KR20220100997A - 다양한 질환 및 장애의 치료를 위해 masp-1 및/또는 masp-2 및/또는 masp-3를 억제하는 조성물 및 방법 - Google Patents

다양한 질환 및 장애의 치료를 위해 masp-1 및/또는 masp-2 및/또는 masp-3를 억제하는 조성물 및 방법 Download PDF

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한스-윌헬 쉬웨블
그레고리 에이. 데모풀로스
토마스 두들러
패트릭 그레이
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오메로스 코포레이션
유니버시티 오브 레스터
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Abstract

한 양태에서, 본 발명은 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양으로 MASP-3의 양을 포함하는 조성물을 개체에 투여함으로써 발작성 야간혈색뇨증, 나이-관련 황반 변성, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증, 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법 및 조성물을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 적혈구 세포의 생존율을 증가시키는데 효과적인, MASP-1 억제제 및/또는 MASP-3 억제제 중 적어도 하나의 양을 포함하는 조성물을 개체에 투여함으로써 발작성 야간혈색뇨증으로 고통받는 개체에서 적혈구 세포의 생존율을 증가시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 개체에 MASP-2 억제제 및 MASP-1 억제제, MASP-2 억제제 및 MASP-3 억제제, MASP-3 억제제 및 MASP-1 억제제, 또는 MASP-1 억제제, MASP-2 억제제 및 MASP-3 억제제가 투여된다.

Description

다양한 질환 및 장애의 치료를 위해 MASP-1 및/또는 MASP-2 및/또는 MASP-3를 억제하는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS OF INHIBITING MASP-1 AND/OR MASP-2 AND/OR MASP-3 FOR THE TREATMENT OF VARIOUS DISEASES AND DISORDERS}
관련된 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2012년 6월 18일에 출원된 출원 번호 제61/661,167호의 이익을 주장한다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 연관된 서열 목록은 서류 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며 명세서에 참고로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 이름은 MP_1_0176_PCT_SequenceListingasFiled_20130614.txt이고 명세서의 출원과 함께 EFS-Web을 통해 제출되고 있다.
보체 시스템은 인간 및 다른 척추동물에서, 미생물 감염 및 다른 심각한 손상에 대한 면역 반응을 개시하고, 증폭시키며 조정하기 위한 초기 작동 메커니즘을 제공한다 (M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., New York). 보체 활성화는 잠재적 병원체에 대하여 귀중한 제1 선 방어를 제공하는 한편, 보호적 면역 반응을 촉진하는 보체의 활성은 또한 숙주에 대한 잠재적 위협을 나타낼 수 있다 (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 75:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). 예를 들어, C3 및 C5 단백질 가수분해 생성물은 호중구를 보충하고 이를 활성화한다. 숙주 방어에 필수적인 한편, 활성화된 호중구는 파괴적 효소의 방출에 무차별적이고 기관 손상을 유발할 수도 있다. 게다가, 보체 활성화는 가까운 숙주 세포, 뿐만 아니라 미생물 표적 상에 용해성 보체 성분의 침착을 유발할 수도 있으며, 숙주 세포 용해를 일으킨다.
보체 시스템은 또한 심근경색(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), ARDS, 재관류 손상(reperfusion injury), 패혈성 쇼크(septic shock), 열화상(thermal burn) 후 모세관 누출(capillary leakage), 후 심폐 바이패스 염증(postcardiopulmonary bypass inflammation), 이식 거부(transplant rejection), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 및 알츠하이머 병(Alzheimer's disease)을 포함하는 수많은 급성 및 만성 질환 상태의 발병에 관여되었다. 이 질병들 중 거의 전부에서, 보체가 원인은 아니지만 발병에 수반되는 여러 인자 중 하나이다. 그럼에도 불구하고, 보체 활성화는 주요 병리학적 메커니즘일 수도 있으며 이 질병 상태들 중 다수에서 임상적 조절에 유효한 점을 나타낸다. 다양한 질병 상태에 있어서 보체-매개된 조직 부상의 중요성의 증가하는 인식은 효과적인 보체 억제 약물의 필요성을 강조한다. 지금까지, 에쿨리쥬맙 (Solaris®), C5에 대한 항체는 인간 사용이 승인된 유일한 보체-표적화 약물이다. 하지만, C5는 보체 시스템에서 "다운스트림"에 위치하는 여러 효과기 분자들 중 하나이고, C5의 차단은 보체 시스템의 활성화를 억제하지 않는다. 그러므로, 보체 활성화의 개시 단계의 억제자는 "다운스트림" 보체 억제자 보다 큰 이점을 가질 것이다.
현재, 보체 시스템이 세 개의 별개의 경로, 고전적 경로, 렉틴 경로, 및 대체 경로를 통해 활성화될 수 있다는 것이 널리 수용된다. 고전적 경로는 보통 외부 입자 (즉, 항원)에 결합된 숙주 항체로 구성된 복합체에 의해 촉발되고 따라서 특이적 항체 반응의 발생을 위해 항원에 사전 노출이 필요하다. 고전적 경로의 활성화가 숙주에 의한 선천적 면역 반응(adaptive immune response)에 의존적이기 때문에, 고전적 경로는 후천적 면역계(acquired immune system)의 일부이다. 반대로, 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다는 적응 면역에 독립적이며 내재 면역계의 일부이다.
보체 시스템의 활성화는 세린 프로테아제 치모겐(serine protease zymogen)의 순차적 활성화를 일으킨다. 고전적 경로 활성화의 첫 번째 단계는 특이적 인식 분자, C1q의 항원-결합된 IgG 및 IgM 분자로의 결합이다. C1q는 C1으로 불리는 복합체로서 C1r 및 C1s 세린 프로테아제와 결합된다. C1q의 면역 복합체로의 결합시, C1r의 Arg-Ile 부위의 단백질 가수분해 분할은 C1r-매개된 분할 및 C1s의 활성화로 이어지며, 이로 인해 이것은 C4 및 C2를 분할하는 능력을 획득한다. C4는 C4a 및 C4b로 지정된 두 개의 단편으로 분할되고, 유사하게, C2는 C2a 및 A2b로 분할된다. C4b 단편은 인접한 히드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성할 수 있고 활성화된 C2의 C2a 단편과의 비공유 상호작용을 통해 C3 컨버타제 (C4b2a)를 생성한다. C3 컨버타제 (C4b2a)는 C5 컨버타제 (C4b2a3b)의 생성으로 이어지는 C3a 및 C3b 하위 구성요소로의 단백질 가수분해 분할에 의해 C3를 활성화하며, 이것은, C5를 분할 함으로써, 세포막을 붕괴시켜서 세포 용해를 일으킬 수 있는 막 공격 복합체(membrane attack complex) ("MAC"로도 불리는, C6, C7, C8 및 C-9와 결합된 C5b)의 형성으로 이어진다. C3 및 C4의 활성화된 형태 (C3b 및 C4b)는 공유 결합에 의해 외부 표적 표면에 침착되며, 이것은 다수의 포식세포 상의 보체 수용체에 의해 인식된다.
독립적으로, 렉틴 경로를 통한 보체 시스템 활성화의 첫 번째 단계는 또한 특이적 인식 분자의 결합이며, 이것은 관련된 세린 프로테아제 전구효소(proenzyme)의 활성화로 이어진다. 하지만, C1q에 의한 면역 복합체의 결합 대신에, 렉틴 경로의 인식 분자는, 종합적으로 렉틴으로 불리는, 탄수화물-결합 단백질 (만난-결합 렉틴 (MBL), H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 C-형 렉틴 CL-11)의 군을 포함한다. J. Lu et al, Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, (2002); Holmskov et al, Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh et al, Immunology 101:225-232 (2000))를 참고하면 된다. 또한 J. Luet et al, Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al, Immunology 101:225-232 (2000); Hansen et al, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010)를 참고하면 된다.
Ikeda 등은, C1q와 유사하게, MBL이 C4-의존적 방식에서 효모 만난-코팅된 적혈구에 결합시 보체 시스템을 활성화할 수 있다는 것을 처음 입증하였다 (Ikeda et al, J. Biol. Chem. 2(52:7451-7454, (1987)). MBL, 콜렉틴 단백질 과의 멤버는 피라노스 고리의 적도면으로 배향된 3- 및 4-히드록시 기를 가진 탄수화물에 결합하는 칼슘-의존적 렉틴이다. 따라서 MBL에 중요한 리간드는 D-만노스 및 N-아세틸-D-글루코사민인 한편, 입체적 요건을 만족하지 않는 탄수화물은 MBL에 대하여 검출 불가능한 친화도를 갖는다 (Weis et al., Nature 360:127-134, (1992)). MBL과 1가 당 사이의 상호작용은 극도로 약하며, 해리 상수는 전형적으로 한 자릿수의 밀리 몰 범위에 있다. MBL은 결합 활성에 의해, 즉, 서로 가까이에 다수의 단당류 잔기와 동시에 상호작용함으로써 글리칸 리간드에 대한 단단하고, 특이적인 결합을 달성한다 (Lee et al, Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992)). MBL은 박테리아, 효모, 기생충 및 특정 바이러스와 같은 미생물을 일반적으로 장식하는 탄수화물 패턴을 인식한다. 반대로, MBL은 D-갈락토스 및 시알산, 포유동물 혈장 및 세포 표면 당단백질에 존재하는 "성숙한" 복합성 당접합체(glycoconjugate)를 보통 장식하는 끝에서 두 번째 및 최종 당을 인식하지 않는다. 이 결합 특이성은 "외부" 표면의 인식을 촉진하고 "자기 활성화"로부터의 보호를 돕는 것으로 생각된다. 하지만, MBL은 포유동물 세포의 소포체(endoplasmic reticulum) 및 골지체(Golgi)에서 격리된 N-결합된 당단백질 및 당지질에서 높은 친화도로 고-만노스 "전구체" 글리칸의 클러스터에 결합한다 (Maynard et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, (1982)). 게다가, MBL이 폴리뉴클레오티드, DNA 및 RNA에 결합할 수 있다는 것으로 나타나며, 이것은 괴사 및 사멸 세포에서 노출될 수도 있다 (Palaniyar et al, Ann. N. Y. Acad. ScL, 1010:467-470 (2003); Nakamura et al, J. Leuk. Biol. 86:737-748 (2009)). 그러므로, 손상된 세포는 MBL 결합을 통한 렉틴 경로 활성화에 대한 잠재적 표적이다.
피콜린은 피브리노겐-유사 도메인으로 불리는, MBL과 다른 타입의 렉틴 도메인을 소유한다. 피콜린은 Ca++-독립적 방식으로 당 잔기에 결합한다. 인간에서, 세 종류의 피콜린 (L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린)이 확인되었다. 두 개의 혈청 피콜린, L-피콜린 및 H-피콜린은 공동으로 N-아세틸-D-글루코사민에 대한 특이성을 갖지만, H-피콜린은 또한 N-아세틸-D-갈락토사민에 결합한다. L-피콜린, H-피콜린, CL-11, 및 MBL의 당 특이성의 차이는 다른 렉틴이 상보성이고, 중첩에도 불구하고, 다른 당접합체를 표적화할 수도 있다는 것을 의미한다. 이 개념은 렉틴 경로의 알려진 렉틴 중에서, L-피콜린만이 리포테이코산, 모든 그람-양성 박테리아에서 발견된 세포벽 당접합체에 특이적으로 결합한다는 최근 보고서에 의해 지지된다 (Lynch et al., J. Immunol. 172: 1198-1202, (2004)). 게다가, 아세틸화된 당 모이어티(moiety)에 대하여, 피콜린은 아세틸화된 아미노산 및 폴리펩티드에 결합할 수 있다 (Thomsen et al, Mol. Immunol. 48(4):369-81 (2011)). 콜렉틴 (즉, MBL) 및 피콜린은 아미노산 서열에서 유의한 유사성을 함유하지 않는다. 하지만, 두 군의 단백질은 유사한 도메인 조직을 갖고, C1q와 같이, 올리고머 구조로 조립하며, 이것은 다중부위 결합의 가능성을 최대화한다.
MBL의 혈청 농도는 건강한 집단에서 매우 가변적이고 이것은 MBL 유전자의 프로모터 및 암호화 영역 둘 다에서 다형현상(polymorphism)/돌연변이에 의해 유전적으로 조절된다. 급성기 단백질로서, MBL의 발현은 염증 동안 더 상향조절된다. L-피콜린은 혈청에서 MBL의 것과 유사한 농도로 존재한다. 그러므로, 렉틴 경로의 L-피콜린 분지는 강도가 MBL 팔과 잠재적으로 비슷하다. MBL 및 피콜린은 또한 옵소닌으로 기능할 수 있으며, 이것은 포식세포가 MBL- 및 피콜린-장식된 표면을 표적화하게 한다 (Jack et al, J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi et al, J Immunol, 174(1):418-25(2005)를 참고하면 된다). 이 옵소닌화는 이 단백질들의 포식세포 수용체와의 상호작용을 필요로 하며 (Kuhlman et al, J. Exp. Med. 169: 1733, (1989); Matsushita et al, J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996)), 이것의 정체성은 확립되지 않았다.
인간 MBL은 그것의 콜라겐-유사 도메인을 통해 MBL-연관된 세린 프로테아제 (MASP)로 불리는, 독특한 C1r/C1s-유사 세린 프로테아제와의 특이적 및 고-친화도 상호작용을 형성한다. 지금까지, 세 개의 MASP가 설명되었다. 먼저, 단일 효소"MASP"는 보체 캐스케이드(cascade) (즉, C2 및 C4의 분할)의 개시의 원인이 되는 효소로서 확인되었고 특성화되었다 (Matsushita et al., J Exp Med 176(6): 1497-1502 (1992); Ji et al, J. Immunol. 150:571-578, (1993)). MASP 활성은, 사실은, 두 개의 프로테아제, MASP-1 및 MASP-2의 혼합물이라는 것이 그 후에 결정되었다 (Thiel et al, Nature 556:506-510, (1997)). 하지만, MBL-MASP-2 복합체 단독이 보체 활성화에 충분하다는 것이 입증되었다 (Vorup-Jensen et al, J. Immunol. 165:2093-2100, (2000)). 게다가, MASP-2만이 높은 비율로 C2 및 C4를 분할하였다 (Ambrus et al, J. Immunol. 770: 1374-1382, (2003)). 그러므로, MASP-2는 C4 및 C2를 활성화하여 C3 컨버타제, C4b2a를 발생시키는 원인이 되는 프로테아제이다. 이것은, 두 개의 특이적 세린 프로테아제 (C1r 및 C1s)의 조율된 작용이 보체 시스템의 활성화로 이어지는 경우에, 고전적 경로의 C1 복합체와 크게 다르다. 게다가, 세 번째 새로운 프로테아제, MASP-3이 분리되었다 (Dahl, M.R., et al, Immunity 15: 127-35, 2001). MASP-1 및 MASP-3은 같은 유전자의 대체 스플라이스된(대안으로 spliced) 생성물이다.
MASP는 C1r 및 C1s의 것들과 동일한 도메인 조직, C1 복합체의 효소적 구성요소를 공유한다 (Sim et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000)). 이 도메인들은 N-말단 C1r/C1s/성게 VEGF/뼈 형태 형성 단백질 (CUB) 도메인, rr표피 성장 인자-유사 도메인, 제2 CUB 도메인, 보체 조절 단백질 도메인의 탠덤(tandem), 및 세린 프로테아제 도메인을 포함한다. C1 프로테아제에서와 마찬가지로, MASP-2의 활성화는 세린 프로테아제 도메인에 인접한 Arg-Ile 결합의 분할을 통해 일어나며, 이것은 효소를 이황화-결합된 A 및 B 사슬로 분열시키고, 후자는 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다.
MBL은 또한 19 kDa의 MBL-관련된 단백질 (MAp19) 또는 작은 MBL-관련된 단백질 (sMAP)로 알려져 있는, MASP-2의 대체 스플라이스된 형태와 결합할 수 있으며, 이것은 MASP-2의 촉매 활성이 결핍된다 (Stover, J. Immunol. 162:3481-90, (1999); Takahashi et al, Int. Immunol. 11:859-863, (1999)). MAp19는 MASP-2의 처음 두 개의 도메인에 이어서, 네 개의 독특한 아미노산의 추가 서열을 포함한다. Map19의 기능은 불분명하다 (Degn et al., J Immunol. Methods, 2011). MASP-1 및 MASP-2 유전자는 각각 인간 염색체 3 및 1에 위치한다 (Schwaeble et al, Immunobiology 205:455-466, (2002)).
여러 방면의 증거는 다른 MBL-MASP 복합체가 있고 혈청 중의 MASP의 큰 분획은 MBL과 복합체를 형성하지 않는다는 것을 제안한다 (Thiel, et al., J. Immunol. 165:878-887, (2000)). H- 및 L-피콜린은 MBL이 한 바와 같이 모든 MASP에 결합하고 렉틴 보체 경로를 활성화한다 (Dahl et al., Immunity 15: 127-35, (2001); Matsushita et al., J. Immunol. 168:3502-3506, (2002)). 렉틴 경로 및 고전적 경로 둘 다는 일반적인 C3 컨버타제 (C4b2a)를 형성하고 두 경로는 이 단계에서 수렴된다.
렉틴 경로는 나이브(naive) 숙주에서 감염에 대한 숙주 방어에 있어서 주요한 역할을 갖는 것으로 널리 생각된다. 숙주 방어에서 MBL의 수반에 대한 강력한 증거는 기능적 MBL의 감소된 혈청 수준을 갖는 환자의 분석에서 나온다 (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)). 이러한 환자는 재발성 박테리아 및 균류 감염에 대한 민감성을 나타낸다. 이 증상들은 보통 삶의 초기에, 모계 유래된 항체 역가와 같은 취약점의 분명한 창이 약해지는 동안, 하지만 항체 반응의 전체 레퍼토리(repertoire)가 발달하기 전에 눈에 띈다. 이 증후군은 종종 MBL의 콜라겐성 부분의 여러 부위에서의 돌연변이로부터 발생하며, MBL 올리고머의 적절한 형성을 방해한다. 하지만, MBL이 보체 독립적인 옵소닌으로서의 기능을 할 수 있기 때문에, 감염에 대한 증가된 민감성이 어느 정도로 손상된 보체 활성화로 인한 것인지는 알려져 있지 않다.
고전적 경로 및 렉틴 경로와 달리, 대체 경로의 어떤 개시자도 C1q 및 렉틴이 다른 두 개의 경로에서 수행하는 인식 기능을 실행하는 것으로 이전에 발견되지 않았다. 현재 대체 경로가 낮은 수준의 턴오버(turnover) 활성화를 자발적으로 경험한다는 것이 널리 수용되며, 이것은 자발적 보체 활성화를 억제하는 적절한 분자 요소가 결핍된, 외부 또는 다른 비정상적인 표면 (박테리아, 효모, 바이러스 감염된 세포, 또는 손상된 조직)에서 쉽게 증폭될 수 있다. 네 개의 혈장 단백질, C3, 인자 B 및 D, 및 프로퍼딘이 대체 경로의 활성화에 직접적으로 수반된다.
비-전염성 인간 질환의 발병에 있어서 고전적 및 대체 보체 경로 둘 다에 관여하는 많은 증거가 있지만, 렉틴 경로의 역할은 막 평가되기 시작했다. 최근 연구는 국소성 빈혈(ischemia)/재관류 손상에서 렉틴 경로의 활성화가 보체 활성화 및 관련된 염증의 원인이 될 수 있다는 증거를 제공한다. Collard et al. (2000)은 산화 스트레스를 받은 배양된 내피 세포가 MBL에 결합하고 인간 혈청에 노출시 C3의 침착을 나타낸다는 것을 보고하였다 (Collard et al, Am. J. Pathol. 156: 1549-1556, (2000)). 게다가, 차단 항-MBL 단클론성 항체와 함께 인간 혈청의 처리는 MBL 결합 및 보체 활성화를 억제하였다. 이 발견들은 래트 MBL에 관련된 차단 항체가 처리된 래트는 관상 동맥의 폐색 시 대조군 항체가 처리된 래트보다 훨씬 적은 심근 손상을 나타낸, 심근 허혈(myocardial ischemia)-재관류의 래트 모델로 연장되었다 (Jordan et al., Circulation 104: 1413-1418, (2001)). 산화 스트레스 후 혈관 내피에 결합하는 MBL의 분자적 메커니즘은 불분명하다: 최근 연구는 산화 스트레스 후 렉틴 경로의 활성화가 혈관 내피의 시토케라틴에 결합하지만, 당접합체에는 결합하지 않는 MBL에 의해 매개될 수도 있다는 것을 제안한다 (Collard et al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001)). 다른 연구는 국소성 빈혈/재관류 손상의 발병에 있어서 고전적 경로 및 대체 경로에 관여하였고 이 질환에서 렉틴 경로의 역할은 논란의 여지가 있다 (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162:363-361, 2003).
최근 연구는 MASP-1 및 MASP-3이 대체 경로 활성 효소 인자 D를 그것의 치모겐 형태로부터 그것의 효소적으로 활성인 형태로 전환시킨다는 것을 보여주었다 (Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1):29-37 (2010); Iwaki et al., J. Immunol. 187:3751-58 (2011)을 참고하면 된다). 이 과정의 생리학적 중요성은 MASP-1/3-결핍 마우스의 혈장에서 대체 경로 기능적 활성의 부재에 의해 강조된다. 고유한 C3으로부터 C3b의 단백질 가수분해 발생은 대체 경로가 기능하는데 필요하다. 대체 경로 C3 컨버타제 (C3bBb)가 필수 서브유닛으로서 C3b를 함유하기 때문에, 대체 경로를 통한 첫 번째 C3b의 기원에 관한 질문은 당혹스러운 문제를 제시하고 많은 연구를 자극하였다.
C3은 티오에스테르 결합으로 알려져 있는 희귀한 번역 후 변형을 함유하는 단백질의 과에 속한다 (C4 및 α-2 마크로글로불린과 함께). 티오에스테르 기는 말단 카르보닐 기가 세 개의 아미노산과 떨어져서 시스테인의 술프히드릴 기와 공유 티오에스테르 결합을 형성하는 글루타민으로 구성된다. 이 결합은 불안정하고 친전자성 글루타밀-티오에스테르는 히드록실 또는 아미노 기와 같은 친핵성 모이어티와 반응할 수 있으며 따라서 다른 분자와 공유 결합을 형성한다. 티오에스테르 결합은 온전한 C3의 소수성 포켓 내에서 격리될 때 상당히 안정하다. 하지만, C3의 C3a 및 C3b로의 단백질 가수분해 분할은 C3b에 고도로 반응성인 티오에스테르 결합의 노출을 일으키고, 히드록실 또는 아미노 기를 포함하는 인접한 모이어티에 의한 친핵성 공격 후, C3b는 표적에 공유 결합된다. C3b의 보체 표적으로의 공유 결합에 의한 부착에 있어서 잘 서류화된 그것의 역할에 더하여, C3 티오에스테르는 또한 대체 경로를 촉발하는데 있어서 중심적인 역할을 갖는 것으로 생각된다. 널리 수용된 "틱-오버 이론(tick-over theory)"에 따라, 대체 경로는 체액-단계 컨버타제, iC3Bb의 발생에 의해 개시되며, 이것은 가수분해된 티오에스테르 (iC3; C3(H20)) 및 인자 B와 함께 C3로부터 형성된다 (Lachmann, P. J., et al, Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, (1984)). C3b-유사 C3(H20)은 단백질에서 내부 티오에스테르의 느린 자발적 가수분해에 의해 고유한 C3으로부터 발생된다 (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med. 754:856-867, 1981). C3(H20)Bb 컨버타제의 활성을 통해, C3b 분자는 표적 표면상에 침착되며 이로 인해 대체 경로를 개시한다.
본원에서 설명된 즉석 발견 이전에는, 대체 경로의 활성화의 개시자에 대해서는 알려진 것이 거의 없었다. 활성화제는 효모 세포벽(치모산), 많은 순수한 다당류, 토끼 적혈구, 특정 면역글로불린, 바이러스, 균류, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충, 및 손상된 세포를 포함하는 것으로 생각되었다. 이 활성화들에 공통된 유일한 특징은 탄수화물의 존재이지만, 탄수화물 구조의 복잡성 및 다양성은 인식되는 공유 분자적 결정요인을 확립하는 것을 어렵게 만들었다. 대체 경로 활성화가 인자 H, 인자 I, DAF, 및 CR1과 같이, 이 경로의 억제 조절 구성요소와 프로퍼딘 사이의 좋은 균형을 통해 제어된다는 것이 널리 수용되며, 이것들 중 후자는 대체 경로의 유일한 양성 조절기이다 (Schwaeble W.J. and Reid K.B., Immunol Today 20(1): 17-21 (1999)를 참고하면 된다).
상기 설명된 명백하게 조절되지 않은 활성화 메커니즘에 더하여, 어떤 C3b도 추가적인 대체 경로 C3 컨버타제 (C3bBb)를 형성하는데 인자 B와 함께 참여할 수 있기 때문에, 대체 경로는 또한 렉틴/고전적 경로 C3 컨버타제 (C4b2a)에 대한 강력한 증폭 루프(loop)를 제공할 수 있다. 대체 경로 C3 컨버타제는 프로퍼딘의 결합에 의해 안정화된다. 프로퍼딘은 여섯 내지 열 배로 대체 경로 C3 컨버타제 반감기를 연장한다. C3b의 대체 경로 C3 컨버타제로의 추가는 대체 경로 C5 컨버타제의 형성으로 이어진다.
모든 세 개의 경로 (즉, 고전적, 렉틴 및 대체)는 C5에서 수렴되는 것으로 생각되었으며, 이것은 분할되어 다수의 전염증성 효과를 갖는 생성물을 형성한다. 수렴된 경로는 말단 보체 경로로 나타난다. C5a는 가장 강한 아나필라톡신이며, 평활근 및 혈관 긴장도(vascular tone), 뿐만 아니라 혈관 투과성(vascular permeability)의 변화를 유발한다. 그것은 또한 강력한 케모탁신이고 호중구 및 단핵구 둘 다의 활성화제이다. C5a-매개된 세포 활성화는 다수의 추가적 염증 매개자의 방출을 유발함으로써 염증 반응을 크게 증폭할 수 있으며, 시토킨, 가수분해 효소, 아라키돈 산 대사산물, 및 활성 산소종(reactive oxygen species)을 포함한다. C5 분할은 막 공격 복합체 (MAC)로도 알려져 있는, C5b-9의 형성으로 이어진다. 현재는 저용해성 MAC 침착은 그것의 용해성 구멍-형성 복합체로서의 역할 이외에 염증에서 중요한 역할을 할 수도 있다는 강력한 증거가 있다. 따라서, 이 부작용들을 방지하기 위해 치료적으로 유효한 보체 억제제를 개발하는 것이 절실하게 필요하다.
한 양태에서, 본 발명은 발작성 야간혈색뇨증 (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria; PNH), 나이-관련 황반 변성(age-related macular degeneration; AMD), 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury), 관절염(arthritis), 파종성 혈관 내 응고(disseminated intravascular coagulation), 혈전성 미소혈관증(thrombotic microangiopathy), 천식(asthma), 조밀침착병(dense deposit disease), 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염(pauci-immune necrotizing crescentic glomerulonephritis), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 흡인성 폐렴(aspiration pneumonia), 내안구염(endophthalmitis), 시속척수염(neuromyelitis optica) 또는 베체트 병(Behcet's disease)으로 고통받는 개체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. 방법은 개체에게 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-3 억제제의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 개체에게 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 더 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 또는 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. 방법은 개체에 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 이것의 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 SEQ ID NO: 5의 일부에 특이적으로 결합하는 이것의 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 항체는 키메라, 인간화된 또는 인간 항체이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 적어도 하나의 억제제는 MASP-2 억제제 및 MASP-3 억제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 MASP-1 (SEQ ID NO:10 전장)의 일부에 결합하고 또한 MASP-3 (SEQ ID NO:8)의 일부에 결합하는 MASP-3 억제제 및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 MASP-2 (SEQ ID NO:5 전장)의 일부에 결합하고 또한 MASP-3 (SEQ ID NO:8)의 일부에 결합하는 MASP-3 억제제 및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 MASP-1 (SEQ ID NO:10 전장)의 일부에 결합하고 또한 MASP-2 (SEQ ID NO:5)의 일부에 결합하는 MASP-3 억제제 및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 MASP-1 (SEQ ID NO:10 전장)의 일부에 결합하고, MASP-2 (SEQ ID NO:5 전장)의 일부에 결합하고, 또한 MASP-3 (SEQ ID NO:8)의 일부에 결합하는 MASP-3 억제제 및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 살아있는 개체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화의 효과를 억제하는데 사용되는 의약품을 제조하는 방법을 제공하며, 약학적 담체에서 MASP-3 억제제의 치료적 유효량을 조합하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 양태에 따르는 방법은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증, 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 또는 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화의 효과를 억제하는데 사용되는 의약품을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 MASP-3 억제자를 포함하는 의약품으로 또는 이것과 조합하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 살아있는 개체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 효과를 억제하는데 사용되는 의약품을 제조하는 방법을 제공하며, 약학적 담체에서 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 조합하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 양태에 따르는 방법은 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 또는 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 효과를 억제하는데 사용되는 의약품을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 MASP-3 억제제의 치료적 유효량을 MASP-2 억제자를 포함하는 의약품으로 또는 이것과 조합하는 단계를 더 포함한다.
본원에서 설명된 바와 같이, MASP-3 억제제의 다양한 구체예 및/또는 MASP-2 억제제의 다양한 구체예는 본 발명의 약학적 조성물에서 사용될 수 있다.
본원에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.
본원에서 설명된 발명의 이 및 다른 양태들은 다음 상세한 설명 및 도면을 참조하여 명백해질 것이다. 본 명세서에서 나타난 미국 특허, 미국 특허 출원 간행물, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 간행물 모두는, 각각이 개별적으로 포함되는 것처럼, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 상기 언급된 양태 및 부수적 이점 중 다수는, 첨부된 도면과 함께 취해질 때, 같은 것이 다음 상세한 설명을 참조하여 더 잘 이해되기 때문에 더 쉽게 인정될 것이며:
도 1은 렉틴 및 대체 경로의 새로운 이해를 도시한다.
도 2는 Schwaeble et al., Immunobiol 205:455-466 (2002)로부터 조정된 개략도이며, Yongqing et al, BBA 1824:253 (2012)에 의해 변형된 바와 같고, MASP-2 및 MAp19 단백질 도메인 및 같은 것을 암호화하는 엑손을 도시한다.
도 3은 Schwaeble et al., Immunobiol 205:455-466 (2002)로부터 조정된 개략도이며, Yongqing et al, BBA 1824:253 (2012)에 의해 변형된 바와 같고, MASP-1, MASP-3 및 MAp44 단백질 도메인 및 같은 것을 암호화하는 엑손을 도시한다.
도 4는 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3 단백질의 아미노산 서열의 정렬을 나타내고 그 사이의 공통 영역을 지시한다.
도 5는 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3 알파 사슬의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
도 6은 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3 베타 사슬의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
도 7A는 MASP-1 및 MASP-2 프로테아제 도메인 (베타 사슬)의 아미노산 서열의 쌍별 정렬을 나타낸다.
도 7B는 MASP-1 및 MASP-3 프로테아제 도메인 (베타 사슬)의 아미노산 서열의 쌍별 정렬을 나타낸다.
도 7C는 MASP-2 및 MASP-3 프로테아제 도메인 (베타 사슬)의 아미노산 서열의 쌍별 정렬을 나타낸다.
도 8은 네이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 혈청군 A Z2491의 2.6 x 107 cfu의 감염량의 투여 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존율을 그래프로 도시하는 카플란-메이어(Kaplan-Meyer) 플롯이며, MASP-2 결핍 마우스는 네이세리아 메닝기티디스 유발된 치사율로부터 보호된다는 것을 입증하며, 실시예 1에서 설명된 바와 같다.
도 9는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 6 x 106 cfu의 감염량의 투여 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존율을 그래프로 도시하는 카플란-메이어(Kaplan-Meyer) 플롯이며, MASP-2 결핍 마우스는 네이세리아 메닝기티디스 유발된 치사율로부터 보호된다는 것을 입증하며, 실시예 1에서 설명된 바와 같다.
도 10은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 6 x 106 cfu로 복강 내 감염 후 다른 시점에서 MASP-2 KO 및 WT로부터 회수된 혈액의 mL 당 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 log cfu/mL을 그래프로 도시하며 (두 군의 마우스에 대하여 다른 시점에서 n=3), MASP-2 KO 마우스가 WT 마우스와 같은 용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 감염되었지만, MASP-2 KO 마우스는 WT와 비교하여 균혈증(bacteremia)의 향상된 제거율을 갖는다는 것을 입증하며, 실시예 1에서 설명된 바와 같다.
도 11은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 6 x 106 cfu로 감염 후 3, 6, 12 및 24시간에 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 평균 질병 점수(illness score)를 그래프로 도시하며, MASP-2-결핍 마우스는 WT 마우스와 비교하여 감염 후 6시간, 12시간, 및 24시간에 훨씬 더 낮은 질병 점수를 나타냈다는 것을 입증하며, 실시예 1에서 설명된 바와 같다.
도 12는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 4 x 106 cfu의 감염량의 투여에 이어서, 억제 MASP-2 항체 (1 mg/kg) 또는 대조군 이소타입 항체의 투여 3시간 후-감염 후 마우스의 퍼센트 생존율을 그래프로 도시하는 카플란-메이어 플롯이며, MASP-2 항체는 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 개체를 치료하고 이의 생존율을 개선하는데 효과적이라는 것을 입증하며, 실시예 2에서 설명된 바와 같다.
도 13은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58과 함께 배양 후 다른 시점에서 채취된, 표 5에 나타난 인간 혈청 샘플에서 다른 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 생균 계수법의 log cfu/mL을 그래프로 도시하며, 실시예 3에서 설명된 바와 같다.
도 14는 표 7에서 나타난 인간 혈청 샘플에서 다른 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균 계수법의 log cfu/mL을 그래프로 도시하며, 인간 20% (v/v) 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해는 MASP-2 및 MBL-의존적이라는 것을 나타내며, 실시예 3에서 설명된 바와 같다.
도 15는 표 9에서 나타난 마우스 혈청 샘플에서 다른 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균 계수법의 log cfu/mL를 그래프로 도시하며, MASP-2 -/- 넉아웃 마우스 ("MASP-2 -/-"로 불림) 혈청은 WT 마우스 혈청보다 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 더 높은 수준의 살균 활성을 갖는 반면에, 반대로, MASP-1/3 -/- 마우스 혈청은 어떤 살균 활성도 갖지 않는다는 것을 나타내며, 실시예 3에서 설명된 바와 같다.
도 16은 WT, C4-/-, MASP-1/3-/-, 인자 B-/- 및 MASP-2-/- 마우스 혈청에서 렉틴 경로-특이적 조건 (1% 혈장) 하에 C3 활성화의 동역학을 그래프로 도시하며, 실시예 4에서 설명된 바와 같다.
도 17은 "전통적" 대체 경로-특이적 (AP-특이적) 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 대체 경로-구동된 (AP-구동된) C3b 침착의 수준을 MASP-3-결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 인간 개체로부터 얻은 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 그래프로 도시하며, 실시예 4에서 설명된 바와 같다.
도 18은 "전통적" AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 MASP-3-결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 인간 개체로부터 얻은 10% 인간 혈청 샘플에서 시간의 함수로서 그래프로 도시하며, 실시예 4에서 설명된 바와 같다.
도 19A는 "전통적" AP-특이적 조건 (즉 Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 또는 생리학적 조건 하에 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 (AP) 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에 만난-코팅된 미세역가 플레이트에서 C3b 침착의 수준을 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스로부터 얻은 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 그래프로 도시하며, 실시예 4에서 설명된 바와 같다.
도 19B는 전통적 AP-특이적 조건 (즉 Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 또는 생리학적 조건 하에 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 (AP) 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 C3b 침착의 수준을 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스로부터 얻은 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 그래프로 도시하며, 실시예 4에서 설명된 바와 같다.
도 19C는 전통적 AP-특이적 조건 (즉 Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 또는 생리학적 조건 하에 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 (AP) 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에 스트렙토코쿠스 뉴모니애(스트렙토코쿠스 뉴모니애e) D39-코팅된 미세역가 플레이트에서 C3b 침착의 수준을 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스로부터 얻은 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 그래프로 도시하며, 실시예 4에서 설명된 바와 같다.
도 20A는 0%에서 1.25%까지의 범위의 혈청 농도를 사용하여, 전통적 AP-특이적 조건 (즉 Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에 만난-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 수행된, 고도로 희석된 혈청에서 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 실시예 4에서 설명된 바와 같다.
도 20B는 0%에서 1.25%까지의 범위의 혈청 농도를 사용하여, 전통적 AP-특이적 조건 (즉 Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 수행된, 고도로 희석된 혈청에서 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 실시예 4에서 설명된 바와 같다.
도 20C는 0%에서 1.25%까지의 범위의 혈청 농도를 사용하여, 전통적 AP-특이적 조건 (즉 Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 수행된, 고도로 희석된 혈청에서 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 실시예 4에서 설명된 바와 같다.
도 21은 MASP-3-/-, 열 불활성화된 정상 인간 혈청 (HI NHS), MBL-/-, NHS + MASP-2 단클론성 항체 및 NHS 대조군의 혈청에서 혈청 희석의 범위에 걸쳐 생리학적 조건 하에 (즉, Ca++의 존재시) 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐 적혈구의 용혈의 수준 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 마우스 적혈구 (Crry/C3-/-)의 상층액으로의 헤모글로빈 방출로 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시하며, 실시예 5에서 설명된 바와 같다.
도 22는 MASP-3-/-, 열 불활성화된 정상 인간 혈청 (HI NHS), MBL-/-, NHS + MASP-2 단클론성 항체 및 NHS 대조군의 혈청에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 생리학적 조건 하에 (즉, Ca++의 존재시) 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐 적혈구의 용혈의 수준 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 마우스 적혈구 (Crry/C3-/-)의 상층액으로의 헤모글로빈 방출로 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시하며, 실시예 5에서 설명된 바와 같다.
도 23은 3MC (MASP-3-/-), 열 불활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, NHS + MASP-2 단클론성 항체 및 NHS 대조군의 혈청에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 생리학적 조건 하에 (즉, Ca++의 존재시) 인간 혈청에 의한 비-코팅된 쥐 적혈구의 용혈의 수준 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 WT 마우스 적혈구의 상층액으로의 헤모글로빈 방출로 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시하며, 실시예 5에서 설명된 바와 같다.
도 24는 열 불활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, NHS + MASP-2 단클론성 항체 및 NHS 대조군의 혈청에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 생리학적 조건 하에 (즉, Ca++의 존재시) 인간 혈청에 의한 비-코팅된 쥐 적혈구의 용혈의 수준 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 마우스 적혈구 (CD55/59-/-)의 상층액으로의 헤모글로빈 방출로 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시하며, 실시예 5에서 설명된 바와 같다.
도 25는 혈청 농도의 범위에 걸쳐 생리학적 조건 하에 (즉, Ca++의 존재시) MASP-1/3-/- 마우스 혈청 및 WT 대조군 마우스 혈청에 의한 만난-코팅된 토끼 적혈구의 용혈 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 토끼 적혈구의 상층액으로의 헤모글로빈 방출로 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시하며, 실시예 6에서 설명된 바와 같다.
도 26은 AP-특이적 조건 하에 수행된 C3 침착 검정에서 인자 D-/-, MASP-2-/- 및 WT 마우스 혈청의 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 C3b 침착의 수준 (OD 405 nm)을 그래프로 도시하며, 실시예 7에서 설명된 바와 같다.
도 27은 생리학적 조건 하에 (Ca++의 존재시) 수행된 C3 침착 검정에서 인자 D-/-; MASP-2-/- 및 WT 마우스 혈청의 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 C3b 침착의 수준 (OD 405 nm)을 그래프로 도시하며, 실시예 7에서 설명된 바와 같다.
도 28은 생리학적 조건 하에 (Ca++의 존재시) 수행된 C3 침착 검정에서 인자 D-/-; 인자 B-/-; 플러스 및 마이너스 MASP-2 단클론성 항체로부터 얻은 마우스 혈청 샘플에서 혈청 배양 시간(분)의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 C3b 침착의 수준 (OD 405 nm)을 그래프로 도시하며, 실시예 7에서 설명된 바와 같다.
도 29A는 마우스 MASP-2 MoAb의 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 피하 투여 후 다양한 시점에서 마우스 (n=3 마우스/군)로부터 채취한 희석되지 않은 혈청 샘플에서 생체 외에서 측정된, 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 렉틴 경로 특이적 C4b 침착을 그래프로 도시하며, 실시예 13에서 설명된 바와 같다.
도 29B는 마우스에서 0.6 mg/kg로 마우스 MASP-2 MoAb의 일회 복강 내 투여 후 3주 동안 렉틴 경로 회복의 시간 과정을 그래프로 도시하며, 실시예 13에서 설명된 바와 같다.
도 30A는 클론 M3J5에 대한 MASP-2 항원/항체 결합의 FACS 히스토그램이며, 실시예 15에서 설명된 바와 같다.
도 30B는 클론 M3M1에 대한 MASP-3 항원/항체 결합의 FACS 히스토그램이며, 실시예 15에서 설명된 바와 같다.
도 31은 MASP-3 항원에 대한 클론 M3J5 (클론 5)의 포화 결합 곡선을 그래프로 도시하며, 실시예 15에서 설명된 바와 같다.
도 32A는 M3J5, M3M1, D14 및 1E10의 VH 영역의 닭 DT40 VH 서열로의 아미노산 서열 정렬이며, 점은 DT40 서열과의 아미노산 동일성을 나타내고 대쉬(dash)는 정렬을 최대화하기 위해 도입된 공간을 지시하며, 실시예 15에서 설명된 바와 같다.
도 32B는 M3J5, M3M1, D14 및 1E1의 VL 영역의 닭 DT40 VL 서열로의 아미노산 서열 정렬이며, 점은 DT40 서열과의 아미노산 동일성을 나타내고 대쉬는 정렬을 최대화하기 위해 도입된 공간을 지시하며, 실시예 15에서 설명된 바와 같다.
도 33은 검정 키트와 함께 제공된 양성 혈청과 비교될 때 Wieslab Complement System Screen, MBL Pathway의 mAb1E10, 뿐만 아니라 이소타입 대조군 항체의 억제 활성을 나타내는 막대 그래프이며, mAb1E10는 LEA-2-의존적 활성화를 부분적으로 억제하는 반면에, 이소타입 대조군 항체는 그렇지 않다는 것을 입증하며 (MASP-2의 MASP-1-의존적 활성화의 억제를 통해), 실시예 15에서 설명된 바와 같다.
도 34는 0.15 내지 1000 nM의 농도 범위에 걸쳐 1% 정상 인간 혈청 플러스 이소타입 대조군, SGMI-1Fc 또는 SGMI-2Fc에 대한 C3b 침착의 수준을 그래프로 도시하며, SGMI-1Fc 및 SGMI-2Fc 둘 다가 만난-코팅된 ELISA 웰에서 정상 혈청의 C3b 침착을 억제하며, 각각 대략 27 nM 및 300 nM의 IC50 값을 갖는다는 것을 입증하며, 실시예 16에서 설명된 바와 같다.
도 35A는 열사(heat-killed) 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 유동 세포 분석의 결과를 제공하며, 렉틴 경로 및 대체 경로를 비활성화하는 것으로 알려져 있는 EDTA의 존재시 정상 인간 혈청에서는, C3b 침착이 관찰되지 않았고 (패널 1), Mg++/EGTA가 처리된 정상 인간 혈청에서는, 대체 경로-구동된 C3b 침착이 관찰되었으며 (패널 2), 패널 3, 4 및 5에서 나타난 바와 같이, 인자 B-고갈, 인자 D-고갈 및 프로퍼딘 (인자 P)-고갈 혈청 각각에서는, 대체 경로 구동된 C3b 침착이 관찰되지 않았다는 것을 입증하며, 실시예 17에서 설명된 바와 같다.
도 35B는 열사 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)에서 C3b 침착에 대한 유동 세포 분석의 결과를 제공하며, EDTA-처리된 정상 혈청에서와 같이 (패널 1), Mg++/EGTA의 존재시 3MC 혈청에서는 AP-구동된 C3b 침착이 없다는 것을 입증하는 반면에 (패널 3), 패널 4 및 5는 활성 전장 rMASP-3 (패널 4) 및 활성 rMASP-3 (CCP1-CCP2-SP) (패널 5) 둘 다는 3MC 혈청에서 AP-구동된 C3b 침착을 Mg++/EGTA가 처리된 정상 혈청에서 (패널 2) 관찰된 수준으로 회복시키고, 비활성 rMASP-3 (S679A) (패널 6) 및 야생형 rMASP-1 (패널 7)은 3MC 혈청에서 AP-구동된 C3b 침착을 회복할 수 없다는 것을 보여주며, 실시예 17에서 설명된 바와 같다.
도 36은 rMASP-3의 존재시 또는 부재시 3MC 혈청에서 스타필로코쿠스 아우레우스에 반응하여 인자 B 분할을 결정하기 위한 웨스턴 블롯(western blot) 분석의 결과를 보여주며, EDTA의 존재시 정상 인간 혈청 (음성 대조군, 레인 1)은, 레인 2에서 나타난 바와 같이, Mg++/EGTA의 존재시 정상 인간 혈청에 비해 매우 적은 인자 B 분할을 입증하며, (양성 대조군), 레인 3에서 추가로 나타난 바와 같이, 3MC 혈청은 Mg++/EGTA의 존재시 매우 적은 인자 B 분할을 입증한다. 하지만, 레인 4에서 나타난 바와 같이, 인자 B 분할은 전장, 재조합 MASP-3 단백질의 3MC 혈청에 추가 및 사전 배양에 의해 회복되며, 실시예 17에 의해 설명된 바와 같다.
도 37은 인자 B 분할이 분석되는 단백질 겔의 쿠마시 (Comassie) 염색을 나타내며, 인자 B 분할은 C3, MASP-3 및 프로-인자 D (레인 1)의 존재시 가장 적합하고, 레인 4 및 5에서 나타난 바와 같이, MASP-3 또는 프로-인자 D 단독은 C3가 존재하는 한 인자 B 분할을 매개할 수 있으며, 실시예 17에서 설명된 바와 같다.
도 38은 rMASP-3의 존재시 3MC 혈청에서 mAb 농도의 함수로서 플롯팅된, mAbD14 (MASP-3에 결합함), mAb1A5 (음성 대조군 항체) 및 이소타입 대조군 항체로부터 얻은 스타필로코쿠스 아우레우스의 C3b 염색의 평균 형광 강도 (mean fluorescent intensity; MFI)를 그래프로 도시하고, mAbD14는 농도-의존적 방식으로 MASP-3-의존적 C3b 침착을 억제한다는 것을 입증하며, 실시예 17에서 설명된 바와 같다.
도 39는 웨스턴 블롯 분석 of 프로-인자 D 기질 분할의 웨스턴 블롯 분석을 나타내며, 프로-인자 D 단독 (레인 1) 또는 비활성 전장 재조합 MASP-3 (S679A; 레인 3) 또는 MASP-1 (S646A; 레인 4)와 비교하여, 전장 야생형 재조합 MASP-3 (레인 2) 및 MASP-1 (레인 5)은 완벽하게 또는 부분적으로 프로-인자 D를 분할하여 성숙한 인자 D를 발생시키며, 실시예 18에서 설명된 바와 같다.
도 40은 MASP-3 및 프로-인자 D (mAb 없음, 레인 1)만을 함유하는 대조군 반응, 뿐만 아니라 MASP-1에 결합하지만, MASP-3 (레인 4)에는 결합하지 않는 DTLacO 라이브러리로부터 얻은 mAb를 함유하는 대조군과 비교할 때 MASP-3-의존적 프로-인자 D 분할에서 MASP-3 결합 mAbs D14 (레인 2) 및 M3M1 (레인 3)의 억제 활성을 나타내는 웨스턴 블롯이며, 실시예 18에서 설명된 바와 같다.;
도 41은 MASP-3-결핍 (3MC), C4-결핍 및 MBL-결핍 개체로부터 얻은 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 도시하며, 환자 2 및 환자 3의 MASP-3-결핍 혈청이 높은 혈청 농도 (25%, 12.5%, 6.25% 혈청 농도)에서 잔여 AP 활성을 갖지만 훨씬 더 높은 AP50을 갖는다 (8.2% 및 12.3%의 혈청이 최대 C3 침착의 50%>을 달성하는데 필요하다)는 것을 입증하며, 실시예 19에서 설명된 바와 같다.
도 42A는 "전통적" AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 MASP-3 결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 인간 개체로부터 얻은 10% 인간 혈청 샘플에서 시간의 함수로서 그래프로 도시하며, 실시예 19에서 설명된 바와 같다.
도 42B는 3MC 환자 #2 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (+/+)), 3MC 환자 #3 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (-/-))로부터 얻은 혈장, 및 정상 기증자의 혈청 (W)의 웨스턴 블롯을 나타내는데, 인간 프로-인자 D (25,040 Da) 및/또는 성숙 인자 D (24,405 Da)는 인간 인자 D-특이적 항체로 검출되었으며, 실시예19에서 설명된 바와 같다.
도 42C는 3MC 환자 #2, 3MC 환자 #3, 및 정상 인간 혈청으로부터 얻은 혈장의 Weislab 고전적 경로, 렉틴 경로 및 대체 경로 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 실시예 19에서 설명된 바와 같다.
도 43은 두 명의 정상 인간 개체 (NHS) 및 두 명의 환자 (환자 2 및 환자 3)의 혈청에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 만난-코팅된 토끼 적혈구의 퍼센트 용혈 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 토끼 적혈구의 상층액으로의 헤모글로빈 방출로 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시하며, Ca++의 부재시 측정되고, MASP-3 결핍은 정상 인간 혈청과 비교하여 만난-코팅된 적혈구의 보체-매개된 용해의 퍼센트를 감소시킨다는 것을 입증하며, 실시예 19에서 설명된 바와 같다.
도 44는 인간 3MC 환자 2 (MASP-3-/-)로부터 얻은 혈청 샘플에 추가된 재조합 전장 MASP-3 단백질의 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 도시하며, 음성 대조군 비활성 재조합 MASP-3 (MASP-3A; S679A)와 비교하여, 활성 재조합 MASP-3 단백질은 농도-의존적 방식으로 치모산-코팅된 플레이트에서 AP-구동된 C3b 침착을 재구성하며, 실시예 19에서 설명된 바와 같다.
도 45는 (1) 정상 인간 혈청 (NHS); (2) 3MC 환자 혈청; (3) 3MC 환자 혈청 플러스 활성 전장 재조합 MASP-3 (20 μg/ml); 및 (4) 열-비활성화된 인간 혈청 (HIS)에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 만난-코팅된 토끼 적혈구의 퍼센트 용혈 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 토끼 적혈구의 상층액으로의 헤모글로빈 방출로 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시하며, Ca++의 부재시 측정되고, 토끼 적혈구의 퍼센트 용해는 재조합 MASP-3가 없는 3MC 혈청의 퍼센트 용해와 비교하여 rMASP-3을 함유하는 3MC 혈청에서 크게 증가되었다는 것을 입증하며 (p=0.0006), 실시예 19에서 설명된 바와 같다.
도 46은 0 내지 110 μg/ml의 농도 범위에서 (BBS/Mg++/EGTA에서) 활성 재조합 MASP-3을 함유하는 3MC 환자 2 및 3MC 환자 3의 7% 인간 혈청에서 토끼 적혈구 용해의 퍼센트를 도시하며, 토끼 적혈구 용해의 퍼센트는 농도-의존적 방식으로 재조합 MASP-3의 양으로 증가한다는 것을 입증하고, 실시예 19에서 설명된 바와 같다.
도 47은 정상 인간 개체 (NHS), 두 명의 3MC 환자 (환자 2 및 환자 3), 환자 3의 부모, 및 MBL-결핍 개체의 혈청에 대하여, BBS 버퍼에서 희석된 인간 혈청의 농도의 함수로서 만난-코팅된 ELISA 플레이트에서 LEA-2-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 도시한다.
도　48A는 야생형 (WT) (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스로부터 분리된 RPE-맥락막 복합체에서 베이스라인 VEGF 단백질 수준을 나타내는 결과를 제공하며, 실시예 20에서 설명된 바와 같다.
도　48B는 제3 일에 황반 변성 모델에서 레이져-유발 손상 후 (WT) (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 제3 일에 RPE-맥락막 복합체의 VEGF 단백질 수준을 나타내는 결과를 제공하며, 실시예 20에서 설명된 바와 같다.
도　49는 (WT) (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 레이져 유발-손상 후 제7 일에 평균 맥락막 신혈관 형성 (mean 맥락막 신혈관 형성; CNV)을 나타내는 결과를 제공하며, 실시예 20에서 설명된 바와 같다.
도 50은 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg 마우스 MASP-2 단클론성 항체의 일회 복강 내 주사로 사전-치료된 WT (+/+) 마우스에서 레이져-유발 손상 후 제7 일에 평균 맥락막 신혈관 형성 (CNV) 면적을 그래프로 도시하며, 실시예 21에서 설명된 바와 같다.
도　51A는 관상 동맥 폐색(관상 동맥 occlusion) 및 재관류 모델에서 손상 후 (WT) (+/+)에 대한 경색 크기 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 감소된 경색 크기를 입증하는 결과를 제공하며, 실시예 22에서 셜명된 바와 같다.
도　51B는 관상 동맥 폐색 및 재관류 모델에서 테스트된 개개의 동물의 분포를 나타내는 결과를 제공하며, 실시예 22에서 설명된 바와 같다.
도　52A는 좌전하행(left anterior descending) 관상 동맥 폐색 및 재관류를 경험한 후 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 총 심근 부피의 퍼센트로서 평균 위험 면적 (AAR) 및 경색 부피 (INF)를 그래프로 도시하며, 실시예23에서 설명된 바와 같다.
도 52B는 동맥 폐색 및 재관류를 경험한 후 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 좌심실 심근 부피의 퍼센트로서 평균 위험 면적 (AAR)에 대하여 플롯팅된 경색 부피 사이의 관계를 그래프로 도시하며, 실시예 23에서 설명된 바와 같다.
도　52C는 랑겐도르프(Langendorff) 분리된-관류된 마우스 심장 모델에 따라 제조된 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스의 버퍼-관류된 심장에서 경색 부피 (INF)를 그래프로 도시하는데, 이것에서 전 허혈(global ischemia) 및 재관류는 혈청의 부재시 수행되었으며, 실시예 23에서 설명된 바와 같다.
도　52D는 랑겐도르프 분리된-관류된 마우스 심장 모델에 따라 제조된 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스의 버퍼-관류된 심장에서 경색 부피 (INF) 및 위험 지역 (RZ) 사이의 관계를 그래프로 도시하며, 실시예 23에서 설명된 바와 같다.
도　53A는 면역 복합체-코팅된 플레이트에서 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시하는데, 부호 "*"는 WT (MASP-2 (+/+))의 혈청을 나타내고; 부호 "●"는 WT (C1q 결핍됨)의 혈청을 나타내고; 부호 "□"는 MASP-2 (-/-)의 혈청을 나타내고; 부호 "△"는 MASP-2 (-/-) (C1q 결핍됨)의 혈청을 나타내며, MASP-2 (-/-) 마우스가 기능적인 고전적 경로를 유지한다는 것을 입증하고, 실시예 24에서 설명된 바와 같다.
도　53B는 치모산-코팅된 플레이트에서 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시하는데, 부호 "*"는 WT (MASP-2 (+/+))의 혈청을 나타내고, 부호 "□"는 MASP-2 (-/-)의 혈청을 나타내며, MASP-2 (-/-) 마우스가 기능적인 대체 경로를 유지한다는 것을 입증하고, 실시예 24에서 설명된 바와 같다.
도　54A는 관상 동맥의 좌전하행 가지의 결찰 및 C4 (-/-) 마우스 (n=6) 및 해당 WT 한 배 새끼 대조군 (n=7)에서 재관류 후 심근 허혈/재관류 손상 (MIRI)-유발된 조직 손실을 그래프로 도시하며, 실시예 24에서 설명된 바와 같이 위험 지역 (AAR) 및 경색 크기 (INF)를 나타낸다.
도　54B는 도 42a에서 설명된 바와 같이 치료된 C4 (-/-) 및 WT 마우스에서 위험 지역의 함수로서 경색 크기 (INF)를 그래프로 도시하며, C4 (-/-) 마우스는 WT 대조군 (파선)처럼 MIRI에 민감하다는 것을 입증하고, 실시예 24에서 설명된 바와 같다.
도 55A는 WT 마우스, C4 (-/-) 마우스의 혈청, 만난과 함께 사전-배양된 C4 (-/-) 마우스의 혈청을 사용하여 C3b 침착의 결과를 그래프로 도시하며, 실시예 24에서 설명된 바와 같다.
도　55B는 다양한 농도의 쥐 MASP-2 mAb (mAbM11)와 혼합된 WT, C4 (-/-), 및 MASP-2 (-/-) 마우스의 혈청을 사용하여 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 실시예 24에서 설명된 바와 같다.
도　55C는 WT (C4-충분) 및 C4-결핍 개체의 인간 혈청, 및 만난과 함께 사전-배양된 C4 결핍 개체의 혈청을 사용하여 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 실시예 24에서 설명된 바와 같다.
도　55D는 인간 MASP-2 mAb (mAbH3)와 혼합된 WT (C4-충분) 및 C4-결핍 개체의 인간 혈청을 사용하여 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 실시예 24에서 설명된 바와 같다.
도　56A는 렉틴 활성화 경로-특이적 검정 조건 하에서, 또는 고전적 활성화 경로-특이적 검정 조건 하에서 테스트된 다양한 보체-결핍 마우스 계통의 혈장에서 C3 컨버타제 활성의 비교 분석을 그래프로 도시하며, 실시예 24에서 설명된 바와 같다.
도　56B는 렉틴 활성화 경로-특이적 조건 하에서 테스트된 다양한 보체-결핍 마우스 계통의 혈장에서 C3 컨버타제 활성의 시간-분해 동역학을 그래프로 도시하며, 실시예 24에서 설명된 바와 같다.
도　57A는 위장관에서 일시적 허혈/재관류 손상 (GIRI)의 유발 후 WT 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 조직 손상의 정도를 그래프로 도시하며, MASP-2 (-/-) 마우스는 WT 대조군에 비해 유의한 정도의 보호를 갖는다는 것을 입증하고, 실시예 25에서 설명된 바와 같다.
도　57B는 재조합 쥐 MASP-2 항체 (mAbM11)의 복강 내 일회 투여 볼루스(bolus) 주사 후 시간이 흐름에 따라 마우스 (n=3)로부터 얻은 혈청을 사용하여 수행된 C4b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 렉틴 경로 기능적 활성의 생체 내 절제를 입증하고, 실시예 25에서 설명된 바와 같다.
도　57C는 GIRI 병리의 심각도에 대한 MASP-2 mAb 처리의 효과를 그래프로 도시하며, 위장관에서 일시적 허혈/재관류 손상 (GIRI)을 받기 전 24시간에 쥐 MASP-2 mAb (mAbM11)가 투여된 마우스는 식염수가 투여된 마우스에 비해 크게 감소된 조직 손상을 갖는다는 것을 입증하고 (MASP-2 억제 항체 mAbM11 또는 부적절한 이소타입 대조군 항체가 처리된 동물과 비교할 때 *p<0.05), 실시예 25에서 설명된 바와 같다.
도　57D는 GIRI의 유발 전 12시간에 식염수, 이소토프 대조군, 또는 재조합 쥐 MASP-2 항체 (mAbM11)의 일회 투여 복강 내 주사로 사전-치료된 마우스에서 소장의 GIRI-매개된 병리의 조직학적 표현을 나타내며, 실시예 25에서 설명된 바와 같다.
도　58은 30분 허혈 및 24시간 재관류 후 WT (MASP-2 (+/+)) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 뇌 경색 부피를 그래프로 도시하며, 실시예 26에서 설명된 바와 같다.
도　59A는 30분 허혈 및 24시간 재관류 후 WT (MASP-2 (+/+)) 마우스의 염색된 뇌 단면의 일련의 사진들을 나타낸다. 도 52A의 패널 1-8은 청신경의 출구 (Bregma 0)에 관하여 각각 Bregma 1-8에 해당하는 뇌의 다른 단면을 나타내며, 실시예 26에서 설명된 바와 같다.
도　59B는 30분 허혈 및 24시간 재관류 후 WT (MASP-2 (-/-)) 마우스의 염색된 뇌 단면의 일련의 사진들을 나타낸다. 도 52B의 패널 1-8은 청신경의 출구 (Bregma 0)에 관하여 각각 Bregma 1-8에 해당하는 뇌의 다른 단면을 나타내며, 실시예 26에서 설명된 바와 같다.
도　60은 Col2 mAb-유발된 류머티스성 관절염 후 시간이 흐름에 따라 (WT) (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스의 평균 임상적 관절염 점수를 나타내는 결과를 제공하며, 실시예 27에서 설명된 바와 같다.
도　61은 집먼지 진드기(house dust mite) 또는 치모산의 존재시 WT 마우스에서 얻은 혈청 샘플에서 C3 침착 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 실시예 28에서 설명된 바와 같다.
도　62A 및 62B는 정상 래트 혈청에서 MASP-2 Fab2 항체 (H1)의 투여 후 C4b 침착의 억제 (도 62A) 및 트롬빈 활성화의 억제에 대한 용량 반응 곡선을 제공하며, 실시예 29에서 설명된 바와 같다.
도　63A 및 63B는 파종성 혈관 내 응고의 국소화된 슈바르츠만 반응 모델(Schwartzman reaction model)에서 미처리된 야생형 마우스 및 보체 경로가 고갈제 코브라 독 인자 (CVF) 및 말단 경로 억제자 (C5aR 길항제)에 의해 억제되는 야생형 마우스의 혈소판 응집 (도 63A)과 비교하여 MASP-2 (-/-) 마우스의 측정된 혈소판 응집 (응집 면적으로 표현됨) (도 63B)을 제공하며, 실시예 30에서 설명된 바와 같다.
도　64는 a' 사슬의 존재에 의해 나타난, 트롬빈 기질 FXIa 및 FXa에 의한 인간 C3의 활성화를 나타내는 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시하며, 실시예 31에서 설명된 바와 같다.
도　65는 WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4 (-/-) 및 C4 (-/-) 마우스로부터 얻은 혈청 샘플에서 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시하며, C4, 또는 F11의 완벽한 부재시에도 기능적 렉틴 경로가 있는 한편, 조합된 F11-(-/-)/C4 (-/-)-결핍을 갖는 마우스는 기능적인 렉틴 경로가 결핍된다는 것을 입증하고, 실시예 31에서 설명된 바와 같다.
도 66은 MASP-2 -/- 및 WT 마우스에서 LPS 주사 후 미세혈관 폐색(microvascular occlusion)의 발병 시간을 그래프로 도시하며, 60분 동안 혈전 형성이 측정되는 마우스의 퍼센트를 나타내고, 혈전 형성이 WT 마우스에서 15분 후 검출된다는 것을 입증하며, WT 마우스 중 80%까지는 60분에 혈전 형성을 입증하고; 반대로, MASP-2 -/- 마우스 중 아무 것도 60분 기간 중에 혈전 형성을 나타내지 않았으며 (로그 순위: p=0.0005), 실시예 32에서 설명된 바와 같다.
도 67은 HUS의 STX/LPS-유발 모델에서 시간 (시간)이 흐름에 따르는 식염수-처리된 대조군 마우스 (n=5) 및 MASP-2 항체-처리된 마우스 (n=5)의 퍼센트 생존율을 그래프로 도시하며, 모든 대조군 마우스가 42시간에 죽은 반면에, 반대로, MASP-2 항체-처리된 마우스의 100%는 실험의 시간 과정 동안에 생존하였다는 것을 입증하며, 실시예 33에서 설명된 바와 같다.
도 68은 FITC/덱스트란의 주사 전 16시간 및 1시간에 투여된 이소타입 대조군, 또는 인간 MASP-2 항체 mAbH6 (10mg/kg)의 처리 후 FITC/덱스트란 UV 모델에서 미세혈관 폐색에 걸린 마우스의 퍼센트를, 손상 유발 후 시간의 함수로서, 그래프로 도시하며, 실시예 34에서 설명된 바와 같다.
도 69는 인간 MASP-2 항체 (mAbH6) 및 이소타입 대조군 항체가 처리된 마우스에 대하여 분으로 폐색 시간을 그래프로 도시하며, 데이터는 평균 값 (수평 막대) 및 표준 오차 막대 (수직 막대)로의 분산-도트로서 보고된다. 분석에 사용된 통계적 테스트는 언페어드 t 테스트(unpaired t test)였으며; 부호 "*"는 p=0.0129를 나타내고, 실시예 34에서 설명된 바와 같다.
도 70은 낮은 빛의 세기를 이용하는 혈전증의 FITC-덱스트란/빛 유발된 내피 세포 손상 모델에서 야생형 마우스, MASP-2 KO 마우스, 및 혈전증의 유발 전 16시간, 및 다시 1시간 전에 10mg/kg로 복강 내 투여된 MASP-2 항체 (mAbH6)가 사전-처리된 야생형 마우스에 대하여 분으로 폐색까지의 시간을 그래프로 도시하며, 실시예 34에서 설명된 바와 같다.
서열 목록의 설명
SEQ ID NO:1 인간 MAp19 cDNA
SEQ ID NO:2 인간 MAp19 단백질 (선도 서열 있음)
SEQ ID NO:3 인간 MAp19 단백질 (성숙한)
SEQ ID NO:4 인간 MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5 인간 MASP-2 단백질 (선도 서열 있음)
SEQ ID NO:6 인간 MASP-2 단백질 (성숙한)
SEQ ID NO:7 인간 MASP-3 cDNA
SEQ ID NO:8 인간 MASP-3 단백질 (선도 서열 없음)
SEQ ID NO:9 인간 MASP-1 cDNA
SEQ ID NO:10 인간 MASP-1 단백질 (선도 서열 없음)
SEQ ID NO:11 인간 MAp44 단백질 (선도 서열 없음)
SEQ ID NO:12 래트 MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:13 래트 MASP-2 단백질 (선도 서열 있음)
SEQ ID NO:14 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH)을 암호화하는 DNA (신호 펩티드 없음)
SEQ ID NO:15 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드
SEQ ID NO:16 17N16mc 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드
SEQ ID NO:17 17D20_dc21N11VL (OMS644) 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드
SEQ ID NO:18 17N16_dc17N9 (OMS641) 경쇄 가변 영역 (VL)을 암호화하는 DNA (신호 펩티드 없음)
SEQ ID NO:19 17N16_dc17N9 (OMS641) 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드
SEQ ID NO:20: scFv 딸 클론 17N16m_d17N9 전장 폴리펩티드
SEQ ID NO:21: scFv 딸 클론 17D20m_d3521N11 전장 폴리펩티드
SEQ ID NO:22 전장 폴리펩티드를 암호화하는 scFv 딸 클론 17N16m_d17N9 DNA (신호 펩티드 없음)
SEQ ID NO:23 전장 폴리펩티드를 암호화하는 scFv 딸 클론 17D20m_d3521N11 DNA (신호 펩티드 없음)
SEQ ID NO:24: 모체 DTLacO 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드
SEQ ID NO:25: MASP-3 특이적 클론 M3J5 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드
SEQ ID NO:26: MASP-3 특이적 클론 M3M1 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드
SEQ ID NO:27: 모체 DTLacO 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드
SEQ ID NO:28: MASP-3 특이적 클론 M3J5 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드
SEQ ID NO:29: MASP-3 특이적 클론 M3M1 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드
SEQ ID NO:30: MASP-3 클론 D14 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드
SEQ ID NO:31: MASP-3 클론 D14 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드
SEQ ID NO:32: MASP-1 클론 1E10 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드
SEQ ID NO:33: MASP-1 클론 1E10 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드
SEQ ID NO:34 SGMI-1 펩티드
SEQ ID NO:35 SGMI-2 펩티드
SEQ ID NO:36 인간 IgG1-Fc 폴리펩티드;
SEQ ID NO:37 펩티드 결합자 #1 (12aa);
SEQ ID NO:38: 펩티드 결합자 #2 (10aa);
SEQ ID NO:39: 인간 IL-2-신호 서열, SGMI-1, 결합자 #1, 및 인간 IgG1-Fc를 포함하는 폴리펩티드 융합체를 암호화하는 핵산;
SEQ ID NO:40: SGMI-1, 결합자 #1 및 인간 IgG1-Fc (SGMI-1Fc)를 포함하는 성숙한 폴리펩티드 융합체;
SEQ ID NO:41: 인간 IL-2-신호 서열, SGMI-2, 결합자 #1 및 인간 IgG1-Fc를 포함하는 성숙한 폴리펩티드 융합체를 암호화하는 핵산;
SEQ ID NO:42: SGMI-2, 결합자 #1 및 인간 IgG1-Fc (SGMI-2Fc)를 포함하는 성숙한 폴리펩티드 융합체.
상세한 설명
I. 정의
본원에서 특별히 정의되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 용어는 본 발명의 당업자들에 의해 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 용어는 본 발명을 설명하기 위해 명세서 및 청구범위에서 사용되었기 때문에 다음 정의는 용어에 관한 명확성을 제공하기 위해 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 렉틴 경로 효과기 팔 1 ("LEA-1")은 MASP-3에 의한 인자 B 및 인자 D의 렉틴-의존적 활성화를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 렉틴 경로 효과기 팔 2 ("LEA-2")는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-3-의존적 보체 활성화"는 두 개의 구성요소를 포함한다: (i) LEA-1-매개된 보체 활성화에 포함되고, Ca++의 존재시 발생하며, 보통 C3bB의 C3bBb로의 전환 및 프로-인자 D의 인자 D로의 전환으로 이어지는 인자 B 및 인자 D의 렉틴 MASP-3-의존적 활성화; 및 (ii) Ca++의 부재시 발생할 수 있고, 보통 C3bB의 C3bBb로의 전환 및 프로-인자 D의 인자 D로의 전환으로 이어지는, 인자 B 및 인자 D의 렉틴-독립적 전환. LEA-1-매개된 보체 활성화 및 인자 B 및 인자 D의 렉틴-독립적 전환은 옵소닌화 및/또는 용해를 유발하는 것으로 결정되었다. 어떤 특정 이론에도 결부되지 않지만, 다수의 C3b 분자가 근접하여 연관되거나 결합할 때만, C3bBb C3 컨버타제는 그것의 기질 특이성을 변화시키고 C5를 C3bBb(C3b)n으로 불리는 대체 경로 C5 컨버타제로 분할하는 것으로 생각된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 LEA-2-매개된 보체 활성화로도 불리는 용어 "MASP-2-의존적 보체 활성화"는 MASP-2 렉틴-의존적 활성화를 포함하며, 이것은 Ca++의 존재시 발생하고, 렉틴 경로 C3 컨버타제 C4b2a 및 이후에 C3 분할 생성물 C3b의 누적시 C5 컨버타제 C4b2a(C3b)n의 형성으로 이어지며, 이것은 옵소닌화 및/또는 용해를 유발하는 것으로 결정되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, "전통적 대체 경로"로도 불리는 용어 "대체 경로의 전통적 이해"는 본원에서 설명된 본 발견, 즉, 예를 들어, 균류 및 효모 세포벽의 치모산, 그람 음성 외막, 및 토끼 적혈구, 뿐만 아니라 많은 순수한 다당류, 바이러스, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충 및 손상된 세포의 지질 다당류에 의해 촉발되고, 전통적으로 보체 인자 C3으로부터 C3b의 자발적 단백질 가수분해 생성에서 발생하는 것으로 생각되는 보체 활성화 이전의 대체 경로를 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 "대체 경로"로도 불리는 "전통적 대체 경로"의 활성화는 Mg++/EGTA 버퍼에서 측정된다 (즉, Ca++의 부재시).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "렉틴 경로"는 혈청 및 만난-결합 렉틴 (MBL), CL-11 및 피콜린 (H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)을 포함하는 비-혈청 탄수화물-결합 단백질의 특이적 결합을 통해 발생하는 보체 활성화를 나타낸다. 본원에서 설명된 바와 같이, 발명자들은 렉틴 경로가 두 개의 효과기 팔, 현재 MASP-3-의존적인 것으로 알려져 있는 렉틴 경로 효과기 팔 1 (LEA-1), 및 MASP-2-의존적인 렉틴 경로 효과기 팔 2 (LEA-2)에 의해 구동된다는 것을 발견하였다. 본원에서 사용된 바와 같이, 렉틴 경로의 활성화는 Ca++ 함유 버퍼를 사용하여 평가된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "고전적 경로"는 외부 입자에 결합된 항체에 의해 촉발되고 인식 분자 C1q의 결합을 필요로 하는 보체 활성화를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "HTRA-1"은 세린 펩티다제 고온 요건 세린 프로테아제 A1을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-3 억제제"는 MASP-3-의존적 보체 활성화를 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 어떤 약제를 나타내며, MASP-3 항체 및 이것의 MASP-3 결합 단편, 천연 및 합성 펩티드, 경쟁적 기질, 작은 분자, 발현 억제자 및 분리된 천연 억제자를 포함하는, MASP-3에 결합하거나 또는 이와 직접적으로 상호작용하는 약제를 포함하고, 렉틴 경로에서 또 다른 인식 분자 (예를 들어, MBL, CL-11, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)에 결합을 위해 MASP-3와 경쟁하는 펩티드를 포함하는 약제를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제는 MASP-3에 특이적이고 MASP-1 또는 MASP-2에 결합하지 않는다. MASP-3을 직접적으로 억제하는 억제제는 직접적 MASP-3 억제제 (예를 들어, MASP-3 항체)로 불릴 수 있는 한편, MASP-3을 간접적으로 억제하는 억제제는 간접적 MASP-3 억제제 (예를 들어, MASP-3 활성화를 억제하는 MASP-1 항체)로 불릴 수 있다. 직접적 MASP-3 억제제의 예는 보체 시스템의 다른 구성요소보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 MASP-3 (SEQ ID NO:8)의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-3 억제제와 같은 MASP-3 특이적 억제제이다. 한 구체예에서, 예를 들어, MASP-3 활성화의 억제자와 같은, MASP-3 억제제는 MASP-3 활성을 간접적으로 억제하며, MASP-1-매개된 MASP-3 활성화의 억제자를 포함한다 (예를 들어, MASP-1 항체 또는 이것의 MASP-1 결합 단편, 천연 및 합성 펩티드, 작은 분자, 발현 억제자 및 분리된 천연 억제자이고, 또한 MASP-3에 결합을 위해 MASP-1과 경쟁하는 펩티드를 포함한다). 또 다른 구체예에서, MASP-3 억제제는 인자 D의 MASP-3-매개된 성숙화를 억제한다. 또 다른 구체예에서, MASP-3 억제제는 인자 B의 MASP-3-매개된 활성화를 억제한다. 본 발명의 방법에 유용한 MASP-3 억제제는 MASP-3-의존적 보체 활성화를 10% 이상, 예를 들어, 20% 이상, 50% 이상, 또는 90% 이상 만큼 감소시킬 수도 있다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제는 MASP-3-의존적 보체 활성화를 90% 이상 만큼 감소시킨다 (즉, 단 10% 이하의 MASP-3 보체 활성화를 일으킴). MASP-3 억제는 LEA-1-관련 용해 및 옵소닌화 및 인자 B 및 인자 D-관련 용해 및 옵소닌화의 렉틴-독립적 전환 둘 다를, 전부 또는 부분적으로, 차단할 것으로 예상된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-1 억제제"는 MASP-1에 결합하거나 또는 이와 직접적으로 상호작용하고 (i) MASP-3-의존적 보체 활성화 및/또는 (ii) MASP-2-의존적 보체 활성화 및/또는 (iii) 인자 D의 렉틴-독립적 또는 렉틴-의존적 MASP-1-매개된 성숙화 중 적어도 하나를 억제하는 어떤 약제도 나타내며, 인자 D의 렉틴-의존적 MASP-1 성숙화는 MASP-1 항체 및 이것의 MASP-1 결합 단편, 천연 및 합성 펩티드, 작은 분자, 발현 억제자 및 분리된 천연 억제자를 포함하는, 인자 D의 직접적 활성화를 수반하거나, 렉틴 경로에서 또 다른 인식 분자 (예를 들어, MBL, CL-11, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)에 결합을 위해 MASP-1과 경쟁하는 펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 MASP-1 억제제는 MASP-3-의존적 보체 활성화를 10% 이상, 예를 들어, 20% 이상, 50% 이상, 또는 90% 이상 만큼 감소시킨다. 한 구체예에서, MASP-1 억제제는 MASP-3-의존적 보체 활성화를 90% 이상 만큼 감소시킨다 (즉, 단 10% 이하의 MASP-3 보체 활성화를 일으킴). 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 MASP-1 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 10% 이상, 예를 들어, 20% 이상, 50% 이상, 또는 90% 이상 만큼 감소시킨다. 한 구체예에서, MASP-1 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 90% 이상 만큼 감소시킨다 (즉, 단 10% 이하의 MASP-2 보체 활성화를 일으킴)
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 MASP-1 억제제는 MASP-3-의존적 보체 활성화 (LEA-1), 인자 B 및 인자 D의 렉틴-독립적 전환, 및 MASP-2-의존적 보체 활성화 (LEA-2) 둘 다를 10% 이상, 예를 들어, 20% 이상, 50% 이상, 또는 90% 이상 만큼 감소시킨다. 한 구체예에서, MASP-1 억제제는 MASP-3-의존적 보체 활성화 (LEA-1), 인자 B 및 인자 D의 렉틴-독립적 전환, 및 MASP-2-의존적 보체 활성화 (LEA-2)를 90%만큼 감소시킨다 (즉, 단 10% 이하의 MASP-3 보체 활성화 및 단 10% 이하의 MASP-2 보체 활성화를 일으킴).
직접적 MASP-1 억제제의 예는 보체 시스템의 다른 구성요소보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 MASP-1의 일부 (SEQ ID NO:10)에 특이적으로 결합하는 MASP-1 억제제와 같은, MASP-1-특이적 억제제이다. 많은 예에서, MASP-1이 MASP-3을 활성화할 수 있고, MASP-1이 MASP-2를 활성화할 수 있으면, MASP-1의 억제는 MASP-3 및/또는 MASP-2를 억제하는데 있어서 효과적인 것으로 예상될 것이다. 하지만, 일부 예에서, MASP-1 또는 MASP-3 또는 MASP-2의 억제는 다른 MASP 표적의 억제에 관하여 바람직한 구체예일 수도 있다. 예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스 (스타필로코쿠스 아우레우스) 감염의 설정에서, MASP-3는 MASP-1의 부재시 활성화되는 것으로 나타났고 스타필로코쿠스 아우레우스 옵소닌화의 원인이 된다 (Iwaki D. et al., J Immunol 187(7):3751-8 (2011)을 참고하면 된다). 그러므로, 발작성 야간혈색뇨증 (PNH)의 치료에 있어서, 예를 들어, MASP-3 대신에 MASP-1을 직접적으로 억제하고, 이로 인해 PNH의 LEA-1-억제 치료 동안에 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 잠재적 민감성을 감소시키는 것이 유리할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-2 억제제"는 MASP-2에 결합하거나 또는 이와 직접적으로 상호작용하는 어떤 약제도 나타내고 (i) MASP-2-의존적 보체 활성화 및/또는 (ii) MASP-1-의존적 보체 활성화 중 적어도 하나를 억제하며, MASP-2 항체 및 이것의 MASP-2 결합 단편, 천연 및 합성 펩티드, 작은 분자, 발현 억제자 및 분리된 천연 억제자를 포함하고, 또한 렉틴 경로의 또 다른 인식 분자 (예를 들어, MBL, CL-11, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)에 결합을 위해 MASP-2와 경쟁하는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 10% 이상, 예를 들어, 20% 이상, 50% 이상, 또는 90% 이상 만큼 감소시킬 수도 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 90% 이상 만큼 감소시킨다 (즉, 단 10% 이하의 MASP-2 보체 활성화를 일으킴). 직접적 MASP-2 억제제의 예는 보체 시스템의 다른 구성요소보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 MASP-2의 일부 (SEQ ID NO:5)에 특이적으로 결합하는 MASP-2 억제제와 같은, MASP-2-특이적 억제제이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는, 예를 들어, MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 폴리펩티드 또는 이것의 일부와 같은 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 항체 및 이것의 항체 단편을 포함하며, 어떤 항체-생산 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 및 인간을 포함하는 영장류), 또는 히브리도마(hybridoma), 파지 선택, 재조합 발현 또는 유전자 이식 동물 (또는 항체 또는 항체 단편을 생산하는 다른 방법)로부터 유래된다. 용어 "항체"는 항체의 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식 (예를 들어, 히브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 유전자 이식 동물, 펩티드 합성, 등)에 관하여 제한하려는 것은 아니다. 예시적 항체는 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체; 전체-특이적, 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체); 인간화된 항체; 쥐 항체; 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단클론성 항체; 및 항-이디오타입(idiotype) 항체를 포함하고, 어떤 온전한 항체 또는 이것의 단편일 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 다클론성 또는 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이것의 단편 (예를 들어, dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이것의 합성 변이체, 자연 발생 변이체, 필수적 특이성의 항원-결합 단편을 갖는 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체, 및 필수적 특이성의 항원-결합 부위 또는 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 어떤 다른 변형된 배열도 포함한다.
"단클론성 항체"는 동질 항체 집단을 나타내며 단클론성 항체는 에피토프의 선택적 결합에 수반되는 아미노산 (자연 발생 및 비-자연 발생)으로 구성된다. 단클론성 항체는 표적 항원에 매우 특이적이다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체 및 전장 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이것의 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이것의 변이체, 항원-결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 필수적 특이성 및 에피토프에 결합하는 능력의 항원-결합 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린의 어떤 다른 변형된 배열도 포함한다. 항체의 공급원 또는 그것이 만들어진 방식 (예를 들어, 히브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 유전자 이식 동물, 등)에 관하여 제한하려는 것은 아니다. 용어는 "항체"의 정의 하에 상기 설명된 전체 면역글로불린, 뿐만 아니라 단편 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은, 예를 들어, MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 항체와 같은 전치 길이 항체로부터 유래되거나 또는 이와 관련된 부분을 나타내며, 일반적으로는 항원 결합 또는 이것의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 실례적 예는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이 도메인들은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 결합자를 더 포함하며, 이것은 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있게 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "키메라 항체"는 비-인간 종 (예를 들어, 설치류) 항체로부터 유래된 가변 도메인 및 상보성-결정 영역(complementarity-determining region)을 함유하는 재조합 단백질인 한편, 항체 분자의 나머지는 인간 항체로부터 유래된다
본원에서 사용된 바와 같이, "인간화된 항체"는 인간 항체 프레임워크로 이식된 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 특이적 상보성-결정 영역에 맞는 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 인간화된 항체는 전형적으로 항체 상보성-결정 영역만이 비-인간 기원인 재조합 단백질 (파지 디스플레이(phage display) 또는 효모로부터 발생한 항체 등)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "만난-결합 렉틴" ("MBL")은 만난-결합 단백질 ("MBP")과 동등하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "막 공격 복합체" ("MAC")는 막에 삽입되어 이를 붕괴시키는 다섯 개의 말단 보체 성분 (C6, C7, C8 및 C9와 결합된 C5b)의 복합체를 나타낸다 (C5b-9로도 불림).
본원에서 사용된 바와 같이, "개체"는 모든 포유동물을 포함하며, 제한 없이 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 양, 염소, 소, 토끼, 돼지 및 설치류를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기는 다음과 같이 줄여쓴다: 알라닌 (Ala;A), 아스파라긴 (Asn;N), 아스파르트산 (Asp;D), 아르기닌 (Arg;R), 시스테인 (Cys;C), 글루탐산 (Glu;E), 글루타민 (Gln;Q), 글리신 (Gly;G), 히스티딘 (His;H), 이소류신 (Ile;I), 류신 (Leu;L), 리신 (Lys;K), 메티오닌 (Met;M), 페닐알라닌 (Phe;F), 프롤린 (Pro;P), 세린 (Ser;S), 트레오닌 (Thr;T), 트립토판 (Trp;W), 티로신 (Tyr;Y), 및 발린 (Val;V).
넓은 의미에서, 자연 발생 아미노산은 각각의 아미노산의 측쇄의 화학적 특성에 기초한 군으로 나누어질 수 있다. "소수성" 아미노산은 He, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys 또는 Pro을 의미한다. "친수성" 아미노산은 Gly, Asn, Gin, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His을 의미한다. 아미노산의 이 군은 다음과 같이 더 하위분류될 수 있다. "비전하 친수성" 아미노산은 Ser, Thr, Asn 또는 Gln을 의미한다. "산성" 아미노산은 Glu 또는 Asp를 의미한다. "염기성" 아미노산은 Lys, Arg 또는 His를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "보존적 아미노산 치환"은 다음 군 중 각각의 내부의 아미노산 사이의 치환에 의해 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파르트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 사용된 바와 같이 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머 또는 이것들의 모방체를 나타낸다. 이 용어는 또한 자연-발생 뉴클레오티드, 당 및 공유 결합에 의한 뉴클레오시드 간 (백본) 결합으로 구성된 상기 올리고뉴클레오베이스(oligonucleobase)뿐만 아니라 비-자연-발생 변형을 갖는 올리고뉴클레오티드를 커버한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "에피토프"는 항체에 의해 결합된 단백질 (예를 들어, 인간 MASP-3 단백질) 상의 부위를 나타낸다. "중첩 에피토프"는 적어도 하나의 (예를 들어, 둘, 셋, 넷, 다섯, 또는 여섯 개) 공통 아미노산 잔기(들)을 포함하며, 선형 및 비선형 에피토프를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 교체 가능하게 사용되며, 길이 또는 번역 후 변형에 상관없이, 아미노산의 어떤 펩티드-결합된 사슬도 의미한다. 본원에서 설명된 MASP 단백질 (MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3)은 야생형 단백질을 함유하거나 야생형 단백질일 수도 있거나 또는 50개 이하 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개 이하)의 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체일 수 있다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 기 내의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소류신, 및 류신; 아스파르트 산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신.
본원에서 설명된 인간 MASP-1 단백질 (SEQ ID NO:10으로 제시됨), 인간 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO:5로 제시됨) 및 인간 MASP-3 단백질 (SEQ ID NO:8로 제시됨)은 또한 단백질의 "펩티드 단편"을 포함하며, 이것은 MASP 단백질의 펩티드 단편을 포함하는, 전장 및/또는 미성숙한 (프리-프로(pre-pro)) MASP 단백질보다 더 짧고, 단백질의 말단뿐만 아니라 내부 결실 변이체를 포함한다. 결실 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 세그먼트 (둘 이상의 아미노산 중) 또는 비인접 단일 아미노산이 결핍될 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 MASP-1 단백질은 SEQ ID NO:10에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 MASP-1 단백질과 70% 이상 (예를 들어, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 인간 MASP-3 단백질은 SEQ ID NO:8에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 MASP-3 단백질과 70% 이상 (예를 들어, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 인간 MASP-2 단백질은 SEQ ID NO:5에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 MASP-2 단백질과 70% 이상 (예를 들어, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 펩티드 단편은 길이가 적어도 6개의 (예를 들어, 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 600개 이상) 아미노산 잔기 (예를 들어, SEQ ID NOS: 5, 8 또는 10 중 어느 하나에서 적어도 6개의 인접한 아미노산 잔기)일 수도 있다. 일부 구체예에서, 인간 MASP 단백질의 항원성 펩티드 단편은 길이가 500개 이하의 (예를 들어, 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 또는 6개) 아미노산 잔기 (예를 들어, SEQ ID NOS: 5, 8 또는 10 중 어느 하나에서 500개 이하의 인접한 아미노산 잔기)이다.
일부 구체예에서, MASP-1, MASP-2 및/또는 MASP-3에 결합하는 항체 생성의 맥락에서, 펩티드 단편은 항원성이고 포유동물의 항원 반응을 도입하는 전장 단백질의 능력 중 적어도 10% (예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 이상)를 유지한다 (하기 "Methods for Producing an Antibody" 참조).
퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성은, 필요하면, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 참조 서열의 아미노산과 동일한 후보 서열의 아미노산의 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 서열 동일성을 결정할 목적을 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 어떤 알고리즘도 포함하는, 정렬을 측정하는 적절한 파라미터는 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
대표적인 구체예에서, 인간 MASP-1 단백질 (SEQ ID NO:10)은 SEQ ID NO:9로 제시된 cDNA 서열에 의해 암호화되고; 인간 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO:5)은 SEQ ID NO:4로 제시된 cDNA 서열에 의해 암호화되고; 인간 MASP-3 단백질 (SEQ ID NO:8)은 SEQ ID NO:7로 제시된 cDNA 서열에 의해 암호화된다. 당업자는 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:4 및 SEQ ID N0:7에서 개시된 cDNA 서열이 각각 인간 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3의 단일 대립유전자를 나타내고, 대립유전자 변화 및 대체 스플라이싱(splicing)이 일어날 것으로 예상된다는 것을 인식할 것이다. 침묵 돌연변이를 함유하는 것들 및 돌연변이가 아미노산 변화를 일으키는 것들을 포함하는, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:7에서 나타난 뉴클레오티드 서열의 대립유전자 변이체는 본 발명의 범위 내에 있다. MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 서열의 대립유전자 변이체는 표준 과정에 따라 다른 개인의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 탐침함으로써 클로닝될 수 있거나, 또는 이러한 돌연변이를 함유하는 데이터베이스의 상동성 비교 검색 (예를 들어, BLAST 검색)에 의해 확인될 수도 있다.
II. 렉틴 경로: 새로운 이해
i. 개요: 렉틴 경로는 재정립되었다
본원에서 설명된 바와 같이, 발명자들은 보체의 렉틴 경로가 보체를 활성화하기 위해 두 개의 효과기 팔을 갖고 있으며, 둘 다 탄수화물 인식 구성요소 (MBL, CL-11 및 피콜린)에서 형성된 렉틴 경로 활성화 복합체에 의해 구동된다는 놀라운 발견을 하였다: i) 본원에서 "렉틴 경로 효과기 팔 1" 또는 "LEA-1"로 불리는, 렉틴 경로-관련 세린 프로테아제 MASP-1 및 MASP-3에 의해 형성된 효과기 팔; 및 (ii) 본원에서 "렉틴 경로 효과기 팔 2", 또는 "LEA-2"로 불리는, MASP-2 구동된 활성화 효과기 팔. LEA-1 및 LEA-2는 용해 및/또는 옵소닌화에 영향을 미칠 수도 있다.
또한 MASP-3에 의한 인자 B의 렉틴-독립적 전환 및 HTRA-1, MASP-1 및 MASP-3에 의한 인자 D의 렉틴-독립적 전환은, 둘 다 Ca++의 부재시 발생할 수 있으며, 보통 C3bB의 C3bBb로의 전환 및 프로-인자 D의 인자 D로의 전환으로 이어지는 것으로 결정되었다. 그러므로, MASP-3의 억제는 LEA-1 및 인자 B 및/또는 인자 D의 렉틴-독립적 활성화 둘 다를 억제할 수 있으며, 이것은 용해 및/또는 옵소닌화의 억제를 일으킬 수 있다.
도 1은 보체 활성화의 경로의 새로운 이해를 도시한다. 도 1에서 나타난 바와 같이, LEA-1은 렉틴-결합된 MASP-3에 의해 구동되며, 이것은 인자 D의 치모겐을 그것의 활성 형태로 활성화할 수 있고 C3b- 또는 C3b(H20)-결합된 인자 B를 분할할 수 있으며, C3bB 치모겐 복합체의 그것의 효소에 의한 활성 형태인 C3bBb로의 전환으로 이어진다. MASP-3에 의해 생성된, 활성화된 인자 D는 또한 C3bB 또는 C3b(H20) 치모겐 복합체를 그것들의 효소에 의한 활성 형태로 전환시킬 수 있다. MASP-1은 신속한 자기 활성화가 가능한 반면에, MASP-3은 아니다. 많은 경우에, MASP-1은 MASP-3의 활성자이다.
많은 예에서 렉틴 (즉, MBL, CL-11 또는 피콜린)이 세포 표면에 활성을 지시할 수 있는 한편, 도 1은 또한 인자 B 활성화 및/또는 인자 D 성숙화에서 MASP-3, MASP-1, 및 HTRA-1의 렉틴-독립적 기능의 개요를 말한다. LEA-1에서 MASP-3의 렉틴-관련 형태 중에서, MASP-3의 렉틴-독립적 형태는 C3bB 또는 C3b(H20)의 C3bBb로의 전환 (또한 도 36 및 37 참조) 및 프로-인자 D의 인자 D로의 전환 (도 39 참조)을 매개할 수 있다. MASP-1 (또한 도 39 참조) 및 비-MASP-관련된 단백질 HTRA-1은 또한 렉틴 구성요소가 필요없는 방식으로 인자 D를 활성화시킬 수 있다 (2011년 5월 4일에 The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2011 컨퍼런스에서 발표된, Stanton et al., Evidence That the HTRA1 Inter actome Influences Susceptibility to Age-related Macular Degeneration).
