가 활발한 실정이다. [Houghton, M., and Abrignani, S. (2005). Prospects for a vaccine against the hepatitis C virus. Nature 436 (7053), 961-6].
예방백신의 경우에, 거의 대다수의 백신후보군은, 대게 E1과 E2로 알려진 HCV의 피막단백질 중 어느 하나 또는 두 개에 근거하는데, 상기 후보군은 세포성 면역을 유발하고 체액성 면역반응의 neutralising을 유발한다.
그러나 HCV의 E1, E2 단백질은 다른 바이러스의 경우와는 달리, 서브바이러스 입자(subviral particles)로 자기조립(self-assemble)하지 않는다. 또한 소포체 투과막의(transmembrane region) 높은 보유능(high retention) 때문에, 상기 단백질의 정제(purification)는 계면제를 통해 수용화 할 필요가 있다. 결과는 실망스럽고 얻어진 부분의 순도가 좋지 않다. [The challege of developing a vaccine against hepatitis C virus. J Hepatol 37(5), 684-95]
트렌스멤브레인 도메인(transmembrane domain)이 제거된 막 단백질의 회복을 대안으로 하면, 상기 대안에 의해 세포 바깥쪽에서 단백질 E1, E2의 분비를 촉발시킬 수는 있으나, 3차원적 입체구조의 변화는 와일드 타입(wild-type) 단백질의 항원능 감소 때문에 바람직하지 않은 결과를 낳을 수 있다.
HBV는 두 가지 형태로 존재하는데, 하나는 전염성의 비리온(virion)이고 다른 하나는 감염물의 혈액에서 바이러스 자체보다 더 많은 수로 발견되는 막 입자의 형태이다. 이런 현상은 HBV의 S단백질의 자기조립능력과, 외피단백질(capsid protein)또는 핵산을 포함하지 않는 서브바이러스 입자(subviral particles)로의 붕괴(또는 단백질 막의 과다한 존재)로 때문이다[Moriarty, A. M., Hoyer, B. H., Shih, J. W., Gerin, J. L., and Hamer, D. H. (1981). Expression of the hepatitis B virus surface antigen gene in cell culture by using a simian virus 40 vector. Proc Natl Acad Sci U S A 78(4), 2606-10]. HBV의 와일드 타입(wild-type) S단백질은 4개의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 구성한다. 와일드 타입(wild-type) 단백질 S의 자기조립(self-assemble)에 의해 발생한 서브바이러스 입자(subviral particles)는 비감염성이나 높은 면역원성이 있다: 그래서 1970년대 중반 이후로, 상기 HBV의 와일드 타입(wild-type) S단백질은 좋은 백신 후보군으로 고려되어 왔다. 사실 상기 와일드 타입(wild-type) S단백질은, HBV에 따른 감염에 대해 보호적인 면역반응을 일으키는데 효과적임을 보여주는 백신의 결과물로서 역할을 수행해왔다.
B형 간염 바이러스에 대해 외래단백질이 벡터로서 작용토록, HBV의 서브바이러스 입자(subviral particles)를 사용하는 것이 이전 연구의 목적이었다. 그래서, "patent application n°US2004/0146529 entitled, HBV /HCV virus like particle"는, 한편으로는 HBV의 S단백질 전체를 체계적으로 구성하고 있는 HBV-HCV의 막 키메라들(envelope chimerics)의 수확을 소개하면서도, 다른 한편으로는 HBV의 S단백질 N 말단끝에(N-terminal end) 접목된 HCV의 막 단백질 E1 또는 E2중 어느 하나의 엑토도메인(ectodomain) 부분에 관하여 예를 들어 소개하고 있다 [Mark Selby, Edward Glazer and Michael Houghton “HBV/HCV virus-like particle” US patent n°2004/01465529].
그러나 상기의 기술은, 상기의 구조들이 잘 조직된 서브바이러스 입자(subviral particles)를 유발할 수 있다는 점과 상기 서브바이러스 입자(subviral particles)가 질 좋은 항원 반응을 유발할 수 있는 것을 설명하지 못한다.
본 발명의 목적은 ,이전 기술의 결점에 비해 비감염성이고, 잘 이루어진 구조에, 효과적으로 분비되는 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하며, 많은 수의 E1 및/또는 E2를 포함하는 HCV-HBV의 융합 단백질을 제공하는 것이다.
또한, C형 간염 및/또는 B형 간염 백신을 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.
본 발명의 추가적인 이점은, B형 간염에 대한 상업화된 백신생산을 위해 쉽게 산업생산라인에 적용 가능하다는 사실이다.
본 발명은, 적어도 이하 두 개의 펩티드로 구성된 면역원성의 융합 단백질에 관한 것이다:
a) C 말단(C-terminal) 측에서, 첫 번째 펩티드는 이하의 아미노산 서열로 구성되는데:
- 상기 첫 번째 펩티드를 구성하는 아미노산의 서열은, isolate HBV의 S단백질의 아미노산 서열이며, 상기 S 단백질은 N 말단 끝에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(membrane domain)이 제거된 것이고, 또는
- 상기 첫 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, 상기 아미노산 서열이 비감염성의 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하는 조건에서, 상기 N말단에서의 제거된 S단백질의 아미노산 서열과, 91%, 특히 93%, 적어도 95%, 더욱 97%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 첫 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, 상기 아미노산 서열이 비감염성의 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하는 조건에서, 다른 isolate HBV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 서열이거나 또는 상기의 N말단에서 제거된 S단백질의 아미노산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 서열이고,
b) N 말단(N-terminal) 측에서, 두 번째 펩티드는 이하의 아미노서열로 구성되는데:
- 상기 두 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, 적어도 하나의 isolate HCV의 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)의 서열이고, 또는
- 상기 두 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존한다는 조건에서, 상기의 isolate HCV의 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)의 서열과 적어도 78%, 특히 적어도 80%, 85%, 더욱 90%의 동일성을 보이고, 또는,
- 상기 두 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존한다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 서열이거나 또는 상기 E1 또는 E2 단백질의 상기 아미노산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 서열이고,
상기 두 번째 펩티드는 막 단백질 E1, E2로부터 선택된 것이거나 또는 E1, E2 로 구성되는 융합 단백질로부터 선택된 것이다.
또한 본 발명은 면역원성의 융합 단백질이 갖는 아미노산 서열이, N 말단에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)이 제거된 S단백질(Sd)의 아미노산 서열 및 isolate HCV 단백질(E1 또는 E2)의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)의 아미노산 서열과, 적어도 83%, 특히 적어도 85%, 90%, 더욱 95%의 동일성을 보이는 아미노산 서열을 갖는 면역원성의 융합 단백질에 관한 것이다.
"융합 단백질"은 적어도 isolate HBV의 N 말단에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)이 제거된 S단백질(Sd)로 구성되는데, isolate HCV의 막 단백질 E1 및/또는 E2 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)이 상기 HBV의 S에서 제거된 부분을 대체한다. (도 3b, 3c, 4D, 4E)
"면역원성의 단백질" 이란, 특히 발명에 따른 융합 단백질뿐 아니라 여기에서 개시된 어떤 융합 단백질의 단편(fragment)도 포함하는 것으로, 항원 물질을 제공받아 어떤 반작용 또는 항원반응을 일으킬 수 있는 것을 말한다. 특히, 단백질은 면역화 이후 anti-E1, anti-E2 및/또는 anti-S의 체액성 면역을 일으킬 때 HCV 및/또는 HBV에 대해 면역원성을 띠는 것으로 고려되고 이하의 기술에 따라 예를 들 수 있다.
- by Huzly et al., 2008, as regards HBV, [Huzly D, Schenk T, Jilg W, Neumann-Haefelin D. Comparison of nine commercially available assays for quantification of antibody response to hepatitis B virus surface antigen. J Clin Microbiol. 2008 Apr, 46(4):1298-306], or,
- By Hamed et al., 2008, as regards HCV, [Hamed MR, Tarr AW, McClure CP, Ball JK, Hickling TP, Irving WL. Association of antibodies to hepatitis C virus glycoproteins 1 and 2 (anti-E1E2) with HCV disease. J Viral Hepat. 2008 May, 15(5):339-45].
" 서브바이러스 입자( subviral particles )를 형성할 수 있는 능력"은 S 단백질, 특히 N말단의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)이 제거된 HBV의 S 단백질과 N말단의 제거된 S단백질을 구성하는 융합 단백질 S이, 와일드 타입(wild-type) S단백질의 존재하에 자기조립(self-assemble)을 할 수 있는 능력, 적절하게는 사상(filamentous) 또는 구형(spherical)의 서브바이러스 입자(subviral particles)로 자기조립을 할 수 있는 능력을 말한다; 상기 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력은 적어도 전자현미경을 통해 관찰로 강조되는데, 특히 본문의 예 1, 2의 기술과 도 7D, 7G, 11B 에서 11D까지에서 확인할 수 있다.
"비감염성의 서브바이러스 입자( subviral particles )"란 HBV의 와일드 타입(wild-type) S단백질의 조립(도 2b) 및/또는 N말단의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)이 제거된 HBV의 S단백질의 조립에서 기인한 사상(filamentous) 또는 구형(spherical)의 입자를 의미하는데, 상기 입자는 바이러스 게놈(viral genome)이 없고 특히, 매우 많은 양으로 합성되거나 분비되는데, 상기 입자는, 예를 들어 PCR에 의해 증폭된 것과 같은, HBV 또는 HCV의 특정 뉴클레오티드 단편의 부재를 강조할 수 있는 어떤 프로토콜(protocol)에 의해 분석될 수 있고 공지된 예를 들면:
- as regards HCV, by [Halfon P, Bourliere M, Ouzan D, Sene D, Saadoun D, Khiri H, Penaranda G, Martineau A, Oules V, Cacoub P.Occult HCV infection revisited with ultra-sensitive real-time PCR assay. J. Clin. Microbiol. 2008 Apr 30],
- as regards HCV, by [Thibault V, Pichoud C, Mullen C, Rhoads J, Smith JB, Bitbol A, Thamm S, Zoulim F. Characterization of a new sensitive PCR assay for quantification of viral DNA isolated from patients with hepatitis B virus infections. J. Clin. Microbiol. 2007 Dec. 45(12):3948-53],
상기 결과는 부정적이다.
" isolate HCV "란 Flaviviridae 과(family)로 Hepacivirus 속(genus)에 속하며, 3000개 이상의 HCV의 아미노산으로 만들어진 다 단백질(polyprotein)로 구성되며, 도 1에 그려져 있다. [Choo, Q. L., Kuo, G., Weiner, A. J., Overby, L. R., Bradley, D. W., and Houghton, M (1989). Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science 244(4902), 359-362; Choo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) v88:2451-2455; Han et al. Characterization of the terminal regions of hepatitis C viral RNA: identification of conserved sequences in the 5' untranslated region and poly(A) tails at the 3' end. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715]; 또는 ICTV(International Committee for the Taxonomy of Viruses)에 의해 분류된, HCV에 관련된 어떤 isolate를 말한다.
" HBV 의 isolate "란 Hepadnaviridae과(family)로 Orthohepadnavirus속(genus)에 속하거나 또는 ICTV(International Committee for the Taxonomy of Viruses)에 의해 분류된, HBV에 관련된 어떤 isolate를 말한다[Schaefer S. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World J Gastroenterol. 2007 Jan 7: 13(1):14-21].
"S 단백질" 또는 "와일드 타입( wild - type ) S 단백질" 이란:
- 특히 226개의 아미노산과 4개의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 구성하는 isolate HBV의 막 단백질(도 2 참고)로서, 특히 isolate HBVadw의 막 단백질이거나, 또는
- isolate HBV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant) 또는 상기 S 단백질의 인공변형물(synthetic variant)이다.
"조립( assembly )"이란 와일드 타입(wild-type) S 단백질의 결합으로 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 단백질의 능력을 말한다. "자기조립(self-assembly)"은 스스로 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 단백질의 능력을 말한다.
"N 말단에 위치한 트랜스멤브레인 도메인( transmembrane domain )이 제거된 S 단백질" 또는 "N 말단의 제거된 S단백질" 또는 "제거된 S 단백질"(Sd)은:
- S 단백질은 상기에서 정의한 바와 같고, isolate HBV의 S 단백질에서 아미노산이 제거된 형태를 보이는 것으로 1번에서 19번, 또는 1번에서 20번, 또는 1번에서 21번, 우선적으로 1번에서 22번이 제거된 것을 말하고, 또는
- 상기 S 단백질은, 상기의 제거된 S 단백질의 아미노산 서열과 적어도 91%, 특히 93%, 95%, 더욱 97% 동일성을 보이고, 또는
- isolate HBV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant) 또는 상기 제거된 S 단백질의 인공변형물(synthetic variant)이다.
" isolate HCV 의 막 단백질은" 거의 필수적으로 단백질 E1 과 E2 둘 중 어느 하나로서, 상기의 단백질 E1과 E2의 엑토도메인(ectodomain)과 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)으로 구성되며(도 4b, 4c), 이하와 같다:
* HCV, 특히 isolate HCV의 HCV-1a의 다 단백질(polyprotein) 중 펩티드 단편(fragment)은 이하의 확장된 영역에 위치한다:
- 상기 단백질 E1에 관하여 상기 펩티드 단편은, 아미노산 서열이 192번부터 383번, 또는 특히 192번부터 380번까지인 확장된 영역에 위치해 있고
- 상기 단백질 E2에 관하여 상기 펩티드 단편은 아미노산 서열이 384번부터 746번, 또는 특히 384번부터 743번까지인 확장된 영역에 위치해 있고; 또는
* 상기 단편(fragment)은, 상기 E1의 아미노산 서열과 적어도 75%, 특히 80%, 85%, 더욱 90&의 동일성을 보이고, 또는
* 상기 단편(fragment)은, 상기 E2의 아미노산 서열과 적어도 78%, 특히 80%, 85%, 더욱 90&의 동일성을 보이고, 또는
* 상기 막 단백질은, isolate HCV 다 단백질(polyprotein)의 자연변형물(natural variant) 또는 인공변형물(synthetic variant)이다.
" HCV 의 막 단백질의 엑토도메인(ectodomain)이란 ",
* HCV, 특히 isolate HCV-1a의 다 단백질(polyprotein)로부터 얻어진 단백질 E1 또는 E2의 단편(fragment)으로서 이하의 확장된 영역에 위치한다:
- 상기 단백질 E1의 엑토도메인(ectodomain)에 관하여 상기 단편은, 아미노산 서열이 192번부터 352번, 또는 특히 192번부터 352번까지인 확장된 영역에 위치해 있고,
- 상기 단백질 E2의 엑토도메인(ectodomain)에 관하여 상기 단편은, 아미노산 서열이 384번부터 717번, 또는 특히 384번부터 717번까지인 확장된 영역에 위치해 있고; 또는
* 상기 단편(fragment)은, 상기 E1의 아미노산 서열과 적어도 75%, 특히 80%, 85%, 더욱 90&의 동일성을 보이고, 또는
* 상기 단편(fragment)은, 상기 E2의 아미노산 서열과 적어도 78%, 특히 80%, 85%, 더욱 90&의 동일성을 보이고, 또는
* 상기 막 단백질은, isolate HCV의 다 단백질(polyprotein)의 자연변형물(natural variant) 또는 인공변형물(synthetic variant)이다.
" HCV 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인( transmembrane )"이란
* HCV, 특히 isolate HCV-1a의 다 단백질(polyprotein)로부터 얻어진 단백질 E1 또는 E2의 단편(fragment)으로서 이하의 확장된 영역에 위치한다:
- 상기 단백질 E1의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)에 관하여 상기 단편은, 아미노산 서열이 353번부터 383번, 또는 특히 353번부터 380번까지인 확장된 영역에 위치해 있고
- 상기 단백질 E2의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)에 관하여 상기 단편은, 아미노산 서열이 718번부터 746번, 또는 특히 718번부터 743번까지인 확장된 영역에 위치해 있고; 또는
* 상기 단편(fragment)은, 상기 E1의 아미노산 서열과 적어도 75%, 특히 80%, 85%, 더욱 90&의 동일성을 보이고, 또는
* 상기 단편(fragment)은, 상기 E2의 아미노산 서열과 적어도 78%, 특히 80%, 85%, 더욱 90&의 동일성을 보이고, 또는
* 상기 막 단백질은, isolate HCV의 다 단백질(polyprotein)의 자연변형물(natural variant) 또는 인공변형물(synthetic variant)이다.
"동일성율(Percentage of identity)"이란 폴리펩티드 분자의 두 서열을 직접 비교하여 결정되는 것으로, 상기 서열은 두 서열에서의 아미노산 잔기 수에 의해 결정되고, 두 서열 중 보다 긴 아미노산의 잔기 수로 짧은 것을 나눈 결과에 100을 곱하여 구한다.
본 발명에서 개시된 특정 서열에 관해 상기 서열의 동일성율이 어떻든지 간에, 본 발명은 isolate HBV 및/또는 HCV의 어떤 뉴클레오티드(nucleotide) 및/또는 펩티드 서열로 구성된 융합 단백질에 관한 것이다.
"자연변형물(natural variant)"은 같은 종(species) 또는 같은 개체군 사이에 있어, DNA서열, 대립유전자의 서열 또는 단백질 서열의 어떤 변동성(variability), 어떤 동질의 다형성(polymorphism), 어떤 다양성(diversity)에 관한 것이다. "자연적 변동의 비율(percentage of natural variability)"은 두 폴리펩티드(polypeptide) 또는 두 폴리뉴클레오티드(polynucleotide) 분자의 직접적인 대조를 통해 결정되는데, 상기 분자는 와일드 타입(wild-type)의 기준분자에서 얻어진 것으로, 면역원성 및/또는 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력과 같은 생물체의 성질을 갖는다. 상기 비율의 산정은, 두 아미노산 또는 핵산 서열에서 일치하는 잔기(residues)의 정확한 숫자를 정한 뒤, 두 개중 더 짧은 서열의 아미노산 또는 핵산의 잔기(residues) 숫자로 상기 일치하는 잔기 수를 나눈 결과에 100을 곱해 산정한다.
두 서열 간 상기 변동 비율(percentage of variability)은, 상기 비율이 바이러스, 유전자형, 서열의 단편 - 예를 들어 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)의 구역보다 더 가변적인 HCV의 엑토도메인(ectodomain) 구역- 등을 고려한 것에 의존하기 때문에, 특히 변화가 심하다. 그래서, HCV의 단백질 E1, E2의 변동 비율은, 같은 유전형의 계통에서도 뉴클레오티드가 88%, 아미노산이 90%이다. 그러나 다른 유전형의 계통에서는 상기 비율이 뉴클레오티드는 55%, 아미노산은 59%까지 떨어진다. DNA 바이러스로 존재하는 HBV는 HCV에 비해 덜 가변적이다[Zhang M, Gaschen B, Blay W, Foley B, Haigwood N, Kuiken C, Korber B. Tracking global patterns of N-linked glycosylation site variation in highly variable viral glycoproteins: HIV, SIV, and HCV envelopes and influenza hemagglutinin. Glycobiology. 2004 Dec. 14(12):1229-46].
본문에서 개시된 특정 서열에 관하여 상기 서열의 상기 자연변동의 비율 및/또는 인공적 변동의 비율이 어떻든지 간에, 본 발명은 어떤 isolate HCV 및/또는 HBV로부터 얻어진 펩티드 서열 및/또는 뉴클레오티드 서열을 구비한 어떤 자연변형물(natural variant) 또는 자연변형물(natural variant)의 어떤 단편(fragment)으로 구성되는 융합 단백질 및/또는 하이브리드 핵산 분자에 관한 것이다.
"인공변형물(synthetic variant)"은, 인공변형물(synthetic variant)이 면역원성 및/또는 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력과 같은 생물체의 성질을 갖는다는 조건에서, 기준 와일드 타입(wild-type) 분자의 재결합과 상기 기준 와일드 타입(wild-type) 분자에 대한 삭제 또는 보충에 의해 얻어진, 발명에 따른 어떤 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 상기 분자의 단편(fragment)에 관한 것이다. "인공적 변동의 비율(percentage of synthetic variability)"은 기준 와일드 타입(wild-type) 분자에 의해 얻어진 분자의 직접적인 비교를 통해, 유전 형질 총체와 자리에 관한, 아미노산 서열 또는 핵산 서열 간의 동일한 잔기의 정확한 수를 결정하고, 상기의 수를 두 아미노산 서열 또는 두 핵산 서열 중 짧은 잔기의 숫자로 나눈 결과에 100을 곱하여 결정한다.
본 발명은 어떤 인공변형(synthetic variant)물 또는 인공변형물의 단편으로 구성된 융합 단백질을 얻는 것에 관한 것으로, 상기 인공변형물(synthetic variant)은 isolate HBV 및/또는 HCV로 부터 얻어진 펩티드 및/또는 뉴클레오티드로부터 얻어진 것이다.
특히 본 발명에서, C말단에 위치한, 융합 단백질의 일부를 구성하는 E1 및/또는 E2의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)은, 특히 적어도 마지막 3개의 아미노산 중 하나가 제거되는데, 그래서 E1 및/또는 E2에서 제거된 트랜스 멤브레인 도메인(transmembrane domain)은 와일드 타입 E1 및/또는 E2의 트랜스 멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 적어도 E1에 관해 91%, E2에 관해 90%의 동일성을 보인다.
C말단에서 상기 3개의 아미노산 중 하나의 제거, 특히 마지막 3개의 아미노산에서의 제거는, 도 1에 가위모양으로 도시된 핍티다아제의 클리비지 사이트(cleavage site)를 비활성(inactivating)화하는 장점을 갖는데, 이는 HCV의 폴리프로테인의 성숙에 대해서는 필요하지만 본 발명의 키메라 구조 범위에서는 바람직 하지 않기도 하다.
