JP2014504277A - 免疫グロブリン開裂フラグメントワクチン組成物 - Google Patents
免疫グロブリン開裂フラグメントワクチン組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014504277A JP2014504277A JP2013539805A JP2013539805A JP2014504277A JP 2014504277 A JP2014504277 A JP 2014504277A JP 2013539805 A JP2013539805 A JP 2013539805A JP 2013539805 A JP2013539805 A JP 2013539805A JP 2014504277 A JP2014504277 A JP 2014504277A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- antibody
- igg
- cleavage site
- protease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 53
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 27
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 27
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title description 16
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title description 16
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 69
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 39
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 180
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 176
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 141
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 90
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 90
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 80
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 58
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 58
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 57
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 40
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 2-[benzyl-(4-methoxyphenyl)sulfonylamino]-n-hydroxy-4-methylpentanamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(CC(C)C)C(=O)NO)CC1=CC=CC=C1 VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 101710108790 Stromelysin-1 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 claims description 18
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 18
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 claims description 17
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 17
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 claims description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 12
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 9
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 9
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 8
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 8
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 7
- 229940037003 alum Drugs 0.000 claims description 7
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 claims description 5
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 5
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 claims description 5
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 claims description 4
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 4
- 101710187853 Macrophage metalloelastase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100027998 Macrophage metalloelastase Human genes 0.000 claims description 4
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 claims description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 4
- LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[1-[[1-[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108090000617 Cathepsin G Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004173 Cathepsin G Human genes 0.000 claims description 3
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 claims description 3
- 229940123189 CD40 agonist Drugs 0.000 claims description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 claims description 2
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 claims description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 claims description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims 2
- 101000851058 Homo sapiens Neutrophil elastase Proteins 0.000 claims 2
- -1 IdeS Proteins 0.000 claims 2
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 claims 2
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 claims 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 37
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 37
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 37
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 21
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 74
- 239000000047 product Substances 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 36
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 33
- 230000006870 function Effects 0.000 description 32
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 31
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 20
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 11
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 10
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 9
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 8
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 235000012773 waffles Nutrition 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 6
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 6
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 5
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 3
- 101100075829 Caenorhabditis elegans mab-3 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 3
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 101800004419 Cleaved form Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000635804 Homo sapiens Tissue factor Proteins 0.000 description 2
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 2
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 2
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 2
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000003072 Ellman's test Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000759376 Escherichia phage Mu Tail sheath protein Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004989 Hepsin Human genes 0.000 description 1
- 108090001101 Hepsin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000005726 Inflammatory Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010021980 Inflammatory carcinoma of the breast Diseases 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001244 Poly(D,L-lactide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 101710145796 Staphylokinase Proteins 0.000 description 1
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102100030859 Tissue factor Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940047712 aluminum hydroxyphosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 230000000941 anti-staphylcoccal effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000001099 axilla Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910001593 boehmite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 208000014387 congenital coronary artery anomaly Diseases 0.000 description 1
- 201000011639 coronary artery anomaly Diseases 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000013415 human tumor xenograft model Methods 0.000 description 1
- FAHBNUUHRFUEAI-UHFFFAOYSA-M hydroxidooxidoaluminium Chemical compound O[Al]=O FAHBNUUHRFUEAI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 201000004653 inflammatory breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000051367 mu Opioid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012808 pre-inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002764 solid phase assay Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010911 splenectomy Methods 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 108010092231 staphylococcal alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- BCIPGSZQUDLGSY-INIZCTEOSA-N tert-butyl (4s)-4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5-oxopentanoate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCC(=O)OC(C)(C)C)C=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 BCIPGSZQUDLGSY-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004308 thiabendazole Substances 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 230000006441 vascular event Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 108020001612 μ-opioid receptors Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、結合するが損失エフェクター機能を有する抗原を保持するIgG破壊に対して治療的免疫特異的産物の調製及び使用のための方法及び試薬に関する。本発明の試薬は、ヒト対象の予防的又は治療的ワクチンの目的のために免疫原として使用されてもよい。