따라서, MASP-1 (LEA-1 및 렉틴-독립적 형태를 통해), MASP-3 (LEA-1 및 렉틴-독립적 형태를 통해), 및 HTRA-1 (렉틴-독립적으로만)은 MASP-3-인자 D-인자 B 축을 따라 하나 이상의 지점에서 직접적 또는 간접적 활성화를 지시할 수 있다. 그렇게 해서, 그것들은 C3bBb, 대체 경로의 C3 컨버타제를 생성하고, 그것들은 미생물의 표면에서 C3b의 생산 및 침착을 자극한다. C3b 침착은 옵소닌화, 대식세포(macrophage)와 같은 숙주 식균성 세포에 의한 파괴를 위한 미생물의 표면에 표지에 있어서 중요한 역할을 한다. 본원에서 예로서 (도 35), MASP-3은 스타필로코쿠스 아우레우스의 옵소닌화에 중요하다. C3b 침착은 MASP-3-의존적 방식으로 인간 혈청에 노출된 스타필로코쿠스 아우레우스에서 신속하게 발생한다 (도 35).
하지만, LEA-1 및 MASP-3, MASP-1, 또는 HTRA-1의 렉틴-독립적 기능의 기여는 옵소닌화에 제한되지 않는다. 도 1에서 도식화된 바와 같이, 이 세 개의 구성요소들은 또한 인자 B의 간접적 또는 직접적 활성화에 의한 세포 용해, 및 C3b의 생산을 유발할 수 있다. 복합체의 이 성분들은 대체 경로 C5 컨버타제를 생성하는 복합체, C3bBb(C3b)n을 형성한다. 본원에서 더 설명된 바와 같이, 네이세리아 메닝기티디스의 용해에서, MASP-2는 아니지만 (및, 그러므로, 이 예에서 LEA-2도 아님), MASP-3 및 MBL에 대한 요건은 용해에서 LEA-1의 역할을 입증한다 (도 13, 14 및 15 참조). 요약하면, 스타필로코쿠스 아우레우스 연구로부터 얻은 옵소닌화 결과 및 네이세리아 메닝기티디스 연구에서 관찰된 용해 결과는 두 과정에서 LEA-1의 역할을 지지한다 (도 1에서 도식화된 바와 같음). 게다가, 이 연구들은 옵소닌화 및 용해가 C3bB 또는 C3b(H20)의 전환 및/또는 프로-인자 D의 인자 D로의 전환을 일으킬 수 있다는 것을 입증하고; 그러므로, 두 과정은 MASP-3, MASP-1, 또는 HTRA-1의 렉틴-독립적 역할의 결과일 수도 있다. 따라서, 도 1에서 발명자들에 의해 개발된 모델은 옵소닌화 및/또는 용해를 차단하기 위해 및 이 과정들의 조절 장애에 의해 유발된 병리를 치료하기 위해, 주로 MASP-3, 뿐만 아니라 MASP-1 및/또는 HTRA-1의 억제자의 사용을 지지한다.
1. 렉틴 경로 효과기 팔 (LEA-1)
렉틴 경로의 제1 효과기 팔, LEA-1은 렉틴 경로-관련 세린 프로테아제 MASP-1 및 MASP-3에 의해 형성된다. 본원에서 설명된 바와 같이, 발명자들은 지금 MASP-3의 부재시 및 MASP-1의 존재시, 대체 경로는 표면 구조에서 효율적으로 활성화되지 않는다는 것을 보여주었다. 이 결과들은 MASP-3이 대체 경로를 시작하는데 있어서 이전에 개시되지 않은 역할을 한다는 것을 입증하고, 이것은 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인를 제대로 기능하지 않게 하는 돌연변이를 가진 희귀한 3MC 상염색체 열성 질환(autosomal recessive disorder)에 걸린 환자들로부터 얻은 MASP-3-결핍 3MC 혈청을 사용하여 확인되었다 (Rooryck C, et al., Nat Genet. 43(3): 197-203 (2011)). 이 새로운 결과에 기초하여, 대체 경로를 수반하는 보체 활성화는, 통상적으로 정의된 바와 같이, MASP-3-의존적인 것으로 예상된다. 사실은, MASP-3, 및 그것의 LEA-1의 활성화는 대체 경로의 지금까지의 애매한 개시자를 나타낼 수도 있다.
본원에서 실시예 1 내지 4에서 더 설명된 바와 같이, MASP-2-결핍 혈청에서, 발명자는 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 더 높은 살균 활성 (즉, 용해성 활성)을 일으키는 렉틴-의존적 대체 경로 활성화의 더 높은 활성을 관찰하였다. 어떤 특정 이론에도 결부되지 않지만, MASP-2의 부재시, MASP-1-함유 탄수화물 인식 복합체는 MASP-3을 활성화시키기 위해 MASP-3-함유 탄수화물 인식 복합체 가까이에 결합할 가능성이 더 크다고 생각된다. 많은 예에서, MASP-3의 활성화는, MASP-3이 자가-활성화 효소가 아니고 때때로 그것의 치모겐 형태로부터 그것의 효소에 의한 활성 형태로 전환되는 MASP-1의 활성을 필요로 하기 때문에, MASP-1 활성에 의존적인 것으로 알려져 있다. MASP-1 (MASP-2와 유사함)은 자가-활성화 효소인 한편, MASP-3은 자가-활성화하지 않고, 많은 예에서, 그것의 효소에 의한 활성 형태로 전환되는 MASP-1의 효소적 활성이 필요하다. Zundel S, et al, J Immunol., 172(7):4342-50 (2004)를 참고하면 된다. MASP-2의 부재시, 모든 렉틴 경로 인식 복합체는 MASP-1 또는 MASP-3로 로딩된다. 그러므로, MASP-2의 부재는 MASP-3의 그것의 효소에 의한 활성 형태로의 MASP-1-매개된 전환을 용이하게 한다. MASP-3이 활성화되면, 활성화된 MASP-3은 지금 C3bB의 C3bBb로의 MASP-3-매개된 전환 및/또는 프로-인자 D의 인자 D로의 전환을 통해, "LEA-1" 활성화로 불리는, 대체 경로 활성화를 시작한다. 대체 경로 C3 컨버타제로도 불리는 C3bBb는 옵소닌 C3b 분자의 침착을 수득하는 추가적인 C3 분자를 분할한다. 여러 C3b 단편이 C3bBb 컨버타제 복합체 가까이에 결합하면, 이것은 대체 경로 C5 컨버타제 C3bBb(C3b)n의 형성을 일으키며, 이것은 MAC의 형성을 촉진한다. 추가적으로, 표면에 침착된 C3b 분자는 인자 B 결합을 위한 새로운 부위를 형성하며, 이것은 지금 인자 D 및/또는 MASP-3에 의해 분할되어 대체 경로 C3 및 C5 컨버타제 복합체가 형성될 수 있는 추가적인 부위를 형성할 수 있다. 이 후자의 과정은 효과적인 용해에 필요하고 초기 C3b 침착이 발생하면 렉틴을 필요로 하지 않는다. 최근의 간행물 (Iwaki D. et al, J Immunol 187(7):3751-8 (2011))뿐만 아니라 발명자들로부터 생성된 데이터 (도 37)는 대체 경로 C3 컨버타제 치모겐 복합체 C3bB가 활성화된 MASP-3에 의해 그것의 효소에 의한 활성 형태로 전환된다는 것을 입증한다. 발명자들은 지금 인자 B의 MASP-3-매개된 분할이 최근에 설명된 LEA-1의 하위 구성요소를 나타내며, 이것은 대체 경로 C3 컨버타제 C3bBb의 렉틴-의존적 형성을 촉진한다는 것을 발견하였다.
2. 렉틴 경로 효과기 팔 (LEA-2)
렉틴 경로의 제2 효과기 팔, LEA-2는 렉틴 경로-관련 세린 프로테아제 MASP-2에 의해 형성된다. MASP-2는 인식 구성요소의 결합시 그것들의 각각의 패턴에 따라 활성화되었고, 또한 MASP-1에 의해 활성화될 수도 있고, 이후에 보체 성분 C4를 C4a 및 C4b로 분할한다. 분할 생성물 C4b의 혈장 C2로의 결합 후, C4b-결합된 C2는 C4b-결합된 C2를 효소에 의한 활성 복합체 C4bC2a 및 작은 C2b 분할 단편으로 전환하는 제2 MASP-2-매개된 분할 단계의 기질이 된다. C4b2a는 렉틴 경로의 C3-전환 C3 컨버타제이며, 풍부한 혈장 구성요소 C3를 C3a 및 C3b로 전환한다. C3b는 티오에스테르 결합을 통해 어떤 표면에도 가까이에 결합한다. 여러 C3b 단편이 C3 컨버타제 복합체 C4b2a 가까이에 결합하면, 이것은 대체 경로 C5 컨버타제 C3bBb(C3b)n의 형성을 일으키며, 이 컨버타제는 C5를 C5b 및 C5a로 전환하는 그것의 특이성을 변화시키며, C5 컨버타제 복합체 C4b2a(C3b)n을 형성한다. 이 C5 컨버타제가 MAC의 형성을 시작할 수 있는 한편, 이 과정은 저절로 용해를 촉진하는데 충분히 효과적이지 않은 것으로 생각된다. 오히려, LEA-2에 의해 생산된 초기 C3b 옵소닌은 새로운 대체 경로 C3 컨버타제 및 C5 컨버타제 부위의 형성을 위해 핵을 형성하며, 궁극적으로 풍부한 MAC 형성 및 용해로 이어진다. 이 후자의 사건은 LEA-2-형성된 C3b와 결합된 인자 B의 인자 D 활성화에 의해 매개되며, 이로 인해 인자 D의 성숙화에 있어서 MASP-1에 대하여 중요한 역할 덕분에 LEA-1에 의존적이다. 또한 C4의 부재시 C3을 활성화하기 위한 MASP-2-의존적 C4-바이패스(bypass) 활성화 루트가 있으며, 이것은 국소성 빈혈-재관류 손상의 병리생리학에서 중요한 역할을 하는데, C4-결핍 마우스는 국소성 빈혈-재관류 손상으로부터 보호되지 않는 한편, MASP-2-결핍 마우스는 보호되기 때문이다 (Schwaeble et al., PNAS, 2011 상기). LEA-2는 또한 응고 경로와 관련되며, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 분할 (공통 경로) 및 또한 효소에 의한 활성 형태 XIIa로 전환하기 위한 인자 XII (하게만(Hageman) 인자)의 분할을 수반한다. 인자 XIIa는 차례로 인자 XI를 XIa로 분할한다 (내재 경로). 응혈(clotting) 캐스케이드의 내재 경로 활성화는 피브린 형성으로 이어지며, 이것은 혈전 형성에 매우 중요하다.
도 1은 본원에서 제공된 결과에 기초하여 렉틴 경로 및 대체 경로의 새로운 이해를 도시한다. 도 1은 옵소닌화 및 용해 둘 다에서 LEA-2의 역할을 묘사한다. MASP-2가 생리학적으로 다수의 렉틴-의존적 설정에서 "다운스트림" C3b 침착 (및 그에 따른 옵소닌화)의 개시자인 한편 (도 20A, 20B, 20C), 그것은 또한 혈청-민감성 박테리아의 용해에서 역할을 한다. 도 1에서 도시된 바와 같이, 네이세리아 메닝기티디스와 같은 혈청-민감성 병원체에 대하여 MASP-2-결핍 또는 MASP-2-고갈된 혈청/혈장의 증가된 살균 활성의 원인이 되는, 제안된 분자적 메커니즘은, 박테리아의 용해를 위해, MASP-1 및 MASP-3과 연관된 렉틴 경로 인식 복합체가 박테리아 표면상에서 서로 가까이에 결합해야 하며, 이로 인해 MASP-1이 MASP-3을 분할하게 한다는 것이다. MASP-1 및 MASP-2와 반대로, MASP-3는 자가-활성화 효소가 아니지만, 많은 예에서, MASP-1에 의한 활성화/분할이 효소에 의한 활성 형태로 전환되는데 필요하다.
도 1에서 나타난 바와 같이, 활성화된 MASP-3은 병원체 표면에서 C3b-결합된 인자 B를 분할하여 각각 효소에 의해 활성인 대체 경로 C3 및 C5 컨버타제 C3bBb 및 C3bBb(C3b)n의 형성에 의한 대체 활성화 캐스케이드를 시작할 수 있다. MASP-2-함유 렉틴-경로 활성화 복합체는 MASP-3의 활성화와 관련이 없고, MASP-2의 부재시 또는 이것의 고갈 후, 모든-렉틴 경로 활성화 복합체는 MASP-1 또는 MASP-3이 로딩될 것이다. 그러므로, MASP-2의 부재시, 미생물 표면에서 MASP-1- 및 MASP-3-함유 렉틴-경로 활성화 복합체는 서로 가까이에 위치할 것이며, 더 많은 MASP-3의 활성화로 이어지고 이로 인해 미생물의 표면에서 대체 경로 C3 및 C5 컨버타제 C3bBb 및 C3bBb(C3b)n을 형성하기 위한 더 높은 비율의 C3b-결합된 인자 B의 MASP-3-매개된 분할로 이어질 가능성이 현저하게 증가된다. 이것은 C6과 결합된 표면-결합된 C5b, C7과 결합된 C5bC6, C8과 결합된 C5bC6C7, 및 C5bC6C7C8로 구성된, 막 공격 복합체를 형성하는 말단 활성화 캐스케이드 C5b-C9의 활성화로 이어지며, 박테리아 표면 구조로 삽입되어 박테리아 벽에서 구멍을 형성하는 C9의 폴리머화로 이어지는데, 이것은 보체-표적화된 박테리아의 삼투성 사멸로 이어질 것이다.
이 새로운 개념의 핵심은 본원에서 제공된 데이터가, 도 1에서 도시된 바와 같이, 렉틴 경로 활성화 복합체가 다음 두 개의 별개의 활성화 루트를 구동한다는 것을 분명히 보여준다는 것이다:
i) LEA-1: 활성화제 표면에서 인자 B의 초기 분할 및 활성화를 통해 대체 경로 컨버타제 C3bBb를 생성함으로써 보체의 활성화를 시작하고 구동하는 MASP-3-의존적 활성화 루트로서, 이것은 C3b 침착 및 대체 경로 컨버타제 C3bBb의 형성에 촉매 작용할 것이다. MASP-3-구동된 활성화 루트는 미생물의 옵소닌화 및 용해에 필수적인 역할을 하고 박테리아의 표면에서 대체 경로를 구동하며, 막 공격 복합체를 생성하기 위한 최적의 비율의 활성화로 이어진다; 그리고
ii) LEA-2: 렉틴 경로 C3 컨버타제 C4b2a, 및 C3 분할 생성물 C3b의 누적시, C5 컨버타제 C4b2a(C3b)n의 형성으로 이어지는 MASP-2-의존적 활성화 루트. 보체 C4의 부재시, MASP-2는 C2 및 응혈 인자 XI를 수반하는 대체 C3 컨버타제 복합체를 형성할 수 있다.
용해에 있어서 그것의 역할 이외에, MASP-2-구동된 활성화 루트는 공유 결합에 의해 결합된 C3b 및 이것의 분할 생성물 (즉, iC3b 및 C3dg)로 코팅되는 미생물로 이어지는 박테리아 옵소닌화에서 중요한 역할을 하며, 이것은 과립구, 대식세포, 단핵구, 소교세포(microglia cell) 및 세망내피계(reticuloendothelial system)와 같은, C3 수용체-함유 포식세포에 의한 흡수 및 사멸을 위해 표적화될 것이다. 이것은 보체 용해에 저항성인 박테리아 및 미생물의 제거의 가장 효율적인 루트이다. 이것들은 그람-양성 박테리아의 대부분을 포함한다.
LEA-1 및 LEA-2 이외에, MASP-3, MASP-1 및/또는 HTRA-1에 의한 인자 D의 렉틴-독립적 활성화의 가능성이 있고, 및 또한 MASP-3에 의한 인자 B의 렉틴-독립적 활성화의 가능성이 있다.
어떤 특정 이론에도 결부되지 않지만, (i) LEA-1, (ii) LEA-2 및 (iii) 인자 B 및/또는 인자 D의 렉틴-독립적 활성화 중 각각은 옵소닌화 및/또는 그에 따른 용해와 함께 MAC의 형성으로 이어진다고 생각된다.
ii. MASP-1, MASP-2 및 MASP-3의 배경
세 개의 만난-결합 렉틴-관련 세린 프로테아제 (MASP-1, MASP-2 및 MASP-3)는 현재 인간 혈청에서 만난-결합 렉틴 (MBL)과 결합되는 것으로 알려져 있다. 만난-결합 렉틴은 최근 문헌에서는 '만노스-결합 단백질' 또는 '만노스-결합 렉틴'으로도 불린다. MBL-MASP 복합체는
MBL의 매우 다양한 미생물에 존재하는 탄수화물 구조로의 결합 덕분에 선천적 면역력에서 중요한 역할을 한다. MBL의 탄수화물 구조의 특이적 배열과의 상호작용은, 차례로, 보체 성분 C4 및 C2를 분할하여 C3 컨버타제 C4b2b를 형성함으로써 보체를 활성화하는 MASP 전구효소의 활성화를 초래한다 (Kawasaki et al, J. Biochem 106:483-489 (1989); Matsushita & Fujita, J. Exp Med. 176: 1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol 150:571-578 (1993)).
MBL-MASP 전구효소 복합체는, 최근까지, 한 타입의 프로테아제 (MASP-1)만을 함유하는 것으로 간주되었지만, 현재는 MBL (Thiel et al., Nature 386:506-510 (1997); Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001)), 뿐만 아니라 "MAp19" 또는 "sMAP"로 불리는 19 kDa의 추가적 혈청 단백질 (Stover et al., J. Immunol 162:3481-3490 (1999); Stover et al, J. Immunol 163:6848-6859 (1999); Takahashi et al, Int. Immunol 11:859-63 (1999))과 연관된 두 개의 다른 별개의 프로테아제 (즉, MASP-2 및 MASP-3)가 있다는 것이 명백하다.
MAp19는 MASP-2에 대한 유전자 구조의 대체 스플라이스된 유전자 생성물이며 세린 엔도펩티다제 도메인을 포함하는, MASP-2의 네 개의 C-말단 도메인이 결핍된다. 풍부하게 발현된, MAp19를 암호화하는 절단된 mRNA 전사물은 MASP-2 유전자의 대체 스플라이싱/폴리아데닐화 사건에 의해 생성된다. 유사한 메커니즘에 의해, MASP-1/3 유전자는 세 개의 주요 유전자 생성물, 두 개의 세린 프로테아제 MASP-1 및 MASP-3 및 "MAp44"로 불리는 44 kDa의 절단된 유전자 생성물을 발생시킬 것이다 (Degn et al, J. Immunol 183(11):7371-8 (2009); Skjoedt et al, J Biol Chem 285:8234-43 (2010)).
MASP-1은 처음에 혈청 Ra-반응성 인자의 P-100 프로테아제 구성요소로서 설명되었으며, 이것은 현재 MBL 플러스 MASP로 구성된 복합체인 것으로 인식된다 (Matsushita et al, Collectins and Innate Immunity, (1996); Ji et al., J Immunol 150:571-578 (1993). 보체의 고전적 경로의 C1q-(C1r)2-(C1s)2 복합체 내의 C1s 효소의 것과 겉보기에 동일한 방식으로 보체 성분 C4 및 C2에서 작용하는, MBL-MASP 복합체 내의 MBL-관련 엔도펩티다제의 능력은 C1q-(C1r)2-(C1s)2 복합체와 기능적으로 유사한 MBL-MASP 복합체가 있다고 제안한다. C1q-(C1r)2-(C1s)2 복합체는 C1q의 면역 복합체에 존재하는 항체 IgG 또는 IgM의 Fc 영역과의 상호작용에 의해 활성화된다. 이것은, 차례로, 보체 성분 C4 및 C2에서 작용하는 C1s 전구효소를 성화시키는 C1r 전구체 효소의 자가활성화를 초래한다.
MBL-MASP 복합체의 화학량론은 다른 MBL 올리고머가 MASP-1/MAp19 또는 MASP-2/MASP-3의 다른 비율로 결합된 것으로 나타난다는 점에서 C1q-(C1r)2-(C1s)2 복합체에 대하여 발견된 것과 다르다 (Dahl et al, Immunity 15: 127-135 (2001)). 혈청에서 발견된 MASP 및 MAp19의 대부분은 MBL과 복합체를 형성하지 않고 (Thiel et al., J Immunol 165:878-887 (2000)) 피콜린, 최근에 설명된, 미생물의 표면에서 N-아세틸글루코사민 잔기에 결합할 수 있는 피브리노겐-유사 도메인을 갖는 렉틴의 군과 부분적으로 결합할 수도 있다 (Le et al., FEBS Lett 425:367 (1998); Sugimoto et al, J. Biol Chem 273:20721 (1998)). 이것들 중에서, 인간 L-피콜린, H-피콜린 및 M-피콜린은 MASP, 뿐만 아니라 MAp19와도 결합하고 피콜린에 의해 인식된 특이적 탄수화물 구조에 결합시 렉틴 경로를 활성화시킬 수도 있다 (Matsushita et al, J Immunol 164:2281-2284 (2000); Matsushita et al, J Immunol 168:3502-3506 (2002)). 피콜린 및 MBL 이외에, CL-11로 불리는 MBL-유사 렉틴 콜렉틴은 렉틴 경로 인식 분자로 확인되었다 (Hansen et al. J Immunol 185:6096-6104 (2010); Schwaeble et al. PNAS 108:7523-7528 (2011)). 이 대안의 탄수화물 인식 분자들의 생리학적 중요성을 강조하는 강력한 증거가 있고 그러므로 MBL은 렉틴 활성화 경로의 유일한 인식 구성요소가 아니며 MBL 결핍은 렉틴-경로 결핍으로 혼동하지 않아야 한다는 것을 이해하는 것이 중요하다. MBL과 구조적으로 관련된 대체 탄수화물-인식 복합체의 가능한 배열의 존재는 보체의 활성화를 통해 내재 면역 시스템의 직접적인 반응을 시작하는 미생물 구조의 스펙트럼을 넓힐 수도 있다.
모든 렉틴 경로 인식 분자는 그것들의 콜라겐-상동성 줄기 영역(stalk region) 내의 특이적 MASP-결합 모티프(motif)를 특징으로 한다 (Wallis et al. J. Biol Chem 279: 14065-14073 (2004)). MBL, CL-11 및 피콜린에서 MASP-결합 부위는 이 도메인 내의 별개의 모티프, Hyp-Gly-Lys-Xaa-Gly-Pro를 특징으로 하며, Hyp는 히드록시프롤린이고 Xaa는 일반적으로 지방족 잔기이다. 이 서열에서 점 돌연변이(point mutation)는 MASP 결합을 붕괴시킨다.
1. 각각의 구조, 서열, 염색체 위치 측정 및 스플라이스 변이체
도 2는 MASP-2 폴리펩티드 (SEQ ID NO:5) 및 MAp19 폴리펩티드 (SEQ ID NO:2) 및 같은 것을 암호화하는 엑손의 도메인 구조를 도시하는 개략도이다. 도 3은 MASP-1 폴리펩티드 (SEQ ID NO:10), MASP-3 폴리펩티드 (SEQ ID NO:8) 및 MAp44 폴리펩티드 (SEQ ID NO:11) 및 같은 것을 암호화하는 엑손의 도메인 구조를 도시하는 개략도이다. 도 2 및 도 3에서 보이는 바와 같이, 세린 프로테아제 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3은 C1r 및 C1s에서 발견된 바와 같이 배열된 여섯 개의 별개의 도메인, 즉, (I) N-말단 C1r/C1s/성게 VEGF/뼈 형태 형성 단백질 (또는 CUBI) 도메인; (II) 표피 성장 인자 (EGF)-유사 도메인; (III) 제2 CUB 도메인 (CUBII); (IV 및 V) 두 개의 보체 대조군 단백질 (CCP1 및 CCP2) 도메인; 및 (VI) 세린 프로테아제 (SP) 도메인으로 구성된다.
인간 및 마우스 MASP-1 (Sato et al., Int Immunol 6:665-669 (1994); Takada et al., Biochem Biophys Res Commun 196: 1003-1009 (1993); Takayama et al., J. Immunol 152:2308-2316 (1994)), 인간, 마우스, 및 래트 MASP-2 (Thiel et al., Nature 386:506-510 (1997); Endo et al., J Immunol 161:4924-30 (1998); Stover et al., J. Immunol 162:3481-3490 (1999); Stover et al., J. Immunol 163:6848-6859 (1999)), 뿐만 아니라 인간 MASP-3 (Dahl et al., Immunity 15: 127-135 (2001))의 cDNA-유래된 아미노산 서열은 이 프로테아제들이 그것들의 추정 촉매 도메인 (Genbank 수납 번호: 인간 MASP-1: BAA04477.1; 마우스 MASP-1: BAA03944; 래트 MASP-1: AJ457084; 인간 MASP-3:AAK84071; 마우스 MASP-3: AB049755로서, 2012년 2월 15일에 Genbank에서 접속된 바와 같으며, 이것들 각각은 본원에 참고로 포함된다) 내에서 His, Asp 및 Ser 잔기의 특유의 트라이어드(triad)를 갖는 세린 펩티다제라는 것을 지시한다.
도 2 및 도 3에 더 나타난 바와 같이, 치모겐의 활성 형태로의 전환시, 중쇄 (알파, 또는 A 사슬) 및 경쇄 (베타, 또는 B 사슬)는 이황화-결합된 A-사슬 및 세린 프로테아제 도메인를 나타내는 더 작은 B-사슬을 수득하기 위해 분열된다. 단일-사슬 전구효소 MASP-1은 제2 CCP 도메인 (도메인 V)와 세린 프로테아제 도메인 (도메인 VI) 사이에 위치한 Arg-Ile 결합의 분할에 의해 활성화된다 (전구효소 C1r 및 C1s와 유사함). 전구효소 MASP-2 및 MASP-3은 MASP-1의 그것과 유사한 방식으로 활성화되는 것으로 간주된다. 각 MASP 단백질은 호모다이머를 형성하고 Ca++-의존적 방식으로 MBL 및 피콜린과 개별적으로 결합된다.
2. MASP-1/3
인간 MASP-1 폴리펩티드 (SEQ ID NO:10) 및 MASP-3 폴리펩티드 (SEQ ID NO:8)는 한 구조 유전자로부터 발생하며 (Dahl et al., Immunity 15: 127-135 (2001), 이것은 염색체 3의 긴 팔의 3q27-28 영역으로 맵핑되었다 (mapped) (Takada et al., Genomics 25:757-759 (1995)). MASP-3 및 MASP-1 mRNA 전사물이 대체 스플라이싱/폴리아데닐화 과정에 의한 주요 전사물로부터 생성되었다. MASP-3 번역 생성물은 MASP-2 및 MASP-3 둘 다에 공통된 알파 사슬, 및 MASP-3에 고유한 베타 사슬(세린 프로테아제 도메인)로 구성된다. 도 3에서 보이는 바와 같이, 인간 MASP-1 유전자는 18개의 엑손을 포함한다. 인간 MASP-1 cDNA (SEQ ID NO:9로 제시됨)는 엑손 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17 및 18에 의해 암호화된다. 도 3에서 추가로 보이는 바와 같이, 인간 MASP 3 유전자는 12개의 엑손을 포함한다. 인간 MASP-3 cDNA (SEQ ID NO:7로 제시됨)는 엑손 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 및 12에 의해 암호화된다. 대체 스플라이스는 MBL-관련 단백질 44 ("MAp44"), (SEQ ID NO:11로 제시됨)로 불리는 단백질을 발생시키며, 엑손 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로부터 발생한다.
인간 MASP-1 폴리펩티드 (Genbank BAA04477.1의 SEQ ID NO:10)는 699개의 아미노산 잔기를 가지며, 이것은 19개의 잔기의 선도 펩티드를 포함한다. 선도 펩티드가 제외되면, MASP-1의 계산된 분자 질량은 76,976 Da이다. 도 3에서 보이는 바와 같이, MASP-1 아미노산 서열은 네 개의 N-결합된 글리코실화 부위를 함유한다. 인간 MASP-1 단백질의 도메인 (SEQ ID NO:10에 관하여)이 도 3에서 나타나고 N-말단 C1r/C1s/성게 VEFG/뼈 형태 형성 단백질 (CUBI) 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 25-137), 표피 성장 인자-유사 도메인 (SEQ ID NO:10의 139-181), 제2 CUB 도메인 (CUBII) (SEQ ID NO:10의 aa 185-296), 뿐만 아니라 보체 대조군 단백질 (SEQ ID NO:10의 CCP1 aa 301-363 및 CCP2 aa 367-432) 도메인 및 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 449-694)의 탠덤을 포함한다.
인간 MASP-3 폴리펩티드 (SEQ ID NO:8, Genbank AAK84071)는 728개의 아미노산 잔기를 가지며, 이것은 19개의 잔기의 선도 펩티드를 포함한다. 선도 펩티드가 제외되면, MASP-3의 계산된 분자 질량은 81,873 Da이다. 도 3에서 보이는 바와 같이, MASP-3에 일곱 개의 N-결합된 글리코실화 부위가 있다. 인간 MASP-3 단백질의 도메인 (SEQ ID NO:8에 관하여)이 도 3에서 나타나고 N-말단 C1r/C1s/성게 VEGF/뼈 형태 형성 단백질 (CUBI) 도메인 (SEQ ID NO:8의 aa 25-137), 표피 성장 인자-유사 도메인 (SEQ ID NO:8의 aa 139-181), 제2 CUB 도메인 (CUBII) (SEQ ID NO:8의 aa 185-296), 뿐만 아니라 보체 대조군 단백질 (SEQ ID NO:8의 CCP1 aa 301-363 및 CCP2 aa 367-432) 도메인 및 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:8의 aa 450-711)의 탠덤을 포함한다.
MASP-3 번역 생성물은 MASP-1 및 MASP-3 둘 다에 공통된 CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2 도메인 (알파 사슬: SEQ ID NO:8의 aa 1-448)을 함유하는 알파 사슬 (중쇄), 및 세린 프로테아제 도메인을 함유하는, MASP-3 및 MASP-1에 고유한 경쇄 (베타 사슬: SEQ ID NO:8의 aa 449-728)로 구성된다.
3. MASP-2
인간 MASP-2 유전자는 염색체 lp36.3-2 상에 위치하고 (Stover et al., Cytogenet and Cell Genet 84: 148-149 (1999) 12개의 엑손을 포함하며, 도 2에서 나타난 바와 같다. MASP-2 (SEQ ID NO:5) 및 MAp19 (SEQ ID NO:2)는 대체 스플라이싱/폴리아데닐화에 의해 생성된 단일 구조 유전자의 전사물에 의해 암호화된다 (Stover et al, Genes and Immunity 2: 119-127 (2001)). 인간 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)는 엑손 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12에 의해 암호화된다. MBL-관련 단백질 19로 불리는 ("MAp19", "sMAP"로도 불림) 20 kDa 단백질 (SEQ ID NO:2)은 SEQ ID NO:1에 의해 암호화되며, 엑손 2, 3, 4 및 5로부터 발생한다. MAp19는 도 2에서 보이는 바와 같이 엑손 5로부터 유래된 네 개의 추가 잔기 (EQSL)와 함께 MASP-2의 N-말단 CUB1-EGF 영역을 함유하는 비효소적 단백질이다.
MASP-2 폴리펩티드 (SEQ ID NO:5)는 686개의 아미노산 잔기를 가지며, 이것은 분비 후 분할 제거되는 15개의 잔기의 선도 펩티드를 포함하고, 성숙한 형태의 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:6)를 발생시킨다. 도 2에서 나타난 바와 같이, MASP-2 아미노산 서열은 어떤 N-결합된 글리코실화 부위도 함유하지 않는다. MASP-2 폴리펩티드는 MASP-1, MASP-3, 및 C1r 및 C1s, C1 보체 시스템의 프로테아제와 유사한 분자 구조를 나타낸다. 인간 MASP-2 단백질의 도메인 (SEQ ID NO:5에 관한 넘버링됨 (numbered))은 도 2에서 나타나고 N-말단 C1r/C1s/성게 VEGF/뼈 형태 형성 단백질 (CUBI) 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 24-136), 표피 성장 인자-유사 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 138-180), 제2 CUB 도메인 (CUBII) (SEQ ID NO:5의 aa 184-295), 뿐만 아니라 보체 대조군 단백질 (SEQ ID NO:5의 CCP1 aa 300-359 및 CCP2 aa 364-431) 도메인 및 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 445-682)의 탠덤을 포함한다.
도 2에서 나타난 바와 같이, MASP-2 폴리펩티드는 CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2 도메인을 함유하는 알파 사슬 (중쇄) (알파 사슬: SEQ ID NO:5의 aa 1-443) 및 세린 프로테아제 도메인을 함유하는 베타 사슬 (경쇄) (베타 사슬: aa 444-686)을 가진다. CUB-1, EGF 및 CUB-2 도메인은 다이머화에 필요하고 CUB-1, EGF, CUB-2 및 CCP-1 도메인은 MBP에 대한 결합 부위를 함유한다. Wallis et al, J. Biol Chem 279: 14065-14073 (2004)에서 설명된 바와 같이, 각각의 MASP-2 다이머는 두 개의 MBL 서브유닛에 결합한다.
4. MASP-1, MASP-2 및 MASP-3 아미노산 서열의 비교
도 4는 MASP-1 (SEQ ID NO:10), MASP-2 (SEQ ID NO:6) 및 MASP-3 (SEQ ID NO:8)의 단백질 서열의 아미노산 정렬이며, 세린 프로테아제 (SP) 도메인에서 CUBI, EGF, CUBII, CCP1, CCP2 도메인 및 전환된 촉매 트라이어드 잔기 (H, D, S)를 나타낸다. 부호 "."는 동일한 아미노산 서열을 지시한다.
도 5는 알파 사슬 서열의 아미노산 정렬이며, MASP-1 (알파 사슬: SEQ ID NO:10의 aa 1-447), MASP-2 (알파 사슬: SEQ ID NO:5의 aa 1-443) 및 MASP-3 (알파 사슬: SEQ ID NO:8의 aa 1-448)의 CUBI-EGF-CUBII-CCP1-CCP2를 포함한다. 도 5에서 점선으로 된 박스에 의해 지시된 바와 같이, CUBI, EGF, 및 CUBII 도메인에서 동일성의 많은 패치(patch)가 있다. CCP1 및 CCP2 도메인은 어두운 박스에 의해 지시된다. 인간 MASP1/3 및 인간 MASP-2의 알파 사슬 사이의 전체적인 퍼센트 동일성은 하기 표 1에서 제공된다.
도 6은 MASP-1 (베타 사슬: aa 448-699 of SEQ ID NO:10), MASP-2 (베타 사슬: SEQ ID NO:5의 aa 444-686) 및 MASP-3 (베타 사슬: SEQ ID NO:8의 aa 449-728)의 베타 사슬 서열 (세린 프로테아제 도메인 등)의 아미노산 정렬이다. 도 7A는 MASP-1 (베타 사슬: SEQ ID NO:10의 aa 448-699) 및 MASP-2 (베타 사슬: SEQ ID NO:5의 aa 444-686)의 베타 사슬 영역 사이의 쌍별 아미노산 정렬을 나타낸다. 도 7B는 MASP-1 (베타 사슬: SEQ ID NO:10의 aa 448-699) 및 MASP-3 (베타 사슬: SEQ ID NO:8의 aa 449-728)의 베타 서슬 영역 사이의 쌍별 아미노산 정렬을 나타낸다. 도 7C는 MASP-2 (베타 사슬: SEQ ID NO:5의 aa 444-686) 및 MASP-3 (베타 사슬: SEQ ID NO:8의 aa 449-728)의 베타 사슬 서열 사이의 쌍별 아미노산 정렬을 나타낸다. 도 5-7에서 동일성의 영역은 동일한 아미노산을 둘러싼 점선으로 된 상자로 나타난다 ("." 부호로 나타남).
인간 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3 단백질의 알파 및 베타 사슬 사이의 퍼센트 동일성은 하기 표 1에 제공된다.
인간 MASP 단백질 사이의 퍼센트 동일성
A 사슬 사이에서 % 동일성 B 사슬 사이에서 % 동일성
MASP-1 MASP-2 MASP-3 MASP-1 MASP-2 MASP-3
MASP-1 100% 45.6% 98% 100% 27% 27%
MASP-2 45.6% 100% 45.4% 27% 100% 28.6%
MASP-3 98% 45.4% 100% 27% 28.6% 100%
알파 사슬 (중쇄)에 관하여, 상기 표 1에서 지시된 바와 같이, MASP-1 및 MASP-3 알파 사슬은 동일하다 (3' 끝에서 15개의 아미노산 서열을 제외하고). MASP-2 및 MASP-3 알파 사슬 사이의 전체 % 동일성은 45.4%이며, CUBI-EGF-CUBII 도메인에서 동일성의 많은 패치는 도 5에서 나타난 바와 같다. 베타 사슬 (경쇄)에 관하여, 세 개의 베타 사슬 사이의 전체 퍼센트 동일성은 낮으며, 27% 내지 28%의 범위에 있다. 하지만, 세 개의 B-사슬 사이의 전체 동일성이 낮음에도 불구하고, 동일성의 많은 패치가 있으며, 도 6에서 나타난 바와 같다. 도 7A-C에서 더 나타난 바와 같이, 서열의 동일한 패치는 MASP-2와 3 사이에서 1과 2 사이 또는 1과 3 사이보다 더 넓게 분포된다.
MASP-2, MASP-3, C1r 및 C1s에 존재하는 모든 시스테인 잔기는 MASP-1의 동등한 잔기에 맞춰진다; 하지만 MASP-1은 MASP-2, MASP-3, C1r 및 C1s에서 발견되지 않는 두 개의 시스테인 잔기를 가진다 (L 사슬의 위치 465 및 481에서). MASP-1에서 이 두 개의 시스테인 잔기는 트립신 및 키모트립신에서 발견된 바와 같은 '히스티딘-루프' 이황화 다리를 형성하기 위해 사용된, 예측된 위치에 있다. 이것은 MASP-2, MASP-3, C1r, 및 C1s가, 유전자 중복 및 차이에 의해, MASP-1로부터 발달했을 수도 있다고 제안한다 (Nonaka & Miyazawa, Genome Biology 3 Reviews 1001.1-1001.5 (2001)).
5. 적절한 인간 유전 데이터를 포함하는, 각각의 생물학적 기능/활성
선천적 면역에서 MBL/피콜린-MASP 복합체의 역할은 효모, 박테리아, 바이러스, 및 균류에서 발견되는 탄수화물 구조에 C-형 렉틴 도메인 (MBL 분자에 존재)의 칼슘-의존적 결합을 통해 또는 피브리노겐-유사 도메인 (피콜린 분자에 존재)의 결합을 통해 매개된다. 이 인식 단계는 전구효소 MASP-2의 활성화를 초래하며, 이것은 그때 C4 및 C2를 분할하여 C3 컨버타제 C4b2b를 형성함으로써 C1q-(C1r)2-(C1s)2 복합체 내에서 활성화된 C1s의 작용을 모방한다. 이것은 표적 병원체 상에 C4b 및 C3b의 침착을 허용하고 따라서 식균작용을 통해 사멸 및 제거를 촉진한다.
최근 문헌의 증거는 렉틴 경로 활성화 복합체가 C4 및 C2를 분할하기 위해 유일하게 MASP-2의 활성을 필요로 한다는 것을 제안한다: i) 재조합 MBL 및 재조합에 의해 발현된 MASP-2를 사용하는 최소 렉틴-경로 활성화 복합체의 재구성은 시험관 내에서 C4 및 C2 둘 다를 효과적으로 분할하는데 충분한 것으로 나타나는 한편 (Vorup-Jensen et al., J. Immunol 165:2093-2100 (2000); Rossi et al., J Biol Chem 276:40880-40887 (2001); Ambrus et al, J Immunol 170: 1374-1382 (2003); Gal et al, J Biol Chem 280:33435-33444 (2005)); ii) MASP-2의 유전자-표적화된 결핍을 가진 마우스의 혈청은 어떤 렉틴 경로 기능적 활성이 전혀 없다 (Schwaeble et al, PNAS 108:7523-7528 (2011)). 최근에, MASP-2의 유전적으로 결정된 결핍이 설명되었다 (Stengaard-Pedersen et al, New Eng. J. Med. 349:554-560, (2003)). 단일 뉴클레오티드의 돌연변이는 CUB1 도메인에서 Asp-Gly 교체로 이어지고 MASP-2가 MBL에 결합할 수 없게 한다.
게다가, MASP-1 및 MASP-3 둘 다가 결핍된 마우스 혈청의 기능적 특성은 생리학적 조건 하에서 야생형 및 MASP-1/MASP-3 넉아웃 (MASP-1/3-/-) 마우스의 혈청을 비교할 때 렉틴 경로 활성은 더 느리지만, 없지는 않다는 것을 나타낸다 (Takahashi et al., J. Immunol 180:6132-6138 (2008); Schwaeble et al, PNAS (2011)). 이 연구들은 고전적 경로 효과기 엔도펩티다제 C1s와 반대로, MASP-2의 활성화는 반드시 다른 MBL-관련 세린 엔도펩티다제 (즉, MASP-1 또는 MASP-3) 중 어떤 것의 활성을 수반하거나 이를 필요로 하는 것은 아니며 MASP-2의 단백질 가수분해 활성은 렉틴 경로의 탄수화물 인식 분자 (즉, MBL, 피콜린 또는 CL-11)의 보체 활성화로의 결합을 번역하는데 충분하다는 것을 제안한다. 하지만, 더 최근의 연구는 MASP-2가 자가활성화하는능력을 갖는 한편, MASP-2 치모겐의 MASP-1 활성화의 촉매 반응 비율이 그것의 자체 치모겐 형태의 MASP-2 분할의 그것을 약 85,000배 만큼 초과한다는 것을 입증하였다 (Heja et al, PNAS 106: 10498-503 (2011); Megyeri et al, J. Biol. Chem. 288(13):8922-34 (2013)). 그러므로, 생리학적 설정에서 MASP-2의 주요 활성화제는 MASP-1일 가능성이 크다. 생성된 C4의 단편의 크기, 및 생성된 기능적 C3 컨버타제 활성에 의해 판단된 바와 같이, 활성화된 MASP-2는 활성화된 C1s에 의해 수행된 것과 동일한 방식으로, 즉, C4의 알파-사슬 내 단일 아르기닐 결합 (Arg76 Ala77)에서 및 C2의 전구효소 사슬 내 단일 아르기닐 결합 (Arg223 Lys224)에서 C4 및 C2를 분할할 것으로 보인다. 또한 마우스 MASP (마우스 MBL-MASP 복합체 설계된 Ra-반응 인자의 형태에서)는, C1s와 달리, 생물학적 활성 단편 C3a 및 C3b를 수득하기 위해 보체 성분 C3의 알파-사슬을 분할할 수 있다는 것이 보고되었다 (Ogata et al, J. Immunol 154:2351-2357 (1995)). 이것이 인간 시스템에서 일어나면, 그것은 C3의 알파-사슬 내에서 단일 아르기닐 결합 (Arg77 Ser78)의 분할을 필요로 할 것이다. 활성화된 MASP-2는, 활성화된 C1s와 유사하게, 보체 성분 C5를 분할할 수 없다. MASP-1 및 MASP-2의 단백질 가수분해 활성은 C1-억제자에 의해 억제되는 반면 (Matsushita et al., J Immunol 165:2637-2642 (2000), C1-억제자는 MASP-3과 반응하지 않는다 (Dahl et al, Immunity 15: 127-135 (2001); Zundel et al, J Immunol 172:4342-4350 (2004)).
MASP-1 및 MASP-3의 생물학적 기능은 등장하는 것이 느려졌다. MASP-1의 기질 특이성 및 생리학적 역할은 그것의 발견 이래로 논쟁의 대상이었다. 많은 잠재적 기질이 최근 몇 년 동안 확인되었다. MASP-1은 고유한 C3을 천천히 분할할 수 있고 C3의 이 직접적인 분할은 아마도 대체 경로의 기여와 함께 보체 캐스케이드를 시작할 수도 있다는 것이 제안되었다 (Matsushita et al., J Immunol 165:2637-2642 (2000)). 이후에 재조합 MASP-1은 보체 캐스케이드의 시작에 관하여 비생산적인 재조합 MASP-1은 비활성 (가수분해된 티오에스테르) 형태를 분할하는 것으로 나타났다 (Ambrus et al., J Immunol 170: 1374-1382 (2003)). MASP-2-결핍 마우스의 혈청 희석에서 렉틴 경로 활성의 결핍은 MASP-1-구동된 C3-바이패스 메커니즘이 존재하지 않는다는 것을 명백하게 증명하였다 (Schwaeble et al, PNAS 108:7523-7528 (2011)). MASP-1에 의해 상당한 효율로 분할되는 보체 성분은 C2 (Rossi et al, J Biol Chem 276:40880-40887 (2001); Ambrus et al, J Immunol 170: 1374-1382 (2003)) 및 인자 D의 치모겐 형태이다 (Takahashi et al., J Exp Med 207:29-37 (2010)). C2를 분할하는 MASP-1의 능력에 따르면, 그러므로 C2 분할을 통한 MASP-2의 C3-컨버타제 (C4b2a)-형성 능력을 증가시킬 수 있다는 것이 타당하다. 이 제안은 렉틴 경로의 활성이 MASP-1-고갈된 인간 혈청에서 및 MASP-1/3-결핍 마우스의 혈청에서 줄어든다는 관찰에 의해 지지되며 (Takahashi et al., J Immunol 180:6132-6138 (2008)), 이 관찰은 또한 MASP-1이 MASP-2의 활성화에 있어서 역할을 한다는 것을 제안한다. 하지만, MBL-MASP 복합체에 의해 침착된 모든 C4b가 C4b2a 컨버타제를 형성할 수 있는 한편, 고전적 경로 C1 복합체에 의해 침착된 네 개의 C4b 중 하나만이 같은 것을 할 수 있다 (Rawal et al., J Biol Chem 283 (12):7853-63 (2008)).
MASP-1은 또한 MASP-2 및 MASP-3을 분할한다 (Megyeri M., et al, J Biol Chem. 2013 Mar 29;288(13):8922-34). 최근 실험은 MASP-2가 자가활성화할 수 있지만, MASP-1이 치모겐 MASP-2의 주요 활성화제라는 것을 제안한다. MASP-2의 활성화는 MASP-1 넉아웃 마우스의 혈청에서 지연되었고 (Takahashi et al., J Immunol 180: 6132-6138 (2008)) MASP-1의 활성이 정상 인간 혈청에서 특이적 억제자에 의해 차단될 때 유사한 결과를 얻었다 (Kocsis et al., J Immunol 185(7):4169-78 (2010)). 게다가, Degn et al. (J. Immunol. 189(8): 3957-69 (2012))은 MASP-1이 인간 혈청에서 MASP-2 활성화 및 그 후의 C4 분할에 중요하다는 것을 발견하였다. 치모겐 MASP-2의 활성 MASP-2로의 전환에 대한 촉매 반응 비율은 MASP-2가 자가활성화할 수 있는 속도보다 85,000배 더 높다 (Megyeri et al, J. Biol. Chem. 288:8922-8934 (2013); Heja et al, J. Biol. Chem. 287(24):20290-300 (2012); Heja et al, PNAS 109: 10498-503 (2012)).
최근 발견은 또한 MASP-1을 대체 경로와 관련시켰다. MASP-1은 치모겐 인자 D를 그것의 효소에 의한 활성 형태로 전환시킬 수 있다 (도 39; Takahashi et al, J Exp Med 207:29-37 (2010)). 게다가, MASP-1은 MASP-3의 치모겐 형태를 활성화시키며 (Megyeri et al, J. Biol. Chem. 288:8922-8934 (2013); Degn et al. J. Immunol. 189(8): 3957-69 (2012)), 이것은 스스로 치모겐 인자 D를 활성화시킬 수 있을뿐만 아니라 (도 39) 인자 B, 대체 경로의 또 다른 필수 구성요소를 그것의 활성 형태로 분할할 수 있다 (Iwaki et al., J. Immunol. 187:3751-58 (2011)). 하지만, 프로-인자 D 및 프로-인자 B의 전환은 LEA-2의 활성화 상태에 독립적일 가능성이 크고 비-복합체-결합된 MASP-1을 통해 발생할 수도 있다.
몇 개의 증거는 MASP-1이 트롬빈-유사 효소이고 응고 경로의 활성화에 중요하다는 것을 지시한다. MASP-1은 피브리노겐 (Hajela K. et al., Immunobiology 205(4-5):467-75 (2002)), 인자 XIII (Krarup et al, Biochim Biophys Acta 1784(9): 1294-1300 (2008)) 및 프로테아제-활성화된 수용체 4 (PAR4) (Megyeri et al., J Immunol 183(5):3409-16 (2009))를 포함하는 트롬빈의 여러 기질을 분할할 수 있다. 게다가, 헤파린의 존재시 항트롬빈은 C1-억제자보다 더 효과적인 MASP-1의 억제자이다 (Dobo et al, J Immunol 183: 1207-1214 (2009)). 보체 및 응고 경로 사이의 연관성은 또한 MASP-2가 프로트롬빈을 활성화시킬 수 있다는 관찰에 의해 강조된다 (Krarup A. et al, PLoS One 2(7):e623 (2007)). 제한된 응고는 병원체 침입의 확산이 피브린 응고에 의해 방지될 때 선천적 면역력의 고대의 타입을 나타낸다. 방출 피브리노펩티드 B는 전염증 활성을 갖는다. PAR4의 MASP-1-매개된 분할은 내피 세포-시작 염증 반응을 활성화시킨다 (Megyeri et al, J Immunol 183(5):3409-16 (2009)).
MASP-3는 C4, C2 또는 C3 기질에 대한 단백질 가수분해 활성을 갖지 않는다. 반대로, MASP-3은 렉틴 경로의 억제자로서 작용하는 것으로 보고되었다 (Dahl et al., Immunity 15: 127-135 (2001)). 이 결론은, MASP-1 및 MASP-2와 달리, MASP-3는 자가활성화 효소가 아니기 때문에 발생할 수도 있다 (Zundel S. et al, J Immunol 172:4342-4350 (2004); Megyeri et al, J. Biol. Chem. 288:8922-8934 (2013).
최근에, MASP-1 및 MASP-3의 가능한 생리학적 기능에 대한 증거는 결합된 MASP-1 및 MASP-3 결핍을 갖는 마우스 계통를 사용하는 유전자 이식 마우스 연구로부터 나타났다. MASP-1/3-넉아웃 마우스가 기능적 렉틴 경로를 갖는 한편 (Schwaeble et al, PNAS 108:7523-7528 (2011)), 그것들은 대체 경로 활성이 결핍된 것으로 나타난다 (Takahashi et al, JEM 207(1):29-37 (2010)). 대체 경로 활성의 결핍은 보체 인자 D의 가공 결함 때문인 것으로 나타난다. MASP-1/3 넉아웃 마우스에서, 모든 인자 D는 단백질 가수분해에 의한 비활성화 전-형태(pro-form)로서 순환하는 반면에, 정상 마우스의 혈청에서는, 실질적으로 모든 인자 D가 활성 형태이다. 생하학적 분석은 MASP-2이 보체 인자 D를 그것의 치모겐 형태로부터 그것의 효소에 의한 활성 상태로 전환시킬 수도 있다는 것을 제안하였다 (도 39; Takahashi et al, JEM 207(1):29-37 (2010)). MASP-3는 또한 프로-인자 D 치모겐을 분할하고 시험관 내에서 활성 인자 D를 생산한다 (도 39; Takahashi et al, JEM 207(1):29-37 (2010)). 인자 D는 정상적인 개인의 순환에서 활성 효소로서 존재하고, MASP-1 및 MASP-3, 뿐만 아니라 HTRA-1은 이 활성화의 원인이 될 수도 있다. 게다가, 결합된 MBL 및 피콜린 결핍을 가진 마우스는 여전히 정상 수준의 인자 D를 생산하고 충분히 기능적인 대체 경로를 갖고 있다. 따라서, MASP-1 및 MASP-3의 이 생리학적 기능들은 반드시 렉틴을 수반하는 것은 아니고, 따라서 렉틴 경로와 관련이 없다. 재조합 마우스 및 인간 MASP-3은 또한 시험관 내 스타필로코쿠스 아우레우스에서 인자 B를 분할하고 C3 침착을 지지하는 것으로 나타난다 (도 36; Iwaki D. et al, J Immunol 187(7):3751-8 (2011)).
MASP-3에 대한 예상 밖의 생리학적 역할이 3MC 증후군에 걸린 환자의 최근 연구로부터 드러났다 (이전에 카니발(Carnevale), 밍가렐리(Mingarelli), 말푸에치(Malpuech), 및 미헬스(Michels) 증후군으로 지정됨; OMIM # 257920). 이 환자들은 구개 파열(cleft palate), 구순 구개열(cleft lip), 두개골 기형(cranial malformation) 및 정신 지체(mental retardation)를 포함하는, 심각한 발달 장애를 나타낸다. 유전적 분석은 제대로 기능하지 않는 MASP-3 유전자에 대해 동형 접합성인 3MC 환자를 확인하였다 (Rooryck et al, Nat Genet. 43(3): 197-203 (2011)). 또 다른 군의 3MC 환자는 기능적 MASP-1 및 MASP-3 단백질의 부재로 이어지는 MASP-1 유전자의 돌연변이에 대하여 동형 접합성인 것으로 발견되었다. 또 다른 그룹의 3MC 환자는 기능적 CL-11 유전자가 결핍되었다 (Rooryck et al., Nat Genet. 43(3): 197-203 (2011)). 따라서, CL-11 MASP-3 축은 배 발생 중에 역할을 하는 것으로 나타난다. 이 발달 경로의 분자적 메커니즘은 불분명하다. 하지만, 공통 보체 성분의 결핍을 갖는 개인이 이 증후군을 발달시키지 않기 때문에 통상적인 보체-구동된 과정에 의해 매개될 가능성은 낮다. 따라서, 본 발명자의 발견 이전에는, 본원에서 설명된 바와 같이, 렉틴-의존적 보체 활성화에서 MASP-3에 대한 기능적 역할은 확립되지 않았다.
MASP-1 및 MASP-2의 촉매 단편의 구조는 X-선 결정학에 의해 결정되었다. MASP-1 프로테아제 도메인의 다른 보체 프로테아제의 그것들과의 구조적 비교는 그것의 느슨한 기질 특이성(relaxed substrate specificity)의 기초를 나타냈다 (Dobo et al, J. Immunol 183: 1207-1214 (2009)). MASP-2의 기질 결합 고랑(groove)의 접근성은 표면 루프에 의해 제한되는 한편 (Harmat et al, JMol Biol 342: 1533-1546 (2004)), MASP-1은 다른 보체 프로테아제 대신에 트립신과 유사한 열려있는 기질 결합 포켓(substrate Binding pocket)을 갖는다. MASP-1 구조의 트롬빈-유사 속성은 기질과 상호작용할 수 있는 매우 큰 60개 아미노산 루프 (루프 B)이다. MASP-1 구조의 또 다른 흥미로운 특징은 S1 Asp 189 및 Arg224 사이의 내부 염 다리(salt bridge)이다. 유사한 염 다리는 인자 D의 기질 결합 포켓에서 발견될 수 있으며, 이것은 그것의 프로테아제 활성을 조절할 수 있다. C1s 및 MASP-2는 거의 동일한 기질 특이성을 갖는다. 놀랍게도, MASP-2의 8개의 표면 루프 중 일부는, 기질 특이성을 결정하며, C1s와 비교하여 매우 다른 구조를 갖는다. 이것은 두 개의 기능적으로 관련된 효소가 같은 기질과 다른 방식으로 상호작용한다는 것을 의미한다. 치모겐 MASP-2의 구조는 붕괴된 옥시음이온(oxyanion) 구멍 및 기질 결합 포켓을 갖는 비활성 프로테아제 도메인을 나타낸다 (Gal et al, J Biol Chem 280:33435-33444 (2005)). 놀랍게도, 치모겐 MASP-2는 큰 단백질 기질, C4에서 많은 활성을 나타낸다. 치모겐 MASP-2의 구조는 매우 플렉시블(flexible)하며, 비활성 및 활성 형태 사이의 전이를 가능하게 할 가능성이 크다. 이 유연성은 구조에서 반영되고, 자가활성화 과정에서 역할을 할 수도 있다.
노던 블롯(northern blot) 분석은 간이 MASP-1 및 MASP-2 mRNA의 주요 공급원이라는 것을 지시한다. MASP-1에 대한 5' 특이적 cDNA 프로브를 사용하여, 주요 MASP-1 전사물은 4.8 kb이고 작은 것은 대략 3.4 kb인 것으로 보였고, 둘 다 인간 및 마우스 간에 존재하였다 (Stover et al, Genes Immunity 4:374-84 (2003)). MASP-2 mRNA (2.6 kb) 및 MAp19 mRNA (1.0 kb)는 간 조직에서 풍부하게 발현된다. MASP-3은 간에서, 및 또한 신경 조직을 포함하는, 많은 다른 조직에서 발현된다 (Lynch N. J. et al, J Immunol 174:4998-5006 (2005)).
감염 및 만성 염증 질환의 병력이 있는 환자는 활성 MBL-MASP 복합체를 형성하는데 실패하는, MASP-2의 돌연변이된 형태를 갖는 것으로 발견되었다 (Stengaard-Pedersen et al, N Engl J Med 349:554-560 (2003)). 몇몇 조사관은 MBL의 결핍이 소아의 빈번한 감염 (Super et al, Lancet 2: 1236-1239 (1989); Garred et al, Lancet 346:941-943 (1995)) 및 HIV 감염에 대하여 감소된 저항성 (Nielsen et al., Clin Exp Immunol 100:219-222 (1995); Garred et al, Mol Immunol 33 (suppl 1):8 (1996))의 경향으로 이어진다는 것을 결정하였다. 하지만, 다른 연구는 낮은 MBL 수준의 증가된 감염과의 유의한 연관성을 입증하지 않았다 (Egli et al, PLoS One. 8(1):e51983(2013); Ruskamp et al, J Infect Dis. 198(11): 1707-13 (2008); Israels et al, Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 95(6):F452-61 (2010)). 문헌이 혼동되는 한편, MASP의 결핍, 또는 비-활용은 즉시 증가하는 하는 개인의 능력에 대한 역효과, 특정 병원체에 대한 비-항체-의존적 방어를 가질 수도 있다.
iii. 새로운 이해를 위한 데이터의 지지, Ca ++ 가 전혀 없는 강조된 전통적 검정 조건 및 Ca ++ 를 포함하는 조건의 더 생리학적인 설정을 사용하여 얻은 결과
여러 독립적인 방면의 강력한 실험적 증거가 본원에서 제공되며, 보체의 렉틴 경로 활성화가 두 개의 독립적인 효과기 메커니즘을 통해 보체를 활성화시킨다는 결론을 가리킨다: i) LEA-2: 보체-구동된 옵소닌화, 주화성(chemotaxis) (Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011)), 및 세포 용해를 매개하는 MASP-2-구동된 경로, 및 ii) LEA-1: 활성화제 표면에서 인자 B의 분할 및 활성화를 통해 대체 경로 컨버타제 C3bBb를 생성함으로써 보체 활성화를 시작하는 새로운 MASP-3-의존적 활성화 루트로서, 대체 경로 컨버타제 C3bBb의 C3b 침착 및 형성에 촉매 작용할 것이고, 세포 용해뿐만 아니라 미생물의 옵소닌화를 일으킬 수 있는 활성화 루트. 게다가, 본원에서 설명된 바와 같이, MASP-1, MASP-3, 또는 HTRA-1, 또는 어떤 세 개의 조합에 의한 인자 B 및/또는 인자 D의 별개의 렉틴-독립적 활성화는 또한 대체 경로를 통한 보체 활성화로 이어질 수 있다.
대체 경로의 렉틴 경로-의존적 MASP-3-구동된 활성화는 세포 표면에서 C5b-9 막 공격 복합체(MAC)의 형성을 통해 박테리아 세포를 용해하기 위한 말단 활성화 캐스케이드를 통해 보체-의존적 용해에 대한 최적의 활성화 비율을 달성하기 위해 C3b-결합된 인자 B의 잘-확립된 인자 D-매개된 분할에 기여하는 것으로 나타난다 (도 14-15). 이 비율-제한된 사건은 MASP-3 기능적 활성의 부재시뿐만 아니라 인자 D 기능적 활성의 부재시 결함이 되기 때문에 최적의 조정을 필요로 하는 것으로 나타난다. 본원에서 실시예 1-4에서 설명된 바와 같이, 발명자들은 네이세리아 메닝기티디스 감염의 실험적 마우스 모델에서 MASP-2 결핍 및 MASP-2 억제의 표현형을 연구할 때 이 MASP-3-의존적 렉틴 경로가 기능적이라는 것을 발견하였다. 유전자-표적화된, MASP-2-결핍 마우스 및 항체-기반 MASP-2 억제자가 처리된 야생형 마우스는 실험적 네이세리아 메닝기티디스 감염에 대하여 매우 저항성이었다 (도 8-12 참조). 감염 용량이 야생형 한 배 새끼에서 대략 60% 치사율을 제공하도록 조정될 때, MASP-2-결핍 또는 MASP-2-고갈된 마우스 모두는 감염을 제거하였고 생존하였다 (도 8 및 도 12 참조). 이 극도로 높은 정도의 저항성은 MASP-2-결핍 또는 MASP-2-고갈된 마우스 혈청에서 혈청 살균 활성의 큰 증가에서 반영되었다. 추가의 실험은 이 살균 활성이 대체 경로-구동된 박테리아 용해에 의존적이라는 것을 나타냈다. 인자 B, 또는 인자 D, 또는 C3이 결핍된 마우스 혈청은 네이세리아 메닝기티디스에 대한 살균 활성을 나타내지 않았으며, 대체 경로가 말단 활성화 캐스케이드를 구동하는데 필수적이라는 것을 지시한다. MBL-A 및 MBL-C (둘 다 네이세리아 메닝기티디스를 인식하는 렉틴-경로 인식 분자임)가 결핍된 마우스 혈청뿐만 아니라 렉틴 경로-관련 세린 프로테아제 MASP-1 및 MASP-3가 결핍된 마우스 혈청이 네이세리아 메닝기티디스에 대한 모든 용균 활성을 잃어버렸다는 것은 놀라운 결과이다 (도 15). 최근 문서 (Takahashi M. et al, JEM 207: 29-37 (2010)) 및 본원에서 제공된 저작물 (도 39)은 MASP-1이 인자 D의 치모겐 형태를 그것의 효소에 의한 활성 형태로 전환시킬 수 있고 이 혈청들에서 효소에 의한 활성 인자 D의 부재를 통해 용해 활성의 손실을 부분적으로 설명할 수도 있다. 이것은 MBL-결핍 마우스에서 살균 활성의 결핍을 설명하지 않는데 이 마우스들이 정상적인 효소에 의한 활성 인자 D를 갖기 때문이다 (Banda et al., Mol Imunol 49(1-2):281-9 (2011)). 놀랍게도, MASP-3의 세린 프로테아제 도메인이 제대로 기능하지 않게 하는 돌연변이와 함께 희귀한 3MC 상염색체 열성 질환 (Rooryck C, et al, Nat Genet. 43(3): 197-203)에 걸린 환자의 인간 혈청을 테스트할 때, 네이세리아 메닝기티디스에 대한 살균 활성이 검출되지 않았다 (주의: 이 혈청들은 MASP-1 및 인자 D를 갖지만, MASP-3은 아니다). 인간 혈청이 살균 활성을 발달시키기 위해 렉틴 경로-매개된 MASP-3-의존적 활성을 필요로 한다는 가설은 MBL-결핍 인간 혈청이 또한 네이세리아 메닝기티디스를 용해시키는데 실패한다는 관찰에 의해 더 지지된다 (도 13-14). MBL은 이 병원체에 결합하는 유일한 인간 렉틴-경로 인식 분자이다. MASP-3이 자가활성화하지 않기 때문에, 발명자들은, MASP-2의 부재시, 박테리아 표면에 결합하는 모든 렉틴-경로 활성화 복합체는 MASP-1 또는 MASP-3이 로딩될 것이기 때문에, MASP-2-결핍 혈청에서 더 높은 용균 활성이 MASP-1을 통한 MASP-3의 선호되는 활성화에 의해 설명될 수 있다고 가정한다. 인자 D (도 39) 및 인자 B 둘 다를 분할하여 시험관 내에서 각각의 효소에 의한 활성 형태를 발생시키기 때문에 (도 37 및 Iwaki D., et al, J. Immunol. 187(7):3751-3758 (2011)), 가장 가능성이 큰 MASP-3의 기능은 대체 경로 C3 컨버타제 (즉, C3bBb)의 형성을 용이하게 하는 것이다.
렉틴-의존적 역할에 대한 데이터가 설득력 있는 한편, 다수의 실험은 MASP-3 및 MASP-1이 반드시 렉틴 분자를 갖는 복합체에서 기능하도록 강요되지 않는다는 것을 제안한다. 도 35B에서 나타난 바와 같은 실험은 렉틴을 갖는 복합체가 존재하지 않는 조건 (즉, EGTA의 부재) 하에서 대체 경로를 활성화시키는 MASP-3의 능력을 입증한다 (스타필로코쿠스 아우레우스에서 C3b 침착에 의해 입증된 바와 같음). 도 35A는 침착이 이 조건들 하에서 인자 B, 인자 D, 및 인자 P, 대체 경로의 모든 중요한 구성요소에 의존적이라는 것을 입증한다. 추가적으로, MASP-3 및 MASP-1에 의한 인자 D 활성화 (도 39), 및 MASP-3에 의한 인자 B 활성화 (도 37)는 시험관 내에서 렉틴의 부재시 발생할 수 있다. 마지막으로, 인간 혈청의 존재시 마우스 적혈구의 용혈 연구는 세포 용해에 대하여 MBL 및 MASP-3 둘 다에 대한 분명한 역할을 입증한다. 하지만, MBL의 결핍은 MASP-3의 결핍의 심각성을 완벽히 재현하지 않으며, 모든 기능적 MASP-3이 MBL과 함께 복합체를 형성하는지 예상되는 것과 반대이다. 따라서, 발명자들은 본원에서 입증된 MASP-3 (및 MASP-1)의 역할 모두가 렉틴과 연관된 기능에 단독으로 기인할 수 있다는 개념에 의해 강요되기를 희망하지 않는다.
렉틴 경로의 두 개의 효과기 팔의 확인, 뿐만 아니라 MASP-1, MASP-3, 및 HTRA-1의 가능한 렉틴-독립적 기능은 미생물의 병원체 또는 변화된 숙주 세포 또는 대사산물 침착의 존재시 과도한 보체 활성화에 의해 유발된 효율적으로 치료 정의된 인간 병리학에 대한 치료적 간섭을 위한 새로운 기회를 나타낸다. 본원에서 설명된 바와 같이, 발명자들은 현재 MASP-3의 부재시 및 MASP-1의 부재시, 대체 경로는 표면 구조에서 활성화되지 않는다는 것을 발견하였다 (도 17-18, 35B, 41-42, 45-46). 대체 경로는 박테리아 용해뿐만 아니라 세포 용해로 이어지는 비율-지한 사건을 구동하는데 있어서 중요하기 때문에 (Mathieson PW, et al, J Exp Med 177(6): 1827-3 (1993)), 우리의 결과는 활성화된 MASP-3이 보체의 용해 활성에서 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였다. 도 14-15, 21-23, 43-44, 및 46-47에서 나타난 바와 같이, MASP-3이 결핍되지만 MASP-1은 아닌 3MC 환자의 혈청에서, 보체의 용해성 말단 활성화 캐스케이드는 결함이 있다. 도 14 및 15에서 나타난 데이터는 MASP-3 및/또는 MASP-1/MASP-3 기능적 활성의 부재시 용균 활성의 손실을 입증한다. 유사하게는, MASP-3-결핍 인간 혈청에서 용혈 활성의 손실 (도 21-23, 43-44 및 46-47)은 재조합 MASP-3을 추가함으로써 용혈을 재구성하는 능력과 결합되며 (도 46-47), 표적 표면에서 대체 경로의 활성화 (보체-매개된 용해를 구동하는데 필수적임)가 활성화된 MASP-3의 존재에 의존적이라는 결론을 강력하게 지지한다. 상기 상세히 설명된 렉틴 경로의 새로운 이해에 기초하여, 표적 표면의 대체 경로 활성화는 따라서 LEA-1, 및/또는 인자 B 및/또는 인자 D의 렉틴-독립적 활성화에 의존적이며, 이것은 또한 MASP-3에 의해 매개되고, 그러므로, MASP-3-의존적 보체 활성화를 차단하는 약제는 표적 표면엣 대체 경로 활성화를 방지할 것이다.
대체 경로 활성화의 MASP-3-의존적 시작의 기본적인 역할의 개시는 대체 경로는 기본적으로 모든 현행 의학 교과서 및 보체에 대한 최근 재검토 논문에서 설명된 바와 같이 보체 활성화의 독립적, 스탠드-얼론(stand-alone) 경로가 아니라는 것을 나타낸다. 현재 및 널리 받아들여진 과학적 견해는 대체 경로는 자발적 "틱-오버" C3 활성화의 증폭을 통해 특정 미립자 표적 (미생물, 치모산, 및 토끼 적혈구)의 표면에서 활성화된다는 것이다. 하지만, 치모산-코팅된 플레이트 및 두 개의 다른 박테리아 (네이세리아 메닝기티디스 및 스타필로코쿠스 아우레우스)에서 MASP-1 및 MASP-3 이중-결핍 마우스의 혈청 및 인간 3MC 환자 혈청에서 어떤 대체 경로 활성화의 부재 및 인간 및 마우스의 MASP-3-결핍 혈청에서 적혈구의 용혈의 감소는 이 표면들에서 대체 경로 활성화의 시작은 기능적 MASP-3을 필요로 한다는 것을 지시한다. MASP-3에 대한 필수적인 역할은 렉틴-의존적 또는 -독립적일 수도 있으며, 각각 대체 경로 C3 컨버타제 및 C5 컨버타제 복합체, 즉, C3bBb 및 C3bBb(C3b)n의 형성으로 이어진다. 따라서, 발명자들은 대체 경로에 대한 이전의 애매한 시작 루트의 존재를 본원에서 개시한다. 이 시작 루트는 (i) LEA-1, 렉틴 경로의 새로 발견된 활성화 팔, 및/또는 (ii) 단백질 MASP-3, MASP-1, 및 HTRA-1의 렉틴-독립적 역할에 의존적이다.
III. 발작성 야간혈색뇨증에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
i. PNH의 개요
때때로 마르키아파바-미첼리 증후군(Marchiafava-Micheli syndrome)으로도 불리는 발작성 야간혈색뇨증 (PNH)은 후천적인, 잠재적으로 생명을 위협하는 혈액 질환이다. PNH는 자체적으로 발달할 수도 있으며, "1차 PNH"로 불리거나 또는 무형성 빈혈(aplastic anemia)과 같이 다른 골수 질환의 맥락에서 발달할 수도 있으며, "2차 PNH"로 불린다. 대부분의 경우는 1차 PNH이다. PNH는 적혈구 세포의 보체-유발된 파괴 (용혈), 낮은 적혈구 세포 계수 (빈혈증(anemia)), 혈전증(thrombosis) 및 골수 부전(bone marrow failure)을 특징으로 한다. PNH의 검사 소견은, 가능한 원인으로서 자가반응성 RBC-결합 항체의 부재시, 혈관 내 용혈성 빈혈증: 낮은 헤모글로빈, 높은 락테이트 데히드로게나제, 높은 망상적혈구 계수 (파괴된 세포를 대체하기 위해 골수에 의해 방출된 미성숙한 적혈구), 높은 빌리루빈 (헤모글로빈의 붕괴 생성물)과 일치하는 변화를 나타낸다.
PNH의 특징은 순환 RBC의 표면에서, 막 공격 복합체를 포함하는, 말단 보체 성분의 제어되지 않는 활성화에 의해 유발된 만성 보체-매개된 용혈이다. PNH RBC는 그것들의 표면에서 보체 조절기 CD55 및 CD59의 부재로 인한 제어되지 않는 보체 활성화 및 용혈을 받는다 (Lindorfer, M.A., et al, Blood 115(11):2283-91 (2010), Risitano, et al, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011)). CD55 및 CD59는 정상 RBC에서 풍부하게 발현되고 보체 활성화를 제어한다. CD55는 대체 경로의 음성 조절기로서 작용하며, 대체 경로 C3 컨버타제 (C3bBb) 복합체의 조립을 억제하고, 미리 형성된 컨버타제의 붕괴를 가속화하며, 따라서 막 공격 복합체 (MAC)의 형성을 차단한다. CD59는 C5b678 복합체에 결합하여 C9를 결합 및 폴리머화로부터 방지함으로써 직접적으로 보체 막 공격 복합체를 억제한다.
용혈 및 빈혈증이 PNH의 우세한 임상 소견인 한편, 질환은 임상적 발견의 일부로서 혈전증 및 골수 부전을 더 포함하는, 복합성 혈액학적 장애이다 (Risitano et al, Mini Reviews in Med Cheml l:528-535 (2011)). 분자 수준에서, PNH는 기능적 PIG A 유전자가 결핍된 조혈모세포의 비정상 클론 확장에 의해 유발된다. PIG A는 GPI-고정된 등급 A 당단백질의 안정한 표면 발현에 필요한 글리코실-포스파티딜 이노시톨 트랜스퍼라제를 암호화하는, X-결합된 유전자이며, CD55 및 CD59를 포함한다. 현재 조사중인 이유로, 자발적 체세포 돌연변이의 결과로서 발생하는, 제대로 기능하지 않는 PIG A 유전자를 갖는 조혈모세포는 그것들의 자손이 상당 부분의 말초 조혈 세포 풀(pool)을 구성하는 지점으로 클론 확장을 경험할 수 있다. 돌연변이 줄기 세포 클론의 적혈구 및 림프구 자손 둘 다는 CD55 및 CD59가 결핍되는 한편, RBC만이 그것들이 순환에 진입한 후에 명백한 용해를 경험한다.
PNH에 대한 현재의 치료는 빈혈증에 대해 혈액 수혈, 혈전증에 대해 항응고 및 단클론성 항체 에쿨리쥬맙 (Soliris®)의 사용을 포함하며, 이것은 보체 시스템을 억제함으로써 면역 파괴에 대하여 혈액 세포를 보호한다 (Hillmen P. et al, N. Engl. J. Med. 350(6):552-559 (2004)). 에쿨리쥬맙 (Soliris®)은 보체 성분 C5를 표적화하는 인간화된 단클론성 항체이며, C5 컨버타제에 의해 그것의 분할을 차단하고, 이로 인해 C5a의 생산 및 MAC의 조립을 방지한다. PNH 환자의 에쿨리쥬맙으로 치료는 락테이트 데히드로게나제 (LDH)에 의해 측정된 바와 같이, 혈관 내 용혈의 감소를 일으키며, 환자의 약 절반에서 헤모글로빈 안정화 및 수혈 독립으로 이어진다 (Risitano et al, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11(6) (2011)). 에쿨리쥬맙 치료를 경험하는 거의 모든 환자가 정상 또는 거의 정상 LDH 수준을 달성하는 한편 (혈관 내 용혈의 제어로 인해), 환자 중 약 3분의 1만이 약 11 gr/dL의 헤모글로빈 값에 도달하고, 에쿨리쥬맙에 대한 나머지 환자들은, 거의 같은 비율로, 중간 내지 극심한 (즉, 수혈-의존적) 빈혈증을 계속해서 나타낸다 (Risitano A.M. et al, Blood 113:4094-100 (2009)). Risitano et al, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011)에서 설명된 바와 같이, 에쿨리쥬맙에 대한 PNH 환자는 PNH 적혈구에 결합된 많은 양의 C3 단편을 얻는다는 것이 입증되었다 (한편 치료되지 않은 환자는 아니다). 이 발견은 Soliris 처리된 PNH 환자에서, C5 차단으로 인해 더 이상 용혈되지 않는 PNH RBC는 엄청난 양의 막-결합된 C3 단편을 축적할 수 있으며, 이것은 옵소닌으로서 작동하고, 특이적 C3 수용체 및 그 이후의 혈관 외 용혈을 통해 세망내피계 세포에서 그것들의 포획을 일으킨다는 인식으로 이어진다. 따라서, 혈관 내 용혈 및 결과적인 후유증을 방지하는 한편, 에쿨리쥬맙 치료는 이 RBC의 성향을 혈관 내에서 혈관 외 용혈로 간단하게 전환시키며, 많은 환자에서 실질적으로 나머지 치료되지 않은 빈혈증을 일으킨다 (Risitano A.M. et al, Blood 113:4094-100 (2009)). 그러므로, 에쿨리쥬맙의 사용 이외의 치료적 범주가 C3-단편-매개된 혈관 외 용혈에 걸린 상기 환자들에게 필요한데, 그것들은 적혈구 세포 수혈을 계속해서 필요로 하기 때문이다. 이러한 C3 단편을 표적화하는 접근법은 실험적 시스템의 유용성을 입증하였다 (Lindorfer et al., Blood 115:2283-91, 2010).
ii. PNH의 보체-시작 메커니즘
PNH에서 음성 보체 조절기 CD55 및 CD59의 결함성 표면 발현 사이의 가벼운 결합은, 혈관 내 용혈을 방지하는데 있어서 에쿨리쥬맙의 효과와 결합되며, PNH를 보체 시스템에 의해 매개된 조건으로서 명백하게 정의한다. 이 패러다임이 널리 수용되는 한편, 보체 활성화를 시작하는 사건, 및 수반된 보체 활성화 경로(들)의 성질은 해결되지 않은 채로 남아있다. CD55 및 CD59가 모든 보체 시작 경로에 공통적인 보체 캐스케이드에서 말단 증폭 단계를 부정적으로 조절하기 때문에, 이 분자들의 결핍은, 보체 활성화가 렉틴 경로에 의해, 고전적 경로에 의해 또는 대체 경로의 자발적 턴오버에 의해 시작되는지에 상관없이, 막 공격 복합체의 지나친 형성 및 막 통합으로 이어질 것이다. 따라서, PNH 환자에서 RBC 표면상에서 C3b 침착으로 이어지는 어떤 보체 활성화 사건도 이후의 증폭 및 병리학적 (혈관 내 및/또는 혈관 외) 용혈을 촉발할 수 있고 용혈성 위기를 재촉할 수 있다. PNH 환자에서 용혈성 위기를 촉발시키는 분자적 사건의 분명한 기계적 이해는 애매하게 남아있다. 보체 시작 사건이 용혈성 위기를 경험한 PNH 환자에서 명백하게 분명하지 않기 때문에, PNH에서 보체 활성화가 대체 경로의 낮은 수준 "틱-오버" 활성화 때문에 자발적으로 발생할 수도 있다는 것이 우세한 견해이며, 이것은 이후에 CD55 및 CD59의 결핍으로 인한 말단 보체 활성화의 부적절한 제어에 의해 확대된다.
하지만, 그것의 자연사에서, PNH는 보통 감염 또는 부상과 같은 특정 사건 이후 발달하거나 약화된다는 것에 주목하는 것이 중요하며 (Risitano, Biologies 2:205-222 (2008)), 이것은 보체 활성화를 촉발하는 것으로 나타났다. 이 보체 활성화 반응은 선동 병원체에 대한 숙주의 이전 면역력에 의존적이지 않고, 및 이런 이유로 고전적 경로를 수반하지 않을 가능성이 크다. 오히려, 이 보체 활성화 반응이 외부 또는 미생물 약제 또는 손상된 숙주 조직의 표면상에서 발현된 "변화된 자체" 탄수화물 패턴에 결합하는 렉틴에 의해 시작된다는 것이 나타난다. 따라서, PNH에서 용혈성 위기를 재촉하는 사건은 렉틴을 통해 개시된 보체 활성화에 밀접하게 관련된다.
분자적 수준에서 활성화 캐스케이드를 분석하기 위한 실험 모델로서 렉틴을 통해 보체를 활성화시키는 잘-정의된 병원체를 사용하여, 발명자들은 선동하는 미생물에 의존적으로, 보체 활성화는 LEA-2 또는 LEA-1에 의해 시작될 수 있고, 옵소닌화 및/또는 용해로 이어질 수 있다는 것을 입증한다. 렉틴 시작 사건에 대한 이중 반응 (즉, 옵소닌화 및/또는 용해)의 이 같은 원칙은 또한 다른 타입의 감염원, 또는 숙주에 대한 조직 부상 후 렉틴에 의한 보체 활성화, 또는 PNH를 재촉할 수도 있는 다른 렉틴-구동된 보체 활성화 사건에 적용될 가능성이 클 것이다. 렉틴 경로에서 이 이중성에 기초하여, 발명자들은 PNH 환자에서 LEA-2- 및/또는 LEA-1-시작된 보체 활성화가 C3b로 RBC의 옵소닌화 및/또는 용해 및 그 다음의 혈관 외 및 혈관 내 용혈을 촉진한다는 것을 추론한다. 그러므로, PNH의 설정에서, LEA-1 및 LEA-2 둘 다의 억제는 혈관 내 및 혈관 외 용혈 둘 다를 지시하는 것으로 예측되며, C5 억제자 에쿨리쥬맙을 통해 상당한 이점을 제공한다.
스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 노출은 우선적으로 LEA-2의 렉틴-의존적 활성화를 촉발하며, 이것은 C3b로 이 미생물의 옵소닌화로 이어진다는 것이 결정되었다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애가 MAC-매개된 용해에 저항성이기 때문에, 순환으로부터 그것의 제거는 C3b로의 옵소닌화를 통해 발생한다. 이 옵소닌화 및 그 후 순환으로부터의 제거는 LEA-2-의존적이며, MASP-2-결핍 마우스 및 MASP-2 단클론성 항체가 처리된 마우스에서 면역반응이 제대로 발휘되지 않는 박테리아 제어에 의해 지시된 바와 같다 (PLOS Pathog., 8: e1002793. (2012)).
미생물제에 대한 선천적 숙주 반응에서 LEA-2의 역할을 탐구하는데 있어서, 발명자들은 추가적인 병원체를 테스트하였다. 네이세리아 메닝기티디스가 모델 유기체로서 연구되었을 때 극적으로 다른 결과가 관찰되었다. 네이세리아 메닝기티디스는 또한 렉틴을 통해 보체를 활성화하고, 보체 활성화는 나이브(naive) 숙주에서 네이세리아 메닝기티디스 감염의 억제에 필요하다. 하지만, LEA-2는 이 반응에는 숙주 보호 기능 역할을 하지 않는다: 도 8 및 9에서 나타난 바와 같이, MASP-2의 유전적 절제를 통한 LEA-2의 차단은 네이세리아 메닝기티디스로 감염 후 생존율을 감소시키지 않는다. 반대로, MASP-2 절제에 의한 LEA-2 차단은 이 연구들에서 생존율 (도 8 및 9)뿐만 아니라 질병 점수 (도 11)를 크게 개선하였다. MASP-2 항체의 투여에 의한 LEA-2 차단은 같은 결과를 수득하였으며 (도 12), 넉아웃-마우스 계통에서 가능한 원인으로서 2차적 또는 보상적 효과를 제거하였다. LEA-2-절제된 동물에서 이 바람직한 결과들은 혈액으로부터 네이세리아 메닝기티디스의 더 신속한 제거와 연관된 것이었다 (도 10). 또한, 본원에서 설명된 바와 같이, 정상 인간 혈청과 함께 네이세리아 메닝기티디스의 배양은 네이세리아 메닝기티디스를 살해하였다 (도 13). LEA-2를 차단하는 인간 MASP-2에 특이적인 기능적 단클론성 항체의 추가는 살해 반응을 향상시킬 수도 있지만, 이소타입 대조군 단클론성 항체의 투여는 아니다. 하지만, 이 과정은, MBL-결핍 인간 혈청 또는 열-비활성화된 인간 혈청이 네이세리아 메닝기티디스를 살해할 수 없었기 때문에, 렉틴 및 적어도 부분적으로는 기능적 보체 시스템에 의존적이다 (도 13). 종합해보면, 이 새로운 발견은 네이세리아 메닝기티디스 감염이 기능적 보체 시스템의 존재시 보체 활성화의 렉틴-의존적이지만 LEA-2 독립적 경로에 의해 제어된다는 것을 제안한다.
LEA-1이 네이세리아 메닝기티디스의 렉틴-의존적 살해의 원인이 되는 보체 경로일 수도 있다는 가정은 3MC 환자로부터 혈청 견본을 사용하여 테스트되었다. 이 환자는 MASP-1/3 유전자의 엑손 12에서 넌센스(nonsense) 돌연변이에 대하여 동형 접합성이다. 결과로서, 이 환자는 기능적 MASP-3 단백질이 결핍되었지만, 그렇지 않은 보체는 충분하였다 (엑손 12는 MASP-3 전사물에 특이적이다; 돌연변이는 MASP-1 기능 또는 발현 수준에 대하여 아무런 효과도 없다) (Nat Genet 43(3): 197-203 (2011) 참조). 정상 인간 혈청은 네이세리아 메닝기티디스를 효율적으로 살해하지만, MBL에서 결핍된 열-불활성화된 혈청 (렉틴 경로에 대한 인식 분자 중 하나) 및 MASP-3-결핍 혈청은 네이세리아 메닝기티디스를 살해할 수 없었다 (도 14). 따라서, LEA-1은 네이세리아 메닝기티디스 살해를 매개하는 것으로 나타난다. 이 발견은 넉아웃 마우스 계통의 혈청 샘플을 사용하여 확인되었다. 정상 마우스 혈청을 함유하는 보체는 네이세리아 메닝기티디스를 쉽게 살해하는 한편, MBL-결핍 또는 MASP-1/3-결핍 마우스 혈청은 기능적 보체가 결핍된 열-불활성화된 혈청만큼 효과가 없었다 (도 15). 반대로, MASP-2-결핍 혈청은 네이세리아 메닝기티디스의 효율적인 살해를 나타냈다.
이 발견은 렉틴-의존적 보체 활성화의 별개의 LEA-2 및 LEA-1 경로의 존재를 나타냄으로써 렉틴 경로의 지금까지 알려져 있지 않았던 이중성에 대한 증거를 제공한다. 상기 상세히 설명된 예에서, LEA-2 및 LEA-1은 비-환원성이고, 별개의, 기능적 결과를 매개한다. 데이터는 특정 타입의 렉틴 경로 활성화제 (스트렙토코쿠스 뉴모니애를 포함하지만, 이에 제한되지 않음)가 옵소닌화로 이어지는, LEA-2를 통한 보체 활성화를 우선적으로 시작하는 한편, 다른 것 (네이세리아 메닝기티디스에 의해 예시됨)은 LEA-1을 통한 보체 활성화를 우선적으로 시작하고 세포 용해 과정을 촉진한다는 것을 제안한다. 하지만, 데이터는 반드시 LEA-2를 옵소닌화로 및 LEA-1을 세포 용해 과정으로 제한하는 것은 아닌데, 두 경로가 다른 설정에서 옵소닌화 및/또는 용해를 매개할 수 있기 때문이다.
네이세리아 메닝기티디스에 의한 렉틴-의존적 보체 활성화의 맥락에서, LEA-2 및 LEA-1 팔은 서로 경쟁하는 것으로 나타나는데, LEA-2의 차단이 시험관 내에서 유기체의 LEA-1-의존적 용해성 파괴를 향상시켰기 때문이다 (도 15). 상기 설명된 바와 같이, 이 발견은 MASP-2의 부재시 렉틴 MASP-3 복합체 가까이에 있을 렉틴 MASP-1 복합체의 증가된 가능성에 의해 설명될 수 있으며, 이것은 LEA-1 활성화를 향상시킬 것이고 따라서 네이세리아 메닝기티디스의 더 효과적인 용해를 촉진한다. 네이세리아 메닝기티디스의 용해는 나이브 숙주에서 주요 보호 메커니즘이기 때문에, LEA-2의 차단은 생체 내에서 네이세리아 메닝기티디스 제거를 증가시키고 향상된 살해로 이어진다.
상기 논의된 예들이 네이세리아 메닝기티디스로 감염 이후의 결과에 관하여 LEA-2 및 LEA-1의 다른 효과를 도시하는 한편, LEA-2 및 LEA-1 둘 다가 상승 작용하여 특정 결과를 생산하는 다른 설정이 있을 수도 있다.
하기 설명된 바와 같이, PNH에서 존재하는 것들과 같은 렉틴을 통해 병리학적 보체 활성화의 다른 상황에서, LEA-2- 및 LEA-1-구동된 보체 활성화는 PNH의 전체 병리학에 기여하기 위해 상승 작용 방식으로 협력할 수도 있다. 게다가, 본원에서 설명된 바와 같이, MASP-3은 또한 인자 B 및 인자 D의 렉틴-독립적 전환에 기여하며, 이것은 Ca++의 부재시 발생할 수 있고, 보통은 C3bB의 C3bBb로의 및 프로-인자 D의 인자 D로의 전환으로 이어지며, 이것은 PNH의 병리학에 더 기여할 수도 있다.
iii. PNH에서 생물학 및 예상된 기능적 활성
이 섹션은 PNH의 시험관 내 모델에서 용혈에 대한 LEA-2 및 LEA-1 차단의 억제 효과를 설명한다. 발견은 PNH의 하나 이상의 양태로 고통받는 환자를 치료하기 위한 LEA-2-차단제 (MASP-2에 결합하여 이의 기능을 차단하는 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않음) 및 LEA-1-차단제 (MASP-3에 결합하여 MASP-3의 MASP-1-매개된 활성화, MASP-3, 또는 둘 다의 기능을 억제하는 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 및 또한 에쿨리쥬맙과 같은 C5-억제자 치료를 경험하고 있는 PNH 환자에서 C3-단편-매개된 혈관 외 용혈의 효과를 개선하기 위한 LEA-2 및/또는 LEA-1, 및/또는 MASP-3-의존적, 렉틴-독립적 보체 활성화의 억제자 (MASP-2 억제자, MASP-3 억제자, 및 이중- 또는 이중 특이적 MASP-2/MASP-3 또는 MASP-1/MASP-2 억제자, 및 전체-특이적 MASP-1/MASP-2/MASP-3 억제자를 포함)의 사용을 지지한다.
iv. 세망내피계를 통한 PNH RBC의 옵소닌화 및 혈관 외 용혈을 차단하기 위한 MASP-2 억제자
상기 상세히 설명된 바와 같이, PNH 환자는 순환으로부터 RBC 제거의 두 개의 별개의 메커니즘 때문에 빈혈이 된다: 막 공격 복합체 (MAC)의 활성화를 통한 혈관 내 용혈, 및 C3b로 옵소닌화 후 혈관 외 용혈 및 그 다음 보체 수용체 결합 후 제거 및 세망내피계에 의한 흡수. 혈관 내 용혈은 환자가 에쿨리쥬맙으로 치료될 때 크게 방지된다. 에쿨리쥬맙이 보체-시작 활성화 사건뿐만 아니라 뒤이은 옵소닌화 둘 다의 다운스트림에서 발생하는 말단 용해성 효과기 메커니즘을 차단하기 때문에, 에쿨리쥬맙은 혈관 외 용혈을 차단하지 않는다 (Risitano A.M. et al, Blood 113:4094-100 (2009)). 대신에, 치료되지 않은 PNH 환자에서 용혈을 경험한 RBC는 이제 그것들의 표면에 활성화된 C3b 단백질을 축적할 수 있으며, 이것은 세망내피계에 의한 흡수를 증가시키고 그것들의 혈관 외 용혈을 향상시킨다. 따라서, 에쿨리쥬맙 치료는 RBC 성향을 혈관 내 용혈에서 잠재적 혈관 외 용혈로 효과적으로 전환한다. 결과로서, 일부 에쿨리쥬맙-치료된 PNH 환자는 빈혈인 채로 남아있다. 다음과 같이 보체 활성화 업스트림을 차단하고 PNH RBC의 옵소닌화를 방지하는 약제는 가끔 에쿨리쥬맙과 함께 나타나는 혈관 외 용혈을 차단하는데 특히 적합할 수도 있다.