[1]. 본 발명은, 적어도 이하 두 개의 펩티드로 구성된 면역원성의 융합 단백질에 관한 것이다:
a) C 말단(C-terminal) 측에서, 첫 번째 펩티드는 이하의 아미노산 서열로 구성되는데:
- 상기 첫 번째 펩티드를 구성하는 아미노산의 서열은, isolate HBV의 S단백질의 아미노산 서열이며, 상기 S 단백질은 N 말단 끝에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(membrane domain)이 제거된 것이고, 또는
- 상기 첫 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HBV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하는 조건에서, 상기 N말단에서의 제거된 S단백질의 아미노산 서열과, 91%, 특히 93%, 적어도 95%, 더욱 97%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 첫 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HBV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하는 조건에서, 다른 isolate HBV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 서열이거나 또는 상기의 제거된 S단백질의 아미노산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 서열이고,
b) N 말단(N-terminal) 측에서, 두 번째 펩티드는 이하의 아미노서열로 구성되는데:
- 상기 두 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, 적어도 하나의 isolate HCV의 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)의 서열이고, 또는
- 상기 두 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감역성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기의 isolate HCV의 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)의 서열과 적어도 78%, 특히 적어도 80%, 85%, 더욱 90%의 동일성을 보이고, 또는,
- 상기 두 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존한다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 서열이거나 또는 상기 E1 또는 E2 단백질의 상기 아미노산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 서열이고,
상기 두 번째 펩티드는 막 단백질 E1, E2로부터 선택된 것이거나 또는 E1, E2 로 구성되는 융합 단백질로부터 선택된 것이다.
본 발명은 적어도 이하를 구성하는 융합 단백질에 관한 것이다:
- 한편으로, C말단에 위치한 트랜스멤브레인(transmembrane domain) 3개를 필수적 요소로 구성된(2A,,3A) HBV의 제거된 S단백질(Sd)은, 서브바이러스 입자(subviral particles)로 조립할 수 있는 능력과 HBV에 대한 면역원성을 보존하고,
- 다른 한편으로 E1 및 E2 단백질 중 하나의 서열은 필히 HCV에 대한 면역원성을 보존하므로,
도 3b, 3c에 나타난 상기 융합 단백질은 와일드 타입(wild-type) S단백질의 존재하에서 서브바이러스 입자(subviral particles)로 자기조립(self-assenble) 할 수 있는 능력을 갖고, HBV 및/또는 HCV에 대한 면역화, 특히 HBV와 HCV에 대하여 두 개의 면역화를 유발할 수 있다.
[1a]. 유리하게도 본 발명의 면역원성 융합 단백질은, 상기 두 번째 펩티드(E1E 또는 2)의 N말단과 isolate HCV의 transfer initiation peptide(PIT)로 구성된 세 번째 펩티드를 포함한다.
" Transfer initiation peptide "란 본 발명에서의 단백질 E1 또는 E2(각각PIT1, PIT2) 또는 융합 단백질을 의미하는데,
*HCV, 특히 isolate HCV-1a의 다 단백질(polyprotein)의 펩티드 단편(fragment)은 이하의 확장된 영역에 위치한다:
- 상기 단백질 E1에 대하여 상기 펩티드의 단편은, 아미노산 서열이 166번부터 191까지인 확장된 영역에 위치하고,
- 상기 단백질 E2에 대하여 상기 펩티드의 단편은, 아미노산 서열이 366번부터 383까지인 확장된 영역에 위치하고, 또는
* 상기 단백질은 isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant) 또는 상기 펩티드 단편의 인공변형물(synthetic variant)이고, 또는
*상기 단편은 상기 두 번째 펩티드의 N말단에 접목된 어떤 펩티드 단편인데,
그 조건은, 상기 펩티드 단편이 본 발명 융합 단백질 일부를 구성할 때, 상기 펩티드 단편이 번역(translation)후 상기 융합 단백질을 소포체로 이끌어 상기 융합 단백질의 당화(glycosylated)가 이루어지고 상기 융합 단백질의 삼차원구조 및/또는 항원특성은 와일드 타입(wild-type) S단백질에 관해 되도록 보존된다는 조건이다.
[2]. 본 발명의 다른 이점은 N말단에 위치한 두 번째 펩티드가 있는 면역원성의 융합 단백질인데, 이하로 구성된다:
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, 막 단백질 E1의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)의 아미노산 서열 총체이고, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HCV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원성을 보존한다는 조건에서, 상기 막 단백질 E1의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain) 및 엑토도메인(ectodomain)의 아미노산 서열과 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 85%, 더욱 90%의 동일성을 보이고, 또는,
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HCV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원성을 보존한다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 아미노산 서열이거나 또는 상기 E1단백질로부터 얻어진 아미노산 서열의 인공변형물(synthetic variant)이다.
본 발명의 특별한 목적은, 거의 필수적으로 HCV의 단백질 E1으로 구성된 융합 단백질 E1-Sd에 있는데, 상기 HCV는 HBV의 N말단 끝의 제거된 S단백질과 접목되어 있고, 이는 도 3b에 도시되어 있다.
[3]. 본 발명은, N말단에 위치한 두 번째 펩티드가 있는 상기 면역원성의 융합 단백질에 관한 것인데, 이하로 구성된다:
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, 막 단백질 E2의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)의 아미노산 서열 총체이고, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HCV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원성을 보존한다는 조건에서, 상기 막 단백질 E2의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain) 및 엑토도메인(ectodomain)의 아미노산 서열과 적어도 78%, 특히 적어도 80%, 85%, 더욱 90%의 동일성을 보이고, 또는,
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HCV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원성을 보존한다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 아미노산 서열이거나 또는 상기 E2 단백질로부터 얻어진 아미노산 서열의 인공변형물(synthetic variant)이다.
본 발명의 특별한 목적은, 거의 필수적으로 HCV의 단백질 E2로 구성된 융합 단백질 E2-Sd에 있는데, 상기 HCV는 HBV의 N말단 끝의 제거된 S단백질과 접목되어 있고, 이는 도 3c에 도시되어 있다.
[3b]. 본 발명에서 특히 면역원성의 융합 단백질은 이하 세 개의 펩티드로 구성된다:
a) C 말단(C-terminal) 측에서, 첫 번째 펩티드는 이하의 아미노산 서열로 구성되는데:
- 상기 첫 번째 펩티드를 구성하는 아미노산의 서열은, isolate HBV의 N 말단 끝에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(membrane domain)이 제거된 S단백질의 아미노산 서열이고, 또는
- 상기 첫 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HBV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하는 조건에서, 상기 N말단에서의 제거된 S단백질의 아미노산 서열과, 91%, 특히 93%, 적어도 95%, 더욱 97%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 첫 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HBV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하는 조건에서, isolate HBV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 서열이거나 또는 상기의 N말단에서 제거된 S단백질의 아미노산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 서열이고,
b) 두 번째 펩티드는 이하의 아미노서열로 구성되는데:
- 상기 두 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, isolate HCV의 막 단백질 E2의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)의 아미노산 서열의 총체이고, 또는
- 상기 두 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존하는 조건에서, 상기 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)의 서열과 적어도 78%, 특히 적어도 80%, 85%, 더욱 90%의 동일성을 보이고, 또는,
- 상기 두 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존하는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 서열이거나 또는 상기 E2 단백질의 상기 아미노산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 서열이고,
c) N 말단 측에서, 두 번째 펩티드는 이하의 아미노서열로 구성되는데:
- 상기 세 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, isolate HCV의 막 단백질 E1의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)의 아미노산 서열의 총체이고, 또는
- 상기 세 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대하여 상기 아미노산 서열이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존하는 조건에서, 상기 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)의 서열과 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 85%, 더욱 90%의 동일성을 보이고, 또는,
- 상기 세 번째 펩티드를 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존하는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 서열이거나 또는 상기 E1 단백질의 상기 아미노산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 서열이고,
상기 두 번째 펩티드는 첫 번째와 세 번째 펩티드 사이에 외치하고 첫 번째와 두 번째, 세 번째 펩티드는 서로 인접해 있다.
본 발명의 특별한 목적은 융합 단백질 E1-E2-Sd을 얻는 것인데, 상기 융합 단백질은, 거의 필수적으로 E2 단백질의 N말단에서 접목된 HCV E1의 엑토도메인(ectodomain)으로 구성되어 있고, 상기 E2단백질은 HBV의 N말단에서 제거된 S단백질에 접목되어 있다.
또한 본 발명은 융합 단백질 E2-E1-Sd을 얻는 것인데, 상기 융합 단백질은, 거의 필수적으로 E1 단백질의 N말단에서 접목된 HCV E2의 엑토도메인(ectodomain)으로 구성되어 있고, 상기 E1단백질은 HBV의 N말단에서 제거된 S단백질에 접목되어 있다.
[4]. 본 발명에 있어, 면역원성의 융합 단백질을 만드는 첫 번째와 두 번째 펩티드는 인접해 있는데, 두 번째 펩티드의 C말단 끝은 공유결합의 방식으로 첫 번째 펩티드의 N말단 끝에 결속되어 있다.
발명에 의할 때, HCV의 단백질 E1 또는 E2, 또는 융합 단백질 PIT1-E1, PIT2-E2, E1-E2, 또는 PIT1-E1-E2 의 단편(fragment)은 HBV의 제거된 S단백질에 공유결합되어 인접한 방식으로 결속되어 있다.
또한 발명에서, 상기 면역원성의 융합 단백질이 HCV 또는 HBV 또는 HBV와 HCV에 대해 와일드 타입(wild-type) S단백질의 존재하에 서브바이러스 입자(subviral particles)로 자기조립할 수 있는 능력 및 면역원 성질을 유지하는 조건에서, 1개 또는 2, 3, 4, 5개의 아미노산으로 이루어진 바인딩 펩티드(binding peptide)는, 상기의 융합 단백질을 구성하는 첫 번째와 두 번째 펩티드를 연결한다.
[5]. 본 발명에 있어, 상기 면역원성의 융합 단백질의 C말단에 위치한 첫 번째 펩티드는 이하의 아미노산으로 구성된다:
- 상기 C 말단의 첫 번째 펩티드의 아미노산 서열은, HBV 특히 isolate HBVadw의 제거된 S단백질 N-말단의 아미노산 서열 23번부터 226번까지에 자리한 인접한 아미노산에 의해 둘러싸여 있고,
특히 상기 C 말단의 첫 번째 펩티드의 서열은 서열번호 2로 기재되고, 또는
- 상기 C 말단의 첫 번째 펩티드의 서열은, HBV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하는 능력을 유지하는 조건에서, 상기 제거된 S단백질의 N-말단의 인접한 아미노산 서열과 적어도 91%, 특히 적어도 93%, 95%, 더욱 97%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 C 말단의 첫 번째 펩티드의 서열은, HBV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하는 능력을 유지하는 조건에서, isolate HBV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 아미노산 서열이거나 또는, 상기 제거된 S단백질 N-말단의 상기 아미노산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
발명의 목적은 융합 단백질 E1-Sd 또는 E2-Sd 또는 E1-E2-Sd에 있는데, 상기 융합단백질을 위해 제거된 S 단백질은 isolate HBVadw의 제거된 S 단백질이고, 서열번호 2의 서열을 갖는다(cf. table 1).
[6]. 본 발명에 있어, 상기 면역원성의 융합 단백질의 N 말단에 위치한 두 번째 펩티드는 이하의 아미노산으로 구성된다:
- 상기 N 말단의 두 번째 펩티드의 아미노산 서열은, HCV 특히 isolate HCV-1a 단백질 E1의 아미노산 서열 192번부터 380번까지에 자리한 인접한 아미노산에 의해 둘러싸여 있고,
특히 상기 N 말단의 두 번째 펩티드의 서열은 서열번호 4로 기재되고, 또는
- 상기 N 말단의 두 번째 펩티드의 서열은, HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존한다는 조건에서, 상기 단백질 E1의 인접한 아미노산 서열과 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 85%, 더욱 90%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 N 말단의 두 번째 펩티드의 서열은, HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원 성질을(immunogenic properties) 보존한다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 아미노산 서열이거나 또는, 상기 단백질 E1의 인접한 아미노산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
발명의 목적인 융합 단백질을 위해 단백질 E1의 서열은, isolate HCV-1a로부터 유래하고, 특히 융합 단백질 서열번호 4의 E1-Sd 또는 E1-E2-Sd, PIT1-E1-E2-Sd에 일치한다(cf. table 1).
[7]. 본 발명에 있어, 상기 면역원성의 융합 단백질 내의 첫 번째 펩티드와 두 번째 펩티드는 인접하고, 상기 융합 단백질은 이하의 아미노산 서열로 구성된다:
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 8로 기재되고 또는,
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 비감염성의 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지하는 조건에서, 서열번호 8의 서열과 적어도 88%, 특히 적어도 90%, 92%, 더욱 95%의 동일성을 보이고,
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 8으로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
발명의 목적인 융합 단백질 E1-Sd를 위해 단백질 E1의 서열은, isolate HCV-1a로부터 유래하고 상기 서열 서열번호 8가 제공되는데, 상기 서열은 E1의 서열번호 4의 앞 부분에 접목된 Sd의 서열번호 2에 일치한다.
[7b]. 본 발명에 있어, 상기 면역원성의 융합 단백질은, 두 번째 펩티드의 N 말단에 위치한 세 번째의 transfer initiation peptide로 구성되는데, 상기 융합단백질은 이하로 기재된다:
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 12로 기재되고, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지하는 조건에서, 서열번호 12의 서열과 적어도 83%, 특히 적어도 85%, 90%, 더욱 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 기재되고, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 12으로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열로 기재된다.
또 다른 발명의 목적인 융합 단백질 PIT1-E1-Sd를 위해, 단백질 E1의 서열은 HCV 특히 isolate HCV-1a로부터 유래하고 상기 서열 서열번호 12가 제공되며, 상기 서열은 E1의 서열번호 4의 N 말단에 접목된 Sd의 서열번호 2에 일치하는데, E1의 서열번호 4 는 HCV의 아미노산 서열이 166번부터 191번인 자리에 포함된 단백질 E1의 transfer initiation peptide E1(PIT1)의 아미노산 서열의 N 말단에 접목되어 있다.
상기 융합 단백질 E1-Sd의 N 말단에서 transfer initiation peptide의 삽입은, 번역 후 상기 융합 단백질을 소포체로 보내어, 상기 융합 단백질이 정확하게 당화되고 상기 융합 단백질의 삼차원적 구조 및/또는 와일드 타입(wild-type) 단백질에 대한 상기 융합 단백질의 항원 특성이 어떤 큰 변화를 보이지 않는다는 장점을 갖는다.
[8]. 본 발명에 있어, 상기 면역원성의 융합 단백질 내의 N 말단에 위치한 두 번째 펩티드는 이하의 아미노산 서열로 구성된다:
- 상기 N-말단의 두 번째 펩티드의 서열은, HCV 특히 isolate HCV-1a 단백질 E2의 아미노산 서열 384자리부터 743자리까지에 자리한 인접한 아미노산에 의해 둘러싸여 있고,
특히 상기 N-말단의 두 번째 펩티드의 서열은 서열번호 6로 기재되고, 또는
- 상기 N-말단의 두 번째 펩티드의 서열은, HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존한다는 조건에서, 상기 단백질 E2의 인접한 아미노산 서열과 적어도 78%, 특히 적어도 80%, 85%, 더욱 90%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 N-말단의 두 번째 펩티드의 서열은, HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존한다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 아미노산 서열이거나 또는, 상기 단백질 E2의 인접한 아미노산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
발명의 목적인 융합 단백질 E2-Sd, E1-E2-Sd 위해 단백질 E2의 서열은, HCV 특히 isolate HCV-1a로부터 유래하고 상기 단백질 E2의 서열의 상기 구간에 일치한다.
[9]. 본 발명에 있어서, 상기 면역원성 융합 단백질 내의 첫 번째와 두 번째 펩티드는 인접하고, 상기 융합 단백질은 이하의 아미노산 서열로 구성된다:
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 10로 기재되고 또는,
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 서열번호 10의 서열과 적어도 86%, 특히 적어도 88%, 90%, 더욱 95%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성한다는 조건에서, 서열번호 10으로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
발명의 목적인 융합 단백질 E2-Sd를 위해 단백질 E2의 서열은, isolate HCV-1a로부터 유래하고 상기 서열 서열번호 10가 제공되는데, 상기 서열은 E2의 서열번호 6의 앞 부분에 접목된 Sd의 서열번호 2에 일치한다.
[9b]. 본 발명에 있어, 상기 면역원성의 융합 단백질(PIT2-E2-Sd)은, 두 번째 펩티드의 N 말단에 위치한 세 번째의 transfer initiation peptide로 구성되는데, 상기 융합 단백질은 이하로 기재된다:
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 14로 기재되고, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, 서열번호 14의 서열과 적어도 82%, 특히 적어도 85%, 90%, 더욱 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 기재되고, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해서 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 14로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열로 기재된다.
발명의 다른 목적인 융합 단백질 PIT2-E2-Sd를 위해, 단백질 E2의 서열은 isolate HCV-1a로부터 유래하고 상기 서열 서열번호 14가 제공되며, 상기 서열은 E2의 서열번호 6의 N 말단에 접목된 Sd의 서열번호 2에 일치하는데, E2의 서열번호 6 은 HCV의 아미노산 서열이 366번부터 383번인 자리에 포함된 단백질 E2의 transfer initiation peptide E1(PIT2)의 아미노산 서열의 N 말단에 접목되어 있다.
또 다른 발명의 목적은 융합 단백질 E1-E2-Sd 또는 PIT-E1-E2-Sd 이다. 또한 상기 융합 단백질이 정제된 형태인 것도 발명의 목적이다.
발명은 또한 상기 융합 단백질을 인코딩하는 하이브리드 핵산 분자에 관한 내용에도 관계된다.
" 하이브리드 핵산분자( Hybrid nucleic acid molecule )"란 isolate HBV의 N 말단 끝에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)이 제거된 S 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 서열로 구성된 어떤 핵산분자이며, isolate HCV의 막 단백질을 거의 완전하게 인코딩하는 적어도 하나의 서열로 구성되는 어떤 핵산분자이며, 또는 상기에서 정의한 분자로부터 얻어진 어떤 분자와, 이어지는 유전자 코드의 자연적 퇴보 뒤에 수정된 어떤 분자를 말한다.
본 발명은 상기 하이브리드 핵산분자에 관한 것으로, 상기 핵산분자는 상기에서 정의한 융합 단백질을 인코딩하고 이하의 핵산 서열로 구성된다:
a) 상기 핵산분자를 구성하는 3' 측의 첫 번째 핵산 서열은, isolate HBV의 N 말단 끝에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 제거한 S 단백질을 인코딩하고, 또는
- 3' 측의 첫 번째 핵산 서열은, HBV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral partocles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 N 말단에서 제거된 S단백질의 핵산 서열과 적어도 91%, 특히 적어도 93%, 95%, 더욱 97%의 상동성을 보이고, 또는
- 3' 측의 첫 번째 핵산 서열은, HBV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral partocles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 다른 isolate HBV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 핵산 서열이거나 또는 N 말단에서 제거된 S단백질의 핵산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이고,
b) 상기 핵산분자를 구성하는 첫 번째 핵산 서열의 5' 측에서, 두 번째 핵산 서열은, isolate HCV의 막 단백질 E1 또는 E2 중 적어도 어느 하나의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 엑토도메인(ectodomain)을 인코딩하고, 또는
- 상기 두 번째 핵산 서열은, HCV에 대해 상기의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질이 면역원 성질을 보존한다는 조건에서, isolate HCV의 상기 E1 또는 E2 단백질 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 78%, 특히 적어도 80%, 85%, 더욱 90%의 상동성을 보이고,
- 상기 두 번째 핵산 서열은, HCV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원 성질을 보존한다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 핵산 서열이거나 또는 상기 E1 또는 E2 단백질 중 어느 하나의 핵산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이고,
상기 두 번째 핵산 서열은 단백질 E1과 E2 또는 단백질 E1과 E2로 구성되는 융합 단백질을 인코딩하는 서열에서 선택된 것이고
c) 상기 핵산분자를 구성하는 두 번째 핵산 서열의 5'측에서, 세 번째 핵산 서열은, isolate HCV의 막 단백질 E1 또는 E2의 transfer initiation peptide(PIT)를 인코딩하고, 또는
- 상기 세 번째 핵산 서열은, 상기 핵산 서열에 의해서 인코딩된 transfer initiation peptide가, 번역(translation) 후에, 소포체로 상기 융합 단백질을 이동시킬 수 있는 능력을 유지하여 상기 융합 단백질이 정확하게 당화(glycosylated)되고, 상기 융합 단백질의 삼차원 구조가 가능한 가장 적게 변형되고 그리고/또는 상기 융합 단백질의 와일드 타입(wild-type) S 단백질에 관한 항원특성이 되도록 보존된다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 핵산 서열이거나 또는 transfer initiation peptide(PIT)를 인코딩하는 상기 단백질의 핵산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이고, 또는
- 상기 세 번째 핵산 서열은 펩티드를 인코딩하는 것으로, 상기 펩티드가 상기 융합 단백질을, 번역(translation) 후에, 소포체로 보내어 상기 융합 단백질이 정확히 당화(glycosylated)되고 상기 융합 단백질의 삼차원 구조가 가장 적게 변화되고 그리고/또는 상기 융합 단백질의 와일드 타입(wild-type) 단백질에 관한 항원특성이 되도록 보존된다.
본 발명의 목적은 하이브리드 핵산분자(특히 이하 테이블 1에서 정의한 e1-sd, 또는 e2-sd 또는 e1-e2-sd, pit1-e1-sd 또는 pit2-e2-sd)인데, 상기 하이브리드 핵산 분자는 5'부터 3'까지의 서열로 각각 구성되는 것으로, 상기 융합 단백질(특히 E1-Sd 또는 E2-Sd 또는 E1-E2-Sd, PIT1-E1-Sd 또는 PIT2-E2-Sd)과 isolate HCV의 transfer initiation peptide(PIT), isolate HCV의 E1 또는 E2, isolate HBV의 제거된 S단백질을 인코딩한다.
상기 융합 단백질(특히 E1-Sd 또는 E2-Sd 또는 E1-E2-Sd)의 N 말단에 접목된 transfer initiation peptide을 인코딩하는 핵산 서열의 삽입은, 번역 후에 상기 융합 단백질을 소포체로 보내어, 상기 융합 단백질이 정확하게 당화되고 상기 융합 단백질의 삼차원 구조 그리고/또는 와일드 타입(wild-type) S 단백질에 대한 상기 융합 단백질의 항원 특성이 어떤 큰 변화를 보이지 않는다는 장점을 갖는다.
