BRPI9912175B1

BRPI9912175B1 - peptídios de antígeno cd4-cdr2, composição farmacêutica compreendendo os mesmos bem como uso da mesma

Info

Publication number: BRPI9912175B1
Application number: BRPI9912175-1A
Authority: BR
Inventors: Chang Yi Wang
Original assignee: United Biomedical, Inc.
Priority date: 1998-06-20
Filing date: 1999-06-21
Publication date: 2019-08-27
Also published as: JP4216473B2; ATE447585T1; WO1999067294A1; EP1098910B1; AU4704899A; ZA200006385B; BRPI9912175A; EP1098910A1; CN1303394A; DE69941625D1; CN1207306C; ES2336393T3; BRPI9912175B8; DK1098910T3; JP2002518523A; CA2330235A1; TWI227242B; CA2330235C; HK1036805A1; EP1098910A4

Abstract

patente de invenção:<b>"composição de peptídios para prevenção e tratamento de infecção por hiv e distúrbios imunológicos"<d>. a invenção apresenta peptídios que compreendem uma seqüência homóloga a uma porção do domínio do tipo cdr-2 de cd4, ligada covalentemente a um epítipo de célula auxiliar t, e opcionalmente também a outras seqüências imunoestimuladoras. a invenção apresenta o uso de tais peptídios como imunógenos para resultar na produção em mamíferos de auto-anticorpos policlonais de elevado título, os quais são específicos para o complexo de superfície de cd4. esses auto-anticorpos impedem a ligação de partículas virais do hiv às células cd4+. os peptídios são úteis em composições farmacêuticas, para que se obtenha uma imunoterapia para a infecção de hiv e para a proteção contra a infecção pelo hiv.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao uso de uma composição de peptídios, tal como um imunógeno, com cada peptídio aqui contido, o qual compreende um sítio alvo antigênico que seja reconhecido pelos anticorpos, contra um complexo receptor/co-receptor da célula hospedeira para o HIV. O / τ complexo compreende CD4 associado a um domínio receptor de quimiocina.

O sítio alvo antigênico está sob uma forma cíclica, covalentemente ligada e linearmente, e junto (1) a uma proteína carreadora, através do acoplamento químico, ou de preferência (2) a um epítopo da célula T auxiliar do peptídio e a outras seqüências imunoestimuladoras do peptídio por acoplamento químico, ou de forma mais preferencial, por síntese direta. De forma mais parti15 cular, a presente invenção apresenta o uso de tal composição de peptídios como um imunógeno para obter a produção em mamíferos saudáveis, incluindo os seres humanos, de anticorpos de alta titulação que têm amplas j atividades neutralizantes contra os isolados primários de todas as classes de ' HIV do tipo 1 (HIV-1) e contra os isolados primários de HIV do tipo 2 (HIV-2).

A presente invenção também está direcionada a um método para usar a referida composição de peptídios como um imunógeno para a prevenção e o % '^;l tratamento de infecção viral por imunodeficiência, assim como para o tratamento de imunorrespostas indesejáveis, tais como rejeição de transplante e distúrbios auto-imunológicos, tais como artrite reumatóide, lúpus eritematoso 25 sistêmico e psoríase.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Apesar da pesquisa intensiva para uma vacina, durante 14 anos desde a descoberta e a caracterização do HIV, continuam os obstáculos principais para o desenvolvimento da imunoterapia e da vacina do HIV. Es30 tes obstáculos incluem a variabilidade do HIV-1, uma falta de entendimento

quanto à estrutura do vírus, bem como uma falta de entendimento quanto às imunorrespostas necessárias para a prevenção da infecção por HIV. Veja D.

Burton e J. Moore, Nature Medicine, 1998, 4: 495-48. O presidente do comitê de pesquisas de vacinas da AIDS do governo dos Estados Unidos afirmou, em 01 de fevereiro de 1998, que, uma vacina segura para impedir a AIDS poderia ainda demorar mais do que uma década para ser testada, pois mui5 tos pontos permanecem desconhecidos sobre como o sistema imunológico do corpo humano funciona (http ://cnn .com/H EALTH/802/01 /aids. vaccine. search).

Houve um início de otimismo quanto às vacinas em envelopes / recombinantes eficazes de subunidade de HIV-1 (por exemplo, produtos de vacina gp120 e gp160), uma vez que os soros da vacina de diversos experimentos clínicos foram capazes de neutralizar os isolados laboratoriais de HIV-1 in vitro (Belshe et al., J. Am. Med. Assoe., 1994, 272: 475; Keefer et al., AIDS Res. Hum Retrovíruses, 1994, 10: 1713). Este otimismo foi abalado quando descobriram que os soros da vacina eram amplamente ineficazes para neutralizar os isolados primários dos pacientes com HIV-1 (Hanson, AIDS Res. Hum. Retrovíruses, 1994, 10: 645; Mascola et al., J. Infect Dis., 1996, 173: 340). Estes achados decepcionantes fizeram com que, em junho de 1994, a NIH decidisse adiar os custosos experimentos de eficácia em grande escala de diversas proteínas recombinantes em envelope, baseadas 20 nas vacinas de subunidade de HIV.

Atualmente, a pesquisa sobre a vacina do HIV focaliza os isolados primários que se acredita que sejam os mais assemelhados, de forma mais próxima, às cepas do HIV responsáveis pela infecção humana, se comparadas às cepas laboratoriais em geral utilizadas (Sawyer et al., J Viroi, 25 1994, 68: 1342; Wrin et al., J Virol, 1995, 69:39). Os isolados primários de

HIV-1 são obtidos por meio de cultivo limitado de PBMCs ou do plasma do paciente com PBMCs não infectadas. Os vírus primários podem de imediato ser distinguidos pelo fenótipo, tal como discutido abaixo, a partir dos vírus adaptados da linhagem das células T (TCLA), tais como lllb/LAI, SF2 e MN, 30 os quais foram passados do tempo em linhagens de células T linfóides humanas e se tornaram bem adaptadas para crescerem nestas linhagens da célula T:

T ' (1) ao contrário dos vírus da TCLA, a maior parte dos isolados primários não cresce de imediato em linhagens de células T.

(2) ao contrário dos vírus da TCLA, os quais são todos induzidos por plexo, os isolados primários incluem ambos os isolados induzidos por plexo (SI), os quais induzem a formação de plexo na cultura de PBMC e de isolados que não induzidos por plexo (NSI). Entre os isolados primários SI, a maior parte irá replicar, em especial na linhagem MT2 da célula T sensível ao HIV, mas poucos podem replicar nas linhagens da célula T menos permissivas, tais como CEM ou H9, as quais são em geral utilizadas para a cultura de isolados da TCLA. Os isolados que não induzidos por plexo (NSI) replicam somente nas células T primárias.

(3) Os isolados primários são altamente resistentes na neutralização in vitro por formas solúveis recombinantes da proteína CD4 viral do receptor (rsCD4) que requer de 200 a 2700 vezes mais de rsCD4 do que as cepas da TCLA para uma neutralização comparável (Daar et al., PNAS USA, 1990, 87: 6574-6578).

(4) Os isolados primários são também resistentes aos anticorpos neutralizantes obtidos pelo uso de vacinas gp120 (envelope). Por outro lado, as cepas da TCLA são sensíveis à neutralização por anticorpos com especificidades para o envelope viral (Sawyer et al., J Virol, 1994, 68: 1342; e, Mascola et al., 1996).

Estas características fenotípicas dos isolados primários são debilidade viral, uma característica genotípica, também permanece como um obstáculo ao desenvolvimento de vacinas de HIV de eficácia mundial (Masvido às características estruturais mal compreendidas do HIV, em particular à qualidade inacessível do envelope viral com respeito aos anticorpos do anti-env (D. Burton e J. Moore, Nature Medicine, 1998, 4: 495-498). A varia• Λ cola et al., 1996). Estes fatores, em conjunto, esclarecem a falha inesperada das vacinas de HIV direcionadas viralmente, as quais foram desenvolvidas contra as cepas homotípicas da TCLA crescidas de imediato. Uma abordagem alternativa para o desenvolvimento da vacina de HIV podería ser atra5 vés da intervenção dos receptores de HIV da célula hospedeira, bloqueando, desse modo a infecção, impedindo que o HIV se ligue ou se funda com as células suscetíveis. A abordagem direcionada à célula oferece métodos para superar a hipervariabilidade da diversidade fenotípica e em envelope do HIV.

Uma abordagem direcionada à célula para a proteção da infec-

Ção por HIV foi sugerida por estudos de imunização ativa e passiva, no tipo de símio rhesus SIV, o qual mostrou que os anticorpos da anticélula contribuíram extremamente para a proteção da infecção (Stott, Nature, 1991, 353: 393). Adicionalmente, os anticorpos monoclonais direcionados contra CD4, um receptor da célula T para moléculas da classe II de MHC e o receptor 15 primário para a ligação do HIV, têm sido reconhecidos há muito tempo como bloqueadores da infecção em ensaios de neutralização de HIV-1, de uma maneira que seja dependente do epítopo CD4, e não às cepas do vírus (Sattentau et al. , Science, 1986; 234: 1120). Nesta abordagem quanto à imunoprofilaxia, foi descoberto que os anticorpos monoclonais anti-D4 são 20 eficazes para bloquear a infecção das células por isolados primários (Daar et al., Proc. Natí Acad. Sei. EUA, 1990; 87: 6574; e Hasunuma et al., J Immunol., 1992; 148: 1841).

Outras abordagens direcionadas à célula potencialmente eficazes incluem a escolha de receptores CXCR4, CCR5, CCR2B e CCR3 alvo 25 de químiocina, que foram identificados recentemente como co-receptores para o HIV (Feng et al., Science, 1996; 272: 872; e, Doranz et al., Ceil, 1996;

85: 1149). Estes co-receptores funcionam em conjunto com CD4 para iniciar as interações posteriores às ligações de glicoproteína viral em envelope com a membrana da célula hospedeira e em etapas posteriores à entrada da ré30 plica do retrovírus (Chackerian et al., J Virol, 1997; 71: 3932).

A necessidade de CD4 e um co-receptor para a ligação eficiente e a fusão do HIV sugere que qualquer uma ou ambas destas moléculas po♦ t *· .4 * « *>·

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dem ser alvos bons para que as estratégias direcionadas às células inibam a infecção. Os anticorpos direcionados a um complexo CD4-/co-receptor da célula hospedeira mostraram que afetam ambas as etapas de ligação e pósligação da infecção por HIV (Wang, WO 97/46697). Estes anticorpos neutra5 lizaram a transmissão de vírus à célula ou de célula à célula, tanto de cepas de HIV induzidas por plexo (SI), tal como que não SI (NSI).

Também foi verificado que um antagonista de quimiocina que se liga ao CCR5 é eficaz para a prevenção da infecção, tanto por vírus SI, tal como por vírus de NSI (Simmons et al., Science, 1997; 276: 276). A neutrali10 zação de isolados de NSI é em particular significativa, pois as cepas de NSI são responsáveis pela maior parte da transmissão de HIV e são frequentemente resistentes aos anticorpos anti-HIV, os quais neutralizam os isolados TCLA (Fauci, 1996). Os agentes que são alvos dos receptores celulares do HIV evitam a necessidade de confrontar os fenótipos diversos e a hipervari15 abilidade do envelope viral e, além disso, oferecem a atividade potencial de neutralização contra o HIV-2 e o SIV (Chen et al, J Virol, 1997; 71: 2705; yi Pleskoff et al., J Virol, 1997; 71: 3259; Wo 97/46697).

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Um complexo receptor/co-receptor da célula hospedeira, que compreende CD4 e um co-receptor de quimiocina na superfície das células í 20 T hospedeiras, que facilita a entrada e a ligação viral nas células T hospedei^Üih ras, é reportado para ser um alvo eficaz para neutralizar os anticorpos em um pedido de patente co-pendente (WO 97/46697). Em tal pedido, o presente inventor demonstrou que os anticorpos elaborados estão direcionados especificamente contra este complexo do antígeno da superfície da célula.

Nenhum outro anticorpo anticélula é elaborado em resposta aos antígenos da superfície da célula nos isolados primários de HIV-1 neutralizados das células HPB-ALL. Os anticorpos com as propriedades desejadas, tal como descrito neste pedido, podem bloquear a infecção de macacos por SIV, a infecção por HIV-1 in vivo do sistema imunológico humano reconstituído em 30 camundongos, em infecções in vitro de células humanas por isolados primários de HIV-1 de diversos fenótipos e de genótipos, bem como bloquear a infecção de células humanas por HIV-2. Este complexo do antígeno da su/ί

perfície da célula, que compreende o receptor CD4 associado a um coreceptor de quimiocina (complexo D4/co-receptor), age como um alvo para anticorpos protetores anticélula.

Os anticorpos anticélula do complexo D4/co-receptor exibem um padrão mais eficaz de neutralização contra as cepas relevantes de HIV do que os anticorpos antivírus direcionados contra o envelope viral. Tal como mostrado no pedido de patente co-pendente (WO 97/46697), um anticorpo monoclonal (MAb B4) produzido contra a HPB-ALL é moderadamente reajf gente contra a proteína CD4 solúvel recombinante (rsCD4) e se liga forte10 mente às células de HPB-ALL. Foi verificado que a especificidade para o complexo da superfície da célula de D4/co-receptor é altamente eficaz para neutralizar os isolados primários de H1V-1, mas menos eficaz para neutralizar as cepas da TCLA. Por outro lado, os anticorpos anti-env exibem um padrão reverso para a neutralização preferencial das cepas da TCLA.

Foi verificado que MAb B4 neutralizou os isolados primários do ** HIV em um ensaio in vitro de microplacas, em uma concentração de <10 pg/ml. Por outro lado, os anticorpos policlonais com especificidade elevada de titulação (>5 Logio) para o CD4 solúvel recombinante (rsCD4) não indicaram nenhuma atividade neutralizante para os isolados primários do HIV, | j 20 apesar de suas poderosas atividades de ligação da célula T. Desse modo, os isolados primários parecem ser preferencíalmente sensíveis aos anticorpos com especificidade para o complexo do antígeno de D4/co-receptor da superfície da célula, em comparação aos anticorpos com uma especificidade CD4 pura. A caracterização extensiva da neutralização do HIV por anticor25 pos do complexo anti-D4/co-receptor inclui MAb B4 e seus homólogos MAb M2 e MAb B13 (WO 97/46697).

O mecanismo para a ampla atividade neutralizante dos anticorpos ao complexo D4/co-receptor não está evidente por causa dos diversos papéis desse complexo da superfície da célula ao mediar a infecção por HIV, conforme mostrado pela capacidade daqueles anticorpos de afetar as etapas de ligação e pós-ligação da infecção por HIV (Wang, WO 97/46697). O complexo da superfície da célula de D4/co-receptor pode desempenhar papéis duplos ao mediar a infecção por HIV e a patogênese: (1) como um receptor da superfície da célula T para a ligação do HIV, a fusão da célula e a entrada por HIV; ou (2) como um fator supressivo do HIV.

Entretanto, mesmo que estes agentes sejam eficazes para a inibição da infecção por HIV, os antagonistas ou os anticorpos direcionados à célula acima não podem ser usados como vacinas preventivas. Os antagonistas ou os anticorpos direcionados à célula discutidos previamente (WO 97/46697) não são imunógenos e não podem ser usados como vacinas preventivas. Eles são agentes para imunização passiva. Sua eficácia requer que estes agentes sejam administrados frequentemente para manter as concentrações do soro suficientes para a consolidação total do receptor. Uma vacina que induz uma resposta ativa do anticorpo contra si mesmo, contra o complexo D4/co-receptor por imunização ativa, seria preferível para a imunidade protetora. Como uma vacina, se pudesse ser desenvolvida, fornecería a proteção eficaz e prolongada da infecção, no entanto, iria requerer a administração infreqüente e conveniente de quantidades pequenas do imunógeno.

Para a eficácia, os componentes imunogênicos de tal vacina devem compreender ou imitar um epítopo da célula B, relevantes sítios no complexo receptor/co-receptor da célula hospedeira, com fidelidade suficiente para acarretar os anticorpos inibitórios cruzados, enquanto retêm especificidade ao sítio suficiente para evitar a imunossupressão adversa. Tais sítios para imitação por intermédio de antígenos sintéticos não são de imediato identificáveis no presente, ainda que os anticorpos anticélula que neutralizam o HIV, incluindo os anticorpos anti-D4 com atividade neutralizante, estejam disponíveis. O anticorpo monoclonal anti-D4 relatado para ser neutralizante (Burkly et al., J Immunol, 1992; 149: 1779) e o anticorpo monoclonal anti-D4/co-receptor amplamente neutralizante relatado por Wang (WO 97/46697) reconhecem os sítios descontínuos adaptáveis de CD4, os quais não podem ser de imediato duplicados. Sem o conhecimento exato dos sítios vulneráveis, a seleção a partir dos imunógenos recombinantes longos, tal como o alvo antigênico útil da célula hospedeira e a reprodução dos mesmos são muito difíceis. A maior parte dos anticorpos elaborada por imunização com especificidades úteis de CD4 com falta (Davis et al., Nature, 1992; 358: 76). Por exemplo, o anti-soro hiperimune de alta titulação a rsCD4 foi desprovido da atividade neutralizante para os isolados primários de HIV (WO 97/46697). Além disso, espera-se que os anticorpos com ampla reatividade para regiões abrangentes de um antígeno da célula T sejam excessivamente imunossupressivos (Reimann et al., AIDS Res. Hum Retrovíruses, 1997; 13: 933).

Além disso, embora os extensivos estudos de mapeamento de

CD4 tenham produzido um mapa da função da estrutura para a molécula (Sattentau et al., Science, 1986, 234: 1120; Peterson e Seed, Cell, 1988, 54:

65; Jameson et al., Science, 1988, 240: 1335; Sattentau et al., J Exp. Med., 1989, 170: 1319; Hasunuma et al., J Immunol, 1992, 148: 1841; Burkly et al.,

J Immunol, 1992, 149: 1779; Davis et al., Nature, 1992, 358: 76), este mape15 amento não fornece modelos estruturais de precisão suficiente para prever * os sítios efetores vulneráveis que podem ser duplicados como peptídios sintéticos. Os modelos disponíveis para CD4 não descrevem imunógenos úteis à base de D4.

Além de apropriarem a especificidade ao sítio, os imunógenos receptores/co-receptores de uma vacina eficaz do HIV devem ser altamente imunoestimuladores para acarretar respostas do anticorpo de nível suficiente para a proteção. Estes imunógenos também devem ser projetados para superar a forte tolerância exibida em direção às próprias moléculas. Desse modo, também continua uma necessidade de imunógenos de imunopotência suficiente.

Um objetivo da presente invenção consiste na apresentação de composições de peptídios que tenham especificidade ao sítio e desejadas, tal como imunógenos para a prevenção da infecção por HIV.