Description
本発明は、標的特異的特性又は治療的免疫グロブリンと反応する免疫グロブリンの方法、組成物、及び使用に関し、そこで結合は、標的特性又は治療的免疫グロブリンの開裂かつ結合フラグメントに特有の生物活性を回復し、それによって、生物活性を提供又は再構成する。本発明は更に、かかるエクスビボ又はインビボ免疫グロブリンの産生のためにワクチンに使用するための免疫原性免疫グロブリンフラグメントを提供する。
循環免疫グロブリン、及び特にIgGクラスのそれらの抗体は、主要血清タンパク質である。ヒトプロテアーゼは、炎症性、増殖性、転位性、及び感染性疾患に関連することは周知である。マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、及び好中球エラスターゼ等のヒトプロテアーゼは、グルタミルエンドペプチダーゼ(黄色ブドウ球菌)又は連鎖球菌(化膿連鎖球菌)の免疫グロブリン分解酵素等の細菌プロテアーゼと同様に、IgG重鎖ポリペプチドを各プロテアーゼに特有の残基で開裂する。重鎖における開裂部位は、2つの重鎖の鎖間ジスルフィド結合が発生するヒンジドメインと呼ばれる領域の周りに集約される。ヒンジの下の領域は、Fc領域を構成し、IgGのエフェクター機能に関与する結合部位を含む。微生物の場合、プロテアーゼ発現は潜在的な補助毒性経路であり、ヒンジの下の開裂によるFcドメインのタンパク質分解放出が、そうでなければその病的細胞の標的及び致死に至らしめる作用を効果的に中和する限りにおいて、有機体がオプソニン化を回避するのを可能にする(Rooijakkersら、Microbes and Infection 7:476〜484,2005)。したがって、特定プロテアーゼの綿密さは、癌、炎症、及び感染性疾患を含む、無数の疾患状態の代表であり得る。
IgG分解は、開裂ヒンジドメインに結合する、天然IgG自己抗体の存在によって証明されるように、病理学的インビボ環境において強化される(Knight et al.,1995、Nasu et al.,1980、Persselin and Stevens,1985、Terness et al.,1995 J Imunol.154:6446〜6452)。これらの自己抗体もまた、F(ab’)2分子内のC末端残基として残留する下部ヒンジドメインへの特に強い反応性を有し、幾つかのプロテイナーゼ(パパイン及びペプシンを含む)によって生成されたFabフラグメント、及びF(ab’)2フラグメントを結合する(Terness et al.,1995)。実際の開裂産物の検出が報告されているが(Fick et al.,1985、Goldberg and Whitehouse,1970、Waller,1974)、これらのフラグメントがバイオメーカーとして機能することを可能にするロバストアッセイは、恐らく様々なフラグメントの迅速なクリアランスからもたらさせる血清の低濃度、又は血液及び組織内の多量の無傷免疫グロブリンの中にフラグメントを検出する際の技術的問題が原因で、開発されていない。特異的抗体が実験中央値ヒト好中球エラスターゼ開裂Fcドメインの検出のために調製され(Eckle,et al.,1988.Adv.Exp.Med.Biol.240:531〜534)、直接、関節リウマチ患者の滑液中で0.62μg/mlの中央値濃度でFcを検出したが、他の種類の関節疾患を有する患者の滑液中では検出されなかった。
プロテアーゼ特異的疾患活性に罹患する対象の体内でインビボIgG機能の欠乏を是正し、IgG開裂のプロセスを補う能力は、これまで治療的戦略として想定されていない。
本発明は、標的の結合又は非結合IgGを分解することが可能なタンパク質分解酵素の放出から生じるIgG開裂産物に対して特異的である抗体を産生するための抗体及びワクチンに関する。抗体及びワクチンは、プロテアーゼ分解を受けている治療的IgG抗体組成物にエフェクター機能を回復するために有用である。
本発明の別の実施形態において、IgG開裂産物の新規に作製されたC末端配列に相当する疾患特異的開裂部位ペプチドが提供される。これらのペプチドはまた、本発明の抗IgG開裂産物抗体での免疫付与、パンニング、及び選択にも有用である。一態様において、ペプチドは、プロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側上にある配列番号1、2、3、又は4のヒトIgGヒンジ領域配列から選択された少なくとも5つの連続アミノ酸からなる群から選択される。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号5〜11及びそのN末端切断のポリペプチドから選択される。別の態様において、ヒトIgG分子のタンパク質分解開裂部位に基づいたペプチド免疫原を設計する方法が提供される。
本発明の一実施形態において、抗IgG開裂産物抗体の組み換え産生のための核酸配列、ベクター、及び宿主細胞を含む、本発明の抗IgG開裂産物抗体の調製方法が提供される。抗IgG開裂産物抗体を製造する方法の別の態様において、免疫付与された宿主動物が提供され、その動物が本発明の抗体を提供する。特定の実施形態において、動物は、ヒトであり、抗IgG開裂産物は、配列番号5〜11の配列及びそのN末端切断等のプロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側上にある配列番号1、2、3、又は4のヒトIgGヒンジ領域配列から選択された少なくとも5つの連続アミノ酸からなる群から選択される開裂部位ペプチド免疫原の投与によって生成される。
本発明の別の実施形態において、IgG開裂プロテアーゼ産物を特徴とする疾患の診断又は監視に使用するための本発明の抗IgG開裂産物抗体を含む、抗IgG開裂産物の検出のためのキットが提供される。
本発明の更なる実施形態は、治療方法として、抗IgG開裂特異的抗体を患者に投与し、それによって、プロテアーゼ分解を受けている治療的抗体組成物にエフェクター機能を回復する方法である。該方法に従い、エフェクター機能は、IgG開裂産物に特異的に結合する本発明の抗体を投与することによって、IgG開裂産物に回復される。
本発明の別の態様において、疾患特異的プロテアーゼの生産を特徴とする疾患に罹患するヒトは、かかる患者内のIgG開裂産物のエフェクター機能を回復するために、配列番号1、2、3、又は4から選択され、かつ配列番号5〜11及びN末端切断の配列等のプロテアーゼ開裂部位のアミノ(N)末端側上の位置にあるヒトIgGヒンジ領域配列の少なくとも5つの連続アミノ酸、相同種及び化学的類似体からなる群から選択される開裂部位特異的ペプチド免疫原を投与することによって治療することができる。特定の実施形態において、開裂部位特異的ペプチド免疫原は、アミノ酸Glu233(EU番号付け)で終端する開裂ヒトIgG1へのN末端であるペプチドフラグメントに相当し、疾患は、グルタミルエンドペプチダーゼI(GluV8)の放出又はカテプシンGの好中球放出を特徴とする黄色ブドウ球菌感染から選択される。別の実施形態において、開裂部位特異的ペプチド免疫原は、アミノ酸Pro232(EU番号付け)で終端するペプチドフラグメントN末端開裂ヒトIgG1に相当し、疾患は、MMP−3、MMP−12の放出を特徴とするヒトの癌の形態を特徴とする。別の実施形態において、開裂部位特異的ペプチド免疫原は、GLy236(EU番号付け)で終端する化膿連鎖球菌開裂ヒトIgG1のIdeSに対してペプチドフラグメントN末端に相当し、疾患は、ブドウ球菌属感染である。
本発明の別の実施形態において、本発明の抗IgG開裂産物抗体、及び使用説明書を含むキットが提供される。
略語
Abs=抗体類、ADCC=抗体依存性細胞媒介性細胞傷害;CDC=補体依存性細胞傷害;HNE=ヒト好球中エラスターゼ;IdeS=化膿連鎖球菌の免疫グロブリン分解酵素;Ig=免疫グロブリン;Mab=モノクローナル抗体;MMP=マトリックスメタロプロテアーゼ又はメタロプロテイナーゼ;N末端=アミノ末端;scIgG=単一開裂IgG;SA=ストレプトアビジン;GluV8=黄色ブドウ球菌由来のグルタミルエンドペプチダーゼI。
Abs=抗体類、ADCC=抗体依存性細胞媒介性細胞傷害;CDC=補体依存性細胞傷害;HNE=ヒト好球中エラスターゼ;IdeS=化膿連鎖球菌の免疫グロブリン分解酵素;Ig=免疫グロブリン;Mab=モノクローナル抗体;MMP=マトリックスメタロプロテアーゼ又はメタロプロテイナーゼ;N末端=アミノ末端;scIgG=単一開裂IgG;SA=ストレプトアビジン;GluV8=黄色ブドウ球菌由来のグルタミルエンドペプチダーゼI。
定義
抗体フラグメント;Fab、F(ab’)2、及びFcは、重鎖間のジルフィド結合の還元(コアヒンジ領域)によって更に分離され得る、IgG抗体のタンパク質分解開裂産物を説明する用語である。典型的なタンパク質分解で生成された抗体フラグメントには、Fab(例えば、パパイン消化による)、Fab’(例えば、ペプシン消化及び部分的還元による)、及びF(ab’)2(例えば、ペプシン消化による)、facb(例えば、プラスミン消化による)、pFc’(例えば、ペプシン又はプラスミン消化による)、Fd(例えば、ペプシン消化、部分的還元、及び再集合による)が挙げられ、そこで還元は、鎖間結合を形成するシステイン残基間のジスルフィド結合を除去する(図1を参照)。Fcフラグメントが、ヒンジに対してN末端である、残基224(EU番号付け)においてヒトIgG1を開裂するパパイン開裂フラグメントとして説明されるため、Fcフラグメントは、ヒンジ及び重鎖間ジスルフィド結合を保持すると想定されが、抗体内の重鎖CH2−CH3二量体間の高い会合のため、二量体構造は、ジスルフィド(ヒンジ)結合が欠乏している場合でも保持される。したがって、本明細書に使用されるとき、「Fc」は、共有結合か否かにかかわらず重鎖CH2−CH3セグメントの会合によって形成された二量体構造を指す。非共有結合的会合Fcは、洗剤等の変性剤の存在下でCH2−CH3単量体への解離を起こす能力により、ジスルフィド結合のFcと異なり得ることを理解するであろう。
抗体フラグメント;Fab、F(ab’)2、及びFcは、重鎖間のジルフィド結合の還元(コアヒンジ領域)によって更に分離され得る、IgG抗体のタンパク質分解開裂産物を説明する用語である。典型的なタンパク質分解で生成された抗体フラグメントには、Fab(例えば、パパイン消化による)、Fab’(例えば、ペプシン消化及び部分的還元による)、及びF(ab’)2(例えば、ペプシン消化による)、facb(例えば、プラスミン消化による)、pFc’(例えば、ペプシン又はプラスミン消化による)、Fd(例えば、ペプシン消化、部分的還元、及び再集合による)が挙げられ、そこで還元は、鎖間結合を形成するシステイン残基間のジスルフィド結合を除去する(図1を参照)。Fcフラグメントが、ヒンジに対してN末端である、残基224(EU番号付け)においてヒトIgG1を開裂するパパイン開裂フラグメントとして説明されるため、Fcフラグメントは、ヒンジ及び重鎖間ジスルフィド結合を保持すると想定されが、抗体内の重鎖CH2−CH3二量体間の高い会合のため、二量体構造は、ジスルフィド(ヒンジ)結合が欠乏している場合でも保持される。したがって、本明細書に使用されるとき、「Fc」は、共有結合か否かにかかわらず重鎖CH2−CH3セグメントの会合によって形成された二量体構造を指す。非共有結合的会合Fcは、洗剤等の変性剤の存在下でCH2−CH3単量体への解離を起こす能力により、ジスルフィド結合のFcと異なり得ることを理解するであろう。
ヒト抗体は、基本構造が2つのヘテロ二量体の二量体である免疫グロブリンであり、ヘテロ二量体はそれぞれ、重鎖及び軽鎖ポリペプチドからなる。
「タンパク質分解」、「プロテアーゼ」、「プロテイナーゼ」、及び「タンパク質分解酵素」という用語用語は、互換的に使用され、2つ以上のフラグメントを産生するポリペプチド鎖を開裂することが可能な薬剤、例えば、酵素を意味し、酵素は、通常温度で、かつ生理学的条件又は生理学的に適合条件下で作用する。生理学的条件には、任意の温度、緩衝剤、カチオン、アニオン、基質、触媒、pH、共同因子、又は健康又は病気であれ生存している哺乳類の身体内に天然に見られる同等物が挙げられる。しかしながら、プロテアーゼは、任意の種類の生命体であり得る病原体等の非哺乳類源に由来し得る。プロテアーゼは、ペプチド結合に作用するヒドロラーゼである。
「scIgG」又は「単一開裂IgG」は、2つの重鎖及び2つの軽鎖を含むヘテロ二量体構造を有する、任意の免疫グロブリンクラスG分子を意味し、重鎖のうちの1つは、単一重鎖上でタンパク質分解開裂を受け、二番目の重鎖は無傷のままである。
N末端からC末端残基まで記述されたアミノ酸配列に対する「上流」は、所与の残基からN末端に向かう配列の残基を意味する。反対に、アミノ酸配列に対して「下流」は、所与の残基からC末端に向かう配列の残基を意味する。
基礎構造による抗体機能
一般に、免疫グロブリン、抗体は、それぞれ約10〜11kDaの約100のアミノ酸を含む連続ポリペプチド鎖の領域からなり、特徴的に折り畳まれた球状ドメインを示し、構造の異なる要素を表す。免疫ガンマグロブリンは、約150kDaのタンパク質である抗体(IgG)であり、これらのドメインは、セグメントにグループ化され、Fabセグメントは、重鎖可変領域と連続する重鎖第1定常領域(CH1)へのジスルフィド結合を介して結合された単鎖内の軽鎖定常領域に可変接合した軽鎖からなり、Fcは、ヒンジ領域内の2つ又は3つのジスルフィド結合を介して結合された2つの連続重鎖定常領域(CH2及びCH3)からなる。研究は、パパイン及びヘプシン等のプロテアーゼが、セグメント間にある部位で優先的に抗体を開裂することを示した。2つの同一のFabセグメントは、ヒンジ領域を介して1つのFcセグメントに接続され、したがって、l50kDa構造(図1を参照)のY型構造を形成する。パパインを使用して生成されたFabセグメントは、典型的には、46kDaの分子量を有し、非還元性F(ab’)2は、典型的には、90〜100kDaの分子量を有し、非グリコシル化、非還元性Fcは、約50〜60kDaの見掛けの分子量を有する。しかしながら、それぞれの抗体種、及び抗体種内の抗体のそれぞれのサブクラスは、わずかに異なり、開裂及び開裂産物の厳密な性質及び位置は異なる。
一般に、免疫グロブリン、抗体は、それぞれ約10〜11kDaの約100のアミノ酸を含む連続ポリペプチド鎖の領域からなり、特徴的に折り畳まれた球状ドメインを示し、構造の異なる要素を表す。免疫ガンマグロブリンは、約150kDaのタンパク質である抗体(IgG)であり、これらのドメインは、セグメントにグループ化され、Fabセグメントは、重鎖可変領域と連続する重鎖第1定常領域(CH1)へのジスルフィド結合を介して結合された単鎖内の軽鎖定常領域に可変接合した軽鎖からなり、Fcは、ヒンジ領域内の2つ又は3つのジスルフィド結合を介して結合された2つの連続重鎖定常領域(CH2及びCH3)からなる。研究は、パパイン及びヘプシン等のプロテアーゼが、セグメント間にある部位で優先的に抗体を開裂することを示した。2つの同一のFabセグメントは、ヒンジ領域を介して1つのFcセグメントに接続され、したがって、l50kDa構造(図1を参照)のY型構造を形成する。パパインを使用して生成されたFabセグメントは、典型的には、46kDaの分子量を有し、非還元性F(ab’)2は、典型的には、90〜100kDaの分子量を有し、非グリコシル化、非還元性Fcは、約50〜60kDaの見掛けの分子量を有する。しかしながら、それぞれの抗体種、及び抗体種内の抗体のそれぞれのサブクラスは、わずかに異なり、開裂及び開裂産物の厳密な性質及び位置は異なる。
抗原は、軽鎖及び重鎖の各対の可変領域で抗原結合部位を介して抗体に結合する(図1)。エフェクター分子又は細胞として知られる他の分子は、残りの分子内の他の部位、すなわち、抗原結合部位以外に結合し、この抗体部分は、より不変の免疫グロブリン配列を含み、抗体の「定常部分」、かかる部位は、特に軽鎖の末端:上部ヒンジ、下部ヒンジ、CH2、及びCH3ドメインを超えて延在する重鎖の部分によって構成されたFc領域に部分的に位置する。
抗体は、エフェクター分子の結合により仲介される数種のエフェクター機能を有する。例えば、抗体に対する補体のC1成分の結合は、補体系を活性化させる。補体の活性化は、オプソニン化及び病原体細胞の溶解(補体媒介性細胞傷害又はCDCと呼ばれるプロセス)において重要である。補体の活性化は、炎症性応答を刺激し、また自己免疫過敏症にも関与し得る。更に、抗体は、Fc領域を介して細胞に結合し、抗体Fc領域上のFc受容体部位が細胞上のFc受容体(FcR)と結合する。IgG(γ受容体)、IgE(η受容体)、IgA(α受容体)及びIgM(μ受容体)を含む、抗体の異なるクラスに特異的な多数のFc受容体が存在する。細胞表面上のFc受容体に対する抗体の結合は、多数の重要かつ多様な生物学的応答を誘発し、生物学的応答には、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解(抗体依存性細胞媒介細胞傷害、補対指向細胞傷害、又はADCCと称される)、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過及び内皮細胞再接種(新生児型Fc受容体又はFcRnを介する)、並びに免疫グロブリン産生の制御が含まれる。