발명의 또 다른 목적인 상기 하이브리드 핵산분자는, 상기 하이브리드 핵산 분자가 오직 상기 첫 번째인 두 상기 핵산 서열로만 구성되어 있고, transfer initiation peptide를 인코딩하는 핵산 서열은 갖지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 융합 단백질을 인코딩하는 상기 하이브리드 핵산 분자는 적어도 이하로 구성된다:
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, 특히 C 말단 끝에 위치한 3개의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)으로 구성된(도 2a 및 도 3a) HBV의 제거된 S단백질(Sd)을 인코딩하는 서열로서, 상기 제거된 S 단백질은 서브바이러스 입자(subviral particles)로 조립할 수 있는 능력과 HBV에 대한 면역원성을 보존하며,
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, 단백질 E1, E2 중 하나의 서열을 거의 총체적으로 인코딩하는 것으로, 상기 단백질은 HCV에 대한 면역원성을 또한 보존하고,
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, transfer initiation peptide을 인코딩하는 것으로, 상기 transfer initiation peptide은 번역후에 융합 단백질을 소포체로 이동시켜 상기 융합 단백질이 정확히 당화(glycosylated)되고 상기 융합 단백질의 삼차원적 구조가 가능한 가장 적게 변화하고, 그리고/또는 상기 융합 단백질의 와일드 타입(wild-type) S 단백질에 대한 항원특성이 되도록 보존되게 하며,
그래서 상기 하이브리드 핵산분자에 의해 인코딩된 융합 단백질은, 서브바이러스입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있고, HBV 및/또는 HCV 특히 HBV 및 HCV에 대해 면역원성을 유지할 수 있다.
" 상동성 비율( Percentage of homology )" 이란 ...폴리뉴클레오티드 분자의 두 서열을 직접 비교하여 결정되는 것으로서, 상기 서열은 두 서열의 핵산 잔기 수를 통해 정해지는 것이고, 두 서열 중 짧은 잔기 수를 긴 잔기 수로 나눈 값에 100을 곱해 정한다.
본 발명에서, E1 및/또는 E2의 트랜스멤브레인 도메인(trasnsmembrane domain)을 인코딩하는 핵산 서열은, 특히 3'에 위치한 마지막 9개의 핵산 중 적어도 하나가 제거된 것으로서, 상기 핵산 서열은 E1 및/또는 E2의 트랜스멤브레인 도메인(trasnsmembrane domain)을 인코딩하는 것으로 이하와 같다:
- isolate HCV 게놈(genome)의 뉴클레오티드 단편(fragment)의 위치는:
* E1의 트랜스멤브레인 도메인(trasnsmembrane domain)을 합성하는 핵산 서열에 관하여, 핵산 서열이 1398번부터 1490번, 특히 1398번부터 1481번까지의 자리에 위치하고, 또는
* E2의 트랜스멤브레인 도메인(trasnsmembrane domain)을 합성하는 핵산 서열에 관하여, 핵산 서열이 2493번부터 2579번, 특히 2493번부터 2570번까지의 자리에 위치하고, 또는
- isolate HCV 게놈(genome)의 뉴클레오티드 단편(fragment)은, E2에 관하여 상기 HCV 게놈의 와일드 타입(wild-type) 뉴클레오티드 단편(fragment)과 적어도 91%의 상동성을 갖으며, 또는
- 뉴클레오티드 단편(fragment)은 HCV의 자연변형물(natural variant)로부터 얻어진 것, 및/또는 isolate HCV 게놈의 와일드 타입(wild-type) 뉴클레오티드 단편의 인공변형물(synthetic variant)로부터 얻어진 것이다.
" 3'에 위치한 마지막 9개의 핵산 중 적어도 하나가 제거된 E1 및/또는 E2의 트랜스멤브레인 도메인(trasnsmembrane domain) " 이란 상기 트랜스멤브레인 도메인(trasnsmembrane domain) 중 하나의 3'위치에 있는 3개의 핵산 또는 6개의 핵산, 또는 9개의 핵산이 제거된 것을 의미한다.
상기 하이브리드 핵산분자의 첫 번째 및 두 번째 핵산 서열은, 상기 면역원성의 융합 단백질을 인코딩하는 것으로, 서로 인접해 있고, 첫 번째 핵산 서열의 5'부분은 공유결합의 방식으로 두 번째 핵산 서열의 3'에 결합돼 있다.
발명에 의할 때, 상기 하이브리드 핵산분자는 예를 들어 e1-sd, e2-sd 또는 pit1-e1-sd 또는 pit2-e2-sd에 일치하며, 상기 각 핵산분자는 E1-Sd, E2-Sd, PIT1-E1-Sd 또는 PIT2-E2-Sd 를 인코딩한다.
본 발명에서, binding peptide 를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 상기 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오티드 서열을 연결하는데, 상기 뉴클레오티드 서열은 이하와 같이 구성된다:
- 상기 뉴클레오티드 서열은, 3개 또는 6개 또는 9개 또는 12개 또는 15개의 핵산으로 구성되고, 또는
- 상기 뉴클레오티드 서열은, 어떤 binding peptide를 인코딩하는 어떤 뉴클레오티드 서열로 구성된 것으로, 조건은 이하와 같다.
상기 binding peptide를 포한하는 것으로 하이브리드 핵산분자에 의해 인코딩되는 면역원성의 융합 단백질은, 와일드 타입 S 단백질의 존재하에서, 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)로 자기조립(self-assemble)할 수 있는 능력을 유지하고 HCV 및/또는 HBV에 대하여 면역원성을 보존한다는 조건이다.
상기와 같은 점에서, 본 발명의 목적인 상기 하이브리드 핵산 분자에 위치한 첫 번째 핵산 서열은, HBV 특히 isolate HBVadw의 N 말단의 제거된 S단백질을 인코딩하는데, 상기 하이브리드 핵산분자의 3'에 위치하고 이하의 핵산 서열로 구성된다:
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HBV 게놈의 1630번부터 2241번까지 자리에 위치한 인접한 핵산 서열에 의해 둘러싸여 있고, 특히
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, 서열번호 1으로 기재되고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HBV에 대해 상기 핵산서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 N 말단의 제거된 S 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열과 적어도 91%, 특히 93%, 95% 더욱 97%의 상동성을 보이고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HBV에 대해 상기 핵산서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 임자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, isolate HBV로 부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 핵산 서열이거나 또는 상기 N 말단에서 제거된 S 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이다.
본 발명에 관한 상기 하이브리드 핵산분자(특히 e1-sd, 또는 e2-sd 또는 e1-e2-sd 또는 pit1-e1-sd 또는 pit2-e2-sd 또는 pit1-e1-e2-sd)는 상기 융합 단백질(특히 E1-Sd 또는 E2-Sd 또는 E1-E2-Sd, PIT1-E1-Sd 또는 PIT2-E2-Sd 또는 PIT1-E1-E2-Sd)을 인코딩하는 것으로, HCV의 제거된 S 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열은 HBVadw의 핵산 서열이며, 상기 핵산 서열은 서열번호 1이다.
상기와 같은 점에서, 본 발명의 목적인 상기 하이브리드 핵산 분자에 위치한 두 번째 핵산 서열은, HBV 특히 isolate HBV-1a의 단백질 E1의 엑토도메인(ectodomain)과 트랜스멤브레인 도메인(transmembraane domain)을 인코딩하는 하는데, 상기 하이브리드 핵산분자의 5'에 위치하고 이하의 핵산 서열로 구성된다:
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HCV 특히 isolate HCV-1a 게놈의 915번부터 1490번까지 자리, 특히 915번부터 1481번까지에 위치한 인접한 핵산 서열에 의해 둘러싸여 있고,
특히 핵산 서열은 서열번호 3으로 기재되고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HCV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성을 보존한다는 조건에서, 상기 단백질 E1의 핵산 서열과 적어도 75%, 특히 80%, 85% 더욱 90%의 상동성을 보이고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HCV에 대해 상기 핵산서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성을 보존한다는 조건에서, isolate HCV로 부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 핵산 서열이거나 또는 단백질 E1의 핵산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이다.
본 발명에 관한 상기 하이브리드 핵산분자(특히 e1-sd, 또는 pit1-e1-sd 또는 e1-e2-sd, 또는 pit1-e1-e2-sd)는 상기 융합 단백질(특히 E1-Sd 또는 PIT1-E1-Sd 또는 E1-E2-Sd, 또는 PIT1-E1-E2-Sd)을 인코딩하는 것으로, HCV의 제거된 S 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열은 isolate HCV-1a의 핵산 서열이며, 상기 핵산 서열은 서열번호 3이다.
본 발명에서 N 말단에 위치한 transfer initiation peptide를 포함하는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 상기 하이브리드 핵산분자는, 이하의 핵산 서열로 기재된다:
- 상기 하이브리드 핵산분자는 서열번호 11로 기재되고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산분자의 핵산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 상기 단백질이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존한다는 조건에서, 상기 서열번호 11 서열과 적어도 78%, 특히 적어도 80%, 85%, 더욱 90%의 상동성을 보이는 것으로 기재되고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산분자의 핵산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 상기 단백질이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존한다는 조건에서, 상기 서열번호 11로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열로 기재된다.
상기 핵산 서열 서열번호 11은 pit1-e1-sd로 명명되고, 서열번호 12의 융합 단백질 PIT1-E1-Sd을 인코딩한다.(테이블 1)
발명에 관한 하이브리드 핵산분자, 특히 서열번호 11 인 pit1-e1-sd는 이하와 같다:
- 단백질 E1을 인코딩하는 핵산 서열은, HCV 특히 isolate HCV-1a로부터 얻은 것이고, 상기 핵산 서열은 상기 서열번호 3이며,
- S 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은, HBV 특히 isolate HBVadw로부터 얻은 것으로 상기 서열번호 1이고, 상기 서열번호 1은 E1의 상기 서열번호 3의 5' 끝에 접목돼있고, 상기 E1의 서열번호 3은 핵산 837번부터 914번까지로 구성된 영역에 포함되는 것으로 E1의 transfer initiation peptide(PIT1)를 인코딩하는 핵산 서열의 5'측에 접목되어 있다.
상기와 같은 점에서, 본 발명의 목적인 상기 하이브리드 핵산 분자의 두 번째 핵산 서열은, HCV 특히 isolate HBV-1a의 단백질 E2의 엑토도메인(ectodomain)과 트랜스멤브레인 도메인(transmembraane domain)을 인코딩하는 하는데, 상기 분자의 5'에 위치하고 이하의 핵산 서열로 구성된다:
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HCV 특히 isolate HCV-1a 게놈의 1491번부터 2579번까지 자리, 특히 1491번부터 2570번까지에 위치한 인접한 핵산 서열에 의해 둘러싸여 있고,
특히 핵산 서열은 서열번호 5으로 기재되고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HCV에 대해 상기 핵산서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성을 보존한다는 조건에서, 상기 단백질 E2의 핵산 서열과 적어도 78%, 특히 80%, 85% 더욱 90%의 상동성을 보이고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HCV에 대해 상기 핵산서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성을 보존한다는 조건에서, isolate HCV로 부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 핵산 서열이거나 또는 서열번호 5로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이다.
본 발명에 관한 상기 하이브리드 핵산분자(e2-sd, 또는 pit2-e2-sd)는 상기 융합 단백질(E2-Sd 또는 PIT2-E2-Sd)을 인코딩한다.
본 발명에서 N 말단에 위치한 transfer initiation peptide을 포함하는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 상기 하이브리드 핵산분자는 이하의 핵산 서열로 기재된다:
- 상기 하이브리드 핵산분자는 서열번호 13로 기재되고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산분자의 핵산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 상기 단백질이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존한다는 조건에서, 상기 서열번호 13 서열과 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 90%, 더욱 95%의 상동성을 보이는 것으로 기재되고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산분자의 핵산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 상기 단백질이 면역원 성질(immunogenic properties)을 보존한다는 조건에서, 상기 서열번호 13로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열로 기재된다.
상기 핵산 서열 서열번호 13은 pit2-e2-sd로 명명되고, 서열번호 14의 융합 단백질 PIT2-E2-Sd을 인코딩한다.(테이블 1)
발명에 관한 하이브리드 핵산분자(특히 서열번호 13 인 pit2-e2-sd)는 이하와 같다:
- 단백질 E2을 인코딩하는 핵산 서열은, HCV 특히 isolate HCV-1a로부터 얻은 것이고, 상기 핵산 서열은 상기 서열번호 5이며,
- S 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은, HBV 특히 isolate HBVadw로부터 얻은 것으로 상기 서열번호 1이고, 상기 서열번호 1은 E1의 상기 서열번호 5의 5' 끝에 접목돼있고, 상기 E2의 서열번호 5는 핵산 1437번부터 1490번까지로 구성된 영역에 포함되는 것으로 E2의 transfer initiation peptide(PIT2)를 인코딩하는 핵산 서열의 5'측에 접목되어 있다.
발명의 또 다른 목적이란, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 상기 하이브리드 핵산 분자를 구성하는 벡터뿐 아니라 상기 하이브리드 핵산분자에 작동하는 방법으로 연결된 발현을 위해 필요한 수단도 의미한다..
발명의 목적인 expression vectors와 관련하여, plasmids, viral vectors of lentiviral type, Semliki, adenovirus, poxvirus, vaccine virus, baculovirus, bacterial vectors of the salmonella type and BCG 를 예로 들 수 있다.
“발현을 위해 필요한 수단( Necessary means for the expression )”은 단백질을 말하는데, 단백질이란 용어는 예를 들어 융합 단백질, 단백질의 단편, 펩티드, 다 단백질, 폴리펩티드 등과 같은 아미노산의 어떤 분자를 의미하는 것으로 사용되고, 어떤 수단이란 단백질, 예를 들어 프로모터(promoter), 전사종결인자(transcription terminator), 복제원점(origin of replication) 그리고 셀렉션 마커(selection marker)와 같은 것을 의미한다. 펩티드의 발현을 위해 필요한 수단이란 관심 펩티드(peptide of interest)를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 방법으로 연결돼 있다.
“작동방법으로 연결된( Linked in an operational manner )”이란 상기 발현을 위해 필요한 요소와 관심 펩티드(peptide of interest)를 인코딩하는 유전자의 병치(juxtaposition)로서, 상기 요소와 유전자가 예상되는 방법으로 기능을 수행할 수 있도록 하는 관계를 말한다. 예를 들어, 프로모터와 관심 유전자 사이에는, 이들간의 기능적인 관계가 보존되는 한, 보충전인 염기가 존재할 수 있다.
펩티드의 발현을 위해 필요한 수단은, 상동(homologous)의 것, 다시 말해 사용된 벡터 유전자에 포함되는 것이나, 또는 대신에 비상동(heterologous)일 수 있다. 후자의 경우, 상기 수단은 발현되기 위해 관심 펩티드(peptide of interest)가 클로닝된 것이다.
Semliki vector와 lentiviral vector에서 expression vectors로 사용된 프로모터(promotor)는 상동의 프로모터이고 cytomegolovirus(CMV) 프로모터이다.
비상동의 프로모터는 (i) the SV40 (Simian Virus 40) promoter, the promoter of the gene of the thymidine-kinase of the Herpes simplex virus (TK-HSV-1), the LTR of the Rous sarcoma virus (RSV), the cytomegolovirus (CMV) promoter and the adenovirus major late promoter (MLP)와 같은 바이러스 프로모터 뿐만 아니라, (ii) the promoter of the constitutive gene of phosphoglycerate-kinase (PGK) (Adra et al., 1987, Gene, 60: 65-74), the promoter of specific genes of the liver alphal-antitrypsine and FIX and the specific promoter SM22 of the cells of the smooth muscle (Moessler et al., 1996, Development, 122: 2415-2425)와 같이 더 높은 단계의 진행생물에서 펩티드를 인코딩하는 유전자의 전사(transcription)를 조절하는 어떤 셀 프로모터(cell promoter)로 구성된다.
본 발명은 상기 벡터, 더 나아가 lentiviral vector를 구성하는 것에 관한 것이다.
본 발명에서, lentiviral vector는 vector pLenti이다.
상기 벡터는 이하에 개시된 바 있다. Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H., Verma, I. M., and Trono, D. (1996). In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272(5259), 263-7.
본 발명에서 상기 벡터는, Semliki Forest virus의 게놈으로부터 얻어진 결함있는 바이러스 벡터로 구성된다.
상기는 이하에 개시된 바 있다. Schlesinger, S., and T. M. Dubensky, Jr. 1999. Alphavirus vectors for gene expression and vaccines. Curr. Opin. Biotechnol. 10:434-439.
본 발명에서, Semliki Forest virus의 게놈으로부터 얻어진 결함있는 바이러스 벡터는 pSFV1 이고, 후자는 인비트로젠에 의해 상업적으로 생산된다.
상기와 같은 점에서, 본 발명의 목적인 상기 벡터에 위치한 하이브리드 핵산분자는 하기의 핵산 서열로 구성된다:
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은 서열번호 11이고 또는,
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 융합 단백질을 인코딩한다는 조건에서, 상기 서열번호 11 서열과 적어도 78%, 특히 적어도 80%, 85%, 더욱 90%의 상동성을 갖는 핵산 서열로 구성되고,
상기 벡터는 특히 서열번호 15 로 기재되고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 융합 단백질을 인코딩한다는 조건에서, 서열번호 11로 기재되는 핵산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이다.
본 발명의 목적인 서열 서열번호 15의 pSFV1 로부터 얻어진 벡터는, 상기 융합단백질(특히 서열번호 12 인 PIT1-E1-Sd)을 인코딩하는 하이브리드 핵산분자(특히 서열번호 11 인 pit1-e1-sd)로 구성되는데:
- 단백질 E1을 인코딩하는 핵산 서열은 HCV, 특히 isolate HCV-1a로부터 얻어지고, 상기의 서열 서열번호 3 이며,
- S 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은, HBV 특히 isolate HBVadw로부터 얻은 것으로 상기 서열번호 1이고, 상기 서열번호 1은 E1의 상기 서열번호 3의 5' 끝에 접목돼있고, 상기 E1의 서열번호 3은 핵산 837번부터 914번까지로 구성된 영역에 포함되는 것으로 E1의 transfer initiation peptide(PIT1)를 인코딩하는 핵산 서열의 5'측에 접목되어 있다.
상기와 같은 점에서, 발명의 목적인 상기 벡터의 하이브리드 핵산분자는 이하의 핵산 서열로 구성된다:
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은 서열번호 13 로 기재되고 또는,
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있다는 조건에서, 상기 서열번호 13 서열과 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 90%, 더욱 95%의 동일성을 보이는 핵산 서열로 구성되고,
상기 벡터는 특히 서열번호 16 로 기재되고,
- 상기 하이브리드 핵산분자를 구성하는 핵산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있다는 조건에서, 서열번호 13의 핵산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이다.
본 발명의 목적인 서열 서열번호 16 인 벡터는, 상기 융합단백질(특히 서열번호 14 인 PIT1-E1-Sd)을 인코딩하는 하이브리드 핵산분자(특히 서열번호 13 인 pit1-e1-sd)로 구성되는데:
- 단백질 E2를 인코딩하는 핵산 서열은 HCV, 특히 isolate HCV-1a로부터 얻어지고, 상기의 서열 서열번호 5 이며,
- S 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은, HBV 특히 isolate HBVadw로부터 얻은 것으로 상기 서열번호 1이고,
- 상기 서열번호 1은 E2의 상기 서열번호 5의 5' 끝에 접목돼있고, 상기 E2의 서열번호 5은 핵산 1437번부터 1490번까지로 구성된 영역에 포함되는 것으로 E2의 transfer initiation peptide(PIT2)를 인코딩하는 핵산 서열의 5'측에 접목되어 있다.
본 발명에서 상기 벡터는, 하기 3개의 핵산 서열로 이루어진 하이브리드 핵산분자로 구성된다:
a) 3' 측에서 첫 번째 핵산 서열은, isolate HBV의 N 말단 끝에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)이 제거된 S 단백질을 인코딩하고, 또는
- 상기 핵산 서열은, HBV에 대해 상기 핵산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 펩티드를 인코딩한다는 조건에서, N 말단의 제거된 S 단백질의 핵산 서열과 적어도 91%, 93%, 95%, 특히 97%의 상동성을 갖고, 또는
- 상기 핵산 서열은, HBV에 대해 상기 핵사서열에 의해 인코딩되는 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 펩티드를 인코딩한다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 핵산 서열이거나 또는 제거된 S 단백질(Sd)을 인코딩하는 상기 핵산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)이다.
b) 첫 번째 핵산 서열의 5' 끝에 있는 두 번째 핵산 서열은, isolate HCV의 막 단백질 E1 또는 E2 중 적어도 하나의 의 엑토도메인(ectodomain)과 트랜스멤브레인 도메인(trnasmembrane domain)을 인코딩하고, 또는
- 상기 핵산 서열은, HCV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질이 면역원성의 펩티드를 인코딩할 수 있다는 조건에서, isolate HCV의 상기 단백질 E1 또는 E2 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 78%, 80%, 85%, 특히 90%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 핵산 서열은, HCV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질이 면역원성의 펩티드를 인코딩할 수 있다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 핵산 서열이거나 또는 막 단백질 E1 또는 E2를 인코딩하는 상기 핵산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)이고,
상기 두 번째 서열은 단백질 E1과 E2, 또는 E1과 E2로 이루어진 융합 단백질을 인코딩하는 서열로부터 선택되고,
c) 두 번째 핵산 서열의 5' 끝에 있는 세 번째 핵산 서열은, isolate HCV의 transfer initiation peptide(PIT)를 인코딩하는 것이고, 또는
- 상기 핵산 서열은, 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 transfer initiation peptide(PIT)가 번역 후에 상기 융합 단백질을 소포체로 이동시킬 수 있는 능력을 유지하여 상기 융합 단백질이 정확히 당화(glycolated)되고, 상기 융합 단백질의 삼차원구조가 가능한 가장 적게 변화하며, 그리고/또는 wild-type 단백질에 대해 상기 융합 단백질의 항원특성이 되도록 보존되는 조건하에, HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)이거나 또는 transfer initiation peptide(PIT)를 인코딩하는 단백질의 핵산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)이며, 또는
- 상기 핵산 서열은, 번역 후에 상기 융합 단백질을 소포체로 보내어, 상기 융합 단백질이 정확히 당화(glycolated)되고, 상기 융합 단백질의 삼차원구조가 가능한 작게 변화하며, 그리고/또는 와일드 타입(wild-type) 단백질에 대한 상기 융합 단백질의 항원특성이 되도록 보존되게 하는 펩티드를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적인 상기 벡터에서, 상기 하이브리드 핵산 분자(특히 e1-sd 또는 e1-e2-sd)의 첫 번째와 두 번째 핵산 서열은, 상기 면역원성의 융합 단백질(E1-Sd E1-E2-Sd)을 인코딩하며 그 위치가 서로 인접하고, 첫 번째 핵산 서열의 5'끝에는 두 번째 핵산 서열의 3' 끝이 공유결합의 방식으로 결속돼 있다.