A capacidade imunogênica melhorada e a especificidade apro30 priada para os imunógenos sintéticos úteis de peptídios da presente invenção foram realizadas através da incorporação de uma coleção de métodos para a identificação e o projeto de imunógenos sintéticos de peptídios. Estes

1/ métodos incluem: (1) um procedimento eficaz para a identificação de um epítopo alvo eficaz de elevada afinidade; (2) os meios para a estabilização das características adaptáveis desse sítio alvo em um peptídio sintético pela introdução de restrições cíclicas, de forma que maximize a reatividade cru5 zada à molécula nativa; (3) os meios para aumentar a capacidade imunogênica do epítopo alvo da célula B pela combinação deste com um sítio que compreende um epítopo amplamente reagente da célula T auxiliar (Th) promíscua; e (4) os meios para ampliar o repertório dos epítopos da célula T pela aplicação de química combinatória de peptídios e desse modo também 10 acomodar a capacidade variável de imunorresposta de uma população exogâmica.

Os peptídios sintéticos foram usados para o mapeamento dos epítopos para identificar as determinantes ou os epítopos imunodominantes na superfície das proteínas para o desenvolvimento de novas vacinas e de 15 diagnóstico. O mapeamento dos epítopos emprega uma série de peptídios sobrepostos que correspondem às regiões da proteína de interesse para identificar os sítios que participam na interação determinante imunogênica do anticorpo. Em geral, o mapeamento dos epítopos emprega os peptídios de extensão relativamente curta para detectar precisamente as determinan20 tes lineares. Um método rápido e conhecido de mapeamento dos epítopos como o PEPSCAN é baseado na síntese simultânea de centenas de peptídios sobrepostos, de extensão de 8 a 14 aminoácidos, acoplados aos suportes sólidos. Os peptídios acoplados são testados pela sua capacidade de ligar os anticorpos. A abordagem do PEPSCAN é eficaz em localizar as de25 terminantes contínuas lineares, mas não para a identificação dos epítopos necessários para imitar os sítios efetores descontínuos, tal como o sítio receptor/co-receptor de ligação do HIV (Meloen et al., Ann. Biol. Clin., 1991; 49: 231-242). Um método alternativo depende de uma série de peptídios aninhados e sobrepostos de extensões múltiplas que variam entre 15 e 60 30 resíduos. Estes peptídios mais longos podem sintetizados de forma confiante, mas laboriosamente por uma série de sínteses independentes de peptídios de fase sólida, em vez das sínteses rápidas e simultâneas do

PEPSCAN. A série resultante de peptídios aninhados e sobrepostos pode então ser usada para a análise da ligação do anticorpo nos sistemas, tais como imunizações experimentais e infecções naturais, para identificar os peptídios longos que melhor apresentam determinantes imunodominantes, 5 incluindo os epítopos descontínuos simples. Este método é exemplificado pelos estudos de Wang para o mapeamento de sítios imunodominantes de HTLV l/ll (Patente U. S. N² 5.476.765) e HCV (Patente U. S. N² 5.106.726). Este método foi usado para a seleção de uma posição precisa na seqüência gp120 para a melhor apresentação de um epítopo neutralizante do HIV 10 (Wang et al., Science, 1991; 254: 285-288).

Os imunógenos de peptídio são em geral mais flexíveis do que as proteínas e tendem a não reter nenhuma estrutura preferida. Consequentemente, são úteis para estabilizar um imunógeno de peptídio pela introdução de restrições cíclicas. Um imunógeno de peptídio corretamente ci15 clizado pode imitar e preservar a conformação de um epítopo alvo e, desse modo, acarretar os anticorpos com reatividades cruzadas para esse sítio, na molécula autêntica. Por exemplo, uma estrutura em alça presente em um epítopo autêntico pode ser duplicada de forma mais exata em um peptídio sintético pela adição de resíduos de cisteína vantajosamente colocados, se20 guidos pela ciclização, através dos grupos sulfidrila (Moore, Capítulo 2, in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, WH Freeman and Company: New York, 1992, pp. 63-67).

Um outro fator importante que afeta a capacidade imunogênica de um imunógeno de peptídio derivado de um complexo receptor/co-receptor θ a apresentação deste peptídio ao sistema imunológico pelos epítopos da célula T auxiliar que reagem com os receptores da célula T auxiliar de um hospedeiro e as moléculas MHC classe II (Babbitt et al., Nature, 1985; 317; 359-361). Os epítopos da célula T auxiliar (Th) são fornecidos frequentemente por proteínas carreadoras com desvantagens concomitantes, devido às dificuldades para a produção de conjugados carreadores de peptídios bem definidos, pela má direção da maior parte das respostas do anticorpo ao veículo, bem como pela supressão epitópica induzida pelo carreador

-LO (Cease, Intern Rev Immunol, 1990; 7: 85-107; Schutze et al., J Immunol, 1985; 135: 2319-2322). Alternativamente, a ajuda da célula T pode ser estimulada pelos peptídios sintéticos que compreendem os sítios da Th. Desse modo, os epítopos da Th classe II, denominados Th promíscua, acarretam a 5 ajuda eficiente da célula T e podem ser combinados com os epítopos sintéticos da célula B que, por si só, eles são pouco imunogênicos para gerarem imunógenos potentes de peptídio (Patente U. S. N- 5.759.551). Os peptídios quiméricos bem elaborados do epítopo da célula Th/B promíscua são capa| , zes de produzir as respostas da Th, bem como as respostas resultantes do anticorpo que têm como alvo o sítio da célula B, na maior parte dos membros de uma população geneticamente diversa que expressa haplótipos diversos de MHC. A Th promíscua pode ser fornecida pelas seqüências específicas derivadas de antígenos estranhos potentes, tais como, por exemplo, a proteína F do vírus de sarampo, o antígeno da superfície do vírus de he15 patite B e da proteína principal da membrana externa (MOMP) de Chlamydia trachomatis. Foi demonstrado que muitas Ths promíscuas conhecidas são eficazes para aumentar a potência de um peptídio pouco imunogênico que corresponde ao hormônio decapeptítidio (Patente U. S. N- 5.759.551).

Os epítopos da Th promíscua variam em tamanho, de cerca de ξ 20 15 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos em extensão (Patente U. S. N^e

5.759.551), e, freqüentemente, compartilham de características estruturais comuns e podem conter seqüências específicas de ponte de referência. Por exemplo, uma característica comum é as hélices antipáticas, que são estruturas alfa-helicoidais com resíduos hidrofóbicos de aminoácido que dominam 25 uma face da hélice e com resíduos carregados e polares que dominan as faces circunvizinhas (Cease et al., Proc Natl Acad Sei, EUA, 1987; 84: 42494253). Os epítopos de Th contêm, freqüentemente, padrões primários adicionais de aminoácido, tais como um Gly ou um resíduo carregado seguido por dois a três resíduos hidrofóbicos, seguidos um após o outro por um resí30 duo carregado ou polar. Este padrão define o que são chamadas seqüências Rothbard. Além disso, os epítopos da Th freqüentemente obedecem a ordem 1, 4, 5, 8, onde um resíduo positivamente carregado é seguido por resí12 duos hidrofóbicos na quarta, quinta e oitava posições, após o resíduo carregado, de acordo com uma hélice antipática que tem as posições 1, 4, 5 e 8, situadas na mesma face. Uma vez que todas estas estruturas são compostas de aminoácidos hidrofóbicos, carregados e polares comuns, cada estru5 tura pode existir simultaneamente dentro de um único epítopo da Th (Partidos et al., J Gen Virol, 1991; 72: 1293-99; Alexander et al., Immunity, 1994; 1: 751-761). A maior parte, se não todos os epítopos da célula T promíscua contêm ao menos uma das periodicidades descritas acima. Estas caracterís/ ticas podem ser incorporadas nas elaborações de sítios artificiais idealiza10 dos de Th.

Os epítopos da Th promíscua, derivados de elementos patogênicos estranhos incluem, como exemplos, mas não ficam limitados a, epítopos de célula T auxiliar do antígeno do núcleo e da superfície de hepatite B (HBs Th e HBc Th), epítopos de célula T auxiliar de toxina de coqueluche 15 (PT Th), epítopos de célula T auxiliar de toxina de tétano (TT Th), epítopos ** de célula T auxiliar de proteína F de vírus de sarampo (MVf Th), epítopos de célula T auxiliar de proteína da membrana externa principal de Chlamydia trachomatis (CT Th), epítopos de célula T auxiliar de toxina de difteria (DT Th), epítopos de célula T auxiliar de circunsporozoíto de Plasmodium falcipa| 20 rum (PF Th), epítopos de célula T auxiliar de isomerase de fosfato de triose de Schistosoma mansoni (SM Th) e epítopos de célula T auxiliar de TraT de Escherichia coli (TraT Th). A Th derivada do elemento patogênico foi listada como SEQ. ID. N²s 2-9 e 42-52, na Patente U. S. 5.759.551; como sítio P11 auxiliar de clamídia, in Stagg et al., Immunology, 1993; 79; 1-9; e como 25 peptídio HBc 50-69, in Ferrari etal., J Clin Invest, 1991; 88: 214-222.

Os sítios úteis da Th também podem incluir a Th combinatória que incorpora sítios degenerados selecionados na elaboração dos sítios idealizados da Th. Em Wang et al. (WO 95/11998), uma classe particular de um epítopo combinatório foi designada como uma Biblioteca de Antígenos Sin30 téticos Estruturados ou SSAL. Uma Th construída como um epítopo da SSAL é composto por substituições posicionais organizadas ao redor de uma armação estrutural de resíduos constantes. A seqüência da SSAL é determinada pelo alinhamento da Sequência primária de aminoácidos de uma Th promíscua, que retém resíduos relativamente constantes em posições responsáveis pela estrutura única de peptídios da Th e fornece degeneração nas posições associadas com o reconhecimento dos diversos elementos de restrição de MHC. As listas de aminoácidos preferidos e posições variáveis e invariáveis estão disponíveis para os motivos ligados ao MHC (Meister et al., Vaccine, 1995; 13: 581-591; Alexander et al., Immunity, 1994, 1:751-761).

Todos os membros da SSAL são simultaneamente produzidos em uma única síntese de peptídios em fase sólida, em série, com o epítopo alvo da célula B e outras Sequências. A Sequência da biblioteca de Th mantém os motivos estruturais de ligação de uma Th promíscua e acomoda a reatividade para um alcance mais amplo de haplótipos. Por exemplo, o epítopo degenerado da Th, descrito como SSAL1TH1 foi modelado depois de um epítopo promíscuo ser tirado da proteína F do vírus de sarampo (Partidos et al., 1991). O SSAL1TH1 foi projetado para ser usado em série, com um peptídio alvo de LHRH. Como o epítopo de sarampo, o SSAL1TH1 segue a Sequência de Rothbard, bem como a ordem 1,4, 5 e 8:

10 15

Asp-Leu-Ser-Asp-Leu-Lys-Gly-Leu-L.eu-Leu-His-Lys-Leu-Asp-G:Ly-Leu

Glu Ile	Glu Ile Arg	Ile Ile Ile	Arg Ile Glu	Ile
Vai	Vai	Vai Vai Vai	Vai	Vai
Phe	Phe	Phe Phe Phe	Phe	Phe

Os resíduos carregados Glu ou Asp são adicionados na posição 1 para aumentar a carga que circunda a face hidrofóbica da Th. A face hidrofóbica da hélice anfipática é então mantida por resíduos hidrofóbicos em 2, 5, 8, 9, 10, 13 e 16, com variabilidade em 2, 5, 8, 9, 10, 13 e 16, para fornecer uma aparência externa com a capacidade de ligação a um grande alcance de elementos de restrição de MHC. O efeito puro da característica da SSAL é o aumento do alcance de capacidade de imunorresposta a uma Th artificial (WO 95/11998).

De acordo com a presente invenção, os imunógenos de peptídio que são eficazes para o HIV foram projetados com o mapeamento preciso do epítopo, a restrição cíclica, a incorporação de epítopos da Th promíscua ou da Th promíscua idealizada e de epítopos idealizados da Th da SSAL. Tais peptídios são preferidos porque são seguros e eficazes. Acredita-se que os imunógenos de peptídio da presente invenção forneçam imunopotência por causa da apresentação eficaz de um sítio receptor/co-receptor de ligação do HIV que foi aperfeiçoado por intermédio da precisão do posicionamento e da ciclização, bem como o uso de epítopos receptivos da Th amplamente reagentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As composições de peptídios da presente invenção compreendem um ou mais imunógenos do peptídio que foram projetados, conforme a discussão acima. As composições de peptídios são a base para uma vacina para prevenção e tratamento eficazes da infecção por HIV e distúrbios imunológicos. Os peptídios componentes da presente invenção são preferidos por sua apresentação de sítios efetores receptores/co-receptores neutralizantes do domínio de CD4 semelhante ao CDR2. Estes peptídios acarretam respostas eficazes do anticorpo por (1) ter especificidade aperfeiçoada ao sítio, obtida através de mapeamento preciso do epítopo do domínio semelhante ao CDR2 e pela ciclização seletiva, considerando a conformação nativa do CDR2 e (2) por sua capacidade de resposta à Th, amplamente reagente.

De acordo com a presente invenção, um ou mais peptídios foram fornecidos, sendo que cada um dos peptídios também compreende duas seqüências de peptídio e que correspondem aos sítios efetores situados no domínio CDR2 de CD4, ou análogos imunologicamente funcionais dos mesmos.

Além disso, os sítios alvo dos peptídios da presente invenção ficam mais imunogênicos através da ligação covalente com uma proteína carreadora, por intermédio de acoplamento químico, ou de forma mais preferencial, através da ligação covalente com os elementos imunoestimuladores

sintéticos (tais como epítopos da Th promíscua), através de acoplamento químico ou de forma mais preferencial através da síntese direta do peptídio. Os exemplos específicos de proteína carreadora e de elementos imunoestimuladores são fornecidos, por exemplo, por veículo de hemocianina de lapa 5 de ponta (KLH), enterotoxina A modificada de coqueluche (PEA), epítopos da Th (por exemplo, SEQ. ID. N² 6) e peptídios imunoestimuladores em geral (por exemplo, o peptídio invasino (Inv) de Yersinia (SEQ. ID. N⁵ 7)).

Os peptídios sintéticos da presente invenção podem ser repre/ sentados pelas fórmulas:

ΐ (A)_n-(Th)_m-(B)₀-( peptídio de antígeno de CD4-CDR2)-X ou (A)_n-( peptídio de antígeno de CD4-CDR2)-(B)_o-(Th)_m-X ou (peptídio de antígeno de CD4-CDR2)-(B)₀-(Th)_m-(A)_n-X ou * (Th)_m-(B)_o-(peptídio de antígeno de CD4-CDR2)-(A)_n-X onde :

cada A é independentemente um aminoácido, ou um peptídio imunoestimulador em geral;

í 20 cada B é independentemente um aminoácido ou uma outra ligação química;

X é um aminoácido a- COOH ou a- COHN₂;

Th é um epítopo da célula T auxiliar ou um homólogo de aumento imunológico ou um segmento dos mesmos;

peptídio de antígeno CD4-CDR2 é um antígeno de peptídio que acarreta os anticorpos que reagem com o complexo CD4 de superfície;

n varia de 1 a cerca de 10;

m varia de 1 a cerca de 4; e o varia de 0 a cerca de 10.

As composições de peptídios da presente invenção compreendem imunógenos de peptídio de cerca de 30 a cerca de 115 resíduos de aminoácidos, de preferência de cerca de 40 a cerca de 90 resíduos de ami16

t noácidos e de forma mais preferencial de cerca de 50 a cerca de 80 resíduos de aminoácidos.

As composições da presente invenção opcionalmente compreendem também veículos adjuvantes e/ou de distribuição, bem como outros 5 ingredientes rotineiramente incorporados nas formulações de vacina. A presente invenção fornece instruções para a dosagem, de forma que os anticorpos imunoterapêuticos direcionados contra os sítios efetores CD4-CDR2 alvo sejam gerados.

f > A presente invenção fornece, pela primeira vez, peptídios sintéti10 cos capazes de obter anticorpos em mamíferos que estão protegidos contra a infecção por isolados primários de HIV, a partir de classes múltiplas.

A resposta do anticorpo às composições de peptídios da presente invenção fornece a proteção ou a terapia contra a infecção por HIV de um hospedeiro por meio de: (1) bloqueio da ligação do HIV às células de 15 expressão de CD4, (2) bloqueio da formação de plexo induzida por HIV entre * as células de expressão de D4, (3) neutralização eficaz da infecção in vitro das células CD4 positivas por isolados primários de todas as classes do HIV do tipo 1 e do tipo 2, e (4) prevenção de infecção por isolados primários do HIV; quando o hospedeiro for administrado por uma formulação da vacina í 20 que compreende uma composição de peptídios da presente invenção.

As composições de peptídios são úteis para a prevenção e para o tratamento de infecção por HIV, através de isolados primários de todas as classes de HIV-1 e por isolados primários de HIV-2, assim como também para o tratamento das imunorrespostas indesejáveis mediadas pela célula 25 CD4, tal como a rejeição de transplante, e os distúrbios auto-imunológicos, tais como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico e psoríase.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 descreve a seqüência de aminoácidos de CD4 humana (SEQ. ID. N² 1), uma parte do complexo CD4/co-receptor do antígeno da 30 célula hospedeira, tal como deduzido da seqüência do ácido nucléico. Os aminoácidos são representados por códigos padrão, com uma única letra, tal como segue:

CC

Ala: A Cys: C His: H Met: M Thr: T Arg: R Gln:Q lie: I Phe: F Trp: W Asn: N Glu: E Leu: L Pro:P Tyr: Y Asp: D Gly: G Lys: K Ser: S Vai: V O sistema de numeração é aquele de Littman et al. (Cell, 1988,

55: 541). A região sublinhada (AA27-AA66) é a região da qual os peptídios de antígeno CD4-CDR2 da presente invenção são derivados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

Conforme a expressão aqui utilizada, os “isolados primários do vírus de imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) são obtidos por cultivo 10 limitado, de até cinco passagens, nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) dos doadores. Os isolados primários podem ser distintos das cepas de laboratório adaptadas da linhagem de célula T (TCLA), tais como lllb/LAl, SF2 e MN, as quais passaram mais tempo nas linhagens humanas da célula linfóide T. Primeiramente, os isolados mais primários não 15 crescem de imediato nas linhagens da célula T e eles indicam tanto os fenótipos de indução por plexo (SI), tal como os fenótipos de indução por nãoplexo (NSI). Por exemplo, muitos isolados primários por Si que induzem a formação de plexo na cultura de PBMC irão replicar nas linhagens da célula MT2 especialmente sensíveis ao HIV, mas poucos irão replicar em linhagens 20 menos permissivas da célula T, tais como CEM ou H9. Os isolados primários de NSI replicam somente em células T primárias. Em segundo lugar, eles diferem das cepas da TCLA em sua sensibilidade para a neutralização in vitro por formas solúveis recombinantes da proteína CD4 receptora vtral (rsCD4) (Daar et al., PNAS USA, 1990, 87: 6574-6578). Em terceiro lugar, as 25 cepas adaptadas de laboratório são sensíveis à neutralização por anticorpos com especificidades para o envelope viral, enquanto que os isolados primários são resistentes (Sawyer et al., J Virol, 1994, 68: 1342; Mascola et al., J infect Dis, 1996, 173: 340).

