JP2022084946A - 様々な疾患および障害の治療のためにmasp-1および/またはmasp-2および/またはmasp-3を阻害する組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年6月18日に出願された米国特許仮出願第61/661,167号の恩典を主張するものである。
本願に関連する配列表はハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名前は、MP_1_0176_PCT_SequenceListingFiled_20130614.txtであり、本明細書の出願と共にEFS-Webを介して提出されている。
補体系は、ヒトおよび他の脊椎動物において微生物感染および他の急性傷害に対する免疫応答を開始、増幅、および組織化するための初期作用機構を提供する(M.K. Liszewski and J. P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, W.E, Paul編, Raven Press, Ltd., New York)。補体活性化は潜在的な病原体に対する有益な第一線の防御を提供するが、防御免疫応答を促進する補体の活性は宿主にとって潜在的な脅威となることもある(K.R, Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994)。例えば、C3およびC5タンパク質分解産物は好中球を動員および活性化する。活性化好中球は宿主防御に不可欠であるが見境なく破壊酵素を放出し、臓器損傷を引き起こすことがある。さらに、補体活性化によって、近くの宿主細胞ならびに微生物標的の表面に溶解性補体成分が沈着し、その結果、宿主細胞が溶解することがある。
一局面において、本発明は、発作性夜間血色素尿症(PNH)、加齢黄斑変性症(AMD)、虚血-再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型(pauci-immune)壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、またはベーチェット病に罹患している対象においてMASP-3依存性補体活性化を阻害する方法を提供する。方法は、MASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-3阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、方法はさらに、MASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む。
SEQ ID NO:1 ヒトMAp19 cDNA
SEQ ID NO:2 ヒトMAp19タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:3 ヒトMAp19タンパク質(成熟)
SEQ ID NO:4 ヒトMASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5 ヒトMASP-2タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:6 ヒトMASP-2タンパク質(成熟)
SEQ ID NO:7 ヒトMASP-3 cDNA
SEQ ID NO:8 ヒトMASP-3タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:9 ヒトMASP-1 cDNA
SEQ ID NO:10 ヒトMASP-1タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:11 ヒトMAp44タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:12 ラットMASP-2 cDNA
SEQ ID NO:13 ラットMASP-2タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:14 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646)重鎖可変領域(VH)をコードするDNA(シグナルペプチドなし)
SEQ ID NO:15 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646)重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:16 17N16mc重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:17 17D20_dc21N11VL(OMS644)軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:18 17N16_dc17N9(OMS641)軽鎖可変領域(VL)をコードするDNA(シグナルペプチドなし)
SEQ ID NO:19 17N16_dc17N9(OMS641)軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:20 scFv娘クローン17N16m_d17N9完全長ポリペプチド
SEQ ID NO:21 scFv娘クローン17D20m_d3521N11完全長ポリペプチド
SEQ ID NO:22 完全長ポリペプチドをコードするscFv娘クローン17N16m_d17N9 DNA(シグナルペプチドなし)
SEQ ID NO:23 完全長ポリペプチドをコードするscFv娘クローン17D20m_d3521N11 DNA(シグナルペプチドなし)
SEQ ID NO:24 親DTLacO重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:25 MASP-3特異性クローンM3J5重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:26 MASP-3特異性クローンM3M1重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:27 親DTLacO軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:28 MASP-3特異性クローンM3J5軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:29 MASP-3特異性クローンM3M1軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:30 MASP-3クローンD14重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:31 MASP-3クローンD14軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:32 MASP-1クローン1E10重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:33 MASP-1クローン1E10軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:34 SGMI-1ペプチド
SEQ ID NO:35 SGMI-2ペプチド
SEQ ID NO:36 ヒトIgG1-Fcポリペプチド
SEQ ID NO:37 ペプチドリンカー#1(12aa)
SEQ ID NO:38 ペプチドリンカー#2(10aa)
SEQ ID NO:39 ヒトIL-2-シグナル配列、SGMI-1、リンカー#1およびヒトIgG1-Fcを含むポリペプチド融合体をコードする核酸
SEQ ID NO:40 SGMI-1、リンカー#1およびヒトIgG1-Fcを含む成熟ポリペプチド融合体(SGMI-1Fc)
SEQ ID NO:41 ヒトIL-2-シグナル配列、SGMI-2、リンカー#1およびヒトIgG1-Fcを含むポリペプチド融合体をコードする核酸
SEQ ID NO:42 SGMI-2、リンカー#1およびヒトIgG1-Fcを含む成熟ポリペプチド融合体(SGMI-2Fc)
I. 定義
本明細書において特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての用語は、本発明の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本発明を説明するために明細書および特許請求の範囲において使用される用語を明確にするために、以下の定義を提供する。
i. 概略;レクチン経路は定義し直された
本明細書に記載されるように、本発明者らは、補体のレクチン経路が、いずれも糖質認識成分(MBL、CL-11およびフィコリン)で形成されたレクチン経路活性化複合体によって駆動される、補体を活性化するための2つのエフェクターアーム:(i)「レクチン経路エフェクターアーム1」または「LEA-1」と呼ばれる、レクチン経路関連セリンプロテアーゼMASP-1およびMASP-3によって形成されたエフェクターアーム;ならびに(ii)本明細書では「レクチン経路エフェクターアーム2」または「LEA-2」と呼ばれるMASP-2駆動型活性化エフェクターアームを有するという驚くべき発見を達成した。LEA-1およびLEA-2はいずれも溶解および/またはオプソニン化を実施することができる。
レクチン経路の第一のエフェクターアーム、すなわちLEA-1は、レクチン経路関連セリンプロテアーゼMASP-1およびMASP-3によって形成される。本明細書に記載されるように、本発明者らはこれまでのところ、MASP-3の非存在かつMASP-1の存在において、第二経路が面構造上で実質的に活性化されないことを示した。これらの結果は、MASP-3が、第二経路を開始させる上で、これまで開示されたことがない役割を果たすことを実証し、これは、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインを機能不全にする突然変異を有する珍しい3MC常染色体劣性障害の患者から採取されたMASP-3欠損3MC血清を使用して確認されている(Rooryck C, et al., Nat Genet. 43(3):197-203 (2011))。これらの新規な発見に基づき、従来から定義されるような第二経路を伴う補体活性化はMASP-3依存性であると予想される。事実、MASP-3、およびそのLEA-1活性化は、これまでわかりにくかった第二経路のイニシエーターということになり得る。
レクチン経路の第二のエフェクターアーム、すなわちLEA-2は、レクチン経路関連セリンプロテアーゼMASP-2によって形成される。MASP-2は、認識成分がそれぞれのパターンに結合した場合に活性化され、かつ、またMASP-1によっても活性化され得、その後、補体成分C4をC4aおよびC4bへと切断する。切断産物C4bが血漿C2に結合したのち、C4b結合C2は、C4b結合C2を酵素的に活性な複合体C4bC2aおよび小さなC2b切断断片へと転換する第二のMASP-2媒介性切断工程の基質になる。C4b2aは、豊富な血漿成分C3をC3aおよびC3bへと転換する、レクチン経路のC3転換C3コンバターゼである。C3bは、チオエステル結合を介して、近接する任意の面に結合する。いくつかのC3b断片がC3コンバターゼ複合体C4b2aに近接して結合するならば、このコンバターゼは、C5をC5bおよびC5aへと転換するようにその特異性を変化させて、C5コンバターゼ複合体C4b2a(C3b)nを形成する。このC5コンバターゼはMACの形成を開始することができるが、このプロセスは、それだけで溶解を促進するのには効果が不十分であると考えられる。むしろ、LEA-2によって産生される初期のC3bオプソニンが新たな第二経路C3コンバターゼおよびC5コンバターゼ部位の形成のための核を形成し、それが最終的に豊富なMAC形成および溶解を生じさせる。後者の事象は、LEA-2形成C3bと関連するB因子のD因子活性化によって媒介され、したがって、D因子の成熟におけるMASP-1の本質的役割のおかげでLEA-1に依存する。また、C4欠損マウスは虚血再灌流障害から保護されないが、一方、MASP-2欠損マウスは保護されることから(前記Schwaeble et al., PNAS, 2011)、虚血再灌流障害の病態生理学において重要な役割を果たす、C4の非存在においてC3を活性化するためのMASP-2依存性C4バイパス活性化経路がある。LEA-2はまた、プロトロンビンからトロンビンへの切断(共通経路)およびXII因子(ハーゲマン因子)をその酵素的に活性な形態XIIaへと転換するための切断を含む凝固経路に結び付いている。XIIa因子は他方でXI因子をXIaに切断する(内因性経路)。凝固カスケードの内因性経路活性化は、血栓形成にとってきわめて重要であるフィブリン形成を生じさせる。
(i)LEA-1:アクチベーター表面上のB因子の初期切断および活性化を通して第二経路コンバターゼC3bBbを生成することによって補体の活性化を開始し、かつ駆動し、次いで、それがC3b沈着および第二経路コンバターゼC3bBbの形成を触媒するMASP-3依存性活性化経路。MASP-3駆動型活性化経路は、微生物のオプソニン化および溶解において本質的な役割を果たし、細菌の表面上で第二経路を駆動して、膜侵襲複合体を生成するのに最適な活性化速度を生じさせる。
(ii)LEA-2:レクチン経路C3コンバターゼC4b2aの形成を生じさせ、C3切断産物C3bが蓄積すると、その後、C5コンバターゼC4b2a(C3b)nを生じさせるMASP-2依存性活性化経路。補体C4の非存在において、MASP-2は、C2および凝固因子XIを含む第二C3コンバターゼ複合体を形成することができる。
現在、3つのマンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ(MASP-1、MASP-2、およびMASP-3)がヒト血清中でマンナン結合レクチン(MBL)と関連していることが公知である。マンナン結合レクチンはまた、最近の文献においては、「マンノース結合タンパク質」または「マンノース結合レクチン」とも呼ばれている。MBL-MASP複合体は、多様な微生物上に存在する糖質構造へのMBLの結合のおかげで、先天性免疫において重要な役割を果たす。MBLと糖質構造の特定のアレイとの相互作用がMASP酵素前駆体の活性化を生じさせ、それが他方で、補体成分C4およびC2を切断してC3コンバターゼC4b2bを形成することによって補体を活性化する(Kawasaki et al., J. Biochem 106:483-489 (1989); Matsushita & Fujita, J. Exp Med. 176:1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol. 150:571-578 (1993))。
図2は、MASP-2ポリペプチド(SEQ ID NO:5)およびMAp19ポリペプチド(SEQ ID NO:2)ならびにそれらをコードするエキソンのドメイン構造を示す略図である。図3は、MASP-1ポリペプチド(SEQ ID NO:10)、MASP-3ポリペプチド(SEQ ID NO:8)およびMAp44ポリペプチド(SEQ ID NO:11)ならびにそれらをコードするエキソンのドメイン構造を示す略図である。図2および3に示すように、セリンプロテアーゼMASP-1、MASP-2、およびMASP-3は、C1rおよびC1sに見られるように配置された6つの別々ドメイン;すなわち(I)N末端C1r/C1s/ウニVEGF/骨形成タンパク質(またはCUBI)ドメイン;(II)上皮成長因子(EGF)様ドメイン;(III)第二のCUBドメイン(CUBII);(IVおよびV)2つの補体制御タンパク質(CCP1およびCCP2)ドメイン;および(VI)セリンプロテアーゼ(SP)ドメインからなる。
ヒトMASP-1ポリペプチド(SEQ ID NO:10)およびMASP-3ポリペプチド(SEQ ID NO:8)は1つの構造遺伝子から生じ(Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001)、その遺伝子は3番染色体の長腕の3q27~28領域にマッピングされている(Takada et al., Genomics 25:757-759 (1995))。MASP-3およびMASP-1 mRNA転写物は一次転写物から選択的スプライシング/ポリアデニル化プロセスによって生成される。MASP-3翻訳産物は、MASP-1およびMASP-3の両方に共通であるアルファ鎖と、MASP-3に固有であるベータ鎖(セリンプロテアーゼドメイン)と構成される。図3に示すように、ヒトMASP-1遺伝子は18のエキソンを包含する。ヒトMASP-1 cDNA(SEQ ID NO:9と表記される)はエキソン2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14、15、16、17、および18によってコードされる。図3にさらに示すように、ヒトMASP 3遺伝子は12個のエキソンを包含する。ヒトMASP-3 cDNA(SEQ ID NO:7と表記される)はエキソン2、3、4、5、6、7、8、10、11、および12によってコードされる。選択的スプライシングが、エキソン2、3、4、5、6、7、8、および9から生じる、MBL関連タンパク質44(「MAp44」)(SEQ ID NO:11と表記される)と呼ばれるタンパク質を生じさせる。
ヒトMASP-2遺伝子は染色体1p36.3-2上に位置し(Stover et al., Cytogenet and Cell Genet. 84:148-149 (1999))、図2に示すように、12個のエキソンを包含する。MASP-2(SEQ ID NO:5)およびMAp19(SEQ ID NO:2)は、選択的スプライシング/ポリアデニル化によって生成される単一の構造遺伝子の転写物によってコードされる(Stover et al., Genes and Immunity 2:119-127 (2001))。ヒトMASP-2 cDNA(SEQ ID NO:4)はエキソン2、3、4、6、7、8、9、10、11、および12によってコードされる。(SEQ ID NO:1)によってコードされる、MBL関連タンパク質19(「MAp19」、「sMAP」とも呼ばれる)と呼ばれる20kDaタンパク質(SEQ ID NO:2)がエキソン2、3、4、および5から生じる。MAp19は、図2に示すようにエキソン5に由来する4つのさらなる残基(EQSL)を有するMASP-2のN末端CUB1-EGF領域を含む非酵素的タンパク質である。
図4は、CUBI、EGF、CUBII、CCP1、CCP2ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)ドメイン中の保存された触媒三連構造残基(H、D、S)を示す、MASP-1(SEQ ID NO:10)、MASP-2(SEQ ID NO:6)およびMASP-3(SEQ ID NO:8)のタンパク質配列のアミノ酸アライメントである。「.」という記号は同一のアミノ酸配列を示す。
先天性免疫におけるMBL/フィコリン-MASP複合体の役割は、C型レクチンドメイン(MBL分子中に存在)のカルシウム依存性結合によって、または酵母、細菌、ウイルスおよび真菌において見られる糖質構造へのフィブリノゲン様ドメイン(フィコリン分子中に存在)の結合によって媒介される。この認識段階が酵素前駆体MASP-2の活性化をもたらし、その後それが、C4およびC2を切断してC3コンバターゼC4b2bを形成することにより、C1q-(C1r)2-(C1s)2複合体内の活性化されたC1の作用を模倣する。これが、標的病原体上のC4bおよびC3bの沈着を可能にし、ひいては、食作用による死滅およびクリアランスを促進する。
補体のレクチン経路活性化ルートが、2つの独立したエフェクター機構:(i)LEA-2:補体駆動型オプソニン化、走化性(Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011))および細胞溶解を媒介するMASP-2駆動型経路、ならびに(ii)LEA-1:アクチベーター表面上のB因子の切断および活性化によって第二経路コンバターゼC3bBbを生成することによって補体活性化を開始し、次いでそれがC3b沈着および第二経路コンバターゼC3bBbの形成を触媒し、それが結果として細胞溶解および微生物オプソニン化を生じさせることができる新規なMASP-3依存性活性化ルートを介して、補体を活性化するという結論を指摘する、いくつかの独立した線の強力な実験的証拠が本明細書に提供される。加えて、本明細書に記載されるように、MASP-1、MASP-3もしくはHTRA-1またはこれら3つのいずれかの組み合わせによるB因子および/またはD因子の別々のレクチン非依存性活性化が、第二経路を介する補体活性化を生じさせることもできる。
i. PNHの概略
発作性夜間血色素尿症(PNH)は、時としてマルキアファーヴァ・ミケーリ症候群とも呼ばれ、後天的な、潜在的に命にかかわる血液疾患である。PNHは自然発症することがあり、これは「一次PNH」と呼ばれるか、または再生不良性貧血などの他の骨髄障害の状況では「二次PNH」と呼ばれる。症例の大半は一次PNHである。PNHは、補体誘導性の赤血球破壊(溶血)、少ない赤血球数(貧血)、血栓症、および骨髄機能不全を特徴とする。実験室におけるPNHの所見は、考えられる原因として自己反応性RBC結合抗体の非存在下で、血管内溶血性貧血:低ヘモグロビン、多量の乳酸デヒドロゲナーゼ、多数の網状赤血球数(破壊された細胞を交換するために未熟血球が骨髄によって放出される)、高ビリルビン(ヘモグロビンの破壊産物)と一致する変化を示す。
PNHにおける負の補体制御因子CD55およびCD59の不完全な表面発現の間の因果関係と、血管内溶血の阻止におけるエクリズマブの有効性の組み合わせから、PNHは、補体系によって媒介される状態であるとはっきりと定義される。このパラダイムは広く受け入れられているが、補体活性化を開始する事象、および関与する補体活性化経路がどういったものであるかは未解決のままである。CD55およびCD59は、全ての補体開始経路に共通する補体カスケード中の終末増幅段階を負に調節するので、補体活性化がレクチン経路によって開始されるか、古典経路によって開始されるか、第二経路の自発的代謝回転によって開始されるかに関係なく、これらの分子が欠損すると膜侵襲複合体の形成と膜組込みが悪化する。従って、PNH患者では、RBC表面上でのC3b沈着につながる、全ての補体活性化事象が、その後の増幅ならびに病理学的溶血(血管内溶血および/または血管外溶血)を誘発し、溶血発作を突然引き起こすことができる。PNH患者における溶血発作を誘発する分子事象のはっきりとした機構理解はまだなされていない。溶血発作を起こしているPNH患者における補体開始事象はまったく明らになってないので、PNHにおける補体活性化は低レベルの第二経路「チックオーバー」活性化により自然発生する可能性があり、その後に、CD55およびCD59の欠如による不適切な終末補体活性化制御によって増大するというのが主流となっている見解である。
このセクションは、PNHのインビトロモデルにおける溶血に対するLEA-2およびLEA-1遮断の阻害効果を記載する。この発見は、PNHの1つまたは複数の局面に罹患している患者を治療するためのLEA-2遮断物質(MASP-2に結合し、かつその機能を遮断する抗体を含むが、それに限定されない)およびLEA-1遮断物質(MASP-3、MASP-3または両方に結合し、かつそのMASP-1媒介性活性化の機能を遮断する抗体を含むが、それに限定されない)の有用性、ならびにエクリズマブのようなC5阻害因子による治療を受けるPNH患者においてC3断片媒介性血管外溶血の効果を緩和するためののLEA-2および/またはLEA-1および/またはMASP-3依存性レクチン非依存性補体活性化の阻害因子(MASP-2阻害因子、MASP-3阻害因子、およびMASP-2/MASP-3またはMASP-1/MASP-2二重または二重特異性阻害因子、ならびに、汎特異性MASP-1/MASP-2/MASP-3阻害因子を含む)の使用を裏付ける。
上に詳述したように、PNH患者は、循環からのRBCクリアランスの2つの別々の機構:膜侵襲複合体(MAC)の活性化による血管内溶血、ならびにC3bによるオプソニン化後の血管外溶血およびその後の細網内皮系による補体レセプター結合および取込み後のクリアランスにより、貧血になる。血管内溶血は、患者がエクリズマブで治療された場合に概ね予防される。エクリズマブは、補体開始活性化事象およびその後のオプソニン化の両方よりも下流で起こる終末溶解エフェクター機構を遮断するため、エクリズマブは血管外溶血を遮断しない(Risitano A.M. et. al., Blood 113:4094-100(2009))。その代わり、未治療PNH患者においては溶血を起こしたと考えられるRBCが、今や、活性化されたC3bタンパク質をその表面に蓄積できることができ、それが、細網内皮系による取込みを増強し、その血管外溶血を増強する。したがって、エクリズマブ治療は、実質的に、RBCの性質を血管内溶血から潜在的な血管外溶血に変える。結果として、エクリズマブで治療される一部のPNH患者は依然として貧血のままである。したがって、上流で補体活性化を遮断し、かつPNH RBCのオプソニン化を阻止する作用物質は、エクリズマブを用いてときおり見られる血管外溶血を遮断するのに特に適していることができるということになる。
PNHのインビトロモデルを使用して、本発明者らは、PNHにおける補体活性化および結果的な溶血が実際にLEA-2および/またはLEA-1活性化によって開始され、それが、第二経路の独立した機能ではないことを実証した。これらの研究は、Crry欠損マウスからのRBC(マウスにおける終末補体経路の重要な負の調節物質)およびPNH患者には存在しない同じ補体調節物質を欠くCD55/CD59欠損マウスからのRBCをはじめとする様々なマウス系統のマンナン感作RBCを使用した。マンナン感作Crry欠損RBCを補体充分なヒト血清に曝露すると、RBCは、3%の血清濃度で実質的に溶血したが(図21および22)、一方、補体欠損血清(HI:熱不活化)は溶血性ではなかった。驚いたことに、MASP-2抗体の添加によってLEA-2が遮断された補体充分な血清は溶血活性が低下しており、効果的な溶血のためには6%血清が必要であった。CD55/CD59欠損RBCを試験した場合にも同様な観察結果が得られた(図24)。MASP-2モノクローナル抗体で補充された補体充分なヒト血清(すなわち、LEA-2が抑制された血清)は、溶血の支持において未処理の血清よりも効果が約2倍の低さであった。さらに、未処理の血清に比べて未処理のWT RBCの効果的な溶血を促進するためには、より高濃度のLEA-2遮断血清(すなわち、抗MASP-2モノクローナル抗体で処理された)が必要であった(図23)。
本明細書に提示されるデータは、PNHにおける貧血に関して以下の病原性機構を示唆する。主としてであるがただし排他的でなくLEA-1によって開始される、終末補体成分の調節されない活性化およびMACの形成によるRBCの溶解による血管内溶血、ならびに、主としてLEA-2によって開始されると考えられる、C3bによるRBCのオプソニン化によって生じる血管外溶血。補体活性化を開始し、MAC形成および溶血を促進することにおけるLEA-2の認められる役割は明らかであるが、このプロセスは、溶血を生じさせるLEA-1開始補体活性化よりも効果が実質的に低いと考えられる。したがって、LEA-2遮断物質は、PNH患者における血管内溶血を有意に減少させると予想されるが、この治療活性は部分的でしかないと予想される。比較により、LEA-1遮断物質の場合に、PNH患者における血管内溶血のより実質的な減少が予想される。
本明細書に提示されるデータは、別々のクラスの治療剤によって別々に、または組み合わせて標的化することができる、PNHにおけるRBCクリアランスおよび貧血の以下の2つの病原性機構を明示する:主としてであるがただし排他的でなくLEA-1によって開始され、したがって、LEA-1遮断物質によって効果的に予防されると予想される血管内溶血;および、主としてLEA-2によって駆動され、したがってLEA-2遮断物質によって効果的に予防されるC3bオプソニン化による血管外溶血。
上に詳述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断し、ひいては組み合わさって、血管内溶血および血管外溶血を媒介するすべての補体活性化事象を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、PNH患者にとって最良の臨床転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。一部の態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、LEA-1およびLEA-2複合遮断活性を有するそのような実体は、血管内溶血および血管外溶血を効果的に阻止し、PNHにおける貧血を予防する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、LEA-1を遮断し、LEA-2を減少させ、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、さらにLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいはまた、そのような実体は二重特異性モノクローナル抗体からなり得、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、LEA-2を遮断する。そのような実体は最適には二重特異性モノクローナル抗体からなり得、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、LEA-2を減少させ、その上、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、さらにLEA-2を遮断する。また、タンパク質配列およびアーキテクチャ全体の類似性に基づき、機能的にMASP-1、MASP-2、およびMASP-3に特異的に結合し、ひいてはLEA-1およびLEA-2の機能的遮断を達成する、2つの同一の結合部位を有する従来の抗体を開発することができると考えることができる。汎MASP阻害活性を有するそのような抗体は、血管内溶血および血管外溶血の両方を阻止し、ひいてはPNH患者における貧血を効果的に治療すると予想される。