본원에서 제공된 미생물의 데이터는 LEA-2가 종종 렉틴-의존적 옵소닌화에 대하여 우세한 루트라는 것을 제안한다. 게다가, 렉틴-의존적 옵소닌화 (C3b 침착으로 측정됨)는 세 개의 원형 렉틴 활성화 표면에서 평가되었고 (만난, 도 19A; 치모산, 도 19B, 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애; 도 19C), LEA-2는 생리학적 조건 하에 렉틴-의존적 옵소닌화에 대하여 우세한 루트인 것으로 나타난다 (즉, Ca++의 존재시, 모든 보체 경로가 작동하는 것을 특징으로 한다). 이 실험 조건 하에서, MASP-2-결핍 혈청 (LEA-2가 결핍됨)은 테스트 표면의 옵소닌화에 있어서 WT 혈청보다 실질적으로 덜 효과적이다. MASP-1/3-결핍 혈청 (LEA-1이 결핍됨)이 또한 손상되지만, 이 효과는 LEA-2가 결핍된 혈청과 비교하여 훨씬 덜 두드러진다. LEA-2 및 LEA-1의 렉틴-구동된 옵소닌화로의 기여의 상대적인 규모는 도 20A-20C에서 더 예시된다. 보체의 대체 경로는 렉틴 경로 또는 고전적 경로의 부재시 렉틴 활성화 표면의 옵소닌화를 지지하는 것으로 보고되는 한편 (Selander et al., J Clin Invest 116(5): 1425-1434 (2006)), 대체 경로는 별개로 (Ca++이 없는 검정 조건 하에서 측정됨) 본원에서 설명된 LEA-2- 및 LEA-1-시작된 과정보다 실질적으로 덜 효과적인 것으로 나타난다. 추정에 의해, 이 데이터들은 PNH RBC의 옵소닌화가 또한, 렉틴-독립적 대체 경로 활성화의 결과 대신에, LEA-2에 의해 및, 더 적은 정도로, LEA-1에 의해 우선적으로 시작된다는 것을 제안한다 (대체 경로 증폭 루프에 의해 가능하게 증폭됨). 그러므로, LEA-2 억제자는 PNH에서 옵소닌화의 제한 및 혈관 외 용혈의 방지에 가장 효율적인 것으로 예상될 수도 있다. 하지만, MBL 이외의 렉틴, 예를 들어, 피콜린은 아세틸화된 단백질과 같은 비-탄수화물 구조에 결합하고, MASP-3은 H-피콜린과 우선적으로 결합한다 (Skjoedt et al., Immunobiol. 215:921-931, 2010)는 사실의 인식은 PNH-관련 RBC 옵소닌화에서 LEA-1에 대한 중요한 역할의 가능성을 또한 열어두었다. 그러므로, LEA-1 억제자는 추가적인 항-옵소닌화 효과를 갖는 것으로 예상되고, PNH 환자에서 LEA-1 및 LEA-2 억제자의 조합이 최적이며 옵소닌화 및 혈관 외 용혈을 제한하는데 있어서 가장 강력한 치료 이익을 매개하는 것으로 예상된다. 이 개념은 도 28에서 나타난 옵소닌화 데이터에 의해 더 지지된다: 인자 D-결핍 마우스 혈청 (이것은 유체 단계에서 대체 경로를 활성화시키는 능력이 부족하지만 기능적 고전적 경로뿐만 아니라 기능적 LEA-1 및 LEA-2 경로를 갖는다)은 WT 혈청과 비교하여 옵소닌화에서 결혼을 나타내지 않는다. LEA-1이 결핍된 인자 B-결핍 혈청은 감소된 옵소닌화를 나타내는 한편 LEA-2-매개된 보체 활성화를 차단하기 위해 MASP-2 단클론성 항체로 치료된 인자 D-결핍 혈청은 옵소닌화의 더 강력한 저해를 수득한다 (도 28). 중요하게는, MASP-2 단클론성 항체의 인자 B-결핍 혈청으로의 추가는 MASP-2 차단 또는 인자 D 차단 단독보다 더 효과적으로 옵소닌화를 저해하였다. 따라서, LEA-2 및 LEA-1은 부가적으로 또는 상승 작용에 의해 작용하여 옵소닌화를 촉진하고, 교차반응성 또는 이중 특이적 LEA-1/LEA-2 억제자는 PNH에서 옵소닌화 및 혈관 외 용혈의 차단에 가장 효과적인 것으로 예상된다.
v. PNH에서 MASP-3 억제자의 역할
PNH의 시험관 내 모델을 사용하여, 발명자들은 PNH에서 보체 활성화 및 결과의 용혈이 실제로 LEA-2 및/또는 LEA-1 활성화에 의해 시작되고, 그것은 대체 경로의 독립적 기능이 아니라는 것을 입증하였다. 이 연구들은 다양한 마우스 계통의 만난-감작 RBC를 사용하였으며, Crry-결핍 마우스 (마우스에서 말단 보체 경로의 중요한 음성 조절기)의 RBC, 뿐만 아니라 CD55/CD59-결핍 마우스 (이것은 PNH 환자에는 없는 같은 보체 조절기가 결핍됨)의 RBC를 포함한다. 만난-감작 Crry-결핍 RBC는 보체-충분한 인간 혈청에 노출되었고, RBC는 3%의 혈청 농도에서 효과적으로 용혈되는 한편 (도 21 및 22) 보체-결핍 혈청 (HI: 열-불활성화됨)은 용혈되지 않다. 현저하게, 보체-충분한 혈청은 LEA-2가 MASP-2 항체의 추가에 의해 차단된 경우 감소된 용혈 활성을 갖고, 6% 혈청이 효과적인 용혈에 필요하였다. CD55/CD59-결핍 RBC가 테스트될 때 유사한 관찰이 이루어졌다 (도 24). MASP-2 단클론성 항체가 보충된 보체-충분한 인간 혈청 (즉, LEA-2가 저해된 혈청)은 용혈을 지지하는데 있어서 치료되지 않은 혈청보다 약 2배 덜 효과적이었다. 게다가, 더 높은 농도의 LEA-2-차단된 혈청 (즉, 항MASP-2 단클론성 항체로 치료됨)은 치료되지 않은 혈청과 비교하여 치료되지 않은 WT RBC의 효과적인 용혈을 촉진하는데 필요하였다 (도 23).
더 놀랍게도, 제대로 기능하지 않는 MASP-3 단백질 (및 이런 이유로 LEA-1이 결핍됨)에 동형 접합성인 3MC 환자의 혈청은 만난-감작 Crry-결핍 RBC를 완전히 용혈시킬 수 없었다 (도 22 및 도 23). 미감작 정상 RBC가 사용되었을 때 유사한 결과가 관찰되었다: 도 23에서 나타난 바와 같이, 3MC 환자로부터 분리된 LEA-1-결여 혈청은 용혈의 매개에서 완전히 비효과적이었다. 종합해보면, 이 데이터들은 LEA-2가 혈관 내 용혈 반응에 상당히 기여를 하는 반면에, LEA-1은 용혈로 이어지는 지배적 보체-시작 경로라는 것을 지시한다. 따라서, PNH 환자에서 LEA-2 차단제는 RBC의 혈관 내 용혈을 상당히 감소시키는 것으로 예상되는 한편, LEA-1 차단제는 더 지대한 효과를 갖고 보체-구동된 용혈을 크게 제거할 것으로 예상된다.
이 연구에서 사용된 LEA-1-결핍 3MC 환자의 혈청이 통상적인 대체 경로 검정 조건 하에서 테스트될 때 감소되지만 기능적인 대체 경로를 소유했다는 것을 주목해야 한다 (도 17). 이 발견은 LEA-1이 PNH의 실험적 설정에서 통상적으로 한정된 바와 같이 대체 경로 활성보다 더 큰 기여를 한다는 것을 제안한다. 추론해보면, LEA-1-차단제는 적어도 PNH 환자에서 혈관 내 용혈을 방지하거나 치료하는데 있어서 대체 경로의 다른 양태를 차단하는 약제만큼 효과적인 것으로 나타난다.
vi. PNH에서 MASP-2 억제자의 역할
본원에서 제공된 데이터는 PNH에서 빈혈에 대한 다음 병원성 메커니즘을 제안한다: 말단 보체 성분의 제어되지 않는 활성화로 인한 혈관 내 용혈 및 MAC의 형성에 의한 RBC의 용해는 LEA-1에 의해, 독점적으로는 아니지만, 대부분 시작되고, C3b에 의한 RBC의 옵소닌화에 의해 유발된 혈관 외 용혈은 LEA-2에 의해 대부분 시작되는 것으로 나타난다. 보체 활성화의 개시 및 MAC 형성 및 용혈의 촉진에 있어서 LEA-2에 대한 식별 가능한 역할은 분명한 한편, 이 과정은 용혈로 이어지는 LEA-1-시작된 보체 활성화보다 실질적으로 덜 효과적인 것으로 나타난다. 따라서, LEA-2-차단제는 PNH 환자에서 혈관 내 용혈을 상당히 감소시키는 것으로 예상되지만, 이 치료적 활성은 단지 부분적인 것으로 예상된다. 비교해 보면, PNH 환자에서 혈관 내 용혈의 더 실질적인 감소는 LEA-1-차단제로 예상된다. PNH에서 빈혈로 이어지는 RBC 파괴의 덜 극적인, 하지만 동등하게 중요한 메커니즘인 혈관 외 용혈은 주로 C3b에 의한 옵소닌화의 결과이며, 이것은 대부분 LEA-2에 의해 매개되는 것으로 나타난다. 따라서, LEA-2-차단제는 PNH에서 RBC 옵소닌화 및 뒤이은 혈관 외 용혈을 우선적으로 차단하는 것으로 예상될 수도 있다. LEA-2-차단제의 이 독특한 치료 활성은 어떤 치료도 이 병원성 과정을 경험한 상기 PNH 환자를 위해 존재하지 않기 때문에 모든 PNH 환자에게 상당한 치료 이익을 제공하는 것으로 예상된다.
vii. LEA-1 억제자 또는 말단 보체 차단제에 대한 보조 치료로서 LEA-2 억제자
본원에서 제공된 데이터는 별개의 등급의 치료제에 의해, 별도로 또는 조합으로, 표적화될 수 있는 PNH에서 RBC 제거 및 빈혈증에 대한 두 개의 병원성 메커니즘을 상세히 설명한다: 혈관 내 용혈은 LEA-1에 의해, 독점적으로는 아니지만, 대부분 시작하였고 따라서 LEA-1-차단제에 의해 효과적으로 방지되는 것으로 예상되며, C3b 옵소닌화로 인한 혈관 외 용혈은 대부분 LEA-2에 의해 구동되고, 따라서 LEA-2-차단제에 의해 효과적으로 방지된다.
용혈의 혈관 내 및 혈관 외 메커니즘 둘 다는 PNH 환자에서 빈혈증으로 이어진다는 것이 잘 기록되어 있다 (Risitano et al, Blood 113:4094-4100 (2009)). 그러므로, 주로 혈관 외 용혈을 방지하는 LEA-2 차단제와 결합하여 혈관 내 용혈을 방지하는 LEA-1-차단제는 PNH 환자에서 발달하는 빈혈을 방지하는데 있어서 약제 단독보다 더 효과적일 것으로 예상된다. 사실은, LEA-1- 및 LEA-2-차단제의 조합은 PNH에서 보체 시작의 모든 관련된 메커니즘을 방지하고 따라서 PNH에서 빈혈증의 모든 증상을 차단할 것으로 예상된다.
또한 C5-차단제 (예를 들어, 에쿨리쥬맙)은 혈관 내 용혈을 효과적으로 차단하지만 옵소닌화를 방해하지 않는다는 것이 알려져 있다. 이것은 일부 항-C5-치료된 PNH 환자를 치료되지 않은 채로 남아있는 LEA-2에 의해 매개된 혈관 외 용혈로 인해 실질적 남은 빈혈증에 걸린 채로 두었다. 그러므로, 혈관 외 용혈을 감소시키는 LEA-2 차단제와 결합하여 혈관 내 용혈을 방지하는 C5-차단제 (예를 들어, 에쿨리쥬맙)는 PNH 환자에서 발달하는 빈혈을 방지하는데 있어서 약제 단독보다 더 효과적일 것으로 예상된다.
C5 활성화 및 MAC 침착으로 이어지는, 보체 시스템의 말단 증폭 루프를 차단하는 다른 약제 (프로퍼딘, 인자 B 또는 인자 D를 차단하고 인자 I, 인자 H 또는 다른 보체 억제 인자의 억제 활성을 향상시키는 약제를 포함하지만, 이에 제한되지 않음)는 또한 혈관 내 용혈을 억제하는 것으로 예상된다. 하지만, 이 약제들은 PNH 환자에서 LEA-2 매개된 옵소닌화를 방해하는 것으로 예상되지는 않는다. 이것은 이러한 약제로 치료된 일부 PNH 환자를 치료되지 않은 채로 남아있는 LEA-2에 의해 매개된 혈관 외 용혈로 인해 실질적 남은 빈혈증에 걸린 채로 두었다. 그러므로, 혈관 외 용혈을 최소화하는 LEA-2 차단제와 결합하여 혈관 내 용혈을 방지하는 이러한 약제 치료는 PNH 환자에서 발달하는 빈혈을 방지하는데 있어서 약제 단독보다 더 효과적일 것으로 예상된다. 사실은, 이러한 약제 및 LEA-2 차단제의 조합은 PNH에서 RBC 파괴의 모든 관련된 메커니즘을 방지하고 따라서 PNH에서 빈혈증의 모든 증상을 차단할 것으로 예상된다.
viii. PNH를 치료하기 위한 LEA-1 및 LEA-2 다중, 이중 특이적 또는 전체-특이적 항체의 사용
상기 상세히 설명된 바와 같이, LEA-1 및 LEA-2를 개별적으로 차단하고, 따라서 혈관 내, 뿐만 아니라 혈관 외 용혈을 매개하는 모든 보체 활성화 사건을 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 PNH 환자에 대하여 최고의 임상적 결과를 제공하는 것으로 예상된다. 이 결과는 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 갖는 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자적 실체물로 결합되고, 결합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는 이러한 실체물은 PNH에서 혈관 내, 뿐만 아니라 혈관 외 용혈을 효과적으로 차단하고 빈혈증을 방지할 것이다. 이러한 실체물은 한 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하고 LEA-2를 줄이며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 더 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 한 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최선으로 한 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하고 LEA-2를 줄이는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 더 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 전체적인 단백질 서열 및 구조의 유사성에 기초하여, 두 개의 동일한 결합 부위를 갖는 통상적인 항체가 기능적 방식으로 MASP-1 및 MASP-2 및 MASP-3에 특이적으로 결합하도록 개발되고, 따라서 LEA-1 및 LEA-2의 기능적 차단을 달성할 수 있다는 것이 또한 구상될 수 있다. 전체-MASP 억제 활성을 갖는 이러한 항체는 혈관 내뿐만 아니라 혈관 외 용혈 둘 다를 차단하고 따라서 PNH 환자에서 빈혈증을 효과적으로 치료하는 것으로 예상된다.
IV. 나이-관련 황반 변성에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
나이-관련 황반 변성 (AMD)은 노인들의 시각적 손상 및 실명의 중요한 원인이며 개발 도상국에서 실명의 경우 중 50%까지를 차지한다. AMD의 유병률은 성인에서 약 3%이고 나이와 함께 증가하여 80살 이상의 인구 중 거의 3분의 2가 일부 징후를 가질 것이다. 미국에서 175만명 이상의 개인이 후기 AMD에 걸린 것으로 추정되고 유병률은 집단 나이에 따라 증가하고 있으며 2020년에는 거의 3백반명에 도달할 것으로 예상된다 (Friedman, D.S., et al., Arch. Ophthalmol. 122:564-572, 2004). AMD는 덮여 있는 중심 망막, 또는 황반의 광수용체의 퇴화, 및 중심 시각의 손실을 일으키는 망막 색소 상피 (RPE)의 이상이다. AMD의 초기 및 중간 형태는 망막에서 색소 불균형과 함께, RPE에 인접한 망막 하 공간에서 지질, 단백질, 지질단백질, 및 세포 데브리(debris)를 함유하는 노르스름한 물질인 드루센(drusen)의 점진적 침착을 특징으로 한다. 후기 AMD는 두 개의 임상적 서브타입, 비-신혈관 형성 지도상 위축성 ('건식') AMD 및 신혈관 형성 삼출성 ('습식') AMD로 구성된다. 건식 AMD가 후기 AMD 중 80-90%를 차지하지만, 갑작스런 및 심각한 시각 손상의 대부분은 습식 AMD에 걸린 환자에서 발생한다. 두 가지 타입의 AMD가 유사한 병리 또는 두 개의 별개의 질병으로부터 발생한 다른 표현형을 나타내는지는 알려져 있지 않다. 현재 미국 식품 의약국 (Food and Drug Administration; FDA)에 의해 승인된 치료법이 없다. 습식 AMD에 대한 FDA-승인된 치료 옵션은 항혈관형성제 (라니비쥬맙, 페가프타닙 나트륨, 아플리베르셉트)의 안내 주사, 레이져 치료, 광역학적 레이져 치료, 및 이식 가능 망원경(implantable telescope)을 포함한다. AMD의 병인학 및 병태생리학은 복잡하며 불완전하게 이해된다. 몇 가지 증거들은 AMD의 발병에 있어서 보체 시스템의 조절 장애의 역할을 지지한다. 유전자 결합 연구는 AMD와 관련된 다수의 유전적 자리를 확인하였으며, 다양한 보체 단백질, 인자, 및 조절자를 암호화하는 유전자를 포함한다. 가장 강력한 결합은 보체 인자 H (CFH) 유전자의 다형성, 비위험성 유전자형에 비해 대략 6배 증가된 AMD에 걸릴 위험을 갖는 Y402H 변종 동형 접합체 및 대략 2.5배 증가된 위험을 갖는 이형 접합체와의 것이다 (Khandhadia, S., et al., Immunobiol. 217:127-146, 2012). 유전자를 암호화하는 다른 보체 경로의 돌연변이는 또한 AMD의 증가된 또는 감소된 위험과 관련되어 있는데, 보체 인자 B (CFB), C2, C3, 인자 I, 및 CFH-결합 단백질 1 및 3을 포함한다 (Khandhadia et al.). AMD 환자의 기증체 눈에서의 면역조직학적 및 단백질체학적 연구는 보체의 단백질이 연계되어 증가되거나 드루센에 위치한다는 것을 나타냈다 (Issa, P.C., et al., Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249:163-174, 2011). 게다가, AMD 환자는 말초 혈액에서 측정된 바와 같이 전신성 보체 활성화를 증가시켰다 (Issa et　al., 2011, 상기).
보체의 대체 경로는 AMD의 발병에 있어서 고전적 경로보다 더 적절한 것으로 나타난다. 고전적 경로의 활성화에 대한 필수적인 인식 구성요소인 C1q는 면역조직학적 분석에 의해 드루센에서 검출되지 않았다 (Mullins et　al., FASEB　J.　14:835-846, 2000; Johnson et　al., Exp. Eye Res. 70:441-449, 2000). 유전적 결합 연구는 CFH 및 CFB 유전자와 관련된다. 이 단백질들은 보체 경로 증폭 루프에 수반되며, CFH는 유체 단계 억제자이고 CFB는 대체 경로의 활성화 프로테아제 성분이다. CFH의 Y402H 변이체는 C-반응성 단백질, 헤파린, M 단백질, 및 글리코스아미노글리칸과의 결합을 포함하는, 리간드 결합과의 상호작용에 영향을 미친다. 이 변화된 리간드로의 결합은 세포 표면으로의 결합을 감소시킬 수도 있으며, 이것은 차례로 C3b 활성화 단편의 감소된 인자 I 매개된 변성 및 대체 C3 컨버타제의 손상된 조절로 이어질 수도 있으며, 대체 경로의 과활성화를 일으킨다 (Khandhadia et al., 2012, 상기). CFB 유전자의 변화는 AMD의 발달에 대한 보호 효과와 연관된다. 기능적 변이체 fB32Q는 위험 변이체 fB32R보다 C3b에 대하여 4배 더 낮은 결합 친화도를 가졌으며, C3 컨버타제 형성의 감소를 일으킨다 (Montes, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106:4366-4371, 2009).
AMD에서 보체-시작 메커니즘
상기 논의된 인간 유전적 결합 연구는 AMD 발병에 있어서 보체 시스템에 대하여 중요한 역할을 제안한다. 게다가, 보체 활성화 생성물은 습식 및 건식 AMD 둘 다에서 홀마크(hallmark) 병리학적 병변인 드루센에 풍부하게 존재한다 (Issa, P.C., et al., Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249:163-174, 2011). 하지만, 보체 활성화를시작하는 사건의 특징 및 수반된 보체 활성화 경로(들)는 불완전하게 이해된 채로 남아있다.
드루센 침착은 세포 데브리 및 눈의 나이로서 RPE 아래에 축적되는 망막으로부터 기원한 산화 폐기물로 구성된다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 게다가, 산화 스트레스는 중요한 역할을 하는 것으로 나타나고 (Cai et al; Front Biosci., 17:1976-95, 2012), RPE에서 보체 활성화를 유발하는 것으로 나타났다 (J Biol Chem., 284(25):16939-47, 2009). 산화 스트레스 및 세포 또는 조직 손상 둘 다가 보체 시스템 렉틴을 활성화시킨다는 것이 널리 인정되고 있다. 예를 들어, Collard et al.은 산화 스트레스에 노출된 내피 세포가 렉틴에 의해 매개된 풍부한 보체 침착을 촉발하고 (Collard CD et al., Mol Immunol., 36(13-14):941-8, 1999; Collard C.D. et al., Am J Pathol., 156(5):1549-56, 2000), 렉틴 결합 및 렉틴-의존적 보체 활성화의 차단이 산화 스트레스 손상의 실험적 모델의 결과를 개선한다는 것을 입증하였다 (Collard C.D. et al., Am J Pathol.,156(5):1549-56, 2000). 따라서, 드루센에 존재하는 산화 폐기물이 또한 렉틴을 통해 보체를 활성화시킬 가능성이 높은 것으로 나타난다. 추론해 보면, 렉틴-의존적 보체 활성화는 AMD 발병에 있어서 중심 역할을 할 수도 있다.
보체 시스템의 역할은 AMD의 마우스 모델에서 평가되었다. 산화 스트레스-매개된 광수용체 변성에 대한 실험적 모델인 빛-손상 마우스 모델에서, 고전적 경로가 제거된 넉아웃 마우스 (C57BL/6 배경에서 C1qa-/-)는 야생형 한 배 새끼와 비교하여 빛 손상에 대하여 같은 민감도를 갖는 반면에, 대체 경로의 보체 인자 D의 제거 (CFD-/-)는 빛 손상으로부터의 보호를 일으켰다 (Rohrer, B. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48:5282-5289, 2007). 브루프 막(Bruch membrane)의 레이져 광응고에 의해 유발된 맥락막 신혈관 형성 (CNV)의 마우스 모델에서, 보체 인자 B가 없는 넉아웃 마우스 (CFB-/-)는 야생형 마우스와 비교하여 CNV에 대하여 보호되었다 (Rohrer, B. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50:3056-3064, 2009). 같은 모델에서, 보체 활성화의 부위로 표적화된 보체 인자 H의 재조합 형태 (CR2-fH)의 정맥 내 투여는 CNV의 정도를 감소시켰다. 이 보호 효과는 레이져 손상의 시간에 또는 치료적으로 (레이져 손상 후) 투여의 여부에 따라 관찰되었다. CR2-fH의 인간 치료 버젼 (TT30)은 또한 쥐 CNV 모델에서 효과적이었다 (Rohrer, B. et al. J. Ocul. Pharmacol. Ther.,28:402-409, 2012). fB가 LEA-1에 의해 활성화되기 때분에, 및 MASP-1 및 MASP-3이 인자 D의 성숙화이 기여하기 때문에, 이 발견들은 LEA-1 억제자가 AMD 환자에서 치료적 이점을 가질 수도 있다는 것을 나타낸다.
MBL-결핍 마우스를 사용하는 AMD의 설치류 모델에서 초기 실험적 연구는 병원성 보체 활성화에서 렉틴 경로에 중요한 역할을 지지하지 않았다 (Rohrer et al., Mol Immunol. 48:e1-8, 2011). 하지만, MBL은 여러 렉틴 중 단지 하나이고, MBL 이외의 렉틴은 AMD에서 보체 활성화를 촉발할 수도 있다. 실제로, 우리의 이전 작업은 MASP-2, 렉틴 경로 기능에 결정적으로 필요한 속도-제한 세린 프로테아제가 AMD에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타냈다. 미국 특허 번호 제7,919,094호 (Omeros Corporation에 할당됨)에서, 및 본원의 실시예 20 및 21에서 설명된 바와 같이, MASP-2-결핍 마우스 및 MASP-2 항체가 처리된 마우스는 레이져-유발된 CNV의 마우스 모델, 습식 AMD의 인증된 전임상 모델에서 보호되었다 (Ryan et al., Tr Am Opth Soc LXXVII:707-745, 1979). 따라서, LEA-2의 억제자는 CNV를 효과적으로 방지하고 AMD 환자의 결과를 개선할 것으로 예상된다.
따라서, 상기를 고려하여, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 AMD에서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 게다가, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 약제 단독에 비해 추가적인 치료 이점을 달성할 수도 있거나, 또는 더 넓은 범위의 환자 서브세트에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 성취될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중 특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-1에 결합하여 이것들을 차단할 수 있는 이중 특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에 포함될 수도 있다.
상기에 따라, 본 발명의 양태는 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 조성물을 이러한 질병으로 고통받고 있는 개체에 투여함으로써 나이-관련 황반 변성 (습식 및 건식 형태)를 치료하기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은, 예를 들어, 관주법(irrigation), 유리체 내 투여, 또는 겔, 연고 또는 방울의 형태로 조성물의 적용에 의해 눈에 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여, 예를 들어, 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강 내, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로는 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 나이-관련 황반 변성으로 고통받고 있는 개체에서 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단계를 더 포함하며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3 또는 MASP1/3 억제제의 치료적 유효량을 이것들을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, LEA-1 및 LEA-2를 개별적으로 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 AMD 환자에서 개선된 치료적 결과를 제공하는 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-조합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제 조성물은, 예를 들어, 관주법, 유리체 내 주사 또는 겔, 연고 또는 방울의 형태로 조성물의 국부적 적용에 의해 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-2 억제제는 개체에 비-펩티드성 약제에 대하여, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강 내, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로는 경구 투여에 의해 전신으로 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 최적의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 AMD의 치료를 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 AMD의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 투여될 수도 있다.
V. 허혈 재관류 손상에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
조직 허혈은 광범위한 임상적 장애에 대한 기초가 된다. 혈류의 적절한 회복이 허혈성 조직의 보존에 필수적이지만, 자발적으로 또는 치료적 개입을 통해 발생할 수 있는 재관류가 추가적인 조직 손상, 허혈 재관류 (I/R) 손상으로 불리는 현상으로 이어질 수도 있다는 것이 오랫동안 인식되어 왔다 (Eltzschig, H.K. and Tobias, E., Nat. Med. 17:1391-1401, 2011). I/R 손상은 심장 (급성 관상 동맥 증후군(acute coronary syndrome)), 신장 (급성 신부전(acute kidney injury)), 장 (장 I/R), 및 뇌 (뇌졸중(stroke))와 같이 단일 기관에 영향을 미칠 수도 있다. I/R 손상은, 예를 들어, 중증 외상 및 소생 (복합 장기 부전(multiple organ failure)), 순환 정지 (저산소 뇌 손상(hypoxic brain injury), 급성 신부전), 말초 혈관계 질환, 및 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell disease) (급성 흉부 증후군(acute chest syndrome), 급성 신부전) 후 다수의 기관에도 영향을 미칠 수 있다. 대수술은 I/R 손상과 연관될 수도 있으며, 심장 수술 (심폐 바이패스(cardiopulmonary bypass) 후 급성 심부전(acute heart failure)), 흉부 수술 (급성 폐 손상(acute lung injury)), 말초 혈관 수술 (구획 압착 증후군(compartment syndrome)), 혈관 수술 (급성 신부전), 및 고형 장기 이식 (급성 이식 조직 장애(acute graft failure))를 포함한다. 현재는 I/R 손상을 표적화하는 특정 치료법이 없고 허혈 지역에서 조직의 구조를 최대화하고 이 보통의 설정에서 기능적 결과를 개선하기 위한 효과적인 치료가 필요하다.
I/R 손상의 병리생리학은 복합적이고 재관류 후 강력한 염증 반응을 특징으로 한다. 보체 시스템의 활성화는 I/R 손상의 중요한 구성요소로서 관련되었으며 보체 활성의 억제는 다양한 동물 모델에서 효과적이었다 (Diepenhorst,　G.M.P., 　et　al., Ann. Surg. 249:889-899, 2009). I/R 손상에서 고전적, 렉틴, 및 대체 경로의 상대적 중요성은 매우 불확실하고 영향을 받는 기관에 따라 다를 수도 있다. 최근에 특정 보체 단백질 및 경로-특이적 억제자가 결핍된 넉아웃 마우스의 이용 가능성은 I/R 손상에서 렉틴 및 대체 경로와 연관된 데이터를 생성하였다.
위장관 I/R 손상에서 대체 경로의 역할은 인자 D-결핍 (-/-) 및 이형 접합성 (+/-) 마우스를 사용하여 조사되었다 (Stahl, G.L., et al. Am. J. Pathol. 162:449-455, 2003). 일시적인 위장관 허혈 후, 이형 접합체 마우스와 비교하여 장 및 폐 손상이 감소되었지만 인자 D-결핍 마우스에서는 방지되지 않았고, 인간 인자 D의 -/- 마우스로의 추가는 I/R 손상을 회복시켰다. 같은 모델이 C1q-결핍 및 MBL-A/C-결핍 마우스에서 평가되었고 결과는 위장관 I/R 손상이 C1q 및 고전적 경로 활성화에 독립적이었지만, MBL 및 렉틴 경로 활성화는 장 손상을 필요로 한다는 것을 나타냈다 (Hart, M.L., et al. J. Immunol. 174:6373-6380, 2005). 반대로, 고전적 경로의 C1q 인식 분자는 장 I/R 후 폐 손상의 원인이었다 (Hart, M.L., et al. J. Immunol. 174:6373-6380, 2005). 한 가설은 I/R 손상 중에 보체의 활성화가 허혈성 (정상이 아님) 조직의 표면에 존재하는 자기-항원, 예를 들어, 예를 들어, 비-근육 마이오신 중쇄 타입 II에 결합하는 천연 IgM을 통해 발생한다는 것이다. 마우스 위장관 I/R 손상 모델에서, 소화관 조직의 면역복합체는 고전적 (C1q), 렉틴 (MBL), 또는 대체 (인자 B) 경로에서 시작 인자의 존재에 대하여 평가되었다 (Lee, H., et al., Mol. Immunol. 47:972-981, 2010). 결과는 C1q 및 MBL이 검출되는 반면에 인자 B는 이 면역복합체에서 검출되지 않는다는 것을 나타냈으며, 대체 경로가 아니라 고전적 및 렉틴 경로의 수반을 나타낸다. 같은 모델에서, 인자 B-결핍 마우스는 국소적 조직 손상으로부터 보호되지 않았으며, 대체 경로의 수반의 결핍에 대하여 추가적인 지지를 제공한다. 위장관 I/R 손상에서 렉틴 경로의 역할이 MASP-2-결핍 마우스에서 직접적으로 평가되었고 결과는 위장관 손상이 야생형 대조군에 비해 이 마우스에서 감소되었고; MASP-2 단클론성 항체는 유사하게 보호적이라는 것을 나타냈으며 (Schwaeble, W.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108:7523-7528, 2011), 또한 본원에서 실시예 23을 참고하면 된다. 종합하자면, 이 결과들은 위장관 I/R 손상에서 렉틴 경로의수반에 대한 지지를 제공하며, 대체 경로의 수반에 관한 데이터와 상반된다.
마우스 심근 I/R 손상 모델에서, 병원성 역할이 렉틴 경로에 대하여 입증되었는데, MBL-결핍 마우스는 심근 손상으로부터 보호되는 반면에 C1q-결핍 및 C2/fB-결핍 마우스는 그렇지 않기 때문이다 (Walsh, M.C. et al., J. Immunol. 175:541-546, 2005). 심근 I/R 손상으로부터의 보호는 또한 MASP-2-결핍 마우스에서 관찰되었으며 (Schwaeble, W.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108:7523-7528, 2011); 또한 본원에서 실시예 22 및 23을 참고하면 된다. 심근 I/R 모델의 래트의 래트 MBL에 대한 단클론성 항체로의 치료는 감소된 허혈 후 재관류 손상을 일으켰다 (Jordan, J.E.,　et　al., Circulation 104:1413-18, 2001). 혈관형성술(angioplasty)로 치료된 심근 경색 환자의 연구에서, MBL 결핍은 MBL-충분한 대응물에 비해 감소된 90일 치사율과 관련되었다 (M Trendelenburg et al., Eur Heart J. 31:1181, 2010). 게다가, 혈관형성술 후 심장 기능장애에 걸린 심근 경색 환자는 기능적으로 회복되는 환자에 비해 대략 ~3배 더 높은 MBL 수준을 갖는다 (Haahr-Pedersen S., et al., J Inv Cardiology, 21:13, 2009). MBL 항체는 또한 산화 스트레스 후 시험관 내 내피 세포에서 보체 침착을 감소시켰으며 심근 I/R 손상의 렉틴 경로에 대한 역할을 나타낸다 (Collard, C.D.,　et　al., Am. J. Pathol.　156:1549-56, 2000). I/R 손상의 마우스 이소성 동계 심장 이식 모델에서, 대체 경로의 역할은 경로-특이적 융합 단백질 CR2-fH를 사용하여 조사되었다 (Atkinson, C., et al., J. Immunol. 185:7007-7013, 2010). 이식 직후 CR2-fH의 전신성 투여는 CR2-Crry 치료와 비슷한 정도로 심근 I/R 손상의 감소를 일으켰는데, 이것은 모든 보체 경로를 억제하며, 대체 경로가 이 모델에서 매우 중요하다는 것을 나타낸다.
신장 I/R 손상의 마우스 모델에서, 대체 경로는 인자 B-결핍 마우스가 신장 기능 및 관 손상의 감소로부터 보호되었기 때문에 관련되었다 (Thurman, J.M., et al., J. Immunol. 170:1517-1523, 2003). 인자 B에 대한 억제 단클론성 항체의 처리는 보체 활성화를 방지하였고 쥐 신장 I/R 손상을 감소시켰다 (Thurman, J.M., et al., J. Am. Soc. Nephrol. 17:707-715, 2006). 좌우 신장 I/R 손상 모델에서, MBL-A/C-결핍 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 신상 손상으로부터 보호되었고 재조합 인간 MBL은 MBL-A/C-결핍 마우스에서 보호 효과를 반전시키며, 이 모델에서 MBL에 대한 역할과 관련된다 (Moller-Kristensen, M., et al., Scand. J. Immunol. 61:426-434, 2005). 래트 일방적 신장 I/R 손상 모델에서, MBL-A에 대한 단클론성 항체로 MBL의 억제는 I/R 후 신장 기능을 보존하였다 (van der Pol, P., et al., Am. J. Transplant. 12:877-887, 2010). 흥미롭게도, 이 모델에서 MBL의 역할은 C5 항체로의 치료가 신장 손상을 방지하는데 효과적이지 않았기 때문에 말단 보체 성분의 활성화를 수반하지 않는 것으로 나타났다. 오히려, MBL은 시험관 내에서 MBL과 함께 배양된 인간 근위 관 세포가 이후의 세포 사멸과 함께 MBL을 내면화하였기 때문에 관 세포에 대한 직접적인 독성 효과를 갖는 것으로 나타났다. 신장 I/R의 돼지 모델에서, Castellano G. et al. (Am J Pathol, 176(4):1648-59, 2010)은 C1 억제자를 테스트하였는데, 이것은 고전적 경로에서 C1r 및 C1s 프로테아제 및 또한 렉틴 경로의 MBL 복합체에서 MASP-1 및 MASP-2 프로테아제를 비가역적으로 비활성화하며, C1 억제자가 세포 주위 모세혈관 및 사구체에서 보체 침착을 감소시키고 관 손상을 감소시킨다는 것을 발견하였다.
대체 경로는 인자 B-결핍 마우스가 혈청 C5a 수준으로 측정된 바와 같이 야생형 마우스와 비교하여 감소된 전신성 보체 활성화 및 감소된 외상 후 신경 세포 사멸을 갖기 때문에 실험적 외상성 뇌 손상에 수반되는 것으로 나타난다 (Leinhase, I., et al., BMC Neurosci. 7:55-67, 2006). 인간 뇌졸중에서, 보체 구성요소 C1q, C3c, 및 C4d는 허혈성 병변에서 면역조직화학적 염색에 의해 검출되었으며, 고전적 경로를 통한 활성화를 제안한다 (Pedersen, E.D., et al., Scand. J. Immunol. 69:555-562, 2009). 뇌 허혈증의 동물 모델에서 고전적 경로의 표적화는 복잡한 결과를 얻었는데, 일부 연구는 보호를 입증하는 한편 다른 것들은 아무런 이점도 나타내지 않았다 (Arumugam, T.V., et al., Neuroscience 158:1074-1089, 2009). 실험 및 임상 연구는 렉틴 경로 수반에 대한 강력한 증거를 제공하였다. 실험적 뇌졸중 모델에서, MBL 또는 MASP-2의 결핍은 야생형 마우스에 비해 감소된 경색 크기를 발생시킨다 (Cervera A, et al.; PLoS One 3;5(2):e8433, 2010; Osthoff M. et al., PLoS One, 6(6):e21338, 2011, 및 본원의 실시예 26). 게다가, 낮은 수준의 MBL을 갖는 뇌졸중 환자는 MBL-충분한 대응물과 비교하여 더 양호한 예후를 갖는다 (Osthoff M. et al., PLoS One, 6(6):e21338, 2011).
심폐 바이패스의 개코원숭이 모델에서, 인자 D 단클론성 항체의 처리는 C3a, sC5b-9, 및 IL-6의 혈장 수준으로 측정된 바와 같이 전신성 염증을 억제하였고, 심근 조직 손상을 감소시켰으며, 이 모델에서 대체 경로의 수반을 나타낸다 (Undar, A., et al., Ann. Thorac. Surg. 74:355-362, 2002).
따라서, I/R에 의해 영향을 받은 기관에 따라, 보체의 세 가지 경로 모두가 발병 및 부정적인 결과에 기여한다. 상기 상세히 설명된 실험적 및 임상적 결과에 기초하여, LEA-2 억제자가 가장 많은 설정의 I/R에서 보호적인 것으로 예상된다. LEA-1의 렉틴-의존적 활성화는 적어도 일부 설정에서 대체 경로를 통해 보체 활성화를 유발할 수도 있다. 게다가, LEA-2-시작된 보체 활성화는 대체 경로 증폭 루프에 의해 더 증폭되고 따라서 I/R-관련 조직 손상을 악화시킬 수도 있다. 따라서, LEA-1 억제자는 허혈증-관련 질병으로 고통받는 환자에서 추가적 또는 상보적 치료 이점을 제공하는 것으로 예상된다.
상기를 고려하여, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 허혈-재관류 관련 질병을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 독립적인 치료적 이점을 갖는 것으로 예상된다. 게다가, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 약제 단독과 비교하여 추가적인 치료 이점을 달성할 수도 있다. 그러므로 I/R-관련 질병에 대한 최적으로 효과적인 치료는, 단독으로 또는 조합하여, LEA-1 및 LEA-2 둘 다를 차단하는 활성 약학적 성분을 포함한다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1 차단제 및 LEA-2 차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 바람직하게는, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중 특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단할 수 있는 이중 특이성 항체로 구성된 이중 특이적 항체와 같은 단일 분자 실체물에서 포함될 수도 있다.
상기에 따라, 본 발명의 양태는 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 허혈 재관류를 경험하는 개체에게 투여함으로써 허혈 재관류 손상을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위한 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 비-펩티드성 억제자의 동맥 내, 정맥 내, 두개 내, 근육 내, 피하, 또는 다른 비경구 투여, 및 잠재적으로는 경구 투여에 의해, 및 가장 적합하게는 동맥 내 또는 정맥 내 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 본 발명의 LEA-1 억제 조성물의 투여는 적합하게는 허혈 재관류 사건 직후 또는 이후 가능한 한 빨리 시작된다. 재관류가 제어된 환경에서 발생하는 경우에 (예를 들어, 대동맥 수리, 장기 이식 또는 심각한 또는 외상을 입은 사지 또는 손가락의 재부착 후), LEA-1 억제제는 재관류 전에 및/또는 동안 및/또는 후에 투여될 수도 있다. 투여는 최적의 치료 효과를 위해 의사에 의해 결정된 바와 같이 주기적으로 반복될 수도 있다.
일부 구체예에서, 대동맥 수리, 심폐 바이패스, 장기 이식 및/또는 사지/손가락 재이식과 관련된 관 재문합, 뇌졸중, 심근 경색, 및 쇼크 및/또는 수술 과정 후 혈류역학적 소생 중 적어도 하나와 관련된 허혈-재관류 손상을 치료하거나 예방하기 위한 방법이 사용된다.
일부 구체예에서, 장기 이식을 경험하려고 하거나, 경험 중이거나, 또는 경험한 개체에서 허혈-재관류 손상을 치료하거나 예방하기 위한 방법이 사용된다. 일부 구체예에서, 장기 이식을 경험하려고 하거나, 경험 중이거나, 또는 경험한 개체에서 허혈-재관류 손상을 치료하거나 예방하기 위한 방법이 제공되는데, 장기 이식이 신장 이식이 아니라는 것을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 허혈 재관류를 경험하고 있는 개체에서 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단계를 더 포함하며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, LEA-1 및 LEA-2를 개별적으로 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 허혈 재관류 손상의 치료, 예방, 또는 이것의 심각도의 감소에 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원 결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것들로 구성된다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위는 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위는 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구서오딜 수도 있다.
MASP-2 억제 조성물은 비-펩티드성 억제자에 대하여 동맥 내, 정맥 내, 두개 내, 근육 내, 피하, 또는 다른 비경구 투여, 및 잠재적으로 경구 투여에 의해 및 가장 적합하게는 동맥 내 또는 정맥 내 투여에 의해 필요로 하는 개체에 투여될 수도 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 투여는 적합하게 허혈 재관류 사건 직후 또는 이후 가능한 한 빨리 시작된다. 재관류가 제어된 환경에서 발생하는 경우에 (예를 들어, 대동맥 수리, 장기 이식 또는 심각한 또는 외상을 입은 사지 또는 손가락의 재부착 후), MASP-2 억제제는 재관류 전에 및/또는 동안 및/또는 후에 투여될 수도 있다. 투여는 최적의 치료 효과를 위해 의사에 의해 결정된 바와 같이 주기적으로 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 최적의 MASP-2 억제 조성물의 적용은, 허혈 재관류 손상의 치료 또는 예방을 위해, 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 허혈 재관류를 경험하고 있는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 투여될 수도 있다.
VI. 염증성 및 비-염증성 관절염에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
류머티스성 관절염 (RA)은 또한 전신성 징후를 가질 수도 있는 활막 관절의 만성 염증성 질환이다. RA는 세계 인구 중 대략 1%에 영향을 미치며, 여성이 고통받을 가능성이 2 내지 3배 더 높다. 관절 염증은 부기, 통증, 및 강직에 나타난다. 질환이 진행됨에 따라 관절 부식 및 파괴가 있을 수도 있으며, 손상 범위의 동작 및 기형을 일으킨다. RA에서 치료 목표는 관절 손상의 예방 또는 제어, 관절 기능의 손실 및 질환 진행의 예방, 증상의 완화 및 생활의 질의 개선, 및 무약물성 관해(remission)의 달성을 포함한다. RA의 약학적 치료는 질환-변형 항-류머티즘 약 (disease-modifying anti-rheumatic drug; DMARD), 진통제, 및 항-염증제 (글루코코르티코이드 및 비-스테로이드성 항-염증제)를 포함한다. DMARD는 가장 중요한 치료법인데 그것들이 내구성 관해를 유발하고 비가역적인 관절 파괴의 진행을 지연시키거나 중단시킬 수 있기 때문이다. 전통적인 DMARD는 메토트렉세이트, 술파살라진, 히드록시클로로퀸, RMAUDA 레플루노미드, D-페니실아민, 시클로스포린, 및 아자티오프린과 같은 저분자를 포함한다. 전통적인 DMARD가 질환을 제어하는데 불충분하면 그 다음에 종양 괴사 인자 억제자 (에타너셉트, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리쥬맙 페골, 및 골리무맙), 시토킨 길항제 (아나킨라 및 토실리쥬맙), 리툭시맙, 및 아바타셉트와 같이, 염증 세포 또는 매개자를 표적화하는 여러 생물학적 약제가 이용 가능한 치료 옵션이 된다.
후천적 면역력은 분명히 T-세포 활성화 유전자와의 유전적 결합 및 자가 항체의 존재에 의해 증명된 바와 같이 RA 발병의 중심이 되지만, 선천적 면역 메커니즘 또한 관련되었다 (McInnes, I.B. and Schett, G. New Engl. J. Med. 365:2205-2219, 2011). 인간 RA에서, 대체 경로 분할 단편 Bb의 활액 수준은 결정-유발성 관절염 또는 퇴행성 관절 질환에 걸린 환자의 샘플보다 몇 배 더 높았으며, RA 환자에서 대체 경로의 바람직한 활성화와 관련된다 (Brodeur, J.P., et al., Arthritis Rheum. 34:1531-1537, 1991). 관절염의 이 실험적 안티-타입 II 콜라겐 항체-수동 전달 모델에서, 인자 B-결핍 마우스는 야생형 마우스에 비해 감소된 염증 및 관절 손상을 갖는 반면에, C4-결핍 마우스는 야생형 마우스와 유사한 질환 활성을 갖는데, 이 모델에서 고전적 경로가 아니라 대체 경로의 필요성을 나타낸다 (Banda, N.K. et al., J. Immunol. 177:1904-1912, 2006). 콜라겐 항체-유발된 관절염 (CAIA)의 같은 실험 모델에서, 고전적 경로만 활성이거나 렉틴 경로만 활성인 마우스는 관절염에 걸리지 않았다 (Banda, N.K. et al., Clin. Exp. Immunol. 159:100-108, 2010). 이 연구의 데이터는 고전적 또는 렉틴 경로가 시험관 내에서 낮은 수준의 C3을 활성화시킬 수 있다는 것을 제안하였다. 하지만, 대체 경로 증폭 루프의 부재시, C3의 관절 침착 수준은 임상적 질환을 생산하는데 불충분하였다. 대체 경로의 활성화에서 중요한 단계는 인자 D의 치모겐 (프로-인자 D)의 성숙한 인자 D로의 전환이고, 이것은 MASP-1 및/또는 MASP-3 (Takahashi, M., et al., J. Exp. Med. 207:29-37, 2010) 및/또는 HTRA1 (Stanton et al., Evidence That the HTRA1 Interactome Influences Susceptibility to age-related macular degeneration, presented at The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2011 conference on May 4, 2011)에 의해 매개된다. MASP-1/3의 역할은 쥐 CAIA에서 평가되었고 결과는 MASP-1/3 결핍 마우스가 야생형 마우스와 비교하여 관절염으로부터 보호된다는 것을 나타냈다 (Banda, N.K., et al., J. Immunol. 185:5598-5606, 2010). MASP-1/3-결핍 마우스에서, 성숙한 인자 D가 아니라 프로-인자 D가 CAIA의 진화 중에 혈청에서 검출되었고, 인간 인자 D의 추가는 이 마우스의 혈청을 사용하여 C3 활성화 및 C5a 생성을 재구성하였다. 반대로, 관절염의 효과기 단계의 쥐 모델에서, C3-결핍 마우스는 WT 마우스와 비교하여 매우 가벼운 관절염에 걸리는 한편 인자 B-결핍 마우스는 여전히 관절염에 걸렸으며, 고전적/렉틴 및 대체 경로 둘 다의 독립적인 기여를 나타낸다 (Hietala, M.A. et al., Eur. J. Immunol. 34:1208-1216, 2004). 염증성 관절염의 K/BxN T 세포 수용체 유전자 이식 마우스 모델에서, C4 또는 C1q가 결핍된 마우스는 야생형 마우스와 유사한 관절염에 걸린 반면에 인자 B가 결핍된 마우스는 관절염에 걸리지 않았거나 가벼운 관절염에 걸렸으며, 이 모델에서 고전적 경로가 아닌 대체 경로의 필요성을 입증한다 (Ji H. et al., Immunity 16:157-168, 2002). K/BxN 모델에서, MBL-A가 결핍된 마우스는 혈청-유발된 관절염으로부터 보호되지 않았지만, MBL-CDML 역할이 조사되지 않았기 때문에, 렉틴 경로에 대한 잠재적 역할이 제거되지 않았을 수도 있다 (Ji et al., 2002, 상기).
두 연구 군은 렉틴-의존적 보체 활성화가 MBL의 특이적 IgG 당질과의 상호작용을 통해 RA 환자의 염증을 촉진한다는 것을 독립적으로 제안하였다 (Malhotra　et　al., Nat. Med. 1:237-243, 1995; Cuchacovich　et　al., J. Rheumatol. 23:44-51, 1996). 류머티스성 질병이 분자의 Fc 영역에서 갈락토스 (IgG0 당질로도 불림)가 결핍된 IgG 당질의 현저한 증가와 관련된다는 것이 주목된다 (Rudd　et　al., Trends Biotechnology 22:524-30, 2004). IgG0 당질의 퍼센트는 류머티스성 질병의 질환 진전과 함께 증가하고, 환자가 관해에 들어갈 때 정상으로 돌아온다. 생체 내에서, IgG0은 활액 조직에 침착되고 MBL은 RA에 걸린 개인의 활액에서 증가된 수준으로 존재한다. RA와 관련된 응집된 아갈락토실 IgG (IgG0)는 MBL에 결합할 수 있고 그러므로 LEA-1 및/또는 LEA-2를 통해 렉틴-의존적 보체 활성화를 시작할 수 있다. 게다가, RA 환자에서 대립 변이체에 관한 임상 연구의 결과는 MBL이 질환에서 염증-향상 역할을 가질 수도 있다고 제안한다 (Garred　et　al., J. Rheumatol.　27:26-34, 2000). 그러므로, LEA-1 및/또는 LEA-2를 통한 렉틴-의존적 보체 활성화는 RA의 발병에 중요한 역할을 할 수도 있다.
보체 활성화는 또한 류머티스성 관절염에서 중요한 역할을 한다 (Mollnes, T.E.,　et　al., Arthritis Rheum. 29:1359-64, 1986). 성인 RA와 유사하게, 청소년 류머티스성 관절염에서도, C4d (고전적 또는 LEA-2 활성화에 대한 마커)와 비교하여 대체 경로 보체 활성화 생성물 Bb의 증가된 혈청 및 활액 수준은 대부분 LEA-1에 의해 매개된다 (El-Ghobarey, A.F.　et　al., J. Rheumatology　7:453-460, 1980; Agarwal, A.,　et　al., Rheumatology 39:189-192, 2000).
유사하게, 보체 활성화는 건선성 관절염에서 중요한 역할을 한다. 이질병에 걸린 환자는 순환에 있어서 증가된 보체 활성화 생성물을 갖고 있으며, 그것들의 적혈구 세포는 더 낮은 수준의 보체 조절기를 갖는 것으로 나타난다 (Triolo,. Clin Exp Rheumatol., 21(2):225-8, 2003). 보체 수준은 질환 활성과 관련되고, 치료 결과를 결정하기 위한 높은 예측값을 갖는다 (Chimenti at al., Clin Exp Rheumatol., 30(1):23-30, 2012). 사실, 현재의 연구들은 이 질병에 대한 항-TNF 치료의 효과가 보체 조절에 기인한다 (Ballanti et al., Autoimmun Rev., 10(10):617-23, 2011). 건선성 관절염에서 보체의 정확한 역할이 결정되지 않은 한편, 이 환자들의 순환에서 C4d 및 Bb 보체 활성화 생성물의 존재는 발병에서 중요한 역할을 제안한다. 관찰된 생성물에 기초하여, LEA-1, 및 가능하게는 또한 LEA-2도 이 환자들에서 병리학적 보체 활성화에 원인이 있다고 생각된다.
골관절염 (osteeoarthritis; OA)은 가장 흔한 형태의 관절염이며, 미국에서 2500만명 이상에게 영향을 미친다. OA는 관절 연골의 고장 및 최종적 손실을 특징으로 하는데, 신생 골 형성 및 활액 증식을 동반하며, 통증, 강직, 관절 기능 손실, 및 장애로 이어진다. OA에 흔히 영향을 받는 관절은 손, 목, 등 아래쪽, 무릎 및 엉덩이이다. 질환은 진행성이고 현재의 치료는 증상성 통증 완화를 위한 것이며 질환의 자연사를 변화시키지 않는다. OA의 병원은 불분명하지만, 보체에 대한 역할과 관련되어 있다. OA에 걸린 환자의 활액의 단백질체학적 및 전사체학적 분석에서, 보체의 여러 구성요소는 건강한 개인의 샘플과 비교하여 비정상적으로 발현되었으며, 고전적 (C1s 및 C4A) 및 대체 (인자 B) 경로, 및 또한 C3, C5, C7, 및 C9를 포함한다 (Wang, Q., et al., Nat. Med. 17:1674-1679, 2011). 게다가, 내측 반월판 절제술(medial meniscectomy)에 의해 유발된 OA의 마우스 모델에서, C5-결핍 마우스는 더 작은 연골 손실, 골극(osteophyte) 형성 및 활액막염(synovitis)을 갖고, 야생형 마우스에 CR2-fH, 대체 경로를 억제하는 융합 단백질의 처리는 OA의 발달을 감소시켰다 (Wang et al., 2011 상기).
로스 리버 바이러스 (Ross River virus; RRV) 및 치쿤군야 바이러스 (chikungunya virus; CHIKV)는 인간에서 급성 및 지속성 관절염 및 근염(myositis)을 유발할 수 있는 모기-매개 바이러스의 군에 속한다. 풍토병의 유발 이외에, 이 바이러스들은 수 백만 명의 감염된 개인을 수반하는 전염병을 유발할 수 있다. 관절염은 바이러스 복제 및 관절에서 숙주 염증 반응의 유발에 의해 시작되는 것으로 생각되고 보체 시스템은 이 과정에서 중요한 구성요소로서 적용되었다. RRV-유발된 다발성 관절염에 걸린 인간의 활액은 oa에 걸린 인간의 활액보다 더 높은 수준의 C3a를 함유한다 (Morrison, T.E., et al., J. Virol. 81:5132-5143, 2007). RRV 감염의 마우스 모델에서, C3-결핍 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 덜 심각한 관절염에 걸렸으며, 보체의 역할과 관련된다 (Morrison et al., 2007, 상기). 수반된 특이적 보체 경로가 조사되었고 비활성화된 렉틴 경로를 가진 마우스 (MBL-A-/- 및 MBL-C-/-)는 야생형 마우스에 비해 감소된 관절염에 걸렸다. 반대로, 비활성화된 고전적 경로를 가진 마우스 (C1q-/-) 또는 대체 경로를 가진 마우스 (인자 B-/-)는 심각한 관절염에 걸렸으며, MBL에 의해 시작된 렉틴 경로는 이 모델에서 필수적인 역할을 하였다 (Gunn, B.M., et al., PLoS Pathog. 8:e1002586, 2012). 관절염이 관절의 손상을 수반하기 때문에, 다양한 병인에 의해 유발된 초기 관절 손상은 LEA-2에 의한 보체 활성화의 제2 파를 촉발할 수도 있다. 이 개념을 지지하며, 발명자들의 이전 작업은 MASP-2 KO 마우스가 RA의 콜라겐-유발된 모델에서 WT 마우스에 비해 감소된 관절 손상을 갖는다는 것을 입증하였으며, 본원의 실시예 27에서 설명된 바와 같다.
상기 상세히 설명된 증거의 본문을 고려하여, LEA-1 및 LEA-2 억제자는, 단독으로 또는 조합하여, 관절염의 치료에 치료적으로 유용할 것으로 예상된다. 그러므로 관절염에 최적으로 유효한 치료는, 단독으로 또는 조합하여, LEA-1 및 LEA-2 둘 다를 차단할 수 있는 활성 약학적 성분을 포함할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1 차단제 및 LEA2 차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 바람직하게는, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중 특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단할 수 있는 이중 특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에 포함될 수도 있다. 상기에 따라, 본 발명의 양태는 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 염증성 또는 비-염증성 관절염으로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험 위험이 있는 개체에 투여함으로써 골관절염, 류머티스성 관절염, 청소년 류머티스성 관절염 및 건선성 관절염을 포함하는 염증성 또는 비-염증성 관절염을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것들의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 대안으로, 투여는 국소적 전달, 예를 들어, 관절 내 주사에 의한 것일 수도 있다. LEA-1 억제제는 만성 질병의 치료 또는 제어를 위해 연장된 기간 동안 주기적으로 투여될 수도 있거나, 관절에서 수행된 수술 과정을 포함하는 급성 외상 또는 손상 전, 동안 및/또는 후의 기간에 일회 또는 반복된 투여에 의한 것일 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP1/3 억제제의 치료적 유효량을 개체에게 투여함으로써 염증성 또는 비-염증성 관절염 (골관절염, 류머티스성 관절염, 청소년 류머티스성 관절염 및 건선성 관절염 포함)으로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험 위험이 있는 개체에서 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단계를 더 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, LEA-1 및 LEA-2를 개별적으로 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 관절염을 치료하거나 예방하는데 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시 투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것들로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제 조성물은 필요로 하는 개체에 비-펩티드성 억제자에 대하여, 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 대안으로, 투여는 국소적 전달, 예를 들어, 관절 내 주사에 의한 것일 수도 있다. MASP-2 억제제는 만성 질병의 치료 또는 제어를 위해 연장된 기간 동안 주기적으로 투여될 수도 있거나, 또는 관절에서 수행된 수술 과정을 포함하는 급성 외상 또는 손상 전, 중 및/또는 후의 기간에 단일 또는 반복된 투여에 의한 것일 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 최적의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 염증성 또는 비-염증성 관절염을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것들의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중-억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 주기적인 간격으로, 예를 들어, 염증성 또는 비-염증성 관절염으로 고통받는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 투여될 수도 있다.
VII. 파종성 혈관 내 응고 (DIC)에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
파종성 혈관 내 응고 (DIC)는 임상적으로 출혈 및/또는 혈전증으로 나타낼 수 있는 응고 시스템의 병리학적 과자극의 증후군이다. DIC는 주요한 질병으로서 하지만 조직 손상 (외상, 화상, 열사병, 수혈 반응, 급성 이식 거부), 종양 형성, 감염성, 산과 질병 (전치 태반(placenta previa), 양수 색전(amniotic fluid embolism), 임신 중독증(toxemia of pregnancy)), 및 심장성 쇼크, 익수(near drowning), 지방 색전증(fat embolism), 대동맥류(aortic aneurysm)와 같은 다양한 질병을 포함하는 다양한 질환 과정과 함께 발생하지 않는다. 혈소판 감소증(Thrombocytopenia)은 중환자실 환자에서 빈번한 이상 현상이며, 발생률은 35% 내지 44%이고, DIC는 이 경우들 중 약 25%의 병인이다, 즉, DIC는 위독한 환자 중 대략 10%에서 발생한다 (Levi, M. and Opal, S.M. Crit. Care 10:222-231, 2006). DIC의 병리생리학은 근본적인 질환 과정이 생리학적 응고 반응을 시작한다는 것이다. 하지만, 전혈전 물질은 미소순환에서 섬유소 및 혈소판의 부적절한 침착이 있는 정상 상쇄 메커니즘을 압도하며, 기관 허혈, 저섬유소원혈증(hypofibrinogenemia), 및 혈소판 감소증으로 이어진다. DIC의 진단은 실험실 파라미터 (프로트롬빈 시간, 부분적 프로트롬빈 시간, 섬유소 분해 생성물, D-다이머, 또는 혈소판 수)의 이상과 함께, 적절한 근본적인 질병 또는 공정의 임상적 발표에 기초한다. DIC의 주된 치료는 원인이 되는 촉발자인 근본적인 질병을 해결하는 것이다. 적혈구 세포, 혈소판, 신선 동결 혈장, 및 동결침전물 형태의 혈액 생성 지원은 임상적 합병증을 치료하거나 예방하는데 필요할 수도 있다.
DIC에서 보체 경로의 역할이 여러 연구에서 조사되었다. 보체 활성화는 MBL 유전자형에 관하여 임상 경과와 비교하여 수막염 감염된 소아 환자에서 평가되었다 (Sprong, T. et al., Clin. Infect. Dis. 49:1380-1386, 2009). 입원시에, MBL 결핍 환자는 MBL-충분한 환자보다 더 낮은 순환 수준의 C3bc, 말단 보체 복합체, C4bc, 및 C3bBbP를 갖고 있었는데, 더 낮은 정도의 공통 보체, 말단 보체, 및 대체 경로 활성화를 나타낸다. 게다가, 전신성 보체 활성화의 정도는 질환 심각도 및 DIC의 파라미터와 연관되었고 MBL-결핍 환자는 MBL-충분한 환자보다 더 가벼운 임상 경과를 갖고 있었다. 그러므로, MBL 결핍이 감염에 대한 민감성에 대하여 위험한 인자이지만, 패혈성 쇼크 중에 MBL 결핍은 더 낮은 질환 심각도와 연관될 수도 있다.
본원의 실시예 1-4에서 입증된 바와 같이, 실험적 연구는 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria menigitidis), 수막염 감염의 유병 기생충에 대한 선천적 면역 반응에서 MBL 및 MASP-1/3의 중요한 기여를 강조하였다. 마우스 또는 인간의 MBL-결핍 혈청, MASP-3 결핍 인간 혈청, 또는 MASP-1/3 넉아웃 마우스는 야생형 혈청과 비교하여 시험관 내에서 보체를 활성화하고 수막염균을 용해하는데 덜 효과적이다. 유사하게, 나이브 MASP-1/3 넉아웃 마우스는 그것들의 야생형 대응물보다 네이세리아 감염에 더 민감하다. 따라서, 후천적 면역력의 부재시, LEA-1 경로는 네이세리아 감염에 대한 선천적-숙주 저항성에 기여한다. 반대로, LEA-1은 DIC를 포함하는 해로운 숙주 반응을 촉발시키는 병리학적 보체 활성화를 증가시킨다.
동맥 혈전증의 쥐 모델에서, MBL-눌(null) 및 MASP-1/-3 넉아웃 마우스는 야생형 또는 C2/인자 B-눌 마우스와 비교하여 감소된 혈전 형성을 갖고, 결함은 재조합 인간 MBL로 재구성되었다 (La Bonte, L.R., et al., J. Immunol. 188:885-891, 2012). 시험관 내에서, MBL-눌 또는 MASP-1/-3 넉아웃 마우스 혈청은 야생형 또는 C2/인자 B-눌 마우스 혈청과 비교하여 감소된 트롬빈 기질 분할을 갖고 있었다. 재조합 인간 MASP-1의 추가는 MASP-1/-3 넉아웃 마우스 혈청에서 트롬빈 기질 분할을 회복시켰다 (La Bonte et al., 2012, 상기). 이 결과들은 MBL/MASP 복합체, 특히 MASP-1이 혈전 형성에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 따라서, LEA-1은 DIC를 포함하는 병리학적 혈전증에서 중요한 역할을 할 수도 있다.
실험적 연구는 병리학적 혈전증에서 LEA-2에 대하여 동일하게 중요한 역할을 확립하였다. 본원에서 실시예 30에서 설명된 바와 같이, 국소화된 DIC의 마우스 모델에서, 발명자들은 MASP-2 넉아웃 마우스가 야생형 마우스보다 LPS-유발된 미소혈관 응고에 대하여 훨씬 덜 민감하다는것을 입증하였다. 시험관 내 연구는 LEA-2가 보체 시스템과 응고 시스템 사이의 분자 결합을 제공한다는 것을 더 입증한다. 본원에서 실시예 29 및 31에서 설명된 바와 같이, MASP-2는 인자 Xa-유사 활성을 갖고 분할을 통해 프로트롬빈을 활성화시켜서 트롬빈을 형성하며, 이것은 그 다음에 피브리노겐을 제거하여 섬유소 응집 형성을 촉진할 수 있다 (또한 Krarup et al., PLoS One, 18:2(7):e623, 2007을 참고하면 된다).
별개의 연구는 렉틴-MASP 복합체가 MASP-2 의존적 과정에서 혈전 형성, 섬유소 침착 및 피브리노펩티드 방출을 촉진할 수 있다는 것을 나타냈다 (Gulla et al., Immunology, 129(4):482-95, 2010). 따라서, LEA-2는 보체 및 응고 시스템의 동시 렉틴-의존적 활성화를 촉진한다.
시험관 내 연구는 MASP-1이 트롬빈-유사 활성을 갖고 (Presanis J.S., et al., Mol Immunol, 40(13):921-9, 2004), 피브리노겐 및 인자 XIII (Gulla K. C. et la., Immunology, 129(4):482-95, 2010)를 분할한다는 것을 추가로 나타냈으며, LEA-1은 LEA-2와 독립적으로 또는 이것과 협력하여 응고 경로를 활성화시킬 수도 있다는 것을 제안한다.
상기 상세히 설명된 데이터는 렉틴-의존적 보체 활성화와 응고 사이의 독립적인 결합을 제공한다는 것을 제안한다. 따라서, 상기를 고려하여, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 파종성 혈관 내 응고로 고통받는 개체를 치료하는데 있어서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 일부 구체예에서, 개체는 패혈증, 외상, 감염 (박테리아, 바이러스, 균류, 기생충), 악성 종양, 이식 거부 반응, 수혈 반응, 조산 합병증, 혈관 동맥류(vascular aneurysm), 간 부전, 열사병, 화상, 방사선 노출, 쇼크, 또는 심각한 독성 반응 (예를 들어, 사교상(snake bite), 곤충자상(insect bite), 수혈 반응)에 부차적인 파종형 혈관 내 응고로 고통받고 있다. 일부 구체예에서, 외상은 신경성 외상이다. 일부 구체예에서, 감염은 박테리아 감염, 예를 들어, 네이세리아 메닝기티디스 감염이다.
게다가, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 약제 단독과 비교하여 추가적인 치료 이점을 달성할 수도 있다. LEA-1 및 LEA-2 둘 다가 DIC로 이어지는 질병 (예를 들어, 감염 또는 외상)에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있기 때문에, LEA-1- 및 LEA-2-차단제는, 별개로 또는 조합으로, DIC의 치료에 있어서 치료적 유용성을 가질 것으로 예상된다. LEA-1 및 LEA-2 차단제는 보체와 응고 사이의 다른 크로스-토크(cross-talk) 메커니즘을 예방할 수도 있다. 따라서 LEA-1- 및 LEA-2-차단제는 DIC 및 다른 혈전증 장애를 예방하는데 있어서 상보적, 추가적 또는 시녀지 효과를 가질 수도 있다.
게다가, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 약제 단독과 비교하여 추가적인 치료 이점을 달성할 수도 있거나, 또는 더 넓은 범위의 환자 서브세트에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중 특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이를 차단하는 이중 특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에 포함될 수도 있다.
상기에 따라, 본 발명의 양태는 필요로 하는 개체의 파종성 혈관 내 응고를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 파종성 혈관 내 응고를 경험하고 있거나, 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 개체에 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다. 외상 또는 다른 급성 사건에 부차적인 DIC의 치료 또는 예방을 위해서, LEA-1 억제 조성물은 외상성 손상 직후에 또는 외상-유발성 손상 또는 DIC의 위험이 있는 것으로 보이는 환자의 수술과 같은 상황 전에, 중에, 직후에, 또는 1일 내지 7일 이상 내, 예를 들어, 24시간 내지 72시간 내에 예방적으로 투여될 수도 있다. 일부 구체예에서, LEA-1 억제 조성물은 신속하게 작용하는 투약 형태로, 예를 들어, LEA-1 억제 조성물을 함유하는 용액의 볼루스의 정맥 내 또는 동맥 내 전달에 의해 적합하게 투여될 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 필요로 하는 개체에서 파종성 혈관 내 응고를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단계를 더 포함하며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1의 억제와 비교하여 파종성 혈관 내 응고를 치료하거나 예방하는데 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 필요로 하는 대상에게 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다. 외상 또는 다른 급성 사건에 부차적인 DIC에 대하여, MASP-2 억제 조성물은 외상성 손상 직후에 또는 외상-유발성 손상 또는 DIC의 위험이 있는 것으로 보이는 환자의 수술과 같은 상황 전에, 중에, 직후에, 또는 1일 내지 7일 이상 내, 예를 들어, 24시간 내지 72시간 내에 예방적으로 투여될 수도 있다. 일부 구체예에서, LEA-1 억제 조성물은 신속하게 작용하는 투약 형태로, 예를 들어, MASP-2 억제 조성물을 함유하는 용액의 볼루스의 정맥 내 또는 동맥 내 전달에 의해 적합하게 투여될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 최적의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 필요로 하는 대상에서 파종성 혈관 내 응고를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중-억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 파종성 혈관 내 응고를 경험하거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 투여될 수도 있다.
VIII. 용혈성 요독 증후군 (hemolytic uremic syndrome; HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (atypical hemolytic uremic syndrome; aHUS) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP)을 포함하는 혈전성 미소 혈관증 (TMA)에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
혈전성 미소혈관증 (TMA)은 임상적으로 혈소판 감소증, 미세혈관병성 용혈성 빈혈(microangiopathic hemolytic anemia), 및 가변성 장기 허혈을 특징으로 하는 장애의 군을 나타낸다. TMA의 특징적인 병리학적 기능은 소동맥 및 소정맥에서 혈소판 활성화 및 미소혈전의 형성이다. 고전적 TMA는 용혈성 요독 증후군 (HUS) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP)이다. HUS는 급성 신부전의 존재에 의해 TTP와 구별된다. HUS는 두 가지 형태, 설사-관련 (D+) 또는 전형적인 HUS, 및 설사 음성 (D-) 또는 비정형 HUS (aHUS)로 발생한다.
HUS
D+HUS는 보통 대장균(Escherichia coli) O157 또는 또 박테리아의 다른 쉬가(Shiga)-독소-생산 균주에 의해 유발된 전구 증상성(prodromal) 설사의 질병과 연관되고, 아동에서 HUS 경우의 90% 이상을 차지하며, 아동의 급성 신부전의 가장 흔한 원인이다. 대장균 O157로의 인간 감염이 비교적 빈번하지만, D+HUS로 진행되는 혈성 설사(bloody diarrhea)의 퍼센트는 산발적인 경우에 3% 내지 7% 및 일부 발생에서는 20% 내지 30%의 범위에 있다 (Zheng, X.L. and Sadler, J.E., Annu. Rev. Pathol. 3:249-277, 2008). HUS는 보통 설사의 발병 후 4 내지 6일에 발생하고 아동들의 대략 3분의 2는 질환의 급성 단계에서 투석을 필요로 한다. 특이적인 치료가 효과적이지 않은 것으로 나타나기 때문에 D+HUS의 치료가 지지된다. D+HUS의 예측이 유리하며, 대부분의 환자들은 신장 기능을 회복한다.
D+HUS의 발명은 미소혈관 내피 세포, 단핵구, 및 혈소판의 박에 결합하는 박테리아-생산된 쉬가 독소를 수반한다. 신장의 미소혈관계가 가장 흔히 영향을 받는다. 결합 후, 독소가 내면화되며, 전염증성 매개자의 방출 및 궁극적으로 세포 사멸로 이어진다. 내피 세포 손상이 응고 캐스케이드의 활성화를 촉진함으로써 신장 미소혈관 혈전증을 촉발한다고 생각된다. D+HUS에서 보체 시스템의 활성화에 대한 증거가 있다. D+HUS에 걸린 아동들에서, Bb 및 SC5b-9의 혈장 수준은 입원시 정상 대조군에 비해 증가되었고, 퇴원 후 제28 일에, 혈장 수준이 정상화되었다 (Thurman, J.M. et al., Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 4:1920-1924, 2009). 쉬가 독소 2 (Stx2)는 고전적 경로를 차단하는 에틸렌 글리콜 테트라아세트산의 존재시 진행된 활성화로서 주로 대체 경로를 통해, 시험관 내 유체 단계에서 인간 보체를 활성화하는 것으로 발견되었다 (Orth, D. et al., J. Immunol. 182:6394-6400, 2009). 게다가, Stx2는 인자 I는 아니지만 인자 H에 결합되었고 세포 표면에서 인자 H의 공통 인자 활성을 지연시켰다 (Orth et al, 2009, 상기). 이 결과들은 직접적인 독성 효과를 포함하는 다수의 잠재적 메커니즘을 통해, 및 간접적으로 보체의 활성화 또는 보체 조절자의 억제를 통해 신장 손상을 유발할 수도 있다는 것을 제안한다. 혈관 내피에 대한 독성 효과는 LEA-2를 통해 보체를 활성화할 것으로 예상되는데, 본원의 실시예 21-23에서 입증된 바와 같이 다양한 혈관상(vascular bed)에서 보체-매개된 재관류 손상을 예방하는데 있어서 MASP-2 차단의 효과에 의해 증명된 바와 같으며, 또한 Schwaeble, W.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108:7523-7528, 2011을 참고하면 된다.
쉬가 독소와 지질다당류의 동시-주사에 의해 유발된 HUS의 쥐 모델에서, 인자 B-결핍 마우스는 혈소판 감소증에 덜 걸렸고 야생형 마우스와 비교하여 신장 장애로부터 보호되었으며, 미소혈관 혈전증에서 대체 경로의 LEA-1-의존적 활성화와 관련된다 (Morigi, M. et al., J. Immunol. 187:172-180, 2011). 본원의 실시예 33에서 설명된 바와 같이, 같은 모델에서, MASP-2 항체의 투여가 또한 효과적이었고 STX 도전 후 생존율을 증가시켰으며 미소혈관 혈전증에서 LEA-2-의존적 보체 경로와 관련된다.
상기에 기초하여, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 HUS는 치료 또는 예방에 있어서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 게다가, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 약제 단독과 비교하여 추가적인 치료 이점을 달성할 수도 있거나, 더 광범위한 환자 서브세트에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1 차단제 및 LEA-2 차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중 특이적 항체, 또는 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단할 수 있는 이중-특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에서 포함될 수도 있다.
aHUS
비정형 HUS는 희귀한 질환이며, 미국에서 백만 명 당 2명의 추정된 발생율을 갖는다 (Loirat, C. and Fremeaux-Bacchi, V. Orphanet J. Rare Dis. 6:60-90, 2011). 비정형 HUS는 어떤 나이에도 발생할 수 있지만, 대부분의 환자는 아동기 동안 발병한다. 비정형 HUS는 이질적이이다: 일부 경우는 가족성이고, 일부는 재발성이며, 일부는 감염성 질환, 전형적으로 상기도 또는 위장염에 의해 촉발된다. aHUSDML 발병은 보통 돌발적이며 대부분의 환자는 입원시 투석을 필요로 한다. 신장 외 발현이 환자의 약 20%에 존재하고 중추신경계, 심근 경색, 원위 허혈성 괴저(distal ischemic gangrene), 또는 다기관 부전을 수반할 수도 있다. aHUS의 치료는 장기 기능 장애, 혈장 주입 또는 혈장 교관, 및 에쿨리쥬맙, 최근 미국 및 유럽 연합에서 사용이 승인된 C5를 표적화하는 인간화된 단클론성 항체에 대한 지지적 관리를 포함한다. aHUS에서 예측은 D+HUS에서와 같이 양호하지 않으며, 급성 단계 중에 치사율은 대략 25%이고 대부분의 생존자는 말기 신장 질환에 걸린다.
비정형 HUS는 대략 50%의 환자들이 보체 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 돌연변이를 갖는다는 점에서 보체 기능 장애의 질환으로서 특성화되었다 (Zheng and Sadler, 2008 상기). 대부분의 돌연변이는 인자 H (FH)에서 보인다; 다른 돌연변이는 막 공통인자 단백질 (MCP), 인자 I (FI), 인자 B, 및 C3을 포함한다. 기능적 연구는 FH, MCP, 및 FI의 돌연변이가 기능의 손실 및 그러므로 더 많은 보체 활성화로 이어지는 반면에, 인자 B의 돌연변이는 기능이 증가된다. 이 돌연변이들의 효과는 대부분 대체 경로에 영향을 미친다. 이 유전적 이상은 돌연변이를 가지고 있지 않은 가족 구성원 중 대략 50%는 45살까지 질환을 제공하지 않기 때문에 질환의 유일한 원인이라기 보다 위험 인자이다 (Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011 상기).
인자 H는 대체 경로 보체 공격으로부터 숙주 조직을 보호하는 보체 제어 단백질이다. FH는 세 가지 방법으로 대체 경로 증폭 루프를 조절하는데, 그것은 C3b를 분할하는 FI에 대한 공통 인자이고, 그것은 대체 경로 C3 컨버타제, C3bBb의 형성을 억제하며, 그것은 세포 표면 및 조직 매트릭스에서 다가음이온에 결합하여 C3b의 침착을 차단한다 (Atkinson, J.P. and Goodship, T.H.J., J. Exp. Med. 6:1245-1248, 2007). aHUS 환자에서 대부분의 FH 돌연변이는 단백질의 C-말단 짧은 공통 반복 도메인에서 발생하는데, 이것은 FH의 헤파린, C3b, 및 내피로의 결함이 있는 결합을 발생시키지만, N-말단 도메인 사이에 있는 혈장 C3 조절을 변화시키지 않는다 (Pickering, M.C. et al., J. Exp. Med. 204:1249-1256, 2007). FH-결핍 마우스는
제어되지 않는 혈장 C3 활성화를 가지며 동시에 막 증식성 사구체 신염(membranoproliferative glomerulonephritis) 타입 II에 걸리지만, aHUS는 아니다. 하지만, aHUS-관련 인간 FH 돌연변이와 기능적으로 동등한 마우스 FH 단백질을 유전자 이식에 의해 발현하는 FH-결핍 마우스는 동시에 HUS에 걸리지만 막 증식성 사구체 신염 타입 II에는 걸리지 않으며, 신장 내피에서 대체 경로 활성화의 결함이 있는 제어가 FH-관련된 aHUS의 발병에 있어서 중요한 사건이라는 생체 내 증거를 제공한다 (Pickering et al., 2007 상기). FH-관려된 aHUS의 또 다른 형태는 FH 기능적 활성의 손실을 일으키는 항-FH 자가 항체를 갖는 환자에서 발생하며; 이 환자들 중 대부분은 다섯 개의 FH-관련된 단백질을 암호화하는 유전자의 결실을 갖는다 (Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011, 상기).
FH와 유사하게, MCP는 표적 세포에서 C3b 침착을 조절함으로써 보체 활성화를 억제한다. MCP 돌연변이는 낮은 C3b-결합 및 공통 인자 활성을 갖는 단백질을 발생시키며, 따라서 조절되지 않는 대체 경로 활성화를 허용한다. FI는 FH 및 MCP와 같은 공통 인자의 존재시 C3b 및 C4b를 분할하는 세린 프로테아제이고, 이로 인해 C3 및 C5 컨버타제의 형성을 방지하고 대체 및 고전적 보체 경로 둘 다를 억제한다. FI-관련된 aHUS 돌연변이 대부분은 C3b 및 C4b의 분해에 대하여 감소된 FI 활성을 발생시킨다 (Zheng and Stadler, 2008, 상기). FB는 대체 경로 컨버타제 C3bBb의 촉매 작용 부위를 가지고 있는 치모겐이다. 기능적 분석은 aHUS 관련된 FB 돌연변이가 증가된 대체 경로 활성화를 발생시킨다는 것을 나타냈다 (Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011, 상기). C3의 이형 접합체 돌연변이는 aHUS와 관련된다. 대부분의 C3 돌연변이는 MCP에 결합하기 위해 C3의 결함을 유발하며, C3b에 결합하는 FB의 증가된 능력 및 C3 컨버타제의 증가된 형성으로 이어진다 (Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011, 상기). 따라서, aHUS는 대체 경로 증폭 루프의 불충분한 제어로 이어지는 보체 유전자의돌연변이와 밀접하게 관련된 질환이다. 대체 경로 증폭 루프가 인자 B 단백질 분해 활성에 의존적이기 때문에, 및 LEA-1가 인자 B 활성화에 필요하기 때문에 (MASP-3 의존적 분할에 의해 또는 MASP-1이 인자 D의 성숙화에 기여하는 인자 D-매개된 분할에 의해), LEA-1-차단제는 민감한 개인에서 제어되지 않는 보체 활성화를 방지할 것으로 예상된다. 결과로서, LEA-1 차단제는 aHUS를 효과적으로 치료할 것으로 예상된다.
aHUS에서 비조절성 대체 경로 증폭 루프의 중심 역할이 널리 수용되는 한편, 보체 활성화를 시작하는 촉발자 및 수반된 분자적 경로가 해결되지 않았다. 상기-설명된 돌연변이를 가지고 있는 모든 개인이 aHUS에 걸리는 것은 아니다. 사실, 가족 연구는 aHUS의 유전자 침투도가 단지 ~50%라는 것을 제안하였다 (Sullivan M. et al., Ann Hum Genet 74:17-26 2010). 질환의 자연사는 aHUS가 감염성 에피소드 또는 손상과 같은 시작 사건 후에 가장 빈번하게 발달한다는 것을 제안한다. 감염원은 보체 시스템을 활성화하는 것으로 잘 알려져 있다. 기존의 후천적 면역력의 부재시, 감염원에 의한 보체 활성화는 주로 LEA-1 또는 LEA-2를 통해 시작될 수도 있다. 따라서, 감염에 의해 촉발된 렉틴-의존적 보체 활성화는 aHUS-취약한 개인에서 보체 활성화의 그 다음의 생리학적 증폭에 대한 시작 촉발자를 나타낼 수도 있는데, 이것은 궁극적으로 질환 진행으로 이어질 수도 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 LEA-1- 또는 LEA-2-억제제의 유효량을 투여함으로써 감염에 부차적인 aHUS로 고통받는 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
다른 형태의 숙주 조직에 대한 손상, 특히 혈관 내피에 대한 손상은 LEA-2를 통해 보체를 활성화시킬 것이다. 인간 혈관 내피 세포는 산화 스트레스를 받는데, 예를 들어, 렉틴에 결합하여 보체의 LEA-2 경로를 활성화시키는 표면 모이어티를 발현함으로써 반응한다 (Collard et al., Am J. Pathol 156(5):1549-56, 2000). 허혈/재관류 후 혈관 손상은 또한 생체 내에서 LEA-2를 통해 보체를 활성화시킨다 (Moller-Kristensen et al., Scand J Immunol 61(5):426-34, 2005). 이 설정에서 렉틴 경로 활성화는 숙주에 대한 생리학적 결과를 갖고, 실시예 22 및 23에서 나타난 바와 같이, MASP-2의 차단에 의한 LEA-2의 억제는 추가의 숙주 조직 손상 및 해로운 결과를 방지한다 (또한 Schwaeble PNAS, 2011, 상기를 참고하면 된다).
따라서, aHUS를 침전시키는 다른 공정은 LEA-1 또는 LEA-2를 활성화하는 것으로 또한 알려져 있다. 그러므로, LEA-1 및/또는 LEA-2 경로가 aHUS에 유전적으로 취약한 개인에서 비조절성 방식으로 부적절하게 증폭되어, aHUS 발병을 시작하는 시작 보체 활성화 메커니즘을 나타낼 가능성이 크다. 추론해보면, LEA-1 및/또는 LEA-2를 통해 보체의 활성화를 차단하는 약제는 aHUS 민감성 개인에서 질환 진행을 방지하거나 악화를 감소시킬 것으로 예상된다.
이 개념의 추가의 지원에 있어서, 최근 연구는 aHUS의 소아의 경우에서 스트렙토코쿠스-뉴모니애(Streptococcus-pneumoniae)를 중요한 유병 기생충으로 확인하였다 (Lee, C.S. et al, Nephrology, 17(1):48-52 (2012); Banerjee R. et al., Pediatr Infect Dis J., 30(9):736-9 (2011)). 이 특별한 병인은 중요한 치사율 및 장기간 발병율과 함께, 바람직하지 않은 예후를 갖는 것으로 나타난다. 특히, 이 경우들은 aHUS에 취약한 것으로 알려져 있는 보체 유전자에서 동시 돌연변이의 증거 없이 미소혈관증, 요독증(uremia) 및 용혈(hemolysis)의 발현으로 이어지는 비-장 감염을 수반하였다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애(S. pneumoniae)가 보체 활성화에 특히 효과적이며, 대부분 LEA-2를 통해 그렇게 된다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 따라서, 폐렴 감염과 관련된 비-장 HUS의 경우에, 미소혈관증, 요독증 및 용혈의 발현은 주로 LEA-2의 활성화에 의해 구동되는 것으로 예상되며, MASP-2 항체를 포함하는, LEA-2를 차단하는 약제는 이 환자들에서 aHUS의 진행을 방지하거나 질환 심각도를 감소시킬 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 MASP-2 억제제의 유효량을 투여함으로써 스트렙토코쿠스 뉴모니애와 관련된 비-장 aHUS로 고통받는 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
TTP
혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP)은 자가 면역에 의해 유발된 혈액 응고 시스템의 생명을 위협하는 장애 또는 응고 캐스케이드 또는 보체 시스템을 활성화하는 유전적 기능 장애이다 (George, JN, N Engl J Med; 354:1927-35, 2006). 이것은 신체를 통해 작은 혈관에서 많은 미세한 응고, 또는 혈전증을 발생시키며, 이것은 TMA의 특징이다. 적혈구 세포는 전단 응력(shear stress)를 받으며, 이것은 그것들의 막을 손상시키고, 혈관 내 용혈로 이어진다. 결과의 감소된 혈류 및 내피 손상은 뇌, 심장, 및 신장을 포함하는 장기 손상을 일으킨다. TTP는 임상적으로 혈소판 감소증, 미세혈관병성 용혈성 빈혈, 신경학적 변화, 신부전 및 열병을 특징으로 한다. 혈장 교체 전 시대에서, 사망률은 급성 에피소드 중에 90% 였다. 혈장 교체와 함께, 6개월에 생존율은 약 80%였다.
TTP는 효소 ADAMTS-13, 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor; vWF)의 큰 멀티머를 더 작은 유닛으로의 분할의 원인인 메탈로프로테아제의 유전적 또는 후천적 억제로부터 발생할 수도 있다. ADAMTS-13 억제 또는 결핍은 궁극적으로 증가된 응고를 일으킨다 (Tsai, H. J Am Soc Nephrol 14: 1072-10081, 2003). ADAMTS-13은 vWF의 활성을 조절하고; ADAMTS-13의 부재시, vWF는 미소혈관계에서 혈소판에 결합하여 환자가 혈소판 응집 및 혈전증에 취약하게 할 가능성이 더 높은 큰 멀티머를 형성한다.
ADAMTS13에서 많은 돌연변이가 TTP에 걸린 개인에서 확인되었다. 질환은 또한 ADAMTS-13에 대한 자가 항체로 인해 발달할 수 있다. 게다가, TTP는 유방암, 위장관암, 또는 전립선암 (George JN., Oncology (Williston Park). 25:908-14, 2011), 임신 (임신 중기 또는 산후) (George JN., Curr Opin Hematol 10:339-344, 2003) 중에 발달할 수 있거나, HIV 또는 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosis)와 같은 자가 면역 질환과 같은 질환에 관련된다 (Hamasaki K, et al., Clin Rheumatol.22:355-8, 2003). TTP는 또한 헤파린, 퀴닌, 면역 매개된 성분, 암 화학 치료제 (블레오마이신, 씨스플라틴, 시토신 아라비노시드, 다우노마이신 젬시타빈, 미토마이신 C, 및 타목시펜), 시클로스포린 A, 경구 피임약, 페니실린, 리팜핀 및 티클로피딘 및 클로피도그렐을 포함하는 항-혈소판제를 포함하는, 특정 약물 치료에 의해 유발될 수 있다 (Azarm, T. et al., J Res Med Sci., 16: 353-357, 2011). TTP와 관련된 다른 인자 또는 질병은 벌침 독, 패혈증, 지라의 격리(splenic sequestration), 이식, 맥관염(vasculitis), 혈관 수술(vascular surgery), 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애 및 시토메갈로바이러스와 같은 감염과 같은 독소이다 (Moake JL., N Engl J Med., 347:589-600, 2002). 일시적 기능적 ADAMTS-13 결핍으로 인한 TTP는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염과 관련된 내피 세포 손상의 결과로서 발생할 수 있다 (Pediatr Nephrol, 26:631-5, 2011).
혈장 교체는 TTP에 대한 표준 치료법이다 (Rock GA, et al., N Engl J Med 325:393-397, 1991). 혈장 교체는 유전적 결핍을 갖고 있는 환자의 ADAMTS-13 활성을 대체하여 후천적 자가 면역 TTP에 걸린 상기 환자에서 ADAMTS-13 자가 항체를 제거한다 (Tsai, H-M, Hematol Oncol Clin North Am., 21(4): 609-v, 2007). 면역억제제와 같은 추가의 약제가 보통 치료에 추가된다 (George, JN, N Engl J Med, 354:1927-35, 2006). 하지만, 혈장 교체는 약 20%의 환자에 대해서는 성공적이지 않고, 환자 중 3분의 1 이상에서 재발이 일어나고, 세포 원형질 분해는 비용적으로 및 기술적으로 부담이 크다. 게다가, 많은 환자들이 혈장 교체를 견딜 수 없다. 그 결과 TTP에 대한 추가적이고 더 나은 치료에 대한 중요한 필요가 남아있다.
TTP가 혈액 응고 캐스케이드의 장애이기 때문에, 보체 시스템의 길항제로의 치료는 질환의 안정화 및 교정을 도울 수도 있다. 대체 보체 경로의 병리학적 활성이 aHUS와 관련되는 한편, TTP에서 보체 활성화의 역할은 불분명하다. ADAMTS13의 기능적 결핍은 TTP에 대한 민감성에 중요하지만, 그것은 급성 에피소드를 유발하는 것에 충분하지 않다. 환경 인자 및/또는 다른 유전적 변화는 TTP의 발현에 기여할 수도 있다. 예를 들어, 응고 캐스케이드, vWF, 혈소판 기능, 내피 혈관 표면의 구성요소, 또는 보체 시스템의 조절에 수반된 단백질을 암호화하는 유전자는 급성 혈전성 미소혈관증의 발달에 관련될 수도 있다 (Galbusera, M. et al., Haematologica, 94: 166-170, 2009). 특히, 보체 활성화는 결정적인 역할을 하는 것으로 나타났는데; ADAMTS-13 결핍과 관련된 혈전성 미소혈관증의 혈청은 C3 및 MAC 침착 및 보체 활성화에 의해 폐지될 수 있는 그 다음의 호중구 활성화를 유발하는 것으로 나타났다 (Ruiz-Torres MP, et al., Thromb Haemost, 93:443-52, 2005). 게다가, 최근에 TTP의 급성 에피소드 동안에 C4d, C3bBbP, 및 C3a의 수준이 증가되며 (M. Reti et al., J Thromb Haemost. 10(5):791-798, 2012), 고전적, 렉틴 및 대체 경로의 활성화와 일치하는 것으로 나타났다. 급성 에피소드에서 이 증가된 양의 보체 활성화는 말단 경로 활성화를 시작할 수도 있고 TTP의 추가의 악화의 원인이 될 수도 있다.
TTP에서 ADAMTS-13 및 vWF의 역할은 분명히 혈소판의 활성화 및 응집 및 미소혈관 장애에 있어서 전단 응력 및 침착에서 그것들의 역할의 원인이 된다. 활성화된 혈소판은 보체의 고전적 및 대체 경로 둘 다와 상호작용하고 이것들을 촉발한다. 혈소판-매개된 보체 활성화는 염증 매개자 C3a 및 C5a를 증가시킨다 (Peerschke E. et al., Mol Immunol, 47:2170-5 (2010)). 따라서 혈소판은 유전적 또는 자가 면역 TTP에서 고전적 보체 활성화의 표적의 역할을 할 수도 있다.
상기 설명된 바와 같이, MASP-1 및 LEA-2-매개된 프로트롬빈 활성화의 트롬빈-유사 활성에 의한 보체의 렉틴-의존적 활성화는 HUS에서 발생하는 응고 및 미소혈관 혈전증에 대한 내피 손상 관련 지배적 분자 경로이다. 유사하게, LEA-1 및 LEA-2의 활성화는 TTP에서 응고 시스템을 직접 구동할 수도 있다. LEA-1 및 LEA-2 경로 활성화는 TTP에서 ADAMTS-13 결핍에 의해 유발된 초기 내피 손상에 반응하여 시작될 수도 있다. 그러므로 MASP-2 기능, MASP-1 기능, MASP-3 기능, 또는 MASP-1 및 MASP-3 기능을 차단하는 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 TTP로 고통받는 환자에서 미소혈관 응고, 혈전증, 및 용혈과 관련된 미소혈관 장애를 완화시킬 것으로 예상된다.
뇌졸중을 포함하여 자반병, 신부전, 저 혈소판, 빈혈 및/또는 혈전증 중 하나 이상과 함께 TTP로 고통받는 환자는 전형적으로 응급실에 존재한다. TTP에 대한 관리의 현재 표준은 2주 이상의 기간 동안, 전형적으로 일주일에 3번, 하지만 최대 매일 대체 세포 원형질 분해의 내부-카테터(catheter) 전달 (예를 들어, 정맥 내 또는 카테터의 다른 형태)을 수반한다. 개체가 ADAMTS13의 억제자 (즉, ADAMTS13에 대한 내인성 항체)의 존재에 대하여 양성으로 테스트하면, 세포 원형질 분해는 면역 억제 치료 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 리툭산, 또는 시클로스포린)와 조합하여 수행될 수도 있다. 난치성 TTP에 걸린 개체 (TTP 환자 중 대략 20%)는 적어도 2주의 세포 원형질 분해 치료에 반응하지 않는다.