또 다른 관점에서 보면, 본 발명의 벡터(vector pLenti와 같은 lentiviral vector 또는 vector pSFV1와 같은 Semliki Forest virus의 유전자로부터 얻어진 손상된 바이러스 벡터)에 있어, binding peptide를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 면역원성의 융합 단백질(E1-Sd 또는 E2-Sd)을 인코딩하는 상기 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열을 연결하는데, 상기 뉴클레오티드 서열은,
결합펩티드를 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열이, 와일드 타입(wild-type) S 단백질의 존재하에서 상기 면역원성 융합 단백질의 서브바이러스 입자(subviral particles)로의 자기조립(self-assemble) 능력을 변경시키지 못하고 상기 융합 단백질이 HCV 및/또는 HBV에 대해 면역원 성질을 보존한다는 조건에서, 3, 또는 6, 또는 9, 또는 12, 또는 15개의 핵산 서열로 구성된다.
상기 벡터는, HBV 특히 isolate HBVadw의 N 말단 제거된 S 단백질을 인코딩하는 첫 번째 핵산 서열로 구성되는데, 핵산 서열은 이하와 같다:
- 상기 핵산 서열은, HBV 특히 isolate HBVadw의 1630번부터 2241번까지에 위치한 인접한 핵산에 둘러싸여 있고,
득히 서열번호 1로 기재되고, 또는
- 상기 핵산 서열은, HBV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 1와 적어도 91%, 93%, 95%, 특히 97%의 상동성을 갖고, 또는
- 상기 핵산 서열은, HBV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, isolate HBV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 핵산 서열이거나 또는 서열번호 1로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이다.
본 발명의 융합 단백질(특히 E1-Sd, 또는 E2-Sd, 또는 E1-E2-Sd, 또는 PIT1-E1-Sd, 또는 PIT2-E2-Sd)을 인코딩하는 상기 하이브리드 핵산 분자(특히 e1-sd, 또는 e2-sd, 또는 e1-e2-sd, 또는 pit1-e1-sd, 또는 pit2-e2-sd)로 구성된 상기 벡터(특히, vector pLenti와 같은 lentiviral vector 또는 vector pSFV1와 같은 Semliki Forest virus의 유전자로부터 얻어진 손상된 바이러스 벡터)에 있어서, HBV의 제거된 S 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열은 isolate HBVadw의 핵산서열이고 그 서열은 서열번호 1이다.
본 발명의 상기 벡터는, HCV, 특히 isolate HCV-1a의 단백질 E1의 엑토도메인(ectodomain)과 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 인코딩하는 두 번째 핵산 서열로 구성되는데, 상기 핵산 서열은 상기 분자의 5'에 위치하고, 이하로 구성된다:
- 상기 핵산 서열은, HCV 특히 isolate HBV 1-a 게놈의 915번부터 1490번까지, 특히 915번부터 1481번까지에 위치한 인접한 핵산에 둘러싸여 있고,
특히 서열번호 3으로 기재되고, 또는
- 상기 핵산 서열은, HCV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질이 면역원 성질을 보존한다는 조건에서, 단백질 E1을 인코딩하는 상기 핵산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 특히 90%의 상동성을 갖고, 또는
- 상기 핵산 서열은, HCV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질이 면역원 성질을 보존한다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 핵산 서열이거나 또는 E1 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이다.
본 발명의 융합 단백질(특히 E1-Sd, 또는 E1-E2-Sd, 또는 PIT1-E1-Sd)을 인코딩하는 상기 하이브리드 핵산 분자(특히 e1-sd, 또는 e1-e2-sd, 또는 pit1-e1-sd)로 구성된 상기 벡터(특히, vector pLenti와 같은 lentiviral vector 또는 vector pSFV1와 같은 Semliki Forest virus의 유전자로부터 얻어진 손상된 바이러스 벡터)에 있어서, HCV의 E1 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열은 isolate HCV1-a의 핵산 서열이고 그 서열은 서열번호 3이다.
본 발명의 상기 벡터는, HCV, 특히 isolate HCV-1a의 단백질 E2의 엑토도메인(ectodomain)과 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 인코딩하는 두 번째 핵산 서열로 구성되는데, 상기 핵산 서열은 상기 분자의 5'에 위치하고, 이하로 구성된다:
- 상기 핵산 서열은, HCV 특히 isolate HBV 1-a 게놈의 1491번부터 2579번까지, 특히 1491번부터 2570번까지에 위치한 인접한 핵산에 둘러싸여 있고,
특히 서열번호 5으로 기재되고, 또는
- 상기 핵산 서열은, HCV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질이 면역원 성질을 보존한다는 조건에서, 단백질 E2를 인코딩하는 상기 핵산 서열과 적어도 78%, 80%, 85%, 특히 90%의 상동성을 갖고, 또는
- 상기 핵산 서열은, HCV에 대해 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질이 면역원 성질을 보존한다는 조건에서, isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 핵산 서열이거나 또는 E2 단백직을 인코딩하는 핵산서열로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이다.
본 발명의 융합 단백질(특히 E2-Sd, 또는 E1-E2-Sd, 또는 PIT2-E2-Sd)을 인코딩하는 상기 하이브리드 핵산 분자(특히 e2-sd, 또는 e1-e2-sd, 또는 pit2-e2-sd)로 구성된 상기 벡터(특히, vector pLenti와 같은 lentiviral vector 또는 vector pSFV1와 같은 Semliki Forest virus의 유전자로부터 얻어진 손상된 바이러스 벡터)에 있어서, HCV의 E2 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열은 isolate HCV1-a의 핵산 서열이고 그 서열은 서열번호 5이다.
본 발명의 막 입자는, 서브바이러스(subviral), 키메라(chimeric), 면역원성(immunogenic), 비감염(non infection)적 특성을 갖는데, 이하 단백질로 구성된다:
- 상기 단백질은 isolate HBV 표면항원의 와일드 타입(wild-type) S 단백질로 구성되고,
- 적어도 상기 면역원성 융합 단백질 중 하나로 구성된다.
“키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particle)”이란 와일드 타입(wild-type) S 단백질의 존재하에, 적어도 HBV의 와일드 타입(wild-type) S 단백질과 와일드 타입(wild-type) S단백질의 자기조립으로부터 기인한 상기 면역원성의 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질의 조립으로 구성된 어떤 서브바이러스 입자(subviral particles)를 말한다.
상기 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)의 면역원성 융합 단백질이란:
- 아미노산 서열이 서열번호 8로 기재되고, 또는
- 상기 아미노산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 상기 서열번호 8 서열과 적어도 88%, 특히 적어도 90%, 92%, 더욱 95%의 동일성을 보이고,
- 상기 아미노산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, isolate HCV 및/또는 HBV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 아미노산 서열이나 아미노산 서열 서열번호 8로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
본 발명의 상기 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)는, 상기 융합 단백질 특히 서열번호 8의 E1-Sd 또는 E1-E2-Sd로 구성된 것으로, 상기 단백질에서 E1 단백질의 서열은, 특히 상기 서열번호 4이며 서열번호 2에서 제거된 S단백질(Sd)의 아미노산서열 C 말단에 접목된다.
상기 면역원성의 키메라 서브바이러스(chimeric subviral particles) 입자의 면역원성 융합 단백질은 이하로 구성된다:
- 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열이 서열번호 10로 기재되고, 또는,
- 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 상기 서열번호 10 서열과 적어도 86%, 특히 적어도 88%, 92%, 더욱 95%의 동일성을 보이고,
- 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 아미노산 서열 서열번호 10로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
본 발명의 상기 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)는, 상기 융합 단백질 특히 서열번호 10의 E1-Sd 또는 E1-E2-Sd로 구성된 것으로, 상기 단백질에서 E1 단백질의 서열은, 특히 상기 서열번호 6이며 서열번호 2에서 제거된 S단백질(Sd)의 아미노산서열 C 말단에 접목된다.
발명에서, 상기 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)는 이하 두 융합 단백질로 구성된다:
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 8로 기재되고, 또는,
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 서열번호 8 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지하는 단백질을 인코딩한다는 조건에서, 상기 서열번호 8 서열과 적어도 88%, 특히 적어도 90%, 92%, 더욱 95%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 서열번호 8 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지하는 단백질을 인코딩한다는 조건에서, 아미노산 서열 서열번호 8로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열로 구성되고,
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 10 서열로 기재되며, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 10 서열과 적어도 86%, 특히 적어도 88%, 90%, 더욱 95%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HVB 및/또는 HVC에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성하는 능력을 유지한다는 조건에서, 아미노산 서열 서열번호 10로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
본 발명의 상기 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)는 상기 두 융합 단백질로 구성된다.(특히, 서열번호 8인 E1-Sd 또는 서열번호 10인 E2-Sd)
본 발명의 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)에 있어서, 면역원성의 융합 단백질은 적어도 isolate HCV의 막 단백질(E1)으로 구성되며, 상기 단백질은 이하로 구성된다:
- 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HCV 특히 isolate HCV-1a의 와일드 타입(wild-type) S 단백질의 192번부터 380번까지의 아미노산으로 구성된 자리에 위치한 아미노산 잔기에 일치하고, 또는
- 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성을 보존한다는 조건에서, isolate HCV의 와일드타입(wild-type) 단백질 E1의 상기 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 특히 90%의 동일성을 보이고,
- 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성을 보존한다는 조건에서, HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 아미노산 서열이거나 또는 단백질 E1으로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
본 발명의 상기 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)는 상기 융합 단백질(특히 E1-Sd, 또는 E1-E2-Sd, 또는 PIT1-E1-E2-Sd, 또는 PIT2-E2-E1-Sd)로 구성되는데, 단백질 E1의 서열은 isolate HCV-1a로부터 얻어진 것이다.
본 발명의 상기 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)에 있어서, 면역원성의 단백질은 적어도 isolate HCV의 막 단백질 중 어느 하나로 구성되는데, 상기 단백질은 이하에서 선택된 아미노산 서열로 구성된다:
- 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HCV 특히 isolate HCV-1a의 와일드 타입(wild-type) S 단백질의 384번부터 743번까지의 아미노산으로 구성된 자리에 위치한 아미노산 잔기에 일치하고, 또는
- 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성을 보존한다는 조건에서, isolate HCV의 와일드타입(wild-type) 단백질 E2의 상기 서열과 적어도 78%, 80%, 85%, 특히 90%의 동일성을 보이고,
- 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성을 보존한다는 조건에서, HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 아미노산 서열이거나 또는 단백질 E2으로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
본 발명의 상기 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)는 상기 융합 단백질(특히 E2-Sd, 또는 E1-E2-Sd, 또는 PIT1-E1-E2-Sd)로 구성되는데, 단백질 E2의 서열은 isolate HCV-1a로부터 얻어진 것이다.
또한 본 발명의 상기 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)는 이하 두 융합 단백질로 구성된다:
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HCV 특히 isolate HCV-1a의 와일드 타입 E1 단백질의 192번부터 383번, 특히 192번부터 380번까지에 자리한 아미노산으로 구성된 아미노산 서열이고: 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원 성질을 보존한다는 조건에서, 상기 isolate HCV의 와일드타입 단백질 E1의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 특히 90%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원 성질을 보존한다는 조건에서, 상기 isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 아미노산 서열이거나 또는 상기 단백질 E1으로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이고,
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HCV 특히 isolate HCV-1a의 와일드 타입 E2 단백질의 384번부터 746번, 특히 384번부터 743번까지에 자리한 아미노산으로 구성된 아미노산 서열이고: 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원 성질을 보존한다는 조건에서, 상기 isolate HCV의 와일드타입 단백질 E2의 서열과 적어도 78%, 80%, 85%, 특히 90%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원 성질을 보존한다는 조건에서, 상기 isolate HCV로부터 얻어진 자연변형물(natural variant)의 아미노산 서열이거나 또는 상기 단백질 E2로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
본 발명의 상기 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)는 상기 두 융합 단백질로 구성된다.(특히,E1-Sd, 또는 PIT1-E1-Sd, 또는 E2-Sd, 또는 PIT1-E1-Sd, 또는 E1-E2-Sd, 또는 PIT1-E1-E2-Sd)
본 발명의 또 다른 목적인 유효성분(active ingredient)은 이하에서 선택된 적어도 하나의 화합물(compound)로 구성되는 면역원성의 조성물(immunogenic composition)이다.
- 상기 융합 단백질
- 상기 하이브리드 핵산 분자
- 상기 하이브리드 핵산 분자로 구성된 벡터
- 상기 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)와 약학적으로 허용되는 운반체(pharmaceutically acceptable vehicle)
발명에 따른 약학조성물은 약학적으로 허용되는 운반체와 약학 제형 및 시행방법을 포함하는 것으로, 당업자는 바람직한 약학조성물의 구성과 보통의 파라미터로서 사용할 수 있도록 약학적으로 허용되는 운반체의 성질과 양을 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
발명의 약학조성물은 투여에 있어 구강, 혀 밑, 피하, 근육 내, 정맥주사, 국소 및 인체 일부, 생체기관, 비강, 피부, 직장, 안구, 귀에 대한 투약에 적합하며, 상기 유효성분은 unit administration form으로 투여가 가능하다.
unit administration form 은 예를 들어, 약제, 캡슐, 과립제, 파우더, 주입가능한 용액 또는 구강 현탁액, 피부 패치, 흡입을 통한 제형으로 혀 밑, 구강, 기관 내, 비강, 귀로의 투여, 국소 투약, 피부를 통한, 피하로, 근육 내 또는 정맥주사로, 직장의 투여 또는 삽입 제형일 수 있다. 국소투약의 경우, 크림, 젤, 연고, 로션 또는 안약이 예상될 수 있다.
발명에 있어, 상기 면역원성의 조성물은 이하 3개의 화합물 중에서 적어도 하나에서 선택된 유효성분으로 구성된다:
a) - 상기 융합 단백질로서 이하로 구성된다:
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 8로 기재되고, 또는
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 서열번호 8과 적어도 88%, 90%, 92%, 특히 95%의 동일성을 보이고, 또는
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 서열번호 8로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이고,
b) - 하이브리드 핵산 분자로 이하로 구성된다:
* 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은 서열번호 11로 기재되고, 또는
* 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해 상기 핵산서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 11과 적어도 78%, 80%, 85%, 특히 90%의 상동성을 갖고, 또는
* 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해 상기 핵산서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력 또는 상기 하이브리드 핵산분자로 구성된 상기 벡터를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 서열번호 11로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산서열이고,
c) 면역원성의 융합 단백질로 구성된 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)로서, 상기 융합 단백질은 이하로 구성된다:
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 8로 기재되고, 또는
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및 HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 서열번호 8과 적어도 88%, 90%, 92%, 특히 95%의 동일성을 보이고, 또는
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및 HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 서열번호 8로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
본 발명의 목적은 이하 3개의 조성물과 관련된다:
a)-단백질 E1(특히 E1-Sd, PIT1-E1-Sd, E1-E2-Sd, PIT-E1-E2_Sd)으로 구성된 상기 융합 단백질로서, 도 3b에 나타나 있고, 상기 단백질은 거의 HCV의 E1 단백질로 구성되는데, 상기 E1은 HBV의 제거된 S단백질의 N 말단에 접목돼있고, 또는
b)-단백질 E1을 인코딩하는 핵산 서열(특히 e1-sd, pit1-e1-sd, e1-e2-sd, pit1-e1-e2-sd)로 구성된 상기 하이브리드 핵산분자로서, 상기 핵산분자는 거의 HCV의 단백질 E1을 인코딩하는 핵산 서열로 구성되고, 상기 핵산 서열은 HBV의 제거된 S 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 5'측에 접목되고, 또는
c)-단백질 E1(특히 E1-Sd, PIT1-E1-Sd, E1-E2-Sd, PIT-E1-E2_Sd)으로 구성된 상기 서브바이러스 입자(subviral particles)로서, 도 3b에 나타나 있고, 상기 단백질은 거의 HCV의 E1 단백질로 구성되는데, 상기 E1은 HBV의 제거된 S 단백질의 N 말단에 접목돼있다.
발명에 의할 때, 상기 면역원성의 조성물은 유효성분으로서 이하 화합물 중 어느 하나에서 선택된다:
a) - 융합 단백질로서 이하로 구성된다:
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 10로 기재되고, 또는
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 서열번호 10과 적어도 86%, 88%, 90%, 특히 95%의 동일성을 보이고, 또는
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 서열번호 10로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이고,
b) - 하이브리드 핵산 분자로 이하로 구성된다:
* 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은 서열번호 13로 기재되고, 또는
* 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해 상기 핵산서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 특히 95%의 상동성을 갖고, 또는
* 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해 상기 핵산서열에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력 또는 상기 하이브리드 핵산분자로 구성된 상기 벡터를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 서열번호 13로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산서열이고,
c) 면역원성의 융합 단백질로 구성된 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)로서, 상기 융합 단백질은 이하로 구성된다:
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 10로 기재되고, 또는
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 서열번호 10과 적어도 86%, 88%, 90%, 특히 95%의 동일성을 보이고, 또는
* 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 서열번호 10로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
본 발명의 목적은 이하 3개의 조성물과 관련된다:
a)-단백질 E2(특히 E2-Sd, PIT2-E2-Sd, E1-E2-Sd, PIT-E1-E2_Sd)으로 구성된 상기 융합 단백질로서, 도 3c에 나타나 있고, 상기 단백질은 거의 HCV의 E2 단백질로 구성되는데, 상기 E2는 HBV의 제거된 S단백질의 N 말단에 접목돼있고, 또는
b)-단백질 E2을 인코딩하는 핵산 서열(특히 e2-sd, pit2-e2-sd, e1-e2-sd, pit1-e1-e2-sd)로 구성된 상기 하이브리드 핵산분자로서, 상기 핵산분자는 거의 HCV의 단백질 E1을 인코딩하는 핵산 서열로 구성되고, 상기 핵산 서열은 HBV의 제거된 S 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 5'측에 접목되고, 또는
c)-단백질 E1(특히 E1-Sd, PIT1-E1-Sd, E1-E2-Sd, PIT-E1-E2_Sd)으로 구성된 상기 서브바이러스 입자(subviral particles)로서, 상기 단백질은 거의 HCV의 E2 단백질로 구성되는데, 상기 E2는 HBV의 제거된 S 단백질의 N 말단에 접목돼있다.
발명에 있어 상기 면역원성의 조성물은 유효성분으로 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)를 구비하는데, 상기 입자는 적어도 이하로 구성된 면역원성의 융합 단백질로 이루어진다:
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은 서열번호 8로 기재되고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 8과 적어도 88%, 90%, 92%, 특히 95%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 서열번호 8로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이고,
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은 서열번호 10로 기재되고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 E2-Sd인 서열번호 10과 적어도 86%, 88%, 90%, 특히 95%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 서열번호 10으로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
상기 서브바이러스 입자(subviral particles)는 상기 두개의 융합 단백질로 구성되는데, 상기 단백질은 이하로 구성된다:
- HCV의 단백질 E1(특히, E1-Sd, PIT1-E1-Sd, E1-E2-Sd, PIT-E1-E2-Sd)과 HBV의 제거된 S 단백질의 N 말단에 접목된 HCV의 단백질 E2, 그리고
- HCV의 단백질 E2(특히, E2-Sd, PIT2-E2-Sd, E1-E2-Sd, PIT-E1-E2-Sd)로서 HBV의 제거된 S 단백질의 N 말단에 접목되어 있다.
[27].본 발명에서 상기 면역원성 조성물의 유효성분은 이하의 혼합물로 구성된다:
- 상기 조성물은 적어도 이하 2개의 융합 단백질로 구성된다:
* 융합 단백질 중 하나는 이하로 구성된다:
- 상기 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은 서열번호 8로 기재되고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 8과 적어도 88%, 90%, 92%, 특히 95%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 서열번호 8로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산서열이고;
* 융합 단백질 중 다른 하나는 이하로 구성된다:
- 상기 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은 서열번호 10로 기재되고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 10과 적어도 86%, 88%, 90%, 특히 95%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 서열번호 10으로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
- 상기 조성물은 적어도 이하 2개의 하이브리드 핵산 분자로 구성된다:
* 상기 하이브리드 핵산 분자 중 하나는:
- 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은 서열번호 11로 기재되고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은, HCV 및/또는 HBV에 대해상기 핵산 분자에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 상기 서열번호 11과 적어도 78%, 80%, 85%, 특히 90%의 상동성을 갖고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은, HCV 및/또는 HBV에 대해상기 핵산 분자에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건 또는 상기 벡터가 상기 하이브리드 핵산분자로 구성된다는 조건에서, 서열번호 11로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산서열이고,
*상기 하이브리드 핵산 분자 중 다른 하나는:
- 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은 서열번호 13로 기재되고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은, HCV 및/또는 HBV에 대해상기 핵산 분자에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건에서, 상기 서열번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 특히 95%의 상동성을 갖고, 또는
- 상기 하이브리드 핵산 분자의 핵산 서열은, HCV 및/또는 HBV에 대해상기 핵산 분자에 의해 인코딩된 단백질이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 조건 또는 상기 벡터가 상기 하이브리드 핵산분자로 구성된다는 조건에서, 서열번호 13로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 핵산 서열이다:
- 상기 조성물은 적어도 이하 2개의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)로 구성된다:
* 상기 입자 중 하나는 이하로 구성된 면역원성의 융합 단백질로 구성된다:
- 상기 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은 서열번호 8로 기재되고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 8과 적어도 88%, 90%, 92%, 특히 95%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 서열번호 8로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이고;
* 상기 입자 중 다른 하나는 이하로 구성된 면역원성의 융합 단백질로 구성된다:
- 상기 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은 서열번호 10로 기재되고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 상기 서열번호 10과 적어도 86%, 88%, 92%, 특히 95%의 동일성을 보이고, 또는
- 상기 면역원성의 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열은, HBV 및/또는 HCV 에 대해 상기 아미노산 서열이 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 형성할 수 있는 능력을 유지한다는 조건에서, 서열번호 10으로부터 얻어진 인공변형물(synthetic variant)의 아미노산 서열이다.
