KR20130118910A - 면역글로불린 절단 단편 백신 조성물 - Google Patents
면역글로불린 절단 단편 백신 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20130118910A KR20130118910A KR1020137015471A KR20137015471A KR20130118910A KR 20130118910 A KR20130118910 A KR 20130118910A KR 1020137015471 A KR1020137015471 A KR 1020137015471A KR 20137015471 A KR20137015471 A KR 20137015471A KR 20130118910 A KR20130118910 A KR 20130118910A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- peptide
- antibody
- igg
- cleavage site
- disease
- Prior art date
Links
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title claims description 185
- 230000007017 scission Effects 0.000 title claims description 182
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 43
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title description 57
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title description 20
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title description 20
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 69
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 56
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 146
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 89
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 89
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 86
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 56
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 54
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 44
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 39
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 2-[benzyl-(4-methoxyphenyl)sulfonylamino]-n-hydroxy-4-methylpentanamide Chemical group C1=CC(OC)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(CC(C)C)C(=O)NO)CC1=CC=CC=C1 VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 claims description 18
- 101710108790 Stromelysin-1 Proteins 0.000 claims description 18
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 16
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 claims description 16
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 16
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 14
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 claims description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 11
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 11
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 10
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 9
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 9
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 9
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 8
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 7
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- 229940037003 alum Drugs 0.000 claims description 7
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 7
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 claims description 5
- 101000851058 Homo sapiens Neutrophil elastase Proteins 0.000 claims description 5
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 5
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 claims description 5
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 claims description 4
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 4
- 101710187853 Macrophage metalloelastase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100027998 Macrophage metalloelastase Human genes 0.000 claims description 4
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 claims description 4
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 4
- LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[1-[[1-[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000617 Cathepsin G Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004173 Cathepsin G Human genes 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 claims description 3
- 229940123189 CD40 agonist Drugs 0.000 claims description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 2
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 claims description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 claims description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 claims description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-AAJYLUCBSA-N squalene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-AAJYLUCBSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 claims 2
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 claims 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 34
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 34
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 abstract 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 36
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 34
- 230000006870 function Effects 0.000 description 32
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 30
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 30
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 11
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 11
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 8
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 8
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 7
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 7
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 7
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 7
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N Ala-Pro-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 5
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 5
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 5
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 101100075829 Caenorhabditis elegans mab-3 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N Pro-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 4
- SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N Pro-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N 0.000 description 4
- KNCJWSPMTFFJII-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KNCJWSPMTFFJII-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- SMEYEQDCCBHTEF-FXQIFTODSA-N Cys-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMEYEQDCCBHTEF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 3
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 3
- TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N Pro-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N 0.000 description 3
- HWLKHNDRXWTFTN-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O HWLKHNDRXWTFTN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- VUXIQSUQQYNLJP-XAVMHZPKSA-N Thr-Ser-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O VUXIQSUQQYNLJP-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 3
- BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 230000001050 lubricating effect Effects 0.000 description 3
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PUUPMDXIHCOPJU-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O PUUPMDXIHCOPJU-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- YMBAVNPKBWHDAW-CIUDSAMLSA-N Cys-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N YMBAVNPKBWHDAW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- KSMSFCBQBQPFAD-GUBZILKMSA-N Cys-Pro-Pro Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 KSMSFCBQBQPFAD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N Glu-Pro-Lys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 101000635804 Homo sapiens Tissue factor Proteins 0.000 description 2
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- YTJFXEDRUOQGSP-DCAQKATOSA-N Lys-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YTJFXEDRUOQGSP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- IEVXCWPVBYCJRZ-IXOXFDKPSA-N Lys-Thr-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 IEVXCWPVBYCJRZ-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 2
- MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N Phe-Leu-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N Pro-Glu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- PRKWBYCXBBSLSK-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PRKWBYCXBBSLSK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- ODSAPYVQSLDRSR-LKXGYXEUSA-N Thr-Cys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ODSAPYVQSLDRSR-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N Thr-Cys-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 2
- SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N Thr-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N 0.000 description 2
- ZQGPWORGSNRQLN-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N ZQGPWORGSNRQLN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 102000052502 human ELANE Human genes 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- YWENWUYXQUWRHQ-LPEHRKFASA-N Arg-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O YWENWUYXQUWRHQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- NVFSJIXJZCDICF-SRVKXCTJSA-N Asp-Lys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NVFSJIXJZCDICF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N Asp-Lys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- ASHTVGGFIMESRD-LKXGYXEUSA-N Cys-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O ASHTVGGFIMESRD-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- ZOKPRHVIFAUJPV-GUBZILKMSA-N Cys-Pro-Arg Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O ZOKPRHVIFAUJPV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 101000759376 Escherichia phage Mu Tail sheath protein Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ser Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- HZWWOGWOBQBETJ-CUJWVEQBSA-N His-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O HZWWOGWOBQBETJ-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 1
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000005726 Inflammatory Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010021980 Inflammatory carcinoma of the breast Diseases 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N Leu-Gly-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- CFVQPNSCQMKDPB-CIUDSAMLSA-N Lys-Cys-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N CFVQPNSCQMKDPB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N Lys-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- CTJUSALVKAWFFU-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N CTJUSALVKAWFFU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RQILLQOQXLZTCK-KBPBESRZSA-N Lys-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O RQILLQOQXLZTCK-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- QLFAPXUXEBAWEK-NHCYSSNCSA-N Lys-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QLFAPXUXEBAWEK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N Phe-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102100038124 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 229920001244 Poly(D,L-lactide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- MHHQQZIFLWFZGR-DCAQKATOSA-N Pro-Lys-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MHHQQZIFLWFZGR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CZCCVJUUWBMISW-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Cys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O CZCCVJUUWBMISW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N Ser-Val-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 101710145796 Staphylokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N Thr-Ala-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N 0.000 description 1
- DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N Thr-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102100030859 Tissue factor Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N Val-Ala-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- BRPKEERLGYNCNC-NHCYSSNCSA-N Val-Glu-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N BRPKEERLGYNCNC-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- AHHJARQXFFGOKF-NRPADANISA-N Val-Glu-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N AHHJARQXFFGOKF-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- WDIGUPHXPBMODF-UMNHJUIQSA-N Val-Glu-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N WDIGUPHXPBMODF-UMNHJUIQSA-N 0.000 description 1
- OQWNEUXPKHIEJO-NRPADANISA-N Val-Glu-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N OQWNEUXPKHIEJO-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- HJSLDXZAZGFPDK-ULQDDVLXSA-N Val-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](C(C)C)N HJSLDXZAZGFPDK-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940047712 aluminum hydroxyphosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 230000000941 anti-staphylcoccal effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910001593 boehmite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000013415 human tumor xenograft model Methods 0.000 description 1
- FAHBNUUHRFUEAI-UHFFFAOYSA-M hydroxidooxidoaluminium Chemical compound O[Al]=O FAHBNUUHRFUEAI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 201000004653 inflammatory breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000051367 mu Opioid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 239000000101 novel biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012808 pre-inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005430 regulation of immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002764 solid phase assay Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010911 splenectomy Methods 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- -1 tPA Proteins 0.000 description 1
- BCIPGSZQUDLGSY-INIZCTEOSA-N tert-butyl (4s)-4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5-oxopentanoate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCC(=O)OC(C)(C)C)C=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 BCIPGSZQUDLGSY-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000004308 thiabendazole Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 230000006441 vascular event Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 108020001612 μ-opioid receptors Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 항원 결합성을 보유하지만 이펙터 기능을 상실한 IgG 분해 생성물에 대하여 면역특이적인 치료제의 제조 및 사용을 위한 방법 및 시약에 관한 것이다. 본 발명의 시약은 인간 대상의 예방적 또는 치료적 백신 접종을 위하여 면역원으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 표적 특이적인 천연 면역글로불린 또는 치료용 면역글로불린과 반응성인 면역글로불린의 방법, 조성물 및 용도에 관한 것이며, 여기서 결합은 표적화된 천연 면역글로불린 또는 치료용 면역글로불린의 절단된 그리고 결합된 단편에 내재하는 생물활성을 복구시키고 이럼으로써 그 생물활성을 제공하거나 또는 재구성할 것이다. 본 발명은 생체외에서(ex vivo) 또는 생체내에서(in vivo) 이러한 면역글로불린을 생성하기 위한 백신에서 사용하기 위한 면역원성 면역글로불린 단편을 추가로 제공한다.
순환 면역글로불린, 및 특히 IgG 클래스의 항체들이 주요 혈청 단백질이다. 인간 프로테아제는 염증성 질환, 증식성 질환, 전이성 질환, 및 감염성 질환과 관련됨이 잘 알려져 있다. 인간 프로테아제, 예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테이나아제(matrix metalloproteinase, MMP) 및 호중구 엘라스타아제는, 세균 프로테아제, 예를 들어, 글루타밀 엔도펩티다아제 (스타필로코커스 아우레우스(Staph. aureus)) 또는 연쇄상구균(스트렙토코커스 피오제네스(Strep. pyogenes))의 면역글로불린 분해 효소가 하는 것처럼, 각 프로테아제에 독특한 잔기에서 IgG 중쇄 폴리펩티드를 절단한다. 상기 중쇄 내의 절단 부위는 힌지 도메인(hinge domain)으로 불리는 영역 주위에 밀집되어 있으며, 여기에서 두 중쇄의 사슬간 다이설파이드 결합이 나타난다. 힌지 아래의 영역은 Fc 영역을 구성하며 IgG의 이펙터(effector) 기능에 책임이 있는 결합 부위를 포함한다. 미생물의 경우, 힌지 아래의 절단에 의한 Fc 도메인의 단백질 분해적 방출이 그렇지 않으면 그 병리학적 세포의 표적화 및 사멸을 유도할 기능들을 효과적으로 중화시키는 한은, 프로테아제 발현은 유기체가 옵소닌작용(opsonization)을 피하도록 하는 잠재적인 부속 발병 경로이다 (문헌[Rooijakkers et al. Microbes and Infection 7: 476-484, 2005]). 따라서, 특정 프로테아제의 정교화(elaboration)는 암, 염증 및 감염성 질환을 비롯한 수많은 질환 상태를 나타낼 수 있다.
IgG 분해는 절단된 힌지 도메인에 결합하는 천연 IgG 자가항체의 존재에 의해 입증되는 바와 같이 병리학적 생체내 환경에서 향상된다(문헌[Knight et al., 1995]; 문헌[Nasu et al., 1980]; 문헌[Persselin and Stevens, 1985], 문헌[Terness, et al. 1995 J Imunol. 154:6446-6452]). 이들 자가항체는 또한 몇몇 프로테이나아제(파파인 및 펩신 포함)에 의해 생성된 Fab 및 F(ab')2 단편에 결합하며, F(ab')2 분자에서 C-말단 잔기로 남아 있는 하부 힌지 도메인에 특히 강한 반응성을 갖는다(문헌[Terness et al., 1995]). 실제 절단 생성물의 검출이 보고되었으나 (문헌[Fick et al., 1985], 문헌[Goldberg and Whitehouse, 1970], 문헌[Waller, 1974]), 아마도 다양한 단편들의 신속한 제거에서 생기는 혈청 중의 낮은 농도로 인하여 또는 혈액 및 조직 중의 다량의 온전한 면역글로불린 중에서 당해 단편들을 검출함에 있어서의 기술적 문제로 인하여, 이들 단편이 바이오마커로서의 역할을 하도록 하는 확고한 분석법은 개발되지 않았다. 인간 호중구 엘라스타아제로 절단된 Fc 도메인의 검출을 위한 특이적 항체가 제조되었으며 (문헌[Eckle, et al. 1988. Adv. Exp. Med. Biol. 240: 531-534]), 이 항체는 류마티스 관절염 환자의 윤활액에서 0.62 ug/ml의 중앙값 농도에서 Fc를 직접 검출하였으나 다른 유형의 관절 질환을 가진 환자로부터의 윤활액에서는 검출하지 못했다.
지금까지는 프로테아제 특이적 질환 활성으로 고통받고 있는 대상의 신체에서 IgG 절단의 과정을 보상하고 생체내에서 IgG 기능의 상실을 교정하는 능력이 치료적 전략으로서 예상되지 않았었다.
본 발명은 표적 결합 또는 비결합 IgG를 분해시킬 수 있는 단백질 분해 효소의 방출에서 생기는 IgG 절단 생성물에 특이적인 항체를 생성하기 위한 백신과, 항체에 관한 것이다. 본 항체 및 백신은 프로테아제 분해를 가했던 치료적 IgG 항체 조성물에 이펙터(effector) 기능을 복구시키는 데 유용하다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, IgG 절단 생성물의 새롭게 생성된 C-말단 서열을 나타내는 질환 특이적 절단 부위 펩티드가 제공된다. 이들 펩티드는 본 발명의 항-IgG 절단 생성물 항체의 면역화, 패닝(panning), 및 선발에 또한 유용하다. 일 태양에서, 펩티드는 프로테아제 절단 부위의 아미노 말단측에 있는, 서열 번호 1, 2, 3, 또는 4의 인간 IgG 힌지 영역 서열들로부터 선택되는 5개 이상의 연접 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 서열 번호 11의 폴리펩티드 및 이의 N-말단 절단물로부터 선택된다. 다른 태양에서, 인간 IgG 분자의 단백질분해 절단 부위에 기반한 펩티드 면역원을 디자인하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 항-IgG 절단 생성물 항체의 재조합 생성을 위한 핵산 서열, 벡터, 및 숙주 세포를 비롯하여 본 발명의 항-IgG 절단 생성물 항체의 제조 방법이 제공된다. 항-IgG 절단 생성물 항체를 제조하는 방법의 다른 태양에서, 면역화된 숙주 동물이 제공되며, 이 동물은 본 발명의 항체를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 상기 동물은 인간이며, 항-IgG 절단 생성물은 프로테아제 절단 부위의 아미노 말단측에 있는, 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 인간 IgG 힌지 영역 서열로부터 선택되는 5개 이상의 연접 아미노산, 예를 들어 서열 번호 5-11의 서열 및 이의 N-말단 절단물로 이루어진 군으로부터 선택되는 절단 부위 펩티드 면역원의 투여에 의해 생성된다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 항-IgG 절단 생성물 검출용 키트가 제공되며, 이는 IgG 절단 프로테아제의 생성을 특징으로 하는 질환의 진단 또는 모니터링에서 사용하기 위한 본 발명의 항-IgG 절단 생성물 항체를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시 형태는 치료 방법으로서 환자에게 항-IgG 절단 특이적 항체를 투여하고 이럼으로써 프로테아제 분해를 가했던 치료적 항체 조성물에 이펙터(effector) 기능을 복구시키는 방법이다. 본 방법에 따르면, IgG 절단 생성물에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체를 투여함으로써 IgG 절단 생성물에 이펙터 기능을 복구시킨다.
본 발명의 다른 태양에서, 질환 특이적 프로테아제의 정교화를 특징으로 하는 질환을 앓고 있는 인간은, 서열 번호 1, 2, 3, 또는 4의 서열로부터 선택되는 인간 IgG 힌지 영역 서열의 5개 이상의 연접 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는; 그리고 프로테아제 절단 부위의 아미노(N) 말단측의 위치인 절단 부위 특이적 펩티드 면역원, 예를 들어 서열 번호 5-11의 서열 및 이의 N-말단 절단물, 상동체형 및 화학적 유사체형 종을 투여하여 그러한 환자에 있어서 IgG 절단 생성물의 이펙터 기능을 복구시킴으로써 치료될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 절단 부위 특이적 펩티드 면역원은 아미노산 Glu233 (EU 넘버링(numbering))로 종결되는 절단된 인간 IgG1에 대하여 N-말단인 펩티드 단편으로 대표되며, 질환은 글루타밀 엔도펩티다아제 I (GluV8)의 방출 또는 카텝신 G의 호중구에 의한 방출을 특징으로 하는 에스. 아우레우스(S. aureaus) 감염으로부터 선택된다. 다른 실시 형태에서, 절단 부위 특이적 펩티드 면역원은 아미노산 Pro232 (EU 넘버링)로 종결되는 절단된 인간 IgG1의 N-말단의 펩티드 단편으로 대표되며, 질환은 MMP-3, MMP-12의 방출을 특징으로 하는 인간 암의 형태를 특징으로 한다. 다른 실시 형태에서, 절단 부위 특이적 펩티드 면역원은 Gly236 (EU 넘버링)에서 종결되는, 스트렙토코커스 피오제네스의 IdeS에 의해 절단된 인간 IgG1에 대하여 N-말단인 펩티드 단편으로 대표되며, 질환은 스트렙토코커스 종 감염이다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 본 발명의 항-IgG 절단 생성물 항체 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.
<도 1>
도 1은 힌지에 대한 그들의 관계를 보여주는 전형적인 포유류 IgG 클래스 항체의 다양한 도메인들과, Fab, F(ab')2, 및 Fc로 정의된 펩신 및 파파인 절단 산물을 도시한다.
<도 2>
도 2는 힌지 영역 주위의 인간 IgG1 중쇄의 서열을 보여주며; 주요 단백질 분해 절단의 위치가 화살표로 표시된다.