Conforme aqui utilizado, o termo CD4 significa qualquer proteí30 na CD4 codificada por um gene CD4 natural. CD4 foi descrita inicialmente como um marcador da superfície da célula para linfócitos auxiliares T. Subsequentemente, foi descoberto que a CD4 é expressa de forma esparsa em monócitos, células de Langerhans, células microgliais e em subconjuntos de células B. Foi descoberto que a molécula CD4 também participa diretamente na ativação de células T auxiliares específicas ao antígeno por meio de sua função, tal como um receptor para a molécula MHC classe II. Em 1984, foi descoberto que a CD4 humana é o receptor para o HIV (Dalgleish et al., Nature, 1984, 312: 763). A ligação da glícoproteína em envelope do HIV, gp120 à CD4 representa a etapa inicial na entrada viral na célula alvo. A seqüência de aminoácidos para CD4 humana está aqui incorporada por Maddon et al. (Cell, 1985; 42: 93; e, Littman et al., Cell, 1988; 55: 541) e repre10 sentada, tal como a Figura 1 e SEQ. ID. N.:1.

Conforme aqui utilizada, a expressão ’’CD4 solúvel recombinante ou ^¢04¹¹ é um polipeptídio expresso por microorganismos ou células recombinantes que consistem em AA1-AA375 de CD4 humana (Figura 1, SEQ. ID. N.:1.).

Conforme aqui utilizada, a expressão complexo de CD4 de superfície ou complexo de superfície que compreende CD4 ou complexo de receptor/co-receptor da superfície que compreende CD4 refere-se à proteína CD4 intata nativa, tal como a mesma aparece em seu contexto natural, na superfície de células de mamíferos, juntamente com e/ou complexadas a 20 todas as proteínas associadas da membrana.

Conforme aqui utilizado, o termo imunógeno refere-se a uma composição de peptídios que, quando administrada a um hospedeiro, é capaz de induzir os anticorpos contra os sítios efetores alvo presentes no domínio CDR2 da CD4 (SEQ. ID. N⁹s 2 e 3), conduzindo aos anticorpos de alta 25 titulação que têm amplas atividades neutralizantes contra os isolados primários de todas as classes do HIV do tipo 1 (HIV-1) e do tipo 2 (HIV-2). Os sítios alvo CDR2-CD4 estão sublinhados na Figura 1 e listados como SEQ. ID. N^âs 2 e 3.

Um peptídio de antígeno CD4-CDR2, de acordo com a pre30 sente invenção, possui entre cerca de 25 e cerca de 50, de preferência entre cerca de 30 e cerca de 46 aminoácidos de extensão, e contém dois resíduos de cisteína separados por uma seqüência de intervenção de 28 a 40 resídu«·· *#·

ί ’

Μ os de aminoácidos. A seqüência de intervenção pode ser qualquer porção contígua da seqüência representada pelos resíduos 27 a 66 da SEQ. ID. N^e1, ou pode ser um homólogo imunologicamente funcional dos resíduos 27 a 66 da SEQ. ID. N.:1.

Um conjugado de peptídios, tal como aqui utilizado, refere-se a uma molécula que compreende um peptídio de antígeno CD4-CDR2 covalentemente unido a um peptídio de epítopo da Th auxiliar, por qualquer meio que não seja pela síntese direta do peptídio da molécula. Os exemplos de acoplamento covalente de um peptídio de antígeno CD4-CDR2 com um peptídio de epítopo da Th para formar um conjugado de peptídios são: acoplamento de Tiol-haloacetamida, acoplamento de Tiol-maleimida, formação da ligação de bissulfeto da corrente interna de Tiol-tiol e algo de gênero.

Um imunógeno peptídio, tal como aqui utilizado, refere-se a um peptídio ou ao conjugado de peptídios que compreende um peptídio de antígeno CD4-CDR2 ligado covalentemente a um peptídio de epítopo da Th, que, opcionalmente, também compreende um peptídio imunoestimulador em geral, um ligante e um espaçador, tal como aqui descrito mais adiante; e tem a capacidade de acarretar os anticorpos para o peptídio de antígeno CD4CDR2.

O termo homólogo, tal como aqui utilizado, refere-se a um peptídio que tem, essencialmente, a mesma seqüência de aminoácidos, com substituições conservadoras de até cerca de 10% dos aminoácidos. As substituições conservadoras são aquelas nas quais um aminoácido é substituído por outro, de preferência da mesma classe (por exemplo, hidrofóbicos, polar, carregado, etc.), sem significativamente alterar as propriedades do peptídio. Os homólogos também podem ter inserções ou deleções dos aminoácidos que não alteram significativamente as propriedades imunológicas do peptídio. Os homólogos podem ser obtidos artificialmente, ou podem ser encontrados como variantes das seqüências de peptídios que ocorrem naturalmente, as quais estão aqui apresentadas.

Os homólogos imunologicamente funcionais são os homólogos que induzem, essencialmente, a mesma reação a partir do sistema imunoló20 gico, por exemplo, a capacidade de resposta da célula T, a capacidade de resposta da célula B ou a indução dos anticorpos contra um determinado antígeno.

A presente invenção está direcionada para o uso de novas com5 posições de peptídios, tal como imunógenos. Os imunógenos são úteis para a geração, por imunização ativa, de anticorpos de alta titulação, direcionados contra os sítios efetores (SEQ. ID. N^es 2 e 3) no domínio CDR2 de CD4 em mamíferos, inclusive os seres humanos. Os imunógenos da presente invenção são úteis para a prevenção e o tratamento de infecção viral por imuno10 deficiência, assim como para o tratamento de imunorrespostas indesejáveis mediadas pela célula CD4+, tais como rejeição de transplante e distúrbios auto-imunológicos, tais como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico e psoríase.

Tais intervenções empregadas na prevenção e no tratamento de 15 infecção por HIV, bem como de distúrbios imunológicos, com o uso de anticorpos específicos reagentes de D4, isto é, um tipo de imunoterapia, podem ser obtidas passivamente, através do tratamento profilático com os anticorpos direcionados ao sítio'¹ específicos a um sítio no domínio de CD4 semelhante ao CDR2. De forma mais preferencial, tal como aqui descrita, a tera20 pia pode ser efetuada por meio de imunização ativa, pela inoculação do hospedeiro com uma composição que compreende um ou mais imunógenos de peptídio da presente invenção. Estes imunógenos obtêm a produção pelo hospedeiro de seus próprios anticorpos reagentes CD4-CDR2 direcionados ao sítio, os quais têm amplas atividades de neutralização contra os isolados 25 primários de todos as classes do HIV tipo 1 (HIV-1) e do tipo 2 (HIV-2). Acredita-se que a imunização ativa irá fornecer uma forma mais durável e mais eficaz de proteção do que a imunização passiva.

Os sítios alvo no domínio de CD4 humana semelhante a CDR2 (SEQ. ID. N⁹ 2 e 3) são restringidos de forma adaptável pela ciclização, atra30 vés da adição de resíduos de cisteína aos terminais N e C (SEQ. ID. N⁹ 4 e

5). Tais sítios alvo também podem incluir os homólogos imunológicos da

SEQ. ID. N^e4 e 5, os quais compreendem de 1 a 5 aminoácidos adicionais

provenientes de um ou outro terminal das SEQ. ID. N^Q 2 e 3, contanto que a estrutura única de alça de bissulfeto seja preservada (por exemplo, SEQ. ID. N⁹ 10e 11).

Os sítios alvo são também modificados nos peptídios imunogê5 nicos do antígeno CD4-CDR2 pelo acoplamento químico a uma proteína carreadora, por exemplo, hemocianina de lapa de ponta (KLH) e enterotoxina A modificada de coqueluche (PEA). Umas deficiências de tais vacinas à base de “proteínas carreadoras do peptídio do antígeno CD4-CDR2 são (1) as | , fracas capacidades imunogênicas dos sítios antigênicos alvo, um problema inerente associado a quase todos os auto-antígenos; (2) a grande parte dos anticorpos não funcionais direcionados contra as proteínas carreadoras e (3) o potencial para a supressão epitópica induzida pelo veículo.

Conseqüentemente, é preferível transmitir os peptídios imunogênicos pela adição em série da Th promíscua quimicamente definida e/ou 15 outros peptídios imunoestiladores, através do acoplamento químico ou de • preferência através de síntese direta do peptídio. Os imunógenos preferidos da presente invenção minimizam a geração de anticorpos irrelevantes para obter uma imunorresposta mais focalizada nas seqüências alvo. Os anticorpos desejados têm reatividade ao complexo de superfície CD4, sem pro20 duzir os efeitos colaterais indesejáveis que podem complicar o processo da v,.

imunoterapia, para a prevenção e o tratamento da infecção por HIV e de distúrbios imunológicos. Além disso, os anticorpos específicos ao local alvo aos sítios desejados podem ser gerados mais amplamente em uma população hospedeira geneticamente diversa pelo uso da Th promíscua. Estas 25 respostas do anticorpo conduzem aos anticorpos de alta titulação que têm amplas atividades de neutralização contra os isolados primários de todos as classes do HIV tipo 1 e do tipo 2.

A presente invenção também está direcionada a um método de usar as ditas composições de peptídios, tal como imunógenos, para a pre30 venção e o tratamento de infecção viral por imunodeficiência, assim como para o tratamento de imunorrespostas indesejáveis mediadas pela célula

CD4, tais como rejeição de transplante e distúrbios auto-imunológicos, tais como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico e psoríase.

Os anticorpos que são específicos para o complexo receptor/coreceptor de superfície da célula hospedeira que compreende CD4, tal como os distinguidos a partir dos anticorpos específicos para rsCD4, provavel5 mente interagem com o sistema imunológico, sob diversas maneiras:

1. Eles podem bloquear a interação de CD4 classe II entre células T que expressam CD4 e outras células T, células B ou monócitos ativados;

/ 2. Eles podem entregar sinais às células T, inibindo, desse modo, as funções imunorreguladoras normais mediadas pela célula T CD4+;

3. Eles podem induzir a morte celular de células que expressam CD4 por apoptose, quando provocadas por um acoplamento simultâneo das moléculas receptoras da célula T; e

4. Eles bloqueiam as interações entre CD4 e HIV, as quais ini15 bem a imunopatologia mediada por HIV.

• Os anticorpos do complexo de superfície que compreende CD4 são bons candidatos para impedir e tratar a infecção por HIV e as doenças associadas ao HIV, incluindo a AIDS. Em um nível mais geral, os anticorpos do complexo CD4 podem ser úteis para impedir ou curar as imunorrespostas i 20 indesejáveis mediadas por células T que expressam CD4, tais como a rejeição de transplante e doenças auto-imunológicas, tais como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico ou psoríase.

As propriedades dos anticorpos gerados pelas composições de peptídios da presente invenção são sumariadas aqui, baseadas nos resulta25 dos obtidos nos exemplos de 1 a 5:

1. Ligação à rsCD4 em um ensaio ELISA;

2. Ligação às células que expressam CD4 em um ensaio imunofluorescente; e

3. Neutralização de isolados primários do HIV resistentes à neu30 tralização ensaio in vitro de microplacas.

Os anticorpos com estas características são especialmente úteis na prevenção e no tratamento de doenças em seres humanos, que são cau23 sadas por agentes infecciosos, cujos alvos primários são as células positivas de CD4. Por conseguinte, a presente invenção fornece composições de peptídios, tal como imunógenos, as quais são úteis para prevenir e tratar doenças em seres humanos, que são causadas por agentes infecciosos, 5 cujos alvos primários são as células positivas de CD4, em particular as doenças relacionadas ao HIV, incluindo todos os estágios da AIDS. A presente invenção também apresenta métodos para usar estas composições de anticorpos.

/ As composições de peptídios da presente invenção compreen10 dem os imunógenos de peptídio que incorporam uma ou outra das duas seqüências de peptídios que correspondem aos sítios efetores alvo situados no domínio semelhante ao CDR2 de CD4 (SEQ. ID. N⁹s 2 e 3), ou homólogos imunologicamente funcionais dos mesmos. Os imunógenos são caracterizados por sua acarretação de neutralizar os anticorpos contra os sítios efetores 15 CD4/co-receptores provenientes do domínio CDR2 de CD4. Os imunógenos acarretam respostas protetoras do anticorpo em virtude de sua especificidade aperfeiçoada do sítio, obtida através do (1) mapeamento preciso dos epítopos, (2) da ciclização para compelir suas conformações em consideração à sua conformação nativa; e (3) de sua resposta da Th amplamente reaf 20 gente.

V

Especificamente, os sítios alvo são provenientes do domínio semelhante ao CDR2, da seqüência nativa humana CD4. A seqüência de aminoácidos para CD4 humana está aqui incorporada por Maddon et al. (Cefl, 1985; 42: 93; e, Littman et al., Cell, 1988; 55: 541) e apresentada na 25 Figura 1 e ID. SEQ. N^e 1. Os sítios alvo CD4-CDR2 são mostrados sublinhados na Figura 1 e listados como SEQ. ID. N²s 2 e 3. As composições de peptídios da presente invenção são produzidas, de preferência, tal como peptídios sintéticos que compreendem os sítios alvo (SEQ. ID. Ns.:2 e 3), nos quais os alvos foram modificados de suas seqüências nativas pela in30 serção de resíduos de cisteína em ou próximo do N terminal e do terminal C, para facilitar a formação de peptídios cíclicos (por exemplo, SEQ. ID. N-s 4 e 5).

As composições de peptídios da presente invenção compreendem também os homólogos imunológicos das SEQ. ID. N²s 4 e 5, que podem compreender de 1 a 5 aminoácidos adicionais provenientes de um ou outro terminal das SEQ. ID. N-s 2 e 3 (por exemplo., SEQ. ID. N^as 10 e 11), 5 contanto que a estrutura única da alça de bissulfeto seja preservada. O sítio alvo também pode incluir os homólogos imunologicamente funcionais que compreendem um peptídio cíclico no alcance de cerca de 25 a cerca de 50 aminoácidos, tendo uma sequência contígua de aminoácidos derivada das SEQ. ID. N²s 2 e 3. A estrutura cíclica é um elemento essencial da presente 10 invenção, pois os peptídios que compreendem as réplicas lineares dos sítios alvo não produzem anticorpos com atividade de neutralização contra os isolados primários do HIV.

Além disso, o sítio alvo dos peptídios da presente invenção é transmitido imunogênico, através da ligação covalente a uma proteína carre15 adora aos elementos imunoestimuladores sintéticos, tais como, por exemplo, os epítopos da Th promíscua derivados dos vírus e das bactérias patogênicas, dos epítopos artificiais da Th promíscua e dos peptídios imunoestimuladores em geral. Os exemplos específicos de proteína carreadora e de elementos imunoestimuladores são fornecidos, por exemplo: proteína carreado20 ^ra de hemocianina de lapa de ponta (KLH), proteína carreadora de enterotoxina A modificada de coqueluche (PEA), uma Th proveniente do antígeno da superfície do vírus de hepatite B (SEQ. ID. N² 8), uma Th artificial (por exemplo, SEQ. ID. N² 6) e um peptídio invasino imunoestimulador em geral (Inv) de Yersínia (SEQ. ID. N² 7).

Os peptídios completamente sintéticos da presente invenção podem ser representados pelas fórmulas:

(A)n-(Th)_m-(B)_o-(peptídio do antígeno CD4-CDR2)-X ou (A)n(peptídio do antígeno CD4-CDR2)-(B)₀-(Th)_m-X ou (peptídio do antígeno CD4-CDR2)-(B)₀-(Th)_m-(A)_n-X ou (Th)_m-(B)₀-( peptídio do antígeno CD4-CDR2)-(A)_n-X em que:

cada A é independentemente um aminoácido, α- ΝΗ₂, ou um peptídio imunoestimulador em gerai;

cada B é independentemente escolhido a partir do grupo constituído de aminoácidos, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO-, - NHCH(X)CH₂SCH₂CO(eN)Lys-,

-NHCH(X)CH2S-succinimidil(s-N)Lys-, e ? -NHCH(X)CH₂S-(succinimidil)-;

X é um aminoácido a-COOH ou a-CONH₂;

peptídio de antígeno CD4-CDR2 é um antígeno de peptídio, conforme descrição acima, e de preferência a SEQ. ID. N²4ou a SEQ. ID.

N² 5, ou um homólogo imunologicamente funcional e de reação cruzada dos • mesmos;

n varia de 1 a cerca de 10;

m varia de 1 a cerca de 4; e o varia de 0 a cerca de 10.

As composições de peptídios da presente invenção compreendem imunógenos de peptídios de cerca de 30 a cerca de 115 resíduos de aminoácidos, de preferência de cerca de 40 a cerca de 90 resíduos de aminoácidos e de forma mais preferencial de cerca de 50 a cerca de 80 resíduos de aminoácidos.

Quando A é um aminoácido, este pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente ou qualquer aminoácido que não ocorra naturalmente. Os aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem, mas não ficam a eles limitados: D-aminoácidos, 6-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidróxi prolina, tiroxina, ácido γ-amino butírico, homosserina, citrulina e 30 outros do gênero. Além disso, quando m é maior do que um e dois ou mais dos grupos A são aminoácidos, então, cada aminoácido pode ser independentemente o mesmo ou diferente.

Quando A é um domínio de invasina, este é um epítopo imunoestimulador proveniente da proteína invasina de uma espécie de Yersinia. Esta propriedade imunoestimuladora é resultante da capacidade deste domínio de invasina para interagir com as moléculas integrinas 61 presentes 5 em células T, em particular nas células T de memória ou imunes ativadas. A seqüência específica para um domínio de invasina que interage com as moléculas integrinas 31 foi descrita por Brett et al. (Eur J Immunoi, 1993; 23: 1608).