본 발명의 혼합물은 이하의 조성물로 구성된다:
a)-상기 조성물은 적어도 상기 2개의 융합 단백질로 구성되며, 그중 하나는 단백질 E1(특히 서열번호 8의 E1-Sd 또는 PIT1-E1-Sd 또는 PIT1-E1-E2-Sd)으로 구성되고, 다른 하나는 HCV의 단백질 E2(특히, 서열번호 10의 E2-Sd 또는 PIT2-E2-Sd 또는 E1-E2-Sd 또는 PIT1-E1-E2-Sd)구성되며, 후자는 HBV의 제거된 S단백질의 N 말단에 접목되어 있고, 또는
b)-상기 조성물은 적어도 상기 2개의 하이브리드 핵산분자로 구성되며, 그 중 하나는 E1 단백질(특히, 서열번호 11의 pit1-e1-sd 또는 e1-sd 또는 e1-e2-sd 또는 pit1-e1-e2-sd)을 인코딩하는 핵산 서열로 구성되며, 다른 하나는 E1 단백질(특히, 서열번호 13의 pit2-e2-sd 또는 e2-sd 또는 e1-e2-sd 또는 pit1-e1-e2-sd)을 인코딩하는 핵산 서열로 구성되는데, 후자는 HBV의 제거된 S 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 5'측에 접목되어있고, 또는
c)-상기 조성물은 적어도 상기 2개의 서브바이러스 입자(subviral particles)로 구성되며, 그 중 하나는 단백질 E1(특히 서열번호 8의 E1-Sd 또는 PIT1-E1-Sd 또는 E1-E2-Sd 또는 PIT1-E1-E2-Sd)을 구성하고, 다른 하나는 HCV의 단백질 E2(특히, 서열번호 10의 E2-Sd 또는 PIT2-E2-Sd 또는 E1-E2-Sd 또는 PIT1-E1-E2-Sd)를 구성하는데, 후자는 HBV의 제거된 S 단백질의 N 말단에 접목돼있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역원성 조성물을, HCV의 예방 및/또는 치료적 처리를 목적으로 하는 의약의 제조에 사용하는 것과 HCV 방지에 사용하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역원성 조성물을, HBV의 예방 및/또는 치료적 처리를 목적으로 하는 의약의 제조에 사용하는 것과 HBV 방지에 사용하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역원성 조성물을, HCV 및 HBV의 예방 및/또는 치료적 처리를 목적으로 하는 의약의 제조에 사용하는 것과 HCV 및 HBV의 방지에 사용하는 것에 있다.
본 발명은 또한, 상기 면역원성의 비감염성 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)를 발현하는 세포주(cell line)를 목적으로 한다.
발명의 목적에 부합하게 미생물에 관한 예를 보면, 이스트(yeasts), 예를 들어 이하의 과(families): Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces, Zygosaccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis and Kluveromyces lactis being preferred; 와 박테리아(bacteria), 예를 들어 E. coli 와 같은 이하의 과(families): Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus and Streptomyces.
진핵세포(eukaryote cells), 포유류, 파충류, 곤충과 같은 동물세포를 예로 들수 있다. 선호되는 진핵세포는 중국 햄스터(CHO cells), 원숭이(COS and Vero cells), 드워프 햄스터의 신장(BHK cells), 돼지의 신장(PK 15 cells), 토끼의 신장(RK13 cells), human cell lines of the osteosacorma (143 B cells), human HeLa cell lines and human cell lines of the hepatoma (Hep G2 type cells), as well as insect cell lines (예를 들어, Spodoptera frugiperda).
본 발명에 있어, 상기 세포계는 CHO로 알려진 중국햄스터 난소 세포주이다.
상기는, Michel ML, Pontisso P, Sobczak E, Malpiece Y, Streeck RE, Tiollais P. Synthesis in animal cells of hepatitis B surface antigen particles carrying a receptor for polymerized human serum albumin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Dec; 81(24):7708-12, 에 공지된 바 있다.
본 발명은, 또한 상기 이스트의 세포주에 관계되는데, 상기 이스트는 특히 Saccharomyces cerevisae 일 수 있다.
상기의 세포주는, 새로 태어난 햄스터의 신장 세포주이고(BHK ), 특히 새로태어난 햄스터의 것이다(BHK-21).
후자는, Goldman RD, Follett EA. Birefringent filamentous organelle in BHK-21 cells and its possible role in cell spreading and motility. Science. 1970 Jul 17; 169(942):286-8, 에 공지된 바 있다.
본 발명은, 상기 세포주로부터의 상기 키메라(chimeric) 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)의 생산 방법에 관계되는데, 이하의 단계로 구성된다.
1-a 단계는, isolate HBV의 와일드 타입 S 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로 구성된 lentiviral vector를 이용해 세포주의 세포를 형질도입(TRANSDUCTION)하는 것이고,
2-a 단계는, HBV의 와일드 타입 서브바이러스 막 입자(subviral enevelope particles)를 발현시킬 수 있는 세포를 생산하기 위해, 상기 세포를 배양(CULTURE)하는 것이고,
3-a 단계는, HBV의 와일드 타입 서브바이러스 막 입자(subviral enevelope particles)의 최적화된 분비를 갖는 클론의 선택(SELECTION)이고,
4-a 단계는, 상기 벡터를 구비한 상기 클론의 재-형질도입(OVER-TRANSDUCTION)이고,
5-a 단계는, 상기 키메라(chimeric), 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 발현할 수 있는 세포주를 생산하기 위한 상기 세포를 배양(CULTURE)하는 것이고,
6-a 단계는, 상기 키메라(chimeric), 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)를 최적화된 방법으로 분비가능한 상기 세포의 선택(SELECTION)이고,
7-a 단계는, 상기 키메라(chimeric), 면역원성의 비감염성 서브바이러스 입자(subviral particles)의 생산을 위한 상기 클론의 배양(CULTURE)이고,
8-a 단계는, 선택된 배지로부터 서브바이러스 입자(subviral particles)의 정제(PURIFICATION)이다.(centrifugation, ultra-centrifugation on gradients, collection of the positive fractions for the chimeric subviral particles, dialysis).
테이블 1은 본 발명의 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다. 관례상, 소문자는 핵산서열의 표시이고, 대문자는 아미노산 서열의 표시이다.
Table 1: LIST OF SEQUENCES
Nucleic acids Amino acids
서열번호 1 : sd 서열번호 2 : Sd
서열번호 3 : e1 서열번호 4 : E1
서열번호 5 : e2 서열번호 6 : E2
서열번호 7 : e1-sd 서열번호 8 : E1-Sd
서열번호 9 : e2-sd 서열번호 10 : E2-Sd
서열번호 11 : pit1-e1-sd 서열번호 12 : PIT1-E1-Sd
서열번호 13 : pit2-e2-sd 서열번호 14 : PIT2-E2-Sd
서열번호 15 : Vector with pit1-e1-sd /
서열번호 16 : Vector with pit2-e2-sd /
본 발명은, 단백질 E1 및/또는 E2로 구성된 HCV-HBV 융합 단백질을 제공하는 것에 있어서, 아미노산 및 핵산 서열에 관한 상동성 또는 동일성율을 일정수준 이상 유지한 상태에서 상기 서열의 형질도입 및 합성이 이루어지도록 함으로써, 상기 융합 단백질의 자기조립능력 유지 및 면역원성 보존과, 상기 단백질의 정확한 당화, 삼차원구조의 유지를 통해 S 단백질에 대한 항원특성을 보존하고, 이하의 cell line 을 통해 세포독성효과의 제거를 이룬다.
상기와 같이 본래 유전특성이 형질도입 및 합성 후에도 높은 수준으로 발현됨으로써 HCV 및 HBV의 예방 및 치료를 가능케 하는 융합 단백질과 이와 관련된 상업화된 키메라 서브바이러스 입자의 생산과, 하이브리드 핵산분자, 벡터 및 백신의 획득이 가능하다.
본 발명의 또 다른 특성은 이하의 실시 예에 관한 도면과 기술들을 통해 명확해질 수 있다:
도 1은, 3000개 이상의 아미노산의 HCV의 다 단백질(polyprotein) 단편의 토폴로지(topology)를 도시한 것이다. 세포 펩티다아제(가위모양으로 도시)에 의해 발생하는 클리비지(cleavages)는 상기 다 단백질, 특히 구조 단백질(capsid, 막 단백질 E1 and E2)의 성숙(maturation)을 야기한다. 도시된 숫자는 다 단백질의 서로 다른 구조 단백질(structural proteins)의 도메인을 결속하는 아미노산 잔기의 위치를 나타낸다.
도 2a와 2b는, HBV의 와일드 타입 S 단백질의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)의 토폴로지(topology)를 보인다.
- 도 2a에서, HBV의 와일드 타입 S 단백질 아미노산의 226개 잔기는, 특히 4개의 회색의 수직막대로 표시된 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)으로 구성되고, N 말단과 C 말단의 끝은 밝은 부분 RE를 지향한다. isolate HBVadw의 경우, 25kD 가량의 단백질은 아미노산 226개의 잔기로 구성된다.
- 도 2b는, 와일드 타입 S단백질의 자기조립 이후에 얻어진 서브바이러스 입자(subviral particles)를 나타낸다.
도 3a에서 3c는, 와일드 타입 S단백질의 존재하에서(도 3b) 융합 단백질 E1-Sd(도 3b) 또는 E2-Sd(도 3c)의 동시발현(co-expression)을 나타내는데, 이들은 본 발명의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)로 자기조립한다.
- 도 3a는, 서브바이러스 입자(subviral particles)로 자기조립하는 HBV의 와일드 타입 S단백질을 나타낸다.
- 도 3b는, 융합 단백질 E1-Sd를 나타내는데, 이는 검은 사각형의 막대로 표시된 HCV 막 단백질 E1의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 점선으로 표시된 E1의 엑토도메인(ectodomain)에 의한, 와일드 타입 S 단백질의 N 말단 끝에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)의 교체로부터 기인한다: 도시된 것은 와일드 타입 S 단백질의 존재하에서 융합 단백질 E1-Sd의 서브바이러스 입자(subviral particles) S + E1-Sd로의 조립이다
발명에 의할 때, 50kD 가량의 융합 단백질 E1-Sd는 S 도메인과 단백질 E1으로부터 얻어진 393개의 아미노산 잔기로 구성된다. 완전한 E1 단백질의 192번부터 380번 잔기는, 와일드 타입 S 단백질의 23번부터 226번까지 잔기로 구성된 제거된 S 단백질의 N 말단 끝에 연결돼있다.
- 도 3c는, E2-Sd를 타나내는데, 이는 흰색의 사각형의 막대로 표시된 HCV 막 단백질 E2의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 점선으로 표시된 E2의 엑토도메인(ectodomain)에 의한, 와일드 타입 S 단백질의 N 말단 끝에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)의 교체로부터 기인한다: 도시된 것은 와일드 타입 S 단백질의 존재하에서 융합 단백질 E2-Sd의 서브바이러스 입자(subviral particles) S + E2-Sd로의 조립이다
발명에 의할 때, 85kD 가량의 융합 단백질 E2-Sd는 S 도메인과 단백질 E2로부터 얻어진 564개의 아미노산 잔기로 구성된다. 완전한 E2 단백질의 384번부터 743번 잔기는, 와일드 타입 S 단백질의 23번부터 226번까지 잔기로 구성된 제거된 S 단백질의 N 말단 끝에 연결돼있다.
도 4a에서 4e는, 융합 단백질 E1-Sd와 E2-Sd 뿐 아니라 HCV의 E1, E2 HBV의 와일드타입 막 단백질 S의 토폴로지(topology)를 도시한다.
- 도 4a는, HCV의 와일드 타입 막 단백질 E1의 토폴로지를 나타내는데, (검은색의 사각형으로 표시된) 하나의(unique) 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 밝은 부분인 RE.로 지향되는 넓은 엑토도메인(ectodomain)으로 구성된다. isolate HCV-1a의 경우, 35kD 가량의 상기 단백질은 192개의 아미노산 잔기로 구성된다.
- 도 4b는, HBV의 와일드 타입 막 단백질 E2의 토폴로지를 나타내는데, (하얀색의 사각형으로 표시된) 하나의(unique) 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 밝은 부분인 RE.로 지향되는 넓은 엑토도메인(ectodomain)으로 구성된다. isolate HCV-1a의 경우, 70kD 가량의 상기 단백질은 363개의 아미노산 잔기로 구성된다.
- 도 4c는, HBV의 와일드 타입 S 단백질 E2의 토폴로지를 나타내는데, 특히 네개의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain, 회색의 사각형)으로 구성된다.
- 도 4d는, 하이브리드 핵산 분자 pit1-e1-sd의 DNA 서열을 나타내며, 상기의 5'부터 3'까지 서열은 이하와 같다:
- 상기 서열은 HCV의 transfer initiation peptide PIT1을 일코딩하고
- 상기 서열은 단백질 E1의 엑토도메인(ectodomain) 전부를 인코딩하고, HCV의 3'말단에서 마지막 3개의 코돈이 제거된 E1 단백질의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 인코딩하고,
- 상기 서열은 HBV의 제거된 S 단백질을 인코딩하며,
그 용도는 융합 단백질 E1-Sd의 생산이다.
- 도 4e는, 하이브리드 핵산 분자 pit2-e2-sd의 DNA 서열을 나타내며, 상기의 5'부터 3'까지 서열은 이하와 같다:
- 상기 서열은 HCV의 transfer initiation peptide PIT2를 일코딩하고
- 상기 서열은 단백질 E2의 엑토도메인(ectodomain) 전부를 인코딩하고, HCV의 3'말단에서 마지막 3개의 코돈이 제거된 E2 단백질의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 인코딩하고,
- 상기 서열은 HBV의 제거된 S 단백질을 인코딩하며,
그 용도는 융합 단백질 E2-Sd의 생산이다.
도 5는, 융합 단백질을 인코딩하는 DNAc를 얻기 위한 프로토콜(protocol)이다. 단백질 E1과 E2를 인코딩하는 서열은 블랙라인(서열A)으로, 제거된 S 단백질을 인코딩하는 서열은 회색라인(서열B)으로, 제한부위(restriction site) BamHI는 검정 다이아몬드로 표시된다. e1-sd A, e1-sd B 및 e2-sd A, e2-sd B를 증폭하는 forward and reverse primers 는 테이블 X에 나타난다.
도 6a와 6b는, Semliki / BHK-21 세포 시스템에서 융합 단백질 E1-Sd 또는 E2-Sd 중 하나의 일시적 생산을 위한 실험적 프로토콜을 나타낸다.
- 도 6a는, pSFV1-E1-Sd 로부터 얻어진 RNA가 키메라 서브바이러스(chimeric subviral) 막 입자 E1-Sd의 생산을 위한 목적으로 BHK-21 세포로 형질주입되는 것을 나타낸다.
- 도 6b는, pSFV1-E2-Sd 로부터 얻어진 RNA가 키메라 서브바이러스(chimeric subviral)막 입자 E2-Sd의 생산을 위한 목적으로 BHK-21 세포로 형질주입되는 것을 나타낸다.
도 6c와 6d는, 플라스미드 pSFV1-E1-Sd 와 pSFV1-E2-Sd로부터 얻어진 RNA에 의해 형질주입된 다수의 세포 용해물(lysates)에서, Western-blot으로 나타난 항S(6C)-항체 또는 항 E1 및 항 항E2 (6D)-항체를 나타낸다.
- 도 6c는, 각 50kD 및 85kD 크기로 관찰된 융합 단백질 E1-Sd 및 E2-Sd(사각형 틀로 표시됨)를 나타내는데, 이는 이론적 사이즈와 일치한다. M:molecular weight marker (kD).
- 도 6d는, 각 항 E1 및 항 E2항체에 의해, 각 50kD 및 85kD 크기로 관찰된 융합 단백질 E1-Sd 및 E2-Sd(사각형 표시)를 나타낸다. M:molecular weight marker (kD).
도 7A 부터 7B는, Semliki / BHK-21 세포 시스템에서 두 융합 단백질 E1과 E2 및 HBV의 와일드 타입 S 단백질의 공동생산(co-production)을 도시한다.
설명(Caption): M:molecular weight marker(kD);the β-gal, E1E2 또는 E1E2 및 S 트랙(S tracks)은 SFV RNA에 의한 BHK-21의 도입로부터 얻어진 control cellular lysates 를 나타낸다.
- 도 7A는, 실험적인 프로토콜의 설명을 도시한다. 플라스미드 pSFV1-E1-Sd 와 pSFV1-E2-Sd 로부터 얻어진 RNA는, BHK-21 세포에 플라스미드 pSFV1-S로부터 얻어진 RNA와 함께, 두 타입의 키메라 서브바이러스(chimeric subviral) 막 입자 S+E1-Sd와 S+E2-Sd를 얻을 목적으로, 동시에 각각 형질주입 된다. 상기 막 입자 중 첫째는 융합 단백질 E1-Sd와 와일드 타입 S 단백질로 구성되고, 두 번째는 융합 단백질 E2-Sd와 와일드 타입 S 단백질로 구성된다.
- 도 7B는, Western-blot을 통한 항-E1 항체로서, 벡터 pSFV1-E1-Sd 와 pSFV1-S로부터 얻어진 RNA에 의해 형질도입된 세포를 통해 정제된 세포내 입자에서 발견된다. 상기 결과는 융합 단백질 E1-Sd(사각형 표시)는 이론에 일치하게 50kD로 관찰된다.
- 도 7C는, Western-blot을 통한 항-S 항체로서, 벡터 pSFV1-E1-Sd 와 pSFV1-S로부터 얻어진 RNA에 의해 형질도입된 세포를 통해 정제된 세포내 입자에서 발견된다. 상기 결과는 융합 단백질 E1-Sd(사각형 표시)는 이론에 일치하게 50kD로 관찰된다.
- 도 7D는, 플라스미드 pSFV1-E1-Sd 와 pSFV1-S로부터 얻어진 RNA에 의해 형질도입된 세포를 통해 정제된 새포내 입자에서의 음성착색(negative coloration)을 통한 transmission electron microscopy micrograph이다. Bar:100nm
- 도 7E는, Western-blot을 통한 항-E2 항체로서, 플라스미드 pSFV1-E2-Sd 와 pSFV1-S로부터 얻어진 RNA에 의해 형질도입된 세포를 통해 정제된 세포내 입자에서 발견된다. 상기 결과는 융합 단백질 E2-Sd(사각형 표시)는 이론에 일치하게 85kD로 관찰된다.
- 도 7F는, Western-blot을 통한 항-S 항체로서, 플라스미드 pSFV1-E2-Sd 와 pSFV1-S로부터 얻어진 RNA에 의해 형질도입된 세포를 통해 정제된 세포내 입자에서 발견된다. 상기 결과는 융합 단백질 E2-Sd(사각형 표시)는 이론에 일치하게 85kD로 관찰된다.
- 도 7G는, 플라스미드 pSFV1-E2-Sd 와 pSFV1-S로부터 얻어진 RNA에 의해 형질도입된 세포를 통해 정제된 새포내 입자에서의 음성착색(negative coloration)을 통한 transmission electron microscopy micrograph이다. Bar:100nm
도 8은, 와일드 타입 S 단백질과 융합단백질을 생산하는 CHO clonal lines를 얻기위한 프로토콜을 나타낸다. 히그로마이신 내성 유전자(hygromycin resistance gene) 뿐 아니라, CHO-S라 불리는 첫 번째 cellular clone 과 와일드 타입 S 단백질의 생산자를 개발(development)할 수 있는 HBV의 와일드 타입 S 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 lentivirus(LV)에 의해 형질도입이 CHO 세포주로부터 어떻게 일어나는지를 보인다. 상기 클론은, GFP gene (gfp)뿐 아니라 두 융합 단백질 E1-Sd 또는 E2-Sd 중 어느 하나를 인코딩할 수 있는 유전자를 포함하는 lentivirus(LV)에 의해 재형질도입(over-transduced)된 것이다. 두 번째 형질도입은, CHO-S/E1-Sd 및 CHO-S/E2-Sd로 불리는 두 개의 서로 다른 cellular clone을 개발(development)한다.
도 9는, 서로 다른 안정된 CHO 클론에서 융합 단백질과 와일드 타입 S 단백질의 세포 내 생산에 관한 western-blot 분석이다. 항-E1, 항-E2 그리고 항-S 항체를 통해 드러나는 클론 CHO-S, CHO-S/E1-Sd 및 CHO-S/E2-Sd 의 세포내의 단백질을 보여준다. 목표인 융합 단백질은 블랙박스 안에 나타난다. M: molecular weight marker (kD); β-gal, E1E2 and S tracks: SFA RNA에 의한 BHK-21 세포의 형질도입으로부터 얻어진 제어 세포 용해물(control cellular lysates)이다.
도 10은, CsCl 구배로부터 선택된 프랙션(fractions)의 ELISA(효소결합면역흡착검사)에 의한 와일드 타입 S 단백질의 정량화된 히스토그램이다. 가로축은 선택된 프랙션(fraction)을 세로축은 290nm에서의 각 광학밀도(optical density)이다. 클론 CHO-S, CHO-S/E1-Sd 및 CHO-S/E2-Sd의 배양상층액(culture supernatants)으로부터, CsCl내의 초 원심분리법에 의해 키메라 서브바이러스 S 입자(chimeric subviral particles)가 정제된다. 프랙션(fraction)은 구배의 정상에서 선택된 것이고(fraction 1) 와일드 타입 S 단백질의 양은 ELISA(효소결합면역흡착검사)에 의해 평가된다. 검은 히스토그램은 클론 CHO-S의 프랙션(fraction)에서 와일드 타입 S 단백질의 분포를 나타내고, 밝은 회색의 히스토그램은 CHO-S/E1-Sd의 프랙션(fraction)에서 와일드 타입 S 단백질의 분포를 나타내고, 어두운 회색의 히스토그램은 CHO-S/E2-Sd의 프랙션(fraction)에서 와일드 타입 S 단백질의 분포를 나타낸다.