加齢黄斑変性症(AMD)は、高齢者における視力損傷および失明の主要な原因であり、先進国における失明症例の50%までを占める。成人におけるAMD罹患率は約3%であり、年齢とともに増加して、80歳超の人口のほぼ2/3が何らかの徴候を有する。米国においては175万超の個人が進行AMDを有し、人口高齢化とともに罹患率は高まり、2020年までにはほぼ300万に達すると予想されている(Friedman, D.S., et al., Arch. Ophthalmol. 122:564-572, 2004)。AMDは、表面を覆う中央網膜、すなわち黄斑の光受容体の変性および中心視力の損失を生じさせる網膜色素上皮(RPE)の異常である。AMDの早期および中期形態は、RPEに隣接する網膜下空間中のドルーゼン、すなわち脂質、タンパク質、リポタンパク質および壊死細胞片を含む黄色を帯びた物質の漸増的沈着ならびに網膜中の色素不規則性を特徴とする。進行AMDは、2つの臨床サブタイプ;非新生血管形成性地理的萎縮性(「ドライ型」)AMDおよび新生血管形成性滲出性(「ウェット型」)AMDからなる。ドライ型AMDが進行AMDの80~90%を占めるが、突然かつ重篤な視覚損失の大部分はウェット型AMDの患者に起こる。2つのタイプのAMDが、類似した病態から生じる異なる表現型を表すのか、または2つの異なる状態を表すのかは不明である。現在、ドライ型AMDを治療するための治療法は米国薬品医薬品局(United States Food and Drug Administraion)(FDA)によって承認されていない。ウェット型AMDのためのFDA承認治療選択肢は、抗血管形成薬(ラニビズマブ、ペガプタニブナトリウム、アフリベルセプト)の硝子体内注射、レーザー療法、光力学的レーザー療法および埋め込み型望遠鏡を含む。
上述したヒトの遺伝的連鎖研究はAMD病原における補体系の重要な役割を示唆する。さらに、補体活性化産物は、ウェット型およびドライ型の両AMDにおける特徴的な病理学的病変であるドルーゼン中に豊富に存在する(Issa, P.C., et al., Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249:163-174, 2011)。しかし、補体活性化を開始する事象の性質および関与する補体活性化経路は不完全にしか理解されないままである。
組織虚血は広範囲の臨床障害の基礎である。血流の適時回復が虚血組織の保存に不可欠であるが、自然発生的に、または治療的介入によって起こることができる再灌流が、虚血再灌流(I/R)障害と呼ばれる現象である、さらなる組織損傷を招き得ることが長らく認識されている(Eltzschig, H. K. and Tobias, E., Nat. Med. 17:1391-1401, 2011)。I/R障害は、心臓(急性冠症候群)、腎臓(急性腎損傷)、腸(腸I/R)および脳(卒中)のように、単一の臓器を侵襲し得る。I/R障害はまた、大きな外傷および蘇生(多臓器不全)、循環停止(低酸素性脳障害、急性腎損傷)、末梢血管疾患および鎌状赤血球症(急性胸部症候群、急性腎損傷)ののちなど、複数の臓器を冒す場合もある。心臓手術(心肺バイパス後の急性心不全)、胸部手術(急性肺損傷)、末梢血管手術(コンパートメント症候群)、血管手術(急性腎損傷)および固形臓器移植(急性移植片不全)を含む大きな手術がI/R障害と関連する場合もある。現在、I/R障害を標的化する具体的な治療法は存在せず、虚血ゾーンにおける組織のサルベージを最大化し、これらの一般的状況における機能的転帰を改善するために有効な治療の必要性がある。
関節リウマチ(RA)は、全身的な症状発現も有し得る滑膜関節の慢性炎症性疾患である。RAは全世界人口の約1%を冒し、女性の方が2~3倍かかりやすい。関節の炎症は、腫れ、痛みおよびこわばりとして現れる。疾患が進行するにつれ、関節の侵食および破壊が起こり得、その結果、可動域の障害および変形が生じる。RAの治療目標は、関節損傷の予防および抑制、関節機能損失および疾病進行の予防、症候の軽減および生活の質の改善ならびにドラッグフリー寛解の達成を含む。RAの薬理学的治療は、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)、鎮痛薬および抗炎症剤(糖質コルチコイドおよび非ステロイド系抗炎症薬)を含む。DMARDは、長期寛解を誘発し、不可逆性である関節破壊の進行を遅延または停止させることができるため、最も重要な治療である。旧来のDMARDの例は、小分子、例えばメトトレキサート、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金塩、レフルノミド、D-ペニシラミン、シクロスポリンおよびアザチオプリンを含む。旧来のDMARDが疾病を抑制するのに不十分であるならば、腫瘍壊死因子阻害因子(エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴルおよびゴリムマブ)、サイトカインアンタゴニスト(アナキンラおよびトシリズマブ)、リツキシマブおよびアバタセプトのような、炎症細胞または媒介物を標的化するいくつかの生物学的剤が利用可能な治療選択肢である。
播種性血管内凝固(DIC)は、出血および/または血栓症として臨床的に現れることができる凝固系の病理的過剰刺激の症候群である。DICは原発性状態としては起こらず、むしろ、組織損傷(外傷、火傷、熱中症、輸血反応、急性移植拒絶反応)、新生物、感染症、産科的状態(前置胎盤、羊水塞栓症、妊娠中毒症)ならびに雑多な状態、例えば心原性ショック、溺水、脂肪塞栓症、大動脈瘤を含む多様な疾患プロセスと関連して起こる。血小板減少症は、集中治療室中の患者において35%~44%の発生率で頻繁に起こる異常であるが、DICはこれらの症例の約25%の病因である。すなわち、DICは重症患者の約10%において発症する(Levi, M. and Opal, S.M. Crit. Care 10:222-231, 2006)。DICの病態生理は、基礎にある疾患プロセスが生理学的凝固反応を開始させるということである。しかし、血栓症形成促進物質が正常な反対平衡機序を圧倒すると、微小循環中にフィブリンおよび血小板の不適切な沈着が起こり、臓器虚血、低フィブリノゲン血症および血小板減少を招くようになる。DICの診断は、検査値(プロトロンビン時間、部分トロンボプラスチン時間、フィブリン分解産物、Dダイマーまたは血小板数)の異常と共に、適切な基礎疾患またはプロセスにおける臨床所見に基づく。DICの一次治療は、誘因である基礎疾患に対処することである。臨床合併症を治療または予防するために、赤血球、血小板、新鮮な凍結血漿およびクリオプレシピテートの形態の血液製剤サポートが必要になる場合もある。
血栓性微小血管症(TMA)とは、血小板減少症、微小血管症性溶血性貧血および可変性臓器虚血を臨床的特徴とする障害の群をいう。TMAの特徴的な病理学的特徴は、血小板活性化ならびに小細動脈および細静脈中の微小血栓の形成である。古典的TMAは、溶血性尿毒症症候群(HUS)および血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)である。HUSは、急性腎不全の存在によってTTPから区別される。HUSは、2つの形態:下痢関連(D+)または典型HUSおよび下痢を伴わない(D-)または非定型HUS(aHUS)で起こる。
D+HUSは、通常は大腸菌O157または別の志賀毒素産生性細菌株によって生じる前駆的下痢性疾患を伴い、子供におけるHUS症例の90%超を占め、子供における急性腎不全の最も一般的な原因である。大腸菌(Escherichia coli)O157によるヒト感染は相対的によくあるが、D+HUSまで進行する血性下痢の割合は、散発的症例においては3%~7%の範囲であり、いくつかの大発生においては20%~30%であった(Zheng, X.L. and Sadler, J. E., Annu. Rev. Pathol. 3:249-277, 2008)。HUSは通常、下痢発症後4~6日で発症し、子供の約2/3は疾患の急性期において透析を必要とする。有効であることが示されている特定の治療法がないため、D+HUSの治療は支持的である。D+HUSの予後は良好であり、大多数の患者が腎機能を取り戻す。
非定型HUSは奇病であり、米国においては100万人あたり2人の推定発生率である(Loirat, C. and Fremeaux-Bacchi, V. Orphanet J. Rare Dis. 6:60-90, 2011)。非定型HUSは任意の年齢で発症することができるが、大多数の患者は小児期に発症を示す。非定型HUSは不均一である。いくつかの症例は家族性であり、いくつかは再発性であり、いくつかは感染症、一般的に上気道または胃腸炎によって誘発される。通常、aHUSの発症は突然であり、大部分の患者は入院時に透析を必要とする。さらなる腎症状発現が患者の約20%に見られ、中枢神経系、心筋梗塞、虚血性遠位壊疽または多臓器不全を含み得る。aHUSの治療は、臓器不全の場合の支持療法、血漿注入または血漿交換、および、エクリズマブ、最近米国および欧州連合において使用を承認された、C5を標的化するヒト化モノクローナル抗体、を含む。aHUSにおける予後はD+HUSにおける予後ほど良くなく、約25%が急性期に死亡し、大部分の生存者は末期腎疾患を発症する。
血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)は、凝固カスケードまたは補体系を活性化する自己免疫または遺伝性機能不全によって生じる、生命を脅かす血液凝固系の障害である(George, JN, N Engl J Med; 354:1927-35, 2006)。これは体中の小さな血管中に多数の微細な血餅、すなわち血栓を生じさせ、これがTMAの特徴である。赤血球が剪断応力を受け、それが膜を損傷し、血管内溶血を招く。その結果として生じる血流の減少および内皮損傷が、脳、心臓および腎臓を含む臓器の損傷を生じさせる。TTPは、臨床的には血小板減少症、微小血管症性溶血性貧血、神経学的変化、腎不全および発熱を特徴とする。血漿交換の前の時代には、急性エピソード時の致死率は90%であった。血漿交換を実施してさえ、6ヶ月生存率は約80%である。
喘息は一般的な慢性炎症性気道疾患である。米国においては、18歳未満の子供700万人を含む約2500万人が喘息を有し、半分超が年に少なくとも一度は喘息発作を経験し、毎年170万を超える救急外来訪問数および450,000件の入院をもたらしている(ワールドワイドウェブ、gov/health/prof/lung/asthma/naci/asthma-info/index.htm.、2012年5月4日アクセス時点)。この疾患は不均一であり、複数の臨床表現型を有する。最も一般的な表現型はアレルギー性喘息である。他の表現型は、非アレルギー性喘息、アスピリン悪化呼吸器疾患、感染後喘息、職業性喘息、空気中の刺激物誘発性喘息および運動誘発性喘息を含む。アレルギー性喘息の主要な特徴は、多様な特定および不特定刺激への気道過敏性(AHR)、過度の気道粘液産生、肺好酸球増加および血清IgE濃度上昇を含む。喘息の症候は、咳、喘鳴、胸苦しさおよび息切れを含む。喘息治療の目標は、疾患を制御し、悪化、日常的な症候を最小限にし、患者が肉体的に活動的であることを可能にすることである。現在の治療指針は、喘息抑制が達成されるまでの段階的治療を奨励している。最初の治療ステップは、必要に応じて、速効性吸入β2アゴニストののち、長期管理薬、例えば吸入コルチコステロイド、長時間作用性吸入β2アゴニスト、ロイコトリエン修飾薬、テオフィリン、経口糖質コルチコステロイドおよび抗IgEモノクローナル抗体である。
膜性増殖性糸球体腎炎(MPGN)は、メサンギウム細胞増殖と、メサンギウムの内皮下延長による糸球体毛細血管壁の肥厚とを形態学的特徴とする腎障害である。MPGNは原発性(特発性とも呼ばれる)または続発性に分類され、感染症、全身性免疫複合体疾患、新生物、慢性肝疾患などのような基礎疾患を有する。特発性MPGNは3つの形態学的タイプを含む。I型、すなわち古典的MPGNは、免疫複合体の内皮下沈着物および古典補体経路の活性化を特徴とする。II型、すなわちデンスデポジット病(DDD)は、さらなる膜内高密度沈着物を特徴とする。III型はさらなる上皮下沈着物を特徴とする。特発性MPGNは希であり、ネフローゼ症候群の原発性腎原因の約4~7%しか占めない(Alchi, B. and Jayne, D. Pediatr. Nephrol. 25:1409-1418, 2010)。MPGNは、主として子供および若年成人を冒し、ネフローゼ症候群、急性腎炎症候群、無症候性タンパク尿および血尿または再発性肉眼的血尿として現れ得る。腎機能不全が大多数の患者において起こり、疾患は、ゆっくり進行する経過をたどり、患者の約40%が診断から10年以内に末期腎疾患を発症する(前記Alchi and Jayne, 2010)。現在の治療選択肢は、コルチコステロイド、免疫抑制剤、抗血小板レジメンおよび血漿交換を含む。
微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎(NCGN)は、糸球体毛細血管壁が炎症の徴候を示すが、糸球体基底膜に対する微量の検出可能な免疫複合体沈着または抗体を有する急速進行性糸球体腎炎の一形態である。状態は腎機能の急速な低下を伴う。大部分のNCGN患者が、抗好中球細胞質自己抗体(ANCA)を有することがわかっており、したがって、ANCA関連血管炎と呼ばれる疾患の群に属する。血管炎は、血管壁の炎症およびフィブリノイド壊死を特徴とする血管の障害である。全身性血管炎は、血管サイズ:大、中、小に基づいて分類される。小血管血管炎のいくつかの形態は、ANCAの存在、すなわちヴェーゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群および腎限定的血管炎(NCGN)を伴う。それらはまた、全身性エリテマトーデスのような基礎疾患の症状発現であることもできる。ANCAの標的抗原はプロテイナーゼ-3(PR3)およびミエロペルオキシダーゼ(MPO)を含む。微量免疫型NCGNは奇病であり、英国ウェセックス(Wessex)において100万人あたり約4人の発生率が報告されている(Hedger, N. et al., Nephrol. Dial. Transplant. 15:1593-1599, 2000)。微量免疫型NCGN患者128名のウェセックス群においては、73%がANCA陽性であり、患者の59%が初期透析を必要とし、36%が長期透析を必要とした。微量免疫型NCGNの治療は、コルチコステロイドならびにシクロホスファミドおよびアザチオプリンのような免疫抑制剤を含む。ANCA関連血管炎のさらなる治療選択肢はリツキシマブおよび血漿交換を含む(Chen, M. and Kallenberg, C.G.M. Nat. Rev. Rheumatol. 6:653-664, 2010)。
外傷性脳障害(TBI)は、毎年少なくとも1000万人の死亡または入院をもたらす主要な全世界的健康問題である(Langlois, J.A. et al., J. Head Trauma Rehabil. 21:375-378, 2006)。2003年、米国においては、120万件の救急外来訪問、29万件の入院および51,000件の死亡を含め、推定160万件のTBIがあった(Rutland-Brown, W. et al., J. Head Trauma Rehabil. 21:544-548, 2006)。米国におけるTBIの大多数は転倒および交通事故によって生じる。TBIは長期または一生涯の身体的、認知的、行動的および情動的後遺症をもたらす可能性がある。500万を超える米国人がTBI関連の長期または一生涯の身体障害とともに生きている(前記Langlois et al., 2006)。
多くの研究が、補体タンパク質と、アルツハイマー病、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、脳ループスおよび卒中を含む神経学的障害との関係を特定している(Wagner, E., et al., Nature Rev Drug Disc. 9:43-56, 2010において概説されている)。最近、シナプス除去におけるC1qおよびC3の役割が実証され、したがって、補体因子が正常なCNS機能および神経変性疾患の両方に関与する可能性が高い(Stevens, B. et al., Cell 131:1164-1178, 2007)。MASP-1およびMASP-3の遺伝子は脳および神経膠腫細胞株T98G中で広く発現し(Kuraya, M. et al., Int Immunol., 15:109-17, 2003)、CNSにおけるレクチン経路の役割と合致している。
誤嚥とは、口咽頭または胃いずれかの内容物の下気道への吸入と定義される。誤嚥は、誤嚥性(化学性)肺炎、原発性細菌性誤嚥性肺炎または化学性肺炎の続発性細菌感染の合併症を生じさせ得る。誤嚥の危険因子は、意識レベルの低下(例えば、頭部外傷、感覚中枢におけるアルコールまたは薬物誘発性の変化、卒中)、様々な胃腸および食道の異常ならびに神経筋疾患を含む。450万の市中肺炎症例の5~15%が誤嚥性肺炎によるものであると推定される(Marik, P.E. New Engl. J. Med. 344:665-671, 2001)。化学性肺炎の治療は主として支持的であり、経験的抗生物質使用は議論の余地がある。細菌性誤嚥性肺炎の治療は、適切な抗生物質による治療であり、細菌性誤嚥性肺炎の治療は、誤嚥が市中で起こったのかまたは院内で起こったのかに基づき、というのはこれらの状況の間では考えられる原因生物が異なるからである。高リスク患者、例えば咽頭反射障害を有する介護施設中の高齢患者における誤嚥を防ぐための措置が講じられるべきである。有効な予防法であることが示されている措置は、摂食中にベッドの頭部を高くすること、歯科予防および良好な口腔衛生を含む。予防的抗生物質は有効性が示されておらず、耐性菌の出現を招き得ることから、推奨されない。
眼内炎は、眼窩洞の炎症状態であり、通常、感染によって生じる。眼内炎は、遠い感染源(例えば心内膜炎)からの生物の血行性伝播から生じる内因性眼内炎でもあり得るし、または眼科手術、異物および/もしくは鈍的もしくは穿通性眼部外傷の合併症として外部からの生物の直接接種から生じる外因性眼内炎でもあり得る。外因性眼内炎は内因性眼内炎よりもはるかに一般的であり、外因性眼内炎の大部分の症例は眼科手術ののち起こる。米国においては、白内障手術が眼内炎の主要な原因であり、この処置の0.1~0.3%において発生し、過去10年間、発生率の明らかな増加が見られる(Taban, M. et al., Arch. Ophthalmol. 123:613-620, 2005)。術後眼内炎は、手術から2週以内に急性に出る場合もあるし、または手術から数ヶ月後に遅発的に出る場合もある。急性眼内炎は一般に痛み、発赤、眼瞼の腫れおよび視力低下を呈する。遅発性眼内炎は急性型ほど一般的ではなく、患者は軽度の痛みおよびまぶしさしか訴えない場合もある。眼内炎の治療は、基礎にある原因に依存し、全身的および/または硝子体内抗生物質を含み得る。眼内炎は視力低下または失明を招く場合もある。
視神経脊髄炎(NMO)は、視神経および脊髄を標的化する自己免疫疾患である。これは、視神経炎として知られる視神経の炎症および脊髄炎として知られる脊髄の炎症をもたらす。NMOにおける脊髄病変は、脚または腕の衰弱または麻痺、失明、膀胱および腸の機能不全ならびに感覚機能不全を招き得る。
ベーチェット病またはベーチェット症候群は、しばしば粘膜潰瘍および眼の障害を呈する稀な免疫媒介性小血管全身性血管炎である。ベーチェット病(BD)は、再発性口腔潰瘍、性器潰瘍およびブドウ膜炎の三症候複合体を最初に記載したトルコ人皮膚科医Hulusi Behcetの名をとって1937年に命名された。BDは原因不明の全身性再発性炎症障害である。BDの炎症性血管周囲炎は、胃腸管系、肺系、筋骨格系、心血管系および神経系を巻き込み得る。BDは、血管動脈瘤の破裂または重篤な神経学的合併症のせいで致命的になる可能性がある。視神経に血液を供給する血管の血管炎および閉塞から視神経症および萎縮が生じる場合もある。Al-Araji A, et al., Lancet Neurol., 8(2):192-204, 2009を参照されたい。
補体のレクチン経路が2つの主要な補体活性化アームLEA-1およびLEA-2で構成され、また、レクチン非依存性補体活性化アームがあるという認識をもって、補体の免疫防御能力を完全に停止させることなく(すなわち、古典経路をインタクトなままにしておく)、発作性夜間血色素尿症(PNH)、加齢黄斑変性症(AMD)、虚血-再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症(溶血性尿毒症症候群(HUS)、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、および血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)を含む)、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、またはベーチェット病の少なくとも1つと関連する病態を生じさせるこれらのエフェクターアームの1つまたは複数を特異的に阻害することが非常に望ましいということが理解されよう。これは、免疫複合体処置を取り扱い、かつ感染に対する宿主防御を支援するために、C1q依存性補体活性化系をインタクトなままにしておくと考えられる。
本明細書に記載されるように、本発明者らは、溶解を生じさせるLEA-1の活性化がMASP-3依存性であることを予想外に発見した。本明細書にさらに記載されるように、生理学的条件下、MASP-3依存性LEA-1活性化はオプソニン化にも寄与し、それにより、LEA-2媒介性補体活性化との付加的効果を提供する。実施例7に実証されるように、Ca++の存在においては、MASP-3がD因子-/-血清中でLEA-1の活性化を駆動することができるため、D因子は必要とされない。MASP-3、MASP-1およびHTRA-1は、プロD因子を活性D因子へと転換することができる。同様に、MASP-3(MASP-1およびMASP-2とは対照的に)は、自己活性化酵素ではなく、MASP-1の支援なしにはその活性形態へと転換されることができないため、MASP-3活性化は、多くの場合、MASP-1に依存すると考えられる(Zundel, S. et al., J. Immunol. 172:4342-4350 (2004); Megyeri et al., J. Biol. Chem. 288:8922-8934 (2013)。MASP-3は自己活性化せず、多くの場合、MASP-1の活性がその酵素的に活性な形態へと転換されることを必要とするため、第二経路C3コンバターゼC3BbのMASP-3媒介性活性化は、MASP-3酵素前駆体もしくはすでに活性化されたMASP-3を標的化すること、またはMASP-3のMASP-1媒介性活性化を標的化すること、またはその両方により、阻害することができる。理由は、多くの場合、MASP-1機能活性の非存在においては、MASP-3はその酵素前駆体形態にとどまり、第二経路C3コンバターゼ(C3bBb)の直接形成を通してLEA-1を駆動することができないからである。
本明細書に記載されるように、LEA-2媒介性補体活性化はMASP-2依存性であり、オプソニン化および/または溶解を生じさせる。したがって、LEA-2レクチン依存性補体系を特異的に阻害するための治療剤の開発において標的化するのに好ましいタンパク質成分はMASP-2である。いくつかのタンパク質が、タンパク質-タンパク質相互作用を介してMASP-2に結合またはMASP-2と相互作用することが示されている。例えば、MASP-2は、レクチンタンパク質MBL、H-フィコリンおよびL-フィコリンならびにコレクチン-11に結合し、それらと一緒にカルシウム依存性複合体を形成することが知られている。Ma Y., et al., J Innate Immun. Epub Dec. 4 (2012)。各MASP-2/レクチン複合体は、タンパク質C4およびC2のMASP-2依存性切断によって補体を活性化することが示されている(Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, (1987); Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, (2000); Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, (2002))。研究は、MASP-2のCUB1-EGFドメインがMBLとのMASP-2の関連に不可欠であることを示している(Thielens, N. M., et al., J. Immunol. 166:5068, (2001))。また、CUB1EGFCUBIIドメインが、活性MBL複合体の形成に必要であるMASP-2の二量体化を媒介することが示されている(Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000)。したがって、MASP-2依存性補体活性化にとって重要であることが知られているMASP-2標的領域に結合するかまたはそれを妨害するMASP-2阻害物質を同定することができる。
別の局面において、本発明は、発作性夜間血色素尿症(PNH)、加齢黄斑変性症(AMD)、虚血-再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症(溶血性尿毒症症候群(HUS)、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、もしくは血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)を含む)、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象または該疾患もしくは該障害を発症する危険のある対象においてLEA-1の有害作用を阻害し、かつLEA-2の有害作用を阻害する方法であって、MASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-1阻害物質および/またはMASP-3阻害物質の少なくとも1つを含む組成物を該対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
*表2に記載されている交差反応性の列に関して、指定されたMASP阻害因子は、「結合しない」と記されている他の補体成分(すなわち、ポリペプチドまたはその断片)に対する場合よりも少なくとも10倍(例えば少なくとも20倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍)大きい結合親和性で阻害因子結合ドメインに結合する。
本発明のこの局面のいくつかの態様において、MASP阻害物質は、LEA-1および/またはLEA-2補体活性化経路の少なくとも1つを阻害するMASP抗体(例えば、MASP-1、MASP-2またはMASP-3抗体)を含む。本発明のこの局面において有用なMASP抗体は、任意の抗体産生哺乳動物由来のポリクローナル、モノクローナルまたは組換え抗体を含み、かつ、多重特異性(すなわち、二重特異性または三重特異性)、キメラ、ヒト化、完全ヒト、抗イディオタイプ、および抗体断片であり得る。抗体断片としては、本明細書にさらに説明するFab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv断片、scFv断片および単鎖抗体がある。
本発明のこの局面の一部の態様において、古典的補体経路の活性化から生じ得る炎症を減少させるために、本明細書記載のMASP抗体はエフェクター機能が低下している。IgG分子が古典的補体経路を誘発する能力は、この分子のFc部分の中にあることが示されている(Duncan, A.R.. et al., Nature 332:738-740 (1988))。この分子のFc部分が酵素切断によって除去されているIgG分子には、このエフェクター機能がない(Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照されたい)。従って、エフェクター機能を最小化する遺伝子操作Fc配列を有することによって、またはヒトIgG2もしくはIgG4アイソタイプにすることによって、この分子のFc部分を欠いた結果としてエフェクター機能が低下した抗体を作製することができる。