<도 3>
도 3은 3가지 상이한 프로테아제, 즉 MMP-3, V8, 및 IdeS로부터 효소적으로 생성된 인간 IgG의 단편으로 면역화한 토끼에서 생성된 항혈청의 상대적인 특이성을 보여주는 그래프로서, 토끼는 MMP-3 절단 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7-14인 서열 TCPPCPAP; 글루타밀 엔도펩티다아제 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7-15인 서열 TCPPCPAPE; 및 IdeS 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7-18인 서열 TCPPCPAPELLG를 갖는 콘쥬게이션(conjugate)된 펩티드로 면역화하였다. 3가지의 개별 토끼 다클론 항-절단 부위 특이적 펩티드 항체 제제의 ELISA 반응성은 ScIgG 및 온전한 IgG뿐만 아니라 Mab3 IgG1κ의 F(ab')2 단편과 결합하는 이들의 능력에 대하여 시험되었다. F(ab')2 단편을 인간 재조합 MMP-3, 포도상구균 글루타밀 엔도펩티다아제 I 및 스트렙토코커스 피오제네스로부터의 재조합 IdeS로 생성하였다. 상기 항체 제제는 scIgG 및 F(ab1)2에의 결합을 보였지만, 온전한 IgG에의 결합은 보이지 않았다. 막대는 세 개의 반복(replicate) 웰들의 평균 + 표준 편차에 해당한다.
<도 4>
도 4는 항체 분해물을 이용한 토끼 다클론 항체 제제의 반응성을 보여주는 웨스턴(Western) 블롯으로서, 온전한 Mab3 인간 IgG1 또는 MMP-3, 글루타밀 엔도펩티다아제 (V8) 또는 IdeS로 부분적으로 분해된 Mab3 인간 IgG1을 SDS-PAGE로 분리한 후 면역블롯팅하였으며, 여기서 (A)는 항-인간 IgG (H+L) [레인 1-4] 또는 항…LLG 토끼 다클론 [레인 6-10]으로 블롯팅되었다. (B)는 항…PAP [레인 2-5] 또는 항…APE [레인7-10]로 블로팅되었다. 패널 A의 레인 5 및 패널 B의 레인 6까지 블롯을 절단한 후 항체를 이용하여 인큐베이션하여 개별 항혈청에 의한 검출을 허용하였다.
<도 5>
도 5는 5명의 RA 환자로부터의 윤활액에서의 IgG 분해 분석에 의해 샘플 상에서 RAH-1 시약을 이용하여 현상되고 MMP-3, 글루타밀 엔도펩티다아제 (V8) 및 IdeS를 이용한 단클론 IgG1의 시험관내 단백질분해 소화물로부터의 샘플과 비교한 웨스턴 블롯이다.
<도 6>
도 6은 정상 인간 혈청 샘플 군에서의 값과 비교한, 표시된 질환으로 진단된 환자들로부터의 인간 혈청 샘플에서 시약 RAH-1에 의해 검출된 scIgG의 개별 값들의 점 그래프이며 여기서 선은 각 군에서의 평균값을 나타낸다.
<도 7>
도 7은 펩티드 유사체로서 인간 IgG1 힌지로부터의 절단 단편 및 특정된 잔기(도 3 참고)에서 종결되는 항체 단편을 표적화하는 토끼 단클론 항체의 상대적 반응성을 보여준다.
<도 8>
도 8은 펩티드 유사체를 절단하도록 제조된 토끼 다클론(rb poly)과 비교한, IgG1을 IdeS로 분해하여 생성된 F(ab')2에 보체-의존성 세포 용해(CDC)를 복구시킴에 있어서 인간 IgG1 힌지의 절단 단편을 표적화하는 세 가지 상이한 토끼 단클론 항체의 농도 의존성을 보여준다.
<도 9>
도 9는 면역화 토끼 (파선)에 대하여 대조 토끼 (실선)에 스타필로코커스 아우레우스를 접종한 후 휘플볼(whiffle ball)에서의 SEM 및 평균 로그 콜로니 세균 카운트를 보여준다.
<도 10>
도 10은 대조 토끼 (실선) 및 면역화 토끼 (파선)를 보여주는, 스타필로코커스 아우레우스를 접종한 토끼에 있어서의 카플란 마이어(Kaplan Meier) 생존 플롯이다.
<도 11>
도 11은 인간 유방암종 세포(MDA-MB231)를 이식하고, 종양 표적화 Mab (860)만으로 처리되거나 (채워진 삼각형); 860의 프로테아제 처리된 제제, 860 scIgG로 처리되거나 (채워진 원); 항-힌지 항체 제제 2095-2로 처리되거나; 860 scIgG + 항-힌지 항체 제제 2095-2로 처리되거나; 또는 PBS로 처리된 (채워지지 않은 원) 생쥐의 5개의 군에 있어서 시간이 지남에 따른 종양 부피의 변화를 보여준다.
<도 12>
도 12는 개에 있어서 혈소판 카운트에 대한, 단독으로 그리고 항-절단 부위 mAb, 2095-2와 조합되어 투여된, 항-혈소판 인테그린 Mab (c7E3) 또는 상기 Mab의 단백질 분해적 절단 생성물의 순환 혈소판 수에 대한 영향을 보여주며, 여기서 각각의 점은 3마리의 동물에 대한 측정치의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 1은 힌지에 대한 그들의 관계를 보여주는 전형적인 포유류 IgG 클래스 항체의 다양한 도메인들과, Fab, F(ab')2, 및 Fc로 정의된 펩신 및 파파인 절단 산물을 도시한다.
<도 2>
도 2는 힌지 영역 주위의 인간 IgG1 중쇄의 서열을 보여주며; 주요 단백질 분해 절단의 위치가 화살표로 표시된다.
<도 3>
도 3은 3가지 상이한 프로테아제, 즉 MMP-3, V8, 및 IdeS로부터 효소적으로 생성된 인간 IgG의 단편으로 면역화한 토끼에서 생성된 항혈청의 상대적인 특이성을 보여주는 그래프로서, 토끼는 MMP-3 절단 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7-14인 서열 TCPPCPAP; 글루타밀 엔도펩티다아제 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7-15인 서열 TCPPCPAPE; 및 IdeS 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7-18인 서열 TCPPCPAPELLG를 갖는 콘쥬게이션(conjugate)된 펩티드로 면역화하였다. 3가지의 개별 토끼 다클론 항-절단 부위 특이적 펩티드 항체 제제의 ELISA 반응성은 ScIgG 및 온전한 IgG뿐만 아니라 Mab3 IgG1κ의 F(ab')2 단편과 결합하는 이들의 능력에 대하여 시험되었다. F(ab')2 단편을 인간 재조합 MMP-3, 포도상구균 글루타밀 엔도펩티다아제 I 및 스트렙토코커스 피오제네스로부터의 재조합 IdeS로 생성하였다. 상기 항체 제제는 scIgG 및 F(ab1)2에의 결합을 보였지만, 온전한 IgG에의 결합은 보이지 않았다. 막대는 세 개의 반복(replicate) 웰들의 평균 + 표준 편차에 해당한다.
<도 4>
도 4는 항체 분해물을 이용한 토끼 다클론 항체 제제의 반응성을 보여주는 웨스턴(Western) 블롯으로서, 온전한 Mab3 인간 IgG1 또는 MMP-3, 글루타밀 엔도펩티다아제 (V8) 또는 IdeS로 부분적으로 분해된 Mab3 인간 IgG1을 SDS-PAGE로 분리한 후 면역블롯팅하였으며, 여기서 (A)는 항-인간 IgG (H+L) [레인 1-4] 또는 항…LLG 토끼 다클론 [레인 6-10]으로 블롯팅되었다. (B)는 항…PAP [레인 2-5] 또는 항…APE [레인7-10]로 블로팅되었다. 패널 A의 레인 5 및 패널 B의 레인 6까지 블롯을 절단한 후 항체를 이용하여 인큐베이션하여 개별 항혈청에 의한 검출을 허용하였다.
<도 5>
도 5는 5명의 RA 환자로부터의 윤활액에서의 IgG 분해 분석에 의해 샘플 상에서 RAH-1 시약을 이용하여 현상되고 MMP-3, 글루타밀 엔도펩티다아제 (V8) 및 IdeS를 이용한 단클론 IgG1의 시험관내 단백질분해 소화물로부터의 샘플과 비교한 웨스턴 블롯이다.
<도 6>
도 6은 정상 인간 혈청 샘플 군에서의 값과 비교한, 표시된 질환으로 진단된 환자들로부터의 인간 혈청 샘플에서 시약 RAH-1에 의해 검출된 scIgG의 개별 값들의 점 그래프이며 여기서 선은 각 군에서의 평균값을 나타낸다.
<도 7>
도 7은 펩티드 유사체로서 인간 IgG1 힌지로부터의 절단 단편 및 특정된 잔기(도 3 참고)에서 종결되는 항체 단편을 표적화하는 토끼 단클론 항체의 상대적 반응성을 보여준다.
<도 8>
도 8은 펩티드 유사체를 절단하도록 제조된 토끼 다클론(rb poly)과 비교한, IgG1을 IdeS로 분해하여 생성된 F(ab')2에 보체-의존성 세포 용해(CDC)를 복구시킴에 있어서 인간 IgG1 힌지의 절단 단편을 표적화하는 세 가지 상이한 토끼 단클론 항체의 농도 의존성을 보여준다.
<도 9>
도 9는 면역화 토끼 (파선)에 대하여 대조 토끼 (실선)에 스타필로코커스 아우레우스를 접종한 후 휘플볼(whiffle ball)에서의 SEM 및 평균 로그 콜로니 세균 카운트를 보여준다.
<도 10>
도 10은 대조 토끼 (실선) 및 면역화 토끼 (파선)를 보여주는, 스타필로코커스 아우레우스를 접종한 토끼에 있어서의 카플란 마이어(Kaplan Meier) 생존 플롯이다.
<도 11>
도 11은 인간 유방암종 세포(MDA-MB231)를 이식하고, 종양 표적화 Mab (860)만으로 처리되거나 (채워진 삼각형); 860의 프로테아제 처리된 제제, 860 scIgG로 처리되거나 (채워진 원); 항-힌지 항체 제제 2095-2로 처리되거나; 860 scIgG + 항-힌지 항체 제제 2095-2로 처리되거나; 또는 PBS로 처리된 (채워지지 않은 원) 생쥐의 5개의 군에 있어서 시간이 지남에 따른 종양 부피의 변화를 보여준다.
<도 12>
도 12는 개에 있어서 혈소판 카운트에 대한, 단독으로 그리고 항-절단 부위 mAb, 2095-2와 조합되어 투여된, 항-혈소판 인테그린 Mab (c7E3) 또는 상기 Mab의 단백질 분해적 절단 생성물의 순환 혈소판 수에 대한 영향을 보여주며, 여기서 각각의 점은 3마리의 동물에 대한 측정치의 평균 ± SD를 나타낸다.
약어
Ab = 항체, ADCC = 항체-의존성 세포-매개 세포독성; CDC = 보체 유도된 세포독성; HNE = 인간 호중구 엘라스타아제; IdeS = 에스. 피로제네스의 면역글로불린 분해 효소; Ig = 면역글로불린; Mab = 단클론 항체; MMP = 매트릭스 메탈로프로테아제 또는 메탈로프로테이나아제; N-말단 = 아미노 말단; scIgG = 단일 절단 IgG; SA = 스트렙타비딘; GluV8 = 스타필로코커스 아우레우스 유래의 글루타밀 엔도펩티다아제 I.
정의
항체 단편; Fab, F(ab')2, 및 Fc는 IgG 항체의 단백질분해 절단 산물을 설명하는 용어이며 이들은 중쇄 사이(코어 힌지 영역)의 다이설파이드 결합의 환원에 의해 추가로 해리될 수 있다. 전통적인 단백질 분해에 의해 생성된 항체 단편은 하기를 포함한다: Fab (예를 들어, 파파인 분해에 의해), Fab' (예를 들어, 펩신 분해 및 부분적 환원에 의해) 및 F(ab')2 (예를 들어, 펩신 분해에 의해), facb (예를 들어, 플라스민 분해에 의해), pFc' (예를 들어, 펩신 또는 플라스민 분해에 의해), Fd (예를 들어, 펩신 분해, 부분적 환원 및 재응집에 의해)(여기서 환원은 사슬간 연결을 형성하는 시스테인 잔기 사이의 다이설파이드 결합을 제거한다(도 1 참고)). Fc 단편이 파파인 절단 단편으로 설명되었으며 파파인은 인간 IgG1을 잔기 224(EU 넘버링)에서 절단하며 이 잔기는 힌지에 대해 N-말단이므로, Fc 단편은 힌지 및 중쇄간의 다이설파이드 결합을 보유하는 것으로 가정되지만, 항체에서 중쇄 CH2-CH3 이량체 간의 고도의 회합으로 인하여, 이량체 구조는 다이설파이드 (힌지) 결합의 부재 하에서도 보유된다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "Fc"는 공유 결합되든지 그렇지 않든지 간에 중쇄 CH2-CH3 절편의 회합에 의해 형성된 이량체 구조를 말한다. 비공유적으로 회합된 Fc는 세제와 같은 변성제의 존재 하에서 CH2-CH3 단량체로 해리되는 그의 능력에 의해 다이설파이드 결합된 Fc로부터 구별될 수 있음이 이해될 것이다.
인간 항체는 기본 구조가 2개의 헤테로이량체의 이량체인 면역글로불린이며, 여기서 헤테로이량체들은 각각이 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드로 이루어진다.
용어 "단백질 분해", "프로테아제", "프로테이나아제" 및 "단백질 분해 효소"는 상호교환가능하게 사용되며, 폴리펩티드 사슬을 절단하여 둘 이상의 단편을 생산할 수 있는 약제, 예를 들어 효소를 의미하는데, 여기서 효소는 보통 온도 하에서 그리고 생리적 조건 또는 생리적으로 양립가능한 조건 하에서 작용한다. 생리적 조건은 건강한 상태이든지 병에 걸린 상태이든지 간에 살아있는 포유류의 신체에서 자연적으로 발견되는 임의의 온도, 완충물질, 양이온, 음이온, 기질, 촉매, pH, 보조인자 등을 포함한다. 그러나, 프로테아제는 임의의 유형의 생명 형태일 수 있는 병원체로부터와 같이 비-포유류 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로테아제는 펩티드 결합에 작용하는 하이드롤라아제이다.
"scIgG" 또는 "단일 절단 IgG"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로이량체 구조를 가진 임의의 면역글로불린 클래스 G 분자를 의미하며, 여기서 중쇄 중 하나는 단일 중쇄 상에서 단백질 분해적으로 절단된 한편 두 번째 중쇄는 온전하게 남아 있다.
N-말단 잔기로부터 C-말단 잔기로 씌어진 아미노산 서열과 관련하여 "상류(upstream)"는 주어진 잔기로부터 N-말단을 향한 서열 내 잔기를 의미한다. 역으로, 아미노산 서열과 관련하여 "하류(downstream)"는 주어진 잔기로부터 C-말단을 향한 서열 내 잔기를 의미한다.
하위구조(
substructure
)에 의한 항체 기능
일반적으로, 면역글로불린, 항체는 각각이 10 - 11 kDa이며 약 100개의 아미노산을 포함하는 연속적인 폴리펩티드 사슬의 영역들로 이루어지며, 이는 특징적으로 접힌 구형 도메인(globular domain)을 보여주며 상이한 요소들의 구조를 나타낸다. 면역감마글로불린에 있어서, 이는 약 150 kDa의 단백질인 항체(IgG)이며, 여기서 이들 도메인은 절편들로 함께 그룹화되고; Fab 절편은 중쇄 가변 영역과 인접한 중쇄 제1 불변 영역(CH1)에 다이설파이드 결합을 통해 연결된 단쇄 내의 경쇄 불변 영역에 연결된 경쇄 가변 영역으로 이루어지며; Fc는 힌지 영역에서 두 개 또는 세 개의 다이설파이드 결합을 통해 연결된 두 개의 인접한 중쇄 불변 영역(CH2 및 CH3)으로 이루어진다. 연구에 의하면 파파인 및 펩신과 같은 프로테아제가 당해 절편들 사이에 있는 부위에서 우선적으로 항체를 절단함이 밝혀졌다. 두 개의 동일한 Fab 절편이 힌지 영역을 통해 하나의 Fc 절편에 연결되고, 그에 따라 Y형 형태의 150 kDa 구조를 형성한다(도 1 참고). 파파인을 이용하여 생성된 Fab 절편은 전형적으로 46 kDa의 분자량을 가지며, 비-환원된 F(ab')2는 전형적으로 90-100 kDa의 분자량을 가지며, 글리코실화되지 않고 비-환원된 Fc는 약 50-60 kDa의 겉보기 분자량을 가질 것이다. 그러나, 각각의 항체 종, 및 종 내의 항체의 각 하위클래스는 약간 상이하므로, 절단의 정확한 성질 및 위치와 절단 생성물은 변화가 많다.
항원은 경쇄와 중쇄의 각 쌍의 가변성 도메인 내의 항원 결합 부위를 통해 항체에 결합한다(도 1). 이펙터 분자 또는 세포로 알려진 다른 분자는 분자의 나머지 내의 다른 부위, 즉, 항원 결합 부위 이외의 다른 부위에 결합하며, 항체의 이 부분은 보다 비가변성인 면역글로불린 서열인, 항체의 "불변 부분"을 포함하며, 그러한 부위는 특히 경쇄의 말단부를 넘어 연장하는 중쇄 부분, 즉 상부 힌지, 하부 힌지, CH2 및 CH3 도메인으로 구성되는 Fc 영역 내에 위치한다.