Uma modalidade preferida do domínio de invasina (Inv) para a 10 ligação a um epítopo de Th promíscua foi previamente descrita na Patente U. S. N- 5.759.551, a qual está aqui incorporada a título de referência. O domínio de Inv tem de preferência a seqüência:

Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-GIn-Phe (ID SEQ NO:7) ou é um homólogo estimulador imune deste, proveniente da região correspondente em outra espécie de proteína invasina de Yersinia. Tais homólogos, deste modo, podem conter substituições, deleções ou inserções de resíduos de aminoácido para acomodar a variação de tensão bacteriana, uma vez que os homólogos retêm propriedades estimuladoras imunes. De prefe20 rência, o domínio de invasina é unido através de um espaçador, fornecido por aminoácidos adicionais A ao peptídio da Th.

Em uma modalidade preferida, n é 3 e (A)3 é um domínio de invasina (Inv), glicina e glicina, nesta ordem.

(B)o é um espaçador opcional e inclui aminoácidos que podem estar acontecendo naturalmente ou aminoácidos que podem estar acontecendo não naturalmente, tal como a descrição acima. Cada B é índependentemente o mesmo ou diferente. As proteínas carreadoras são covalentemente ligadas aos peptídios com um espaçador (por exemplo, Lys-LysLys), por acoplamento químico. Os aminoácidos de (B)_o também podem for30 necer um espaçador, por exemplo, Gly-Gly, ou eNLys, entre o epítopo da Th promíscua e o peptídio do antígeno CD4-CDR2 (SEQ. ID. N²s 4 e 5), para acarretar respostas eficazes do anticorpo. Além de separar fisicamente o

epítopo de Th do epítopo da célula B (por exemplo, SEQ. ID. N-s 4 e 5) e análogos imunológicos destes, os espaçadores, tal como Gly-Gly, podem romper quaisquer estruturas secundárias de artefato, criadas pelo acoplamento do epítopo de Th com os peptídio do antígeno CD4-CDR2 e desse 5 modo eliminar a interferência entre as respostas da célula B e/ou da Th.

Os aminoácidos de (B)o também podem formar um espaçador que age como uma dobradiça flexível que aumenta a separação dos domínios da Th e da IgE. Os exemplos de seqüências de codificação de dobradiças flexíveis são encontrados na região da dobradiça de cadeia pesada de 10 imunoglobulina. As seqüências de dobradiça flexível são freqüentemente ricas em prolina. Uma dobradiça flexível em particular útil é fornecida pela seqüência Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ. ID. N⁹ 9), onde Xaa é qualquer aminoácido, e de preferência, ácido aspártico. A separação adaptável fornecida pelos aminoácidos de Bo permite interações mais eficazes entre o 15 imunógeno de peptídio apresentado e as apropriadas células Th e as células B, e, deste modo, aumenta as imunorrespostas para o epítopo da Th e o epítopo produtor de anticorpos e seus homólogos imunologicamente funcionais e de ligação cruzada destes.

Th é uma seqüência de aminoácidos (aminoácidos naturais ou 20 não naturais) que inclui um epítopo de Th. Um epítopo de Th pode consistir em um epítopo contínuo ou descontínuo. Por conseguinte, nem todo aminoácido de Th faz, necessariamente, parte do epítopo. Os epítopos de Th, incluindo os homólogos e os segmentos de epítopos de Th, são capazes de aumentar ou estimular uma imunorresposta para os peptídios do antígeno de 25 CD4-CDR2 (por exemplo, SEQ. ID. N⁹s 4 e 5, e os homólogos imunologicamente funcionais destes). Os epítopos de Th, que são imunodominantes e promíscuos, são altamente e amplamente reagentes em populações animais e humanas, com tipos de MHC amplamente divergentes (Partidos et al., 1991; na Patente U. S. N⁹ 5.759.551). O domínio de Th dos peptídios pre30 sente tem de cerca de 10 a cerca de 50 aminoácidos e, de preferência, de cerca de 10 a cerca de 30 aminoácidos. Quando múltiplos epítopos de Th estiverem presentes (ou seja, m > 2), então, cada epítopo de Th é indepen» · ·«

dentemente o mesmo ou diferente. Os segmentos de Th são porções contíguas de um epítopo de Th, que são suficientes para aumentar ou estimular uma imunorresposta para o peptídio do antígeno de CD4-CDR2 (por exemplo, SEQ. ID. N⁹s 4 e 5), e/ou análogos imunologicamente funcionais dos mesmos.

Os epítopos da Th da presente invenção incluem aqueles deri vados dos elementos patogênicos estranhos, os quais são fornecidos a título de exemplo, mas não ficam limitados a eles: epítopos de células auxiliares T do antígeno do núcleo e da superfície de hepatite B (HBs Th e HBc Th), epítopos de células auxiliares T de toxina de coqueluche (PT Th), epítopos de células auxiliares T de toxina de tétano (TT Th), epítopos de células auxiliares T de proteína F de vírus de sarampo (MV_F Th), epítopos de células auxiliares T de proteína de membrana externa principal de Chlamydia trachomatis (CT Th), epítopos de células auxiliares T de toxina de difteria (DT

Th), epítopos de células auxiliares T de circunsporozoíto de Plasmodium ’ falciparum (PF Th), epítopos de células auxiliares T de isomerase de fosfato de triose de Schistosoma mansoni (SM Th) e epítopos de células auxiliares T de TraT de Escheríchia coli (TraT Th). A Th derivada do elemento patogênico foi listada como SEQ. ID. N-s 2-9 e 42-52, na Patente U. S. N° f 20 5.759.551; como sítio P11 auxiliar de clamídia T, em Stagg et al., Immunology, 1993; 79; 1-9; e como peptídio HBc 50-69, em Ferrari et al., J Clin Investe, 1991; 88: 214-222, e estão aqui apresentados a título de referência e listados juntamente com outros como SEQ. ID. N^es 8, 13, 38-58 (Tabela 8).

Os epítopos da Th também incluem a Th artificial idealizada, por exemplo, as SEQ. ID. N^es 6, 12, 36, 59 (Tabela 9), e homólogos ímunologicamente funcionais. Os homólogos funcionais da Th incluem homólogos de aumento de imunidade, homólogos de reação cruzada e segmentos de qualquer um destes epítopos da Th. Os homólogos funcionais da Th também incluem substituições, adições, deleções e inserções conservadoras de um a 30 aproximadamente dez resíduos de aminoácidos no epítopo da Th que não modificam essencialmente a função de estimulação da Th do epítopo da Th.

Os conjugados de peptídios da presente invenção incluem tam ««« ♦ · ·· bém os peptídios do antígeno de CD4-CDR2 (por exemplo, SEQ, ID. N²s 4 ou 5) acoplados a uma proteína carreadora (por exemplo, hemocianina de lapa de ponta).

Os imunógenos de peptídios preferidos da presente invenção são os peptídios que contêm os peptídios do antígeno de CD4-CDR2 (por exemplo, ID. SEQ. N² 4 ou 5, ou homólogos imunologicamente funcionais destes) e epítopos da Th, e, opcionalmente, um sítio imunoestimulador em geral, por exemplo, inv (ID. SEQ. N² 7). Em uma modalidade mais preferida, o epítopo da Th é uma Th de HB_S, Th de HB_C, Th de MV_F, Th de PT, Th de

TT, Th de CT ou Th do HIV derivada dos elementos patogênicos estranhos ou uma Th artificial idealizada, ou homólogo imunogênico funcional destes. Opcionalmente, A é um peptídio imunoestimulador em geral, por exemplo, Inv (ID. SEQ. N² 7), de preferência unido através de um espaçador Gly-Gly ou eNLys.

A estrutura do sítio modificado é à base de uma sequência de peptídios proveniente do domínio semelhante ao CDR2 de CD4 humana (aminoácidos 27-66 da ID. SEQ. N² 1), ou a seqüência homóloga de uma outra espécie. Este sítio alvo de CD4-CDR2 está sujeito às seguintes modificações:

(1) adição ou inserção de um resíduo de cisteína, perto do N terminal, (2) adição ou inserção de um resíduo de cisteína, perto do terminal C, de preferência na posição ou perto da posição 66 ou uma posição homóloga, e (3) formação de uma ligação de bissulfeto entre as cisteínas retidas de forma que produza uma estrutura cíclica.

As estruturas de peptídios também podem compreender de 1 a 5 aminoácidos adicionais provenientes de um ou outro terminal do segmento 27-66 ou 39-66 de CD4, contanto que a estrutura cíclica única da alça de 30 bissulfeto seja preservada (por exemplo, SEQ. ID. N²s 10 e 11). De preferência, todas as cisteínas de intervenção na seqüência nativa não pretendida a ser empregada para a ciclização serão substituídas de forma conservado30 ra, por exemplo, com serina.

Por exemplo, os sítios alvo de CD4-CDR2 humano (SEQ. ID. N²s 2 e 3) são ciclizados por meio das cisteínas adicionadas nos ou perto dos terminais N e C (por exemplo, SEQ. ID. N²s 4 e 5) ou através de uma 5 císteína adicionada no N terminal e de uma substituição de cisteína perto do terminal C (por exemplo, substituindo Cys por Phe na posição 67, para obter SEQ. ID. N²s 10 e 11). Os peptídios modificados, ciclizados e sobrepostos do antígeno de CD4-CDR2, com as seguintes seqüências, | Cys His Trp Lys Asn Trp Asn Gin lle Lys lle Leu Gly

Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu

Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin

Gly Asn Cys (SEQ. ID. N² 4)

Cys Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp

Gin Gly Asn Cys (SEQ. ID. N² 5) * Cys His Trp Lys Asn Trp Asn Gin lle Lys lle Leu Gly

Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu *

Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin

Gly Asn Cys Pro Leu lle lle (SEQ. ID. N²10) ( ,; ^{20 e}

Cys Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Cys Pro Leu lle lle (SEQ. ID. N² 11) são fornecidos a título de exemplo. Nestes exemplos, as posições modifica25 das são indicadas pelo uso de tipos em negrito.

O anticorpo que é acarretado pelos imunógenos de peptídios que compreendem os peptídios do antígeno de CD4-CDR2 da presente invenção tem reação cruzada com o complexo receptor/co-receptor da superfície da célula hospedeira que compreende a CD4 e neutraliza os isolados 30 primários do HIV. Os sítios antigênicos alvo correspondentes à superfície da CD4 de outras espécies podem ser, do mesmo modo, derivados dos segmentos homólogos da espécie relevante.

Os homólogos imunologicamente funcionais e de reação cruzada dos peptídios do antígeno de CD4-CDR2 (SEQ. ID. N^es 4, 5, 10 e 11) também podem compreender substituições conservadoras, adições, deleções ou inserções de um a cerca de quatro resíduos de aminoácidos, con5 tanto que os homólogos de peptídios sejam capazes de produzir imunorrespostas de reação cruzada com os peptídios de CD4-CDR2 (SEQ. ID. N°s 2, 3, 4 e 5) e ter a atividade de neutralização contra os isolados primários do HIV. As substituições conservadoras, as adições e as inserções são conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser de imediato realizadas 10 com aminoácidos naturais ou não naturais, tal como aqui definidos.

Os imunógenos de peptídios preferidos da presente invenção são peptídios que contêm (1) sítios ciclizados modificados de CD4-CDR2, aqui referidos como peptídios do antígeno de CD4-CDR2 (por exemplo, SEQ. ID. N^ss 4, 5, 10 e 11) ou homólogos imunológícos destes e (2) peptí15 dios do epítopo da Th. Os imunógenos de peptídios mais preferidos são aqueles construtos em série que contêm peptídios ciclizados do antígeno de CD4-CDR2 (SEQ. ID. N^Qs 4, 5, 10 e 11) ou homólogos imunologicamente funcionais e de reação cruzada destes; um espaçador (por exemplo, Gly-Gly ou cNLys); um epítopo da Th selecionado do grupo que consiste em uma Th 20 de HB_s, Th de HB_C, Th de MV_F, Th de PT, Th de TT, SMTh, HIVTh (por exemplo, SEQ. ID. N^es 8, 38-50, 55), uma Th artificial (por exemplo, SEQ. ID. N^es 6, 12, 36, 59), ou um homólogo destes; e, opcionalmente, um domínio de Inv (ID. SEQ. N^e 7) ou análogo destes.

Os imunógenos de peptídio da presente invenção podem ser 25 feitos por métodos de síntese química que são bem conhecidos pelos versado na técnica. Vide, por exemplo, Fields et al., Capítulo 3 em Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Cia., Nova Iorque, NY, 1992, pág. 77. Por conseguinte, os peptídios podem ser sintetizados, através do uso das técnicas automatizadas de Merrifield de síntese de fase 30 sólida com a a-NH2 protegidos ou por uma química de Fmoc ou f-Boc, usando aminoácidos protegidos da corrente lateral, os quais estão comercialmente disponíveis. Um exemplo de instrumentos apropriados para a sínte32 se de peptídios é um Sintetizador Aplicado de Peptídio de Biossistemas Modelo 430 A ou 431.

Depois da montagem completa do imunógeno de peptídio desejado, a resina é tratada de acordo com os procedimentos normais para clivar o peptídio da resina e desbloquear os grupos funcionais das correntes laterais de aminoácido. O peptídio livre é purificado por meio de HPLC, e caracterizado bioquimicamente, por exemplo, através da análise do aminoácido, de espectrometria da massa, e/ou por seqüenciamento. Os métodos de purificação e caracterização de peptídios são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

Outros recursos químicos para gerar os construtos de peptídio sintético da presente invenção que contêm sítios de CD4 e Th incluem a ligação de peptídios haloacetilatados e cisteínados, através da formação de uma ligação tioéter. Por exemplo, uma cisteína pode ser adicionada ao terminal C de um peptídio que contém Th e o grupo tiol de cisteína pode ser utilizado para formar um laço covalente com um grupo eletrofílico (por exemplo, um grupo modificado por N(cloroacetila) ou um grupo a- ou ε-ΝΗ2 derivado de maleimida de um resíduo de lisina) ligado ao N terminal de um peptídio CD4-CH3. Nesta maneira, uma composição do conjugado de peptídios que compreende Th-(B)_o-(peptídio do antígeno de CD4-CDR2) ou em seu reverso, (CD4-CDR2 o antígeno peptídio)-(B)_o -Th, com ou sem um sítio imunoestimulador em geral, pode ser onde um dos ligantes B é Gly-Gly, (e-N)Lys, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO-, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO(e-N)Lys-, -NHCH(X)CH₂S-succinimidil(e-N)Lys-, ou -NHCH(X)CH₂S-(succinimidil)-.

O presente imunógeno também pode ser polimerizado. A polimerização pode ser realizada pela reação do imunógeno com um reagente de ligação cruzada, por exemplo por reação entre glutaraldeído e os grupos NH₂ de resíduos de lisina, pelo uso de metodologia rotineira.

Por outro método, os imunógenos sintéticos de peptídios podem ser polimerizados ou co-polimerizados por meio da utilização de uma cisteína adicional somada ao N terminal do imunógeno. O grupo tiol da cisteína do

N terminal pode ser usado para a formação de um laço de '‘tioéter com ami-

noácido modificado por haloacetila ou um grupo a-NH2 ou ε-ΝΗ2 derivado de maleimida de um resíduo de lisina que está ligado ao N terminal de uma molécula ramificada do núcleo de poli-lisil (por exemplo, K2K, K4K2K ou K8K4K2K). O presente imunógeno também pode ser polimerizado como 5 uma estrutura ramificada, através da síntese do construto de peptídios desejada, diretamente sobre uma resina ramificada do núcleo de poli-lisil (Wang et al., Science, 1991; 254: 285-288).

Alternativamente, os imunógenos mais distantes de peptídio sintético podem ser sintetizados por meio de técnicas recombinantes de 10 DNA bem conhecidas. Muitos manuais padrão de tecnologia de DNA fornecem protocolos detalhados para a produção de peptídios da presente invenção. Para construir um gene que codifique um peptídio da presente invenção, a seqüência de aminoácido é reversa, traduzida em uma seqüência ácida nucléica, de preferência, pelo uso de códon aperfeiçoado, no organis15 mo em que o gene será expresso. Logo em seguida, um gene sintético é • feito, tipicamente através da síntese de oligonucleotídeos sobrepostos que codificam o peptídio e quaisquer necessários elementos reguladores. O gene sintético é inserido no vetor de expressão desejada e os recombinantes são obtidos e caracterizados. O peptídio é então expresso sob condições f 20 apropriadas para o sistema de expressão e hospedeiro selecionados. O peptídio é purificado e caracterizado por métodos padrão.

Os ácidos nucléicos descritos acima podem ser úteis como componentes das denominadas vacinas de DNA. Nesta modalidade da invenção, a expressão dos peptídios imunogênicos da presente invenção é 25 induzida nas próprias células do paciente, de preferência, pelo uso de códons e promotores que aperfeiçoem a expressão em células humanas. Os métodos de produção e para o uso das vacinas de DNA são apresentados nas Patentes Norte-americanas de números 5.580.859, 5.589.466 e 5.703.055; vide também WO 97/02840 e W. McDonnell e F. Askari, New 30 Engl. J. Med., 1996, 334: 2-45, todos as quais estão aqui incorporadas a título de referência. Esses métodos de produção e para o uso dos peptídios e os conjugados de peptídio da presente invenção são fornecidos a título de

ilustração e não se prestam a limitar o âmbito da invenção.

A eficácia da composição de peptídios da presente invenção pode ser estabelecida pela injeção em animais, por exemplo, em cobaias, seguida de monitoramento da imunorresposta humoral aos peptídios do an5 tígeno de CD4-CDR2 quanto à capacidade dos soros imunes para neutralizar os isolados primários do HIV, tal como detalhes citados nos exemplos.

Um outro aspecto da presente invenção fornece uma composição vacinai que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de f um ou mais imunógenos de peptídio da presente invenção em um sistema de distribuição farmaceuticamente aceitável. Tais composições imunogênicas são usadas para a prevenção e o tratamento da infecção por vírus de imunodeficiência, assim como para o tratamento das imunorrespostas indesejáveis mediadas por células T que expressam CD4, tais como a rejeição de transplante e distúrbios auto-imunológicos, tais como artrite reumatóide, 15 lúpus eritematoso sistêmico e psoríase.

• Por conseguinte, a composição de peptídios da presente invenção pode ser formulada como uma composição farmacêutica ao se empregar adjuvantes, emulsificantes, veículos farmaceuticamente aceitáveis, ou outros ingredientes habitualmente fornecidos em composições de vacina. Os 20 adjuvantes ou emulsificantes que podem ser usados na presente invenção Mli;

incluem: alume, adjuvante incompleto de Freund , liposina, saponina, escaleno, L121, emulsígeno, lipídeo A monofosforil (MPL), brometo de drmetil dioctadecil amônio (DDA), QS21, ISA 206 e ISA 720, tal como também outros adjuvantes e emulsificantes eficazes conhecidos. Tais formulações são 25 de imediato determinadas por um elemento de competência ordinária na técnica e também incluem formulações para liberação imediata e/ou prolongada, bem como para indução de imunidade sistêmica e/ou indução de imunidade localizada de mucosa, que pode ser realizada através de, por exemplo, armadilha de imunógeno ou com co-administração de micropartículas.