상기에 따라, 한 구체예에서는, TTP의 초기 진단의 설정에서, 또는 TTP의 진단 (예를 들어, 중추신경계 수반, 심각한 혈소판 감소증 (아스피린이 없으면 5000/μL 이하, 아스피린이 있으면 20,000/μL 이하의 혈소판 수), 심각한 심장 수반, 심각한 폐 수반, 위장 경색 또는 괴저)과 일치하는 하나 이상의 증상을 나타내는 개체에서, 세포 원형질 분해의 부재시 제1 선의 치료로서, 또는 세포 원형질 분해와 조합하여 LEA-2 억제제 (예를 들어, MASP-2 항체) 또는 LEA-1 억제제 (예를 들어, MASP-1 또는 MASP-3 항체)의 유효량으로 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 제1 선 치료로서, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제는 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 일부 구체예에서, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제는 혈장 기증자에서, 또는 세포 원형질 분해를 싫어하는 개체에서, 또는 세포 원형질 분해가 이용 불가능한 설정에서 출혈, 감염, 및 장애 및/또는 알레르기에 대한 노출과 같은 세포 원형질 분해의 잠재적 합병증을 막기 위해 세포 원형질 분해의 부재시 제1 선 치료로서 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제는 면역 억제제 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 또는 시클로스포린)와 조합하여 (동시-투여 등) 및/또는 농축된 ADAMTS-13과 조합하여 TTP로 고통받는 개체에 투여된다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 기간 (예를 들어, 적어도 1일 내지 일주일 또는 2주일 동안 지속되는 급성 단계) 동안 LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제를 TTP로 고통받는 개체에 카테터를 통해 (예를 들어, 정맥 내로) 투여한 후 이어서 제2 기간 (예를 들어, 적어도 2주 이상의 만성 단계) 동안 LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제를 개체에 피하로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 기간에 투여는 세포 원형질 분해의 부재시 일어난다. 일부 구체예에서, 개체가 TTP와 연관된 하나 이상의 증상으로 고통받는 것을 방지하도록 개체를 유지하는 방법이 사용된다.
또 다른 구체예에서, TTP의 하나 이상의 증상을 감소시키는데 효과적인 LEA-1 및/또는 LEA-2의 양을 투여함으로써, 난치성 TTP로 고통받는 개체 (즉, 적어도 2주의 세포 원형질 분해 치료에 반응하지 않는 개체)를 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제자는 피하를 통해 또는 다른 비경구 투여에 의해 적어도 2주 이상의 기간 동안 만성 기준으로 난치성 TTP에 걸린 개체에 투여된다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
일부 구체예에서, 방법은 치료 전에, 및 최적으로 치료 중에 개체에서 적어도 하나의 보체 인자 (예를 들어, C3, C5)의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하며, 표준 값 또는 건강한 대조군 개체와 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 결정은 LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제의 지속적인 처리에 대한 필요성을 나타낸다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제를 TTP로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에, 피하로 또는 정맥 내로, 투여하는 단계를 포함한다. 치료는 바람직하게 매일 되지만, 매달과 같이 드물게 될 수도 있다. 치료는 개체의 혈소판 수가 적어도 연속 2일 동안에 150,000/ml보다 더 높을 때까지 계속된다.
요약하면, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 HUS, aHUS 및 TTP를 포함하는, TMA의 치료에 있어서 독립적인 치료적 이점을 갖는 것으로 예상된다. 게다가, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는
약제 단독과 비교하여 추가적인 치료 이점을 달성할 것으로 예상되거나, 또는 변종 형태의 TMA로 고통받는 광범위한 환자 서브세트에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1 차단제 및 LEA2 차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단할 수 있는 이중 특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에서 포함될 수도 있다.
상기에 따라, 본 발명의 양태는 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 혈전성 미소혈관증으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP)과 같은 혈전성 미소혈관증을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것들의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP)과 같은 혈전성 미소혈관증을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것들의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단계를 더 포함하며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 혈전성 미소혈관증으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, LEA-1 및 LEA-2를 개별적으로 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 혈전성 미소혈관증을 치료하거나 예방하거나 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
IX. 본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 죄거의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 혈전성 미소혈관증으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에서 혈전성 미소혈관증을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 투여될 수도 있다. 천식에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
천식은 기도의 일반적인 만성 염증 질환이다. 미국에서 대략 2500만 명의 인구가 천식에 걸려있는데, 700만 명의 18세 이하의 아동들을 포함하며, 절반 이상은 매년 적어도 한번의 천식 공격을 경험하고, 매년 170만 건 이상의 응급실 방문 및 450,000건의 입원으로 이어진다 (gov/health/prof/lung/천식/naci/천식-info/index.htm.의 월드 와이드 웹, 2012년 5월 4일에 접속됨). 질환은 다수의 임상적 표현형과 이질적이다. 가장 흔한 표현형은 알레르기성 천식이다. 다른 표현형은 비알레르기성 천식, 아스피린-악화된 호흡기 질환, 후-감염성 천식, 직업적 천식, 공기 중 자극물질-유발된 천식, 및 운동-유발된 천식을 포함한다. 알레르기성 천식의 기본적인 특징은 다양한 특이적 및 비특이적 자극에 대한 기도 과민반응성 (airway hyperresponsiveness; AHR), 과도한 기도 점액 생산, 호산구성 폐렴(pulmonary 호산성ia), 및 혈청 IgE의 증가된 농도를 포함한다. 천식의 증상은 기침, 천명(wheezing), 흉통(chest tightness), 및 숨가쁨을 포함한다. 천식 치료의 목표는 질환을 제어하여 악화, 매일의 증상을 최소화하고, 환자가 신체적으로 활성이 되도록 하는 것이다. 현재 치료 가이드라인은 천식 제어가 이루어질 때까지 단계별 치료를 추천한다. 제1 치료 단계는 필요에 따라 신속하게 작용하는 흡입된 β2-작용제에 이어서, 장기간 작용하는 흡입된 β2-작용제, 류코트리엔 개질 약물, 테오필린, 경구용 글루코코르티코스테로이드, 및 항-IgE 단클론성 항체와 같은 흡입된 코르티코스테로이드와 같이 제어 의약품의 추가이다.
천식은 기원이 다원적이지만, 일반적으로 그것이 유전적으로 민감한 개인에서 보통의 환경적 항원에 대한 부적절한 면역학적 반응의 결과로서 발생하는 것으로 수용된다. 천식은 보체 활성화와 연관되고 아나필라톡신 (AT) C3a 및 C5a는 알레르기성 반응의 발달 및 조절에 적절한 전염증성 및 면역조절 속성을 갖는다 (Zhang, X. and Kohl, J. Expert. Rev. Clin. Immunol., 6:269-277, 2010). 하지만, 천식에서 보체의 고전적, 대체, 및 렉틴 경로의 상대적인 수반은 잘 이해되어 있지 않다. 대체 경로는 알레르겐의 표면에서 활성화될 수도 있고 렉틴 경로는 알레르겐 다당류 구조의 인식을 통해 활성화될 수도 있으며, 두 공정은 AT의 생성으로 이어진다. 보체는 수반된 원인이 되는 알레르겐에 의존적인 다른 경로에 의해 활성화될 수도 있다. 예를 들어, 파리에타리아(Parietaria) 과의 고도로 알레르기성인 꽃가루는 C4의 MBL-의존적 활성화를 촉진하는데 매우 효과적이며, LEA-2와 관련된다. 반대로, 집먼지 진드기 알레르겐은 보체 활성화를 위해 MBL을 필요로 하지않는다 (Varga et al. Mol Immunol., 39(14):839-46, 2003).
천식의 환경적 촉발자는 대체 경로에 의해 보체를 활성화시킬 수도 있다. 예를 들어, 인간 혈청의 담배 연기 또는 디젤 배기가스 입자로의 시험관 내 노출은 보체의 활성화를 일으켰고 효과는 EDTA의 존재에 의해 영향을 받지 않으며, 활성화는 고전적 경로 대신에 대체 경로를 통해서 이루어진다는 것을 제안한다 (Robbins, R.A. et al, Am. J. Physiol. 260:L254-L259, 1991; Kanemitsu, H., et al., Biol. Pharm. Bull. 21:129-132, 1998). 알레르기성 기도 염증에서 보체 경로의 역할은 마우스 오발부민 감작 및 도전 모델에서 평가되었다. 야생형 마우스는 공기 알레르겐 도전에 반응하여 목 및 기도 염증을 발달시켰다. 보체 활성화의 모든 경로를 억제하는 Crry-Ig 융합 단백질은 알레르기성 폐 염증의 마우스 오발부민 모델에서 전신으로 또는 흡입에 의해 국부적으로 투여될 때 AHR 및 폐 염증을 예방하는데 효과적이었다 (Taube et al., Am J Respir Crit Care Med., 168(11):1333-41, 2003).
야생형 마우스와 비교하여, 인자 B-결핍 마우스는 더 낮은 AHR 및 기도 염증을 입증하는 반면에 C4-결핍 마우스는 야생형 마우스와 유사한 효과를 갖고 있었다 (Taube, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:8084-8089, 2006). 이 결과는 쥐 공기 알레르겐 도전 모델에서 고전적 수반은 아니지만 대체 경로에 대한 역할을 지지한다. 대체 경로의 중요성에 대한 추가의 증거는 같은 마우스 모델을 사용하는 인자 H (FH)의 연구에서 제공되었다 (Takeda, K., et al., J. Immunol. 188:661-667, 2012). FH는 대체 경로의 음성 조절자이고 자가 조직의 자가 손상을 방지하는 작용을 한다. 내인성 FH는 알레르겐 도전 중에 기도에 존재하는 것으로 발견되었다. FH의 재조합 경쟁적 길항제로의 억제는 AHR 및 기도 염증의 정도를 증가시켰다 (Takeda et al., 2012, 상기). CR2-fH, fH의 보체 조절 활성을 기존의 보체 활성화의 부위로 표적화하는 FH의 보체-조절 영역에 대한 CR2의 iC3b/C3d 결합 영역에 결합하는 키메라 단백질의 치료적 전달은 알레르겐 도전 후 AHR의 발달 및 기도로의 호산성 침투를 보호하였다 (Takeda et al., 2012, 상기). 보호 효과는 오발부민 뿐만 아니라 인간에게 적절한 알레르겐인 돼지풀 알레르겐으로 입증되었다.
천식에서 렉틴-의존적 보체 활성화의 역할은 균류 천식의 마우스 모델에서 평가되었다 (Hogaboam　et　al., J. Leukocyte Biol. 75:805-814, 2004). 이 연구는 만난-결합 렉틴-A (MBL-A), 렉틴 보체 경로의 활성화를 위해 인식 성분으로 기능하는 카르보히드레이트 결합 단백질이 유전적으로 결핍된 마우스를 사용하였다. MBL-A(+/+) 및 MBL-A(-/-) 아스페르질루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)-민감한 마우스는 아스페르질루스 푸미가투스(A. fumigatus) 분생자(conidia)로의 면역 테스트(i.t.) 도전 후 제4 일 및 제28 일에 검사되었다. 민감한 MBL-A(-/-) 마우스에서 AHR은 만감한 MBL-A (+/+) 군과 비교하여 분생자 도전 후 두 시간대에서 크게 감소되었다. 폐 TH2 시토킨 수준 (IL-4, IL-5 및 IL-13)은 분생자 후 제4 일에 야생형 군과 비교하여 아스페르질루스 푸미가투스-민감한 MBL-A(-/-) 마우스에서 훨씬 더 낮았다. 이 결과는 MBL-A 및 렉틴 경로가 만성 균류 천식 중에 AHR의 발달 및 유지에 있어서 주요 역할을 한다는 것을 나타낸다.
상기 상세히 설명된 발견은 천식의 발병에 있어서 렉틴-의존적 보체 활성화의수반을 제안한다. 실험 데이터는 인자 B 활성화가 중심 역할을 한다는 것을 제안한다. 인자 B의 렉틴-의존적 활성화 및 그 다음에 대체 경로의 활성화에 있어서 LEA-1에 대한 근본적인 역할에 비추어, LEA-1 차단제가 대체 경로에 의해 매개된 천식의 특정 형태의 치료에 이로울 것으로 예상된다. 따라서 이러한 치료는 집먼지 진드기-유발된 천식, 또는 담배 연기 및 디젤 배기가스와 같은 환경적 촉발자에 의해 유발된 천식에서 특히 유용할 수도 있다. 다른 한편으로 꽃가루에 의해 촉발된 천식 반응은 LEA-2-의존적 보체 활성화를 적용할 가능성이 크다. 그러므로, LEA-2-차단제는 환자의 이 서브세트에서 천식 질병을 치료하는데 특히 유용한 것으로 예상된다.
상기 상세히 설명된 데이터를 고려해서, 발명자들은 LEA-1 및 LEA-2가 천식에서 병리학적 보체 활성화를 매개하는 것으로 생각한다. 자극적 알레르기원에 의존적으로, LEA-1 또는 LEA-2가 바람직하게 수반될 수도 있다. 따라서, LEA-2-차단제와 조합된 LEA-1-차단제는 근본적인 병인에 상관없이 여러 형태의 천식의 치료에 있어서 유용할 수도 있다. LEA-1 및 LEA-2-차단제는 폐 염증 및 천식의 증상을 예방하거나, 치료하거나 또는 반전시키는데 있어서 상보적, 추가적 또는 시너지 효과를 가질 수도 있다.
조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중 특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단할 수 있는 이중 특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에서 포함될 수도 있다.
상기에 따라, 본 발명의 양태는 천식을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 lea-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 천식으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 천식을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단계를 더 포함하며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 천식으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 설명된 바와 같이, LEA-1 및 LEA-2를 개별적으로 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 천식을 치료하거나 예방하거나 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 최적의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 천식으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에서 천식을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 투여될 수도 있다.
X. 조밀침착병에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할, MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
막 증식성 사구체 신염 (MPGN)은 형태학적으로 사구체 간질의 내피 하 확장으로 인해 혈관 사이 세포 증식 및 사구체 모세관 벽의 두께를 특징으로 하는 신장 질환이다. MPGN은 감염성 질환, 전신성 면역 복합 질환, 신생물, 만성 간 질환, 등과 같이 근본적인 질환으로, 1차 (특발성으로도 불림) 또는 2차로 분류된다. 특발성 MPGN은 세 개의 형태적 타입을 포함한다. 타입 I, 또는 고전적 MPGN은 면역 복합체의 내피 하 침착 및 고전적 보체 경로의 활성화를 특징으로 한다. 타입 II, 또는 조밀침착병 (DDD)은 추가적인 막 내 조밀 침착을 특징으로 한다. 타입 III는 추가적인 상피 하 침착을 특징으로 한다. 특발성 MPGN은 희귀하며, 신장 증후군의 주요 신장 원인의 대략 4 내지 7%를 차지한다 (Alchi, B. and Jayne, D. Pediatr. Nephrol. 25:1409-1418, 2010). MPGN은 주로 아동 및 젊은 성인들에 영향을 미치고 신장 증후군, 급성 신증후군, 무증상 단백뇨(asymptomatic proteinuria) 및 혈뇨(hematuria), 또는 재발성 육안적 혈뇨로서 존재할 수도 있다. 신장 기능 장애는 대부분의 환자에서 발생하고 질환은 서서히 점진적 과정을 가지며, 대략 40%의 환자가 진단 10년 내 말기 신장 질환에 걸린다 (Alchi and Jayne, 2010, 상기). 현재의 치료 옵션은 코르티코스테로이드, 면역 억제제, 항혈소판 요법, 및 혈장 교체를 포함한다.
DDD는 신장 생검 조직의 면역 형광 염색에 의해 면역글로불린의 부재 및 C3의 존재로 진단되고, 전자 현미경은 사구체 기저막을 따라 특징적인 밀도 오스뮴 친화성 침착을 나타낸다. DDD는 보체의 대체 경로의 조절 장애에 의해 유발되는데 (Sethi et al, Clin J Am Soc Nephrol. 6(5):1009-17, 2011), 이것은 많은 다른 메커니즘으로부터 발생할 수 있다. DDD에서 가장 흔한 보체 시스템 이상은 반감기를 증가시키고 그러므로 경로의 활성화를 증가시키는 대체 경로 C3 컨버타제 (C3bBb)에 대한 자가 항체인 C3 신장 인자의 존재이다 (Smith, R.J.H. et al., Mol. Immunol. 48:1604-1610, 2011). 다른 대체 경로 이상은 인자 H의 기능을 차단하는 인자 H 자가 항체, 기능적 C3 돌연변이의 획득, 및 인자 H의 유전적 결핍을 포함한다 (Smith et al., 2011, 상기). 최근 경우의 보고서는 에클리쥬맙 (항-C5 단클론성 항체) 처리가 DDD에 걸린 두 명의 환자에서 신장 기능의 개선과 관련된다는 것을 나타내며 (Daina, E. et al., New Engl. J. Med. 366:1161-1163, 2012; Vivarelli, M. et al., New Engl. J. Med. 366:1163-1165, 2012), 신장 결과에서 보체 활성화에 대한 원인이 되는 역할을 제안한다.
유전적, 기능적 및 면역조직화학적 및 입증되지 않은 임상적 데이터가 제공되면, DDD의 발병에 있어서 보체에 대한 중심 역할이 잘 확립된다. 따라서, 보체 활성화의 질환-유발 메커니즘, 또는 그 다음의 보체 활성화 생성물을 차단하는 개입은 이 질병을 치료하는데 치료적으로 유용할 것으로 예상된다.
인간 유전적 데이터는 대체 경로 증폭 루프의 부적절한 제어 또는 과도한 활성화가 중요한 역할을 한다고 제안하는 한편, 보체-시작 사건은 확인되지 않았다. 신장 생검 조직에서 면역 조직 화학적 연구는 병에 걸린 조직에서 MBL 침착의 증거를 나타내며, DDD에서 병리학적 보체 활성화의 시작에서 렉틴 경로의 수반을 제안한다 (Lhotta et al, Nephrol Dial Transplant., 14(4):881-6, 1999). 대체 경로의 중요성은 실험 모델에서 더 확증되었다. 인자 H-결핍 마우스는 인간 질병의 특성인 점진적 단백뇨 및 신장 병리학적 병변에 걸린다 (Pickering et al., Nat Genet., 31(4):424, 2002). Pickering et al.은 인자 B의 절제를 입증하였는데, 이것은 대체 경로의 LEA-1-의존적 활성화를 매개하고, 인자 H-결핍 마우스를 DDD로부터 완전히 보호한다 (Pickering et al., Nat Genet., 31(4):424, 2002).
따라서 LEA-1을 차단하는 약제가 대체 경로의 렉틴-의존적 활성화를 효과적으로 차단하고, 따라서 DDD에 대하여 효과적인 치료를 제공할 것으로 예상된다. 대체 경로 증폭 루프가 DDD 환자에서 조절 불가능하면, 증폭 루프를 차단하는 약제가 효과적일 것으로 더 예상될 수 있다. MASP-1 또는 MASP-1 및 MASP-3을 차단하는 LEA-1-표적화 약물이 인자 D의 성숙화를 억제하기 때문에, 이러한 약제는 대체 경로 증폭 루프를 효과적으로 차단할 것으로 예측된다.
상기 설명된 바와 같이, 병에 걸린 신장 표본에서 확연한 MBL 침착이 발견되었으며, DDD 발병에서 렉틴-구동된 활성화 사건의 개연적 수반을 강조한다. 사구체 모세관에 대한 초기 조직 손상이 확립되면, 손상된 사구체 내피에 결합하는 추가적인 MBL 및 근본적인 혈관 사이 구조가 발생한다. 이러한 조직 손상은 LEA-2의 활성화로 이어지는 것으로 잘 알려져 있는데, 따라서 이것은 추가의 보체 활성화를 유발할 수 있다. 그러므로, LEA-2-차단제는 또한 손상된 사구체 구조에서 추가의 보체 활성화를 방지하는데 유용하고, 따라서 말기 신부전에 대한 추가의 질환 진행을 미연에 방지하는 것으로 예상된다.
상기 상세히 설명된 데이터는 LEA-1 및 LEA-2가 DDD에서 별개의 병리학적 보체 활성화 공정을 촉진한다는 것을 제안한다. 따라서, LEA-1-차단제 및 LEA-2 차단제는, 단독으로 또는 조합으로, DDD를 차료하는데 유용한 것으로 예상된다.
조합하여 사용될 때, LEA-1- 및 LEA-2-차단제는 약제 단독보다 더 효과적이거나, 다른 단계의 질환을 치료하는데 유용한 것으로 예상된다. 따라서 LEA-1- 및 LEA-2-차단제는 DDD-관련된 신장 기능 장애를 예방하거나, 치료하거나 또는 반전시키는데 있어서 상보적, 추가적 또는 시너지 효과를 가질 수도 있다.
조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1 차단제 및 LEA2 차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, 억제 기능을 가진 LEA-1 및 LEA-2 차단제는 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중 특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단할 수 있는 이중-특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에서 포함될 수도 있다.
상기에 따라, 본 발명의 양태는 조밀침착병을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 조밀침착병으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 조밀침착병을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 조밀침착병으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 조밀침착병을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3-억제제의 치료적 유효량을 조밀침착병으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 조밀침착병을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것들의 심각도를 감소시키는데 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것들로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 필요로 하는 개체에서 조밀침착병을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 필요로 하는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 투여될 수도 있다.
XI. 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할, 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염 (NCGN)은 사구체 모세관 벽이 염증의 증상을 나타내는 신속하게 점진적인 사구체 신염의 한 형태이지만 소량의 검출 가능한 면역 복합체 침착 또는 사구체 기저막에 대한 항체를 갖는다. 질병은 신장 기능의 신속한 감소와 연관된다. NCGN에 걸린 대부분의 환자는 항 호중구 세포질 자가 항체 (antineutrophil cytoplasmic autoantibody; ANCA)를 갖고 따라서 ANCA-관련 맥관염으로 불리는 질환의 군에 속한다는 것이 발견된다. 맥관염은 혈관 벽의 염증 및 피브리노이드 괴사를 특징으로 하는 혈관의 장애이다. 전신성 맥관염은 혈관 크기에 따라 분류된다: 대형, 중형, 및 소형. 여러 형태의 소형 혈관 맥관염, 즉 베게너 육아종증(Wegener granulomatosis), 현미경 다발성 맥관염(microscopic polyangiitis), 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 및 신장-제한된 맥관염 (NCGN)은 ANCA의 존재과 관련된다. 그것들은 또한 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus)와 같이 근본적인 질병의 발현일 수 있다. ANCA에 대한 표적 항원은 프로테이나제-3 (PR3) 및 미엘로퍼옥시다제 (MPO)를 포함한다. 소수-면역성 NCGN은 희귀한데, 영국 웨식스에서 백만 명 당 대략 4명의 발병률이 보고되었다 (Hedger, N. et al., Nephrol. Dial. Transplant. 15:1593-1599, 2000). 소수-면역성 NCGN에 걸린 128명의 환자의 웨식스 시리즈에서, 73%가 ANCA-양성이었고 환자 중 59%가 초기 투석을 필요로 하였으며 36%가 장기간 투석을 필요로 한다. 소수-면역 NCGN에 대한 치료는 코르티코스테로이드 및 시클로포스파미드 및 아자티오프린과 같은 면역 억제제를 포함한다. ANCA-관련 맥관염에 대한 추가적인 치료 옵션은 리툭시맙 및 혈장 교체를 포함한다 (Chen, M. and Kallenberg, C.G.M. Nat. Rev. Rheumatol. 6:653-664, 2010).
NCGN은 소량의 보체 침착을 특징으로 하지만, 보체의 대체 경로는 그것의 발병에 관련되었다. MPO-ANCA-관련된 소수-면역 NCGN에 걸린 7명의 환자의 신장 생검 조직 평가는 막 공격 복합체, C3d, 인자 B, 및 인자 P의 존재를 검출하는 반면에 (이것들은 정상 대조군 또는 미세 변화 질환에 걸린 환자의 생검 조직에서는 검출되지 않았다), C4d 및 민노스 결합 렉틴은 검출되지 않았으며, 대체 경로의 선택적 활성화를 제안한다 (Xing, G.Q. et al. J. Clin. Immunol. 29:282-291, 2009). 실험적 NCGN은 항-MPO IgG의 야생형 마우스로의 전이 또는 항-MPO 비장세포의 면역-결핍 마우스로의 전이에 의해 유발될 수 있다 (Xiao, H. et al. J. Clin. Invest. 110:955-963, 2002). NCGN의 이 마우스 모델에서, 특이적 보체 활성화 경로의 역할은 넉아웃 마우스를 사용하여 조사되었다. 항-MPO IgG의 주사 후, C4-/- 마우스는 야생형 마우스와 비슷한 신장 질환에 걸린 반면에 C5-/- 및 인자 B-/- 마우스는 신장 질환에 걸리지 않았으며, 대체 경로는 이 모델에 수반되었지만 고전적 및 렉틴 경로는 아니었다 (Xiao, H. et al. Am. J. Pathol. 170:52-64, 2007). 게다가, TNF-α-준비된 인간 호중구를 가진 환자의 MPO-ANCA 또는 PR3-ANCA IgG의 배양은 C3a의 발생에 의해 검출된 바와 같이 정상 인간 혈청에서 보체 활성화를 일으키는 인자의 방출을 유발하였는데; 이 효과는 건강한 개체의 IgGF로는 관찰되지 않았으며, 호중구 및 보체 활성화에서 ANCA의 잠재적 병원성 역할를 제안하였다 (Xiao et al., 2007, 상기).
이 질병의 대체 경로에 대하여 상기 개요가 서술된 역할에 기초하여, 대체 경로의 활성화의 차단이 ANCA 양성 NCGN의 치료에 있어서 유용할 것이라고 예상된다. 발병을 위해 fB 활성화가 필요하면, LEA-1의 억제자가 이 질병을 치료하는데 있어서, 및 이 환자들의 신장 기능의 추가의 감소를 방지하는데 있어서 특히 유용할 것으로 예상된다.
환자의 또 다른 서브세트는 ANCA의 부재시 신장 기능의 신속한 감소에 의해 동반되는 반월 형성과 함께 점진적 신장 맥관염에 걸린다. 이 형태의 질병은 ANCA-음성 NCGN으로 불리고 소수 면역 NCGN에 걸린 모든 환자의 약 3분의 1을 구성한다 (Chen et al, JASN 18(2): 599-605, 2007). 이 환자들은 더 젊어지는 경향이 있고, 신장 결과는 더 심각해지는 경향이 있다 (Chen et al., Nat Rev Nephrol., 5(6):313-8, 2009). 이 환자들의 차별적인 병리학적 특성은 신장 병변에서 MBL 및 C4d의 침착이다 (Xing et al., J Clin Immunol. 30(1):144-56, 2010). 신장 생검 조직에서 MBL 및 C4d 염색 강도는 신장 기능과 음의 상관 관계가 있었다 (Xing et al., 2010, 상기). 이 발견들은 발병에서 렉틴-의존적 보체 활성화에 대한 중요한 역할을 제안한다. 인자 B는 아니지만, C4d가 보통 병에 걸린 조직 표본에서 발견된다는 사실은 LEA-2 수반을 나타낸다.
상기 설명된 ANCA 음성 NCGN에서 렉틴-의존적 보체 활성화의 역할에 기초하여, LEA-2 경로의 활성호를 차단하는 것이 ANCA 음성 NCGN의 치료에 유용할 것으로 예상된다.
상기 상세히 설명된 데이터는 LEA-1 및 LEA-2가 각각 ANCA-양성 및 ANCA-음성 NCGN에서 병리학적 보체 활성화를 매개한다는 것을 제안한다. 따라서, LEA-2-차단제와 조합돈 LEA-1-차단제는 근본적인 병인과 상관없이, 모든 형태의 소수-면역 NCGN의 치료에 유용할 것으로 예상된다. 따라서 LEA-1- 및 LEA-2-차단제는 NCGN-관련된 신장 기능 장애를 예방하거나, 치료하거나 또는 반전시키는데 있어서 상보적, 추가적 또는 시너지 효과를 가질 수도 있다. 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 약제 단독과 비교하여 추가적인 치료 이점을 달성할 수도 있거나, 광범위한 환자의 서브세트에 대한 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1 차단제 및 LEA2 차단제의 동시-발현에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중 특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단할 수 있는 이중-특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에서 포함될 수도 있다.
상기에 따라, 본 발명의 양태는 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염을 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것들로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 투여될 수도 있다.
XII. 외상성 뇌 손상에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할, 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
외상성 뇌 손상 (TBI)은 매년 적어도 1000만 명의 사망 또는 입원으로 이어지는 세계적인 주요 건강 문제이다 (Langlois, J.A. et al., J. Head Trauma Rehabil. 21:375-378, 2006). 2003년에 미국에서는 120만 명의 응급실 방문, 290,000명의 입원, 및 51,000명의 사망을 포함하여, 160만 명의 TBI가 추정되었다 (Rutland-Brown, W. et al., J. Head Trauma Rehabil. 21:544-548, 2006). 미국에서 대부분의 TBI는 추락 및 모터 달린 차의 왕래에 의해 유발된다. TBI는 장기간 또는 평생 동안의 육체적, 인식적, 행동적, 및 감정적 결과를 발생시킬 수 있다. 500만 명 이상의 미국인들이 TBI와 관련된 장기간 또는 평생 동안의 장애를 가지고 살고 있다 (Langlois et al., 2006, 상기).
TBI는 뇌 기질의 침투 ("침투성" 손상) 또는 뇌를 침투하지 않는 손상 ("폐쇄성" 손상)을 수반한다. 손상 프로파일 및 관련 신경 행동 후유증은 침투성 및 폐쇄성 TBI 사이에서 매우 다를 수 있다. 각 손상이 독특하지만, 특정 뇌 영역은 외상-유발된 손상에 특히 취약한데, 전두 피질 및 전두엽 하방 백질, 기저핵 및 간뇌, 입쪽 뇌 줄기, 및 해마(hippocampi)를 포함하는 측두엽을 포함한다 (McAllister, T.W. Dialogues Clin. Neurosci. 13:287-300, 2011). TBI는 여러 신경 전달 물질 시스템의 변화로 이어질 수 있는데, 카테콜아민성 및 콜린성 시스템에서 급성기 및 만성 변화 중에 글루타메이트 및 흥분성 아미노산의 방출을 포함하며, 이것은 신경 행동적 장애와 관련될 수도 있다 (McAllister, 2011, 상기). 유효한 TBI의 생존자는 종종 인지 결함, 인격 변화, 및 증가된 정신 질환, 특히 우울증, 불안, 및 외상 후 스트레스 장애로 고통받는다. 치열한 연구에도 불구하고, 치사율 및 발병율을 감소시킬 수 잇고 기능적 결과를 개선할 수 있는, TBI에 대한 임상적으로 효과적인 치료가 발견되지 않았다.
보체 인자 및 TBI
많은 연구가 보체 단백질 및 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 뇌 낭창(cerebral lupus), 및 뇌졸중을 포함하는 신경 질환의 관계를 확인하였다 (Wagner, E., et al., Nature Rev Drug Disc. 9: 43-56, 2010에서 재검토됨). 최근에 시냅스 배출에서 C1q 및 C3에 대한 역할이 입증되었고, 따라서 보체 인자는 정상 CNS 기능 및 신경 퇴행성 질환 둘 다에 수반될 가능성이 크다 (Stevens, B. et al., Cell 131: 1164-1178, 2007). MASP-1 및 MASP-3에 대한 유전자는 뇌에서 및 또한 신경교종(glioma) 세포주, T98G에서도 널리 발현되며 (Kuraya, M. et al., Int Immunol., 15:109-17, 2003), CNS에서 렉틴 경로의 역할과 일치한다.
MASP-1 및 MASP-3은 병원체 및 변화된 자가 세포에 대한 즉각적인 반응에 대한 열쇠이지만 렉틴 경로는 또한 뇌졸중, 심장병, 및 다른 허혈 재관류 손상 후 심각한 조직 손상의 원인이 된다. 유사하게, MASP-1 및 MASP-3은 TBI에 의해 유발된 조직 손상의 매개자일 가능성이 크다. 대체 경로에서 인자 B의 억제는 두 마리의 마우스 모델에서 TBI를 감소시키는 것으로 나타났다. 인자 B 넉아웃 마우스는 TBI 후 보체-매개된 신경세포 염증 및 신경병리로부터 보호된다 (Leinhase I, et al., BMC Neurosci. 7:55, 2006). 게다가, 항-인자 B 항체는 TBI 유발된 마우스에서 뇌 조직 손상 및 신경 세포 사멸을 감소시켰다 (Leinhase I, et al., J Neuroinflammation 4:13, 2007). MASP-3은 인자 B를 직접적으로 활성화시키고 (Iwaki, D. et al., J Immunol. 187:3751-8, 2011) 그러므로 또한 TBI의 매개자일 가능성이 크다. 인자 B의 억제와 유사하게, MASP-3에 대한 항체와 같은 LEA-1 억제자는 TBI에서 조직 손상 및 그 다음의 후유증을 치료하기 위해 유망한 전략을 제공할 것으로 예상된다.
따라서, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 TBI에서 독립적인 치료적 이점을 가질 수도 있다. 게다가, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 약제 단독과 비교하여 추가적인 치료 이점을 달성할 수도 있거나, 광범위한 환자 서브세트에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중 특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단할 수 있는 이중-특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에서 포함될 수도 있다.
상기에 따라, 본 발명의 양태는 외상성 뇌 손상을 치료하거나, 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하는데, 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물를 외상성 뇌 손상으로 고통받는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 두개 내, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 외상성 뇌 손상을 치료하거나, 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되는데, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 외상성 뇌 손상으로 고통받는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 외상성 뇌 손상을 치료하거나, 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 방법이 제공되는데, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 외상성 뇌 손상으로 고통받는 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 외상성 뇌 손상을 치료하거나 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것들로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하, 두개 내, 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 외상성 뇌 손상을 치료하거나 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 투여될 수도 있다.
XIII. 흡인성 폐렴에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할, 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
흡인은 하단 기도로 구강인구 또는 위 내용물의 흡입으로서 한정된다. 흡인은 흡인 (화학적) 간질성 폐렴(pneumonitis), 1차 박테리아 흡인성 폐렴, 또는 2차 화학적 간질성 폐렴의 합병증을 일으킬 수도 있다. 흡인에 대한 위험 인자는 감소된 수준의 의식 (예를 들어, 두부 손상(head trauma), 알콜 또는 약물-유발된 감각 기관의 변화, 뇌졸중), 다양한 위장 및 식도 이상, 및 신경근질환(neuromuscular disease)을 포함한다. 450만 건의 지역-후천적 폐렴 중 5-15%는 흡인성 폐렴으로 인한 것이라고 추정된다 (Marik, P.E. New Engl. J. Med. 344:665-671, 2001). 화학적 간질성 폐렴의 치료는 주로 지지적이고 경험적 항생제의 사용은 논란이 많다. 박테리아 흡인성 폐렴의 치료는 적절한 항생제로 이루어지는데, 이것은 흡인이 원인이 되는 유기체가 이 설정에서 다르기 때문에 지역 또는 병원에서 발생하는지에 기초한다. 고-위험 환자, 예를 들어, 손상된 구역질 반사를 갖는 요양원의 고령의 환자에서 흡인을 방지하기 위해 대책이 취해져야 한다. 효과적인 예방인 것으로 나타난 대책은 급식, 치아 예방, 및 양호한 구강 위생 동안에 침대의 머리의 상승을 포함한다. 예방적 항생제는 효과적인 것으로 나타나지 않았고 저항성 유기체의 출현으로 이어질 수도 있기 때문에 반대된다.
보체 성분의 조절은 많은 임상적 징후를 위해 제안되었는데, 감염성 질환---패혈증, 바이러스, 박테리아, 및 균류 감염---및 폐 질환---호흡 장애 증후군(respiratory distress syndrome), 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease), 및 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)을 포함한다 (Wagner, E., et al., Nature Rev Drug Disc. 9: 43-56, 2010에 의해 재검토됨). 많은 임상적 및 유전적 연구에 의해 이 제안에 대한 지지가 제공된다. 예를 들어, 임상적 폐결핵(tuberculosis)에 걸린 낮은 MBL 수준의 환자의 빈도가 크게 감소되며 (Soborg et al., Journal of Infectious Diseases 188:777-82, 2003), 낮은 수준의 MBL은 질환으로부터의 보호와 관련된다.
산성 흡인 손상의 쥐 모델에서, Weiser MR et al., J. Appl. Physiol. 83(4): 1090-1095, 1997은 C3-넉아웃 마우스가 심각한 손상으로부터 보호되는 반면에, C4-넉아웃 마우스는 보호되지 않는다는 것을 입증하였으며, 보체 활성화가 대체 경로에 의해 매개된다는 것을 나타낸다. 그 결과, LEA-1 억제자로의 대체 경로의 차단은 흡인성 폐렴에서 치료적 이점을 제공할 것으로 예상된다.
따라서, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 흡인성 폐렴에서 독립적인 치료적 이점을 가질 수도 있다. 게다가, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 약제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 광범위한 환자 서브세트에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중-특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단하는 이중-특이성 항체 와 같은 단일 분자 실체물에서 포함될 수도 있다.
따라서 본 발명의 양태는 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 이러한 질병 또는 다른 보체-매개된 폐렴으로 고통받는 개체에게 투여함으로써 흡인성 폐렴을 치료하기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 폐에 흡입기에 의해서와 같이 국부적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제는 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
상기에 따라, 본 발명의 양태는 흡인성 폐렴을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하는데, 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 흡인성 폐렴으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 흡인성 폐렴을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되는데, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 흡인성 폐렴으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 흡인성 폐렴을 치료하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함하는 방법이 제공되는데, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 흡인성 폐렴으로 고통받는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 흡인성 폐렴을 치료하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것들로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하, 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 필요로 하는 개체에서 흡인성 폐렴을 치료하거나, 예방하거나 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중-억제제를 포함하는 단일 조성물, 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 투여될 수도 있다.
XIV. 내안구염에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할, 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
내안구염은 안구 내 구멍의 염증성 질환이며 보통 감염에 의해 유발된다. 내안구염은 내인성일 수도 있으며, 감염의 먼 공급원의 유기체의 혈행성 확산으로부터 발생하거나 (예를 들어, 심장 내막염(endocarditis)), 또는 외인성일 수도 있으며, 안구 수술, 이물질, 및/또는 블런트(blunt) 또는 침투성 안구 외상의 합병증으로서 외부의 유기체의 직접적인 접종으로부터 발생한다. 외인성 내안구염은 내인성보다 훨씬 더 일반적이고 대부분의 경우의 외인성 내안구염은 안구 수술 후에 발생한다. 미국에서는, 백내장(cataract) 수술이 내안구염의 주요 원인이고 이 수술의 0.1-0.3%에서 발생하며, 지난 10년 동안 발생률이 분명히 증가하였다 (Taban, M. et al., Arch. Ophthalmol. 123:613-620, 2005). 수술 후 내안구염은 급성으로, 수술 후 2주 내, 또는 지연되거나, 수술 후 수 개월에 존재할 수도 있다. 급성 내안구염은 전형적으로 통증, 붉어짐, 눈꺼풀 부종, 및 감소된 시력을 제공한다. 지연된-발병 내안구염은 급성 형태보다 덜 일반적이고 환자들은 가벼운 고통 및 감광성을 보고할 수도 있다. 내안구염의 치료는 근본적인 원인에 의존적이며 전신성 및/또는 유리체 내 항생제를 포함할 수도 있다. 내안구염은 시력의 감소 또는 상실을 일으킬 수도 있다.
AMD에 대하여 상기 설명된 바와 같이, 다수의 보체 경로 유전자가 안과학적 장애와 관련되어 있었고, 이것들은 특이적으로 렉틴 경로의 유전자를 포함한다. 예를 들어, MBL2는 AMD의 서브타입으로 확인되었다 (Dinu V, et al., Genet Epidemiol 31: 224-37, 2007). LEA-1 및 LEA-2 경로는 내안구염과 같은 안구 염증 질환에 수반될 가능성이 높다 (Chow SP et al., Clin Experiment Ophthalmol. 39:871-7, 2011). Chow et al.은 내안구염에 걸린 환자의 MBL 수준을 검사하였고 MBL 수준 및 기능적 렉틴 경로 활성 둘 다가 염증이 생긴 인간 눈에서는 상당히 증가하지만 염증이 생기지 않은 대조군 눈에서는 사실상 검출되지 않는다는 것을 입증하였다. 이것은 시력을 위협하는 안구 염증성 질환, 특히 내안구염에서 MBL 및 렉틴 경로에 대한 역할을 제안한다. 게다가, 각막의 균질 각막염의 쥐 모델에서, MBL-A 유전자는 다섯 개의 상향 조절된 염증 경로 유전자 중 하나였다 (Wang Y., et al., Mol Vis 13: 1226-33, 2007).
따라서, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 내안구염을 치료하는데 있어서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 게다가, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 약제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 광범위한 환자 서브세트에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중-특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단하는 이중-특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에서 포함될 수도 있다.
상기에 따라, 본 발명의 양태는 내안구염을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하는데, 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 내안구염으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은, 예를 들어, 관주법 또는 국소용 겔, 연고 또는 방울의 형태로 조성물의 적용에 의해 또는 유리체 내 투여에 의해 눈에 국부적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 내안구염을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되는데, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 내안구염로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 내안구염을 치료하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함하는 방법이 제공되는데, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 내안구염으로 고통받는 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학제의 조합의 사용 LEA-1 단독의 억제와 비교하여, 내안구염을 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것들로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는, 예를 들어, 관주법 또는 국소적 겔, 연고 또는 방울의 형태로 조성물의 적용에 의해, 또는 유리체 내 주사에 의해 눈에 국부적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-2 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 필요로 하는 개체에서 내안구염을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 개체에 투여될 수도 있다.
XV. 시속척수염에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할, 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
시속척수염 (NMO)은 시신경 및 척수를 표적으로 하는 자가 면역 질환이다. 이것은 시신경염(optic neuritis)으로 불리는 시신경의 염증, 및 척수염(myelitis)로 불리는 척수의 염증을 발생시킨다. NMO에서 척수 병변은 다리 또는 팔의 쇠약 또는 마비, 맹목, 방광 및 장 기능 장애, 및 감각 기능 장애로 이어질 수도 있다.
NMO는 다발성 경화증 (MS)과 여러 유사성을 공유하는데, 둘 다 CNS 표적의 면역 공격으로 인한 것이며 둘 다 탈수초화(demyelination)를 일으키기 때문이다 (Papadopoulos and Verkman, Lancet Neurol., 11(6):535-44, 2013). 하지만, NMO에 대한 분자적 표적, 치료, 및 병변은 MS의 그것과는 다르다. MS가 T 세포에 의해 주로 매개되는 한편, NMO 환자는 전형적으로 물 채널 단백질 아쿠아포린 4 (AQP4), 혈액 뇌 관문(blood brain barrier)을 둘러싼 성상 세포에서 발견된 단백질을 표적화하는 항체를 가진다. 인터페론 베타는 MS에 대하여 가장 일반적으로 사용되는 치료법이지만, 그것은 일반적으로 NMO에서 해로운 것으로 알려져 있다. NMO의 염증성 병변은 척수 및 시신경에서 발견되고 백질 및 회백질을 포함하는 뇌로 진행할 수도 있다. NMO 병변에서 발생하는 탈수초화는 보체에 의해 매개된다 (Papadopoulos and Verkman, Lancet Neurol., 11(6):535-44, 2013).
보체-의존적 세포 독성은 NMO의 발달을 유발하는 주요 메커니즘인 것으로 나타난다. NMO 환자들 중 90% 이상은 AQP4에 대한 IgG 항체를 갖고 있다 (Jarius and Wildemann, Jarius S, Wildemann B., Nat Rev Neurol. 2010 Jul;6(7):383-92). 이 항체들은 혈액 뇌 관문에서 병변의 형성을 시작한다. 성상 세포의 표면에서 초기 항원-항체 복합체, AQP4/AQP4-IgG는 보체의 고전적 경로를 활성화한다. 이것은 성상 세포 표면에서 막 공격 복합체의 형성을 일으키며, 과립구 침윤, 탈수초화, 및 궁극적으로는 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포(oligodendrocyte) 및 신경세포의 괴사로 이어진다 (Misu et al., Acta Neuropathol 125(6):815-27, 2013). 이 세포적 사건은 조직 파괴 및 낭포성, 괴사성 병변의 형성에서 반영된다.
보체의 고전적 경로는 NMO 발병에 중요하다. NMO 병변은 면역글로불린 및 활성화된 보체 성분의 혈관 중심(vasculocentric) 침착을 나타낸다 (Jarius et al., Nat Clin Pract Neurol. 4(4):202-14, 2008). 게다가, C5a와 같은 보체 단백질은 NMO 환자의 뇌척수액으로부터 분리되었다 (Kuroda et al., J Neuroimmunol.,254(1-2):178-82, 2013). 게다가, NMO 환자로부터 얻은 혈청 IgG는 마우스 NMO 모델에서 보체-의존적 세포 독성을 유발할 수 있다 (Saadoun et al., Brain, 133(Pt 2):349-61, 2010). C1q에 대한 단클론성 항체는 NMO의 마우스 모델에서 성상 세포의 보체 매개된 파괴 및 병변을 예방한다 (Phuan et al., Acta Neuropathol, 125(6):829-40, 2013).
보체의 대체 경로는 전체적인 보체 활성을 증폭시키는 역할을 한다. Harboe 및 동료들은 (2004) 대체 경로의 선택적 차단이 고전적 경로에 의해 유발된 막 공격 복합체 형성의 80% 이상을 억제한다는 것을 입증하였다 (Harboe et al., Clin Exp Immunol 138(3):439-46, 2004). Tuzun 및 동료들은 (2013) NMO 환자에서 고전적 및 대체 경로 생성물 둘 다를 검사하였다 (Tuzun E, et al., J Neuroimmunol. 233(1-2): 211-5, 2011). C4d, C4의 고장 생성물은 고전적 경로 활성을 평가하기 위해 측정되었고 NMO 환자 혈청에서 대조군에 비해 증가되었다 (2.14배 증가). 게다가, 인자 Bb, 대체 경로 인자 B의 고장 생성물의 증가는 MS 환자 또는 정상 대조군 개인과 비교하여 NMO 환자에서 관찰되었다 (1.33배 증가). 이것은 대체 경로 기능이 또한 NMO에서 증가된다는 것을 제안한다. 이 활성화는 전체적인 보체 활성화를 증가시킬 것으로 예상되고, 사실 sC5b-9, 보체 캐스케이드의 최종 생성물이 크게 증가되었다 (4.14배 증가).
MASP-3의 특이적 억제자는 NMO로 고통받는 환자를 치료하는데 있어서 이점을 제공할 것으로 예상된다. 실시예 17 및 18에서 입증된 바와 같이, MASP-3 결핍 혈청은 인자 B, C5 컨버타제의 필수 보체, 또는 인자 D 대체 경로의 중요한 활성자를 활성화할 수 없다. 그러므로, 항체 또는 작은 분자와 같은 억제제로의 MASP-3 활성의 차단은 또한 인자 B 및 인자 D의 활성화를 억제할 것으로 예상된다. 이 두 인자의 억제는 대체 경로의 증폭을 막을 것이며, 감소된 전체 보체 활성을 일으킨다. MASP-3 억제는 따라서 NMO에서 치료적 결과를 크게 개선해야 한다.
따라서, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제자는 NMO를 치료하는데 있어서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 게다가, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 약제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 광범위한 환자 서브세트에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중-특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단하는 이중-특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에서 포함될 수도 있다.
상기에 따라, 본 발명의 양태는 NMO를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하는데, 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 NMO로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은, 예를 들어, 관주법 또는 국소용 겔, 연고 또는 방울의 형태로 조성물의 적용에 의해 또는 유리체 내 투여에 의해 눈에 국부적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, NMO를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되는데, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 NMO로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, NMO를 치료하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함하는 방법이 제공되는데, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 NMO로 고통받는 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 NMO를 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것들로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는, 예를 들어, 관주법 또는 국소적 겔, 연고 또는 방울의 형태로 조성물의 적용에 의해, 또는 유리체 내 주사에 의해 눈에 국부적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-2 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 필요로 하는 개체에서 NMO를 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 개체에 투여될 수도 있다.
XVI. 베체트 병에서 MASP-2 및 MASP-3의 역할, 및 MASP-2 및 MASP-3 억제제를 사용하는 치료 방법
베체트 병, 또는 베체트 증후군은 종종 점막 궤양 및 시각적 문제를 제공하는 희귀한, 면역-매개된 소혈관 전신성 맥관염이다. 베체트 병 (BD)은 터키인 피부과 의사인 Hulusi Behcet 이후 1937년에 이름지어 졌는데, 이 인간은 재발성 경구 궤양, 음부 궤양, 및 포도막염(uveitis)의 3중-증상 복합체를 처음으로 설명하였다. BD는 알려져 있지 않은 원인의 전신성, 재발성 염증 장애이다. BD의 염증성 혈관주위염(perivasculitis)은 위장관, 폐, 근골격계, 심혈관계, 및 신경계를 수반할 수도 있다. BD는 파열된 혈관 동맥류 또는 심각한 신경학적 합병증으로 인해 치명적일 수 있다. 시신경병증(Optic neuropathy) 및 시신경 위축증(optic atrophy)은 맥관염 및 시신경을 공급하는 혈관의 폐색으로부터 발생할 수도 있다. Al-Araji A, et al., Lancet Neurol., 8(2):192-204, 2009를 참고하면 된다.
BD의 가장 높은 발생은 중동 및 극동 지역에서 일어나지만, 그것은 유럽 및 북미에서는 희귀하다. BD는 종종 초기에 코르티코스테로이드 및 면역억제제로 제어되지만, 많은 경우는 심각한 발병률 및 차시율로 난치성이다. 인터페론-알파, IVIG, 항-TNF, 항-IL-6, 및 항-CD20을 포함하는 생물학적 약제는 일부 경우에 이점을 나타냈지만, 최고의 치료에 대한 합의는 없다.
BD가 분명히 염증성 장애인 한편, 그것의 병리 생물학은 분명하지 않다. HLA 항원과의 유전적 관계가 있고 전장 게놈 연관성 연구는 많은 시토킨 유전자와 관련되어 있다 (Kirino et al., Nat Genet, 45(2):202-7, 2013). 면역 시스템의 과다 활성은 보체 시스템에 의해 조절되는 것으로 나타난다. 증가된 수준의 C3가 BD 환자 혈청에서 관찰되었고 (Bardak and Aridogan, Ocul Immunol Inflamm 12(1):53-8, 2004), 뇌척수액에서 증가된 C3 및 C4는 질환과 관련된다 (Jongen et al., Arch Neurol, 49(10):1075-8, 1992).
Tuzun 및 동료들은 (2013) BD 환자의 혈청에서 고전적 및 대체 경로 생성물 둘 다를 검사하였다 (Tuzun E, et al., J Neuroimmunol, 233(1-2):211-5, 2011). C4d, C4의 고장 생성물은 대체 경로의 상류에서 생성되고 초기 고전적 경로 활성을 증가시키기 위해 측정되었다. C4d는 대조군과 비교하여 BD 환자 혈청에서 증가되었다 (2.18배 증가). 인자 Bb는 인자 B의 고장 생성물이고, 대체 경로의 활성을 결정하기 위해 측정되었다. BD 환자는 정상 대조군 개인과 비교하여 증가된 인자 Bb를 갖고 있었으며 (2.19배 증가), BD 대체 경로 기능에서 증가와 일치한다. 보체의 대체 경로가 전체적인 보체 활성을 증폭시키는 역할을 하지만, 이 활성화는 전체적인 보체 활성화를 증가시킬 것으로 예상된다. Harboe 및 동료들은 (2004) 대체 경로의 선택적 차단이 고전적 경로에 의해 유발된 막 공격 복합체 형성의 80% 이상을 억제한다는 것을 입증하였다 (Harboe M, et al., Clin Exp Immunol, 138(3):439-46, 2004). 사실 sC5b-9, 보체 캐스케이드의 최종 생성물은 BD 환자에서 크게 증가되었다 (5.46배 증가). MASP-3의 특이적 억제자는 BD에서 이점을 제공해야 한다. MASP-3의 차단은 인자 B 및 인자 D의 활성화를 억제해야 한다. 이것은 대체 경로의 증폭을 중단시킬 것이며, 전체적인 보체 활성의 감소된 반응을 일으킨다. MASP-3 억제는 따라서 BD에서 치료적 결과를 크게 개선해야 한다. 따라서, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제자는 BD를 치료하는데 있어서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 게다가, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 약제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 광범위한 환자 서브세트에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중-특이적 항체, 또는 각 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단하는 이중-특이성 항체와 같은 단일 분자 실체물에서 포함될 수도 있다. 상기에 따라, 본 발명의 양태는 BD를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하는데, 약학적 담체에서 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 BD로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은, 예를 들어, 관주법 또는 국소용 겔, 연고 또는 방울의 형태로 조성물의 적용에 의해 또는 유리체 내 투여에 의해 눈에 국부적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다. 또 다른 양태에서, BD를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되는데, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 BD로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, BD를 치료하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함하는 방법이 제공되는데, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 BD로 고통받는 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 BD를 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 개선된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는 예를 들어, LEA-1-차단 활성을 갖는 항체와 LEA-2-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 항체를 포함하거나 이것들로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-결합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하며 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-결합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하고 따라서 LEA-1을 차단하는 한편 제2 항원-결합 부위는 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중 특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는, 예를 들어, 관주법 또는 국소적 겔, 연고 또는 방울의 형태로 조성물의 적용에 의해, 또는 유리체 내 주사에 의해 눈에 국부적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-2 억제제는 비-펩티드성 약제에 대하여 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 개체에 투여될 수도 있다. 투여는 질병이 해결되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 필요로 하는 개체에서 BD를 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 별개의 조성물의 동시-투여), 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 개체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 개체에 투여될 수도 있다.
XVII. MASP 억제제
보체의 렉틴 경로가 두 개의 주요 보체 활성화 팔, LEA-1 및 LEA-2로 구성되고, 또한 렉틴-독립적 보체 활성화 팔도 있다는 인식과 함께, 보체의 면역 방어 능력을 완전히 폐쇄하지 않고 (즉, 고전적 경로를 온전한 채로 두고) 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 또는 베체트 병 중 적어도 하나와 관련된 병리학을 유발하는 이 효과기 팔들 중 하나 이상을 특이적으로 억제하는 것이 매우 바람직할 것이라고 인식된다. 이것은 C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 온전한 채로 두어서 면역 복합체 가공을 조작하고 감염에 대한 숙주 방어를 도울 것이다.
i. LEA-1-매개된 보체 활성화를 억제하기 위한 조성물
본원에서 설명된 바와 같이, 발명자들은 예상외로 용해로 이어지는 LEA-1의 활성화가 MASP-3-의존적이라는 것을 발견하였다. 본원에서 더 설명된 바와 같이, 생리학적 조건 하에서, MASP-3-의존적 LEA-1 활성화는 또한 옵소닌화에 기여하고, 이로 인해 LEA-2-매개된 보체 활성화에 추가적인 효과를 제공한다. 실시예 7에서 입증된 바와 같이, Ca++의 존재시, MASP-3이 인자 D-/- 혈청에서 LEA-1의 활성화를 구동할 수 있기 때문에, 인자 D는 필요하지 않다. MASP-3, MASP-1, 및 HTRA-1은 프로-인자 D를 활성 인자 D로 전환할 수 있다. 유사하게, MASP-3 활성화는, 많은 예에서, MASP-1에 의존적인 것으로 나타나는데, MASP-3 (MASP-1 및 MASP-2와 반대로)이 자가-활성화 효소가 아니며 MASP-1의 도움없이 그것의 활성 형태로 전환할 수 없기 때문이다 (Zundel, S. et al., J. Immunol. 172: 4342-4350 (2004); Megyeri et al, J. Biol. Chem. 288:8922-8934 (2013). MASP-3이 자가활성화하지 않고, 많은 예에서, 그것의 효소에 의한 활성 형태로 전환되기 위해 MASP-1의 활성이 필요하기 때문에, 대체 경로 C3 컨버타제 C3Bb의 MASP-3-매개된 활성화는 MASP-3 치모겐 또는 이미-활성화된 MASP-3을 표적화하거나, 또는 MASP-3으M의P -1-매개된 활성화를 표적화함으로써, 또는 둘 다에 의해 억제될 수 있는데, 많은 예에서, MASP-1 기능적 활성의 부재시, MASP-3은 그것의 치모겐 형태로 유지되고 대체 경로 C3 컨버타제 (C3bBb)의 직접적인 형성을 통해 LEA-1을 구동할 수 없기 때문이다.
그러므로, 본 발명의 한 양태에서, LEA-1을 특이적으로 억제하기 위한 치료제의 개발에 있어서 표적화되는 바람직한 단백질 성분은 MASP-3의 억제자이다 (MASP-1-매개된 MASP-3 활성화의 억제자 (예를 들어, MASP-3 활성화를 억제하는 MASP-1 억제자)를 포함).
상기 언급된 바에 따라, 한 양태에서, 본 발명은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에서 LEA-1의 역효과 (즉, 용혈 및 옵소닌화)를 억제하는 방법을 제공하며, 개체에게 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-3 억제제의 양 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-3 억제제는 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 또는 베체트 병으로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 살아있는 개체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다. 본 발명의 이 양태의 실행에 있어서, 대표적인 MASP-3 억제제는 인자 B의 렉틴 MASP-3-의존적 활성화, 프로-인자 D의 렉틴 MASP-3-의존적 활성화, 인자 B의 MASP-3-의존적, 렉틴-독립적 활성화, 및 프로-인자 D의 MASP-3-의존적, 렉틴-독립적 활성화 (예를 들어, 작은 분자 억제자, MASP-3 항체 및 이것의 단편, 또는 MASP-3과 상호작용하거나 또는 단백질-단백질 상호작용을 방해하는 차단 펩티드) 중 적어도 하나 이상을 억제하는 분자, 및 MASP-3의 발현을 감소시키는 분자 (예를 들어, MASP-3 안티센스(antisense) 핵산 분자, MASP-3 특이적 RNAi 분자 및 MASP-3 리보자임)을 포함하는, MASP-3의 생물학적 활성을 억제하는 분자를 포함한다. MASP-3 억제제는 효과적으로 MASP-3 단백질-대-단백질 상호작용을 차단하거나, MASP-3 다이머화 또는 조립을 방해하거나, Ca++ 결합을 차단하거나, MASP-3 세린 프로테아제 활성 부위를 방해하거나, 또는 MASP-3 단백질 발현을 감소시킴으로써, MASP-3을 LEA-1-매개된, 또는 렉틴-독립적, 보체 활성화의 활성화로부터 방지할 수도 있다. MASP-3 억제제는, 본원에서 더 설명된 바와 같이, 다른 의학적 치료의 치료적 이점을 향상시키기 위해 주요 치료로서 단독으로 또는 보조 치료로서 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다.
한 구체예에서, MASP-3 억제제는 보체 시스템에서 다른 구성요소보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 MASP-3의 일부 (SEQ ID NO:8)에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, MASP-3 억제제는 보체 시스템에서 다른 구성요소보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 MASP-3의 일부 (SEQ ID NO:8)에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제는 억제제가 MASP-1의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:10)에 결합하지 않고, 그것이 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:5)에 결합하지 않는다는 조건 하에, MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:8의 aa 450-711)에 특이적으로 결합하고 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제한다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제는 MASP-3에 특이적으로 결합하는 MASP-3 단클론성 항체, 또는 이것의 단편이다.
또 다른 구체예에서, MASP-3 억제제는 보체 시스템에서 다른 구성요소보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 MASP-2의 일부 (SEQ ID NO:10)에 특이적으로 결합하고, MASP-3의 MASP-1-매개된 활성화를 억제한다. 또 다른 구체예에서, MASP-3 억제제는 보체 시스템에서 다른 구성요소 (즉, 폴리펩티드, 또는 이것의 단편)보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 MASP-1의 일부 (SEQ ID NO:10)에 특이적으로 결합하고, MASP-3의 MASP-1-매개된 활성화를 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-3 억제제는 억제제가 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:5)에 결합하지 않고, 그것이 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:8)에 결합하지 않는다는 조건 하에, MASP-1의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 449-694)에 특이적으로 결합하고, MASP-3의 MASP-1-매개된 활성화를 억제한다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제는 MASP-1에 특이적으로 결합하고 MASP-3의 MASP-1-매개된 활성화를 억제하는 MASP-1 단클론성 항체, 또는 이것의 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-1에 결합하는 MASP-3 억제제는 MASP-3의 MASP-1-매개된 활성화를 억제하고 인자 D의 MASP-1-매개된 성숙화를 더 억제한다.
또 다른 구체예에서, MASP-3 억제제는 억제제가 MASP-2 (SEQ ID NO:5), 또는 MAp19 (SEQ ID NO:3)에 결합하지 않는다는 조건 하에, MASP-3의 일부 (SEQ ID NO:8)에 결합하고 또한 MASP-1의 일부 (SEQ ID NO:10)에 결합한다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제는 억제제가 MASP-2 (SEQ ID NO:5) 또는 MAp19 (SEQ ID NO:3)에 결합하지 않는다는 조건 하에, MASP-3의 일부 (SEQ ID NO:8)에 결합하고 또한 MASP-1의 일부 (SEQ ID NO:10)에 결합한다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제는 억제제가 MASP-2 (SEQ ID NO:5), MAp19 (SEQ ID NO:3), 또는 MAp44 (SEQ ID NO:11)에 결합하지 않는다는 조건 하에, MASP-3의 일부 (SEQ ID NO:8)에 결합하고 또한 MASP-1의 일부 (SEQ ID NO:10)에 결합하고, 이로 인해 MAp44에 대한 결합의 결핍으로 인해 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하기 위한 더 낮은 유효량의 허용을 제공하며, 인간 혈청에서 더 높은 농도로 존재한다.
한 구체예에서, MASP-3 억제제는 CUBI-CCP2 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 25-432)과 같이, MASP-1 및 MASP-3 사이에서 보존된 아미노산 영역 내에서 에피토프에 결합하는 MASP-1/MASP-3 이중 억제제이며, 도 3-5에서 예시된 바와 같다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제는 억제제가 CCP 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 367-432)과 같이, MAp44에 결합하지 않는다는 조건 하에, MASP-1 및 MASP-3 사이에서 보존된 아미노산 영역 내에서 에피토프에 결합하는 MASP-1/MASP-3 이중 억제제이다. 또 다른 구체예에서, MASP-3 억제제는 이중 특이적 단클론성 항체와 같이, MASP-3 단백질 (SEQ ID NO: 8)의 에피토프 및 MASP-1 단백질 (SEQ ID NO:10)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 억제제이다. 일부 구체예에서, MASP-3 억제제는 MASP-1의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 449-694)에 결합하고 또한 MASP-3의 세린 프로테아제 (SEQ ID NO:8의 aa 450-711)의 도메인에 결합하는 이중 특이적 단클론성 항체이다.
MASP-3 억제제의 결합 친화도는 적합한 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
MASP-3-의존적 보체 활성화의 억제는 본 발명의 방법에 따라 MASP-3 억제제의 투여의 결과로서 나타나는 보체 시스템의 구성요소의 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: LEA-1-매개된 보체 활성화의 억제 (용혈 및/또는 옵소닌화의 억제); 인자 B의 렉틴-독립적 전환의 억제; 인자 D의 렉틴-독립적 전환의 억제, MASP-3 세린 프로테아제 기질-특이적 분할의 억제, 용혈의 감소 (예를 들어 실시예 5에서 설명된 바와 같이 측정됨) 또는 C3 분할 및 C3b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 4 및 실시예 11에서 설명된 바와 같이 측정됨).
일부 구체예에서, MASP-3 억제제는 MASP-3-의존적 보체 활성화 (즉, LEA-1-매개된 보체 활성화 및/또는 인자 B의 렉틴-독립적 전환 및/또는 인자 D의 렉틴-독립적 전환)를 선택적으로 억제하며, C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 기능적으로 온전하게 둔다. 일부 구체예에서, MASP-3 억제제는 MASP-3 항체 및 MASP-3 결합 이것의 단편, MASP-1 항체 및 이것의 단편, 천연 및 합성 펩티드, 또는 작은 분자를 포함하는, 항체, 또는 이것의 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-3 억제제는 MASP-1에 대하여 선택적이거나, 또는 MASP-3에 대하여 선택적이거나, 또는 MASP-1 및 MASP-3에 대하여 선택적인 작은 분자 프로테아제 억제자이다.
ii. LEA-2의 활성화를 억제하기 위한 조성물
본원에서 설명된 바와 같이, LEA-2-매개된 보체 활성화는 MASP-2-의존적이며, 옵소닌화 및/또는 용해로 이어진다. 그러므로, 특이적으로 LEA-2 렉틴-의존적 보체 시스템을 억제하기 위해 치료제의 개발에 있어서 표적화되는 바람직한 단백질 구성요소는 MASP-2이다. 여러 단백질은 단백질-대-단백질 상호작용을 통해 MASP-2에 결합하거나, 이와 상호작용하는 것으로 나타났다. 예를 들어, MASP-2는 렉틴 단백질 MBL, H-피콜린 및 L-피콜린 및 콜렉틴-11에 결합하고, 이것들과 함께 칼슘-의존적 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. Ma Y., et al., J Innate Immun. Epub Dec 4 (2012). 각각의 MASP-2/렉틴 복합체는 단백질 C4 및 C2의 MASP-2-의존적 분할을 통해 보체를 활성화시키는 것으로 나타났다 (Ikeda, K., et al, J. Biol. Chem. 262:7451-7454, (1987); Matsushita, M., et al, J. Exp. Med. 176: 1497-2284, (2000); Matsushita, M., et al, J. Immunol. 168:3502-3506, (2002)). 연구들은 MASP-2의 CUB1-EGF 도메인이 MASP-2의 MBL과의 관계에 필수적인 것으로 나타냈다 (Thielens, N.M., et al, J. Immunol. 166:5068, (2001)). 또한 CUB1EGFCUBII 도메인이 MASP-2의 다이머화를 매개하며, 이것은 활성 MBL 복합체의 형성에 필요한 것으로 나타났다 (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000). 그러므로, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화에 중요한 것으로 알려져 있는 MASP-2 표적 영역에 결합하거나 이것을 방해하는 것으로 확인될 수 있다.
상기 언급된 바에 따라, 한 양태에서, 본 발명은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에서 LEA-2-매개된 보체 활성화의 역효과를 억제하는 방법을 제공하며, 개체에 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에서 LEA-2-매개된 보체 활성화의 해로운 효과를 억제하는 방법을 제공하는데, MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. MASP-2 억제제는 PNH, 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 또는 베체트 병으로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 살아있는 개체에서 MASP-2-의존적 LEA-2를 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다.
. 본 발명의 양태의 실행에 있어서, 대표적인 MASP-2 억제제는 MASP-2의 생물학적 활성을 억제하는 분자 (예를 들어, 작은 분자 억제자, MASP-2 항체 또는 MASP-2와 상호작용하거나 단백질-단백질 상호작용을 방해하는 차단 펩티드), 및 MASP-2의 발현을 감소시키고, 이로 인해 MASP-2를 LEA-2의 활성화로부터 방지하는 분자 (예를 들어, MASP-2 안티센스 핵산 분자, MASP-2 특이적 RNAi 분자 및 MASP-2 리보자임)를 포함한다.
MASP-2 억제제는 효과적으로 MASP-2 단백질-대-단백질 상호작용을 차단하거나, MASP-2 다이머화 또는 조립을 방해하거나, Ca++ 결합을 차단하거나, MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를 방해할 수도 있거나, 또는 MASP-2 단백질 발현을 감소시키고, 이로 인해 MASP-2를 LEA-2의 활성화로부터 방지할 수도 있다. MASP-2 억제제는, 본원에서 더 설명된 바와 같이, 다른 의학적 치료의 치료적 이점을 향상시키기 위해 주요 치료로서 단독으로 또는 보조 치료로서 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제는 보체 시스템에서 다른 항원보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 MASP-2의 일부 (SEQ ID NO:5)에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, MASP-2 억제제는 보체 시스템에서 다른 항원보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 MASP-2의 일부 (SEQ ID NO:5)에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 억제제가 MASP-1의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:10)에 결합하지 않고, 그것이 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:8)에 결합하지 않는다는 조건 하에, (i) CCP1-CCP2 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 300-431) 또는 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 445-682) 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하고 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 MASP-2에 특이적으로 결합하는 이것의 단편이다.
MASP-2 억제제의 결합 친화도는 적합한 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
MASP-2-의존적 보체 활성화의 억제는 본 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 발생하는 보체 시스템의 구성요소의 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2-의존적 보체-활성화-시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생산의 억제 (예를 들어, 미국 특허 번호 제7,919,094호의 실시예 2에서 설명된 바와 같이 측정됨), C4 분할 및 C4b 침착의 감소 (예를 들어 실시예 8 또는 실시예 9에서 설명된 바와 같이 측정됨), 또는 C3 분할 및 C3b 침착의 감소 (예를 들어, 실시에 11에서 설명된 바와 같이 측정됨).
일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 보체 활성화 (즉, LEA-2)를 선택적으로 억제하며, C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 기능적으로 온전하게 둔다.
일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 및 이것의 MASP-2 결합 단편, 천연 및 합성 펩티드, 또는 작은 분자를 포함하는, 항체, 또는 이것의 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2에 대하여 선택적인 작은 분자 프로테아제 억제자이다.
iii. LEA-1-매개된 보체 활성화 및 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제하기 위한 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에서 LEA-1의 역효과를 억제하고 LEA-2의 역효과를 억제하는 방법을 제공하며, MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-1 억제제 및/또는 MASP-3 억제제 중 적어도 하나의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 조성물은 MASP-1 억제제를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-1 억제제는 MASP-3-매개된 보체 활성화를 억제하고 또한 MASP-2-매개된 보체 활성화를 억제한다.
한 구체예에서, 조성물은 MASP-3 억제제를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제는 인자 B의 렉틴 MASP-3-의존적 활성화; 인자 D의 렉틴 MASP-3-의존적 활성화; 인자 B의 MASP-3-의존적, 렉틴-독립적 활성화; 및/또는 인자 D의 MASP-3-의존적, 렉틴-독립적, 활성화 중 적어도 하나를 억제한다.
한 구체예에서, 조성물은 MASP-1 억제제 및 MASP-3 억제제를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 개체에 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 이 양태는 PNH로 고통받는 개체에 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양 및 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-3 억제제의 양 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 LEA-1 및 LEA-2 둘 다를 억제하는 단일 약제 (즉, 이중 MASP-2/MASP-3 억제제, 이중 MASP-1/MASP-2 억제제, 이중 특이적 MASP-2/MASP-3 억제제, 이중 특이적 MASP-1/MASP-2 억제제, 또는 전체-MASP-1/2/3 억제제 또는 삼중 특이적 MASP-1/2/3 억제제)를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 LEA-1 및 LEA-2 억제제의 조합, 예를 들어, 이중 억제제 플러스 단일 억제제의 조합, 이중 특이적 억제제 플러스 단일 억제제의 조합, 또는 본원에서 설명된, 조합하여 LEA-1 및 LEA-2 둘 다를 억제하는 MASP-1, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제 중 어떤 것의 조합을 포함하며, 본원에서 더 설명된 바와 같다.
한 구체예에서, 본 발명은 LEA-1 및 LEA-2 둘 다를 억제하는 약학적 조성물을 제공하며, 적어도 하나의 MASP-3 억제제 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 한 구체예에서, 약학적 조성물은 MASP-3 억제제인 제1 분자 및 MASP-2 억제제인 제2 분자의 조합을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 약학적 조성물은 MASP-3 억제제로서의 활성 및 MASP-2 억제제로서의 활성을 포함하는 단일 분자적 실체물 (즉, MASP-2-매개된 LEA-2 활성화 및 MASP-3-매개된 LEA-1 활성화 둘 다를 억제하는 억제제)을 포함한다. 한 구체예에서, 억제제는 세린 프로테아제 도메인, 예를 들어, 베타 사슬의 N-말단 영역 (예를 들어, SEQ ID N05 및 SEQ ID NO:8의 베타 사슬의 N-말단 영역의 처음 150 aa)과 같이, MASP-2 (SEQ ID NO:5) 및 MASP-3 (SEQ ID NO:8) 사이에서 보존된 아미노산 영역 내에서 에피토프에 결합하는 MASP-2/MASP-3 이중 억제제이며, 도 4, 6 및 7C에서 나타난 바와 같다. 한 구체예에서, 억제제는 이중 특이적 단클론성 항체와 같이, MASP-2 단백질 (SEQ ID NO:5)의 에피토프 및 MASP-3 단백질 (SEQ ID NO:8)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 억제제이다. 일부 구체예에서, 억제제는 MASP-2 (SEQ ID NO:5의 aa 300-431)의 CCP1-CCP2 도메인 또는 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 445-682) 중 적어도 하나에 결합하고 또한 MASP-3의 세린 프로테아제 (SEQ ID NO:8의 aa 450-711)의 에피토프에 결합하는 이중 특이적 단클론성 항체이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 LEA-1 및 LEA-2 둘 다를 억제하는 조성물을 제공하며, MASP-2-매개된 LEA-2 활성화 및 MASP-3의 MASP-1-매개된 활성화 둘 다를 억제하고, 이로 인해 MASP-3-매개된 LEA-1 활성화를 억제하는 (및 선택적으로 인자 D의 MASP-1-매개된 성숙화를 또한 억제하는) 억제제를 포함한다. 한 구체예에서, 억제제는 세린 프로테아제 도메인과 같이, MASP-1 (SEQ ID NO:10) 및 MASP-2 (SEQ ID NO:5) 사이에서 보존된 아미노산 영역 내에서 에피토프에 결합하는 MASP-1/MASP-2 이중 억제제이며, 도S 4, 6 및 7A에 나타난 바와 같다. 한 구체예에서, 억제제는 이중 특이적 단클론성 항체와 같이, MASP-1 단백질 (SEQ ID NO:10)의 에피토프 및 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO:5)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 억제제이다. 일부 구체예에서, 억제제는 MASP-1의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 449-694)에 결합하고 또한 MASP-2의 CCP1-CCP2 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 300-431) 또는 the MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 445-682) 중 적어도 하나에 결합하는 이중 특이적 단클론성 항체이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 LEA-1 및 LEA-2 둘 다를 억제하는 조성물을 제공하며, MASP-2-매개된 LEA-2 활성화, MASP-3에 직접적으로 결합함으로써 MASP-3-매개된 LEA-1 활성화를 억제하고 또한 MASP-3의 MASP-1-매개된 활성화를 억제하고, 이로 인해 MASP-3-매개된 LEA-1 활성화를 억제하는 (및 선택적으로 인자 D의 MASP-1-매개된 성숙화를 또한 억제하는) 억제제를 포함한다. 한 구체예에서, 억제제는 MASP-1 (SEQ ID NO:10), MASP-2 (SEQ ID NO:5) 및 MASP-3 (SEQ ID NO:8) 사이에서 보존된 아미노산 영역, 예를 들어, CUBI-EGF-CUB2 도메인에서 보존된 영역에 결합하는 전체-MASP 억제자이며, 도 4 및 5에서 나타난 바와 같다. 도 4 및 5에서 예시된 바와 같이, CUB1-EGF-CUBII 도메인에서 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3 사이에서 공유된 동일성의 많은 패치가 있으며, 이로 인해 전체-특이적 MASP 항체의 생성을 허용한다. 일부 구체예에서, 전체-특이적 MASP 항체는 MASP-1의 CUB2 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 185-296), MASP-2의 CUB2 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 184-295) 및 MASP-3의 CUB2 도메인 (SEQ ID NO:8의 aa 185-296) 내의 에피토프에 결합할 수 있다. MASP-1, MASP-2 및 MASP-3의 CUB1-EGF에 결합하는 전체-특이적 MASP 억제자는 또한 MAp19 및 MAp44에 결합하고, 그러므로 이러한 억제자의 치료적 유효량은 이 결합을 보상하기 위해 더 높은 수준으로 조정된다는 것을 주목해야 한다. MASP-1, MASP-2 및 MASP-3의 CUBII 도메인에 결합하는 전체-특이적 MASP 억제자는 또한 MAp44에 결합하고, 그러므로 이러한 억제자의 치료적 유효량은 이 결합을 보상하기 위해 더 높은 수준으로 조정된다는 것을 더 주목해야 한다.
한 구체예에서, 억제제는 MASP-1 단백질 (SEQ ID NO:10)의 에피토프, MASP-2 단백질 (SEQ ID NO:5)의 에피토프 및 MASP-3 단백질 (SEQ ID NO:8)의 에피토프에 결합하는 삼중 특이적 MASP-1/2/3 억제자이다. 일부 구체예에서, 억제제는 MASP-1의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 449-694)에 결합하고, MASP-2의 CCP1-CCP2 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 300-431) 또는 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 445-682) 중 적어도 하나에 결합하고 또한 MASP-3의 세린 프로테아제 (SEQ ID NO:8의 aa 450-711)의 에피토프에 결합하는 삼중 특이적 단클론성 항체이다.
LEA-1, LEA-2 또는 LEA-1 및 LEA-2를 억제하는 예시적 억제제가 하기 표 2에서 설명된다.
MASP 억제제
MASP 억제자의 타입 억제자 결합 도메인(들) 교차-반응* 억제 활성에 대한 검정 치료적 유용성
MASP-3 특이적 MASP-3 세린 프로테아제 도메인
(SEQ ID NO:8의 aa 450-711)
 MASP-3에 결합하지만; MASP-1; MASP-2; MAp44 또는 MAp19에는 결합하지 않음 MASP-3 세린 프로테아제 기질-특이적 분할의 억제에 대한 검정; LEA-1 억제, 인자 D 활성화의 억제; 인간 혈청에 의한 비-인간 RBC의 용혈의 억제 LEA-1-매개된 보체 활성화를 억제함
(용해 및 옵소닌화를 억제함)
MASP-2 특이적 MASP-2 CCP1-CCP2 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 300-431); 또는
MASP-2 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 445-682)		 MASP-2에 결합하지만; MASP-1; MASP-3; MAP19 또는 MAp44에는 결합하지 않음 MASP-2-특이적 프로테아제 기질-특이적 분할의 억제, LEA-2 억제 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제함
(옵소닌화 및/또는 용해를 억제함)
MASP-1 특이적
 MASP-1 세린 프로테아제 도메인
(aa449-694 of SEQ ID NO:10)		 MASP-1에 결합하지만; MASP-2, MASP-3, MAp44 또는 MAp19에는 결합하지 않음 MASP-1-특이적 프로테아제 기질-특이적 분할의 억제에 대한 검정; LEA-1 및 LEA2 억제,
인자 D 활성화의 억제에 대한 검정; 프로-인자 D가 보충된 인자 D 고갈된 혈청에서 AP-1 활성의 복구에 대한 검정		 LEA-1 및 LEA-2 매개된 보체 활성화를 억제함
(용해 및/또는 옵소닌화를 억제함)
MASP-2/MASP-3 이중 억제자
(한 항체가 보존된 영역에 결합함)		 MASP-2 및 MASP-3 사이에서 보존된 세린 프로테아제 도메인의 영역
, 특히 베타 사슬의 N-말단 영역 (처음 150aa) 		MASP-2 및 MASP-3에 결합하지만; MASP-1, MAp44, 또는 MAp19에는 결합하지 않음 MASP-2- 및 MASP-3 프로테아제 기질-특이적 분할에 대한 검정, LEA-1 및 LEA-2의 억제 LEA-1 및 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제함
(용해 및/또는 옵소닌화를 억제함)
MAp44를 제외하는 MASP-1/3 이중 억제자 MASP-1/3 CCP2 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 367-432) MASP-1 및 MASP-3에 결합하지만; MAp44, MASP-2, 또는 MAp19에는 결합하지 않음 MASP-3 및 MASP-1 프로테아제 기질-특이적 분할 및 인자 D 활성화의 억제에 대한 검정
, LEA-1 및 LEA-2 억제		 LEA-1- 및 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제함
(용해 및/또는 옵소닌화를 억제함)
MAp44를 포함하는 MASP-1/3 이중 억제자 MASP-1/3 CUBI-CCP1 도메인 (SEQ ID NO:10
의 aa25-363)		 MASP-1, MASP-3, 및 MAp44에 결합하지만; MASP-2 또는 MAp19에는 결합하지 않음 MASP-3 및 MASP-1 프로테아제 기질-특이적 분할 및 인자 D 활성화의 억제에 대한 검정, LEA-1 및 LEA-2 억제 LEA-1- 및 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제함 (용해 및/또는 옵소닌화를 억제함)
MASP-1/2 이중 억제자 MASP-1 및 MASP-2 사이에서 보존된 세린 프로테아제 도메인의 영역 MASP-1 및 MASP-2에 결합하지만; MASP-3, MAp19 또는 MAp44에는 결합하지 않음 MASP-1 및 MASP-2 세린 프로테아제 기질-특이적 분할의 억제에 대한 검정; LEA-1 및 LEA-2 억제 LEA-1- 및 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제함
(용해 및/또는 옵소닌화를 억제함)
MASP-1/2/3 전체 억제자 CUB1-EGF-CUB2의 보존된 영역
, 특히 CUB2 도메인 (공통 상호작용 부위)		 MASP-1/2/3에 더하여 MAp44, 및 가능하게 Map19에도 결합함 MASP-1-, MASP-2- 및 MASP-3-특이적 프로테아제 기질-특이적 분할 및 인자 D 활성화의 억제에 대한 검정; LEA-1 및 LEA-2의 억제LEA-1- 및 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제함
(용해 및/또는 옵소닌화를 억제함)
MASP-2/MASP-3
이중 특이적 억제자		 CCP1-CCP2 또는
MASP-2 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 445-682)으로의 MASP-2-특이적 결합
(SEQ ID NO:5의 aa 300-431);
및 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:8의 aa 450-711)으로의 MASP-3-특이적 결합		 MASP-2 및 MASP-3에 결합하지만; MASP-1, MAp44 또는 MAp19에는 결합하지 않음 MASP-2- 및 MASP-3-특이적 프로테아제 기질-특이적 분할에 대한 검정, LEA-1 및 LEA-2의 억제 LEA-1- 및 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제함
(용해 및/또는 옵소닌화를 억제함)
MASP-1/MASP-2
이중 특이적 억제자		 MASP-1 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa449-694), 및 CCP1-CCP2
(SEQ ID NO:5의 aa 300-431); 또는 MASP-2 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 445-682)으로의 MASP-2-특이적 결합		 MASP-1 및 MASP-2에 결합하지만; MASP-3, MAp19 또는 MAp44에는 결합하지 않음 MASP-1- 및 MASP-2-특이적 세린 프로테아제 기질-특이적 분할의 억제; LEA-1 및 LEA-2 억제에 대한 검정 LEA-1- 및 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제함
(용해 및/또는 옵소닌화를 억제함)
MASP-1/MASP-3
이중 특이적		 MASP-1 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa449-694) 및 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:8의 aa 450-711)으로의 MASP-3-특이적 결합 MASP-1 및 MASP-3에 결합하지만; MASP-2, MAp44 또는 MAp19에는 결합하지 않음 MASP-1 및 MASP-3- 프로테아제 기질-특이적 분할 및 인자 D 활성화의 억제, LEA-1 및 LEA-2 억제에 대한 검정 LEA-1- 및 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제함
(용해 및/또는 옵소닌화를 억제함)
MASP-1/MASP-2/MASP-3
삼중 특이적 		MASP-1 세린 프로테아제 도메인, MASP-2 세린 프로테아제 도메인 또는 CCP-CCP2 도메인 및 MASP-3 세린 프로테아제 도메인 MASP-1 및 MASP-2 및 MASP-3에 결합하지만; MAp19 또는 MAp44에는 결합하지 않음 MASP-1-, MASP-2- 및 MASP-3- 프로테아제 기질-특이적 분할 및 인자 D 활성화의 억제, LEA-1 및 LEA-2의 억제에 대한 검정 LEA-1- 및 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제함
(용해 및/또는 옵소닌화를 억제함)
*표 2에서 설명된 바와 같이 교차-반응 컬럼에 관하여, 지정된 MASP 억제자는 결합 "하지 않음"으로 나열된 다른 보체 성분 (즉, 폴리펩티드 또는 이것의 단편)보다 적어도 10배 더 큰 (예를 들어, 적어도 20배, 적어도 50배 또는 적어도 100배 더 큰) 결합 친화도로 억제자 결합 도메인에 결합한다.일부 구체예에서, 조성물은 LEA-1 및 LEA-2 억제제의 조합, 예를 들어, 상기 설명되고 표 2에서 나타난 단일 억제제의 조합을 포함한다. 예를 들어, 한 구체예에서, 조성물은 MASP-1 항체 및 MASP-2 항체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 조성물은 MASP-1 항체 및 MASP-3 항체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 조성물은 MASP-2 항체 및 MASP-3 항체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 조성물은 MASP-1, 및 MASP-2 및 MASP-3 항체의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 억제제의 조합을 포함하는 단일 조성물의 투여를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 동시 투여되는 별개의 조성물을 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 이중 억제제 플러스 단일 억제제 (즉, MASP-2/3 이중 억제자 플러스 MASP-1 억제자; MASP-1/3 이중 억제자 플러스 MASP-2 억제자; 또는 MASP- 1/2 이중 억제자 플러스 MASP-3 억제자)의 조합을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 이중 억제자 및 단일 억제자를 포함하는 동시 투여되는 별개의 조성물을 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 이중 특이적 억제제 플러스 단일 억제제의 조합 (즉, MASP-2/3 이중 특이적 억제자 플러스 MASP-1 억제자; MASP-1/3 이중 특이적 억제자 플러스 MASP-2 억제자; 또는 MASP-1/2 이중 특이적 억제자 플러스 MASP-3 억제자)을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 이중 특이적 억제자 및 단일 억제자를 포함하는 별개의 조성물을 포함한다.
본 발명의 다양한 구체예에 따라, MASP-3 억제제 및/또는 MASP-2 억제제 및/또는 MASP-1 억제제는 작용의 부위에 국한되어야 하는 C5 항체와 비교하여 혈장의 표적 단백질을 제거하기 위해 사용된다는 것을 주목해야 한다.
MASP 항체
본 발명의 이 양태의 일부 구체예에서, MASP 억제제는 LEA-1 및/또는 LEA-2 보체 활성화 경로 중 적어도 하나를 억제하는 MASP 항체 (예를 들어, MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 항체)를 포함한다. 본 발명의 이 양태에 유용한 MASP 항체는 어떤 항체 생산 포유동물로부터 유래된 다클론성, 단클론성 또는 재조합 항체를 포함하고 다중 특이적 (즉, 이중 특이적 또는 삼중 특이적), 키메라, 인간화된, 완전한 인간, 항-이디오타입, 및 항체 단편일 수도 있다. 항체 단편은 본원에서 더 설명된 바와 같이 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 단편, scFv 단편 및 단일-사슬 항체를 포함한다.
MASP 항체는 본원에서 설명된 검정을 사용하여 LEA-1 또는 LEA-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다. 여러 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3 항체는 문헌에서 설명되었고 몇몇은 새로 생성되었으며, 이것들 중 일부는 하기 표 3에서 나열된다. 이 예시적 MASP 항체는 본원에서 설명된 검정을 사용하여 LEA-1- 및/또는 LEA-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 실시예 11-13에서 설명된 바와 같이, 항-래트 MASP-2 Fab2 항체는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 차단하는 것으로 확인되었다. 실시예 14에서 더 설명된 바와 같이, 완전한 인간 MASP-2 scFv 항체는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 차단하는 것으로 확인되었다. 실시예 15에서 더 설명된 바와 같이, MASP-3 항체가 생성되었다. MASP 항체가 LEA-1 또는 LEA-2의 억제자로서 기능하는 것으로 확인되면, 그것은 본원에서 설명된 바와 같이 약학적 조성물에서 사용될 수 있고, 그것은 또한 이중 특이적 및 삼중 특이적 억제제를 생성하는데 사용될 수 있으며, 표 2에서 제시되고 본원에서 더 설명된 바와 같다 (예를 들어, 실시예 8 참조).
MASP- 1, MASP-2 및 MASP-3 특이적 항체
표적 항원 항체 타입 참고문헌
MASP-2 재조합 MASP-2 래트 다클론성 Peterson, S.V.,　et　al., Mol. Immunol.　37:803-811, 2000
MASP-2 재조합 인간 CCP1/2-SP 단편 (MoAb 8B5) 래트 MoAb
(하위등급 IgG1)		 Moller-Kristensen, M.,　et　al., J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003
MASP-2 재조합 인간 MAp19 (MoAb 6G12) (MASP-2와 교차반응함) 래트 MoAb
(하위등급 IgG1)		 Moller-Kristensen, M.,　et　al., J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003
MASP-2 hMASP-2 마우스 MoAb (S/P)
마우스 MoAb (N-말단)		 Peterson, S.V.,　et　al., Mol. Immunol.　35:409, April 1998
MASP-2 hMASP-2 (CCP1-CCP2-SP 도메인 래트 MoAb: Nimoab101, produced by 히브리도마 세포주 03050904 (ECACC) WO 2004/106384
MASP-2 hMASP-2 (전장 his-태그됨(tagged)) 쥐 MoAbs:
NimoAb104, 히브리도마 세포주에 의해 생산됨 M0545YM035 (DSMZ)
NimoAb108, 히브리도마 세포주 M0545YM029 (DSMZ)에 의해 생산됨
히브리도마 세포주 M0545YM046 (DSMZ)에 의해 생산된 NimoAb109
히브리도마 세포주 M0545YM048 (DSMZ)에 의해 생산된 NimoAb110		 WO 2004/106384
MASP-2 래트 MASP-2 (전장) MASP-2 Fab2 항체 단편

 실시예 11-12
MASP-2 hMASP-2 (전장) 완전한 인간 scFv 클론
실시예 14
MASP-1 hMASP-1 (전장) 마우스 MoAbs:
히브리도마 라인 1E2 및 2B11에 의해 생산된 MoaAbs1E2 및 2B11 (MASP-2와 교차반응 하지 않음). 두 개의 abs가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다에 공통된 중쇄를 인식한다. 		Terai I. et al., Clin Exp Immunol 110:317-323 (1997);
MoAb1E2: Hycult Biotech Cat#HM2092에서 상업적으로 이용 가능함
MoAb2B11: Hycult Biotech에서 상업적으로 이용 가능함: 제품번호 HM2093
MASP-1 hMASP-1 (전장) 마우스 MoAb 4C2 Endo M. et al., Nephrol Dial Transplant 13:1984-1990 (1998)
MASP-1 hMASP-1 (전장) MASP-1 닭 abs 실시예 15
MASP-3 hMASP-3 (전장) 마우스 MoAbs:
MoAb-7D8;MoAb-7B7;MoAb-8B3; 및 MoAb-5H3
MoAb-7D8 및 mAb-5H3은 MASP-3-특이적이고, 다른 것은 MASP-1과 교차반응한다		 Skjoedt et al., Immunobiology 215(11):921-31 (2010)
MASP-3 hMASP-3 (전장) 래트 MoAb 38:12-3,
MASP-1을 인식하지 않음		 Moller-Kristensen et al., Int Immunol 19:141 (2007);
Hycult Biotech에서 상업적으로 이용 가능함: 제품번호 HM2216
MASP-3 hMASP-3 (전장) MASP-3 닭 abs 실시예 15
i. 효과기 기능이 감소된 MASP 항체본 발명의 이 양태의 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 MASP 항체는 고전적 보체 경로의 활성화로부터 일어날 수도 있는 염증을 감소시키기 위해 효과기 기능이 감소된다. 고전적 보체 경로를 촉발하는 IgG 분자의 능력은 분자의 Fc 부분 내에 있는 것으로 나타났다 (Duncan, A.R., et al, Nature 332:738-740 (1988)). 분자의 Fc 부분이 효소에 의한 분할에 의해 제거된 IgG 분자는 이 효과기 기능이 전혀 없다 (Harlow, 항체: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 참조). 따라서, 효과기 기능이 감소된 항체는 Jolliffe et al, Int'l Rev. Immunol. 10:241-250, (1993), 및 Rodrigues et al, J. Immunol. 151:6954-6961, (1998)에서 설명된 바와 같이 IgG 중쇄의 Fc 부분의 표준 분자적 생물학적 조작에 의해 생산될 수 있다. 효과기 기능이 감소된 항체는 또한 보체를 활성화하고 및/또는 Fc 수용체와 상호작용하는 능력이 감소된 인간 IgG2 및 IgG4 이소타입을 포함한다 (Ravetch, J.V., et al, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, (1991); Isaacs, J.D., et al, J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et al, Immunol. Today 14:215-221, (1993)). IgG2 또는 IgG4 이소타입으로 구성된 인간 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3에 특이적인 인간화된 또는 완전한 인간 항체 (이중, 전체, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체)는 당업자에게 알려져 있는 여러 방법 중 하나에 의해 생산될 수 있으며 Vaughan, T.J., et al, Nature Biotechnical 16:535-539, (1998)에서 설명된 같다.
ii. MASP 항체의 생산
MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 항체는 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 폴리펩티드 (예를 들어, 전장 MASP-1, MASP-1 또는 MASP-3)를 사용하여 또는 항원성 MASP-1, 2 또는 3 에피토프-함유 펩티드 (예를 들어, MASP-2 폴리펩티드의 일부)를 사용하여 생산될 수 있다. 면역원성 펩티드는 5개의 아미노산 잔기만큼 작을 수도 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:5의 전체 아미노산 서열을 포함하는 MASP-2 폴리펩티드는 본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 항체를 유발하는데 사용될 수도 있다. CUB1, 및 CUBI-EGF 도메인과 같이, 단백질-단백질 상호작용에 수반된 것으로 알려져 있는 특정 MASP 도메인, 뿐만 아니라, 예를 들어, 표 2에서 제시된 세린-프로테아제 활성 부위를 포함하는 영역은 업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 재조합 폴리펩티드로서 발현되고 항원으로 사용될 수도 있다. 게다가, MASP-1 폴리펩티드 (SEQ ID NO:10), 또는 MASP-2 폴리펩티드 (SEQ ID NO:5) 또는 MASP-3 폴리펩티드 (SEQ ID NO:8)의 적어도 6개의 아미노산의 일부를 포함하는 펩티드는 또한 각각 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 항체를 유발하는데 유용하다. 항체를 발생시키는데 사용된 MASP 펩티드 및 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드, 또는 재조합 또는 합성 펩티드 및 촉매 반응에 의한 비활성 재조합 폴리펩티드로서 분리될 수도 있다. MASP 항체를 생산하는데 유용한 항원은 또한 MASP 폴리펩티드 또는 이것의 일부의 면역글로불린 폴리펩티드 또는 말토스-결합 단백질과의 융합과 같은 융합 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 전장 분자 또는 이것의 일부일 수도 있다. 폴리펩티드 일부가 합텐-유사하면, 이러한 일부는 면역화를 위해 고분자 담체 (예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 파상풍 변독소(tetanus toxoid))에 유리하게 연결되거나 이것에 결합될 수도 있다.
iii. 다클론성 항체
MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3에 대한 다클론성 항체는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 동물을 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 폴리펩티드 또는 이것의 면역원성 부분으로 면역화함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", in Immunochemical Protocols (Manson, ed.)을 참고하면 된다. MASP 폴리펩티드의 면역원성은 알루미늄 히드록시드 또는 프로인트 보조제(Freund's adjuvant) (완전 또는 불완전)와 같은 미네랄 겔, 리졸레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루론 폴리올, 다음이온(polyanion), 오일 에멀젼, KLH 및 디니트로페놀을 포함하는, 보조제의 사용을 통해 증가될 수 있다. 다클론성 항체는 전형적으로 말, 소, 개, 닭, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그, 염소, 또는 양과 같은 동물에서 발생한다. 대안으로, 본 발명에서 유용한 MASP 항체는 또한 인간 이하 영장류로부터 유래될 수도 있다. 개코원숭이에서 진단적으로 및 치료적으로 유용한 항체를 발생시키는 일반적인 기술은, 예를 들어, Goldenberg et al., 국제 특허 공개 번호 제WO 91/11465호, 및 Losman, M.J., et al, Int. J. Cancer 46:310, (1990)에서 발견될 수도 있다. 그 다음에 면역학적 활성 항체를 함유하는 혈청은 업계에 잘 알려져 있는 표준 과정을 사용하여 이러한 면역화된 동물의 혈액으로부터 생산된다.
iv. 단클론성 항체
일부 구체예에서, LEA-2 억제제는 MASP-2 단클론성 항체이고 및/또는 LEA-1 억제제는 MASP-3 단클론성 항체 또는 MASP-1 단클론성 항체이다. 상기 설명된 바와 같이, 일부 구체예에서는, MASP-1, MASP-2 및 MASP-3 단클론성 항체가 고도로 특이적이며, 단일 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 에피토프를 향하게 된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 수식어 "단클론성"은 항체의 특징을 실질적으로 균질의 집단의 항체로부터 얻는 것으로서 지시하고, 어떤 특정 방법에 의해서도 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 단클론성 항체는 Kohler, G., et al, Nature 256:495, (1975)에 의해 설명된 히브리도마 방법과 같이, 배양물에서 지속적인 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 어떤 기술을 사용해서도 얻어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수도 있다 (예를 들어, Cabilly의 미국 특허 번호 제4,816,567호). 단클론성 항체는 또한 Clackson, T., et al, Nature 352:624-628, (1991), 및 Marks, J.D., et al, J. Mol. Biol. 222:581-597, (1991)에서 설명된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리(library)로부터 분리될 수도 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이것들의 어떤 하위등급을 포함하는 어떤 면역글로불린 등급일 수도 있다.