MASP-1、MASP-2、またはMASP-3抗体は、MASP-1、MASP-2、もしくはMASP-3ポリペプチド(例えば、完全長のMASP-1、MASP-1、もしくはMASP-3)を用いてまたは抗原性MASP-1、MASP-2、もしくはMASP-3エピトープ含有ペプチド(例えば、MASP-2ポリペプチドの一部)を用いて作製することができる。免疫原性ペプチドは5アミノ酸残基と小さくてもよい。例えば、本発明の方法において有用なMASP-2抗体を誘導するために、SEQ ID NO:5の全アミノ酸配列を含むMASP-2ポリペプチドが用いられてもよい。例えば表2に示される、タンパク質-タンパク質間相互作用に関与することが公知の特定のMASPドメイン、例えば、CUBIおよびCUBI-EGFドメイン、ならびにセリン-プロテアーゼ活性部位を含む領域が、当技術分野で周知の方法を用いて組換えポリペプチドとして発現され、抗原として用いられてもよい。さらに、MASP-1ポリペプチド(SEQ ID NO:10)またはMASP-2ポリペプチド(SEQ ID NO:5)またはMASP-3ポリペプチド(SEQ ID NO:8)の少なくとも6アミノ酸の部分を含むペプチドもまた、それぞれMASP-1、MASP-2、またはMASP-3抗体を誘導するのに有用である。抗体を産生させるのに用いられるMASPのペプチドおよびポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは組換えペプチドもしくは合成ペプチドおよび触媒的に不活性な組換えポリペプチドとして単離されてもよい。MASP抗体の作製において有用な抗原はまた、融合ポリペプチド、例えば、MASPポリペプチドまたはその一部と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合も含む。ポリペプチド免疫原は完全長分子またはその一部でもよい。ポリペプチド部分がハプテン様であれば、このような部分は、免疫のために、都合よく、巨大分子担体(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、または破傷風トキソイド)に接続または連結されてもよい。
MASP-1、MASP-2、またはMASP-3に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて、動物をMASP-1、MASP-2、またはMASP-3ポリペプチドまたはその免疫原性部分で免疫することによって調製することができる。例えば、Green et al.,「Production of Polyclonal Antisera」, Immunochemical Protocols(Manson, ed.)を参照されたい。MASPポリペプチドの免疫原性は、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウムまたはフロイントアジュバント(完全もしくは不完全)、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、油エマルジョン、KLHおよびジニトロフェノールを含むアジュバントを用いて高まることができる。ポリクローナル抗体は、典型的には、動物、例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジにおいて産生される。または、本発明において有用なMASP抗体はまた、ヒトに近い霊長類に由来してもよい。ヒヒにおいて診断および治療に有用な抗体を産生するための一般的な技法は、例えば、Goldenberg et al.,国際特許公報WO91/11465、およびLosman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990)において見られ得る。次いで、免疫学的に活性な抗体を含有する血清が、当技術分野において周知の標準的な手順を用いて、このような免疫動物の血液から生成される。
一部の態様において、LEA-2阻害物質はMASP-2モノクローナル抗体であり、かつ/またはLEA-1阻害物質はMASP-3モノクローナル抗体またはMASP-1モノクローナル抗体である。上記のように、一部の態様において、MASP-1、MASP-2、またはMASP-3モノクローナル抗体は、単一のMASP-1、MASP-2、またはMASP-3エピトープに対して作られているので高度に特異的である。本明細書で使用する「モノクローナル」という修飾語は、抗体が実質的に均一な抗体集団から得られているという特徴を示し、特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈してはならない。モノクローナル抗体は、連続培養細胞株による抗体分子の作製を提供する任意の技法、例えば、Kohler, G., et al., Nature 256:495 (1975)に記載のハイブリドーマ法を用いて得ることができる。または、モノクローナル抗体は、組換えDNA法(例えば、Cabillyに対する米国特許第4,816,567号を参照されたい)によって作られてもよい。モノクローナル抗体は、Clackson, T., et al., Nature 352:624-628 (1991)、およびMarks, J.D., et al., J. Mol Biol. 222:581-597 (1991)に記載の技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびその任意のサブクラスの抗体でよい。
本発明の方法において有用なモノクローナル抗体には、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるキメラ抗体、ならびにこのような抗体の断片が含まれる(Cabillyに対する米国特許第4,816,567号;およびMorrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, (1984))。
MASP-1、MASP-2、またはMASP-3抗体は組換え法を用いて作ることもできる。例えば、ヒト抗体断片(VH、VL、Fv、D因子、Fab、またはF(ab') 2)を作製するようにヒト免疫グロブリン発現ライブラリー(例えば、Stratagene, Corp., La Jolla, CAから入手可能)を用いてヒト抗体を作ることができる。次いで、キメラ抗体の作製法に類似した技法を用いて、これらの断片を用いてヒト抗体全体を構築する。
望ましい阻害活性を有するMASP-1、MASP-2、またはMASP-3抗体が同定されたら、これらの抗体を用いて、当技術分野において周知の技法を用いてMASP-1、MASP-2、またはMASP-3の一部に似ている抗イディオタイプ抗体を生成することができる。例えば、Greenspan, N.S., et al., FASEB J. 7:437 (1993)を参照されたい。例えば、MASP-2に結合し、補体活性化に必要とされるMASP-2タンパク質相互作用を完全に阻害する抗体を用いて、MASP-2タンパク質上のMBL結合部位に似ている、従って、MASP-2の結合リガンド、例えば、MBLに結合し、これを中和する抗イディオタイプを生成することができる。
本発明の方法において有用なMASP-2およびMASP-3阻害物質は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、抗体断片から形成された、Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab') 2、およびFv断片、scFv断片、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ならびに多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体および三重特異性抗体)を含む周知の断片も包含する。
または、重鎖Fv領域および軽鎖Fv領域が連結されている、MASP-1、MASP-2、またはMASP-3に特異的なペプチド単鎖結合分子を作製することができる。Fv断片は、単鎖抗原結合タンパク質(scFv)を形成するようにペプチドリンカーで連結されてもよい。これらの単鎖抗原結合タンパク質は、オリゴヌクレオチドで連結された、VHドメインをコードするDNAおよびVLドメインをコードするDNAを含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、その後に、大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する1本のポリペプチド 鎖を合成する。scFvを作製するための方法は、例えば、Whitlow, et al.,「Methods:A Companion to Methods in Enzymology」2:97 (1991); Bird, et al., Science 242:423 (1988); Ladnerに対する米国特許第4,946,778号; Pack, P., et al., Bio/Technology 11:1271 (1993)に記載されている。
本発明の方法において有用なMASP-2およびMASP-3阻害物質は、多重特異性(すなわち、二重特異性および三重特異性)抗体を包含する。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原への結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。上述され、かつ表2に示されているように、一態様において、方法は、MASP-2への結合特異性(例えば、MASP-2のCCP1-CCP2またはセリンプロテアーゼドメインの少なくとも1つへの結合)およびMASP-3への結合特異性(例えば、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインへの結合)を含む二重特異性抗体の使用を含む。別の態様において、方法は、MASP-1への結合特異性(例えば、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインへの結合)およびMASP-2への結合特異性(例えば、MASP-2のCCP1-CCP2またはセリンプロテアーゼドメインの少なくとも1つへの結合)を含む二重特異性抗体の使用を含む。別の態様において、方法は、MASP-1への結合特異性(例えば、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインへの結合)およびMASP-3への結合特異性(例えば、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインへの結合)を含む二重特異性抗体の使用を含む。別の態様において、方法は、MASP-1への結合特異性(例えば、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインへの結合)、MASP-2への結合特異性(例えば、MASP-2のCCP1-CCP2またはセリンプロテアーゼドメインの少なくとも1つへの結合)およびMASP-3への結合特異性(例えば、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインへの結合)を含む三重特異性抗体の使用を含む。
一部の態様において、MASP-3またはMASP-2阻害物質は、MASP-3もしくはMASP-2もしくはMASP-1阻害ペプチドまたはMASP-3もしくはMASP-2もしくはMASP-1の非ペプチド阻害因子である。非ペプチドMASP阻害物質は、例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下もしくは他の非経口投与または経口投与によって対象に全身投与され得る。MASP阻害物質は、慢性状態の治療または抑制のために長期にわたって定期的に投与され得るし、急性外傷または傷害の前、期間中または後の期間中に単回または反復投与され得る。
投薬
別の局面において、本発明は、PNHのような溶血性疾患または加齢黄斑変性症(AMD)、虚血-再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症(溶血性尿毒症症候群(HUS)、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、もしくは血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)を含む)、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象においてMASP-3依存性補体活性化の有害作用を阻害するための組成物であって、MASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-3阻害物質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を該対象に投与することを含む、組成物を提供する。一部の態様において、方法は、MASP-2阻害物質を含む組成物を投与する工程をさらに含む。MASP-3およびMASP-2阻害物質は、MASP-3依存性補体活性化(LEA-1)とおよびまた任意でMASP-2依存性補体活性化(LEA-2)と関連する状態を治療または寛解するための治療的に有効な用量で、それを必要とする対象に投与することができる。治療的に有効な用量とは、状態の症候の寛解を生じさせるのに十分な、MASP-3阻害物質またはMASP-3阻害物質とMASP-2阻害物質との組み合わせの量を指す。
一般的に、本発明のMASP-3阻害物質組成物およびMASP-2阻害物質組成物、または、MASP-2阻害物質とMASP-3阻害物質の組み合わせを含む組成物は、他の任意の選択された治療剤と組み合わされてもよく、適宜、薬学的に許容される担体中に含まれる。担体は、無毒で、生体適合性があり、MASP-3阻害物質またはMASP-2阻害物質(およびMASP-2阻害物質と組み合わされた他の任意の治療剤)の生物学的活性に悪影響を及ぼさないように選択される。ペプチド用の例示的な薬学的に許容される担体は、Yamadaに対する米国特許第5,211,657号に記載されている。本明細書に記載される、本発明において有用なMASP抗体は、経口投与、非経口投与、または外科的投与を可能にする、固体、半固体、ゲル、液体、または気体の形をした調製物、例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、デポジトリ(depository)、吸入剤、および注射剤に処方されてもよい。本発明はまた、医療装置などをコーティングすることによる組成物の局所投与も意図する。
本明細書に記載されるMASP抗体に関してより具体的には、例示的な製剤を、水、油、食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの滅菌液体でもよい薬学的担体と共に、生理学的に許容される希釈剤に溶解した化合物の注射投与量の溶液または懸濁液として非経口投与することができる。さらに、MASP抗体を含む組成物中には、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質などが存在してもよい。薬学的組成物のさらなる成分には、石油(例えば、動物由来、野菜由来、または合成由来の石油)、例えば、ダイズ油および鉱油が含まれる。一般的に、グリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが注射液に好ましい液体担体である。
MASP-3阻害物質またはMASP-2阻害物質を含む薬学的組成物は、局所投与方法または全身投与方法が、治療されている状態に最も適しているかどうかに応じて多くのやり方で投与することができる。さらに、本発明の組成物を移植可能な医療装置の表面に、または移植可能な医療装置の中にコーティングまたは組み込むことによって、本発明の組成物を送達することができる。
本明細書で使用する「全身送達」および「全身投与」という用語は、筋肉内(IM)投与経路、皮下投与経路、静脈内(IV)投与経路、動脈内投与経路、吸入投与経路、舌下投与経路、頬投与経路、局部投与経路、経皮投与経路、鼻投与経路、直腸投与経路、腟投与経路、および送達作用物質を1つまたは複数の目的の治療作用部位に効果的に分散させる他の投与経路を含む、経口経路および非経口経路を含むが、これに限定されないことが意図される。本組成物の好ましい全身送達経路には、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、動脈内経路、および吸入経路が含まれる。本発明の特定の組成物において用いられる選択された作用物質の正確な全身投与経路は、一つには、ある特定の投与経路に関連した代謝変換経路に対する作用物質感受性を説明するように決定されることが理解されると考えられる。例えば、ペプチド物質は、最も適切には、経口以外の経路によって投与することができる。
本明細書で使用する「局所」という用語は、目的の限局作用の部位の中に、または目的の限局作用の部位の周囲に薬物を適用することを包含し、例えば、皮膚または他の患部組織への局部送達、眼送達、くも膜下腔内(IT)、脳室内(ICV)、関節内、洞内、頭蓋内、もしくは小胞内の投与、留置、または灌注を含んでもよい。局所投与は、低用量の投与が全身副作用を回避するために、ならびに局所送達部位に活性物質を送達および濃縮するタイミングをより正確に制御するために好ましい場合がある。局所投与は、代謝、血流などの患者間のばらつきに関係なく標的部位において既知濃度を供給する。改善された投与量制御は直接的な送達方法によっても提供される。
予防的用途において、薬学的組成物は、発作性夜間血色素尿症(PNH)、加齢黄斑変性症(AMD)、虚血-再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症(溶血性尿毒症症候群(HUS)、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、および血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)を含む)、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に感受性である対象に、またはそうでなければ該疾患もしくは該障害の危険のある対象に、状態の症候を発症する危険を除くかまたは減少させるのに十分な量で投与される。治療的用途において、薬学的組成物は、発作性夜間血色素尿症(PNH)、加齢黄斑変性症(AMD)、虚血-再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症(溶血性尿毒症症候群(HUS)、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、もしくは血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)を含む)、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害の疑いがある対象またはすでに該疾患もしくは該障害に罹患している対象に、状態の症候を緩和させるのにまたは少なくとも部分的に軽減するのに十分な治療有効量で投与される。
以下の実施例は、本発明の実施について意図された最良の態様(best mode)の単なる例示であり、本発明を限定すると解釈してはならない。本明細書中の全ての文献引用が明確に参照により組み入れられる。
本実施例は、MASP-2欠損マウスが、髄膜炎菌血清群Aまたは髄膜炎菌血清群Bのどちらかに感染した後に髄膜炎菌誘導死から保護されることを証明する。
MASP-2ノックアウトマウス(MASP-2 KOマウス)を、本明細書に参照として組み入れられるUS 7,919,094の実施例1に記載のように生成した。100μl体積で投与量2.6×107CFUの髄膜炎菌血清群A Z2491を腹腔内(i.p.)注射することによって、10週齢MASP-2 KOマウス(n=10)および野生型(WT)C57/BL6マウス(n=10)に接種した。感染用量を、最終濃度400mg/kgの鉄デキストランと一緒にマウスに投与した。72時間の期間にわたって感染後のマウスの生存をモニタリングした。
図8は、感染用量2.6×107cfuの髄膜炎菌血清群A Z2491を投与させた後のMASP-2 KOマウスおよびWTマウスの生存率(%)を図示したカプラン・マイヤープロットである。図8に示したように、感染後72時間の期間全体を通じて100%のMASP-2 KOマウスが生存した。対照的に、感染24時間後、WTマウスの80%しか生存しておらず(p=0.012)、感染72時間後、WTマウスの50%しか生存していなかった。これらの結果から、MASP-2欠損マウスは髄膜炎菌血清群A Z2491誘導死から保護されることが証明される。
本実施例は、髄膜炎菌感染後のMASP-2抗体の投与が髄膜炎菌感染マウスの生存率を増加させることを実証する。
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,919,094号の実施例24に記載されているように、ラットMASP-2タンパク質を使用してFabファージディスプレイライブラリーをパンニングし、そこからFab2#11を機能的に活性な抗体として同定した。ラットIgG2cおよびマウスIgG2aアイソタイプの完全長抗体をFab2#11から生成した。マウスIgG2aアイソタイプの完全長MASP-2抗体を薬力学的パラメータに関して特徴決定した(米国特許第7,919,094号の実施例38に記載されているとおり)。
上記のように生成したFab2#11由来のマウスIgG2a完全長MASP-2抗体アイソタイプを、以下のように、髄膜炎菌感染マウスモデルにおいて試験した。
9週齢C57/BL6チャールズリバーマウスを、高用量(4×106cfu)の髄膜炎菌血清型B株MC58の腹腔内注射から3時間後、阻害性マウスMASP-2抗体(1.0mg/kg)(n=12)または対照アイソタイプ抗体(n=10)で処理した。
図12は、感染量4×106cfuの髄膜炎菌血清群B株MC58の投与ののち、阻害性MASP-2抗体(1.0mg/kg)または対照アイソタイプ抗体のいずれかを感染後3時間で投与したマウスの生存率%をグラフで示すカプラン・マイヤー(Kaplan-Meyer)プロットである。図12に示すように、MASP-2抗体で処理されたマウスは、90%が感染後72時間を通して生存した。対照的に、アイソタイプ抗体で処理されたマウスは、50%しか感染後72時間を通して生存しなかった。「*」という記号は、2つの生存曲線の比較によって決定されたp=0.0301を示す。
本実施例は、ヒト血清中の髄膜炎菌の補体依存性死滅がMASP-3依存性であることを実証する。
機能的MBLの血清レベルが低下した患者は、再発性の細菌および真菌感染への罹患性の増大を示す(Kilpatrick et al., Biochim Biophys Acta 1572:401-413 (2002))。髄膜炎菌がMBLによって認識されることは公知であり、MBL欠損血清が髄膜炎菌を溶解しないことが示されている。
1. 様々な補体欠損ヒト血清におけるおよびヒトMASP-2抗体で処理されたヒト血清における血清殺菌活性
この実験には、以下の補体欠損ヒト血清および対照ヒト血清を使用した。
図13は、表5に示すヒト血清試料中、様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示す。表6は、図13のスチューデントt検定の結果を提示する。
この実験には、以下の補体欠損ヒト血清および対照ヒト血清を使用した。
注記:試料DにおけるMASP-3-/-(MASP-1+)血清は、特徴が重なるCarnevale症候群、Mingarelli症候群、Malpuech症候群およびMichels症候群の統一用語である3MC症候群の対象から採取したものである。実施例4にさらに記載されるように、MASP-1/3遺伝子のエキソン12の突然変異は、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインを機能不全にするが、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインを機能不全にしない。実施例19に記載されるように、プロD因子は3MC血清中に優先的に存在しているが、活性化されたD因子は正常ヒト血清中に優先的に存在している。
図14は、表7に示すヒト血清試料中、様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示す。図14に示すように、WT(NHS)血清が、髄膜炎菌に関して最高レベルの殺菌活性を有する。対照的に、MBL-/-およびMASP-3-/-(MASP-1充分である)ヒト血清は任意の殺菌活性を有しない。これらの結果は、ヒト20%(v/v)血清中の髄膜炎菌の補体依存性死滅がMASP-3およびMBL依存性であることを示す。表8は図14のスチューデントt検定の結果を提示する。
この実験には、以下の補体欠損マウス血清および対照マウス血清を使用した。
図15は、表9に示すマウス血清試料中、様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示す。図15に示すように、MASP-2-/-マウス血清は、WTマウス血清よりも髄膜炎菌に関して高いレベルの殺菌活性を有する。対照的に、MASP-1/3-/-マウス血清は任意の殺菌活性を有しない。「**」という記号はp=0.0058を示し、「***」という記号はp=0.001を示す。表10は、図15のスチューデントt検定の結果を提示する。
本実施例は、実施例1~3に記載されるような、MASP-2 KOマウスにおいて認められた髄膜炎菌感染に対するMASP-3依存性抵抗の機構を決定するために実施された一連の実験を記載する。
以下のように、MASP-2 KOマウスにおいて認められた髄膜炎菌感染に対するMASP-3依存性抵抗の機構(上記実施例1~3に記載)を決定するために一連の実験を実施した。
方法:
MASP-1/3欠損マウスがレクチン経路機能活性(「LEA-2」とも呼ばれる)を欠損しているかどうかを判定するために、参照により本明細書に組み入れられるSchwaeble W. et al., PNAS vol 108(18):7523-7528 (2011)に記載されているとおりに、レクチン活性化経路特異的アッセイ条件下(1%血漿)、試験される様々な補体欠損マウス系統からの血漿中のC3コンバターゼ活性の動態を測定するためのアッセイ法を実施した。
レクチン経路特異的条件下のC3活性化の動態(1%血清を有するマンナンコーティングされたプレート上のC3b沈着によって測定)を図16に示す。MASP-2-/-血漿中にはC3切断は見られなかった。B因子-/-(B因子-/-)血漿は、おそらくは増幅ループの損失のせいで、WT血漿の半分の速度でC3を切断した。C4-/-(T1/2=33分)およびMASP-1/3-/-欠損血漿(T1/2=49分)においてC3からC3bへのレクチン経路依存性転換の有意な遅延が見られた。MASP-1/3-/-血漿におけるC3活性化のこの遅延は、MASP-3依存性ではなくMASP-1依存性であることが示されている(Takahashi M. et al., J Immunol 180:6132-6138 (2008)を参照されたい)。これらの結果は、MASP-1/3-欠損マウスがレクチン経路機能活性(「LEA-2」とも呼ばれる)を欠損していないことを実証する。
原理:
MASP-3のセリンプロテアーゼをコードするエキソン中のフレームシフト突然変異によって生じる3MC症候群を有するMASP-3欠損患者の血清を試験することにより、第二経路活性化に対する遺伝性MASP-3欠損の影響を判定した。3MC症候群とは、特徴が重なるCarnevale症候群、Mingarelli症候群、Malpuech症候群およびMichels症候群の統一用語である。この珍しい常染色体劣性障害は、特徴的な顔面異形症、口唇裂および/または口蓋裂、頭蓋骨癒合症、学習障害ならびに性器、四肢および膀胱直腸異常を含む一連の発達的特徴を示す。Rooryck et al., Nature Genetics 43:197-203 (2011)は、3MC症候群の11家族を研究し、突然変異した2つの遺伝子COLEC11およびMASP-1を同定した。MASP-1遺伝子の突然変異は、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にするが、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にはしない。したがって、MASP-3のセリンプロテアーゼをコードするエキソン中に突然変異を有する3MC患者は、MASP-3を欠損しているが、MASP-1を充分に有する。
MASP-3欠損血清は、3MC患者、その3MC患者の母親および父親(両親とも、MASP-3セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にする突然変異を有するアレルに関してヘテロ接合性)ならびにC4欠損患者(両方のヒトC4遺伝子を欠損している)およびMBL欠損対象から得た。Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol. 11:291-295 (1981))に記載されているような従来のAP特異的条件下(BBS/Mg++/EGTA、Ca++なし、ここで、BBS=スクロースを含有するバルビタール緩衝食塩水)、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上、0.5~25%の範囲の血清濃度で第二経路アッセイ法を実施し、時間の経過とともにC3b沈着を測定した。