항체는 이펙터 분자의 결합에 의해 매개되는 몇몇 이펙터 기능을 가진다. 예를 들어, 보체의 C1 성분의 항체에의 결합은 보체 시스템을 활성화시킨다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌작용 및 용해(보체-매개 세포독성 또는 CDC로 불리는 과정)에서 중요하다. 보체의 활성화는 염증 응답을 촉진하며 또한 자가면역 과민성에 연루될 수 있다. 추가로, 항체는 Fc 영역을 통해 세포에 결합하며, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위가 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (에타 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)을 비롯한 상이한 항체 클래스에 대해 특이적인 많은 Fc 수용체가 있다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에의 항체의 결합은, 항체-코팅된 입자의 탐식(engulfment) 및 파괴, 면역 복합체의 제거(clearance), 킬러 세포(killer cell)에 의한 항체-코팅 표적 세포의 용해(항체-의존성 세포-매개 세포독성으로 불림, 보체 유도된 세포독성 또는 ADCC), 염증 매개체의 방출, 태반 통과(placental transfer) 및 내피 세포 재흡수 (신생 Fc 수용체 또는 FcRn)와 면역글로불린 생성의 조절을 비롯한 많은 중요하고 다양한 생물학적 응답을 트리거링(trigger)한다.
힌지 도메인 주위의 서열은 일반적으로 IgG 아이소타입들 (서열 번호 1-4) 사이에서 그리고 포유류 종들 사이에서 보존되어 있다. IgG1 (서열 번호 1) 및 IgG3 (서열 번호 1) 아이소타입은 Fcγ 수용체(들)에의 결합을 위한 그리고 Fc 이펙터 기능을 위한 구조적 모티프인 Leu-Leu 쌍을 포함한다. 전형적으로 두 개의 비-시스테인 잔기에 의해 분리된 적어도 하나의 시스테인을 포함하는 "힌지 코어"의 하류의 다른 잔기가 또한 보존되어 있다.
인간 IgG1의 단일 절단된 절단 생성물 또는 scIgG는 이전에 나타낸 바와 같이 헤테로이량체 분자의 전체 조성을 파괴하지 않고서 IgG를 포함하는 2개의 중쇄 폴리펩티드 중 하나에서 단백질 분해가 일어날 때 인간 및 세균 프로테아제에 의해 형성된다 (문헌[Gearing AJH et al, Immunol. Lett. 81: 41-48, 2002]; 문헌[Vincents et al, Biochemistry 43: 15540-15549, 2004]). scIgG는 다른 단편보다 더 풍부한, 혈청에서 발견되는 생체내 단백질 분해 생성물일 가능성이 있다.
생리적 조건 하에서 단백질 분해적 절단의 동역학에 의하면 F(ab')2와 같은 다중 절단 사건의 생성물인 종보다 더 큰 비율의, 단백질 분해적으로 절단된 IgG가 scIgG 형태로 된다 (도 1) (1008년 8월 4일자로 출원된 미국 특허 출원 제12/185,333호). 많은 프로테아제를 시험하는 과정에서, 온전한 IgG에서 중쇄 불변 영역의 첫 번째 절단이 두 번째보다 더 신속하게 진행되며, 이는 한 번 절단된 종의 일시적인 축적으로 귀결되는 것으로 결정되었다. 이러한 단일 절단 버전의 IgG 분자는 많은 방식(예를 들어 분자 크기, 항원 결합, 단백질 A/G에 의해 인식되는 능력)에서 그의 온전한 모분자와 구별될 수 없다.
F(ab')2 및 scIgG를 포함하는 단백질 분해적 절단 생성물의 특이적 결합이 가능한 항체는 본 발명의 절단 부위 유사체형 펩티드를 이용하여 생성하였으며, 이는 인간 IgG1 절단 생성물을 인식하지만 온전한 IgG는 인식하지 못한다. 본 출원과 공계류 중인 상기 특허 출원에는 항원 결합 특이성을 유지하는 IgG 절단 생성물을 특이적으로 인식하는 항체 제제가 선택될 수 있고 이는 CDC 및 ADCC와 같은 이펙터 기능을 절단 IgG에 복구시킬 수 있음이 추가로 개시되어 있다.
단백질 분해 효소 및 질환 관련성
본 출원인은 시험관내에서 효소 패널을 이용하여 생성된 것들과 크기가 유사한, scIgG를 비롯한 항체 절단 생성물이 류마티스 관절염을 가진 환자로부터의 윤활액과 같은 염증성 삼출물에서 검출가능함을 입증하였다. 추가로, scIgG는 국소화된 단백질분해 활성이 당해 병리학의 공지 특징인 많은 질환을 가진 환자들의 혈청에서 검출될 수 있다. 이들 질환 상태에서 scIgG는 건강한 정상 지원자에서보다 농도가 더 높으며 또한 덜 중증인 염증성 질환을 가진 환자들의 혈청에서보다 더 높다.
표 1은 인간 프로테아제 및 2가지의 세균 프로테아제가 인간 IgG1에 작용하는 것에 관한 발견을 요약한 것이다. 용어 "응고 프로테이나아제"는 FXIIa, FIXa, FXa, 트롬빈 및 활성화 단백질 C를 비롯한 혈청 응고 캐스케이드(cascade) 단백질을 말하며; 플라스민은 플라스미노겐 활성화 인자(activator), 즉 tPA, 스트렙토키나아제 및 스타필로키나아제와 함께 공동 인큐베이션된 플라스미노겐이었으며; "단독의 플라스미노겐 활성화 인자"는 플라스미노겐이 없는 것이며; MMP는 재료에서 상술된 바와 같이 전구효소 또는 활성 형태로 얻어지는 재조합 프로테이나아제였으며; "없음"은 24시간 후에 검출가능한 절단이 전혀 없음을 나타낸다. 표시된 곳을 제외하고는 모든 효소는 인간 효소였다. IgG1 항체 중쇄에 있어서 EU 넘버링 시스템에 대하여 잔기 표기를 하며, 여기서 서열 번호 1의 25개의 잔기는 완전한 성숙 중쇄의 잔기 219 내지 243에 해당한다.
scIgG를 포함하는 절단 IgG의 검출은 힌지 다이설파이드에서 또는 그 주위에서 절단 중쇄 내의 새로 노출된 에피토프에 특이적으로 결합하지만 온전한 비-절단 IgG 분자와는 반응하지 않는 친화성-정제된 다클론 항체(토끼)의 생성에 의해 달성되었다. 혈청 내의 scIgG의 검출의 확인은 온전한 IgG와 유사한 그의 연장된 순환 수명에 의해 지지된다. 병을 가진 개인의 체액 또는 혈액에서 scIgG를 검출하는 능력은 잠재적으로 신규한 바이오마커의 전략이다.
항체 제제
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 진단제, 예방제 또는 치료제로서 사용하기 위한 절단 부위 특이적 펩티드에 대하여 특이성을 갖는 항체는 본 발명의 실시에 유용한 항체를 초래하거나 또는 선발하기 위하여 본 명세서에 예시된 면역원, 방법 및 기준을 사용하여 당업계에 잘 알려진 몇몇 방식으로 제조될 수 있다.
일 태양에서, 항체는 관찰된 절단 단편 또는 그로부터 유도된 절단 부위 특이적 유사체형 펩티드로 동물을 면역화하여 제조된 하이브리도마로부터 편리하게 얻는다. 따라서, 항체는 F(ab')2 및 scIgG, 또는 이의 N-말단 절단물 또는 구조적 유사체를 비롯한 항체 절단 단편으로 동물을 면역화하거나 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 일 실시 형태에서, 항체 생성에 사용되는 펩티드는 서열 번호 5-11로 나타낸 IgG1의 14-머(14-mer) 펩티드 단편으로부터 선택되며, 여기서 상기 폴리펩티드 또는 펩티드의 C-말단 잔기는 잔기 절단 쌍들의, 표 1에 나타낸 절단 부위의 상류의 (N-말단측의) 잔기를 나타낸다. 힌지 모티프, 예를 들어 IgG1의 -T-C-P-P-C- (서열 번호 1의 잔기 7-11)를 포함하는 단편은, 시스테인 잔기(C)가 예를 들어 알라닌(A) 또는 세린(S) 잔기로 대체되고 이럼으로써 절단 펩티드의 화학적 상동체의 형태를 생성하는 것이 아니라면, 다이설파이드 결합 형성으로 인하여 다량체가 될 것이다.
특정 실시 형태에서, 항체는 MMP-3 절단 부위의 아미노 말단측 상의 아미노산의 서열에 해당하는 8-머 펩티드 (TCPPCPAP, 서열 번호 1의 잔기 7-14), 또는 글루타밀 엔도펩티다아제 부위에 해당하는 연장된 펩티드(TCPPCPAPE, 서열 번호 1의 잔기 7-15), 또는 IdeS 부위에 해당하는 연장된 펩티드(TCPPCPAPELLG, 서열 번호 1의 잔기 7-18)를 사용하여 생성된다. 면역원으로 사용될 때, 펩티드는 편리하게는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH) 또는 다른 캐리어 단백질, 예를 들어 혈청 알부민에, N-말단을 통하여 또는 부가된 링커 잔기 또는 펩티드를 통하여 공유적으로 부착될 수 있다.
따라서, 원하는 특이성을 갖는 항체는 당업계에 잘 알려진 하이브리도마 기술들 중 임의의 것을 사용하여 얻어질 수 있으며, 예를 들어 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참고하며, 이들 각각은 전체적으로 참고로 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 항체는 인간, 생쥐, 토끼, 쥐, 설치류, 영장류, 또는 임의의 그 조합과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 임의의 포유류를 포함하거나 이로부터 유래될 수 있으며, 단리된 인간, 영장류, 설치류, 포유류, 키메라, 인간화 및/또는 CDR-그래프팅된 항-인테그린 항체, 면역글로불린, 절단 생성물 및 다른 특정 부분 및 그 변이체를 포함한다.
파지-디스플레이된(Phage-displayed) 항체 또는 펩티드 라이브러리가 또한 scIgG 및 다른 항체 단편에 원하는 특이성을 가진 신규 결합 도메인을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 유용한 항체 또는 다른 결합체를 증대시키거나 선발함에 있어서, 이 목적을 위해 사용되는 특정 시약이 본 발명의 추가 태양이다. 본 목적을 위해 개발된 특정 면역원 또는 시험 시약은 도 3에 나타낸 바와 같이 잔기 SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFP (서열 번호 1)를 포함하지만 이에 한정되지 않는, IgG1의 힌지 코어 주위의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 한다. 단백질 분해 효소와 접촉시에 항체 단편을 생성하는 다른 인간 아이소타입 항체의 힌지 영역은 또한 효소적 절단 생성물에 대한 항체 또는 다른 결합 분자를 생성, 선발 또는 시험할 목적을 위해 유사체의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 인간 IgG4 중쇄의 유사 영역은 잔기 TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPSCPA PEFLGGPSVF LF (서열 번호 2)를 포함하며 IgG2 및 IgG3에 대해서는 각각 서열 번호 3 및 4에 나타낸 바와 같다. 각각의 경우, 펩티드는 프로테아제 절단 부위의 아미노 말단측에 있는, 서열 번호 1, 2, 3, 또는 4의 인간 IgG 힌지 영역 서열들로부터 선택되는 5개 이상의 연접 아미노산으로 이루어진다. 일 태양에서, 항체 생성을 위해 사용되는 특정 면역원 또는 펩티드는 잔기 -C-P-P-C-로 정의된, IgG1의 힌지 코어를 적어도 포함한다. 구체적 실시 형태에서, 당해 펩티드는 서열 TCPPCPAPELLG (서열 번호 1의 잔기 7-18)를 가진 인간 IgG1 하부 힌지 및 이웃한 CH2 도메인의 12-머 펩티드 유사체이다.
단백질 분해적 절단 생성물에 대한 항체 또는 다른 결합 분자를 생성, 선발 또는 시험하는 데 유용한 펩티드 단편을 생성하는 일반적 방법은 a) 표 1에 나타낸 바와 같은 특정 프로테아제로 예시되는 것과 같은 프로테아제에 의해 절단된 항체 중쇄의 잔기들 쌍의 N-말단 잔기를 확인하고, b) N-말단 잔기가 정의된 서열의 C-말단이 되는 그 절단 부위로부터 5-14 또는 그 이상의 상류의 잔기를 정의하고, c) 원하는 목적(들)에 충분한 양의 펩티드를 생성하는 것이다. 선택적으로, 임의의 시스테인 잔기는, 세린 또는 알라닌, 또는 반응성 측기가 존재하지 않거나 또는 반응성 측기가 비가역적으로 또는 가역적으로 차단된 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 개시된 것들과 같은 펩티드는 서열 번호 5-11 또는 이의 말단 절단물로부터 선택되는 것들이다. 펩티드는 결합을 시험할 목적을 위해, 또는 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 결합체를 선발하는 데 사용하기 위한 면역원 또는 패닝 표적으로서, 표지되거나, 콘쥬게이션되거나 또는 가교결합되거나 또는 다른 것과 또는 아쥬반트(adjuvant)와 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 일 태양에서, 적어도 하나의 특정 서열, 도메인, 부분 또는 그 변이체를 포함하는, 전술한 특정 펩티드 또는 그에 대한 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이 폴리뉴클레오티드에 상보적이거나, 이 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 본 발명에서 개시된 바와 같이 scIgG에 대해 특이성을 가진 적어도 하나의 단리된 단클론 항체를 코딩하는 단리된 핵산 및 이 단리된 핵산을 포함하는 핵산 벡터, 및/또는 이 단리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다. 선택적으로 숙주 세포는 적어도 이. 콜라이(E. Coli), COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 이들의 임의의 유도체, 불사화 또는 형질전환 세포로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한 본 발명의 적어도 하나의 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 시험관내, 생체내, 또는 원위치(in situ)의 조건 하에서 항체를 코딩하는 핵산을 번역시켜, 펩티드 또는 항체가 검출가능한 또는 회수가능한 양으로 발현되도록 하는 단계를 포함한다.
사용 방법
진단
IgG 절단 펩티드를 이용하여 제조된 항체는 단백질 분해 활성 및 단백질 분해 효소(프로테아제)에서 생기거나, 그를 야기하는 질환 병리학 또는 과정을 식별하거나 또는 확인하는 데 유용한 검출 시약으로서 사용될 수 있거나, 또는 달리 단백질 분해 활성 및 단백질 분해 효소(프로테아제)와 관련된다. 그러한 질환과 과정은 감염, 뇌졸중, 혈관 질환, 심근경색 및 몇몇 다른 급성 및 만성 염증성 질병을 촉발시키거나 악화시키거나, 이들 질환에 의해 생성되거나, 이들 질환에서 생기는 것들을 포함한다. 본 출원인은 단백질분해 활성의 특히 유용한 한 가지 바이오마커가 scIgG이며, 이것은 전술한 질병 중 일부에서 증가된 수준으로 검출됨을 입증하였다. scIgG는 병리학 또는 병리학적 과정 또는 감염의 부위에서 국소적으로 생성되므로, scIgG는 질환 부위에서 특정 조직 또는 세포 유형의 연루의 게이지로서 그러한 과정의 독특하고 특정한 마커를 제공한다.
본 발명의 방법의 일 실시 형태에서, 샘플은 프로테아제 수준 상승을 특징으로 하는 질환을 가진 것으로 의심되거나, 그 질환을 가졌거나, 또는 그 질환이 치료되었던 대상으로부터 얻어진다. 샘플은 질환에 의해 자극된 프로테아제와 혈청 IgG 집단 사이의 접촉에서 생기는 것으로 알려진 IgG 절단 단편에 대해 특이성을 가진, 항체 제제와 같은, 결합 약제와 접촉된다.
본 발명의 방법은 소정 질환 또는 상태로 이전에 진단된 환자가 질환의 진행 위험이 있는지(예를 들어, 암 전이, 공격적 종양 성장, 지속적 감염 등)를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 예를 들어, 암 환자에서, scIgG의 검출은 단백질분해 효소, 특히 MMP의 정교화를 포함하는 것으로 알려진 전이성 퍼짐을 포함하는 진전된 질환 진행을 나타내는 데 유용할 수 있다. 일부 태양에서, 신생물성 질환에서는 이들 기작이 일반적으로 염증 과정, 조직 복구, 및 치유와 공유된다(문헌[Coussens, L.M. and Werb, Z. 2002. Nature 420 (19): 860-867]). 다른 연구는 예를 들어, 지질 강하가 심장 및 혈관 사건, 예를 들어, 혈전증의 위험의 감소, 및 MMP-2 및 MMP-9와 같은 MMP의 감소 둘 모두와 상관이 있으며, 이들 효소는 동맥경화반(atherosclerotic plaque)에 의해 생성됨을 보여주었다(문헌[Deguchi, J, Maanori, A., Ching-Hsuan, T. et al. 2006 Circulation 114: 555-62]). 따라서, 본 발명의 방법은 특히 중증 관절염 증후군(RA, 강직성 척추염), 소정 암(특히 염증성 유방암), 중증 관상 동맥 세팅(coronary arterial setting)(심근 경색 및 울혈성 심부전) 및 천식과 같은 기타 질환을 가진 환자에게 적용가능하지만 이로 한정되지 않는다. 본 발명의 방법은 병리생리학이 분비된 프로테아제의 향상된 수준 상승을 특징으로 하지 않는 다른 병리학에 의해 IgG에 작용할 수 있는 프로테아제를 포함하거나 이 프로테아제를 유도하거나 또는 프로테아제가 IgG를 절단하지 않는 질환 및 상태를 구별하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명에서 개시된 시약을 사용하는 방법이 절단된 단편의 검출에 대해 특이적인 한편, 절단된 단편의 보다 특이적인 분석은 절단된 항체의 가변 영역의 결합 특이성의 분석을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 선택성과 단편화된 항체 검출을 조합하는 고체상 분석은 소정 항원 및 프로테아제가 대상에서 동시 국소화되는지를 결정하고 그럼으로써 단백질분해 활성 부위에서 조직, 질환, 또는 병리학의 성질에 관한 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
혈액 채취는 건강하거나 아픈 대상인 인간 또는 동물로부터의 조직 샘플링의 가장 빈번히 실시되는 형태이다. scIgG가 전신적으로 발견되며 형성 부위, 즉, 프로테아제 활성 부위로 제한되지 않는 한은, 그것은 특정 구획에 국소화될 수 있는 질환 활성에 대한 리포터 마커이다. 한 가지 그러한 구획이 윤활액이다. 따라서, 혈액 또는 혈청 수집물은 본 발명에 의해 제공되는 시약과 방법을 이용하여 초기 질환을 탐지하기 위한 편리하고 실현가능한 공급원을 제공한다. 대안적으로, RA 윤활액, 폐 삼출물, 생검체 등과 같은 국소적 세팅의 샘플링은 또한 진단을 포함하는 임의의 단계에서 환자에게 또는 진행된 질환을 가진 환자에서 적용될 수 있다. 절단된 항체 단편은 직접 염색(면역조직화학적 방법)에 의해 그러한 조직 샘플에서 또는 샘플로부터 유래된 분획화된 샘플에서 검출될 수 있다.