도 11a는, CsCl에 의해 정제된 입자 중 단백질 성분이 항-E1, 항-E2 및 항-S 항체를 이용한 western-blot에 의해 분석된 것이다. 와일드 타입 S 단백질은 3개 유형의 서브바이러스 입자(subviral particles)에서 두(24, 27kD) 당화 상태(glycosylation states)로 발견된다. 융합 단백질 E1-Sd 또는 E2-Sd는 각각 50과 85kD의 이론상 크기와 일치한다. M: molecular weight marker (kD)
도 11b는, 클론 CHO-S의 상층액으로부터, 투과전자현미경(transmission electron microscopy)의 정제에 의한 음성착색(negative coloration)을 분석한 것인데, 상기 클론은 지름이 20nm 가량인 구 형태의 와일드 타입 S 단백질의 자기조립에서 기인한 서브바이러스 입자(subviral particles)의 것이다. Bar: 20 nm.
도 11c는, 클론 CHO-S/E1-Sd의 상층액으로부터, 투과전자현미경(transmission electron microscopy)의 정제에 의한 음성착색(negative coloration)을 분석한 것인데, 상기 클론은 와일드 타입 S 단백질의 존재하에서 융합 단백질 E1-Sd의 조립에서 기인한 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)의 것이다. 상기 입자는 지름이 20nm 가량인 구 형태이다. Bar: 20 nm.
도 11d는, 클론 CHO-S/E2-Sd의 상층액으로부터, 투과전자현미경(transmission electron microscopy)의 정제에 의한 음성착색(negative coloration)을 분석한 것인데, 상기 클론은 와일드 타입 S 단백질의 존재하에서 융합 단백질 E1-Sd의 조립에서 기인한 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)의 것이다. 상기 입자는 지름이 20nm 가량인 구 형태이다. Bar: 20 nm.
이하의 실시 예를 통하여, Semliki system 에서(도 4 내지 7), HCV의 서브바이러스 막 입자(subviral enevelope particles)를 얻기 위한, 본 발명의 구체적인 예를 든다.
이하의 실시 예는 발명의 목적인 면역원성의 융합 단백질과 특히 융합 단백질 E1-Sd 또는 E2-Sd을 얻는 것에 기초한 것으로, 상기 융합 단백질은 한편으로는 HBV의 N 말단에서 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)이 제거된 S단백질로 구성되고 또 한편으로는 거의 HCV의 E1 또는 E2의 막 단백질로 구성된 것이다. 본 발명의 실시 예는, 특히 lentiviral vectors의 사용으로 상기 입자의 생산자인 안정된 클론을 얻기 전에, Semliki forest virus (pSFV vector)의 복제물에 기초한 벡터의 높은 수준의 발현 덕택으로, 와일드 타입 S 단백질의 존재하에서 상기 제거된 S 단백질(Sd)의 집합능력이, 상기 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)를 얻을 수 있게 한다는 것을 증명한다.
예 1: Semliki system ( pSFV )에서 HCV 의 키메라 서브바이러스 막 입자(chimeric subviral enevelpe particles )의 획득
I .1 ) 플라스미드 pSFV1 - E1 - Sd 와 pSFV1 - E2 - Sd .의 구조
11033pb의 바이시스트론(bicistronic) 구조인 pSFV1 vector (Invitrogen)는 이하 구조에 사용된다. 상기 벡터는, 생체외(in vitro)의 전사에 의한 양극의 완전한 RNA(RNA를 42S(+)로 명명) 합성을 시작하기 위해, 첫 번째 시스트론의 5'측에 삽입된 SP6-RNA-polymerase의 프로모터 서열에 제공된다. 포유류 세포에 형질주입을 한 뒤, 상기 생체 외에서 씌워진(capped in vitro) 재조합 RNA는 SFV의 nsP1-4 레플리카제(replicase)의 존재하에 자가복제(self-replicate)하고, 26S(+)로 명명된 2차 RNAm(secondary RNAm)의 매개자(intermediary)에 의해 관심 단백질의 생산을 돕는다.
와일드 타입의 보완적인 DNA(DNAc) 또는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 하이브리드 핵산분자는 polymerase chain reactions(PCR)에 의한 일련의 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 플라스미드 pSFV1-E1E2 (HCV의 E1 또는 E2 단백질을 인코딩하는 서열로 구성된 SFV vector로 이루어짐)로 시작하는, PCR A로 명명한 첫 PCR 단계는, HCV의 막 단백질 E1 또는 E2을 상기 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 함께 인코딩하는 서열의 증폭을 가능하게 하고, 소포체로 이동하는 각 transfer initiation peptide를 인코딩하는 서열과 함께 진행된다.
[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]에 개시된 바 있는 플라스미드 pHBV1.5로 시작하는, PCR B로 명명한 두 번째 PCR 단계는, HBV의 제거된 S 단백질을 인코딩하는 서열을 증폭시킬 수 있다. 발명에 의할 때 융합 단백질을 인코딩하는 서열의 HCV 부분은 "A"로 명명되고, HBV 부분은 "B"로 명명된다.(도 5) PCR A와 B의 산물은 젤에서 정량화 및 정제되고, 마지막 PCR로 등분되어 포함된다. bivalent HCV-HBV 프라이머는, 겹치는 도메인을 갖는 PCR A와 B의 생산물 합성을 가능하게 하는데, 이것은 결국, 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 DNAc의 완전한 서열을 얻을 수 있게 한다.
I .1. 1 ) 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 DNAc 서열의 증폭(특히 E1 - Sd 및 E2 - Sd )
PCR에 의한 증폭은 보정활동이 이루어져 연속적인 증폭과 관련된 오류를 최소화하기 위해, 프라이머 각 쌍 15pmol(Proligo), DNA 50ng, 데옥시 뉴클레오티드(desoxyribonucleotides) dNTP (Invitrogen), Taq-DNA-polymerase (Takara)의 10개 유닛을 포함하는 50μL 의 반응매개체에서 일어난다. “Vector NTI Advance 10” (Invitrogen) 과 “Primer premier” (Biosoft International) software의 도움으로, A 서열의 “forward” primers 와 B 서열“reverse” primers 가 정의되어 증폭된 DNA 단편의 각 5' 및 3'에서 BamHI site를 발생시킨다.
Table 2의 "키메라(chimeric) 서열로 이루어진 A 및 B 서열의 유전적 증폭에 사용되는 Oligonucleotides " 는 사용되는 프라이머의 서열을 나타낸다.
HCV에 일치하는 서열은 검은 글자체로, HBV에 일치하는 서열은 밑줄쳐진 검은 글자체로, BamHI 제한구역(restriction site)은 밑줄쳐진 이태릭체로, 번역의 개시코돈(initiation codon) ATG에 일치하는 서열은 굵은 글자체로, 번역의 종결코돈(termination codon) ATG에 일치하는 서열은 굵은 글자체로 나타난다.
Table 2 "키메라(chimeric) 서열로 이루어진 A 및 B 서열의 유전적 증폭에 사용되는 Oligonucleotides "
Fragment of
DNAc
amplified 		Primer
pair 		Primer sequence
e1-sd A forward
reverse		 5’ - ATAGGATCC ATGACAGGGAACCTTCCTGGTTGC - 3’
3’ - AACGACAAGCGGTCGTGTTCTTAGGAGT - 5’
e1-sd B forward
reverse		 5’ - GCTGTTCGCCAGCACAAGAATCCTC - 3’
3’ - TAAAAGAAAACAGAGACCCATATGTAA ATT CCTAGGATA - 5’
e2-sd A forward
reverse		 5’ - ATAGGATCC ATGGGGAACTGGGCGAAGGT - 3’
3’ - ACGATGAGTATAGGGTTTGTTCTTAGGAGTGTTATGG - 5’
e2-sd B forward
reverse		 5’ - GCTACTCATATCCCAAACAAGAATCCTCACAATACC - 3’
3’ - TAAAAGAAAACAGAGACCCATATGTAA ATT CCTAGGATA - 5’
상기 증폭반응은, thermal cycler 인 “iCycler”(Biorad)에서 실행되는데, 초기 denaturation 은 95°C 에서 5분간, 그 다음 denaturation이 95°C 에서 1분간 25 싸이클로, hybridisation이 60°C에서 1분간, elongation이 69°C에서 1분간공정이 이어진다. elongation이 69°C에서 10분간 행해진 후에 25싸이클이 행해진다. PCR A 및 B에 의해 증폭된 단편은 제조자의 권고에 따라 “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” system (Promega)을 써서 1 % agarose gel에서 정제된다. PCR A 및 B의 정제된 단편은 그때 10싸이클 동안 프라이머의 부존재하에서 PCRHYB라 불리는 마지막 PCR에 의해 하이브리드화(hybridised)되고, A 서열의 “forward” primers 와 B 서열의“reverse” primers의 존재하에서, 25 싸이클 동안 PCRFIN으로 불리는 마지막 PCR에 의해 증폭된다. 후자 2개의 PCR 프로그램은 PCR A와B에 쓰이는 점에서 유사하다. 하이브리드 핵산분자의 증폭된 단편은 상기 젤에서 정제된다.
I.1.2 ) pSFV1 vector 에서 하이브리드 DNAc 서열의 복제
PCRFIN의 정제된 산물은 제조자의 권고에 맞게 pGEM-T®vector (“pGEM-T Easy Vector System”, Promega)에 의해 복제된다. 발명에 따른 하이브리드 핵산분자의 단편은 enzyme BAMHI의 제한에 의해 (Biolabs) pGEM-T®로 부터 자유로우며, 플라스미드 pSFV1의 BAMHI site 에서 복제된다. 융합단백질(특히 pSFV1-E1-Sd, pSFV1-E2-Sd)로 구성되 다른 플라스미드들은 박테리아 형질전환(bacterial transformation)에 의해 증폭되고, 페놀/클로로폼 내의 DNA 의 maxi-preparation에 의해 정제된다. 삽입 배향(orientation of the insert)은 효소제한에 의해 확인되고 모든 구조는 서열에 의해 확인된다.
I-2 ) 다른 SFV 구조의 RNA 에 의해 잠정적으로 형질주입된 세포주 얻기
생체외 SFV의 전사 프로토콜 및 자가복제하여 재조합된 RNA의 형질주입 뿐 아니라 새로 태어난 햄스터 신장 세포(BHK-21)를 위한 배양 절차는 이미 기술된 바와 동일하다. [Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]. pSFV-S 구조는, HBV의 와일드 타입 S 단백질을 발현하고 이미 공지된 것인데, 콘트롤로서 사용된다(used as control).
I-3 ) 와일드 타입 키메라(chimeric) 막 단백질의 세포 내 생산 분석
immunofluorescence confocal microscopy 과 Western Blot에 의해 관심 단백질(특히 S, Sd, E1, E2, E1-Sd, Es-Sd...)을 분석하는 생화학 과정과, 정량화 과정(ELISA(효소결합면역흡착검사))/HCV-HBV의 정제(sucrose gradient then affinity chromatography)과정뿐 아니라 transmission electron microscopy에서 형질주입된 세포의 전자현미경적(ultra-structural analysis) 분석과정에 있어서, 키메라 서브바이러스 막 입자(chimeric subviral enevelope particles)는 이미 개시된바 있다[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51].
발명의 융합단백질과 HCV의 와일드 타입 S단백질 E1,E2의 탐지는 monoclonal murine 항-E1 항체(A4, provided by Dr Harry Greenberg, University of Stanford, California) [Dubuisson, J., Hsu, H. H., Cheung, R. C., Greenberg, H. B., Russell, D. G., and Rice, C. M. (1994). Formation and intracellular localization of hepatitis C virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia and Sindbis viruses. J Virol 68(10), 6147-60)] 또는 항-E2 항체(H52, provided by Dr Jean Dubuisson, Institut Pasteur de Lille) [Deleersnyder, V., Pillez, A., Wychowski, C., Blight, K., Xu, J., Hahn, Y. S., Rice, C. M., and Dubuisson, J. (1997). Formation of native hepatitis C virus glycoprotein complexes. J Virol 71(1), 697-704].에 의해 이루어진다.
I-4 ) 배양상층액(culture supernatant)의 분석
형질주입 후 107 가량의 세포가 형질주입된 배양상층액은 1500g에서 10분간 원심분리를 통해 깨끗해지고, SW41 rotor (L70 Ultracentrifuge, Beckman)에 의해 4°C에서 16시간 동안 35000rpm 초원심분리가 이루어진다. 잔류물은 lysis buffer 50μL 에 흡수되고 Western-blot에 의해 분석된다.
I.5 ) 발명의 융합 단백질 E1 - Sd 및 E2 - Sd 의 생산
pit1-e1-sd, pit2-e2-sd 의 하이브리드 핵산분자로 구성된 플라스미드 pSFV1에 의한 형질주입 후 16시간이 지나, BHK-21 세포는 monoclonal 항-E1 및 항-E2 항체를 이용한 Western-blot에 의해 용해되고 분석된다. BHK-21 세포에서의 일시적인 생산 후에, E1-Sd는 대략 50kD, E2-Sd는 대략 85kD의 크기를 갖는다. 상기 결과는, 상기 융합 단백질 항-E1 및 항-E2 항-S 항체의 발견으로 얻어진 강렬한 면역형광법(immunofluorescence)과 관련된 것으로, 상기 단백질이 정확히 생산되고 당화되었으며 원하는 트랜스멤브레인(transmembrane) 토폴로지에 맞게 설계되었음을 나타낸다.(도 6a에서 6d)
발명에서 다른 융합 단백질의 분비능(secretion capacity)을 회복시키기 위해, 동시 형질주입(co-transfections)은 trans로 HBV S 단백질의 와일드 타입 형태를 발명의 각 융합 단백질로 도입하여 이행된다(도 7).
형질주입(transfection) 후 16시간이 지나, 동시 형질주입된 세포는 가공되고 세포내의 서브바이러스 입자(subviral particles)는 sucrose gradient 이후 affinity chromatography 에 의해 이미 소개한 바와 같이 정제된다.[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]. 모든 경우에 서브바이러스 입자(subviral particles)는, 실시 예 I.3에 기술한 항-S, 항-E1, 항-E2 항체를 사용한 transmission electron microscopy 및 Western-blot에 의해 연구된다.(도 7B에서 7G)
transmission electron microscopy의 이미지는, 발명의 융합 단백질을 갖고 와일드 타입 S 단백질을 재 생산(co-production)하는 상기 모든 실험에 있어, 구체이고 사상(filamentous)인 서브바이러스 입자(subviral particles)의 중요한 수치를 만들어낸다. Wetern-blot 분석은 발명의 융합 단백질에서 더 많은 또는 더 적은 사상(filamentous)의 서브바이러스 입자(subviral particles)를 나타낸다.
“Semliki”system 에서의 발명의 실시 예 1에 의하면, HCV의 E1 또는 E2 단백질로 거의 구성된 융합 단백질은 HBV에 대한 백신생산에 사용되는 서브바이러스 입자(subviral particles)처럼 같은 성질의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)로 자기조립하고, 그로 인해 상기 발명의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)의 정제의 시행과 HCV에 대한 백신의 산업적 이용개발 및 HBV백신의 재생산이 가능하다.
본 발명의 실시 예 1은 또한 HCV의 잘려지지(non truncated) 않은 단백질 E1 및/또는 E2로 구성된 융합단 생산을 생산을 보여준다. 상기 특성이 최적화된 중화반응과 세포면역반응의 유발을 결정함을 증명해 보인다.
그러나, “Semliki”system에서, 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)는 일시적 세포의 형질주입의 의해 생산된다. 실제로, 상기 벡터의 높은 세포독성으로 인해, 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)의 긴 시간 동안 효율적인 분비가 불가능하다. 더욱이, 동시형질주입(co-transfected)된 세포의 현탁액(homogenate)에서 얻은 상기 입자의 정화는 상대적으로 다루기가 어렵고, 산업적 생산에는 부적당하다.
비 제한된 예를 사용하여, 안정된 방법으로 HBV의 와일드 타입 S 단백질뿐 아니라 융합 단백질 E1-Sd 또는 E2-Sd를 발현하는 CHO 타입 주(CHO type lines)의 취득에 관한 발명의 구체화는 도 8내지 11에 나타난다. 상기 시스템의 장점은, 융합 단백질과 같은 재조합 단백질의 생산에 있어 중대한 단기간의 세포독성효과, 예를 들어 SFV 시스템에서 나타나는 것과 같은 세포독성효과가 없다는 것이다.
본 발명의 구체화된 목적은 HBV에 대한 백신의 산업적 재료에 사용되는 입자와 같게 발명의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)를 생산하는 세포 시스템을 생산할 수 있다는 것이다.
실시 예 II : lentiviral system 에서 HCV 의 서브바이러스 막 입자( subviral enevelepe particles )의 취득
lentiviral vectors의 사용은, 융합 단백질 E1-Sd 및/또는 E2-Sd 중 하나와 관련된 HBV의 와일드타입 S 단백질을 안정된 방법으로 생산하는 클론의 개발을 카능토록 한다.
II -1 ) pLENTI 플라스미드 lentiviral vectors .
selection gene으로 구성되며 selection marker와 같은 히그로마이신 저항 단백질을 인코딩하는 9955 pb의 pLENTIhph plasmid는 이하 구조에 사용된 바 있다[Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H., Verma, I. M., and Trono, D. (1996). In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector. Science 272(5259), 263-7].
우선, 와일드 타입 S 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 효소 BamHI (Biolabs)의 제한에 의해 pSFV1-S로부터 이미 공지된 바와 같이 얻어지고 [Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51], 제조자의 권고에 맞게 “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” system (Promega)을 이용하여 1% agarose gel에서 정제된다. 상기 정제된 단편은 제조자의 권고에 맞게 T4-DNA-ligase (Biolabs)를 이용하여 pLENTIhph 의 멀티플 클로닝 싸이트에 포함된 BAMHI site에서 클로닝된다. pLENTIhph -S 플라스미드는 결국 박테라아 형질도입에 의해 증폭되고 제조자의 권고에 맞게 “Nucleobond PC 500 Kit”system (Qiagen) 을 이용하여 DNA maxi-preparation에 의해 정제된다. 삽입배향(the orientation of the insert)은 효소제한(enzymatic restriction)에 의해 확인된다.
같은 방법으로, 발명에 있어 융합 단백질(특히 E1-Sd 및 E2-Sd)을 인코딩하는 발명의 DNAc의 다른 하이브리드 핵산 분자는 pLENTIgfp plasmid의 BamHI site 에서 복제된다. 그 결과 얻어진 플라스미드는(특히 pLENTIgfp- E1-Sd and E2-Sd) 증폭 및 정제되고 배열이 결정된다.
II -2 ) 재조합 lentivirus 의 생산
lentiviral plasmids의 형질주입 24시간전에, HEK 293T 세포는, DMEM-glutamax medium (Invitrogen)에서 3.106 cells/75 cm2 flask (Falcon)의 비율로, decomplemented foetal bovine serum (ATGC) 10%와 페니실린(penicillin) 100 UI/mL와 스트렙토 마이신 (streptomycin)100μg/mL이 보충되어 시드된다(seeded). 상기 세포는 CO2 5% 조건에서 배양되고 배지(culture medium)에서 형질주입 4시간전에 변화했다. 각 플라스미드 p8.74, pVSV-G와 pLENTI의 1pmole(pLENTIhph-S, pLENTIgfp- E1-Sd, E2-Sd)는 제조자의 권고에 따라 “Calcium Phosphate Transfection Kit” system (Invitrogen)를 이용하여 세포 HEK 293T에서 동시에 형질주입되었다. 배지(culture medium)는 형질주입 20 후에 변화하고 형질주입 후 48시간, 72시간 후에 수집된다. 수집된 배지는 0.45μm에서 필터링되고, 90분간 1000.000g, 4℃조건으로 20% sucrose cushion에서 농축된다. 제조합 lentiviruses 를 포함한 잔류물은 phosphate buffer (PBS)의 500μL 에서 처리되어 -80℃에 보존된다. 재조합 lentiviral vectors, 특히 lentiviral vectors LVhph-S, LVgfp-E1-Sd, LVgfp-E2-Sd의 한 회분이 발생된다. 각 한 회분 lentiviral transducing units(TU)의 적정은 제조자의 권고에 맞게 “Innotest HIV Kit” (Innogenetics) system을 이용한 p24 단백질의 분석으로부터 결정된다.
II -3 ) 세포 배양과 형질도입
HCV-HBV 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)의 안정되고 필수적인 생산에 사용되는 세포주는, CHO로 명명되는 Chinese hamster ovary line이다. 상기 세포주는 의학용, 특히 HBV 백신 “GenHevac B Pasteur®”(Sanofi Pasteur MSD)의 재결합 단백질의 생산에 완벽히 유효한 것이 인정되었다. 상기 CHO 세포는 DMEM-F12 medium (Invitrogen)에서 5% CO2, 10 % decomplemented foetal bovine serum (ATGC), 페니실린(penicillin) 100 UI/mL 및 스트렙토마이신(streptomycin) 100μg/mL인 조건에서 배양된다. 형질도입 24시간 전에, CHO 세포는 6-well plate (Falcon)에서 105 cells/well의 비율로 배양된다. 그 후 상기 세포는 2.5 감염다중도(multiplicity of infection)로 새로운 배지에서 폴리브렌(polybrene) 4μg/mL (Sigma-Aldrich)의 존재하에 형질도입되고, 24시간 배양된다. 다음날, 형질도입 미디엄(transduction medium)이 제거되고, 발명의 실시에 따라 얻어진 상기 세포는 PBS buffer에서 씻겨지며(rinsed), 2일간 배양된다.
II -3.1 ) 와일드 타입 S 단백질의 안전한 CHO 클론 제조자의 생성
사용된 CHO 주는, 상기 프로토콜에 따라 lentivirus LVhph-S로 형질도입된다(도 8). 형질도입의 효율은 이미 공지된 프로토콜에 따른 직접적인 와일드 타입 S 단백질에 대한 항체를 이용한 면역형광(immunofluorescence)에 의해 확인된다 [Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]. 형질도입 3일 후, 히그로마이신(hygromycin, Euromedex) 1 mg/mL 의 존재하에, 10cm 지름의 배양상자에서 세포는 trypsinized되고 재배양되며, 3주간 배양이 유지된다. 신생의 세포클론은 cloning cylinder (Invitrogen)에 의해 회복되고, 24-well plates (Falcon)에서 증폭된다. 사용된 CHO 클론은 정량화된 후 ELISA(효소결합면역흡착검사)에 의한 와일드 타입 S 단백질의 배양 상층액(culture supernatant)에서 선택된다[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]. 상기 세포 클론은 CHO-S라 명명한다.