図17は、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上の第二経路駆動型C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損、C4欠損およびMBL欠損対象から採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図17に示すように、MASP-3欠損患者の血清は、高い血清濃度(25%、12.5%、6.25%血清濃度)で残留第二経路(AP)活性を有するが、有意に高いAP50(すなわち、最大C3沈着の50%を達成するために必要な血清の9.8%)を有する。
方法:
MASP-2-/-、MASP-1/3-/-およびWTマウスから採取された0%~20%の範囲のマウス血清濃度を使用して、マンナン、ザイモサンおよび肺炎連鎖球菌D39でコーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着を測定した。「従来の」第二経路特異的条件下(すなわちCa++なしのBBS/EGTA/Mg++)またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下(すなわちBBS/Mg++/Ca++)、C3b沈着アッセイ法を実施した。
図19Aは、従来の第二経路特異的条件下(すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++)またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下(BBS/Mg++/Ca++)、マンナンコーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスから採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図19Bは、従来のAP特異的条件下(すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++)またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下(BBS/Mg++/Ca++)、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスからの血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図19Cは、従来のAP特異的条件下(すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++)またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下(BBS/Mg++/Ca++)、肺炎連鎖球菌D39コーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスからの血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。
本実施例に記載された結果は、MASP-2阻害因子(またはMASP-2 KO)が、MASP-3駆動型第二経路活性化を促進することにより、髄膜炎菌感染からの有意な保護を提供することを実証する。マウス血清溶菌アッセイ法およびヒト血清溶菌アッセイ法の結果はさらに、髄膜炎菌に対する血清殺菌活性をモニターすることにより、髄膜炎菌に対する殺菌活性がMBL欠損(マウスMBL AおよびMBL C二重欠損血清およびヒトMBL欠損血清)中には存在しないことを示す。
本実施例は、発作性夜間血色素尿症(PNH)のマウスモデルから得られた血液試料に由来する赤血球の溶解に対するMASP-2欠損および/またはMASP-3欠損の阻害作用を証明する。
発作性夜間血色素尿症(PNH)はマルキアファーヴァ・ミケーリ症候群とも呼ばれ、補体誘導性の血管内溶血性貧血を特徴とする、後天的な、潜在的に命にかかわる血液疾患である。PNHの顕著な特徴は、補体制御因子CD55およびCD59がPNH赤血球上に存在しないために補体第二経路が無秩序に活性化した結果である慢性的な補体媒介性血管内溶血と、その後に起こるヘモグロビン尿症および貧血である。Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11)(2010)、Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535(2011)。PNHにおける貧血は血流中の赤血球の破壊が原因である。PNHの症状には、尿中のヘモグロビンの出現による赤色尿、背部痛、疲労、息切れ、および血栓症が含まれる。PNHは自然発症することがあり、これは「一次PNH」と呼ばれるか、または再生不良性貧血などの他の骨髄障害の状況では「二次PNH」と呼ばれる。PNHの治療には、貧血の場合は輸血、血栓症の場合は血液凝固阻止、および補体系を阻害することによって免疫破壊から血球を保護するモノクローナル抗体エクリズマブ(Soliris(登録商標))の使用(Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6) 552-9(2004))が含まれる。エクリズマブ(Soliris(登録商標))は、補体成分C5を標的とし、C5コンバターゼによるC5切断を遮断し、それによって、C5aの産生およびMACの集合を阻止するヒト化モノクローナル抗体である。エクリズマブによるPNH患者の治療は、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって測定されるように血管内溶血を減少させ、そのため、患者の約半分におけるヘモグロビン安定化および輸血非依存性につながった(Hillmen P, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol11(6)(2011))。エクリズマブ療法を受けているほぼ全員の患者においてLDHレベルが正常またはほぼ正常になったが(血管内溶血の管理のため)、患者の約1/3しかヘモグロビン値 約11gr/dLに達せず、エクリズマブを服用した残りの患者は中程度から重度の(すなわち、輸血依存性)貧血をほぼ同じ割合で示し続ける(Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100(2009))。Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535(2011)に記載のように、エクリズマブを服用しているPNH患者は、PNH赤血球のかなりの部分に結合しているC3断片を含んだ(が、未治療患者は含んでいなかった)ことが証明された。このことから、膜に結合しているC3断片はPNH赤血球に対してオプソニンとして働き、その結果、特異的C3受容体を介して細網内皮細胞内に閉じ込められ、その後に、血管外溶血が起こるという結論が導かれた。従って、C3断片を介した血管外溶血を発症している患者は赤血球輸血を必要とし続けるので、これらの患者には、エクリズマブの使用の他に治療方針が必要とされる。
PNH動物モデル:
CrryおよびC3を欠損した(Crry/C3-/-)遺伝子標的化マウスおよびCD55/CD59欠損マウスから血液試料を採取した。これらのマウスは、赤血球上のそれぞれの表面補体制御因子を欠き、したがって、これらの赤血球はPNHヒト血球と同様に自発的に補体自己溶解を受けやすい。
1日目、マウスRBC(±マンナンコーティング)の調製
材料は以下を含むものであった:新鮮なマウス血液、BBS/Mg++/Ca++(4.4mMバルビツール酸、1.8mMナトリウムバルビトン、145mM NaCl、pH7.4、5mM Mg++、5mM Ca++)、塩化クロム、CrCl3・6H2O(BBS/Mg++/Ca++中0.5mg/mL)、およびマンナン、BBS/Mg++/Ca++中100μg/mL。
材料は、BBS/ゼラチン/Mg++/Ca++(上記)、試験血清、96ウェル丸底および平底プレートならびに410~414nmで96ウェルプレートを読み取る分光光度計を含むものであった。
上記プロトコールに詳述したように、CD55/CD59二重欠損マウスおよびCrry/C3二重欠損マウスから新鮮な血液を採取し、赤血球を調製した。赤血球を分割し、赤血球の半分をマンナンでコーティングし、他方の半分を未処理のままにし、最終濃度を108/mLに調節し、そのうち100μlを、上記のように実施した溶血アッセイ法に使用した。
最初の実験において、コーティングなしのWTマウス赤血球が任意のマウス血清中で溶解しないことがわかった。さらに、マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球は、WTマウス血清中ではゆっくりと溶解するが(37度で3時間超)、MBLヌル血清中では溶解しないことがわかった(データ示さず)。
マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球は、MBLを含む高希釈ヒト血清中では非常に良好に溶解するが、MBLを含まない高希釈ヒト血清中ではそうはならない。試験した各血清濃度での効率的な溶解は、第二経路がこの溶解に関与せず、または必要とされないことを暗示する。MBL欠損マウス血清およびヒト血清がマンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球を溶解できないことは、古典経路もまた、観察された溶解とは関係がないことを示す。レクチン経路認識分子(すなわちMBL)が必要とされるため、この溶解はレクチン経路によって媒介される。
Crry/C3およびCD55/CD59二重欠損マウスから新鮮な血を採取し、マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球を、上記のような溶血アッセイ法において、以下のヒト血清:MASP-3-/-;MBLヌル;WT;ヒトMASP-2抗体で前処理されたNHS;および対照としての熱不活化NHSの存在において分析した。
マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球とともにNHSを、1/640まで(すなわち、1/40、1/80、1/160、1/320および1/640)希釈された希釈物、ヒトMBL-/-血清、ヒトMASP-3欠損血清(3MC患者からのもの)およびMASP-2mAbで前処理されたNHSおよび対照として熱不活化NHSの中でインキュベートした。
Crry/C3およびCD55/CD59二重欠損マウスからの新鮮な血液から採取されたコーティングなしのCrry-/-マウス赤血球を、上記のような溶血アッセイ法において、以下の血清:MASP-3-/-;MBL-/-;WT血清;ヒトMASP-2抗体で前処理されたNHSおよび対照として熱不活化NHSの存在において分析した。
図23は、3MC(MASP-3-/-)患者、熱不活化(HI)NHS、MBL-/-、MASP-2抗体で前処理されたNHSおよびNHS対照からのヒト血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、コーティングなしのマウス赤血球の溶血(上清への溶解WTマウス赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定)をグラフで示す。図23に示し、表12にまとめているように、MASP-3の阻害が非感作WTマウス赤血球の補体媒介性溶解を阻害することが実証される。
本実施例は、WTまたはMASP-1/3-/-マウス血清の存在における溶解に関してマンナンコーティングされたウサギ赤血球を試験する溶血アッセイ法を記載する。
1. マウスMASP-1/3欠損血清およびWT対照血清におけるウサギRBC(マンナンコーティングされた)の溶血アッセイ法
1日目、ウサギRBCの調製
材料は以下を含むものであった:新鮮なウサギ血液、BBS/Mg++/Ca++(4.4mMバルビツール酸、1.8mMナトリウムバルビトン、145mM NaCl、pH7.4、5mM Mg++、5mM Ca++)、0.1%ゼラチンを含むBBS/Mg++/Ca++、緩衝液に含まれた塩化クロム、すなわちCrCl3.6H2O(BBS/Mg++/Ca++中0.5mg/mL)およびマンナン、BBS/Mg++/Ca++中100μg/mL。
1. ウサギ全血(2mL)を、2つの1.5mLエッペンドルフ管に分割し、4℃の冷却エッペンドルフ遠心分離機中、8000rpm(約5.9rcf)で3分間遠心処理した。氷冷BBS/Mg++/Ca++中に再懸濁させたのち、RBCペレットを3回洗浄した。3回目の洗浄後、ペレットをBBS/Mg++/Ca++4mL中に再懸濁させた。このアリコート2mLを、コーティングなし対照として使用するために、15mLファルコンチューブに加えた。残り2mLのRBCアリコートをCrC13緩衝液2mL中に希釈し、マンナン溶液2mLを添加し、懸濁液を穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートした。BBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++7.5mLを混合物に加えることによって反応を停止させた。上記のように赤血球をペレット化し、RBCをBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++で2回洗浄した。RBC懸濁液をBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++中、4℃で貯蔵した。
2. 懸濁させたRBC100μlを水1.4mLで希釈し、8000rpm(約5.9rcf)で3分間スピンダウンし、上清のODを541nmで0.7に調節した(541nmで0.7のODは赤血球約109個/mLに相当)。
3. 再懸濁させたRBCをBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++で108個/mLの濃度まで希釈した。
4. 試験血清の希釈物を氷冷BBS/ゼラチン/Mg++/Ca++中に調製し、各血清希釈物100μlを丸底プレートの対応するウェルにピペットで移した。適切に希釈したRBC100μl(108/mL)を各ウェルに加えた。完全な溶解のための対照として、精製水(100μL)を希釈RBC(100μL)と混合して100%溶解を生じさせ、一方、血清なしのBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++(100μL)を陰性対照として使用した。次いで、プレートを37℃で1時間インキュベートした。
5. 丸底プレートを3250rpmで5分間遠心処理した。各ウェルからの上清(100μL)を平底プレートの対応するウェルに移し、ELISAリーダー中、415~490nmでODを読み取った。結果を、490nmでのODに対する415nmでのODの比として報告する。
図25は、MASP-1/3-/-およびWT対照からの血清中の一定範囲の血清濃度にわたり、マウス血清によるマンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血(上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定)をグラフで示す。図25に示すように、MASP-3の阻害が、マンナンコーティングされたWTウサギ赤血球の補体媒介性溶解を阻止することが実証される。これらの結果はさらに、実施例5に記載されたようなPNHの1つまたは複数の局面の治療のためのMASP-3阻害因子の使用を裏付ける。
本実施例は、D因子欠損血清中、Ca++の存在において第二経路が活性化されることを実証する。
方法:
第二経路特異的条件下(BBS/EGTA/Mg++、Ca++なし)、以下のマウス血清:D因子-/-;MASP- -/-;およびWTの希釈度を高めながら使用して、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上でC3b沈着アッセイ法を実施した。
図26は、第二経路特異的条件下で実施されたC3沈着アッセイ法におけるC3b沈着(OD 405nm)のレベルを、D因子-/-、MASP-2-/-;およびWTマウス血清からの血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図26に示すように、これらの条件下、D因子-/-マウス血清はC3をまったく活性化せず、第二経路は作用していない。MASP-2-/-血清は、WT血清と同様な速度で第二経路活性化を示す。これらの結果は、Ca++の非存在においては、C3b沈着のためにD因子が必要とされることを確認させる。これは、MASP-1、MASP-3活性化酵素およびMASP-3とそれぞれの糖質認識成分との相互作用がCa++依存性であるため、これらの条件下ではMASP-3をその酵素的に活性な形態へと転換することができないという証拠と合致している。
方法:
生理学的条件下(BBS/Ca++/Mg++)(LPおよびAPの両方が機能することを可能にする)、以下のマウス血清:D因子-/-;MASP-2-/-;およびWTの希釈度を高めながら使用して、C3b沈着アッセイ法を実施した。
図27は、生理学的条件下(Ca++の存在下)で実施されたC3b沈着アッセイ法におけるC3b沈着(OD 405nm)のレベルを、D因子-/-;MASP-2-/-;およびWTマウスからの血清の試料を使用する血清濃度の関数としてグラフで示す。図27に示すように、D因子-/-マウス血清は、指示された血清希釈度を通して、WT血清に比べて差なく、レクチン経路および第二経路の両方を介してC3を活性化する。MASP- -/-血清は、第二経路(すなわちMASP-3駆動型第二経路活性化)のみによって、より低い血清希釈度でC3のターンオーバーを示す。これらの結果は、Ca++の存在においては、MASP-3が第二経路活性化を駆動することができるという条件で、D因子が必要とされないことを示す。
方法:
以下のとおりに、生理学的条件下(BBS/Ca++/Mg++)、マンナンコーティングされたマイクロタイタープレート上でC3b沈着アッセイ法を実施した。
1. マイクロタイターELISAプレートを、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCo3、0.02%アジ化ナトリウム、pH9.6)中のマンナン(1μg/mL)で4℃において一晩コーティングした。
2. 翌日、BBS(4mMバルビタール、145mM NaCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、pH 7.4)中0.1% HSAを250μl/ウェルで用いて残留タンパク質結合部位を室温で2時間ブロッキングした。
3. プレートを洗浄緩衝液(0.05% Tween 20および5mM CaCl2を含むTBS)で3回洗浄した。
4. BBS中1:10希釈血清試料を指定の時点でウェルに加えた。緩衝液のみを入れたウェルを陰性対照として使用した。プレートを37℃で40分間インキュベートした。
5. 次いで、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。
6. 次いで、洗浄緩衝液中で1:5000に希釈したウサギ抗ヒトC3c(Dako)100μlをウェルに加え、プレートを37℃で90分間インキュベートした。
7. 洗浄緩衝液で3時間洗浄したのち、洗浄緩衝液中で1:5000に希釈したアルカリホスファターゼコンジュゲート化抗ウサギ100μlをウェルに加え、その後、室温で90分間インキュベートした。
8. 洗浄後、基質溶液100μlを加えることによってアルカリホスファターゼを検出した。
9. 15分間インキュベートしたのち、光学密度をOD 405nmで測定した。
図28は、MASP-2 mAbの存在または非存在におけるD因子-/-またはB因子-/-マウスから採取されたマウス血清中、生理学的条件下(Ca++の存在下)で実施されたC3b沈着アッセイ法におけるC3b沈着(OD 405nm)のレベルを血清インキュベーション時間(分)の関数としてグラフで示す。図28に示すように、WTおよびD因子-/-血清におけるC3b沈着の量に差はなく、D因子の非存在でさえ、MASP-3が第二経路活性化を開始させることができるという結論の強力な支持を提供する。観察されたシグナルは、レクチン経路活性化および第二経路活性化の両方によるものと考えられる。図28にさらに示すように、D因子-/-+MASP-2 mAbはMASP-3-媒介性第二経路活性化のみを示す。B因子-/-+MASP-2 mAbはバックグラウンドのみであった(データ示さず)。熱不活化血清をバックグラウンド対照値として使用すると、それは、MASP-2とのD因子-/-およびB因子-/-と同一であった(データ示さず)。
本実施例は、ヒトMASP-1、MASP-2またはMASP-3ポリペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を製造し、二重、二重特異性、または汎特異性MASP抗体を生成する例示的方法を記載する。
8~12週齢のオスA/Jマウス(Harlan, Houston, Tex.)に、pH7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS)200μl中、完全フロイントアジュバント(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)中のヒト完全長ポリペプチド:rMASP-1(SEQ ID NO:10)、rMASP-2(SEQ ID NO:5)もしくはrMASP-3(SEQ ID NO:8)または例えば表2に記載したようなそれらの抗原断片100μgを皮下注射する。2週間後、不完全フロイントアジュバント中の同じヒトポリペプチド50μgをマウスに皮下注射する。6週目、PBS中の同じヒトポリペプチド50μgをマウスに注射し、4日後に融合させる。
前記のMASP-2 ELISAアッセイ法の試験において陽性と判定された培養上清を、MASP-2に対してMASP-2阻害物質が有する結合親和性を決定するために結合アッセイ法において試験することができる。阻害物質が補体系の他の抗原に結合するかどうか判定するために類似アッセイ法も使用することができる。
MASP-2/3二重阻害抗体:図4、6、および7Cに示すように、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:8のベータ鎖によってコードされた、セリンプロテアーゼドメイン中のMASP-2とMASP-3との間で保存された領域がある。したがって、二重MASP-2/3抗体は、MASP-2(またはMASP-3)のセリンプロテアーゼドメイン、例えばSEQ ID NO:5(またはSEQ ID NO:8)のベータ鎖を含む、またはそれからなる抗原を使用して、上記のようにモノクローナル抗体を生成することによって生成することもできるし、あるいはまた、これらの抗原を使用して、これらの抗原に特異的に結合するクローンに関してファージライブラリーをスクリーニングし、その後、MASP-3(またはMASP-1)への二重結合に関してスクリーニングし得る。次いで、二重MASP-2/3抗体を、例えば表2に記載されるように、機能アッセイ法において阻害活性に関してスクリーニングする。
アルファ鎖:MASP-2とMASP-1/3との間の同一性の数多くの部分は、MASP-1/3およびMASP-2に結合するモノクローナル抗体を生成することが可能であり得ることを示唆する。特に、同一性の大部分は、図5に示すようにCUB1-EGF-CUB2ドメイン内にある。図5に示す様々なドメインは、Yongqing, et al., Biochemica et Biophysica Acta 1824:253-262 (2012); Teillet et al., J. Biol. Chem. 283:25715-25724 (2008);およびMarchler-Bauer et al., Nucleic Acids Res. 39:D225-229 (2011)に従って同定されたものである。
汎特異性MASP阻害抗体(すなわち、MASP-1、2および3活性を阻害する抗体)は以下のとおりに生成される。
1. MASP-1/3およびMASP-2アルファ鎖CUB1-EGF-CUB2ドメインに対してライブラリーをスクリーニングし、MASP-1/3およびMASP-2の両方と交差反応するクローンを選択する。
2. 例えば表2に記載されるような機能活性を阻害する能力に関してクローンをスクリーニングする。
3. DTLacO親和性/機能的成熟技術(Yabuki et al., PLoS ONE, 7(4):e36032 (2012))を使用して、3つすべてのタンパク質への結合および阻害機能を最適化する。
4. 表2に記載されるように、汎MASP阻害因子を使用してLEA-1-およびLEA-2媒介性補体活性化を阻害することができる。
二重特異性MASP-2/3阻害抗体は以下のとおりに生成される。
1. 実施例11~14に記載されるように、CCP1ドメインに結合し、かつMASP-2依存性補体活性化を阻害する例示的なMASP-2特異性阻害抗体は同定されている。
2. MASP-3特異性阻害抗体は、実施例15に記載されるようにMASP-3ポリペプチドに対してライブラリーをスクリーニングし、かつMASP-3抗体を同定したのち、例えば表2に記載されるように機能アッセイ法においてLEA-1阻害活性に関して抗体をアッセイすることによって生成される。例示的なMASP-3抗体は実施例15に記載される。
3. MASP-2およびMASP-3に特異的な抗原結合領域をフレームワークにクローニングして二重特異性抗体を生成する。免疫グロブリンG様フォーマットならびに様々な融合タンパク質および単鎖可変断片構成を含む数多くの二重特異性抗体フォーマットが記載されている(Holmes, Nature Reviews, Drug Discovery 10:798-800 (2011), Muller and Kontermann, Biodrugs 24:89-98 (2010))。一例において、二重特異性抗体は、2つの別々の抗原に対する抗体を発現する2つのハイブリドーマを融合して、様々な重鎖および軽鎖対合を生じさせることによって生成することができ、該対合の一定の割合が、一方の抗原に特異的な重鎖および軽鎖と対合した他方の抗原に特異的な重鎖および軽鎖を含む(Milstein and Cuello, Nature 305:537-539 (1983))。2つの重鎖が異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対を同時発現させることにより、同様な二重特異性抗体を組換え的に生成し得る。所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)(例えば、実施例11~14に記載されるようなMASP-2抗体、実施例15に記載されるようなMASP-3抗体)を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。融合は、好ましくは、ヒンジ、CH2およびCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。免疫グロブリン重鎖融合物および所望の場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物中に同時トランスフェクトする。
一態様において、二重特異性抗体が提供され、該二重特異性抗体が、ヒトMASP-2およびヒトMASP-3に結合し、かつ、
(I)以下を含む、MASP-2特異的結合領域:
(a)(i) SEQ ID NO:21の31~35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;および(ii) SEQ ID NO:21の50~65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:21の95~102のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、を含む重鎖可変領域の少なくとも1つまたは複数、および/または、
(b)(i)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの24~34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの50~56のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの89~97のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、を含む軽鎖可変領域の少なくとも1つまたは複数;ならびに
(II)MASP-3特異的結合領域、任意で、以下の少なくとも1つを含むMASP-3特異的結合領域:
(a)(i)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:26の31~35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:26の50~65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:26の95~102のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、を含む重鎖可変領域、および
(b)(i)SEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:29いずれかの24~34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:29いずれかの50~56のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:29いずれかの89~97のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、を含む軽鎖可変領域