ヒンジドメインの配列は、通常、IgGアイソタイプ(配列番号1〜4)及び哺乳類種間で保存される。IgG1(配列番号1)及びIgG3(配列番号1)アイソタイプは、Fcγ受容体への結合及びFcエフェクター機能の構造モチーフであるロイシン−ロイシンの対を含む。典型的には、2つの非システイン残基によって分離された少なくとも1つのシステインを含む、「ヒンジコア」の下流の他の残基もまた保存される。
ヒトIgG1の開裂産物、単一開裂又はscIgGは、IgGを含む2つの重鎖ポリペプチドのうちの1つにタンパク質分解が生じるとき、ヒト及び細菌プロテアーゼによって形成されるが、前述のように、ヘテロ二量体分子の全体の組成物は、破壊されない(Gearing AJH et al.,Immunol.Lett.81:41〜48、2002、Vincents et al.,Biochemistry 43:15540〜15549,2004)。scIgGは、恐らく、他のフラグメントよりも血清中に見られる、より豊富なインビボタンパク質分解産物である。
生理学的条件下でのタンパク質分解開裂の動力学は、F(ab’)2(図1)等の複数回の開裂事象の産物である種よりも、高い割合のscIgG構造にあるタンパク質分解的開裂IgGにつながる(2008年8月4日に出願された米国特許第12/185,333号)。数多くのプロテアーゼを試験するプロセスにおいて、無傷IgG内の重鎖定常領域の第1の開裂は、第2の開裂より急速に進行することが決定され、この順序は、単一開裂種の一時的な蓄積をもたらす。このIgG分子の単一開裂型は、その無傷の親と多くの点で区別ができない(例えば、分子サイズ、抗原結合、タンパク質A/Gによって認識される能力)。
F(ab’)2及びscIgGを含むタンパク質分解開裂産物の特異的結合が可能な抗体は、ヒトIgG1開裂産物を認識するが、無傷IgGを認識しない本発明の開裂部位類似体ペプチドを使用して生成される。同時係属特許出願は更に、抗原結合特異性を保持するIgG開裂産物を特異的に認識し、開裂IgGにCDC及びADCC等のエフェクター機能を回復することができる抗体調製物を選択することができることを開示する。
タンパク質分解酵素及び疾患関連性
本出願は、インビトロ酵素パネルで作製されたものと同等のサイズのscIgGを含む抗体開裂産物は、関節リウマチを有する患者の滑液等の炎症性滲出液において検出可能であることを証明した。更に、scIgGは、局所的タンパク質分解活動が既知の病理特性である、多くの疾患を有する患者の血清中で検出することができる。これらの疾患状態のscIgGは、健常ボランティアよりも高濃度であり、比較的経度の炎症疾患を有する患者の血清よりも高い。
本出願は、インビトロ酵素パネルで作製されたものと同等のサイズのscIgGを含む抗体開裂産物は、関節リウマチを有する患者の滑液等の炎症性滲出液において検出可能であることを証明した。更に、scIgGは、局所的タンパク質分解活動が既知の病理特性である、多くの疾患を有する患者の血清中で検出することができる。これらの疾患状態のscIgGは、健常ボランティアよりも高濃度であり、比較的経度の炎症疾患を有する患者の血清よりも高い。
表1は、ヒトプロテアーゼ及び2つの細菌プロテアーゼのヒトIgG1への作用に関する所見の概要である。「凝固プロテイナーゼ」という用語は、FXIIa、FIXa、FXa、トロンビン、及び活性タンパク質Cを含む、血清凝固カスケードタンパク質を指し、プラスミンは、プラスミノゲン活性剤であるtPA、ストレプトキナーゼ、及びスタフィロキナーゼと共インキュベートされたプラスミノゲンであり、「プラスミノゲン活性剤単独」とは、プラスミノゲンを含まず、MMPは、材料において詳細に示されるように活性形態又はプロ酵素のいずれかとして得られる組み換えプロテイナーゼであり、「無し」は、24時間以内に検出可能な開裂がないことを示す。指示される場合を除き、すべての酵素はヒトであった。残基指定は、IgG1抗体重鎖用のEU番号付けシステムで、配列番号1の25の残基は、完全成熟重鎖の残基219〜243と一致する。
(2)Barrett A.J.,Rawlings N.D.and Woessner J.F.(Eds.),Handbook of Proteolytic Enzymes Vol.2,Elsevier,Amsterdam,2004。
(3)Powers,JC.「Proteolytic Enzymes and Disease Treatment」1982。In:Feeney and Whitaker(eds)。Modification of Proteins:Food,Nutritional,and Pharmacological Aspects。Advances in Chemistry Series 198。ACS,Washington,D.C.1982 pp 347〜367。
(4)Tchetverikov I.,Ronday H.K.,van El B.,Kiers G.H.,Verzijl N.,TeKoppele J.M.,Huizinga T.W.J.,DeGroot J.and Hannemaaijer R.,2004。MMP Profile in paired serum and synovial fluid samples of patients with rheumatoid arthritis。Ann.Rheum.Dis。63,881〜883。
(5)Vincents B.,von Pawel−Rammingen U.,Bjorck L.and Abrahamson M.,2004。Enzymatic characterization of the streptococcal endopeptidase,IdeS,reveals that it is a cysteine protease with strict specificity for IgG cleavage due to exosite binding。Biochemistry 43,15540〜15549。
(6)Sun H.,Ringdahl U.,Homeister J.W.,Fay W.P.,Engleberg N.C.,Yang A.Y.,Rozek L.S.,Wang X.,Sjobring U.,Ginsburg D.,2004。Plasminogen is a critical host pathogenicity factor for group A streptococcal infection。Science。305,1283〜1286。
scIgGを含む開裂IgGの検出は、ヒンジジスルフィドの、又はその周辺の開裂重鎖の新たに露出したエピトープに特異的に結合するが、無傷の非開裂IgG分子と反応しない、親和性精製ポリクロナール抗体(ウサギ)の生成によって達成された。血清中のscIgGの検出の確証は、無傷IgGと同様の持続性循環寿命である。scIgGに罹患した個人の体液又は血液中で検出する能力は、新規バイオメーカー戦略となる可能性がある。
抗体調製物
本発明の方法に使用する診断的、予防的、又は治療的薬剤として使用するために、開裂部位特異的ペプチドに対する特異性を有する抗体は、本明細書に例示された評価基準、方法、及び免疫原を使用して、本発明の実施に有用な抗体を作製又は選択するために当該技術分野において周知の様々な方法で調製することができる。
本発明の方法に使用する診断的、予防的、又は治療的薬剤として使用するために、開裂部位特異的ペプチドに対する特異性を有する抗体は、本明細書に例示された評価基準、方法、及び免疫原を使用して、本発明の実施に有用な抗体を作製又は選択するために当該技術分野において周知の様々な方法で調製することができる。
一態様において、抗体は、観察した開裂フラグメント又はそれに由来する開裂部位特異的類似体ペプチドで動物に免疫付与することによって作製されたハイブリドーマから容易に取得される。したがって、抗体は、F(ab’)2及びscIgGを含む、抗体開裂フラグメント、又はそのN末端切断若しくは構造類体によって動物に免疫付与するか、又は抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。一実施形態において、抗体を生成するために使用されるペプチドは、配列番号5〜11に示されるIgG1の14−merペプチドから選択され、ここでポリペプチド又はペプチドのC末端残基が、残基開裂の対の表1に示される開裂部位の残基上流(N末端側)に相当する。ヒンジモチーフ、例えば、IgG1の−T−C−P−P−C−(配列番号1の残基7〜11)を含むフラグメントは、システイン残基(C)が、例えば。アラニン(A)又はセリン(S)残基と交換され、それによって、開裂ペプチドの化学的相同体の形態を形成しないかぎり、ジスルフィド結合形成によって多重結合となる。
特定の実施形態において、抗体は、MMP−3開裂部位のアミノ末端側のアミノ酸の配列に一致する(TCPPCPAP、配列番号1の残基7〜14)8−merペプチド、又はグルタミルエンドペプチターゼ部位(TCPPCPAPE、配列番号1の残基7〜15)若しくはIdeS部位(TCPPCPAPELLG、配列番号1の残基7〜18)に一致する伸張ペプチドを使用して生成される。免疫原として使用されるとき、ペプチドは、容易に共有結合によってキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)にN末端を介して、又は追加したリンカー残基若しくはペプチドを通して付着させることができる。
したがって、抗体は、当該技術分野において周知のハイブリドーマ技術のいずれかを使用して取得することができる。例えば、Ausubel,et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,NY,NY(1987〜2001)、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor,NY(1989)、Harlow and Lane,antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY(1989)、Colligan,et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,Inc.,NY(1994〜2001)、Colligan et al.,Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,NY,(1997〜2001)を参照。それぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類、又はこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意の哺乳類も含む、又はそれらに由来することができ、単離ヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化及び/又はCDRグラフト抗インテグリン抗体、免疫グロブリン、開裂産物、及びその他の特定部分及び変異を含む。
ファージディスプレイされた抗体又はペプチドライブラリーも使用して、scIgG及び他の抗体フラグメントへの所望の特異性を有する新規結合ドメインを特定し得る。
本発明に有用な抗体又はその結合剤を作製又は選択する上で、この目的に使用された特定の試薬が本発明の更なる態様である。この目的のために開発された特定の免疫原又は試験試料は、図3に示される残基SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFP(配列番号1)を含むが、これに限定されないIgG1のヒンジコア周囲の残基を含むことを特徴とする。タンパク質分解酵素と接触すると抗体フラグメントを産生する他のヒトアイソタイプ抗体のヒンジ領域もまた、抗体又は酵素開裂産物への他の結合分子を作製、選択、又は試験する目的で類似体の源として機能し得る。ヒトIgG4重鎖の類似領域は、それぞれ、残基TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPSCPA PEFLGGPSVF LF(配列番号2)並びに配列番号3及び4に示されるIgG2及びIgG3用を含む。それぞれの場合において、ペプチドは、プロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側上にある配列番号1、2、3、又は4のヒトIgGヒンジ領域配列から選択された少なくとも5つの連続アミノ酸からなる。一態様において、抗体を生成するために使用された特定の免疫原又はペプチドは、残基−C−P−P−C−として定義されるIgG1の少なくともヒンジコアを含む。特定の実施形態において、ペプチドは、ヒトIgG1下部ヒンジの12−merペプチド類似体、及び配列TCPPCPAPELLG(配列番号1の残基7〜18)を有する隣接CH2ドメインである。
抗体又は他のタンパク質分解開裂産物への結合分子の生成、選択、又は試験する上で有用なペプチドフラグメントを生成する一般的な方法は、a)表1に示される特異的プロテアーゼによって例示されたもの等のプロテーゼ開裂抗体重鎖の一対の残基のN末端残基を特定する、b)該N末端残基が定義された配列のC末端になる開裂部位から5〜14以上上流の残基を定義する、c)所望の目的に十分な量のペプチドを産生することである。任意に、任意のシステイン残基は、反応性側基が存在しないか、又は反応性側基が不可逆的又は可逆的に阻害されている、セリン又は他のアミノ酸で置換することができる。記述されるペプチド等のペプチドは、配列番号5〜11、又はそのN末端切断から選択される。ペプチドは、標識される、抱合される、又は架橋される、又は別のものと混合して、又は結合を試験する目的のためのアジュバント、免疫原として、又は例えば、ファージディスプレイライブラリーから結合剤を選択する際の使用のための免疫原若しくはパンニング標的として使用される。
本発明は、一態様において、少なくとも1つの特定の配列、ドメイン、部分又はその変異体を含む、そこに先述の特異的ペプチド又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含むか、これに対し相補的か、又はこれとハイブリダイズする単離核酸分子を提供する。本発明は、本明細書において説明されるように、scIgGに対する特異性を有する少なくとも1つの単離モノクローナル抗体をコードする単離核酸、及び単離核酸を含む核酸ベクトル、及び/又は単離核酸を含む原核又は真核宿主細胞を包含する。宿主細胞は所望により、大腸菌COS−1、COS−7、HEK293、BHK21、CHO、BSC−1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそれらの任意の誘導体、不死化細胞若しくは形質編幹細胞から選択される少なくとも1つであり得る。同様に提供されているのは、ペプチド又は抗体が検出可能な、又は回収可能な量で発現されるようにインビトロ、インビボ又はインサイチュ条件下で核酸をコードする抗体を翻訳することを含む、本発明の少なくとも1つの抗体の産生方法である。
使用方法
診断
IgG開裂ペプチドを使用して調製された抗体は、疾患病理学を特定又は確定する上で、又はタンパク質分解活性及びタンパク質分解酵素(プロテアーゼ)から生じる、それを引き起こす、又はさもなければ、それに関連する経過において、有用な検出試薬として使用することができる。かかる疾患及び経過は、感染、脳卒中、血管疾患、心筋梗塞、及び種々の他の急性及び慢性炎症疾患の増悪及び悪化、それらによって生じる、又はそれらに起因するものを含む。出願者らは、タンパク質分解酵素の1つの特に有用なバイオマーカーが、先述の疾患のうちの幾つかにおいて増加レベルで検出されるscIgGであることを示した。scIgGが病理部位又は病理過程若しくは感染において胸部的に生成されるため、scIgGは、疾患部位における特定の組織又は細胞型の関与の測定基準としてのかかる過程の独自で特定のマーカーを提供する。
診断
IgG開裂ペプチドを使用して調製された抗体は、疾患病理学を特定又は確定する上で、又はタンパク質分解活性及びタンパク質分解酵素(プロテアーゼ)から生じる、それを引き起こす、又はさもなければ、それに関連する経過において、有用な検出試薬として使用することができる。かかる疾患及び経過は、感染、脳卒中、血管疾患、心筋梗塞、及び種々の他の急性及び慢性炎症疾患の増悪及び悪化、それらによって生じる、又はそれらに起因するものを含む。出願者らは、タンパク質分解酵素の1つの特に有用なバイオマーカーが、先述の疾患のうちの幾つかにおいて増加レベルで検出されるscIgGであることを示した。scIgGが病理部位又は病理過程若しくは感染において胸部的に生成されるため、scIgGは、疾患部位における特定の組織又は細胞型の関与の測定基準としてのかかる過程の独自で特定のマーカーを提供する。
本発明の一実施形態において、サンプルは、プロテアーゼの上昇レベルを特徴とする疾患を有する、それを有していた、又はその治療を受けた対象から取得する。サンプルを、疾患刺激プロテアーゼと血清IgG群との接触に起因することが既知のIgG開裂フラグメントに対して特異性を有する、抗体調製物等の結合剤と接触させる。
本発明の方法を使用して、過去に疾患又は病状の診断を受けた患者が、進行した疾患(例えば、癌転移、侵襲性腫瘍増殖、持続感染等)のリスクがあるか否かを評価することができる。
幾つかの場合において、例えば、scIgGの検出は、癌患者において、タンパク質分解酵素、特にMMPの生産に関与することが既知の転移拡散を含む進行した疾患経過の指摘に役立ち得る。幾つかの態様において、腫瘍性疾患は、通常、炎症過程、組織修復、及び治癒(Coussens,L.M.and Werb,Z.2002.Nature 420(19):860〜867)と、これらの機構を共有する。他の研究は、例えば、皮質低下が、心臓及び血管事象、例えば、血栓症のリスク低下、並びにMMP−2及びMMP−9等のMMPの低下の両方と相互作用し、これらの酵素が動脈硬化プラークによって産生されることが示された(Deguchi,J,Maanori,A.,Ching−Hsuan,T.et al.2006 Circulation 114:555〜62)。したがって、本発明の方法は、重度の関節性症候群(RA、強直性脊椎炎)、ある特定の癌(特に、炎症性乳癌)、重度の冠状動脈異常状態(心筋梗塞及びうっ血性心不全)、並びに喘息等の他の疾患を含むが、これらに限定されない疾患を有する患者に特に適用可能である。本発明の方法を使用して、病態生理学がIgGに作用することが可能なプロテアーゼを伴う、又はそれを誘発するこれらの疾患及び病状を、分泌プロテアーゼ上昇の増進を特徴としない又はプロテアーゼがIgGを開裂しない他の病理学から区別し得る。