혈액을 비롯한 조직 샘플은 임의의 잔여 활성 프로테아제를 억제하도록 처리되어야 한다. 금속의 킬레이팅화(예를 들어 EDTA)는 효과적으로 MMP를 억제한다. 요오도아세트아미드는 시스테인 프로테아제(예를 들어 IdeS)를 차단하며, 세린 프로테아제는 DFP 및 유사한 화합물로 차단될 수 있다. 활성 프로테아제는 윤활액에 존재하며 그에 따라 처리되어야 한다. 샘플은 또한 분석 시간까지 동결된 채로 유지될 수 있다. 일단 샘플이 적절히 처리되면, 본 발명의 scIgG 특이적 시약은 당업자에게 공지되었거나 아직도 개발되어야 할, ELISA, 비드-기반 포맷, RIA와 같은 임의의 항체-기반 기술에서 이용될 수 있다.
본 발명의 항-IgG 단백질분해 절단 단편 시약은 연구 또는 진단 용도를 위해 그리고 완충액과 같은 다른 시약 및 온전한 인간 IgG 및 공지된 양의 절단된 IgG와 같은 표준물과 함께, 대상으로부터의 조직 샘플 수확물에서의 IgG 단백질분해 절단 단편의 측정 및 원할 경우 정량에 대한 설명서와 함께 상업적 판매를 위해, 키트로 패키징될 수 있다.
항체 치료법
힌지 펩티드 절단 단편에 대해 면역특이적인 본 발명의 항체는 항원 결합 도메인을 보유한 단백질 분해적 절단 IgG의 나머지, 예를 들어 Fab, F(ab')2, scIgG에 결합할 수 있으며, 따라서 온전한 Fc-영역을 제공함으로써 Fc-관련 결합 특징 및 수반되는 이펙터 기능을 회복시킨다. 따라서, 본 명세서에서 교시된 방법에 의해 생성되거나 생체내에서 단백질 분해적으로 생성된 항체 단편에 결합하는 특성을 가진 항체는 치료용 분자로서 유용할 수 있다. 본 발명의 항-IgG 절단 단편 항체는 환자 - 여기서, 질환은 IgG의 질환 유도된 단백질분해 절단을 특징으로 함 - 를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일 태양에서, 항-IgG 절단 단편 항체는 표적 특이적 결합 능력을 보유한 항체 단편에 이펙터 기능을 회복시키기 위해 사용될 수 있다.
인간 질환 또는 병상의 치료적 또는 예방적 치료용으로 의도된 항-IgG 절단 부위 항체는 본 발명의 펩티드를 면역원 또는 선발 시약으로 사용하여 본 명세서에 상기에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 절단된 힌지 단편에 특이적인 다른 결합 도메인은, 이 결합 도메인이 면역특이적 IgG 절단 생성물에 CDC 또는 ADCC와 같은 이펙터 기능을 복구시킬 수 있는 Fc-도메인과 관련되기만 한다면, 또한 사용될 수 있다. 물론, 변형되거나 또는 변이형인 Fc 서열이 일부 FcR-구동 상호작용을 향상시키고 다른 것을 약화시킬 목적으로 본 발명에 또한 포함된다. 변형된 Fc 영역은 예를 들어 미국 특허 제6737056호, 미국 특허 제7083784호, 미국 특허 제7317091호, 미국 특허 제7355008호, 미국 특허 제7364731호, 미국 특허 제7371826호, 미국 특허 제7632497호, 미국 특허 제7670600호, 미국 특허 공개 제20040002587A1호, 국제특허 공개 WO06105338A2호, 국제특허 공개 WO200905849호, 및 국제특허 공개 WO2009086320호에 교시되어 있다.
따라서, 프로테아제 절단된 IgG에 결합하고 이펙터 기능을 복구시킬 수 있는 Fc-융합 단백질 또는 항-IgG 절단 생성물 항체의 재조합 생성을 위한 핵산 서열, 벡터, 및 숙주 세포를 포함하는 본 발명이 제공된다.
백신 접종
항원 결합 도메인을 보유하는, 효소적으로 절단된 IgG의 나머지, 예를 들어 Fab, F(ab')2, scIgG에 결합하고, 따라서 기능성 Fc-영역의 제공에 의해 항체의 Fc-관련 결합 특성 및 수반되는 이펙터 기능을 복구시킬 수 있는, 절단 부위 특이적 단편에 대하여 면역특이적인 본 발명의 항체가 본 명세서에 개시된 바와 같이 절단 단편 펩티드를 이용한 면역화에 의해 대상에서 유도될 수 있다. 항-IgG 절단 생성물 항체는 숙주 동물을 프로테아제 절단 부위 특이적 펩티드 또는 단백질 분해적으로 절단된 IgG 단편으로 면역화하고, 항체를 그 동물의 혈청으로부터 회수함으로써 제조될 수 있다. 그러한 방법에 있어서, 면역화된 동물은 본 발명의 항체의 공급원인데, 진단 검사용 시약으로 사용되거나 또는 대안적으로는 치료적으로 사용될 항체가 당업계에서 설명되거나 또는 공지된 방법에 의해 그로부터 제조된다. 특정 실시 형태에서, 인간 대상은 프로테아제 절단 부위 특이적 펩티드 또는 단백질 분해적으로 절단된 IgG 단편으로 면역화되며, 항-IgG 절단 생성물이 생체내에서 생성된다. 일 실시 형태에서, 프로테아제 절단 부위 특이적 펩티드 면역원은 프로테아제 절단 부위의 아미노 말단측에 있는, 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 인간 IgG 힌지 영역 서열로부터 선택되는 5개 이상의 연접 아미노산, 예를 들어 서열 번호 5-11의 서열, 이의 N-말단 절단물 및 화학적 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
절단 부위 특이적 면역화 또는 "백신 접종 전략"의 이용은 IgG 내에서의 잔기 특이적 절단에 의해 형성되는 에피토프에 대한 절단 부위 특이적 항체의 특이성에만 한정되는, 프로테아제의 기원에 관계없이(즉, 단백질 분해적 풍부화 종양의 경우 숙주 기원에 관계없이 또는 세균 기원에 관계없이) IgG의 고유 Fc-도메인 기능의 보편적인 복구를 제공할 것이다. 개체는 더욱 넓은 스펙트럼의 항체 복구 능력을 위하여, 그렇게 원할 경우 하나 초과의 절단 부위 펩티드 또는 유사체형 펩티드로 백신 접종될 수 있다. 대안적으로, 환자는 절단 부위 특이적 항체 반응이 생성되도록 백신 접종되기 전에, 상기 백신 접종 동안, 또는 그 후 절단 부위 특이적 항체로 치료될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 개체는 주어진 질환 상태를 치료하도록 디자인된 표적화 항체 제제의 투여 전, 상기 투여와 함께, 또는 그 후 질환 특이적 절단 부위 특이적 펩티드 또는 유사체형 펩티드로 백신 접종되며, 여기서 표적화 항체의 활성은 이펙터 기능을 수반하고, 상기 항체는 하나 이상의 IgG 절단 프로테아제에 의해 절단된다. 이러한 방식으로, 표적화 항체의 이펙터 기능이 복구될 수 있으며, 항체 치료의 효과는 항체의 표적화 기능을 변경시키지 않으면서 향상되거나 또는 복구된다. 일 실시 형태에서, 대상에 있어서 치료되는 질환은 하나 이상의 IgG-절단 프로테아제의 정교화를 특징으로 한다 (표 1 참조).
백신 접종 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 특히 작은 항원, 또는 합텐, 및 선형 펩티드는, 이들의 복수가 또한 면역원일 수 있는 캐리어 분자, 예를 들어 키홀 림펫 헤마시아닌(KLH)에 콘쥬게이션될 때 면역원성이 더욱 커진다는 것이 공지되어 있다. 다수의 콘쥬게이션 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[G. T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, 1996]에 기재되어 있다. 간략하게는, 캐리어에의 합텐의 콘쥬게이션은 일반적으로 링커, 또는 더욱 적절하게는 크로스-링커(cross-linker)에 의해 초래되는데, 상기 링커는 양 말단에 반응성 작용기를 보유하는 다양한 길이의 선형 분자들로 이루어진다. 동종이작용성(homobifunctional) 링커(즉, 글루타르알데하이드)에 있어서, 상기 2개의 작용기는 동일하며; 이종이작용성(heterobifunctional) 링커에 있어서, 이들은 상이하다. 상술된 콘쥬게이션 화학은 잘 알려져 있다. 표적화 IgG 절단 단편이 면역글로불린의 N-말단 부분과 관련된 항원 특이적 결합 도메인(가변 영역, CH1, 및 일부의 경우 코어 힌지 도메인의 일부)을 보유할 때, 항체 반응은 절단 부위에서 새로운 C-말단을 나타내는 유사체형 펩티드의 부분에 대하여 유도되어야 한다. 따라서, 유사체형 펩티드의 N-말단을 콘쥬게이션시키고 자유 C-말단 잔기를 면역원으로 제시하는 것이 바람직하다.
백신 접종 방법에서, 아쥬반트 (예를 들어, 알루미늄 함유 아쥬반트(명반), 불완전 프로인트 아쥬반트(Incomplete Freund's Adjuvant; IFA), 완전 프로인트 아쥬반트(Complete Freund's Adjuvant; CFA))를 비콘쥬게이션된 또는 콘쥬게이션된 힌지 영역 유사체형 펩티드와 함께 사용하여 면역 반응을 유도하여 항체(체액성 또는 Th2-구동성)를 생성하고 절단 부위 특이적 단편에 대하여 결합 도메인을 유도할 수 있다. CD40 작동제, 예를 들어 천연 리간드 gp39를 사용하여 면역 반응을 촉진할 수 있다. 바람직하게는 항원 제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포 상의 CD40 수용체를 활성화시키는 CD40 작동제가 일례이다.
인간 백신
안전하고 유효한 인간 백신 제제가 개발되었다. 재조합 단백질 기반의 백신의 면역원성을 향상시키기 위하여, 아쥬반트가 필요하다. 가장 널리 이용되는 아쥬반트는 일반적으로 명반으로 불리는 불용성 알루미늄 염, 예를 들어 뵘석 및 알루미늄 하이드록시포스페이트이다. 명반 아쥬반트는 주로 Th2-타입 사이토카인 반응을 유발한다 (문헌[Lindblad, 2004] ; 문헌[Raz & Spiegelberg, 1999]; 문헌[Valensi et al., 1994]). 따라서, 대안적인 아쥬반트가 펩티드 백신의 성공적인 개발에 필요할 수 있다.
중합체성 미세입자 캡슐화된 항원이 백신 아쥬반트로서 평가되었다 (문헌[Eyles et al., 2003J Drug Target 11, 509-514]; 문헌[Singh et al., 2004 Expert Opin Biol Ther 4, 483-491]). 폴리(DL-락티드 코-글리콜라이드; PLG)로 형성된 미세입자가 당업계에 잘 알려져 있다.
다양한 수중유 에멀젼이 명반에 대한 대안적인 아쥬반트로서 또한 개발되었다. 이들 중 가장 진보된 것은 스쿠알렌 수중유 에멀젼(MF59)이며, 이는 허용가능한 안전성 프로파일을 갖는 효능이 강한 아쥬반트이다. 플루아드(Fluad)로 불리는 인플루엔자 백신 생성물은 MF59를 포함한다. 명반과 같이, MF59는 생체내에서 수지상 세포에 의한 항원 흡수를 촉진할 수 있다. 더욱이, 근육내 주사(i.m. injection) 후, MF59는 림프절로 이동하는 APC에 의해 내재화됨이 밝혀졌다. 항원 전달을 촉진하는 것 외에, MF59는 또한 국소적 전염증성 아쥬반트로서 작용할 수 있으며, 그 이유는 이것이 근육내 주사 후 혈액 단핵 세포의 유입을 촉진하는 것으로 관찰되었기 때문이다.
명반, MF59, 또는 미세입자와 조합되어 사용될 수 있는 다른 분자는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 백신에 대한 Th1-타입 반응을 향상시키는 CpG, GM-CSF, 및 IL-2.
아쥬반트가 혼합되거나 또는 혼합되지 않은 준비된 면역원 또는 "백신"은 피내, 피하, 비강내, 및 근육내와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 경로에 의해 대상에게 투여될 수 있다.
다양한 프로토콜이 백신 접종에 이용될 수 있다. 본 발명의 일 태양으로 고려되는 하나의 프로토콜은 프라임-부스트(prime-boost) 프로토콜이며, 여기서 원하는 면역원을 포함하는 제1 백신 조성물, 프라임 백신 조성물은 프라임 백신 조성물의 면역원과는 형태 면에서 상이한 상응하는 면역원을 포함하는 부스트 백신 조성물과 함께 투여된다. 부스트 백신 조성물은 프라임 백신 조성물과 동일한 시점에 투여될 수 있거나 또는 이것은 프라임 백신 조성물의 처음 투여 후 어떤 시점에 투여될 수 있다. 프라임 및 부스트 백신 조성물은 동일한 경로를 통하여 투여될 수 있거나 또는 상기 조성물들은 상이한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 프라임 및 부스트 백신 조성물이 동일한 시점에 투여될 경우, 상기 조성물들은 동일 제형의 일부로서 또는 상이한 제형으로서 투여될 수 있다. 프라임 백신 조성물 및 부스트 백신 조성물 둘 모두는 1회 또는 수회 투여될 수 있다. 따라서, 프라임 백신 조성물의 일부 용량은 소정 용량의 부스트 백신의 투여 후 투여될 수 있다. 이러한 백신 투여 경로 및 다른 공지되거나 또는 아직 발견되지 않은 상기 경로의 변형과, 백신 투여 타이밍을 이용하여 백신 접종 프로토콜을 최적화하는 것은 당업자의 기술 이내이다.
본 발명을 일반적으로 설명하였지만, 본 발명의 실시 형태가 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이다.
실시예
1: 펩티드 면역원을 사용한 면역글로불린 절단 부위 특이적 항체 제제의 유도
내인성 프로테아제에 의해 생성된 숙주 (환자) 항체 단편의 존재의 결정은 절단된 IgG에 선택적으로 결합하지만 온전한 IgG에는 결합하지 않는 시약을 필요로 한다. 절단된 성분의 확인과, 정상 집단에 비교할 때 질환을 가진 환자로부터의 샘플들에서의 단편 함량 사이의 정량적 차이는 시약을 이용하여 평가될 수 있어야 한다.
미지의, 그러나 소량일 가능성이 있는, 상대적으로 고농도의 온전한 IgG를 함유한 용액 중의 IgG 단편을 검출하기는 어렵다. scIgG가 가능한 IgG 절단 단편으로 주목되었지만 (상기 문헌[Gearing 2002]), 인간 샘플에서의 정량화는 이전에 실시되지 않았다. 이 목적을 위하여, 온전한 IgG가 아닌 절단된 IgG에 대해 고도의 특이성을 가진, 필요한 특이성을 가진 시약을 토끼에서 생성시켰다.
3개의 콘쥬게이션된 그리고 점진적으로 더 긴, 인간 IgG1 힌지의 단쇄 펩티드 유사체를 면역화를 위해 사용하였다(인비트로겐 코포레이션에서). MMP-3 절단 부위의 아미노 말단 측 상의 아미노산 서열에 해당하는 8-머 펩티드를 N-말단을 통해 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 공유 결합에 의해 부착시켰다(TCPPCPAP, 서열 번호 1의 잔기 7-14). 글루타밀 엔도펩티다아제 부위에 해당하는 연장된 펩티드(TCPPCPAPE, 서열 번호 1의 잔기 7-15) 및 IdeS 부위 (TCPPCPAPELLG, 서열 번호 1의 잔기 7-18)를 면역원으로서 개별적으로 준비하였다. 뉴질랜드 토끼(면역원 당 2마리)를, 완전 프로인트 아쥬반트 중의 0.2 ㎎의 콘쥬게이션된 펩티드를 피하 주사하여 면역화하고 14, 42 및 56일에 불완전 프로인트 아쥬반트 중의 0.1 ㎎ 항원으로 세 번 더 재부스팅(reboost)하였다. 혈청을 4, 8 및 10주에 수집하고 항체 정제를 위하여 면역원마다 풀링하였다. 면역 역가(immune titer)는 고체상 항원 펩티드에 기반한 ELISA에 의해 모니터링하였다.