を含む。
一態様において、二重特異性抗体が提供され、該二重特異性抗体が、ヒトMASP-1およびヒトMASP-2に結合し、かつ、
(I)以下を含む、MASP-2特異的結合領域:
(a)(i)SEQ ID NO:21の31~35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:21の50~65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:21の95~102のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、を含む重鎖可変領域の少なくとも1つまたは複数、ならびに/または、
(b)(i)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの24~34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの50~56のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの89~97のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、を含む軽鎖可変領域の少なくとも1つまたは複数;ならびに
(II)MASP-1特異的結合領域
を含む。
本実施例は、L-フィコリン/P35、H-フィコリン、M-フィコリン、またはマンナンを介したMASP-2依存性補体活性化を遮断することができるMASP-2阻害物質を同定するための機能スクリーニングとして用いられるインビトロC4切断アッセイ法について述べる。
以下のアッセイ法を用いて、免疫複合体によって古典経路が開始する条件下でMASP阻害物質の効果を分析することによって、MASP阻害物質が古典経路を遮断するかどうか試験する。
免疫複合体によって古典経路が開始する補体活性化の状態に対するMASP阻害物質の効果を試験するために、90%NHSを含有する3つ組の試料50μlを、10μg/mL免疫複合体またはPBSの存在下で37℃においてインキュベートする。37℃でのインキュベーション中に、200nM抗プロペルジンモノクローナル抗体を含有する3つ組の対応する試料(+/-免疫複合体)も含める。37℃で2時間のインキュベーション後に、さらなる補体活性化を止めるために、13mM EDTAを全ての試料に添加し、すぐに、試料を5℃まで冷却する。次いで、試料を-70℃で保管した後に、ELISAキット(Quidelカタログ番号A015およびA009)を用いて製造業者の説明書に従って補体活性化産物(C3aおよびsC5b-9)をアッセイする。
本実施例は、MASP-2活性を遮断する高親和性MASP-2 Fab2抗体断片の同定について述べる。
1.レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定するためのアッセイ法:
背景:レクチン経路C3コンバターゼは、C3を2つの強力な炎症誘発断片であるアナフィラトキシンC3aおよびオプソニンC3bにタンパク分解によって切断する酵素複合体(C4bC2a)である。C3コンバターゼの形成は、炎症を媒介する点でレクチン経路の重要な段階であると考えられる。MASP-2はレクチン経路C3コンバターゼ(C4bC2a)の構造成分ではない。従って、MASP-2抗体(またはFab2)は、既にあるC3コンバターゼの活性を直接阻害しない。しかしながら、レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質成分(C4b、C2a)を生成するために、MASP-2セリンプロテアーゼ活性が必要とされる。従って、MASP-2機能活性を阻害するMASP-2 Fab2(すなわち、遮断MASP-2 Fab2)はレクチン経路C3コンバターゼの新規形成を阻害する。C3は、その構造の一部として、珍しく、かつ高反応性のチオエステル基を含有する。このアッセイ法ではC3がC3コンバターゼによって切断されると、C3b上のチオエステル基は、エステル結合またはアミド結合を介してプラスチックウェルの底に固定化された巨大分子上のヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することができ、従って、ELISAアッセイ法におけるC3bの検出が容易になる。
96ウェルCostar Medium Bindingプレートを、1μg/50μl/ウェルで、50mM炭酸緩衝液、pH9.5で希釈したマンナンと5℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、200μl PBSで各ウェルを3回洗浄した。次いで、ウェルを、PBSに溶解した100μl/ウェルの1%ウシ血清アルブミンでブロッキングし、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、各ウェルを200μlのPBSで3回洗浄した。MASP-2 Fab2試料を、5℃で、Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1%ゼラチン、pH7.4)で選択された濃度まで希釈した。0.5%ラット血清を5℃で前記試料に添加し、100μlを各ウェルに移した。プレートに蓋をし、補体活性化を可能にするために37℃水浴中で30分間インキュベートした。37℃水浴から、氷と水の混合物を含む容器にプレートを移すことによって、反応を止めた。各ウェルを、PBS-Tween20(0.05%Tween20を含むPBS)で200μlで5回洗浄し、次いで、200μlのPBSで2回洗浄した。2.0mg/mLウシ血清アルブミンを含有するPBSに溶解した100μl/ウェルの一次抗体(ウサギ抗ヒトC3c、DAKO A0062)1:10,000希釈液を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを5回200μlのPBSで洗浄した。2.0mg/mLウシ血清アルブミンを含有するPBSに溶解した、100μl/ウェルの二次抗体(ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG, American Qualex A102PU)1:10,000希釈液を添加し、シェーカーに載せて穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルをPBSで200μlで5回洗浄した。100μl/ウェルのペルオキシダーゼ基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、室温で10分間インキュベートした。100Tl/ウェルの1.0M H3PO4を添加することによってペルオキシダーゼ反応を止め、OD450を測定した。
背景:MASP-2のセリンプロテアーゼ活性は高度に特異的であり、MASP-2のタンパク質基質はC2およびC4の2種類しか同定されていない。C4の切断によってC4aおよびC4bが生成される。MASP-2 Fab2は、C4切断に直接関与するMASP-2上の構造エピトープ(例えば、C4のMASP-2結合部位;MASP-2セリンプロテアーゼ触媒部位)に結合し、それによって、MASP-2のC4切断機能活性を阻害する可能性がある。
背景:MASP-2は、通常、特異的レクチン分子(マンノース結合タンパク質(MBL)およびフィコリン)も含むMASP-2二量体複合体として血漿中に存在する。従って、MASP-2 Fab2と生理学的に関連する形態のMASP-2との結合の研究に興味があるのであれば、精製組換えMASP-2ではなく、Fab2と血漿中の「天然」MASP-2との相互作用が用いられる結合アッセイ法を開発することが重要である。この結合アッセイ法では、最初に、10%ラット血清に由来する「天然」MASP-2-MBL複合体をマンナンコーティングウェルに固定化した。次いで、標準的なELISA法を用いて、固定化「天然」MASP-2に対する様々なMASP-2 Fab2の結合親和性を研究した。
ELISAスクリーニングのために、高親和性でラットMASP-2タンパク質と反応した約250個の異なるFab2を選んだ。異なる抗体のユニークさを決定するために、これらの高親和性Fab2を配列決定した。さらなる分析のために、50個のユニークなMASP-2抗体を精製した。それぞれの精製Fab2抗体250μgを、MASP-2結合親和性の特徴決定および補体経路の機能試験に使用した。この分析の結果を以下の表13に示した。
本実施例は、実施例11に記載のように生成された遮断抗ラットMASP-2 Fab2抗体のいくつかのエピトープマッピングについて述べる。
全てN末端6XHisタグを有する以下のタンパク質を、pED4ベクターを用いてCHO細胞において発現させた:
ラットMASP-2A、活性中心にあるセリンをアラニンに変えることによって不活性化された完全長MASP-2タンパク質(S613A);
ラットMASP-2K、自己活性化を減少させるように変えられた完全長MASP-2タンパク質(R424K);
CUBI-II、CUBIドメイン、EGF様ドメイン、およびCUBIIドメインしか含まないラットMASP-2 N末端断片;ならびに
CUBI/EGF様、CUBIドメインおよびEGF様ドメインしか含まないラットMASP-2 N末端断片。
前述した5個の組換えMASP-2ポリペプチドの段階希釈液(ならびにCCPII-セリンプロテアーゼポリペプチドの陰性対照としてチオレドキシンポリペプチド)をニトロセルロース膜上にスポットした。スポットされたタンパク質の量は5倍段階で100ng~6.4pgであった。後の実験において、スポットされたタンパク質の量は、再度、5倍段階で50ng~16pgであった。膜を、TBS(ブロッキング緩衝液)に溶解した5%スキムミルク粉末でブロッキングし、次いで、ブロッキング緩衝液(5.0mM Ca++を含有する)に溶解した1.0μg/mLの抗MASP-2 Fab2とインキュベートした。結合しているFab2を、HRP結合抗ヒトFab(AbD/Serotec;1/10,000に希釈した)およびECL検出キット(Amersham)を用いて検出した。1枚の膜を、陽性対照としてポリクローナルウサギ抗ヒトMASP-2 Ab(Stover et al., J Immunol 163:6848-59(1999)に記載)とインキュベートした。この場合、結合しているAbを、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(Dako; 1/2,000に希釈した)を用いて検出した。
ELISAプレートを、炭酸緩衝液(pH9.0)に溶解した1.0μg/ウェルの組換えMASP-2AまたはCUBI-IIポリペプチドで4℃において一晩コーティングした。ウェルを、TBSに溶解した1%BSAでブロッキングし、次いで、5.0mM Ca++を含有するTBSに溶解したMASP-2 Fab2の段階希釈液を添加した。プレートをRTで1時間インキュベートした。TBS/tween/Ca++で3回洗浄した後、TBS/Ca++で1/10,000に希釈したHRP結合抗ヒトFab(AbD/Serotec)を添加し、プレートを室温でさらに1時間インキュベートした。結合している抗体を、TMBペルオキシダーゼ基質キット(Biorad)を用いて検出した。
Fab2と様々なMASP-2ポリペプチドとの反応性を証明したドットブロット分析の結果を以下の表14に示した。表14に示した数値は、ほぼ最大半量のシグナル強度を得るのに必要とされる、スポットされたタンパク質の量を示す。示したように、(チオレドキシン融合パートナー単独を除く)全てのポリペプチドが、陽性対照Ab(ポリクローナル抗ヒトMASP-2血清、ウサギにおいて産生された)によって認識された。
本実施例は、実施例11に記載のように同定された代表的な高親和性抗MASP-2 Fab2抗体の薬力学的分析について述べる。
実施例11に記載のように、ラットレクチン経路を遮断する高親和性抗体を同定するために、ラットMASP-2タンパク質を用いてファージディスプレイライブラリーをパンニングした。このライブラリーは大きな免疫学的多様性を提供するように設計され、完全ヒトイムノグロビン(immunoglobin)遺伝子配列を用いて構築された。実施例11に示したように、ラットMASP-2タンパク質と高親和性で結合する約250個の個々のファージクローンをELISAスクリーニングによって同定した。これらのクローンの配列決定によって、50個のユニークなMASP-2抗体コードファージが同定された。これらのクローンからFab2タンパク質を発現させ、精製し、MASP-2結合親和性およびレクチン補体経路機能阻害について分析した。
実施例11に記載のように、ラットMASP-2タンパク質を用いてFabファージディスプレイライブラリーをパンニングした。これから、Fab2#11を同定した。ラットIgG2cおよびマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプ変種はFab2#11から得られた。ラットIgG2cおよびマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプを、以下の通り薬力学パラメータについてインビボで特徴決定した。
インビボでの血漿レクチン経路活性に対するMASP-2抗体投与の効果を調べるために、マウスにおいて薬力学的研究を行った。この研究では、0.3mg/kgまたは1.0mg/kgのマウスMASP-2 MoAb(Fab2#11に由来するマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプ)の皮下(sc)投与後および腹腔内(ip)投与後の様々な時点で、C4沈着をレクチン経路アッセイ法においてエクスビボで測定した。
本実施例は、ファージディスプレイを使用して、MASP-2に結合し、かつレクチン媒介性補体活性化(LEA-2)を阻害しながらも免疫系の古典(C1q依存性)経路成分をインタクトなままにしておく完全ヒトscFv抗体の同定を記載する。
ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって完全ヒト高親和性MASP-2抗体を同定した。scFvフォーマットおよび完全長IgGフォーマットの両方において抗体の可変軽鎖および重鎖断片を単離した。ヒトMASP-2抗体は、レクチン経路媒介性第二補体経路活性化に関連する細胞傷害を阻害しながらも免疫系の古典(C1q依存性)経路成分をインタクトなままにしておく場合に有用である。一部の態様において、対象MASP-2阻害抗体は、以下の特徴を有する:(a)ヒトMASP-2に関する高い親和性(例えば10nMまたはそれ未満のKD)および(b)90%ヒト血清中のMASP-2依存性補体活性化を30nMまたはそれ未満のIC50で阻害すること。
完全長の触媒的に不活性なMASP-2の発現:
リーダー配列(SEQ ID NO:5)を有するヒトMASP-2ポリペプチドをコードするヒトMASP-2の完全長cDNA配列(SEQ ID NO:4)を、CMVエンハンサー/プロモーター領域の制御下で真核性発現を駆動する哺乳動物発現ベクターpCI-Neo(Promega)中にサブクローニングした(Kaufman R. J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)に記載)。
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域配列のファージディスプレイライブラリーを抗原パンニングに供したのち、自動化抗体スクリーニングおよび選択によってヒトMASP-2タンパク質に対する高親和性scFv抗体を同定した。HIS標識またはビオチン標識MASP-2Aに対して3回のscFvファージライブラリーパンニングを実施した。3回目のパンニングは、まずMBLで溶出させ、次いでTEA(アルカリ性)で溶出させた。標的MASP-2Aに対してscFv断片を表示するファージの特異的濃縮をモニターするために、固定化MASP-2Aに対するポリクローナルファージELISAを実施した。3回目のパンニングからのscFv遺伝子をpHOG発現ベクターにクローニングし、小規模フィルタースクリーニングに通して、MASP-2Aに対する特異性クローンを捜した。
レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定する機能アッセイ法を使用して、MASP-2 scFV候補クローンの「ブロッキング活性」を評価した。レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質成分(C4b、C2a)を生成するためには、MASP-2セリンプロテアーゼ活性が必要である。したがって、MASP-2機能活性を阻害するMASP-2 scFv(すなわち、遮断性MASP-2 scFv)はレクチン経路C3コンバターゼの新規形成を阻害する。C3は、異例な高反応性チオエステル基をその構造の一部として含む。このアッセイ法においてC3コンバターゼによってC3が切断されると、C3b上のチオエステル基が、プラスチックウェルの底に固定化された高分子上のヒドロキシルまたはアミノ基とエステルまたはアミド結合による共有結合を形成し、それにより、ELISAアッセイ法におけるC3bの検出を容易にすることができる。
上記のように同定した45個の候補クローンを発現させ、精製し、同じ保存濃度まで希釈し、それを、すべてのクローンが同じ量の緩衝液を有することを保証するために、Ca++およびMg++含有GVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1%ゼラチン、pH7.4)中で再び希釈した。scFvクローンをそれぞれ2μg/mLの濃度において三つ組で試験した。陽性対照はOMS100 Fab2であり、かつ0.4μg/mLで試験した。scFv/IgGクローンの存在および非存在においてC3c形成をモニターした。
(表16A)重鎖(aa1~20)
(表16B)重鎖(aa21~40)
(表16C)重鎖(aa41~60)
(表16D)重鎖(aa61~80)
(表16E)重鎖(aa81~100)
(表16F)重鎖(aa101~118)
(表17B)軽鎖(aa21~40)
(表17C)軽鎖(aa41~60)
(表17D)軽鎖(aa61~80)
(表17E)軽鎖(aa81~100)
(表17F)軽鎖(aa101~120)
(I)(a)(i)SEQ ID NO:21の31~35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:21の50~65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:21の95~102のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む、重鎖可変領域;ならびに
(b)(i)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの24~34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの50~56のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの89~97のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、軽鎖可変領域;または(II)該重鎖可変領域の該CDR領域内の合計6つまでのアミノ酸置換および該軽鎖可変領域の該CDR領域内の合計6つまでのアミノ酸置換を除く、他の点では該可変ドメインと同一であるそれらの変異体を含み、該抗体またはその変異体がMASP-2依存性補体活性化を阻害する。
本実施例は、改変されたDT40細胞株DTLacOを使用するインビトロ系を使用する、MASP-1およびMASP-3モノクローナル抗体の生成を記載する。
WO2009029315およびUS2010093033にさらに記載されているように、特定のポリペプチドの可逆性多様化誘発を可能にする改変されたDT40細胞株DTLacOを含むインビトロ系を使用して、ヒトMASP-1およびMASP-3に対する抗体を生成した。DT40は、培養中にその重鎖および軽鎖免疫グロブリン(Ig)遺伝子を構成性突然変異させることが知られているニワトリB細胞株である。他のB細胞と同様に、この構成性突然変異誘発は、Ig遺伝子のV領域への突然変異、ひいては発現した抗体分子のCDRを標的化する。DT40細胞中の構成性突然変異誘発は、各機能的V領域よりも上流に位置する非機能的V遺伝子セグメント(疑似V遺伝子;ΨV)のアレイをドナー配列として使用する遺伝子変換によって起こる。ΨV領域の欠失は、以前、ヒトB細胞において一般に認められる機構である、多様化の機構における遺伝子転換から体細胞超変異への切替えを生じさせることが知られていた。DT40ニワトリB細胞リンパ腫系が、エクスビボでの抗体進化のための有望な出発点であることが示されている(Cumbers, S. J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005))。DT40細胞は培養中、8~10時間の倍加時間(ヒトB細胞系の場合の20~24時間に比べて)で強く増殖し、非常に効率的な相同遺伝子標的化を支援する(Buerstedde, J. M. et al. Embo J 9, 921-927 (1990))。DT40細胞は、多様化のための2つの別々の生理学的経路、それぞれ鋳型化突然変異および非鋳型化突然変異を創製する遺伝子転換および体細胞超変異にアクセスすることができることを条件に、非常に大きな潜在的V領域配列多様性を命令する(Maizels, N. Annu Rev Genet. 39, 23-46 (2005))。多様化した重鎖および軽鎖免疫グロブリン(Ig)は細胞表面表示IgMの形態で発現する。表面IgMは、構造的にIgG分子に似る二価形態を有する。特定の抗原への特異性をもってIgMを表示する細胞は、抗原の固定化可溶性バージョンまたは膜表示バージョンに結合させることによって単離することができる。しかし、抗体進化のためのDT40細胞の利用は実際には限られている。理由は、他の形質転換B細胞株と同様、多様化が生理学的速度の1%未満の速度でしか起こらないからである。
MASP-1およびMASP-3抗原結合についての選択
遺伝子標的化によって多様化させたDTLacO集団を、ヒトMASP-1(SEQ ID NO:10)およびMASP-3抗原(SEQ ID NO:8)と複合化したビーズに結合することによって最初の選択を実施し、その後、FACSにより、蛍光標識可溶性抗原を使用して選択した(Cumbers, S. J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005)。MASP-1とMASP-3との間で共有されるアルファ鎖中の保存されたアミノ酸配列(図5に示す)および別々のベータ鎖配列(図6に示す)のせいで、MASP-1およびMASP-3へのバインダのための別々の平行スクリーニングを実施して、MASP-1特異性mAb、MASP-3特異性mAbならびにMASP-1およびMASP-3の両方に結合することができる(二重特異性)mAbを同定した。2つの形態の抗原を使用して、バインダを選択し、スクリーニングした。まず、Fcドメインに融合した、完全長または断片のいずれかの組換えMASP-1またはMASP-3をDynal磁性プロテインGビーズに結合させるか、または、PECy5標識抗ヒトIgG(Fc)二次抗体を使用してFACSベースの選択に使用した。あるいはまた、MASP-1またはMASP-3タンパク質の組換えバージョンをDylight fluorで直接標識し、選択およびスクリーニングに使用した。
PCR増幅V領域を293F細胞中のヒトIgG1の発現を支持するベクターにクローニングすることによって組換え抗体を生成した(Yabuki et al., PLoS ONE, 7(4):e36032 (2012))。MASP-1またはMASP-3を様々な濃度の蛍光標識可溶性抗原と結合させる抗体を発現するDTLacO細胞を染色することによって飽和結合反応速度を測定した。MASP-3依存性C3b沈着およびMASP-3依存性D因子切断を含むMASP-3特異性活性に関する機能アッセイ法を、それぞれ実施例17および18に記載するように実施した。MASP-1特異性活性、すなわちMASP-1依存性C3b沈着の阻害に関する機能アッセイ法を以下に記載するように実施した。
上記方法を使用して、数多くのMASP-1およびMASP-3結合抗体を生成した。FACS分析によって実証された結合を、MASP-3バインダのスクリーニングにおいて単離された代表的なクローンM3J5およびM3M1に関して記載する。
図32Aは、親DTLacO(SEQ ID NO:24)、MASP-3結合クローンM3J5(SEQ ID NO:25)およびM3M1(SEQ ID NO:26)ならびにMASP-1/MASP-3二重結合クローンD14(SEQ ID NO:30)および1E10に関する重鎖可変領域(VH)配列のアミノ酸アライメントを示す。
図32Bは、親DTLacO(SEQ ID NO:27)ならびにMASP-3結合クローンM3J5(SEQ ID NO:28)およびM3M1(SEQ ID NO:29)ならびにMASP-1/MASP-3二重結合クローンD14(SEQ ID NO:31)および1E10(SEQ ID NO:33)に関する軽鎖可変領域(VL)配列のアミノ酸アライメントを示す。
MASP-1は、MASP-2を活性化するその能力を介してLEA-2に寄与する(図1を参照されたい)。Wieslab(登録商標)補体システムスクリーニングMBLアッセイ法(Euro Diagnostica, Malmo, Sweden)は、LEA-2依存活性化(すなわち、従来のレクチン経路活性化)を単離する条件下、C5b-C9沈着を測定する。製造者の取り扱い指示に従って、代表的なクローン1E10を400nMの最終濃度で試験してアッセイ法を実施した。
上記結果は、DTLacOプラットフォームが、LEA-1(以下、図17および18に示す)およびLEA-2(本実施例に示す)に対する阻害性を有するMASP-1およびMASP-3モノクローナル抗体の迅速なエクスビボ発見を可能にすることを示した。
本実施例はMASP-1およびMASP-2のポリペプチド阻害因子の生成を記載する。
それぞれSGMI-1およびSGMI-2と呼ばれる、MASP-1およびMASP-2の特異性阻害因子の生成が、いずれも参照により本明細書に組み入れられるHeja et al., J Biol Chem 287:20290(2012)およびHeja et al., PNAS 109:10498 (2012)に記載されている。SGMI-1およびSGMI-2は、いずれも、プロテアーゼ結合ループの8つの位置のうち6つが完全にランダム化されたサバクトビバッタ(Schistocerca gregaria)プロテアーゼ阻害因子2の変異体のファージライブラリーから選択された36アミノ酸ペプチドである。その後のインビトロ進化が、一桁nMのKI値の一特異性阻害因子を生じさせた(Heja et al., J. Biol. Chem. 287:20290, 2012)。構造的研究が、最適化されたプロテアーゼ結合ループが、2つの阻害因子の特異性を決定する一次結合部位を形成することを明らかにした。延長した二次および内部結合領域のアミノ酸配列は2つの阻害因子に共通であり、接触界面に寄与する(Heja et al., 2012. J. Biol. Chem. 287:20290)。機械的に、SGMI-1およびSGMI-2はいずれも、古典経路または第二経路に影響することなく補体活性化のレクチン経路を遮断する(Heja et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498)。
SGMI-IgG1 Fc融合タンパク質を発現させるために、SGMI-1(SEQ ID NO:34)およびSGMI-2(SEQ ID NO:35)ペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成し(DNA 2.0)、発現ベクターpFUSE-hIgG1-Fc2(InvivoGen)中、IL-2シグナル配列およびヒトIgG1Fc領域(SEQ ID NO:36)をコードするヌクレオチド配列の間に挿入した。フレキシブルなポリペプチドリンカー(例えば、SEQ ID NO:37またはSEQ ID NO:38)をSGMIペプチドとIgG1 Fc領域との間に含めた。
Freestyle 293-FまたはExpi293F細胞(Invitrogen)を、供給者のプロトコールに従って、2つの発現プラスミド(pFUSE-SGMI-1Fc(SEQ ID NO:39)およびpFUSE-SGMI-2Fc(SEQ ID NO:41)の1つと過渡的にトランスフェクトした。37℃で4日間のインキュベーションののち、培地を収穫した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによってFc融合タンパク質を精製した。
レクチン経路活性化の尺度である、1%血清からマンナンコーティングされた96ウェルプレートへのC3bの沈着を阻害する能力に関してSGMI-1FcおよびSGMI-2Fc融合タンパク質を試験した。SGMI-1FcおよびSGMI-2Fcを1%正常ヒト血清とともに氷上で1時間プレインキュベートしたのち、マンナンでコーティングされたウェルに加えた(2μg/ウェル)。Schwaeble et al. PNAS 108:7523, 2011に記載されているようにELISAによってC3b沈着を測定した。
黄色ブドウ球菌による3MC血清中の補体経路の分析
背景/原理:
MASP-3は、正常ヒト血清の存在または非存在において非固定化流体相マンナン、ザイモサンAまたはN-アセチルシステインへの曝露を経ても活性化されないことがわかった。しかし、組換えおよび天然のMASP-3は正常ヒト血清(NHS)または熱不活化ヒト血清(HIS)の存在および非存在において熱不活化黄色ブドウ球菌の表面で活性化されることがわかった(データ示さず)。また、正常ヒト血清の存在において黄色ブドウ球菌の表面でC3b沈着が起こり、フローサイトメーターを使用してその沈着をモニターすることができることがわかった。したがって、LEA-1に対するMASP-3の寄与を評価する手段として、本実施例に記載するように、黄色ブドウ球菌に対する第二経路(AP)応答を測定した。
組換えMASP-3:完全長組換えヒトMASP-3をコードするポリヌクレオチド配列、MASP-3の切断型セリンプロテアーゼ(SP)活性バージョン(CCP1-CCP2-SP)およびSP不活化形態のMASP-3(S679A)をpTriEx7哺乳動物発現ベクター(Invivogen)にクローニングした。得られた発現構築物は完全長MASP-3またはCCP1-CCP2-SP断片をアミノ末端Streptagおよびカルボキシ末端His6タグによってコードする。発現構築物を製造者によって提供されるプロトコールに従ってFreestyle 293-FまたはExpi293F細胞(Invitrogen)中にトランスフェクトした。5% CO2中37℃で3~4日間の培養ののち、Streptactinアフィニティークロマトグラフィーを使用して組換えタンパク質を精製した。
最初の実験は、フローサイトメトリーアッセイ法がAP駆動型C3b沈着(AP-C3b)の存在または非存在を検出することができることを実証するために、以下のように実施した。以下の血清:正常ヒト血清、B因子(B因子)枯渇ヒト血清、D因子枯渇ヒト血清およびプロパージン枯渇ヒト血清(Complement Technology, Tyler, Texas., USAから入手)の5%を、Mg++/EGTA緩衝液またはEDTA中、試験抗体と4℃で一晩混合した。加熱殺菌黄色ブドウ球菌(108個/反応)を100μLの全量まで各混合物に加え、37℃で40分間回転流動させた。細菌を洗浄緩衝液中で洗浄し、細菌ペレットを洗浄緩衝液中に再懸濁させ、細菌表面のC3b沈着に関して各サンプルの80μLアリコートを分析し、それを、フローサイトメトリーを使用して、抗ヒトC3c(Dako, UK)で検出した。
1. 5%正常ヒト血清+EDTA
2. 5%正常ヒト血清+Mg/EGTA
3. 5%ヒト3MC(MASP-3-/-)血清+Mg++/EGTA
4. 5%ヒト3MC(MASP-3-/-)血清+Mg++/EGTAに加えて活性完全長rMASP-3
5. 5%ヒト3MC(MASP-3-/-)血清+Mg++/EGTAに加えて切断型活性rMASP-3(CCP1/CCP2/SP)
6. 5%ヒト3MC(MASP-3-/-)血清+Mg++/EGTAに加えて不活性rMASP-3(S679A)
7. 5%ヒト3MC(MASP-3-/-)血清+Mg++/EGTAに加えて活性完全長rMASP-1
B因子のMASP-3依存性活性化を分析するために、5%血清(正常ヒト血清または3MC患者血清のいずれか)と組換えタンパク質との様々な混合物を上記のようにアッセイした。各反応混合物から20μLを取り出し、タンパク質試料添加緩衝液に加えた。試料を70℃で10分間加熱し、SDS-PAGEゲルに添加した。B因子ポリクローナル抗体(R&D Systems)を使用してウェスタンブロット分析を実施した。B因子の活性化は、高めの分子量のプロB因子タンパク質に由来する低めの分子量の2つの切断産物(BbおよびBa)の形成によって明らかであった。
MASP-3依存性B因子活性化/切断のための最小要件を決定するために以下のアッセイ法を実施した。
図37は、B因子切断が分析されるクマシー染色SDS-PAGEゲルを示す。レーン1に示すように、B因子切断はC3、MASP-3およびプロD因子の存在において最適である。レーン2に示すように、C3は絶対に必要であるが、レーン4および5に示すように、C3が存在する限り、MASP-3またはプロD因子はいずれもB因子切断を媒介することができる。
本実施例に記載されるように、ヒト血清中の黄色ブドウ球菌におけるAP駆動型C3b沈着にはMASP-3が必要であることが実証された。したがって、実施例15に記載されるように同定された代表的なMASP-3 mAbがMASP-3の活性を阻害することができるかどうかを判定するために以下のアッセイ法を実施した。活性組換えMASP-3(CCP1-CCP2-SP)断片タンパク質(250ng)を3つの異なる濃度(0.5、2および4μM)のアイソタイプ対照mAb、mAb1A5(MASP-3またはMASP-1に結合しないDTLacOプラットフォームから得られた対照)またはmAbD14(MASP-3に結合する)とともに氷上で1時間プレインキュベートした。酵素-mAb混合物を50μLの最終反応量で5% 3MC血清(MASP-3欠損)および5×107個の加熱殺菌黄色ブドウ球菌に曝露した。反応物を37℃で30分間インキュベートしたのち、C3b沈着の検出のために染色した。染色された細菌細胞をフローサイトメーターによって分析した。
要約すると、本実施例の結果は、MASP-3を欠損している血清中のAPの明らかな欠陥を実証する。したがって、B因子活性化およびC3b沈着を機能的終点として使用して、MASP-3がAPに対して非常に重要な寄与を成すことが実証された。さらに、MASP-3の触媒的に活性なC末端部分を含む機能的な組換えMASP-3の添加が、3MC患者からの血清中のB因子活性化およびC3b沈着における欠陥を補正する。逆に、本実施例においてさらに実証されるように、rMASP-3を有する3MC血清中のMASP-3抗体(例えばmAbD14)の添加はAP駆動型C3b沈着を阻害する。B因子活性化、ひいてはAPにおけるMASP-3の直接的な役割が、組換えMASP-3がC3とともに組換えB因子を活性化するのに十分であるという観察によって実証される。
本実施例は、MASP-1およびMASP-3がD因子を活性化することを実証する。
プロD因子の2つの異なる組換えバージョンを切断する能力に関して、組換えMASP-1およびMASP-3を試験した。第一のバージョン(プロD因子His)はN末端タグを欠くが、C末端Hisタグを有する。したがって、プロD因子のこのバージョンは、活性化中に切断によって除去される5アミノ酸プロペプチドを含む。第二のバージョン(STプロD因子His)はN末端上にStrep-TagII配列を有し、したがって、切断されるN末端断片を15アミノ酸に増加させる。STプロD因子はまた、His6タグをC末端に含む。STプロD因子Hisのプロペプチドの長さの増大が、プロD因子HIS形態で可能である分解に比較して、SDS-PAGEによる切断形態と非切断形態との分解を改善する。
図39はプロD因子基質切断のウェスタンブロット分析を示す。
実施例15に記載されたように同定された代表的なMASP-3およびMASP-1 mAbの、MASP-3依存性D因子切断に対する阻害効果を判定するために、以下のようにアッセイ法を実施した。活性組換えMASP-3タンパク質(80ng)を代表的なmAb D14、M3M1および対照抗体(MASP-1に特異的に結合するが、MASP-3には結合しない)1μgとともに室温で15分間プレインキュベートした。N末端Strepタグを有するプロD因子(ST-プロD因子-His、70ng)を加え、混合物を37℃で75分間インキュベートした。上記のように反応物を電気泳動させ、ブロッティングし、抗D因子で染色した。
本実施例は、MASP-3欠損がマンナンコーティングされたWTウサギ赤血球の補体媒介性溶解を防ぐことを実証する。
本明細書の実施例5および6に記載されるように、PNHのマウスモデルから採取された血液試料からの赤血球の溶解に対するMASP-2およびMASP-3欠損血清の効果が、PNHに罹患している対象を治療するためのMASP-2阻害および/またはMASP-3阻害の有効性を実証し、また、エクリズマブのようなC5阻害因子による治療を受けているPNH対象においてC3断片媒介性血管外溶血の効果を緩和するためのMASP-2の阻害因子および/またはMASP-3の阻害因子(二重または二重特異性MASP-2/MASP-3阻害因子を含む)の使用を裏付ける。
以下のように、3名の異なる3MC患者からMASP-3欠損血清を採取した。
3MC患者1は、MASP-3セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にする突然変異を有するアレルを含み、この3MC患者の母親および父親からも提供してもらった(両親とも、MASP-3セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にする突然変異を有するアレルに関してヘテロ接合性)。
3MC患者2は、MASP-1のエキソン12、すなわち、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンにC1489T(H497Y)突然変異を有して、非機能的MASP-3を生じさせ、機能的MASP-1タンパク質を生じさせる。
3MC患者3は、MASP-1遺伝子中に確認された欠陥を有し、非機能的MASP-3および機能的MASP-1タンパク質を生じさせる。
Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol. 11:291-295 (1981))に記載されているような従来のAP特異的条件下(BBS/Mg++/EGTA、Ca++なし、ここで、BBS=スクロースを含有するバルビタール緩衝食塩水)、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上、0.5~25%の範囲の血清濃度でAPアッセイ法を実施し、時間とともにC3b沈着を測定した。
図41は、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のAP駆動型C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損対象(3MC)、C4欠損対象およびMBL欠損対象から採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図41に示し、以下の表18にまとめているように、患者2および患者3からのMASP-3欠損患者血清が、高い濃度(25%、12.5%、6.25%血清濃度)での残留AP活性を有し、かつ有意に高いAP50(すなわち、最大C3沈着の50%を達成するために必要な血清の8.2%および12.3%)を有する。
方法:3MC患者#2(MASP-3(-/-)、MASP-1(+/+))および3MC患者#3(MASP-3(-/-)、MASP-1(-/-))から血清を採取した。患者血清を、正常なドナーからの血清(W)とともに、SDS-ポリアクリルアミドゲルによって分離し、分解したタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜上にブロッティングした。ヒトD因子特異的抗体によってヒトプロD因子(25,040Da)および/または成熟D因子(24,405Da)を検出した。
方法:3MC患者#2(MASP-3(-/-)、MASP-1(+/+))および3MC患者#3(MASP-3(-/-)、MASP-1(-/-))から採取した血清を、Wieslab補体システムスクリーン(Euro-Diagnostica, Malmo, Sweden)を製造者の取扱い指示に従って使用して、古典、レクチンおよび第二経路活性に関しても試験した。正常ヒト血清を対照として同時並行的に試験した。
方法:
Ca++の非存在における(すなわちEGTAを使用することによる)ウサギRBCの調製
ウサギ全血(2mL)を、2つの1.5mLエッペンドルフ管に分割し、4℃の冷却エッペンドルフ遠心分離機中、8000rpm(約5.9rcf)で3分間遠心処理した。氷冷BBS/Mg++/Ca++(4.4mMバルビツール酸、1.8mMナトリウムバルビトン、145mM NaCl、pH7.4、5mM Mg++、5mM Ca++)中に再懸濁させたのち、RBCペレットを3回洗浄した。3回目の洗浄後、ペレットをBBS/Mg++/Ca++4mL中に再懸濁させた。上記のように赤血球をペレット化し、RBCをBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++で洗浄した。RBC懸濁液をBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++中、4℃で貯蔵した。次いで、懸濁させたRBC100μlを水1.4mLで希釈し、8000rpm(約5.9rcf)で3分間スピンダウンし、上清のODを541nmで0.7に調節した(541nmで0.7のODは赤血球約109個/mlに相当)。その後、赤血球108個/mlの濃度を達成するために、OD 0.7で再懸濁させたRBC1mLをBBS/Mg++/EGTA 9mlに加えた。試験血清または血漿の希釈物を氷冷BBS、Mg++、EGTA中に調製し、各血清または血漿希釈物100μLを丸底プレートの対応するウェルにピペットで移した。適切に希釈したRBC 100μL(赤血球108個/ml)を各ウェルに加えた。ナノ水を使用して陽性対照(100%溶解)を製造し、血清または血漿なしのBBS/Mg++/EGTAによる希釈物を陰性対照として使用した。次いで、プレートを37℃で1時間インキュベートした。丸底プレートを3750rpmで5分間遠心処理した。次いで、各ウェルからの上清100μLを平底プレートの対応するウェルに移し、415~490nmでODを読み取った。
図43は、Ca++の非存在下で測定した、正常な対象および2名の3MC患者(患者2および患者3)からの血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、マンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血率(上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定)をグラフで示す。図43に示すように、MASP-3欠損が、正常ヒト血清に比べて、マンナンコーティングされた赤血球の補体媒介性溶解の割合を低下させることが実証される。正常ヒト血清からの2つの曲線と3MC患者からの2つの曲線との間の差は有意である(p=0.013、フリードマン試験)。
方法:
Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol. 11:291-295 (1981))に記載されているような従来のAP特異的条件下(BBS/Mg++/EGTA、Ca++なし、ここで、BBS=スクロースを含有するバルビタール緩衝食塩水)、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上、以下の血清試料中で、APアッセイ法を実施した:(1)完全長活性rMASP-3が0~20μg/mlの範囲で加えられた3MC患者#2からの5%ヒト血清;(2)完全長活性rMASP-3が0~20μg/mlの範囲で加えられた3MC患者#2からの10%ヒト血清;および(3)不活性rMASP-3A(S679A)が0~20μg/mlの範囲で加えられた3MC患者#2からの5%ヒト血清。
図44は、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のAP駆動型C3b沈着のレベルを、ヒト3MC患者#2(MASP-3欠損)から採取された血清試料に加えられるrMASP-3タンパク質の濃度の関数としてグラフで示す。図44に示すように、活性組換えMASP-3タンパク質は、ザイモサンコーティングされたプレート上にAP駆動型C3b沈着を濃度依存的に再構成する。図44にさらに示すように、不活性rMASP-3(S679A)を含有する3MC血清中ではC3b沈着は認められなかった。
方法:
ウサギRBCを使用して、実験#2で上述された方法を使用して、以下の試験血清を、0~12%の範囲で用いて溶血アッセイ法を実施した:(1)正常ヒト血清;(2)3MC患者血清;(3)3MC患者血清+活性完全長rMASP-3(20μg/ml);および(4)熱不活化ヒト血清。
図45は、Ca++の非存在において測定された、(1)正常ヒト血清;(2)3MC患者血清;(3)3MC患者血清+活性完全長rMASP-3(20μg/ml);および(4)熱不活化ヒト血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、マンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血率(上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定)をグラフで示す。図45に示すように、rMASP-3を含む3MC血清中のウサギRBCの溶解率は、rMASP-3を含まない3MC血清中の溶解率に比べて有意に増大する(p=0.0006)。
方法:
3MC血清がLEA-2を欠損しているかどうかを調べるために、マンナンコーティングされたELISAプレートを使用してC3b沈着アッセイ法を実施した。クエン酸添加血漿を、BBS緩衝液中、連続希釈度(1:80から出発して1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560)に希釈し、マンナンコーティングされたプレート上に固定した。ニワトリ抗ヒトC3bアッセイ法を使用して、沈着したC3bを検出した。マンナンコーティングされたELISAプレート上のLEA-2駆動型C3b沈着(APおよびLEA-1が働くには血漿希釈度が高すぎる)を、正常ヒト対象(NHS)、2名の3MC患者(患者2および患者3)、患者3の両親およびMBL欠損対象からの血清中のヒト血清濃度の関数として評価した。
図47は、正常ヒト対象(NHS)、2名の3MC患者(患者2および患者3)、患者3の両親およびMBL欠損対象からの血清に関して、マンナンコーティングされたELISAプレート上のLEA-2駆動型(すなわち、MASP-2駆動型)C3b沈着のレベルを、BBS緩衝液中に希釈されたヒト血清の濃度の関数としてグラフで示す。これらのデータは患者2がMBL充分であることを示す。しかし、患者3および患者3の母親はMBL欠損であり、したがって、この人たちの血清はLEA-2を介してC3bをマンナン上に沈着させない。これらの血清中のMBLの置換は、患者3(MASP-3欠損を生じさせるSNPに関してホモ接合性である)およびその母親(突然変異MASP-3アレルに関してヘテロ接合性である)の血清中のLEA-2媒介性C3b沈着を回復させる(データ示さず)。この発見は、3MC血清がLEA-2を欠損しているのではなく、むしろ、機能的MASP-2を有すると考えられることを実証する。
これらの結果は、ザイモサンコーティングされたウェル上のC3b沈着の減少およびウサギ赤血球溶解の減少によって証明されるように、ヒト血清中のMASP-3欠損がAP活性の損失を生じさせることを実証する。機能的組換えヒトMASP-3で血清を補充することにより、両アッセイ法においてAPを回復させることができる。
本実施例は、マウス黄斑変性症モデルにおけるMASP-2-/-の結果を記載する。
実施例1に記載したようにMASP-2-/-マウスを作製し、C57Bl/6とで10世代にわたり戻し交配させた。最新の研究は、レーザー誘発CNV、新生血管形成性AMDの促進モデル、の過程において、レーザー誘発CNVの体積を重視しながら、レーザー損傷後のELISAによる組織損傷および網膜色素上皮細胞(RPE)/脈絡膜中のVEGF、CNVにおける関連が示唆される強力な血管形成因子、のレベル測定の手段として走査型共焦点レーザー顕微鏡法によってMASP-2(-/-)およびMASP-2(+/+)雄マウスを評価した場合の結果を比較した。
VEGFレベルの評価:
図48Aは、0日目にC57Bl6野生型およびMASP-2(-/-)マウスから単離されたRPE-脈絡膜複合体中のVEGFタンパク質レベルをグラフで示す。図48Aに示すように、VEGFレベルの評価は、C57bl/6野生型対照マウスに対し、MASP-2(-/-)マウスにおけるVEGFのベースラインレベルの低下を示す。図48Bは、レーザー誘発損傷ののち3日目に測定されたVEGFタンパク質レベルをグラフで示す。図48Bに示すように、レーザー誘発損傷ののち3日で、VEGFレベルは野生型(+/+)マウスにおいて有意に増加し、公表されている研究(Nozaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:2328-33 (2006))と合致していた。しかし、驚くことに、MASP-2(-/-)マウスにおいて非常に低いレベルのVEGFが見られた。
レーザー誘発黄斑変性症後のVEGFレベルの低下に加えて、レーザー損傷の前後でCNV面積を測定した。図49は、レーザー誘発損傷ののち7日目でのC57bl/6野生型マウスおよびMASP-2(-/-)マウスにおいて測定したCNV体積を示す。図49に示すように、MASP-2(-/-)マウスは、レーザー誘発損傷ののち7日目に、野生型対照マウスに比べて、CNV面積の約30%の減少を示した。
本実施例は、加齢黄斑変性症のマウスモデルにおける有効性に関するFab2#11由来のMASP-2 Moabの分析を記載する。
実施例11および12に記載したように、ラットMASP-2タンパク質を利用してFabファージディスプレイライブラリーをパンニングし、そこからFab2#11を機能的に活性な抗体として同定した。ラットIgG2cおよびマウスIgG2aアイソタイプの完全長抗体をFab2#11から作製した。実施例13に記載したように、マウスIgG2aアイソタイプの完全長MASP-2抗体を薬力学的パラメータに関して特性決定した。本実施例においては、Bora P.S.ら、J Immunol 174:491-497 (2005)によって記載されているように、Fab2#11由来のマウスMASP-2完全長抗体を加齢黄斑変性症(AMD)のマウスモデルにおいて分析した。
実施例13に記載したFab2#11由来のマウスIgG2a完全長MASP-2抗体アイソタイプを、実施例20に記載したように、ただし以下の変更を加えて、加齢黄斑変性症(AMD)のマウスモデルにおいて試験した。
CNV誘発の16時間前、2つの異なる用量(0.3mg/kgおよび1.0mg/kg)のマウスMASP-2 MoAbを、アイソタイプ対照MoAb治療とともに、WT(+/+)マウス(1群あたりn=8)に腹腔内注射した。
実施例20に記載したように、レーザー光凝固を使用して、脈絡膜新生血管(CNV)の誘発およびCNVの体積測定を実施した。
図50は、アイソタイプ対照MoAbまたはマウスMASP-2 MoAb(0.3mg/kgまたは1.0mg/kg)のいずれかで処置されたマウスにおける、レーザー損傷ののち7日目に測定されたCNV面積をグラフで示す。図50に示すように、1.0mg/kg MASP-2 MoAbで前処置されたマウスにおいて、レーザー処置後7日目でCNVにおける統計的に有意な(p<0.01)約50%の減少が認められた。図50にさらに示すように、0.3mg/kg用量のMASP-2 MoAbはCNVを減少させる有効性を有しないことが認められた。実施例13に記載し、図29Aに示すように、0.3mg/kg用量のMASP-2 MoAbは、皮下投与ののち、C4b沈着の部分的および一過性の阻害を有することが示されたことが注目される。
本実施例は、マウス心筋虚血/再灌流モデルにおけるMASP-2(-/-)マウスの分析を記載する。
マンノース結合レクチン(MBL)は、広い範囲の糖質構造に応答して、免疫複合体非依存的に補体活性化を開始させる循環分子である。これらの構造は、特に壊死、腫脹またはアポトーシス細胞内の感染作用物質または改変された内因性糖質残基の成分であることができる。これらの形態の細胞死は、補体の活性化が、おそらくは、再灌流によって虚血が終わる瞬間に存在する境界を超えるまで損傷を拡張させる再灌流心筋中で起こる。補体活性化が心筋再灌流を悪化させるという有力な証拠があるが、そのような活性化の機序は十分には理解されておらず、すべての既知の経路の阻害は、耐容し得ない副作用を及ぼす可能性が高い。最近の研究は、活性化が、古典経路または第二増幅ループ(本発明において定義する)ではなくMBLを含み得ることを示唆している。理由は、梗塞がMBL(A/C)ヌルマウスにおいて減少したが、C1qヌルマウスにおいては減少しなかったからである(Walsh M. C. et al., Jour of Immunol. 175:541-546 (2005))。しかし、有望であるが、これらのマウスは、レクチン経路を介して補体を活性化することができる、フィコリンAのような循環成分をなおも保有する。
以前に記載されているようなハンギングウエイトシステム(Eckle et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 291:H2533-H2540, 2006)を使用して冠動脈閉塞を達成した。単糸結紮の両端を長さ2mmのポリエチレンPE-10管に通し、シアノアクリレート接着剤を使用して5-0縫合糸に取り付けた。次いで、縫合糸を、水平に取り付けた2本の可動金属ロッドにわたし、各1gの塊を縫合糸の両端に取り付けた。ロッドの上昇により、塊は吊り下げられ、縫合糸は制御された張力下に配されて、LADを規定かつ一定の圧で閉塞させた。LAD閉塞は、虚血域が青ざめ、LAD灌流ゾーンの色が明るい赤色から紫色に変わり、血流の停止を示すことによって立証された。塊が手術パッドに載り、結紮糸の張りが解放されるまでロッドを下げることにより、再灌流を達成した。閉塞を立証するために使用された同じ3つの基準によって再灌流を立証した。それぞれ冠動脈閉塞の開始時または再灌流から15分以内に3つ基準すべてが満たされないならば、マウスをさらなる分析から除外した。冠動脈閉塞中、心臓を小胸筋のフラップで覆い、開胸部を0.9%食塩水含浸ガーゼで封止することによって心臓表面の温度および湿度を維持した。
梗塞サイズ(INF)および虚血域(AAR)をプラノメトリーによって測定した。500 I.U.ヘパリンを静脈内注射したのち、LADを再び閉塞させ、5%(w/vol)エバンスブルー(Sigma-Aldrich, Poole, UK)300μlをゆっくりと頚静脈に注射して虚血域(AAR)を画定した。この戦略は、色素を左心室の非虚血領域に入らせ、虚血AARを未染色のままにする。頚椎脱臼によってマウスを安楽死させたのち、心臓を速やかに摘出した。心臓を氷冷し、5%アガロースのブロックに取り付けたのち、厚さ800μmの8枚の横方向スライスに切断した。すべてのスライスを、pH7.4に調節された0.1M Na2HPO4/NaH2PO4緩衝液中に溶解した3% 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(SigmaAldrich, Poole, UK)とともに、37℃で20分間インキュベートした。スライスを10%ホルムアルデヒド中で一晩固定した。スライスを2枚のカバーガラスの間に配置し、高解像度光学スキャナーを使用して各スライスの側面をデジタル的に画像処置した。次いで、デジタル画像をSigmaScanソフトウェア(SPSS, US)の使用によって解析した。梗塞領域(淡色)、左心室(LV)虚血域(赤)および正常に灌流されたLVゾーン(青)のサイズを、それらの色の外観および色の境界の識別により、各切片中に輪郭で表した。研究者が各スライスの両側で面積を数値化し、平均した。梗塞サイズを各マウスの虚血域の%として算出した。
本実施例は、マウス心筋虚血/再灌流モデルにおけるMASP-2(-/-)マウスの分析を記載する。
冠動脈に対する虚血侵襲後の炎症性再灌流傷害へのMASP-2の寄与を評価するために、Marberら、J. Clin Invest. 95:1446-1456 (1995)によって記載されているマウス虚血/再灌流(MIRP)モデルおよびランゲンドルフ単離灌流マウス心臓モデルにおいてMASP-2(-/-)およびMASP-2(+/+)マウスを比較した。
実施例1に記載したように、この実験に使用されるMASP-2(-/-)マウスを作製した。実施例22に記載された方法を使用して、WT(MASP-2(+/+)マウス8匹およびMASP-2(-/-)マウス11匹において左心室に対する虚血侵襲を実施した。実施例22に記載したように、プラノメトリーによって梗塞サイズ(INF)および虚血域(AAR)を測定した。
逆行性灌流を開始したのち、心臓を30分間安定化させた。評価に含めるためには、すべての心臓は以下の基準を満たさなければならなかった:冠動脈血流1.5~4.5mL/分、心拍数>300bpm(非調律)、左心室発生圧>55mmHg、開胸術から大動脈カニューレ挿入までの時間<3分および安定化中に持続性律動異常の非存在。次いで、血清の非存在において全虚血および再灌流を実施した。次いで、大動脈流入管をクランプで締めることによってすべての心臓を30分間の全虚血に供したのち、2時間の再灌流を実施した。
梗塞区域(淡色)、左心室(LV)虚血域(赤)および正常に灌流されたLVゾーン(青)のサイズを、それらの色の外観および色の境界の識別により、各切片中に輪郭で表した。研究者が各スライスの両側で面積を数値化し、平均した。梗塞サイズを各マウスの虚血域の%(RZ%)として算出した。
本実施例は、補体C3の、新規なレクチン経路媒介性およびMASP-2依存性C4バイパス活性化の発見を記載する。