したがって、本明細書において説明される試薬を使用する方法が、開裂フラグメントの検出に対して特異的である一方、開裂フラグメントのより具体的な分析は、開裂抗体の様々な領域の結合特異性の分析を含むことができる。例えば、抗原結合選択度及びフラグメント化抗体検出を組み合わせる固相アッセイを使用して、対象におけるある特定の抗原及びプロテアーゼが共局在化され、したがって、タンパク質分解活性の部位での組織、疾患、又は病理学の性質についての情報を提供するか否かを決定することができる。
採血は、健康又は病気の対象、ヒト、又は動物からの組織サンプリングの最も頻繁に実施される形態である。scIgGは、全身において見られ、形成部位、すなわちプロテアーゼ活性部位に制限されず、特定の区画で局在化され得る疾患活性のレポーターマーカーである。かかる区画の1つは滑液である。したがって、血液又は血清採取は、本発明によって提供される試薬及び方法を使用して、初期の疾患の検出に容易で実行可能な供給源を提供する。あるいは、RA滑液、肺滲出液、生検、及び同等物等の局所設定のサンプリングも、診断を含む任意の段階の患者に、又は進行疾患を有する患者にも適用することができる。開裂抗体フラグメントは、直接染色法(免疫組織化学法)によってかかる組織サンプル中に、又はサンプルから得られる断片サンプル中に検出され得る。
血液を含む組織サンプルは、任意の残留活性プロテアーゼを抑制するように処理されなければならない。金属のキレート化(例えば、EDTA)は、効果的にMMPを抑制する。ヨードアセトアミドは、システインプロテアーゼ(例えば、IdeS)を阻害し、セリンプロテアーゼは、DFP及び同様の化合物で阻害することができる。活性プロテアーゼは、滑液中に存在し、それに応じて処理されなければならない。サンプルもまた、分析時まで冷凍で維持され得る。サンプルが適切に処理されると、本発明のscIgG特異的試薬は、当業者に既知の、又はまだ開発されていないELISA、ビーズに基づく形式、RIAに使用し得る。
本発明の抗IgGタンパク質開裂フラグメント試薬は、研究又は診断用途のための、及び緩衝液等の他の試薬と共に無傷ヒトIgG及び既知重量のIgG開裂等の標準物質、及び必要に応じて、対象から得た組織サンプルのIgGタンパク質分解酵素フラグメントの定量化と共に、販売用途としてのキットにパッケージ化され得る。
抗体療法
ヒンジペプチド開裂フラグメントに対して免疫特異的な本発明の抗体は、抗原結合ドメイン、例えば、Fab、F(ab’)2、scIgGを保持する、タンパク質分解活性開裂IgGの残留を結合することが可能であり、したがって、無傷Fc領域を提供することによってFcに関連する結合特性及び付随のエフェクター機能を回復する。したがって、本明細書に教示される方法により作製される抗体、又はインビボにタンパク質分解的に作製された抗体フラグメントへの結合特性を有する抗体は、治療的分子として有用であり得る。本発明の抗IgG開裂フラグメント抗体を使用して、疾患により誘発されたIgGのタンパク質分解開裂を特徴とする疾患を有する患者を治療することができる。一態様において、抗IgG開裂フラグメント抗体を使用して、標的特異的結合能力を保持する抗体フラグメントにエフェクター機能を回復し得る。
ヒンジペプチド開裂フラグメントに対して免疫特異的な本発明の抗体は、抗原結合ドメイン、例えば、Fab、F(ab’)2、scIgGを保持する、タンパク質分解活性開裂IgGの残留を結合することが可能であり、したがって、無傷Fc領域を提供することによってFcに関連する結合特性及び付随のエフェクター機能を回復する。したがって、本明細書に教示される方法により作製される抗体、又はインビボにタンパク質分解的に作製された抗体フラグメントへの結合特性を有する抗体は、治療的分子として有用であり得る。本発明の抗IgG開裂フラグメント抗体を使用して、疾患により誘発されたIgGのタンパク質分解開裂を特徴とする疾患を有する患者を治療することができる。一態様において、抗IgG開裂フラグメント抗体を使用して、標的特異的結合能力を保持する抗体フラグメントにエフェクター機能を回復し得る。
ヒト疾患又は病理の治療的又は予防的処理を目的とした抗IgG開裂部位抗体は、免疫減又は選択試薬として本発明のペプチドを使用して、本明細書に説明される方法によって調製され得る。開裂ヒンジフラグメントに対して特異的な他の結合ドメインもまた、結合ドメインが、免疫特異的IgG開裂産物にCDC又はADCC等のエフェクター機能を回復することが可能なFcドメインに関連する限り使用され得る。勿論、修飾された、又は変異Fc配列も、幾つかのFcR駆動相互作用を強化し、その他を減衰させる目的のために本発明によって包含される。修飾Fc領域は、例えば、米国特許第6737056号、同第7083784号、同第7317091号、同第7355008号、同第7364731号、同第7371826号、同第7632497号、同第7670600号、同第20040002587A1号、国際公開第WO06105338A2号、同第WO200905849及び同第WO2009086320号に教示される。
したがって、本発明は、プロテアーゼ開裂IgGを結合し、エフェクター機能を回復することが可能な抗IgG開裂産物抗体又はFc融合タンパク質の組み換え産生のための核酸配列、ベクター、宿主細胞を含んで提供される。
ワクチン接種
抗原結合ドメイン、例えば、Fab、F(ab’)2、scIgGを保持し、したがって、機能的Fc領域を提供することによって抗体のFc関連結合特性及び付随のエフェクター機能を回復する、酵素的に開裂したIgGの残留を結合することが可能な、開裂特異的フラグメントに対して免疫特異的な本発明の抗体は、本明細書に開示される開裂フラグメントペプチドでの免疫付与によって対象に誘発され得る。抗IgG開裂産物抗体は、宿主動物をプロテアーゼ開裂部位特異的ペプチド又はタンパク質分解開裂IgGフラグメントで免疫付与し、動物の血清から抗体を回復させることによって調製することができる。かかる方法において、免疫付与された動物は、本発明の抗体の源であり、診断試験のための試薬として使用されるか、あるいは、治療的に使用される抗体が、説明される方法、又は当該技術分野において既知の方法によって調製される。特定の実施形態において、ヒト対象は、プロテアーゼ開裂部位特異的ペプチド又はタンパク質分解開裂IgGフラグメントで免疫付与され、抗IgG開裂産物は、インビボで生成される。一実施形態において、プロテアーゼ開裂部位特異的免疫原は、配列番号5〜11の配列等のプロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側上にある配列番号1、2、3、又は4のヒトIgGヒンジ領域配列から選択された少なくとも5つの連続アミノ酸、そのN末端切断及び化学的相同体からなる群から選択される。
抗原結合ドメイン、例えば、Fab、F(ab’)2、scIgGを保持し、したがって、機能的Fc領域を提供することによって抗体のFc関連結合特性及び付随のエフェクター機能を回復する、酵素的に開裂したIgGの残留を結合することが可能な、開裂特異的フラグメントに対して免疫特異的な本発明の抗体は、本明細書に開示される開裂フラグメントペプチドでの免疫付与によって対象に誘発され得る。抗IgG開裂産物抗体は、宿主動物をプロテアーゼ開裂部位特異的ペプチド又はタンパク質分解開裂IgGフラグメントで免疫付与し、動物の血清から抗体を回復させることによって調製することができる。かかる方法において、免疫付与された動物は、本発明の抗体の源であり、診断試験のための試薬として使用されるか、あるいは、治療的に使用される抗体が、説明される方法、又は当該技術分野において既知の方法によって調製される。特定の実施形態において、ヒト対象は、プロテアーゼ開裂部位特異的ペプチド又はタンパク質分解開裂IgGフラグメントで免疫付与され、抗IgG開裂産物は、インビボで生成される。一実施形態において、プロテアーゼ開裂部位特異的免疫原は、配列番号5〜11の配列等のプロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側上にある配列番号1、2、3、又は4のヒトIgGヒンジ領域配列から選択された少なくとも5つの連続アミノ酸、そのN末端切断及び化学的相同体からなる群から選択される。
開裂部位特異的免疫付与又は「ワクチン戦略」の使用は、IgG内の残基特異的開裂によって形成されたエピトープのための開裂部位特異的抗体の特異性のみに制限された、プロテアーゼ由来(すなわち、タンパク質分解で強化された腫瘍の場合において細菌由来又は宿主由来)を含まないIgGの生来のFcドメイン機能の一般的回復を提供する。個人は、望ましい場合に、幅広い抗体回復能力のために、1つ以上の開裂部位ペプチド又は類似ペプチドでワクチン接種され得る。あるいは、患者は、開裂部位特異的抗体反応を生成するために、ワクチン接種前、その最中、又はその後に開裂部位特異的抗体で治療され得る。特定の実施形態において、個人は、標的抗体活性が、エフェクター機能に関与し、抗体は1つ以上のIgG開裂プロテアーゼによる開裂を受けるものであって、所与の疾患状態を治療するために設計された標的抗体調製物の投与前、それと同時に、又はその後に疾患特異的開裂部位特異的ペプチド又は類似ペプチドでワクチン接種される。このようにして、標的抗体のエフェクター機能は、回復することができ、抗体処理の効果は、抗体の標的機能が変更されずに強化されるか、又は回復される。一実施形態において、対象において治療される疾患は、1つ以上のIgG開裂プロテアーゼの生産を特徴とする(表1参照)。
ワクチン接種方法は、当該技術分野において周知であり、特に、低分子抗原、すなわちハプテン、及び直鎖ペプチドは、その複数がキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)等の免疫原でもあり得るキャリア分子に抱合するとき、より免疫原性であることは既知である。多くの抱合方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、G.T.Hermansonによる「Bioconjugate Techniques」、Academic Press、1996に説明されている。簡潔に述べると、キャリアへのハプテンの抱合は、一般に、両端において反応性官能基を有する様々な長さの直鎖分子からなるリンカー又はより適切には架橋リンカーによって達成される。ホモ二官能性リンカー(すなわち、グルタルアルデヒド)において、2つの官能基は、同一であり、ヘテロ二官能性リンカーでは、それらは異なる。詳細な抱合化学は周知である。標的IgG開裂フラグメントが、免疫グロブリンのN末端部分(可変領域、CH1、及び幾つかの場合において、コアヒンジドメインの一部)に関連する抗原特異的結合ドメインを保持するため、抗体反応は、開裂部位における新規のC末端に相当する類似ペプチドの部分に指向されなければならない。したがって、類似ペプチドのN末端を抱合し、免疫原として遊離C末端残基を提示することが望ましい。
ワクチン接種方法において、アジュバント(例えば、アルミニウム含有アジュバント(Alum)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、完全フロイントアジュバント(CFA))を、非抱合型又は抱合型ヒンジ領域類似ペプチドと使用して、抗体(液性又はTh2駆動)を生成するための免疫反応を指向し、開裂部位特異的フラグメントに対して結合ドメインを指向することができる。天然リガンドgp39等のCD40作動薬を使用して、免疫反応を刺激することができる。好ましくは、抗原提示細胞、好ましくは樹枝状細胞上のCD40受容体を活性化するCD40作動薬が一例である。
ヒトワクチン
安全かつ有効なヒトワクチン調製物が開発されている。組み換えタンパク質ベースのワクチンの免疫原性を強化するために、アジュバントが必要である。最も広く使用されるアジュバントは、ベーマイト及びヒドロキシリン酸アルミニウム等の一般にミョウバンと呼ばれる不溶性アルミニウム塩である。ミョウバンアジュバントは、主にTh2型サイトカイン反応を誘発する(Lindblad,2004、Raz & Spiegelberg,1999、Valensi et al.,1994)。したがって、代替的アジュバントは、ペプチドワクチン開発の成功に必要であり得る。
安全かつ有効なヒトワクチン調製物が開発されている。組み換えタンパク質ベースのワクチンの免疫原性を強化するために、アジュバントが必要である。最も広く使用されるアジュバントは、ベーマイト及びヒドロキシリン酸アルミニウム等の一般にミョウバンと呼ばれる不溶性アルミニウム塩である。ミョウバンアジュバントは、主にTh2型サイトカイン反応を誘発する(Lindblad,2004、Raz & Spiegelberg,1999、Valensi et al.,1994)。したがって、代替的アジュバントは、ペプチドワクチン開発の成功に必要であり得る。
抗原のポリマー微小粒子封入は、ワクチンアジュバントとして評価されている(Eyles et al.,2003J Drug Target 11,509〜514、Singh et al.,2004 Expert Opin Biol Ther 4,483〜491)。ポリ(DL−ラクチドコグリコリド)(PLG)で形成された微小粒子は、当該技術分野において周知である。
様々な水中油型エマルションもまた、ミョウバンに対する代替的アジュバントとして開発されている。これらの最も進化したものは、許容される安全プロファイルを有する潜在的なアジュバントである、スクアレン水中油型エマルション(MF59)である。フラウドと呼ばれるインフルエンザワクチン産物は、MF59を含む。ミョウバンのように、MF59は、インビボ樹枝状細胞による抗原摂取を促進することができる。その上、筋肉内注射後に、MF59がリンパ節に移動するAPCによって内在化されることが示されている。抗原送達を促進する以外に、MF59もまた、それが筋肉内注射後に血単核細胞の流入を促進することが認められたため、局所炎症誘発性アジュバントとして機能する。
ミョウバン、MF59、又は微小粒子と組み合わせて使用することができる他の分子には、ワクチンに対するTh1型反応を強化するためのCpG、GM−CSF、及びIL−2が挙げられるが、これらに限定されない。
混合されたアジュバント又は「ワクチン」を有する、又は有さない調製免疫原は、皮内、皮下、鼻腔内、及び筋肉内等に制限されない任意の好適な経路によって対象に投与され得る。
ワクチン接種のために様々なプロトコルを使用し得る。本発明の一態様として意図される1つのプロトコルは、所望の免疫原を含む第1のワクチン組成物、プライムワクチン組成物が、プライムワクチン組成物の免疫原と形態が異なる対応する免疫原を含むブーストワクチン組成物と併せて投与される、プライムブーストプロトコルである。ブーストワクチン組成物は、プライムワクチン組成物と同時に投与され得るか、又はプライムワクチン組成物の初期投与の後のある時点において投与され得る。プライム及びブーストワクチン組成物は、同一経路を介して投与され得るか、異なる経路を介して投与され得る。プライム及びブースト組成物が同時に投与される場合、それらは、同一の製剤の一部として、又は異なる製剤として投与され得る。プライムワクチン組成物及びブーストワクチン組成物の両方は、1回又は数回投与され得る。したがって、プライムワクチンの投与量は、ブーストワクチンの投与量の投与後に投与され得る。これら及び他の既知の、又はまだ発見されていない、様々なワクチン投与経路及びワクチン投与のタイミングを使用してワクチンプロトコルを最適化することは、当業者の技術範囲内である。
本発明は一般的な用語で説明したが、本発明の実施形態は、以下の実施例において更に開示される。
実施例1:免疫グロブリン開裂部位特異的抗体調製物を引き起こすためのペプチド免疫原の使用。
内因性プロテアーゼによって産生された宿主(患者)抗体フラグメントの存在の確認は、開裂IgGに選択的に結合するが、無傷IgGには結合しない試薬を必要とする。開裂構成要素の特定、及び正常集団と比較した疾患を有する患者からのサンプル内のフラグメント含有量の定量的差異の両方は、試薬を使用して評価することができなければならない。
内因性プロテアーゼによって産生された宿主(患者)抗体フラグメントの存在の確認は、開裂IgGに選択的に結合するが、無傷IgGには結合しない試薬を必要とする。開裂構成要素の特定、及び正常集団と比較した疾患を有する患者からのサンプル内のフラグメント含有量の定量的差異の両方は、試薬を使用して評価することができなければならない。
比較的高濃度の無傷IgG濃度を含有する未知であるが恐らく少量のIgGフラグメントの溶液中の検出は、困難である。scIgGが、可能性のあるIgG開裂フラグメントとして記載されているが(Gearing 2002 supra)、ヒトサンプルの定量化は、過去に実施されていなかった。この目的のため、必要な特異性を有する試薬を、開裂IgGに対して高い特異性を有するが、無傷IgGには有さないウサギで生成した。
ヒトIgG1ヒンジの3つの抱合された、及び徐々に長くなる単鎖ペプチド類似体を、免疫付与に使用した(Invitrogen Corporationにおいて)。MMP−3開裂部位のアミノ末端側上のアミノ酸配列に一致する8−merペプチドを、N末端(TCPPCPAP、配列番号1の残基7〜14)を介してキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に共有的に付着させた。グルタミルエンドペプチダーゼ部位(TCPPCPAPE、配列番号1の残基7〜15)及びIdeS部位(TCPPCPAPELLG、配列番号1の残基7〜18)に一致する延長ペプチドを、免疫原として別個に調製した。ニュージーランドウサギ(1つの免疫原当たり2匹)を、完全フロインドアジュバントの0.2mgの抱合ペプチドの皮下注射により免疫付与し、不完全フロイントアジュバントの0.1mgの抗原で更に3回、14日目、42日目、及び56日目に再ブースした。4週目、8週目、及び10週目に血清を収集し、抗体精製のために免疫原毎にプールした。免疫タイターを、固相抗原ペプチドに基づくELISAによって監視した。