항체의 친화성 정제는 활성화된 지지체 상에 고정된 각각의 펩티드 항원을 이용하였다. 동일 항원으로 면역화된 두 토끼로부터의 항혈청을 풀링하고 항원 컬럼에 통과시킨 후 컬럼을 철저하게 세척하였다. 특이적 항체를 각각 3M KSCN 및 0.1M 글리신, pH 2.5를 이용하여 저 친화성 및 고 친화성 풀로 용출시켰다. 두 풀은 구별할 수 없는 결합 특징을 생성하였으며 이는 상호교환가능하게 사용하고/하거나 풀링하였다. 다음, 결합된 항체의 세 가지 별도 용출 풀을 두 번째 친화성 흡착 단계 - 이번에는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역(Mab3)을 포함하는 온전한 항체를 함유한 컬럼 상에서 - 에 처하였다. 두 번째 친화성 크로마토그래피 단계의 목적은 온전한 IgG를 인식할 수 있는 바람직하지 못한 항체를 제거하는 것이었다. 그러나, IgG 컬럼에 토끼 항체가 거의 또는 전혀 흡착되지 않았으며, 이는 항체 집단이 노출된 카르복시 말단을 가진 "절단된" 서열에만 반응성임을 시사하는 것이다.
개별적인 친화성-정제된 토끼 항-펩티드 항체를 ELISA에 의해 그들이 인간 IgG의 효소적으로 생성된 단편 및 온전한 IgG에 결합하는 능력에 대해 시험하였다 (도 3). 서열 번호 1의 잔기 7-14에 콘쥬게이션된 KLH (MMP-3 부위 유사체)로 면역화된 토끼로부터의 정제된 항체는 온전한 IgG에 결합하지 않았으며 MMP-3으로 IgG를 분해하여 생성된 scIgG 및 F(ab')2에 대해 매우 특이적이었다. 이 항체 제제는 V8 프로테아제 또는 IdeS를 이용하여 생성된 scIgG 및 F(ab')2에 대해 최소의 반응성을 나타냈다. 대조적으로, V8-절단 부위 힌지 펩티드 유사체(서열 번호 1의 잔기 7-15) 및 IdeS-절단 부위 힌지 펩티드 유사체(서열 번호 1의 잔기 7-18)로 면역화된 토끼로부터 얻은 항체는 이들 두 효소 중 어느 하나에 의해 생성된 scIgG 및 F(ab')2에 대해 교차반응성 결합 프로파일을 나타냈다. 그러나, 이들 제제는 MMP-3 분해된 생성물에 대해 최소의 반응성을 나타냈다. 온전한 IgG에 결합한 항체 제제 중 어느 것도 그리고 항체 제제 중 어느 것도 도 4에 나타낸 바와 같이 세 가지 상이한 효소에 의해 생성된 F(ab')2 및 scIgG를 비롯한 단편들과 비견될만한 반응성을 갖지 않았다.
항-힌지 시약의 의도한 용도는 질환 특이적 조직에 존재하는 효소에 의해 생체내 배경에서 복합적으로 생성되거나 또는 질환 특이적 세포 유형 또는 세포 집단, 예를 들어, 침윤성 대식세포 또는 호중구에 의해 생성되는 scIgG 및 F(ab')2 (및 다른 잠재적 단편)의 검출이다. 잠재적인 IgG 단편의 적절한 커버를 위하여, 절단 부위 인식의 프로파일이 가능한 넓은 것이 바람직하게 생각되었다. 이러한 이유로, 세 가지 토끼 항체 풀의 각각의 혼합물을 후속 웨스턴 블롯팅 및 혈청-기반 ELISA 시험에 사용하기 위해 각 성분 0.33 ㎎/mL(전체 = 1 ㎎/mL)로 제조하였다. 풀링된 이 시약을 RAH-1로 칭한다.
다른 염증성 유체인, 류마티스 관절염(RA)을 가진 환자의 윤활액에서 IgG 단편을 검출하는 능력에 대해 RAH-1 시약을 시험하였다. RA 환자 유래의 윤활액 샘플들을 상업적으로 구매하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, RAH-1 제제는 온전한 IgG와 반응하지 않았으나, 모든 3가지의 프로테아제 분해물로부터 scIgG, F(ab')2 가능하게는 Fab'를 검출하였다. RA 환자로부터의 모든 5개의 윤활액 샘플에 대해, 대략적인 scIgG, F(ab')2 및 Fab'의 크기에서 밴드가 검출되었으며, 이는 RA를 가진 개인으로부터의 윤활액 내에 이들 단백질분해 단편이 존재함을 시사한다.
류마티스 관절염(RA)을 가진 10명의 대상 및 10명의 연령- 및 성별-매치되는 건강한 개인으로부터의 혈청 샘플을 제노믹스 콜래보러티브로부터 입수하였다. ELISA 결과는 RA를 가진 10명의 대상 중 4명이 >60 ㎍/mL의 혈청중 scIgG 농도를 드러냄을 나타냈다. 건강한 대조군에서는, scIgG 농도는 <8.2 ㎍/mL 내지 52.7 ㎍/mL 범위였다. 이 비교를 위한 샘플은 병기, 치료 요법 등에 대해 엄격하게 선택되지 않았지만, 이들 상업적 샘플에서의 본 발명의 분석은 상승된 scIgG 농도가 질환을 가진 환자에서 검출될 수 있음을 시사한다.
다른 시험에서, 질환을 가진 개인으로부터의 혈청의 상업적 공급원은 제노믹스 콜래보러티브(Genomics Collaborative) (지금은 세라케어 라이프 사이언시즈 인크.(SeraCare Life Sciences Inc.))로 확인되었다. 각각의 8가지 질환 내의 10명의 상이한 개인으로부터의 적은 부피의 혈청(300 마이크로리터)을 구매하였다. 질환 카테고리는 류마티스 관절염, 골관절염, 천식, 제1형 당뇨병, 유방암, 폐암, 심근경색, 및 울혈성 심부전이었다. 또한, 28명의 연령-매치되고 성별-매치되는 정상의 건강한 지원자로부터의 혈청을 대조군으로서 이 공급자로부터 입수하였다.
ELISA 포맷 분석법을 이용하여 샘플들을 분석하고, 그 결과를 도 6에 나타냈다. RAH-1 시약의 선택성에 기초하여, 분석은 공지의 특이적 프로테아제에 의해 생성된 것들과 비견되는 IgG 절단 생성물이 명확히 검출가능하며 염증성 자가면역 질환인 류마티스 관절염에 대한 건강한 또는 정상 공여체에서 유지된 수준보다 높음을 입증하였다. 대조적으로, 골관절염을 가진 환자는 정상 개인의 샘플의 수준과 유사하며 그 범위 내인 수준을 나타냈다.
실시예
2: 항-
힌지
IgG
단클론
항체의 제조
제조 및 인간 환자에서의 잠재적인 사용을 위해, 절단된 IgG에는 결합하지만 온전한 IgG에는 결합하지 않는 단클론 항체와 같은 규정된 분자를 생성하는 것이 바람직할 것이다. 하기 절차는 그러한 분자를 생성하는 방법을 나타낸다.
인간 IgG1 하부 힌지 영역 및 인접 CH2 도메인의 하기 12-머 펩티드 유사체가 면역원이었다: 인간 IgG1의 IdeS 절단 부위의 펩티드 유사체인 TCPPCPAPELLG (서열 번호 1의 잔기 7-18). 자연 발생 시스테인을 알라닌으로 대체하여 변이체 TAPPAPAPELLG를 얻었다 (서열 번호 12). N-말단 시스테인을 부가하여 자유 설프하이드릴에 대한 반응을 위한 표준적인 화학적 방법에 의해 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에의 콘쥬게이션을 가능하게 하였다.
뉴질랜드 흰 토끼(3)를 다수의 피하 부위(5)를 이용하여 완전 프로인트 아쥬반트 중의 0.5 ㎎ KLH 펩티드로 면역화시켰다. 동물을 총 4번의 추가 면역화를 위해 3주 간격으로 불완전 프로인트 아쥬반트 중의 0.25 ㎎ 면역원으로 부스팅하였다.
샘플 펩티드의 BSA-콘쥬게이션된 버전에 대한 혈청 항체 역가를 표준 ELISA 방법에 의해 면역화 과정 동안 모니터링하였다. 동물 (2마리)을 역가 데이터에 기초하여 비장절제술을 위하여 선택하였다. 토끼 하이브리도마는 토끼 융합 파트너 세포와 융합된 비장-유래 림프구로부터 생성하였다 (문헌[Spieker-Polet, 1995 PNAS USA 92(20):9348 - 9352]). 다중 플레이트에서의 융합 후 2-3주에 세포 성장을 조사하였다.
양성 하이브리도마를 BSA-면역원 펩티드 콘쥬게이트로 코팅된 플레이트에서의 ELISA를 통해 스크리닝하였다. 각 융합체로부터의 다수의 양성 클론이 확인되었다. 추가 스크리닝은 온전한 IgG1 및 IgG1의 효소적으로 생성된 다양한 F(ab')2 단편에의 결합을 포함하였다. 이들 스크리닝 및 대조-스크리닝 전략으로부터, 면역원 펩티드에의 그리고 F(ab')2 단편에의 결합의 강한 선택성에 기초하여 3개의 클론(33-2, 91-2, 및 68-6으로 표기)을 선발하였으며, 이때 C-말단은 면역원 펩티드의 C-말단 또는 그 근처였으며 온전한 IgG1에는 최소로 결합되었다. 양성 하이브리도마를 서브클로닝하고 확장시켰다.
토끼 IgG를 고정된 단백질 A에서의 크로마토그래피를 비롯한 표준 방법에 의해 개별 세포 상청액으로부터 정제하였다. 인간 IgG1 힌지 영역의 펩티드 유사체, 및 온전한 IgG와, IdeS 및 MMP-3 효소를 이용하여 단일 또는 이중 절단된 Mab를 이용하여 생성된 정제된 IgG 단편(F(ab')2)에의 결합에 대한 정제된 토끼 IgG의 특이성을 표준 ELISA 프로토콜에서 시험하였다. 요약하면, 표준 펩티드 화학에 의해 합성되고 N-말단에서 바이오티닐화된 펩티드를 스트렙타비딘-코팅된 웰에서 포획하였다. 10 ㎍/mL의 IgG 및 단편들로 직접 코팅하였다. 토끼 mAb의 결합은 잘 특성화된 염소 항-토끼 IgG Fc-서양고추냉이 퍼옥시다아제 및 OPD 기질 시스템에 의해 검출하였다.
토끼 mAb 91-2에 대한 ELISA 결과를 도 7에 나타낸다. 서열 번호 1의 잔기 16-23(L-L-G-G-P-S-V-F) 중 임의의 것에서 종결되는 하부 힌지 펩티드에 대한 결합의 명확한 선택성이 있었다. 서열 번호 1의 3-15(D-K-T-H-T-C-P-P-C-P-A-P-E) 에 포함되는 상부 힌지, 코어 힌지 또는 초기 하부 힌지의 절편들에 해당하는 상류 잔기들 중 임의의 것에서 종결되는 펩티드들에의 결합은 거의 또는 전혀 없다. MMP-3 생성 F(ab')2 단편 및 scIgG 단편에의 결합은 무시할 정도였다(서열 번호 1의 잔기 14와 잔기 15 사이의 MMP-3 절단 부위의 펩티드 유사체 (P-A-P로 끝남)에의 결합 부족과 일치). 대조적으로, C-말단 서열(-P-A-P-E-L-L-G)을 반드시 가질 Ides-생성 F(ab')2 단편 및 scIgG에는 상당한 결합이 있었다. 따라서, 토끼 mAb 결합 특이성은 그것이 유도된 면역원에 잘 부합하였다. 직접 코팅된 rb (토끼) IgG가 양성 대조군이었다.
보체 분석
CD20 (ATCC CRL-8885)을 발현하는 림프아구양 B-세포주인 WIL2-S 세포를 CDC 분석을 위한 표적 세포로 사용하였다. 50 μl의 세포를 RPMI, 5% 열-불활성화 FBS, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산나트륨, 페니실린 (500 U/ml), 스트렙토마이신 (500 U/ml), 2 mM L-글루타민 중에서 8 × 104세포/웰의 최종 농도를 위해 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 추가의 50 μl를 다양한 농도의 항체를 포함하는 또는 항체를 포함하지 않는 웰에 첨가하였으며 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 50 μl의 10% 토끼 보체(인비트로겐)를 웰에 첨가하고 플레이트를 20분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 모든 샘플을 삼중으로 실시하였다. 플레이트를 3분 동안 200 g에서 원심분리하고 50 μl의 상청액을 제거하여 플레이트를 분리하고 락테이트 데하이드로게나아제(lactate dehydrogenase; LDH) 세포독성 검출 키트(로쉐)로 CDC를 측정하였다. 스펙트라(Spectra) 맥스 플러스(max Plus) 384 (퍼킨엘머(PerkinElmer))를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 데이터를 트리톤(Triton) X-100 (시그마 알드리치)을 이용하여 최대 세포독성에 대하여 정상화시키고 단지 세포 및 보체 단독을 함유한 최소 대조군에 대하여 정상화시켰다.
도 8은 3가지의 토끼 절단 부위 특이적 mAb가 CD20에 결합하는 항체의 F(ab')2 단편의 고정 농도의 존재 하에서 적정될 때 표적 세포에 보체 의존성 세포 용해를 복구시킬 수 있었음을 보여준다. 토끼 mAb가 보다 효과적이었으며, 다클론 토끼 절단 부위 특이적 mAb 제제 (앞서 설명된 혈청 scIgG를 위한 동일한 검출 시스템의 성분)보다 낮은 농도에서 그러하였다. CD20에 대한 온전한 항체가 예상대로 활성을 가졌으나, 그것의 F(ab')2 단편 및 scIgG 버전은 단독으로는 활성을 갖지 않았다. 토끼 절단 부위 특이적 mAb는 세포-결합 F(ab')2 단편의 부재 하에서 세포 용해를 유도할 수 없었다. 이들 결과는 단클론 절단 부위 특이적 항체가 다르게는 불활성인 IgG1 단백질 분해 절단 생성물에 대해 보체-매개 이펙터 기능을 재구성시킬 수 있음을 확립한다.
인간 시스템에 있어서 이펙터 기능의 복구를 시험하기 위하여, Mab 91-2의 토끼 항체 가변 도메인을 클로닝하고, 인간 불변 도메인에 융합시키고, HEK293 세포에서 발현시켰다. 생성된 토끼-키메라 Mab를 2095-2로 표기하였다. 항체 특이성을 ELISA 포맷으로 절단 부위 펩티드에 결합시킴으로써 또한 시험하였으며, 최고 친화성은 -P-A-P-E-L-L-G로 종결되는 펩티드에 대한 것임을 확인하였다.
표면 플라스몬 공명 플랫폼 (바이아코어(Biacore))을 이용하여 2095-2 항체의 Fab 단편을 이용하여 결합 특이성을 추가로 조사하였다. 요약하면, 표준 NHS/EDC 커플링을 이용하여 3가지의 상이한 표면 밀도 (8500, 1650, 및 350 RU)로 바이아코어 2000 내의 CM5 센서 칩에 Fab를 고정시켰다. 러닝 완충액(running buffer)은 pH 7.4의 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 및 0.01% 트윈(Tween)-20을 함유하였다. 데이터를 25℃에서 수집하였다.
하기의 3가지의 N-말단 바이오티닐화 펩티드를 고정된 Fab에의 결합에 대하여 시험하였다: 스트렙토코커스 피오제네스 IdeS 프로테아제에 의한 절단 후 인간 IgG1 절단 부위로부터의 펩티드 단편의 예상되는 서열을 나타내는 WT; C-말단의 상류의 아미노산 잔기의 4개의 위치에서 단일 알라닌 치환을 갖는 변이체를 나타내는 E233A; 및 C-말단으로부터 상류의 아미노산 잔기의 3개의 위치에서 단일 알라닌 치환을 갖는 변이체인 L234A. 상기 펩티드들은 시스테인을 세린으로 치환하여 상기 펩티드가 커플링 화학과 양립가능해지게 하고 단량체 구조가 보존되게 함으로써 변형시켰다.
야생형 및 E233A 펩티드를 각각 최고 농도로서 588 nM 및 2.9 uM를 이용하여 3배 희석 시리즈로 시험하였다. L234A 펩티드를 최고 농도로서 14.7 uM에서 2배 희석 시리즈로 시험하였다. 각각의 펩티드 농도 시리즈를 3가지의 상이한 밀도의 Fab의 표면 위에서 삼중으로 시험하였다. 회합 및 해리를 1분 동안 모니터링하였다. 1/500으로 희석시킨 인산의 12초간 주입에 의해 표면들을 재생시켰다. 각각의 표면으로부터의 응답 데이터를 전체적으로 피팅시켜 하기 표에 요약된 결합 상수들을 결정하였다. 각각의 펩티드 상호 작용은 단순한 1:1 (랭뮤어(Langmuir)) 모델에 매우 잘 피팅된다.