예를 들어, 단클론성 항체는 적합한 포유동물 (예를 들어, BALB/c 마우스)에 MASP-1 폴리펩티드, MASP-2 폴리펩티드 또는 MASP-3 폴리펩티드, 또는 이것의 일부를 포함하는 조성물을 주사함으로써 얻을 수 있다. 미리 결정된 기간 후, 비장세포는 마우스로부터 제거되고 세포 배양 배지에서 현탁되었다. 그 다음 비장세포는 불멸의 세포주와 융합되어 히브리도마를 형성한다. 형성된 히브리도마는 세포 배양물에서 성장되었고 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3에 대한 단클론성 항체를 생산하는 그것들의 능력에 대하여 스크리닝되었다 (또한 Current Protocols in Immunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, pages 2.5.1-2.6.7, 1991. 참조).
인간 단클론성 항체는 항원의 도전에 반응하여 특이적 인간 항체를 생산하도록 설계된 유전자 이식 마우스의 사용을 통해 얻어질 수도 있다. 이 기술에서, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 자리의 요소는 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 자리의 표적화된 붕괴를 함유하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스의 균주로 도입된다. 유전자 이식 마우스는 본원에서 설명된 MASP-2 항원과 같은 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 통상적인 쾰러-밀스타인(Kohler-Milstein) 기술을 사용하여 이러한 동물의 B-세포를 적합한 골수종(myeloma) 세포주에 융합함으로써 인간 MASP-2 항체-분비 히브리도마를 생산하는데 사용될 수 있다. 유전자 이식 마우스로부터 인간 항체를 얻는 방법은, 예를 들어, Green, L.L., et al, Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg, N., et al, Nature 368:856, 1994; 및 Taylor, L.D., et al, Int. Immun. 6:579, 1994에 의해 설명된다.
단클론성 항체는 잘 확립된 다양한 기술에 의해 히브리도마 배양물로부터 분리되고 정제될 수 있다. 이러한 분리 기술은 단백질-A 세파로스와의 친화도 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다 (예를 들어, 2.7.1-2.7.12페이지 및 2.9.1-2.9.3페이지의 Coligan; Baines et al, "Purification of 면역글로불린 G (IgG)", in Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, pages 79-104, 1992 참조).
생산되면, 다클론성, 단클론성 또는 파지-유래된 항체는 먼저 특이적 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 결합에 대하여, 또는 원하는 경우, 이중 MASP-1/3, MASP-2/3 또는 MASP-1/2 결합에 대하여 테스트 된다.
항체가 단백질 항원에 결합하는지의 여부 및/또는 단백질 항원에 대한 항체의 친화도를 결정하는 방법은 업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들어, 항체의 단백질 항원으로의 결합은 웨스턴 블롯, 도트 블롯(dot blot), 플라스몬 표면 공명(plasmon surface resonance) 방법 (예를 들어, BIAcore 시스템; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden 및 Piscataway, NJ), 또는 효소-결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술을 사용하여 검출되고 및/또는 정량화될 수 있다. 예를 들어, Harlow and Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Benny K. C. Lo (2004) "Antibdy Engineering: Methods and Protocols", Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide", W.H. Freeman and Co., NY; Borrebaek (1995) "Antibody Engineering", 2nd Edition, Oxford University Press, NY, Oxford; Johne et al. (1993), Immunol. Meth. 160: 191-198; Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; 및 Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627을 참고하면 된다. 또한, 미국 특허 번호 제6,355,245호를 참고하면 된다.
MASP 단클론성 항체의 친화도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다 (예를 들어, Scatchard, A., NY Acad. Sci. 57:660-672, 1949를 참고하면 된다). 한 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 단클론성 항체는 < 100 nM, 바람직하게 <10 nM 및 가장 바람직하게 <2 nM의 결합 친화도로 MASP-1, MASP-2, 또는 MASP-3에 결합한다.
항체가 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3에 특이적으로 결합하는 것이 확인되면, MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 항체는, 예를 들어, 표 2에서 설명된 여러 기능적 검정 중 하나에서 LEA-1 억제제 또는 LEA-2 억제제로서 기능하는 능력에 대하여 테스트되었다. 예를 들어, MASP-2에 특이적으로 결합하는 것으로 확인된 항체는, 예를 들어, 표 2에서 설명된 바와 같은 여러 검정 (예를 들어, 렉틴-특이적 C4 분할 검정 (예를 들어, 실시예 8 또는 실시예 9에서 설명된 검정), 또는 C3b 침착 검정 (예를 들어, 실시예 4 또는 실시예 11에서 설명된 검정)) 중 하나에서 LEA-2 억제제로서 기능하는 능력에 대하여 테스트되었다. 추가의 예로서, MASP-1 또는 MASP-3에 특이적으로 결합하는 것으로 확인된 항체는, 예를 들어, 표 2에서 설명된 바와 같은 여러 검정 중 하나에서 LEA-1 억제제로서 기능하는 능력 (예를 들어, 예를 들어 실시예 5에서 설명된 바와 같이 측정된 용혈의 감소, 또는, 예를 들어, 실시예 4 및 실시예 11에서 설명된 바와 같이 측정된 C3 분할 및 C3b 침착의 감소)에 대하여 테스트 되었다.
v. 키메라/인간화된 항체
본 발명의 방법에 유용한 단클론성 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 등급 또는 하위등급에 속하는 항체에서 해당 서열과 동일하거나 이에 상동성인 한편, 나머지 사슬(들)은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또는 또 다른 항체 등급 또는 하위등급, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에 속하는 항체에서 해당 서열과 동일하거나 이에 상동성인 키메라 항체를 포함한다 (Cabilly에 대한 미국 특허 번호 제4,816,567호; 및 Morrison, S.L., et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, (1984)).
본 발명에서 유용한 키메라 항체의 한 형태는 인간화된 단클론성 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 항체이다. 인간화된 형태의 비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체는 키메라 항체이며, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 함유한다. 인간화된 단클론성 항체는 비-인간 (예를 들어, 마우스) 상보성 결정 영역 (CDR)을 마우스 면역글로불린의 가변 중쇄 및 경쇄로부터 인간 가변 도메인으로 이동시킴으로써 생산된다. 전형적으로, 인간 항체의 잔기는 그 다음에 비-인간 대응물의 프레임워크 영역에서 치환된다. 게다가, 인간화된 항체는 수령자 항체 또는 제공자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이 변형들은 항체 성능을 더 개량하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간 면역글로불린의 것에 해당하는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프 및 모든 또는 실질적으로 모든 FV 프레임워크 영역이 인간 면역글로불린 서열의 것인, 적어도 하나, 및 전형적으로 두 개의 가변 도메인을 포함할 것이다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 선택적으로 포함할 것이다. 더 상세한 설명을 위해, Jones, P.T., et al, Nature 321:522-525, (1986); Reichmann, L., et al, Nature 332:323-329, (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, (1992)를 참고하면 된다.
본 발명에서 유용한 인간화된 항체는 적어도 MASP-1, MASP-2, 또는 MASP-3 결합 CDR3 영역을 포함하는 인간 단클론성 항체를 포함한다. 게다가, Fc 영역은 IgA 또는 IgM뿐만 아니라 인간 IgG 항체를 생산하기 위해 대체될 수도 있다. 이러한 인간화된 항체는 그것들이 인간 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3을 특이적으로 인식하지만 인간에서 항체 자체에 대한 면역 반응을 일으키지 않기 때문에 특별한 임상적 유용성을 가질 것이다. 결과적으로, 그것들은, 특히 반복된 또는 장기간 투여가 필요할 때, 인간에서 생체 내 투여에 더 적합하다.
인간화된 단클론성 항체를 생산하는 기술은 또한, 예를 들어, Jones, P.T., et al, Nature 321:522, (1986); Carter, P., et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, (1992); Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, (1992); Singer, I.I., et al, J. Immun. 150:2844, (1993); Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., (1995); Kelley, "Engineering Therapeutic Antibody", in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., pages 399-434, (1996); 및 Queen, 1997에 대한 미국 특허 번호 제5,693,762호에 의해 설명된다. 게다가, Protein Design Labs (Mountain View, CA)와 같이, 특이적 쥐 항체 영역으로부터 인간화된 항체를 합성하는 상업적 실체물이 있다.
vi. 재조합 항체
MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 항체는 또한 재조합 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 인간 항체는 인간 항체 (VH, VL, FV, 인자 D, Fab 또는 F(ab')2)의 단편을 생산하기 위해 인간 면역글로불린 발현 라이브러리 (예를 들어, Stratagene, Corp., La Jolla, CA로부터 이용 가능함)를 사용하여 만들어질 수 있다. 그 다음 이 단편들이 키메라 항체를 생산하는 것과 유사한 기술을 사용하여 전체 인간 항체를 구성하기 위해 사용된다.
vii. 항-이디오타입 항체
MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 항체가 원하는 억제 활성을 갖는 것으로 확인되면, 이 항체들은 업계에 잘 알려져 있는 기술을 사용하여 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3의 일부와 유사한 항-이디오타입 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Greenspan, N.S., et al, FASEB J. 7:437, (1993)을 참고하면 된다. 예를 들어, MASP-2에 결합하여 보체 활성화에 필요한 MASP-2 단백질 상호작용을 경쟁적으로 억제하는 항체는 MASP-2 단백질의 MBL 결합 부위와 유사하고 그러므로, 예를 들어, MBL와 같은 MASP-2의 결합 리간드에 결합하고 이를 중화시키는 항-이디오타입을 생성하는데 사용될 수 있다.
viii. 면역글로불린 단편
본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 및 MASP-3 억제제는 온전한 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자 및 항체 단편으로 형성된 다중 특이적 (예를 들어, 이중 특이적 및 삼중 특이적) 항체를 포함하는, 잘 알려져 있는 단편도 포함한다.
항체 분자의 작은 부분, 파라토프만이 항체의 그것의 에피토프로의 결합에 수반된다는 것이 업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986을 참고하면 된다). 항체의 pFc' 및 Fc 영역은 고전적 보체 경로의 효과기이지만 항원 결합에 수반되지 않는다. pFc' 영역이 효소에 의해 분할되거나, 또는 pFc' 영역 없이 생산된 항체는 F(ab')2 단편으로 지정되고 온전한 항체의 항원 결합 부위 둘 다를 보유한다. 분리된 F(ab')2 단편은 그것의 두 개의 항원 결합 부위 때문에 2가 단클론성 단편으로 불린다. 유사하게, Fc 영역이 효소에 의해 분할되거나, 또는 Fc 영역 없이 생산된 항체는 Fab로 지정되고, 온전한 항체 분자의 항원 결합 부위 중 하나를 보유한다.
항체 단편은 단백질 가수분해에 의해, 예를 들어, 통상적인 방법에 의한 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 F(ab')2로 표시된 5S 단편을 제공하기 위해 펩신으로 항체의 효소적 분할에 의해 생산될 수 있다. 이 단편은 3.5S Fab' 1가 단편을 생산하기 위해 티올 환원제를 사용하여 더 분할될 수 있다. 선택적으로, 분할 반응은 이황화 결합의 분할로부터 발생하는 술프히드릴 기에 대한 차단 기를 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로서, 펩신을 사용하는 효소적 분할은 두 개의 1가 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접적으로 생산한다. 이 방법들은, 예를 들어, Goldenberg에 대한 미국 특허 번호 제4,331,647호; Nisonoff, A., et al, Arch. Biochem. Biophys. 89:230, (1960); Porter, R.R., Biochem. J. 73:119, (1959); Edelman, et al, in Methods in Enzymology 1:422, Academic Press, (1967); 및 2.8.1-2.8.10 페이지 및 2.10.-2.10.4페이지의 Coligan에 의해 설명된다.
일부 구체예에서, Fc 영역이 결핍된 항체 단편의 사용은 Fc의 Fcγ 수용체로의 결합시 시작되는 고전적 보체 경로의 활성화를 막기 위해 바람직하다. 예를 들어, 단클론성 항체의 Fc 영역은 단백질 가수분해 효소에 의한 부분적 분해 (예를 들어, 피신 분해)를 사용하여 화학적으로 제거될 수 있고, 이로 인해, 예를 들어, Fab 또는 F(ab)2 단편과 같은 항원-결합 항체 단편을 생성할 수 있다 (Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28:69-71, (1991)). 대안으로, 인간 γ4 IgG 이소타입은, Fcγ 수용체에 결합하지 않으며, 본원에서 설명된 바와 같이 인간화된 항체의 구성 중에 사용될 수 있다. Fc 도메인이 결핍된 항체, 단일 사슬 항체 및 항원-결합 도메인은 또한 본원에서 설명된 재조합 기술을 사용하여 조작될 수 있다.
ix. 단일-사슬 항체 단편
대안으로, 중쇄 및 경쇄 Fv 영역이 연결되는 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3에 특이적인 단일 펩티드 사슬 결합 분자를 생성할 수 있다. Fv 단편은 펩티드 결합자에 의해 연결되어 단일-사슬 항원 결합 단백질 (scFv)을 형성할 수도 있다. 이 단일-사슬 항원 결합 단백질은 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 구성함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터로 삽입되며, 이것은 그 다음에 대장균 (E. coli)와 같은 숙주 세포로 도입된다. 재조합 숙주 세포는 두 개의 V 도메인을 연결하는 결합자 펩티드와 함께 단일 폴리펩티드 사슬을 합성한다. scFv를 생산하는 방법은, 예를 들어, Whitlow, et al., "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, (1991); Bird, et al, Science 242:423, (1988); Ladner에 대한 미국 특허 번호 제4,946,778호; Pack, P., et al, Bio/Technology 11:1271, (1993)에 의해 설명된다.
실례적 예로서, MASP-3-특이적 scFv는 시험관 내에서 림프구를 MASP-3 폴리펩티드에 노출시키고 파지 또는 유사한 벡터 (예를 들어, 고정된 또는 표지된 MASP-3 단백질 또는 펩티드의 사용을 통해)에서 항체 디스플레이 라이브러리를 선택함으로써 얻어질 수 있다. 잠재적 MASP-3 폴리펩티드 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 파지 또는 대장균과 같은 박테리아에서 나타난 무작위 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리는 MASP-3과 상호작용하는 펩티드에 대하여 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 기술은 업계에 잘 알려져 있고 (Lardner에 대한 미국 특허 번호 제5,223,409호; Ladner에 대한 미국 특허 번호 제4,946,778호; Lardner에 대한 미국 특허 번호 제5,403,484호; Lardner에 대한 미국 특허 번호 제5,571,698호; 및 Kay et al, Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) 무작위의 펩티드 디스플레이 라이브러리 및 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 키트는, 예를 들어, CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.)로부터 상업적으로 이용 가능하다.
본 발명의 이 양태에 유용한 MASP-3 항체 단편의 또 다른 형태는 MASP-3 항원에서 에피토프에 결합하고 MASP-3-의존적 보체 활성화 (즉, LEA-1)를 억제하는 단일 상보성-결정 영역 (CDR)을 암호화하는 펩티드이다. 본 발명의 이 양태에서 유용한 MASP-2 항체 단편의 또 다른 형태는 MASP-2 항원에서 에피토프에 결합하고 MASP-2-의존적 보체 활성화 (즉, LEA-2)를 억제하는 단일 상보성-결정 영역 (CDR)을 암호화하는 펩티드이다.
CDR 펩티드 ("최소 인식 단위")는 원하는 항체의 CDR을 암호화하는 유전자를 구성함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어, 항체-생산 세포의 RNA의 가변 영역을 합성하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 제조된다 (예를 들어, Larrick et al, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of 단클론성 항체", in 단클론성 항체: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, (1995); 및 Ward et aL, "Genetic Manipulation and Expression of Antobodies", in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), page 137, Wiley-Liss, Inc., 1995를 참고하면 된다).
본원에서 설명된 MASP 항체는 LEA-1, LEA-2 또는 LEA-1 및 LEA-2 보체 활성화의 조합을 억제하기 위해 이것이 필요한 개체에 투여된다. 일부 구체예에서, MASP 억제제는 높은 친화도의 인간 또는 인간화된 단클론성 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 효과기 기능이 감소된 항체이다.
x. 이중 특이적 항체
본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 및 MASP-3 억제제는 다중 특이적 (즉, 이중 특이적 및 삼중 특이적) 항체를 포함한다. 이중 특이적 항체는 적어도 두 개의 다른 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, 단클론성, 바람직하게 인간 또는 인간화된, 항체이다. 상기 설명되고 표 2에서 나타난 바와 같이, 한 구체예에서, 방법은 MASP-2에 대한 결합 특이성 (예를 들어, CCP1-CCP2 또는 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 중 적어도 하나에 결합) 및 MASP-3에 대한 결합 특이성 (예를 들어, MASP-3의 세린 프로테아제 도메인에 결합)을 포함하는 이중 특이적 항체의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 MASP-1에 대한 결합 특이성 (예를 들어, MASP-1의 세린 프로테아제 도메인에 결합) 및 MASP-2에 대한 결합 특이성 (예를 들어, CCP1-CCP2 또는 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 중 적어도 하나에 결합)을 포함하는 이중 특이적 항체의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 MASP-1에 대한 결합 특이성 (예를 들어, MASP-1의 세린 프로테아제 도메인에 결합) 및 MASP-3에 대한 결합 특이성 (예를 들어, MASP-3의 세린 프로테아제 도메인에 결합)을 포함하는 이중 특이적 항체의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 MASP-1에 대한 결합 특이성 (예를 들어, MASP-1의 세린 프로테아제 도메인에 결합), MASP-2에 대한 결합 특이성 (예를 들어, CCP1-CCP2 또는 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 중 적어도 하나에 결합) 및 MASP-3에 대한 결합 특이성 (예를 들어, MASP-3의 세린 프로테아제 도메인에 결합)을 포함하는 삼중 특이적 항체의 사용을 포함한다.
이중 특이적 항체를 만드는 방법은 당업자의 범위 내에 있다. 전통적으로, 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 동시-발현에 기초하며, 두 개의 중쇄는 다른 특이성을 갖는다 (Milstein and Cuello, Nature 305:537-539 (1983)). 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지(hinge), CH2, 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 융합된다. 면역글로불린 중쇄 융합체를 암호화하는 DNA 및, 원하면, 면역글로불린 경쇄는 별개의 발현 벡터로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체로 동시-트랜스펙션된다.
이중 특이적 항체를 생성하기 위한 현재 알려져 있는 예시적 방법의 더 상세한 설명을 위해, 예를 들어, Suresh et al, Methods in Enzymology 121:210 (1986); WO96/27011; Brennan et al, Science 229:81 (1985); Shalaby et al, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992); Kostelny et al, J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992); Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 (1993); Gruber et al, J. Immunol. 152:5368 (1994); 및 Tutt et al, J. Immunol. 147:60 (1991)을 참고하면 된다. 이중 특이적 항체는 또한 교차-결합된 헤테로콘쥬게이트 (heteroconjugate) 항체를 포함한다. 헤테로콘쥬게이트 항체는 어떤 편리한 교차-결합 방법을 사용해서도 만들어질 수 있다. 적합한 가교제가 업계에 잘 알려져 있고, 많은 교차-결합 기술과 함께, 미국 특허 번호 제4,676,980호에서 개시된다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중 특이적 항체 단편을 만들고 분리하는 다양한 기술이 또한 설명되었다. 예를 들어, 이중 특이적 항체는 류신 지퍼(leucin zipper)를 사용하여 생산되었다 (예를 들어, Kostelny et al. J.Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992)를 참고하면 된다). Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 (1993)에 의해 설명된 "디아바디" 기술은 이중 특이적 항체 단편을 만들기 위한 대체 매커니즘을 제공하였다. 단편은 너무 작아서 같은 사슬 상의 두 개의 도메인 사이에서 짝짓기를 허용할 수 없는 결합자에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루도록 강요되고, 이로 인해 두 개의 항원-결합 부위를 형성한다. 이중 특이적 전체 항체와는 대조적으로, 이중 특이적 디아바디는 또한 그것들이 대장균에서 쉽게 구성되고 발현될 수 있기 때문에 특별히 유용할 수도 있다. 적절한 결합 특이성의 디아바디 (및 항체 단편과 같은 많은 다른 폴리펩티드)는 라이브러리의 파지 디스플레이 (WO94/13804)를 사용하여 쉽게 선택될 수 있다. 디아바디의 한 팔에서, 예를 들어, 항원 X에 대한 특이성이 일정하게 유지되어야 하면, 그 다음 다른 팔이 다양한 경우에 라이브러리가 만들어질 수 있고 적절한 특이성의 항체가 선택된다.
단일-사슬 Fv (scFv) 다이머의 사용에 의해 이중 특이적 항체 단편을 만들기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다 (예를 들어, Gruber et al. J. Immunol., 152:5368 (1994)를 참고하면 된다). 대안으로, 항체는, 예를 들어, Zapata et al, 단백질 Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)에서 설명된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 간략히 설명하면, 이 항체들은 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 인자 D 세그먼트 (VH-CHI-VH-CHI)의 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이중 특이적 또는 단일 특이적일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 Wu et al, Nat Biotechnol 25: 1290-1297 (2007)에서 설명된 3가 이중 가변 도메인 면역글로불린 (DVD-Ig) 분자와 같은 이중 특이적 항체의 다양한 형태의 사용을 또한 받아들일 수 있다. DVD-Ig 분자들은 두 개의 다른 모체 항체의 두 개의 다른 경쇄 가변 도메인 (VL)이 재조합 DNA 기술에 의해 직접적으로 또는 짧은 결합자를 통해 탠덤에 이어, 경쇄 불변 도메인에서 결합되도록 설계된다. 두 개의 모체 항체로부터 DVD-Ig 분자를 생성하기 위한 방법은, 예를 들어, 제WO08/024188호 및 제WO07/024715호에서 더 설명되며, 이것들 각각의 개시는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
비-펩티드 억제자
일부 구체예에서, MASP-3 또는 MASP-2 억제제는 MASP-3 또는 MASP-2 또는 MASP-1 억제 펩티드 또는 MASP-3, 또는 MASP-2 또는 MASP-1의 비-펩티드 억제자이다. 비-펩티드 MASP 억제제는 개체에 전신으로, 예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. MASP 억제제는 만성 질환의 치료 또는 제어를 위해 장기간 동안 주기적으로 투여될 수도 있거나, 또는 급성 외상 또는 부상 전, 중간 또는 이후의 기간에 일회 또는 반복된 투여에 의한 것일 수도 있다.
XVIII. 약학적 조성물 및 전달 방법
투여
또 다른 양태에서, 본 발명은 PNH와 같은 용혈성 질환, 또는 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받는 개체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화의 역효과를 억제하기 위한 조성물을 제공하며, 개체에 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-3 억제제의 양 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 더 포함한다. MASP-3 및 MASP-2 억제제는 이것이 필요한 개체에, MASP-3-의존적 보체 활성화 (LEA-1), 및 선택적으로 또한 MASP-2-의존적 보체 활성화 (LEA-2)와 관련된 질병을 치료하거나 개선하기 위한 치료적 유효량으로, 투여될 수 있다. 치료적 유효량은 질병의 증상의 개선을 일으키는데 충분한 MASP-3 억제제, 또는 MASP-3 억제제 및 MASP-2 억제제의 조합의 양을 나타낸다.
MASP-3 및 MASP-2 억제제의 독성 및 치료 효능은 실험 동물 모델을 이용하는 표준 약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 이러한 동물 모델을 사용하여, NOAEL (관찰된 역효과 수준 없음) 및 MED (최소 유효량)은 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. NOAEL 및 MED 효과 사이의 용량비는 치료 계수이며, 이것은 NOAEL/MED 비로 표현된다. 큰 치료 계수 또는 지수를 나타내는 MASP-3 억제제 및 MASP-2 억제제가 가장 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용되는 투약량의 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. MASP-3 억제제 및 MASP-2 억제제의 투약량은 바람직하게 거의 또는 전혀 독성이 없는 MED를 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투약량은 활용된 투약 형태 및 이용된 투여 루트에 의존적으로 이 범위 내에서 다를 수도 있다.
어떤 합성 제형에 대해서도, 치료적 유효량은 동물 모델을 사용하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 MED를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위한 동물 모델에서 공식화될 수도 있다. 혈장에서 MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제의 양적 수준이 또한, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수도 있다.
독성 연구 외에도, 유효량은 또한 살아있는 개체에 존재하는 표적 MASP 단백질의 양 및 MASP-3 또는 MASP-2 억제제의 결합 친화도에 기초하여 추정될 수도 있다.
정상 인간 개체에서 MASP-1 수준은 1.48 내지 12.83 μg/mL의 범위의 수준으로 혈청에 존재한다고 보고되었다 (Terai I. et al, Clin Exp Immunol 110:317-323 (1997); Theil et al, Clin. Exp. Immunol. 169:38 (2012)). 정상 인간 개체에서 평균 혈청 MASP-3 농도는 약 2.0 내지 12.9 μg/mL의 범위에 있는 것으로 보고되었다 (Skjoedt M et al, Immunobiology 215(11):921-31 (2010); Degn et al, J. Immunol Methods, 361-37 (2010); Csuka et al, Mol. Immunol. 54:271 (2013). 정상 인간 개체에서 MASP-2 수준은 500 ng/mL의 범위에서 낮은 수준으로 혈청에 존재하고, 특정 개체의 MASP-2 수준은 Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol. Methods 282:159-167 (2003) 및 Csuka et al., Mol. Immunol. 54:271 (2013)에서 설명된 MASP-2에 대한 정량적 검정을 사용하여 결정될 수 있는 것으로 나타났다.
일반적으로, MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제를 포함하는 투여된 조성물의 투약량은 개체의 나이, 체중, 키, 성별, 일반적인 의학적 상태, 및 이전의 병력에 따라 다르다. 예시로서, MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제 (예를 들어, MASP-3 항체, MASP-1 항체 또는 MASP-2 항체)는 개체 체중의 약 0.010 내지 100.0 mg/kg, 바람직하게 0.010 내지 10 mg/kg, 바람직하게 0.010 내지 1.0 mg/kg, 더 바람직하게 0.010 내지 0.1 mg/kg의 투약 범위로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제 (예를 들어, MASP-2 항체)는 개체 체중의 대략 바람직하게 0.010 내지 10 mg/kg, 바람직하게 0.010 내지 1.0 mg/kg, 더 바람직하게 0.010 내지 0.1 mg/kg의 투약 범위로 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-1 억제제 (예를 들어, MASP-1 항체) 또는 MASP-3 억제제 (예를 들어, MASP-3 항체)는 개체 체중의 약 0.010 내지 100.0 mg/kg, 바람직하게 0.010 내지 10 mg/kg, 바람직하게 0.010 내지 1.0 mg/kg, 더 바람직하게 0.010 내지 0.1 mg/kg의 투약 범위로 투여된다.
특정 개체에서 선택적으로 MASP-2 억제 조성물과 결합된 MASP-3 억제 조성물, 또는 선택적으로 MASP-2 억제 조성물과 결합된 MASP-1 억제 조성물의 치료 효능, 및 본 발명의 방법, 및 적절한 투약량은 당업자에게 잘 알려져 있는 보체 검정에 따라 결정될 수 있다. 보체는 많은 특이적 생성물을 발생시킨다. 지난 10년 동안 민감성 및 특이적 검정이 개발되었고 이 활성화 생성물의 대부분에 대하여 상업적으로 이용 가능하며, 작은 활성화 단편 C3a, C4a, 및 C5a 및 큰 활성화 단편 iC3b, C4d, Bb, 및 sC5b-9를 포함한다. 이 검정들 중 대부분은 단편에 노출된, 하지만 그것들이 형성되는 고유한 단백질에는 노출되지 않은 새로운 항원(신항원)과 반응하는 단클론성 항체를 이용하며, 이 검정들을 매우 단순하고 특이적으로 만든다. 대부분 ELISA 기술에 의존하지만, 방사선 면역 검정은 C3a 및 C5a에 대해서는 여전히 가끔 사용된다. 이 후자의 검정들은 미가공된 단편 및 그것들의 'desArg' 단편 둘 다를 측정하는데, 이것은 순환에서 발견되는 주요 형태이다. 미가공된 단편 및 C5adesArg는 세포 표면 수용체로의 결합에 의해 신속하게 제거되고 이런 이유로 매우 낮은 농도로 존재하는 반면에, C3adesArg는 세포에 결합하지 않고 혈장에 축적된다. C3a의 측정은 보체 활성화의 민감성, 경로-독립적 지표를 제공한다. 대체 경로 활성화는 Bb 단편을 측정함으로써 및/또는 인자 D 활성화의 측정에 의해 평가될 수 있다. 막 공격 경로 활성화의 체액-단계 생성물, sC5b-9의 검출은 보체가 완료될 때까지 활성화되고 있다는 증거를 제공한다. 렉틴 경로 및 고전적 경로 둘 다가 같은 활성화 생성물, C4a 및 C4d을 발생시키기 때문에, 이 두 개의 단편들의 측정은 이 두 개의 경로들 중 어떤 것이 활성화 생성물을 발생시키는지에 대한 어떤 정보도 제공하지 않는다.
MASP-3-의존적 보체 활성화의 억제는 본 발명의 방법에 따라 MASP-3 억제제의 투여의 결과로서 발생하는 보체 시스템의 구성요소의 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: LEA-1-매개된 보체 활성화의 억제 (용혈 및 옵소닌화의 억제); MASP-3 세린 프로테아제 기질-특이적 분할의 억제, 용혈의 감소 (예를 들어 실시예 5에서 설명된 바와 같이 측정됨) 또는 C3 분할 및 C3b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 4 또는 실시예 11에서 설명된 바와 같이 측정됨).
MASP-2-의존적 보체 활성화의 억제는 본 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 발생하는 보체 시스템의 구성요소의 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2 -의존적 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생산의 억제 (예를 들어, 미국 특허 번호 제7,919,094호의 실시예 2에서 설명된 바와 같이 측정된 것에서 설명된 바와 같이 측정됨), C4 분할 및 C4b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 8 또는 실시예 9에서 설명된 바와 같이 측정됨), 또는 C3 분할 및 C3b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 11에서 설명된 바와 같이 측정됨).
i. 약학적 담체 및 전달 비히클(vehicle)
일반적으로, 본 발명의 MASP-3 억제제 조성물 및 MASP-2 억제제 조성물, 또는 MASP-2 및 MASP-3 억제제의 조합을 포함하는 조성물은 어떤 다른 선택된 치료제와 결합될 수도 있고, 약학적으로 허용 가능한 담체로 적합하게 함유된다. 담체는 비-독성이고, 생체에 적합하며, MASP-3 억제제 또는 the MASP-2 억제제 (및 그것과 결합된 어떤 다른 치료제)의 생물학적 활성에 해로운 영향을 미치지 않기 위해 선택된다. 펩티드에 대하여 약학적으로 허용 가능한 예시적 담체는 Yamada에 대한 미국 특허 번호 제5,211,657호에서 설명된다. 본 발명에서 유용한 MASP 항체는, 본원에서 설명된 바와 같이, 경구, 비경구 또는 수술적 투여를 허용하는 타블렛, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 디파지터리(depository), 흡입제 및 주사액과 같이 고체, 반고체, 겔, 액체 또는 기체 형태의 조제물로 제형화될 수도 있다. 본 발명은 또한 코팅 의료 장치 등에 의한 조성물의 국부적 투여를 고려한다. 주사, 투입 또는 관주법 및 국소 전달을 통해 비경구 전달에 적합한 담체는 증류수, 생리학적 포스페이트-완충된 식염수, 정상 또는 락테이트화된 링거 용액(Ringer's solution), 덱스트로스 용액, 행크 용액(Hank's solution), 또는 프로판디올을 포함한다. 게다가, 멸균, 고정된 오일은 용제 또는 현탁 배지로서 이용될 수도 있다. 이 목적을 위해 어떤 생체 적합성 오일도 활동될 수 있으며 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함한다. 게다가, 올레산과 같은 지방산은 주사 가능 물질의 제조에서 용도를 찾는다. 담체 및 약제는 액체, 현탁액, 폴라머화 가능 또는 비-폴리머화 가능 겔, 페이스트(paste) 또는 고약으로서 합성될 수도 있다.
담체는 또한 약제(들)의 전달을 지속 (즉, 연장, 지연 또는 제어)하기 위해 또는 치료제(들)의 전달, 흡수, 안정성 또는 약물동력학을 향상시키기 위해 전달 비히클을 포함할 수도 있다. 이러한 전달 비히클은, 비-제한 예의 방법으로, 단백질, 리포솜, 탄수화물, 합성 유기 화합물, 무기 화합물, 폴리머 또는 코폴리머 히드로겔(hydrogel) 및 폴리머 미셸(micelle)로 구성된 미세입자, 미소구체, 나노구체 또는 나노입자를 포함할 수도 있다. 적합한 히드로겔 및 미셸 전달 시스템은 제WO 2004/009664 A2호에서 개시된 PEO:PHB:PEO 코폴리머 및 코폴리머/시클로덱스트린 복합체 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2002/0019369 A1호에서 개시된 PEO 및 PEO/시클로덱스트린 복합체를 포함한다. 이러한 히드로겔은 의도된 작용의 부위에 국부적으로 또는 피하 또는 근육 내 주사되어 지속적인 방출 디폿(depot)을 형성할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 피하, 근육 내, 정맥 내, 동맥 내 전달을 위해 또는 흡입제로서 제형화될 수도 있다.
관절 내 전달을 위해, MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제는 주사 가능한 상기 설명된 액체 또는 겔 담체, 주사 가능한 상기 설명된 지속적-방출 전달 비히클, 또는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체에서 운반될 수도 있다.
비-펩티드 약제의 경구 투여를 위해, MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제는 수크로스, 콘스타치(cornstarch), 또는 셀룰로스와 같은 충전제 또는 희석제에서 운반될 수도 있다.
국부적 투여를 위해, MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제는 연고, 로션, 크림, 겔, 방울, 좌약, 스프레이, 액체 또는 분말에서, 또는 겔 또는 경피성 패치를 통한 마이크로캡슐 전달 시스템에서 운반될 수도 있다.
에어로졸, 정량(metered-dose) 흡입기, 분말식 흡입기, 및 분무기를 포함하는 다양한 코 및 폐 전달 시스템이 개발되고 있고 각각 에어로졸, 흡입제, 또는 분무된 전달 비히클에서 본 발명의 전달에 적합하게 적용될 수도 있다.
척추강 내 (IT) 또는 뇌실 내 (ICV) 전달을 위해, 적절하게 멸균된 전달 시스템 (예를 들어, 액체; 겔, 현탁액, 등)이 본 발명을 투여하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 분산제 또는 습윤제, 현탁화제, 희석제, 완충제, 경피 흡수 촉진제(penetration enhancer), 에멀젼화제, 결합제, 증점제, 착향제와 같은 생체 적합성 첨가제 (경구 투여를 위해)를 포함한다.
ii. 항체 및 펩티드에 대한 약학적 담체
MASP 항체에 관하여 더 구체적으로, 본원에서 설명된 바와 같이, 예시적 제형는 물, 오일, 식염수, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 멸균 액체일 수도 있는 약학적 담체와 함께 생리학적으로 허용 가능한 희석제의 화합물의 용액 또는 현탁액의 주사 가능 용량으로서 비경구 투여될 수 있다. 추가적으로, 습윤제 또는 에멀젼화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질은 MASP 항체를 포함하는 조성물에서 존재할 수 있다. 약학적 조성물의 추가적인 구성요소는 석유 (예를 들어, 동물성, 또는 식물성 또는 합성 기원), 예를 들어, 대두유 및 미네랄 오일을 포함한다. 일반적으로, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜은 주사 용액에 바람직한 액체 담체이다.
MASP 항체는 또한 활성제의 지속적 또는 박동성 방출을 허용하기 위해 이러한 방식으로 제형화될 수 있는 디폿 주사액 또는 이식 조제물의 형태로 투여될 수 있다.
XVIX. 투여의 방식
MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 국소적 또는 전신성 방식의 투여가 치료되는 질병에 가장 적절한지에 따라 많은 방법으로 투여될 수도 있다. 게다가, 본 발명의 조성물은 이식 가능한 의료 장치에 또는 그 위에 조성물을 코팅하거나 이에 통합함으로써 전달될 수 있다.
i. 전신성 전달
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전신성 전달" 및 "전신성 투여"는 의도된 치료적 작용의 단일 또는 다수의 부위에 전달된 약제의 분산을 효율적으로 일으키는 투여의 근육 내 (IM), 피하, 정맥 내 (IV), 동맥 내, 흡입, 혀 밑, 볼, 국부적, 경피성, 비강, 직장, 질 및 다른 루트를 포함하는 경구 및 비경구 루트를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 조성물에 대한 전신성 전달의 바람직한 루트는 정맥 내, 근육 내, 피하, 동맥 내 및 흡입을 포함한다. 본 발명의 특정 조성물에서 이용된 선택된 약제들에 대하여 정확한 전신성 투여 루트는 투여의 특정 루트와 관련된, 대사의 형질전환 경로에 대한 약제의 민감성을 부분적으로 설명하기 위해 결정된다는 것이 인정될 것이다. 예를 들어, 펩티드성 약제는 경구 이외의 루트에 의해 가장 적합하게 투여될 수도 있다.
MASP 억제 항체는, 본원에서 설명된 바와 같이, 어떤 적합한 수단에 의해서도 이것이 필요한 개체로 전달될 수 있다. MASP 항체 및 폴리펩티드의 전달의 방법은 투여의 경구, 폐, 비경구 (예를 들어, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 (IV) 또는 피하 주사), 흡입 (예를 들어, 미세한 분말 제형를 통해), 경피성, 코, 질, 직장, 또는 혀 밑 루트에 의한 투여를 포함하고, 투여의 각 루트에 적절한 투약 형태로 제형화될 수 있다.
대표적인 예의 방법에 의해, MASP 억제 항체 및 펩티드는 폴리펩티드를 흡수할 수 있는 신체 막, 예를 들어, 코, 위장 및 직장 막에 적용에 의해 살아있는 신체로 도입될 수 있다. 폴리펩티드는 전형적으로 침투 강화제와 함께 흡수성 막에 적용된다 (예를 들어, Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69, (1988); Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:213, (1990); Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G., et al, J. Controlled Release 13:241, (1990)을 참고하면 된다). 예를 들어, STDHF는 푸시딘 산의 합성 유도체, 담즙산염과 구조가 유사한 스테로이드 계면활성제이고, 코 전달을 위한 침투 강화제로서 사용되었다 (Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 199.).
MASP 억제 항체는 본원에서 설명된 바와 같이 효소적 분해로부터 폴리펩티드를 보호하기 위해 지질과 같은 또 다른 분자와 함께 도입될 수도 있다. 예를 들어, 폴리머, 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공유 결합에 의한 부착은 신체에서 특정 단백질을 효소적 가수 분해로부터 보호하고 따라서 반감기를 연장시키기 위해 사용되었다 (Fuertges, F., et al, J. Controlled Release 11: 139, (1990)). 많은 폴리머 시스템이 단백질 전달에 대하여 보고되었다 (Bae, Y.H., et al, J. Controlled Release 9:271, (1989); Hori, R., et al, Pharm. Res. 6:813, (1989); Yamakawa, I., et al, J. Pharm. Sci. 79:505, (1990); Yoshihiro, I., et al, J. Controlled Release 10: 195, (1989); Asano, M., et al, J. Controlled Release 9: 111, (1989); Rosenblatt, J., et al, J. Controlled Release 9:195, (1989); Makino, K., J. Controlled Release 12:235, (1990); Takakura, Y., et al, J. Pharm. Sci. 78: 117, (1989); Takakura, Y., et al, J. Pharm. Sci. 78:219, (1989)).
최근에, 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 가진 리포솜이 개발되었다 (예를 들어, Webb에 대한 미국 특허 번호 제5,741,516호). 게다가, 잠재적 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜-유사 조제물의 다양한 방법이 재검토되었다 (예를 들어, Szoka에 대한 미국 특허 번호 제5,567,434호; Yagi에 대한 미국 특허 번호 제5,552,157호; Nakamori에 대한 미국 특허 번호 제5,565,213호; Shinkarenko에 대한 미국 특허 번호 제5,738,868호; 및 Gao에 대한 미국 특허 번호 제5,795,587호).
경피성 적용을 위해, MASP 억제 항체는, 본원에서 설명된 바와 같이, 담체 및/또는 보조제와 같은 다른 적합한 성분과 결합될 수도 있다. 그것들이 의도된 투여를 위해 약학적으로 허용 가능해야 하고, 조성물의 활성 성분의 활성을 분해할 수 없다는 점을 제외하고는, 이러한 다른 성분의 성질에 대한 제한은 없다. 적합한 비히클의 실시예는 정제된 콜라겐과 있거나 없이 연고, 크림, 겔, 또는 현탁액을 포함한다. MASP 억제 항체는 또한 경피성 패치, 플라스터(plaster), 및 붕대로, 바람직하게는 액체 또는 반액체 형태로 함침될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 원하는 수준의 치료 효과를 유지하도록 결정된 간격으로 주기적으로 전신에 투여될 수도 있다. 예를 들어, 조성물은, 예를 들어, 피하 주사에 의해, 2 내지 4주 마다 또는 덜 빈번한 간격으로 투여될 수도 있다. 투약 요법은 약제의 조합의 작용에 영향을 미칠 수도 있는 다양한 인자를 고려하여 의사에 의해 결정된다. 이 인자들은 치료되는 질병의 진행의 정도, 환자의 나이, 성별 및 체중, 및 다른 임상적 인자를 포함할 것이다. 각 개개의 약제에 대한 투약량은 조성물에 포함되는 MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제의 기능, 뿐만 아니라 어떤 약물 전달 비히클 (예를 들어, 지속적 방출 전달 비히클)의 존재 및 성질에 따라 변할 것이다. 게다가, 투약량은 전달된 약제(들)의 투여의 빈도 및 약물동력학적 행동의 변화를 설명하기 위해 조정될 수도 있다.
ii. 국소 전달
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "국소적"은 의도된 국소화된 작용의 부위에 또는 그 주위에 약물의 적용을 포함하고, 예를 들어, 피부 또는 다른 영향을 받는 조직에 국부적 전달, 안구 전달, 척추강 내 (IT), 뇌실 내 (ICV), 관절 내, 공동 내, 두개 내 또는 방광 내 투여, 배치 또는 관주법을 포함할 수도 있다. 국소적 투여는 전신성 부작용을 막기 위해, 및 국소적 전달의 부위에서 활성제의 전달 시기 및 농도의 더 정확한 제어를 위해 더 낮은 용량의 투여를 가능하게 하는 것이 바람직할 수도 있다. 국소적 투여는, 대사, 혈류, 등의 환자 간 가변성에 상관없이, 표적 부위에 알려진 농도를 제공한다. 개선된 투약 제어는 또한 직접적인 전달의 방식에 의해 제공된다.
MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제의 국소적 전달은 질환 또는 질병을 치료하기 위한 수술 방법의 맥락에서, 예를 들어, 동맥우회술(arterial bypass surgery), 죽종절제술(atherectomy), 레이져 수술, 초음파 수술, 기구 혈관 형성(balloon 혈관형성술) 및 스텐트 배치(stent placement)와 같은 수술 도중에 달성될 수도 있다. 예를 들어, MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제는 혈관형성술로 개체에 투여될 수 있다. 혈관형성술은 동맥으로 바람이 빠진 기구를 가진 카테터를 삽입하는 단계를 수반한다. 바람 빠진 기구는 동맥경화성 플라크 근처에 위치하고 플라크(plaque)가 혈관 벽에 압축되도록 부풀어오른다. 결과로서, 기구 표면은 혈관의 표면상의 혈관 내피 세포층과 접촉된다. MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제는 동맥경화성 플라크의 부위에서 약제의 방출을 허용하는 방식으로 기구 혈관 형성 카테터에 부착될 수도 있다. 약제는 업계에 알려져 있는 표준 과정에 따라 기구 카테터에 부착될 수도 있다. 예를 들어, 약제는 기구가 부풀 때까지 기구 카테터의 구획에 저장될 수도 있으며, 이 지점에서 그것은 국소적 환경으로 방출된다. 대안으로, 약제는 기구 표면상에 함침될 수도 있으며, 이로 인해 그것은 Flugelman, M.Y., et al, Circulation 85:1110-1117, (1992)에서 개시된 것들과 같은 구멍난 기구 카테터에서 전달될 수도 있다. 또한 치료적 단백질을 기구 혈관 형성 카테터에 부착시키기 위한 예시적 과정에 대하여 공개된 PCT 출원 제WO 95/23161호를 참고하면 된다. 유사하게, MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제는 스텐트에 적용된 겔 또는 폴리머 코팅에 포함될 수도 있거나, 또는 스텐트의 재료에 통합될 수도 있으며, 이로 인해 스텐트는 혈관 배치 후 MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제를 용출시킨다.
관절염 및 다른 근골격계 장애의 치료에 사용된 MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제는 관절 내 주사에 의해 국소적으로 전달될 수도 있다. 이러한 조성물은 지속적 방출 전달 비히클을 적합하게 포함할 수도 있다. 국소적 전달이 필요할 수도 있는 경우의 추가 예로서, 비뇨생식기 질병의 치료에 사용된 MASP-2 억제 조성물은 방광 내 또는 다른 비뇨생식기 구조 내에서 적합하게 주입될 수도 있다.
XX. 치료 요법
예방적 적용에서, 약학적 조성물은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) and 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애에 민감한, 또는 그렇지 않으면 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에 질병의 증상에 걸릴 위험을 제거하거나 감소시키는데 충분한 양으로 투여된다. 치료적 적용에서, 약학적 조성물은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 의심되거나, 또는 이미 이것들로 고통받는 개체에 질병의 증상을 완화하거나, 또는 적어도 부분적으로 감소시키는데 충분한 치료적 유효량으로 투여된다.
한 구체예에서, 약학적 조성물은 PNH로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여된다. 이에 따라, 개체의 적혈구 세포는 조성물의 부재시 C3의 단편에 의해 옵소닌화되고, 조성물의 개체로의 투여는 개체의 적혈구 세포의 생존율을 증가시킨다. 한 구체예에서, 개체는 (i) 정상 수준 이하의 헤모글로빈, (ii) 정상 수준 이하의 혈소판; (iii) 정상 수준 이상의 망상적혈구, 및 (iv) 정상 수준 이상의 빌리루빈으로 구성된 군으로부터 선택된 조성물의 부재시 조성물의 부재시 하나 이상의 증상을 나타낸다. 조성물의 개체로의 투여는 (i) 증가된, 정상, 또는 거의 정상 수준의 헤모글로빈 (ii) 증가된, 정상, 또는 거의 정상 수준의 혈소판, (iii) 감소된, 정상, 또는 거의 정상 수준의 망상적혈구, 및/또는 (iv) 감소된, 정상, 또는 거의 정상 수준의 빌리루빈을 발생시키는, 증상의 적어도 하나 이상을 개선한다.
발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 이것들의 심각도의 감소를 위한 예방적 및 치료적 요법 둘 다에서, MASP-3 억제제 및 선택적으로 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 충분한 치료적 결과가 개체에서 달성될 때까지 여러 번의 투약량으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서, MASP-3 및/또는 MASP-2 억제제는 MASP-1 항체, MASP-2 항체 또는 MASP-3 항체를 포함하며, 이것은 성인 환자 (예를 들어, 70 kg의 평균 성인 체중)에게 0.1 mg 내지 10,000 mg, 더 적합하게 1.0 mg 내지 5,000 mg, 더 적합하게 10.0 mg 내지 2,000 mg, 더 적합하게 10.0 mg 내지 1,000 mg 및 더 적합하게 50.0 mg 내지 500 mg, 또는 10 내지 200 mg의 투약량으로 적합하게 투여될 수도 있다. 소아 환자에 대하여, 투약량은 환자의 체중에 비례하여 조정될 수 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 선택적 MASP-2 억제 조성물의 적용은, 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애의 치료를 위해, 조성물의 일회 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중 특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시 투여)에 의해, 또는 제한된 순서의 투여로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 최선의 치료적 효과를 위해 의사에 의해 결정된 바와 같이 장기간 동안 주기적인 간격으로, 예를 들어, 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매달 또는 2달마다 투여될 수도 있다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 MASP-3 억제제를 포함하는 제1 조성물 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제를 포함하는 제2 조성물은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에 투여된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 MASP-3 억제제를 포함하는 제1 조성물 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제를 포함하는 제2 조성물은 동시에 (즉, 약 15분 이하 또는 그 미만, 예를 들어, 10, 5 또는 1분 중 어떤 것 이하의 시간 간격 내에) 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 MASP-3 억제제를 포함하는 제1 조성물 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제를 포함하는 제2 조성물은 순차적으로 투여된다 (즉, 제1 조성물은 제2 조성물의 투여 전 또는 후에 투여되며, 투여의 시간 간격은 15분 이상이다). 일부 구체예에서, 적어도 하나의 MASP-3 억제제를 포함하는 제1 조성물 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제를 포함하는 제2 조성물은 함께 투여된다 (즉, 제1 조성물의 투여 기간은 제2 조성물의 투여와 겹친다). 예를 들어, 일부 구체예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 적어도 1, 2, 3 또는 4주 이상의 기간 동안 투여된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 MASP-3 억제제 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제는 단위 투약 형태로 결합된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 MASP-3 억제제를 포함하는 제1 조성물 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제를 포함하는 제2 조성물은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 또는 베체트 병의 치료에 사용되는 키트에 함께 포장된다.
일부 구체예에서, PNH, 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증 (용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 등), 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 또는 베체트 병으로 고통받는 개체는 보체 단백질 C5의 분할을 억제하는 말단 보체 억제자 치료를 이전에 경험하였거나 현재 경험하고 있다. 일부 구체예에서, 방법은 개체에 MASP-3 및 선택적으로 MASP-2 억제자를 포함하는 본 발명의 조성물을 투여하는 단계 및 개체에 보체 단백질 C5의 분할을 억제하는 말단 보체 억제자를 더 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 인간화된 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 에쿨리쥬맙이다
XXI. 실시예
다음 실시예는 단지 본 발명을 실행하기 위해 현재 고려되는 최선의 방식을 도시하지만, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 모든 인용 문헌은 본원에서 참고로 명확히 포함된다.
실시예 1
이 실시예는 MASP-2 결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A 또는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B로 감염 후 네이세리아 메닝기티디스 유발된 치사율로부터 보호된다는 것을 입증한다.
방법:
MASP-2 넉아웃 마우스 (MASP-2 KO 마우스)를 본원에서 참고로 포함되는 제US 7,919,094호의 실시예 1에서 설명된 바와 같이 생성하였다. 10주령 MASP-2 KO 마우스 (n=10) 및 야생형 (WT) C57/BL6 마우스 (n=10)를 100 μl의 부피의 2.6 x 107 CFU의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491의 투약량으로 복강 내 (i.p.) 주사에 의해 접종하였다. 감염량을 철 덱스트란과 함께 400 mg/kg의 최종 농도로 마우스에 투여하였다. 감염 후 마우스의 생존을 72시간 동안 관찰하였다.
별개의 실험에서, 10주령 MASP-2 KO 마우스 (n=10) 및 WT C57/BL6 마우스 (n=10)를 100 μl의 부피의 6 x 106 CFU의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 투약량으로 복강 내 주사에 의해 접종하였다. 감염량을 철 덱스트란과 함께 400 mg/kg의 최종 농도로 마우스에 투여하였다. 감염 후 마우스의 생존을 72시간의 동안 관찰하였다. 질병 점수를 또한 감염 후 72시간 동안 WT 및 MASP-2 KO 마우스에 대하여 결정하였으며, 하기 표 4에서 설명된 질병 점수 파라미터에 기초하는데, 이것은 약간 변화된 Fransen et al. (2010)의 계획에 기초한다.
감염된 마우스의 임상적 징후와 관련된 질병 점수
징후 점수
정상 0
약간 헝클어진 털 1
헝클어진 털, 느리고 끈적거리는 눈 2
헝클어진 털, 기면증 및 닫힌 눈 3
자극 후 매우 아프고 움직임 없음 4
사망 5
혈액 샘플을 마우스로부터 감염 후 시간 간격으로 채취하였고 감염을 확인하고 혈청으로부터 박테리아의 제거의 비율을 결정하기 위해 네이세리아 메닝기티디스의 혈청 수준 (log cfu/mL)을 결정하기 위해 분석하였다. 결과:
도 8은 2.6 x 107 cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491의 감염량의 투여 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존율을 그래프로 도시하는 카플란-메이어 플롯이다. 도 8에서 나타난 바와 같이, MASP-2 KO 마우스의 100%가 감염 후 72시간 동안 생존하였다. 반대로, WT 마우스 중 80%만이 감염 후 24시간에 여전히 살아있었고 (p=0.012), WT 마우스 중 50%만이 감염 후 72시간에 여전히 살아있었다. 이 결과들은 MASP-2-결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491-유발되어 치사율로부터 보호된다는 것을 입증한다.
도 9는 2.6 x 107 cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491의 감염량의 투여 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존율을 그래프로 도시하는 카플란-메이어 플롯이다. 도 8에서 나타난 바와 같이, MASP-2 KO 마우스의 100%가 감염 후 72시간 동안 생존하였다. 반대로, WT 마우스 중 80%만이 감염 후 24시간에 여전히 살아있었고 (p=0.012), WT 마우스 중 50%만이 감염 후 72시간에 여전히 살아있었다. 이 결과들은 MASP-2-결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491-유발되어 치사율로부터 보호된다는 것을 입증한다.
도 9는 6 x 106 cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 감염량의 투여 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존율을 그래프로 도시하는 카플란-메이어 플롯이다. 도 9에서 나타난 바와 같이, MASP-2 KO 마우스 중 90%가 감염 후 72시간 동안 생존하였다. 반대로, WT 마우스의 20%만이 (p=0.0022) 감염 후 24시간에 여전히 살아있었다. 이 결과들은 MASP-2-결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58-유발된 치사율로부터 보호된다는 것을 입장한다.
도 10은 6 x 106 cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 복강 내 감염 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스로부터 채취된 혈액 샘플에서 다른 시점에 채취된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 log cfu/mL을 그래프로 도시한다 (두 군의 마우스에 대하여 다른 시점에 n=3). 결과는 평균 ± SEM로 표현된다. 도 10에서 나타난 바와 같이, WT 마우스에서, 혈액의 네이세리아 메닝기티디스의 수준은 감염 후 24시간에 약 6.0 log cfu/mL의 피크에 도달하였고 감염 후 36시간까지 약 4.0 log cfu/mL로 떨어졌다. 반대로, MASP-2 KO 마우스에서는, 네이세리아 메닝기티디스의 수준은 감염 후 12시간에 약 4.0 log cfu/mL의 피크에 도달하였고 감염 후 36시간까지 약 1.0 log cfu/mL로 떨어졌다 (부호 "*"는 p<0.05를 지시한다; 부호는 p=0.0043을 지시한다). 이 결과들은 MASP-2 KO 마우스를 WT 마우스와 같은 용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 감염시켰지만, MASP-2 KO 마우스는 WT와 비교하여 균혈증(bacteraemia)의 향상된 제거율을 갖는다는 것을 입증한다.
도 11은 6 x 106 cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 감염 후 3, 6, 12 및 24시간에 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 평균 질병 점수를 그래프로 도시한다. 도 11에서 나타난 바와 같이, MASP-2-결핍 마우스는 감염에 대하여 높은 저항성을 나타냈으며, 질병 점수는 WT 마우스와 비교하여, 감염 후 6시간 (부호 "*"는 p=0.0411을 지시한다), 12 시간 (부호 "**"는 p=0.0049를 지시한다) 및 24시간 (부호는 p=0.0049를 지시한다)에 훨씬 더 낮았다. 도 11의 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다.
요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-2-결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A 또는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B로 감염 후 네이세리아 메닝기티디스-유발된 치사율로부터 보호된다는 것을 입증한다.
실시예 2
이 실시예는 네이세리아 메닝기티디스로 감염 후 MASP-2 항체의 투여가 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 마우스의 생존율을 증가시킨다는 것을 입증한다.
배경/근거:
본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제7,919,094호의 실시예 24에서 설명된 바와 같이, 래트 MASP-2 단백질을 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 나타내기 위해 이용하였으며, 이것들로부터 Fab2 #11이 기능적 활성 항체로서 확인되었다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 이소타입을 생성하였다. 마우스 IgG2a 이소타입의 전장 MASP-2 항체를 약물동력학적 파라미터에 대하여 특성화하였다 (미국 특허 제7,919,094호의 실시예 38에서 설명된 바와 같음).
이 실시예에서, Fab2 #11로부터 유래된 마우스 MASP-2 전장 항체를 네이세리아 메닝기티디스 감염의 마우스 모델에서 분석하였다.
방법:
상기 설명된 바와 같이 생성된, Fab2 #11로부터 유래된 마우스 IgG2a 전장 MASP-2 항체 이소타입을 다음과 같이 네이세리아 메닝기티디스 감염의 마우스 모델에서 테스트하였다.
1. 감염 후 마우스-MASP-2 단클론성 항체 (MoAb)의 투여
9주령 C57/BL6 Charles River 마우스를 고용량의 (4 x 106 cfu)의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 복강 내 주사 후 3시간에 억제 마우스 MASP-2 항체 (1.0 mg/kg) (n=12) 또는 대조군 이소타입 항체 (n=10)로 치료하였다.
결과:
도 12는 4 x 106 cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 투여에 이어, 억제 MASP-2 항체 (1.0 mg/kg) 또는 대조군 이소타입 항체의 감염 후 3시간에 투여 이후 마우스의 퍼센트 생존율을 그래프로 도시하는 카플란-메이어 플롯이다. 도 12에서 나타난 바와 같이 MASP-2 항체로 치료된 마우스 중 90%는 감염 후 72시간 동안 생존하였다. 반대로, 이소타입 대조군 항체로 치료된 마우스 중 50%만이 감염 후 72시간 동안 생존하였다. 부호 "*"는, 두 개의 생존 곡선의 비교에 의해 결정된 바와 같이, p=0.0301을 지시한다.
이 결과들은 MASP-2 항체의 투여는 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 개체를 치료하고 이들의 생존율을 개선하는데 유효하다는 것을 입증한다.
본원에서 입증된 바와 같이, 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 개체의 치료시 MASP-2 항체의 사용은 감염 후 3시간 내에 투여될 때 효과적이고, 감염 후 24시간 내지 48시간 내에 효과적일 것으로 예상된다. 뇌척수막염 질환 (수막염균혈증(meningococcemia) 또는 수막염(meningitis))은 응급 상황이고, 뇌척수막염 질환이 의심되면 (즉, 네이세리아 메닝기티디스가 유병기생충(유병 기생충)으로 긍정적으로 확인되기 전에) 치료는 전형적으로 즉시 시작될 것이다.
실시예 1에서 입증된 MASP-2 KO 마우스의 결과를 고려해서, 네이세리아 메닝기티디스로의 감염 전에 MASP-2 항체의 투여는 또한 감염의 심각도를 방지하거나 개선하는데 효과적인 것으로 생각된다.
실시예 3
이 실시예는 인간 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해가 MASP-3-의존적이라는 것을 입증한다.
근거:
기능적 MBL의 혈청 수준이 감소된 환자는 재발성 박테리아 및 균류 감염에 대하여 증가된 민감성을 나타낸다 (Kilpatrick et al., Biochim Biophys Acta 1572:401-413 (2002)). 네이세리아 메닝기티디스는 MBL에 의해 인식된다는 것이 알려져 있고, 그것은 MBL-결핍 혈청은 네이세리아 메닝기티디스를 용해하지 않는다는 것을 나타냈다.
실시예 1 및 2에서 설명된 결과를 고려해서, 보체-결핍 및 대조군 인간 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스 감염을 치료하기 위한 MASP-2 항체의 투여의 효능을 결정하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 실험을 수행하였다. 실험을 보체 경로를 보존하기 위해 고농도의 혈청 (20%)에서 수행하였다.
방법:
1. 다양한 보체-결핍 인간 혈청 및 인간 MASP-2 항체로 치료된 인간 혈청에서 혈청 살균 활성
다음 보체-결핍 인간 혈청 및 대조군 인간 혈청을 이 실험에서 사용하였다:
테스트된 인간 혈청 샘플 (도 13에서 나타난 바와 같음)
샘플 혈청 타입
A 정상 인간 혈청 (NHS) + 인간 MASP-2 Ab
B NHS + 이소타입 대조군 Ab
C MBL -/- 인간 혈청
D NHS
E 열-불활성화된 (HI) NHS
인간 MASP-2에 대한 재조합 항체를 조합 Antibody Library로부터 분리하였으며 (Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. 296:51-86 (2000)), 항원으로서 재조합 인간 MASP-2A를 사용한다 (Chen, C.B. and Wallis, J. Biol. Chem. 276:25894-25902 (2001)). 인간 혈장에서 C4 및 C3의 렉틴 경로-매개된 활성화를 강하게 억제하는 항-인간 scFv 단편 (IC50-20 nM)을 확인하였고 전장 인간 IgG4 항체로 전환하였다. 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58을 표 5에서 나타난 다른 혈청과 함께, 각각 20%의 혈청 동도로, 억제 인간 MASP-2 항체 (100 μl 총량 중 3 μg)를 추가하거나 추가하지 않고 37℃에서 흔들면서 배양하였다. 샘플을 다른 시점, 0-, 30-, 60- 및 90-분 간격으로 채취하였으며, 그 다음 생균 계수법을 결정하였다. 열-불활성화된 인간 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다.
결과:
도 13은 표 5에서 나타난 인간 혈청 샘플에서 다른 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균 계수법의 log cfu/mL을 그래프로 도시한다. 표 6은 도 13에 대한 스튜던트 t 테스트(Student's t-test) 결과를 제공한다.
도 13에 대한 스튜던트 t 테스트 결과 (시점 60분)
평균 차 (Log) 유의성? P<0.05? P 값 요약
A 대 B -0.3678 예 ***(0.0002)
A 대 C -1.1053 예 ***(p<0.0001)
A 대 D -0.2111 예 **(0.0012)
C 대 D 1.9 예 ***(p<0.0001)
도 13 및 표 6에서 나타난 바와 같이, 인간 20% 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해는 인간 MASP-2 억제 항체의 추가에 의해 유의하게 향상되었다. 2. 다양한 보체-결핍 인간 혈청에서 혈청 살균 활성
다음 보체-결핍 인간 혈청 및 대조군 인간 혈청을 이 실험에서 사용하였다:
테스트된 인간 혈청 샘플 (도 14에서 나타난 바와 같음)
샘플 혈청 타입
A 정상 인간 혈청 (NHS)
B 열-불활성화된 NHS
C MBL -/-
D MASP-3-/- (MASP-1 +)
주: 샘플 D에서 MASP-3-/- (MASP-1 +) 혈청을 3MC 증후군에 걸린 개체로부터 채취하였으며, 이것은 중복된 카니발, 밍가렐리, 말푸에치 및 미헬스 증후군에 대하여 통합된 용어이다. 실시예 4에서 더 설명된 바와 같이, MASP-1/3 유전자의 엑손 12에서 돌연변이는 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인을 제대로 기능하지 않게 하지만, MASP-1은 아니다. 실시예 19에서 설명된 바와 같이, 프로-인자 D는 바람직하게 3MC 혈청에 존재하는 반면에, 활성화된 인자 D는 바람직하게 정상 인간 혈청에 존재한다. 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58을 다른 보체-결핍 인간 혈청과 함께, 각각 20%의 혈청 동도로, 37℃에서 흔들면서 배양하였다. 샘플을 다른 시점, 0-, 15-, 30-, 45-, 60-, 90- 및 120-분 간격으로 채취하였고, 배양하였으며, 그 다음 생균 계수법을 결정하였다. 열-불활성화된 인간 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다.
결과:
도 14는 표 7에서 나타난 인간 혈청 샘플에서 다른 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균 계수법의 log cfu/mL을 그래프로 도시한다. 도 14에서 나타난 바와 같이, WT (NHS) 혈청은 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 가장 높은 수준의 살균 활성을 갖는다. 반대로, MBL -/- 및 MASP-3-/- (이것은 MASP-1-충분하다) 인간 혈청은 어떤 살균 활성도 갖지 않는다. 이 결과들은 인간 20% (v/v) 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해는 MASP-3- 및 MBL-의존적이라는 것을 지시한다. 표 8은 도 14에 대한 스튜던트 t 테스트 결과를 제공한다.
도 14에 대한 스튜던트 t 테스트 결과
비교 시점
(분)		 평균 차 (Log) 유의성? P<0.05? P 값 요약
A 대 B 60 -0.8325 예 ***(p<0.0001)
A 대 B 90 -1.600 예 ***(p<0.0001)
A 대 C 60 -1.1489 예 ***(p<0.0001)
A 대 C 90 -1.822 예 ***(p<0.0001)
A 대 D 60 -1.323 예 ***(0.0005)
A 대 D 90 -2.185 예 ***(p<0.0001)
요약하면, 도 14 및 표 8에서 나타난 결과는 20% 인간 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해가 MASP-3- 및 MBL-의존적이라는 것을 입증한다. 3. MASP-2, MASP-1/3 또는 MBL A/C가 결핍된 20% (v/v) 마우스 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해
다음 보체-결핍 마우스 혈청 및 대조군 마우스 혈청을 이 실험에서 사용하였다:
테스트된 마우스 혈청 샘플 (도 15에서 나타난 바와 같음)
샘플 혈청 타입
A WT
B MASP-2 -/-
C MASP-1/3 -/-
D MBL A/C -/-
E WT 열-불활성화된 (HIS)
네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58을 다른 보체-결핍 마우스 혈청과 함께, 각각 20%의 혈청 농도로, 37℃에서 흔들면서 배양하였다. 샘플을 다음 시점, 0-, 15-, 30-, 60-, 90- 및 120-분 간격으로 채취하였고, 배양하였으며 그 다음 생균 계수법을 결정하였다. 열-불활성화된 인간 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다. 결과:
도 15는 표 9에서 나타난 마우스 혈청 샘플에서 다른 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균 계수법의 log cfu/mL을 그래프로 도시한다. 도 15에서 나타난 바와 같이, MASP-2 -/- 마우스 혈청은 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 WT 마우스 혈청보다 더 높은 수준의 살균 활성을 갖는다. 반대로, MASP-1/3 -/- 마우스 혈청은 어떤 살균 활성도 갖지 않는다. 부호 "**"는 p=0.0058을 지시한다. 부호 "***"는 p=0.001을 지시한다. 표 10은 도 15에 대한 스튜던트 t 테스트 결과를 제공한다.
도 15에 대한 스튜던트 t 테스트 결과
비교 시점 평균 차 (LOG) 유의성? (p<0.05)? P 값 요약
A 대 B 60분. 0.39 예 ** (0.0058)
A 대 B 90분. 0.6741 예 *** (0.001)
요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-2 -/- 혈청이 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 WT 혈청보다 더 높은 수준의 살균 활성을 갖고 20% 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해는 MASP-3- 및 MBL- 의존적이라는 것을 입증한다. 실시예 4
이 실시예는 실시예 1-3에서 설명된 바와 같이, MASP-2 KO 마우스에서 관찰된 네이세리아 메닝기티디스 감염에 대한 MASP-3-의존적 저항성의 메커니즘을 결정하기 위해 수행된 일련의 실험을 설명한다.
근거:
MASP-2 KO 마우스에서 관찰된 네이세리아 메닝기티디스 감염에 대한 MASP-3-의존적 저항성의 메커니즘을 결정하기 위해 (상기 실시예 1-3에서 설명된 바와 같음), 일련의 실험을 다음과 같이 수행하였다.
1. MASP-1/3-결핍 마우스는 렉틴 경로 기능적 활성 ("LEA-2"로도 불림)이 결핍되지 않는다
방법:
MASP-1/3-결핍 마우스가 렉틴 경로 기능적 활성 (LEA-2로도 불림)이 결핍되는지를 결정하기 위해, 검정을 수행하여 렉틴 활성화 경로-특이적 검정 조건 (1% 혈장) 하에서 테스트된 다양한 보체-결핍 마우스 계통의 혈장에서 C3 컨버타제 활성의 동역학을 측정하였으며, Schwaeble W. et al, PNAS vol 108(18):7523-7528 (2011)에서 설명된 바와 같고, 본원에서 참고로 포함된다.
WT, C4-/-, MASP-1/3-/-; 인자 B-/-, 및 MASP-2-/-마우스의 혈장을 다음과 같이 테스트하였다.
C3 활성화를 측정하기 위해, 미세역가 플레이트를 코팅 버퍼 (15mM Na2CO3, 35mM NaHC03) 중의 만난 (1 μg/웰), 치모산 (1 μg/웰), 또는, 코팅 버퍼 중의 1% 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 코팅하고 0.05% Tween 20 및 5mM Ca++와 함께, TBS (1OmM Tris, 140mM NaCl, pH 7.4) 중의 양 항-HAS 혈청 (2 μg/mL)을 추가함으로써 제자리에서 발생하는 면역 복합체로 코팅하였다. 플레이트를 TBS 중의 0.1% HSA로 차단하였고 TBS/Tween20/Ca++로 세 번 세척하였다. 혈장 샘플을 4mM 바비탈, 145mM NaCl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2, pH 7.4에서 희석하였으며, 플레이트에 추가하였고 37℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. 세척 후, 결합된 C3b를 토끼 항-인간 C3c (Dako)에 이어, 알칼린 포스파타제-컨쥬게이션된(conjugated) 염소 항-토끼 IgG 및 p-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 검출하였다.
결과:
렉틴 경로-특이적 조건 하에서 C3 활성화의 동역학 (1%> 혈청이 들어있는 만난-코팅된 플레이트에서 C3b 침착에 의해 측정됨)은 도 16에서 나타난다. C3 분할은 MASP-2-/- 혈장에서는 보이지 않는다. 인자 B-/- (인자 B -/-) 혈장은 WT 혈장의 절반의 속도로 C3을 분할하였으며, 증폭 루프의 손실 때문일 가능성이 크다. C3의 C3b로의 렉틴 경로-의존적 전환의 유의한 지연은 C4-/- (T1/2=33분)뿐만 아니라 MASP-1/3-/- 결핍 플라스마 (T1/2=49분)에서 보였다. MASP-1/3 -/- 혈장에서 C3 활성화의 이 지연은 MASP-3-의존적인 대신에 MASP-1-의존적인 것으로 나타났다 (Takahashi M. et al, J Immunol 180:6132-6138 (2008)을 참고하면 된다). 이 결과들은 MASP-1/3-결핍 마우스는 렉틴 경로 기능적 활성 ("LEA-2"로도 불림)이 결핍되지 않는다는 것을 입증한다.
2. 대체 경로 활성화에 대한 세습적 MASP-3 결핍의 효과
근거:
대체 경로 활성화에 대한 세습적 MASP-3 결핍의 효과를 MASP-3의 세린 프로테아제를 암호화하는 엑손의 프레임-시프트(frame-shift) 돌연변이에 의해 유발된 3MC 증후군에 걸린 MASP-3-결핍 환자의 혈청을 테스트함으로써 결정하였다. 3MC 증후군은 중복된 카니발, 밍가렐리, 말푸에치 및 미헬스 증후군에 대하여 통합된 용어이다. 이 희귀한 상염색체 열성 질환은 특유의 안면 기형(facial dysmorphism), 구순 구개열 및/또는 파열, 두개 유합증(craniosynostosis), 학습 장애 및 생식기, 사지 및 방광 이상을 포함하는, 광범위한 발달 특성을 나타낸다. 이 환자들은 구개 파열(cleft palate), 구순 구개열(cleft lip), 두개골 기형(cranial malformation) 및 정신 지체(mental retardation)를 포함하는, 심각한 발달 장애를 나타낸다. Rooryck et al, Nature Genetics 43: 197-203 (2011)은 3MC 증후군에 걸린 11 가족을 연구하였고 두 개의 돌연변이된 유전자, COLEC11 및 MASP-1을 확인하였다. MASP-1 유전자의 돌연변이는 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손을 제대로 기능하지 않게 하지만, MASP-1의 세린 프로테아제를 암호화하는 엑손은 아니다. 그러므로, MASP-3의 세린 프로테아제를 암호화하는 엑손의 돌연변이를 갖는 3MC 환자는 MASP-3이 결핍되지만 MASP-1은 충분하다.
방법:
MASP-3-결핍 혈청을 3MC 환자, 3MC 환자의 부모 (둘 다 MASP-3 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손을 제대로 기능하지 않게 하는 돌연변이를 함유하는 대립유전자에 대하여 이형 접합성), 뿐만 아니라 C4-결핍 환자 (인간 C4 유전자 둘 다가 결핍됨) 및 MBL-결핍 개체로부터 얻었다. 대체 경로 검정을 전통적 AP-특이적 조건 (BBS/Mg++/EGTA, Ca++ 없음, 여기에서, BBS = 수크로스를 함유하는 바비탈 완충된 식염수) 하에서, 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 0.5 내지 25%의 범위에 있는 혈청 농도에서 수행하였고, Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol 1 1:291-295 (1981)에서 설명된 바와 같으며, C3b 침착을 시간의 흐름에 따라 측정하였다.
결과:
도 17은 MASP-3-결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 개체로부터 얻은 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 대체 경로-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 도 17에서 나타난 바와 같이, MASP-3-결핍 환자 혈청은 높은 혈청 농도에서 (25%, 12.5%, 6.25% 혈청 농도)에서 잔여 대체 경로 (AP) 활성을 갖지만, 훨씬 더 높은 AP50 (즉, 최대 C3 침착의 50%를 달성하기 위해 필요한 혈청의 9.8%>)을 갖는다.
도 18은 MASP-3-결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 인간 개체로부터 얻은 10% 인간 혈청 샘플에서 시간의 함수로서 "전통적" 대체 경로-특이적 (AP-특이적) 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 대체 경로-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 도시한다.
하기 표 11은 도 17에서 나타난 AP50 결과 및 도 18에서 나타난 C3b 침착에 대한 하프 타임(half-time)을 요약한다.
도 17 및 18에서 나타난 결과의 요약
혈청 타입 AP 50 (%) T 1/2 (분)
MASP-3-결핍
(3MC 환자)		 9.8 37.4
3MC 환자 (이형 접합체)의 친모 4.3 17.2
3MC 환자 (이형 접합체)의 친부 4.3 20.9
C4-결핍 4.0 11.6
MBL-결핍 4.8 11.0
주: BBS/Mg++/EGTA 버퍼, 이 버퍼에서 Ca++의 부재로 인해 렉틴 경로-매개된 효과가 결핍된다. 요약하면, 이 검정들의 조건 하에서, 대체 경로는 3MC 환자에서 면역 반응이 크게 발휘되지 않는다.
3. MASP-2 또는 MASP-1/3이 결핍된 마우스 혈청에서 만난, 치모산 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39에서 C3b 침착의 측정
방법:
C3b 침착을 MASP-2-/-, MASP-1/3-/- 및 WT 마우스로부터 얻은 0% 내지 20%의 범위에 있는 마우스 혈청 농도를 사용하여 만난, 치모산 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39-코팅된 미세역가 플레이트에서 측정하였다. C3b 침착 검정을 "전통적" 대체 경로-특이적 조건 (즉 Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++), 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (즉, BBS/Mg++/Ca++) 하에서 수행하였다.
결과:
도 19A는 전통적 대체 경로-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++), 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스로부터 얻은 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 만난-코팅된 미세역가 플레이트에 대한 C3b 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 도 19B는 전통적 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++), 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스의 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에 대한 C3b 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 도 19C는 전통적 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++), 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스의 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39-코팅된 미세역가 플레이트에 대한 C3b 침착의 수준을 그래프로 도시한다.
도 20A는 전통적 AP-특이적 조건 (즉 Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서, 0%에서 1.25%까지의 범위의 혈청 농도를 사용하여, 만난-코팅된 미세역가 플레이트에서 수행된 고도로 희석된 혈청에서 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시한다. 도 20B는 전통적 AP-특이적 조건 (즉 Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/EGTA/Mg++/Ca++) 하에서, 0%에서 1.25%까지의 범위의 혈청 농도를 사용하여, 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시한다. 도 20C는 전통적 AP-특이적 조건 (즉 Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/EGTA/Mg++/Ca++) 하에서, 0%에서 1.25%까지의 범위의 혈청 농도를 사용하여, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39-코팅된 미세역가 플레이트에서 수행된 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시한다.
도 20A-C에서 나타난 바와 같이, C3b 침착 검정을 또한 전통적 대체 경로-특이적 조건 (즉 Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다를 기능하게 하는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서, 만난-코팅된 플레이트 (도 20A); 치모산-코팅된 플레이트 (도 20B) 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39-코팅된 플레이트 (도 20C)에서 0% 내지 1.25% 혈청까지의 범위에 있는 더 높은 희석을 사용하여 수행하였다. 대체 경로는 더 높은 혈청 희석 하에서 감소하고, 그래서 Ca++의 존재시 MASP-1/3-결핍 혈청에서 관찰된 활성은 MASP-2-매개된 LP 활성이고, Ca++의 존재시 MASP-2-결핍 혈청의 활성은 AP의 MASP-1/3-매개된 잔여 활성화이다.
논의:
이 실시예에서 설명된 결과는 MASP-2 억제자 (또는 MASP-2 KO)가 MASP-3-구동된 대체 경로 활성화를 촉진함으로써 네이세리아 메닝기티디스 감염으로부터 유의한 보호를 제공한다는 것을 입증한다. 마우스 혈청 용균 검정 및 인간 혈청 용균 검정의 결과는 네이세리아 메닝기티디스에 대한 혈청 살균 활성을 관찰함으로써, 네이세리아 메닝기티디스에 대한 살균 활성이 MBL-결핍 (마우스 MBL A 및 MBL C 이중-결핍 및 인간 MBL-결핍 혈청)에서 없다는 것을 더 나타낸다.
도 1은 본원에서 제공된 결과에 기초하여 렉틴 경로 및 대체 경로의 새로운 이해를 도시한다. 도 1은 옵소닌화 및 용해 둘 다에서 LEA-2의 역할을 묘사한다. MASP-2는 다중 렉틴-의존적 설정에서 생리학적으로 "다운스트림" C3b 침착 (및 그에 따른 옵소닌화)의 개시자인 한편 (도 20A, 20B, 20C), 그것은 또한 혈청-민감성 박테리아의 용해에서 역할을 한다. 도 1에서 도시된 바와 같이, 네이세리아 메닝기티디스와 같은 혈청-민감성 병원체에 대한 MASP-2-결핍 또는 MASP-2-고갈된 혈청/혈장의 증가된 살균 활성의 원인이 되는 제안된 분자적 메커니즘은 박테리아의 용해를 위해, MASP-1 및 MASP-3과 관련된 렉틴 경로 인식 복합체가 박테리아 표면에서 서로 가까이에 결합해야 하고, 이로 인해 MASP-1이 MASP-3을 분할하는 것을 허용한다는 것이다. MASP-1 및 MASP-2와 반대로, MASP-3는 자기-활성화 효소가 아니지만, 많은 예에서, 그것의 효소에 의한 활성 형태로 전환되기 위해 MASP-1에 의한 활성화/분할이 필요하다.
도 1에서 더 나타난 바와 같이, 그 다음 활성화된 MASP-3은 병원체 표면에서 C3b-결합된 인자 B를 분할하여 각각 효소에 의한 활성 대체 경로 C3 및 C5 컨버타제 C3bBb 및 C3bBb(C3b)n의 형성에 의해 대체 경로 활성화 캐스케이드를 시작할 수 있다. MASP-2-함유 렉틴-경로 활성화 복합체는 MASP-3의 활성화에 관여하지 않고, MASP-2의 부재시 또는 이것의 고갈 후에, 모든-렉틴 경로 활성화 복합체에 MASP-1 또는 MASP-3이 로딩될 것이다. 그러므로, MASP-2의 부재시, 미생물의 표면에서 미생물의 표면 MASP-1 및 MASP-3-함유 렉틴-경로 활성화 복합체는 서로 가까이에 있을 것이며, 더 많은 MASP-3이 활성화되고 이로 인해 미생물의 표면에서 대체 경로 C3 및 C5 컨버타제 C3bBb 및 C3bBb(C3b)n을 형성하기 위한 C3b-결합된 인자 B의 더 높은 속도의 MASP-3-매개된 분할로 이어질 가능성이 현저하게 증가한다. 이것은 C6과 결합된 표면-결합된 C5b, C7과 결합된 C5bC6, C8과 결합된 C5bC6C7 및 C5bC6C7C8로 구성된 막 공격 복합체를 형성하는 말단 활성화 캐스케이드 C5b-C9의 활성화로 이어지고, 박테리아 표면 구조에 삽입하여 박테리아 벽에 구멍을 형성하는 C9의 폴리머화로 이어지며, 이것은 보체-표적화된 박테리아의 삼투성 살해로 이어질 것이다.
이 새로운 개념의 핵심은 본원에서 제공된 데이터가 렉틴-경로 활성화 복합체가 도 1에서 도시된 바와 같이, 다음 두 개의 별개의 활성화 루트를 구동한다는 것을 분명하게 나타낸다는 것이다:
실시예 5
이 실시예는 발작성 야간혈색뇨증 (PNH)의 마우스 모델로부터 얻은 혈액 샘플의 적혈구 세포의 용해에 대한 MASP-2 결핍 및/또는 MASP-3 결핍의 억제 효과를 입증한다.
배경/근거:
마르키아파바-미첼리 증후군으로도 불리는 발작성 야간혈색뇨증 (PNH)은 후천적인, 잠재적으로 생명을 위협하는 혈액 질환이며, 보체-유발된 혈관 내 용혈성 빈혈증을 특징으로 한다. PNH의 특징은 다음의 혈색소뇨증 및 빈혈증과 함께, PNH 적혈구에서 보체 조절기 CD55 및 CD59의 부재로 인한 보체의 대체 경로의 제어되지 않는 활성화의 결과인 만성 보체-매개된 혈관 내 용혈이다. Lindorfer, M.A., et al., Blood 775(11) (2010), Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011). PNH의 빈혈증은 혈류에서 적혈구 세포의 파괴로 인한 것이다. PNH의 증상은 소변에 헤모글로빈의 등장으로 인한 붉은 소변, 요통, 피로, 숨가쁨 및 혈전증을 포함한다. PNH는 그 자체에서 발달할 수도 있으며, "1차 PNH"로 불리거나 또는 무형성 빈혈과 같은 다른 골수 장애의 맥락에서 발달할 수도 있으며, "2차 PNH"로 불린다. PNH에 대한 치료는 빈혈증에 대하여 혈액 수혈, 혈전증에 대하여 항응고 및 단클론성 항체 에쿨리쥬맙 (Soliris®)을 포함하며, 이것은 보체 시스템을 억제함으로써 면역 파괴로부터 혈액 세포를 보호한다 (Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. J50(6):552-9 (2004)). 에쿨리쥬맙 (Soliris®)은 보체 성분 C5를 표적화하는 인간화된 단클론성 항체이며, C5 컨버타제에 의한 그것의 분할을 차단하고, 이로 인해 C5a의 생산 및 MAC의 조립을 방지한다. PNH 환자의 에쿨리쥬맙로의 치료는 혈관 내 용혈의 감소를 일으켰는데, 락테이트 데히드로게나제 (LDH)에 의해 측정된 바와 같으며, 환자의 약 절반에서 헤모글로빈 안정화 및 수혈 독립성으로 이어진다 (Hillmen P, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 11(6) (2011)). 에쿨리쥬맙으로 치료를 경험하는 거의 모든 환자는 정상 또는 거의 정상 LDH 수준을 달성하는 한편 (혈관 내 용혈의 제어로 인해), 환자 중 약 3분의 1만이 약 11gr/dL의 헤모글로빈 값에 도달하며, 에쿨리쥬맙에 대하여 나머지 환자는 거의 동일한 비율로, 중간 내지 극심한 (즉, 수혈-의존적) 빈혈증을 계속해서 나타낸다 (Risitano A.M. et al, Blood 113:4094-100 (2009)). Risitano et al, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011)에서 설명된 바와 같이, 에쿨리쥬맙에 대하여 PNH 환자는 그들의 PNH 적혈구의 상당한 부분에 결합된 C3 단편을 함유한다는 것이 입증되었으며 (하지만 치료되지 않은 환자는 그렇지 않다), 막-결합된 C3 단편이 PNH 적혈구에서 옵소닌으로 작용하며, 특이적 C3 수용체를 통한 세망내피계 세포에서 그것들의 포착(entrapment) 및 다음의 혈관 외 용혈을 일으킨다는 결론으로 이어진다.
이 실시예는 PNH의 마우스 모델로부터 얻은 혈액 샘플의 적혈구 세포의 용해에 대한 MASP-2- 및 MASP-3-결핍 혈청의 효과를 평가하는 방법을 설명하고
PNH로 고통받는 개체를 치료하기 위한 MASP-2 억제 및/또는 MASP-3 억제의 효능을 입증하며, 또한 에쿨리쥬맙과 같은 C5 억제자 치료를 경험하는 PNH 개체에서 C3 단편-매개된 혈관 외 용혈의 효과를 개선하기 위해 MASP-2의 억제자 및/또는 MASP-3의 억제자 (이중 또는 이중 특이적 MASP-2/MASP-3 억제자 등)의 사용을 지지한다.
방법:
PNH 동물 모델:
혈액 샘플을 Crry 및 C3 (Crry/C3-/-)가 결핍된 유전자-표적화된 마우스 및 CD55/CD59-결핍 마우스로부터 얻었다. 이 마우스들은 그것들의 적혈구에서 각각의 표면 보체 조절기가 없고, 그러므로, 이 적혈구들은 PNH 인간 적혈구이기 때문에 자발적 보체 자가용해에 민감하다.
이 적혈구들을 더 민감하게 만들기 위해, 이 세포들을 만난으로 코팅하거나 하지 않고 사용하였고 그 다음 용혈에 대하여 WT C56/BL6 혈장, MBL 눌 혈장, MASP-2 -/- 혈장, MASP-1/3 -/- 혈장, 인간 NHS, 인간 MBL -/- 혈장, 및 인간 MASP-2 항체로 치료된 NHS에서 테스트하였다.
1. MASP-2-결핍/고갈된 혈청 및 대조군에서 Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 쥐 적혈구의 용혈 검정
제1 일. 쥐 RBC의 조제물 (± 만난 코팅).
포함된 재료: 신선한 마우스 혈액, BBS/Mg++/Ca++ (4.4mM 바비투르산, 1.8mM 바비톤 나트륨, 145mM NaCl, pH 7.4, 5mM Mg++, 5mM Ca++), 염화 크롬, CrCl3 6H20 (BBS/Mg++/Ca++ 중 0.5mg/mL) 및 만난, BBS/Mg++/Ca++ 중 100 μg/mL.
전체 혈액 (2mL)을 냉장한 원심분리기에서 4℃에서 2000xg로 1-2분 동안 스핀 다운 (spin down)하였다. 혈장 및 연층(buffy coat)을 빨아냈다. 그 다음 샘플을 RBC 펠릿을 2mL 아주 차가운 BBS/젤라틴/Mg++/Ca++에서 재현탁하고 원심분리 단계를 반복함으로써 세 번 세척하였다. 세 번째 세척 후, 펠릿을 4mL BBS/Mg++/Ca++에서 재현탁하였다. RBC의 2mL 앨리쿼트를 코팅되지 않은 대조군으로서 확보하였다. 남아있는 2mL에, 2mL CrCl3 및 2mL 만난을 추가하였고 샘플을 부드럽게 섞으면서 RT에서 5분 동안 배양하였다. 반응을 7.5mL BBS/젤라틴/Mg++/Ca++를 추가함으로써 종결하였다. 샘플을 상기와 같이 스핀 다운하였고, 2mL BBS/젤라틴/Mg++/Ca++에서 재현탁하였고 상기와 같이 추가로 2번 세척하였고, 그 다음 4℃에서 저장하였다.
제2 일. 용혈 검정
재료는 BBS/젤라틴/Mg++/Ca++ (상기와 같음), 테스트 혈청, 96-웰 바닥이 둥근 및 바닥이 평평한 플레이트 및 410-414 nm에서 96-웰 플레이트를 판독하는 분광광도계를 포함하였다.
RBC의 농도를 처음에 결정하였고 세포를 109/mL로 조정하였고, 이 농도로 저장하였다. 사용 전, 세포를 검정 버퍼에서 108/mL로 희석하였고, 그 다음 웰 당 100 ul을 사용하였다. 용혈을 410-414 nm에서 측정하였다 (541 nm보다 더 높은 민감도 허용). 테스트 혈청의 희석액을 아주 차가운 BS/젤라틴/Mg++Ca++에서 제조하였다. 각 혈청 희석액의 100 μl를 바닥이 둥근 플레이트로 피펫팅하였다 (pipetted). 대략 100 μl의 희석된 RBC 조제물을 추가하였고 (즉, 108/mL), 37℃에서 약 1시간 동안 배양하였고, 용해를 관찰하였다. (플레이트를 이 시점에 사진 찍을 수도 있다). 그 다음 플레이트를 최대 속도로 5분 동안 스핀 다운하였다. 유체 단계 중 100 μl를 빨아냈고, 바닥이 평평한 플레이트로 옮겼고, OD를 410-414 nm에서 기록하였다. RBC 펠릿을 보유하였다 (이것들은 이후에 반대의 결과를 얻기 위해 물로 용해될 수 있다).
실험 #1
신선한 혈액을 CD55/CD59 이중-결핍 마우스로부터 얻었고 Crry/C3 이중-결핍 마우스의 혈액 및 적혈구를 상기 프로토콜에서 상세히 설명된 바와 같이 제조하였다. 세포를 분열시키고 세포의 절반을 만난으로 코팅하였고 다른 절반을 미처리상태로 두었으며, 최종 농도를 108/mL로 조정하였고, 이것들 중 100 μl를 용혈 검정에서 사용하였으며, 이것을 상기 설명된 바와 같이 수행하였다.