抗体の親和性精製は、活性化支持体上で固定化されたそれぞれのペプチド抗原を採用した。同一の抗原で免疫付与された2匹のウサギからの抗血清をプールし、抗原カラムを完全に洗浄した後に、抗原カラムを通過させた。特定の抗体を、それぞれ3M KSCN及び0.1Mグリシン、pH 2.5を使用して低親和性及び高親和性プールとして溶出した。2つのプールは、区別できない結合特性を生じ、交互に使用された、及び/又はプールされた。結合抗体の3つの別個に溶出したプールを、次に、今回は、ヒトIgG1重鎖定常領域(Mab3)を含む無傷抗体を含有するカラム上で、第2の親和性吸収工程の対象とした。2番目の親和性クロマトグラフィー工程の目的は、無傷IgGを認識し得る望ましくない抗体を除去することであった。しかしながら、IgGカラムに吸収されたウサギ抗体は、ほとんど、又は全くなく、抗体群は、その暴露されたカルボキシ末端を有する「開裂」配列のみと反応性であったことを示唆した。
個々の親和性精製ウサギの抗ペプチド抗体を、ELISAによってヒトIgGの酵素的生成フラグメント並びに無傷IgGへのそれらの結合能力に対して試験した(図3)。配列番号1の残基7〜14(MMP−3部位類似体)に抱合するKLHで免疫付与されたウサギの精製抗体は、無傷IgGに結合せず、MMP−3でのIgGno消化によって産生されたscIgG及びF(ab’)2に対して特異性が高かった。この抗体調製物は、V8プロテアーゼ及びIdeSで産生されたscIgG及びF(ab’)2に対して最小限の反応性を示した。対照的に、V8開裂部位ヒンジペプチド類似体(配列番号1の残基7〜15)及びIdeS開裂部位ヒンジペプチド類似体(配列番号1の残基7〜18)で免疫付与されたウサギから取得した抗体は、これらの2つの酵素のいずれかによって産生されたscIgGs及びF(ab’)2に対して交差反応性結合プロファイルを示した。しかしながら、これらの調製物は、MMP−3消化産物に対して最小限の反応性を示した。抗体調製物のいずれも無傷IgGと結合せず、抗体調製物のいずれも、図4に示されるように、3つの異なる酵素によって産生されたF(ab’)2及びscIgGを含むフラグメントと同等に反応性ではなかった。
抗ヒンジ試薬の目的とした使用は、複雑なインビボ設定で疾患特異的組織に存在する酵素によって産生されたか、又は疾患特異的細胞若しくは細胞集団、例えば、湿潤性マクロファージ若しくは好中球によって産生された、scIgG及びF(ab’)2(及び他の潜在的なフラグメント)の検出である。潜在的IgGフラグメントの最適な適用範囲では、できる限り広域な開裂部位認識プロファイルを有することが望ましいと考えられた。この理由により、3つのウサギ抗体プールのそれぞれの混合物を、後に続くウエスタンブロット法及び血清ベースのELISA試験での使用のために、0.33mg/mLの各構成要素(合計=1mg/mL)で調製した。このプールされた試薬は、RAH−1と称される。
RAH−1試薬を、別の炎症性流体、関節リウマチ(RA)を有する患者の滑液内にIgGフラグメントを検出するその能力に対して試験した。RA患者からの滑液サンプルを市販で購入した。図5に示されるように、RAH−1調製物は、無傷IgGと反応しなかったが、すべての3つのプロテーゼ消化から、scIgG、F(ab’)2、恐らくFab’を検出した。RA患者からのすべての5つの滑液サンプルでは、バンドを、ほぼscIgG、F(ab’)2、及びFab’のサイズで検出し、これらのタンパク質分解フラグメントがRAを有する個人からの滑液内に存在することを示唆する。
関節リウマチ(RA)を有する10人の対象、及び10人の年齢と性別が一致した健康な個人からの血清サンプルをGenomic Collaborativeから入手した。ELISA結果は、RAを有する10人の対象中の4人が、>60μg/mLの血清scIgG濃度を表したことを示した。健康な対照グループにおいて、scIgG濃度は、<8.2μg/mL〜52.7μg/mLの範囲であった。この比較のためのサンプルは、疾患の段階、治療レジメン等のために厳密に選択されなかったが、これらの市販のサンプルへのこのアッセイは、上昇したscIgG濃度が疾患を有する患者において検出することができることを示唆する。
別の試験において、罹患した個人からの市販の血清源をGenomics Collaborative(現SeraCare Life Sciences Inc.)として特定した。それぞれ8つの疾患の10人の異なる個人からの少量の容積(300マイクロL)の血清を購入した。疾患カテゴリーは、関節リウマチ、変形性関節症、喘息、1型糖尿病、乳癌、肺癌、心筋梗塞、及びうっ血性心不全であった。加えて、28人の年齢一致及び性別一致の健常なボランティアからの血清を対照としてこの販売者から入手した。
ELISAフォーマットアッセイを使用して、サンプルを分析し、結果を図6に示す。アッセイは、RAH−1試薬の選択性に基づき、既知の特異的プロテアーゼにより生成されたものと比較して、IgG開裂産物が明らかに検出可能であり、炎症性自己免疫疾患、関節リウマチでは、健康又は正常なドナーで維持されたレベルを上回ることを証明した。対照的に、変形性関節炎を有する患者は、正常な個人のサンプルのレベル範囲と同様であり、その範囲内を示した。
実施例2:抗ヒンジIgGモノクローナル抗体の調製物
製造及びヒト患者における潜在的使用のために、開裂IgGを結合し、無傷IgGを結合しないモノクローナル抗体等の定義された分子を産生することが望ましい。以下の手順は、かかる分子の生成方法を示す。
製造及びヒト患者における潜在的使用のために、開裂IgGを結合し、無傷IgGを結合しないモノクローナル抗体等の定義された分子を産生することが望ましい。以下の手順は、かかる分子の生成方法を示す。
ヒトIgG1下部ヒンジ領域の12−merペプチド類似体及び隣接CH2ドメインは、ヒトIgG1のIdeS開裂部位のペプチド類似体である免疫原:TCPPCPAPELLG(配列番号1の残基7〜18)である。天然に存在するシステインを、変異型TAPPAPAPELLG(配列番号12)を与えるためにアラニンによって置換した。標準的化学手法によってN末端システインを追加し、キーホールリンペットヘモシアン(KLH)への抱合を可能した。
ニュージーランドシロウサギ(3)を、複数回の皮下部位(5)を使用して完全フロインドアジュバントの0.5mgのKLHペプチドで免疫付与した。動物を、3週間の間隔で合計4回の免疫付与のために不完全フロイントアジュバントの0.25mgの免疫原でブーストした。
同一のペプチドのBSA抱合型の血清抗体タイターを、標準ELISA方法によって免疫付与の過程中に監視した。動物(2)をタイターデータに基づき脾臓摘出に選択した。ウサギハイブリドーマを、ウサギ縮合パートナー細胞と縮合した脾臓誘導のリンパ球から生成した(Spieker−Polet,1995 PNAS USA 92(20):9348〜9352)。細胞増殖を複数のプレートでの縮合2〜3週間後に観察した。
陽性ハイブリドーマをBSA免疫原ペプチド抱合でコーティングされたプレート上のELISAを介してスクリーニングした。各縮合から複数の陽性クローンが特定された。更なるスクリーニングには、無傷IgG1及びIgG1の様々な酵素生成F(ab’)2フラグメントへの結合が伴った。これらのスクリーニング又はカウンタースクリーニング策には、3つのクローン(指定33−2、91−2、及び68−6)を、免疫原ペプチドへの、及び免疫原ペプチドのC末端又はその近傍のC末端を有する、及び無傷IgG1との最小結合を有するF(ab’)2フラグメントへの結合の強い選択性に基づき選択した。陽性ハイブリドーマをサブクローンし、拡大した。
ウサギIgGを、固定化タンパク質Aのクロマトグラフィーを含む標準方法によって個別の細胞上澄みから精製した。精製されたウサギIgGのヒトIgGヒンジ領域のペプチド類似体への結合の特異性、並びにIdeS及びMMP−3酵素を用いてAb内で開裂された単一又は二重開裂(F(ab’)2)から作製された無傷IgG及び精製IgGフラグメントを、標準ELISAプロトコルで試験した。簡潔に述べると、標準ペプチド化学によって合成され、N末端ビオチン化したペプチドを、ストレプトアビジンでコーティングされたウェル上で捕捉した。IgG及びフラグメントを、直接、10μg/mLでコーティングした。ウサギmAbの結合を、よく特徴付けられたヤギ抗ウサギIgG Fc−西洋ワサビペルオキシダーゼ及びOPD基質システムによって検出した。
ウサギmAb 91−2のELISA結果を図7に示す。配列番号1の残基16〜23(L−L−G−G−P−S−V−F)のいずれかで終端する下部ヒンジペプチドへの明らかな結合選択性があった。配列番号1の3〜15(D−K−T−H−T−C−P−P−C−P−A−P−E)に包括される上部ヒンジ、コアヒンジ、又は初期下部ヒンジのこれらのセグメントに一致する上流残基のいずれかで終端するペプチドへの結合がほとんどない、又は全くない。MMP−3生成のF(ab’)2フラグメント及びscIgGフラグメントへのごくわずかな結合があった(配列番号1の残基14及び15(P−A−Pで終わる)との間のMMP−3開裂部位のペプチド類似体への結合不足に一致する)。対照的に、C末端配列(−P−A−P−E−L−L−G)を有するべきである、Ides生成のF(ab’)2フラグメント及びscIgGへの実質的結合があった。したがって、ウサギmAb結合特異性は、それを引き起こした免疫原によく適合した。直接コーティングされたrb(ウサギ)IgGは、陽性対照であった。
補体アッセイ
WIL2−S細胞、CD20(ATCC CRL−8885)を発現するリンパ芽球様B細胞株を、CDCアッセイに標的細胞として使用した。50μlの細胞を、96ウェルプレートのウェルに追加し、RPMI、5%の加熱不活性化FBS、0.1mMの非必須アミノ酸、1mMのプルビン酸ナトリウム、ペニシリン(500U/ml)、ストレプトマイシン(500U/ml)、2mMのL−グルタミンのウェル当たり最終濃度8×104細胞を得た。様々な濃度の抗体とともに、又はそれ無しで、付加的な50μlをウェルに追加し、プレートを室温で2時間インキュベートとした。50μlの10%のウサギ補体(Invitrogen)をウェルに追加し、プレートを37℃で20分間インキュベートした。全ての試料は3組で実行された。プレートを200gで3分間遠心分離し、プレートを分離するために50μlの上澄みを除去し、CDCをラクテートデヒドロゲナーゼ(LDH)細胞毒性検出キット(Roche)で測定した。吸収度を、Spectra max Plus 384(PerkinElmer)を使用して測定した。データを、Triton X−100(Sigma Aldrich)並びに細胞及び補体のみを含む最小コントロールで最高細胞毒性に正規化した。
WIL2−S細胞、CD20(ATCC CRL−8885)を発現するリンパ芽球様B細胞株を、CDCアッセイに標的細胞として使用した。50μlの細胞を、96ウェルプレートのウェルに追加し、RPMI、5%の加熱不活性化FBS、0.1mMの非必須アミノ酸、1mMのプルビン酸ナトリウム、ペニシリン(500U/ml)、ストレプトマイシン(500U/ml)、2mMのL−グルタミンのウェル当たり最終濃度8×104細胞を得た。様々な濃度の抗体とともに、又はそれ無しで、付加的な50μlをウェルに追加し、プレートを室温で2時間インキュベートとした。50μlの10%のウサギ補体(Invitrogen)をウェルに追加し、プレートを37℃で20分間インキュベートした。全ての試料は3組で実行された。プレートを200gで3分間遠心分離し、プレートを分離するために50μlの上澄みを除去し、CDCをラクテートデヒドロゲナーゼ(LDH)細胞毒性検出キット(Roche)で測定した。吸収度を、Spectra max Plus 384(PerkinElmer)を使用して測定した。データを、Triton X−100(Sigma Aldrich)並びに細胞及び補体のみを含む最小コントロールで最高細胞毒性に正規化した。
図8は、3つのウサギ開裂部位特異的mAbが、CD20を結合する抗体のF(ab’)2フラグメントの固定濃度の存在下で滴定されるとき、補体依存性細胞溶解を標的細胞に回復させることができたことを示す。ウサギmAbは、ポリクローナルウサギ開裂部位特異的mAb調製物(上記で説明される同一の血清scIgG検出システムの構成要素)よりも低い濃度で有効であった。CD20の無傷抗体は、予想されるように活性であったが、そのF(ab’)2フラグメント及びscIgG型のみは活性ではなかった。ウサギ開裂部位特異的mAbは、細胞結合F(ab’)2フラグメントの不在下で細胞溶解を誘導することができなかった。これらの結果は、モノクローナル部位特異的抗体が、補体媒介エフェクター機能を、さもなければIgG1の不活性タンパク質分解開裂産物を再構成することができることを確立する。
ヒトシステムにおけるエフェクター機能の回復を試験するために、Mab 91−2のウサギ抗体変異ドメインをクローンし、ヒト定常ドメインに縮合し、HEK293細胞内で発現させた。得られたウサギキメラMabは、2095−2と指定した。抗体特異性を再度、ELISA形式で開裂部位ペプチドへ結合させることによって試験し、最高の親和性が−P−A−P−E−L−L−Gで終端するペプチドであったことを確定した。
結合特異性を更に、表面プラズモン共鳴プラットフォーム(Biacore)を使用して、2095−2抗体のFabフラグメントを使用して検査した。簡潔に述べると、Fabを、標準NHS/EDCカップリングを使用して、3つの異なる表面密度(8500、1650、及び350 RU)でBiacore 2000内のCM5センサーチップに対して固定化した。泳動緩衝液は、10mMのHEPES、pH 7.4、150mMのNacl、及び0.01%のTween−20を含有した。データを25℃で収集した。
3つのN末端のビオチン化ペプチドを、固定化Fabへの結合に対して試験する:WTは、化膿連鎖球菌IdeSプロテアーゼによる開裂後のヒトIgG1開裂部位からのペプチドフラグメントの予測された配列に相当し、E233Aは、C末端の4位上流のアミノ酸残基で単一アラニン置換を有する変異体に相当し、L234Aは、C末端から3位上流のアミノ酸残基に単一アラニン置換を有する変異体である。ペプチドを、カップリング化学と適合するペプチドを作製し、モノマー構造を保存するためにセリンを置換することによって修飾した。
ペプチド野生型及びE233Aを、それぞれ、最高濃度としての588nM及び2.9μMを使用して3倍の希釈系列において試験した。ペプチドL234Aを、2倍の希釈系列において最高濃度としての14.7μMで試験した。各ペプチド濃度系列を、3つの異なる濃度のFab表面の上で三部試験した。会合及び解離を1分間監視した。表面を、1/500希釈のリン酸の12秒の注射で再生成した。各表面からの反応データを全体的に適合させて、下記の表に要約される結合定常を決定した。各ペプチド相互作用は、サンプル1:1(Langmuir)モデルに非常によく適合する。
会合速度(M−1s−1のka))は、10の倍数未満ほど異なったが、解離速度(s−1のkd)は、200倍以上異なった。3つのペプチドの算出されたnMのKDを下記に示す(表2)。
これらの結果は、モノクローナル抗体2095−2が、ヒトIgG1のN末端(上流)配列のIdeS開裂部位ペプチドの類似体であり、システイン残基が原因のモノマー構成にある、使用される免疫原への結合に対して特異性が高いことを示す。
実施例3:開裂部位特異的抗体のインビボモデル
開裂部位特異的抗体のインビボ開裂IgGを救う能力を試験するために、「組織ケージ」(Fernandez JA,et.al.(1997)Antimicrob.Agents Chemother.43(3):667〜671)を採用する細菌感染のモデルを適用した。このシステムにおいて、ウィッフルボールは、外科的に背側頚部領域に皮下に移植される。モデルは、感染体が容易にアクセス可能な流体区画、組織パウチ内に局所化されることを可能にし、細菌に対する抗生物質の有効性を評価するために使用されている。
開裂部位特異的抗体のインビボ開裂IgGを救う能力を試験するために、「組織ケージ」(Fernandez JA,et.al.(1997)Antimicrob.Agents Chemother.43(3):667〜671)を採用する細菌感染のモデルを適用した。このシステムにおいて、ウィッフルボールは、外科的に背側頚部領域に皮下に移植される。モデルは、感染体が容易にアクセス可能な流体区画、組織パウチ内に局所化されることを可能にし、細菌に対する抗生物質の有効性を評価するために使用されている。
本システムにおいて、ウサギウィッフル流体ボールは、ウサギ血清において報告されている5〜10mg/mlのIgGとは対照的に、約1.5mg/mlのIgGを含有することが発見された。GluV8発現細菌黄色ブドウ球菌でのウサギの感染が、ウィッフルボール内のウサギIgGの開裂を生じるであろうということが我々の仮定である。更に、GluV8開裂IgG開裂部位特異的ペプチド類似体でのウサギのワクチン接種は、ブドウ球菌に対する一定の保護を提供するロバストな開裂部位特異的タイターを生じるであろう。