補体活性化の阻害因子を利用して心筋虚血/再灌流障害(MIRI)を抑制する主要な治療上の有益性は20年前に心筋梗塞の実験的ラットモデルにおいて確信的に実証されている。MIRIのラットインビボモデルにおいて、細胞表面補体受容体1型(CR1)の可溶性切断型誘導体である組換えsCR1が静脈内に投与され、その効果が評価されている。sCR1による治療は梗塞体積を40%超も減少させた(Weisman, H.F., et al., Science 249:146-151 (1990))。この組換え体阻害因子の治療能力は、のちに、MI患者におけるsCR1の投与が虚血後心臓における収縮障害を防ぐことを示す臨床試験において実証された(Shandelya, S., et al., Circulation 87:536-546 (1993))。しかし、虚血組織中の補体の活性化をもたらす主要な機序は、主として適切な実験モデルの欠如、酸素欠乏細胞上での補体活性化を招く分子プロセスの限られた理解ならびに異なる補体活性化経路間のクロストークおよび相乗作用のせいで、最終的には確定されていない。
MASP-2欠損マウスは肉眼的異常を示さない。実施例1に記載のとおりにMASP-2欠損マウスを作製した。ヘテロ接合性(+/-)およびホモ接合性(-/-)両方のMASP-2欠損マウスは健康かつ繁殖可能であり、肉眼的異常を示さない。それらの期待寿命はWT同腹仔の期待寿命と同程度である(>18ヶ月)。疾患の実験モデルにおいてこれらのマウスの表現型を研究する前に、本発明者らのMASP-2(-/-)系統をC57BL/6バックグラウンドと11世代にわたり戻し交配させた。MASP-2 mRNAの完全な非存在がポリA+選択肝RNA試料のノーザンブロッティングによって確認されたが、一方、MAp19またはsMAP(MASP2遺伝子の切断型選択的スプライシング産物)をコードする1.2kb mRNAは豊富に発現する。
MASP-2はレクチン経路機能活性に不可欠である
本明細書および米国特許第7,919,094号に記載されているように、MASP-2-/-血漿のインビトロ分析は、C4およびC3両方の活性化のためにマンナンコーティングされた面およびザイモサンコーティングされた面を活性化する場合のレクチン経路機能活性の完全な非存在を示した。同様に、MBL A、MBL CおよびフィコリンAを介して結合し、活性化を誘発するN-アセチルグルコサミンコーティングされた表面上のMASP-2(-/-)血漿中でレクチン経路依存性のC4またはC3の切断はいずれも検出されなかった(データ示さず)。
実施例23に記載したように、MIRIへのレクチン経路機能活性の寄与を研究するために、本発明者らは、冠動脈の左前下行枝(LAD)の一過性結紮および再灌流後のMIRIモデルにおいてMASP-2(-/-)マウスとWT同腹仔対照とを比較した。実施例23に記載された結果は、MASP-2欠損マウスが、レクチン経路充分な同腹仔に比べて有意に減少した梗塞サイズ(p<0.01)で、有意な程度の保護を示すことを明らかに実証する。
C4欠損モルモット血清中のC4バイパス活性化ルートの存在を示す学史的に有名な報告(May, J.E., and M. Frank, J. Immunol. 111:1671-1677 (1973))によって励まされて、本発明者らは、C4欠損マウスが残留古典またはレクチン経路機能活性を有し得るかどうかを分析し、第二経路の寄与を排除する経路特異的アッセイ条件下、C3の活性化をモニターした。
本実施例に記載された結果は、MASP-2機能活性が、C4の存在および非存在の両方において、レクチン経路を介するC3の活性化に不可欠であることを強く示唆する。さらには、この新規なC3のレクチン経路特異的C4バイパス活性化ルートが作動するためにはC2およびMASP-1が必要である。MASP-2(-/-)およびC4(-/-)血漿中のレクチン経路機能活性の比較分析は、これまで認識されていなかったC4非依存性であるが、MASP-2依存性の補体C3活性化ルートの存在を明らかにし、C4の完全な非存在においてC3がレクチン経路依存モードで活性化されることができることを示した。この新規なMASP-2依存性C3コンバターゼの詳細な分子組成および活性化事象の順序はまだ解明されていないが、本発明者らの結果は、このC4バイパス活性化ルートがMASP-1だけでなく補体C2の存在をさらに必要とすることを暗示する。C4欠損およびMASP-1/3欠損を合わせもつマウスの血漿中のレクチン経路媒介性C3切断活性の損失は、ごく最近記載された、MASP-2の直接切断および活性化によってMASP-2依存性補体活性化を増強するためのMASP-1の役割によって説明され得る(Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008))。同様に、MASP-1は、C2を切断するその能力を通してMASP-2機能活性を支援し得る(Moller-Kristensen, et al., Int. Immunol. 19:141-149 (2007))。両活性は、MASP-1/3欠損血漿がレクチン活性化経路を介してC3を切断する場合の速度の低下およびC4バイパス活性化ルートを介するC3転換を維持するためにMASP-1が必要とされ得る理由を説明し得る。
本実施例は、MASP-2機能活性の非存在が胃腸虚血/再灌流障害(GIRI)からの有意な程度の保護を生じさせることを実証する。
本発明者らは、確立されたマウスモデルを使用してGIRIにおけるMASP-2の役割を調査した(Zhang, M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3886-3891 (2004); Zhang, M. et al. J. Exp. Med. 203, 141-152 (2006))。
実施例1に記載したとおりにMASP-2欠損マウスを作製した。上腸間膜動脈を外科的に40分間クランプで締めたのち3時間再灌流することにより、MASP-2(-/-)マウスおよびWT同腹仔対照を急性腸虚血に供した。以前に記載されているように(Zhang, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:3886-3891 (2004))GIRIの外科的プロトコールを実施した。麻酔ののち、開腹術を実施し、外科マイクロクリップを上腸間膜動脈(SMA)に適用した。40分間の虚血ののち、マイクロクリップを取り外し、虚血組織を3時間再灌流させた。偽対照には、SMAをクランプで締めることなく開腹術を施した。再灌流後、マウスを屠殺し、遠位空腸の対応区分を収穫した。
図57Aは、MASP-2(-/-)マウスが、腸間膜動脈の一過性(40分)閉塞および虚血腸組織の再灌流(3時間)ののち、重篤なGIRI損傷からの有意な程度の保護を示すことをグラフで示す(スチューデント検定による判定で*p<0.05)。図57Aに示すように、MASP-2(-/-)マウスは、WT同腹仔と比較してI/R組織損傷の有意な減少を示した(MASP-2(-/-)I/R群の病態スコア:4±1、n=6、MASP-2(+/+)I/R群の病態スコア:11±3、n=7、P<0.05)。
多くの最近の報告が、酸素欠乏細胞上で補体活性化を招く機序および経路を解明しようとした。補体依存性GIRIにおけるIgM抗体の関与は十分に立証されている(Zhang, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101I3886-3891 (2004); Zhang, M., et al., J. Exp. Med. 203:141-152 (2006))。IgMは古典経路の強力なアクチベーターであるため、古典経路を欠くマウス(例えばC1qa(-/-)マウス)は補体依存性GIRIおよびMIRIから保護されると仮定された(実施例24に記載)。驚くべきことに、最近の2つの研究は、C1qa(-/-)マウスがGIRIまたはMIRIのいずれにおいても保護されないが、一方、レクチン経路認識分子MBL AおよびMBL Cを欠くマウスがGIRIおよびMIRIの両方の有意な軽減を示すことを実証した(Hart, M.L., et al., J. Immunol. 174:6373-6380 (2005); Walsh, M.C. et al. J. Immunol. 175:541-546 (2005))。これらの発見は、IgM依存性補体活性化の決定的な炎症誘発性寄与が、古典経路活性の非存在において、自己反応性IgMとMBLとの間の直接的相互作用を介するレクチン活性化経路を用いて起こることを特定した2つの後のGIRI研究において確認された(Zhang, M., et al., J. Immunol. 177:4727-4734 (2006); McMullen, M.E., et al., Immunobiology 211:759-766 (2006))。対照的に、同じMBLヌル系統(すなわち、MBLヌルマウスはフィコリンAを通して残留レクチン経路機能活性を保持する)を腎臓IRIモデルにおいて試験すると、組織損傷からの中程度の保護しか示されなかった(Moller-Kristensen, M., et al., Scand. J. Immunol. 61:426-434 (2005))。
本実施例は、MASP-2(-/-)マウスモデルにおけるMASP-2機能活性の非存在が脳虚血/再灌流障害(卒中)からの有意な程度の保護を生じさせることを実証する。
三血管閉塞(3VO)手術:
Yanamotoら、Exp Neurology 182(2):261-274 (2003)に記載されているように、三血管閉塞(3VO)卒中モデルによって一過性虚血を誘発した。簡潔に説明すると、手術前、術後の痛みを最小限にするために、8~18週齢の雌C57/B16マウスにVetergesic(鎮痛剤)を投与した。マウスを3%~4%イソフルオランおよびO2/N2Oで麻酔したのち、維持麻酔のためにイソフルオランを0.5~1.5%に減少させた。頚部の腹側正中切開によって2つ総頚動脈(CCA)を露出させたのち、動脈瘤クリップで左CCAを留めた。これは、同側の中大脳動脈(MCA)を焼灼する処置中の出血を減少させる。左CCAのクリップ留めののち、左頬骨弓を除去して頭蓋骨および中大脳動脈へのアクセスを可能にした。厚さ1mmの穿頭孔を開けてMCAへのアクセスを可能にしたのち、バイポーラコアギュレーター(Aura, Kirwan Surgical Products)を使用して永久的焼灼を実施した。MCA閉塞後、右CCAのクリップ留めによって30分間の虚血を誘発した。虚血期間中に頭部の創傷を閉じた。虚血の終了後、両クリップを取り外して24時間の再灌流を可能にし、その後、頚椎脱臼によってマウスを殺処分した。
24時間の再灌流後、頸椎脱臼によってマウスを屠殺し、その脳を取り出し、予冷した脳マトリックスを使用して厚さ1mmにスライスした。虚血後の梗塞体積を、Bederson, J.B. et al., Stroke 17:1304-1308 (1986)およびLin T.N. et al, Stroke 24:117-121 (1993)に記載されている、ミトコンドリア活性の代謝細胞指示薬である2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)を使用する信頼性の高い方法によって測定した。このアッセイ法においては、脳切片中の赤い着色(白黒写真では暗い区域に見える)が正常な非梗塞組織を示し、一方、無着色の白い区域が梗塞組織を示す(Bederson et al., 1986)。脳を切り出したのち、スライスを室温の食塩水中2%TTCによって暗所で30分間染色した。その後、切片を10%ホルマリン中に固定し、4℃の暗所で貯蔵した。デジタル画像を撮影し、Scion Imageソフトウェアで解析して梗塞体積を算出した。浮腫による梗塞面積の過大評価を避けるため、梗塞体積は以下のように算出した。
梗塞体積=梗塞面積/(同側面積/対側面積)×1mm(スライスの厚さ)
図58は、30分の虚血および24時間の再灌流後の、WTおよびMASP-2(-/-)マウスにおける脳梗塞体積をグラフで示す。図58に示すように、3-VO後の梗塞体積は、WT(MASP-2(+/+)マウスに比べてMASP-2(-/-)マウスにおいて有意に減少している(p=0.0001)。
本実施例は、マウスモノクローナル抗体誘発関節リウマチモデルにおけるMASP-2(-/-)の結果を記載する。
動物:実施例1に記載したようにMASP-2(-/-)マウスを作製し、C57Bl/6と10世代にわたり戻し交配させた。抗体注射時に7~8週齢であった雄雌C57BL/6野生型マウス14匹ならびに抗体注射時に7~8週齢であった雄雌MASP-2(-/-)およびWT(+/+)C57Bl/6マウス10匹をこの実験に使用した。マウス20匹にモノクローナル抗体カクテルを注射して20匹の確実な応答動物を得た(10匹ずつ2群)。マウス(10/群)を5匹/ケージで収容し、実験を開始する前5~7日間、順化させた。
群1(対照):C57/BL/6WT(+/+)系統のマウス4匹、
群2(試験):C57/BL/6WT(+/+)系統のマウス10匹(Col2 MoAb+LPSを投与)、および
群3(試験):C57/BL/MASP-2KO/6Ai(-/-)系統のマウス10匹(Col2 MoAb mAb+LPSを投与)。
図60は、毎日の平均臨床関節炎スコアを2週間プロットした群データを示す。CoL2 MoAb処置を受けなかった対照群において臨床関節炎スコアは見られなかった。MASP(-/-)マウスは、9~14日目に低めの臨床関節炎スコアを示した。曲線下面積分析(AUC)による全臨床関節炎スコアは、WT(+/+)マウスに対してMASP-2(-/-)群における21%の減少を示した。しかし、C57Bl6マウスバックグラウンドは、先に述べたように、強固な全関節炎臨床スコアを提供しなかった。低い発生率および群サイズのせいで、肯定的な傾向を示しながらも、データは傾向(p=0.1)しか提供せず、p<0.05レベルでは統計的に有意ではなかった。統計的有意性を示すためには処置群にさらなるマウスが必要であると考えられる。関節炎の発生率の低下のせいで、重篤度に関しては患部足スコアを評価した。3よりも高い臨床関節炎スコアの発生は、MASP-2(-/-)マウスのいずれにも見られなかったが、WT(+/+)マウスの30%に見られ、(1)関節炎の重篤度が補体経路活性化に関連し得ること、および(2)MASP-2の遮断が関節炎において有益な効果を有し得ることをさらに示唆した。
本実施例は、喘息モデルとして、レクチン経路媒介性C3活性化の強力なアクチベーターとしての純チリダニアレルゲンの使用を実証する。
チリダニ(HDM)誘発性アレルギー性喘息の十分に特性決定されたマウスモデルが開発されている。参照により本明細書に組み入れられる、X. Zhang et al., J. of Immunol. 182:5123-5130 (2009)を参照されたい。Zhang et al. (2009)に記載されているように、このモデルは、マウスを、3週にわたり週1度、気管内HDMに曝露することを含む。気管内HDM投与は、WT BALB/cマウスにおける気道応答性、BAL液中の総細胞数および好酸球数ならびに血清総IgEおよびアレルゲン特異性IgEレベルを有意に上昇させる。このモデルは、喘息の治療としてのMASP-2 mabの使用を評価するために使用することができる。
WTマウスから採取された血清試料を用いてC3沈着アッセイ法を実施した。C3活性化を測定するために、マイクロタイタープレートをマンナン(1μg/ウェル)でコーティングしたのち、TBS/Tween/Ca2+中ヒツジ抗HSA血清(2μg/ml)でコーティングした。プレートをTBS中0.1% HSAでブロッキングし、上記のように洗浄した。血漿試料を、4mMバルビタール、145mM NaCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.4中に希釈し、プレートに加え、37℃で1.5時間インキュベートした。洗浄後、ウサギ抗ヒトC3c(Dako)、次いでアルカリホスファターゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギIgGおよびpNPPを使用して結合C3bを検出した。
図61は、チリダニまたはザイモサンの存在における、WTマウスから採取された血清試料中のC3沈着アッセイ法の結果をグラフで示す。図61に示すように、チリダニアレルゲンは、ザイモサンとほぼ同じレベルでC3を活性化する、レクチン経路媒介性C3活性化の強力なアクチベーターである。これらの結果は、チリダニアレルゲンがレクチン経路を刺激することができることを示す。MASP-2抗体が第二補体経路の活性化を遮断するということが示された事実を考慮すると、MASP-2抗体は、チリダニアレルゲン感作個体による喘息の治療において治療物質として有効であると予想される。
本実施例は、トロンビン活性化が、生理学的条件下、レクチン経路活性化ののちに起こることができることを実証し、MASP-2関与の程度を実証する。正常ラット血清中、レクチン経路の活性化は、補体活性化(C4沈着として評価)と同時並行的なトロンビン活性化(トロンビン沈着として評価)を招く。図62Aおよび62Bに見てとれるように、この系におけるトロンビン活性化は、MASP-2遮断抗体H1(Fab2フォーマット)によって阻害され、補体活性化の場合のそれ(図62A)に匹敵する阻害濃度応答曲線(図62B)を示す。これらのデータは、外傷において起こるようなレクチン経路の活性化が、MASP-2に完全に依存するプロセスにおいて補体系および凝固系の両方の活性化を招くことを示唆する。推論により、MASP-2阻害抗体は、大きな外傷の症例において死亡につながる顕著な特徴の1つである過度な全身性凝固、例えば播種性血管内凝固の症例を緩和する有効性があることを証明し得る。
本実施例は、播種性血管内凝固(「DIC」)におけるレクチン経路の役割を評価するために、MASP-2(-/-)およびWT(+/+)マウスにおけるDICの限局性シュワルツマン反応モデルを使用して生成された結果を提供する。
上述したように、MASP-2の遮断は、レクチン経路活性化を阻害し、両アナフィラトキシンC3aおよびC5a両方の生成を減少させる。C3aアナフィラトキシンは、インビトロで強力な血小板凝集因子であることが示されることができるが、インビボにおけるそれらの関与はそれほど十分には確定されておらず、創傷修復における血小板物質およびプラスミンの放出が二次的に補体C3を関与させるだけかもしれない。この例においては、播種性血管内凝固を生じさせるためにC3活性化の長期的上昇が必要であるかどうかを検討するために、MASP-2(-/-)およびWT(+/+)マウスにおいてレクチン経路の役割を分析した。
実施例1に記載したように、この実験に使用されるMASP-2(-/-)マウスを作製した。限局性シュワルツマン反応(LSR)モデルをこの実験に使用した。LSRは、リポ多糖(LPS)誘発応答であり、先天免疫系の細胞性および体液性要素からの十分に特性決定された寄与を示す。補体へのLSRの依存は十分に立証されている(Polak, L., et al., Nature 223:738-739 (1969); Fong J.S. et al., J Exp Med 134:642-655 (1971))。LSRモデルにおいて、マウスをTNFアルファ(500ng、陰嚢内)で4時間プライミングしたのち、マウスを麻酔し、精巣挙筋の生体内顕微鏡検査のために準備した。良好な血流量(1~4mm/s)を示す後毛細血管細静脈(直径15~60μm)のネットワークを観察に選択した。マウスを蛍光抗体で処置して、好中球または血小板を選択的に標識した。血管のネットワークを順次にスキャンし、すべての血管の画像を後の分析のためにデジタル的に記録した。微小循環の基底状態を記録したのち、LPS(100μg)を、単独で、または以下に記載する作用物質のいずれかとともに、マウスに単回静脈内注射した。次いで、同じ血管ネットワークを1時間にわたり10分ごとにスキャンした。バックグラウンド蛍光の減法によって蛍光体の特異的蓄積を識別し、画像を閾値化することによって強調した。記録された画像から反応の大きさを測定した。LSRの主な測度は凝集塊データであった。
本実施例は、WT(+/+)、MASP-2(-/-)、F11(-/-)、F11/C4(-/-)およびC4(-/-)マウスにおけるトロンビン基質によるC3の活性化およびマンナンへのC3沈着を記載する。
実施例29に記載したように、トロンビン活性化は、生理学的条件下、レクチン経路活性化ののちに起こることができ、MASP-2関与の程度を示すと判断された。C3は、補体系の活性化において中心的役割を果たす。C3活性化は古典補体活性経路および第二補体活性化経路の両方に求められる。C3がトロンビン基質によって活性化されるかどうかを決定するための実験を実施した。
トロンビン基質によるC3活性化
以下の活性化形態のトロンビン基質:ヒトFXIa、ヒトFVIIa、ウシFXa、ヒトFXa、ヒト活性化プロテインCおよびヒトトロンビンの存在においてC3の活性化を測定した。C3を様々なトロンビン基質ともにインキュベートしたのち、10% SDS-ポリアクリルアミドゲル上、還元条件下で分離した。セルロース膜を使用する電気泳動的転写ののち、膜を、モノクロナールビオチン結合ラット抗マウスC3とともにインキュベートし、ストレプトアビジン-HRPキットによって検出し、ECL試薬を使用して現像した。
C3の活性化は、インタクトなa鎖を切断型a'鎖および可溶性C3aへと切断することを含む。図64は、トロンビン基質によるヒトC3の活性化に関するウェスタンブロット分析の結果を示し、非切断C3アルファ鎖および活性化産物a'鎖が矢印によって示されている。図64に示すように、活性化形態のヒト凝固因子XIおよび因子Xならびに活性化ウシ凝固因子XとのC3のインキュベーションは、任意の補体プロテアーゼの非存在においてもインビトロでC3を切断することができる。
WT、MASP-2(-/-)、F11(-/-)、F11(-/-)/C4(-/-)およびC4(-/-)から採取された血清試料に対してC3沈着アッセイ法を実施した。F11は、凝固因子XIをコードする遺伝子である。C3活性化を測定するために、マイクロタイタープレートをマンナン(1μg/ウェル)でコーティングしたのち、TBS/Tween/Ca2+中ヒツジ抗HSA血清(2μg/ml)でコーティングした。プレートをTBS中0.1% HSAでブロッキングし、上記のように洗浄した。血漿試料を、4mMバルビタール、145mM NaCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.4中に希釈し、プレートに加え、37℃で1.5時間インキュベートした。洗浄後、ウサギ抗ヒトC3c(Dako)、次いでアルカリホスファターゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギIgGおよびpNPPを使用して結合C3bを検出した。
図65は、WT、MASP-2(-/-)、F11(-/-)、F11(-/-)/C4(-/-)およびC4(-/-)から採取された血清試料におけるC3沈着アッセイ法の結果を示す。図65に示すように、C4の完全な非存在においてさえ機能的レクチン経路がある。図65にさらに示すように、この新規なレクチン経路依存性補体活性化は凝固因子XIを要する。
この実験において得られた結果以前は、補体のレクチン経路は活性のためにC4を必要とすると当業者によって考えられていた。したがって、C4ノックアウトマウス(およびC4欠損ヒト)からのデータは、それらの生物がレクチン経路を欠く(古典経路欠損に加えて)という仮定をもって解釈されていた。本結果は、この概念が誤りであることを実証する。したがって、C4欠損動物の表現型に基づいて特定の疾患状況においてレクチン経路が重要ではないと示唆した過去の研究の結論は誤りといえる。実施例24に記載したように、本発明者らは、MASP-2ノックアウトマウスは保護されたが、一方、C4ノックアウトマウスは保護されなかった心筋梗塞モデルに関してこれを実証した。
この研究は、LPS(リポ多糖)誘発性血栓症のマウスモデルにおけるMASP-2欠損の効果を研究する。
志賀毒素産生性大腸菌感染によって生じる溶血性尿毒症症候群(HUS)は子供における急性腎不全の主要原因である。本実施例においては、MASP-2阻害が血管内血栓の形成を阻害または防止するのに有効であるかどうかを決定するために、MASP-2(-/-)マウスにおいてLPS誘発性血栓症(微小血管凝固)のシュワルツマンモデルを実施した。
LPS誘発性血栓症(微小血管凝固)のシュワルツマンモデルにおいてMASP-2(-/-)(n=9)およびWT(n=10)マウスを分析した。マウスにセラチアLPSを投与し、血栓形成を経時的にモニターした。微小血栓およびLPS誘発性微小血管凝固の発生率の比較を実施した。
注目すべきことに、試験したすべてのMASP-2-/-マウス(9/9)がセラチアLPS投与後に血管内血栓を形成しなかった。対照的に、同時並行的に試験されたWTマウス10匹のうち7匹において微小血栓が検出された(p=0.0031、フィッシャーの直接確率検定)。図66に示すように、LPS感染後、微小血管閉塞の発症までの時間をMASP-2(-/-)およびWTマウスにおいて測定し、60分間の測定で血栓形成を示したWTマウスの割合を示し、血栓形成は早くも約15分で検出された。WTマウスの80%までが60分で血栓形成を実証した。対照的に、図66に示すように、MASP-2(-/-)のいずれも60分では血栓形成を示さなかった(ログランク:p=0.0005)。
本実施例は、精製志賀毒素2+LPSの同時腹腔内注射を使用して、HUSのマウスモデルにおけるMASP-2抗体の効果を記載する。
精製志賀毒素2(STX2)+LPSの同時腹腔内注射を使用して、HUSのマウスモデルを発症させた。マウス腎臓の生化学的およびマイクロアレイ分析は、STX2+LPSチャレンジが、いずれかの作用物質単独の効果とは異なることを明らかにした。これらのマウスの血液および血清分析は、好中球増加、血小板減少、赤血球溶血ならびに増加した血清クレアチニンおよび血中尿素窒素を示した。加えて、マウス腎臓の組織学的分析および電子顕微鏡検査が、糸球体フィブリン沈着、赤血球うっ血、微小血栓形成および糸球体超微細構造変化を実証した。このHUSモデルが、C57BL/6マウスにおいて、ヒト疾患を確定する、血小板減少、溶血性貧血および腎不全を含むヒトHUSの病態のすべての臨床徴候を誘発することが立証された(J. Immunol 187(1):172-80 (2011))。
体重18~20gの雌C57BL/6マウスをCharles River Laboratoriesから購入し、2群(各5匹)に分割した。一方の群のマウスを、総量150μlの食塩水に希釈した組換えMASP-2抗体mAbM11(1匹あたり100μg、最終濃度5mg/kg体重に相当)の腹腔内(i.p.)注射によって前処置した。対照群には任意の抗体なしの食塩水を投与した。MASP-2抗体mAbM11の腹腔内注射から6時間後、全てのマウスに、総量150μl中、亜致死量(3μg/1匹、150μg/kg体重に相当)のSerratia marcescens(LL6136、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)のLPSと、4.5ng/1匹の用量(225ng/kgに相当)のSTX2(LD50量の2倍)との組み合わせ腹腔内注射を実施した。食塩水注射を対照として使用した。
各マウス腎臓の1/3を4%パラホルムアルデヒド中で24時間固定し、処理し、パラフィンに包埋した。厚さ3マイクロメートルの切片を切り出し、その後のヘマトキシリン・エオジン染料による染色に備えて帯電スライドに載せた。
腎臓の中間切片を約1~2mm3のブロックに切り分け、1×PBS中2.5%グルタルアルデヒド中4℃で一晩固定した。その後、固定した組織をUniversity of LeicesterのElectron Microscopy Facilityによって処理した。
腎臓のもう1/3を約1~2mm3のブロックに切り分け、液体窒素中で急速凍結させ、クリオスタット切片およびmRNA解析に備えて-80℃で維持した。
図67は、STX/LPS誘発性モデルにおける、食塩水で処置された対照マウス(n=5)およびMASP-2抗体で処置されたマウス(n=5)の経時(時)的生存率をグラフで示す。注目すべきことに、図67に示すように、すべての対照マウスが42時間以内に死んだ。きわめて対照的に、MASP-2抗体処置マウスの100%が実験の時間経過を通して生き延びた。図67に示す結果と合致して、重篤な疾病の徴候を示して死んだ、または殺処分されたのいずれかの非処置マウスのすべては有意な糸球体損傷を有するが、すべてのMASP-2抗体処置マウスの糸球体は正常に見えることが認められた(データ示さず)。これらの結果は、MASP-2阻害因子、例えばMASP-2抗体を使用して、溶血性尿毒症症候群(HUS)、非定型HUS(aHUS)、もしくは血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)などの血栓性微小血管症(TMA)に罹患している対象または該血栓性微小血管症(TMA)を発症する危険のある対象を治療し得ることを実証する。
本実施例は、血栓症のマウスFITC-デキストラン/光誘発性内皮細胞損傷モデルにおけるMASP-2欠損およびMASP-2阻害の効果を記載する。
生体内顕微鏡検査
Frommholdら、BMC Immunology 12:56-68, 2011によって記載されているように、マウスを生体内顕微鏡検査のために準備した。簡潔にいうと、マウスを、ケタミン(125mg/kg体重、Ketanest, Pfitzer GmbH, Karlsruhe, Germany)およびキシラジン(12.5mg/kg体重、Rompun, Bayer, Leverkusen, Germany)の腹腔内(i.p.)注射によって麻酔し、体温を37℃に維持するための加熱パッドに載せた。食塩水浸漬対物レンズ(SW 40/0.75開口数、Zeiss, Jena, Germany)を有する正立顕微鏡(Leica, Wetzlar, Germany)で生体内顕微鏡検査を実施した。呼吸しやすくするために、マウスにPE90チューブ(Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA)を挿入した。採血およびモノクロナール抗体(mAb)全身投与のために、左頚動脈にPE10チューブ(Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA)を挿入した。