회합 속도들(M-1s-1 단위의 k a)은 10배 미만만큼 변하였지만, 해리 상수들(s-1 단위의 k d)은 200배 초과만큼 변하였다. 상기 3가지 펩티드에 있어서 nM 단위의 계산된 KD를 하기에 나타낸다 (표 2).
이들 결과는, 단클론 항체 2095-2가, 인간 IgG1의 N-말단 (상류) 서열로부터의 IdeS 절단 부위 펩티드의 유사체인 그리고 시스테인 잔기들의 제거로 인하여 단량체 형태로 존재하는, 사용한 면역원에의 결합에 고도로 특이적임을 나타낸다.
실시예
3: 절단 부위 특이적 항체의
생체내
모델
생체내에서 절단 부위 특이적 항체가 절단 IgG를 구출하는 능력을 시험하기 위하여, "조직 케이지"를 이용하는 세균 감염 모델 (문헌[Fernandez JA, et. al. (1997) Antimicrob. Agents Chemother. 43(3):667-671])을 채용하였다. 이 시스템에서, 휘플볼을 등쪽 경부 영역 내에 수술에 의해 피하 이식한다. 상기 모델은 용이하게 접근가능한 유체 구획, 조직 소낭(tissue pouch) 내에 감염체(infectious agent)가 위치화되게 하며, 이는 세균에 대한 항생제의 효능의 평가에 사용되어 왔다.
본 시스템에 있어서, 토끼 유체 휘플볼은 토끼 혈청에서 보고된 5-10 ㎎/ml의 IgG와는 대조적으로 대략 1.5 ㎎/ml의 IgG를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 우리의 가정은, GluV8-발현 세균 에스. 아우레우스를 토끼에 감염시키면 휘플볼 내에서 토끼 IgG가 절단된다는 것이다. 더욱이, GluV8-절단 IgG 절단 부위 특이적 펩티드 유사체를 이용한 토끼의 백신 접종은 에스. 아우레우스에 대한 보호 척도를 제공할 강건한 절단 부위 특이적 역가로 이어질 것이다.
토끼 절단 부위 특이적 항체가 에스. 아우레우스 감염에 대하여 어느 정도의 보호를 제공할 수 있음을 입증하는 데 있어서 상기 모델이 양성 결과를 제공하기 위해서는 4가지 인자가 작동하고 있어야 한다. 첫째, GluV8은 토끼 IgG를 절단할 수 있어야 한다. 둘째, 토끼들은 에스. 아우레우스 항원에 대하여 약간의 기존 면역 반응성을 가져야 하거나, 또는 토끼들은 감염 직후 에스. 아우레우스에 대하여 항체-매개된 면역 반응을 생성할 수 있어야 하는데, 그 이유는 이들이 대상 IgG가 될 것이기 때문이다. 셋째, 백신 접종 접근법에서는 절단된 토끼 IgG에 결합하기에 충분한 친화성 및 특이성의 절단 부위 특이적 항체가 생성되어야 한다. 마지막으로, 절단된 항체 유사체로 면역화된 동물은 비면역화된 동물과는 측정가능하게 상이한 반응을 보여야 한다.
본 출원인은 이전에 GluV8이 시험관내에서 하부 힌지 영역 내에 위치한 아미노산 E233과 L234 사이에서 인간 IgG1을 절단함을 보여주었다 (국제특허 공개 WO2009/023457A1호, 문헌[Ryan MH, et al. (2008) Mol Immunol 45(7):1837-1846]). 이 영역 내의 토끼 IgG 하부 힌지 영역의 서열은 단일 아미노산 변화, A231P를 제외하고는 인간 IgG1 서열과 동일하다. GluV8 절단 부위와 같이 상기 효소는 토끼 IgG에 작용할 것으로 예상되었다.
접종한지 3일 후 토끼의 휘플볼 유체를 포함하는 에스. 아우레우스로부터의 그리고 혈청으로부터의 토끼 IgG를 단백질 A 시약을 이용하여 별도로 정제하였다. 토끼 IgG의 생성된 제제를 MALDI로 분석하여 IgG 절단의 양을 결정하였다. 토끼 혈청 IgG의 MALDI 분석에 의하면 3개의 일차 피크가 나타났으며, 이는 온전한 IgG의 단일 하전 분자 이온 (143,600 Da), 온전한 IgG의 이중 하전 분자 이온 (71,700 Da), 및 토끼 알부민(65,800 Da)에 해당하였다. 대조적으로, 휘플볼 토끼 IgG의 MADLI 분석은 Fc 단편의 단일 하전 분자 이온(52,800 Da), Fc 단편의 이중 하전 분자 이온(25,500 Da), 및 온전한 IgG의 단일 하전 분자 이온에 해당하는 작은 피크(143,700 Da)를 포함하였다. 이들 결과는, 휘플볼 유체를 포함하는, 에스. 아우레우스로부터 정제된 토끼 IgG는 절단된 IgG를 함유하며, 반면 혈청으로부터 정제된 토끼 IgG는 온전한 IgG를 함유하고, 이때 검출가능한 IgG 절단 생성물은 없음을 나타냈다. 따라서, 본 출원인은 시험관내에서의 인간 IgG1과 같이, 생체내에서의 토끼 IgG는 에스. 아우레우스를 함유하는 미세환경 내에서 절단에 민감하다는 결론을 내렸다.
스타필로코커스 아우레우스에 대한 연구 동물의 면역 상태와 관련하여, 혈청에 기존 면역 반응성이 존재하는 것을 2가지의 에스. 아우레우스-유래된 항원을 이용하여 ELISA에 의해 검사하였다. 이들은 포도상구균 알파 독소(알파-헤모라이신, H1a) 및 포도상구균 장독소 B(일반적으로 식중독과 관련된 독소)였다. 힌지 유사체형 펩티드로 후속적으로 면역화시키는 6마리의 토끼로부터의 연구 전 혈청, 및 6마리의 비면역화된 대조 토끼로부터의 접종 전 혈청을 상기 두 독소에의 결합에 대하여 1:50, 1:200 및 1:800으로 희석시켜 시험하였다. 양의 역가는 광학 밀도 (490 nm)가 상응하는 대조 웰 (항원 코팅되지 않음)에서 얻어지는 시그널보다 2배 이상인 최고 희석률로서 정량화하였다. 게다가, 인간 인테그린 및 계란 알부민을 잠재적인 음성 대조군으로서 시험하였으며, 그 이유는 토끼가 그러한 단백질에 노출되었을 것 같지 않기 때문이었다. 그 결과를 하기 표로 나타낸다 (표 3).
결과
결과에 의하면 12마리의 연구 동물에 있어서 상당한 발생률의 항-포도상구균 독소 반응성이 있음이 나타났다. 일부 토끼에 있어서, 역가는 시험한 최대 희석비(1:800)를 명백하게 넘어섰을 것이다. 대조적으로, 인간 및 닭 항원에 대한 면역 반응성의 발생률은 두드러지게 더 낮았으며, 단지 1:50의 희석비에서 검출가능하였다. 이들 결과는 토끼가 그 일생에 에스. 아우레우스에 자연스럽게 노출되며, 접종시에 에스. 항원의 즉각적인 표적화가 가능하여야 하거나, 또는 리콜(recall) 반응을 급속하게 시작하는 능력을 보유한다는 가정을 지지하였다. 이들 발견은 세포 표면 성분에 대한 항체를 비롯한 스타필로코커스 아우레우스 항원에 대한 항체의 소정의 스펙트럼이 존재할 수 있음을 시사한다.
실시예
4: 면역화
실시예 3에 설명한 절차에 의하면, 천연 세균 표적화 항체를 제공할 스타필로코커스 아우레우스 항원에 대하여 시험 대상 토끼가 이전에 면역 역가를 드러냈음이 확인되었다. 세균 챌린지(challenge)에 대하여 보호하기 위하여, 절단 부위 펩티드를 이용하여 백신 접종 후 토끼가 충분히 특이적이고 강건한 절단 부위 특이적 항체 반응을 생성하는지를 결정하기 위하여, 하기 실험을 수행하였으며, 여기서 토끼는 면역원 KLH에 콘쥬게이션된 GluV8-절단 부위 펩티드 유사체 (서열 번호 1의 잔기 7-15, TCPPCPAPE)로 면역화하였다.
인간 IgG1 힌지의 잔기 225-233의 펩티드 유사체를 화학적으로 합성하였다. 면역원 펩티드, C-T-S-P-P-S-P-S-P-A-P-E (Cys-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Ala-Pro-Glu, 서열 번호 16)를 디자인하였으며, 이는 연결을 위한 N-말단 Cys와, IgG의 위치 226 및 229에서 일어나는 Cys의 Ser로의 내부 치환을 포함하였는데, 상기 치환은 상기 위치에서 펩티드의 산화 및 이량체화를 피하기 위한 것이었다.
0.25 mmol 규모의 패스트모크(FastMoc) 화학 및 Fmoc-Glu(OtBu)-Wang 수지를 이용하여 에이비아이(ABI) 433A 펩티드 합성기에서 상기 펩티드를 제조하였다 대략 190 ㎎의 조 펩티드를 수지로부터 방출시켰으며, 2개의 바이닥(Vydac) C-18 컬럼 상으로의 다수의 주입을 통하여 정제하였다. 분획들을 수집하고, RP-HPLC 및 MALDI-TOF MS로 분석하였다. 풀링한 분획은 엘맨 검사(Elllman's test)에 의하면 자유 시스테인을 갖는 동결 건조 생성물 38 ㎎을 생성하였다.
키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 펩티드를 콘쥬게이션시키는 것은 임젝트 이뮤노겐 EDC 키트 (피어스(Pierce) 제품 번호: 77622)를 이용하여 EDC 커플링 화학 (1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카르보다이이미드)을 이용하여 달성하였다. EDC 콘쥬게이션 완충액 중 4 ㎎/mL의 정제 펩티드 22 ㎎을 물 중 10 ㎎/mL의 등가의 질량의 KLH와 조합하였다. KLH에의 펩티드의 연결은 실온에서 2시간 동안 부드럽게 혼합하면서 상기 혼합물에 EDC 용액을 첨가한 후 일어났다. 상기 단계들 전부는 제조업자의 사용법에 따라 수행하였다. 상기 콘쥬게이션 혼합물을 PBS에 대하여 투석하여 여분의 연결 시약들을 제거하였다. 실시예 1에 기재된 다클론 토끼 절단 부위 특이적 특이 항체 제제 RAH (서열 C-P-P-C-P-A-P-E로 끝나는 절단 부위 특이적 유사체형 펩티드에 대하여 반응성임)와 바이오티닐화 항-KLH 항체를 각각 포착용 항체 및 검출용 항체로 사용하여 샌드위치 면역분석법에 의해 KLH-펩티드 콘쥬게이션을 확인하였다.
면역화 후, 상기 펩티드 유사체에 대한 토끼 혈청의 반응성을 ELISA로 검사하였다. 표 4는 역가 (시그널을 검출할 수 있는 희석률의 역수로서)를 나타내며, 이는 토끼들 전부가 혈청 중에 검출가능한 절단 부위 특이적 유사체형 펩티드에 대하여 반응성인 항체를 가졌음을 나타낸다. 1마리의 동물 (657)은 1/(640과 동일한 역가)를 갖는, 면역원에 대한 매우 낮은 수준의 검출가능한 항체를 가졌다. 또한 절단 부위 특이적 항체는 모든 6마리의 토끼의 휘플볼 유체에서 검출되었으며, 이때 동일 동물(657)은 낮은 수준의 검출가능한 항체를 가졌다. 따라서, 6마리의 토끼 중 5마리는 혈청 및 휘플볼 유체 둘 모두에서 검출가능한 강건한 절단 부위 특이적 항체 역가를 드러냈다.
마지막 연구 시기에, 휘플볼 구획들 내에 직접적으로 넣은 6.2의 log10 콜로니 형성 단위(colony forming unit; CFU)의 에스. 아우레우스(ATCC 29213)를 면역화 및 비면역화 토끼에 접종하였다.
세균 카운트 및 생존률에 대하여 2주 코스에 걸쳐 세균 카운트 및 시험 대상 생존성을 모니터링하였다. 도 9에 나타낸 데이터는 첫 번째 주의 연구 동안 대조 동물의 평균 세균 카운트는 절단 부위 특이적 백신 접종 동물보다 몇 로그 더 높았음을 나타낸다. 예를 들어, 2일에 대조군은 7.2의 log10 CFU/ml의 휘플볼 유체를 갖는 반면 면역화 군은 5.2의 log10 CFU/ml의 휘플볼 유체를 가졌다.
세균 카운트에서의 차이를 토끼 생존성의 심오한 차이로 바꾸었다. 2주간의 연구 마지막까지 단지 40%의 대조 동물이 생존한 반면, 절단 부위 특이적 백신 접종 동물 중 100%가 생존가능하였다 (도 10).
따라서, 이들 결과는 존재할 경우 병원체에 대한 선천 면역이 병원체 생성된 프로테아제의 부산물, 아마도 절단된 그러나 여전히 면역반응성인 항-스타필로코커스 아우레우스 IgG에 대하여 본 발명의 면역화 방법에 의해 유효 수준으로 복구될 수 있다는 가설을 지지하였다. 이 과정은 고도로 단백질 분해적인 세균을 접종한 동물의 세균 카운트를 감소시킴에 의해서뿐만 아니라 상기 동물을 사망으로부터 구출하였다는 사실에 의해서도 입증되었다.
실시예
4: 암을 치료하기 위한 수동 면역
종양 표적화 Mab에 대한 절단 부위 특이적 항체에 의한 이펙터 기능의 복구의 원리를 입증하기 위하여, SCID 베이지(Beige) 생쥐에서의 쥐과 인간 종양 이종 이식 모델, MDA MB 231 정위 이종 이식 모델을, 상기 모델에 있어서 종양 성장을 감소시키는 능력을 보이는 것으로 이전에 입증된, 인간 조직 인자(CD142)에 대하여 유도된 CNTO860 (미국 특허 제7605235호)으로 불리는 항체와 함께 사용하였다.
CNTO860의 IgG1의 하부 힌지 도메인의 단백질 분해적 절단은 항체가 비효과적으로 되게 함을 보여주고, 절단 부위 특이적 절단 부위 mAb가 SCID 베이지 생쥐에서의 MDA-MB-231 정위 이종 이식 모델에서 절단 CNTO860의 항-종양 효능을 복구시키는지를 평가하기 위하여 연구를 디자인하였다.
온전한 항-종양 항원 항체, CNTO 860은 인간 IgG1 불변 영역을 포함한다. 프로테아제 절단된 항체, CNTO860을 상기에 기재된 바와 같이 세균 프로테아제 IdeS를 사용하여 제조하였다.
항체 제제를 신선하게 매주 희석시키고, 0.1 ㎎/㎏으로 동물 투약하는 경우 PBS 중 10 ㎍/mL로 공급하였다. mAb 2095-2 (키메라형 절단 부위 특이적 절단IdeS)를 상기 860 변이체에 대한 것과 동일한 일정으로 1.0 ㎎/㎏으로 단독으로 투여하였다.
면역손상된 생쥐 (찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 획득한, 중량이 대략 18-20 g인 SCID 베이지 생쥐(C.B-17/IcrCrl-scid-bgBR))를 마취시키고, IACUC 승인된 프로토콜에 의해 명시된 바와 같이 50㎕의 부피로 (2번 또는 3번 우액와부) 유방 지방체(mammary fat pad) 내로 무혈청 DMEM 중에 5x107개의 세포/mL로 현탁시킨 인간 유방암종주(ATCC #HTB-26) 세포인 MDA-MB-231을 이식하였다.
군당 8마리의 생쥐는 시험 물질 또는 PBS (대조군)를 받았으며, 이는 표 5 (하기)에 나타낸 바와 같았다. 4군은 단일요법에 있어서 상기에 명시된 바와 같이 투약되는 CNTO 860 단일 절단 IgG + 2시간 지연하여 복강내 투약되는, 1.0 ㎎/㎏으로 투여되는 mAb 2095-2를 받았다. 투약은 연구한지 3일째에 시작하였으며, 주당 1회 반복하였다.
대조군 종양의 부피가 800 mm3에 도달할 때 연구를 종료하였다. 종료시에, 전혈을 준비된 EDTA 코팅 튜브 내로 심장 천자를 통하여 모든 동물로부터 수집하였다. 연구 종료시에, 체중 및 종양에 대한 측정치를 기록하고, 원발성 종양을 수술에 의해 제거하고, 칭량하였다.
결과
실험 동안의 특정 시점에서의 각각의 군의 생쥐의 평균 종양 부피를 도 11에 나타낸다. 통계적으로, CNTO860 처리된 군에서의 종양 부피들은 연구일 11일에 시작하는 다른 군들 각각과 비교하여 더 작았다. CNTO860 + mAb2095-2 조합 군에서의 종양 부피들은 연구일 18-40일로부터의 PBS 군에서의 것보다 더 작았으며; 연구일 26-40일로부터의 CNTO860 scIgG 단독 군에서의 것보다 더 작았으며; 연구일 18-40일로부터의 mAb2095-2 단독 군에서의 것보다 더 작았다. 처리군들 사이에서 종양 부피에 있어서 다른 차이는 전혀 없었다.