As presentes vacinas podem ser administradas por qualquer via conveniente, incluindo a via subcutânea, oral, intramuscular, ou outra via parenteral ou enteral. De forma semelhante, os imunógenos podem ser administrados

Ψ

como uma dose única ou doses múltiplas. As programações de imunização são de imediato determinadas pelo elemento ordinariamente versado na técnica.

A composição imunogênica da presente invenção contém uma quantidade eficaz de um ou mais dos imunógenos de peptídio da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal composição em uma forma satisfatória de unidade de dosagem contém em geral de cerca de 0,5 gg a cerca de 1 mg do imunógeno por kg do peso corpóreo. Quando ofeI recida em doses múltiplas, pode ser convenientemente dividida em uma quantidade apropriada, tal como a forma da unidade de dosagem. Por exemplo, uma dose inicial, por exemplo de 0,2 a 2,5 mg; de preferência, 1 mg, de imunógeno representado como uma composição de peptídio da presente invenção, pode ser administrada por injeção, de preferência, via intramuscular, seguida por doses repetidas (reforço). A dosagem vai depender da idade, do peso e do estado geral de saúde do paciente, tal como é bem ’ conhecido por aqueles versados nas técnicas de vacinação e terapêutica.

As vacinas que contêm misturas dos presentes imunógenos de peptídio, com dois ou mais dos epítopos da Th podem aumentar a immunoeficácia em uma população mais ampla e assim fornecer uma imunorresζ 20 posta aperfeiçoada ao peptídio do antígeno de CD4-CDR2 (por exemplo, SEQ. ID. Ns.:4e5).

A imunorresposta aos imunógenos sintéticos de CD4-CDR2 da presente invenção pode ser melhorada por distribuição, através de armadilha em ou sobre micropartículas biodegradáveis do tipo descrito por O'Ha25 gan et al. (Vaccine, 1991; 9: 768). Os imunógenos podem ser encapsulados com ou sem um adjuvante, e tais micropartículas podem carregar um adjuvante estimulador imune. As micropartículas também podem ser coadministradas com os imunógenos de peptídio para potencializar as imunorrespostas tópicas, inclusive a imunidade localizada de mucosa que pode ser 30 especialmente aplicável a um vírus transmitido por mucosa, tal como o HIV, bem como para fornecer a liberação controlada pelo tempo para respostas prolongadas ou periódicas, para administração oral e para administração * * * tópica.(0'Hagan et al., 1991; e, Eldridge et al., 1991; 28:287).

A fim de que a presente invenção possa ser melhor compreendida, os seguintes exemplos são apresentados. Estes exemplos se prestam apenas para fins de ilustração, e não devem ser interpretados como limitadores do âmbito da invenção de nenhuma maneira.

EXEMPLOS

Os peptídios de sítios antigênicos alvo destes exemplos foram sintetizados pelo método de fase sólida esboçado no Exemplo 1. Cada peptídio pode ser representado pela fórmula (A)_n-(Th)_m-(B)_o-(04-CDR2 peptídio de antígeno) ou (A)_n-(D4-CDR2 peptídio de antígeno)-(B)_o-(Th)_m, mas outras fórmulas tal omo descrito acima também são englobadas dentro da invenção. O sítio antígênico alvo de CD4 é um peptídio ciclizado, exemplificado pelas SEQ ID N^s: 4, 5, 10 e 11, mas os homólogos imunologicamente funcionais que compreendem um peptídio cíclico na faixa de cerca de 25 a cerca de 50 aminoácidos, com uma seqüência de aminoácidos contígua derivada das SEQ ID NOS: 2 ou 3 e até uma seqüência adicional de cinco aminoácidos ligada ao N terminal ou ao terminal C da estrutura cíclica, deve estar dentro do âmbito da invenção.

Cada peptídio usado para este exemplo tem Gly-Gly ou sNLys como o espaçador de (B)_o entre o Th e os elementos imunogênicos de sítio alvo CD4-CDR2 modificados, e alguns incorporam um elemento (A)₃ opcional que compreende Inv-Gly-Gly, sendo que Inv (SEQ ID NO: 7) é acoplado ao peptídio antígênico (por exemplo, SEQ ID NOS: 32-35), mas os peptídios da invenção também podem ter outros espaçadores (por exemplo, SEQ ID NO: 9, NLys) ou então nenhum espaçador. Os epítopos de Th, tal como exemplificado na tabela 8, incluem os sítios adjuvantes promíscuos derivados de patógenos estranhos tais como a proteína de superfície do vírus de hepatite B e a proteína F do vírus de núcleo e do sarampo, e outros epítopos de Th, tal como mostrado na Tabela 8 (SEQ ID NOS: 8, 13, e 43-58) e Th artificial, tal como mostrado na Tabela 9 (por exemplo, SEQ ID NOS: 6, 12 36 59). Os peptídios deste exemplo também incluem um sítio imunoestimulador geral opcional (por exemplo, SEQ ID NO: 7). Além disso, a invenção não fica limitada a Inv como o elemento imunoestimulador adicional. EXEMPLO 1

IDENTIFICAÇÃO DE SÍTIOS DE EFETOR POTENCIAIS NO COMPLEXO DE CD4/CO-RECEPTOR DE SUPERFÍCIE

A. Elaboração do Peptídio

Os sítios dentro de todos os quatro domínios de CD4 humano juntos com os sítios de co-receptores que representam os quatro domínios externos receptores de quimiocina, incluindo CC-CKR1, CC-CKR2b, CCCKR3, CCKR5 e LESTR foram selecionados para a simulação por peptídios.

Uma vez que o epítopo reconhecido por MAb B4 (WO 97/46697) é de natureza conformacional, nenhum dos peptídios lineares derivados dos receptores/co-receptores acima reagiram fortemente com MAb B4, embora a reatívidade de MAb B4 com rsD4 fosse realçada de maneira significativa na presença de determinados peptídios derivados dos domínios de co-receptores 15 de quimiocina, tal como mostrado em WO 97/46697.

A despeito da falta de uma forte reatividade de MAb B4 com qualquer peptídio derivado de co-receptor de CD4 ou quimiocina individual, reatividades fracas de MAb B4 para os peptídios derivados das várias regiões de CD4 (AA1-A20, AA81-92, AA60-AA109, AA118-AA165, AA235-251, 20 AA297-AA351, ou AA361-AA375) foram detectadas. Isto acarretou uma abordagem diferente cujo objetivo era a elaboração de peptídios sintéticos que resultariam em anticorpos de alta afinidade reativos com um sítro(s) vizinho ao conformacional reconhecido por MAb B4, para a inibição da infecção de HIV das células alvo.

As seqüências de tais sítios potenciais dispersados por todos os quatro domínios de CD4 e os domínios externos de vários co-receptores de quimiocina foram portanto projetadas e sintetizadas como peptídios alvo e transformadas em imunógenos através da construção de peptídios onde os Th promíscuos derivados de HBsAg (SEQ ID NO: 8) e Inv (SEQ ID NO: 7) 30 foram ligados aos sítios alvo, tal como mostrado nas Tabelas 1 e 2. Os sítios

CD4 específicos dentro destes domínios foram selecionados para a ciclização com base em predições pelo modelo tridimensional de Brookhaven para

CD4 humano (http:www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids) de laços expostos na superfície. As restrições cíclicas especificas foram instaladas nestes peptídios para maximizar as reações cruzadas entre os sítios antigênicos alvo e a molécula CD4 nativa.

Por conseguinte, diversos dos construtos sintéticos das Tabelas e 2 foram sintetizados com as cisteínas introduzidas não encontradas na seqüência nativa, para produzir laços de ligação de bissulfeto na simulação das estruturas de laço preditas pelo modelo de Brookhaven. Em alguns ca/ sos, as cisteínas naturais foram substituídas com serinas para impedir a formação das conformações não favorecidas pelo modelo. Para os peptídios derivados de co-receptores de quimiocina, a ligação cruzada entre os peptídios dos domínios externos 2 e 3, mostrados do lado direito da Tabela 2, foi feita através dos resíduos naturalmente existentes de cisteína nos respectivos domínios, na simulação de sua estrutura nativa.

Os sítios marcados por * na coluna da descrição da Tabela 1 * foram desse modo elaborados com uma ciclização específica. Outros sítios de peptídios são lineares. Os peptídios rotulados por um a nas colunas da Forma das Tabelas 1 e 2 representam apenas o sítio do antígeno alvo de CD4 ou de CCKR. Estes foram usados como antígenos do substrato para os 20 ensaios ELISA com base em peptídios. Os peptídios marcados por b foram sintetizados como sítios antigênicos alvo em tandem com o sítio de HBs Th (SEQ ID NO: 8) tal como mostrado. Os peptídios marcados por c são variantes dos construtos de b“ sintetizados em tandem com o peptídio imunoestimulador do domínio de Inv (SEQ ID NO: 7), tal como mostrado nas Ta25 belas 1 e 2. Os peptídios designados como d eram variantes dos construtos de “b sintetizados em tandem com um segundo peptídio de Th, o CT P11 Th (SEQ ID NO: 13) unido ao N terminal com um ligante de Gly-Gly. Os peptídios marcados por e foram sintetizados como a inversão de b com os sítios de Th localizados no terminal C e no sítio antigênico alvo no N ter30 mina) do construto. Um peptídio marcado por g representa um peptídio tetramérico ramificado com a síntese realizada diretamente em uma resina do núcleo de polilisila. Os peptídios marcados por x representam os peptídios

que compreendem uma estrutura de duas cadeias ligada por uma ligação interbissulfetos através dos resíduos de cisteína naturalmente existentes presentes nas respectivas cadeias.

Outros sítios de Th usados nas experiências mostrados nas Ta5 belas 1 e 2, mas não mostrados aqui, empregaram os sítios artificiais de Th 1, 4, 9 PALINDRÔMICO (SEQ ID NO: 6) e Syn Th (1,2,4) (SEQ ID NO: 12). Os peptídios com o sítio de Inv localizado no terminal C, e o antígeno CD4-CDR2 no N terminal (CD4-CDR2 peptídio de antígeno-GG-Th-GG-lnv) também foram preparados, mas nao sao mostrados.

Os peptídios imunogênicos de Th b, c, d, “e, x, e outros usados para os estudos das Tabelas 1 e 2 também foram sintetizados com os espaçadores de Gly-Gly para a separação do sítio antigênico alvo do sítio de Th, e a separação de Th de Inv ou de um segundo sítio imunoestimulador de Th. Os imunógenos de peptídios resultantes foram selecionados como 15 sítios antigênicos alvo candidatos quanto à sua capacidade de induzir em anticorpos de hospedeiros imunizados com as seguintes propriedades:

1. Ligação ao sítio antigênico alvo em um ensaio ELISA;

2. Ligação a rsCD4 em um ensaio ELISA, nos casos de peptí- dios antigênicos derivados de CD4;

3. Ligação em um ensaio imunofluorescente às células T que expressam o complexo de receptor/co-receptor de superfície de célula que compreende CD4; e

4. Neutralização dos isolados primários de HIV resistentes à neutralização em um ensaio de microplacas in vitro.

B, Seleção de peptídios antigênicos alvo candidatos:

1. Síntese de peptídios antigênicos alvo derivados de receptor de CD4 e guimiocina.

Os peptídios listados nas Tabelas 1 e 2 em sua forma a, b c, d, e ou x correspondente foram sintetizados individualmente pela técnica da síntese de fase sólida de Merrifield em sintetizadores de peptídios automatizados da Applied Biosystems (modelos 430, 431 e 433A) ao se empregar a química de Fmoc. A preparação dos imunógenos de peptídios que compreendem uma biblioteca de antígenos sintéticos estruturados (SSAL) para o epítopo de célula T artificial (1,4,9 PALINDRÔMICO) Th (SEQ ID NO: 6) foi realizada ao se empregar uma mistura de aminoácidos alternativos para acoplar em uma determinada posição variável, na relação apropri5 ada tal como especificado na elaboração da SEQ ID NO: 6. Os peptídios de SSAL que têm elaborações de biblioteca tanto para o sítio de antígeno alvo de células B quanto para outros sítios de SSAL Th podem ser sintetizados de uma maneira análoga. Após a montagem completa do peptídio desejado, / a resina foi tratada de acordo com o procedimento padrão ao se empregar o o ácido trifluoroacétíco para clivar o peptídio da resina e desbloquear os grupos de proteção nas cadeias laterais do aminoácido. Para os peptídios cíclicos, o peptídio clivado foi deixado em repouso em DMSO a 15% em água por 48 horas para facilitar a formação da ligação de bissulfeto intracadeias entre as cisteínas. Os peptídios clivados, extraídos e lavados foram purifica15 dos por meio de HPLC e caracterizados através de espectrometria de massa • e HPLC de fase reversa.

1. Geração de imunossoros específicos de sítios antigênicos alvo derivados de receptores de CD4 e quimiocina para eficácia funcional e avaliação.

/ 20 A eficácia imunogênica das composições de peptídios foi avaliada tal como especificado pelo protocolo experimental de imunização esboçado abaixo seguido por ensaios sorológicos da resposta de anticorpo.

Elaboração Experimental Padrão:

Imunógenos:

(1) imunógeno de peptídio individual; ou (2) uma mistura que compreende uma razão molar igual de imunógenos de peptídios tal como especificado em cada protocolo.

Dose:

100 μg em 0,5 ml por imunização, a menos que esteja especifi30 cado de outra maneira.

Via:

Intramuscular, a menos que esteja especificado de outra manei41 ra.

Adjuvantes:

(1) Adjuvante de Freund completo (CFA)/Adjuvante incompleto (IFA);

(2) 0,4% de alúmen (hidróxido de alumínio); ou (3) outros adjuvantes tal como especificado. Um adjuvante por imunógeno por grupo.

Programação das Doses:

/ 0, 2, e 4 semanas; ou 0, 3, e 6 semanas; ou tal como especifica10 do de outra maneira. Grupos de CFA/IFA receberam CFA na semana, e IFA nas semanas subsequentes. O alúmen ou outros grupos adjuvantes especificados receberam as mesmas formulações para todas as doses.

Programação da sangria:

semanas 0, 3, 6, e 8, ou tal como especificado de outra maneira 15 Espécies:

* Porquinhos-da-índia Duncan Hartley

Tamanho do Grupo:

porquinhos-da-índia/grupo

Ensaio:

l 20 ELISAs específicos para a atividade antipeptídio de cada

i.

imunossoro. Os substratos de fase sólida eram a forma a correspondente do peptídio antigênico alvo (por exemplo, peptídio antigênico alvo CD4, peptídio derivado de receptor de quimiocina, etc.)

O sangue foi coletado e processado no soro, e armazenado an25 tes da titulação através de ELISA com os peptídios antigênicos alvo.

2. Soros e Anticorpos,

Os seguintes reagentes sorológicos, tanto os imunossoros derivados de porquinhos-da-índia, quanto o anticorpo monoclonal de murino ou humanizado, foram usados para as avaliações em diversos ensaios soroló30 gicos. Todos os soros de porquinhos-da-índia dirigidos contra os sítios antigênicos alvo derivados de co-receptores de rsCD4, CD4 e quimiocina foram obtidos tal como descrito acima em vários momentos após a imunização.

Outros reagentes sorológicos foram obtidos através dos estudos precedentes ou de fontes externas tal como descrito. Estes foram incorporados ocasionalmente para fins de comparação.

Por exemplo, o gp anti-gp120 V3 MN (anti-V3 MN) é soro agluti5 nado de porquinhos-da-índia que tinham sido hiperimunizados com um antígeno de peptídio sintético correspondente ao domínio V3 hipervariável de gp120 de HIV-1 MN (Wang et al., Science, 1991, 254:285-288). Os soros da biblioteca do GP anti-gp120 V3 são antisoros aglutinados de três porquinhos-da-índia hiperimunizados com uma mistura complexa dos peptídios 10 que representam um SSAL de cerca de 10¹³ seqüências possíveis de HIV-1 V3 (anti-V3 SSAL). Os imunógenos de V3 MN e V3 SSAL usados para as imunizações de porquinhos-da-índia eram imunógenos de peptídios sintéticos V3 multirramificados que foram usados para gerar anticorpos policlonais com atividade de neutralização para diversas cepas de laboratório de HIV-1, 15 tal como descrito em Walfield et al. (Capítulo 18 em AIDS Research Revi* ews, ed. Koff et al., Marcei Dekker: New York, 1993, páginas 345 a 360).

Um outro anticorpo anti-gp120 era um anticorpo monoclonal humano recombinante designado como lgG1 b12 com especificidade para o sítio de ligação gp120 para CD4 (anti-gp120 CD4-BS) (Burton et al., Scien20 ce, 1994, 266:1024-1027). O IgGl b12 foi gerado como um fragmento de Fab de uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo preparada a partir da medula óssea de um doador soropositivo HIV-1 assintomático de longa duração e convertido em um anticorpo humano integral mediante a clonagem em um vetor de expressão de lgG1 de DNA recombinante. Ele é considera25 do como o padrão de ouro” dos anticorpos para a neutralização de diversos isolados primário do HIV (Burton et al., supra).

3. Ensaios ELISA de Antipeptídios.

As atividades do anticorpo antipeptídio foram determinadas por ensaios ELISA (ensaios imunossorventes ligados por enzimas) ao se em30 pregar placas de microtítulo de fundo lisao de 96 cavidades que foram revestidas com o peptídio de sítio antigênico alvo correspondente na forma a como imunossorvente. Alíquotas (100 μΙ) de uma solução de peptídio anti43 gênico alvo a uma concentração de 5 pg/ml foi incubada por uma hora a 37^QC. As placas foram bloqueadas por uma outra incubação a 37^eC por uma hora com uma solução de 3% de gelatina/PBS. As placas bloqueadas foram então secas e usadas para o ensaio. Alíquotas (100 μΙ) dos imunossoros do 5 teste, começando com uma diluição de 1:100 de um tampão de diluição de amostra e diluições em série dez vezes maiores depois disso, foram adicionadas às placas revestidas com peptídio. As placas foram incubadas por uma hora a 37²C.

if As placas foram lavadas seis vezes com tampão de 0,05% de

PBS/TWEEN®. 100 μΙ do anticorpo específico de cabra-anti-espécie rotulado com peroxidase de raiz forte foram adicionados em diluições apropriadas no tampão de diluição do conjugado (tampão de fosfato contendo NaCl a 0,5 M, e soro normal de cabra). As placas foram incubadas por uma hora a 37^QC antes de serem lavadas tal como acima. Alíquotas (100 μΙ) da solução do 15 substrato de o-fenilenodiamina foram então adicionadas. A cor foi desenvol• vida durante cinco a quinze minutos antes que a reação de cor enzimática fosse parada pela adição de 50 μΙ de H₂SO₄ a 2N. A A₄₉₂ dos conteúdos de cada cavidade foi lida em uma leitora de placas. Os títulos de ELISA, mostrados como Logio da diluição recíproca, foram calculados com base na aná' 20 Irse da regressão linear das absorbâncias, com o corte de A₄₉₂ ajustado em

0,5. Este valor de corte era intenso, uma vez que os valores para as amostras de controle de porquinho-da-lndia normais diluídas empregadas com cada ensaio eram menores do que 0,15.