실험 #1의 결과: 렉틴 경로는 PNH 동물 모델에서 적혈구 용해에 수반된다.
처음 실험에서, 비-코팅된 WT 마우스 적혈구가 어떤 마우스 혈청에서도 용해되지 않았다는 것이 결정되었다. 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 WT 마우스 혈청에서 느리게 용해되었지만 (37도에서 3시간 이상), 그것들은 MBL 눌 혈청에서는 용해되지 않는다는 것이 더 결정되었다 (데이터 미도시).
만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 인간 혈청에서 신속하게 용해되었지만 열-불활성화된 NHS에서는 아니라는 것이 결정되었다. 중요하게는, 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구를 1/640 이하로 희석된 NHS (즉, 모두 용해된 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 및 1/640 희석액)에서 용해시켰다 (데이터 미도시). 이 희석액에서, 대체 경로는 작동하지 않는다 (AP 기능적 활성은 8% 혈청 농도 미만으로 유의하게 감소되었다).
실험 #1의 결론
만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 MBL이 있는 고도로 희석된 인간 혈청에서 매우 잘 용해되지만 MBL이 없이는 그렇지 않다. 테스트된 모든 혈청 농도에서 효율적인 용해는 대체 경로가 이 용해에 수반되지 않거나 이에 필요하지 않다는 것을 나타낸다. 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구를 용해할 수 없는 MBL-결핍 마우스 혈청 및 인간 혈청의 능력은 고전적 경로가 또한 관찰된 용해와 관련되지 않는다는 것을 지시한다. 렉틴 경로 인식 분자가 필요하기 때문에 (즉, MBL), 이 용해는 렉틴 경로에 의해 매개된다.
실험 #2
신선한 혈액을 Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 마우스로부터 얻었고 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구를 다음 인간 혈청의 존재시 상기 설명된 바와 같이 용혈 검정에서 분석하였다: MASP-3-/-; MBL 눌; WT; 인간 MASP-2 항체가 사전 처리된 NHS; 및 대조군으로서 열-불활성화된 NHS.
실험 #2의 결과: MASP-2 억제자 및 MASP-3 결핍은 PNH 동물 모델에서 적혈구 용해를 방지한다
만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구와 함께, NHS, 인간 MBL-/-혈청, 인간 MASP-3-결핍 혈청 (3MC 환자의 것), 및 MASP-2 mAb가 사전 처리된 NHS, 및 대조군으로서 열-불활성화된 NHS를 1/640 이하 (즉, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 및 1/640)로 희석된 희석액에서 배양하였다.
ELISA 미세역가 플레이트를 스핀 다운시켜서 비-용해된 적혈구를 둥근-웰 플레이트의 바닥에 수거하였다. 각 웰의 상층액을 수거하였고 용해된 적혈구부터 방출된 헤모글로빈의 양을 ELISA 측정기에서 OD415 nm을 판독함으로써 측정하였다.
MASP-3-/- 혈청이 만난-코팅된 마우스 적혈구를 전혀 용해시키지 않는다는 것을 관찰하였다. 대조군 열-불활성화된 NHS (음성 대조군)에서는, 예상된 바와 같이, 용해가 관찰되지 않았다. MBL-/- 인간 혈청은 1/8 및 1/16 희석액에서 만난-코팅된 마우스 적혈구를 용해시켰다. MASP-2-항체-사전 처리된 NHS는 1/8 및 1/16 희석액에서 만난-코팅된 마우스 적혈구를 용해시키는 한편 WT 인간 혈청은 1/32 이하의 희석액으로 만난-코팅된 마우스 적혈구를 용해시켰다.
도 21은 MASP-3-/-의 혈청, 열-불활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, MASP-2 항체가 사전 처리된 NHS, 및 NHS 대조군의 혈청 희석의 범위에 걸쳐 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (용해된 마우스 적혈구 (Crry/C3-/-)의 광도측정법에 의해 측정된 상층액으로의 헤모글로빈 방출에 의해 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시한다.
도 22는 MASP-3-/-의 혈청, 열-불활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, MASP-2 항체가 사전 처리된 NHS, 및 NHS 대조군의 혈청의 혈청 농도에 걸쳐 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 마우스 적혈구 (Crry/C3-/-)의 상층액으로의 헤모글로빈 방출로 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시한다.
도 21 및 22에서 나타난 결과로부터, MASP-3의 억제는 자가유래 보체 활성화로부터의 결핍 보호 기능이 있는 감작 적혈구의 어떤 보체-매개된 용해도 방지한다는 것이 입증되었다. MASP-2 항체로의 MASP-2 억제는 CH50을 크게 이동시켰고 어느 정도는 보호적이지만, MASP-3 억제가 더 효과적이었다.
실험 #3
Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 마우스의 신선한 혈액으로부터 얻은 비-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구를 다음 혈청의 존재시 상기 설명된 바와 같이 용혈 검정으로 분석하였다: MASP-3-/-; MBL-/-; WT; 인간 MASP-2 항체가 사전 처리된 NHS, 및 대조군으로서 열-불활성화된 NHS.
결과:
도 23은 3MC (MASP-3-/-) 환자의 인간 혈청, 열 불활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, 항체가 사전 처리된 NHS, 및 NHS 대조군에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 비-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 WT 마우스 적혈구의 상층액으로의 헤모글로빈 방출에 의해 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시한다. 도 23에서 나타나고 표 12에서 요약된 바와 같이, MASP-3의 억제는 비-감작 WT 마우스 적혈구의 보체-매개된 용해를 억제한다는 것이 입증된다.
도 24는 열-불활성화된 (HI) NHS의 인간 혈청, MBL-/-, 항체가 사전 처리된 NHS, 및 NHS 대조군에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 인간 혈청에 의한 비-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 마우스 적혈구 (CD55/59 -/-)의 상층액으로의 헤모글로빈 방출에 의해 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시한다. 도 24에서 나타나고 표 12에서 요약된 바와 같이, MASP-2의 억제는 제한된 정도로 보호적이라는 것이 입증된다.
혈청 농도로서 표현된 CH50 값
혈청 WT CD55/59 -/-
3MC 환자 용해되지 않음 용해되지 않음
열-불활성화된 NHS 용해되지 않음 용해되지 않음
MBL AO/XX 제공자
(MBL 결핍)		 7.2% 2.1%
NHS + MASP-2 항체 5.4% 1.5%
NHS 3.1% 0.73%
주: "CH50"은 보체-매개된 용혈이 50%에 도달하는 지점이다. 요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-3의 억제는 자가유래 보체 활성화로부터 결핍 보호 기능이 있는 감작 및 비-감작 적혈구의 어떤 보체 용해도 방지한다는 것이 입증되었다. MASP-2 억제는 또한 어느 정도로는 보호적이다. 그러므로, MASP-2 및 MASP-3 억제자 단독 또는 조합 (즉, 동시 투여됨, 순차적으로 투여됨) 또는 MASP-2/MASP-3 이중 특이적 또는 이중 억제자는 PNH로 고통받는 개체를 치료하는데 사용될 수도 있고, 또한 에쿨리쥬맙 (Soliris®)과 같은 C5 억제자 치료를 경험하는 PNH 환자에서 혈관 외 용혈을 개선하는데 (즉, 이것의 심각도를 억제, 방지 또는 감소시키는데) 사용될 수도 있다.
실시예 6
이 실시예는 WT 또는 MASP-1/3-/- 마우스 혈청의 존재시 용해에 대하여 만난-코팅된 토끼 적혈구를 테스트하는 용혈 검정을 설명한다.
방법:
1. 마우스 MASP-1/3-결핍 혈청 및 WT 대조군 혈청에서 토끼 RBC (만난 코팅됨)의 용혈 검정
제1 일. 토끼 RBC의 제조.
포함된 재료: 신선한 토끼 혈액, BBS/Mg++/Ca++ (4.4mM 바비투르산, 1.8mM 바비톤 나트륨, 145mM NaCl, pH 7.4, 5mM Mg++, 5mM Ca++), 0.1% 젤라틴이 들어있는 BBS/Mg++/Ca++, 버퍼에 함유된 염화 크롬; 즉, CrCl3, 6H20 (BBS/Mg++/Ca++ 중 0.5 mg/mL) 및 만난, BBS/Mg++/Ca++ 중 100 μg/mL.
토끼 전체 혈액 (2mL)을 두 개의 1.5mL 에펜도르프 튜브로 분리하였고 4℃의 냉장한 에펜도르프 원심분리기에서 3분 동안 8000 rpm (대략 5.9 rcf)으로 원심분리하였다. RBC 펠릿을 아주 차가운 BBS/Mg++/Ca++에서 재현탁 후 세 번 세척하였다. 세 번째 세척 후, 펠릿을 4mL BBS/Mg++/Ca++에서 재현탁하였다. 이 앨리쿼트 중 2mL 코팅되지 않은 대조군으로 사용하기 위해 15mL 팔콘 튜브에 추가하였다. RBC 앨리쿼트의 남아있는 2mL을 CrCl3 버퍼 2mL에서 희석하였고, 2mL의 만난 용액을 추가하였고 현탁액을 상온에서 5분 동안 부드럽게 섞으면서 배양하였다. 반응을 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++의 7.5mL을 혼합물에 추가함으로써 종결하였다. 적혈구를 펠릿화하였고 RBC를 상기 설명된 바와 같이 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++로 두 번 세척하였다. RBC 현탁액을 4℃에서 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++에 저장하였다.
2. 100 μl의 현탁된 RBC를 1.4mL 물로 희석하였고 8000 rpm으로 (대략 5.9 rcf)로 3분 동안 스핀 다운하였고 상층액의 OD를 541 nm에서 0.7로 조정하였다 (541 nm에서 0.7의 OD는 대략 109 적혈구/mL에 해당함).
3. 재현탁된 RBC를 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++로 108/mL의 농도로 희석하였다.
4. 테스트 혈청의 희석액을 아주 차가운 BBS/젤라틴/Mg++/Ca++에서 제조하였고 각 혈청 희석액 중 100 μl을 원형 바닥 플레이트의 해당 웰로 피펫팅하였다. 대략 희석된 RBC의 100 μl (108/mL)를 각 웰에 추가하였다. 완전한 용해에 대한 대조군으로서, 정제된 물 (100 μl)을 희석된 RBC (100 μl)와 혼합하여 100% 용해를 유발하는 한편, 혈청 (100 μl)이 없는 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++을 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
5. 원형 바닥 플레이트를 3250 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 각 웰의 상층액 (100 μl)을 평면 바닥 플레이트의 해당 웰로 옮겼고 OD를 ELISA 판독기에서 415-490 nm에서 측정하였다. 결과를 415 nm의 OD와 490 nm의 그것의 비율로서 보고한다.
결과:
도 25 MASP-1/3-/- 및 WT 대조군의 혈청에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 마우스 혈청에 의한 만난-코팅된 토끼 적혈구의 용혈 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 토끼 적혈구의 상층액으로의 헤모글로빈 방출로 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시한다. 도 25에서 나타난 바와 같이, MASP-3의 억제는 만난-코팅된 WT 토끼 적혈구의 보체-매개된 용해를 방지한다는 것이 입증된다. 이 결과들은 실시예 5에서 설명된 바와 같이. PNH의 하나 이상의 양태의 치료에 대한 MASP-3 억제자의 사용을 더 지지한다.
실시예 7
이 실시예는 대체 경로가 인자 D-결핍 혈청 Ca++의 존재시 활성화된다는 것을 입증한다.
실험 #1: 대체 경로 특이적 조건 하에 C3b 침착 검정
방법:
치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 C3b 침착 검정을 대체 경로-특이적 조건 (BBS/EGTA/Mg++, Ca++ 없음) 하에서 다음 마우스 혈청의 점점 증가하는 희석액을 사용하여 수행하였다: 인자 D-/-; MASP- -/-; 및 WT.
결과:
도 26은 대체 경로 특이적 조건 하에서 수행된 C3 침착 검정에서 인자 D-/-, MASP-2 -/-; 및 WT 마우스 혈청의 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 C3b 침착 (OD 405 nm)의 수준을 그래프로 도시한다. 도 26에서 나타난 바와 같이, 이 조건들 하에서, 인자 D -/- 마우스 혈청은 C3을 전혀 활성화시키지 않고 대체 경로는 작동하지 않는다. MASP-2-/- 혈청은 WT 혈청과 유사한 속도로 대체 경로 활성화를 나타낸다. 이 결과들은, Ca++의 부재시, 인자 D가 C3b 침착에 필요하다는 것을 확인한다. 이것은 MASP-3은 MASP-1, MASP-3 활성화 효소, 및 MASP-3의 그것들의 탄수화물 인식 구성요소와의 상호작용이 Ca++-의존적이기 때문에 이 조건들 하에서 그것의 효소에 의한 활성 형태로 전환될 수 없다는 증거와 일치한다.
실험 #2: 생리학적 조건 하에서 C3b 침착 검정
방법:
C3b 침착 검정을 생리학적 조건 (BBS/Ca++/Mg++) 하에서 (LP 및 AP 둘 다가 기능하게 함) 다음 마우스 혈청의 증가하는 희석액을 사용하여 수행하였다: 인자 D -/-; MASP-2 -/-; 및 WT.
결과:
도 27은 생리학적 조건 (Ca++의 존재시) 하에 수행된 C3b 침착 검정에서 인자 D-/-; MASP-2-/-; 및 WT 마우스의 혈청의 샘플을 사용하여 혈청 농도의 함수로서 C3b 침착의 수준 (OD 405 nm)을 그래프로 도시한다. 도 27에서 나타난 바와 같이, 인자 D-/- 마우스 혈청은 지시된 혈청 희석액을 통해 WT 혈청과 비교하여 아무 차이가 없는 렉틴 및 대체 경로 둘 다를 통해 C3를 활성화시킨다. MASP- -/- 혈청은 대체 경로만에 의한 더 낮은 혈청 희석액에서의 C3 턴오버(turnover) (즉, MASP-3-구동된 대체 경로 활성화)를 나타낸다. 이 결과들은, Ca++의 존재시, MASP-3이 대체 경로 활성을 구동할 수 있다는 것을 고려하면 인자 D는 필요하지 않다는 것을 지시한다.
실험 #3: MASP-2 mAb의 존재시 또는 부재시 인자 B 또는 인자 D가 결핍된 마우스 혈청을 사용하는 C3b 침착 검정
방법:
C3b 침착 검정을 만난 코팅된 미세역가 플레이트에서 생리학적 조건 (BBS/Ca++/Mg++) 하에 다음과 같이 수행하였다:
1. 미세역가 ELISA 플레이트를 코팅 버퍼 (15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, 0.02% 아지드화 나트륨, pH 9.6) 중의 만난 (1 μg/mL)으로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다.
2. 그 다음날, 잔여 단백질 결합 부위를 BBS (4mM 바비탈, 145mM NaCl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2, pH 7.4) 중의 0.1% HSA가 들어있는 250 μl/웰로 실온에서 2시간 동안 차단하였다.
3. 플레이트를 세척 버퍼 (0.05% Tween 20 및 5mM CaCl2가 들어있는 TBS)로 세 번 세척하였다.
4. BBS 중의 1:10 희석된 혈청 샘플을 특정 시점에서 웰에 추가하였다. 버퍼만을 받은 웰을 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 37℃에서 최대 40분 동안 배양하였다.
5. 그 다음 플레이트를 세척 버퍼로 세 번 세척하였다.
6. 그 다음 세척 버퍼에서 1:5000으로 희석된 100 μl의 토끼 항-인간 C3c (Dako)를 웰에 추가하였고 플레이트를 37℃에서 90분 동안 배양하였다.
7. 세척 버퍼로 세 번 세척한 후, 세척 버퍼에서 1:5000으로 희석된 100 μl의 알칼린 포스파타제-컨쥬게이션된 항-토끼를 웰에 추가한 후 이어서 실온에서 90분 동안 배양하였다.
8. 세척 후, 알칼린 포스파타제를 100 μl의 기질 용액을 추가함으로써 검출하였다.
9. 15분 동안 배양 후, 시각적 밀도를 OD 405 nm에서 측정하였다.
결과:
도 28은 생리학적 조건 (Ca++의 존재시) 하에 수행된 C3b 침착 검정에서 MASP-2 mAb의 존재 또는 부재시 인자 D-/- 또는 인자 B-/- 마우스로부터 얻은 마우스 혈청 샘플에서 혈청 배양 시간 (분)의 함수로서 C3b 침착 (OD 405 nm)의 수준을 그래프로 도시한다. 도 28에서 나타난 바와 같이, WT 및 인자 D-/- 혈청에서 C3b 침착의 양의 차이는 없으며, 인자 D의 부재시에도, MASP-3이 대체 경로 활성화를 시작할 수 있다는 결론에 대한 강한 지지를 제공한다. 관찰된 신호는 렉틴 경로 및 대체 경로 활성화 둘 다로 인한 것이라고 생각된다. 도 28에서 더 나타난 바와 같이, 인자 D-/- 플러스 MASP-2 mAb는 MASP-3-매개된 대체 경로 활성화만을 나타낸다. 인자 B-/- 플러스 MASP-2 mAb는 배경만 있다 (데이터 미도시). 열-불활성화된 혈청을 배경 대조군 값으로 사용하였으며, 이것은 MASP-2와 함께 인자 D-/- 및 인자 B-/-와 동일하였다 (데이터 미도시).
요약하면, 이 실시예의 결과는 비-생리학적 조건 하에서 (즉 Ca++의 부재시 BBS/EGTA/Mg++에서 대체 경로 활성화에 대하여 테스트할 때) 인자 D가 유일하게 필수적이라는 것을 입증한다. 반대로, 생리학적 조건 하에 (Ca++의 존재시) 대체 경로 활성화에 대하여 테스트할 때, 이것은 대체 경로가 MASP-3을 통해 활성화되게 하며, 인자 D-결핍 혈청은 WT 대조군과 비교하여 대체 경로 활성이 전혀 결핍되지 않는다. 그러므로, 생리학적 조건 하에서, 대체 경로 활성화의 시작이 MASP-3에 의해 구동된다는 점에서, 인자 D는 불필요하다. 이 결과들은 렉틴 경로가 MASP-3-의존적 활성화 사건을 통해 AP 활성화를 지시한다는 결론을 지지한다.
실시예 8
이 실시예는 인간 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 폴리펩티드에 대한 쥐 단클론성 항체를 생산하고, 이중, 이중 특이적 또는 전체-특이적 MASP 항체를 생성하기 위한 예시적 방법을 설명한다.
1. MASP 항체를 생성하는 방법
8 내지 12주령의 수컷 A/J 마우스 (Harlan, Houston, Tex.)에, 예를 들어, 표 2에서 제시된 바와 같이, 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) pH　7.4 중 200　μl에서 완전 프로인트 보조제 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) 중의 100　μg 인간 전장 폴리펩티드: rMASP-1 (SEQ ID NO:10), rMASP-2 (SEQ ID NO:5) 또는 rMASP-3 (SEQ ID NO:8), 또는 항원 이것의 단편을 피하 주사한다. 2주 후, 마우스에 불완전 프로인트 보조제 중의 같은 인간 폴리펩티드 50　μg을 피하 주사한다. 6주차에서, 마우스에 PBS 중의 같은 인간 폴리펩티드 50　μg을 피하 주사한다.
각각의 융합을 위해, 단일 세포 현탁액을 면역화된 마우스의 비장으로부터 제조하였고 Sp2/0 골수종 세포와의 융합에 사용하였다. 5 x 108개의 Sp2/0 및 5 x 108개의 비장 세포를 50% 폴리에틸렌 글리콜 (M.W.　1450) (Kodak, Rochester, N.Y.) 및 5% 디메틸술폭시드 (Sigma Chemical Co., St.　Louis, Mo.)를 함유하는 배지에서 융합시켰다. 그 다음 세포를 10% 태아 소 혈청, 100　유닛/mL의 페니실린, 100　μg/mL의 스트렙토마이신, 0.1　mM 히폭산틴, 0.4　μM 아미놉테린 및 16　μM 티미딘으로 보충된 Iscove 배지 (Gibco, Grand Island, N.Y.) 중의 현탁액 200　μl 당 1.5 x 105개의 비장 세포의 농도로 조정하였다. 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 대략 20개의 96-웰 미량배양 플레이트에 포함된 각 웰에 추가하였다. 약 10일 후, 배양 상층액을 ELISA 검정에서 표적 정제된 항원 (MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3, 또는 표 2의 항원 단편)과의 반응성에 대하여 스크리닝하기 위해 회수하였다.
ELISA 검정 (MASP-2에 대하여 참고로 설명됨): Immulon　2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) 마이크로테스트 플레이트의 웰을 실온에서 하룻밤 동안 50　ng/mL로 50　μl의 정제된 hMASP-2를 추가함으로써 코팅하였다. 코팅에 사용된 저농도의 MASP2는 고-친화도 항체의 선택을 가능하게 한다. 코팅 용액을 플레이트를 털어서 제거한 후, PBS 중의 200　μl의 BLOTTO (무지방 분유)를 한 시간 동안 각 웰에 추가하여 비-특이적 부위를 차단하였다. 한 시간 후, 웰을 버퍼 PBST (0.05% Tween　20 함유 PBS)로 세척하였다. 각 융합 웰의 배양 상층액 (50 uL)을 50　μl의 BLOTTO와 혼합하였고 그 다음 마이크로테스트 플레이트의 개개의 MASP-2-코팅된 웰에 추가하였다. 배양 한 시간 후, 웰을 PBST로 세척하고 MASP-2에 대한 항체 결합을 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase; HRP)-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG (Fc 특이적) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)를 추가함으로써 검출한다. HRP-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG를 적절한 신호 대 잡음 비(signal to noise ratio)를 제공하기 위해 BLOTTO에서 적당히 희석하고, 각 샘플-함유 웰에 추가한다. 세척 후, 결합된 HRP-컨쥬게이션된 항체를 퍼옥시다제 기질 용액으로 검출한다. 0.1% 3,3,5,5 테트라메틸 벤지딘 (Sigma, St.　Louis, Mo.) 및 0.0003% 히드로겐 퍼옥시드 (Sigma)를 함유하는 퍼옥시다제 기질 용액을 발색을 위해 30분 동안 웰에 추가한다. 반응을 웰 당 50　μl의 2M H2SO4의 추가에 의해 종결하였고 반응 혼합물의 450 nm에서의 시각적 밀도를 BioTek ELISA Reader (BioTek Instruments, Winooski, Vt.)로 측정한다.
결합 검정 (MASP-2에 대하여 참고로 설명됨):
상기 설명된 MASP-2 ELISA 검정에서 양성으로 테스트된 배양 상층액은 MASP-2 억제제가 MASP-2에 대하여 갖는 결합 친화도를 결정하기 위한 결합 검정에서 테스트될 수 있다. 유사한 검정이 억제제가 보체 시스템에서 다른 항원에 결합하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
폴리스티렌 미세역가 플레이트 웰 (96-웰 배지 결합 플레이트, Corning Costar, Cambridge, MA)을 포스페이트-완충된 식염수 (PBS) pH　7.4 중의 MASP-2 (20　ng/100　μl/웰, Advanced Research Technology, San Diego, CA)로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅한다. MASP-2 용액을 빨아낸 후, 웰을 1% 소 혈청 알부민 (BSA; Sigma Chemical)을 함유하는 PBS로 실온에서 2시간 동안 차단하였다. MASP-2 코팅이 없는 웰은 배경 대조군으로서 역할을 한다. 히브리도마 상층액 또는 정제된 MASP-2 MoAbs의 앨리쿼트를, BSA PBS 차단 용액 중의 다양한 농도로, 웰에 추가하였다. 실온에서 2시간 배양 후, 웰을 PBS로 광범위하게 헹궜다. MASP-2-결합된 MASP-2 MoAb를 차단 용액 중의 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG (Sigma Chemical)의 추가에 의해 검출하며, 이것을 실온에서 1시간 동안 배양한다. 플레이트를 다시 PBS로 철저하게 헹궜고, 100　μl의 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) 기질 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)을 추가한다. TMB의 반응은 1M 인산의 100　μl의 추가에 의해 퀸치되고 (quenched), 플레이트를 마이크로플레이트 판독기 (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 450 nm에서 판독하였다.
양성 웰의 배양 상층액을 그 다음에 본원에서 설명된 바와 같이 C4 분할 검정과 같은 기능적 검정에서 보체 활성화를 억제하는 능력에 대하여 테스트한다 (실시예 9). 양성 웰의 세포를 그 다음에 희석을 제한함으로써 클로닝하였다. MoAbs를 상기 설명된 바와 같이 ELISA 검정에서 hMASP-2와의 반응성에 대하여 다시 테스트하였다. 선택된 히브리도마를 스피너 플라스크(spinner flask)에서 키웠고 소모된 배양 상층액을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 항체 정제를 위해 수거하였다.
MASP-2 항체는, 예를 들어, 실시예 9에서 설명된 바와 같이, C4 분할 검정에서 LEA-2 억제 활성에 대하여 검정될 수도 있다.
상기에서 ELISA 및 결합 검정이 MASP-2에 대하여 참고로 설명되는 한편, 같은 ELISA 및 결합 검정이 MASP-1 또는 MASP-3 폴리펩티드 및 항원 이것의 단편을 사용하여 수행될 수도 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다 (예를 들어, 표 2에서 설명된 바와 같음). MASP-3 항체는 C3b 침착 검정에서, 예를 들어 실시예 4에서 설명된 바와 같이, 실시예 5에서 설명된 용혈 검정에서 MASP-3 기질의 MASP-3 세린 프로테아제 분할의 억제에 대하여 및 LEA-1 억제 활성에 대하여 검정될 수도 있다. MASP-1 항체는, 예를 들어 실시예 4에서 설명된 바와 같이, C3b 침착 검정에서 및 실시예 5에서 설명된 바와 같이. 용혈 검정에서 MASP-1 기질의 MASP-1 세린 프로테아제 분할의 억제에 대하여, MASP-3 활성화의 억제에 대하여, 및 LEA-1 억제 활성에 대하여 검정될 수도 있다.
2. 이중-MASP 항체를 생성하는 방법
MASP-2/3 이중 억제 항체: 도 4, 6 및 7C에서 나타난 바와 같이, 세린 프로테아제 도메인에서 MASP-2와 MASP-3 사이에서 보존된 영역이 있으며, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:8의 베타 사슬에 의해 암호화된다. 그러므로, 이중 MASP-2/3 항체는 상기 설명된 바와 같이 단클론성 항체를 생성하기 위해 SEQ ID NO:5 (또는 SEQ ID NO:8)의 베타 사슬과 같은 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 (또는 MASP-3)을 포함하거나 이로 구성된 항원을 사용하여 생성될 수 있거나, 또는 대안으로, 이 항원(들)은 이 항원(들)에 특이적으로 결합하는 클론에 대하여 파지 라이브러리를 스크리닝한 후, 이어서 MASP-3 (또는 MASP-1에 대한 이중 결합에 대하여 스크리닝하는데 사용될 수도 있다. 그 다음에 이중 MASP-2/3 항체를, 예를 들어, 표 2에서 설명된 바와 같이, 기능적 검정에서 억제 활성에 대하여 스크리닝한다.
MASP-1/3 이중 억제 항체: 도 3-5에서 나타난 바와 같이, MASP-1 및 MASP-3은 CUBI-CCP2 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 25-432)에서 동일한 보존된 영역을 공유하며, 이것은 또한 MAp44에 의해 공유된다. 도 3에서 나타난 바와 같이, MAp44는 CCP2 도메인을 함유하지 않는다. 그러므로, MAp44를 포함하는 이중 MASP-1/3 항체는 상기 설명된 바와 같이 단클론성을 생성하기 위해 MASP-1 (또는 MASP-3)의 CUBI-CCP-2 도메인을 포함하거나 이로 구성된 항원을 사용하여 생성되거나, 또는 대안으로, 이 항원은 이 항원에 특이적으로 결합하는 클론에 대한 파지 라이브러리를 스크리닝한 후, 이어서 MASP-3 (또는 MASP-1)에 대한 이중 결합에 대하여 스크리닝하는데 사용된다. MAp44를 제외하는 이중 MASP-1/3 항체를, MASP-1 (또는 MASP-3)의 CCP2 도메인을 포함하거나 이로 구성된 항원을 사용하여, 유사한 방식으로 생성한다. 그 다음에 이중 MASP-1/3 항체를, 예를 들어, 표 2에서 설명된 바와 같이, 기능적 검정에서 억제 활성에 대하여 스크리닝한다.
MASP-1/2 이중 억제 항체: 도 4, 6 및 7A에서 나타난 바와 같이, MASP-1의 세린 프로테아제 도메인 및 MASP-2는 보존되는 영역을 함유한다. 그러므로, 이중 MASP-1/2 항체는 상기 설명된 바와 같이 단클론성 항체를 생성하기 위해 MASP-1의 세린 프로테아제 도메인 (또는 MASP-2)을 포함하거나 이로 구성된 항원을 사용하여 생성되거나, 또는 대안으로, 이 항원은 이 항원에 특이적으로 결합하는 클론에 대하여 파지 라이브러리를 스크리닝한 후, 이어서 MASP-2 (또는 MASP-1)에 대한 이중 결합에 대하여 스크리닝하는데 사용된다. 그 다음에 이중 MASP-1/2 항체를, 예를 들어, 표 2에서 설명된 바와 같이, 기능적 검정에서 억제 활성에 대하여 스크리닝한다.
3. 전체-특이적 MASP 항체를 생성하는 방법:
알파 사슬: MASP-2 및 MASP-1/3 사이에서 동일성의 많은 패치들은 그것이 MASP-1/3 및 MASP-2에 결합하는 단클론성 항체를 생성하는 것이 가능할 수도 있다고 제안한다. 특히, 동일성의 대부분은 도 5에서 나타난 바와 같이, CUB1-EGF-CUB2 도메인 내에 있다. 도 5에서 예시된 다양한 도메인을 Yongqing, et al., Biochemica et Biophysica Acta 1824:253-262 (2012); Teillet et al., J. Biol. Chem. 283:25715-25724 (2008); 및 Marchler-Bauer et al., Nucleic Acids Res. 39:D225-229 (2011)에 따라 확인하였다.
베타 사슬: MASP-2 및 MASP-1/3 사이에서 동일성의 많은 패치들은, 도 6에서 나타난 바와 같이, 전체-특이적 MASP-1/2/3 억제자의 생성을 허용할 것이다.
방법:
전체-특이적 MASP 억제 항체 (즉, MASP-1, 2 및 3 활성을 억제하는 항체)는 다음과 같이 생성된다:
1. MASP-1/3 및 MASP-2 알파-사슬 CUB1-EGF-CUB2 도메인에 대한 라이브러리를 스크리닝하고 MASP-1/3 및 MASP-2 둘 다에 교차-반응하는 클론을 선택한다.
2. 예를 들어, 표 2에서 설명된 바와 같이, 기능적 활성을 억제하는 능력에 대하여 클론을 스크리닝한다.
3. DTLacO 친화도/기능성 성숙화 기술 (Yabuki et al., PLoS ONE, 7(4):e36032 (2012))을 사용하여 세 개의 단백질 모두에 대한 결합 및 억제 기능을 최적화한다.
4. 표 2에서 설명된 바와 같이, 전체-MASP 억제자는 LEA-1- 및 LEA-2-매개된 보체 활성화를 억제하는데 사용될 수도 있다.
4. 이중 특이적 MASP-2/3 항체를 생성하는 방법
이중 특이적 MASP-2/3 억제 항체를 다음과 같이 생성한다:
1. 실시예 11-14에서 설명된 바와 같이, CCP1 도메인에 결합하고 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 예시적 MASP-2 특이적 억제 항체를 확인하였다.
2. MASP-3 특이적 억제 항체를, 실시예 15에서 설명된 바와 같이, MASP-3 폴리펩티드에 대한 라이브러리를 스크리닝하고 MASP-3 항체를 확인한 후, 이어서, 예를 들어, 표 2에서 설명된 바와 같이, 기능적 검정에서 LEA-1 억제 활성에 대하여 항체를 검정함으로써 생성한다. 예시적 MASP-3 항체는 실시예 15에서 설명된다.
3. MASP-2 및 MASP-3에 특이적인 항원 결합 영역을 프레임워크로 클로닝하여 이중-특이적 항체를 생성한다. 많은 이중 특이적 항체 포맷이 설명되며, 면역글로불린 G-유사 포맷뿐만 아니라 다양한 융합 단백질 및 단일 사슬 가변 단편 배열을 포함한다 (Holmes, Nature Reviews, Drug Discovery 10:798-800 (2011), Muller and Kontermann, Biodrugs 24:89-98 (2010)). 한 예에서, 이중 특이적 항체는 두 개의 별개의 항원에 대한 항체를 발현하는 두 개의 히브리도마를 융합함으로써 생성될 수 있으며, 다양한 중쇄 및 경쇄 짝짓기를 발생시키고, 이것의 퍼센트는 다른 항원에 특이적인 중쇄 및 경쇄와 쌍을 이룬 하나의 항원에 특이적인 중쇄 및 경쇄를 포함한다 (Milstein and Cuello, Nature 305:537-539 (1983)). 유사한 이중 특이적 항체는, 두 개의 중쇄가 다른 특이성을 갖는 경우, 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍을 동시 발현함으로써, 재조합에 의해 생성될 수도 있다. 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 바람직하게 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 융합되며, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 원하면, 면역글로불린을 암호화하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 동시-트랜스펙션한다.
짝을 이룬 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 이외에, 두 개의 다른 표적에 특이적인 단일 사슬 가변 단편의 결합은 Kipriyanov et al., J. Mol. Biol. 293:41 (1999)에서 예시된다. 이 예에서, 단을 폴리뉴클레오티드 발현 구조는 결합자 펩티드에 의해 분리된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 두 개의 쌍을 암호화하도록 설계되며, 각각의 쌍은 별개의 단백질 표적에 대한 특이성을 전달한다. 발현시, 폴리펩티드는 하나의 표적에 특이적인 중쇄 및 경쇄 쌍이 단백질의 하나의 항원-결합 표면을 형성하고, 다른 쌍은 별개의 항원-결합 표면을 형성하는 배열에서 모여서, 단일 사슬 디아바디로 불리는 분자를 생성한다. 중심 중쇄 및 경쇄 가변 영역 쌍 사이에서 결합자의 길이에 따라, 폴리펩티드는 또한 다이머화하도록 강요될 수 있으며, 탠덤 디아바디의 형성을 일으킨다.
예를 들어, 다음 면역글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 이중-특이적 항체의 다음 예시적, 비-제한 실시예를 생성하기 위해 하나 이상의 벡터로 삽입되고 적합한 숙주 유기체에서 발현될 수도 있다.
MASP-2/3 이중 특이적 항체
한 구체예에서, 인간 MASP-2 및 인간 MASP-3에 결합하는 이중 특이적 항체가 제공되며 다음을 포함한다:
(I) a) i) SEQ ID NO:21의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 및 ii) SEQ ID NO:21의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 iii) SEQ ID NO:21의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 중 적어도 하나 이상; 및/또는 b) i) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 및 ii) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 iii) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 특이적 결합 영역; 및
(II) MASP-3 특이적 결합 영역, 선택적으로 a) i) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:26의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 및 ii) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:26의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 iii) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:26의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 b) i) SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 및 ii) SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 iii) SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 중 적어도 하나를 포함하는 MASP-3 특이적 결합 영역.
MASP-1/2 이중 특이적 항체
한 구체예에서, 인간 MASP-1 및 인간 MASP-2에 결합하는 이중 특이적 항체가 제공되며 다음을 포함한다:
(I) a) i) SEQ ID NO:21의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 및 ii) SEQ ID NO:21의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 iii) SEQ ID NO:21의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 중 적어도 하나 이상; 및/또는 b) i) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 및 ii) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 iii) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 중 적어도 하나 이상을 포함하는 MASP-2 특이적 결합 영역; 및
(II) MASP-1 특이적 결합 영역.
4. MASP-2 및/또는 MASP-3에 대한 기능적 억제 활성의 테스트를, 예를 들어, 표 2에서 설명된 바와 같이, 및 본원에서 더 설명된 바와 같이, 테스트한다.
실시예 9
이 실시예는 L-피콜린/P35, H-피콜린, M-피콜린 또는 만난을 통해 MASP-2-의존적 보체 활성화를 차단할 수 있는 MASP-2 억제제를 확인하기 위한 기능적 스크린닝으로서 사용된 시험관 내 C4 분할 검정을 설명한다.
C4 분할 검정 : C4 분할 검정은 Petersen, S.V.,　et　al., J.　Immunol. Methods 257:107, 2001에 의해 설명되었으며, 이것은 L-피콜린에 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스에서 리포테이코산 (LTA)로부터 발생하는 렉틴 경로 활성화를 측정한다.
시약: 포르말린-고정된 스타필로코쿠스 아우레우스 (DSM20233)를 다음과 같이 제조하였다: 박테리아를 트립신 콩 혈액 배지에서 37℃에서 하룻밤 동안 키우고, PBS로 세 번 세척하고, 그 다음 PBS/0.5% 포르말린으로 상온에서 1시간 동안 고정하고, 코팅 버퍼 (15　mM Na2CO3, 35　mM NaHCO3, pH　9.6)에서 재현탁되기 전에, PBS로 추가로 세 번 세척한다.
검정: Nunc MaxiSorb 미세역가 플레이트 (Nalgene Nunc International, Rochester, NY)의 웰을 1　μg의 코팅 버퍼 중의 L-피콜린과 함께 100　μl의 코팅 버퍼 중의 포르말린-고정된 스타필로코쿠스 아우레우스 DSM20233 (OD550　=　0.5)으로 코팅한다. 하룻밤 동안 배양 후, 웰을 TBS (10　mM Tris-HCl, 140　mM NaCl, pH　7.4) 중의 0.1% 인간 혈청 알부민 (HSA)로 차단하고, 그 다음 0.05% Tween　20 및 5　mM CaCl2를 함유하는 TBS (세척 버퍼)로 세척한다. 인간 혈청 샘플을 20mM Tris-HCl, 1　M NaCl, 10　mM CaCl2, 0.05% Triton X-100, 0.1% HSA, pH　7.4에서 희석하며, 이것은 내인성 C4의 활성화를 방지하고 C1 복합체 (C1q, C1r 및 C1s로 구성됨)를 분해한다. MASP-2 MoAbs를 포함하는 MASP-2 억제제를 다양한 농도로 혈청 샘플에 추가한다. 희석된 샘플을 플레이트에 추가하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양한다. 24시간 후, 플레이트를 세척 버퍼로 철저하게 세척하고, 그 다음 4　mM 바비탈, 145　mM NaCl, 2　mM CaCl2, 1　mM MgCl2, pH　7.4의 100　μl 중의 정제된 인간 C4 (Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993에서 설명된 바와 같이 얻어짐)의 0.1　μg을 각 웰에 추가한다. 37℃에서 1.5시간 후, 플레이트를 다시 세척하고 C4b 침착을 알칼린 포스파타제-컨쥬게이션된 닭 항-인간 C4c (Immunsystem, Uppsala, Sweden으로부터 얻어짐)를 사용하여 검출하고 비색 기질 ρ-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 측정한다.
만난에서 C4 검정 : 상기 설명된 검정을 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 추가하기 전에 LSP 및 만난으로 플레이트를 코팅함으로써 MBL을 통한 렉틴 경로 활성화를 측정하는데 적용한다.
H-피콜린 (Hakata Ag)에서 C4 검정 : 상기 설명된 검정을 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 추가하기 전에 LPS 및 H-피콜린으로 플레이트를 코팅함으로써 H-피콜린을 통한 렉틴 경로 활성화를 측정하는데 적용한다.
실시예 10
다음 검정을 고전적 경로가 면역 복합체에 의해 시작되는 조건 하에 MASP 억제제의 효과를 분석함으로써 MASP 억제제가 고전적 경로를 차단하는지 테스트하는데 사용한다.
방법: 고전적 경로가 면역 복합체에 의해 시작되는 경우 보체 활성화의 조건에 대한 MASP 억제제의 효과를 테스트하기 위해, 90% NHS를 함유하는 3배수의 50　μl 샘플을 10　μg/mL 면역 복합체 또는 PBS의 존재시 37℃에서 배양하고, 37℃ 배양 중에 200　nM 항-프로퍼딘 단클론성 항체를 함유하는, 유사한 3배수의 샘플 (+/- 면역 복합체)이 또한 포함된다. 37℃에서 2시간 배양 후, 추가의 보체 활성화를 중단하기 위해 13　mM EDTA를 모든 샘플에 추가하고 샘플을 즉시 5℃로 냉각한다. 그 다음 제조사의 지시에 따라 ELISA 키트 (Quidel, 제품 번호 A015 및 A009)를 사용하여 보체 활성화 생성물 (C3a 및 sC5b-9)에 대하여 검정하기 전에 샘플을 -70℃에 저장한다.
실시예 11
이 실시예는 MASP-2 활성을 차단하는 고-친화도 MASP-2 Fab2 항체 단편의 확인을 설명한다.
배경 및 근거: MASP-2는 많은 별개의 기능적 도메인을 갖는 복합체 단백질이며, MBL 및 피콜린에 대한 결합 부위(들), 세린 프로테아제 촉매 반응 부위, 단백질 가수분해 기질 C2에 대한 결합 부위, 단백질 가수분해 기질 C4에 대한 결합 부위, MASP-2 치모겐의 자가활성화에 대한 MASP-2 분할 부위, 및 두 개의 Ca++ 결합 부위를 포함한다. Fab2 항체 단편이 MASP-2에 대하여 높은 친화도로 결합하는 것을 확인하였고, 확인된 FaB2 단편을 그것들이 MASP-2 기능적 활성을 차단할 수 있는지 결정하기 위한 기능적 검정에서 테스트하였다.
MASP-2 기능적 활성을 차단하기 위해, 항체 또는 Fab2 항체 단편은 MASP-2 기능적 활성에 필요한 MASP-2의 구조 에피토프에 결합하고 이것을 방해해야한다. 그러므로, 많은 또는 모든 고-친화도 결합 MASP-2 Fab2는 그것들이 MASP-2 기능적 활성에 직접적으로 수반되는 MASP-2의 구조 에피토프에 결합하지 않으면 MASP-2 기능적 활성을 억제하지 않을 수도 있다.
렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 측정하는 기능적 검정을 사용하여 MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하였다. 렉틴 경로에서 MASP-2의 주요 생리학적 역할은 렉틴-매개된 보체 경로의 다음의 기능적 구성요소, 즉 렉틴 경로 C3 컨버타제를 생성하는 것이라는 것이 잘 알려져 있다. 렉틴 경로 C3 컨버타제는 단백질 가수분해에 의해 C3을 C3a 및 C3b로 분할하는 중요한 효소 복합체 (C4bC2a)이다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 컨버타제 (C4bC2a)의 구조적 구성요소가 아니다; 하지만, MASP-2 기능적 활성은 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 두 개의 단백질 구성요소 (C4b, C2a)를 생성하기 위해 필요하다. 게다가, 상기 나열된 MASP-2의 별개의 기능적 활성 모두는 MASP-2가 렉틴 경로 C3 컨버타제를 생성하기 위해 필요한 것으로 나타난다. 이런 이유들로, MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하는데 사용되는 바람직한 검정은 렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 측정하는 기능적 검정인 것으로 생각된다.
고 친화도 Fab2의 생성: 인간 가변 경쇄 및 중쇄 항체 서열의 파지 디스플레이 라이브러리 및 원하는 선택된 리간드와 반응하는 Fab2를 확인하기 위한 자동화된 항체 선택 기술을 사용하여 래트 MASP-2 단백질에 대한 고-친화도 Fab2 (SEQ ID NO:13)를 생성하였다. 래트 MASP-2 (~1　mg, >85% 순도) 단백질의 알려져 있는 양을 항체 스크리닝에 이용하였다. 세 라운드의 증폭을 최고의 친화도를 가진 항체의 선택에 이용하였다. 항체 단편을 발현하는 대략 250개의 다른 히트(hit)를 ELISA 스크리닝으로 선발하였다. 고 친화도 히트를 이후에 다른 항체의 독특성을 결정하기 위해 시퀀싱(sequence)하였다.
50개의 독특한 MASP-2 항체를 정제하였고 각각 정제된 Fab2 항체의 250　μg을 MASP-2 결합 친화도의 특성화 및 보체 경로 기능적 테스트에 사용하였으며, 하기 더 상세히 설명된 바와 같다.
MASP-2 Fab2의 억제 (차단) 활성을 평가하는데 사용된 검정
1. 렉틴 경로 C3 컨버타제의 형성의 억제를 측정하기 위한 검정:
배경: 렉틴 경로 C3 컨버타제는 단백질 가수분해에 의해 C3을 두 개의 강한 전염증 단편, 아나필라톡신 C3a 및 옵소닌 C3b으로 분할하는 효소 복합체 (C4bC2a)이다. C3 컨버타제의 형성은 염증을 매개하는데 관련된 렉틴 경로의 주요 단계인 것으로 나타난다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 컨버타제 (C4bC2a)의 구조적 구성요소가 아니다; 그러므로 MASP-2 항체 (또는 Fab2)는 기존의 C3 컨버타제의 활성을 직접적으로 억제하지 않을 것이다. 하지만, MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 두 개의 단백질 구성요소 (C4b, C2a)를 생성하기 위해 필요하다. 그러므로, MASP-2 Fab2는 MASP-2 기능적 활성을 억제하며 (즉, MASP-2 Fab2를 차단함), 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데 노보(de novo) 형성을 억제할 것이다. C3는 그것의 구조의 일부로서 특이한 및 고도로 반응성인 티오에스테르 기를 함유한다. 이 검정에서 C3 컨버타제에 의한 C3의 분할에서, C3b의 티오에스테르 기는 에스테르 또는 아미드 결합을 통해 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 거대분자에서 히드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성할 수 있고, 따라서 ELISA 검정에서 C3b의 검출을 용이하게 한다.
효모 만난은 렉틴 경로의 알려진 활성화제이다. C3 컨버타제의 형성을 측정하기 위한 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 렉틴 경로를 활성화하기 위해 희석된 래트 혈청과 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 다음 웰을 세척하고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 C3b에 대하여 검정하였다. 이 검정에서 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데 노보 형성의 직접적인 반영이다. 선택된 농도의 MASP-2 Fab2를 이 검정에서 C3 컨버타제 형성 및 결과적인 C3b 생성을 억제하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다.
방법:
96-웰 Costar Medium Binding 플레이트를 1 μg/50 μl/웰로 50　mM 카보네이트 버퍼, pH　9.5에서 희석된 만난과 함께 5℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 하룻밤 동안 배양 후, 각 웰을 200 μl PBS로 세 번 세척하였다. 그 다음 웰을 PBS 중의 100 μl/웰의 1% 소 혈청 알부민으로 차단하였고 실온에서 한 시간 동안 부드럽게 섞으면서 배양하였다. 그 다음 각 웰을 200 μl의 PBS로 세 번 세척하였다. MASP-2 Fab2 샘플을 5℃에서 Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 버퍼 (4.0　mM 바비탈, 141　mM NaCl, 1.0　mM MgCl2, 2.0　mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH　7.4)에서 선택된 농도로 희석하였다. 0.5% 래트 혈청을 5℃에서 상기 샘플에 추가하였고 100 μl을 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 덮었고 보체 활성화를 허용하기 위해 37℃ 수조에서 30분 동안 배양하였다. 반응을 플레이트를 37℃ 수조로부터 얼음물을 함유하는 용기로 옮김으로써 중단하였다. 각 웰을 PBS-Tween　20 (PBS 중의 0.05% Tween　20) 200 μl로 다섯 번 세척하였으며, 그 다음 200 μl PBS로 두 번 세척하였다. 100 μl/웰의 1차 항체 (토끼 항-인간 C3c, DAKO A0062)의 1:10,000 희석액을 2.0　mg/mL 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS에서 추가하였고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 섞으면서 배양하였다. 각 웰을　200 μl PBS로 5번 세척하였다. 100 μl/웰의 2차 항체 (퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG, American Qualex A102PU)의 1:10,000 희석액을 2.0　mg/mL 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS에서 추가하였고 실온에서 한 시간 동안 셰이커에서 부드럽게 섞으면서 배양하였다. 각 웰을 PBS 200 μl로 다섯 번 세척하였다. 100 μl/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)을 추가하였고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 퍼옥시다제 반응을 100 Tl/웰의 1.0M H3PO4를 추가함으로써 중단하였고 OD450을 측정하였다.
2. MASP-2-의존적 C4 분할의 억제를 측정하기 위한 검정
배경: MASP-2의 세린 프로테아제 활성은 고도로 특이적이고 MASP-2에 대해 단 2개의 단백질 기질, C2 및 C4가 확인되었다. C4의 분할은 C4a 및 C4b를 생성한다. MASP-2 Fab2는 C4 분할에 직접적으로 수반된 MASP-2에서 구조적 에피토프 (예를 들어, C4에 대한 MASP-2 결합 부위; MASP-2 세린 프로테아제 촉매 반응 부위)에 결합할 수도 있고 이로 인해 MASP-2의 C4 분할 기능적 활성을 억제할 수도 있다.
효모 만난은 렉틴 경로의 열린 활성화제이다. MASP-2의 C4 분할 활성을 측정하기 위한 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 렉틴 경로를 활성화하기 위해 희석된 래트 혈청과 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였다. ELISA 검정에서 사용된 1차 항체가 인간 C4만을 인식하기 때문에, 희석된 래트 혈청을 또한 인간 C4 (1.0 μg/mL)로 보충하였다. 그 다음 웰을 세척하였고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 인간 C4b에 대하여 검정하였다. 이 검정에서 C4b의 양은 MASP-2-의존적 C4 분할 활성의 측정값이다. 선택된 농도에서 MASP-2 Fab2를 이 검정에서 C4 분할을 억제하는 능력에 대하여 테스트하였다.
방법: 96-웰 Costar Medium Binding 플레이트를 1.0 Tg/50 μl/웰로 50　mM 카보네이트 버퍼, pH　9.5에서 희석된 만난과 함께 5℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 각 웰을 200 μl PBS로 3번 세척하였다. 그 다음 웰을 100 μl/웰의 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민으로 차단하였고 실온에서 한 시간 동안 부드럽게 섞으면서 배양하였다. 각 웰을 200 μl의 PBS로 3번 세척하였다. MASP-2 Fab2 샘플을 5℃에서 Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 버퍼 (4.0　mM 바비탈, 141　mM NaCl, 1.0　mM MgCl2, 2.0　mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH　7.4)에서 선택된 농도로 희석하였다. 1.0 μg/mL 인간 C4 (Quidel)가 또한 이 샘플들에 포함된다. 0.5% 래트 혈청을 5℃에서 상기 샘플에 추가하였고 100 μl를 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 덮었고 보체 활성화를 허용하기 위해 37℃ 수조에서 30분 동안 배양하였다. 37℃ 수조로부터 얼음물을 함유한 용기로 플레이트를 옮김으로써 반응을 중단하였다. 각 웰을 PBS-Tween　20 (PBS 중의 0.05% Tween　20) 200 μl로 5번 세척하였고, 그 다음 웰을 200 μl PBS로 2번 세척하였다. 100 μl/웰의 비오틴-컨쥬게이션된 닭 항-인간 C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)의 1:700 희석액을 2.0　mg/mL 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS에서 추가하였고 상온에서 한 시간 동안 부드럽게 섞으면서 배양하였다. 각 웰을 200 μl PBS로 5번 세척하였다. 100 μl/웰의 0.1 μg/mL 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 스트렙타비딘 (Pierce Chemical #21126)을 2.0　mg/mL BSA를 함유하는 PBS에서 추가하였고 실온에서 한 시간 동안 셰이커에서 부드럽게 섞으면서 배양하였다. 각 웰을 200 μl PBS로 5번 세척하였다. 100 μl/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)을 추가하였고 실온에서 16분 동안 배양하였다. 100　μl/웰의 1.0 M H3PO4를 추가함으로써 퍼옥시다제 반응을 중단하였고 OD450을 측정하였다.
3. '고유한' 래트 MASP-2에 대한 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 검정
배경: MASP-2는 보통 특이적 렉틴 분자 (만노스-결합 단백질 (MBL) 및 피콜린)을 또한 포함하는 MASP-2 다이머 복합체로서 혈장에 존재한다. 그러므로, 하나가 MASP-2 Fab2의 MASP-2의 생리학적으로 적절한 형태에 대한 결합을 연구하는데 관심이 있으면, Fab2 및, 정제된 재조합 MASP-2 대신에, 혈장의 '고유한' MASP-2 사이의 상호작용이 사용되는 결합 검정을 개발하는 것이 중요하다. 이 결합 검정에서, 10% 래트 혈청의 '고유한' MASP-2-MBL 복합체를 먼저 만난-코팅된 벽에 고정하였다. 그 다음 다양한 MASP-2 Fab2의 고정된 '고유한' MASP-2에 대한 결합 친화도를 표준 ELISA 방법론을 사용하여 연구하였다.
방법: 96-웰 Costar High Binding 플레이트를 1 μg/50 μl/웰로 50　mM 카보네이트 버퍼, pH　9.5에서 희석된 만난과 함께 5℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 각 웰을 200 μl PBS로 3번 세척하였다. 웰을 100 μl/웰의 PBST (0.05% Tween　20이 들어있는 PBS) 중의 0.5% 무지방 분유로 차단하였고 상온에서 한 시간 동안 부드럽게 섞으면서 배양하였다. 각 웰을 200 μl의 TBS/Tween/Ca++ 세척 버퍼 (트리스-완충된 식염수, 0.05% Tween　20, 5.0　mM CaCl2 함유, pH　7.4)로 3번 세척하였다. 고염 결합 버퍼 (20　mM Tris, 1.0 M NaCl, 10　mM CaCl2, 0.05% Triton-x 10100, 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민, pH　7.4) 중의 10% 래트 혈청을 얼음 위에서 제조하였다. 100 μl/웰을 추가하였고 5℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 웰을 200 μl의 TBS/Tween/Ca++ Wash 버퍼로 3번 세척하였다. 그 다음 웰을 200 μl PBS로 2번 세척하였다. Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 버퍼 (4.0　mM 바비탈, 141　mM NaCl, 1.0　mM MgCl2, 2.0　mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH　7.4)에서 희석된 100 μl/웰의 선택된 농도의 MASP-2 Fab2를 추가하였고 실온에서 한 시간 동안 부드럽게 섞으면서 배양하였다. 각 웰을 200 μl PBS로 다섯 번 세척하였다. PBS 중의 2.0　mg/mL 소 혈청 알부민에서 1:5000으로 희석된 100 μl/웰의 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-Fab2 (Biogenesis 제품 번호 0500-0099)를 추가하였고 실온에서 한 시간 동안 부드럽게 섞으면서 배양하였다. 각 웰을 200 μl PBS로 5번 세척하였다. 100 μl/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard　& Perry Laboratories)를 추가하였고 실온에서 70분 동안 세척하였다. 퍼옥시다제 반응을 100 μl/웰의 1.0 M H3PO4를 추가함으로써 중단하였고 OD450을 측정하였다.
결과:
래트 MASP-2 단백질에 대하여 높은 친화도로 반응하는 대략 250개의 다른 Fab2를 ELISA 스크리닝으로 선발하였다. 이 고-친화도 Fab2를 시퀀싱하여 다른 항체의 독특성을 결정하였고, 50개의 독특한 MASP-2 항체를 추가의 분석을 위해 정제하였다. 각각의 정제된 Fab2 항체의 250　ug을 MASP-2 결합 친화도의 특성화 및 보체 경로 기능적 테스트에 사용하였다. 이 분석의 결과는 하기 표 13에서 나타난다.
렉틴 경로 보체 활성화를 차단하는 MASP-2 FAB2
Fab2 항체 # C3 컨버타제
(IC50 (nM))		 Kd
(nM) 		C4 분할
IC50 (nM)
88 0.32 4.1 ND
41 0.35 0.30 0.81
11 0.46 0.86 <2　nM
86 0.53 1.4 ND
81 0.54 2.0 ND
66 0.92 4.5 ND
57 0.95 3.6 <2　nM
40 1.1 7.2 0.68
58 1.3 2.6 ND
60 1.6 3.1 ND
52 1.6 5.8 <2　nM
63 2.0 6.6 ND
49 2.8 8.5 <2　nM
89 3.0 2.5 ND
71 3.0 10.5 ND
87 6.0 2.5 ND
67 10.0 7.7 ND
상기 표 13에서 나타난 바와 같이, 테스트된 50개의 MASP-2 Fab2 중에서, 17개를 10　nM Fab2 이하의 IC50 (34% 양성 적중률)로 C3 컨버타제 형성을 강하게 억제하는 MASP-2-차단 Fab2로 확인하였다. 확인된 17개의 Fab2 중 8개는 나노 몰 이하의 범위의 IC50을 갖는다. 게다가, 표 13에서 나타난 MASP-2를 차단하는 Fab2 중 17개 모두는 렉틴 경로 C3 컨버타제 검정에서 C3 컨버타제 형성의 본질적으로 완전한 억제를 제공하였다. 이것은 각 MASP-2 분자가 Fab2에 의해 결합될 때도 "차단" Fab2가 MASP-2 기능을 조금만 억제할 수도 있다는 것이 이론적으로 가능하기 때문에, 중요한 고려사항이다. 만난이 렉틴 경로의 알려진 활성화제이지만, 래트 혈청에서 항-만난 항체의 존재가 고전적 경로를 활성화하고 고전적 경로 C3 컨버타제를 통해 C3b를 생성할 수도 있다는 것이 이론적으로 가능하다. 하지만, 이 실시예에서 나열된 17개의 차단 MASP-2 Fab2 각각은 C3b 생성을 강하게 억제하고 (>95 %), 따라서 렉틴 경로 C3 컨버타제에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다.
결합 검정을 또한 17개의 차단 Fab2 모두로 각각에 대하여 분명한 Kd를 계산하기 위해 수행하였다. 차단 Fab2 중 6개에 대하여 고유한 래트 MASP-2에 대한 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 검정의 결과가 또한 표 13에서 나타난다. 유사한 결합 검정을 또한 다른 Fab2에 대하여 수행하였으며, 그것의 결과는 표 13에서 나타난다. 일반적으로, 6개의 Fab2 각각의 '고유한' MASP-2로의 결합에 대해 얻어진 분명한 Kd는 C3 컨버타제 기능적 검정에서 FaB2에 대한 IC50과 상당히 잘 일치한다. MASP-2가 그것의 프로테아제 활성의 활성화시 '비활성'에서 '활성' 형태로의 구조적 변화를 경험한다는 증거가 있다 (Feinberg　et　al., EMBO J 22:2348-59 (2003); Gal　et　al., J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005)). C3 컨버타제 형성 검정에 사용된 정상 래트 혈장에서, MASP-2는 주로 '비활성' 치모겐 구조에 존재한다. 반대로, 결합 검정에서, MASP-2는 고정된 만난에 결합된 MBL을 가진 복합체의 일부로서 존재한다; MASP-2는 '활성' 구조일 것이다 (Petersen　et　al., J. Immunol Methods 257:107-16, 2001). 결과적으로, 이 두 기능적 검정에서 테스트된 17개의 차단 Fab2 각각에 대한 IC50 및 Kd 사이의 정확한 관련성이 반드시 예상되지는 않는데, 각 검정에서, Fab2는 MASP-2의 다른 구조적 형태와 결합할 것이기 때문이다. 그럼에도 불구하고, Fab2 #88을 제외하고, 두 개의 검정에서 테스트된 다른 16개의 Fab2 각각에 대한 IC50 및 분명한 Kd 사이에서 합리적으로 밀접한 관련성이 있는 것으로 나타났다 (표 13 참조). 차단 Fab2 중 다수를 C4의 MASP-2-매개된 분할의 억제에 대하여 평가하였다. 표 13에서 나타난 바와 같이, 테스트된 Fab2 모두가 C3 컨버타제 검정에서 얻어진 것들과 유사한 IC50으로 C4 분할을 억제하는 것을 발견하였다.
만난은 렉틴 경로의 알려진 활성화제이지만, 래트 혈청에서 항-만난 항체의 존재는 또한 고전적 경로를 활성화시키고 이로 인해 C4의 C1s-매개된 분할에 의해 C4b를 생성할 수도 있다는 것이 이론적으로는 가능하다. 하지만, 여러 MASP-2 Fab2는 C4b 생성을 강하게 억제하는 것으로 확인되었고 (>95 %), 따라서 MASP-2-매개된 C4 분할에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다. C3과 같이, C4는 그것의 구조의 일부로서 특이한 및 고도로 반응성인 티오에스테르 기를 함유한다. 이 검정에서 MASP-2에 의한 C4의 분할에서, C4b의 티오에스테르 기는 에스테르 또는 아미드 결합을 통해 플라스틸 웰의 바닥에 고정된 거대 분자에서 히드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성할 수 있고, 따라서 ELISA 검정에서 C4b의 검출을 용이하게 한다.
이 연구들은 C4 및 C3 컨버타제 활성 둘 다를 기능적으로 차단하고, 이로 인해 렉틴 경로 활성화를 방지하는 래트 MASP-2 단백질에 대한 고-친화도 FAB2의 생성을 분명하게 입증한다.
실시예 12
이 실시예는
실시예 11에서 설명된 바와 같이 생성된 차단 항-래트 MASP-2 Fab2 항체 중 다수에 대한 에피토프 맵핑(mapping)을 설명한다.
방법:
다음 단백질, N-말단 6X His 태그를 가진 모두는 pED4 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 발현된다:
래트 MASP-2A, 활성 중심에서 세린을 알라닌 (S613A)으로 바꿈으로써 비활성화된 전장 MASP-2 단백질;
래트 MASP-2K, 자가활성화를 감소시키도록 변화된 전장 MASP-2 단백질 (R424K);
CUBI-II, CUBI, EGF-유사 및 CUBII 도메인만을 함유하는 래트 MASP-2의 N-말단 단편; 및
CUBI/EGF-유사, CUBI 및 EGF-유사 도메인만을 함유하는 래트 MASP-2의 N-말단 단편.
이 단백질들을 니켈-친화도 크로마토그래피에 의해 배양 상층액으로부터 정제하였으며, 이전에 설명된 바와 같다 (Chen　et　al., J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001)).
래트 MASP-2의 CCPII 및 세린 프로테아제 도메인을 함유하는 C-말단 폴리펩티드 (CCPII-SP)은 pTrxFus (Invitrogen)를 사용하여 티오레독신 융합 단백질로서 대장균에서 발현되었다. 단백질을 Thiobond 친화도 레진을 사용하여 세포 용해물로부터 정제하였다. 티오레독신 융합 파트너가 음성 대조군으로서 빈 pTrxFus로부터 발현되었다.
모든 재조합 단백질을 TBS 버퍼로 투석하였고 그것들의 농도를 280 nm에서 OD를 측정함으로써 결정하였다.
도트 블롯 분석:
상기 설명된 다섯 개의 재조합 MASP-2 폴리펩티드 (및 CCPII-세린 프로테아제 폴리펩티드에 대한 음성 대조군으로서 티오레독신 폴리펩티드)의 단계 희석을 니트로셀룰로스 막에 스폿팅하였다. 스폿팅된 단백질의 양은, 5배 단계에서, 100 ng에서 6.4 pg의 범위에 있었다. 막을 TBS 중의 5% 탈지분유 (차단 버퍼)로 차단하였고 그 다음 차단 버퍼 중 (5.0　mM Ca++ 함유)의 1.0 μg/mL MASP-2 Fab2와 함께 배양하였다. 결합된 Fab2를 HRP-컨쥬게이션된 항-인간 Fab (AbD/Serotec; 1/10,000으로 희석됨) 및 ECL 검출 키트 (Amersham)를 사용하여 검출하였다. 하나의 막을 양성 대조군으로서 다클론성 토끼-항 인간 MASP-2 Ab와 함께 배양하였다. 이 경우에, 결합된 Ab를 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG (Dako; 1/2,000으로 희석됨)를 사용하여 검출하였다.
MASP-2 결합 검정:
ELISA 플레이트를 카보네이트 버퍼 (pH　9.0) 중의 1.0 μg/웰의 재조합 MASP-2A 또는 CUBI-II 폴리펩티드로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 웰을 TBS 중의 1% BSA로 차단하였고, 그 다음 MASP-2 Fab2의 단계 희석액을 5.0　mM Ca++을 함유G는 TBS에 추가하였다. 플레이트를 실온에서 한 시간 동안 배양하였다. TBS/tween/Ca++로 세 번 세척 후, TBS/Ca++에서 1/10,000으로 희석된 HRP-컨쥬게이션된 항-인간 Fab (AbD/Serotec)를 추가하였고 플레이트를 실온에서 추가로 한 시간 동안 배양하였다. 결합된 항체를 TMB 퍼옥시다제 기질 키트 (Biorad)를 사용하여 검출하였다.
결과:
Fab2의 다양한 MASP-2 폴리펩티드와의 반응성을 입증하는 도트 블롯 분석의 결과는 하기 표 14에서 제공된다. 표 14에서 제공된 수치는 대략 반최대 신호 강도를 제공하는데 필요한, 스폿팅된 단백질의 양을 지시한다. 나타난 바와 같이, 모든 폴리펩티드 (티오레독신 융합 파트너 단독을 제외하고)가 양성 대조군 Ab (다클론성 항-인간 MASP-2 혈청, 토끼에서 발생함)에 의해 인식되었다.
도트 블롯에서 다양한 재조합 래트 MASP-2 폴리펩티드와의 반응성
Fab2 항체 # MASP-2A CUBI-II CUBI/EGF-유사 CCPII-SP 티오레독신
40 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
41 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
11 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
49 0.16 ng NR NR >20 ng NR
52 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
57 0.032 ng NR NR NR NR
58 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
60 0.4 ng 0.4 ng NR NR NR
63 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
66 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
67 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
71 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
81 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
86 0.4 ng NR NR 10 ng NR
87 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
양성 대조군 <0.032 ng 0.16 ng 0.16 ng <0.032 ng NR
NR　=　반응 없음. 양성 대조군 항체는 다클론성 항-인간 MASP-2 혈청이며, 토끼에서 발생한다. Fab2 모두는 MASP-2A뿐만 아니라 MASP-2K와 반응하였다 (데이터 미도시). 대부분의 Fab2는 CCPII-SP 폴리펩티드를 인식했지만 N-말단 단편은 아니었다. 두 개 예외는 Fab2 #60 및 Fab2 #57이다. Fab2 #60은 MASP-2A 및 CUBI-II 단편을 인식하지만, CUBI/EGF-유사 폴리펩티드 또는 CCPII-SP 폴리펩티드를 인식하지 않으며, 그것이 CUBII의 에피토프에 결합하거나, 또는 CUBII 및 EGF-유사 도메인에 걸쳐있다는 것을 제안한다. Fab2 # 57은 MASP-2A를 인식하지만 테스트된 MASP-2 단편 중 어떤 것도 인식하지 않으며, 아미도 이 Fab2가 CCP1의 에피토프를 인식한다는 것을 지시한다. Fab2 #40 및 #49는 완전한 MASP-2A에만 결합하였다. ELISA 결합 검정에서, 약간 더 낮은 명백한 친화도로도 Fab2 #60은 또한 CUBI-II 폴리펩티드에 결합하였다 (데이터 미도시).
이 발견들은 MASP-2 단백질의 다수의 영역에 대한 독특한 차단 Fab2의 확인을 입증한다.
실시예 13
이 실시예는 실시예 11에서 설명된 바와 같이 확인된 대표적인 고-친화도 MASP-2 Fab2 항체의 약물동력학적 분석을 설명한다.
배경/근거:
실시예 11에서 설명된 바와 같이, 래트 렉틴 경로를 차단하는 고-친화도 항체를 확인하기 위해서, 래트 MASP-2 단백질을 이용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하였다 (panned). 이 라이브러리는 높은 면역학적 다양성을 제공하도록 설계되었고 전체 인간 면역글로불린 유전자 서열을 사용하여 구성되었다. 실시예 11에서 나타난 바와 같이, 대략 250개의 개개의 파지 클론이 래트 MASP-2 단백질에 높은 친화도로 결합한다는 것을 ELISA 스크리닝에 의해 확인하였다. 이 클론들의 시퀀싱은 50개의 독특한 MASP-2 항체-암호화 파지를 확인하였다. Fab2 단백질은 이 클론으로부터 발현되었으며, 정제되고 MASP-2 결합 친화도 및 렉틴 보체 경로 기능적 억제에 대하여 분석되었다.
실시예 11의 표 13에서 나타난 바와 같이, 기능적 차단 활성을 가진 17개의 MASP-2 Fab2를 이 분석의 결과로서 확인하였다 (차단 항체에 대하여 34% 적중률). Fab2에 의한 렉틴 보체 경로의 기능적 억제는 C4 침착의 수준에서 명백하였으며, 이것은 MASP-2에 의한 C4 분할의 직접적인 측정값이다. 중요하게, 억제는 C3 컨버타제 활성이 평가될 때 똑같이 분명했으며, 렉틴 보체 경로의 기능적 차단을 입증한다. 실시예 11에서 설명된 바와 같이 확인된 17개의 MASP-2 차단 Fab2는 10 nM 이하의 IC50 값으로 C3 컨버타제 형성을 억제한다. 확인된 17개의 Fab 중 8개는 나노 몰 이하의 범위의 IC50 값을 갖는다. 게다가, MASP-2 차단 Fab2 17개 모두는 렉틴 경로 C3 컨버타제 검정에서 C3 컨버타제 형성의 본질적으로 완전한 억제를 제공하였으며, 실시예 11의 표 13에서 요약된 바와 같다. 게다가, 표 13에서 나타난 17개의 차단 MASP-2 Fab2 각각은 C3b 생성을 강하게 억제하고 (>95%), 따라서 렉틴 경로 C3 컨버타제에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다.
래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전장 항체 이소타입 변이체는 Fab2 #11로부터 유래되었다. 이 실시예는 약물동력학적 파라미터에 대한 이 이소타입들의 생체 내 특성화를 설명한다.
방법:
실시예 11에서 설명된 바와 같이, 래트 MASP-2 단백질을 이용하여 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하였으며, 이것으로부터 Fab2 #11을 확인하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전장 항체 이소타입 변이체는 Fab2 #11로부터 유래되었다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전장 항체 이소타입은 다음과 같은 약물동력학적 파라미터에 대하여 생체 내에서 특성화되었다.
마우스의 생체 내 연구:
생체 내 혈장 렉틴 경로 활성에 대한 MASP-2 항체 투여의 효과를 조사하기 위해 마우스에서 약물동력학적 연구를 수행하였다. 이 연구에서, C4 침착을 마우스 MASP-2 MoAb (Fab2 #11로부터 유래된 마우스 IgG2a 전장 항체 이소타입)의 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 피하 (sc) 및 복강 내 (ip) 투여 후 다양한 시점에서 렉틴 경로 검정으로 생체 외에서 측정하였다.
도　29A는 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 렉틴 경로 특이적 C4b 침착을 그래프로 도시하며, 마우스 MASP-2 MoAb의 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 피하 투여 후 다양한 시점에서 마우스 (n=3 마우스/군)로부터 채취한 희석되지 않은 혈청 샘플에서 생체 외에서 측정된다. 항체 투여 전 수거된 마우스의 혈청 샘플은 음성 대조군의 역할을 하는 한편 (100% 활성), 같은 차단 MASP-2 항체의 100 nM으로 시험관 내 보충된 혈청은 양성 대조군으로서 사용되었다 (0% 활성).
도 29A에서 나타난 결과는 마우스 MASP-2 MoAb의 1.0 mg/kg 용량의 피하 투여 후 C4b 침착의 신속하고 완전한 억제를 입증한다. C4b 침착의 부분적 억제는 마우스 MASP-2 MoAb의 0.3 mg/kg 용량의 피하 투여 후 나타났다.
렉틴 경로 회복의 시간 과정은 마우스에서 0.6 mg/kg로 마우스 MASP-2 MoAb의 일회 복강 내 투여 후 3주 동안 이어졌다. 도 29B에서 나타난 바와 같이, 렉틴 경로 활성의 급격한 감소는 항체 투여에 이어서 복강 내 투여 후 약 7일 동안 지속된 완전한 렉틴 경로 억제 후 발생하였다. 렉틴 경로 활성의 느린 복구를 제2 주 및 제3 주 동안 관찰하였다. 마우스의 렉틴 경로는 MASP-2 MoAb 투여 후 17일까지 완벽하게 복구되었다.
이 결과들은 Fab2 #11로부터 유래된 마우스 MASP-2 Moab가 전신으로 전달될 때 용량-반응성 방식으로 마우스의 렉틴 경로를 억제한다는 것을 입증한다.
실시예 14
이 실시예는, 파지 디스플레이를 사용하여, MASP-2에 결합하고 렉틴-매개된 보체 활성화 (LEA-2)를 억제하는 한편, 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존적) 경로 구성요소를 온전하게 두는 완전한 인간 scFv 항체의 확인을 설명한다.
개요:
완전한 인간, 고-친화도 MASP-2 항체를 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인하였다. 항체의 가변 경쇄 및 중쇄 단편을 scFV 포맷 및 전장 IgG 포맷 둘 다에서 분리하였다. 인간 MASP-2 항체는 렉틴 경로-매개된 대체 보체 경로 활성화와 관련된 세포의 부상을 억제하는데 유용하지만, 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존적) 경로 구성요소를 온전하게 둔다. 일부 구체예에서, 개체 MASP-2 억제 항체는 다음 특징을 갖는다: (a) 인간 MASP-2에 대한 높은 친화도 (예를 들어, 10 nM 이하의 KD), 및 (b) 30 nM 이하의 IC50으로 90% 인간 혈청에서 MASP-2-의존적 보체 활성의 억제.
방법:
전장 촉매 반응에 의해 비활성 MASP-2의 발현:
선도 서열을 가진 인간 MASP-2 폴리펩티드 (SEQ ID NO:5)를 암호화하는, 인간 MASP-2의 전장 cDNA 서열 (SEQ ID NO:4)를 포유동물 발현 벡터 pCI-Neo (Promega)로 서브클로닝하였으며, 이것은 CMV 인핸서(enhancer)/프로모터(promoter) 영역의 제어 하에 진핵 생물 발현을 구동한다 (Kaufman R.J.　et　al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)에서 설명됨). 촉매 반응에 의한 비활성 인간 MASP-2A 단백질을 생성하기 위해, 부위-지시된 돌연변이 유발을 제US2007/0172483호에서 설명된 바와 같이 수행하였으며, 본원에서 참고로 포함된다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 후 정제하였고 밴드 조제물 및 단일 아데노신 중복을 표준 테일링(tailing) 과정을 사용하여 생성하였다. 그 다음 아데노신-테일링된 MASP-2A를 pGEM-T 이지 벡터 (easy vector)로 클로닝하였고 대장균으로 형질전환시켰다. 인간 MASP-2A를 포유동물 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo로 더 서브클로닝하였다.
상기 설명된 MASP-2A 발현 구조를 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 DXB1 세포로 트랜스펙션하였다 (Maniatis　et　al., 1989). 조제물이 다른 혈청 단백질로 오염되지 않았다는 것을 보장하기 위해 MASP-2A를 혈청이 없는 배지에서 생산하였다. 배지를 이틀마다 융합성 세포로부터 수거하였다 (총 4회). 재조합 MASP-2A의 수준은 대략 배양 배지의 1.5 mg/리터를 평균으로 하였다. MASP-2A (상기 설명된 Ser-Ala 돌연변이)를 MBP-A-아가로스 컬럼에서 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
패닝/scFv 전환 및 필터 스크리닝에 의해 확인된 ScFv 후보 클론에 대한 MASP-2A ELISA
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열의 파지 디스플레이 라이브러리는 인간 MASP-2 단백질에 대하여 고-친화도 scFv 항체를 확인하기 위해 항원 패닝에 이어서 자동화된 항체 스크리닝 및 선택을 받았다. HIS-태그된 또는 비오틴-태그된 MASP-2A에 대한 scFv 파지 라이브러리의 패닝의 세 라운드를 수행하였다. 패닝의 세 번째 라운드를 먼저 MBL 및 그 다음 TEA (알칼린)으로 용출하였다. 표적 MASP-2A에 대한 scFv 단편을 나타내는 파지의 특이적 풍부함을 관찰하기 위해, 고정된 MASP-2A에 대한 다클론성 파지 ELISA를 수행하였다. 패닝 라운드 3의 scFv 유전자를 pHOG 발현 벡터로 클로닝하였고 MASP-2A에 대한 특이적 클론을 찾기 위해 소규모 필터 스크리닝에서 실행하였다.
패닝의 세 번째 라운드의 scFv 단편을 암호화하는 플라스미드를 함유하는 박테리아 클론을 선발하였고, 니트로셀룰로스 막에 그리드하였그며 (grid) 마스터 플레이트(master plate)를 생산하기 위해 비-유발성 배지에서 하룻밤 동안 키웠다. 총 18,000개의 콜로니를 선발하였고 세 번째 패닝 라운드로부터, 경쟁적 용출로부터 절반 및 이후의 TEA 용출로부터 절반을 분석하였다. MASP-2A에 대한 scFv 파지미드(phagemid) 라이브러리의 패닝 후, 이어서 scFv 전환 및 필터 스크리닝은 137개의 양성 클론을 수득하였다. 108/137 클론은 MASP-2 결합에 대한 ELISA 검정에서 양성이었으며 (데이터 미도시), 이것들 중 45개의 클론을 정상 인간 혈청에서 MASP-2 활성을 차단하는 능력에 대하여 더 분석하였다.
렉틴 경로 C3 컨버타제의 형성의 억제를 측정하는 검정
렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 측정하는 기능적 검정을 MASP-2 scFv 후보 클론의 "차단 활성"을 평가하기 위해 사용하였다. MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 두 개의 단백질 구성요소 (C4b, C2a)를 생성하기 위해 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 MASP-2 scFv (즉, 차단 MASP-2 scFv)는 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데 노보 형성을 억제할 것이다. C3은 그것의 구조의 일부로서 특이한 및 고도로 반응성인 티오에스테르 기를 함유한다. 이 검정에서 C3 컨버타제에 의한 C3의 분할에서, C3b에서 티오에스테르 기는 에스테르 또는 아미드 결합을 통한 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 거대 분자에서 히드록실 또는 아미노기로 공유 결합을 형성할 수 있으며, 따라서 ELISA 검정에서 C3b의 검출을 용이하게 한다.
효모 만난은 렉틴 경로의 알려진 활성화제이다. C3 컨버타제의 형성을 측정하기 위한 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 렉틴 경로를 활성화하기 위해 희석된 인간 혈청과 함께 배양하였다. 그 다음 웰을 세척하였고 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 C3b에 대하여 검정하였다. 이 검정에서 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데 노보 형성의 직접적인 반영이다. 선택된 농도의 MASP-2 scFv 클론을 이 검정에서 C3 컨버타제 형성 및 결과적인 C3b 생성을 억제하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다.
방법:
상기 설명된 바와 같이 확인된 45개의 후보 클론을 발현시켰고, 정제하였고 같은 스톡(stock) 농도로 희석하였으며, 이것은 모든 클론이 같은 양의 버퍼를 갖는다는 것을 보장하기 위해 다시 Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 버퍼 (4.0mM 바비탈, 141mM NaCl, 1.0mM MgCl2, 2.0mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에서 희석하였다. scFv 클론을 2 μg/mL의 농도에서 3배수로 각각 테스트하였다. 양성 대조군은 OMS100 Fab2였고 0.4 μg/mL에서 테스트하였다. scFv/IgG 클론의 존재시 및 부재시 C3c 형성을 관찰하였다.
만난을 50mM 카보네이트 버퍼 (15mM Na2CO3 + 35mM NaHCO3 + 1.5mM NaN3), pH 9.5에서 20 μg/mL (1 μg/웰)의 농도로 희석하였고 ELISA 플레이트에서 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 그 다음날, 만난-코팅된 플레이트를 200　μl PBS로 3번 세척하였다. 그 다음에 100 μl의 1% HSA 차단 용액을 웰에 추가하였고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 200 μl PBS로 3번 세척하였고, 샘플이 추가될 때까지 얼음 위에서 200 μl PBS와 함께 저장하였다.
정상 인간 혈청을 CaMgGVB 버퍼에서 0.5%로 희석하였고, scFv 클론 또는 OMS100 Fab2 양성 대조군을 이 버퍼에 0.01 μg/mL; 1 μg/mL (OMS100 대조군만) 및 10 μg/mL로 3배수로 추가하였고 차단된 ELISA 플레이트에 추가 전에 얼음 위에서 45분 동안 사전 배양하였다. 37℃에서 한 시간 동안 배양에 의해 반응을 시작하였고 플레이트를 얼음 수조로 옮김으로써 중단하였다. C3b 침착을 토끼 α-마우스 C3c 항체에 이어서 염소 α-토끼 HRP로 검출하였다. 음성 대조군은 항체가 없는 버퍼이고 (항체 없음 = 최대 C3b 침착), 양성 대조군은 EDTA가 들어있는 버퍼이다 (C3b 침착 없음). 배경을 웰은 만난이 없다는 것을 제외한 같은 검정을 수행함으로써 결정하였다. 만난이 없는 플레이트에 대한 배경 신호를 만난-함유 웰의 신호에서 뺐다. 컷-오프 기준을 무관한 scFv 클론 (VZV) 및 버퍼 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.
결과: 컷-오프 기준에 기초하여, 총 13개의 클론이 MASP-2의 활성을 차단하는 것으로 발견되었다. > 50% 경로 저해를 생산하는 모두 13개의 클론을 선택하였고 시퀀싱하였으며, 10개의 독특한 클론을 수득하였다. 모두 10개의 클론이 같은 경쇄 하위등급, λ3, 하지만 세 개의 다른 중쇄 하위등급, VH2, VH3 및 VH6을 갖는 것으로 발견되었다. 기능적 검정에서, 10개의 후보 scFv 클론 중 5개는 0.5% 인간 혈청을 사용하여 25 nM 표적 기준보다 낮은 IC50 nM 값을 제공하였다.
개선된 효능을 가진 항체를 확인하기 위해, 상기 설명된 바와 같이 확인된 세 개의 모체 scFv 클론은 경쇄 셔플링(shuffling)을 받았다. 이 과정은 6명의 건강한 제공자로부터 유래된 나이브, 인간 람다(lambda) 경쇄 (VL)의 라이브러리와 쌍을 이룬 각각의 모체 클론의 VH로 구성되는 조합 라이브러리의 생성을 수반하였다. 그 다음 이 라이브러리를 개선된 결합 친화도 및/또는 기능성으로 scFv 클론에 대하여 스크리닝하였다.
선도 딸 클론 및 그것들의 각각의 모체 클론의 IC50 (nM)에서 기능적 효능의 비교 (모두 scFv 포맷)
scFv 클론 1% 인간 혈청
C3 검정
(IC 50 nM) 		90% 인간 혈청
C3 검정
(IC 50 nM) 		90% 인간 혈청
C4 검정
(IC 50 nM)
17D20mc 38 nd nd
17D20m_d3521N11 26 >1000 140
17N16mc 68 nd nd
17N16m_d17N9 48 15 230
상기 표 15에서 나타나고, 하기 표 16A-F에서 나열된 모체 클론 및 딸 클론에 대한 중쇄 가변 영역 (VH) 서열이 하기 제공된다. 카바트(Kabat) CDR (31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3))은 볼드체이고; 쵸티아(Chothia) CDR (26-32 (H1), 52-56 (H2) 및 95-101 (H3))는 밑줄 그어져 있다.
17D20_35VH-21N11VL 중쇄 가변 영역 (VH) (SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:14에 의해 암호화됨)
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS RG KMGVSWIRQPPGKALEWLA HIFSS DEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTAT YYCARIR RGGIDYWGQGTLVTVSS
d17N9 중쇄 가변 영역 (VH) (SEQ ID NO:16)
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS ST SAAWNWIRQSPSRGLEWLG RTYYR SKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDT AVYYCAR DPFGVHDIWGQGTMVTVSS
중쇄 가변 영역
Figure pat00001
하기 표 17A-F에서 나열된 모체 클론 및 딸 클론에 대한 경쇄 가변 영역 (VL) 서열이 하기 제공된다.
카바트 CDR (24-34 (L1); 50-56 (L2); 및 89-97 (L3))은 볼드체이고; 및 쵸티아 CDR (24-34 (L1); 50-56 (L2) 및 89-97 (L3))은 밑줄 그어져 있다. 이 영역들은 카바트 또는 쵸티아 시스템에 의한 넘버링의 여부가 같다.
17D20m_d3521N11 경쇄 가변 영역 (VL) (SEQ ID NO:17)
QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCS GEKLGDKYAYW YQQKPGQSPVLVMYQ DKQRPSG IPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQ AWDSSTAVF GGGTKLTVL
17N16m_d17N9 경쇄 가변 영역 (VL) (SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:18에 의해 암호화됨)
SYELIQPPSVSVAPGQTATITCA GDNLGKKRVHW YQQRPGQAPVLVIYD DSDRPSG IPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQ VWDIATDHV VFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE
Figure pat00002
높은 친화도로 인간 MASP-2에 결합하고 기능적 보체 활성을 차단하는 능력을 갖는 것으로 입증된 MASP-2 항체 OMS100 및 MoAb_d3521N11VL을 도트 블롯 분석에 의해 에피토프 결합에 관하여 분석하였다. 결과는 d3521N11 및 OMS100 항체가 MASP-2에 고도로 특이적이고 MASP-1/3에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 항체는 MAp19 또는 MASP-2의 CCP1 도메인을 함유하지 않은 MASP-2 단편에도 결합하지 않으며, 결합 부위가 CCP1을 포함한다는 결론으로 이어진다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되는 MASP-2 억제제는 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:3)로 구성된 폴리펩티드에 결합하는 인간 항체를 포함하며, 항체는 다음을 포함한다:
I) a) i) SEQ ID NO:21의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 및 ii) SEQ ID NO:21의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 iii) SEQ ID NO:21의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
b) i) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 및 ii) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 iii) SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
II) 상기 중쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에서 최대 결합된 총 6개의 아미노산 치환 및 상기 경쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에서 최대 결합된 총 6개의 아미노산 치환을 제외하면, 상기 가변 도메인과 동일한 이것의 변이체로서, 항체 또는 이것의 변이체가 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 변이체.
실시예 15
이 실시예는 변형된 DT40 세포주, DTLacO을 포함하는 시험관 내 시스템을 사용하는 MASP-1 및 MASP-3 단클론성 항체의 생성을 설명한다.
배경/근거:
인간 MASP-1 및 MASP-3에 대한 항체를 특정 폴리펩티드의 다양화의 가역적 유발을 허용하는 변형된 DT40 세포주, DTLacO을 포함하는 시험관 내 시스템을 사용하여 생성하였으며, 제WO2009029315호 및 제US2010093033호에서 더 설명된 바와 같다. DT40은 배양시 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 (Ig) 유전자를 구성적으로 돌연변이로 만드는 것으로 알려져 있는 닭 B 세포주이다. 다른 B 세포와 같이, 이 구성적 돌연변이 유발은 Ig 유전자의 V 영역 및, 따라서, 발현된 항체 분자의 CDR에 대한 돌연변이를 표적화한다. DT40 세포에서 구성적 돌연변이 유발은 제공자 서열로서 각 기능적 V 영역의 업스트림에 위치하는 비-기능적 V 유전자 세그먼트 (가짜-V 유전자; ψV)를 사용하는 유전자 전환에 의해 일어난다. ψV 영역의 결실은 유전자 전환에서 체세포 초돌연변이로의 다양화의 메커니즘, 보통 인간 B 세포에서 관찰되는 메커니즘에서 스위치(switch)를 유발하는 것으로 이전에 나타났다. DT40 닭 림프종 B 세포주는 생체 외에서 항체 진화를 위한 유망한 시작점인 것으로 나타났다 (Cumbers, S.J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005)). DT40 세포는 배양물에서, 8-10시간의 배증 시간(doubling time)으로, 왕성하게 증식하고, 그것들은 매우 효과적인 상동성 유전자 표적화를 지지한다 (Buerstedde, J.M. et al. Embo J 9, 921-927 (1990)). DT40 세포는 다양화, 유전자 전환 및 체세포 초돌연변이를 위한 두 개의 별개의 생리학적 경로에 접속할 수 있다는 것을 고려해서 엄청난 잠재적 V 영역 서열 다양성을 지시하며, 이것들은 각각 주형 및 비주형 돌연변이를 생성한다 (Maizels, N. Annu Rev Genet 39, 23-46 (2005)). 다양화된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 (Ig)은 세포-표면 표시된 IgM의 형태로 발현된다. 표면 IgM은 IgG 분자와 구조적으로 유사한 2가 형태를 갖는다. 특정 항원에 대한 특이성을 갖는 IgM을 나타내는 세포는 고정된 가용성 또는 막 표시된 버젼의 항원에 결합함으로써 분리될 수 있다. 하지만, 항체 진화를 위한 DT40 세포의 유용성은 실제로는 제한되었는데 다른 형질전환된 B 세포주에서와 마찬가지로 다양화가 1% 미만의 생리학적 속도로 발생하기 때문이다.
이 실시예에서 사용된 시스템에서, 제WO2009029315호 및 제US2010093033호에서 설명된 바와 같이, DT40 세포를 돌연변이 유발에 기여하기 위해 추가의 유전적 변형에 대한 능력 또는 유전자 전환 및 체세포 초돌연변이 둘 다에 대한 가능성을 희생시키지 않고 Ig 유전자 다양화의 속도를 가속화하도록 설계하였다. DT40에 대한 두 개의 주요 변형은 다양화의 속도, 및, 결과적으로, 우리의 세포 라이브러리에서 결합 특이성의 복합성을 증가시키도록 만들어졌다.
먼저, Ig 유전자 다양화를 강한 대장균 락토스 오퍼레이터(operator)/리프레서(repressor) 조절 네트워크의 제어 하에 두었다. 강한 대장균 락토스 오퍼레이터 (PolyLacO)의 대략 100개의 폴리머화 반복구간으로 구성된 멀티머를 상동 유전자 표적화에 의해 재배열되고 발현된 Igλ 및 IgH 유전자의 업스트림에 삽입하였다. 그 다음 락토스 리프레서에 융합된 조절 인자는 LacO 조절 요소에 매어져서 다양화를 조절할 수 있으며, 오퍼레이터 DNA에 대한 락토스 리프레서의 고 친화도 (kD=10-14 M)의 이점을 취한다. DT40 PolyLacO-λR 세포는 어떤 설계 전에도 모체 DT 세포에 비해 Ig 유전자 다양화 속도의 5배 증가를 나타냈으며, 이것에서 PolyLacO는 Igλ에만 통합된다 (Cummings, W.J. et al. PLoS Biol 5, e246 (2007)). 다양화는 Igλ 및 IgH 유전자 둘 다로 표적화된 PolyLacO ("DTLacO")를 운반하도록 설계된 세포에서 더 올라갔다. DTLacO 세포는 모체 DT40 PolyLacO-λR LacI-HP1 라인의 2.8%의 특징에 비해 2.5배 내지 9.2배 올라간 다양화 속도를 갖는 것으로 입증되었다. 따라서, 따라서, PolyLacO 요소를 중쇄 및 경쇄 유전자로 표적화하는 것은 다양성을 DT40 모체 세포주에 비해 21.7배 가속화하였다. 조절 인자를 Ig 자리에 매는 것은 돌연변이 유발의 빈도를 변화시킬 뿐만 아니라, 독특한 서열 변화의 더 큰 컬렉션(collection)을 생성하는 돌연변이 유발의 경로를 변화시킬 수 있다 (Cummings et al. 2007; Cummings et al. 2008). 두 번째로, 매어져 있는 인자-가속화된 Ig 유전자 다양화에 대한 서열 시작점의 다양한 컬렉션을 생성하였다. 이 다양한 서열 시작점을 2개월령 병아리로부터 분리된, 재배열된 Ig 중쇄 가변 영역을 중쇄 자리로 표적화함으로써 DTLacO에 추가하였다. 이 중쇄 가변 영역들의 추가는 항체 다양화에 대한 107 새로운 시작점의 레퍼토리를 생성하였다. 이 새로운 시작점들을 DTLacO 세포주로 만드는 것은 특정 표적에 결합하는 클론의 확인, 및 그 다음 매어져 있는 인자에 의한 신속한 친화도 성숙화를 허용한다. 친화도 성숙화 후, 전장, 재조합 키메라 IgG는 성숙화되고, 재배열된 중쇄 및 경쇄 가변 서열 (닭 프레임워크 영역 및 상보성 결정 영역 또는 CDR로 구성된 VH 및 VL)을 인간 IgG1 및 람다 불변 영역을 함유하는 발현 벡터로 클로닝함으로써 만들어진다. 이 재조합 mAb는 시험관 내 및 생체 내 적용에 적합하고, 그것들은 인간화에 대한 시작점의 역할을 한다.