モデルが、ウサギ開裂部位特異的抗体が黄色ブドウ球菌感染に対するあるレベルの保護を提供することができることを示す陽性結果を提供するために、4つの要素が実行されなければならない。第1に、GluV8は、ウサギIgGを開裂することが可能でなければならない。第2に、ウサギは、既存の黄色ブドウ球菌抗原に対するある免疫活性を有さなければならないか、又は黄色ブドウ球菌が対象IgGになるため、感染直後に黄色ブドウ球菌に対する抗体媒体性免疫反応を生成することが可能でなければならない。第3に、ワクチン接種アプローチは、開裂ウサギIgGを結合するために十分な親和性及び特異性の開裂可能部位特異的抗体をもたらさなければならない。最終的に、開裂抗体類似体で免疫付与された動物は、免疫付与されていない動物とは測定可能に異なる反応を呈さなければならない。
我々は、GluV8が、インビトロ下部ヒンジ領域に位置するアミノ酸E233とL234との間でヒトIgG1を開裂すること(国際公開第WO2009/023457A1号、Ryan MH,et al.(2008)Mol Immunol 45(7):1837〜1846)を以前に示した。この領域内のウサギIgG下部ヒンジ領域の配列は、単一アミノ酸変化A231Pを除き、ヒトIgG1配列と同等である。GluV8開裂部位として、酵素は、ウサギIgGに作用することが予測される。
接種3日後に、血清、及び黄色ブドウ球菌含有のウサギのウィッフルボール流体からのウサギIgGを、タンパク質A試薬を使用して別個に精製した。ウサギIgGの得られた調製物を、MALDIによって分析し、IgG開裂の量を決定した。ウサギ血清IgGのMALDI分析は、IgGの一価分子イオン(143,600Da)、無傷IgGの二価分子イオン(71,700Da)、及びウサギアルブミン(65,800Da)に一致する、3つの主要ピークを明らかにした。対照的に、ウィッフルボールウサギIgGのMALDI分析は、Fcフラグメントの一価分子イオン(52,800Da)、Fcフラグメントの二価分子イオン(25,500Da)、及び無傷IgGの一価分子イオン(143,700Da)に一致する小さいピークを含んだ。これらの結果は、黄色ブドウ球菌を含有するウィッフルボール流体から精製されたウサギIgGが、開裂IgGを含有し、血清から精製されたウサギIgGが検出できないIgG開裂産物を有する無傷IgGを含有しなかったことを示した。したがって、インビボウサギIgGが、ヒトIgG1のように、黄色ブドウ球菌を含有する微小環境内で開裂を受けやすいと結論付けた。
黄色ブドウ球菌に対する研究動物の免疫状態に関して、血清中の既存の免疫反応性の存在を、2つの黄色ブドウ球菌由来抗原を使用して、ELISAによって試験した。これらは、ブドウ球菌α毒素(α溶血素、H1a)及びブドウ球菌外毒素B(共通して食中毒に関連する毒素)であった。その後ヒンジ類似ペプチドで免疫付与された6匹のウサギからの研究前血清、及び6匹の免疫付与されていない対照ウサギからの接種前血清を、1:50、1:200、及び1:800の希釈で、2つの毒素への結合に対して試験した。陽性タイターを、最高の希釈として定量化し、光学密度(490nm)は、一致する対照ウェル(抗原でコーティングされていない)で得られた信号の2倍又はそれ以上であった。加えて、ウサギがかかるタンパク質に暴露される可能性が低いため、ヒトインテグリン及びトリタマゴアルブミンを、潜在的な陰性対照として試験した。結果を下記に表集計した(表3)。
結果
結果は、12匹の研究動物において、その後の抗ブドウ球菌毒素反応性の発生が存在することを示した。数匹のウサギでは、タイターは、試験された最大希釈(1:800)を明らかに超えた。対照的に、ヒト及びトリ抗原への免疫反応性の発生は、著しく低く、1:50の希釈でのみ検出可能であった。これらの結果は、ウサギが、生涯、黄色ブドウ球菌に自然に暴露され、接種時のブドウ球菌抗原の即座に標的にすることが可能でなければならない、又は迅速にリコール反応を開始する能力を保持するという仮定を支持した。これらの所見は、黄色ブドウ球菌抗原への抗体のスペクトルが、細胞表面構成要素に抗原を含んで存在し得ることを示唆する。
結果は、12匹の研究動物において、その後の抗ブドウ球菌毒素反応性の発生が存在することを示した。数匹のウサギでは、タイターは、試験された最大希釈(1:800)を明らかに超えた。対照的に、ヒト及びトリ抗原への免疫反応性の発生は、著しく低く、1:50の希釈でのみ検出可能であった。これらの結果は、ウサギが、生涯、黄色ブドウ球菌に自然に暴露され、接種時のブドウ球菌抗原の即座に標的にすることが可能でなければならない、又は迅速にリコール反応を開始する能力を保持するという仮定を支持した。これらの所見は、黄色ブドウ球菌抗原への抗体のスペクトルが、細胞表面構成要素に抗原を含んで存在し得ることを示唆する。
実施例4:免疫付与
実施例3に説明される手段は、試験対象ウサギが、天然の細胞標的抗原に対して提供し得る、黄色ブドウ球菌抗原に対する免疫タイターを以前に展開させたことを実証した。ウサギが、細菌チャレンジに対して保護するために開裂部位ペプチドでのワクチン接種後に十分に特異的でロバストな開裂部位特異的抗原反応を生成したか否かを決定するために、以下の実験を実施し、そこで、ウサギを、免疫原KLHに抱合されたGluV8開裂部位ペプチド類似体(配列番号1の残基7〜15、TCPPCPAPE)で免疫付与した。
実施例3に説明される手段は、試験対象ウサギが、天然の細胞標的抗原に対して提供し得る、黄色ブドウ球菌抗原に対する免疫タイターを以前に展開させたことを実証した。ウサギが、細菌チャレンジに対して保護するために開裂部位ペプチドでのワクチン接種後に十分に特異的でロバストな開裂部位特異的抗原反応を生成したか否かを決定するために、以下の実験を実施し、そこで、ウサギを、免疫原KLHに抱合されたGluV8開裂部位ペプチド類似体(配列番号1の残基7〜15、TCPPCPAPE)で免疫付与した。
ヒトIgG1ヒンジの残基225〜233のペプチド類似体を、化学的に合成した。免疫原ペプチド、C−T−S−P−P−S−P−S−P−A−P−E(Cys−Thr−Ser−Pro−Pro−Ser−Pro−Ala−Pro−Glu、配列番号16)を、結合のためのN末端Cyr、及びIgG内の226及び229位で生じるCysのためのSerの内部置換を含み、これらの位置におけるペプチドの酸化及び二量体化を回避するように設計した。
ペプチドを、0.25mmolスケールのFastMoc化学及びFmoc−Glu(OtBu)−ワング樹脂を使用して、ABI 433Aペプチドシンセサイザー上で調製した。約190mgの粗ペプチドを、樹脂から放出し、2つのVydac C−18カラム上で、複数回の注射を介して精製した。留分を収集し、RP−HPLC及びMALDI−TOF MSによって分析した。プールされた留分は、Ellman試験によって、38mgの遊離システインを有する凍結乾燥産物をもたらした。
ペプチドのキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)への抱合を、Imject免疫原EDCキット(Pierce product no.77622)を使用してEDCカップリング化学(1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド)で達成した。EDC抱合緩衝液中の4mg/mLの22mgの精製ペプチドを、水中で10mg/mLのKLHの等価質量と組み合わせた。ペプチドのKLHへの結合は、室温で2時間ゆっくり混合しながら、混合物へのEDC溶液を添加した後に生じた。上記の工程のすべてを、製造者の指示に従い実行した。抱合混合物を、PBSに対して透析して、過剰な結合試薬を除去した。KLHペプチド抱合を、実施例1に説明されるポリクローナルウサギ開裂部位特異的特異的抗体調製物RAH(配列C−P−P−C−P−A−P−Eで終わる開裂部位特異的類事ペプチドへの反応性)、及び補足及び検出抗体としてのビオチン化抗KLH抗体をそれぞれ使用してサンドイッチ免疫アッセイによって確定した。
免疫付与後、ウサギ血清のペプチド類似体への反応性をELISAによって試験した。表4は、タイター(信号が検出可能である希釈の逆数として)を示し、すべてのウサギが、血清内に検出可能な開裂部位特異的類似体ペプチドに反応性がある抗体を有したことを示す。1匹の動物(657)は、640と同等の1/タイターを有する免疫原への非常に低いレベルの検出可能な抗体を有した。開裂部位特異的抗体もまた、6匹すべてのウサギのウィッフルボール流体内に検出し、同一の動物(657)は、非常に低いレベルの検出可能な抗体を有した。したがって、6匹中5匹のウサギが、血清及びウィッフルボール流体の両方において検出可能なロバスト開裂部位特異的抗体タイターを表した。
研究の最終相において、免疫付与されたウサギ及び免疫付与されていないウサギを、黄色ブドウ球菌(ATCC29213)の6.2logの10コロニー形成単位(CFU)で、直接、ウィッフルボール区画内に接種した。
細菌数及び試験対象の生存能力を、2週間の経過にわたり細菌数及び生存に対して監視した。図9に示されるデータは、研究の一週目中に、対照動物の平均細菌数が、開裂部位特異的ワクチン接種動物よりも数log高かった。例えば、2日目に、対照は、7.2log10 CFU/mlのウィッフルボール流体を有したが、免疫付与されたグループは、5.2log10 CFU/mlのウィッフルボール流体を有した。
細菌数の差異は、ウサギ生存能力の著しい差異に変換された。2週間の研究の最後まで、対照動物のうちの40%パーセントのみが生存したが、開裂部位特異的ワクチン接種された動物のうちの100%が生存能力を有した(図10)。
したがって、これらの結果は、病原への固有の免疫力が存在するとき、プロテアーゼによって産生された抗原の副産物、恐らく開裂したが、依然として免疫反応性である抗黄色ブドウ球菌IgGに対するこの免疫方法によって有効レベルまで回復することができるという仮定を支持した。このプロセスは、高いタンパク質分解細菌で接種された動物の細菌数を低減することによるだけでなく、動物が死亡から救われたという事実によって証明された。
実施例4:癌を治療するための受動免疫付与。
開裂部位特異的抗体による、腫瘍標的Mabへのエフェクター機能の回復の原理を証明するために、マウスヒト腫瘍異種移植モデル、SCIDベージュマウスのMDA MB 231同所異種移植モデルを、CNTO860(US 7605235)と呼ばれる抗体と共に使用し、以前に、モデルにおいて腫瘍成長を低減させる能力を示すことを証明したヒト組織因子(CD142)に指向させた。
開裂部位特異的抗体による、腫瘍標的Mabへのエフェクター機能の回復の原理を証明するために、マウスヒト腫瘍異種移植モデル、SCIDベージュマウスのMDA MB 231同所異種移植モデルを、CNTO860(US 7605235)と呼ばれる抗体と共に使用し、以前に、モデルにおいて腫瘍成長を低減させる能力を示すことを証明したヒト組織因子(CD142)に指向させた。
研究は、CNTO860のIgG1の下部ヒンジドメインのタンパク質分解開裂が、抗体を無効にさせ、開裂部位特異的開裂部位mAbが、SCIDベージュマウスにおいてMDA−MB−231同所異種移植モデルで開裂CNTO860の抗腫瘍有効性を回復するかどうかを評価することを示すように設計した。
無傷抗腫瘍抗原抗体、CNTO 860は、ヒトIgG1定常領域を含む。プロテアーゼ開裂抗体、CNTO860を、上述のように細菌プロテアーゼIdeSを使用して調製した。
抗体調製物を、毎週新たに希釈し、0.1mg/kgの動物投薬で、PBS中10μg/mLで供給した。mAb 2095−2(キメラ開裂部位特異的開裂IdeS)を単独で、1.0mg/kgで860の変異体と同一のスケジュールで投与した。
免疫不全マウス(Charles River Laboratoriesから入手した約18〜20gの体重のSCIDベージュマウス(C.B−17/IcrCrl−scid−bgBR)に全身麻酔し、IACUCに認可されたプロトコルによって特定されるように、無血清DMEM中5×107細胞/mLで懸濁されたMDA−MB−231、ヒト乳癌株(ATCC #HTB−26)細胞を、50μLの容積の(右腋窩番号2又は3)哺乳類脂肪体内に移植した。
グループ当たり8匹のマウスは、表5(下記)に示されるように試験物質又はPBS(対照グループ)を受けた。グループ4は、単一療法に対して上記に特定される用量でCNTO 860単一開裂IgGを受け、mAb 2095−2が2時間遅れで1.0mg/kgで腹腔内投与される。投薬を研究の3日目に開始し、一週間に一度繰り返した。
研究を、対照グループの腫瘍が800mm3の体積に到達したときに終了した。終了時、すべての動物から全血を、調製されたEDTAでコーティングされた管内に心穿刺を介して収集した。研究の終了時、体重及び腫瘍測定値を記録し、一次腫瘍を外科的に除去し、計量した。
結果
実験中の特定の時間における各マウスグループの平均腫瘍体積を図11に示す。統計的に、CNTO860での治療グループにおける腫瘍体積は、研究11日目に開始した他のグループのそれぞれと比較して低かった。CNTO860及びmAb2095−2の組み合わせグループにおける腫瘍体積は、研究18〜40日目からのPBSグループの腫瘍体積よりも低く、研究26〜40日目からのCNTO860 scIgG単独グループの腫瘍体積よりも低く、研究18〜40日目からのmAb2095−2単独グループの腫瘍体積よりも低かった。治療グループ間の腫瘍体積における他の差異は存在しなかった。
実験中の特定の時間における各マウスグループの平均腫瘍体積を図11に示す。統計的に、CNTO860での治療グループにおける腫瘍体積は、研究11日目に開始した他のグループのそれぞれと比較して低かった。CNTO860及びmAb2095−2の組み合わせグループにおける腫瘍体積は、研究18〜40日目からのPBSグループの腫瘍体積よりも低く、研究26〜40日目からのCNTO860 scIgG単独グループの腫瘍体積よりも低く、研究18〜40日目からのmAb2095−2単独グループの腫瘍体積よりも低かった。治療グループ間の腫瘍体積における他の差異は存在しなかった。
CNTO860単独グループは、すべての他のグループよりも、より少ない最終腫瘍重量を有した。加えて、CNTO860及びmAb2095−2の組み合わせグループは、PBS単独グループ及びmAb2095−2単独グループの両方よりも小さい腫瘍を有した。治療グループ間の腫瘍重量における他の差異は存在しなかった。
これらの結果は、開裂部位特異的抗体調製物での受動免疫付与が、開裂標的特異的抗体が存在する抗腫瘍活性を回復させることを証明する。
実施例5:開裂部位特異的抗体及び開裂標的抗体を使用する標的細胞減少
以下の実験において、開裂部位特異的抗体(IdeS開裂ヒトIgG1(キメラ開裂部位特異的開裂IdeS)への特異性を有するウサギ−ヒトキメラmAb mAb 2095−2)のインビボ投与を、単一開裂IgG又は二重開裂IgG、F(ab’)2の投与後に調査した。
以下の実験において、開裂部位特異的抗体(IdeS開裂ヒトIgG1(キメラ開裂部位特異的開裂IdeS)への特異性を有するウサギ−ヒトキメラmAb mAb 2095−2)のインビボ投与を、単一開裂IgG又は二重開裂IgG、F(ab’)2の投与後に調査した。
抗血小板インテグリン(αIIbβIIIa、IIb/IIIaとも称される)結合抗体、c7E3を、数々の理由により標的抗体として使用した。抗血小板mAbは、予備試験において、5日間にわたる回復の24時間後に著しい血小板クリアランスもたらすことが示されたヒトIgG1キメラであった(イヌ科動物のFcγ受容体及び/又は補体系によるmAbの実質的な即時認識を示す)。加えて、効果は、血小板機能の抑制を引き起こさず、したがって、臨床的に関連する出血性合併症を引き起こす可能性がない無傷IgG(0.05mg/kg)投与量で区別可能であった。最後に、循環血小板数は、容易に定量化可能なエンドポイントを提供し、この非終端研究における複数の血液サンプルは、このサイズの動物に対して出血アーチファクト又はリスクを課さなかった。
材料及び方法
c7E3の3つの調製物を使用した:無傷マウス−ヒトIgG1キメラ抗体、細菌酵素IdeSを使用して調製された単一開裂及びF(ab’)2。
c7E3の3つの調製物を使用した:無傷マウス−ヒトIgG1キメラ抗体、細菌酵素IdeSを使用して調製された単一開裂及びF(ab’)2。
第1に、c7E3抗体抗原結合及び血小板減少パラメーターをイヌにおいて確立した。試験注入の結果は、0.01mg/kgの投与量(ヒトで血小板クリアランスを駆動するのに十分過ぎると算出された)が2時間、及び24時間でイヌにおいて無効であり、生理食塩水基グループと区別できなかったことを示した。0.05mg/kgの投与量は、2時間でわずかに効果があったが、24時間で、>90%の血小板クリアランスをもたらした。c7E3 IgGの0.2mg/kgの投与量は、2時間で著しい血小板クリアランスをもたらし、次いで、それは24時間後に維持された。これらの結果は、実質的な即時的血小板クリアランス(24時間)をもたらす、最低投与量(0.05mg/kg)をイヌに割り当てるための必要な情報を提供した。
血小板機能への効果
c7E3は、血小板表面IIb/III3受容体に結合することによって血小板凝集を抑制し、それによって、活性化血小板上の受容体に結合し、それらを共にクランプするフィブリノゲンの能力を阻害する。無傷及び単一開裂c7E3 IgGのそれぞれの抑制プロファイルを、血小板凝集アッセイで試験した。血小板凝集を、生理学的作動薬での活性化後に血小板懸濁液を通る光透過率として測定する。抑制を、5μMのアデノシン二リン酸(ADP)に対する対照凝集と比較する。抑制の割合を、対照凝集−試験凝集×100%÷対照凝集で算出した。
c7E3は、血小板表面IIb/III3受容体に結合することによって血小板凝集を抑制し、それによって、活性化血小板上の受容体に結合し、それらを共にクランプするフィブリノゲンの能力を阻害する。無傷及び単一開裂c7E3 IgGのそれぞれの抑制プロファイルを、血小板凝集アッセイで試験した。血小板凝集を、生理学的作動薬での活性化後に血小板懸濁液を通る光透過率として測定する。抑制を、5μMのアデノシン二リン酸(ADP)に対する対照凝集と比較する。抑制の割合を、対照凝集−試験凝集×100%÷対照凝集で算出した。
結果は、IdeSプロテアーゼによる単一下部ヒンジ開裂後に血小板へのc7E3の結合/抑制の喪失がなかったことを示した。