CNTO860 단독 군은 모든 다른 군보다 최종 종양 중량이 훨씬 더 작았다. 부가적으로, CNTO860 + mAb2095-2 조합 군은 PBS 단독 군 및 mAb2095-2 단독 군 둘 모두보다 종양이 더 작았다. 처리군들 사이에서 종양 중량에 있어서 다른 차이는 전혀 없었다.
이들 결과는, 절단 부위 특이적 항체 제제를 이용한 수동 면역이, 절단된 표적 특이적 항체가 존재할 경우 항-종양 활성을 복구시킴을 입증한다.
실시예
5: 절단 부위 특이적 항체 및 절단된
표적화
항체를 이용한 표적 세포 고갈
하기 실험에서, 단일-절단된 IgG 또는 이중-절단된 IgG, F(ab')2의 투여 후 절단 부위 특이적 항체 (IdeS에 의해 절단된 인간 IgG1에 대하여 특이성을 갖는 토끼-인간 키메라 mAb인 mAb 2095-2 (키메라형 절단 부위 특이적 절단IdeS))의 생체내 투여를 조사하였다.
항-혈소판 인테그린 (αIIbβIIIa, IIb/IIIa로도 불림) 결합 항체, c7E3을 몇 가지 이유로 표적화 항체로서 사용하였다. 항-혈소판 mAb는 인간 IgG1 키메라였으며, 이는 선행 연구에서 5일에 걸친 회복에서 24시간 후에 엄청난 혈소판 제거로 이어지는 것으로 밝혀졌다 (이는 개 Fcγ 수용체 및/또는 보체 시스템에 의한 상기 mAb의 상당한 급성 인식을 나타냄). 부가적으로, 상기 효과는 혈소판 기능의 저해를 야기하지 않으며 따라서 임상적으로 관련있는 출혈 합병증을 야기할 가능성이 없는 온전한 IgG의 용량 (0.05 ㎎/㎏)에서 구별가능하였다. 마지막으로, 순환 혈소판 수는 쉽게 정량화가능한 종점을 제공하며, 이러한 최종이 아닌(non-terminal) 연구에서의 다수의 혈액 샘플링은 이 크기의 동물에 있어서 실혈 아티팩트(blood loss artifact) 또는 실혈 위험성을 제기하지 않았다.
재료 및 방법
하기의 3가지 c7E3 제제를 이용하였다: 온전한 쥐과-인간 IgG1 키메라 항체, 단일 절단된 것 및 세균 효소 IdeS를 이용하여 제조한 F(ab')2.
첫째, c7E3 항체 항원 결합 및 혈소판 고갈 파라미터를 개에서 확립하였다. 시험 주입의 결과에 의하면, 0.01 ㎎/㎏의 용량 (이는 인간에 있어서 혈소판 제거를 구동시키는 데 충분한 것보다 더 많은 것으로 계산됨)은 2시간 및 24시간에서 개에서 효과적이지 못하며 염수 군의 군과 구별될 수 없음이 나타났다. 0.05 ㎎/㎏의 용량은 2시간까지는 거의 효과가 없었지만, 24시간에서는 >90%의 혈소판 제거율을 생성하였다. 0.2 ㎎/㎏ 용량의 c7E3 IgG는 2시간에서 엄청난 혈소판 제거율을 생성하였는데, 이는 그 후 24시간에서 유지되었다. 이들 결과는 개에 있어서 최소 용량 (0.05 ㎎/㎏)을 배정하는 데 필요한 정보를 제공하였는데, 상기 용량은 상당한, 급성 혈소판 제거로 이어질 것이다 (24시간).
혈소판 기능에 대한 영향
c7E3은 혈소판 표면 IIb/III3 수용체에 결합하고 이럼으로써 피브리노겐이 활성화 혈소판 상의 상기 수용체에 결합하여 상기 혈소판들을 함께 모으는 능력을 차단함으로써 혈소판 응집을 저해한다. 온전한 그리고 단일-절단된 c7E3 IgG의 각각의 저해 프로파일을 혈소판 응집 분석에서 시험하였다. 생리학적 작동제를 이용하여 활성화시킨 후 혈소판 현탁물을 관통하는 광의 투과율의 증가로서 혈소판 응집을 측정한다. 저해는 5 ㅅM의 아데노신 다이포스페이트(ADP)에 대한 대조 응집과 비교한다. 저해율을 다음과 같이 계산하였다: 대조 응집 - 시험 응집 × 100%, 나누기 대조 응집.
상기 결과는 IdeS 프로테아제에 의한 단일 하부 힌지 절단 후 혈소판에의 c7E3의 결합의 손실/c7E3의 저해가 전혀 없음을 나타냈다.
c7E3 IgG 및 IdeS 프로테아제에 의해 단일-절단된 c7E3 IgG를 생체내에서 또한 비교하였다. 5마리의 동물의 3개의 군은 염수 대조군, 온전한 c7E3 IgG (0.05 ㎎/㎏) 또는 c7E3 단일-절단 IgG (0.05 ㎎/㎏) 중 어느 하나를 받았다. 혈소판 카운트를 기저선에서 그리고 투여 후 2, 24, 48, 72 및 96시간에 모니터링하였다. 연구를 5일로 한정하는 것은 결과들의 해석을 혼란에 빠뜨릴 수 있는 항-c7E3 면역 반응의 가능성을 최소화하였다. 결과들은 각각의 시점에서의 각각의 동물 군의 평균 혈소판 카운트 ± SD로 도 3에 제시되어 있다. 에러 바(error bar)의 정도는 상이한 동물들에 있어서의 혈소판 카운트의 보통 변동성을 내포한다 (예를 들어, 단일-절단 IgG 처리군에 있어서 5마리의 동물의 투입 전 카운트는 각각 ㎕당 175,000, 355,000, 305,000, 276,000 및 334,000이었다). 그럼에도 불구하고, 평균 결과는 온전한 c7E3 IgG가 혈소판 수의 상당한 감소를 유도하였으며 이때 최하점은 24시간에서 분명함을 명백하게 확인해 주었다. 동일한 0.05 ㎎/㎏ 용량의 c7E3 IgG의 단일 절단된 버전은 본질적으로 효과가 없었다. 단일-절단된 c7E3 군 및 염수 대조군은 96시간의 모니터링 기간 전체에 걸쳐 유사한 프로파일을 나타냈다. 혈소판 카운트는 염수 대조군 및 단일-절단된 c7E3 군 둘 모두에 있어서 최종 96시간 측정에서 감소하며, 이는 면역-매개되지 않은 원인 (예를 들어, 반복된 샘플링에 의한 혈액 부피 손실)을 시사하였다.
온전한 c7E3 IgG 군에서의 혈소판 카운트는 점진적인 회복을 나타냈으며, 이는 96시간까지 용량 전 수준의 대략 50%에 도달하였다. 어떠한 군에서도 불리한 임상적 발견 (예를 들어 출혈)은 주지되지 않았으며, 이는 적은 순환 혈소판 카운트 및/또는 혈소판의 엄청난 저해의 한정된 기간 동안의 공지된 인간 내성과 일치한다.
이 연구에서의 발견은 하부 힌지에서의 IgG의 단일한 단백질 분해적 절단이 이펙터 기능의 엄청난 손실로 이어진다는 것이었다. c7E3의 단일 절단 유도체는, 혈소판에의 그의 등가의 결합성에도 불구하고, (이 연구에서 온전한 c7E3에서 알 수 있는 바와 같이) 보통은 옵소닌화된 세포를 제거하는 면역계의 성분들을 고용할 수 없다. 이러한 생체내에서의 결과들은 몇몇 세포-표적화 mAb에서의 유사한 시험관내에서의 발견을 확인해 주었는데, 상기 mAb의 단일-절단된 유도체는 ADCC 및 보체 분석에서 모든 이펙터 기능을 본질적으로 상실한다.
이전 실험과 일치시키기 위하여, c7E3의 변이체들을 모두 0.05 ㎎/㎏의 용량으로 투여하였다. 이 연구 프로토콜은 표 6에 열거된 바와 같이 3마리의 동물의 7개의 상이한 군을 포함하였다. 이 실험의 독특한 태양 (6군 및 7군)은 제1 표적화 mAb의 주입, 이어서 10분간의 지연 후 절단 부위 특이적 mAb의 주입을 포함한다. 절단 부위 특이적 IdeS 절단 부위 mAb, 2095-2를 0.5 ㎎/㎏으로 투여하였는데, 이는 c7E3 변이체들 전부에 사용한 용량보다 10배 더 높은 것이었다. 절단 부위 특이적 mAb와 혈소판-결합된 c7E3 변이체들의 복합체 형성을 최대화하기 위하여 상기의 더욱 높은 용량을 선택하였다. 모든 mAb를 20분의 기간에 걸쳐 느린 주입에 의해 전달하였다. 혈소판 카운트를 96시간의 기간에 걸쳐 모니터링하였다. 혈소판 카운트를 프리젠테이션의 명확함을 위하여 그리고 이러한 작은 3마리 동물의 군에서 수치적 혈소판 카운트에서의 보통 변동성(normal variability)을 최소화하기 위하여 각각의 동물 내에서의 용량 전 카운트에 대하여 정규화하였다.
결과가 도 12에 제시되어 있다. 많은 발견이 이 연구로부터 나왔다. 용량을 찾아내는 연구로서, 0.05 ㎎/㎏으로 투여한 온전한 c7E3 IgG는 상당한 혈소판 제거를 유도하였으며, 이때 최저점은 24-48시간에서 명백하였다. 혈소판 수의 회복은 대략 72시간에 시작되었으며, 이는 96시간의 측정 내내 서서히 증가하였다. 추가의 혈액 샘플을 7일(168시간)에서의 연구 내에 포함시켜 완전한 회복이 일어나는지의 평가를 허용하였다. 완전한 회복은 7일까지는 모든 적용가능한 처리군에서 일어났다.
온전한 c7E3 IgG와는 대조적으로, 단일-절단된 IgG 및 F(ab')2는 혈소판 수에 대하여 영향이 없었으며, 이들 군에서의 혈소판 수의 변화는 염수 대조군과 상이하지 않았다. 이와 마찬가지로, 절단 부위 특이적 mAb, 2095-2는, 단독으로 주입될 때 (5군) 순환 혈소판에 대한 측정가능한 영향이 없었다. 그러나, c7E3 F(ab')2 + mAb 2095-2 군에서, 혈소판 카운트의 급속한 감소가 일어나서 2시간에서는 그 영향이 거의 최대가 되었다. 게다가, 혈소판 감소의 정도는, 2시간 및 24시간에서의 측정에서, 절단된 항체의 분획 이후 절단 부위 특이적 항체를 투여한 군에서, 온전한 c7E3 IgG (단독; 2군)를 받은 군에서보다 더 큰 것으로 나타났다. 그 후, 혈소판 카운트는 점진적으로 회복되었으며, 48시간까지는 회복률이 온전한 c7E3 IgG 군에서의 것에 필적하였다.
F(ab')2 조합 군에서, mAb 2095-2를 단일-절단된 c7E3 IgG와 커플링시켰을 때, 혈소판 제거 정도는 F(ab')2 군에서 보이는 것만큼 두드러진 것이 아니었으며, 이는 scIgG 군에서 한 마리의 불량하게 반응하는 동물에 기인할 수 있다 (이는 또한 이 군의 넓은 에러 바에서 반영됨). 그럼에도 불구하고, 혈소판 제거는 온전한 c7E3 IgG 군에서 명백했던 것보다 더 빠르게 일어났다. scIgG 결과는 중요하며, 그 이유는 생체내에서의 상기 mAb에 의한 이 유도체의 표적화가 F(ab')2의 표적화만큼 효과적이었던 것으로 나타나기 때문이다 - 시험관내에서의 발견을 기반으로 해서는 예측될 수 없었던 결과임.
토의/결론
본 명세서에 기재되어 있는 동물 연구 시리즈는 IgG의 단일-절단된 단백질 분해적 유도체가 그가 결합하는 세포를 제거하는 능력을 상실한다는 앞선 시험관내에서의 발견을 확인해 주었다 - 이 경우 생체내. 온전한 c7E3 IgG는 개에 있어서 ≥ 0.05 ㎎/㎏의 용량에서 24시간 이내에 혈소판 제거를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 0.05 ㎎/㎏의 용량은 혈소판당 수천 카피(copy)의 IgG 또는 약 5%의 αIIbβ3 수용체 차단율을 제공하기에 충분한 것으로 계산되었다. 사실상 더 높은 수준의 수용체 차단율이 혈소판 기능의 저해에 필요한 것으로 공지되어 있다 (혈소판당 약 80,000 카피). 따라서, 개 면역계는 이 분율 수준에서 IgG로 옵소닌화된 세포를 제거하는 능력을 갖는다.
상기 결과들은 인간 IgG1 하부 힌지의 단백질 분해적 단일 절단이 c7E3 IgG의 혈소판 제거 특성을 없앰을 보여주었다. 여기서, 기능적 불활성, 단일-절단 IgG가 IdeS 프로테아제를 이용한 부분 소화에 의해 생체외에서 제조되었지만, 본 명세서에서 입증된 바와 같이 다른 프로테아제가 유사한 기능 손실을 갖는 IgG를 생성한다. 단일 IdeS 절단은 시험관내 혈소판 저해 분석에서 밝혀진 바와 같이 c7E3의 항원 결합 특성에 영향을 주지 못하였다. 이러한 발견들은 적대적인 단백질 분해 환경과 관련된 병상 (예를 들어, 소정의 종양, 세균 감염, 염증성 세팅)에 있어서 숙주 면역계의 소정의 결점들을 설명하는 기작을 시사하였다.
연구에서의 발견들은 IgG에 있어서의 단백질 분해적 결함을 보정하는 수단을 암시하였다. 즉, 단백질 분해적 절단 부위에 대한 특이적 mAb는 불활성 세포-결합 항체 상에 기능성 Fc 도메인을 두고 이럼으로써 Fc-매개된 이펙터 기능을 복구시킴에 틀림없다.
IgG 힌지 내의 IdeS 절단 부위에 대한 단클론 항체를 토끼의 면역화에 의해 생성하였다. ADCC 및 보체 분석에서, 이 mAb, 2095-2는, 인간 불변 영역을 포함하도록 변형된 후, 시험관내에서의 세포 사멸성을 불활성 F(ab')2 또는 단일-절단된 IgG에 쉽게 복구시켰다.
주요 시험은 2095-2를 생체내에서 c7E3 IgG의 IdeS-생성된 단백질 분해적 유도체와 조합하여 이용하는 것이었다. 2단계 프로토콜을 디자인하여 c7E3이 먼저 혈소판에 결합하게 하고 그 후 이어서 과량의 절단 부위 특이적 mAb가 혈소판 결합된 c7E3과 복합체를 형성하게 하였다. 커플링된 항-절단 힌지 Mab 및 절단 Mab의 존재 하에서, 혈소판 제거는 온전한 c7E3 IgG 단독에 의해 유도된 것보다 더 신속하였으며 급성 혈소판 제거 정도는 더욱 엄청났다 (c7E3 F(ab')2에서). 병용 요법들에 의한 혈소판 제거의 신속성은 면역 세포 사멸/제거 양식의 증강을 시사한다.
실시예
6: 암을 치료하기 위한 절단 부위 특이적 백신 접종
힌지 유사체형 펩티드의 백신 접종의 이용은 침습성 및 전이성 암과 같은 만성 인간 질환의 치료에 대하여 잠재력을 갖는다. 몇몇 침습성 암 동물 모델이 현재 존재하며, 이는 침습성 암의 치료 수단으로서 절단 부위 특이적 유도 백신 접종의 효능을 시험하는 데 적합하다.
백신 접종 접근법은 단독의 항-종양 mAb 치료법과 비교하여 두드러지게 상이한 약동학적 프로파일을 부여할 것이다. 전자에 있어서, 확립된 종양은 그 표면 상의 특정 표적에 대한 단클론 항체의 갑작스러운 투여가 가해진다. 종양은 종양 세포 상의, 동일 항원 또는 추가의 항원들에 대한 숙주 항체에 의해 이미 표적화되었을 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 백신 접종 전략은, 일찍 개시될 경우, 계속적인 그리고 비교적 변함 없는 수준의 절단 부위 특이적 숙주 항체를 제공하여, 생성될 경우 종양 성장 또는 침습 부위에 존재하는 임의의 종양-표면 절단 항체를 고용할 것이다.
이전에 설명된 감염 모델에 있어서 토끼의 선천적인 체액 반응을 이용함으로써 입증되는 바와 같이, 일차 반응의 세포 표적은 거의 중요하지 않으며; 이차 항체 물결은 존재하는 임의의 손상된 일차 항체에 이펙터 기능을 복구시킨다. 불활성화된 그리고 세포-결합된 결합 숙주 항체는 절단 부위 특이적 Ab를 위한 다양한 항원 표적 (및 표면 위치)을 제공할 것이다.
본 명세서에서 입증된 바와 같이, 세포 표면 항원에 대하여 유도되는 그리고 상기 항원과 맞물리는 단일- 또는 이중-절단 항체는 절단 부위 특이적 항체에 의해 표적화되고 이럼으로써 숙주가 온전한 절단 부위 특이적 항체에 의해 제공되는 이펙터 기능을 이용하여 표적 세포를 제거하는 능력이 복구될 수 있다. 다른 그리고 두드러지게 상이한 접근법은 전이성 암과 같은 특정 질환과 관련된 프로테아제에 의해 유도되는 절단 손상 부위에 대하여 숙주를 면역화하는 것이다. 예를 들어, 종양 세포는 힌지에서 IgG를 절단하는 매트릭스 메탈로프로테아제를 정교화한다. 절단 부위에 대한 백신 접종은 그 분자적 결함에 대항하여 그 국소 환경에서 면역 기능을 증대시키는 숙주 항체를 제공할 수 있다.