II -3.2 ) HBV 의 와일드 타입 S 단백질의 안전한 CHO 클론 생산자 및 발명 E1-Sd와 E2 - Sd 융합 단백질의 생성
CHO-S 세포 클론은, 셀렉션 마커로서 GFP 단백질을 인코딩하며 하이브리드 핵산 분자를 구성하는 재결합 lentivirus LVgfp 특히, 상기§II-3.1에서의 LVgfp-PIT1-E1-Sd 또는 LVgfp-PIT2-E2-Sd(도 8)와 나중에 재 형질도입된다. GFP 단백질의 존재 때문에, 형질도입의 효율은 FACScalibur cytometer in flux (Becton-Dickinson)을 사용하여 확인된다. 형질도입 3일 후 세포는 1 cell/well의 비율로 96-well plate (Falcon)에서 한계 희석(limit dilution)으로 단백질 효소로 처리되고(trypsinized) 재배양되며, 3주간 배양상태가 유지된다. 신생 GFP + 세포 클론은 회복된 후 대량으로 증폭된다. 상기과정으로 얻어진 세포 클론은 특별히 CHO-E1 또는 CHO-E2로 명명한다.
II -4 ) HBV 및 HCV 의 키메라(chimeric), 와인드 타입 막 단백질의 세포 내 생산 분석
immunofluorescence와 Western Blot에 의한 각 클론 세포의 관심 단백질 S, E1-Sd 또는 E2-Sd의 생화학 분석 절차는 이미 example I in § I-4에서 개시된 바 있다.
II -5 ) 배양상층액(culture supernatant)에서 얻은 키메라 서브바이러스 입자( chineric subviral particles )의 정제 및 분석
선택된 각 클론에 대한 약 200ml의 배양상측액(culture supernatant)은 4 °C, 1500 g에서 10 분간 원심분리되어 정화된다. 단백질은 (NH4)2SO4 (pH 7.5; 45 % final)을 첨가하여 침전되고, 4 °C, 10000 g에서 15 분간 원심분리된다. 잔류물은 TNE buffer (10 mM Tris/HCl pH 7.5 / 100 mM NaCl / 1 mM EDTA)에서 최소부피로 처리된다. TNE buffer에서 일련의 투석(dialyses) 후 CsCl은, 1.22 g/cm3 밀도까지 추가되고, 그리고 나서 두 연속적인 등 밀도 초-원심분리(isopycnal ultra-centrifugations)가 45Ti rotor (L70 Ultracentrifuge, Beckman)를 사용하여 15 °C 48시간동안 40.000 rpm으로 행해진다. 단편들은 구배 정상에 수집되고, 와일드 타입 S 단백질은 ELISA(효소결합면역흡착검사)에 의해 정량화된다[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]. 양성 단편(positive fractions)은 TNE buffer에서 4 °C 로 혼합 및 투석되었다.
정제된 물질은 끝내 예 I 의 § I-4에 이미 개시된 바와 같이 Western Blot 과 transmission electron microscopy 에 의해 분석된다.
II -6 ) S 단백질 및 융합 단백질의 세포내 생산
CHO-S, CHO-E1-Sd 및 CH0-E2-Sd 세포 클론은, 단백질 Sd, E1 또는 E2 (cf.: example I 의 § I-4 및 도 9)에 대한 직접적인 항체를 이용하여 immunofluorescence 및 Western-blot 에 의해 분석된다. 예상대로, 모든 클론은 글리코실화(glycosylation)의 두 단계(p24, p27)에서 HBV의 와일드 타입 S 단백질의 집중적인 생산을 가능케 한다. 유사하게, CHO-E1-Sd 및 CHO-E2-Sd 클론도 예상 크기인 발명의 융합 단백질에 대한 집중적인 세포질의 생산을 가능케 한다. 그래서 상기 결과는 발명의 모든 융합 단백질이 CHO 주(CHO Line)에서 정확하게 생성됨을 보인다.
II -7 ) 입자의 정제
첫 번째 정제 시험은 CHO-S, CHO-E1-Sd or CHO-E2-Sd clone의 200 mL 배양상층액(culture supernatant)에서 행해졌다. 상기 배양상층액은, 약 100ng/ml인 3개 클론에 대해서 상기 배양 상층액의 와일드 타입 S 단백질의 농도가 ELISA(효소결합면역흡착검사)에 의해 평가되며, CsCl의 등 밀도 구배에서 초-원심분리된다. 이후, 형성된 각 구배의 단편은 와일드 타입 S 단백질의 정량화에 의해 분석된다(도 10). 정제된 3 유형의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles, S, E1-Sd 및 E2-Sd)에 대해, 와일드 타입 S 단백질의 최고 농도는, 밀도 1.17 과 1.18 사이에 일치하여 단편 n°9에서 관찰될 수 있다. 이후 각 물질의 단편 n° 8, 9 및 10은, 와일드 타입 단백질 S, E1 또는 E2(cf.: 예 I 의 § I-4 및 도 11a) 에 대한 직접적인 항체를 이용하여 Weterm-blot 및 음성착색의(negative coloration) transmission electron microscopy(도 11b에서 11d)에 의해 투석된 후 분석되기 위해 재조립된다.
각 정제된 와일드 타입 S 단백질의 1μg에 맞는 증착물(deposition)은 분석을 위해 acrylamide gel로 이동된다. 상기 이동은 E1-Sd 및 E2-Sd 융합 단백질이 각 물질에서 항-E1 또는 항-E1 항체에 의해 예상된 크기 및 상당량으로 탐지될 수 있다는 것을 보여준다. 유사하게, 와일드 타입 S 단백질의 클리코실화의 예상된 2 형태도 각 물질에서 탐지될 수 있다. transmission electron microscopy에서 음성착색(negative coloration)에 의한 분석은 상기 연구된 3개 물질 내에 약 20nm 지름인 구형(spherical)의 서브바이러스 입자(subviral particles)의 존재가 사실임을 보여준다.
Example III : 2개 융합 단백질 E1 - Sd , E2 - Sd 로 구성된 서브바이러스 막 입자( subviral enevelope particles )의 취득
gene gfp에 있는 Gaussia princeps의 selection gene gluc로 구성된 새로운 pLENTIgluc 플라스미드가 형성되고 상기는 selection marker로 분비된 luciferase (GLuc)를 인코딩한다. 융합 단백질 E1-Sd를 인코딩하는 DNAc의 단편은 pLENTIgluc plasmid의 BamHI site에서 클로닝된다. 그래서 pLENTIgluc -E1-Sd plasmid는 증폭 및 정제되고, 시퀀싱된다(sequenced)(cf. II-1).
III .1. 재조합 lentivirus 의 생산
lentiviral plasmids의 형질주입 24시간 전에, HEK 293T 세포는, DMEM-glutamax medium (Invitrogen)에서 3.106 cells/75 cm2 flask (Falcon)의 비율로, decomplemented foetal bovine serum (ATGC) 10%와 페니실린(penicillin) 100 UI/mL와 스트렙토 마이신 (streptomycin)100μg/mL이 보충되어 시드된다(seeded). 상기 세포는 CO2 5% 조건에서 배양되고 배지(culture medium)에서 형질주입 4시간전 변화한다. 각 플라스미드 p8.74, pVSV-G와 pLENTIgluc-E1-Sd는 제조자의 권고에 따라 “Calcium Phosphate Transfection Kit” system (Invitrogen)를 이용하여 세포 HEK 293T에서 동시에 형질주입된다. 배지(culture medium)는 형질주입 24시간 후에 변화하고 형질주입 후 48시간, 72시간 후에 수집된다. 수집된 배지는 0.45μm에서 필터링되고, 90분간 1000.000g, 4℃조건으로 20% sucrose cushion에서 농축된다. 제조합 lentiviruses 를 포함한 잔류물은 phosphate buffer (PBS)의 500μL 에서 처리되어 -80℃에 보존된다. 재조합 lentivirus, 특히 LVgluc-E1-Sd의 한 회분이 발생된다. 상기 각 한 회분 lentiviral transducing units(TU)의 적정은 제조자의 권고에 맞게 “Innotest HIV Kit” (Innogenetics) system을 이용한 p24 단백질의 분석으로부터 결정된다.
III .2. 융합 단백질 E2 - Sd 와 E1 - Sd , HBV 의 와일드 타입 S 단백질의 안정된 CHO 클론 프로듀서의 발생
CHO 세포의 배양과 개시된 형질도입 방법과 예 II 에 사용되는 방법은 이하에 적용된다. CHO-S 세포 클론의 획득을 가능케 하는 lentivirus LVhph-S와의 첫 번째 형질도입 후, 두 번째 형질도입이 실시 예 II에 개시된 프로토콜에 맞춰 lentivirus LVgfp- E2-Sd와 행해지는데, 이는 CHO-E2-Sd 세포내 클론의 취득을 가능케 한다.
후자는 상기 프로토콜에 맞게 lentivirus LVgiuc- E2-Sd와 재 형질도입이 이뤄진다. 형질도입 3일 후, 세포는 1 cell/well의 비율로 96-well plate (Falcon)에서 한계 희석(limit dilution)으로 단백질 효소로 처리(trypsinized)되고 및 재배양된다. 세포의 3주간 배양이 유지되고 3주 끝에 신생 세포 클론의 상층액(supernatant)이 수집된다. 상기 상층액(supernatant)에서, 루시페라아제(luciferase)의 존재는 제조자의 권고에 따라 “Gaussia Luciferase Assay Kit” system (Biolabs)을 사용한 효소활성(enzymatic activity)의 측정을 통해 탐지된다. 효소반응에 의해 발산되는 빛은 Centro LB 960 luminometer (Berthold Technologies)에 의해 측정할 수 있다. 상층액 GLuc+에 따른 세포 클론은 회복된후 다량으로 증폭된다. 그래서 취득한 클론을 CHO-S/Es-Sd/E1-Sd라 명명한다.
Example IV : 생체 내에서 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)의 면역활동
각 입자 유형(S+E1-Sd, S+E2-Sd, HBV의 오직 S)에 대한 5에서 10 milligrammes의 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles)는 상기 방법에 따른 세포 배양 상층액으로부터 정제된다.
쥐와 토끼의 4개 그룹은 일련의 면역반응을 알아보기 위해 사용된다. 면역화는 고전적 방법으로 면역원 10 milligrammes를 3번 주입하여 행해진다.
첫 번째 그룹은, 입자 S+E1-Sd 에 면역된다
두 번째 그룹은, 입자 S+E2-Sd 에 면역된다.
세 번째 그룹은, 입자 HBV 에 면역된다.
네 번째 그룹은, 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles) S+E1-Sd 및 키메라 서브바이러스 입자(chimeric subviral particles) S+E2-Sd에 면역된다.
상기 동물들에서 나타나는 전반적인 체액성 면역(global humoral response)은 ELISA(효소결합면역흡착검사) 및 Western-blot에 의해 탐지된다. 항-S 항체를 위해, 상업적인 ELISA(효소결합면역흡착검사, Abbott,Roche)가 항-S 항체의 international units(UI)의 수를 결정할 수 있는데, 이는 HBV에 대한 중화성질을 갖고 있다고 알려져 있다. 적어도 10 UI와 같은 농도가 HBV에 대한 보호로서 고려된다(Jilg W, et al. Hepatitis B-vaccination: Strategy for booster doses in high risk population groups. Progress in Hepatitis B Immunization. Eds. P. Coursaget et al. Colloque Inserm. 1990; 190: 419?427.). 항-E1 및 항-E2 항체를 위해, 항-E1 및 항-E2 항체 반응이 발생하는지를 평가하기 위해 Western-blot가 사용된다. 이런 경우, 상기 분석은 바이러스를 중화시키는 항-E1 및 항-E2 항체의 존재를 분석함으로써 완료된다. 상기 항체에 의한 HCV의 중화 분석은, 생체 외에서 유전자형 2인 HCV strain의 전파를가능케 하는 JFH-1 system(Wakita et al., Nat Med 2005)에서, 또는 유전자형 1 또는 3인 HCV의 구조 단백질로 구성된 키메라(chimeric) viral strain을 사용하여 행해진다.
<110> UNIVERSITE FRANCOIS RABELAIS DE TOURS Roingeard, Philippe Hourioux, Christophe Patient, Romuald <120> NEW FUSION PROTEINS AND THEIR USE FOR THE PREPARATION OF VACCINES AGAINST HEPATITIS c <130> IFB 08 TOU VACC <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 612 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <221> CDS <222> (1)..(612) <400> 1 aca aga atc ctc aca ata ccg cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct 48 Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser 1 5 10 15 ctc aat ttt cta ggg gga tct ccc gtg tgt ctt ggc caa aat tcg cag 96 Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln 20 25 30 tcc cca acc tcc aat cac tca cca acc tcc tgt cct cca att tgt cct 144 Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro 35 40 45 ggt tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc 192 Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile 50 55 60 ctg ctg cta tgc ctc atc ttc tta ttg gtt ctt ctg gat tat caa ggt 240 Leu Leu Leu Cys Leu Ile 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Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1089) <400> 5 gaa acc tac acc acc ggg ggg agt att gcc aaa acc gtg caa gga ttc 48 Glu Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Ser Ile Ala Lys Thr Val Gln Gly Phe 1 5 10 15 acc agt ttt ttt acc cca ggc gcc aag cag gac atc cag ctg atc aac 96 Thr Ser Phe Phe Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asp Ile Gln Leu Ile Asn 20 25 30 acc aac ggc agt tgg cac atc aat cgc acg gcc ttg aac tgt aat gcg 144 Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Ala 35 40 45 agc ctc gaa acc ggc tgg ata gcg ggg ctc ttc tac tac aac aaa ttc 192 Ser Leu Glu Thr Gly Trp Ile Ala Gly Leu Phe Tyr Tyr Asn Lys Phe 50 55 60 aac tcc tca ggc tgc ccc gag agg atg gcc agc tgc aaa ccc ctt gcc 240 Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Lys Pro Leu Ala 65 70 75 80 tat ttc gcc caa ggc tgg ggc cct atc agc cat gtc aac gga agc ggc 288 Tyr Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser His Val Asn Gly Ser Gly 85 90 95 ccc gaa cag cgc ccc tac tgc tgg cac tac gcc cca agg cct tgt ggt 336 Pro Glu Gln Arg Pro Tyr 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Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys 210 215 220 ctg gtc gac tat cct tat agg ctc tgg cat tat cct tgc act gtc aac 720 Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn 225 230 235 240 tac acc ctg ttt aaa atc agg atg tac gtg gga ggg gtc gag cac agg 768 Tyr Thr Leu Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg 245 250 255 cta caa gct gct tgc aac tgg acg cgg ggc gag cgt tgt gat ctg gac 816 Leu Gln Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Asp 260 265 270 gac agg gac agg tcc gag ctc agc ccg ctg ctg ctg tcc acc acg cag 864 Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln 275 280 285 tgg cag gtc ctt ccg tgt tct ttc acg acc ttg cca gcc ttg acc acc 912 Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Thr Thr 290 295 300 ggc ctc atc cac ctc cat cag aac atc gtg gac gtg caa tat ttg tac 960 Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr 305 310 315 320 ggg gtg ggg tca agc att gtg tcc tgg gcc atc aag tgg gag tac gtc 1008 Gly Val Gly Ser Ser Ile Val Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val 325 330 335 att ctc ttg ttt ctc ctg ctt gca gac gcg cgc atc tgc tcc tgc ttg 1056 Ile Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Ile Cys Ser Cys Leu 340 345 350 tgg atg atg cta ctc ata tcc caa gcg gag gcg 1089 Trp Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala 355 360 <210> 6 <211> 363 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 6 Glu Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Ser Ile Ala Lys Thr Val Gln Gly Phe 1 5 10 15 Thr Ser Phe Phe Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asp Ile Gln Leu Ile Asn 20 25 30 Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Ala 35 40 45 Ser Leu Glu Thr Gly Trp Ile Ala Gly Leu Phe Tyr Tyr Asn Lys Phe 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Lys Pro Leu Ala 65 70 75 80 Tyr Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser His Val Asn Gly Ser Gly 85 90 95 Pro Glu Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly 100 105 110 Ile Val Ser Ala Gln Thr Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro 115 120 125 Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Lys Leu Gly Ala Pro Thr Tyr 130 135 140 Asn Trp Gly Glu Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg 145 150 155 160 Pro Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Ser Gly 165 170 175 Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Ala Ile Gly Gly Val Gly 180 185 190 Asn Asn Thr Leu Arg Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu 195 200 205 Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys 210 215 220 Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg 245 250 255 Leu Gln Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Asp 260 265 270 Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln 275 280 285 Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Thr Thr 290 295 300 Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr 305 310 315 320 Gly Val Gly Ser Ser Ile Val Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val 325 330 335 Ile Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Ile Cys Ser Cys Leu 340 345 350 Trp Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala 355 360 <210> 7 <211> 1182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from HCV and HBV <220> <221> CDS <222> (1)..(1182) <400> 7 tac caa gta cgc aac tcc tcg ggc ctt tac cat gtc acc aat gat tgc 48 Tyr Gln Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 cct aac tcg agt att gtg tac gag acg gcc gat acc atc cta cac tct 96 Pro Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr Ala Asp Thr Ile Leu His Ser 20 25 30 ccg ggg tgt gtc cct tgc gtt cgc gag ggc aat gcc tca aaa tgt tgg 144 Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Lys Cys Trp 35 40 45 gtg gcg gtg gcc cct aca gtc gcc acc aga gac ggc aag ctc ccc aca 192 Val Ala Val Ala Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr 50 55 60 acg cag ctt cga cgt cac atc gat ctg ctc gtc agg agc gcc acc ctc 240 Thr Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Leu 65 70 75 80 tgc tcg gcc ctc tat gtg ggg gac ttg tgc ggg tcc gtc ttc ctc gtc 288 Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val 85 90 95 ggt caa ctg ttc acc ttc tcc ccc agg cgc cac tgg aca acg caa gac 336 Gly Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp 100 105 110 tgc aac tgt tcc atg tac ccc ggc cat ata acg ggt cac cgt atg gca 384 Cys Asn Cys Ser Met Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala 115 120 125 tgg gac atg atg atg aac tgg tcc cct acg aca gcg ctg gta gta gct 432 Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ala 130 135 140 cag ctg ctc agg gtc ccg caa gcc atc ttg gac atg atc gct ggt gcc 480 Gln Leu Leu Arg Val Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala 145 150 155 160 cac tgg gga gtc cta gcg ggc ata gcg tat ttc tcc atg gtg ggg aac 528 His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn 165 170 175 tgg gcg aag gtc ctg gtg gtg ctg ttg ctg ttc gcc agc aca aga atc 576 Trp Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Ser Thr Arg Ile 180 185 190 ctc aca ata ccg cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt 624 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 195 200 205 cta ggg gga tct ccc gtg tgt ctt ggc caa aat tcg cag tcc cca acc 672 Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 210 215 220 tcc aat cac tca cca acc tcc tgt cct cca att tgt cct ggt tat cgc 720 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 225 230 235 240 tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta 768 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu 245 250 255 tgc ctc atc ttc tta ttg gtt ctt ctg gat tat caa ggt atg ttg ccc 816 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 260 265 270 gtt tgt cct cta att cca gga tca aca aca acc agt acg gga cca tgc 864 Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 275 280 285 aaa acc tgc acg act cct gct caa ggc aac tct atg ttt ccc tca tgt 912 Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys 290 295 300 tgc tgt aca aaa cct acg gat gga aat tgc acc tgt att ccc atc cca 960 Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro 305 310 315 320 tcg tcc tgg gct ttc gca aaa tac cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt 1008 Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg 325 330 335 ttc tct tgg ctc agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg 1056 Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly 340 345 350 ctt tcc ccc act gtt tgg ctt tca gct ata tgg atg atg tgg tat tgg 1104 Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp 355 360 365 ggg cca agt ctg tac agc atc gtg agt ccc ttt ata ccg ctg tta cca 1152 Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro 370 375 380 att ttc ttt tgt ctc tgg gta tac att taa 1182 Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile 385 390 <210> 8 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Tyr Gln Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 Pro Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr Ala Asp Thr Ile Leu His Ser 20 25 30 Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Lys Cys Trp 35 40 45 Val Ala Val Ala Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr 50 55 60 Thr Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Leu 65 70 75 80 Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val 85 90 95 Gly Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp 100 105 110 Cys Asn Cys Ser Met Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala 115 120 125 Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ala 130 135 140 Gln Leu Leu Arg Val Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala 145 150 155 160 His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn 165 170 175 Trp Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Ser Thr Arg Ile 180 185 190 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 195 200 205 Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 210 215 220 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 225 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Gly Phe 1 5 10 15 acc agt ttt ttt acc cca ggc gcc aag cag gac atc cag ctg atc aac 96 Thr Ser Phe Phe Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asp Ile Gln Leu Ile Asn 20 25 30 acc aac ggc agt tgg cac atc aat cgc acg gcc ttg aac tgt aat gcg 144 Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Ala 35 40 45 agc ctc gaa acc ggc tgg ata gcg ggg ctc ttc tac tac aac aaa ttc 192 Ser Leu Glu Thr Gly Trp Ile Ala Gly Leu Phe Tyr Tyr Asn Lys Phe 50 55 60 aac tcc tca ggc tgc ccc gag agg atg gcc agc tgc aaa ccc ctt gcc 240 Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Lys Pro Leu Ala 65 70 75 80 tat ttc gcc caa ggc tgg ggc cct atc agc cat gtc aac gga agc ggc 288 Tyr Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser His Val Asn Gly Ser Gly 85 90 95 ccc gaa cag cgc ccc tac tgc tgg cac tac gcc cca agg cct tgt ggt 336 Pro Glu Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly 100 105 110 atc gtg tca gca cag aca gta tgt ggc cca gtg tat tgt ttc act cct 384 Ile Val Ser Ala Gln Thr Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro 115 120 125 agc ccc gtg gtg gtg ggg acg acc gac aag ttg ggc gcg cct acc tac 432 Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Lys Leu Gly Ala Pro Thr Tyr 130 135 140 aac tgg ggt gag aat gat acg gac gtc ttc gtc ctc aat aac acc agg 480 Asn Trp Gly Glu Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg 145 150 155 160 cca ccg ttg ggc aat tgg ttc ggt tgc acc tgg atg aac tca tct gga 528 Pro Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Ser Gly 165 170 175 ttc acc aaa gtg tgc gga gcg cct ccc tgt gcc atc gga gga gtg ggc 576 Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Ala Ile Gly Gly Val Gly 180 185 190 aat aac acc ttg cgc tgt ccc act gac tgt ttc cgc aag cat ccg gaa 624 Asn Asn Thr Leu Arg Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu 195 200 205 gct aca tac tct cga tgt ggc tcc ggt ccc tgg atc acg ccc agg tgc 672 Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys 210 215 220 ctg gtc gac tat cct tat agg ctc tgg cat tat cct tgc act gtc aac 720 Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn 225 230 235 240 tac acc ctg ttt aaa atc agg atg tac gtg gga ggg gtc gag cac agg 768 Tyr Thr Leu Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg 245 250 255 cta caa gct gct tgc aac tgg acg cgg ggc gag cgt tgt gat ctg gac 816 Leu Gln Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Asp 260 265 270 gac agg gac agg tcc gag ctc agc ccg ctg ctg ctg tcc acc acg cag 864 Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln 275 280 285 tgg cag gtc ctt ccg tgt tct ttc acg acc ttg cca gcc ttg acc acc 912 Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Thr Thr 290 295 300 ggc ctc atc cac ctc cat cag aac atc gtg gac gtg caa tat ttg tac 960 Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr 305 310 315 320 ggg gtg ggg tca agc att gtg tcc tgg gcc atc aag tgg gag tac gtc 1008 Gly Val Gly Ser Ser Ile Val Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val 325 330 335 att ctc ttg ttt ctc ctg ctt gca gac gcg cgc atc tgc tcc tgc ttg 1056 Ile Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Ile Cys Ser Cys Leu 340 345 350 tgg atg atg cta ctc ata tcc caa aca aga atc ctc aca ata ccg cag 1104 Trp Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln 355 360 365 agt cta gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga tct ccc 1152 Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro 370 375 380 gtg tgt ctt ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cac tca cca 1200 Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro 385 390 395 400 acc tcc tgt cct cca att tgt cct ggt tat cgc tgg atg tgt ctg cgg 1248 Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg 405 410 415 cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc tta 1296 Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu 420 425 430 ttg gtt ctt ctg gat tat caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta att 1344 Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile 435 440 445 cca gga tca aca aca acc agt acg gga cca tgc aaa acc tgc acg act 1392 Pro Gly Ser 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Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg 405 410 415 Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu 420 425 430 Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile 435 440 445 Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr 450 455 460 Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro 465 470 475 480 Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe 485 490 495 Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser 500 505 510 Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val 515 520 525 Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr 530 535 540 Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu 545 550 555 560 Trp Val Tyr Ile <210> 11 <211> 1263 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from HCV and HBV <220> <221> CDS <222> (1)..