4. Determinação das reatividades do anticorpo com rsCD4, e com células que expressam CD4

a. Determinação da reatividade anti-CD4 por ELISA de rsCD4,

CD4 solúvel recombinante purificado (rsD4) foi obtido junto a uma fonte comercial (American Bio-Technologies, Inc., Cambridge, MA) e junto ao NIH (USA) AIDS Research and Reference Regante Program. Os 30 ensaios ELISAs de rsCD4 foram realizados ao se revestir placas de microtítulo de 96 cavidades através de incubação durante toda a noite a 4⁹C com rsCD4 em 0,25 pg/ml usando 100 plitros em 10 mM de tampão de NaHCO3, pH de 9,5. As cavidades revestidas com rsCD4 foram incubadas com 250 μΙ de 3% em peso de gelatina em PBS a 37^aC por uma hora, para bloquear os sítios de ligação de proteína não-específicos, lavadas três vezes com PBS contendo 0,05% em volume de TWEEN 20, e então secas.

Os imunossoros ou os anticorpos monoclonais foram diluídos em série com PBS contendo 20% em volume de soro normal de cabra, 1% em peso de gelatina e 0,05% em volume de TWEEN 20 a diluições de 1:20 de volume a volume, a menos que esteja indicado de outra maneira. 100 μΙda amostra diluída foram adicionados a cada uma das cavidades e reagidos 10 por uma hora a 37²C. As cavidades foram lavadas então seis vezes com

PBS contendo 0,05% em volume de TWEEN 20 para remover os anticorpos rotulados não-ligados. 100 μ!_ de IgG anti-camondongo de cabra rotulado com peroxidase de raiz forte ou IgG anti-porquinho-da-índia de cabra a uma diluição de 1:1000 em 1% em volume de soro normal de cabra, 0,05% em 15 volume de TWEEN 20 em PBS foram adicionados a cada cavidade, e incubados a 37^eC por 15 minutos. As cavidades foram lavados seis vezes com 0,05% em volume de TWEEN 20 em PBS para remover o conjugado de anticorpo rotulado não-ligado e reagidos com 100 μΙ da mistura do substrato que contém 0,004% em peso de ortofenilenodiamina (OPD) e 0,12% em vo20 lume de peróxido de hidrogênio em tampão de citrato de sódio com pH de 5,0, por 15 minutos. As reações foram paradas pela adição de 100 μΙ de H2SO4 a 1,0 M, e a absorbância a 492 nm (A492) foi medida. A titulação de anticorpo Logio recíproca foi calculado para a reatividade do ponto final de cada amostra do teste, conforme interpolado pela regressão linear, tal como 25 descrito para o ensaio ELISA de antipeptídio.

a. Determinação da reatividade a células que expressam CD4 por tinqimento imunofluorescente indireto.

0,5 x 10⁶ células que expressam CD4 (por exemplo, as células das linhagens de células HPB-ALL, MT2 ou SUP-T1) por cavidade foram 30 lavadas duas vezes em PBS contendo 1 % de BSA antes de sua incubação com os imunossoros ou anticorpos monoclonais designados, a uma concentração ótima tal como determinado para cada experiência, por 45 minutos, à temperatura ambiente. Após a incubação das células com o primeiro anticorpo do tingimento, as células foram lavadas por mais duas vezes no mesmo tampão de lavagem e incubadas com um reagente de IgG anticamondongo de cabra conjugado com (FITO) de isotiocianato de fluoresceina secundária ou de IgG específico de anti-espécie de cabra conjugado com (FITC) em diluições apropriadas (Cappel, Malvern PA) por mais 45 minutos, à temperatura ambiente. As células tingidas foram lavadas outra vez no mesmo tampão de lavagem, e as células foram processadas para a análise de citofluorógrafo e/ou de microscopia de imunofluorescência para a determinação da porcentagem de células tingidas, e a intensidade do tingimento. b. Ensaio de inibição de imunofluorescência indireta

Para os ensaios da inibição de ligação de célula B4-T de anticorpo monoclonal biotinilado competitiva que empregam a técnica de tingimento de imunofluorescência indireta, as células foram em primeiro lugar incubadas com os reagentes de interferência ou imunossoros foram diluídos apropriadamente, e lavadas duas vezes no mesmo tampão de lavagem antes da adição do anticorpo monoclonal B4 biotinilado. O tingimento das células T que expressam CD4 foi encerrado pela incubação subsequente com FITC-avidina apropriadamente diluídas seguido por três lavagens adicionais antes da análise pelo citofluorógrafo ou pelo microscópio de fluorescência de alta resolução.

5. Determinação da neutralização do vírus pelo anticorpo,

a. Células

A linhagem de células T humanas a MT-2 (ATCC 237) foi mantida no meio Eagle modificado da Dulbecco suplementado com soro bovino fetal a 15% tal como descrito anteriormente (Hanson et al., J. Clin. Microbiol., 1990, 28:2030-2034). As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) dos doadores soronegativos HIV-1 foram isoladas das unidades de revestimento de tampão frescas pela separação de gradiente de FicollHypaque (Organon Teknika Corp., Durham, NC). As PBMCs resultantes foram estimuladas com 0,5% de PHA-P (Difco Laboratories, Detroit, Ml). Depois de três a quatro 4 dias, o meio contendo PHA-P foi removido e as célu46

Ias foram mantidas em RPMI com o soro bovino fetal a 15%, 900 gg/ml de glutamina, antibióticos, e 5% de interleucina-2 (Celular Products, Inc., Buffalo, NY).

b. Vírus

O HIV-1 MN é uma cepa de TCLA disponível como e mantida como uma cultura de células H9 persistentemente infectadas do National Institutes of Health, Bethesda MD (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Catálogo N- 402), a partir da qual foram preparados estoques /..... concentrados sem células. Os isolados primários de HIV-1 foram preparados de PBMCs de pacientes mediante a co-cultivação de PBMC. As culturas em estoque de isolados primários foram preparadas por não mais do que 3 a 5 passagens através de PBMCs, e clarificadas por meio de. centrifugação (Sawyer et al., J. Vírol., 1994, 68:1342-1349). Elas foram fornecidas por Carl Hanson do Califórnia Departament of Health Services, Berkeley CA.

c. Ensaio de Neutralização em Microplacas de MT-2 ' A determinação do título do anticorpo neutralizante de HIV emprega a pré-incubação de soros diluídos em série ou anticorpo com uma quantidade fixa de HIV seguida pela infecção de células MT-2 sensíveis ao HIV e a formação de uma monocamada de célula que apresenta mícropla| 20 cas induzidas por HIV. Os resultados são marcados pela quantificação das microplacas. O ensaio é apropriado apenas para isolados de SI, quer sejam isolados de TCLA quer sejam isolados primários, porque as microplacas representam sincícia gigantes formados pelas células MT-2 que se fundem aos focos de células infectadas pelo HIV. O ensaio é apropriado para a ava25 liação da inibição da transmissão tanto de vírus à célula quanto de célula à célula porque a inibição da formação de sincícia resulta da ação do anticorpo em partículas de HIV ou em células infectadas por HIV, isto é, o ensaio mede tanto a inibição da fusão induzida por HIV do vírus à célula quanto da fusão induzida pelo HIV de célula à célula. A neutralização é observada en30 tão pela redução das microplacas tal como observado pela enumeração das placas tingidas com iodeto de propídio uma semana mais tarde (vide Hanson et al., J. Clin. Microbiol., 1990, 28:2030-2034). Neste ensaio, tanto o vírus

· ♦

quanto o soro ou o anticorpo são diluídos em plasma humano normal desfibrado 50% aglutinado, para eliminar quaisquer efeitos intensificadores ou inibidores não-específicos.

C. Resultados:

Os sítios antigênicos alvo derivados de co-receptores de CD4 ou quimiocina candidatos e os peptídios usados para os estudos da capacidade imunogênica e funcionais preliminares são descritos nas Tabelas 1 e 2. Os porquinhos-da-índia foram imunizados tal como descrito acima com as for/ mas b ou c do sítio antigênico alvo, a menos que esteja indicado de outra maneira nas Tabelas 3 e 4, e os imunossoros que foram coletados em seis ou oito semanas depois da imunização inicial foram analisados por ensaio ELISA de antipeptídio e ELISA de rsCD4 tal como descrito nos Procedimentos.

Tal como mostrado nas Tabelas 3 e 4, a maior parte dos imunó15 genos de peptídios derivados de co-receptores de CD4 e quimiocina era al* tamente imunogênica, uma vez que eles acarretaram anticorpos de antipeptídio com títulos na faixa de 2,5 a >5 Log_w, com exceção dos peptídios p1590b, p1699b, p1699c e p1700b. Os sítios antigênicos derivados de CD4 que compreendem segmentos longos do receptor CD4 (por exemplo, ζ 20 p1612c, p1678b, p1678c, p1686b, p1697b, p1817b, p1889b e 1901b) junto com alguns sítios alvo ciclizados eram de elevada reação cruzada com rsCD4, tal como mostrado por seus títulos correspondentes >3,5 Logw pelo ensaio ELISA de anti-rsCD4 (vide a Tabela 3, coluna A2). A reatividade cruzada com rsCD4 para cada um dos construtos de peptídio não era predisí25 vel. Além disso, tal reatividade cruzada com rsCD4 não se estendeu a CD4 da superfície da célula hospedeira correspondente, uma vez que entre os construtos de peptídios que têm uma reatividade cruzada de rsCD4 elevada, apenas p1697b e p1901b foram reconhecidos como fortemente reativos com as células T que expressam CD4 através do tingimento com imunofluores30 cência indireta com as células das linhagens de células HPB-ALL ou MT2 (Tabela 3, coluna B).

Por outro lado, os soros derivados de peptídios de sítios antigê< ¹ nícos alvo de CD4 com uma estrutura ciclizada (por exemplo, p1472b, p1472c) ou do domínio de CDR2 (por exemplo, p1403b, p1471c) eram altamente reativos com as células T que expressam CD4 a despeito de sua baixa reatividade cruzada baixo com rsCD4 (Tabela 3, coluna B). Para os co5 receptores de quimiocina, os soros derivados dos construtos de peptídios p1990, p1999, p2028, p2047, p2048, p2049, p2087 e p2089, na maior parte com sequências dos domínios 1, 3 ou 4 dos co-receptores, foram reconhecidos como reativos com o complexo de receptor/co-receptor de superfície / (Tabela 4, coluna B).

Os resultados acima indicam que a reatividade cruzada com rsCD4 ou complexo de receptor/co-receptor de superfície é um fenômeno complexo e imprevisível, influenciado pelas características conformationais que só podem ser deduzidas através da observação experimental.

Os imunossoros (seis ou oito semanas depois da imunização) 15 obtidos para os construtos de peptídios acima também foram selecionados ' quanto à sua atividade de neutralização contra um isolado primário de HIV-1

VL 135 da classe B pelo ensaio de neutralização de microplacas com MT-2 tal como descrito acima. Apesar da presença de anticorpos de reação cruzada com título elevado com rsCD4 ou do complexo de CD4/co-receptor de f 20 superfície em alguns dos imunossoros, nenhum apresentou níveis significativos de tais anticorpos neutralizantes (Tabelas 3 e 4, coluna C).

Os imunossoros que têm padrões de fingimento de imunofluorescência brilhante com células T que expressam CD4 foram avaliados ainda quanto à sua capacidade de inibir ou bloquear a ligação por MAb B4 às 25 células T que expressam CD4 para localizar os sítios de efetores potenciais com proximidade aos sítios descontínuos do epítopo conformacional reconhecido por MAb B4. Os resultados obtidos de tais experiências podem emprestar indícios à elaboração eficaz de novos imunógenos de peptídios. Esta avaliação foi feita pelas experiências que envolvem a inibição de fingimento 30 de imunofluorescência da ligação de MAb B4-célula T. As células T alvo de CD4+ (por exemplo, as células de T de MT2) foram pré-incubadas com imunossoros apropriadamente diluídos (por exemplo, 1:10) seguidos pela **· ··· . . : .· , . ι ·* ;

' * · · incubação das células com MAb B4 e avidina conjugada com FITC biotinilada com os procedimentos detalhados descritos acima.

Entre todos os imunossoros avaliados, somente os soros gerados através da imunização com o peptídio p1471c derivado do domínio de 5 CD4-CDR2 são reconhecidos como inibidores da ligação de MAb B4 (Tabela 5). Nenhuma das imunizações com quimiocina peptídios derivados de coreceptores de quimiocina interferiu com a ligação de célula T de MAb B4. Esta falta de inibição da ligação de célula T de MAb B4 pode estar relacio/ nada em parte com a afinidade menos do que ótima apresentada pelos anti10 corpos em relação aos sítios efetores potenciais, e não pode ser devida exclusivamente à distância espacial dos sítios representados pelos sítios antigênicos alvo àquele reconhecido por MAb B4.

Todos, com exceção de um dos hiperimunossoros dirigidos contra os peptídios de receptores e de co-receptores, não inibiram a ligação de 15 MAb B4 a células T, e nenhum apresentou uma atividade de neutralização • contra um isolado primário do HIV. Outras tentativas foram feitas na elaboração de novos construtos de peptídios com o objetivo de capturar os sítios efetores potenciais na molécula de CD4 de superfície, com base na posição de p1471 na seqüência de CD4, sendo que o indício foi fornecido pelo estuí 20 cio da inibição da ligação de MAb B4-células T.

VMais especificamente, os peptídios que compreendem os sítios antigénicos alvo que cercam o domínio de CD4-CDR2 que transpõe os resíduos de aminoácidos de 20 a 75 de acordo com o sistema de numeração da SEQ ID NO: 1 foram revistos e os construtos de peptídios adicionais que 25 cobrem essa região foram reelaborados com uma ênfase particular na preservação da estrutura tridimensional dessa região através da inserção de resíduos de cisteína em ambos os terminais N e C dos peptídios derivados dessa região de CDR2 com um tamanho do laço na faixa de 30 a 45 aminoácidos. As seqüências de aminoácidos para os construtos de peptídios re30 presentativos derivados dessa região são mostradas na Tabela 6.

Os imunossoros foram coletados em seis ou oito semanas depois da imunização inicial e avaliados de maneira análoga àquelas descritas

na seleção precedente. Entre os 41 sítios antigênicos alvo avaliados, foi verificado que p2057, p2189, p2190, e p2240 (SEQ ID NOS: 4, 11, 10, e 5), como construtos c (SEQ ID NOS: 32-35), resultam nos anticorpos neutralizantes dirigidos contra os isolados primários de HIV-1 (Tabela 6). O isolado 5 VL135 (Tabela 6) (Sawyer et al., J. Virol., 1994, 68:1342-1349) é um isolado primário resistente à neutralização representativo. Ele não é um isolado primário sensível à neutralização atípico que pode ser usado para fornecer positivo aparente mas enganoso (D. Burton e J. Moore, Nature Medicine, 1998, f 4:495-48). Portanto, a neutralização viral observada aqui não é a inativação de um vírus facilmente neutralizado, mas é uma evidência para a imunidade de proteção do estímulo por um isolado do campo do HIV. Não houve nenhuma observação prévia no campo da pesquisa da AIDS onde os imunógenos quimicamente definidos acarretaram anticorpos com esta função crítica de neutralização do HIV. Apesar da falta de atividade de ligação por MAb

B4 a qualquer um dos peptídios do sítio do domínio de CD4-CDR2 (tal como • mostrado no pedido de patente co-pendente publicado como WO 97/46697), é aqui demonstrado que um sítio alvo de CD4-CDR2 é proximal ao epítopo descontínuo disperso que constitui o sítio de reconhecimento para neutralizar o anticorpo monoclonal B4. Este sítio de reconhecimento parece conter / 20 sítios de peptídios de todos os quatro domínios de CD4 provavelmente devíX do à natureza curva do complexo de receptor/co-receptor de superfície que compreende CD4, reconhecida por MAb B4. Este CD4 de superfície é distinto do modelo tridimensional estendido bem conhecido de rsCD4. Vale a pena anotar que somente determinados sítios antigênicos alvo derivaram da 25 região de CD4-CDR2, isto é, aqueles que transpõem uma área mais estendida e se apresentaram como peptídios cíclicos (por exemplo, p2057c, p2189c, p2190c e p2240c, SEQ ID NOS: 32-35), resultaram em tais anticorpos neutralizantes.

EXEMPLO 2

OS HIPERIMUNOSSOROS GERADOS PELOS PEPTÍDIOS p2057c E p2240c DEMONSTRAM ANTICORPOS NEUTRALIZANTES AMPLAMENTE REATIVOS CONTRA O HIV PRIMÁRIO DE MÚLTIPLAS CLASSES

Conforme mostrado na Tabela 7, ambos os hiperimunossoros derivados dos sangramentos obtidos em 15 e 12 semanas depois da imunização inicial para os imunógenos de peptídios p2057c e p2240c (SEQ ID NOS: 32 e 35) demonstraram títulos de anticorpos 90% neutralizantes signi/ ficativos contra os isolados primários de HIV de múltiplas classes em um padrão paralelo àquele demonstrado por MAb B4. Os títulos dos anticorpos neutralizantes variaram em uma ordem crescente de 1:20 para 1:185 para os isolados primários da classe D, A, B(DH12), E, para B(VL 135) e a classe C para os imunossoros para p2057c (SEQ ID NO: 32); de Τ.20 para 1:324 para os isolados primários das classes D, B(DH12), A, E para a classe B (VL

135) para os imunossoros para p2240c (SEQ ID NO: 35). Para fins de de• terminar a equivalência, a atividade de neutralização de MAb B4 variou de

25,6 pg/ml a 1,54 pg/ml para os isolados primários de HIV-1 das classes D,

A, E, C, B(DH12), para a classe B (isolado primário VL 135). Em comparação, os soros de porquinhos-da-índia dirigidos ao domínio de gp120 V3 do N terminal e os anticorpos monoclonais dirigidos tanto ao domínio de gp120 V3 do N terminal de HIV-1 MN (MAb 50,1) ou um sítio de ligação de gp120 CD4 conformacional menos variável (MAb lgG1 b12) falhou em neutralizar qualquer desses isolados primários de HIV resistentes à neutralização. Diluições de 1:20 a 1:300 dos imunossoros anti-p2057c e anti-p2240c que conferem

90% de neutralização dos isolados primários HIV das classes A a E, tal como demonstrado na Tabela 7, devem se aproximar de uma concentração de MAb B4 em soro não diluído de cerca de 300 μg/ml a partir de um cálculo da concentração de MAb B4 e diluições de soro a atividades de neutralização equivalentes (isto é, uma média da concentração de MAb B4 (pg/ml) x o fator de diluição de imunossoro para a atividade de neutralização contra cada um dos isolados correspondentes).