방법:
MASP-1 및 MASP-3 항원 결합에 대한 선택
처음 선택을 유전자 표적화에 의해 다양화된 DTLacO 집단을 인간 MASP-1 및 MASP-3 항원과 복합체를 형성하는 비드(bead)에 결합시킴으로써 수행하였고 다음에 형광-표지된 가용성 항원을 사용하여 FACS에 의한 선택을 수행하였다 (Cumbers, S.J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005). MASP-1 및 MASP-3 사이에서 공유되는 알파 사슬에서 보존된 아미노산 서열 (도 5에서 나타남), 및 별개의 베타 사슬 서열 (도 6에서 나타남) 때문에, MASP-1 및 MASP-3에 대한 바인더(binder)에 대하여 별개의, 유사한 스크리닝을 수행하여 MASP-1 특이적 mAb, MASP-3 특이적 mAb 및 또한 MASP-1 및 MASP-3 둘 다에 결합할 수 있는 (이중-특이적) mAb를 확인하였다. 두 개 형태의 항원을 바인더를 선택하고 스크리닝하는데 사용하였다. 먼저, Fc 도메인에 융합된 재조합 MASP-1 또는 MASP-3, 전장 또는 단편은 Dynal 자성 Protein G 비드에 결합되었거나 또는 PECy5-표지된 항-인간 IgG(Fc) 2차 항체를 사용하는 FACS-기반 선택에 사용되었다. 대안으로, MASP-1 또는 MASP-3 단백질의 재조합 버젼을 Dylight 가루로 직접적으로 표지하였고 선택 및 스크리닝에 사용하였다.
결합 및 친화도
재조합 항체를 PCR-증폭된 V 영역을 293F 세포에서 인간 IgG1의 발현을 지지하는 벡터로 클로닝함으로써 생성하였다 (Yabuki et al., PLoS ONE, 7(4):e36032 (2012)). 포화 결합 동역학을 다양한 농도의 형광-표지된 가용성 항원으로 항체 결합 MASP-1 또는 MASP-3을 발현하는 DTLacO 세포를 염색함으로써 결정하였다. MASP-3-의존적 C3b 침착 및 MASP-3-의존적 인자 D 분할을 포함하는 MASP-3 특이적 활성에 대한 기능적 검정을 각각 실시예 17 및 18에서 설명된 바와 같이 수행하였다. MASP-1-특이적 활성, 즉, MASP-1-의존적 C3b 침착에 대한 기능적 검정을 하기 설명된 바와 같이 수행하였다.
결과:
많은 MASP-1 및 MASP-3 결합 항체를 상기 설명된 방법을 사용하여 생성하였다. FACS 분석에 의해 입증된 바와 같이, 결합을 대표적인 클론 M3J5 및 M3M1에 대하여 설명하였으며, 이것을 MASP-3 바인더에 대한 스크리닝에서 분리하였다.
도 30A는 DTLacO 클론 M3J5에 대한 MASP-3 항원/항체 결합의 FACS 히스토그램이다. 도 30B는 DTLacO 클론 M3M1에 대한 MASP-3 항원/항체 결합의 FACS 히스토그램이다. 도 30A 및 30B에서 회색으로 채워진 곡선은 IgG1-염색된 음성 대조군이고, 두꺼운 검은색 곡선은 MASP-3-염색이다.
도 31은 MASP-3 항원에 대한 클론 M3J5 (클론 5)의 포화 결합 곡선을 그래프로 도시한다. 도 31에서 나타난 바와 같이, MASP-3에 대한 M3J5 항체의 분명한 결합 친화도는 약 31 nM이다.
확인된 클론의 서열 분석을 표준 방법을 사용하여 수행하였다. 모든 클론을 일반적인 (DT40) VH 및 VL 서열 및 서로와 비교하였다. 상기 언급된 두 개의 클론, M3J5 및 M3M1에 대한 서열은 추가적인 대표적인 클론, D14 및 1E1로의 정렬에서 제공되며, 이것은 각각 MASP-1 및 MASP-3의 CCP1-CCP2-SP 단편에 대한 스크리닝에서 확인되었다. D14 및 1E10은 MASP-1 및 MASP-3 둘 다에 일반적인 영역에 결합한다.
도 32A는 닭 DT40 VH 서열에 대한 M3J5, M3M1, D14 및 1E10의 VH 영역의 아미노산 서열 정렬이다.
도 32B는 닭 DT40 VL 서열에 대한 M3J5, M3M1, D14 및 1E10의 VL 영역의 아미노산 서열 정렬이다.
각 클론의 VH 및 VL 아미노산 서열이 하기 제공된다.
중쇄 가변 영역 (VH) 서열
도 32A는 모체 DTLacO (SEQ ID NO:24), MASP-3-결합 클론 M3J5 (SEQ ID NO:25), 및 M3M1 (SEQ ID NO:26), 및 MASP-1/MASP-3 이중 결합 클론 D14 (SEQ ID NO:30), 및 1E10에 대한 중쇄 가변 영역 (VH) 서열의 아미노산 정렬을 나타낸다.
하기 VH 서열에서 카바트 CDR은 다음 아미노산 위치에 자리한다: H1:aa 31-35; H2:aa 50-62; 및 H3:aa 95-102.
하기 VH 서열에서 쵸티아 CDR은 다음 아미노산 위치에 자리한다: H1:aa 26-32; H2: aa 52-56; 및 H3: aa 95-101.
모체 DTLacO VH (SEQ ID NO:24)
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSNAMGWVRQAPGKGLEWVAGIDDDGSGTRYAPAVKGRATISRDNGQSTLRLQLNNLRAEDTGTYYCTKCAYSSGCDYEGGYIDAWGHGTEVIVSS
클론 M3J5 VH: (SEQ ID NO:25)
AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLEYVAGIRSDGSFTLYATAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCTRSGNVGDIDAWGHGTEVIVSS
클론 M3M1 VH: (SEQ ID NO:26)
AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFDFSSYQMNWIRQAPGKGLEFVAAINRFGNSTGHGAAVKGRVTISRDDGQSTVRLQLSNLRAEDTATYYCAKGVYGYCGSYSCCGVDTIDAWGHGTEVIVSS
클론 D14 VH: (SEQ ID NO:30)
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAGIYKSGAGTNYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKTTGSGCSSGYRAEYIDAWGHGTEVIVSS
클론 1E10 VH: (SEQ ID NO:32)
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYDMVWVRQAPGKGLEFVAGISRNDGRYTEYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCARDAGGSAYWFDAGQIDAWGHGTEVIVSS
경쇄 가변 영역 (VL) 서열
도 32B는 모체 DTLacO (SEQ ID NO:27) 및 MASP-3-결합 클론 M3J5 (SEQ ID NO:28), 및 M3M1 (SEQ ID NO:29), 및 MASP-1/MASP-3 이중 결합 클론 D14 (SEQ ID NO:31) 및 1E10 (SEQ ID NO:33)에 대한 경쇄 가변 영역 (VL) 서열의 아미노산 정렬을 나타낸다.
모체 DTLacO VL (SEQ ID NO:27):
ALTQPASVSANLGGTVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKSPGSAPVTVIYDNDKRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL
클론 M3J5 VL (SEQ ID NO:28):
ALTQPASVSANPGETVKITCSGGYSGYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL
클론 M3M1 VL (SEQ ID NO:29):
ALTQPASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL
클론 D14 VL: (SEQ ID NO:31)
ALTQPASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL
클론 1E10 VL: (SEQ ID NO:33)
ALTQPASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL
LEA-2 (MASP-2-의존적) 기능적 검정
MASP-1은 MASP-2를 활성화시키는 그것의 능력을 통해 LEA-2에 기여한다 (도 1 참조). Wieslab® 보체 System Screen MBL 검정 (Euro Diagnostica, Malmo, Sweden)은 LEA-2-의존적 활성화 (즉, 전통적 렉틴 경로 활성)을 분리하는 조건 하에서 C5b-C9 침착을 측정한다. 검정을 제조사의 지시에 따라 최종 농도 400 nM으로 테스트된 대표적인 클론 1E10으로 수행하였다.
도 33은 검정 키트, 뿐만 아니라 이소타입 대조군 항체와 함께 제공된 양성 혈청과 비교하여 mAb 1E10의 억제 활성을 나타내는 막대 그래프이다. 도 33에서 나타난 바와 같이, mAb 1E10은 LEA-2-의존적 활성화의 부분적 억제 (MASP-2의 MASP-1-의존적 활성화의 억제를 통해)를 입증하는 반면에, 이소타입 대조군 항체는 아니다. DTLacO 시스템에서 매어져 있는 인자를 사용하여 MASP-1 결합에 대한 이 항체의 지속적인 친화도 성숙화에 의한 더 강한 억제가 달성되어야 한다.
대표적인 mAb에 대한 LEA-1 (MASP-3-의존적) Function Assay는 하기 실시예 17 및 18에서 설명된다.
결과의 요약:
상기 결과는 DTLacO 플랫폼(platform)은 LEA-1 (하기 실시예 17 및 18에서 나타난 바와 같음) 및 LEA-2 (이 실시예에서 나타난 바와 같음)에 대한 억제 속성을 갖는 MASP-1 및 MASP-3 단클론성 항체의 신속한 생체 외 발견을 허용한다는 것을 나타낸다.
실시예 16
이 실시예는 MASP-1 및 MASP-2의 폴리펩티드 억제자의 생성을 설명한다.
근거:
각각 SGMI-1 및 SGMI-2로 불리는 MASP-1 및 MASP-2의 특이적 억제자의 생성은 Heja et al., J Biol Chem 287:20290 (2012) 및 Heja et al., PNAS 109:10498 (2012)에서 설명되며, 이것들 중 각각은 본원에서 참고로 포함된다. SGMI-1 및 SGMI-2는 각각 프로테아제 결합 루프의 8개의 위치 중 6개가 완전히 무작위로 추출된 사막 메뚜기(Schistocerca gregaria) 프로테아제 억제자 2의 변이체의 파지 라이브러리로부터 선택된 36개의 아미노산 펩티드이다. 그 다음의 시험관 내 진화는 한 자릿수의 nM KI 값으로 단일-특이적 억제자를 수득하였다 (Heja et al., J. Biol. Chem. 287:20290, 2012). 구조 연구는 최적화된 프로테아제 결합 루프가 두 개의 억제자의 특이성을 정의하는 1차 결합 부위를 형성한다는 것을 나타냈다. 연장된 2차 및 내부 결합 영역의 아미노산 서열은 두 개의 억제자에 공통된 것이며 접촉 인터페이스(interface)에 기여한다 (Heja et al., 2012. J. Biol. Chem. 287:20290). 기계론적으로, SGMI-1 및 SGMI-2 둘 다는 고전적 경로 또는 대체 경로에 영향을 미치지 않고 보체 활성화의 렉틴 경로를 차단한다 (Heja et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498).
SGMI-1 및 SGMI-2 억제자의 아미노산 서열이 하기 제시된다:
SGMI-1-전장: LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYQ (SEQ ID NO:34)
SGMI-2-전장: LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ (SEQ ID NO:35)
SGMI-1 및 SGMI-2는 각각 MASP-1 및 MASP-2의 고도로 특이적인 억제자이다. 하지만, 펩티드로서 그것들은 생물학적 연구에서의 사용에 대하여 제한된 가능성을 갖는다. 이 제한들을 해결하기 위해, 발명자들은 이 생물학적 활성 펩티드 아미노산 서열들을 인간 IgG1 Fc 영역의 아미노 말단에 붙여넣어서 Fc-융합 단백질을 생성하였다.
방법:
SGMI-IgG1 Fc 융합 단백질을 발현하기 위해, SGMI-1 (SEQ ID NO:34) 및 SGMI-2 (SEQ ID NO:35) 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 합성하였고 (DNA 2.0) IL-2 신호 서열 및 인간 IgG1 Fc 영역 (SEQ ID NO:36)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 사이에서 발현 벡터 pFUSE-hIgG1-Fc2 (InvivoGen)로 삽입하였다. 플렉시블 (flexible) 폴리펩티드 결합자 (예를 들어, SEQ ID NO:37 또는 SEQ ID NO:38)는 SGMI 펩티드 및 IgG1 Fc 영역 사이에 포함되었다.
플렉시블 폴리펩티드 결합자 서열:
GTGGGSGSSSRS (SEQ ID NO:37)
GTGGGSGSSS (SEQ ID NO:38)
결과의 구조는 다음과 같이 설명된다:
인간 IL-2 신호 서열, SGMI-1, 결합자 및 인간 IgG1-Fc (pFUSE-SGMI-1Fc)을 포함하는 폴리펩티드 융합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:39로 제시되며, 이것은 SGMI-1 (밑줄 그어짐), 결합자 영역 (이탤릭체) 및 인간 IgG1-Fc (함께 "SGMI-1Fc"로 불림)를 포함하는 성숙한 폴리펩티드 융합체를 암호화하며, 이것은 SEQ ID NO:40로 제시된다.
SEQ ID NO:40
LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYQGTGGGSGSSSRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
인간 IL-2 신호 서열, SGMI-2, 결합자 및 인간 IgG1-Fc (pFUSE-SGMI-2Fc)을 포함하는 폴리펩티드 융합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:41로 제시되며, 이것은 SGMI-2 (밑줄 그어짐), 결합자 영역 (이탤릭체) 및 인간 IgG1-Fc (함께 "SGMI-2Fc"로 불림)를 포함하는 성숙한 폴리펩티드 융합체를 암호화하며, 이것은 SEQ ID NO:42로 제시된다:
SEQ ID NO:42
LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQGTGGGSGSSSRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
재조합 단백질의 생산:
Freestyle 293-F 또는 Expi293F 세포 (Invitrogen)를 공급자의 프로토콜에 따라 두 개의 발현 플라스미드 (pFUSE-SGMI-1Fc (SEQ ID NO:39) 및 pFUSE-SGMI-2Fc (SEQ ID NO:41)) 중 하나로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 37℃에서 배양 4일 후, 배양 배지를 수확하였다. Fc-융합 단백질을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
렉틴 경로의 활성화를 측정하는 검정
SGMI-1Fc 및 SGMI-2Fc 융합 단백질을 만난-코팅된 96-웰 플레이트에서 1% 혈청의 C3b의 침착을 억제하는 능력에 대하여 테스트하였으며, 이것은 렉틴 경로 활성의 측정값이다. SGMI-1Fc 및 SGMI-2Fc를 만난 (2 μg/웰)으로 코팅된 웰에 추가 전 얼음 위에서 한 시간 동안 1% 정상 인간 혈청과 함께 사전 배양하였다. C3b 침착을 Schwaeble et al. PNAS 108:7523, 2011에서 설명된 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다.
도 34는 0.15 내지 1000 nM의 농도 범위에 걸쳐 1% 정상 인간 혈청 플러스 이소타입 대조군, SGMI-1Fc 또는 SGMI-2Fc의 수준을 그래프로 도시한다. 도 34에서 나타난 바와 같이, SGMI-1Fc 및 SGMI-2Fc 둘 다는 만난-코팅된 ELISA 웰에서 정상 혈청의 C3b 침착을 억제하였으며, 각각 대략 27nM 및 300nM의 IC50 값을 갖는다.
이 결과들은 SGMI 펩티드의 MASP-1 및 MASP-2 억제 기능이 SGMI-1Fc 및 SGMI-2Fc 융합 단백질에서 보유된다는 것을 입증한다.
실시예 17
스타필로코쿠스 아우레우스로 3MC 혈청에서 보체 경로의 분석
배경/근거:
MASP-3은 정상 인간 혈청의 존재시 또는 부재시 비-고정된 체액-단계 만난, 치모산 A 또는 N-아세틸 시스테인에 노출을 통해 활성화되지 않는다는 것이 결정되었다. 하지만 재조합 및 고유한 MASP-3이 정상 인간 혈청 (NHS) 또는 열-불활성화된 인간 혈청 (HIS)의 존재시 및 부재시 열-불활성화된 스타필로코쿠스 아우레우스의 표면에서 활성화된다는 것이 결정되었다 (데이터 미도시). 또한 C3b 침착이 정상 인간 혈청의 존재시 스타필로코쿠스 아우레우스의 표면에서 발생하고, 침착은 유동 세포 분석기를 사용하여 관찰될 수 있다는 것이 결정되었다. 그러므로, 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 대체 경로 (AP) 반응을 MASP-3의 LEA-1에 대한 기여를 평가하는 수단으로서 이 실시예에서 설명된 바와 같이 측정하였다.
방법:
재조합 MASP-3:
전장 재조합 인간 MASP-3, MASP-3의 절단된 세린 프로테아제 (SP) 활성 버젼 (CCP1-CCP2-SP), 및 MASP-3의 SP-불활성화된 형태 (S679A)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 pTriEx7 포유동물 발현 벡터 (Invivogen)로 클로닝하였다. 결과의 발현 구조는 전장 MASP-3 또는 아미노-말단 Streptag 및 카르복시-말단 His6 태그를 가진 CCP1-CCP2-SP 단편을 암호화하였다. 발현 구조를 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 Freestyle 293-F 또는 Expi293F 세포 (Invitrogen)로 트랜스펙션하였다. 37℃에서 5% CO2에서 배양의 3 내지 4일 후, 재조합 단백질을 스트렙트액틴 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
재조합 MASP-1: 안정화 R504Q (Dobo et al., J. Immunol 183:1207, 2009) 또는 돌연변이를 비활성화하고 (S646A) 아미노-말단 Steptag 및 카르복시-말단 His6 태그를 함유하는 SP가 있거나 없는 재조합 MASP-1의 전장 또는 절단된 CCP1-CCP2-SP 형태를 상기 재조합 MASP-3에 대하여 설명된 바와 같이 생성하였다.
1. 3MC (인간) 혈청의 스타필로코쿠스 아우레우스에서 C3b 침착 및 인자 B 분할
유동 세포 분석법 검정이 AP-구동된 C3b 침착 (AP-C3b)의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다는 것을 입증하기 위해 처음 실험을 다음과 같이 수행하였다. 5퍼센트의 다음 혈청: 정상 인간 혈청, 인자 B (인자 B)-고갈된 인간 혈청, 인자 D-고갈된 인간 혈청 및 프로퍼딘-고갈된 인간 혈청 (보체 Technology, Tyler, Texas, USA로부터 얻어짐)을 4℃에서 Mg++/EGTA 버퍼 또는 EDTA 중의 테스트 항체와 혼합하였다. 열사 스타필로코쿠스 아우레우스 (108/반응)를 각각의 혼합물에 100 μl의 총량으로 추가하였고 37℃에서 40분 동안 회전시켰다. 박테리아를 세척 버퍼로 세척하였고, 박테리아 펠릿을 세척 버퍼에서 재현탁하였고 각 샘플의 80 μl 앨리쿼트를 박테리아 표면에서 C3b 침착에 대하여 분석하였으며, 이것을 유동 세포 분석법을 사용하여 항-인간 C3c (Dako, UK)로 검출하였다.
C3b의 유동 세포 분석법 검출의 결과는 도 35A에서 나타난다. 도 35A, 패널 1, AP를 불활성화시키는 것으로 알려져 있는 EDTA의 존재시 정상 인간 혈청에서 나타난 바와 같이, C3b 침착이 관찰되지 않았다 (음성 대조군). Mg++/EGTA가 처리된 정상 인간 혈청에서는, 렉틴-독립적 보체 경로만이 기능할 수 있다. 패널 2에서, Mg++/EGTA 버퍼가 사용되고, 그러므로 AP는 활성이며, AP-구동된 C3b 침착이 관찰된다 (양성 대조군). 패널 3, 4 및 5에서 나타난 바와 같이, 각각 인자 B-고갈된, 인자 D-고갈된 및 프로퍼딘-고갈된 혈청에서, 대체 경로 구동된 C3b 침착이 관찰되지 않았으며, 예상된 바와 같다. 이 결과들은 검정이 AP-의존적 C3b 침착을 검출할 수 있다는 것을 입증한다.
스타필로코쿠스 아우레우스 검정에서 C3b 침착을 MASP-3이 결핍된 인간 3MC 혈청에서 AP를 재구성하는 재조합 MASP-3의 능력 (LEA-1)을 평가하기 위해 상기 설명된 바와 같이 수행하였다 (Rooryck C, et al., Nat Genet. 43(3):197-203 (2011)). 다음 조합의 시약을 테스트하였다.
1. 5% 정상 인간 혈청 + EDTA
2. 5% 정상 인간 혈청 + Mg/EGTA
3. 5% 인간 3MC (MASP-3-/-) 혈청 + Mg++/EGTA
4. 5% 인간 3MC (MASP-3-/-) 혈청 + Mg++/EGTA 플러스 활성 전장 rMASP-3
5. 5% 인간 3MC (MASP-3-/-) 혈청 + Mg++/EGTA 플러스 절단된 활성 rMASP-3 (CCP1/CCP2/SP)
6. 5% 인간 3MC (MASP-3-/-) 혈청 + Mg++/EGTA 플러스 비활성 rMASP-3 (S679A)
7. 5% 인간 3MC (MASP-3-/-) 혈청 + Mg++/EGTA 플러스 활성 전장 rMASP-1
상기 나타난 바와 같이 5% 혈청 및 재조합 단백질 (각각 5 μg)의 다양한 혼합물을 특이적 버퍼 조건 (Mg++/EGTA 버퍼 또는 EDTA)에서 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 하룻밤 동안 배양 후, 108개의 열사 스타필로코쿠스 아우레우스를 100 μl의 총량으로 각 혼합물에 추가하였고 37℃에서 40분 동안 회전시켰다. 박테리아를 세척 버퍼로 세척하였고 이에 재현탁하였으며 각 샘플의 80 μl 앨리쿼트를 FACS에 의해 C3b 침착에 대하여 분석하였다. 각 샘플의 나머지 20 μl 앨리쿼트를 하기 설명된 바와 같이 항-인자 B 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 인자 B 분할을 측정하는데 사용하였다.
C3b의 유동 세포 분석법의 결과는 도 35B에서 나타난다. 패널 번호는 상기 약술된 시약 조합의 각각에 대하여 지정된 번호에 해당한다. 음성 대조군 (패널 1) 및 양성 대조군 (패널 2)은 C3b 침착의 부재 및 존재를 나타내며, 예상된 바와 같다. 패널 3은 3MC 혈청에서 AP-구동된 C3b 침착이 없다는 것을 나타낸다. 패널 4 및 5는 3MC 혈청에서 활성 전장 rMASP-3 (패널 4) 및 활성 rMASP-3 (CCP1-CCP2-SP) (패널 5) 둘 다가 AP-구동된 C3b 침착을 회복시킨다는 것을 나타낸다. 패널 6은 3MC 혈청에서 비활성 rMASP-3 (S679A)가 AP-구동된 C3b 침착을 회복시키지 않는다는 것을 나타낸다. 패널 7은 3MC 혈청에서 rMASP-1이 AP-구동된 C3b 침착을 회복시키지 않는다는 것을 나타낸다.
종합해보면, 이 결과들은 인간 혈청에서 MASP-3이 스타필로코쿠스 아우레우스에서 AP-구동된 C3b 침착에 필요하다는 것을 입증한다.
2. 인자 B의 MASP-3-의존적 활성화
인자 B의 MASP-3-의존적 활성화를 분석하기 위해, 상기 나타난 바와 같이 5% 혈청 (정상 인간 혈청 또는 3MC 환자 혈청) 및 재조합 단백질의 다양한 혼합물을 상기 설명된 바와 같이 검정하였다. 각 반응 혼합물로부터, 20 μl를 제거하였고 단백질 샘플 로딩 버퍼에 추가하였다. 샘플을 70℃에서 10분 동안 가열하였고 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 인자 B 다클론성 항체 (R&D Systems)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 인자 B의 활성화는 고분자량 프로-인자 B 단백질로부터 유래된 두 개의 저분자량 분할 생성물 (Bb 및 Ba)의 형성에 의해 명백했다.
도 36은 3MC 혈청에서 rMASP-3의 존재시 또는 부재시 스타필로코쿠스 아우레우스에 대하여 반응하는 인자 B 분할을 결정하기 위한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸다. 레인 1에서 나타난 바와 같이, EDTA의 존재시 정상 인간 혈청 (음성 대조군)은 레인 2에서 나타난 Mg++/EGTA의 존재시 정상 인간 혈청 (양성 대조군)에 비해 아주 적은 인자 B 분할을 입증한다. 레인 3에서 나타난 바와 같이, 3MC 혈청은 Mg++/EGTA의 존재시 아주 적은 인자 B 분할을 입증한다. 하지만, 레인 4에서 나타난 바와 같이, 인자 B 분할은 전장, 재조합 MASP-3 단백질 (5 μg)의 3MC 혈청으로의 추가에 의해 회복된다.
3. 인자 B/C3(H2O) 분할에서 프로-인자 D에 대한 rMASP-3의 효과를 결정하기 위한 검정
인자 B의 MASP-3-의존적 활성화/분할에 대한 최소한의 필수 조건을 결정하기 위해 다음 검정을 수행하였다. C3(H2O) (200ng), 정제된 혈장 인자 B (20 μg), 재조합 프로-인자 D (200 ng) 및 재조합 인간 MASP-3 (200 ng)을, BBS/Ca++/Mg++에서 100 μl의 총량으로, 다양한 조합으로 (도 37에서 나타난 바와 같음) 함께 혼합하였고 30℃에서 30분 동안 배양하였다. 5% 2-메르캅토에탄올을 함유하는 SDS 로딩 염료의 25 uL를 추가함으로써 반응을 중단하였다. 95℃에서 10분 동안 흔들면서 (300 rpm) 끓인 후, 혼합물을 1400 rpm으로 5분 동안 스핀 다운하였고 상층액 중 20 uL를 로딩하였고 10% SDS 겔에서 분리하였다. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하였다.
결과:
도 37은 인자 B 분할이 분석된 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 레인 1에서 나타난 바와 같이, 인자 B 분할은 C3, MASP-3 및 프로-인자 D의 존재시 최적이다. 레인 2에서 나타난 바와 같이, C3은 무조건 필요하다; 하지만, 레인 4 및 5에서 나타난 바와 같이, MASP-3 또는 프로-인자 D는, C3가 존재하는 한, 인자 B 분할을 매개할 수 있다.
1. MASP-3-의존적 AP-구동된 C3b 침착을 억제하는 MASP-3의 능력의 분석
이 실시예에서 설명된 바와 같이, MASP-3이 인간 혈청에서 스타필로코쿠스 아우레우스에서 AP-구동된 C3b 침착에 필요하다는 것이 입증되었다. 그러므로, 실시예 15에서 설명된 바와 같이 확인된 대표적인 MASP-3 mAb가 MASP-3의 활성을 억제할 수 있는지 결정하기 위해 다음 검정을 수행하였다. 활성, 재조합 MASP-3 (CCP1-CCP2-SP) 단편 단백질 (250 ng)을 세 개 다른 농도 (0.5, 2 및 4μM)로 이소타입 대조군 mAb, mAb1A5 (MASP-3 또는 MASP-1에 결합하지 않는 DTLacO 플랫폼으로부터 얻어진 대조군), 또는 mAbD14 (MASP-3에 결합)와 함께 얼음 위에서 1시간 동안 사전 배양하였다. 효소-mAb 혼합물을 50 μl의 최종 반응 부피로 5% 3MC 혈청 (MASP-3 결핍) 및 5 x 107 열사 스타필로코쿠스 아우레우스에 노출시켰다. 반응물을 37℃에서 30분 동안 배양하였고, 그 다음 C3b 침착의 검출을 위해 염색하였다. 염색된 박테리아 세포를 유동 세포 분석기로 분석하였다.
도 38은 rMASP-3의 존재와 함께 3MC 혈청에서 mAb 농도의 함수로서 플롯팅된 세 개의 항체로부터 얻어진 C3b 염색의 평균 형광 강도 (MFI)를 그래프로 도시한다. 도 38에서 나타난 바와 같이, mAbD14는 농도-의존적 방식으로 C3b 침착의 억제를 입증한다. 반대로, 대조군 mAb 중 어떤 것도 C3b 침착을 억제하지 않았다. 이 결과들은 mAbD14가 MASP-3-의존적 C3b 침착을 억제할 수 있다는 것을 입증한다. mAbD14에 대하여 개선된 억제 활성은 DTLacO 시스템에서 매어져 있는 인자를 사용하여 MASP-3 결합에 대한 이 항체의 지속된 친화도 성숙화에 따라 예상된다.
결과의 요약:
요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-3이 결핍된 혈청에서 AP의 분명한 결핍을 입증한다. 따라서, MASP-3은, 기능적 끝점으로서 인자 B 활성화 및 C3b 침착을 사용하여, AP에 대하여 중요한 기여를 하는 것으로 입증되었다. 게다가, MASP-3의 촉매 반응에 의해 활성인 C-말단 부분을 포함하는, 기능적, 재조합 MASP-3의 추가는 3MC 환자의 혈청에서 인자 B 활성화 및 C3b 침착의 결함을 수정한다. 반대로, 이 실시예에서 더 입증된 바와 같이, rMASP-3이 있는 3MC 혈청에서 MASP-3 항체 (예를 들어, mAbD14)의 추가는 AP-구동된 C3b 침착을 억제한다. 인자 B 활성화에서 MASP-3의 직접적인 역할, 및 그러므로 AP는 C3과 함께, 재조합 MASP-3는 재조합 인자 B를 활성화시키는데 충분하다는 관찰에 의해 입증되었다.
실시예 18
이 실시예는 MASP-1 및 MASP-3가 인자 D를 활성화시킨다는 것을 입증한다.
방법:
재조합 MASP-1 및 MASP-3를 두 개의 다른 재조합 버젼의 프로-인자 D를 분할하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다. 첫 번째 버젼 (프로-인자 D-His)은 N-말단 태그가 없지만 C-말단 His 태그를 갖는다. 따라서, 이 버젼의 프로-인자 D는 활성화 동안의 분할에 의해 제거되는 5개의 아미노산 프로-펩티드를 함유한다. 두 번째 버젼 (ST-프로-인자 D-His)은 N-말단에서 Strep-TagII 서열을 갖고, 따라서 분할된 N-말단 단편을 15개의 아미노산으로 증가시킨다. ST-프로-인자 D는 또한 C-말단에서 His6 태그를 함유한다. ST-프로-인자 D-His의 프로펩티드의 증가된 길이는 프로-인자 D-HIS 형태로 가능한 분해와 비교하여 SDS-PAGE에 의한 분할된 형태 및 분할되지 않은 형태 사이의 분해를 개선한다.
재조합 MASP-1 또는 MASP-3 단백질 (2 μg)을 프로-인자 D-His 또는 ST-프로-인자 D-His 기질 (100 ng)에 추가하였고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 반응물을 프로-인자 D 및 활성 인자 D 분할 생성물을 분해하기 위해 12% Bis-Tris 겔에서 전기영동하였다. 분해된 단백질을 PVDF 막으로 옮겼고 비오티닐화된 인자 D 항체 (R&D Systems)로의 검출에 의한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
결과:
도 39는 프로-인자 D 기질 분할의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 39에서 나타난 웨스턴 블롯에 대한 레인 설명
실험 조건 레인 1 레인 2 레인 3 레인 4 레인 5
프로-인자 D + + + + +
rMASP-3 (전장) - + _ _ _
rMASP-3a (S679A) - - + - -
rMASP-1a (S646A) - - - + -
rMASP-1 (CCP-1-CCP2-SP) - - - - +
도 39에서 나타난 바와 같이, 전장 MASP-3 (레인 2) 및 MASP-1 CCP1-CCP2-SP) 단편 (레인 5)만이 ST-프로-인자 D-His6을 분할하였다. 촉매 반응에 의한-비활성 전장 MASP-3 (S679A; 레인 3) 및 MASP-1 (S646A; 레인 3)은 기질을 분할하는데 실패했다. 프로-인자 D-His6 폴리펩티드로도 동일한 결과를 얻었다 (미도시). MASP-3에 비해 MASP-1 (CCP1-CCP2-SP)의 몰 초과의 비교는, 적어도 본원에서 설명된 조건 하에서는, MASP-3이 MASP-1보다 프로-인자 D 분할의 더 효과적인 촉매라는 것을 제안한다. 결론:
MASP-1 및 MASP-3 둘 다는 인자 D를 분할하고 활성화시킬 수 있다. 이 활성은 LEA-1을 메의 활성화와 직접적으로 연관시킨다. 더 구체적으로, MASP-1 또는 MASP-3에 의한 인자 D의 활성화는 인자 B 활성화, C3b 침착, 및 가능하게는 옵소닌화 및/또는 용해로 이어질 것이다.
1. MASP-3 항체로 프로-인자 D의 MASP-3-의존적 분할의 억제에 대한 검정
MASP-3-의존적 인자 D 분할에 대한, 실시예 15에서 설명된 바와 같이 확인된 대표적인 MASP-3 및 MASP-1 mAb의 억제 효과를 결정하기 위해 검정을 다음과 같이 수행하였다. 활성, 재조합 MASP-3 단백질 (80 ng)을 실온에서 15분 동안 대표적 mAbs D14, M3M1 및 대조군 항체 (이것은 MASP-1에 특이적으로 결합하지만, MASP-3에는 아니다)의 1 μg과 함께 사전 배양하였다. N-말단 Strep-태그가 있는 프로-인자 D (ST-프로-인자 D-His, 70 ng)를 추가하였고 혼합물은 37℃에서 75분 동안 배양하였다. 그 다음 상기 설명된 바와 같이 반응물을 전기영동하였고, 블롯팅하였고 항-인자 D로 염색하였다.
도 40은 MASP-3 및 ST-프로-인자 D-His만을 함유하는 대조군 반응물 (mAb 없음; 레인 1), 뿐만 아니라 MASP-1에 결합하지만, MASP-3에는 아닌 DTLacO 라이브러리로부터 얻은 mAb를 함유하는 대조군 반응물 (레인 4)과 비교하여 mAb D14 및 M3M1의 부분적 억제 활성을 나타내는 웨스턴 블롯이다. 도 40에 나타난 바와 같이, 억제 항체의 부재시, MASP-3은 대략 50%의 프로-인자 D를 인자 D로 분할한다 (레인 1). 대조군 MASP-1 특이적 항체 (레인 4)는 프로-인자 D와 인자 D의 비율을 변화시키지 않는다. 반대로, 레인 2 및 3에서 나타난 바와 같이, mAb D14 및 mAb M3M1 둘 다는 프로-인자 D의 인자 D로의 MASP-3-의존적 분할을 억제하며, 생성된 인자 D의 감소를 일으킨다.
결론: 이 결과들은 MASP-3 mAbs D14 및 M3M1이 MASP-3-의존적 인자 D 분할을 억제할 수 있다는 것을 입증한다. mAb D14 및 mAb M3M1에 대한 개선된 억제 활성은 DTLacO 시스템에서 매어져 있는 인자를 사용하는 MASP-3 결합에 대한 이 항체들의 지속적 친화도 성숙화에 따라 예상된다.
실시예 19
이 실시예는 MASP-3 결핍이 만난-코팅된 WT 토끼 적혈구의 보체-매개된 용해를 방지한다는 것을 입증한다.
배경/근거:
본원에서 실시예 5 및 6에서 설명된 바와 같이, PNH의 마우스 모델로부터 얻은 혈액 샘플의 적혈구 세포의 용해에 대한 MASP-2- 및 MASP-3-결핍 혈청의 효과는 PNH로 고통받는 개체를 치료하기 위한 MASP-2 억제 및/또는 MASP-3 억제의 효능을 입증하고, 또한 에쿨리쥬맙과 같은 C5 억제자 치료를 경험하고 있는 PNH 개체에서 C3 단편-매개된 혈관 외 용혈의 효과를 개선하기 위해 MASP-2의 억제자 및/또는 MASP-3의 억제자 (이중 또는 이중-특이적 MASP-2/MASP-3 억제자 등)의 사용을 지지한다.
이 실시예에서 설명된 바와 같이, C3b 침착 실험 및 용혈 실험을 추가적인 3MC 환자의 MASP-3 결핍 혈청에서 수행하였으며, 실시예 5 및 6에서 얻은 결과를 확인하였다. 게다가, 3MC 혈청에 rMASP-3의 추가는 C3b 침착 및 용혈성 활성을 재구성할 수 있다는 것을 입증하는 실험을 수행하였다.
방법:
MASP-3-결핍 혈청을 다음과 같이 세 명의 다른 환자로부터 얻었다:
3MC 환자 1: MASP-3 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손이 제대로 기능하지 않게 하는 돌연변이를 함유하는 대립유전자 (MASP-3 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손이 제대로 기능하지 않게 하는 돌연변이를 함유하는 대립유전자에 대한 이형 접합체)를 함유하며, 3MC 환자의 부모와 함께 공급된다.
3MC 환자 2: MASP-1의 엑손 12, MASP-3의 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손에서 C1489T (H497Y) 돌연변이를 가지며, 비기능적 MASP-3 단백질도 발생시키지만, 기능적 MASP-1 단백질도 발생시킨다.
3MC 환자 3: MASP-1 유전자에서 확인된 결함을 가지며, 비기능적 MASP-3 단백질 및 비기능적 MASP-1 단백질도 발생시킨다.
실험 #1: C3b 침착 검정
AP 검정을 전통적 AP-특이적 조건 (BBS/Mg++/EGTA, Ca++ 없음, 여기에서 BBS= 수크로스를 함유하는 바비탈 완충된 식염수이며, Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol 11:291-295 (1981)에서 설명된 바와 같음) 하에 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 0.5 내지 25%의 범위에 있는 혈청 농도로 수행하였고 C3b 침착을 시간이 흐름에 따라 측정하였다.
결과:
도 41은 MASP-3-결핍 (3MC), C4-결핍 및 MBL-결핍 개체로부터 얻은 혈청 샘플에서 혈청 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 도 41에서 나타나고, 하기 표 18에서 요약된 바와 같이, 환자 2 및 환자 3의 MASP-3-결핍 환자 혈청은 고농도 (25%, 12.5%, 6.25% 혈청 농도)에서 나머지 AP 활성을 갖지만, 훨씬 더 높은 AP50을 갖는다 (즉, 혈청의 8.2% 및 12.3%이 최대 C3 침착의 50%를 달성하는데 필요하다).
도 42A는 "전통적" AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 MASP-3 결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 인간 개체로부터 얻은 10% 인간 혈청 샘플에서 시간의 함수로서 그래프로 도시한다.
하기 표 19는 도 41에서 나타난 AP50 및 도 42A에서 나타난 C3b 침착에 대한 하프 타임을 요약한다.
도 41 및 42A에서 나타난 결과의 요약
혈청 타입 AP 50 (%) T 1/2 (분)
정상 4.5 26.3
MBL-결핍 (MBL-/-) 5.7 27.5
C4-결핍 (C4-/-) 5.1 28.6
3MC (환자 3) 8.2 58.2
3MC (환자 2) 12.3 72.4
주: BBS/Mg++/EGTA 버퍼에서, 렉틴 경로-매개된 효과는 이 버퍼에서 Ca++의 부재로 인해 결핍된다. 실험 #2: 웨스턴 블롯에 의한 3MC 환자 혈청에서 프로-인자 D 분할의 분석
방법: 혈청을 3MC 환자 #2 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (+/+)) 및 3MC 환자 #3 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (-/-))으로부터 얻었다. 정상 기증자의 혈청 (W)과 함께, 환자 혈청을 SDS-폴리아크릴아미드 겔로 분리하였고 용해된 단백질을 폴리비닐리딘 플루오라이드 막에 블롯팅하였다. 인간 프로-인자 D (25,040 Da) 및/또는 성숙한 인자 D (24,405 Da)를 인간 인자 D-특이적 항체로 검출하였다.
결과: 웨스턴 블롯의 결과는 도 42B에서 나타났다. 도 42B에서 나타난 바와 같이, 정상 기증자의 혈청 (W)에서, 인자 D 항체는 성숙한 인자 D (24,405 Da)와 일치하는 크기의 단백질을 검출하였다. 도 42B에서 더 나타난 바와 같이, 인자 D 항체는 3MC 환자 #2 (P2) 및 3MC 환자 #3 (P3)의 혈청에서 약간 더 큰 단백질을 검출하였는데, 이 3MC 환자들에서 프로-인자 D (25,040 Da)의 존재와 일치한다.
실험 #3: 3MC 환자 혈청으로 Wieslab 보체 검정
방법: 3MC 환자 #2 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (+/+)) 및 3MC 환자 #3 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (-/-))로부터 얻은 혈청을 또한 고전적, 렉틴 및 대체 경로 활성에 대하여 제조사의 지시에 따라 Wieslab Complement System Screen (Euro-Diagnostica, Malmo, Sweden)을 사용하여 테스트하였다. 정상 인간 혈청을 대조군과 동시에 테스트하였다.
결과: 도 42C는 3MC 환자 #2, 3MC 환자 #3, 및 정상 인간 혈청으로부터 얻은 혈장으로 Weislab 고전적, 렉틴 및 대체 경로 검정의 결과를 그래프로 도시한다. 도 42C에서 나타난 바와 같이, Wieslab 검정의 조건 하에서, 고전적, 대체, 및 MBL (렉틴) 경로는 정상 인간 혈청에서 모두 기능적이다. 3MC 환자 #2 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (+/+))의 혈청에서, 고전적 경로 및 렉틴 경로는 기능적이지만, 검출 가능한 대체 경로 활성은 없다. 3MC 환자 #3 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (-/-))의 혈청에서, 고전적 경로는 기능적이지만, 검출 가능한 렉틴 경로 활성이 없고 검출 가능한 대체 경로 활성이 없다.
도 42B 및 42C의 결과는 LEA-1 및 LEA-2 경로에서 MASP-1 및 MASP-3의 역할의 이해를 더 지지한다. 특이적으로, MASP-3만이 결핍된 환자 2의 혈청에서 거의 완전히 기능적인 렉틴 경로와 함께 대체 경로의 부재는 MASP-3이 대체 경로의 활성화에 필수적이라는 것을 확인한다. MASP-1 및 MASP-3 둘 다가 결핍된 환자 3의 혈청은 렉틴 경로, 뿐만 아니라 대체 경로를 활성화하는 능력을 상실하였다. 이 결과는 기능적 LEA-2 경로에 대한 MASP-1의 필요성을 확인하고, 실시예 15 및 16, 및 MASP-1이 MASP-2를 활성화한다는 것을 입증하는 문헌과 일치한다. 프로-인자 D를 활성화할 수 없는 두 가지 혈청의 명백한 능력이 또한 MASP-3이 프로-인자 D를 입증하는 실시예 18에서 설명된 데이터와 일치한다. 이 관찰은 도 1에서 도식화된 바와 같이 LEA-1 및 LEA-2 경로와 일치한다.
실험 #4: 인간 정상 또는 3MC 혈청의 존재시 (Ca ++ 의 부재시) 용해에 대하여 만난-코팅된 토끼 적혈구를 테스트하는 용혈 검정
방법:
Ca ++ 의 부재시 토끼 RBC의 조제물 (즉, EGTA에 의해)
토끼 전체 혈액 (2mL)을 1.5mL 에펜도르프 튜브로 나누었고 냉장한 에펜도르프 원심분리기에서 8000 rpm (대략 5.9 rcf)으로 4℃에서 3분 동안 원심분리하였다. RBC 펠릿을 아주 차가운 BBS/Mg++/Ca++ (4.4mM 바비투르산, 1.8mM 바비톤 나트륨, 145mM NaCl, pH 7.4, 5mM Mg++, 5mM Ca++)에서 재현탁 후 세 번 세척하였다. 세 번째 세척 후, 펠릿을 4mL BBS/Mg++/Ca++에서 재현탁하였다. 적혈구를 펠릿화하였고 RBC를 상기 설명된 바와 같이 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++로 세척하였다. RBC 현탁액을 4℃에서 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++에 저장하였다. 그 다음, 현탁된 RBC 중 100 μl를 1.4mL 물로 희석하였고 8000 rpm (대략 5.9 rcf)으로 3분 동안 스핀 다운하였고 상층액의 OD를 541 nm에서 0.7로 조정하였다 (541nm에서 0.7의 OD는 대략 109 적혈구/ml에 해당한다). 그 후, 108 적혈구/ml의 농도를 달성하기 위해 OD 0.7로 재현탁된 RBC 1mL을 9ml의 BBS/Mg++/EGTA에 추가하였다. 테스트 혈청 또는 혈장의 희석액을 아주 차가운 BBS, Mg++, EGTA로 제조하였고 각 혈청 또는 혈장 희석액의 100 μl를 원형 바닥 플레이트의 해당 웰로 피펫팅하였다. 적당히 희석된 RBC (108 적혈구/ml) 100 μl를 각 웰에 추가하였다. 나노-물 (Nano-water)을 양성 대조군 (100% 용해)를 생산하기 위해 사용하는 한편, 혈청 또는 혈장이 없는 BBS/Mg++/EGTA로의 희석액을 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 원형 바닥 플레이트를 3750 rpm으로 5분 동안 스핀 다운하였다. 그 다음, 각 웰로부터 100 μl의 상층액을 평평한 바닥 플레이트의 해당 웰로 옮겼고 415-490 nm에서 OD를 측정하였다.
결과:
도 43은 정상 개체 및 두 명의 3MC 환자 (환자 2 및 환자 3)의 혈청에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐, Ca++의 부재시 측정된, 만난-코팅된 토끼 적혈구의 퍼센트 용혈 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 토끼 적혈구의 상층액으로의 헤모글로빈 방출로 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시한다. 도 43에서 나타난 바와 같이, MASP-3 결핍은 정상 인간 혈청과 비교하여 만난-코팅된 적혈구의 보체-매개된 용해의 퍼센트를 감소시킨다는 것이 입증되었다. 정상 인간 혈청의 두 개의 곡선 및 3MC 환자의 두 개의 곡선 사이의 사이는 유의하다 (p=0.013, 프리드만 테스트(Friedman test)).
하기 표 20은 도 43에서 나타난 AP50 결과를 요약한다.
도 43에서 나타난 결과의 요약
혈청 타입 AP 50 (%)
정상 인간 혈청 #1 7.1
정상 인간 혈청 #2 8.6
3MC 환자 #2 11.9
3MC 환자 #3 14.3
표 20에서 나타난 혈청 샘플이 풀링될 때 (pooled), 정상 인간 혈청에 대한 AP50 값 = 7.9 및 3MC 혈청에 대한 AP50 값 = 12.8 (p=0.031, 윌콕스 대응 부호 순위 테스트(Wilcox matched-pair signed rank test))인 것을 주의해야 한다. 실험 #5: 재조합 MASP-3에 의한 인간 3MC 혈청의 재구성은 치모산 코팅된 플레이트에서 AP-구동된 C3b 침착을 회복시킨다.
방법:
AP 검정을 전통적 AP-특이적 조건 (BBS/Mg++/EGTA, Ca++ 없음, 여기에서 BBS=수크로스를 함유하는 바비탈 완충된 식염수) 하에 다음 혈청 샘플에서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 수행하였다:
(1) 0 내지 20 μg/ml의 범위로 추가되는 전장 활성 rMASP-3를 가진 3MC 환자 #2의 5% 인간 혈청; (2) 0 내지 20 μg/ml의 범위로 추가되는 전장 활성 rMASP-3를 가진 3MC 환자 #2의 10% 인간 혈청; 및 (3) 0 내지 20 μg/ml의 범위로 추가되는 비활성 rMASP-3A (S679A)를 가진 3MC 환자 #2의 5% 인간 혈청.
결과:
도 44는 인간 3MC 환자 #2 (MASP-3-결핍)로부터 얻은 혈청 샘플에 추가된 rMASP-3 단백질의 농도의 함수로 치모산-코팅된 미세역가 플레이트에서 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 도 44에서 나타난 바와 같이, 활성 재조합 MASP-3 단백질은 농도-의존적 방식으로 치모산-코팅된 플레이트에서 AP-구동된 C3b 침착을 재구성한다. 도 44에서 더 나타난 바와 같이, 비활성 rMASP-3 (S679A)를 함유하는 3MC 혈청에서는 C3b 침착이 관찰되지 않았다.
실험 #6: 재조합 MASP-3에 의한 인간 3MC 혈청의 재구성은 3MC 환자 혈청에서 용혈성 활성을 회복시킨다
방법:
0 내지 12% 혈청의 범위에서 다음 테스트 혈청으로 실험 #2에서 상기 설명된 방법을 사용하여 토끼 RBC를 사용하는 용혈성 검정을 수행하였다: (1) 정상 인간 혈청; (2) 3MC 환자 혈청; (3) 3MC 환자 혈청 플러스 활성 전장 rMASP-3 (20 μg/ml); 및 (4) 열-불활성화된 인간 혈청.
결과:
도 45는 (1) 정상 인간 혈청; (2) 3MC 환자 혈청; (3) 3MC 환자 혈청 플러스 활성 전장 rMASP-3 (20 μg/ml); 및 (4) 열-불활성화된 인간 혈청에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐, Ca++의 부재시 측정된, 만난-코팅된 토끼 적혈구의 퍼센트 용혈 (광도측정법에 의해 측정된, 용해된 토끼 적혈구의 상층액으로의 헤모글로빈 방출로 측정된 바와 같음)을 그래프로 도시한다. 도 45에서 나타난 바와 같이, 토끼 RBC의 퍼센트 용해는 rMASP-3이 없는 3MC 항체의 퍼센트 용해와 비교하여 rMASP-3을 포함하는 3MC 혈청에서 크게 증가하였다 (p=0.0006).
도 46은 BBS/Mg++/EGTA에서 0 내지 110 μg/ml의 농도 범위에서 활성 rMASP-3을 함유하는 3MC 환자 2 및 3MC 환자 3의 7% 인간 혈청에서 토끼 적혈구 용해의 퍼센트를 그래프로 도시한다. 도 46에서 나타난 바와 같이, 토끼 RBC 용해의 퍼센트는 농도-의존적 방식으로 rMASP-3의 양을 100% 활성까지 회복한다.
실험 #7: MBL이 존재하면 MASP-3 결핍 (3MC) 환자의 혈청은 기능적 MASP-2를 갖는다
방법:
LEA-2에서 3MC 혈청이 결핍되는지를 검사하기 위해 만난-코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 C3b 침착 검정을 수행하였다. 시트레이트 혈장을 BBS 버퍼에서 단계 희석으로 희석하였고 (1:80, 1:160, 1: 320, 1:640, 1:1280, 1:2560에서 시작) 만난-코팅된 플레이트에 평판 배양하였다. 침착된 C3b를 닭 항-인간 C3b 검정을 사용하여 검출하였다. 만난-코팅된 ELISA 플레이트에서 LEA-2 구동된 C3b 침착 (혈장 희석액은 AP 및 LEA-1이 작동하기에 너무 높다)을 정상 인간 개체 (NHS), 3MC 환자 (환자 2 및 환자 3), 환자 3의 모체 및 MBL-결핍 개체의 혈청에서 인간 혈청 농도의 함수로서 평가하였다.
결과:
도 47은 정상 인간 개체 (NHS), 두 명의 3MC 환자 (환자 2 및 환자 3), 환자 3의 모체 및 MBL-결핍 개체의 혈청에 대하여, BBS 버퍼에 희석된 인간 혈청의 농도의 함수로서 만난-코팅된 ELISA 플레이트에서 LEA-2-구동된 (즉, MASP-2-구동된) C3b 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 이 데이터들은 환자 2는 MBL 충분하다는 것을 지시한다. 하지만, 환자 3 및 환자 3의 친모은 MBL 결핍되고, 그러므로 그것들의 혈청은 LEA-2를 통해 만난에 C3b를 침착시키지 않는다. 이 혈청들에서 MBL의 대체는 환자 3 (MASP-3 결핍으로 이어지는 SNP에 대하여 동형 접합성이다) 및 그의 친모 (돌연변이 MASP-3 대립유전자에 대한 이형 접합성이다)의 혈청에서 LEA-2 매개된 C3b 침착을 회복시킨다 (데이터 미도시). 이 발견은 3MC 혈청이 LEA-2가 결핍되지 않는다는 것을 입증하지만, 기능적 MASP-2를 갖는 것으로 나타난다.
전체적인 요약 및 결론:
이 결과들은, 치모산-코팅된 웰에서 감소된 C3b 침착 및 감소된 토끼 적혈구 용해에서 나타난 바와 같이, 인간 혈청에서 MASP-3 결핍이 AP 활성의 손실을 일으킨다는 것을 입증한다. AP는 혈청을 기능적, 재조합 인간 MASP-3로 보충함으로써 두 검정에서 회복할 수 있다.
실시예 20
이 실시예는 쥐 황반 변성 모델에서 MASP-2-/-의 결과를 설명한다.
배경/근거: 나이-관련 황반 변성 (AMD)은 산업화된 세계에서 55살 이후 맹목의 주요 원인이다. AMD는 두 개의 주요 형태: 신혈관 (습식) AMD 및 위축성 (건식) AMD로 발생한다. 신혈관 (습식) 형태는 AMD와 관련된 심각한 시력 상실 중 90%를 차지하지만, AMD에 걸린 개인 중 ~20%만이 습식 형태로 발달한다. AMD의 임상적 홀마크는 다수의 드루센, 지도상 위축, 및 맥락막 신혈관 형성 (CNV)을 포함한다. 2004년 12월에, FDA는 Macugen (페가프타닙), AMD의 습식 (신혈관) 형태의 치료를 위해 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 효과를 특이적으로 표적화하고 차단하기 위한 새로운 등급의 안과용 약물을 승인하였다 (Ng　et　al., Nat Rev. Drug Discov 5:123-32 (2006)). Macugen이 AMD 환자의 부분군에 대한 새로운 유망한 치료 옵션을 대표하지만, 이 복잡한 질환에 대한 추가적인 치료법을 개발하는 것이 급히 필요하다. 다수의, 독립적인 라인의 조사는 AMD의 발병에서 보체 활성화에 대한 중심 역할과 관련된다. 맥락막 신혈관 형성 (CNV), 가장 심각한 형태의 AMD의 발병은 보체 경로의 활성화를 수반할 수도 있다.
25년 이상 전에, Ryan은 동물에서 CNV의 레이져-유발된 손상 모델을 설명한다 (Ryan, S.J., Tr. Am. Opth. Soc. LXXVII: 707-745, 1979). 모델은 처음에 붉은털 원숭이(rhesus monkey)를 사용하여 개발되었지만, 같은 기술은 이후로 마우스를 포함하는 다양한 연구 동물에서 CNV의 유사한 모델을 개발하는데 사용되었다 (Tobe　et　al., Am. J. Pathol. 153:1641-46, 1998). 이 모델에서, 레이져 광응고는 CNV-유사 막의 형성을 일으키는 작용인 브루크 막(Bruch's membrane)을 파괴하는데 사용된다. 레이져-유발된 모델은 인간 질병의 중요한 특징 중 다수를 캡쳐한다 (최근의 검토를 위해서, Ambati　et　al., Survey Ophthalmology 48:257-293, 2003을 참고하면 된다). 레이져-유발된 마우스 모델은 현재 잘 확립되어 있으며, 많은, 및 점점 증가하는 연구 프로젝트에서 실험적 근거로서 사용된다. 레이져-유발된 모델은 이 모델을 사용하는 발병 및 약물 억제의 전임상 연구가 인간에서 CNV에 적절하다는 점에서 CNV와 충분한 생물학적 유사성을 공유한다는 것이 일반적으로 수용된다.
방법:
MASP-2-/- 마우스를 실시예 1에서 설명된 바와 같이 발생시켰고 C57BL/6와 10 세대 동안 역교배하였다. 현재의 연구는 레이져 손상 후 ELISA에 의해 망막 색소 내피 (RPE)/맥락막에서 조직 손상의 측정 및 VEGF, CNV에서 관련된 잠재적 혈관 형성 인자의 수준의 결정으로서 레이져 공초점 현미경을 스캔함으로써 MASP-2 (-/-) 및 MASP-2 (+/+) 수컷 마우스가 레이져-유발된 CNV의 과정, 레이져-유발된 CNV의 부피에 초점을 맞추는 신혈관 AMD의 가속화된 모델에서 평가될 때의 결과들을 비교하였다.
맥락막 신혈관 형성 (CNV)의 유발: 레이져 광응고 (532 nm, 200 mW, 100 ms, 75μm; Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA)를 약물 군 배정이 감춰진 단일 개인에 의해 제0 일에 각 동물의 양 눈에서 수행하였다. 레이져 스폿을 세극등(slit lamp) 전달 시스템 및 콘텍트 렌즈로 커버슬립을 사용하여, 시신경 주위에 표준화된 방식으로 적용하였다. 레이져 손상의 형태학적 종료점은 공동화 기포의 출현, 브루크 막의 파괴와 관련된 것으로 생각된 징후였다. 상세히 설명된 방법 및 평가되는 종료점은 다음과 같다.
플루오레세인 혈관 조영법(Fluorescein Angiography): 플루오레세인 혈관 조영법을 레이져 광응고 후 일주일에 카메라 및 이미징 시스템 (TRC 50 1A 카메라; ImageNet 2.01 시스템; Topcon, Paramus, NJ)으로 수행하였다. 사진을 2.5% 플루오레세인 나트륨의 0.1 ml의 복강 내 주사 후 안저 카메라 (fundus camera)와 접촉된 20-D 렌즈로 캡쳐하였다. 레이져 광응고 또는 혈관 조영법에 수반되지 않은 망막 전문가는 감춰진 방식으로 단번에 플루오레세인 혈관 조영도를 평가하였다.
맥락막 신혈관 형성 (CNV)의 부피: 레이져 손상 후 일주일에, 눈을 적출하여 4℃에서 30분 동안 4% 포름알데히드로 고정하였다. 안배(eye cup)을 앞 부분을 제거함으로써 얻었고 PBS에서 세 번 세척한 후 이어서, 메탄올 계열을 통해 탈수 및 재수화하였다. 버퍼 (1% 소 혈청 알부민 및 0.5% Trotpm X-100을 함유하는 PBS)로 실온에서 30분 동안 두 번 차단한 후, 안배를 4℃에서 하룻밤 동안 0.5% FITC-이소렉틴 B4 (Vector laboratories, Burlingame, CA)와 함께 배양하였으며, 0.2% BSA 및 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS로 희석하였다. FITC-이소렉틴 B4는 말단 내피 세포의 표면에서 말단 β-D-갈락토스 잔기에 결합하고 쥐 맥관구조를 선택적으로 표지한다. 0.1% Triton X-100를 함유하는 PBS로 두 번 세척 후, 감각 신경 망막을 부드럽게 떼어냈고, 시신경으로부터 잘라냈다. 네 번의 편안한 방사상 절개가 이루어졌고, 나머지 RPE-맥락막-공막(sclera) 복합체는 안티페이드(antifade) 배지 (Immu-Mount Vectashield Mounting Medium; Vector Laboratories)에서 평평하게 증가하였고 커버-슬립을 덮었다.
평평한-증가를 스캐닝(scanning) 레이져 공초점 현미경 관찰 (TCS SP; Leica, Heidelberg, Germany)로 조사하였다. 혈관을 푸른 아르곤 파장 (488 nm)으로 흥분시키고 515와 545 nm 사이에서 방출을 캡쳐함으로써 시각화하였다. 40X 유침용 대물렌즈를 모든 이미징(imaging) 연구에 사용하였다. 시각적 수평 단면 (1　μm 단계)을 RPE-맥락막-공막 복합체의 표면에서 얻었다. 병변에 연결된 주위의 맥락막 혈관 네트워크가 확인될 수 있는 가장 깊은 초점면을 병변의 바닥인 것으로 판단하였다. 레이져-표적화된 지역에서 및 이 참조 평면에 표면적인 어떤 혈관도 CNV로 판단하였다. 각 단면의 이미지를 디지털 방식으로 저장하였다. CNV-관련 형광 발광 지역을 현미경 소프트웨어 (TCS SP; Leica)로 컴퓨터화된 이미지 분석에 의해 측정하였다. 각 수평 단면에서 전체 형광 발광 지역의 요약을 CNV의 부피에 대한 지표로 사용하였다. 이미지화를 치료군 배정이 감춰진 조작자에 의해 수행하였다.
CNV로 발달하는 각 레이져 병변의 확률이 그것이 속하는 군 (입, 눈, 및 레이져 스폿)에 의해 영향을 받기 때문에, 평균 병변 부피를 분할 플롯 반복-측정 설계된 선형 복합 모델을 사용하여 비교하였다. 전체 플롯 인자는 동물이 속하는 유전적 군인 반면에, 분할 플롯 인자는 눈이었다. 통계적 유의성을 0.05 수준에서 결정하였다. 평균의 사후(Post hoc) 비교를 다수의 비교를 위해 본페로니(Bonferroni) 조정으로 구성하였다.
VEGF ELISA: 12개의 레이져 스폿에 의한 손상 후 3일에, RPE-맥락막 복합체를 얼음 위에서 15분 동안 용해 버퍼 (20　mM imidazole HCl, 10　mM KCl, 1　mM MgCL2, 10　mM EGTA, 1% Triton X-100, 10　mM NaF, 1　mM Na molybdate, and 1　mM EDTA with protease 억제자)에서 초음파 분해하였다. 상층액에서 VEGF 단백질 수준을 450 내지 570　nm에서 (Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA), 모든 스플라이스 변종을 인식하는 ELISA 키트 (R&D Systems, Minneapolis, MN)로 결정하였고, 전체 단백질에 대하여 표준화하였다. 2배수 측정을 광응고, 이미징, 또는 혈관 조영법에 수반되지 않은 조작자에 의해 감춰진 방식으로 수행하였다. VEGF 수를 적어도 세 개의 독립적인 실험의 평균 +/- SEM으로 나타냈고 만-휘트니 U 테스트(Mann-Whitney U test)를 사용하여 비교하였다. 눌 가설은 P<0.05에서 거부되었다.
결과:
VEGF 수준의 평가:
도　48A는 제0 일에 C57Bl6 야생형 및 MASP-2(-/-) 마우스로부터 분리된 RPE-맥락막 복합체에서 VEGF 단백질 수준을 그래프로 도시한다. 도 48A에서 나타난 바와 같이, VEGF 수준의 평가는 MASP-2 (-/-) 마우스 대 C57BL/6 야생형 대조군 마우스에서 VEGF에 대한 베이스라인 수준의 감소를 나타낸다. 도　48B는 레이져-유발된 손상 후 제3 일에 측정된 VEGF 단백질 수준을 그래프로 도시한다. 도 48B에서 나타난 바와 같이 VEGF 수준은 레이져 유발된 손상 후 3일에 야생형 (+/+) 마우스에서 크게 증가하였으며, 공개된 연구와 일치한다 (Nozaki　et　al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:2328-33 (2006)). 하지만, 놀랍게도 MASP-2 (-/-) 마우스에서는 매우 낮은 수준의 VEGF가 보였다.
맥락막 신혈관 형성 (CNV)의 평가:
레이져 유발된 황반 변성 후 VEGF 수준의 감소 이외에, CNV 지역을 레이져 손상 전 및 후에 결정하였다. 도　49는 레이져 유발된 손상 후 제7 일에 C57BL/6 야생형 마우스 및 MASP-2(-/-) 마우스에서 측정된 CNV 부피를 그래프로 도시한다. 도 49에서 나타난 바와 같이, MASP-2 (-/-) 마우스는 야생형 대조군 마우스와 비교하여 제7 일에 레이져 유발된 손상 후 CNV 지역의 약 30% 감소를 나타냈다.
이 발견들은 MASP (-/-) 마우스 대 야생형 (+/+) 대조군에서 나타난 바와 같이 VEGF 및 CNV의 감소 및 MASP-2의 억제자로의 차단은 황반 변성의 치료에 예방적 또는 치료적 효과를 가질 것이라는 것을 나타낸다.
실시예 21
이 실시예는 나이-관련 황반 변성에 대한 마우스 모델의 효능에 대해 Fab2 #11로부터 유래된 마우스 MASP-2 Moab의 분석을 설명한다.
배경/근거:
실시예 11 및 12에서 설명된 바와 같이, 래트 MASP-2 단백질을 이용하여 Fab 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 패닝(pan)하였는데, 이것으로부터 Fab2#11을 기능적 활성 항체로서 확인하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 이소타입의 전장 항체를 Fab2 #11로부터 발생시켰다. 마우스 IgG2a 이소타입의 전장 MASP-2 항체를 실시예 13에서 설명된 바와 같이 약물동역학적 파라미터에 대하여 특성화하였다. 이 실시예에서, Fab2 #11로부터 유래된 마우스 MASP-2 전장 항체를 나이-관련 황반 변성 (AMD)의 마우스 모델에서 분석하였으며, Bora P.S. et al, J Immunol 174:491-497 (2005)에 의해 설명되었다.
방법:
실시예 13에서 설명된 바와 같이 Fab2 #11로부터 유래된 마우스 IgG2a 전장 MASP-2 항체 이소타입을 다음과 같이 변형된 실시예 20에서 설명된 바와 같이 나이-관련 황반 변성 (AMD)의 마우스 모델에서 테스트하였다.
마우스-MASP-2 MoAb의 투여
이소타입 대조군 MoAb 처리와 함께 마우스 MASP-2 MoAb의 2회의 다른 용량 (0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg)을 CNV 유발 전 16시간에 WT (+/+) 마우스 (군 당 n= 8 마우스)에 복강 내 주사하였다.
맥락막 신혈관 형성 (CNV)의 유발
맥락막 신혈관 형성 (CNV)의 유발 및 CNV의 부피의 측정을 실시예 20에서 설명된 바와 같이 레이져 광응고를 사용하여 수행하였다.
결과:
도 50은 이소타입 대조군 MoAb, 또는 마우스 MASP-2 MoAb (0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg)가 처리된 마우스에서 레이져 손상 후 7일에 측정된 CNV 지역을 그래프로 도시한다. 도 50에서 나타난 바와 같이, 1.0 mg/kg MASP-2 MoAb가 사전-처리된 마우스에서, 통계적으로 유의한 (p <0.01) CNV의 대략 50% 감소를 레이져 처리 후 7일에 관찰하였다. 도 50에서 더 나타난 바와 같이, MASP-2 MoAb의 0.3 mg/kg 용량은 CNV를 감소시키는데 효과적이지 않다는 것을 관찰하였다. MASP-2 MoAb의 0.3 mg/kg 용량이 피하 투여 후 C4b 침착의 부분적 및 일시적 억제를 갖는 것으로 나타난 것을 주목되는데, 실시예 13에서 설명되고 도 29A에서 나타난 바와 같다.
이 실시예에서 설명된 결과는 MASP-2의 MASP-2 MoAb와 같은 억자자로의 차단이 황반 변성의 치료에 있어서 예방적 및/또는 치료적 효과를 갖는다는 것을 입증한다. 이 결과들이 MASP-2 (-/-) 마우스에서 수행된 연구에서 관찰된 결과와 일치한다는 것이 주목되고, 실시예 20에서 설명되는데, 레이져 처치 후 7일에 야생형 대조군 마우스와 비교하여 CNV의 30% 감소가 MASP-2 (-/-) 마우스에서 관찰된다. 게다가, 이 실시예의 결과는 전신으로 전달된 MASP-2 항체가 눈에서 국소적 치료적 이점을 제공한다는 것을 입증하는데, 이로 인해 AMD 환자를 치료하기 위한 투여의 전신성 루트에 대한 가능성을 강조한다. 요약하면, 이 결과들은 AMD의 치료에 있어서 MASP-2 MoAb의 사용을 지지하는 증거를 제공한다.
실시예 22
이 실시예는 마우스 심근허혈/재관류 모델에서 MASP-2(-/-) 마우스의 분석을 설명한다.
배경/근거:
만노스-결합 렉틴 (MBL)은 다양한 탄수화물 구조에 반응하여, 면역 복합체-의존적 방식으로 보체 활성화를 시작하는 순환 분자이다. 이 구조들은 감염원의 구성요소이거나 특히 괴사성, 종양성 또는 세포사멸성 세포 내 변화된 내인성 탄수화물 모이어티일 수 있다. 이 형태들의 세포 사멸은 보체의 활성화가 허혈증이 재관류에 의해 종결되는 순간에 존재하는 경계 너머로 손상을 확장할 가능성이 높은 경우에 재관류된 심근에서 발생한다. 보체 활성화가 심근 재관류를 악화시킨다는 강력한 증가가 있지만, 이러한 활성화의 메커니즘은 잘 이해되지 않고 모든 알려진 경로의 억제는 참을 수 없는 해로운 효과를 가질 가능성이 높다. 최근 연구는 활성화가 고전적 경로 또는 대체 증폭 루프 대신에 MBL을 수반할 수도 있는데 (본 발명에서 정의된 바와 같음), 경색이 C1q-, 눌 마우스에서는 아니지만, MBL(A/C)-에서 감소되었기 때문이라고 제안한다 (Walsh M.C.　et　al., Jour of Immunol. 175:541-546 (2005)). 하지만, 고무적이지만, 이 마우스들은 여전히 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화할 수 있는, 피콜린 A와 같은 순환 구성요소를 숨기고 있다.
이 연구는 MASP-2(-/-)가 심근허혈 및 재관류 손상에 덜 민감한지 결정하기 위해 MASP-2(-/-) 마우스 대 야생형 (+/+) 대조군을 조사하였다. MASP-2(-/-) 마우스는 국지적 허혈을 받았고 경색 크기를 그것들의 야생형 한 배 새끼들과 비교하였다.
방법: 다음 프로토콜은 Marber　et　al., J. Clin Invest. 95:1446-1456 (1995)에 의해 이전에 설명된 허혈/재관류 손상을 유발하는 과정에 기초하였다.
MASP-2(-/-) 마우스를 실시예 1에서 설명된 바와 같이 발생시켰고 적어도 10 세대 동안 C57BL/6과 역교배시켰다. 7마리의 MASP-2 (-/-) 마우스 및 7 마리의 야생형 (+/+) 마우스를 케타민/메도토미딘 (각각 100　mg/kg 및 0.2　mg/kg)으로 마취하였고 37 ± 0.3℃로 직장 온도를 유지하기 위해 자동 온도 조절 장치로 제어되는 가열 패드에 눕혀서 배치하였다. 마우스에 직접적인 시야 하에서 관을 삽입하였고 110/분의 호흡 속도 및 225　μl/분의 일회 호흡량으로 실내 공기로 환기 하였다 (Ventilator - Hugo Sachs Elektronic MiniVent Type 845, Germany).
털을 깎았고 전외측 피부 절개는 왼쪽 겨드랑이에서 검상돌기로 이루어 졌다. 대흉근 절개하였고, 흉골 여백에서 잘라냈고 겨드랑이 구멍으로 옮겼다. 소흉근을 두개 여백에서 잘라냈고 꼬리로 옮겼다. 근육을 관상 동맥 폐색 중에 심장을 덮는 근육판으로서 나중에 사용하였다. 제5 늑간격 및 벽측 흉막의 근육을 왼쪽 폐의 구멍의 약간 내측 지점에서 핀셋으로 관통하였고, 따라서 폐 또는 심장의 손상을 막는다. 흉막의 관통 후 핀셋을 조심스럽게 심장을 건드리지 않고 흉막을 너머 흉골로 향하게 하였고, 흉막 및 늑간 근육을 배터리 구동된 소작기로 절개하였다 (Harvard Apparatus, UK). 출혈을 막는데 있어서 특별히 주의하였다. 같은 기술을 사용하여, 개흉을 중간 겨드랑이 선까지 연장하였다. 겨드랑이 구멍에서 제4 갈비뼈를 잘라낸 후, 늑간 공간은 전체 심장이 바닥에서 꼭대기로 노출될 때까지 넓어졌다. 두 개의 소동맥 포셉(forcep)으로 심낭을 열었고 심낭 요람이 심장을 약간 앞쪽으로 움직이게 만들었다. 좌전하행 관상 동맥 (LAD)을 노출시켰고 환침이 있는 8-0 모노필라멘트 구조를 LAD 아래로 통과시켰다. LAD의 결찰 부위는 좌심방의 끝의 꼬리, 방실간 능선에서 좌심실의 꼭대기로 이동하는 선을 따라 약 1/4에 있다.
모든 실험을 맹검 방식으로 수행하였으며, 조사자들은 각 동물의 유전자형을 알지 못한다. 계측 및 수술 과정의 완료 후, 마우스에게 15분 평형화 기간을 허용하였다. 그 다음에 마우스는 관상 동맥 폐색을 경험하였고 재관류 시간은 120분이다.
관상 동맥 폐색 및 재관류 모델
관상 동맥 폐색을 이전에 설명된 바와 같이 행잉 웨이트 시스템(hanging weight system)을 사용하여 달성하였다 (Eckle　et　al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 291:H2533-H2540, 2006). 단일 필라멘트 결합선의 양 끝을 2 mm 긴 조각의 폴리에틸렌 PE-10 튜브를 통과시켰고 시아노아크릴레이트 풀을 사용하여 5-0 구조의 길이에 부착하였다. 그 다음에 구조를 수평으로 장착된 이동 가능한 막대로 향하게 하고, 1 g의 덩어리를 각각 구조의 양 끝에 부착시켰다. 막대의 상승에 의해, 덩어리를 현탁하였고 구조를 한정된 및 일정한 압력으로 LAD의 폐색을 위해 제어된 장력 하에 배치하였다. LAD 폐색을 위험 지역의 창백함으로 확인하였는데, LAD 관류 구역의 색깔은 선홍색에서 보라색으로 바뀌었으며, 혈류의 중단을 나타낸다. 재관류를 덩어리가 작동 패드를 제공할 때까지 막대를 낮춤으로써 달성하였고 결찰의 장력을 완화하였다. 재관류를 폐색을 확인하기 위해 사용된 같은 세 개의 기준으로 확인하였다. 마우스를 세 개의 기준 모두를 각각 관상 동맥 폐색의 시작시 또는 재관류의 15분 내에 충족시키지 않으면 추가의 분석에서 제외하였다. 관상 동맥 폐색 중에, 심장 표면의 온도 및 습도를 심장을 흉근 소근육판으로 덮음으로써 및 0.9% 식염수 젖은 거즈로 개흉을 봉인함으로써 유지하였다.
심근 경색 크기의 측정:
경색 크기 (INF) 및 위험 지역 (AAR)을 면적 측정에 의해 결정하였다. 500 I.U. 헤파린의 정맥 내 주사 후 LAD는 다시 폐색되었고 300　μl 5% (w/vol) 에반스 블루(Evans Blue) (Sigma-Aldrich, Poole, UK)를 위험 지역 (AAR)을 설명하기 위해 경정맥으로 천천히 주사하였다. 이 전략은 염료가 좌심실의 비-허혈성 영역에 들어가게 하고 허혈성 AAR을 염색되지 않은 채로 둔다. 마우스가 자궁 전위에 의해 안락사된 후, 심장을 얼음 위에서 냉각하였고 5% 아가로스의 블록에 장착하였으며 그 다음에 800 μm 두께의 8개의 횡단 슬라이스로 잘랐다. 모든 슬라이스를 pH　7.4로 조정된 0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4 버퍼에 용해된 3% 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드 (Sigma Aldrich, Poole, UK)와 함께 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 슬라이스를 10% 포름알데히드에서 하룻밤 동안 고정하였다. 슬라이스를 두 개의 커버 슬립 사이에 두었고 각 슬라이스의 측면을 고해상도 광 스캐너를 사용하여 디지털 방식으로 이미지화하였다. 그 다음에 디지털 이미지를 SigmaScan software (SPSS, US)를 사용하여 분석하였다. 경색 영역 (옅은 색), 좌심실 (LV) 위험 지역 (빨간 색) 및 정상적으로 관류된 LV 구역 (파란 색)의 크기를
색의 현시 및 색 경계의 확인에 의해 각 섹션에서 요약하였다. 면적을 각 슬라이스의 양 면에서 정량하였고 조사자에 의해 평균을 계산하였다. 각 동물에 대한 위험 지역의 %로서 계산하였다.
결과: 도　51A는 상기 설명된 관상 동맥 폐색 및 재관류 기술을 경험한 후 경색 크기의 결정을 위해 7마리의 WT (+/+) 마우스 및 7마리의 MASP-2 (-/-) 마우스의 평가를 나타낸다. 도 51A에서 나타난 바와 같이 MASP-2 (-/-) 마우스는 WT (+/+) 마우스에 비해 통계적으로 유의한 경색 크기의 감소 (p<0.05)를 나타냈는데, 재관류 손상 모델에서 손상으로부터의 보호적 심근 효과를 나타낸다. 도　51B는 테스트된 개개의 동물의 분포를 나타내는데, MASP-2 (-/-) 마우스에 대하여 분명한 보호 효과를 나타낸다.
실시예 23
이 실시예는 쥐 심근 허혈/재관류 모델에서 MASP-2 (-/-) 마우스의 분석을 설명한다.
배경/근거:
관상 동맥에 대한 허혈성 손상 후 염증성 재관류 손상에 대한 MASP-2의 기여를 평가하기 위해서, MASP-2 (-/-) 및 MASP-2 (+/+) 마우스를 Marber et al., J. Clin Invest. 95:1446-1456 (1995)에 의해 설명된 바와 같이 쥐 허혈/재관류 (MIRP) 모델에서, 및 랑겐도르프 분리된 관류된 마우스 심장 모델에서 비교하였다.
방법:
이 연구에서 사용된 MASP-2 (-/-) 마우스를 실시예 1에서 설명된 바와 같이 발생시켰다. 좌심실에 대한 허혈성 손상을 실시예 22에서 설명된 방법을 사용하여 8마리의 WT (MASP-2 (+/+) 및 11마리의 MASP-2 (-/-) 마우스에서 수행하였다. 경색 크기 (INF) 및 위험 지역 (AAR)을 실시예 22에서 설명된 바와 같이 면적 측정에 의해 결정하였다.
랑겐도르프 분리된-관류된 마우스 심장 모델: 랑겐도르프 분리된-관류된 마우스 심장 모델을 위해 마우스의 심장을 준비하는 방법을 F.J. Sutherland et al., Pharmacol Res 41: 613 (2000)에서 설명된 바와 같이 수행하였다. 또한, A.M. Kabir et al,. Am J Physiol Heart Circ Physiol 291: H1893 (2006); Y. Nishino et al., Circ Res 103:307 (2008) and I.G. Webb et al., Cardiovasc Res (2010)을 참고하면 된다.
간략히 설명하면, WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스를 펜토바비탈 (300 mg/kg) 및 헤파린 (150 유닛)으로 복강 내 마취하였다. 심장을 신속하게 분리하였고 매우 차가운 변형된 크렙스-헨실리트(Krebs-Henselit) 버퍼 (KH, 118.5 mmol/l NaCl, 25.0 mmol/l NaHCO3, 4.75 mmol KCl, KH2PO4 1.18, MgSO4 1.19, D-글루코스 11.0, 및 CaCl2 1.41)에 두었다. 잘라낸 심장을 물 재킷을 구비한 랑겐도르프 장치에 올려놓았고 95% O2 및 5% CO2로 평형화된 KH 버퍼로 80 mm Hg의 일정한 압력으로 관류하였다. 관류액의 온도를 37℃로 유지하였다. 좌심실에 삽입된 유동체가 채워진 기구는 수축 기능을 관찰하였다. 기구를 말단 확장기 압력이 1 내지 7 mm Hg일 때까지 점점 부풀렸다. 심박 페이싱(pacing)을 0.075-mm 은선 (Advent)으로 580 bpm에서 수행하였다. 관상 혈류를 관류액의 시간 설정된 수거에 의해 측정하였다.
시험관 내 경색 평가
역행성 관류가 시작된 후, 심장을 30분 동안 안정화시켰다. 통합적으로, 모든 심장은 다음 기준을 준수해야 한다: 1.5 및 4.5 mL/분 사이의 관상 혈류, 심박동수 >300 bpm (페이싱되지 않음), 좌심실 압력 >55 mm Hg, 개흉에서 대동맥 관삽입술(aortic cannulation)까지의 시간 <3 분, 및 안정화 중에 비 지속성 율동 부정(dysrhythmia). 그 다음에 전 허혈 및 재관류를 혈청의 부재시 실행하였다. 그 다음에 모든 심장은 대동맥 유입 튜빙(tubing)을 클램핑(clamping) 후 이어서, 2시간의 재관류에 의해 30분의 전 허혈을 경험하였다.
전기적 페이싱을 허혈 중에 수축이 중단될 때 중단하였고 30분 후 재관류로 재시작하였다. 2시간의 재관류 후, 심장을 KH 중의 1% 트리페닐 테트라졸리움 클로라이드 (TTC) 5ml로 1분 동안 관류시켰고 그 다음에 37℃에서 10분 동안 동일한 용액에 두었다. 그 다음에 심방을 제거하였고, 심장을 건조시켜, 무게를 측정하였고, -20℃에서 최대 1주일 동안 저장하였다.
그 다음에 심장을 녹였고, 2.5% 글루타르알데히드에 1분 동안 두었고, 5% 아가로스에서 설정하였다. 그 다음에 아가로스 심장 블록을 꼭대기에서 바닥으로 비브라톰(vibratome) (Agar Scientific)을 사용하여 0.7 mm 슬라이스로 절단하였다. 절단 후, 슬라이스를 4℃에서 추가의 날에 PBS로 옮기기 전에 하룻밤 동안 실온에서 10% 포름알데히드에 두었다. 그 다음에 절단면을 Perspex 플레이트 (0.57 mm 거리) 사이에서 압축하였고 스캐너 (Epson 모델 G850A)를 사용하여 이미지화하였다. 확대 후, 면적 측정을 이미지 분석 소프트웨어 (SigmaScan Pro 5.0, SPSS)를 사용하여 수행하였고 전체, 및 TTC-음성 좌심실 심근의 표면적을 조직 두께와 곱셈하여 부피로 형질전환하였다. 각 심장 내에서, 개개의 슬라이스의 합산 후, TTC-음성 경색 부피를 좌심실 부피의 퍼센트로 표현하거나, 또는 이것에 대하여 플롯팅하였다.
결과:
경색 영역 (옅은 색), 좌심실 (LV) 위험 지역 (빨간 색) 및 정상적을 관류된 LV 구역 (파란 색)의 크기를 색의 현시 및 색 경계의 확인에 의해 각 섹션에서 요약하였다. 면적을 각 슬라이스의 양 면에서 정량하였고 조사자에 의해 평균을 계산하였다. 각 동물에 대한 위험 지역의 % (% RZ)로서 계산하였다.
도　52A는 상기 설명된 관상 동맥 폐색 및 재관류 기술을 경험한 후 경색 크기의 결정을 위해 8마리의 WT (+/+) 마우스 및 11마리의 MASP-2 (-/-) 마우스의 평가를 나타낸다. 도　52A는 총 심근 부피의 퍼센트로서 평균 위험 면적 (AAR, 허혈에 의해 영향을 받은 면적의 측정값) 및 경색 부피 (INF, 심근에 대한 손상의 측정값)를 그래프로 도시하였다. 도 52A에서 나타난 바와 같이, 두 군 사이에서 AAR의 차이는 없는 한편, INF 부피는 WT 한 배 새끼와 비교하여 MASP-2 (-/-) 마우스에서 크게 감소하고, 따라서 MIRP의 이 모델에서 MASP-2의 부재시 심근 손상으로부터 보호 효과를 나타낸다.
도　52B는 좌심실 (LV) 심근 부피의 %로서 AAR에 대하여 플롯팅된 INF 사이의 관계를 그래프로 도시한다. 도　52B에서 나타난 바와 같이, 어떤 특정 AAR에 대해서도, MASP-2 (-/-) 동물은 WT 한 배 새끼와 비교하여 경색의 크기의 매우 큰 감소를 나타냈다.
도　52C 및 52D는 랑겐도르프 분리된-관류된 마우스 심장 모델에 따라 제조된 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스의 버퍼-관류된 심장에서 심근 경색의 결과를 나타내는데, 여기에서 전 허혈 및 재관류를 혈청의 부대시 수행하였다. 도　52C 및 52D에서 나타난 바와 같이, MASP-2 (-/-) 및 WT (+/+) 마우스의 심장 사이에서 결과로 얻은 경색 부피 (IFN)에서 어떤 차이도 관찰되지 않았으며, 도 52A 및 52B에서 나타난 경색 크기의 차이가 혈장 인자에 의해 유발되지만, 허혈성 손상에 대한 MASP-2 (-/-) 마우스의 심근 조직의 더 낮은 민감도에 의해서는 아니다.
종합해보면, 이 결과들은 MASP-2 결핍이 쥐 심근 허혈/재관류 모델에서 허혈성 심장의 재관류에 대한 심근 손상을 크게 감소시킨다는 것을 입증하고, 허혈/재관류 손상을 치료하고 예방하기 위한 MASP-2 억제자의 사용을 지지한다.
실시예 24
이 실시예는 새로운 렉틴 경로 매개된 및 MASP-2 의존적인, 보체 C3의 C4-바이패스 활성화의 발견을 설명한다.
근거:
심근 허혈/재관류 손상 (MIRI)을 제한하기 위한 보체 활성화의 억제자 이용의 원칙적인 치료적 이점을 20년 전에 심근 경색의 실험적 래트 모델에서 설득력있게 입증하였다: 재조합 sCR1, 세포 표면 보체 수용체 타입-1의 가용성 절단된 유도체 (CR1)를 정맥 내로 제공하였고 그것의 효과를 MIRI의 래트 생체 내 모델에서 평가하였다. sCR1으로의 치료는 40% 이상만큼 경색 부피를 감소시켰다 (Weisman, H.F., et al., Science 249:146-151 (1990)). 그 이후에 이 재조합 억제자의 치료적 가능성을 MI에 걸린 환자에서 sCR1의 투여는 허혈 후 심장의 수축성 부전을 방지하였다는 것을 나타내는 임상적 시험에서 입증하였다 (Shandelya, S., et al., Circulation 87:536-546 (1993)). 하지만, 허혈성 조직에서 보체의 활성화로 이어지는 주요 메커니즘은 궁극적으로, 주로 적절한 실험 모델의 결핍으로 인해, 산소-고갈된 세포에서 보체 활성화로 이어지는 분자적 공정, 및 다른 보체 활성화 경로 사이의 혼선 및 시너지 효과의 제한된 이해로 정의되지 않았다.
면역 반응의 근본적인 구성요소로서, 보체 시스템은 항체-의존적 및 -독립적 메커니즘을 통해 미생물로의 침입에 대한 보호를 제공한다. 그것은 주화성, 식균 작용, 세포 부착, 및 B-세포 분화를 포함하는 면역 반응 내에서 많은 세포 및 체액의 상호작용을 조율한다. 세 개의 다른 경로, 고전적 경로, 대체 경로, 및 렉틴 경로는 보체 캐스케이드를 시작한다. 고전적 경로 인식 하위 구성요소 C1q는 다양한 표적 - 가장 두드러진 면역 복합체 - 에 결합하여 관련된 세린 프로테아제, C1r 및 C1s의 단계별 활성화를 시작하며, 병원체 및 면역 복합체 제거 후 후천적 면역 시스템에 의한 개입에 대한 주요 메커니즘을 제공한다. C1q의 면역 복합체에 대한 결합은 C1r 치모겐 다이머를 그것의 활성 형태로 전환시켜서 C1s를 분할하고 이로 인해 이것을 활성화한다. C1s는 두 개의 분할 단계에서 C1q 결합을 보체 활성화로 번역한다: 그것은 먼저 C4를 C4a 및 C4b로 전환시키고 그 다음에 C4b-결합된 C2를 분할하여 C3 컨버타제 C4b2a를 형성한다. 이 복합체는 풍부한 혈장 구성요소 C3을 C3a 및 C3b로 전환시킨다. C4b2a 복합체에 아주 근접하여 C3b의 축적은 C3에 대한 기질 특이성을 C5로 옮겨서 C5 컨버타제 C4b2a(C3b)n를 형성한다. 고전적 경로를 통해 생성된 C3 및 C5 컨버타제 복합체는 렉틴 경로 활성화 루트를 통해 생성된 것과 동일하다. 대체 경로에서, 구성요소 C3의 낮은 수준의 자발적 가수분해는 세포 표면에서 단백질 단편의 참착을 일으키며, 외부 세포에서 보체 활성화를 촉발하는 한편, 숙주 조직에서 세포-관련 조절 단백질은 활성화를 막으며, 따라서 자가 손상을 방지한다. 대체 경로와 유사하게, 렉틴 경로는 면역 복합체의 부재시 활성화될 수도 있다. 활성화는 다분자 렉틴 경로 활성화 복합체의 병원체-관련된 분자 패턴 (Pathogen-Associated Molecular Patterns; PAMPs), 주로 바이러스, 균류 또는 바이러스 병원체에 존재하는 탄수화물 구조 또는 세포 사멸성, 괴사성, 악성 또는 산소-유래된 세포에 대한 비정상 글리코실화 패턴으로의 결합에 의해 시작된다 (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556 (2000); Walport, M.J., N. Engl. J. Med. 344:1058-1066 (2001); Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205:455-466 (2002); and Fujita, T., Nat. Rev. Immunol. 2:346-353 (2002)).
만난-결합 렉틴 (MBL)은 MBL-관련 세린 프로테아제 (MASP)로 명명되고 그것들의 발견의 순서에 따라 넘버링된 새로운 세린 프로테아제의 군 (즉, MASP-1, MASP-2 및 MASP-3)과 복합체를 형성하는 것으로 나타난 제1 탄수화물 인식 하위 구성요소였다. 인간에서, 렉틴 경로 활성화 복합체는 다른 탄수화물 결합 특이성을 가진 네 개의 대체 탄수화물 인식 하위 성분, 즉, MBL 2, 및 피콜린 과의 세 개의 다른 멤버, 즉 L-피콜린, H-피콜린 및 M-피콜린 및 MASP와 함께 형성될 수 있다. 두 가지 형태의 MBL, MBL A 및 MBL C, 및 피콜린-A는 마우스 및 래트 혈장에서 MASP와 함께 렉틴 활성화 경로 복합체를 형성한다. 발명자들은 이전에 인간, 마우스 및 래트에서 MASP-2 및 MAp19 또는 sMAP로 불리는 19 kDa의 추가의 절단된 MASP-2 유전자 생성물을 클로닝하였고 이것들로 특성화하였다 (Thiel, S., et al., Nature 386:506-510 (1997);. Stover, C.M., et al., J. Immunol. 162:3481-3490 (1999); Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11:859-863 (1999); and Stover, C.M., et al., J. Immunol. 163:6848-6859 (1999)). MAp19/sMAP는 프로테아제 활성이 전혀 없지만, MASP의 탄수화물 인식 복합체로의 결합에 대하여 경쟁함으로써 렉틴 경로 활성화를 조절할 수도 있다 (Iwaki, D. et al., J. Immunol. 177:8626-8632 (2006)). 세 개의 MASP 중에서, 단지 MASP-2가 렉틴 경로 인식 복합체의 결합을 보체 활성화로 번역하는데 필요하다는 것을 제안하는 강력한 증거가 있다 (Thiel, S., et al. (1997); Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol. 165:2093-2100 (2000); Thiel, S., et al., J. Immunol. 165:878-887 (2000); Rossi, V., et al., J. Biol. Chem. 276:40880-40887 (2001)). 이 결론은 가장 최근에 설명된 MASP-1 및 MASP-3가 결핍된 마우스 계통의 표현형에 의해 강조된다. 렉틴 경로 매개된 보체 활성화의 발생의 지연을 제외하면, 시험관 내-MASP-1/3 결핍 마우스는 렉틴 경로 기능적 활성을 유지한다. MASP-1- 및 MASP-3-결핍 혈청의 재조합 MASP-1로의 재구성은 렉틴 경로 활성화에서 이 지연을 극복하며 MASP-1이 MASP-2 활성화를 용이하게 할 수도 있다는 것을 나타낸다 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)). 최근 연구는 MASP-1 (및 아마도 또한 MASP-3)가 대체 경로 활성화 효소 인자 D를 그것의 치모겐 형태에서 그것의 효소에 의해 활성인 UDXO로 전환하는 것이 필요하다는 것을 나타낸다 (Takahashi, M., et al., J. Exp. Med. 207:29-37 (2010)). 이 공정의 생리학적 중요성은 MASP-1/3 결핍 마우스의 혈장에서 대체 경로 기능적 활성의 부재에 의해 강조된다.
렉틴 경로 탄수화물 인식 하위 구성요소 MBL A 및 MBL C의 조합된 표적화된 결핍을 갖는 최근에 생성된 마우스 계통은 여전히 나머지 쥐 렉틴 경로 인식 하위 구성요소 피콜린 A를 통해 렉틴 경로 활성화를 시작할 수도 있다 (Takahashi, K., et al., Microbes Infect. 4:773-784 (2002)). MASP-2 결핍 마우스에서 어떤 잔여 렉틴 경로 기능적 활성의 부재는 건강한 인간 및 병에 걸린 인간에서 선천적 체액 면역력의 이 효과기 팔의 역할을 연구하는 확실한 모델을 전달한다.
C4- 및 MASP-2-결핍 마우스 계통의 이용 가능성은 발명자들이 보체 C3의, MASP-2-의존적은 아니지만, 새로운 렉틴 경로-특이적 C4-바이패스 활성화 루트를 한정할 수 있게 하였다. 이 새로운 렉틴 경로 매개된 C4-바이패스 활성화 루트의 허혈 후 조직 손실에 대한 필수적인 기여는 MIRI에서 MASP-2 결핍의 두드러진 보호적 표현형에 의해 강조되는 한편, 같은 모델에서 테스트된 C4-결핍 마우스가 보호를 나타내지 않는다.
이 실시예에서, 발명자들은 보체 C3의 새로운 렉틴 경로-매개된 및 MASP-2-의존적 C4-바이패스 활성화를 설명한다. 이 새로운 활성화 루트의 생리학적 타당성은, C4 결핍된 동물이 보호되지 않은 경우에, 심근 허혈/재관류 손상 (MIRI)의 실험 모델에서 MASP-2 결핍의 보호적 표현형에 의해 확립된다.