(1263) <400> 11 atg aca ggg aac ctt cct ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctt ctg gcc 48 Met Thr Gly Asn Leu Pro Gly 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Leu Val Gly Gln Leu Phe Thr 115 120 125 ttc tcc ccc agg cgc cac tgg aca acg caa gac tgc aac tgt tcc atg 432 Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn Cys Ser Met 130 135 140 tac ccc ggc cat ata acg ggt cac cgt atg gca tgg gac atg atg atg 480 Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met 145 150 155 160 aac tgg tcc cct acg aca gcg ctg gta gta gct cag ctg ctc agg gtc 528 Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ala Gln Leu Leu Arg Val 165 170 175 ccg caa gcc atc ttg gac atg atc gct ggt gcc cac tgg gga gtc cta 576 Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu 180 185 190 gcg ggc ata gcg tat ttc tcc atg gtg ggg aac tgg gcg aag gtc ctg 624 Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu 195 200 205 gtg gtg ctg ttg ctg ttc gcc agc aca aga atc ctc aca ata ccg cag 672 Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Ser Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln 210 215 220 agt cta gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga tct ccc 720 Ser Leu Asp Ser Trp Trp 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Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe 340 345 350 gca aaa tac cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tct tgg ctc agt 1104 Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser 355 360 365 tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt 1152 Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val 370 375 380 tgg ctt tca gct ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac 1200 Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr 385 390 395 400 agc atc gtg agt ccc ttt ata ccg ctg tta cca att ttc ttt tgt ctc 1248 Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu 405 410 415 tgg gta tac att taa 1263 Trp Val Tyr Ile 420 <210> 12 <211> 420 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Met Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn 20 25 30 Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn Ser 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Met Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Ser 1 5 10 15 gtc gat gcg gaa acc tac acc acc ggg ggg agt att gcc aaa acc gtg 96 Val Asp Ala Glu Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Ser Ile Ala Lys Thr Val 20 25 30 caa gga ttc acc agt ttt ttt acc cca ggc gcc aag cag gac atc cag 144 Gln Gly Phe Thr Ser Phe Phe Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asp Ile Gln 35 40 45 ctg atc aac acc aac ggc agt tgg cac atc aat cgc acg gcc ttg aac 192 Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn 50 55 60 tgt aat gcg agc ctc gaa acc ggc tgg ata gcg ggg ctc ttc tac tac 240 Cys Asn Ala Ser Leu Glu Thr Gly Trp Ile Ala Gly Leu Phe Tyr Tyr 65 70 75 80 aac aaa ttc aac tcc tca ggc tgc ccc gag agg atg gcc agc tgc aaa 288 Asn Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Lys 85 90 95 ccc ctt gcc tat ttc gcc caa ggc tgg ggc cct atc agc cat gtc aac 336 Pro Leu Ala Tyr Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser His Val Asn 100 105 110 gga agc ggc ccc gaa cag cgc ccc tac tgc tgg cac tac gcc cca agg 384 Gly Ser 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720 His Pro Glu Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr 225 230 235 240 ccc agg tgc ctg gtc gac tat cct tat agg ctc tgg cat tat cct tgc 768 Pro Arg Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys 245 250 255 act gtc aac tac acc ctg ttt aaa atc agg atg tac gtg gga ggg gtc 816 Thr Val Asn Tyr Thr Leu Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val 260 265 270 gag cac agg cta caa gct gct tgc aac tgg acg cgg ggc gag cgt tgt 864 Glu His Arg Leu Gln Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys 275 280 285 gat ctg gac gac agg gac agg tcc gag ctc agc ccg ctg ctg ctg tcc 912 Asp Leu Asp Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser 290 295 300 acc acg cag tgg cag gtc ctt ccg tgt tct ttc acg acc ttg cca gcc 960 Thr Thr Gln Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala 305 310 315 320 ttg acc acc ggc ctc atc cac ctc cat cag aac atc gtg gac gtg caa 1008 Leu Thr Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln 325 330 335 tat ttg tac ggg gtg ggg tca agc att gtg tcc tgg 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gat tat caa ggt atg ttg ccc gtt tgt 1392 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 450 455 460 cct cta att cca gga tca aca aca acc agt acg gga cca tgc aaa acc 1440 Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr 465 470 475 480 tgc acg act cct gct caa ggc aac tct atg ttt ccc tca tgt tgc tgt 1488 Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys 485 490 495 aca aaa cct acg gat gga aat tgc acc tgt att ccc atc cca tcg tcc 1536 Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 500 505 510 tgg gct ttc gca aaa tac cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tct 1584 Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser 515 520 525 tgg ctc agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc 1632 Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 530 535 540 ccc act gtt tgg ctt tca gct ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca 1680 Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro 545 550 555 560 agt 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agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 720 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 780 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 840 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 900 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 960 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1020 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1080 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 1140 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1200 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1260 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1320 ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1380 catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 1440 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 1500 aactggcgaa 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taaaaccatc cctcactggt atcgcatgat 4020 taaccgtctg atgtggatct ggcgcggcat tgacccacgc gaaatcctcg acgtccaggc 4080 acgtattgtg atgagcgatg ccgaacgtac cgacgatgat ttatacgata cggtgattgg 4140 ctaccgtggc ggcaactgga tttatgagtg ggccccggat ctttgtgaag gaaccttact 4200 tctgtggtgt gacataattg gacaaactac ctacagagat ttaaagctct aaggtaaata 4260 taaaattttt aagtgtataa tgtgttaaac tactgattct aattgtttgt gtattttaga 4320 ttccaaccta tggaactgat gaatgggagc agtggtggaa tgcctttaat gaggaaaacc 4380 tgttttgctc agaagaaatg ccatctagtg atgatgaggc tactgctgac tctcaacatt 4440 ctactcctcc aaaaaagaag agaaaggtag aagaccccaa ggactttcct tcagaattgc 4500 taagtttttt gagtcatgct gtgtttagta atagaactct tgcttgcttt gctatttaca 4560 ccacaaagga aaaagctgca ctgctataca agaaaattat ggaaaaatat tctgtaacct 4620 ttataagtag gcataacagt tataatcata acatactgtt ttttcttact ccacacaggc 4680 atagagtgtc tgctattaat aactatgctc aaaaattgtg tacctttagc tttttaattt 4740 gtaaaggggt taataaggaa tatttgatgt atagtgcctt gactagagat cataatcagc 4800 cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac 4860 ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt 4920 tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 4980 agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggatcaa ctggataact 5040 caagctaacc aaaatcatcc caaacttccc accccatacc ctattaccac tgccaattac 5100 ctagtggttt catttactct aaacctgtga ttcctctgaa ttattttcat tttaaagaaa 5160 ttgtatttgt taaatatgta ctacaaactt agtagttgga agggctaatt cactcccaaa 5220 gaagacaaga tatccttgat ctgtggatct accacacaca aggctacttc cctgattagc 5280 agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg tgctacaagc 5340 tagtaccagt tgagccagat aaggtagaag aggccaataa aggagagaac accagcttgt 5400 tacaccctgt gagcctgcat gggatggatg acccggagag agaagtgtta gagtggaggt 5460 ttgacagccg cctagcattt catcacgtgg cccgagagct gcatccggag tacttcaaga 5520 actgctgata tcgagcttgc tacaagggac tttccgctgg ggactttcca gggaggcgtg 5580 gcctgggcgg gactggggag tggcgagccc tcagatcctg catataagca gctgcttttt 5640 gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta 5700 gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc 5760 cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa 5820 atctctagca gtggcgcccg aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct 5880 ctcgacgcag gactcggctt gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg 5940 tgagtacgcc aaaaattttg actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg 6000 tcagtattaa gcgggggaga attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg 6060 gaaagaaaaa atataaatta aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg 6120 cagttaatcc tggcctgtta gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac 6180 aaccatccct tcagacagga tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc 6240 tctattgtgt gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag 6300 aggaagagca aaacaaaagt aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct 6360 ggaggaggag atatgaggga caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa 6420 attgaaccat taggagtagc acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa 6480 agagcagtgg gaataggagc tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg 6540 ggcgcagcgt caatgacgct gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag 6600 cagcagaaca atttgctgag ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc 6660 tggggcatca agcagctcca ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa 6720 cagctcctgg ggatttgggg ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg 6780 aatgctagtt ggagtaataa atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag 6840 tgggacagag aaattaacaa ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa 6900 aaccagcaag aaaagaatga acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg 6960 aattggttta acataacaaa ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga 7020 ggcttggtag gtttaagaat agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag 7080 ggatattcac cattatcgtt tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc 7140 gaaggaatag aagaagaagg tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac 7200 ggatctcgac ggtatcgccg aattcacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa 7260 aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca 7320 tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca 7380 gggacagcag agatccactt tatcgataag cttgggagtt ccgcgttaca taacttacgg 7440 taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 7500 atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 7560 ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 7620 acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact 7680 ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 7740 ggcagtacac caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc 7800 ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 7860 gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 7920 taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg 7980 acctccatag aagacaccga ctctagctag aggatccatg gaaacctaca ccaccggggg 8040 gagtattgcc aaaaccgtgc aaggattcac cagttttttt accccaggcg ccaagcagga 8100 catccagctg atcaacacca acggcagttg gcacatcaat cgcacggcct tgaactgtaa 8160 tgcgagcctc gaaaccggct ggatagcggg gctcttctac tacaacaaat tcaactcctc 8220 aggctgcccc gagaggatgg ccagctgcaa accccttgcc tatttcgccc aaggctgggg 8280 ccctatcagc catgtcaacg gaagcggccc cgaacagcgc ccctactgct ggcactacgc 8340 cccaaggcct tgtggtatcg tgtcagcaca gacagtatgt ggcccagtgt attgtttcac 8400 tcctagcccc gtggtggtgg ggacgaccga caagttgggc gcgcctacct acaactgggg 8460 tgagaatgat acggacgtct tcgtcctcaa taacaccagg ccaccgttgg gcaattggtt 8520 cggttgcacc tggatgaact catctggatt caccaaagtg tgcggagcgc ctccctgtgc 8580 catcggagga gtgggcaata acaccttgcg ctgtcccact gactgtttcc gcaagcatcc 8640 ggaagctaca tactctcgat gtggctccgg tccctggatc acgcccaggt gcctggtcga 8700 ctatccttat aggctctggc attatccttg cactgtcaac tacaccctgt ttaaaatcag 8760 gatgtacgtg ggaggggtcg agcacaggct acaagctgct tgcaactgga cgcggggcga 8820 gcgttgtgat ctggacgaca gggacaggtc cgagctcagc ccgctgctgc tgtccaccac 8880 gcagtggcag gtccttccgt gttctttcac gaccttgcca gccttgacca ccggcctcat 8940 ccacctccat cagaacatcg tggacgtgca atatttgtac ggggtggggt caagcattgt 9000 gtcctgggcc atcaagtggg agtacgtcat tctcttgttt ctcctgcttg cagacgcgcg 9060 catctgctcc tgcttgtgga tgatgctact catatcccaa acaagaatcc tcacaatacc 9120 gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggatctc ccgtgtgtct 9180 tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcctgtc ctccaatttg 9240 tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 9300 atgcctcatc ttcttattgg ttcttctgga ttatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 9360 aattccagga tcaacaacaa ccagtacggg accatgcaaa acctgcacga ctcctgctca 9420 aggcaactct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggatggaa attgcacctg 9480 tattcccatc ccatcgtcct gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 9540 tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 9600 tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acagcatcgt 9660 gagtcccttt ataccgctgt taccaatttt cttttgtctc tgggtataca tttaataagg 9720 atccggacta gtaactcgag gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag 9780 ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc 9840 ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg 9900 tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc 9960 tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc 10020 cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa 10080 ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct 10140 ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg 10200 atctgatctg gggcctcggt acacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg 10260 tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg 10320 ccacaaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 10380 agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 10440 ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 10500 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 10560 acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 10620 ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 10680 acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 10740 tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 10800 agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 10860 agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 10920 acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 10980 acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 11040 acaagtaagt cgagggaatt cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc 11100 tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca 11160 acgaagacaa gatctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg 11220 ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt 11280 gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc 11340 cttttagtca gtgtggaaaa tctctaga 11368

Claims (33)

  1. 다음의 a) 및 b)의 두 펩티드를 포함하는 면역원성의 융합 단백질:
    a) C 말단(C-terminal) 측에서, 다음의 아미노산 서열로 구성되는 첫 번째 펩티드:
    - 인간 HBV(hepatitis B virus)의 단리물(isolate)의 S 단백질의 아미노산 서열로서, 상기 S 단백질은 N 말단 끝에 위치한 트랜스멤브레인 도메인(membrane domain)이 제거된 것이고, 및
    b) N 말단(N-terminal) 측에서, 다음의 아미노산 서열로 구성되는 두 번째 펩티드:
    - HCV(hepatitis C virus) 단리물의 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인 및 엑토도메인(ectodomain)의 아미노산 서열,
    상기 HCV 단리물의 막 단백질은, 단백질 E1, 단백질 E2 또는 상기 단백질 E1과 단백질 E2를 포함하는 융합 펩티드로부터 선택되고,
    상기 융합 단백질은 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역원성의 융합 단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 HBV는 HBVadw 단리물인 것을 특징으로 하는 면역원성의 융합 단백질.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 HCV는 HCV-1a 단리물인 것을 특징으로 하는 면역원성의 융합 단백질.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제1항에 따른 융합 단백질을 인코딩하는 하이브리드 핵산분자로서,
    상기 융합 단백질은 상기 N 말단 측에 위치한 전송개시펩티드(transfer initiation peptide)를 포함하고,
    상기 하이브리드 핵산분자는
    i) - 서열번호 11, 또는
    ii) 서열번호 13으로 기재되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 핵산분자.
  19. 제18항에 따른 하이브리드 핵산분자 및 그의 발현을 위해 필요한 수단을 포함하는 벡터(vector)로서, 상기 벡터는 서열번호 15 또는 서열번호 16으로 기재되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  20. 제19항에 있어서,
    렌티바이러스 벡터를 추가로 포함하는 벡터.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 렌티바이러스 벡터는 플렌티(pLenti) 벡터인 벡터.
  22. 삭제
  23. 다음의 단백질을 포함하는 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자:
    - HBV 단리물의 표면 항원의 야생형 S 단백질로 이루어지는 단백질, 및
    - 제1항에 따른 면역원성의 융합 단백질.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 면역원성의 융합 단백질은 다음의 i) 및 ii)로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자:
    i) - 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열, 또는
    ii) - 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열.
  25. 제23항에 있어서,
    다음의 i) 및 ii)의 2개의 융합 단백질을 포함하는 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자:
    i) - 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열, 및
    ii) - 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열.
  26. 유효성분으로서 다음으로부터 선택되는 한 구성물 및 약학적으로 허용되는 운반체(vehicle)를 포함하는 B형 간염 또는 C형 간염의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물:
    - 제1항, 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질,
    - 제18항에 따른 하이브리드 핵산분자,
    - 상기 하이브리드 핵산분자를 포함하는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 및
    - 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 키메라 서브바이러스 입자.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 유효성분은 다음의 a) 내지 c)로 이루어지는 3개의 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 B형 간염 또는 C형 간염의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물:
    a) 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 융합 단백질:
    * 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열,
    b) 다음의 핵산 서열로 이루어지는 하이브리드 핵산 분자:
    * 서열번호 11로 기재되는 핵산 서열,
    또는 상기 하이브리드 핵산 분자를 포함하는 벡터,
    c) 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 면역원성의 융합 단백질을 포함하는 키메라 서브바이러스 입자:
    * 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 유효성분은 다음의 a) 내지 c)로 이루어지는 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 B형 간염 또는 C형 간염의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물:
    a) 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 융합 단백질:
    * 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열, 또는
    b) 다음의 핵산 서열로 이루어지는 하이브리드 핵산 분자:
    * 서열번호 13으로 기재되는 핵산 서열,
    또는 상기 하이브리드 핵산 분자를 포함하는 벡터,
    c) 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 면역원성의 융합 단백질을 포함하는 키메라 서브바이러스 입자:
    * 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열.
  29. 제26항에 있어서,
    상기 유효성분은 다음의 a) 및 b)의 아미노산 서열로 이루어지는 2개의 면역원성 융합 단백질을 포함하는 키메라 서브바이러스 입자인 것을 특징으로 하는 B형 간염 또는 C형 간염의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물:
    a) - 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열, 및
    b) - 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열.
  30. 제26항에 있어서,
    상기 유효성분은 다음의 i) 내지 iii)을 포함하는 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 B형 간염 또는 C형 간염의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물:
    i) 다음의 2개의 융합 단백질:
    * 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 한 융합 단백질:
    - 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열, 또는
    * 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 다른 융합 단백질:
    - 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열, 또는
    ii) 다음의 2개의 하이브리드 핵산 분자:
    * 다음의 핵산 서열로 이루어지는 한 하이브리드 핵산 분자:
    - 서열번호 11로 기재되는 핵산 서열,
    또는 상기 하이브리드 핵산 분자를 포함하는 벡터,
    * 다음의 핵산 서열로 이루어지는 다른 하이브리드 핵산 분자:
    - 서열번호 13으로 기재되는 핵산 서열,
    또는 상기 하이브리드 핵산 분자를 포함하는 벡터,
    iii) 다음의 2개의 키메라 서브바이러스 입자:
    * 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 면역원성의 융합 단백질을 포함하는 한 키메라 서브바이러스 입자:
    - 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열,
    * 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 면역원성의 융합 단백질을 포함하는 다른 키메라 서브바이러스 입자:
    - 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열.
  31. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 면역원성의 키메라 서브바이러스 입자를 발현하는 세포주.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 세포주는 CHO로 명명되는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) 세포주 또는 이스트(yeast)인 것을 특징으로 하는 세포주.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 이스트는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisae)인 것을 특징으로 하는 세포주.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3052779B1 (fr) * 2016-06-17 2018-06-22 Universite De Tours Nouvelles proteines de fusion et leur application pour la preparation de vaccins
CN107652366A (zh) * 2016-07-26 2018-02-02 中国科学院上海巴斯德研究所 一种展示丙型肝炎病毒包膜蛋白e2的纳米颗粒的制备及应用
US11660332B2 (en) 2017-04-27 2023-05-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleoside-modified mRNA-lipid nanoparticle lineage vaccine for hepatitis C virus
FR3110166B1 (fr) * 2020-05-15 2022-04-29 Univ Tours Nouvelles compositions immunogenes et leur application pour la preparation de vaccins contre l’hepatite c et l’hepatite b
US20240016923A1 (en) * 2020-11-12 2024-01-18 University Of Maryland, College Park Modified secreted hepatitis c virus (hcv) e1e2 glycoproteins and methods of use thereof
CN113640519B (zh) * 2021-08-25 2024-05-31 南通伊仕生物技术股份有限公司 一种特异性检测丙肝的试剂盒及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040146529A1 (en) * 1999-11-24 2004-07-29 Chiron Corporation HBV/HCV virus-like particle
WO2008025067A1 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Hepgenics Pty Ltd Recombinant proteins and virus like particles comprising l and s polypeptides of avian hepadnaviridae and methods, nucleic acid constructs, vectors and host cells for producing same

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0892047A3 (de) * 1997-07-09 2000-03-08 Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH Humanes und murines Semaphorin L
JP4647870B2 (ja) * 1999-11-24 2011-03-09 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド Ｈｂｖ／ｈｃｖウイルス様粒子

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040146529A1 (en) * 1999-11-24 2004-07-29 Chiron Corporation HBV/HCV virus-like particle
WO2008025067A1 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Hepgenics Pty Ltd Recombinant proteins and virus like particles comprising l and s polypeptides of avian hepadnaviridae and methods, nucleic acid constructs, vectors and host cells for producing same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Virol. 74(2): 702-709(2000. 1.)*
Mol. Cell Biol. 7(10): 3591-3601(1987. 10.)*

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