Sperandioら、Blood, 97:3812-3819, 2001によって記載されているとおりに、生体内顕微鏡検査のための精巣挙筋の外科標本作製を実施した。簡潔にいうと、陰嚢を切開し、精巣挙筋を可動化した。筋肉の縦方向切開およびカバーガラス上での延展ののち、精巣上体および精巣を横にずらし、ピン留めして、精巣挙筋微小循環への完全な顕微鏡アクセスを可能にした。精巣挙筋細静脈をCCDカメラ(CF8/1、Kappa, Gleichen, Germany)によってPanasonic S-VHSレコーダに記録した。Frommholdら、BMC Immunology 12:56-68, 20112011によって以前に記載されているとおりに、精巣挙筋を温度調整(35℃)重炭酸緩衝食塩水で表面灌流した。
光毒性(FITC)-デキストラン(Cat. No. FD150S、Sigma Aldrich, Poole, U.K.)の光励起によって精巣挙筋細静脈および動脈の内皮の制御された光用量依存性血管損傷を誘発した。この手順が限局性血栓症を開始させる。光毒性試薬として、FITC-デキストランの10%w/v溶液60μLを左頸動脈アクセスに通して注入し、10分間循環血液全体に均一に延展させた。十分に灌流された細静脈を選択したのち、再現可能な制御されたやり方で血栓症を刺激するために、低~ミッドレンジ強度(800~1500)のハロゲン光を対象の血管に合焦させて、内皮表面にFITC-デキストラン蛍光および軽度~中等度の光毒性を誘発した。ハロゲンランプ(12V、100W、Zeiss, Oberkochen, Germany)を使用して、FITC-デキストランの励起のために必要な光毒性光強度を生成した。Steinbauerら、Langenbecks Arch Surg 385:290-298, 2000によって記載されるように、蛍光色素の光誘発励起から生じた光毒性は、光強度および/または照射時間のしきい値を必要とし、内皮表面の直接加熱または反応性酸素ラジカルの生成のいずれかによって生じる。
盲検試験設計を使用して、生体内顕微鏡検査の精巣挙筋モデルにおける血栓の光毒性誘発の16時間前、9週齢雄C57BL/6 WT同腹仔マウスに、MASP-2機能活性の阻害因子である組換えモノクロナールヒトMASP-2抗体(mAbH6)(最終濃度10mg/kg体重で投与)または同じ量のアイソタイプ対照抗体(MASP-2阻害活性なし)の腹腔内注射を実施した。血栓誘発の1時間前、mAbH6または対照抗体のいずれかの第二の投与を実施した。また、MASP-2ノックアウト(KO)マウスをこのモデルにおいて評価した。
図68は、FITC/デキストラン注射の16時間前および1時間前に投与されたアイソタイプ対照またはヒトMASP-2抗体mAbH6(10mg/kg)による処置後、FITC/デキストランUVモデルにおいて微小血管閉塞を起こしたマウスの割合を損傷誘発後の時間の関数としてグラフで示す。図68に示すように、アイソタイプ対照抗体の投与を受けた野生型マウスは、85%が30分以内またはそれ未満内に閉塞を起こしたが、一方、ヒトMASP-2抗体(mAbH6)で前処置された野生型マウスは、同じ期間内では19%しか閉塞を起こさず、ヒトMASP-2抗体処置群においては、最終的に閉塞を起こしたマウスにおいては閉塞までの時間が延びた。さらに、MASP-2 mAbH6処置マウスのうち3匹は60分の観察期間中に全く閉塞を起こさなかった(すなわち、血栓性閉塞から保護された)ことが注目される。
本実施例の結果はさらに、TMAのマウスモデルにおいて、レクチン経路を遮断するMASP-2阻害物質(例えば、MASP-2機能を遮断する抗体)が、複数の微小血管障害の特徴である微小血管凝固および血栓を阻害することを実証する。したがって、MASP-2阻害抗体のようなMASP-2阻害物質の投与は、HUS、aHUS、TTPまたは他の微小血管障害に罹患している患者において有効な治療であり、かつ微小血管凝固および血栓からの保護を提供すると予想される。
本実施例は、ヒトMASP-2阻害抗体(mAbH6)が、血小板を豊富に含むヒト血漿中の血小板機能に影響を及ぼさないことを実証する研究を記載する。
5分間にわたり溶液中の凝集率を測定した。結果を以下の表22に示す。
排他的な所有権または特権を主張する本発明の態様は添付の特許請求の範囲において規定される。
加齢黄斑変性症、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象または該疾患もしくは該障害を発症する危険のある対象においてMASP-3依存性補体活性化を阻害する方法であって、MASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-3阻害物質を含む組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1002]
前記MASP-3阻害物質がMASP-3モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:8の一部に特異的に結合する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
MASP-1阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記MASP-1阻害物質がMASP-1モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:10の一部に特異的に結合する、本発明1003の方法。
[本発明1005]
MASP-2阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記MASP-2阻害物質がMASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:5の一部に特異的に結合する、本発明1005の方法。
[本発明1007]
MASP-1阻害物質とMASP-2阻害物質とを含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記MASP-3阻害物質が第二経路駆動型C3b沈着を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記MASP-3阻害物質がD因子成熟を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記MASP-1阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-1の一部に特異的に結合する、本発明1003の方法。
[本発明1011]
前記MASP-1阻害物質が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449~694)に特異的に結合する、本発明1003の方法。
[本発明1012]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-1(SEQ ID NO:10)の一部にも結合する、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記MASP-3阻害物質が、CUBI-CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記MASP-3阻害物質が、CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、本発明1012の方法。
[本発明1015]
前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449~694)に結合し、かつ、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450~711)にも結合する、本発明1012の方法。
[本発明1016]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-2(SEQ ID NO:5)の一部にも結合する、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-3およびMASP-2のセリンプロテアーゼドメイン内の保存領域に結合する二重MASP-3/MASP-2阻害因子である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450~711)に結合し、かつ、MASP-2のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:5のaa445~682)またはMASP-2のCCP-1-CCP2ドメイン(SEQ ID NO:5のaa300~431)の少なくとも1つにも結合する、本発明1016の方法。
[本発明1019]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)の一部に結合し、かつ、MASP-1またはMASP-2を阻害しない、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-1(SEQ ID NO:10)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-3の一部に特異的に結合する、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450~711)に特異的に結合する、本発明1001の方法。
[本発明1022]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての汎(pan)阻害因子であり、かつ、CUB1-EGF-CUB2ドメイン中の保存領域に結合する、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての三重特異性(trispecific)阻害因子である、本発明1001の方法。
[本発明1024]
前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1025]
前記組成物がMASP-1抗体をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1026]
前記組成物が、MASP-1抗体、MASP-2抗体、およびMASP-3抗体を含む、本発明1007の方法。
[本発明1027]
MASP-2抗体、MASP-1抗体、またはMASP-3抗体の少なくとも1つを含む組成物の同時投与を含む、本発明1007の方法。
[本発明1028]
前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1029]
前記組成物がMASP-1抗体をさらに含む、本発明1016の方法。
[本発明1030]
前記抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機能を有する抗体、キメラ抗体、および、ヒト化抗体またはヒト抗体からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記組成物が全身投与される、本発明1001の方法。
[本発明1032]
前記組成物が、皮下に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、または吸入剤として投与される、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記対象が、加齢黄斑変性症に罹患しているか、または加齢黄斑変性症を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1034]
前記対象が、関節炎に罹患しているか、または関節炎を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1035]
前記関節炎が、変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、および乾癬性関節炎からなる群より選択される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記対象が、播種性血管内凝固に罹患しているか、または播種性血管内凝固を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1037]
前記播種性血管内凝固が、敗血症、外傷、感染症(細菌、ウイルス、真菌、寄生虫)、悪性腫瘍、移植拒絶反応、輸血反応、分娩合併症、血管動脈瘤、肝不全、熱射病、熱傷、放射線被曝、ショック、または重篤な中毒反応に続発する、本発明1036の方法。
[本発明1038]
前記対象が、血栓性微小血管症に罹患しているか、または血栓性微小血管症を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1039]
前記血栓性微小血管症が、溶血性尿毒症症候群(HUS)、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、および血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)からなる群より選択される、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記対象が、喘息に罹患しているか、または喘息を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1041]
前記対象が、デンスデポジット病に罹患しているか、またはデンスデポジット病を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1042]
前記対象が、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎に罹患しているか、または微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1043]
前記対象が、外傷性脳障害に罹患しているか、または外傷性脳障害を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1044]
前記対象が、誤嚥性肺炎に罹患しているか、または誤嚥性肺炎を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1045]
前記対象が、眼内炎に罹患しているか、または眼内炎を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1046]
前記対象が、視神経脊髄炎に罹患しているか、または視神経脊髄炎を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1047]
前記対象が、ベーチェット病に罹患しているか、またはベーチェット病を発症する危険にある、本発明1001の方法。
[本発明1048]
デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象または該疾患もしくは該障害を発症する危険のある対象においてMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法であって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1049]
前記MASP-2阻害物質がMASP-2抗体またはその断片である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記MASP-2阻害物質がMASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:5の一部に特異的に結合する、本発明1048の方法。
[本発明1051]
前記MASP-2抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、本発明1046の方法。
[本発明1052]
加齢黄斑変性症、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象または該疾患もしくは該障害を発症する危険のある対象におけるMASP-3依存性補体活性化の効果を阻害するのに使用するための医薬を製造する方法。
[本発明1053]
治療有効量のMASP-2阻害物質を、MASP-3阻害因子を含む前記医薬と混ぜ合わせる工程をさらに含む、本発明1052の方法。
[本発明1054]
デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象または該疾患もしくは該障害を発症する危険のある対象におけるMASP-2依存性補体活性化の効果を阻害するのに使用するための医薬を製造する方法であって、治療有効量のMASP-2阻害物質を薬学的担体に混ぜ合わせる工程を含む、方法。
[本発明1055]
治療有効量のMASP-3阻害物質を、MASP-2阻害因子を含む前記医薬と混ぜ合わせる工程をさらに含む、本発明1054の方法。
本明細書に記載される発明のこれらおよび他の局面および態様は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになると考えられる。本明細書において引用される米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物はすべて参照により、それぞれが個々に組み入れられるごとく、全体として本明細書に組み入れられる。
Claims (55)
- 加齢黄斑変性症、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象または該疾患もしくは該障害を発症する危険のある対象においてMASP-3依存性補体活性化を阻害する方法であって、MASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-3阻害物質を含む組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記MASP-3阻害物質がMASP-3モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:8の一部に特異的に結合する、請求項1に記載の方法。
- MASP-1阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-1阻害物質がMASP-1モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:10の一部に特異的に結合する、請求項3に記載の方法。
- MASP-2阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質がMASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:5の一部に特異的に結合する、請求項5に記載の方法。
- MASP-1阻害物質とMASP-2阻害物質とを含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が第二経路駆動型C3b沈着を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質がD因子成熟を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-1阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-1の一部に特異的に結合する、請求項3に記載の方法。
- 前記MASP-1阻害物質が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449~694)に特異的に結合する、請求項3に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-1(SEQ ID NO:10)の一部にも結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、CUBI-CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、請求項12に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、請求項12に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449~694)に結合し、かつ、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450~711)にも結合する、請求項12に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-2(SEQ ID NO:5)の一部にも結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-3およびMASP-2のセリンプロテアーゼドメイン内の保存領域に結合する二重MASP-3/MASP-2阻害因子である、請求項16に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450~711)に結合し、かつ、MASP-2のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:5のaa445~682)またはMASP-2のCCP-1-CCP2ドメイン(SEQ ID NO:5のaa300~431)の少なくとも1つにも結合する、請求項16に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)の一部に結合し、かつ、MASP-1またはMASP-2を阻害しない、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-1(SEQ ID NO:10)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-3の一部に特異的に結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450~711)に特異的に結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての汎(pan)阻害因子であり、かつ、CUB1-EGF-CUB2ドメイン中の保存領域に結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての三重特異性(trispecific)阻害因子である、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記組成物がMASP-1抗体をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記組成物が、MASP-1抗体、MASP-2抗体、およびMASP-3抗体を含む、請求項7に記載の方法。
- MASP-2抗体、MASP-1抗体、またはMASP-3抗体の少なくとも1つを含む組成物の同時投与を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 前記組成物がMASP-1抗体をさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 前記抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機能を有する抗体、キメラ抗体、および、ヒト化抗体またはヒト抗体からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が全身投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、皮下に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、または吸入剤として投与される、請求項31に記載の方法。
- 前記対象が、加齢黄斑変性症に罹患しているか、または加齢黄斑変性症を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、関節炎に罹患しているか、または関節炎を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- 前記関節炎が、変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、および乾癬性関節炎からなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記対象が、播種性血管内凝固に罹患しているか、または播種性血管内凝固を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- 前記播種性血管内凝固が、敗血症、外傷、感染症(細菌、ウイルス、真菌、寄生虫)、悪性腫瘍、移植拒絶反応、輸血反応、分娩合併症、血管動脈瘤、肝不全、熱射病、熱傷、放射線被曝、ショック、または重篤な中毒反応に続発する、請求項36に記載の方法。
- 前記対象が、血栓性微小血管症に罹患しているか、または血栓性微小血管症を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- 前記血栓性微小血管症が、溶血性尿毒症症候群(HUS)、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、および血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)からなる群より選択される、請求項38に記載の方法。
- 前記対象が、喘息に罹患しているか、または喘息を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、デンスデポジット病に罹患しているか、またはデンスデポジット病を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎に罹患しているか、または微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、外傷性脳障害に罹患しているか、または外傷性脳障害を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、誤嚥性肺炎に罹患しているか、または誤嚥性肺炎を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、眼内炎に罹患しているか、または眼内炎を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、視神経脊髄炎に罹患しているか、または視神経脊髄炎を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、ベーチェット病に罹患しているか、またはベーチェット病を発症する危険にある、請求項1に記載の方法。
- デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象または該疾患もしくは該障害を発症する危険のある対象においてMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法であって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記MASP-2阻害物質がMASP-2抗体またはその断片である、請求項48に記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質がMASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:5の一部に特異的に結合する、請求項48に記載の方法。
- 前記MASP-2抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項46に記載の方法。
- 加齢黄斑変性症、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象または該疾患もしくは該障害を発症する危険のある対象におけるMASP-3依存性補体活性化の効果を阻害するのに使用するための医薬を製造する方法。
- 治療有効量のMASP-2阻害物質を、MASP-3阻害因子を含む前記医薬と混ぜ合わせる工程をさらに含む、請求項52に記載の方法。
- デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳障害、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象または該疾患もしくは該障害を発症する危険のある対象におけるMASP-2依存性補体活性化の効果を阻害するのに使用するための医薬を製造する方法であって、治療有効量のMASP-2阻害物質を薬学的担体に混ぜ合わせる工程を含む、方法。
- 治療有効量のMASP-3阻害物質を、MASP-2阻害因子を含む前記医薬と混ぜ合わせる工程をさらに含む、請求項54に記載の方法。
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