IdeSプロテアーゼによって単一開裂されたc7E3 IgG及びc7E3 IgGもまたインビボで比較した。5匹の動物の3つのグループは、生理食塩水の対照、無傷c7E3 IgG(0.05mg/kg)、又はc7E3単一開裂IgG(0.05mg/kg)のいずれかを受けた。血小板数をベースラインで監視し、投与2時間後、24時間後、48時間後、72時間後、及び96時間後に監視した。研究を5日間に制限することで、結果の解釈を混乱させ得る、抗c7E3免疫反応の可能性を最小限化した。結果を、各時点における各動物グループの平均血小板数±SDとして図3に表す。誤差バーの範囲は、異なる動物における血小板数の正常変動性を含む(例えば、単一開裂IgG治療グループにおける5匹の動物での投与前の数は、それぞれ、1μL当たり175,000、355,000、305,000、276,000、及び334,000であった)。それにもかかわらず、平均結果は、無傷c7E3 IgGが24時間で明らかな最低点を有する血小板数の実質的な減少を誘発したことを明らかに確定した。同一の0.05mg/kg投与量でのc7E3 IgGの単一開裂型は、本質的に効果がなかった。単一開裂c7E3グループ及び生理食塩水対照グループは、96時間の監視期間にわたって同様のプロファイルを示した。血小板数は、生理食塩水対照グループ及び単一開裂c7E3グループの両方において最終の96時間の測定で低下し、非免疫媒介原因(例えば、血液量は、繰り返しのサンプリングで失われる)を示唆する。
無傷c7E3 IgGグループにおける血小板数は、96時間で投与前レベルの約50%に達する段階的回復を示した。有害な臨床所見(例えば、出血)は、任意のグループにおいて確認されず、これは、低循環血小板数及び/又は血小板の著しい抑制に対する、制限期間における既知のヒト許容度と一致する。
この研究の所見とは、下部ヒンジ内のIgGの単一タンパク質分解開裂が、著しいエフェクター機能の喪失をもたらすことであった。この血小板への等価結合にかかわらず、c7E3の単一開裂誘導体は、(この研究において無傷c7E3でみられるように)通常オプソニン化細胞を除去する免疫系の構成要素を係合することができなかった。これらのインビボ結果は、単一開裂誘導体がADCC及び補体アッセイにおいて本質的にすべてのエフェクター機能を失う数々の細胞標的mAbでの同様のインビボ所見を確定する。
実験前と一致させるために、c7E3の変異体をすべて、0.05mg/kg投与量で投与した。研究プロトコルは、表6に記載される3つの動物の7つの異なるグループを含んだ。実験の独自の態様には(グループ6及び7)、第1の標的mAbの注入後、10分間遅れて開裂部位特異的mAbの注入を伴う。開裂部位特異的IdeS開裂部位mAb、2095−2を、c7E3変異体のすべてに使用された投与量よりも10倍高い0.5mg/kgで投与した。より高い投与量を、開裂部位特異的mAbと血小板結合c7E3変異体との錯化を最大化するために選択した。すべてのmAbを、20分間の期間にわたる遅い注入によって送達した。血小板数を、96時間の期間にわたり監視した。血小板数を、明確な提示のために各動物内の投与前の数に正規化し、これらの3つの動物グループにおける数値的血小板数において正常変異性を最小限化するために正規化した。
結果を図12に示す。この研究から多くの所見が生じた。投与量を見つける研究として、無傷c7E3 IgGを、0.05mg/kgで投与し、24〜48時間で明らかな最悪値を有する実質的な血小板クリアランスを誘発した。血小板数の回復は、約72時間で開始され、96時間の測定にわたってゆっくりと増大した。付加的な血液サンプルを、完全な回復が生じるかどうかの評価を可能にするように7日目(168時間)に研究に組み込んだ。完全な回復は、すべての適用可能な治療グループにおいて7日で生じた。
無傷c7E3 IgGとは対照的に、単一開裂IgG及びF(ab’)2は、血小板数への効果がなく、これらのグループの血小板数の変化は、生理食塩水対照グループとは異ならなかった。同様に、開裂部位特異的mAb、2095−2は、単独で注入されたとき(グループ5)、循環血小板への測定可能な影響はなかった。しかしながら、c7E3 F(ab’)2及びmAb 2095−2グループでは、2時間で、効果がほぼ最大であるように、血小板数の迅速な減少が生じた。加えて、血小板低下の範囲は、2時間及び24時間の測定で、開裂部位特異的抗体が開裂抗体留分後に投与されたグループにおいて、無傷c7E3 IgGを受けたグループ(単独;グループ2)よりも大きいように思えた。その後、血小板数は、徐々に回復し、48時間で、回復速度は、無傷c7E3 IgGグループの回復速度に匹敵した。
F(ab’)2の組み合わせグループでは、mAb 2095−2が、単一開裂c7E3 IgGとカップリングしたとき、血小板クリアランスの範囲は、F(ab’)2グループに見られるように顕著ではなく、scIgGグループにおける1つの不十分な反応性動物に起因し得る(このグループでは広い誤差棒グラフにも反映される)。それにもかかわらず、血小板クリアランスは、無傷c7E3 IgGグループにおいて明らかになったものよりも早く生じた。scIgG結果は、インビボmAbを有するこの誘導体の標的が、F(ab’)2の標的と同様に有効であると考えられるため、重要である−インビトロ所見に基づき予測できなかった結果。
考察/結論
本明細書に説明される一連の動物研究は、IgGの単一開裂タンパク質分解誘導体が、この場合において、インビボでそれらが結合する細胞を除去する能力を失うという初期のインビボ所見を確定した。無傷c7E3 IgGは、投与量≧0.05mg/kgで、イヌにおいて24時間以内に血小板クリアランスを誘発することが示された。0.05mg/kgの投与量を、血小板当たり数千のコピーのIgG、又は約5%のαIIbβ3受容体遮断を提供するのに十分であるように算出した。受容体遮断の実質的に高いレベルは、血小板機能の抑制に必要であることは既知である(血小板当たり約80,000のコピー)。したがって、イヌ科動物の免疫系は、この断片レベルでIgGでオプソニン化される細胞を一掃する能力を有する。
本明細書に説明される一連の動物研究は、IgGの単一開裂タンパク質分解誘導体が、この場合において、インビボでそれらが結合する細胞を除去する能力を失うという初期のインビボ所見を確定した。無傷c7E3 IgGは、投与量≧0.05mg/kgで、イヌにおいて24時間以内に血小板クリアランスを誘発することが示された。0.05mg/kgの投与量を、血小板当たり数千のコピーのIgG、又は約5%のαIIbβ3受容体遮断を提供するのに十分であるように算出した。受容体遮断の実質的に高いレベルは、血小板機能の抑制に必要であることは既知である(血小板当たり約80,000のコピー)。したがって、イヌ科動物の免疫系は、この断片レベルでIgGでオプソニン化される細胞を一掃する能力を有する。
結果は、ヒトIgG1下部ヒンジの単一タンパク質分解開裂がc7E3 IgGの血小板クリアランス特性を破棄したことを示した。ここで、機能的不活性の単一開裂IgGを、IdeSプロテアーゼでの部分的消化により、エクスビボで調製したが、本明細書に証明されるように、他のプロテアーゼは、同様の機能喪失を有するIgGをもたらす。単一のIdeS開裂は、インビトロ血小板抑制アッセイに示されるように、c7E3の抗原結合特性に影響を及ぼさなかった。所見は、適さないタンパク質分解環境(例えば、ある腫瘍、細菌感染、炎症設定)に関連する病理学における宿主免疫系のある特定の欠点を説明するための機構を示唆した。
研究所見は、IgG内のタンパク質分解欠損を是正する手段を指摘した。つまり、特異的mAb対タンパク質開裂部位は、不活性細胞結合抗体上に機能的Fcドメインを沈着し、それによってFc媒介エフェクター機能を回復しなければならない。
IgGヒンジ内のIdeS部位に対するモノクローナル抗体を、ウサギの免疫付与によって生成した。このmAb、2095−2は、ヒト定常領域を組み込むための修飾後、ADCC及び補体アッセイにおいて、不活性F(ab’)2又は単一開裂IgGにインビトロ細胞死滅を容易に回復した。
主要試験は、インビボc7E3 IgGのIdeS生成タンパク質分解誘導体と組み合わせて2095−2を採用した。2段階プロトコルを、c7E3が、第1に血小板に結合し、次いで、過剰な開裂部位特異的mAbの後に、血小板結合c7E3との錯体に結合することが可能になるように設計した。カップリング抗開裂ヒンジMab及び開裂Mabの存在下で、血小板クリアランスは、無傷c7E3 IgG単独で誘発されたものより早く、即時的血小板クリアランスは、(c7E3 F(ab’)2で)著しかった。組み合わせた療法での血小板クリアランスの速さは、免疫細胞死滅/除去様式の強化を示唆する。
実施例6:癌を治療するための開裂部位特異的ワクチン接種
ヒンジ類似ペプチドワクチン接種の使用は、侵襲性及び転移性癌等の慢性ヒト疾患を治療する可能性を有する。侵襲性癌を治療する手段として、開裂部位特異的指向ワクチン接種の有効性を試験するのに好適な、数々の侵襲性癌動物モデルが、現在存在する。
ヒンジ類似ペプチドワクチン接種の使用は、侵襲性及び転移性癌等の慢性ヒト疾患を治療する可能性を有する。侵襲性癌を治療する手段として、開裂部位特異的指向ワクチン接種の有効性を試験するのに好適な、数々の侵襲性癌動物モデルが、現在存在する。
ワクチン接種アプローチは、抗腫瘍mAb療法単独と比較して著しく異なる薬力的プロファイルをもたらす。後者では、確立された腫瘍は、その表面上の特異的標的へのモノクローナル抗体の突然の投薬を受ける。腫瘍は、これらの細胞上の同一の抗原に対する、又は付加的な抗原に対する宿主抗体によって既に標的とされ得るか、又は標的とされ得ない。ワクチン接種戦略は、初期に開始された場合、生成される腫瘍成長部位又は侵襲部位に存在する任意の腫瘍表面開裂抗体に係合するために、開裂部位特異的宿主抗体の連続的及び比較的不変レベルを提供する。
先述の感染モデルにおいて、ウサギの固有の体液反応を使用して証明されるように、一次反応の細胞標的は、ほぼ無関係であり、二次抗体波は、存在する任意の損傷した一次抗体にエフェクター機能を回復する。不活性化され、細胞結合結合宿主抗体は、開裂部位特異的Absのための様々な抗原標的(及び表面位置)を提供するであろう。
本明細書において証明されるように、細胞表面抗原に指向され、それを係合する単一又は二重開裂抗体は、開裂部位特異的抗原によって標的になることができ、それによって、無傷開裂部位特異的抗体によって提供されるエフェクター機能を使用して標的細胞を排除する宿主能力を回復する。別の、かつ著しく異なるアプローチは、転移性癌等の特定の疾患に関連するプロテアーゼによって誘発された開裂損傷部位に対して宿主を免疫付与することである。例えば、腫瘍細胞は、ヒンジ内のIgGを開裂するマトリックス金属プロテアーゼを生産する。開裂部位に対するワクチン接種は、分子欠損に対抗し、その局所環境における免疫機能を増大させる宿主抗体を提供することができる。
損傷したmAbの標的は、詳しい特定に対する必要性なく、複数のタンパク質分解酵素の作用に対して保護するために、開裂部位特異的ペプチドの混合物を使用して、特異的であることができるか、又は多数の標的になることができる。
したがって、本発明に従い、治療を必要とする対象の癌患者は、治療前、治療後、又は治療と同時に、癌を治療する抗体組成物内に開裂部位特異的抗体反応を生成するために、開裂部位ペプチド免疫原でワクチン接種される。一例では、免疫原は、配列番号1の残基10〜14であるアミノ酸配列P−C−P−A−Pで終端する配列を有するMMP−3又はMMP−12開裂部位ペプチドである。
Claims (33)
- ヒトの対象をプロテアーゼの放出を特徴とする病理学的状態から保護する方法であって、ペプチド免疫原を投与することを含み、前記ペプチドが、IgG上のタンパク質分解開裂部位と反応する抗体を生成することが可能である、方法。
- 前記病理学的状態が、関節炎疾患、悪性疾患、病原菌又は寄生生物の存在、及び血管疾患から選択される疾患である、請求項1に記載の方法。
- 前記疾患が関節リウマチである、請求項2に記載の方法。
- 前記疾患がブドウ球菌属感染である、請求項2に記載の方法。
- 前記疾患が乳癌である、請求項2に記載の方法。
- 前記対象が、心筋梗塞を有すると診断される若しくは疑われるか、又はうっ血性心不全に罹患している、請求項2に記載の方法。
- 前記ペプチドが、黄色ブドウ球菌由来のMMP−3、MMP−7、MMP−12、HNE、プラスミン、カテプシンG、ペプシン、IdeS、又はグルタミルエンドペプチダーゼIからなる群から選択されるプロテアーゼによって産生されるヒトIgG内のプロテアーゼ特異的開裂部位に相当する、請求項1に記載の方法。
- ヒトIgG内の前記プロテアーゼ特異的開裂部位が、前記プロテアーゼ特異的開裂部位に対する特異性を有する抗体を使用して、患者からのサンプル中で検出されている、請求項7に記載の方法。
- 患者を治療するための方法であって、前記患者が特異的抗体を含有する組成物で治療され、抗体が治療される前記特定の疾患に関連する1つ以上のプロテアーゼによる開裂を受けやすく、ペプチド免疫原を前記患者に投与する工程を含み、前記ペプチドが、抗体療法によって治療される前記特定の疾患に関連する前記1つ以上のプロテアーゼによって産生されるIgG上のタンパク質分解開裂部位に相当するペプチドフラグメント又は類似体である、方法。
- 前記病理学的状態が、関節炎疾患、悪性疾患、病原菌又は寄生生物の存在、及び血管疾患から選択される疾患である、請求項9に記載の方法。
- 前記疾患が関節リウマチである、請求項10に記載の方法。
- 前記疾患がブドウ球菌属感染である、請求項10に記載の方法。
- 前記疾患が乳癌である、請求項10に記載の方法。
- 前記対象が、心筋梗塞を有すると診断される若しくは疑われるか、又はうっ血性心不全に罹患している、請求項10に記載の方法。
- 前記ペプチドが、ブドウ球菌由来のMMP−3、MMP−7、MMP−12、HNE、プラスミン、カテプシンG、ペプシン、IdeS、又はグルタミルエンドペプチダーゼIからなる群から選択されるプロテアーゼによって産生されるヒトIgG1内にプロテアーゼ特異的開裂部位に相当する、請求項9に記載の方法。
- ヒトIgG内の前記プロテアーゼ特異的開裂部位が、前記プロテアーゼ特異的開裂部位に対する特異性を有する抗体を使用して、患者からのサンプル中で検出されている、請求項9に記載の方法。
- 前記ペプチド免疫原を投与することは、前記抗体のエフェクター機能を含有する組成物を回復、強化、又は維持することを可能にする、請求項9に記載の方法。
- 前記開裂産物類似体ペプチド免疫原が、
a.重鎖のN末端に最も近位のプロテアーゼによって開裂された抗体の重鎖の一対の残基のうちの前記残基を特定することと、
b.前記ポリペプチドのN末端に最も近位である前記プロテアーゼ開裂部位の前記残基が、前記定義された配列のC末端になる、前記プロテアーゼ開裂部位の上流にある少なくとも5つの連続アミノ酸残基を含む、ペプチド配列を特定することと、
c.免疫付与に十分な量の前記ペプチド又はペプチド相同体若しくは化学的相同体の溶液を作製することによって調製される、請求項1又は9に記載の方法。 - 前記ペプチド免疫原が、プロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側の上流にある配列番号1、2、3、又は4のヒトIgGヒンジ領域配列から選択される少なくとも5つの連続アミノ酸、又は相同種若しくは化学類似体を含む、請求項1又は9に記載の方法。
- 前記ペプチド免疫原が、残基−T−C−P−P−C−(配列番号1の残基7〜11)として定義される、IgG1の少なくともヒンジコア、又は相同種若しくは化学的類似体を含む、請求項1又は9に記載の方法。
- 前記ペプチド免疫原が、配列TCPPCPAPELLG(配列番号1の残基7〜18)を有するヒトIgG1下部ヒンジ及び隣接CHドメインの12−merペプチド類似体を含む、請求項1又は9に記載の方法。
- 前記ペプチド免疫原が、配列番号5〜11及びそのN末端切断から選択されるアミノ酸配列を有し、少なくとも5つのアミノ酸を含み、IgGプロテアーゼ開裂部位のN末端側の上流にあるアミノ酸配列を含有するペプチドを含む、請求項1又は9に記載の方法。
- 前記ペプチド免疫原が、(a)IgG1 MMP−3開裂部位(TCPPCPAP、配列番号1の残基7〜14)のアミノ末端側のアミノ酸配列、(b)グルタミルエンドペプチダーゼIgG1開裂部位(TCPPCPAPE、配列番号1の残基7〜15)、及び(c)IdeS IgG1開裂部位(TCPPCPAPELLG、配列番号1の残基7〜18)を含むペプチドから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1又は9に記載の方法。
- 前記ペプチドが化学的類似体であり、前記システイン残基がセリン残基で置換される、請求項19に記載の方法。
- 前記ペプチドが、前記ペプチドの前記C末端が別の部分に化学的に結合する方法でキャリアタンパク質に抱合する、請求項19に記載の方法。
- 前記キャリアタンパク質が、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)又は血清アルブミンからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記ペプチドが配列番号5〜16のペプチドから選択される、請求項19に記載の方法。
- 特異的な投与経路による患者への投与に適合性の薬学的に許容されるキャリア中に、プロテアーゼ開裂部位の前記アミノ末端側の上流にある配列番号1、2、3、又は4の前記ヒトIgGヒンジ領域配列から選択される少なくとも5つの連続アミノ酸を含むペプチド、又は相同種若しくは化学的類似体を含む、ワクチン組成物。
- 前記ペプチドが、前記ペプチドに対する液性反応を強化する目的のためにアジュバントと併せて投与される、請求項28に記載のワクチン調製物。
- 前記アジュバントが、CD40作動薬、ミョウバン、高分子微粒子、水中油型エマルション、MF59、CpG、GM−CSF、IL−12、及びIL−2からなる群から選択される、請求項29に記載のワクチン調製物。