EXEMPLO 3

CORRELAÇÃO DE TÍTULOS de ANTICORPOS NEUTRALIZANTES EM SOROS COM EFICÁCIA DE PROTEÇÃO EM MACACOS RHESUS CONTRA A INFECÇÃO POR SIVmac251

No pedido de patente co-pendente WO 97/46697, a eficácia de proteção de MAb B4 e sua correlação aos títulos de anticorpos neutralizantes in vitro foi avaliada por uma experimentação de estímulo de MAb B4 contra a infecção experimental de macacos rhesus com SIV, um modelo animal normalmente usado para a AIDS humana.

Nesse estudo, os macacos rhesus foram infusados com MAb B4 e os soros foram coletados nos momentos pré-tratamento, pré-estímulo, e uma hora depois do estímulo, para a avaliação. Foi verificado que o nível do soro do anticorpo de MAb B4, determinado por imunoensaio de rsCD4 contra uma curva pré-calibrada de MAb B4, fica na faixa de 30 a 45 qg/ml para 15 todos os animais que recebem um dosagem de 5 mg/kg do peso corpóreo.

Três de quatro dos animais que receberam esta quantidade de MAb B4 foram protegidos contra SIV_mac 251, durante o período de um ano monitorado. O nível (isto é, 30-45 pg/ml) do soro de MAb B4 presente nos animais estimulados é muito mais baixo do que o nível estimado do anticorpo anti-(peptídio 20 de antígeno CD4-CDR2) (em torno de 300 pg/ml) que deveria estar presente nos imunossoros gerados nos hospedeiros caso eles tivessem sido imunizados com uma composição imunogênica que compreende p2057c ou p2240c (SEQ ID NOS: 32 e 35).

Portanto, pode-se predizer que os hospedeiros imunizados com uma composição do peptídio da presente invenção que compreende as SEQ ID NOS:4,5,10 e 11 ou seus homólogos têm imunidade de proteção contra a infecção por HIV por isolados primários do HIV de múltiplas classes.

EXEMPLO 4

COMPOSIÇÕES DE PEPTÍDIOS IMUNOGÊNICOS QUE COMPREENDEM

UM EPÍTOPO DE Th ARTIFICIAL PROMÍSCUO

Um peptídio de antígeno Th/CD4-DR2 artificial foi sintetizado da montagem (SEQ ID NO: 6)-Gly-Gly-(SEQ ID NO: 5) e recebeu a designação

SEQ ID NO: 60.

O peptídio da SEQ ID NO: 60 foi formulado em ISA 206/DDA. A ISA 206/DDA é uma emulsão de óleo/água na qual é dispersa MONTANIDE™ ISA 206 a 30 mg/ml (A MONTANIDE™ ISA 206 é uma solução meta5 bolizável oleosa fornecida pela SEPPIC Inc., de Fairfield, NJ). A suspensão de óleo é emulsionada então a um coeficiente em volume de 1:1 em uma solução de peptídio aquosa que foi ajustada para o teor do peptídio de modo a fornecer a dose desejado da composição de peptídio em 0,5 ml do prepa| rado final.

A capacidade imunogênica da SEQ ID NO: 60 na formulação acima foi estabelecida em porquinhos-da-índia que receberam 100 pg/dose, aplicados nas semanas 0, 3, e 6. A capacidade imunogênica foi determinada por meio de ensaio ELISA de antipeptídio tal como descrito no Exemplo 1 ao se empregar a SEQ ID NO: 5 como o peptídio de sítio antigênico alvo cicli15 zado usado para o substrat ode fase sólida. Seis dentre seis porquinhos-daíndia foram soroconvertidos com sucesso à reatividade de ELISA.

De modo significativo, foi verificado que a SEQ ID NO: 60 também é altamente imunogênica e de atividade funcional em um animal de grande porte. Uma composição imunogênica que compreende a SEQ ID NO: 20 θθ foi formulada em Adjuvante de Freunds incompleto (IFA), 300 pg/dose, e

Si, administrada a um suíno através de injeção intramuscular nas semanas 0, 3, e 6. Os suínos foram soroconvertidos e o soro da semana 8 foi testado quanto à atividade de neutralização contra o isolado primário de HIV-1 VL135 através do Ensaio de Neutralização de Microplacas de MT-2 (Exem25 pio 1). A amostra do soro dos suínos forneceu 50% de neutralização do vírus de entrada a uma diluição de 1:249, e 90% de neutralização a uma diluição de 1:97. Portanto, a imunização com uma composição de peptídios da invenção resultou em um hospedeiro de animal de grande porte com uma imunorresposta que incluía o anticorpo ao receptor da célula hospedeira que 30 compreende CD4 e a atividade de neutralizaão em relação ao HIV.

^Λ

EXEMPLO 5

CONSTRUTOS DE PEPTÍDIOS REPRESENTATIVOS DA INVENÇÃO

Os peptídios imunogênicos da invenção mostrados na Tabela 10 são construtos totalmente sintéticos que foram sintetizados pelo método de 5 fase sólida esboçado no Exemplo 1. Cada peptídio na tabela pode ser representado pela fórmula (A)_n-(Th)m-(B)₀-(CD4-CDR2 antígeno)-X, mas deve ficar entendido que os peptídios das outras fórmulas indicadas acima são englobados dentro dos peptídios da presente invenção. A seqüência de antígenos CD4-CDR2 é a SEQ ID NO: 4 ou 5. Os peptídios imunogênicos mos10 trados compreendem sítios de Th artificiais (tal como mostrado na Tabela 9). Cada peptídio deste exemplo tem espaçadores de Gly-Gly entre os elementos imunogênicos, mas os peptídios da invenção podem ter outros espaçadores tais como eNLys, ou nenhum espaçador.

Materiais e Métodos

Os construtos de peptídios representativos da invenção tal como listado na Tabela 10 (SEQ ID NOS: 60,61 e 62) são sintetizados, clivados, ciclizados e purificados tal como descrito no Exemplo 1. Os construtos de peptídios foram formulados para a imunização em animais pequenos tais como porquinhos-da-índia, ou em animais maiores tais como suínos ou ba20 buínos para a avaliação de suas capacidades imunogênicas. Os peptídios foram suspensos em um volume de 0,5 ml contendo emulsificantes ou adjuvantes representativos tais como ISA51, ISA720, DDA ou lipídio A de monofosforila (MPL). A dose era de 100 pg do peptídio para porquinhos-daíndia ou 300 pg do peptídio para suínos ou babuínos, e os animais foram imunizados intramuscularmente.

Os animais receberam injeções nas semanas 0, 3 e 6 tal como especificado na Tabela 1. Os sangramentos de teste das semanas 5, 8 ou outras semanas específicas depois da imunização inicial foram avaliados quanto à reação cruzada para rsCD4 por meio de ensaio ELISA de rsCD4 tal 30 como descrito no Exemplo 1, e ainda testados quanto à sua capacidade de neutralizar os isolados primários de HIV-1 também tal como descrito no Exemplo 1.

Resultados

Os construtos de peptídios representativos tinham uma capacidade imunogênica relevante, uma vez que todos os peptídios testados acarretaram uma forte reatividade cruzada dirigida ao sítio para o rsCD4 corres5 pondente, tal como mostrado pelos títulos de Log₁₀ nos ensaios ELISA de rsCD4 anti-humano de mais de 3,5 (Tabela 11). A neutralização do isolado primário de HIV-1 (por exemplo, VL135) também foi observada para os imunossoros obtidos de porquinhos-da-índia, porcos e baboons. Essa reatif _s vidade cruzada funcional pelos soros de baboons é marcante, uma vez que a neutralização dos isolados primários de HIV humanos pelos soros de baboons é quase que um sistema humano. Desse modo, a eficácia de um construto de peptídio da invenção, como um agente para a prevenção e/ou a imunoterapia da infecção por HIV pela imunização ativa é fortemente indicada pelo modelo dos primatas.

Tabela 1

Descrição Estrutural de Peptídios Derivados de CD4

Código	Descrição	Forma t	Código	Descrição	Forma t
-	rsCD4	a	p1616	(C) CD4 (40- 43) (C) *	b, c
p1403	CD4 (43-55)	b, c	p1617	(C) CD4 (52- 54)(C) *	b, c
p1404	(C)CD4(38- 47)(C)*	b, c	p1618	(C) CD4 (51- 55) (C) *	b, c
p1405	CD4 (81-92)	b, c	p1619	(C) CD4 (48- 52)(C) *	b, c
p1406	CD4 (18-29)	b, c	p1620	(C) CD4 (85- 90)(C)*	b, c
p1460	CD4 (1-109)	a	p1621	(C) CD4 (85- 89)(C)*	b, c
p1468	CD4 (47-64)	b, c	p1622	(C) CD4 (85- 90)(C) *	b, c
p1469	CD4 (39-45)	b, c	p1678	(C) CD4 (291- 306)(C)*	b, c
p1470	(C) CD4 (36- 45)(C)*	b, c	p1679	(C) CD4 (297- 302)(C)*	b, c
p1471	CD4 (39-67)	b, c	p1680	(C) CD4 (303- 315)(C)*	b, c
p1472	(C) CD4(115- 130 (C->S) - 137)(C)*	b, c	p1681	(C) CD4 (309- 313)(C) *	b, c
p1518	CD4 (60-109)	b, c	p1682	(C) CD4 (314- 328)(C) *	b, c
p1585	(C) CD4 (36- 47)(C) *	b, c	p1683	(C) CD4 (291- 306)(C) *	b, c
p1586	(C) CD4 (42- 59)(C) *	b, c	p1684	(C) CD4 (315- 346)(C)*	b, c
p1587	(C) CD4 (44- 56)(C) *	b, c	p1685	(C) CD4 (338- 343)(C) *	b, c

ρ1588	(C) CD4 (46- 55)(0) *	b, c	p1686	(C)CD4(341- 360)(C)*	b, c
ρ1589	(C) CD4 (79- 96)(C)*	b, c	p1687	(C) CD4 (349- 353)(C)*	b, c
ρ1590	(C) CD4 (104- 115)(C)*	b, c	p1688	(C) CD4 (202- 205)(C)*	b, c
ρ1608	CD4 (16-25)(0) ★	c	p1689	(C) CD4 (213- 226) (C)*	b, c
ρ1609	(C) CD4 (118- 128)(C)*	c	p1690	(C) CD4 (217- 221)(C)‘	b, c
ρ1610	(C) CD4 (127- 130 (C-+S) - 141)(C)*	c	p1691	(C) CD4 (228- 239)(0) *	b, c
ρ1611	(C) CD4(138- 146)(C)*	c	p1692	(C) CD4 (231- 237)(C) *	b, c
ρ1612	(C) CD4 (133- 153)(C)*	c	p1693	(C) CD4 (235- 251 )(C)*	b, c
ρ1613	CD4 (159- 169)(C)*	c	p1694	(C) CD4 (243- 246)(0) *	b, c
ρ1615	(C) CD4 (39- 44) (C) *	b, c	p1695	(C) CD4 (247- 259)(0) *	b, c
ρ1696	(C) CD4 (250- 255)(C) *	b, c	p1817	CD4[118- 130(C)-159(C)- 165]*	b
ρ1697	(C) CD4 (274- 286)(0) *	b, c	p1818	CD4(81-92))X GD4 (6-20)	b x a
ρ1698	(C) CD4 (277- 282)(0) *	b, c	p1820	CD4 (154-165) XCD4(117- 140)	a x b
ρ1699	CD4 (168-182)	b, c	p1821	CD4 (154-165) X CD4 (123134)	a x b
ρ1700	(C)CD4 (151- 178)(C)*	b, c	p1848	CD4[(68-92)-M]	g

Tabela 1 (continuação)

p1701	CD4 (361-375)	b, c	p1856	CD4(79-88) X CD4(1-20)	a x b
p1702	CD4 (14-22)	b	p1857	CD4(79-88) X CD4(1-20)	b x a
p1761	CD4 (123-134)	b	p1858	CD4(1-20)	b
p1763	CD4 (72-92)	b	P1864	CD4(1-20)) X CD4 (156-173)	b x a
p1765	(C) CD4 (70- 84)	b	p1868	CD4 (297-351)*	b
p1766	CD4 (6-26)	b	p1875	004(87-98)	b
p1767	CD4 (6-20)	b	p1876	CD4 (81-98)	b
p1768	CD4 (154-165)	b	p1877	CD4 (76-98)	b
p1769	CD4 (156-173)	b	p1878	(C) CD4 (77- 98)(C)*	b
p1770	CD4 (146-170)	b	p1879	(C) CD4 (77- 103)*	b
p1771	CD4 (117-140)	b	p1880	CD4 (72-103)*	b
p1773	CD4 (72-92) X CD4 (6-26)	a x b	p1886	CD4(341-375)	b
p1775	CD4 (72-92) X CD4 (6-20)	a x b	p1889	CD4(213-251)	b
p1777	CD4 (117-140) ) XCD4(154165)	a x b	p1901	004(1-26)	b
p1778	CD4 (117-140) ) X 004(156- 173)	a x b	p1905	004(303-0345- 353)*	b
p1780	CD4 (123-134) XCD4 (154165)	a x b	p2037	(C) CD4(68- C84-88)*	b
p1781	CD4 (123-134) X CD4 (154- 173)	a x b	p2038	(C) CD4(68- C84)*	b

Tabela 1 (continuação)

p1783	CD4 (6-20) X CD4 (72-92)	a x b	p2078	CD4 (1-20)	e
p1784	CD4 (6-26) X CD4 (72-92)	a x b	p2100	(C) CD4(68- C84 -92)*	b
p1813	CD4 (79-88)	b	p2101	(C) CD4(68- C84 -98)*	b

t A forma dos construtos de peptídios é designada como a, b, c, e, g, e x, onde:

a representa o Sítio Antigênico Alvo b representa HBsTh-GG-Sítio Antigênico Alvo c representa Inv-GG-HBsTh-GG-Sítio Antigênico Alvo e representa Sítio Antigênico Alvo-GG-HBsTh g representa o tetrâmero ramificado do Sítio Antigênico Alvo no núcleo K2KAA x representa a reticulação das cadeias de peptídio através de uma ligação de dissulfeto intercadeias * O peptídio é ciclizado através das cisteínas em ou perto dos terminais N e C do Sítio Antigênico Alvo

Tabela 2

Descrição Estrutural de Peptídios Derivados de Receptores de β Quimiocina

Antígenos de Peptídios que Representam o Domínio Externo de Receptor de Quimiocina	2/3	4—	d xa	bxa	bxa	X Λ
Descrição	AA94- AA107X AA172- AA203	AA100- AA114X AA182- AA207	AA92- AA107X AA173- AA204	AA88- AA102X AA168- AA199
Código	1	§	p2084	I
'd^- CO	4—	.o	_Q	-Cl
Descrição	AA261- AA287	AA269- AA285	AA265- AA281	AA261- AA277
Código	p2028	1	p2082	I
4—	-Q
Descri- ção	AA168- AA203	AA182- AA207	AA173- AA204	á a § i
Ό CD O	p2027	8 o <3.	8	t
CM	4—	φ	_Q	_Q
Descrição	AA94- AA107	AA100- AA114	AA92- AA107	á $
A ° Ό cn O ia	CL	p2087	§	QJ CL
-	For ma	Φ	φ	φ	Φ
Descrição	AA1-AA34	AA1-AA43	AA1-AA35	AA1-AA29
1 ό σ> O	8 σ> Cl	8 o	p2079	I
ι Tipo de Receptor de Quimiocina	CC-CKR1#	CC-CKR2#	CC-CKR3#	ID Ot Q Ò Q

LC

te σ> τΟ.
	4*
03 c	OC
’ω	J—
ω
LL	LU —1

Tabela 3

Capacidade Imunogênica e Mapeamento Funcional de Peptídios Derivados de CD4 de Ensaios ELISA e de Neutralização

Código do peptídeo	A1	A2	B	C
rs CD4		>5	+++	<1:10
p1403 b	4.3	2.6	+++	<1:10
p1403c	4.3	2.1	tr	<1:10
p1404 b	2	<1	tr	<1:10
p1404 c	4.3	2.6	++	<1:10
p1405 b	4.3	1.1	-	<1:10
p1405 c	>5	1.8	-	<1:10
p1406 b	4.3	0.9	-	1:12
p1406 c	4.3	0.9	-	<1:10
p1460a	4.3	2.4	-	<1:10
p1460#	3.3	1.2	-	<1:10
p1469b	4.3	2.6	-	<1:10
p1469 c	4.3	3.1	tr	<1:10
p1470b	3	0.5	tr	<1:10
p1471 a	3.3	2.5	-	<1:10
p1471 b	3.3	2.8	tr	<1:10
p1471c	4.3	2.7	++	<1:10
p1472 b	4.3	1.3	+++	<1:10
p1472 c	4.3	1.8	+++	<1:10
p1518b	4.3	3.7	-	<1:10
p1518 c	4.3	3.7	-	<1:10
p1585b	4.3	3.0	-	<1:10
p1585 c	4.3	3.0	-	<1:10
p1586 b	4.3	3.2	-	<1:10
p1586 c	4.3	3.2	-	<1:10
p1587 b	4.3	3.2	-	<1:10
p1587c	4.3	3.2	-	<1:10

Tabela 3 (continuação)

Código do peptídeo	A1	A2	B	C
p1588b	4.3	3.2	-	<1:10
p1588 c	4.3	3.2	-	<1:10
p1589 b	4.3	2.2	-	<1:10
p1589 c	4.3	2.2	-	<1:10
p1590 b	4.8	1.7	-	<1:10
p1590 c	4.8	1.7	-	<1:10
p1608 c	3.3	0.8	tr	<1:10
p1609 c	4.3	1.5	tr	<1:10
p1610c	3.3	<1	-	<1:10
p1611 c	2	1.9	tr	<1:10
p1612c	>5	>5	-	<1:10
p1613 c	4.3	1.0	tr	<1:10
p1614b	>5	1.9	-	<1:10
p1614 c	>5	2.6	-	<1:10
p1615b	2.0	1.3	-	<1:10
p1615c	4.3	1.7	-	<1:10
p1616 b	>5	1.1	tr	<1:10
p1616c	3.8	1.2		<1:10
p1617b	>5	1.2		<1:10
p1617c	2.0	1.4		<1:10
p1618 b	>5	1.0		<1:10
p1618c	4.3	1.1		<1:10
p1619 b	4.3	1.4		<1:10
p1619 c	4.3	1.4		<1:10
p1620 b	>5	1.7	tr	<1:10
p1620c	>5	1.4	-	<1:10
p1621 b	>5	1.4 I	-	<1:10