방법:
MASP-2-결핍 마우스는 총 이상을 나타내지 않는다. MASP-2 결핍 마우스를 실시예 1에서 설명된 바와 같이 생성하였다. 이형 접합성 (+/-) 및 동형 접합성 (-/-) MASP-2 결핍 마우스는 건강하고 생식 가능하며, 총 이상을 나타내지 않는다. 그것들의 기대 수명은 WT 한 배 새끼의 그것과 유사하다 (>18개월). 질환의 실험적 모델에서 이 마우스의 표현형을 연구하기 전에, 발명자들의 MASP-2(-/-) 라인을 11세대 동안 C57BL/6 배경에 역교배시켰다. MASP-2 mRNA의 전체적인 부재를 폴리 A+ 선택된 간 RNA 조제물의 노던 블롯팅에 의해 확인하는 한편, MAp19 또는 sMAP를 암호화하는 1.2kb mRNA (MASP-2 유전자의 절단된 대체 스플라이싱 생성물)는 풍부하게 발현된다.
MASP-2의 세린 프로테아제 도메인의 암호화 서열 (B 사슬) 또는 A-사슬의 암호화 서열의 나머지에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하는 qRT-PCR 분석이 B 사슬 암호화 mRNA는 MASP-2 (-/-) 마우스에서 검출 가능하지 않는 한편, 분열된 A 사슬 mRNA 전사물의 풍부함이 크게 증가했다는 것을 나타낸다. 유사하게, MAp19/sMAP 암호화 mRNA의 풍부함은 MASP-2 (+/-) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 증가하였다. 각 유전자형의 다섯 마리의 동물들에 대하여 ELISA에 의해 결정된 혈장 MASP-2 수준은 WT 대조군에 대하여 300ng/ml (범위 260-330ng/ml), 이형 접합성 마우스에 대하여 360ng/ml (범위 330-395ng/ml)이었고 MASP-2(-/-)마우스에서 검출 불가능했다. qRT-PCR을 사용하여, MASP-2-/- 마우스가 MBL A, MBL C, 피콜린 A, MASP-1, MASP-3, C1q, C1rA, C1sA, 인자 B, 인자 D, C4, 및 C3에 대한 mRNA를 발현한다는 것을 입증하는 mRNA 발현 프로파일을 확립하였다 (데이터 미도시).
MASP-2 (-/-) (n=8) 및 MASP-2 (+/+) (n=7) 한 배 새끼의 혈장 C3 수준을 상업적으로 이용 가능한 마우스 C3 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다 (Kamiya, Biomedical, Seattle, WA). MASP-2 결핍 마우스의 C3 수준 (평균 0.84 mg/ml, +/- 0.34)은 WT 대조군의 그것들 (평균 0.92, +/- 0.37)과 유사했다.
결과:
MASP-2는 렉틴 경로 기능적 활성에 필수적이다.
본원에서 및 제US 7,919,094호에서 설명된 바와 같이, MASP-2-/- 혈장의 시험관 내 분석은 C4 및 C3의 활성화 둘 다를 위해 만난- 및 치모산-코팅된 표면에 대한 렉틴 경로 기능적 활성의 전체적인 부재를 나타냈다. 유사하게, 렉틴 경로-의존적 C4 및 C3 분할 둘 다는 N-아세틸 글루코사민으로 코팅된 표면상의 MASP-2 (-/-) 혈장에서 검출 불가능하며, 이것은 MBL A, MBL C 및 피콜린 A에 결합하고 이것들을 통해 활성화를 촉발한다 (데이터 미도시).
MASP-2 (-/-) 마우스의 혈청 및 혈장의 분석은 MASP-2가 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화하는데 반드시 필요하며 MASP-1, 및 MASP-3 둘 다가 MASP-2 결핍에서 렉틴 경로 활성화를 유지하거나 회복시킬 수 없다는 것을 입증하였다 (데이터 미도시).
하지만, 렉틴 경로 기능적 활성의 전체적인 결핍은 다른 보체 활성화 경로를 온전하게 둔다: MASP-2-/- 혈장은 여전히 고전적 (도 53A) 및 대체 경로 (도 53B)를 통해 보체를 활성화할 수 있다. 도 53A 및 53B에서, 부호 "*"는 WT (MASP-2 (+/+))의 혈청을 나타내고; 부호 "●"는 WT (C1q 결핍됨)의 혈청을 나타내며; 부호 "□"는 MASP-2 (-/-)의 혈청을 나타내고; 부호 "△"는 MASP-2 (-/-) (C1q 결핍됨)의 혈청을 나타낸다.
도 53A는 MASP-2 (-/-) 마우스가 기능적 고전적 경로를 유지한다는 것을 그래프로 도시한다: C3b 침착을 면역 복합체로 코팅된 미세역가 플레이트에서 검정하였다 (BSA로 코팅한 다음에 염소 항-BSA IgG를 추가함으로써 제 자리에서 생성됨). 도 53B는 MASP-2 결핍 마우스가 기능적 대체 경로를 유지한다는 것을 그래프로 도시한다: C3b 침착을 대체 경로 활성화만을 허용하는 조건 하에 치모산 코팅된 미세역가 플레이트에서 검정하였다 (Mg2+ 및 EGTA를 함유하는 버퍼). 도 53A 및 도 53B에서 나타난 결과는 2배수의 평균이고 세 번의 독립적인 실험을 대표한다. 혈청 공급원에 대하여 같은 부호를 내내 사용하였다. 이 결과들은 기능적 대체 경로가 MASP-2 결핍 마우스에 존재한다는 것을 나타내며, 대체 경로를 직접적으로 촉발하는 한편, 고전적 경로 및 렉틴 경로 둘 다를 비활성화하도록 설계된 실험 조건 하에서 도 53B에서 나타난 결과에 의해 증명된 바와 같다.
보체 활성화의 렉틴 경로는 심근 허혈/재관류 손상 (MIRI)에서 염증성 조직 손실에 결정적으로 기여한다.
실시예 23에서 설명된 바와 같이, 렉틴 경로 기능적 활성의 MIRI에 대한 기여를 연구하기 위해, 발명자들은 관상 동맥 (LAD)의 좌전하행 분지의 일시적 결찰 및 재관류 후 MIRI의 모델에서 MASP-2 (-/-) 마우스 및 WT 한 배 새끼 대조군을 비고하였다. 실시예 23에서 설명된 결과는 MASP-2-결핍 동물이 렉틴 경로 충분한 한 배 새끼와 비교하여 크게 감소된 경색 크기 (p<0.01)로 유의한 정도의 보호를 나타낸다는 것을 분명히 입증한다. 보체 C4의 존재 또는 부재는 MIRI에서 허혈성 조직 손실의 정도에 영향을 미치지 않는다. 실시예 23에서 설명된 같은 과정을 사용하여, 발명자들은 실험적 MIRI 후 경색 크기에 대한 C4 결핍의 영향을 평가하였다. 도 54A 및 도 54B에서 나타난 바와 같이, 거의 동일한 경색 크기를 C4-결핍 마우스 및 그것들의 WT 한 배 새끼 둘 다에서 관찰하였다. 도 54A는 C4 (-/-) 마우스 (n=6) 및 해당하는 WT 한 배 새끼 대조군 (n=7)에서 LAD 결찰 및 재관류 후 MIRI-유발된 조직 손실을 그래프로 도시한다. 위험 지역 (AAR) 및 경색 크기 (INF)를 도 52에서 설명된 바와 같이 결정하였다. 도 54B는 AAR의 함수로서 INF를 그래프로 도시하며, C4 (-/-) 마우스는 그것들의 WT 대조군만큼 MIRI에 민감하다는 것을 분명히 입증한다 (파선).
이 결과들은 C4-결핍 마우스들이 MIRI로부터 보호되지 않는다는 것을 입증한다. 이 결과는 예상 밖이었는데, 그것이 주요 C4 활성화 단편, C4b가 고전적 및 렉틴 경로 C3 컨버타제 C4b2a의 필수적인 구성요소라는 널리 수용된 관점과 모순되기 때문이다. 그러므로 발명자들은 보체 C3의 잔여 렉틴 경로 특이적 활성화가 C4-결핍 마우스 및 인간 혈장에서 검출될 수 있는지를 평가하였다.
렉틴 경로는 새로운 MASP-2 의존적 C4-바이패스 활성화 루트를 통해 C4의 부재시 보체 C3을 활성화시킬 수 있다.
C4-결핍 기니피그 혈청에서 C4-바이패스 활성화 루트의 존재를 나타내는 역사적인 보고서에 의해 고무되어 (May, J.E., and M. Frank, J. Immunol. 111:1671-1677 (1973)), 발명자들은 잔여 고전적 또는 렉틴 경로 기능적 활성 및 대체 경로의 기여를 제외하는 경로-특잊거 검정 조건 하에 C3의 관찰된 활성화를 가질 수 있는지를 분석하였다.
C3b 침착을 대체 경로 활성화를 금지하는 혈장 농도 (1.25% 이하)의 칼슘 재침착 혈장을 사용하여 만난-코팅된 미세역가 플레이트에서 검정하였다. C3의 분할이 고전적 경로 활성화에 대하여 테스트된 C4-결핍 혈장에서 검출 불가능한 한편 (데이터 미도시), 강한 잔여 C3 분할 활성을 렉틴 경로를 통해 보체 활성화를 시작할 때 C4-결핍 마우스 혈장에서 관찰하였다. 렉틴 경로 의존성은 가용성 만난과 함께 C4-결핍 혈장 희석액의 사전 배양 후 C3 분할의 경쟁적 억제에 의해 입증된다 (도 55A를 참고하면 된다). 도 55A-D에서 나타난 바와 같이, C3의 MASP-2 의존적 활성화를 C4의 부재시 관찰하였다. 도 55A는 C4 (+/+) (십자가) 및 C4 (-/-) (열린 원) 마우스 혈장에 의한 C3b 침착을 그래프로 도시한다. 검정 전에 과도한 (1 μg/ml) 유체상 만난과 함께 C4 (-/-) 혈장의 사전 배양은 C3 침착을 완전히 억제한다 (채워진 원). 결과는 3번의 독립적인 실험을 대표한다. 도 55B는 WT (십자가), MASP-2 결핍 (열린 사각형) 및 C4 (-/-) (열린 원) 마우스 혈장 (1%)이 다양한 농도의 래트 MASP-2 mAbM11 (가로축)와 혼합되는 실험의 결과를 그래프로 도시하며 C3b 침착은 만난-코팅된 플레이트에서 검정하였다. 결과는 4번의 검정 (각 타입의 혈장 중 2개의 2배수)의 평균 (± SD)이다.
도 55C는 정상 인간 혈장: 1 μg/ml 만난 (채워진 원)과 함께 사전 배양된 풀링된 NHS (십자가), C4 (-/-) 혈장 (열린 원) 및 C4 (-/-) 혈장 - 이 만난-코팅된 웰에서 배양되는 실험의 결과를 그래프로 도시하고 C3b 침착을 측정하였다. 결과는 3번의 독립적 실험의 대표값이다.
도 55D는 인간 MASP-2 mAbH3에 의한 C4-충분 및 C4-결핍 인간 혈장 (1%)에서 C3b 침착의 억제를 그래프로 도시한다 (3배수의 평균 ± SD).
도 55B에서 나타난 바와 같이, 렉틴 경로-의존적 C3 활성화는 동시에 검정된 MASP-2 (-/-) 혈장에서 검출되지 않았으며, 이 C3의 C4-바이패스 활성화 루트는 MASP-2 의존적이라는 것을 나타낸다.
이 발견들을 더 확증하기 위해서, 발명자들은 재조합 인간 및 래트 MASP-2A에 대한 친화도 스크리닝에 의해 파지 디스플레이 항체 라이브러리로부터 분리된 일련의 재조합 억제 mAb를 확립하였다 (활성 프로테아제 도메인의 세린 잔기를 항원의 자가 용해성 분해에 대한 부위-관련된 돌연변이 유발에 의해 알라닌 잔기로 대체하는 경우). MASP-2에 대한 재조합 항체 (AbH3 및 AbM11)를 항원으로서 재조합 인간 및 래트 MASP-2A를 사용하여 (Chen, C.B. and Wallis, J. Biol. Chem. 276:25894-25902 (2001)), 조합의 항체 라이브러리로부터 분리하였다 (Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000)). 마우스 혈장에서 C4 및 C3의 렉틴 경로-매개된 활성화를 잠재적으로 억제하는 항-래트 Fab2 단편 (IC50 ~1 nM)을 전장 IgG2a 항체로 전환하였다. 다클론성 항-쥐 MASP-2A 항혈청을 래트에서 발생시켰다. 이 도구들은 발명자들이 C3의 이 새로운 렉틴 경로 특이적 C4-바이패스 활성화 루트의 MASP-2 의존성을 확인하게 하였으며, 하기 더 설명된 바와 같다.
도 55B에서 나타난 바와 같이, M211, 마우스 및 래트 MASP-2에 선택적으로 결합하는 억제 단클론성 항체는 C4-결핍 마우스에서 C3의 C4-바이패스 활성화, 뿐만 아니라 유사한 IC50 값으로 농도 의존적 방식으로 렉틴 경로를 통한 WT 마우스 혈장의 C3 활성화를 억제하였다. 모든 검정을 대체 경로 활성화 루트를 비기능적으로 만드는 높은 혈장 희석 배수로 수행하였다 (가장 높은 혈장 농도는 1.25%이다).
인간에서 C3의 유사한 렉틴 경로 특이적 C4-바이패스 활성화를 조사하기 위해서, 발명자들은 인간 C4 유전자 둘 다 (즉, C4A 및 C4B)가 유전적으로 결핍된 기증자의 혈장을 분석하였으며, C4의 총 부재를 일으킨다 (Yang, Y., et al., J. Immunol. 173:2803-2814 (2004)). 도 55C는 이 환자의 혈장이 높은 혈장 희석 배수 (대체 활성화 경로를 비기능적으로 만든다)에서 C3를 효과적으로 활성화시킨다는 것을 나타낸다. 만난-코팅된 플레이트에서 C3 활성화의 렉틴 경로 특이적 방식은 과도한 농도의 유체상 만난을 추가함으로써 쥐 C4-결핍 혈청 (도 55A) 및 인간 C4 결핍 혈장 (도 55C)에서 입증된다. 인간 C4-결핍 혈장에서 C3의 이 활성화 메커니즘의 MASP-2 의존성을 AbH3, 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하고 MASP-2 기능적 활성을 제거하는 단클론성 항체를 사용하여 평가하였다. 도 55D에서 나타난 바와 같이, AbH3는 C4-충분 및 C4-결핍 인간 혈장 둘 다에서 C3b (및 C3dg)의 침착을 비슷한 힘으로 억제하였다.
C3의 C4-바이패스 활성화에서 다른 보체 구성요소의 가능한 역할을 평가하기 위해, 발명자들은 렉틴 경로 특이적 및 고전적 경로 특이적 검정 조건 둘 다에서 MASP-2 (-/-), C4 (-/-) 및 C1q (-/-) 혈장 (대조군으로서)과 함께 MASP-1/3 (-/-) 및 Bf/C2 (-/-) 마우스의 혈장을 테스트하였다. C3 분할의 상대적인 양을 WT 혈장을 사용할 때 침착된 C3의 양에 대하여 플롯팅하였다.
도 56A는 렉틴 활성화 경로 또는 고전적 활성화 경로 특이적 검정 조건 하에서 테스트된 다양한 보체 결핍 마우스 계통의 혈장에서 C3 컨버타제 활성의 비교 분석을 그래프로 도시한다. WT 마우스 (n=6), MASP-2 (-/-) 마우스 (n=4), MASP-1/3 (-/-) 마우스 (n=2), C4 (-/-) 마우스 (n=8), C4/MASP-1/3 (-/-) 마우스 (n=8), Bf/C2 (-/-) (n=2) 및 C1q (-/-) 마우스 (n=2)의 희석된 혈장 샘플 (1%)을 동시에 테스트하였다. Bf/C2 (-/-) 혈장의 2.5 μg/ml 재조합 래트 C2 (Bf/C2 (-/-)+C2)와 재구성은 C3b 침착을 회복시켰다. 결과는 평균이다 (± SD). **p<0.01 (WT 혈장과 비교하여). 도 56A에서 나타난 바와 같이, 실질적인 C3 침착은 고전적 경로 특이적 조건은 아니지만, 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에서 테스트된 C4 (-/-) 혈장에서 보인다. 다시 말하면, C3 침착은 렉틴 경로 활성화 루트를 통해 MASP-2 결핍 혈장에서 보이지 않는 한편, 같은 혈장은 고전적 경로를 통해서는 C3을 침착시켰다. MASP-1/3 (-/-) 혈장에서, C3 침착은 렉틴 및 고전적 경로 특이적 검정 조건 둘 다에서 발생하였다. C3 침착은 렉틴 경로 또는 고전적 경로 특이적 조건을 사용하여, C4 및 MAPS-1/3의 조합된 결핍을 갖는 혈장에서 보이지 않았다. C3 침착은 렉틴 경로, 또는 고전적 경로를 통해서, Bf/C2 (-/-)에서 검출 가능하지 않았다. 하지만, C2/Bf-/- 마우스 혈장의 재조합 C2와의 재구성은 렉틴 경로 및 고전적 경로-매개된 C3 분할 둘 다를 회복시켰다. 검정 조건을 C1q (-/-) 혈장을 사용하여 인증하였다. 도 56B는 다양한 보체 결핍 마우스 계통 WT, fB (-/-), C4 (-/-), MASP-1/3(-/-), 및 MASP-2(-/-) 혈장으로부터 혈장의 C3 컨버타제 활성의 시간-분석 동역학을 그래프로 도시하며, 렉틴 활성화 경로 특이적 검정 조건 하에서 테스트하였다 (1% 혈장, 결과는 3번의 독립적인 실험을 대표한다). 도 56B에서 나타난 바와 같이, C3 분할이 MASP-2(-/-) 혈장에서 보이지 않는 한편, fB(-/-) 혈장은 WT 혈장과 유사한 동역학으로 C3를 분할하였다. C3의 C3b (및 C3dg)로의 렉틴 경로-의존적 전환의 상당한 지연이 C4 (-/-), 뿐만 아니라 MASP-1/3 결핍 혈장에서 나타났다. MASP-1/3(-/-) 혈장에서 C3 활성화의 이 지연은 최근에 MASP-3-의존적이 아니라, MASP-1인 것으로 나타났다 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)).
논의:
이 실시예에서 설명된 결과는 MASP-2 기능적 활성이 C4의 존재 및 부재 둘 다에서 렉틴 경로를 통해 C3의 활성화에 필수적이라는 것을 강하게 제안한다. 게다가, C2 및 MASP-1이 작동하기 위해서는 C3의 이 새로운 렉틴 경로 특이적 C4-바이패스 활성화 루트가 필요하다. MASP-2 (-/-), 뿐만 아니라 C4 (-/-) 혈장에서 렉틴 경로 기능적 활성의 비교 분석은 이전에 인식되지 않은 보체 C3의 C4-독립적이지만, MASP-2-의존적 활성화 루트의 존재를 나타냈고 C3이 C4의 총 부재시 렉틴 경로-의존적 방식으로 활성화될 수 있다는 것을 나타냈다. 이 새로운 MASP-2-의존적 C3 컨버타제의 활성화 사건의 상세히 설명된 분자 조성물 및 서열이 설명되어야 하는 것으로 남아있는 한편, 발명자들의 결과는 이 C4-바이패스 활성화 루트가 보체 C2, 뿐만 아니라 MASP-1의 존재를 추가로 필요로 한다는 것을 나타낸다. 조합된 C4 및 MASP-1/3 결핍을 갖는 마우스의 혈장에서 렉틴 경로-매개된 C3 분할 활성의 손실은 MASP-2의 직접적인 분할 및 활성화를 통해 MASP-2-의존적 보체 활성화를 향상시키는 MASP-1의 가장 최근에 설명된 역할에 의해 설명될 수도 있다 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)). 유사하게, MASP-1은 C2를 분할하는 능력을 통해 MASP-2 기능적 활성을 도울 수도 있다 (Moller-Kristensen, et al., Int. Immunol. 19:141-149 (2007)). 두 활성은 MASP-1/3-결핍 혈장이 렉틴 활성화 경로를 통해 C3을 분할하는 감소된 속도 및 MASP-1이 C4-바이패스 활성화 루트를 통해 C3 전환을 유지하는 것이 필요할 수도 있는지를 설명할 수도 있다.
렉틴 경로를 통해 C3을 활성화할 수 없는 C2/fB (-/-) 혈장의 능력은 재조합 래트 C2의 C2/fB (-/-) 혈장으로의 추가가 만난-코팅된 플레이트에서 C3을 활성화하는 재구성된 혈장의 능력을 회복시키기 때문에 C2-의존적인 것으로 나타났다.
C4 결핍이 고전적 보체 활성화 경로를 특이적으로 방해하는 한편 렉틴 경로가 MASP-2 의존적 C4-바이패스 활성화 루트를 통해 C3 컨버타제 활성의 생리학적으로 결정정인 수준을 유지한다는 발견은 실험적 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염을 포함하는, 다양한 질환 모델 (Brown, J. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:16969-16974 (2002)); Experimental Allergic Encephalomyelitis (Boos, L.A., et al., Glia 49:158-160 (2005)); 및 C3 의존적 쥐 간 재생의 모델 (Clark, A., et al., Mol. Immunol. 45:3125-3132 (2008))에서 렉틴 경로의 역할의 재평가를 요청한다. 후자의 군은 인자 B 기능적 활성의 항체-매개된 고갈에 의한 대체 경로의 생체 내 억제가 C4 (-/-) 마우스에서 C3 분할-의존적 간 재생에 영향을 미치지 않았기 때문에 독립적인 방식으로 대체 경로에서 C3을 활성화시킬 수 있다는 것을 입증하였다 (Clark, A., et al. (2008)). C3의 이 렉틴 경로-매개된 C4-바이패스 활성화 루트는 또한 MIRI의 발명자들의 모델에서, 뿐만 아니라 신장 동종 이식편 거부의 이전에 설명된 모델에서 C4 결핍의 보호적 표현형의 결핍을 설명할 수도 있다 (Lin, T., et al., Am. J. Pathol. 168:1241-1248 (2006)). 반대로, 발명자들의 최근 결과는 신장 이식의 모델에서 MASP-2 (-/-) 마우스의 상당한 보호적 표현형을 독립적으로 입증하였다 (Farrar, C.A., et al., Mol. Immunol. 46:2832 (2009)).
요약하면, 이 실시예의 결과는 C3의 MASP-2-의존적 C4-바이패스 활성화가 C4의 이용 가능성이 C3 활성화를 제한하는 조건 하에 중요할 수도 있는 생리학적으로 적절한 메커니즘이라는 견해를 지지한다.
실시예 25
이 실시예는 MASP-2 기능적 활성의 부재가 위장관 허혈/재관류 손상 (GIRI)으로부터 유의한 정도의 보호를 발생시킨다는 것을 입증한다.
근거:
발명자들은 확립된 쥐 모델을 사용하여 GIRI에서 MASP-2의 역할을 조사하였다 (Zhang, M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 3886-3891 (2004); Zhang, M. et al. J. Exp. Med. 203, 141-152 (2006)).
방법:
MASP-2-결핍 마우스를 실시예 1에서 설명된 바와 같이 발생시켰다. MASP-2 (-/-) 마우스 및 WT 한 배 새끼 대조군은 40분 동안 상장간동맥(superior 장간막 동맥)의 수술에 의한 클램핑 후 이어서 3시간 동안의 재관류에 의해 급성 장 허혈을 받았다. GIRI에 대한 수술 프로토콜을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Zhang, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:3886-3891 (2004)). 마취 후, 개복술을 수행하였고 수술용 마이크로클립(microclip)을 상장간동맥 (SMA)에 적용하였다. 40분의 허혈 후, 마이크로클립을 제거하였고 허혈 조직에 3시간 동안 재관류를 허용하였다. 샴(sham) 대조군은 SMA를 클램핑하지 않고 개복술을 경험했다. 재관류 후, 동물을 희생시켰고 말단 공장의 해당 세그먼트를 수확하였다.
장 손상을 공장의 한정된 지역, 조직 절편 당 4 cm에서 200-400개의 융모의 반정량적 병리학 점수로 평가하였다. 저온 유지 장치 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였고, 맹목-코드화하였고, 광학 현미경 하에서 검사하였다. 병리학 점수를 설명된 바와 같이 평가하였다 (Zhang, et al., 2004, 상기). 실험의 첫 번째 세트는 8주령 암컷 MASP-2 (-/-) 및 그것들의 MASP-2 (+/+) 한 배 새끼 대조군에서 GIRI를 평가하였다. 실험의 두 번재 설정에서, 8주령 암컷 WT C57BL/6 마우스의 6개의 군을 연구하였다. 샴-작동된 마우스 및 I/R-작동된 마우스에 식염수; 또는 이소타입 대조군 항체; 또는 MASP-2 항체 mAbM11을 사전 처리하였다. 항체 (각각 1 mg/kg로 투여됨) 또는 식염수를 수술 전 18시간에 복강 내 주사하였다.
결과:
도 57A는 MASP-2 (-/-) 마우스가 창자간막 동맥의 일시적인 (40분) 폐색 및 허혈성 내장 조직의 재관류 후 극심한 GIRI 손상으로부터 유의한 정도의 보호를 나타낸다는 것을 그래프로 도시한다 (스튜던트 테스트(Student's test)에 의해 결정된 바와 같이 *p<0.05). 도 57A에서 나타난 바와 같이, MASP-2 (-/-) 마우스는 WT 한 배 새끼와 비교하여 I/R 조직 손상의 유의한 감소를 갖는다 (MASP-2 (-/-) I/R 군의 병리학 점수: 4 ± 1, n=6; MASP-2 (+/+) I/R 군의 병리학 점수: 11 ± 3, n=7; P <0.05).
MASP-2 기능적 활성의 일시적인 억제가 생체 내에서 선택적 항체-기반 MASP-2 억제자를 적용함으로써 달성될 수 있는지를 평가하기 위해서, 발명자들은 0.6 mg/kg 체중의 용량으로 복강 내 주사 후 쥐 특이적 MASP-2 억제자 mAbM11의 렉틴 경로 억제 활성의 정도 및 기간을 평가하였다. 볼루스 주사 후, 혈액을 시점 0시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 및 7일, 10일, 14일 및 17일에 심장 천자에 의해 수거하였고, 본원에 참고로 포함된 Petersen, et al., J. Immunol. Methods 257:107-116 (2001)에서 설명된 방법에 따라 렉틴 경로-매개된 C4 활성화에 대하여 검정하였다.
도 57B는 재조합 항-쥐 MASP-2 항체 mAbM11의 복강 내 일 회 용량 볼루스 주사 (0.6 mg/kg 체중)에 의해 달성된 렉틴 경로 기능적 활성의 생체 내 절제의 시간 과정 동안 얻어진 결과를 도시한다. 지시된 시점에서, 마우스의 군 (n=3)을 희생시켰고, 혈청을 제조하였으며 LP-의존적 C4 활성화에 대하여 검정하였다. 상대적 LP 기능적 활성을 부재시 (100%) 또는 100nM 차단 항체의 퍼센트 (0%)에서 측정된 나이브 마우스의 풀링된 혈청에서 LP 활성으로 표준화하였다. 결과는 각 시점에 대하여 세 마리 다른 마우스의 혈장 샘플의 평균 (± SEM)이다.
도 57B에서 나타난 결과는 항체 투여 전 렉틴 경로-매개된 C4 활성화의 상대적 퍼센트로서 렉틴 경로 의존적 C4 활성화의 상대적 절제를 예측한다. 결과는 항체-처리가 항체 투여 후 6시간 내 렉틴 경로 기능적 활성의 완벽한 절제를 수득한다는 것을 나타낸다. 렉틴 경로 기능적 활성은 투여 후 최대 48시간 동안 완벽히 결핍되고 최대 7일 동안 유의하게 회복되지 않는다 (항체 처리 전 활성 수준의 10% 미만).
MASP-2 기능적 활성의 치료적 고갈이 GIRI로부터 동물을 보호할 수 있는지를 테스트하기 위해, WT 마우스 (수컷 C57BL/6J, 8-10주령)에 장 I/R 또는 샴 수술 전 18시간에 mAbM11 (복강 내, 1 mg/kg 체중), 또는 부적절한 이소타입 대조군 항체의 동일한 용량 (복강 내, 1 mg/kg 체중) 또는 식염수를 주사하였다.
도 57C는 GIRI 병리의 심각도에 대한 MASP-2 mAb 처리의 보호 효과를 그래프로 도시한다. 마우스에 1 mg/kg의 mAbM11 (n=10) 또는 부적절한 이소타입 대조군 항체 (n=10)를 투여하거나 또는 40분 GI 허혈 후 이어서 3시간의 재관류를 받기 전 24시간에 식염수 (n=10)만을 주사하였다. (MASP-2 억제 항체가 처리된 동물을 부적절한 이소타입 대조군 항체 또는 식염수가 처리된 마우스와 비교할 때 *p<0.05)). 샴 동물 (군 당 n=5)에 클램프가 장간막 동맥에 적용되지 않았다는 것을 제외하고 동일한 방식으로 처리하였다.
도 57D는 GIRI 및 그것들의 각각의 샴 대조군의 유발 전 12시간에 등장성 식염수, 이소타입 대조군 항체 (1 mg/kg 체중), 또는 재조합 쥐 MASP-2 항체 mAbM11 (1 mg/kg 체중)의 일 회-용량 복강 내 주사로 사전-처리된 WT C57BL/6 마우스의 소장의 GIRI-매개된 병리의 조직학적 도면을 나타낸다. 화살표는 GIRI 병리의 전형적인 특징으로서 융모의 루멘 부분에서 상피 하 공간을 가리킨다 (계속되는 상피층 아래 세포 내용물의 결핍을 특징으로 함). (배율, X100).
도 57C 및 57D에서 나타난 바와 같이, 식염수-처리된 마우스가 장 I/R 수술을 받을 때, 그것들은 샴-작동된 대조군과 비교하여 유의한 조직 손상을 갖는다 (25 ± 7, n=10; 대 1 ± 0, n=5, P<0.01). 이소타입 대조군 항체의 사전 처리는 식염수 대조군과 비교하여 I/R 손상으로부터 보호를 제공하지 않았다 (17 ± 2 대 25 ± 7, n=10/군, p>0.05). 반대로, mAbM11의 사전 처리는 이소타입 대조군 항체가 처리된 마우스와 비교하여 2배 이상만큼 조직 I/R 손상을 유의하게 감소시켰다 (8 ± 2 대 17 ± 2, n=10/군, p<0.01). MASP-2 mAb가 처리된 GIRI 군에서 허혈성 장 손상은 샴 대조군에서 나타난 베이스라인 수준으로 감소되지 않았지만 (8 ± 2, n=10, 대 2 ± 1, n=5, p<0.01), 조직 손상의 유의한 스페어링(sparing)은 MASP-2 (-/-) 및 MASP-2 mAb 처리된 동물 둘 다에서 명백하였다. MASP-2 mAb 결과는 허혈성 재관류 손상에서 렉틴 경로의 유해한 역할을 더 인증한다.
논의:
많은 최근의 보고서들은 산소-유래된 세포에서 보체 활성화로 이어지는 메커니즘(들) 및 경로(들)를 명확하게 하는 것을 목표로 하였다. 보체-의존적 GIRI에서 IgM 항체의 개입이 잘 확립되어 있다 (Zhang, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101I3886-3891 (2004); Zhang, M., et al., J. Exp. Med. 203:141-152 (2006)). IgM이 고전적 경로의 강력한 활성자이면, 고전적 경로가 결핍된 마우스 (예를 들어, C1qa (-/-) 마우스)가 보체-의존적 GIRI 및 MIRI로부터 보호된다는 것으로 가정하였다 (실시예 24에서 설명됨). 놀랍게도, 두 번의 최근 연구는 C1qa (-/-) 마우스가 GIRI, 또는 MIRI에서 보호되지 않는 한편, 렉틴 경로 인식 분자 MBL A 및 MBL C가 결핍된 마우스는 GIRI 및 MIRI 둘 다의 유의한 감소를 나타낸다는 것을 입증하였다 (Hart, M.L., et al., J. Immunol. 174:6373-6380 (2005); Walsh, M.C. et al. J. Immunol. 175:541-546 (2005)). 이 발견들은 두 번의 그 다음 GIRI 연구에서 확인되었는데, 이것은 IgM-의존적 보체 활성화의 중요한 전염증성 기여가 자가 반응성 IgM 및 MBL 사이의 직접적인 상호작용을 통해 렉틴 활성화 경로를 활용하는 고전적 경로 활성의 부재시 발생한다는 것을 확인하였다 (Zhang, M., et al., J. Immunol. 177:4727-4734 (2006); McMullen, M.E., et al., Immunobiology 211:759-766 (2006)). 반대로, 같은 MBL 눌 계통 (즉, MBL 눌 마우스는 피콜린 A를 통해 잔여 렉틴 경로 기능적 활성을 유지한다)을 신장 IRI의 모델에서 테스트하였고, 조직 손상으로부터 중간 정도의 보호만을 나타냈다 (Moller-Kristensen, M., et al., Scand. J. Immunol. 61:426-434 (2005)).
종합해보면, 이 연구들은 MBL 눌 마우스에서 보호의 정도가 IRI를 매개하는데 있어서 나머지 렉틴 경로 인식 분자 피콜린 A의 역할이 아직 이해되지 않았기 때문에, IRI의 다른 실험 모델 사이에서 다를 수도 있다는 것을 제안한다. 인간에서, 발명자들은 최근에 혈장 MBL이 복부 동맥류 회복 수술 중에 수술-유발된 허혈 후재관류 단계에서 신속하게 소모된다는 것을 나타냈다 (Norwood, M.G., et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 31:239-243 (2006)). 인간에서, 상황은 MBL 이외에 세 개의 다른 피콜린이 렉틴 경로 인식 하위 구성요소의 역할을 할 수도 있기 때문에 더 복잡할 수도 있다.
MIRI의 모델에서 MASP-2 (-/-) 마우스를 활용하여, 발명자들은 렉틴 경로 기능적 활성이 심근 조직의 주요 손실로 이어지는 염증성 공정의 필수적인 구성요소라는 것을 입증하였다. MASP-2 (-/-) 마우스는 여전히 고전적 또는 대체 경로를 통해 보체를 활성화할 수도 있지만 잔여 렉틴 경로 기능적 활성이 전혀 없는 한편, 혈장에 존재하는 세 개의 쥐 렉틴 경로 패턴 인식 분자, MBL A, MBL C 및 피콜린 A 모두를 갖고 있다. 게다가, MASP-2 기능적 활성은 또한 GIRI의 모델에서 허혈 후 염증성 병리를 구동하는데 있어서 필수적인 구성요소인 것으로 나타났으며, MASP-2 (-/-) 및 MASP-2 (+/+) 동물에서 GIRI-매개된 조직 손상의 점수를 매김으로써 관찰되었다. 우리의 결과는 고전적 및 대체 경로 보체 활성화 루트가 렉틴 경로 기능적 활성의 부재시 허혈 후 조직 손상의 염증성 병리를 시작하는데 충분하지 않다는 것을 명백하게 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 대체 경로가 다른 조직에서 보체 활성화의 증가에 이차적으로 기여할 수도 있다는 것은 그럴 듯 하다. 이것은 허혈성 급성 신부전의 모델에서 인자 B의 결핍이 허혈 후 염증성 조직 손실을 개선할 수도 있는 이유를 설명할 것이다 (Thurman, J.M., et al., J. Immunol. 170:1517-1523 (2003)).
마지막으로, MASP-2 결핍의 표현형 및 치료적 간섭에 대한 영향에 관하여, 발명자들의 결과는 MASP-2 및 렉틴 경로 기능적 활성의 일시적 및 지속적 차단이 억제 MASP-2 특이적 단클론성 항체의 전신성 적용에 의해 생체 내에서 달성될 수 있다는 것을 입증한다. 생체 내에서 비교적 낮은 용량의 억제 항체를 사용하여 MASP-2 기능적 활성을 억제하는데 있어서 높은 효능은 혈장에서 MASP-2의 비교적 낮은 풍부함 (마우스 혈장에서 260 내지 330 ng/ml (결과 참조) 및 인간 혈장에서 170 내지 1196 ng/ml의 범위 (Moller-Kristensen, M., et al., J. Immunol. Methods 282:159-167 (2003)), 및 간 외부의 MASP-2 생합성의 엄격한 부재 (Stover, C.M., et al, J. Immunol. 163:6848-6859 (1999); Endo, Y., et al., Int. Immunol. 14:1193-1201 (2002))로 인해 치료적으로 실행 가능할 수도 있다. 그러므로, MASP-2에 대한 억제 단클론성 항체의 투여에 의한 MASP-2의 억제가 허혈-유발된 염증성 병리를 치료하는데 효과적일 것이라고 생각된다.
실시예 26
이 실시예는 MASP-2 (-/-) 마우스 모델에서 MASP-2 기능적 활성의 부재가 뇌 허혈/재관류 손상 (뇌졸중)으로부터 유의한 정도의 보호를 발생시킨다는 것을 입증한다.
방법:
세 개의 혈관 폐색 (3VO) 수술:
일시적 허혈증을 Yanamoto et al., Exp Neurology 182(2):261-274 (2003)에 의해 설명된 바와 같이 세 개의 혈관 폐색 (3VO)에 의해 도입하였다. 간략히 설명하면, 8-18주령의 암컷 C57/Bl6 마우스에 수술 후 통증을 최소화하기 위한 조작 전에 Vetergesic (진통제)을 투여하였다. 동물을 O2/N2O가 들어있는 3% 내지 4% 이소플루오레인으로 마취한 후 이어서, 마취 유지를 위해 이소플루오레인을 0.5 내지 1.5%로 감소시켰다. 두 개의 총 경동맥 (common carotid arter; CCA)을 목의 전면 정중선 절개를 통해 노출시킨 후 이어서, 동맥류 클립으로 왼쪽 CCA를 고정하였다. 이것은 동측성 중뇌동맥 (middle cerebral artery; MCA)에 소작(cauterize)하기 위한 과정 중에 출혈을 감소시킨다. 왼쪽 CCA를 클립으로 고정한 후, 왼쪽 관골궁(zygomatic arch)을 제거하여 두개골 및 중뇌동맥에 접근을 가능하게 했다. 1 mm 두께의 드릴 구멍을 열어서 MCA로의 접근을 허용한 후 이어서 이극성 응고제 (Aura, Kirwan Surgical Products)를 사용하여 영구적으로 소작하였다. MCA 폐색 후, 오른쪽 CCA을 클립으로 고정함으로써 허혈증을 30분 동안 유발하였다. 허혈 시간 중에 머리 상처를 닫았다. 허혈의 종료 후 클립 두 개를 제거하여 24시간 동안 재관류를 허용하고 동물들을 자궁 전위에 의해 이후에 도태시켰다.
경색 크기 결정
24시간의 재관류 후, 마우스를 자궁 전위를 통해 살해하였고 그것들의 뇌를 제거하였으며 미리 냉각된 뇌 기질을 사용하여 1 mm 두께 슬라이스로 잘랐다. 허혈증 후 경색 부피를 2, 3, 5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드 (TTC)를 사용하는 믿을만한 방법을 통해 결정하였는데, 이것은 미토콘드리아 활성의 대사성 세포 지표이며, Bederson, J.B. et al., Stroke 17:1304-1308 (1986) 및 Lin T.N. et al, Stroke 24:117-121 (1993)에서 설명된 바와 같다. 이 검정에서, 뇌 절편에서 빨간 색 (흑백 사진에서는 어두운 영역으로 나타남)은 정상, 비-경색 조직을 나타내는 반면에 색깔이 없는, 흰색 영역은 경색 조직을 나타낸다 (Bederson et al., 1986). 뇌의 절편에서, 슬라이스를 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 식염수 중의 2% TTC로 염색하였다. 그 후에 절편을 10% 포르말린으로 고정하였고 4℃의 어두운 곳에서 저장하였다. 디지털 이미지를 촬영하였고 경색 부피를 계산하기 위해 Scion Image Software에서 분석하였다. 경색 부피를 부종에 의한 경색 영역의 과측정을 방지하기 위해 다음과 같이 계산하였다:
경색 부피 = 경색 영역 / (동측 영역 / 반대쪽 영역) x 1　mm (슬라이스의 두께)
결과:
도 58은 30분 허혈 및 24시간 재관류 후 WT 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 뇌 경색 부피를 그래프로 도시한다. 도 58에서 나타난 바와 같이, 3-VO 후 경색 부피는 WT와 비교하여 MASP-2 (-/-) 마우스에서 유의하게 감소하였다 (MASP-2 (+/+) 마우스 (p=0.0001)).
도 59A는 30분 허혈 및 24시간 재관류 후 WT (MASP-2 +/+) 마우스의 일련의 뇌 절편을 나타낸다. 도 59A의 패널 1-8은, 청신경의 출구 (Bregma 0)에 관하여, 각각 Bregma 1-8에 해당하는 뇌의 다른 절편 영역을 나타낸다.
도 59B는 30분 허혈 및 24시간 재관류 후 MASP-2 (-/-) 마우스의 일련의 뇌 절편을 나타낸다. 도 59B의 패널 1-8은, 청신경의 존재 (Bregma 0)에 관하여, 각각 Bregma 1-8에 해당하는 뇌의 다른 절편 영역을 나타낸다.
도 59A 및 59B에서 나타난 뇌 절편에[ 대하여 측정된 경색 부피는 하기 표 21에서 제공된다.
30분 동안 MCA 폐색 후 이어서 24시간 재관류가 처리된 마우스의 뇌 절편으로부터 경색 부피 측정 (도 59A 및 59B에서 나타남)
도 (참조 패널) 유전자형 BREGMA
(청신경의 출구에 관하여, Bregma=0)		 경색 부피
도 59A-1 WT (MASP2 +/+) 1 1.70 mm
도 59A-2 WT (MASP2 +/+) 2 0.74 mm
도 59A-3 WT (MASP2 +/+) 3 -0.10 mm
도 59A-4 WT (MASP2 +/+) 4 -0.82 mm
도 59A-5 WT (MASP2 +/+) 5 -1.82 mm
도 59A-6 WT (MASP2 +/+) 6 -3.08 mm
도 59A-7 WT (MASP2 +/+) 7 -4.04 mm
도 59A-8 WT (MASP2 +/+) 8 -4.60 mm
도 59B-1 MASP2 (-/-) 1 1.54 mm
도 59B-2 MASP2 (-/-) 2 0.98 mm
도 59B-3 MASP2 (-/-) 3 -0.46 mm
도 59B-4 MASP2 (-/-) 4 -1.22 mm
도 59B-5 MASP2 (-/-) 5 -1.70 mm
도 59B-6 MASP2 (-/-) 6 -2.80 mm
도 59B-7 MASP2 (-/-) 7 -4.36 mm
도 59B-8 MASP2 (-/-) 8 -4.72 mm
도 59A, 59B 및 표 21에서 나타난 바와 같이, MASP-2-결핍은 일시적 뇌 허혈증 (30분 동안 MCAO)에 이은 24시간 재관류 후 조직 손실을 제한한다. 이 결과들은 MASP-2 (-/-) 마우스 모델에서 MASP-2 기능적 활성의 부재가 뇌 허혈/재관류 손상 (뇌졸중)으로부터 유의한 정도의 보호를 발생시킨다는 것을 입증한다. 실시예 27
이 실시예는 쥐 단클론성 항체 유발된 류머티스성 관절염 모델에서 MASP-2(-/-)의 결과를 설명한다.
배경/근거: 류머티스성 관절염 (RA)에 대하여 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델은 콜라겐-유발된 관절염 (CIA)이다 (최근의 검토를 위해, Linton and Morgan, Mol. Immunol. 36:905-14, 1999를 참고하면 된다). 콜라겐 타입 II (CII)는 관절 매트릭스 단백질의 주요 구성 성분 중 하나이이며 보조제 중 고유한 CII로의 면역화는 관절 연골에서 CII에 대한 교차반응성 자가 면역 반응에 의해 자가 면역 다발성 관절염을 유발한다. RA에서와 같이, CIA에 대한 민감도는 특정 등급 II MHC 대립유전자의 발현과 관련된다. C57BL/6을 포함하는 마우스의 일부 계통은 등급 CIA에 대하여 저항성인데 그것들은 적절한 MHC 일배체형이 결핍되고 그러므로 높은 CII 항체 역가를 생성하지 않기 때문이다. 하지만,
일관성 관절염은 타입 II 콜라겐에 대한 네 개의 특이적인 단클론성 항체 (Col2 MoAb)의 칵테일의 마우스로의 정맥 내 또는 복강 내 투여에 의해 모든 계통의 마우스에서 유발될 수 있다는 것을 발견하였다. 이 관절염 유발성 단클론성 항체는 상업적으로 이용 가능하다 (Chondrex, Inc., Redmond, WA). CIA의 이 수동적인 전이 모델은 C57BL/6 마우스 계통을 사용하는 많은 최근 발표된 보고서에서 성공적으로 사용되었다 (Kagari　et　al., J. Immunol. 169:1459-66, 2002; Kato　et　al., J. Rheumatol. 30:247-55, 2003; Banda　et　al, J. Immunol. 177:1904-12, 2006). 다음 연구는 CIA의 수동적 전이 모델을 사용하여 관절염을 발달시키기 위해 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스의 민감도를 비교하였고, 둘 다 C57BL/6 유전적 배경을 공유한다.
방법:
동물: MASP-2(-/-) mouse을 실시예 1에서 설명된 바와 같이 발생시켰고 C57BL/6과 10세대 동안 역교배시켰다. 항체 주입시 7 내지 10주령인 14마리의 수컷 및 암컷 C57BL/6 야생형 마우스 및 항체 주입시 7 내지 8주령인 10마리의 암컷 및 수컷 MASP-2(-/-) 및 WT (+/+) C57BL/6 마우스를 이 연구에 사용하였다. 12마리의 마우스에 단클론성 항체 칵테일을 주입하여 20마리의 견고한 반응자를 얻었다 (10마리 씩 두개의 군). 동물 (10마리/군)을 5마리의 동물/케이지로 사육하였고, 연구를 시작하기 전 5 내지 7일 동안 적응시켰다.
마우스에 단클론성 항체 칵테일을 제0 일 및 제1 일에 정맥 내 주사하였다 (Chondrex, Redmond WA) (5　mg). 테스트 약제는 Chondrex의 단클론성 항체 (Col2 MoAb) + LPS였다. 제2 일에, 마우스에 LPS를 복강 내 투여하였다. 마우스를 제0 일, 제2 일, 제4 일, 제6 일, 제8 일, 제10 일, 제12 일 및 제 14일에 종료 전에 중량을 측정하였다. 제14 일에 마우스를 이소플루란으로 마취하였고 혈청을 위해 말기에 채혈하였다. 혈액 수거 후, 마우스를 안락사시켰고, 앞다리 및 무릎과 함께 뒷다리를 제거하였으며, 이것들은 미래의 처리를 위해 포르말린에 넣어두었다.
처리 군:
군 1 (대조군): 계통 C57/BL/6 WT (+/+)의 4마리의 마우스;
군 2 (테스트): 계통 C57/BL/6 WT (+/+)의 10마리의 마우스 (Col2 MoAb 플러스 LPS를 받음); 및
군 3 (테스트): 계통 C57/BL/MASP-2KO/6Ai (-/-)의 10마리의 마우스 (Col2 MoAb mAb 플러스 LPS를 받음)
임상적 관절염 점수를 다음 채점 시스템을 사용하여 매일 평가하였다: 0　=　정상; 1= 1개의 후지 또는 전지 관절이 영향을 받음; 2= 2개의 후지 또는 전지 관절이 영향을 받음; 3=　3개의 후지 또는 전지 관절이 영향을 받음; 4= 중간 (홍반 및 보통의 부기, 또는 4개의 발가락 관절이 영향을 받음); 5= 심각함 (확산 홍반 및 전체 사지의 극심한 부기, 발가락을 구부릴 수 없음).
결과:
도　60은 최대 2주 동안 평균 매일의 임상적 관절염 점수에 대하여 플롯팅된 군 데이터를 나타낸다. 임상적 관절염 점수는 CoL2 MoAb 처리를 받지 않은 대조군에서 나타나지 않았다. MASP (-/-) 마우스는 제9 일에서 제14 일까지 더 낮은 임상적 관절염 점수를 갖고 있었다. 곡선 아래 면적 (AUC) 분석된 전체적인 임상적 관절염 점수는 WT (+/+) 마우스보다 MASP-2 (-/-) 군에서 21% 감소를 나타냈다. 하지만, 이전에 논의된 C57Bl6 마우스 배경은 강력한 전체적인 관절염 임상적 점수를 제공하지 않았다. 낮은 발생율 및 작은 군 크기로 인해, 추세는 긍정적인 한편, 데이터는 추세만을 제공하였고 (p　=　0.1) p < 0.05 수준에서 통계학적으로 유의하지 않았다. 처리군에서 추가의 동물들이 통계학적 유의성을 나타내는데 필요할 것이다. 관절염의 감소된 발생율로 인해, 영향을 받은 발 점수를 심각도에 대하여 평가하였다. 3 이상의 임상적 관절염 점수의 일 회 발생은 MASP-2 (-/-) 마우스 중 어떤 것에서도 보이지 않았으며, 이것은 WT (+/+) 마우스 중 30%에서 나타났고, (1) 관절염의 심각도는 보체 경로 활성화에 관련될 수도 있고 (2) MASP-2의 차단이 관절염에서 이로운 효과를 가질 수도 있다는 것을 더 제안하였다.
실시예 28
이 실시예는 천식의 모델로서 렉틴 경로 매개된 C3 활성화의 강한 활성자로서 순수한 집먼지 진드기 알레르겐의 사용을 입증한다.
근거:
집먼지 진드기 (HDM)-유발된 알레르기성 천식의 잘 특성화된 마우스 모델이 개발되었다. X. Zhang et al., J. of Immunol. 182:5123-5130 (2009)를 참고하면 되며, 본원에서 참고로 포함된다. Zhang et al. (2009)에서 설명된 바와 같이, 모델은 3주의 과정 동안 일주일에 한 번 마우스를 기관 내 HDM에 노출하는 단계를 수반한다. 기관 내 HDM 투여는 기도 반응성, BAL 유동체 중의 총 세포 수 및 호산구 수, 뿐만 아니라 WT BALB/c 마우스에서 혈청 총 IgE 및 알레르겐-특이적 IgE 수준을 을 크게 증가시킨다. 이 모델은 천식에 대한 치료제로서 MASP-2 mab의 사용을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
방법:
C3 침착 검정을 WT 마우스로부터 얻은 혈청 샘플로 수행하였다. C3 활성화를 측정하기 위해, 미세역가 플레이트를 만난 (1 μg/웰), 그 다음에 TBS/Tween/Ca2+ 중의 양 항-HSA 혈청 (2μg/ml)으로 코팅하였다. 플레이트를 TBS 중의 0.1% HSA로 차단하였고 상기와 같이 세척하였다. 혈장 샘플을 4 mM 바비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4에서 희석하였고, 플레이트에 추가하였고 37℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. 세척 후, 결합된 C3b를 토끼 항-인간 C3c (Dako)에 이어서,
알칼린 포스파타제-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG 및 pNPP를 사용하여 검출하였다.
결과:
도 61는 집먼지 진드기 또는 치모산의 존재시 WT 마우스로부터 얻은 혈청 샘플에서 C3 침착 검정의 결과를 그래프로 도시한다. 도 61에서 나타난 바와 같이, 집먼지 진드기 알레르겐은 렉틴 경로 매개된 C3 활성화의 강한 활성자이며, 치모산과 거의 같은 수준으로 C3을 활성화시킨다. 이 결과들은 집먼지 진드기 알레르겐이 렉틴 경로를 자극할 수 있다는 것을 나타낸다. MASP-2 항체가 대체 보체 경로의 활성화를 차단하는 것으로 나타난 사실을 고려해서, MASP-2 항체가 집먼지 진드기 알레르겐-민감한 개인으로 인해 천식을 치료하는데 있어서 치료제로서 효과적일 것으로 예상된다.
실시예 29
이 실시예는 트롬빈 활성화가 생리학적 조건 하에 다음 렉틴 경로 활성화를 일으킬 수 있다는 것을 입증하며 MASP-2 수반의 정도를 입증한다. 정상 래트 혈청에서, 렉틴 경로의 활성화는 보체 활성화 (C4 침착으로 평가됨)와 동시에 트롬빈 활성화 (트롬빈 침착으로 평가됨)로 이어진다. 도 62A 및 62B에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 시스템에서 트롬빈 활성화는 MASP-2 차단 항체, H1 (Fab2 포맷)에 의해 억제되며, 보체 활성화에 대한 억제 농도-반응 곡선 (도　62A)과 유사한 억제 농도-반응 곡선 (도 62B)을 나타낸다. 이 데이터들은 렉틴 경로의 활성화가 외상에서 발생하기 때문에 MASP-2에 전적으로 의존적인 공정에서 보체 시스템 및 응고 시스템 둘 다의 활성화로 이어질 것이다. 추론해보면, MASP-2 차단 항체는 과도한 전신성 응고, 예를 들어파종성 혈관 내 응고의 경우를 완화하는데 있어서 효과적인 것을 입증할 수도 있는데, 이것은 주요 외상 경우에 치사로 이어지는 홀마크 중 하나이다.
실시예 30
이 실시예는 DIC에서 렉틴 경로의 역할을 평가하기 위해 MASP-2 (-/-) 및 WT (+/+)마우스에서 파종성 혈관 내 응고 ("DIC")의 국소화된 슈바르츠만 반응 모델을 사용하여 생성된 결과를 제공한다.
배경/근거:
상기 설명된 바와 같이, MASP-2의 차단은 렉틴 경로 활성화를 억제하고 C3a 및 C5a의 아나필라톡신 둘 다의 생성을 감소시킨다. C3a 아나필라톡신은
시험관 내에서 강한 혈소판 응집자인 것으로 나타날 수 있지만, 생체 내에서 그것들의 수반은 덜 잘 한정되어 있고 상처 회복에서 혈소판 기질 및 플라스민의 방출은 이차적으로만 보체 C3을 수반할 수도 있다. 이 실시예에서, 렉틴 경로의 역할을 해결하기 위해 MASP-2 (-/-) 및 WT (+/+) 마우스에서 분석하였다.
방법:
이 연구에 사용된 MASP-2 (-/-) 마우스를 실시예 1에서 설명된 바와 같이 발생시켰다. 국소화된 슈바르츠만 반응 (LSR) 모델을 이 실험에 사용하였다. LSR은 지질다당류 (LPS)-유발된 반응이며 선천적 면역 시스템의 세포적 및 체액적 요소로부터의 기여를 특징으로 한다. 보체에 대한 LSR의 의존성이 잘 확립되어 있다 (Polak,　L., et al., Nature 223:738-739 (1969); Fong J.S. et al., J Exp Med 134:642-655 (1971)). LSR 모델에서, 마우스를 TNF 알파로 4시간 동안 프라이밍(primed)하였고 (500 ng, 음낭 내), 그 다음에 마우스를 마취하였고 고환 거근의 생존 중 형미경 관찰을 준비하였다. 양호한 혈류 (1-4 mm/s)를 갖는 후모세관 정맥 (15-60 μm 지름) 망을 관찰을 위해 선택하였다. 동물들에 호중구, 또는 혈소판에 선택적으로 표지하기 위해 형광 항체를 처리하였다. 혈관망을 순차적으로 스캔하였고 모든 혈관의 이미지를 나중의 분석을 위해 디지털 방식으로 기록하였다. 미소순환의 기초 상태를 기록한 후, 마우스는, 단독으로 하기 나열된 약제와 함께, LPS (100 μg)의 일 회 정맥 내 주사를 받았다. 그 다음에 같은 혈관망을 1시간 동안 10분 마다 스캔하였다. 형광단의 특이적 누적을 배경 형광을 뺌으로서 확인하였고 이미지를 임계화함으로써 향상시켰다. 반응의 정도를 기록된 이미지로부터 측정하였다. LSR의 1차 측정값은 총 데이터였다.
연구는 알려진 보체 경로 고갈제, 코브라 독 인자 (CVF), 또는 말단 경로 억제자 (C5aR 길항제)에 노출된 WT (+/+) 마우스를 비교하였다. 결과 (도 63A)는 CVF, 뿐만 아니라 C5aR 길항제 둘 다가 맥관 구조에서 응집체의 출현을 방지했다는 것을 입증한다. 게다가, MASP-2 (-/-) 마우스 (도 63B)는 또한
국소화된 슈바르츠만 반응의 완전한 억제를 입증하였으며, 렉틴 경로 수반을 지지한다. 이 결과들은 DIC 발생에서 MASP-2의 역할을 입증하고 DIC의 치료 및 예방을 위해 MASP-2 억제자의 사용을 지지한다.
실시예 31
이 실시예는 트롬빈 기질에 의한 C3의 활성화 및 WT (+/+), MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11/C4 (-/-) 및 C4 (-/-) 마우스에서 만난에 C3 침착을 설명한다.
근거:
실시예 29에서 설명된 바와 같이, 트롬빈 활성화가 생리학적 조건 하에 다음 렉틴 경로 활성화를 일으킬 수 있다는 것이 결정되었고, MASP-2 수반의 정도를 입증한다. C3은 보체 시스템의 활성화에서 중심 역할을 한다. C3 활성화는 고전적 및 대체 보체 활성화 경로 둘 다에 필요하다. 실험을 C3가 트롬빈 기질에 의해 활성화되는지 결정하기 위해 수행하였다.
방법:
트롬빈 기질에 의한 C3 활성화
C3의 활성화를 다음 활성화된 형태의 트롬빈 기질, 인간 FXIa, 인간 FVIIa, 소 FXa, 인간 FXa, 인간 활성화된 단백질 C, 및 인간 트롬빈의 존재시 측정하였다. C3을 다양한 트롬빈 기질과 함께 배양하였고, 그 다음에 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 환원 조건 하에서 분리하였다. 셀룰로스 막을 사용하는 전기 영동 이동 후, 막을 단클론성 비오틴-커플링된 래트 항-마우스 C3과 함께 배양하였으며, 스트렙타비딘-HRP 키트로 검출하였고 ECL 시약을 사용하여 현상하였다.
결과:
C3의 활성화는 온전한 a-사슬의 절단된 a' 사슬 및 가용성 C3a로의 분할을 수반한다. 도 64는 트롬빈 기질에 의한 인간 C3의 활성화에 대한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타내며, 비분할된 C3 알파 사슬, 및 활성화 생성물 a' 사슬은 화살표로 나타낸다. 도 64에서 나타난 바와 같이, 활성화된 형태의 인간 응고 인자 XI 및 인자 X, 뿐만 아니라 활성화된 소 응고 인자 X와 함께 C3의 배양은 어떤 보체 프로테아제의 부재시에도 시험관 내에서 C3을 분할할 수 있다.
만난에서 C3 침착
C3 침착 검정을 WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4(-/-) 및 C4(-/-)로부터 얻어진 혈청에서 수행하였다. F11은 응고 인자 XI를 암호화하는 유전자이다. C3 활성화를 측정하기 위해, 미세역가 플레이트를 만난 (1 μg/웰), 그 다음에 TBS/Tween/Ca2+ 중 양 항-HSA 혈청 (2 μg/ml)으로 코팅하였다.플레이트를 TBS 중 0.1% HSA로 츠단하였고 상기와 같이 세척하였다. 혈장 샘플을 4 mM 바비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4에서 희석하였고, 플레이트에 추가하였고 37℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. 세척 후, 결합된 C3b를 토끼 항-인간 C3c (Dako)에 이어서, 알칼린 포스파타제-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG 및 pNPP를 사용하여 검출하였다.
결과:
도 65는 WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4 (-/-) 및 C4 (-/-)로부터 얻어진 혈청 샘플에서 C3 침착 검정의 결과를 나타낸다. 도 65에서 나타난 바와 같이, C4의 완벽한 부재시에도 기능적 렉틴 경로가 있다. 도 65에서 더 나타난 바와 같이, 이 새로운 렉틴 경로-의존적 보체 활성화는 응고 인자 XI를 필요로 한다.
논의:
이 실험에서 얻어진 결과 이전에, 당업자들에 의해 보체의 렉틴 경로가 활성을 위해 C4를 필요로 한다고 생각되었다. 이로 인해, C4 넉아웃 마우스 (및 C4 결핍 인간)의 데이터를 이러한 유기체가 렉틴 경로-결핍이라는 (고전적 경로 결핍 이외에) 추정으로 해석하였다. 본 결과는 이 개념이 거짓이라는 것을 입증한다. 따라서, 렉틴 경로가 C4-결핍 동물의 표현형에 기초하는 특정 질환 설정에 중요하지 않았다는 것을 제안하는 과거 연구의 결론은 거짓일 수도 있다. 실시예 24에서 설명된 바와 같이, 발명자들은 MASP-2 넉아웃 마우스가 보호되는 한편 C4 넉아웃 마우스는 그렇지 않은 심근 경색 모델에 대해서 이것을 입증하였다.
이 실시예에서 설명된 데이터는 또한 전체 혈청의 생리학적 맥락에서 렉틴 경로가 응고 캐스케이드의 구성요소를 활성화할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, MASP-2를 수반하는, 보체 및 응고 사이의 혼선이 있다는 것이 입증된다.
실시예 32
이 연구는 LPS (지질다당류)-유발된 혈전증의 마우스 모델에서 MASP-2-결핍의 효과를 조사한다.
근거:
쉬가 독소-생산 대장균 감염에 의해 유발되는 용혈성 요독 증후군 (HUS)은 아동에서 급성 신부전의 주요 원인이다. 이 실시예에서, LPS-유발된 혈전증 (미세 혈관 응고)의 슈바르츠만 모델을 MASP-2 억제가 혈관 내 트롬빈의 형성을 억제하거나 방지하는데 효과적인지를 결정하기 위해 MASP-2 (-/-) 마우스에서 수행하였다.
방법:
MASP-2 (-/-) (n=9) 및 WT (n=10) 마우스를 LPS-유발된 혈전증 (미세 혈관 응고)의 슈바르츠만 모델에서 분석하였다. 마우스에 Serratia LPS를 투여하였고 혈전 형성을 시간이 지남에 따라 관찰하였다. 미소혈전증 및 LPS-유발된 미세 혈관 응고의 발생률의 비교를 수행하였다.
결과:
특히, 테스트된 모든 MASP-2 -/- 마우스 (9/9)는 Serratia LPS 투여 후 혈관 내 트롬빈을 형성하지 않았다. 반대로 미소혈전증을 동시에 테스트된 WT 마우스 10마리 중 7마리에서 검출하였다 (p=0.0031, 피셔 정확성 검정(Fischer's exact)). 도 66에서 나타난 바와 같이, LPS 감염 후 미세혈관 폐색의 발병 시간을 MASP-2 (-/-) 및 WT 마우스에서 측정하였으며, 혈전이 형성된 WT 마우스의 퍼센트를 60분 동안 측정하였고, 혈전 형성을 약 15분 이후에 검출하였다. WT 마우스 중 최대 80%는 60분에 혈전 형성을 입증하였다. 반대로, 도 66에서 나타난 바와 같이, MASP-2 (-/-)의 어떤 것도 60분에 혈전 형성을 갖지 않았다 (로그 순위; p=0.0005).
이 결과들은 MASP-2 억제가 HUS 모델에서 혈관 내 트롬빈의 발달에 대하여 보호적이라는 것을 입증한다.
실시예 33
이 실시예는 정제된 쉬가 독소 2 플러스 LPS의 복강 내 동시-주사를 사용하여 HUS의 마우스 모델에서 MASP-2 항체의 효과를 설명한다.
배경:
HUS의 마우스 모델을 정제된 쉬가 독소 2 (STX2) 플러스 LPS의 복강 내 동시-주사를 사용하여 개발하였다. 마우스 신장의 생화학적 및 마이크로어레이 분석은 STX2 플러스 LPS 도전이 약제 단독의 효과와 다르다는 것을 나타냈다. 이 마우스들의 혈액 및 혈청 분석은 호중구 증가증(neutrophilia), 혈소판 감소증, 적혈구 세포 용혈, 및 증가된 혈청 크레아티닌 및 혈액 요소성 질소를 나타냈다. 게다가, 마우스 신장의 조직학적 분석 및 전자 현미경 관찰은 사구체 섬유소 침착, 적혈구 세포 울혈(congestion), 미세혈전 형성, 및 사구체 초미세구조 변화를 입증하였다. HUS의 이 모델이 인간 질환을 한정하는 혈소판 감소증, 용혈성 빈혈, 및 신부전을 포함하는 C57BL/6 마우스의 인간 HUS 병리의 모든 임상적 증상을 유발한다는 것이 확립되었다 (J. Immunol 187(1):172-80 (2011))
방법:
18 내지 20 g 중량의 C57BL/6 암컷 마우스를 Charles River Laboratories에서 구입하였고 두 개의 군 (각 군에 5마리의 마우스)으로 나누었다. 마우스의 한 군을 150 μl 식염수의 총 량에서 희석된 재조합 MASP-2 항체 mAbM11 (마우스 당 100 μg; 5 mg/kg 체중의 최종 농도에 해당함)의 복강 내로 (복강 내) 주사로 사전 처리하였다. 대조군은 어떤 항체도 없이 식염수를 받았다. MASP-2 항체 mAbM11의 복강 내 주사 후 6시간에 마우스들은 총 150 μl의 용량으로 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)의 LPSS (L6136; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 아치사 용량 (3 μg/동물; 150 μg/kg 체중에 해당함) 및 STX2의 4.5 ng/동물의 용량 (225 ng/kg에 해당함) (LD50 용량의 두 배)의 조합된 복강 내 주사를 받았다. 식염수 주사를 대조군에 사용하였다.
마우스의 생존을 투여 후 6시간 마다 관찰하였다. 마우스를 HUS 병리의 무기라겨 단계에 도달하자마자 도태시켰다. 36시간 후, 모든 마우스를 도태시켰고 두 개의 신장을 면역조직화학법 및 스캐닝 전자 현미경 관찰을 위해 제거하였다. 혈액 샘플을 심장 천자에 의해 실험의 마지막에 채취하였다. 혈청을 분리하여 처리군 및 대조군 둘 다에서 BUN 및 혈청 크레아티닌 수준을 측정하기 위해 -80℃에서 냉동보관하였다.
면역조직화학법
각 마우스 신장의 3분의 1을 24시간 동안 4% 포름알데히드에서 고정하였고 가공하였고, 파라핀에서 임베딩하였다 (embedded). 3 마이크론 두께의 절편을 잘랐고 H & E 염색으로 그 다음의 염색을 위해 전하를 띈 슬라이드에 두었다.
전자 현미경 관찰
신장의 중간 절편을 대략 1 내지 2 mm3의 블록으로 잘랐고, 1x PBS 중의 2.5% 글루타르알데히드에서 4℃에서 하룻밤 동안 고정하였다. 그 다음에 고정된 조직을 University of Leicester Electron Microscopy Facility에 의해 가공하였다.
저온 유지 장치 절편
신장의 다른 3분의 1을 대략 1 내지 2 mm3의 블록으로 잘랐고 액체 질소에서 스냅(snap) 냉동하였고 저온 유지 장치 절편 및 mRNA 분석을 위해 -80℃에서 유지하였다.
결과:
도 67은 STX/LPS-유발된 모델에서 시간 (시간)이 흐름에 따라 식염수-처리된 대조군 마우스 (n=5) 및 MASP-2 항체-처리된 마우스 (n=5)의 퍼센트 생존율을 그래프로 도시한다. 특히, 도 67에서 나타난 바와 같이, 모든 대조군은 42시간까지 죽었다. 대조적으로, MASP-2 항체-처리된 마우스의 100%는 실험의 시간 과정 내내 생존하였다. 도 67에서 나타난 결과와 일치하게, 극심한 질환의 징후로 죽었거나 도태되어야 하는 미처리된 마우스 모두는 유의한 사구체 손상을 갖고 있는 한편, MASP-2-항체-처리된 마우스 모두의 사구체는 정상인 것으로 보이는 것으로 관찰되었다 (데이터 미도시). 이 결과들은 용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 HUS (aHUS), 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP)과 같은 혈전성 미소혈관증 (TMA)으로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체를 치료하는데 사용될 수도 있다는 것을 입증한다.
실시예 34
이 실시예는 혈전증의 쥐 FITC-덱스트란/빛 유발된 내피 세포 손상 모델에서 MASP-2 결핍 및 MASP-2 억제의 효과를 설명한다.
배경/근거: 실시예 32 및 33에서 입증된 바와 같이, MASP-2 결핍 (MASP-2 KO) 및 MASP-2 억제 (억제 MASP-2 항체의 투여를 통해)는 전형적인 HUS의 모델에서 마우스를 보호하는 반면에, STX 및 LPS에 노출된 모든 대조군 마우스는 극심한 HUS에 걸렸고 빈사 상태가 되거나 48시간 내에 죽었다. 예를 들어, 도 67에서 나타난 바와 같이, MASP-2 억제 항체가 처리되고 그 다음에 STX 및 LPS에 노출된 모든 마우스가 생존하였다 (피셔의 정확성 검정 p<0.01; N=5). 따라서, 항-MASP-2 치료는 HUS의 이 모델에서 마우스를 보호한다.
다른 병인의 HUS, aHUS, TTP, 및 TMA's의 치료에 대한 MASP-2 억제자의 이점을 더 입증하기 위해 다음 실시예를 수행하여 혈전성 미소혈관증 (TMA)의 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-덱스트란-유발된 내피 세포 손상 모델에서 MASP-2 결핍 및 MASP-2 억제의 효과를 분석하였다.
방법:
생존 중 현미경 관찰
마우스를 Frommhold et al., BMC Immunology 12:56-68, 2011에 의해 설명된 바와 같은 생존 중 현미경 관찰을 위해 준비하였다. 간략히 말하면, 마우스를 케타민 (125 mg/kg bodyweight, Ketanest, Pfitzer GmbH, Karlsruhe, Germany) 및 자일라진 (12.5 mg/kg 체중; Rompun, Bayer, Leverkusen, Germany)의 복강 내로 (복강 내) 주사로 마취하였고 37℃로 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 두었다. 생존 중 현미경 관찰을 식염수 액침 대물렌즈 (SW 40/0.75 개구수, Zeiss, Jena, Germany)가 장착된 정립 현미경 (Leica, Wetzlar, Germany)에서 수행하였다. 호흡을 용이하게 하기 위해, 마우스에 PE 90 튜빙 (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA)을 사용하여 관을 삽입하였다. 왼쪽 경동맥에 혈액 샘플링 및 전신성 단클론성 항체 (mAb) 투여를 위해 PE10 튜빙 (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA)으로 캐뉼러를 삽입하였다 (cannuled).
고환 거근 준비
생존 중 현미경 관찰을 위해 고관 거근의 수술 준비를 Sperandio et al., Blood, 97:3812-3819, 2001에서 설명된 바와 같이 수행하였다. 간략히 말하면, 음낭을 열어서 고환 거근을 동원하였다. 길이 절개 및 근육을 커버 글라스에 펼친 후, 부고환 및 고환을 이동시켜 측면에 핀으로 고정하였으며, 고환 거근 미소 순환으로 완전한 현미경의 접근을 제공하였다. 고환 거근 소정맥을 Panasonic S-VHS 리코더의 CCD 카메라 (CF8/1; Kappa, Gleichen, Germany)를 통해 기록하였다. 고환 거근을 Frommhold et al., BMC Immunology 12:56-68, 2011에서 이전에 설명된 바와 같이 열-제어된 (35℃ 비카보네이트-완충된 식염수)로 과용해시켰다.
가벼운 들뜸 FITC 덱스트란 손상 모델
고환 거근 소정맥 및 소동맥의 내피의 제어된, 빛-용량-의존적 혈관 손상을 광독성 (FITC)-덱스트란 (제품 번호 FD150S, Sigma Aldrich, Poole, U.K.)의 가벼운 들뜸에 의해 유발하였다. 이 과정은 국소화된 혈전증을 시작한다. 광독성 시약으로서, FITC-덱스트란의 10% w/v 용액의 60 μl를 왼쪽 경동맥 접근을 통해 주사하였고 10분 동안 순환 혈액을 통해 균질하게 분산되게 하였다. 잘 관류된 소정맥을 선택한 후, 낮은 강도에서 중간 강도 (800-1500)의 할로겐 빛을 재현 가능한, 제어된 방식으로 혈전증을 자극하기 위해 FITC-덱스트란 형광 및 내피 표면에 대한 가벼운 내지 보통의 광독성을 유발하도록 원하는 혈관에 초점을 맞추었다. FITC-덱스트란의 들뜸에 필수적인 광독성 빛 강도를 할로겐 램프 (12V, 100W, Zeiss, Oberkochen, Germany)를 사용하여 생성하였다. 형광 색소의 빛-유발된 들뜸으로부터 발생한 광독성은 빛 강도의 임계값 및/또는 조명의 기간을 필요로 하고 내피 표면의 직접적인 가열에 의해 또는 Steinbauer et al., Langenbecks Arch Surg 385:290-298, 2000에 의해 설명된 바와 같이 활성 산소종의 생성에 의해 유발된다.
각 혈관에 적용된 빛의 강도를 더 낮은 파워 측정값 (Labmaster LM-2, Coherent, Auburn, USA)에 대하여 파장-교정 다이오드 검출기(wavelength-correcting diode detector)에 의한 조정을 위해 측정하였다. 비디오 스캔의 오프-라인 분석을 컴퓨터 지원형 미소 순환 분석 시스템 (CAMAS, Dr. Zeintl, Heidelberg) 의 수단으로 수행하였고 적혈구 세포 속도를 Zeintl et al., Int J Microcirc Clin Exp, 8(3):293-302, 2000에 의해 설명된 바와 같이 측정하였다.
혈전증의 유발 전에 단클론성 항-인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6) 및 비히클 대조군의 적용
맹목 연구 설계를 사용하여, 9주령 수컷 C57BL/6 WT 한 배 새끼 마우스에 생존 중 현미경 관찰의 고환 거근 모델에서 혈전증의 광독소 유발 전 16시간에 재조합 단클론성 인간 MASP-2 항체 (mAbH6), MASP-2 기능적 활성의 억제자 (10mg/kg 체중의 최종 농도로 제공됨), 또는 같은 양의 이소타입 대조군 항체 (MASP-2 억제 활성 없음)의 복강 내 주사로 제공하였다. 혈전증 유발 전 한 시간에, mAbH6 또는 대조군 항체의 두 번째 용량을 제공하였다. MASP-2 넉아웃 (KO) 마우스를 또한 이 모델에서 평가하였다.
mAbH6 (재조합 인간 MASP-2에 대하여 확립됨)은 인간 MASP-2 기능적 활성의 강한 억제자이며, 이것은 마우스 MASP-2와 교차 반응하고, 이것에 결합하며 이것을 억제하지만 그것의 종 특이성으로 인해 더 낮은 친화도를 갖는다 (데이터 미도시). mAbH6의 마우스 MASP-2에 대한 더 낮은 친화도를 보상하기 위해, mAbH6을 높은 농도 (10mg/kg 체중)로 제공하여 종 특이성의 변수, 및 생체 내 조건 하에 쥐 MASP-2 기능적 활성의 효과적인 차단을 제공하기 위해 마우스 MASP-2에 대한 더 낮은 친화도를 극복하였다.
이 맹목 연구에서, 테스트된 각각의 개별적인 소정맥에 대하여 완벽한 폐색에 필요한 시간 (선택 기준은 비슷한 지름 및 혈류 속도에 의한 것이다)을 기록하였다.
미세혈관 폐색된 마우스의 퍼센트, 발병의 시간, 및 폐색 시간을 생존 중 현미경 관찰 비디오 녹화를 사용하여 60분 관찰 기간 동안 평가하였다.
결과:
도 68은, 손상 유발 후 시간의 함수로서, FITC/덱스트란의 주사 전 16시간 및 1시간에 투여된 이소타입 대조군 또는 인간 MASP-2 항체 mAbH6 (10mg/kg)의 처리 후 FITC/덱스트란 UV 모델에서 미세혈관 폐색된 마우스의 퍼센트를 그래프로 도시한다. 도 68에서 나타난 바와 같이, 이소타입 대조군 항체를 받는 야생형 마우스의 85%는 30분 이하에 폐색되는 반면, 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)가 사전-처리된 야생형 마우스 중 19%만이 같은 기간 내에 폐색되었고, 인간 MASP-2 항체-처리된 군에서 결국 폐색된 마우스의 폐색 시간이 지연되었다. MASP-2 mAbH6 처리된 마우스 중 세 마리는 60분 관찰 기간 내에 전혀 폐색되지 않았다 (즉, 혈전성 폐색으로부터 보호되었다)는 것이 더 주목된다.
도 69는 인간 MASP-2 항체 (mAbH6) 및 이소타입 대조군 항체가 처리된 마우스에 대하여 분 단위의 폐색 시간을 그래프로 도시한다. 데이터는 평균 값 (수평 막대) 및 표준 오차 막대 (수직 막대)를 가지고 분산-점으로 보고된다. 이 도면은 폐색이 관찰 가능한 마우스에서 폐색 시간을 나타낸다. 따라서, 60분 관찰 기간 동안 폐색되지 않는 세 개의 MASP-2 항체-처리된 마우스를 이 분석에 포함시키지 않았다 (폐색되지 않는 대조군 처리된 마우스는 없었다). 분석에 사용된 통계적 테스트는 언페어드 t 테스트였는데, 부호 "*"는 p=0.0129를 나타낸다. 도 69에서 나타난 바와 같이, 폐색된 네 마리의 MASP-2 항체 (mAbH6)-처리된 마우스에서, MASP-2 항체의 처리는 이소타입 대조군 항체가 처리된 마우스와 비교하여 낮은 빛 강도 (800-1500)로 혈전증의 FITC-덱스트란/빛-유발된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 크게 증가시켰다. 이소타입 대조군의 완전한 폐색 시간의 평균은 19.75분인 한편, MASP-2 항체 처리 군에 대한 완전한 폐색 시간의 평균은 32.5분이었다.
도 70은
낮은 빛 강도 (800-1500)로 혈전증의 FITC-덱스트란/빛-유발된 내피 세포 손상 모델에서 혈전증의 유발 전 16시간에 10mg/kg으로 복강 내 투여되고, 그 다음에 유발 전 1시간에 다시 정맥 내 투여된 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)가 사전-처리된 야생형 마우스, MASP-2 KO 마우스, 및 야생형 마우스에 대하여 분 단위로 폐색까지의 시간을 그래프로 도시한다. 폐색된 동물들만을 도 70에 포함하였다; 이소타입 대조군 항체를 받은 야생형 마우스에 대하여 n=2; MASP-2 KO에 대하여 n=2; 및 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)를 받은 야생형 마우스에 대하여 n=4. 부호 "*"는 p<0.01을 나타낸다. 도 70에서 나타난 바와 같이, MASP-2 결핍 및 MASP-2 억제 (10mg/kg의 mAbH6)는 낮은 빛 강도 (800-1500)로 혈전증의 FITC-덱스트란/빛-유발된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 증가시켰다.
결론:
이 실시예의 결과는 렉틴 경로 (예를 들어, antibodies that block MASP-2 function)를 차단하는 MASP-2 억제제가 TMA의 마우스 모델에서 미세 혈관 응고 및 혈전증, 다수 미소혈관증의 홀마크를 억제한다는 것을 더 입증한다. 그러므로, MASP-2 억제 항체와 같은 MASP-2 억제제의 투여가 HUS, aHUS, TTP, 또는 다른 미소혈관증으로 고통받는 환자에서 효과적인 치료이고 미세 혈관 응고 및 혈전증으로부터의 보호를 제공할 것으로 예상된다.
실시예 35
이 실시예는 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)가 혈소판 풍부한 인간 혈장에서 혈소판 기능에 대한 효과가 없다는 것을 입증하는 연구를 설명한다.
배경/근거: 실시예 34에서 설명된 바와 같이, 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)로 MASP-2 억제가 혈전증의 FITC-덱스트란/빛-유발된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 증가시킨다는 것이 입증되었다. 다음 실험을 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)가 혈소판 기능에 대한 효과를 갖는지를 결정하기 위해 수행하였다.
방법: 인간 mAbH6 MASP-2 항체의 효과를 혈소판의 ADP-유발된 응집에 대하여 다음과 같이 테스트하였다. 40 μl 용액에서 1 μg/ml 또는 0.1 μg/ml 농도의 인간 MASP-2 mAbH6를 신선하게 제조된 혈소판-풍부 인간 혈장의 360 μl로 첨가하였다. 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 항체를 혈장에 추가한 후, 혈소판 활성화를 2 μM의 최종 농도로 ADP를 추가함으로써 유발하였다. 검정을 1 mL 큐벳에서 작은 자석으로 용액을 교반함으로써 시작하였다. 혈소판 응집을 2-채널 Chrono-log Platelet Aggregometer Model 700 Whole Blood/Optical Lumi-Aggregometer에서 측정하였다.
결과:
용액에서 퍼센트 응집을 5분의 기간 동안 측정하였다. 결과는 하기 표 22에서 나타난다.
5분의 기간 동안의 혈소판 응집
항체 진폭
(퍼센트 응집)		 기울기
(기간 동안 퍼센트 응집)
MASP-2 항체 (mAbH6)
(1 μg/ml)		 46% 59
이소타입 대조군 항체
(1 μg/ml)		 49% 64
MASP-2 항체 (mAbH6)
(0.1 μg/ml)		 52% 63
이소타입 대조군 항체
(0.1 μg/ml)		 46% 59
상기 표 22에서 나타난 바와 같이, 대조군 항체 또는 MASP-2 mAbH6 항체가 처리된 ADP-유발된 혈소판의 응집 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 이 결과들은 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)는 혈소판 기능에 대하여 효과가 없다는 것을 입증한다. 그러므로, 혈전증의 FITC-덱스트란/빛-유발된 내피 세포 손상 모델에서 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)로의 MASP-2 억제가 정맥 폐색 시간을 증가시킨다는 것을 입증하는 실시예 34에서 설명된 결과는 mAbH6의 혈소판 기능에 대한 효과 때문이 아니었다. 따라서, MASP-2 억제는 혈소판 기능에 직접적으로 영향을 미치지 않고 혈전증을 방지하는데, 기존의 항-혈전제와 다른 치료적 메커니즘을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구체예가 도시되고 설명되는 한편, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 다양한 변화가 이루어질 수 있다는 것이 인정될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Omeros Corporation University of Leicester <120> Compositions and Methods of Inhibiting MASP-1 and/or MASP-2 and/or MASP-3 for the Treatment of Various Diseases and Disorders <130> MP.1.0176.PCT <150> US 61/661,167 <151> 2012-06-18 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 725 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 ggccaggcca gctggacggg cacaccatga ggctgctgac cctcctgggc cttctgtgtg 60 gctcggtggc cacccccttg ggcccgaagt ggcctgaacc tgtgttcggg cgcctggcat 120 cccccggctt tccaggggag tatgccaatg accaggagcg gcgctggacc ctgactgcac 180 cccccggcta ccgcctgcgc ctctacttca cccacttcga cctggagctc tcccacctct 240 gcgagtacga cttcgtcaag ctgagctcgg gggccaaggt gctggccacg ctgtgcgggc 300 aggagagcac agacacggag cgggcccctg gcaaggacac tttctactcg ctgggctcca 360 gcctggacat taccttccgc tccgactact ccaacgagaa gccgttcacg gggttcgagg 420 ccttctatgc agccgaggac attgacgagt gccaggtggc cccgggagag gcgcccacct 480 gcgaccacca ctgccacaac cacctgggcg gtttctactg ctcctgccgc gcaggctacg 540 tcctgcaccg taacaagcgc 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aagaaacgtg tgcactggta ccagcagagg 540 ccaggccagg cccctgtgtt ggtcatctat gatgatagcg accggccctc agggatccct 600 gaccgattct ctgcctccaa ctctgggaac acggccaccc tgaccatcac taggggcgaa 660 gccggggatg aggccgacta ttattgtcag gtgtgggaca ttgctactga tcatgtggtc 720 ttcggcggag ggaccaagct caccgtccta 750 <210> 23 <211> 735 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (663)..(663) <223> n is a, c, g, or t <400> 23 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60 acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc aggggtaaaa tgggtgtgag ctggatccgt 120 cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcacacattt tttcgagtga cgaaaaatcc 180 tacaggacat cgctgaagag caggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca cgtattactg tgcacggata 300 cgacgtggag gaattgacta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctcaaagctt 360 tcagggagtg catccgcccc aaaacttgaa gaaggtgaat tttcagaagc acgcgtacag 420 ccagtgctga ctcagccccc ctcactgtcc gtgtccccag gacagacagc cagcatcacc 480 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<213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Gly Ile Arg Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ala Thr Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Gly Asn Val Gly Asp Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr 100 105 110 Glu Val Ile Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 128 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gln Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Arg Phe Gly Asn Ser Thr Gly His Gly Ala Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asp Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Val Tyr Gly Tyr Cys Gly Ser Tyr Ser Cys Cys Gly Val 100 105 110 Asp Thr Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser 115 120 125 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val 1 5 10 15 Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr 20 25 30 Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile 35 40 45 Tyr Asp Asn Asp Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Leu Ser Gly Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala 65 70 75 80 Asp Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ser Ala Asp Asn Ser Gly Ala 85 90 95 Ala Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val 1 5 10 15 Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr 20 25 30 Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Asn Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Leu Ser Gly Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg 65 70 75 80 Ala Asp Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ser Ala Asp Asn Ser Gly 85 90 95 Ala Ala Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val 1 5 10 15 Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr 20 25 30 Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Asn Asn Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Leu Ser Gly Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala 65 70 75 80 Asp Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ser Ala Asp Asn Ser Gly Ala 85 90 95 Ala Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 30 <211> 126 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Lys Ser Gly Ala Gly Thr Asn Tyr Ala Pro Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Thr Gly Ser Gly Cys Ser Ser Gly Tyr Arg Ala Glu Tyr 100 105 110 Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser 115 120 125 <210> 31 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val 1 5 10 15 Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr 20 25 30 Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Asn Asn Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Leu Ser Gly Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala 65 70 75 80 Asp Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ser Ala Asp Asn Ser Gly Ala 85 90 95 Ala Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 32 <211> 126 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Arg Asn Asp Gly Arg Tyr Thr Glu Tyr Gly Ser Ala 50 55 60 Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val 65 70 75 80 Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Trp Phe Asp Ala Gly Gln 100 105 110 Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser 115 120 125 <210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> artificial 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Lys Leu 20 25 30 Trp Cys Asn Gln 35 <210> 36 <211> 0 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown <400> 36 000 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Arg Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 0 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Unknown <400> 39 000 <210> 40 <211> 275 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 Leu Glu Val Thr Cys Glu Pro Gly Thr Thr Phe Lys Asp Lys Cys Asn 1 5 10 15 Thr Cys Arg Cys Gly Ser Asp Gly Lys Ser Ala Phe Cys Thr Arg Lys 20 25 30 Leu Cys Tyr Gln Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Arg Ser 35 40 45 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 50 55 60 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 85 90 95 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 100 105 110 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 115 120 125 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 145 150 155 160 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 165 170 175 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 225 230 235 240 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270 Pro Gly Lys 275 <210> 41 <211> 0 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Unknown <400> 41 000 <210> 42 <211> 275 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 Leu Glu Val Thr Cys Glu Pro Gly Thr Thr Phe Lys Asp Lys Cys Asn 1 5 10 15 Thr Cys Arg Cys Gly Ser Asp Gly Lys Ser Ala Val Cys Thr Lys Leu 20 25 30 Trp Cys Asn Gln Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Arg Ser 35 40 45 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 50 55 60 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 85 90 95 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 100 105 110 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 115 120 125 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 145 150 155 160 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 165 170 175 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 225 230 235 240 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270 Pro Gly Lys 275

Claims (55)

  1. 나이-관련 황반 변성, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증, 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법으로서, 개체에 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-3 억제제의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, MASP-3 억제제는 SEQ ID NO:8의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-3 단클론성 항체, 또는 이것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1 항에 있어서, 개체에 MASP-1 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3 항에 있어서, MASP-1 억제제는 SEQ ID NO:10의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-1 단클론성 항체, 또는 이것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항에 있어서, 개체에 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5 항에 있어서, SEQ ID NO:5의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-1 단클론성 항체, 또는 이것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1 항에 있어서, 개체에 MASP-1 억제제 및 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 항에 있어서, MASP-3 억제제는 대체-경로 구동된 C3b 침착을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1 항에 있어서, MASP-3 억제제는 인자 D 성숙화를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제3 항에 있어서, MASP-1 억제제는 MASP-3 (SEQ ID NO:8)에 결합하는 것보다 적어도 10배 더 큰 친화도로 MASP-1의 일부에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제3 항에 있어서, MASP-1 억제제는 MASP-1의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:10의 aa 449-694)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1 항에 있어서, MASP-3 억제제는 또한 MASP-1의 일부 (SEQ ID NO:10)에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서, MASP-3 억제제는 CUBI-CCP2 도메인 내 공통 영역에 결합하는 이중 MASP-1/MASP-3 억제자인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12 항에 있어서, MASP-3 억제제는 CCP2 도메인 내 공통 영역에 결합하는 이중 MASP-1/MASP-3 억제자인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12 항에 있어서, MASP-3 억제제는 MASP-1의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:10D의 aa 449- 694)에 결합하고 또한 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:8의 aa 450- 711)에 결합하는 이중-특이적 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1 항에 있어서, MASP-3 억제제는 또한 MASP-2의 일부 (SEQ ID NO:5)에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16 항에 있어서, MASP-3 억제제는 MASP-3 및 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 내 보존된 영역에 결합하는 이중 MASP-3/MASP-2 억제자인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16 항에 있어서, MASP-3 억제제는 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:8의 aa450-711)에 결합하고 또한 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa 445-682) 또는 MASP-2의 CCP-1-CCP2 도메인 (SEQ ID NO:5의 aa300-431) 중 적어도 하나에 결합하는 이중 특이적 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1 항에 있어서, MASP-3 억제제는 MASP-3의 일부 (SEQ ID NO:8)에 결합하고 MASP-1 또는 MASP-2를 억제하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1 항에 있어서, MASP-3 억제제는 MASP-1 (SEQ ID NO:10)에 결합하는 것보다 적어도 10배 더 큰 친화도로 MASP-3의 일부에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1 항에 있어서, MASP-3 억제제는 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:8의 aa 450-711)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1 항에 있어서, MASP-3 억제제는 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3의 전체 억제자(pan 억제자)이고 CUB1-EGF-CUB2 도메인의 보존된 영역에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1 항에 있어서, MASP-3 억제제는 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3의 삼중 특이적 억제자인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제2 항에 있어서, 조성물은 MASP-2 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제2 항에 있어서, 조성물은 MASP-1 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제7 항에 있어서, 조성물은 MASP-1 항체, 및 MASP-2 항체 및 MASP-3 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제7 항에 있어서, 방법은 MASP-2 항체, MASP-1 항체, 또는 MASP-3 항체 중 적어도 하나를 포함하는 조성물을 동시-투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제12 항에 있어서, 조성물은 MASP-2 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제16 항에 있어서, 조성물은 MASP-1 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 재조합 항체, 효과기 기능이 감소된 항체, 키메라, 및 인간화된 또는 인간 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제1 항에 있어서, 조성물은 전신으로 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31 항에 있어서, 조성물은 피하, 근육 내, 정맥 내, 동맥 내 또는 흡입제로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1 항에 있어서, 개체는 나이-관련 황반 변성으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제1 항에 있어서, 개체는 관절염으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34 항에 있어서, 관절염은 골관절염, 류머티스성 관절염, 청소년 류머티스성 관절염 및 건선성 관절염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1 항에 있어서, 개체는 파종성 혈관 내 응고로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제36 항에 있어서, 파종성 혈관 내 응고는 패혈증, 외상, 감염 (박테리아, 바이러스, 균류, 기생충), 악성 종양, 이식 거부 반응, 수혈 반응, 조산 합병증, 혈관 동맥류, 간부전, 열사병, 화상, 방사선 노출, 쇼크, 또는 극심한 독성 반응에 부차적인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제1 항에 있어서, 개체는 혈전성 미소혈관증으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38 항에 있어서, 혈전성 미소혈관증은 용혈성 요독 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제1 항에 있어서, 개체는 천식으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제1 항에 있어서, 개체는 조밀침착병으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제1 항에 있어서, 개체는 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제1 항에 있어서, 개체는 외상성 뇌 손상으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제1 항에 있어서, 개체는 흡인성 폐렴으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제1 항에 있어서, 개체는 내안구염으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제1 항에 있어서, 개체는 시속척수염으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제1 항에 있어서, 개체는 베체트 병으로 고통받거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법으로서, MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  49. 제48 항에 있어서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 이것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제48 항에 있어서, MASP-2 억제제는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 SEQ ID NO:5의 일부에 특이적으로 결합하는 이것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제46 항에 있어서, MASP-2 항체는 키메라, 인간화된 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 나이-관련 황반 변성, 관절염파종성 혈관 내 응고, 혈전성 미소혈관증, 천식, 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 개체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화의 효과를 억제하는데 사용되는 의약품을 제조하는 방법.
  53. 제52 항에 있어서, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 MASP-3 억제자를 포함하는 의약품과 조합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 조밀침착병, 소수-면역 괴사성 반월형 사구체 신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받거나, 또는 이것들에 걸릴 위험 위험이 있는 개체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 효과를 억제하는데 사용되는 의약품을 제조하는 방법으로서, 약학적 담체에서 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 조합하는 단계를 포함하는 방법.
  55. 제54 항에 있어서, MASP-3의 치료적 유효량을 MASP-2 억제자를 포함하는 의약품과 조합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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