- 前記ペプチドが、配列番号5〜16のペプチドから選択される、請求項28、29、又は30に記載のワクチン組成物。
- 病理学的状態の治療のために患者に投与される抗体のエフェクター機能を強化又は維持するための方法であって、前記抗体は前記患者において1つ以上のプロテアーゼによる開裂を受けるものであって、治療抗体に結合し、かつ前記治療抗体のエフェクター機能を回復させることができる抗体を生成することが可能なヒトIgGプロテアーゼ開裂部位ペプチドを用いる、前記抗体治療前、その後、又はそれと同時に前記患者にワクチン接種することを含む、方法。
- 前記患者にワクチン接種するために使用される前記ヒトIgGプロテアーゼ開裂部位ペプチドが、配列番号5〜16のペプチドから選択されるペプチドである、請求項32に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/US2010/057396 WO2012067624A1 (en) | 2010-11-19 | 2010-11-19 | Immunoglobulin cleavage fragments vaccine compositions |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014504277A true JP2014504277A (ja) | 2014-02-20 |
Family
ID=46084318
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013539805A Pending JP2014504277A (ja) | 2010-11-19 | 2010-11-19 | 免疫グロブリン開裂フラグメントワクチン組成物 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20120269834A1 (ja) |
EP (1) | EP2640414A4 (ja) |
JP (1) | JP2014504277A (ja) |
KR (1) | KR20130118910A (ja) |
CN (1) | CN103260638A (ja) |
AU (1) | AU2010363981A1 (ja) |
BR (1) | BR112013012389A2 (ja) |
CA (1) | CA2818245A1 (ja) |
EA (1) | EA201390735A1 (ja) |
IL (1) | IL225907A0 (ja) |
MX (1) | MX2013005646A (ja) |
NZ (1) | NZ610460A (ja) |
SG (1) | SG190705A1 (ja) |
WO (1) | WO2012067624A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201304480B (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018093868A1 (en) * | 2016-11-16 | 2018-05-24 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Immunoglobulin proteases, compositions, and uses thereof |
CN108410798A (zh) * | 2018-03-27 | 2018-08-17 | 福建三造血技术有限公司 | 细胞分离用微珠洗脱液及配制方法 |
KR20220017430A (ko) | 2019-06-05 | 2022-02-11 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항체 절단 부위 결합 분자 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000061739A1 (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
JP2002518523A (ja) * | 1998-06-20 | 2002-06-25 | ユナイティド バイオメディカル インコーポレイティド | Hiv感染および免疫疾患の予防および治療のペプチド組成物 |
JP2005034049A (ja) * | 2003-07-15 | 2005-02-10 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | Psa由来のhla−a24結合性癌抗原ペプチド |
JP2006512407A (ja) * | 2002-09-27 | 2006-04-13 | ゼンコー・インコーポレイテッド | 最適化Fc変異体およびそれらの生成方法 |
JP2008530010A (ja) * | 2005-02-01 | 2008-08-07 | アメリカ合衆国 | 広範に交差中和する抗体を誘導するためのパピローマウイルスl2n末端ペプチド |
WO2009023457A1 (en) * | 2007-08-10 | 2009-02-19 | Centocor, Inc. | Immunoglobulin cleavage fragments as disease indicators and compositions for detecting and binding such |
JP2009060905A (ja) * | 1993-07-26 | 2009-03-26 | Dana-Farber Cancer Inst Inc | B7−2:ctla4/cd28カウンターレセプター |
WO2009054537A1 (ja) * | 2007-10-25 | 2009-04-30 | Kagoshima University | アミロイドβペプチドのミミック分子を用いたペプチドワクチン |
WO2010127784A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-11 | Universitätsklinikum Freiburg | Polypeptide derived from enterococcus and its use for vaccination |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100260751A1 (en) * | 2007-09-28 | 2010-10-14 | Raju T Shantha | Methods and Structural Conformations of Antibody Preparations with Increased Resistance to Proteases |
-
2010
- 2010-11-19 BR BR112013012389A patent/BR112013012389A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-11-19 MX MX2013005646A patent/MX2013005646A/es unknown
- 2010-11-19 EP EP10859722.0A patent/EP2640414A4/en not_active Withdrawn
- 2010-11-19 AU AU2010363981A patent/AU2010363981A1/en not_active Abandoned
- 2010-11-19 EA EA201390735A patent/EA201390735A1/ru unknown
- 2010-11-19 CA CA2818245A patent/CA2818245A1/en not_active Abandoned
- 2010-11-19 CN CN2010800702131A patent/CN103260638A/zh active Pending
- 2010-11-19 US US13/318,168 patent/US20120269834A1/en not_active Abandoned
- 2010-11-19 KR KR1020137015471A patent/KR20130118910A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-11-19 WO PCT/US2010/057396 patent/WO2012067624A1/en active Application Filing
- 2010-11-19 NZ NZ610460A patent/NZ610460A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-11-19 JP JP2013539805A patent/JP2014504277A/ja active Pending
- 2010-11-19 SG SG2013037395A patent/SG190705A1/en unknown
-
2013
- 2013-04-23 IL IL225907A patent/IL225907A0/en unknown
- 2013-06-18 ZA ZA2013/04480A patent/ZA201304480B/en unknown
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009060905A (ja) * | 1993-07-26 | 2009-03-26 | Dana-Farber Cancer Inst Inc | B7−2:ctla4/cd28カウンターレセプター |
JP2002518523A (ja) * | 1998-06-20 | 2002-06-25 | ユナイティド バイオメディカル インコーポレイティド | Hiv感染および免疫疾患の予防および治療のペプチド組成物 |
WO2000061739A1 (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
JP2006512407A (ja) * | 2002-09-27 | 2006-04-13 | ゼンコー・インコーポレイテッド | 最適化Fc変異体およびそれらの生成方法 |
JP2005034049A (ja) * | 2003-07-15 | 2005-02-10 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | Psa由来のhla−a24結合性癌抗原ペプチド |
JP2008530010A (ja) * | 2005-02-01 | 2008-08-07 | アメリカ合衆国 | 広範に交差中和する抗体を誘導するためのパピローマウイルスl2n末端ペプチド |
WO2009023457A1 (en) * | 2007-08-10 | 2009-02-19 | Centocor, Inc. | Immunoglobulin cleavage fragments as disease indicators and compositions for detecting and binding such |
WO2009054537A1 (ja) * | 2007-10-25 | 2009-04-30 | Kagoshima University | アミロイドβペプチドのミミック分子を用いたペプチドワクチン |
WO2010127784A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-11 | Universitätsklinikum Freiburg | Polypeptide derived from enterococcus and its use for vaccination |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BIOベンチャー, vol. 2, no. 4, JPN6015040075, 2002, pages 37 - 43, ISSN: 0003171778 * |
免疫学イラストレイテッド(原書第2版), JPN6015040074, 1990, pages 71 - 72, ISSN: 0003171777 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL225907A0 (en) | 2013-07-31 |
ZA201304480B (en) | 2014-12-23 |
MX2013005646A (es) | 2013-08-01 |
BR112013012389A2 (pt) | 2019-09-24 |
KR20130118910A (ko) | 2013-10-30 |
SG190705A1 (en) | 2013-07-31 |
EP2640414A4 (en) | 2016-06-15 |
CA2818245A1 (en) | 2012-05-24 |
EP2640414A1 (en) | 2013-09-25 |
CN103260638A (zh) | 2013-08-21 |
US20120269834A1 (en) | 2012-10-25 |
EA201390735A1 (ru) | 2013-12-30 |
AU2010363981A1 (en) | 2013-05-23 |
NZ610460A (en) | 2015-01-30 |
WO2012067624A1 (en) | 2012-05-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11859000B2 (en) | Anti-CCR8 antibodies and uses thereof | |
US10745274B1 (en) | Nucleic acids encoding antibodies specifically binding to MASP-3 | |
TWI654201B (zh) | Pd-1抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
JP7465382B2 (ja) | 抗bcma重鎖のみ抗体 | |
US20190062428A1 (en) | Combination of anti-cd47 antibodies and cell death-inducing agents, and uses thereof | |
US9481734B2 (en) | Immunoglobulin cleavage fragments and disease indicators and compositions for detecting and binding such | |
JP2020524506A (ja) | 抗bcma重鎖のみ抗体 | |
KR20220100997A (ko) | 다양한 질환 및 장애의 치료를 위해 masp-1 및/또는 masp-2 및/또는 masp-3를 억제하는 조성물 및 방법 | |
NZ757986A (en) | Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation | |
CA2977009A1 (en) | Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation | |
US11214615B2 (en) | Anti-TIM-3 antibodies and uses thereof | |
JP2017537084A (ja) | 抗エンドグリン抗体及びその用途 | |
JP2023182853A (ja) | 抗クローディン-18.2と抗4-1bbとの二重特異性抗体およびその使用 | |
KR20200104314A (ko) | Lag-3 항체 약학 조성물 및 이의 용도 | |
KR20210088535A (ko) | 폐렴구균 융합 단백질 백신 | |
JP2014504277A (ja) | 免疫グロブリン開裂フラグメントワクチン組成物 | |
JP7212990B2 (ja) | ヒトpd‐l1抗体 | |
AU2020201271A1 (en) | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation | |
CA3127943A1 (en) | Compositions and methods for treatment of diseases involving cxcl1 function | |
JP6964623B2 (ja) | C.ディフィシルの毒素aおよび毒素bタンパク質の単離ポリペプチドならびにその使用 | |
US20210309746A1 (en) | Antibodies that bind cd277 and uses thereof | |
WO2024054681A1 (en) | METHODS OF TREATMENT COMPRISING IgG ANTIBODIES AND AN IdeS PROTEASE | |
WO2020033925A9 (en) | Antibodies that bind cd277 and uses thereof | |
CN117769434A (zh) | 与C1s结合的抗体和其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141028 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150123 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150428 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20151013 |