<

ί : : : 'ί *'· :

, ,- .>· fc· t »4· <··· « « *

Tabela 3 (continuação)

Código do peptídeo	A1	A2	B	c
p1621 c	3.5	1.1	-	<1:10
p1622b	4.3	1.1	-	<1:10
p1678 b	2.8	4.5	+	<1:10
p1678c	4.3	4.5	+	<1:10
p1679 b	2.5	2.1	-	<1:10
p1679c	2.5	1.9	+	<1:10
p1680 b	4.5	2.9	++	<1:10
p1680c	4.5	2.5	++	<1:10
p1681 b	4.3	1.8	++	<1:10
p1681c	3.5	1.6	+	<1:10
p1682 b	>5	2.7	+	<1:10
p1682c	>5	2.7	+	<1:10
p1683 b	>5	1.8	+	<1:10
p1683 c	4.0	1.6	+	<1:10
p1684 b	>5	2.9	+	<1:10
p1684 c	>5	2.5	++	<1:10
p1685 b	>5	1.8	+	<1:10
p1685 c	3.0	1.6	+	<1:10
p1686b	4.3	4.1	+	<1:10
p1686 c	4.3	3.5	tr	<1:10
p1687 b	4.3	2.9	++	<1:10
p1687c	4.3	2.0	+	<1:10
p1688 b	>5	2.4	+	<1:10
p1688 c	4.3	2.4	+	<1:10
p1689 b	4.3	2.9	++	<1:10
p1689 c	3.8	2.5	++	<1:10
p1690b	3	2.1	++	<1:10

Tabela 3 (continuação)

Código do peptídeo	A1	A2	B	c
p1690 c	2.0	1.9	++	<1:10
p1692b	4.3	1.7	+	<1:10
p1693 c	4.3	2.7	+	<1:10
p1694b	3.0	1.8	-	<1:10
p1694 c	3	1.8	tr	<1:10
p1695 b	3.0	2.0	++	<1:10
p1695 c	2.5	2.1	+	<1:10
p1696 b	>5	1.8	+	<1:10
p1696 c	>5	1.9	tr	<1:10
p1697b	>5	4.2	++	<1:10
p1697c	3.5	2.1	+	<1:10
p1697 c	3.5	2.1	++	<1:10
p1698 b	3.5	1.7	-	<1:10
p1698 c	2.0	1.8	-	<1:10
p1699 b	1.5		-	<1:10
p1699 c	1.5	-	-	<1:10
p1700b	1.5	-	-	<1:10
p1700c	2.5	1.7	-	<1:10
p1701 b	>5	2.2	++	<1:10
p1701 c	>5	2.6	++	<1:10
p1761 b	4.3	2.2	++	<1:10
p1763 b	4.3	2.1	-	<1:10
p1765x	3.5	1.3	-	<1:10
p1766 b	>5	1.2	-	<1:10
p1767b	3.8	3.0	-	<1:10
p1768 b	>5	1.4	-	<1:10
p1769b	>⁶ . .	1.3	-	<1:10

V<

Tabela 3 (continuação)

Código do peptídeo	A1	A2	B	C
p1771 b	>5	2.8	+++	<1:10
p1773x	>5	1.2	-	<1:10
p1775x	4.3	1.3	-	<1:10
p1777x	4.5	1.7	-	<1:10
p1778x	>5	2.7	-	<1:10
p1780x	>5	1.2	++	<1:10
p1781 x	>5	2.7	-	<1:10
p1783x	4.3	1.2	-	<1:10
p1784x	4.3	1.4	-	<1:10
p1813 b	3.3	1.5	-	<1:10
p1817b	>5	4.5	+	<1:10
p1818x	>5	1.3		<1:10
p1820 x	>5	2.5	tr	<1:10
p1821 x	>5	1.3	-	<1:10
p1848 g	>5	3.1	+++	<1:10
p1856 x	4.3	1.5	-	<1:10
p1857x	>5	2.3	-	<1:10
p1864 x	3	2.5	+++	<1:10
p1878 b	4	2	-	<1:10
p1889 b	>5	4.4	1.5	<1:10
p1901 b	>5	4	3	<1:10
p2037 b	>5	NT	tr	<1:10
p2038 b	4.3	NT	-	<1:10
p2078 b	4.3	NT	++	<1:10
p2100 b	3.5	NT	+	<1:10
p2101 b	3.0	NT	tr	<1:10

Legenda, Tabela 3:

#: Conjugado de p1460 - BSA

A1: Título recíproco de sítio antígênico anti-alvo de Logio ELISA

A2: Título recíproco anti-rsCD4 de Log₁₀ ELISA

B: IFA (Ensaio de Tingimento com Imunofluorescência Indireta)

C: Diluição de soro resultando em 50% de inibição no Ensaio de Neutralização MT-2 na Classe B HIV-1 VL 135 g: Peptídio tetramérico ramificado tr: traços

NT: não determinado v

Õ H

Diluição de soro resultando em 50% de inibição em Ensaio de Neutralização em Classe B HIV-1 VL 135 traços

Tabela 4

Capacidade imunogênica e mapeamento funcional por ensaios ELISA e de neutralização de peptídios derivados de co-

Antígeno de Peptídio que Representa o Respectivo Domínio de Receptor de Quimiocina	2/3	O	“ o V	o V	o V	- ° V	<1:1 0 I .
£0	1	1		Φ	1
<	‘í?	3.5	4.3	4.3	‘a
S ⁸		p2091			Cl
	O	o r·; v	<1:10	<1:10	<1:10	<1:10
CD	t	+		!	I
<	4.3	4.3	2.5 L. ____	4.8	3.5
				Íl	§ o.
09	O	<1:10	<1:10	<1:10	<1:10	<1:10
CO		1	1	Φ	í
<	2.5	‘í?	3.0	3.5	LO cxi
Código	i	I	I		Q.
CM	o	<1:10	<1:10	<1:10	<1:10 I	<1:10
CD	1	t	1		1
<		4.3	3.0	3.0	4.3
Código	1		.Q Q.	-Q ^Q.	J3
-	o	<1:10	o t— V	O V	<1:10	<1:10
CD	í				4=
<	•í?	4.3	4.3
Código			1		Q.
Tipo de Receptor de Quimiocina	CC-CKR1	CC-CKR2	CC-CKR3	CC-CKR5	Fusina (LESTR)

LO

Tabela 5

INIBIÇÃO DE LIGAÇÃO DE MAB B4 A CÉLULAS MT2 T POR IMUNOSSOROS GERADOS POR PEPTÍDIOS DERIVADOS DE

CO-RECEPTORES DE CD4 OU QUIMIOCINA

Chemokine co-receptor-derived peptide

Imunossoro (1:10)# í

B4-Biotina x Avidina-FITC

Inibição

Não i

Nao

Não

I Não -

Nao

Não

ο «ca

Não I

Sim

Não

Intensidade

+ +

+

+ +

I ++ _

+ +

+

o

+ +

% Pos cells

>95

σ> Λ

>95

LO σ> Λ

! 96<

>95

o

I >95

Imunossoro (1:50)t

FITC-Gt aGP IgG

Intensidade

+ +

+ + +

+ 4-

+ +

+++

Φ as = 8 à? Q. O

>95

ID <5) A

>95

IO σ> Λ

>95

>95 ί

! >95

>95

1

Código do peptídio*

1990e

1999e

2028b

| 2047b

2048b

χ 'Τ ο CM

2087b

-dQ O ω

MAb B4

++ Φ o Ϊ— c o O

CD4-derived peptide j

Imunossoro (1:10)#

B4-Biotina x Avidina-FITC

Inibição

Não

Sim

i Não

Não

ο >os

Não

o 1OS

Não

Intensidade

+ + +

o

+ +

% de células pos.

LO CT> Λ

o

. >95

>95

Γ ^>95 ι

>95

LO σ> A

I >95

+^o in o o ω ω ο c =5 Ε

FITC-Gt aGP IgG

Intensida- de

+ + +

+ +

+

+ + +

+++

+ + +

(Λ ω as Ό -= ω „ o 5? Κφ CL o

Λ

! S6<

>95

LO <31 Λ

>95

Código do peptídio* i________________________

n o CO

; 1471c

1472c

1684c

1817b

1848d

1864

.Ω σ> co CD Ύ—

1901b

IFA inibidor vide as legendas da Tabela 2 quanto à descrição dos códigos dos peptídios só o meio

Tabela 6

Capacidade dos Peptídios de Produzir Anticorpos Neutralizantes contra Isolado Primário de HIV * · *

Tabela 6 (continuação)

71 ·*: *: '·^: · ’ ’ í ·;*!!·' · ; , * — ...........

<1:10

o V

<1:10

<1:10 I j

o V

<1:10

o V

o v

<1:10

O V

<1:10

o T~ V

<1:10

o

r

1

r

H Z

NT

NT I

NT

1— ~z.

NT

IN

H Z

o co

3.0

CM cõ

3.2

CM CÕ

CM CO

3.2

CM cõ

CM CM

2.2

O)

2.6

1.3 I

cxi T“

CM

CO

4.3

CO Xl·

4.3

4.3 Ί

4.3

m Λ

LO Λ

o CM

Λ

9<

3.5

>5

σ> CM

XI

o

X

o

X

O

X

O

X

o

X

O

X

o

X

Q

X

o

to	<D
00	00
IO	to

CL	CL

Tabela 6 (continuação)

72

<1

« f «

• • « *

Λ » - * ·

• ' *

• •

•

'· ·« ; .

*

«

»*' »»·

« ·

o

O

o

O

o

m

CO CM

U0

co

TT

T7

T~

T7

to

co CM

v

'v

V

t—

>-

H

1—

H

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1-

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2

z

2

z

+

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C0

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O

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LO

m

—1

Λ

> τ· >

IO

xt

Xfr

Tt

ID

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X

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Λ

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φ

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w

05

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O

JO

O

_Q

o

ο

O

05

C

CC ω

o_^ O

CC ω

O

CM h-

Q < cc

z 0

Q < CC

z 0

S O 105

1-

σ

ο

σ

O 05 N

z

Q

z

Q

_j kí

5 u

—1

_1

7õ

ω CL

ω oc

co CL

ω oc

=5 φ

0 i— _j

CC ω Q

LTKG

CC ω D

LISA

z Φ Ό

LL

<

LU

<

UJ

0

ω

CC

ω

CC

o

05

KILGNQG

GPSKLND

KILGNQG

—1 Q.

GPSKLND

T~ σ> o _j φ Ό o

< cn —1 LU

ω c 111 0 c 0 «CC

O

σ z

O z

H _|

σ z

O Z

f— —1

φ

ς> Ig

ω

0

LL

ω

0

u_

c

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<£

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2

σ

C0

z

σ

ω

Φ

QC H 2

____> ω

5

Q §

0 0

sz 5

o 5

0 σ

O O

05 O —1

0 o^x

—1

CL

T

_1

Z

I

—1

<Q

Φ

0

O

o

Ο

ω CC

O

□

o

ω CC

Q

,σ> c

T5

LQ E

05

Q

Φ

*

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*

O

ío

O ‘4—»

0 ω

0 TO

o

co

Q

CO

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1

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G? ID

O 2

cT m

O 2

<ο <ο r^.

õ z

1 σ> co

*C] N0:

r^ 1 r0J

õ T

õ z

<D O 1 07

Ò z

Φ Ό

c 05

Φ ·—· ω

’Γ

O

00

Q

CXI

Q

^Q

tr

J

□

co,

Q

05 O

Φ

yj — í?

σ

'ê Q

σ LU

Q O

ω μ-, σ

Q O

Íd LL

σ

xjQ

σ LU

0 CL

2 CL

o

Q **-* o Q

Q O

LU ω

ο ο

ω

O

LU ω

O

LU ω

O O

co

O Φ k_

ü Φ

ω φ

O

iCÚ

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o

O

i05

05

O

00

σ>

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σ>

o

í a

_g

ι—

1--

LO

00

σ>

i- L

L ÜZ

ΓΊ

tO

CO

ο

1—

CM

1—

1--

CXI

CM

CL

Q.

Cl

Q.

CL

LL

CM

õ

< co <

peptídios ciclizados

Tabela 7

Neutralização de Isolados Primários de HIV-1 de Classes A, B, C, D e E por Anticorpos Monoclonais e Imunossoros (Ensaio de

DH12# (Classe B)	90%	1:20	1:36	2,1 pg/ml	E 'δ) o o 7	NT	E 75) O CO Λ
TH036# (Clas- se E)	90%	1:87	1:102	3,32 pg/ml	Ê 75> o o 7	>50 pg/ml	Ê 75) o m Λ
UG266# (Classe D)	90%	1:20	1:20	E 73) cq in Cd	Ê 73) ±. O O 7	E 75) =i. o UC Λ	Ê 75) =*- o LO Λ
ZIM 748# (Classe C)	90%	1:184	NT	Ê 73) =L C\l CO OJ	Ê 73) =t o o T- Λ	>50 pg/ml	Ê Τι) o LO Λ
VL 135 (Classe B)	90%	I 1:157	1:324	Ê 75) in	1 ι >100pg/ml	E 73) =à. st	Ê 73) ±. o m Λ
UGO29# (Classe A)	90% I	1:20 I j	i 1:76	\| 73) CO Γ- CÓ	E 73) o o Λ	38,5 pg/ml	Ê 73) O CO Λ
Tipo de Anticorpo	..	α p2057c (SEQ ID NO: 32) (15 wpi)	a p2240c (SEQ ID NO: 35) (12 wpi)	xt CD -Q CC 5	α N-terminal V3MN j	o Cd Q. D) a -C < cd T“ -Q T*“ 0 O)	Mab 50.1 α gp120 (N- terminal V3)

ω Q < c o E <u ισι o

Q_ cõ xa o 0 o □2 5 o CL

CO O Ό c

i— o

> T

Φ X5

U) O cã

E

CL <o O Ό aj

Tabela 8

SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE EPÍTOPOS de TH DERIVADOS DE

PATÓGENOS ESTRANHOS

Descrição de Th	SEQ ID NO:	Seqüências de aminoácidos
MVF288-302 Th	38	LSEIKGVIVHRLEGV
MVF258-277 Th	39	GILESRGIKARITHVDTESY
TT830-844 Th	40	KKQYIKANSKFIGITEL
TT947-966 Th	41	KKFNNFTVSFWLRVPKVSASHL
PT149-176 Th	42	KKLRRLLYMIYMSGLAVRVHVSKEEQYYDY
TT73-99 Th	43	YDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIK
PT18-41 Th	44	GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL
HBs19-32 Th	8	FFLLTRILTIPQSLD
HBc120-140Th	45	VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL
HBc21-40 Th	46	SDFFPSVRDLLDTASALYRE
HBc50-69	47	PHHTALRQAILCWGELMTLA
TT615-631 Th	48	WVRDIIDDFTNESSQKT
HIV gp41 Th6 (N-)	49	RAGRAILHIPTRIRQGLER
HIV gp41 Th6 (C-)	50	AVAEGTDRVIEVLQRAGRAIL
CT A8106-130 Th	51	ALNIWDRFDVFTLGATSGYLKGNS
CT P11 Th	13	TINKPKGYVGKE
DT1 Th	52	DSETADNLEKTVAALSILPGHG
DT4 Th	53	EEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAATNFVESC
PF Th	54	DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS
SM Th	55	KWFKTNAPNGVDEKIRI
TraT1 Th	56	GLQGKIADAVKAKG
TraT4 Th	57	GLAAGLVGMAADAMVEDVN
TraT6 Th	58	STETGNQHHYQTRVVSNANK

Tabela 9

Sequências de Aminoácidos de Epítopos de Th Artificiais

Descrição de Th	SEQ ID NO:	Sequência de aminoácidos
1,4,9 PALINDROMIC	6	ISEIKGVIVHKIEGI MT RT TRM TM L L V
Syn Th (1,2,4)	12	KKKIITITRIITIITTID
1S(1,4,9 PALINDRO- MlC)LF simplificada	36	ISISEIKGVIVHKIEGILF T RT TR T
IS(1,4,9 PALINDRO- MIC)LF	59	ISISEIKGVIVHKIEGILF MT RT TRM TM L L V

3

O

3

Q

CO

Oi

U

s

h-1

cn

fn

tá

ω

Ql

tá.

tá

Q

ω

tá

§

Ü

cn

o

α

0

Q

á

1

cí}

3

0

n

CO

i-q

0

3

1

o

h4

Hí

y

0

[x-

0

X

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Η

2

0

Q

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3

HI

3

CJ

S

ω

o

ω

1

1-4

HI

2

>

Cd

M

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2

HI

s

>

tá CO

Cl

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0

H

0

o

0

H

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Ϊ4

CÍ

54

h4

3

CXi

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2

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3

EH

H

>

HI

2

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tá

3

>

i-q

ω

3

K

tá

Eh

2

HI

&4

H

3

H

>

ca

>

CO'

>

E

HI

o

ω

EH

0

tá

H

cn

>

3

tá

Q

>

0

o

Η

o

HI

Oi

Eh

0

Eh

Oi

3

tá

3

M

3

0

tá

X

1—1

ω

E-4

K

HI

ω

HI

<

ω

Λ

cn

H

o

u

ω

o

u

>

CO

Eh

0 0

Μ

2

Z)

IH

-r'

HI

2

h4

rò

ffl

CC

N

O

LO

O 'cj

ío

υ

LfT

O

o

O

ó Z

O

ó z

O

ó Z

θ'

O Ό

Q

CD

o

Q

©

o T5

Q

Tabela 10

Peptideos Adicionais Representativos da Invenção

Tabela 11

Capacidade Imunogênica dos Peptídios Representativos da Invenção

o		— w -J TT	.05
-Φ	ω	CF í
CL G)	Φ	O
LU		0- c

Tabela 11 (continuação)

		Φ				Φ
CO		73	r	CO		73	1	CO
p	CL	O iCtJ	E <D	<p	CL	O icn	t Φ	O.
<ΰ		w	ό	ns	5	CO	ό	ns
CD	<O	3 E	Φ Ό	CD	CD	mu	Φ Ό	3 σι
'<0		LLl	'CO		LU		'CC

co c

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídio, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 32, 33,34, 35, e 60.
2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que

5 compreende o peptídio, como definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o dito peptídio está entre 0,5 pg e 1 mg por quilograma do peso corpóreo por dose.
3. Uso de uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medi-

10 camento para induzir anticorpos a um complexo CD4 de superfície e/ou inibir a ligação do HIV às células CD4+ em um mamífero.