손상된 mAb(들)의 표적은, 상세한 확인에 대한 필요성 없이 다수의 단백질 분해 효소의 작용에 대하여 보호하기 위하여 절단 부위 특이적 펩티드들의 혼합물을 이용하여 다중-표적화될 수 있거나 또는 특이적일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 치료를 필요로 하는 암환자 대상에 절단 부위 펩티드 면역원을 백신 접종하여 암 치료용 항체 조성물 내에서의 치료 전에, 또는 상기 치료 후에 또는 그와 동시에 절단 부위 특이적 항체 반응을 생성한다. 하나의 예에서, 면역원은 서열 번호 1의 잔기 10 내지 14인 아미노산 서열 P-C-P-A-P로 종결되는 서열을 갖는 MMP-3 또는 MMP-12 절단 부위 펩티드이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Centocor Ortho Biotech, Inc.
Jordan, Robert
Knight, David
Brezski, Randall
<120> IMMUNOGLOBULIN CLEAVAGE FRAGMENT VACCINE COMPOSITIONS
<130> CEN5192WOPCT1
<140> Unknown
<141> Herewith
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25
<210> 2
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 2
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
1 5 10 15
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu
20 25 30
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
35 40
<210> 3
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr
1 5 10 15
Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
20 25 30
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35 40
<210> 4
<211> 40
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser
1 5 10 15
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
20 25 30
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35 40
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> chemical analogue of human IgG1 peptide sequence
<400> 12
Thr Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serine subsituted IdeS cleavage site specific peptide
<400> 13
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Position 4 substitute human IgG1 cleavage fragment
<400> 14
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Ala Leu Leu Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Position 3 and 4 substitute human IgG1 cleavage fragment
<400> 15
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly
1 5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Peptide immunogen based on Strep pyrognes cleavage of human IgG1
<400> 16
Cys Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ser Pro Ala Pro Glu
1 5 10
Claims (33)
- 프로테아제의 방출을 특징으로 하는 병리적 상태로부터 인간 대상을 보호하는 방법으로서, 상기 방법은 펩티드 면역원을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 펩티드는 IgG 상의 단백질 분해적 절단 부위와 반응성인 항체를 생성할 수 있는 방법.
- 제1항에 있어서, 병리적 상태는 관절염 질환, 악성 질환, 감염체(infectious agent) 또는 기생 생물(parasite)의 존재 및 혈관 질환으로부터 선택되는 질환인 방법.
- 제2항에 있어서, 질환은 류마티스 관절염인 방법.
- 제2항에 있어서, 질환은 스타필로코커스 종(Stapholycoccus spp .) 감염인 방법.
- 제2항에 있어서, 질환은 유방암인 방법.
- 제2항에 있어서, 대상은 심근 경색이 있었던 것으로 진단 또는 의심되었거나, 또는 울혈성 심부전을 앓고 있는 방법.
- 제1항에 있어서, 펩티드는 MMP-3, MMP-7, MMP-12, HNE, 플라스민, 카텝신 G, 펩신, IdeS, 또는 스타필로코커스 아우레우스(Stapholycoccus aureus) 유래의 글루타밀 엔도펩티다아제 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제에 의해 생성되는 인간 IgG 내의 프로테아제 특이적 절단 부위를 나타내는 방법.
- 제7항에 있어서, 인간 IgG 내의 프로테아제 특이적 절단 부위가 프로테아제 특이적 절단 부위에 대하여 특이성을 갖는 항체를 사용하여 환자 유래의 샘플에서 검출된 방법.
- 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 환자는 치료되는 특정 질환과 결부된 하나 이상의 프로테아제에 의한 절단에 민감한 특이적 항체를 함유하는 조성물로 치료되고, 상기 방법은 펩티드 면역원을 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 펩티드는 항체 치료법에 의해 치료되는 특정 질환과 결부된 하나 이상의 프로테아제에 의해 생성되는 IgG 상의 단백질 분해적 절단 부위를 나타내는 펩티드 단편 또는 유사체인 방법.
- 제9항에 있어서, 병리적 상태는 관절염 질환, 악성 질환, 감염체 또는 기생 생물의 존재, 및 혈관 질환으로부터 선택되는 질환인 방법.
- 제10항에 있어서, 질환은 류마티스 관절염인 방법.
- 제10항에 있어서, 질환은 스타필로코커스 종 감염인 방법.
- 제10항에 있어서, 질환은 유방암인 방법.
- 제10항에 있어서, 대상은 심근 경색이 있었던 것으로 진단 또는 의심되었거나, 또는 울혈성 심부전을 앓고 있는 방법.
- 제9항에 있어서, 펩티드는 MMP-3, MMP-7, MMP-12, HNE, 플라스민, 카텝신 G, 펩신, IdeS, 또는 스타필로코커스 아우레우스 유래의 글루타밀 엔도펩티다아제 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제에 의해 생성되는 인간 IgG1 내의 프로테아제 특이적 절단 부위를 나타내는 방법.
- 제9항에 있어서, 인간 IgG 내의 프로테아제 특이적 절단 부위가 프로테아제 특이적 절단 부위에 대하여 특이성을 갖는 항체를 사용하여 환자 유래의 샘플에서 검출된 방법.
- 제9항에 있어서, 펩티드 면역원의 투여는 항체 함유 조성물의 이펙터(effector) 기능을 복구시키거나, 향상시키거나 또는 유지할 수 있는 방법.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 절단 생성물 유사체형 펩티드 면역원을 하기 단계에 의해 제조되는 방법:
a. 항체의 중쇄의 N-말단에 가장 가까운, 프로테아제에 의해 절단되는 항체의 중쇄의 한 쌍의 잔기들의 잔기를 확인하는 단계;
b. 프로테아제 절단 부위로부터 상류에 있는 5개 이상의 연접 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 서열을 확인하는 단계 - 여기서, 폴리펩티드의 N-말단에 가장 가까운 프로테아제 절단 부위의 잔기는 정의된 서열의 C-말단이 될 것임 - ; 및
c. 펩티드 또는 펩티드의 상동체 또는 화학적 상동체의 용액을 면역화에 충분한 양으로 생성하는 단계. - 제1항 또는 제9항에 있어서, 펩티드 면역원은 프로테아제 절단 부위의 아미노 말단측으로부터 상류에 있는, 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 인간 IgG 힌지(hinge) 영역 서열로부터 선택되는 5개 이상의 연접 아미노산 또는 상동체형 또는 화학적 유사체형 종을 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 펩티드 면역원은 적어도 잔기 …T-C-P-P-C- (서열 번호 1의 잔기 7-11)로 정의된, IgG1의 힌지 코어 또는 상동체형 또는 화학적 유사체형 종을 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 펩티드 면역원은 서열 TCPPCPAPELLG (서열 번호 1의 잔기 7-18)를 갖는 인간 IgG1 하부 힌지 및 인접한 CH2 도메인의 12-머(12-mer) 펩티드 유사체를 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 펩티드 면역원은 서열 번호 5-11의 서열 및 이의 N-말단 절단물로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며 5개 이상의 아미노산을 포함하고 IgG 프로테아제 절단 부위의 N-말단측의 상류에 있는 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 펩티드 면역원은 (a) IgG1의 MMP-3 절단 부위의 아미노 말단측 상의 아미노산 서열 (TCPPCPAP, 서열 번호 1의 잔기 7-14), (b) 글루타밀 엔도펩티다아제 IgG1 절단 부위 (TCPPCPAPE, 서열 번호 1의 잔기 7-15), 및 (c) IdeS IgG1 절단 부위를 포함하는 펩티드 (TCPPCPAPELLG, 서열 번호 1의 잔기 7-18)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
- 제19항에 있어서, 펩티드는 시스테인 잔기가 세린 잔기로 대체된 화학적 상동체인 방법.
- 제19항에 있어서, 펩티드의 C-말단을 다른 부분(moiety)에 화학적으로 결합시키는 방식으로 펩티드를 캐리어(carrier) 단백질에 콘쥬게이션(conjugate)시키는 방법.
- 제25항에 있어서, 캐리어 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH) 또는 혈청 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제19항에 있어서, 펩티드는 서열 번호 5-16의 펩티드로부터 선택되는 방법.
- 특정 투여 경로에 의한 환자에의 투여에 적합한 약학적으로 허용가능한 캐리어 중의, 프로테아제 절단 부위의 아미노 말단측으로부터 상류에 있는, 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 인간 IgG 힌지 영역 서열로부터 선택되는 5개 이상의 연접 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 이의 상동체형 또는 화학적 유사체형 종을 포함하는 백신 조성물.
- 제28항에 있어서, 펩티드는 펩티드에 대한 체액성 반응을 향상시킬 목적으로 아쥬반트(adjuvant)와 함께 투여되는 백신 제제.
- 제29항에 있어서, 아쥬반트는 CD40 작동제, 명반, 중합체성 미세입자, 수중유 에멀젼, MF59, CpG, GM-CSF, IL-12 및 IL-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신 제제.
- 제28항, 제29항 또는 제30항에 있어서, 펩티드는 서열 번호 5-16의 펩티드로부터 선택되는 백신 조성물.
- 병리적 상태의 치료를 위하여 환자에게 투여되는 항체의 이펙터 기능을 향상시키거나 또는 유지하는 방법으로서, 상기 항체는 환자에 있어서 하나 이상의 프로테아제에 의해 절단되며, 상기 방법은 항체 치료 전, 항체 치료 후 또는 항체 치료와 동시에 환자에게 백신 접종을 하는 단계를 포함하고, 인간 IgG 프로테아제 절단 부위 펩티드는 치료 항체에 결합하여 그에 이펙터 기능을 복구시킬 수 있는 항체를 생성할 수 있는 방법.
- 제32항에 있어서, 환자의 백신 접종에 사용되는 인간 IgG 프로테아제 절단 부위 펩티드는 서열 번호 5-16의 펩티드로부터 선택되는 펩티드인 방법.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/US2010/057396 WO2012067624A1 (en) | 2010-11-19 | 2010-11-19 | Immunoglobulin cleavage fragments vaccine compositions |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130118910A true KR20130118910A (ko) | 2013-10-30 |
Family
ID=46084318
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020137015471A KR20130118910A (ko) | 2010-11-19 | 2010-11-19 | 면역글로불린 절단 단편 백신 조성물 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20120269834A1 (ko) |
| EP (1) | EP2640414A4 (ko) |
| JP (1) | JP2014504277A (ko) |
| KR (1) | KR20130118910A (ko) |
| CN (1) | CN103260638A (ko) |
| AU (1) | AU2010363981A1 (ko) |
| BR (1) | BR112013012389A2 (ko) |
| CA (1) | CA2818245A1 (ko) |
| EA (1) | EA201390735A1 (ko) |
| IL (1) | IL225907A0 (ko) |
| MX (1) | MX2013005646A (ko) |
| NZ (1) | NZ610460A (ko) |
| SG (1) | SG190705A1 (ko) |
| WO (1) | WO2012067624A1 (ko) |
| ZA (1) | ZA201304480B (ko) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018093868A1 (en) * | 2016-11-16 | 2018-05-24 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Immunoglobulin proteases, compositions, and uses thereof |
| CN108410798A (zh) * | 2018-03-27 | 2018-08-17 | 福建三造血技术有限公司 | 细胞分离用微珠洗脱液及配制方法 |
| MX2021014433A (es) | 2019-06-05 | 2022-03-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molecula de union a sitio de escision de anticuerpo. |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995003408A1 (en) * | 1993-07-26 | 1995-02-02 | Dana-Farber Cancer Institute | B7-2: ctl a4/cd 28 counter receptor |
| US6090388A (en) * | 1998-06-20 | 2000-07-18 | United Biomedical Inc. | Peptide composition for prevention and treatment of HIV infection and immune disorders |
| EP2264166B1 (en) * | 1999-04-09 | 2016-03-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
| ATE541857T1 (de) * | 2002-09-27 | 2012-02-15 | Xencor Inc | Optimierte fc-varianten und herstellungsverfahren dafür |
| JP4414163B2 (ja) * | 2003-07-15 | 2010-02-10 | 大日本住友製薬株式会社 | Ｐｓａ由来のｈｌａ−ａ２４結合性癌抗原ペプチド |
| JP5224821B2 (ja) * | 2005-02-01 | 2013-07-03 | アメリカ合衆国 | 広範に交差中和する抗体を誘導するためのパピローマウイルスｌ２ｎ末端ペプチド |
| BRPI0814355A2 (pt) * | 2007-08-10 | 2015-01-27 | Centocor Ortho Biotech Inc | Fragmentos de clivagem de imunoglobulina como indicadores de doença e composições para detecção e ligação dos mesmos |
| DK2205258T3 (en) * | 2007-09-28 | 2017-08-28 | Janssen Biotech Inc | Method and structural conformations of antibody preparations with increased resistance to proteases |
| US8586706B2 (en) * | 2007-10-25 | 2013-11-19 | Kagoshima University | Peptide vaccine using mimic molecules of amyloid β peptide |
| DK2248533T3 (da) * | 2009-05-05 | 2014-02-10 | Universitaetsklinikum Freiburg | Polypeptid afledt af enterococcus samt dets anvendelse til vaccination |
-
2010
- 2010-11-19 SG SG2013037395A patent/SG190705A1/en unknown
- 2010-11-19 EA EA201390735A patent/EA201390735A1/ru unknown
- 2010-11-19 CA CA2818245A patent/CA2818245A1/en not_active Abandoned
- 2010-11-19 AU AU2010363981A patent/AU2010363981A1/en not_active Abandoned
- 2010-11-19 WO PCT/US2010/057396 patent/WO2012067624A1/en active Application Filing
- 2010-11-19 BR BR112013012389A patent/BR112013012389A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-11-19 NZ NZ610460A patent/NZ610460A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-11-19 CN CN2010800702131A patent/CN103260638A/zh active Pending
- 2010-11-19 EP EP10859722.0A patent/EP2640414A4/en not_active Withdrawn
- 2010-11-19 MX MX2013005646A patent/MX2013005646A/es unknown
- 2010-11-19 US US13/318,168 patent/US20120269834A1/en not_active Abandoned
- 2010-11-19 JP JP2013539805A patent/JP2014504277A/ja active Pending
- 2010-11-19 KR KR1020137015471A patent/KR20130118910A/ko not_active Application Discontinuation
-
2013
- 2013-04-23 IL IL225907A patent/IL225907A0/en unknown
- 2013-06-18 ZA ZA2013/04480A patent/ZA201304480B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112013012389A2 (pt) | 2019-09-24 |
| EA201390735A1 (ru) | 2013-12-30 |
| US20120269834A1 (en) | 2012-10-25 |
| MX2013005646A (es) | 2013-08-01 |
| EP2640414A1 (en) | 2013-09-25 |
| SG190705A1 (en) | 2013-07-31 |
| WO2012067624A1 (en) | 2012-05-24 |
| NZ610460A (en) | 2015-01-30 |
| IL225907A0 (en) | 2013-07-31 |
| JP2014504277A (ja) | 2014-02-20 |
| CA2818245A1 (en) | 2012-05-24 |
| CN103260638A (zh) | 2013-08-21 |
| AU2010363981A1 (en) | 2013-05-23 |
| EP2640414A4 (en) | 2016-06-15 |
| ZA201304480B (en) | 2014-12-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11859000B2 (en) | Anti-CCR8 antibodies and uses thereof | |
| US10689449B2 (en) | Multimeric death domain-containing receptor-5 (DR5) antibodies and uses thereof | |
| EP2723377B1 (en) | Anti-axl antibodies and uses thereof | |
| US20190062428A1 (en) | Combination of anti-cd47 antibodies and cell death-inducing agents, and uses thereof | |
| US8895005B2 (en) | Therapeutic agent | |
| KR101588276B1 (ko) | 질환 표시자로서의 면역글로불린 절단 단편, 및 그의 검출 및 결합을 위한 조성물 | |
| CA2839508A1 (en) | Anti-axl antibodies and uses thereof | |
| JP2020524000A (ja) | 抗ｂｃｍａ重鎖のみ抗体 | |
| US9481734B2 (en) | Immunoglobulin cleavage fragments and disease indicators and compositions for detecting and binding such | |
| JP7410141B2 (ja) | 抗クローディン－１８．２と抗４－１ｂｂとの二重特異性抗体およびその使用 | |
| EP2951204B1 (en) | Methods for increasing immunoglobulin a levels | |
| CA3070295A1 (en) | Anti-tim-3 antibodies and uses thereof | |
| CN111375059B (zh) | 一种抗gitr抗体药物组合物及其用途 | |
| KR20130118910A (ko) | 면역글로불린 절단 단편 백신 조성물 | |
| EP3710482A2 (en) | Compositions and methods for making and using bispecific antibodies | |
| JP7212990B2 (ja) | ヒトｐｄ‐ｌ１抗体 | |
| JP6964623B2 (ja) | Ｃ．ディフィシルの毒素ａおよび毒素ｂタンパク質の単離ポリペプチドならびにその使用 | |
| WO2020033926A9 (en) | Antibodies that bind cd277 and uses thereof | |
| WO2020033925A2 (en) | Antibodies that bind cd277 and uses thereof | |
| WO2015176104A1 (en) | Bak binding proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |