ES2753419T3 - Inhibidores del factor H del complemento - Google Patents

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ES2753419T3 ES14806951T ES14806951T ES2753419T3 ES 2753419 T3 ES2753419 T3 ES 2753419T3 ES 14806951 T ES14806951 T ES 14806951T ES 14806951 T ES14806951 T ES 14806951T ES 2753419 T3 ES2753419 T3 ES 2753419T3
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Michael J Campa
Elizabeth Gottlin
Barton F Haynes
Hua-Xin Liao
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Duke University
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Abstract

Un anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo del mismo, que se une inmunoespecíficamente a la proteína del Factor H del Complemento (FHC), en el que la unión del anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, al FHC reducido se potencia en comparación con su unión al FHC no reducido, el anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, se une a un epítopo dentro de la repetición de consenso corta (SCR) 19 de la proteína de FHC y dicho epítopo comprende PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3).

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores del factor H del complemento
Campo técnico
La presente divulgación se refiere al factor H del complemento (FHC), en particular, a inhibidores del FHC, tales como anticuerpos anti-FHC y moléculas pequeñas y a métodos de tratamiento de pacientes con cáncer utilizando dichos inhibidores del FHC.
Antecedentes
El cáncer de pulmón es una cuestión de salud pública significativa. La mayoría de los tumores se detectan en una etapa avanzada cuando las opciones de tratamiento son limitadas y los pacientes requieren terapia sistémica.
Incluso los pacientes con cáncer de pulmón resecable de etapa temprana, tienen casi un 50 % de posibilidades de desarrollar recurrencia y, en algún punto, necesitan tratamiento adyuvante. En los últimos años, se han introducido nuevas terapias que se dirigen a rutas específicas y, en individuos seleccionados, estos producen una respuesta inicial. Sin embargo, casi todos los pacientes desarrollan resistencia, que se debe lo más probablemente a heterogeneidad tumoral y evolución clonal.
Aunque se ha investigado la activación de la respuesta humoral contra células malignas, la inmunidad humoral por sí misma se no se ha aprovechado muy bien para la terapia del cáncer. Se han descrito anticuerpos circulantes contra más de 100 antígenos asociados a tumores (AAT) distintos, pero muy pocos están asociados con un estadio o desenlace tumoral. Determinados anticuerpos hospedadores pueden tener el potencial de actividad antitumoral, pero esta capacidad no se ha materializado completamente debido a diversas razones posibles, incluidas la baja concentración o baja afinidad de los anticuerpos, o la activación ineficaz de linfocitos B. Existe una clara necesidad de un mayor número y más amplia variedad de terapias eficaces.
Sumario
La presente invención es como se define en las reivindicaciones.
La presente invención se dirige a un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo, capaz de unirse a una forma reducida de la proteína del Factor H del complemento (FHC). El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo, se une a un epítopo dentro de la repetición de consenso corta (s Cr , siglas del inglés short consensus repeat) 19 de la proteína del FHC. El epítopo comprende PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3). El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo desvelado, puede comprender una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos:
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID
NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID
NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID
NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 72, SEQ ID
NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID
NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID
NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92. La cadena pesada desvelada puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,
SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ
ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ
ID NO: 20, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ
ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 82. La cadena ligera desvelada puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, s Eq ID
NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID N NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID N NO: 37, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID N NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, puede que no reaccione en cruzado con al menos uno de autoantígenos de lupus eritematoso sistémico SSA, SSB, esfingomielina (Sm), ribonucleoproteína (RNP), autoantígeno de esclerosis (Sc1-70), histidina-ARNt ligasa (Jo-1),
ADN bicatenario (ADNbc), centrómero B (CentB) e histonas. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv unido a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo madurado por afinidad, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo con CDR injertada, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo de doble especificidad, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, puede humanizarse. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, puede comprender un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de
IgG2 humana, un dominio constante de IgG3 humana y un dominio constante de IgA humana. El anticuerpo aislado
o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores siempre y cuando el anticuerpo
aislado o fragmento de anticuerpo, no sea un autoanticuerpo.
La presente invención se dirige a un anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo del mismo, capaz de unirse a la
proteína del factor H del complemento (FHC). La proteína del factor H del complemento (FHC) puede ser una forma
reducida de proteína del FHC. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo se une a un epítopo dentro
de la repetición de consenso corta (SCR) 19 de la proteína del FHC. El epítopo puede comprender PlDNGDIT (SEQ
ID NO: 3). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado puede comprender una o más de las siguientes
secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID
NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID
NO: 16, SEQ ID NO: 17, S : 18, : 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SE NO: 23, SEQ ID NO: 24, S : 25, : 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SE NO: 30, SEQ ID NO: 31, S : 32, : 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SE NO: 37, SEQ ID NO: 72, S : 73, : 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SE NO: 78, SEQ ID NO: 79, S
Figure imgf000003_0001
: 80,
Figure imgf000003_0002
: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SE NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID
NO: 92. La cadena pesada desvelada puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SE NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SE NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 82. La
cadena ligera desvelada puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21,
SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28,
SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35,
SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92. El anticuerpo aislado, o
fragmento de anticuerpo, puede que no reaccione en cruzado con al menos uno de autoantígenos de lupus
eritematoso sistémico SSA, SSB, esfingomielina (Sm), ribonucleoproteína (RNP), autoantígeno de esclerosis (Scl-70), histidina-ARNt ligasa (Jo-1), ADN bicatenario (ADNbc), centrómero B (CentB) e histonas. El anticuerpo aislado o
fragmento de anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de
inmunoglobulina, un Fv unido a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo madurado por afinidad, un scFv,
un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo con CDR injertada, un diacuerpo, un
anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo de doble especificidad, un DVD, un
TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede
humanizarse. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender un dominio constante de
inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana,
un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgE
humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de igG3 humana y un dominio constante de
IgA humana. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo no es un autoanticuerpo.
La presente invención se dirige a un anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo del mismo, tal como se cita en las
reivindicaciones, que se une inmunoespecíficamente a la proteína del Factor H del Complemento (FHC). La unión
del anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, a la proteína del FHC es sensible a la forma reducida de la proteína del
FHC. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo del mismo, se une a un epítopo dentro de la repetición de
consenso corta (SCR) 19 de la proteína del FHC. El epítopo comprende PIDNGd It (Se Q ID NO: 3). El anticuerpo
aislado, o fragmento de anticuerpo desvelado, puede comprender una o más de las siguientes secuencias de
aminoácidos: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID
NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID
NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID
NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID
NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID
NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID
NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID
NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92. La cadena pesada
desvelada puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,
SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ
ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ
ID NO: 20, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ
ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 82. La cadena ligera desvelada puede comprender una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, Se Q ID NO: 24,
SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31,
SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 83,
SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90,
SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, puede que no reaccione en
cruzado con al menos uno de autoantígenos de lupus eritematoso sistémico SSA, SSB, esfingomielina (Sm), ribonucleoproteína (RNP), autoantígeno de esclerosis (Scl-70), histidina-ARNt ligasa (Jo-1), ADN bicatenario (ADNbc), centrómero B (CentB) e histonas. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv unido a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo madurado por afinidad, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo con CDR injertada, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo de doble especificidad, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede humanizarse. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de igG3 humana y un dominio constante de IgA humana. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo no es un autoanticuerpo.
La presente invención se dirige a un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo tal como se cita en las reivindicaciones, que se une inmunoespecíficamente a la proteína del factor H del complemento (FHC). El anticuerpo tiene una constante de disociación en equilibrio (Kd) de entre aproximadamente 1,00 x 10-10 M a aproximadamente 1,00 x 10-15 M. El anticuerpo puede tener una Kd de 2,46 x 10-12 M. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, puede que no reaccione en cruzadocon al menos uno de autoantígenos de lupus eritematoso sistémico SSA, s Sb , esfingomielina (Sm), ribonucleoproteína (RNP), autoantígeno de esclerosis (Scl-70), histidina-ARNt ligasa (Jo-1), ADN bicatenario (ADNbc), centrómero B (CentB) e histonas. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv unido a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo madurado por afinidad, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo con CDR injertada, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo de doble especificidad, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede humanizarse. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de IgG3 humana y un dominio constante de IgA humana. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo no es un autoanticuerpo.
La presente invención se dirige a un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo tal como se cita en las reivindicaciones, que se une inmunoespecíficamente a la proteína del factor H del complemento (FHC). El anticuerpo tiene una velocidad de disociación (kd) de entre aproximadamente 1,00 x 10‘4 s_1 a aproximadamente 1,00 x 10‘9 s-1. El anticuerpo puede tener una kd de 5,56 x 10‘7 s-1. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, puede que no reaccione en cruzado con al menos uno de autoantígenos de lupus eritematoso sistémico SSA, SSB, esfingomielina (Sm), ribonucleoproteína (RNP), autoantígeno de esclerosis (Scl-70), histidina-ARNt ligasa (Jo-1), ADN bicatenario (ADNbc), centrómero B (CentB) e histonas. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv unido a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo madurado por afinidad, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo con CDR injertada, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo de doble especificidad, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede humanizarse. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de igG3 humana y un dominio constante de IgA humana. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo no es un autoanticuerpo.
La presente invención se dirige a un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo tal como se cita en las reivindicaciones, que se une inmunoespecíficamente a la proteína del factor H del complemento (FHC). El anticuerpo tiene una velocidad de asociación (ka) de entre aproximadamente 1,00 x 103/M 'V a aproximadamente 1,00 x 108/M 'V . El anticuerpo puede tener una ka de 2,26 x 105/M 'V . El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, puede que no reaccione en cruzadocon al menos uno de autoantígenos de lupus eritematoso sistémico SSA, s Sb , esfingomielina (Sm), ribonucleoproteína (RNP), autoantígeno de esclerosis (Scl-70), histidina-ARNt ligasa (Jo-1), ADN bicatenario (ADNbc), centrómero B (CentB) e histonas. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv unido a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo madurado por afinidad, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo con CDR injertada, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo de doble especificidad, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede humanizarse. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de IgG3 humana y un dominio constante de IgA humana. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo no es un autoanticuerpo.
La presente invención se dirige a un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a FHC, un fragmento del mismo, citado en las reivindicaciones. El ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una o más de las
siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 4, SEQ ID nO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8,
SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15,
SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22,
SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29,
SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36,
SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77,
SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84,
SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 y
SEQ ID NO: 92.
La presente invención se dirige a un ácido nucleico aislado tal como se cita en las reivindicaciones, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ iD NO: 40, SEQ
ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 y SEQ
ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 113.
La presente invención se dirige a una célula aislada tal como se cita en las reivindicaciones, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos unida operativamente a un promotor. La secuencia de ácidos nucleicos comprende una secuencia de codificación que codifica un polipéptido que comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92. La célula aislada puede expresar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a una proteína del factor H del complemento (FHC). La célula aislada puede ser una célula eucariota. La célula eucariota puede ser una célula de mamífero.
La presente invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo, dicho ácido nucleico aislado o célula aislada.
La presente invención se dirige al anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo, el ácido nucleico aislado, la célula aislada o la composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que lo necesita que tiene cáncer. El método comprende administrar al sujeto dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo, dicho ácido nucleico aislado, dicha célula aislada o dicha composición farmacéutica. El cáncer puede ser cáncer de pulmón. El cáncer puede ser carcinoma de pulmón de célula no pequeña. El método puede comprender adicionalmente administrar una cantidad eficaz de al menos uno de Cetuximab, Perjeta o Herceptin.
La presente invención se dirige a un método de detección o medición de Factor H del Complemento (FHC) en una muestra. El método comprende poner en contacto la muestra con dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo.
La presente invención se dirige a un método de detección o medición de una forma reducida del Factor H del Complemento (FHC) en una muestra. El método comprende poner en contacto la muestra con dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo.
La presente invención se dirige al anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, al ácido nucleico aislado, a la célula aislada o a la composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer. El método comprende administrar dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo, dicho ácido nucleico aislado, dicha célula aislada o dicha composición farmacéutica.
La presente invención se dirige a un método in vitro de aumentar la lisis dependiente de complemento de una célula.
El método comprende administrar a la célula dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo o dicha composición farmacéutica. Una cantidad eficaz del anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede administrarse a la célula. La célula puede ser una célula de cáncer. La célula de cáncer puede ser una célula de cáncer de mama o una célula de cáncer de pulmón. La célula de cáncer puede ser una célula de cáncer de mama MCF7, célula de cáncer de mama SKBR3, célula de cáncer de mama MDA-MB-231 o una célula de carcinoma de pulmón A549. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene al menos una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, 85, 79 o 89. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene las SEQ ID NO: 75 y 85. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene las SEQ ID NO: 79 y 89.
La presente invención se dirige a un método in vitro de aumentar la deposición de C3b sobre una célula. El método comprende administrar a la célula dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo o dicha composición farmacéutica. Una cantidad eficaz del anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede administrarse a la célula. La célula puede ser una célula de cáncer. La célula de cáncer puede ser una célula de cáncer de mama o una célula de cáncer de pulmón. La célula de cáncer puede ser una célula de cáncer de mama MCF7, célula de cáncer de mama SKBR3, célula de cáncer de mama MDA-MB-231 o una célula de carcinoma de pulmón A549. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene al menos una secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 75, 85, 79 o 89. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene las SEQ ID NO: 75 y 85. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene las SEQ ID NO: 79 y 89.
La presente invención se dirige a un método in vitro de inhibir la unión del Factor H del Complemento (FHC) a C3b en un sujeto o una célula. El método comprende administrar a la célula dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo o dicha composición farmacéutica. Una cantidad eficaz del anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede administrarse a la célula. La célula puede ser una célula de cáncer. La célula de cáncer puede ser una célula de cáncer de mama o una célula de cáncer de pulmón. La célula de cáncer puede ser una célula de cáncer de mama MCF7, célula de cáncer de mama SKBR3, célula de cáncer de mama MDA-MB-231 o una célula de carcinoma de pulmón A549. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene al menos una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, 85, 79 o 89. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene las SEQ ID NO: 75 y 85. El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene las SEQ ID NO: 79 y 89.
La presente invención se dirige a un método de detección o medición de factor H del complemento (FHC) en una muestra. El método comprende poner en contacto la muestra con dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo.
La presente invención se dirige a un método de detección o medición de una forma reducida de Factor H del Complemento (FHC) en una muestra. El método comprende poner en contacto la muestra con dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo.
La presente invención se dirige al anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo, el ácido nucleico aislado, la célula aislada de la composición farmacéutica para su uso en un método de inhibición del crecimiento tumoral en un sujeto. El método comprende administrar al sujeto dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo, dicho ácido nucleico aislado, dicha célula aislada o dicha composición farmacéutica. Se puede inhibir el crecimiento tumoral de pulmón. La presente invención se dirige a un kit. El kit comprende dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo, dicho ácido nucleico aislado, dicha célula aislada o dicha composición farmacéutica.
La presente invención se dirige a un kit para someter a ensayo una muestra de ensayo para Factor H del Complemento (FHC). El kit comprende dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo, dicho ácido nucleico aislado, dicha célula aislada o dicha composición farmacéutica.
La presente invención se dirige a un kit para someter a ensayo una muestra de ensayo para una forma reducida de Factor H del Complemento (FHC). El kit comprende dicho anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo, dicho ácido nucleico aislado, dicha célula aislada o dicha composición farmacéutica.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra el efecto de reducción y desnaturalización de FHC en la unión de autoanticuerpos. Se revistieron placas de ELISA con o bien FHC nativo o FHC tratado con el TCEP reductor y con o sin la urea desnaturalizante. Se generaron curvas de titulación usando suero de un individuo positivo en anticuerpo de FHC y se detectó la unión de anticuerpos con anti-IgG-HRP humana.
La Fig. 2 muestra la competición de péptidos de la unión de anticuerpos a la diana. Se incubaron autoanticuerpos (H, E y F) durante la noche con (+) o sin (-) péptido y se usaron, a continuación, para sondear una transferencia que contiene FHC de longitud completa y SCR19-20, cargados en la misma calle. Una inmunorreactividad reducida en la presencia del péptido indica la interacción entre el péptido y el autoanticuerpo. Los estándares de peso molecular, en kDa, se indican en la parte izquierda de la figura.
La Fig. 3 muestra la deposición de fragmentos relacionados con C3 sobre células de cáncer de pulmón A549. Los anticuerpos son IgG de control agrupados de suero humano normal, anticuerpo anti-FHC humano de anticuerpo CI8 monoclonal de ratón o de paciente E (AbE), sometido a ensayo con o sin péptido de bloqueo (pep), en presencia de suero humano normal (NHS) o suero inactivado de calor (HI NHS). Se da a conocer un múltiplo de incremento en la deposición de C3 con respecto al nivel basal observado en ausencia de suero.
La Fig. 4 muestra la citotoxicidad dependiente del complemento de células de cáncer de pulmón A549 mediante la ruta alternativa. Los anticuerpos sometidos a ensayo son IgG mezclada, anticuerpo anti-FHC humano de anticuerpo CI8 monoclonal de ratón o de paciente E (AbE), con o sin péptido de bloqueo (pep). Se da a conocer un múltiplo de incremento con respecto al nivel basal observado en presencia de suero humano normal (NHS).
La Fig. 5 muestra un ELISA de los anticuerpos monoclonales humanos clonados frente al antígeno peptídico de 15 meros biotinilado.
La Fig. 6 muestra un ELISA de los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes frente al antígeno peptídico de 15 meros biotinilado
La Fig. 7 muestra una inmunotransferencia de los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes frente al FHC de longitud completa y péptido SCR19-20 en condiciones de reducción o no reducción.
La Fig. 8 muestra un ELISA de los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes frente al péptido de SCR19-20-biotina.
La Fig. 9 muestra un Ensayo de Liberación de LDH de los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes Ab7960/293i y Ab7968 frente a las células A549.
La Fig. 10 muestra la Localización de Epítopos de mAb anti-cáncer 7968.
La Fig. 11 muestra la Localización de Epítopos de mAb anti-cáncer 7955.
La Fig. 12 muestra la Localización de Epítopos de mAb anti-cáncer 7957.
La Fig. 13 muestra la Localización de Epítopos de mAb anti-cáncer 7960.
La Fig. 14 muestra la Localización de Epítopos de mAb anti-cáncer 7961.
La Fig. 15 muestra la Localización de Epítopos de mAb anti-cáncer 7964.
La Fig. 16 muestra la Localización de Epítopos de mAb anti-cáncer 7979.
La Fig. 17 muestra que los mAb de FHC provocan un aumento dependiente de dosis en CDC en células de cáncer de pulmón.
La Fig. 18 muestra que el CDC inducido por anticuerpos de FHC puede bloquearse con el péptido de epítopo.
La Fig. 19 muestra que CDC inducido por mAb de FHC está asociado con los efectos del Cetuximab, Perjeta y Herceptin.
La Fig. 20 muestra que mAb de FHC son inductores eficaces de CDC en líneas celulares de cáncer de mama. La Fig. 21 muestra la respuesta tumoral de A549 a la solución A de anticuerpos en comparación al no tratamiento. La Fig. 22 muestra la respuesta tumoral de A549 a la solución C de anticuerpos en comparación al no tratamiento. La Fig. 23 muestra la respuesta tumoral de A549 a una solución B de anticuerpos en comparación al no tratamiento. La Fig. 24 muestra la respuesta tumoral de A549 a la solución D de anticuerpos en comparación al no tratamiento.
Descripción detallada
La presente invención es como se define en las reivindicaciones.
La presente divulgación se dirige a inhibidores del factor H del complemento (FHC). En particular, la presente divulgación se dirige a inhibidores que se dirigen a un epítopo o región en el dominio SCR 19 de FHC. Este epítopo o región en particular se descubrió caracterizando la respuesta inmunitaria humoral en cáncer para desarrollar agentes terapéuticos frente a cáncer de pulmón. Los autoanticuerpos con respecto al FHC están asociados con cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC, por las siglas del inglés non-small-cell lung cáncer), no metastásico de fase temprana. Se llevó a cabo un análisis funcional de autoanticuerpos del paciente con NSCLC con respecto a FHC para evaluar su potencial para su desarrollo en un terapéutico de cáncer de pulmón que fomenta la lisis celular de tumor dependiente de complemento.
La presente divulgación describe anticuerpos en pacientes con cáncer de pulmón que reconocen una forma reducida de FHC in vitro, que puede representar (o imitar) la forma unida a tumor de FHC. Se purificaron por afinidad anticuerpos anti-FHC procedente de suero de pacientes y se localizaron sus epítopos. Un epítopo común reconocido por la mayoría de estos anticuerpos se emplazó en un dominio funcional de FHC que interactúa con C3b. El autoanticuerpo de FHC purificado aumento la deposición de C3b en células tumorales y aumentó la lisis dependiente de complemento de células tumorales. Este descubrimiento proporciona una diana terapéutica para el tratamiento de cáncer.
La presente divulgación también se dirige a anticuerpos anti-FHC. En particular, la presente divulgación se dirige a anticuerpos anti-FCH que se dirigen a un epítopo o región en el dominio SCR 19 de FHC. La presente divulgación describe anticuerpos que reconocen una forma reducida de FCH in vitro, que puede representar (o imitar) la forma unida a tumor de FHC. Un epítopo común reconocido por la mayoría de estos anticuerpos se emplazó en un dominio funcional de FHC que interactúa con C3b. Este descubrimiento proporciona una diana terapéutica para el tratamiento de cáncer.
1. Definiciones
A menos que se definan de otro modo, todas las expresiones técnicas y científicas usadas en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica. En caso de conflicto, prevalecerá el presente documento, incluidas las definiciones. A continuación, se describen métodos y materiales preferentes, aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o en el ensayo de la presente invención. Los materiales, métodos y ejemplos desvelados en el presente documento son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Los términos "comprende(n)", "incluye(n)", "que tiene(n)", "tiene", "puede(n)", "contiene(n)" y variantes de los mismos, tal y como se utiliza en el presente documento, están previstos para que sean oraciones, términos o palabras transicionales inacabadas, que no excluyen la posibilidad de actos o estructuras adicionales. Las formas en singular "un/a", "uno" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. La presente divulgación también contempla otras realizaciones "que comprenden", "que consisten en" y "consisten esencialmente en", las realizaciones o elementos presentados en el presente documento, se indiquen de forma explícita o no.
Para la citación de intervalos numéricos en el presente documento, cada número intermedio entre estos se contempla explícitamente con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, el número 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6 ,6 , 6,7, 6 ,8, 6,9 y 7,0 se contempla explícitamente.
El término "administración o "administrar", tal como se usa en el presente documento se refiere a proporcionar, poner en contacto y/o suministrar el inhibidor de FHC mediante cualquier vía adecuada para conseguir el efecto deseado. Estos agentes pueden administrarse a un sujeto de numerosas formas incluidas, pero sin limitación a, oral, ocular, nasal, intravenosa, tópica, como aerosoles, supositorio, etc. y puede usarse en combinación.
"Anticuerpo madurado por afinidad" se usa en el presente documento para referirse a cualquier anticuerpo con una o más alteraciones en una o más CDR, lo que da como resultado una mejora en la afinidad (es decir, Kd, kd o ka) del anticuerpo para un antígeno diana en comparación con un anticuerpo parental, que no posee la(s) alteración(es). Los anticuerpos madurados por afinidad ejemplares tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares del antígeno diana. Se conocen en la técnica diversos procedimientos para producir anticuerpos madurados por afinidad, incluido el cribado de una biblioteca de anticuerpos combinatoria que se ha preparado mediante el uso de bio-presentación. Por ejemplo, Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992) describe maduración por afinidad mediante barajado de dominios de VH y VL. La mutagénesis aleatoria de regiones determinantes de la complementariedad (CDR, complementarity determining regions) y/o restos de la región estructural se describe por Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992). La mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectiva y en contacto o posiciones de hipermutación con un resto de aminoácido potenciador de la actividad se describe en la patente de Estados Unidos N.° 6.914.128 B1.
"Ruta alternativa", también conocida como "ruta de complemento alternativa", tal como se usa en el presente documento se refiere a una de las tres rutas de complemento que opsoniza y destruye células diana. La ruta alternativa se desencadena cuando la proteína de C3b se une directamente con la célula diana. La ruta de complemento alternativa es capaz de distinguir la propia frente a la extraña basándose en la expresión de superficie de proteínas reguladoras de complemento que limitan la activación con complemento ya que las células hospedadoras no acumulan C3b de superficie celular puesto que esto se evita mediante las proteínas reguladoras de complemento. Las células extrañas, patógenos y superficies anormales no tienen, en general, proteínas reguladoras de complemento y, de este modo, se vuelven muy decoradas con C3b, que finalmente lleva a la lisis de la célula.
"Anticuerpo y "anticuerpos" tal como se usa en el presente documento se refiere a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados (total o parcialmente humanizados), anticuerpos de animales tales como, pero sin limitación a, un ave (por ejemplo, un pato o un ganso), un tiburón, una ballena y un mamífero, que incluye un no primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, un conejillo de Indias, un gato, un perro, una rata, un ratón, etc.) o un primate no humano (por ejemplo, un mono, un chimpancé, etc.), anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, Fv de cadena simple ("scFv"), anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de dominio único, tales como dominios de cadena pesada variable ("VHH"; también conocidos como "fragmentos de VHH") procedentes de animales en la familia Camelidae (VHH y métodos de fabricarlos se describe en Gottlin et al„ Journal of Biomolecular Screening, 14:77-85 (2009)) y fragmentos Vnap, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab')2, anticuerpos ligados por disulfuro Fv ("sdFv") y anti-idiotípicos ("anti-Id"), anticuerpos de dominio doble, anticuerpos de dominio doble variable (DVD) o de dominio triple variable (TVD) (inmunoglobulinas de dominio doble variable y métodos para prepararlas se describen en Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25(11):1290-1297 (2007)) y el documento de Solicitud Internacional PCT WO 2001/058956), y fragmentos que se unen a epítopo funcionalmente activos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, concretamente, moléculas que contienen un sitio que se une al analito. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2) o subclase. Por razones de simplicidad, un anticuerpo contra un analito se denomina con frecuencia en el presente documento como un "anticuerpo anti-analito" o simplemente un "anticuerpo de analito" (por ejemplo, un anticuerpo anti-FHC o un anticuerpo de FHC).
Un "fragmento de anticuerpo" tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión a antígeno o la región variable. La porción no incluye los dominios constantes de la cadena pesada (es decir, CH2, CH3 o CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, diacuerpos, moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), polipéptidos de cadena sencilla que contienen solo un dominio variable de la cadena ligera, polipéptidos de cadena sencilla que contienen las tres CDR del dominio variable de la cadena ligera, polipéptidos de cadena sencilla que contienen solo una región variable de la cadena pesada, polipéptidos de cadena sencilla que contienen las tres c Dr de la región variable de la cadena pesada y VHH.
"Autoanticuerpo", "anticuerpos de paciente", "autoanticuerpos de FHC de paciente" o "anticuerpos de FHC de paciente" tal como se usa indistintamente en el presente documente se refiere a una inmunoglobulina, receptor de la superficie de linfocitos B específico a antígeno (inmunoglobulina de superficie) o receptor de linfocitos T específico a antígeno producido por un individuo que se dirige frente a una auto-proteína del propio individuo, carbohidrato o ácido nucleico.
Un "autoanticuerpo con respecto a la proteína de FHC" tal como se usa en el presente documento se refiere a un autoanticuerpo capaz de reaccionar con la proteína de FHC o con una variante o con un fragmento de dicha proteína, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento es funcionalmente equivalente, es decir, susceptible de ser reconocido por dicho autoanticuerpo. Por ejemplo, un autoanticuerpo con respecto a la proteína de FHC puede ser una IgG o una IgM.
Se describen en el presente documento las "constantes de unión". La expresión "constante de la tasa de asociación", "kon” o "ka” tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere al valor que indica la tasa de unión de un anticuerpo con su antígeno diana o la tasa de formación de complejo entre un anticuerpo y un antígeno como se muestra en la siguiente ecuación:
Anticuerpo (Ab) Antígeno (Ag) ^ Ab-Ag.
La expresión "constante de la tasa de disociación", "koff” o "kd” tal y como se usa indistintamente en el presente documento, se refiere al valor que indica la tasa de disociación de un anticuerpo desde su antígeno diana o la separación de un complejo Ab-Ag a lo largo del tiempo en anticuerpo y antígeno libre como se muestra en la siguiente ecuación:
Anticuerpo (Ab) Antígeno (Ag) ^ Ab-Ag.
Los métodos para determinar las constantes de la tasa de asociación y disociación son bien conocidos en la técnica.
El uso de técnicas basadas en la fluorescencia ofrece una sensibilidad elevada y la capacidad de examinar muestras en tampones fisiológicos en equilibrio. Se pueden utilizar otros enfoques experimentales e instrumentos tales como un ensayo BIAcore® (análisis de interacción biomolecular) (por ejemplo, una instrumentación disponible en BIAcore International AB, una compañía de GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Adicionalmente, también se puede utilizar un ensayo KinExA® (Ensayo de Exclusión Cinética), disponible en Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).
La expresión "dosificación eficaz" o "cantidad eficaz" tal y como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a una dosificación de un fármaco eficaz para períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una dosificación eficaz puede determinarse por un experto en la técnica y puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, así como la capacidad del fármaco para provocar una respuesta deseada en el individuo. Esta expresión tal como se usa en el presente documento también puede referirse a una cantidad eficaz en llevar a cabo un efecto in vivo deseado en un animal, mamífero o ser humano, tal como reducir y/o inhibir la función del receptor de estrógenos. Se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz en una o más administraciones (por ejemplo, el agente puede proporcionarse como un tratamiento preventivo o terapéuticamente en cualquier etapa de progresión de la enfermedad, antes o después de presentar síntomas y similares), las aplicaciones o dosificaciones no están previstas para estar limitadas a una formulación particular, combinación o vía de administración. Se encuentra dentro del ámbito de la presente divulgación que el SERM se pueda administrar en diversos momentos durante el transcurso del tratamiento del sujeto. Los momentos de administración y dosificaciones usadas dependerán de varios factores, tales como el objetivo de tratamiento (por ejemplo, tratamiento frente a prevención), afección del sujeto, etc. y puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica.
La expresión "constante de disociación en equilibrio", “Kd”, “Kd” o “Kd” tal y como se usa de manera intercambiable, en el presente documento, se refiere al valor obtenido dividiendo la tasa de disociación (koff) por la tasa de asociación (kon). La tasa de asociación, la tasa de disociación y la constante de disociación en equilibrio se utilizan para representar la afinidad de la unión de un anticuerpo con un antígeno.
"Proteína de unión" se usa en el presente documento para referirse a una proteína monomérica o multimérica que se une y forma un complejo con un ligando, tal como, por ejemplo, un polipéptido, un antígeno, un compuesto químico u otra molécula, o un sustrato de cualquier tipo. Una proteína de unión se une específicamente a un ligando. Las proteínas de unión incluyen anticuerpos, así como fragmentos que se unen a antígeno de los mismos y otras diversas formas y derivados de los mismos como se conocen en la técnica y se describen en el presente documento a continuación, y otras moléculas que comprenden uno o varios dominios de unión a antígeno que se unen a una molécula de antígeno o a un sitio en particular (epítopo) sobre la molécula de antígeno. Por consiguiente, una proteína de unión incluye, pero sin limitación a, un anticuerpo, una inmunoglobulina tetramérica, una molécula de IgG, una molécula de IgG1, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con CDR injertada, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo madurado por afinidad y cualquier fragmento de cualquiera de tales anticuerpos que conservan la capacidad de unirse a un antígeno.
Un "anticuerpo biespecífico" se utiliza en este documento para referirse a un anticuerpo de longitud completa que se genera por la tecnología de cuadroma (véase, Milstein et al., Nature, 305(5934): 537-540 (1983)), por conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes (véase, Staerz et al., Nature, 314(6012): 628-631 (1985)) o por botón-en-ojal o enfoques similares, que introducen mutaciones en la región Fc (véase, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993)), dando como resultado múltiples especies diferentes de inmunoglobulinas de las cuales solo una es el anticuerpo biespecífico funcional. Un anticuerpo biespecífico se une a un antígeno (o epítopo) sobre uno de sus dos brazos de unión (una pareja de HC/LC) y se une a un antígeno diferente (o epítopo) sobre su segundo brazo (una pareja diferente de HC/LC). Con esta definición, un anticuerpo biespecífico tiene dos brazos distintos que se unen a antígeno (tanto en las secuencias de CDR como en la especificidad) y es monovalente para cada antígeno al que se une.
"C3b" tal como se usa en el presente documento se refiere al tamaño más grande de dos elementos formados por la escisión del componente 3 (C3) del complemente mediante complejo de enzima de C3 convertasa o mediante escisión espontánea en la sangre. C3b se une covalentemente a superficies de células microbianas dentro de un cuerpo de organismo, lo que lleva a la producción de C3-convertasa unida a superficie y más componentes de C3b y opsonización del microbio mediante macrófagos. C3b que se genera desde C3 mediante un complejo de enzima de C3 convertasa en la fase fluida se inactiva rápidamente mediante el factor H y factor I. Cuando el tioéster interno de C3 reacciona con un grupo hidroxilo o amina de una molécula sobre la superficie de una célula o un patógeno, el C3b que ahora está covalentemente unido a la superficie está protegido de la inactivación mediada por factor H y puede ahora unirse a factor B para formar C3bB.
"Cáncer" o "tumor" tal como se usa indistintamente en el presente documento se refiere al crecimiento incontrolado o no regulado de células anormales en el cuerpo. El cáncer puede invadir partes cercanas del cuerpo y también puede expandirse a partes más distintas del cuerpo mediante el sistema linfático o torrente sanguíneo. "Célula de cáncer" o "célula tumoral" se usan indistintamente en el presente documento y se refiere a una célula que se divide y reproduce anormalmente con crecimiento incontrolado. Una célula de cáncer puede salir y viajar a otras partes del cuerpo y establecerse en otro sitio, denominado metástasis. Las células de cáncer o células cancerosas también se denominan células malignas. Una célula de cáncer o una línea celular de cáncer puede originarse de un cáncer. Por ejemplo, una línea celular de cáncer puede ser una línea celular A549 ("A549"), que es una línea celular epitelial de adenocarcinoma de cáncer humano.
Los cánceres pueden incluir carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, tumor carcinoide, gastrointestinal, carcinoma de primario desconocido, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de la vesícula biliar extrahepática, tumores de la familia de Ewing (PNET), tumor de células germinales extracraneales, cáncer ocular de melanoma intraocular, cáncer de vesícula, cáncer gástrico (estómago), tumor de células germinales extragonadal, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hipofaríngeo, carcinoma de las células de los islotes, cáncer de riñón (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemia linfoblástica aguda, leucemia, mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia de células pilosas, cáncer de labio y cavidad bucal, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma (primario) del sistema nervioso central, linfoma de linfocitos T cutáneo, linfoma de enfermedad de Hodgkin, linfoma de enfermedad no de Hodgkin, mesotelioma maligno, melanoma, carcinoma de células de Merkel, cáncer de cuello escamoso metastásico con primerio oculto, mieloma múltiple y otros neoplasmas de células plasmáticas, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer epitelial de ovario, tumor celular germinal de ovario, cáncer pancreático, exocrino, cáncer pancreático, carcinoma de las células de los islotes, cáncer del seno paranasal y la cavidad nasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer de pituitaria, neoplasma de célula plasmática, cáncer de próstata, rabdomiosarcoma, cáncer rectal, cáncer de células renales (cáncer de riñón), cáncer renal de célula transicional de pelvis y uréter, cáncer de la glándula salival, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer testicular, timoma maligno, cáncer de tiroides, cáncer uretral, cáncer uterino, cáncer inusual de niñez, cáncer vaginal, cáncer de vulva y tumor de Wilms.
"Proteína del Factor H del Complemento", "proteína de FHC" o "FHC" tal como se usa en el presente documento se refiere a una proteína de aproximadamente 150 kDa (UniProt P08603) que es un miembro de los reguladores de la familia de activación del complemento y es una proteína de control de complemento. El FHC es una gran glicoproteína soluble que circula en el plasma humano y sirve para regular la ruta alternativa del sistema de complementos, asegurando que el sistema de complementos se dirige hacia patógenos u otro material peligroso y no daña el tejido hospedador. El FHC es un cofactor en la activación de C3b por el factor I y funciona para aumentar la tasa de disociación del complejo C3bBb (C3 convertasa) y el complejo (C3b)NBB (C5 convertasa) en la ruta de complemento alternativo. El FHC se une a glicosoaminoglicanos que están presentes, en general, sobre células hospedadoras pero no lo están, normalmente, sobre superficies de patógenos.
El FHC está compuesto de 20 repeticiones de consenso cortas (SCR), algunas de la cuales funciona para la unión celular, mientras que otras funcionan para eliminar C3 de la superficie celular. Cada una de las 20 SCR que comprenden el FHC tienen aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, se disponen de cabeza a cola y contiene 4 restos de cisteína que forman 2 enlaces disulfuro por módulo. El dominio de unión de C3b puede referirse a la parte del FHC que se une a C3b. Las SCR 19 y 20 están implicadas en la unión de C3b.
"Derivado" de un anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que tiene una o más modificaciones en su secuencia de aminoácidos cuando se compara con un anticuerpo genuino o parental y muestra una estructura de dominio modificada. El derivado aún puede ser capaz de adoptar la configuración de dominio típica que se encuentra en anticuerpos nativos, así como una secuencia de aminoácidos, que es capaz de unirse a diana (antígenos) con especificidad. Ejemplos típicos de derivados de anticuerpos son anticuerpos acoplados a otros polipéptidos, dominios de anticuerpos redispuestos o fragmentos de anticuerpos. El derivado también puede comprender al menos un compuesto adicional, por ejemplo, un dominio proteico, dicho dominio proteico está unido mediante enlaces covalentes o no covalentes. La unión puede basarse en fusión genética de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. El dominio adicional presente en la proteína de fusión que comprende el anticuerpo empleado de acuerdo con la invención puede unirse preferentemente mediante un enlazador flexible, ventajosamente un enlazador peptídico, en donde dicho enlazador peptídico comprende aminoácidos unidos a péptido, hidrófilos y plurales de una longitud suficiente para abarcar la distancia en entre el extremo C-terminal del dominio de proteína adicional y el extremo N-terminal del anticuerpo o viceversa. El anticuerpo puede estar unido a una molécula efectora que tiene una conformación adecuada para la actividad biológica o unión selectiva a un soporte sólido, una sustancia biológicamente activa (por ejemplo, una citocina u hormona del crecimiento), un agente químico, un péptido, una proteína o un fármaco, por ejemplo.
"Anticuerpo de doble especificidad" se utiliza en el presente documento para referirse a un anticuerpo de longitud completa que se puede unir a dos antígenos diferentes (o epítopos) en cada uno de sus dos brazos de unión (una pareja de HC/IC) (véase el documento de publicación PCT WO 02/02773). Por consiguiente, una proteína de unión específica doble tiene dos brazos idénticos que se unen a antígeno, con especificidad idéntica y secuencias de CDR idénticas, y es bivalente para cada antígeno al que se une.
"Dominio variable doble" o "DVD" se utiliza en el presente documento indistintamente para referirse a dos o más sitios de unión a antígeno en una proteína de unión, que pueden ser divalentes (dos sitios de unión a antígeno), tetravalentes (cuatro sitios de unión a antígeno) o proteínas de unión multivalentes. Los DVD pueden ser monoespecíficos, es decir, capaces de unirse a un antígeno (o un epítopo específico) o multiespecíficos, es decir, capaces de unirse a dos o más antígenos (es decir, dos o más epítopos de la misma molécula de antígeno diana o dos o más epítopos de diferentes antígenos diana). Una proteína que se une a DVD preferente comprende dos polipéptidos de DVD de cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de cadena ligera y se denomina una "inmunoglobulina DVD" o "Ig DVD". Tal proteína de unión a Ig DVD de este tipo es, por tanto, tetramérica y una reminiscencia de una molécula de IgG, pero proporciona más sitios de unión a antígeno que una molécula de IgG. Por tanto, cada mitad de una molécula de Ig DVD tetramérica es una reminiscencia de una mitad de una molécula de IgG y comprende un polipéptido DVD de cadena pesada y un polipéptido DVD de cadena ligera pero, a diferencia de una pareja de cadenas pesadas y ligeras de una molécula de IgG que proporciona un dominio de unión a antígeno único, una pareja de cadenas pesadas y ligeras de una Ig DVD proporciona dos o más sitios de unión a antígeno.
Cada sitio de unión a antígeno de una proteína de unión Ig DVD se puede obtener a partir de un anticuerpo monoclonal donante ("parental") y por lo tanto comprende un dominio variable de la cadena pesada variable (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL) con un total de seis CDR implicadas en la unión al antígeno por cada sitio de unión a antígeno. Por consiguiente, una proteína de unión a Ig DVD que se une a dos epítopos diferentes (es decir, dos epítopos diferentes de dos moléculas de antígeno diferentes o dos epítopos diferentes de la misma molécula de antígeno) comprende un sitio de unión a antígeno obtenido a partir de un primer anticuerpo monoclonal parental y un sitio de unión a antígeno de un segundo anticuerpo monoclonal parental.
En una realización preferida, una proteína de unión Ig DVD de acuerdo con la invención, no solo se une a las mismas moléculas diana a las que se unen sus anticuerpos monoclonales parentales, sino que también posee una o varias propiedades deseables de uno o varios de sus anticuerpos monoclonales parentales. Preferentemente, tal propiedad adicional de este tipo es un parámetro de anticuerpo de uno o varios de los anticuerpos monoclonales parentales. Los parámetros de anticuerpo que se pueden aportar a una proteína de unión a Ig DVD procedente de uno o varios de sus anticuerpos monoclonales parentales incluyen, pero no se limitan a, la especificidad del antígeno, la afinidad del antígeno, la potencia, la función biológica, el reconocimiento del epítopo, la estabilidad de la proteína, la solubilidad de la proteína, la eficacia de la producción, la inmunogenicidad, la farmacocinética, la biodisponibilidad, la reactividad cruzada tisular y la unión a antígenos ortólogos.
Una proteína de unión a Ig DVD se une al menos a un epítopo de un FHC. Ejemplos no limitantes de una proteína de unión a Ig DVD incluyen una proteína de unión a Ig DVD que se une a uno o varios epítopos de f Hc , una proteína de unión a Ig dVd que se une a un epítopo de una FHC humano y un epítopo de un FHC de otra especie (por ejemplo, ratón) y una proteína de unión a Ig DVD que se une a un epítopo de un FHC humano y un epítopo de otra molécula diana.
"Epítopo", o "epítopos", o "epítopos de interés" se refieren a sitio(s) sobre cualquier molécula que reconocen y se pueden unir a sitio(s) complementarios sobre su ligando específico. La molécula y un ligando específico forman parte de una pareja de unión específica. Por ejemplo, un epítopo puede estar sobre un polipéptido, una proteína, un hapteno, un antígeno de hidrato de carbono (tal como, pero sin limitación a, glicolípidos, glicoproteínas o lipopolisacáridos) o un polisacárido. Su ligando específico puede ser, pero sin limitación a, un anticuerpo.
"Fragmento F(ab')2" tal como se usa en el presente documento se refiere a anticuerpos generados mediante digestión de pepsinas de la totalidad de los anticuerpos de IgG para retirar la mayoría de la región Fc mientras que deja intacta algo de la región bisagra. Los fragmentos F(ab')2 tiene dos porciones F(ab) de unión a antígeno unidas juntas mediante enlaces disulfuro y, por lo tanto, son divalentes con un peso molecular de aproximadamente 110 kDa. Los fragmentos de anticuerpo divalentes (fragmentos F(ab')2) son más pequeñas que las moléculas de IgG entera y permiten una mejor penetración en el tejido facilitando, de este modo, un mejor reconocimiento de antígenos en la inmunohistoquímica. El uso de fragmentos F(ab')2 también evita la unión no específica al receptor Fc en células vivas o a la Proteína A/G. Los fragmentos F(ab')2 pueden tanto unir como precipitar antígenos.
"Región estructural" (Framework, FR) o "secuencia estructural" tal y como se utiliza en el presente documento, puede significar las secuencias restantes de una región variable menos las CDR. Debido a que la definición exacta de una secuencia de CDR se puede determinar por diferentes sistemas (por ejemplo, véase más arriba), el significado de una secuencia estructural está sujeta correspondientemente a diferentes interpretaciones. Las seis CDR (CDR-L1, -L2 y -L3 de la cadena ligera y CDR-H1, -H2 y -H3 de la cadena pesada) también dividen las regiones estructurales en la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro subregiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en donde CDR1 se coloca entre FR1 y f R2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las subregiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región estructural, como se indica por otros, representa las FR combinadas dentro de la región variable de una sola cadena de inmunoglobulina, de origen natural. Tal y como se utiliza en el presente documento, una FR representa una de las cuatro subregiones y FR representa dos o más de las cuatro subregiones que constituyen una región estructural.
De las secuencias de FR de la cadena pesada y la cadena ligera humana se conoce en la técnica que se pueden utilizar como secuencias estructurales "aceptoras" de la cadena pesada y la cadena ligera (o simplemente, secuencias "aceptaras") para humanizar un anticuerpo no humano usando métodos conocidos en la técnica. En una realización, las secuencias aceptoras de la cadena pesada y de la cadena ligera humana se seleccionan a partir de las secuencias estructurales indicadas en bases de datos disponibles públicamente, tales como V-base (hypertext transfer protocol://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) o en el sistema de información internacional ImMunoGeneTics® (IMGT®) (hypertext transfer protocol://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/).
"Sitio funcional de unión al antígeno" tal y como se utiliza en el presente documento, puede significar un sitio sobre una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) que es capaz de unirse a un antígeno diana. La afinidad de la unión al antígeno del sitio de unión a antígeno puede no ser tan fuerte como el de la proteína de unión parental, por ejemplo, el anticuerpo parental, a partir del que se deriva el sitio de unión al antígeno, pero la capacidad de unión al antígeno debe ser medible usando uno cualquiera entre una variedad de métodos conocidos para la evaluación de una proteína, por ejemplo, anticuerpo, que se une a un antígeno. Además, la afinidad de la unión al antígeno de cada uno de los sitios de unión a antígeno de una proteína multivalente, por ejemplo, un anticuerpo multivalente, en el presente documento no tiene que ser cuantitativamente la misma.
"Anticuerpo humanizado" se usa en el presente documento para describir un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en el que al menos una porción de la secuencia de VH y/o VL ha sido alterada para ser más "similar a la humana", es decir, más similar a las secuencias variables de la línea germinal humana. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, un derivado, un análogo o un fragmento del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región estructural (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante de complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de un anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, un anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones estructurales son las de una secuencia de consenso de una inmunoglobulina humana. En una realización, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado contiene la cadena ligera, así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, regiones de CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena pesada humanizada. En realizaciones específicas, un anticuerpo humanizado solo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o una cadena pesada humanizada.
Se puede seleccionar un anticuerpo humanizado de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluidas IgM, IgG, IgD, IgA, IgY e IgE, así como cualquier isotipo, incluido sin limitación IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. Un anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo y, en particular, se pueden seleccionar dominios constantes para optimizar las funciones efectoras deseadas usando métodos bien conocidos en la técnica.
Las regiones estructurales y las CDR de un anticuerpo humanizado no tienen que corresponderse exactamente con las secuencias parentales, por ejemplo, la CDR del anticuerpo donante o la región estructural de consenso pueden estar mutagenizadas mediante sustitución, inserción y/o deleción de al menos un residuo de aminoácido, de manera que el residuo de la CDR o la región estructural en ese sitio no se corresponde con el del anticuerpo donante o la región estructural de consenso. En una realización preferida, tales mutaciones, sin embargo, no serán extensas. Normalmente, al menos el 80 %, preferentemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90% y lo más preferiblemente al menos el 95 % de los restos del anticuerpo humanizado se corresponden con los de las secuencias de FR y CDR parentales. Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "región estructural de consenso" se refiere a la región estructural en la secuencia de consenso de la inmunoglobulina. Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "secuencia de consenso de una inmunoglobulina" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) que se presentan más frecuentemente en una familia de secuencias de inmunoglobulinas relacionadas (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)). Una "secuencia de consenso de inmunoglobulina" puede comprender, por tanto, "región(es) estructural(es) de consenso" y/o "CDR de consenso". En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia de consenso está ocupada por el aminoácido que se presenta con más frecuencia en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos se presentan con la misma frecuencia, ambos se pueden incluir en la secuencia de consenso.
"Idéntico" o "identidad", tal y como se emplea en el presente documento, en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, puede significar que las secuencias tienen un porcentaje especificado de restos que son iguales sobre una región especificada. El porcentaje se puede calcular mediante una alineación de manera óptima de las dos secuencias, la comparación de las dos secuencias sobre la región especificada, determinando el número de posiciones en las que el residuo idéntico se presenta en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la región especificada y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de la secuencia. En casos en los que las dos secuencias tienen longitudes diferentes o la alineación produce uno o varios extremos escalonados y la región especificada de la comparación incluye solo una secuencia sencilla, los restos de la secuencia sencilla se incluyen en el denominador pero no en el numerador del cálculo.
"Secuencia enlazadora" o "secuencia peptídica enlazadora" se refiere a una secuencia polipeptídica natural o artificial que está conectada a una o varias secuencias de polipéptidos de interés (por ejemplo, de longitud completa, fragmentos, etc.). El término "conectada" se refiere a la unión de la secuencia enlazadora con la secuencia polipeptídica de interés. Tales secuencias de polipéptidos se unen preferiblemente mediante uno o varios enlaces peptídicos. Las secuencias enlazadoras pueden tener una longitud de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 aminoácidos. Preferentemente, la longitud de la secuencia enlazadora es de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 aminoácidos. Las secuencias enlazadoras naturales se pueden modificar mediante sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos para crear secuencias enlazadoras artificiales. Las secuencias enlazadoras a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: (i) marcadores de histidina (His), tal como un marcador 6X His, que tiene una secuencia de aminoácidos de HHHHHH (SEQ ID NO: 116), son útiles como secuencias enlazadoras para facilitar el aislamiento y la purificación de polipéptidos y anticuerpos de interés; (ii) sitios de escisión de enterocinasas, como los marcadores His, se utilizan en el aislamiento y la purificación de proteínas y anticuerpos de interés. A menudo, los sitios de escisión de enterocinasas se utilizan junto con marcadores His en el aislamiento y la purificación de proteínas y anticuerpos de interés. Diversos sitios de escisión de enterocinasas se conocen en la técnica. Ejemplos de sitios de escisión de enterocinasas incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de aminoácidos de DDDDK (SEQ ID NO: 117) y derivados de la misma (por ejemplo, ADDDDK (SEQ ID NO: 118), etc.); (iii) secuencias variadas se pueden usar para enlazar o conectar las regiones variables de la cadena pesada y/o ligera de fragmentos de la región variable de una cadena sencilla. Ejemplos de otras secuencias enlazadoras se pueden encontrar en Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85: 5879-5883 (1988); y McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990). Las secuencias enlazadoras también se pueden modificar para funciones adicionales, tales como la fijación de fármacos o la fijación a soportes sólidos. En el contexto de la presente divulgación, el inhibidor de FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC, por ejemplo, puede contener una secuencia enlazadora, tal como un marcador His, un sitio de escisión de enterocinasa o ambos.
"Cáncer de pulmón" tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a cáncer que se origina en el pulmón. Por ejemplo, cáncer de pulmón puede ser cáncer del pulmón, tal como cáncer de pulmón de células pequeñas, también conocido como carcinoma de pulmón de células pequeñas y cáncer de células de avena, carcinoma de pulmón no microcítico ("NSCLC"), tumores glandulares, tumores carcinoides y carcinomas indiferenciados.
"Carcinoma de pulmón de células no pequeñas" o "NSCLC" tal y como se usa en el presente documento indistintamente se refiere a cualquier tipo de cáncer de pulmón epitelial distinto de carcinoma de pulmón de células pequeñas. Los tres subtipos principales de NSCLC son adenocarcinoma, incluido carcinoma bronquioloalveolar, carcinoma de pulmón de células escamosas y carcinoma de pulmón de células grandes. Los NSCLC son relativamente insensibles a la quimioterapia.
"Anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpo sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de forma natural que pueden estar presentes en menores cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único antígeno. Además, en contraste a preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen normalmente distintos anticuerpos dirigidos contra distintos determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante sobre el antígeno. Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga con secuencias correspondientes en anticuerpos que proceden de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico con u homólogo con secuencias correspondientes en anticuerpos que proceden de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando muestran las propiedades biológicas deseadas.
"Proteína de unión multivalente" se usa en el presente documento para referirse a una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión a antígeno (también denominado en el presente documento como "dominios de unión a antígeno"). Una proteína de unión multivalente se modifica por ingeniería preferentemente para que tenga tres o más sitios de unión a antígeno y no es, en general, un anticuerpo de origen natural. La expresión "proteína de unión multivalente" se refiere a una proteína de unión que puede unir dos o más dianas relacionadas o no relacionadas, que incluye una proteína de unión capaz de unir dos o más epítopos distintos de la misma molécula diana.
"Anticuerpo recombinante" y "anticuerpos recombinantes" se refieren a anticuerpos preparados mediante una o varias etapas, que incluye la clonación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican la totalidad o una parte de uno o varios anticuerpos monoclonales en un vector de expresión apropiado, por técnicas recombinantes y, posteriormente, la expresión del anticuerpo en una célula hospedadora apropiada. Los términos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales producidos de forma recombinante, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados (total o parcialmente humanizados), estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpos, anticuerpos bifuncionales, Ab heteroconjugados, Ig DVD®s y otros anticuerpos como se describen en (i) en el presente documento. (Inmunoglobulinas de dominio variable doble y métodos para prepararlas se describen en Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25:1290-1297 (2007)). La expresión "anticuerpo bifuncional", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que comprende un primer brazo que tiene una especificidad para un sitio antigénico y un segundo brazo que tiene una especificidad para un sitio antigénico diferente, es decir, los anticuerpos bifuncionales tienen doble especificidad.
"Muestra", "muestra del ensayo", "espécimen", "muestra que proviene de un paciente" y "muestra de paciente" tal como se usan en el presente documento, se pueden usar indistintamente y pueden ser una muestra de sangre, tejido, orina, suero, plasma, fluido amniótico, líquido cefalorraquídeo, células o tejido de la placenta, células endoteliales, leucocitos o monocitos. La muestra se puede utilizar directamente tal y como se obtiene a partir de un paciente o se puede tratar previamente, tal como mediante filtración, destilación, extracción, concentración, centrifugación, inactivación de componentes que interfieren, adición de reactivos y formas similares, para modificar el carácter de la muestra de alguna de las maneras que se han descrito en el presente documento o de otra manera tal y como se conoce en la técnica.
Cualquier tipo de célula, tejido o fluido corporal se puede utilizar para obtener una muestra. Tales tipos de células, tejidos y fluido pueden incluir secciones de tejidos tales como muestras de biopsia y autopsia, secciones congeladas tomadas para fines histológicos, sangre (tal como sangre entera), plasma, suero, esputo, heces, lágrimas, moco, saliva, fluido de lavado broncoalveolar (LBA), cabello, piel, glóbulos rojos, plaquetas, fluido intersticial, fluido de cristalino ocular, líquido cefalorraquídeo, sudor, fluido nasal, fluido sinovial, menstruación, fluido amniótico, semen, etc. Los tipos de células y tejidos también pueden incluir fluido linfático, fluido ascético, fluido ginecológico, orina, fluido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, un fluido recogido mediante lavado vaginal o fluido recogido mediante enjuagado vaginal. Se puede proporcionar un tejido o tipo de células retirando una muestra de las células de un animal, pero también se puede conseguir mediante el uso de células previamente aisladas (por ejemplo, aisladas por otra persona, en otro momento y/o para otro fin). También se pueden utilizar tejidos de archivo, tales como aquellos que tienen historial de tratamiento o de resultados. El aislamiento y/o la purificación de proteínas o nucleótidos puede que no se necesario.
"Repetición de consenso corta" o "SCR", tal y como se emplea indistintamente en el presente documento, se refiere a una estructura basada en una disposición beta-sándwich donde una cara está conformada a partir de tres cadenas beta unidas por hidrógeno para formar una región encadenada triple en su centro y la otra cara conformada a partir de dos cadenas beta por separado. La SCR también denominada módulos de proteína de control del complemento (CCP) y dominios sushi. Las SCR existen en una amplia variedad de proteínas de complementos y de adhesión. Tal y como se utiliza en el presente documento, “SCR19” se refiere al dominio de repetición de consenso corta 19 y “SCR19-20” se refiere a los dominios de repetición de consenso corta 19 y 20, unidos covalentemente entre sí como en la molécula parental, FHC.
"Unión específica" o "que une específicamente", tal y como se usa en el presente documento se refiere a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido con una segunda especie química, en donde la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o un epítopo) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica específica en lugar de a las proteínas en general. Si un anticuerpo es específico de un epítopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epítopo A (o A libre, no marcado), en una reacción que contiene el marcador "A" y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.
"Sujeto" y "paciente", tal como se usan en el presente documento indistintamente,se refiere a cualquier vertebrado, que incluye, pero sin limitación, un mamífero (por ejemplo, vaca, cerdo, camello, llama, caballo, cabra, conejo, oveja, hámster, cobaya, gato, perro, rata y ratón, primate no humano (por ejemplo, un mono, tal como mono cinomolgo o rhesus, un chimpancé, etc.) y un ser humano). En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un humano o un no humano. El sujeto o paciente puede estar sometiéndose a otras formas de tratamiento.
"Región diana" o "diana molecular" tal como se usa en el presente documento indistintamente se refiere a una región de FHC a la que, por ejemplo, se pueden unir inhibidores del FHC, tales como el anticuerpos anti-FHC. Por ejemplo, la región diana puede incluir SCR 19 y/o la secuencia de aminoácidos de PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3). La región diana puede incluir un péptido de 15 meros de GPPPPIDNGDITSFP (SEQ ID NO: 114).
"Tratar", "tratando" o "tratamiento" se emplea cada uno de forma indistinta en el presente documento para describir, revertir, aliviar o inhibir el progreso de una enfermedad o uno o varios síntomas de tal enfermedad, a la que se aplica tal término. Dependiendo del estado del sujeto, el término también se refiere a prevenir una enfermedad, e incluye la prevención del inicio de una enfermedad o prevenir los síntomas asociados con una enfermedad. Un tratamiento puede llevarse a cabo ya sea en una forma aguda o crónica. El término también se refiere a reducir la gravedad de una enfermedad o los síntomas asociados con tal enfermedad antes de padecer la enfermedad. Tal prevención o reducción de ese tipo de la gravedad de una enfermedad antes de padecerla, se refiere a la administración de una composición de anticuerpo o farmacéutica de la presente invención a un sujeto que en el momento de la administración no padece la enfermedad. "Prevención" también se refiere a la prevención de la recurrencia de una enfermedad o de uno o varios síntomas asociados con tal enfermedad. "Tratamiento" y "terapéuticamente", se refieren al acto de tratar, tal y como se ha definido "tratar" anteriormente.
"Variante" se utiliza en el presente documento para describir un péptido o un polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, deleción o sustitución conservadora de aminoácidos, pero que conserva al menos una actividad biológica. Ejemplos representativos de "actividad biológica" incluyen la capacidad de unirse a un anticuerpo específico o para promover una respuesta inmune. Variante también se utiliza en el presente documento para describir una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína de referencia con una secuencia de aminoácidos que conserva al menos una actividad biológica. Una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, la sustitución de un aminoácido por un aminoácido diferente con propiedades similares (por ejemplo, hidrofilia, grado y distribución de las regiones cargadas) se reconoce en la técnica porque implica normalmente un cambio menor. Estos cambios menores se pueden identificar, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, tal y como se entiende en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol.
157:105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en la consideración de su hidrofobicidad y carga. Se conoce en la técnica que los aminoácidos con índices hidropáticos similares se pueden sustituir y todavía conservan la función proteica. En un aspecto, los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2 están sustituidos. La hidrofilia de los aminoácidos también se puede utilizar para revelar sustituciones que darían como resultado proteínas que conservan una función biológica. Una consideración de la hidrofilia de los aminoácidos en el contexto de un péptido, permite el cálculo de la mayor hidrofilia promedio local de ese péptido, una medida útil que se ha descrito que se correlaciona bien con la antigenicidad y la inmunogenicidad. La patente de Estados Unidos n.° 4.554.101, se incorpora en su totalidad en el presente documento por referencia. La sustitución de aminoácidos que tienen valores de hidrofilia similares puede dar como resultado péptidos que conservan una actividad biológica, por ejemplo la inmunogenicidad, tal y como se entiende en la técnica. Las sustituciones se pueden realizar con aminoácidos que tienen valores de hidrofilia de ±2 ambos. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilia de los aminoácidos están influenciados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. En consonancia con esta observación, las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica se entiende que dependerán de la similitud relativa de los aminoácidos y particularmente de las cadenas laterales de los aminoácidos, según lo revelado por la hidrofobicidad, hidrofilia, carga, tamaño y otras propiedades. "Variante" también se puede utilizar para referirse a un fragmento antigénicamente reactivo de un anticuerpo anti-FHC que difiere del fragmento correspondiente del anticuerpo anti-FHC en la secuencia de aminoácidos, pero que todavía es antigénicamente reactivo y puede competir con el fragmento correspondiente de anticuerpo anti-FHC para unirse con el FHC. "Variante" se puede utilizar también para describir un polipéptido o un fragmento del mismo que se ha procesado de forma diferencial, tal como por proteólisis, fosforilación o cualquier otra modificación post-traduccional, pero que conserva su reactividad con el antígeno.
Salvo que se defina de otra forma en el presente documento, los términos científicos y términos utilizados vinculados con la presente divulgación deberán tener los significados que entienden comúnmente las personas normalmente expertas en la técnica. Por ejemplo, cualquier nomenclatura usada vinculada con, y las técnicas de, cultivo celular y cultivo de tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y de ácidos nucleicos descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. El significado y ámbito de los términos debe ser claro, en el caso, sin embargo, de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en el presente documento prevalecen sobre cualquier definición de diccionario o extrínseca. Además, salvo que se requiera de otra forma por el contexto, los términos singulares deberán incluir las formas plurales y los términos plurales deberán incluir el singular.
2. Inhibidores del FHC
En el presente documento se proporcionan inhibidores para su uso en métodos de tratamiento de cáncer, tal como cáncer de pulmón. El inhibidor puede ser un anticuerpo aislado o una molécula pequeña que se une específicamente a FHC, tal como una forma reducida de FHC o fragmentos del mismo.
a. FHC
El factor H del complemente es uno de una clase de factores inhibidores del complemente que protegen células tanto normales como tumorales del ataque y la destrucción por la ruta de complemento alternativa inactivando C3b, una proteína que es esencial para la formación de un complejo lítico celular sobre una superficie celular. La función principal del FHC es inhibir la ruta alternativa de la lisis mediada por complemento. El FHC evita la deposición de proteína de complemento C3b sobre la superficie celular (a) actuando como un cofactor para el factor de complemento I (CFI), una proteasa que escinde C3b, y (b) evitando la formación y acelerando la decadencia de la enzima que forma C3b desde su precursor, C3. La deposición de C3b inicia la formación del complejo de ataque a membrana lítica celular, lo que lleva a la lisis celular; por tanto, el control de la deposición de C3b sobre la superficie celular mediante el FHC protege frente a la lisis celular. El FHC participa con C3b (o C3b degradado, denominado C3d) sobre superficies celulares de mamífero que contienen glicosoaminoglicanos y ácido siálico, al contrario de las superficies bacterianas que carecen de estos grupos, mediando, de este modo, la discriminación diana. Además de proteger las células hospedadoras normales, el FHC ha mostrado proteger las células tumorales, incluidas aquellas de células de NSCLC, glioblastoma y cáncer de colon, del ataque del complemento.
EL FHC humano puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos:
MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLR KCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENG KIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERF QYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKC TSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPC LRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISES QYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGY ESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSP DLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPE LEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILEEHLKNK KEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLI QEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSP PQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFENAIPM GEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQ CRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITC RNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCA KR (SEQ ID NO: 1; UniProt P08603). El FHC puede estar reducido o no reducido.
El FHC humano puede ser un fragmento o una variante de SEQ ID NO: 1. El fragmento o variante puede ser una forma reducida o no reducida. El fragmento de FHC puede tener de entre 5 a 1.230 aminoácidos, entre 10 y 1.000 aminoácidos, entre 10 y 750 aminoácidos, entre 10 y 500 aminoácidos, entre 50 y 400 aminoácidos, entre 60 y 400 aminoácidos, entre 65 y 400 aminoácidos, entre 100 y 400 aminoácidos, entre 150 y 400 aminoácidos, entre 100 y 300 aminoácidos o entre 200 y 300 aminoácidos de longitud. El fragmento puede comprender un número contiguo de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
El fragmento de FHC humano puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos: GKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLH (SEQ ID NO: 2), que se corresponde con los aminoácidos 1107-1165 de SEQ ID NO: 1. El fragmento de FHC humano puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos GPPPPIDNGDITSFP (SEQ ID NO: 114).
(1) Forma reducida de FHC
La forma reducida del FHC puede revelar un epítopo críptico o región diana críptica. El epítopo o región diana puede revelarse solo sobre la superficie de células tumorales. El FHC puede ser un autoantígeno debido a la presentación del epítopo críptico en el microentorno tumoral. Los tumorales de NSCLC muestran niveles elevados de tiorredoxina, el factor inhibidor de la migración de macrófagos de disulfuro reductasa y tioles no proteicos tales como cisteína reducida y glutatión. Estos factores contribuyen a la producción de un entorno más reductor en el tumor que en tejidos normales. Por tanto, el/los epítopo(s) anti-FHC pueden estar escondidos o solo expuestos cuando se reduce la proteína en el espacio intratumoral. Como alternativa, una vez la forma soluble del FHC se une a la célula tumoral, la proteína puede desdoblarse y unirse en una conformación específica a célula tumoral de modo que se vuelve antigénica; la reducción in vitro puede simplemente poner el FHC en una conformación que imite este estado.
(2) Región diana
La región diana para el inhibidor del FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC, que puede ser críptica, puede ser SCR 19 (SEQ ID NO: 2), que está implicada en la función del f Hc . SCR19 contiene sitios de unión de C3b/C3d y polianiones típicos de auto-superficies o superficies propias. SCR19 es un dominio que está implicado en la función protectora de células hospedadores del FHC ya que está implicada en la unión de la porción C3d de C3b. La región diana puede ser un epítopo de PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3), que reside en SCR19. La región diana puede incluir el resto D1119 de SEQ ID NO: 1, que también es un resto 6 de SEQ ID NO: 3. La región diana puede incluir el péptido de 15 meros de GPPPPIDNGDITSFP (SEQ ID NO: 114)
b. Anticuerpos de reconocimiento del FHC
El anticuerpo es un anticuerpo que se une a la forma reducida del FHC, un fragmento del mismo, un epítopo del FHC o una variante del mismo. El anticuerpo puede ser un fragmento del anticuerpo anti-FHC o una variante o un derivado del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo madurado por afinidad, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano o un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab o una mezcla del mismo. Fragmentos de anticuerpo o derivados pueden comprender fragmentos de F(ab')2, Fv o scFv. Los derivados de anticuerpos pueden producirse mediante peptidomimética. Los anticuerpos anti-FHC pueden ser anticuerpos procedentes de seres humano. Asimismo, las técnicas descritas o la producción de anticuerpos de cadena sencilla se puede adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla. El anticuerpo puede o puede no generarse de una respuesta inmunitaria in vivo humana. Por ejemplo, el anticuerpo puede o no puede ser un autoanticuerpo.
Los anticuerpos anti-FHC puede ser un anticuerpo anti-FHC quimérico o anti-FHC humanizado. En una realización, tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico son monovalentes. En una realización, tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico comprenden una única región Fab unida a una región Fc. Los anticuerpos humanos pueden proceder de tecnología de presentación de fagos o de ratones transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana. El anticuerpo puede generarse como resultado de una respuesta inmunitaria in vivo humana y aislarse. Véase, por ejemplo, Funaro et al., BMC Biotechnology, 2008(8): 85. Por lo tanto, el anticuerpo puede ser un producto del repertorio humano y no del animal. Debido a su origen humano, se pueden minimizar los riesgos de reactividad frente a propios antígenos. Como alternativa, se pueden utilizar bibliotecas de presentación de levaduras estándar y tecnologías de presentación para seleccionar y aislar anticuerpos anti-FHC humanos. Por ejemplo, se pueden usar bibliotecas de fragmentos de variable de cadena sencilla (scFv) humanos sin tratamiento para seleccionar anticuerpos anti-FHC humano. Se pueden usar animales transgénicos para expresar anticuerpos humanos.
Los anticuerpos humanizados pueden ser moléculas de anticuerpos de un anticuerpo de especie no humana que se une al antígeno deseado que tiene una o más regiones de determinación de complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones estructurales de una molécula de inmunoglobulina humana.
El anticuerpo es distinguible de anticuerpos conocidos por que posee distinta(s) función(es) biológica(s) que la(s) conocida(s) en la técnica.
(1) Epítopo
Un anticuerpo del FHC puede unirse específicamente a una forma reducida o no reducida de cualquiera uno o más de epítopos dentro de las SEQ ID NO:1-3, 114, o 119-132, un fragmento del mismo o una variante del mismo. El anticuerpo puede reconocer inmunoespecíficamente y unirse a al menos tres aminoácidos, al menos cuatro aminoácidos, al menos cinco aminoácidos, al menos seis aminoácidos o al menos siete aminoácidos dentro del péptido de epítopo de PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3) o GPPPPIDNGDITSFP (SEQ ID NO: 14). El anticuerpo puede inmunoespecíficamente reconocer o unirse un epítopo que tiene al menos tres aminoácidos contiguos, al menos cuatro aminoácidos contiguos, al menos cinco aminoácidos contiguos, al menos seis aminoácidos contiguos, al menos siete aminoácidos contiguos, al menos ocho aminoácidos contiguos, al menos nueve aminoácidos contiguos o al menos diez aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1 o 2. Los aminoácidos contiguos puede incluir el aminoácido D1119 de SEQ ID NO: 1.
(2) Características de unión de anticuerpos
El anticuerpo puede unirse inmunoespecíficamente a FHC (SEQ ID NO: 1), SCR19 (SEQ ID NO: 2), la secuencia de aminoácidos de PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3), la secuencia de aminoácidos de GPPPPIDNGDITSFP (SEQ ID NO: 114), un fragmento del mismo o una variante del mismo y tener una velocidad de disociación (kd) de aproximadamente 1,0 x 10-4 s-1 o menos, aproximadamente 1,0 x 10-5 s-1 o menos, aproximadamente 5,0 x 10-6 s-1 o menos, aproximadamente 1,0 x 10-6 s-1 o menos, aproximadamente 5,0 x 10-7 s-1 o menos, aproximadamente 1,0 x 10-7 s-1 o menos, aproximadamente 5,0 x 10-8 s-1 o menos, aproximadamente 1,0 x 10-8 s-1 o menos, aproximadamente 1,0 x 10-9 s-1 o menos, aproximadamente 1,0 x 10-10 s-1 o menos, aproximadamente 1,0x10-12 s-1 o menos, aproximadamente 1,0 x 10-12 s-1 o menos o tiene una kd que varía de aproximadamente 1,0 x 10' s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-4 s-1, aproximadamente 1,0 x 10-12 s-1s a aproximadamente 1,0 x 10-5 s-1, aproximadamente 1,0 x 10-12 s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-6 s-1, aproximadamente 1,0 x 10-12 s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-7 s-1, aproximadamente 1,0 x 10-12 s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-8 s-1 aproximadamente 1.0 x 10-12 s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-9 s-1, aproximadamente 1,0 x 10-12 s-1 a aproximadamente 1,0 x 10■1° s-1, aproximadamente 1,0 x 10■1° s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-4 s-1, aproximadamente 1,0 x 10■1° s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-5 s-1, aproximadamente 1,0 x 10■1° s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-6 s-1, aproximadamente 1,0 x 10■1° s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-7 s-1, aproximadamente 1,0 x 10■1° s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-8 s-1, aproximadamente 1,0 x 10-8 s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-4 s-1s, aproximadamente 1,0 x 10-8 s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-5 s-1s, aproximadamente 1,0 x 10-8 s-1s a aproximadamente 1,0 x 10-6 s-1, aproximadamente 1,0 x 10-8 s_1 a aproximadamente 1,0 x 10‘7 s-1, aproximadamente 1.0 x 10‘7 s_1 a aproximadamente 1,0 x 10‘4 s-1, aproximadamente 1,0 x 10‘7 s_1 a aproximadamente 1,0 x 10‘5 s_1 o aproximadamente 1,0 x 10-7 s-1 a aproximadamente 1,0 x 10-6 s-1. El fragmento puede ser SEQ ID NO: 114 o SEQ ID NO: 115.
El anticuerpo puede unirse inmunoespecíficamente a FHC (SEQ ID NO: 1), SCR19 (SEQ ID NO: 2), la secuencia de aminoácidos de PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3), la secuencia de aminoácidos de GPPPPIDNGDITSFP (SEQ ID NO: 114), un fragmento del mismo o una variante del mismo y tiene una velocidad de asociación (ka) de al menos aproximadamente 1,0 x 103 M-1s-1, al menos aproximadamente 1,0 x 104 M-1s-1, al menos aproximadamente 5,0 x 104 M-1s-1, al menos aproximadamente 1,0 x 105 M-1s-1, al menos aproximadamente 2,0 x 105 M-1s-1, al menos aproximadamente 3,0 x 105 M-1s-1, al menos aproximadamente 4,0 x 105 M-1s-1, al menos aproximadamente 5,0 x 105 M-1s-1, al menos aproximadamente 6,0 x 105 M-1s-1, al menos aproximadamente 1,0 x 106 M-1s-1, al menos aproximadamente 1,0 x 107 M-1s-1, al menos aproximadamente 1,0 x 108 M-1s-1 o tiene una ka que varía de aproximadamente 1,0 x 103 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 108 M-1s-1 aproximadamente 1,0 x 104 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 108 M-1s-1, aproximadamente 1,0 x 105 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 108 M-1s-1, aproximadamente 1,0 x 106 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 108 M-1s-1, aproximadamente 1,0 x 107 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 108 M-1s-1, aproximadamente 1,0 x 103 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 107 M-1s-1, aproximadamente 1,0 x 104 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 107 M-1s-1, aproximadamente 1,0 x 105 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 107 M-1s-1, aproximadamente 1,0 x 106 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 107 M-1s-1, aproximadamente 1,0 x 104 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 107 M-1s-1, aproximadamente 1,0 x 104 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 106 M-1s-1, aproximadamente 1,0 x 104 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 105 M-1s-1, aproximadamente 1,0 x 105 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 107 M-1s-1 o aproximadamente 1,0 x 105 M-1s-1 a aproximadamente 1,0 x 106 M-1s-1. El fragmento puede ser SEQ ID NO: 114 o s Eq ID NO: 115.
El anticuerpo puede unirse inmunoespecíficamente a FHC (SEQ ID NO: 1), SCR19 (SEQ ID NO: 2), la secuencia de aminoácidos de PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3), la secuencia de aminoácidos de GPPPPIDNg DiTSFP (SEQ ID NO: 114), un fragmento del mismo o una variante del mismo y tiene una afinidad (Kd) de al menos aproximadamente 1.0 x 10-15 M, al menos aproximadamente 1,0 x 10-14 M, al menos aproximadamente 1,0 x 10-13 M, al menos aproximadamente 1,5 x 10-13 M, al menos aproximadamente 1,0 x 10-12 M, al menos aproximadamente 1,6 x 10-12 M, al menos aproximadamente 1,7 x 10-12 M, al menos aproximadamente 1,8 x 10-12 M, al menos aproximadamente 1,9 x 10-12 M, al menos aproximadamente 2,0 x 10-12 M, al menos aproximadamente 2,1 x 10-12 M, al menos aproximadamente 2,2 x 10-12 M, al menos aproximadamente 2,3 x 10-12 M, al menos aproximadamente 2,4 x 10-12 M, al menos aproximadamente 2,5 x 10-12 M, al menos aproximadamente 2,6 x 10-12 M, al menos aproximadamente 2,7 x 10-12 M, al menos aproximadamente 2,8 x 10-12 M, al menos aproximadamente 2,9 x 10-12 M, al menos aproximadamente 3,0 x 10-12 M, al menos aproximadamente 5,0 x 10-12 M, al menos aproximadamente 1,0 x 10-11 M, al menos aproximadamente 1,5 x 10-11 M, al menos aproximadamente 5,0 x 10-11 M, al menos aproximadamente 1,0 x 10-10 M, al menos aproximadamente 5,0 x 10-10 M, al menos aproximadamente 1,0 x 10-9 M, o tiene una Kd que varía de aproximadamente 1,0 x 10-15 M a aproximadamente 1,0 x 10-9 M, aproximadamente 1,0 x 10-15 M a aproximadamente 1,0 x 10-10 M, aproximadamente 1,0 x 10-15 M a aproximadamente 1,0 x 10-11 M, aproximadamente 1.0 x 10-15 M a aproximadamente 1,0 x 10-12 M, aproximadamente 1,0 x 10-15 M a aproximadamente 1,0 x 10-13 M, aproximadamente 1,0 x 10-14 M a aproximadamente 1,0 x 10-9 M, aproximadamente 1,0 x 10-14 M a aproximadamente 1,0 x 10-10 M, aproximadamente 1,0 x 10-14 M a aproximadamente 1,0 x 10-11 M, aproximadamente 1.0 x 10-14 M a aproximadamente 1,0 x 10-12 M, aproximadamente 1,0 x 10-14 M a aproximadamente 1,0 x 10-13 M, aproximadamente 1,0 x 10-13 M a aproximadamente 1,0 x 10-9 M, aproximadamente 1,0 x 10-13 M a aproximadamente 1,0 x 10-10 M, aproximadamente 1,0 x 10-13 M a aproximadamente 1,0 x 10-11 M, aproximadamente 1.0 x 10-13 M a aproximadamente 1,0 x 10-12 M, aproximadamente 1,0 x 10-12 M a aproximadamente 1,0 x 10-9 M, aproximadamente 1,0 x 10-12 M a aproximadamente 1,0 x 10-10 M, o aproximadamente 1,0 x 10-12 M a aproximadamente 1,0 x 10-11 M. El fragmento puede ser SEQ ID NO: 114 o SEQ ID NO: 115.
La unión del anticuerpo al FHC puede ser sensible a la forma reducida del FHC. El anticuerpo que es sensible la forma reducida de FHC significa que la afinidad de unión del anticuerpo al FHC cambia dependiendo de si el FHC se encuentra en la forma reducida o en la forma no reducida. Por ejemplo, un anticuerpo cuya unión es sensible al FHC que se encuentra en la forma reducida o forma no reducida puede tener una afinidad de unión inferior al FHC si el FHC no se encuentra en la forma reducida. Como alternativa, un anticuerpo cuya unión es sensible al FHC que se encuentra en la forma reducida o forma no reducida puede tener una afinidad de unión inferior al FHC si el FHC se encuentra en la forma reducida. Un anticuerpo que es sensible al FHC que se encuentra en la forma reducida o forma no reducida significa que la afinidad de unión del anticuerpo a FHC no cambia si el FHC se encuentra en la forma reducida o en la forma no reducida.
c. Secuencias de cadena pesada y ligera
El anticuerpo puede unirse inmunoespecíficamente a FHC (SEQ ID NO: 1), SCR19 (SEQ ID NO: 2), la secuencia de aminoácidos de PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3), la secuencia de aminoácidos de GPPPPIDNGDITSFP (SEQ ID NO: 114), un fragmento del mismo o una variante del mismo y comprenden una cadena pesada variable (VH) y/o una cadena ligera variable (VL) que se muestra en las Tablas 1 y 2. El anticuerpo puede tener una región HCDR3 como se ha indicado por los restos de aminoácidos subrayados en las Tablas 1 y 2. La cadena ligera del anticuerpo puede ser una cadena kappa (VLk) una cadena lambda (VLl).
Tabla 1
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__________________________
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Tabla 2
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El anticuerpo o variante o derivado del mismo puede contener una o más secuencias de aminoácidos que son superiores al 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 % o 50 % idéntico a uno o más de SEQ ID NO: 4-31. El anticuerpo o variante o derivado del mismo puede estar codificado por una o más secuencias de ácidos nucleicos que son superiores al 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 % o 50 % idéntico a uno o más de SEQ ID NO: 32-48. La homología e identidad de polipéptidos puede determinarse, por ejemplo, mediante el algoritmo descrito en el informe: Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, 726-30 (1983). El anticuerpo, variante o derivado del mismo descritos en el presente documento puede estar codificado por un ácido nucleico que se hibrida en condiciones muy estrictas con el complemento de uno o más de SEQ ID NO: 32-48. El anticuerpo, variante o derivado del mismo puede estar codificado por un ácido nucleico que hibrida en condiciones muy estrictas con el complemento de uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más de SEQ ID NO:4-31. El anticuerpo puede ser una clase de molécula de IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2) o subclase.
d. Secuencias de nucleótidos
Se proporciona en el presente documento un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a FHC. un fragmento del mismo o una variante del mismo. El ácido nucleico aislado puede comprender una secuencia de nucleótidos que se hibrida, en condiciones muy estrictas, a la molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo que comprende una secuencia de cadena pesada o cadena ligera, tal como se muestra en las Tablas 1 y 2. El ácido nucleico aislado puede comprender una secuencia de nucleótidos, tal como se muestra en las Tablas 3 y 4.
Tabla 3
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Tabla 4
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e. Preparación/producción de anticuerpos
Se pueden preparar anticuerpos mediante cualquiera de una variedad de técnicas. En general, los anticuerpos se pueden producir mediante técnicas de cultivo celular, que incluyen la generación de anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales o mediante transfección de genes de anticuerpos, cadenas pesadas y/o cadenas ligeras en huéspedes celulares bacterianos o de mamíferos adecuados, para permitir la producción de anticuerpos, en donde los anticuerpos pueden ser recombinantes. Las diversas formas del término "transfección" están previstas para englobar una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospedadoras o bien procariotas o bien eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas es preferente y lo más preferente en células hospedadoras de mamífero, puesto que tales células eucariotas (y, en particular, células de mamífero) son más probables que las células procariotas en agruparse y segregar un anticuerpo adecuadamente plegado e inmunológicamente activo.
Células hospedadoras de mamífero ejemplares para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluidas células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)), usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982), células de mieloma NSO, células COS, células HEK 293T y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos se introducen en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células hospedadoras. Se pueden recuperar los anticuerpos del medio de cultivo usando métodos estándar de purificación de proteínas.
Las células hospedadoras también se pueden usar para producir fragmentos de anticuerpos funcionales, tales como fragmentos Fab, o moléculas scFv. Se comprenderá que se encuentran dentro del ámbito de la presente invención variaciones del anterior procedimiento. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula hospedadora con ADN que codifica fragmentos funcionales de o bien la cadena ligera y/o cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención. También se puede usar tecnología de ADN recombinante para retirar algo, o todo, del ADN que codifica cualquiera o ambas de las cadenas ligeras y pesada que no es necesaria para unirse a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas de tales moléculas de aDn truncadas también quedan englobadas por los anticuerpos de la invención. Además, se pueden producir anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo de la invención (es decir, se une a FHC humano) y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto de FHC humano reticulando un anticuerpo de la invención en un segundo anticuerpo mediante métodos de reticulación química estándar.
En un sistema preferente para la expresión recombinante de un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera de anticuerpos se introduce en células dhfr-CHO mediante transfección mediada con fosfato cálcico. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo se unen operativamente a elementos reguladores de potenciador de CMV/promotor de AdMFP para conducir altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen de DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando selección de metotraxato/amplificación. Las células hospedadores transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y se recupera anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se usan técnicas de biología molecular estándar para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Aún más, la invención proporciona un método de sintetización de un anticuerpo recombinante de la invención cultivando una célula hospedadora de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta que el anticuerpo recombinante de la invención se sintetiza. El método puede comprender adicionalmente aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo.
Los métodos de preparación de anticuerpos monoclonales implican la preparación de líneas celulares inmortales de producción de anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Tales líneas celulares pueden producirse de células del bazo obtenidas de un animal inmunizado. El animal puede estar inmunizado con FHC o un fragmento y/o variante del mismo Por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3 o 119-132, o una variante de SEQ ID NO: 1-3 o 119-132 se puede usar para inmunizar el animal. El antígeno de inmunización puede estar reducido o no reducido. Las células del bazo pueden entonces inmortalizarse mediante, por ejemplo, fusión con un elemento de fusión de célula de mieloma. Se pueden emplear una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células del bazo y células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y, a continuación, colocarse en placas a una baja densidad sobre un medio selectivo que soporte el crecimiento de células híbridas, aunque no células de mieloma. Una tal técnica usa selección de hipoxantina, aminopterina, timidina (HAT). Otra técnica incluye electrofusión. Después de un tiempo suficiente, normalmente aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan colonias sencillas y sus sobrenadantes de cultivo se someten a ensayo para su actividad de unión frente al polipéptido. Se pueden usar hibridomas que tienen una alta reactividad y especificidad.
Se pueden aislar anticuerpos monoclonales de los sobrenadantes de células de hibridomas en cultivo. Además, se pueden emplear diversas técnicas para potenciar el rendimiento, tal como inyección de la líne celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado adecuado, tal como un ratón. Los anticuerpos monoclonales pueden cultivarse, entonces, del fluido de ascitis o de la sangre. Se pueden retirar los contaminantes de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. La cromatografía de afinidad es un ejemplo de un método que se puede usar en un proceso para purificar los anticuerpos.
La enzima proteolítica papaína escinde preferentemente moléculas de IgG para proporcionar vario fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos F(ab)) cada uno comprende un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión a antígeno intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir moléculas de IgG para proporcioanr varios fragmentos, incluido el fragmento de F(ab')2 que comprende ambos sitios de unión a antígeno.
El fragmento Fv puede producirse mediante escisión proteolítica preferencial de una IgM y en raras ocasiones moléculas de inmunoglobulina de IgG o IgA. El fragmento Fv puede obtenerse mediante el uso de técnicas recombinantes. El fragmento Fv incluye un heterodímero VH::VL no covalente que incluye un sitio de unión a antígeno que retiene la mayor parte de las capacidades de reconocimiento y unión a antígeno de la molécula de anticuerpo nativa.
El anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado puede comprender un conjunto de región de determinación de complementariedad ("CDR") de cadena pesada y una cadena ligera, interpuesto respectivamente entre un conjunto de región estructural (“FR”) de cadena pesada y una cadena ligera que proporciona soporte a las CDR y define la relación espacial de las CDR con respecto entre sí. El conjunto CR puede contener tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o ligera. Desde el extremo N de una cadena pesada o ligera, estas regiones se indican como "CDR1", "CDR2", y "CDR3", respectivamente. El io de unión a antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y cadena ligera. Un polipéptido que comprende una única CDR, (por ejemplo, una CDR1, CDR2 o CDR3) puede denominarse como una "unidad de reconocimiento molecular". Los análisis cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo han demostrado que los restos de aminoácidos de las CDR forman un contacto extenso con el antígeno unido, en donde el contacto más extenso con el antígeno es con CDR3 de cadena pesada. Por tanto, las unidades de reconocimiento molecular son responsables principalmente de la especificidad de un sitio de unión a antígeno. En general, los restos de CDR están directamente y la mayoría sustancialmente implicados en influir en la unión a antígeno.
Se pueden usar otros métodos adecuados de producción o aislamiento de anticuerpos de la especificidad requerida, que incluyen, pero sin limitación a, métodos que seleccionan anticuerpo recombinante de una blibliteca de péptidos o proteínas (por ejemplo, pero sin limitación a, un bacteriófago, un ribosoma, un "oligonucleótido, un ARN, un ADNc, una levadura o similares, biblioteca de presentación); por ejemplo, como está disponible en diversos proveedores comerciales tales como Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido), MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del.), Biovation (Aberdeen, Escocia, Reino Unido) BioInvent (Lund, Suecia), usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase las patentes de Estados Unidos N.° 4.704.692; 5.723.323; 5.763.192; 5.814.476; 5.817.483; 5.824.514; 5.976.862. Procedimientos alternativos dependen de la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones SCID, Nguyen et al., (1997) Microbiol. Immunol. 41:901-907; Sandhu et al., (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118; Eren et al., (1998) Immunol. 93: 154-161 que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, tal como se conoce en la técnica y/o tal como se describe en el presente documento. Tales técnicas, incluyen, pero no se limitan a, presentación en ribosomas (Hanes et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 94:4937-4942; Hanes et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 95:14130-14135); tecnologías que producen anticuerpos de una sola célula (por ejemplo, el procedimiento de anticuerpo de linfocito seleccionado (“SLAM”) (patente de Estados Unidos N.° 5.627.052, Wen et al., (1987) J. Immunol. 17:887-892; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. (1996) 93: 7843-7848); microgota de gel y citometría de flujo (Powell et al., (1990) Biotechnol.; 8:333-337; One Cell Systems, (Cambridge, Mass); Gray et al., (1995) J. Imm. Meth.
182:155-163; Kenny et al., (1995) Bio. Technol. 13:787-790); selección de células B (Steenbakkers et al., (1994) Molec. Biol. Biol. Reports 19: 125-134 (1994)). En particular, se pueden obtener anticuerpos humanos frente a FHC, secuencias y caracterizar a partir de linfocitos B humanos periféricos usando métodos tal como se describe en Liao et al. (2013) Immunity 38(1): 176-186; Bonsignori et al. (2012) J Virol 86(21): 11521-11532; Moody et al. (2012) J Virol 86(14): 7496-7507; Gray et al. (2011) J Virol 85(15): 7719-7729; Morris et al. (2011) PLoS ONE 6(9): e23532; y Liao et al. (2009) J Virol Methods 158(1-2): 171-179.
Se puede producir un anticuerpo madurado por afinidad mediante cualquiera uno de una cantidad de procedimientos que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, vás Merks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992) describe maduración por afinidad mediante barajado de dominios de VH y VL. La mutagenis aleatoria de CDR y/o restos de región estructural se describe por Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992). La mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectiva y en contacto o posiciones de hipermutación con un resto de aminoácido potenciador de la actividad se describe en la patente de Estados Unidos N.° 6.914.128 B1.
Las variantes de anticuerpos de la presente invención también se pueden preparar suministrando un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente invención a un huésped adecuado tal como para proporcionar animales transgénicos o mamíferos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas y similares, que producen tales anticuerpos en su leche. Estos métodos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; y 5.304.489.
También se pueden preparar variantes de anticuerpos suministrando un polinucleótido de la presente invención para proporcionar plantas transgénicas y células vegetales cultivadas (por ejemplo, aunque sin limitarse a tabaco, maíz, y lenteja de agua) que producen dichos anticuerpos, partes o variantes especificadas en las partes de la planta o en células cultivadas de las mismas. Por ejemplo, Cramer et al., (1999) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 95-118y las referencias citadas en ese documento, describen la producción de hojas de tabaco transgénico que expresan grandes cantidades de proteínas recombinantes, por ejemplo, usando un promotor inducible. El maíz transgénico se ha usado para expresar proteínas de mamífero a niveles de producción comercial, con actividades biológicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas de fuentes naturales. Véase, por ejemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464: 127-147 y las referencias citadas en ese documento. Derivados de anticuerpos también se han producido en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgénicas, incluyendo fragmentos de anticuerpos, tales como anticuerpos monocatenarios (scFv), incluyendo de semillas de tabaco y tubérculos de patata. Véase, por ejemplo, Conrad et al., (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101-109 y referencia citadas en el presente documento. Por tanto, los anticuerpos de la presente divulgación también se pueden producir usando plantas transgénicas, de acuerdo con procedimientos conocidos.
Los derivados de anticuerpos pueden producirse, por ejemplo, añadiendo secuencias exógenas para modificar la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la unión, afinidad, tasa de asociación, tasa de disociación, avidez, especificidad, semivida, o cualquier otra característica adecuada. En general, parte o la totalidad de las secuencias de CDR no humanas o humanas se mantienen, mientras que las secuencias no humanas de las regiones variables y constantes se sustituyen con aminoácidos humanos o de otro tipo.
Los fragmentos de anticuerpos pequeños pueden ser diacuerpos que tienen dos sitios de unión a antígeno, en donde los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH VL). Véase por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448. Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. (Véase también, la patente de Estados Unidos N.° 6.632.926 de Chen et al., que describe variantes de anticuerpo que tienen uno o más aminoácidos insertados en una región hipervariable del anticuerpo parental y una afinidad de unión para un antígeno diana que es al menos aproximadamente dos veces más potente que la afinidad de unión del anticuerpo parental por el antígeno.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo lineal. El procedimiento para la fabricación de un anticuerpo lineal se conoce en la técnica y se describe en Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062. En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Los anticuerpos se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos conocidos que incluyen, pero sin limitación a, purificación de la proteína A, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. También puede usarse cromatografía líquida de alta resolución (“HPLC”) para la purificación.
Puede resultar útil etiquetar de forma detectable o terapéutica el anticuerpo. Los procedimientos para conjugar anticuerpos a estos agentes son conocidos en la técnica. Para fines ilustrativos solamente, los anticuerpos se pueden etiquetar con un resto detectable tal como un átomo radioactivo, un cromóforo, un fluoróforo, o similares. Dichos anticuerpos etiquetados se pueden usar para técnicas de diagnóstico, ya sea in vivo, o en una muestra de ensayo aislada. Los anticuerpos también se pueden conjugar, por ejemplo, a un agente farmacéutico, tal como fármaco quimioterapéutico o una toxina. Estos se pueden enlazar a una citoquina, a un ligando, a otro anticuerpo. Los agentes adecuados para el acoplamiento a anticuerpos para conseguir un efecto anti-tumoral incluyen citoquinas, tales como interleuquina 2 (IL-2) y factor de necrosis tumoral (TNF); fotosensibilizadores, para uso en terapia fotodinámica, incluyendo ftalocianina tetrasulfonato de aluminio (III), hematoporfirina, y ftalocianina; radionucleidos, tales como yodo-131 (1311), itrio-90 (90Y), bismuto-212 (212Bi), bismuto-213 (213Bi), tecnecio-99m (99mTc), renio-186 (186Re), y renio-188 (188Re); antibióticos, tales como doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, metotrexato, daunomicina, neocarzinostatina, y carboplatino; toxinas bacterianas, vegetales, y otras, tales como toxina de la difteria, exotoxina de pseudomonas A, enterotoxina A estafilocócica, toxina abrina-A, ricina A (ricina A desglicosilada y ricina natural A), toxina TGF-alfa, citotoxina de cobra China (naja naja atra), y gelonina (una toxina vegetal); proteínas inactivadoras del ribosoma de plantas, bacterias y hongos, tales como restrictocina (una proteína inactivadora del ribosoma producida por Aspergillus restrictus), saporina (una proteína inactivadora del ribosoma de Saponaria officinalis), y RNasa; inhibidores de la tirosina quinasa; ly207702 (un nucleósido de purina difluorado); liposomas que contienen agentes anti-quísticos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, plásmidos que codifican toxinas, metotrexato, etc.); y otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, tales como F(ab).
Los anticuerpos se pueden secuenciar y replicar mediante medios recombinantes o sintéticos. También se pueden secuenciar adicionalmente a la secuencia lineal de los nucleótidos que los codifican. Por consiguiente, la presente invención proporciona estos polinucleótidos, solos o en combinación con un vehículo, vector o célula hospedadora tal como se ha descrito anteriormente. que codifica una secuencia de un anticuerpo de la presente invención.
La producción de anticuerpos mediante el uso de tecnología de hibridomas, el procedimiento de anticuerpo de linfocito seleccionado (selected lymphocyte antibody method, SLAM) animales transgénicos y bibliotecas de anticuerpos recombinantes se describen en más detalle a continuación.
(1) Anticuerpos monoclonales anti-FHC mediante el uso de tecnología de hibridomas
Se pueden usar anticuerpos monoclonales usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen el uso de tecnologías de hibridomas, recombinantes y de presentación de fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales mediante le uso de técnicas de hibridomas que incluyen aquellas conocidas en la técnica y se enseñan, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Segunda Edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling, et al., En IMonoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, (Elsevier, N.Y., 1981). También se destaca que la expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridomas. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se obtiene de un único clon, que incluye cualquier clon eucariota, procariota o de fagos y no el método mediante el cual se produce.
En una realización, la presente invención proporciona métodos de generación de anticuerpos monoclonales así como anticuerpos producidos por el método. El método puede comprender cultivar una célula de hibridoma que segrega un anticuerpo de la invención en donde, preferentemente, el hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados de un mamífero, por ejemplo, una rata o un ratón, inmunizado con FHC con células de mieloma y, a continuación, seleccionando los hibridomas que resultan de la fusión para clones de hibridoma que segregan un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido. tal como GPPPPIDNGDITSFP(GGGK-biotina) (SEQ ID NO: 15). En resumen, se pueden inmunizar ratas con un antígeno de FHC. En una realización preferida, el antígeno de FHC se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Tales adyuvantes incluyen adyuvante de Freund completo o incompleto, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Tales adyuvantes pueden proteger al polipéptido de la dispersión rápida al capturarlo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulen al hospedador a secretar factores que son quimiotácticos de macrófagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferentemente, si se está administrando un polipéptido, el esquema de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, distribuidas durante varias semanas; sin embargo, también se puede usar una única administración del polipéptido.
Después de la inmunización de un animal con antígeno de FHC, se pueden obtener del animal anticuerpos y/o células productoras de anticuerpos. Se obtiene un suero que contiene anticuerpos anti-FHC del animal haciéndolo sangrar o sacrificándolo. El suero se puede usar tal como se obtiene del animal, se puede obtener una fracción de inmunoglobulina del suero o los anticuerpos anti-FHC se pueden purificar del suero. El suero o inmunoglobulinas obtenidos de este modo son policlonales, de este modo, tienen una disposición heterogénea de propiedades.
Una vez se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el FHC de antígeno en el suero de rata, se cultiva el bazo de rata y se aíslan los esplenocitos. A continuación, se fusionan los esplenocitos mediante técnicas bien conocidas en cualquiera células de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 disponible de la Colección de Cultivo de Tipos Americana (ATCC, Manassas, Va. EE.UU.). Los hibridomas se seleccionan y clonan mediante dilución limitada. Los clones de hibridoma se analizan, a continuación, mediante métodos conocidos en la técnica para células que segregan anticuerpos capaces de unir FHC. Fluido de ascitis, que contiene, generalmente, altos niveles de anticuerpos, se puede generar inmunizando ratas con clones de hibridoma positivo.
En otra realización, se pueden preparar hibridomas inmortalizados productores de anticuerpos a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal se sacrifica y las células B esplénicas se fusionan con células de mieloma inmortalizadas como bien se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, citado anteriormente. En una realización preferida, las células de mieloma no segregan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea celular no secretora). Después de la fusión y selección antibiótica, se seleccionan los hibridomas usando FHC o una porción del mismo, tal como GPPPPIDNGDITSFP(GGGK-biotina) (SEQ ID NO: 15), o una célula que expresa FHC. En una realización preferida, la selección inicial se realiza usando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoesnsayo (RIA), preferentemente un ELISA. Un ejemplo de selección de ELISA se proporciona en la publicación PCT n.° WO 00/37504.
Se seleccionan hibridomas productores de anticuerpos anti-FHC, se clonan y seleccionan adicionalmente para sus características deseables, incluido crecimiento robusto de hibridomas, alta producción de anticuerpos y características de anticuerpos deseables. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse in vivo en animales singéneicos, en animales que carecen de sistema inmunitario, por ejemplo, ratones lampiños o en cultivo celular in vitro. Los métodos de selección, clonación y expansión de hibridomas son bien conocidos para los expertos en la técnica.
En una realización preferida, los hibridomas son hibridomas de rata. En otra realización, los hibridomas se producen en una especie no humana, no de rata tal como ratones, ovejas, cerdos, cabras, ganado, conejos o caballos. En aún otra realización preferente, los hibridomas son hibridomas humanos, en los que se fusiona un mieloma no secretor humano con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-FHC.
Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, Se pueden producir fragmentos Fab y F(ab')2 de la invención mediante escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir dos fragmentos Fab idénticos) o pepsina (para producir un fragmento F(ab')2). Un fragmento F(ab')2 de una molécula de IgG retiene los dos sitios de unión a antígeno de la molécula de IgG más grande ("parental"), incluyendo ambas cadenas ligeras (que contienen las regiones de cadena ligera variable y de cadena ligera constante), los dominios CH1 de las cadenas pesadas y una región bisagra formadora de disulfuros de la molécula de IgG parental. Por consiguiente, un fragmentos F(ab')2 aún es capaz de reticular moléculas de antígeno como la molécula de IgG parental.
(2) Anticuerpos monoclonales anti-FHC que usan SLAM
En otro aspecto de la invención, se generan anticuerpos recombinantes a partir de linfocitos aislados, únicos mediante el uso de un procedimiento denominado en la técnica como el procedimiento de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM), tal como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 5.627.052; publicación PCT n.° WO 92/02551; y Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7843-7848 (1996). En este método, células únicas que segregan anticuerpos de interés, por ejemplo, linfocitos procedentes de cualquiera uno de los animales inmunizados se seleccionan usando un ensayo de placas hemolítico específico a antígeno, en donde el FHC de antígeno, una subunidad de FHC o un fragmento del mismo, se acopla a glóbulos rojos de oveja usando un enlazador, tal como biotina, y se usa para identificas células únicas que segregan anticuerpos con especificidad para FHC. Después de la identificación de las células secretoras de anticuerpos de interés, se recuperan los ADNc de región variable de cadena pesada y ligera de las células mediante PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) y estas regiones variables se pueden, a continuación, expresar, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina adecuadas (por ejemplo, regiones constantes humanas), en células hospedadoras de mamíferos, tales como células COS o c Ho . Las células hospedadoras transfectadas con secuencias de inmunoglobulina amplificadas procedentes de linfocitos seleccionados in vivo, puede, a continuación, someterse a análisis y selección adicional in vitro, por ejemplo, seleccionando las células transfectadas para ailar células que expresan anticuerpos al FHC. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas se pueden manipular adicionalmente in vitro, tal como mediante métodos de maduración por afinidad in vitro. Véase, por ejemplo, publicación PCT n.° WO 97/29131 y publicación PCT n.° WO 00/56772.
(3) Anticuerpos monoclonales anti-FHC mediante el uso de animales transgénicos
En otra realización de la invención, se producen anticuerpo inmunizando un animal no humano que comprende algo, o todo, del locus de la inmunoglobulina humana con un antígeno del FHC. En una realización, el animal es un ratón transgénico de XENOMOUSE®, una cepa de ratón por ingeniería genética que comprende grandes fragmentos de los loci de inmunoglobulina humana y es deficiente en la producción de anticuerpos de ratón. Sec, por ejemplo, Green et al., Nature Genetics, 7: 13-21 (1994) y patentes de los EE.UU. n.° 5.916.771; 5.939.598; 5.985.615; 5.998.209; 6.075.181; 6.091.001; 6.114.598; y 6.130.364. Véase también las publicaciones PCT n.° WO 91/10741; WO 94/02602; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 98/16654; WO 98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031; WO 99/53049; WO 00/09560; y WO 00/37504. El ratón transgénico de XENOMOUSE® produce un repertorio humano tipo adulto de anticuerpos completamente humanos y genera anticuerpos monoclonales humanos específicos a antígeno. El ratón transgénico de XENOMOUSE® contiene aproximadamente un 80 % del repertorio de anticuerpos humanos mediante la introducción de fragmentos YAK de configuración de línea germinal con tamaño megabase, de los loci de cadena pesada humanos y loci de cadena ligera x. Véase Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997), Green y Jakobovits, J. Exp. Med., 188: 483-495 (1998).
(4) Anticuerpos monoclonales anti-FHC mediante el uso de bibliotecas de anticuerpos recombinantes
También se pueden usar métodos in vitro para producir los anticuerpos de la invención, en donde se selecciona una biblioteca de anticuerpos para identificar un anticuerpo que tiene la especificidad de unión de FHC deseada. Los métodos para tal selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes son bien conocidos en la técnica e incluyen métodos descritos en, por ejemplo, patente de EE.UU. n.° 5.223.409 (Ladner et al.); publicación PCT n.° Wo 92/18619 (Kang et al ); publicación PCT n.° WO 91/17271 (Dower et al.); publicación PCT n.° WO 92/20791 (Winter et al.); publicación p Ct n.° WO 92/15679 (Markland et al.); publicación PCT n.° WO 93/01288 (Breitling et al.); publicación PCT n.° WO 92/01047 (McCafferty et al.); publicación PCT n.° WO 92/09690 (Garrard et al.); Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al, EMBO J., 12: 725-734 (1993); Hawkins et al, J. Mol. Biol, 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978­ 7982 (1991); la publicación de solicitud de patente de los EE.UU. n.° 2003/0186374; y publicación PCT n.° WO 97/29131.
La biblioteca de anticuerpos recombinantes puede ser de un sujeto inmunizado con FHC o una porción de FHC. Como alternativa, la biblioteca de anticuerpos recombinantes puede ser un sujeto sin tratamiento, es decir, uno que no se ha inmunizado con FHC. tal como una biblioteca de anticuerpos humanos de un sujeto humano que no ha sido inmunizado con FHC humano. Los anticuerpos de la invención se seleccionan cribando la biblioteca de anticuerpos recombinantes con el péptido que comprende FHC humano para seleccionar, de este modo, aquellos anticuerpos que reconocen FHC. Los métodos para llevar a cabo tal cribado y selección son bien conocidos en la técnica, tal como se describe en las referencias en el párrfo anterior. Para seleccionar anticuerpos de la invención que tengan afinidades de unión particulares para FHC, como las de disociación de FHC humano con una constante de tasa de Koff particular, se puede usar el método conocido en la técnica de resonancia de superficie de plasmón para seleccionar anticuerpos que tengan la contante de tasa de Koff deseada. Para seleccionar anticuerpos de la invención que tengan una actividad neutralizante particular para FHC, tal como aquellos con una CI50 particular, se pueden usar métodos estándar conocidos en la técnica para evaluar la inhibición de la actividad el FHC.
En un aspecto, la invención pertenece a un anticuerpo aislado o a una porción de unión a antígeno del mismo, que se une a FHC humano. Preferentemente, el anticuerpo es un agente neutralizante. En diversas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal.
Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar usando diversos métodos de presentación de fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación de fagos, se presentan dominios de anticuerpos funcionales sobre la superficie de las partículas de fago que portan las secuencias de polinucleótidos que los codifican. Tal fago se puede utilizar para presentar dominios de unión a antígeno expresado desde un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humana o murina). Un fago que expresa un dominio de unión a antígeno que une el antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o perla. El fago empleado en estos métodos es normalmente un fago filamentoso que incluye dominios de unión a fd y M13 expresado desde fago con Fab, Fv o dominios de anticuerpo Fv estabilizado con disulfuro fusionado de forma recombinante con o bien la proteína de fago del gen III o bien el gen VIII. Ejemplos de métodos de presentación de fagos que se pueden usar para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos en Brinkmann et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods, 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene, 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191­ 280 (1994); publicación PCT n.° WO 92/01047; publicaciones PCT n.° WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y patentes de Estados Unidos números 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743; y 5.969.108.
Como se ha descrito en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones codificantes de anticuerpos del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanizados, o cualquier otro fragmento deseado, y expresarse en cualquier hospedador deseado, incluyendo células de mamífero células de insecto, células vegetales, levadura y bacterias, por ejemplo, como se describe en detalle posteriormente. Por ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir de forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 usando métodos conocidos en la técnica tales como los desvelados en la publicación de PCT n.° WO 92/22324; Mullinax, R.L. et al., BioTechniques, 12(6): 864-869 (1992); Sawai et al., Am. J. Reprod. Immunol., 34: 26-34 (1995); y Better et al., Science, 240: 1041-1043 (1988). Ejemplos de técnicas que se pueden utilizar para producir Fv de cadena sencilla y anticuerpos incluyen los descritos en las Patentes de Estados Unidos N.° 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science, 240: 1038-1041 (1988).
De modo alternativo a la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes mediante presentación de fagos, se pueden aplicar otras metodologías conocidas en la técnica para seleccionar grandes bibliotecas combinatorias para la identificación de anticuerpos de la invención. Un tipo de sistema de expresión alternativa es uno en el cual la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa como fusiones de ARN-proteína, como se describe en la publicación PCT n.° Wo 98/31700 (Szostak y Roberts) y en Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-12302 (1997). En este sistema, se crea una fusión covalente entre un ARNm y el péptido o la proteína que codifica mediante traducción in vitro de ARNm sintéticos que portan puromicina, un antibiótico aceptor de petidilo, en su extremo 3'. Por tanto, un ARNm específico puede enriquecerse a partir de una mezcla compleja de ARNm (por ejemplo, una biblioteca combinatoria) en base a las propiedades del péptido o proteína codificada, por ejemplo, un anticuerpo, o porció del mismo, tal como la unión del anticuerpo, o una parte del mismo al antígeno de especificidad dual. Las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos, o porciones de los mismos, recuperadas a partir de la exploración de dichas bibliotecas pueden expresarse por medios recombinantes como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, en células hospedadoras de mamíferos) y, además, pueden someterse a una maduración de afinidad adicional por vueltas de selección adicionales de fusiones ARNm-péptido en las que se han introducido mutaciones en la secuencia (o secuencias) seleccionadas originariamente, o por otros métodos para la maduración de afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, tal como se describió anteriormente. Un ejemplo preferente de esta metodología es la tecnología de presentación profusión.
En otro enfoque, los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar usando métodos de presentación de levadura conocidos en la técnica. En los métodos de presentación de levadura, se usan métodos genéticos para fijar dominios de anticuerpos a la pared de la célula de levadura y presentarlos sobre la superficie de la levadura. En particular, tal levadura puede utilizarse para presentar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humana o murina). Ejemplos de métodos de presentación de levadura que se pueden usar para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en la patente de EE.UU. n.°6.699.658 (Wittrup et al.)
f. Producción de anticuerpos de FHC recombinantes
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos recombinantes y pueden producirse mediante cualquiera de una cantidad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, expresión de células hospedadoras, en donde el/los vector(es) que codifica(n) las cadenas pesada y ligera se transfecta(n) en una célula hospedadora mediante técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" están previstas para englobar una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospedadoras o bien procariotas o bien eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas es preferente y lo más preferente en células hospedadoras de mamífero, puesto que tales células eucariotas (y, en particular, células de mamífero) son más probables que las células procariotas en agruparse y segregar un anticuerpo adecuadamente plegado e inmunológicamente activo. El anticuerpo recombinante puede ser un anticuerpo humanizado.
Células hospedadoras de mamífero ejemplares para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluidas células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980), usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos se introducen en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células hospedadoras. Se pueden recuperar los anticuerpos del medio de cultivo usando métodos estándar de purificación de proteínas.
Las células hospedadoras también se pueden usar para producir fragmentos de anticuerpos funcionales, tales como fragmentos Fab, o moléculas scFv. Se comprenderá que se encuentran dentro del ámbito de la presente invención variaciones del anterior procedimiento. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula hospedadora con ADN que codifica fragmentos funcionales de o bien la cadena ligera y/o cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención. También se puede usar tecnología de ADN recombinante para retirar algo, o todo, del ADN que codifica cualquiera o ambas de las cadenas ligeras y pesada que no es necesaria para unirse a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas de tales moléculas de a Dn truncadas también quedan englobadas por los anticuerpos de la invención. Además, se pueden producir anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo de la invención (es decir, se une a FHC humano) y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto de FHC humano reticulando un anticuerpo de la invención en un segundo anticuerpo mediante métodos de reticulación química estándar.
En un sistema preferente para la expresión recombinante de un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera de anticuerpos se introduce en células dhfr-CHO mediante transfección mediada con fosfato cálcico. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo se unen operativamente a elementos reguladores de potenciador de CMV/promotor deAdMLP para conducir altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen de DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando selección de metotraxato/amplificación. Las células hospedadores transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y se recupera anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se usan técnicas de biología molecular estándar para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Aún más, la invención proporciona un método de sintetización de un anticuerpo recombinante de la invención cultivando una célula hospedadora de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta que el anticuerpo recombinante de la invención se sintetiza. El método puede comprender adicionalmente aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo.
(1) Anticuerpo humanizado
El anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo o una variante, un derivado, análogo o porción del mismo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región estructural (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante de complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. El anticuerpo humanizado puede ser de un anticuerpo de especie no humana que se une al antígeno deseado que tiene una o más regiones de determinación de complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones estructurales de una molécula de inmunoglobulina humana.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de un anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, un anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones estructurales son las de una secuencia de consenso de una inmunoglobulina humana. De acuerdo con un aspecto, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera, así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, regiones de CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena pesada humanizada. En realizaciones específicas, un anticuerpo humanizado solo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o de cadena pesada.
Se puede seleccionar el anticuerpo humanizado de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluidas IgM, IgG, IgD, IgA IgE, así como cualquier isotipo, incluido sin limitación IgG 1, IgG2, IgG3 y IgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo y, en particular, se pueden seleccionar dominios constantes para optimizar las funciones efectoras deseadas usando métodos bien conocidos en la técnica.
Las regiones estructurales y las regiones de CDR de un anticuerpo humanizado no tienen que corresponderse exactamente con las secuencias parentales, por ejemplo, la CDR del anticuerpo donante o la región estructural de consenso pueden estar mutagenizadas mediante sustitución, inserción y/o deleción de al menos un residuo de aminoácido de manera que el residuo de la CDR o la región estructural en ese sitio no se corresponde con el del anticuerpo donante o la región estructural de consenso. En una realización, tales mutaciones, sin embargo, no serán extensas. Normalmente, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de los restos del anticuerpo humanizado se corresponden con los de las secuencias de FR y CDR parentales. Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "región estructural de consenso" se refiere a la región estructural en la secuencia de consenso de la inmunoglobulina. Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "secuencia de consenso de una inmunoglobulina" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) que se presentan más frecuentemente en una familia de secuencias de inmunoglobulinas relacionadas (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987)). En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia de consenso está ocupada por el aminoácido que se presenta con más frecuencia en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos se presentan con la misma frecuencia, ambos se pueden incluir en la secuencia de consenso.
El anticuerpo humanizado puede diseñarse para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia anticuerpos anti-humanos de roedor, que limita la duración y eficacia de las aplicaciones terapéuticas a esos restos en receptores humanos. El anticuerpo humanizado puede tener uno o más restos de aminoácidos introducido en este de una fuente que no es humana. Estos restos no humanos se denominan a menudos como restos de "importe", que se toman normalmente de un dominio variable. La humanización se puede llevar a cabo reemplazando secuencias de región hipervariable de las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido reemplazado por la secunecia correspondiente de una especie no humana. Por ejemplo, véase la patente de Estados Unidos n.°. 4.816.567. El anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo humano en el cual algunos restos de región hipervariable y, posiblemente algunos restos de la FR se reemplazan por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La humanización o ingeniería de anticuerpos de la presente invención puede realizarse usando cualquier método conocido, tal como aunque no limitado a los descritos en las patentes de Estados Unidos n.° 5.723.323; 5.976.862; 5.824.514; 5.817.483; 5.814.476; 5.763.192; 5.723.323; 5.766.886; 5.714.352; 6.204.023; 6.180.370; 5.693.762; 5.530.101; 5.585.089; 5.225.539; y 4.816.567.
El anticuerpo humanizado puede retener alta afinidad para FHC y otras propiedades biológicas favorables. El anticuerpo humanizado puede prepararse mediante un proceso de análisis de secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales mediante el uso de modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles. Hay disponibles programas de ordenador que ilustran y presentan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite en análisis del probable papel de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata en unirse a su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar restos de FR y combinarse desde el receptor e importar secuencias de modo que las características de anticuerpos deseadas, tales como afinidad aumentada de FHC se consigue. En general, los restos de región hipervariable pueden estar directamente y en gran parte sustancialmente implicados en influir en la unión a antígeno.
Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos (también denominadas en el presente documento como “anticuerpos humanos completos”). Por ejemplo, es posible aislar anticuerpos humanos de bibliotecas mediante profusión y/o tecnología relacionadas con levadura. También es posible aislar células B productoras de anticuerpos de pacientes que producen un anticuerpo, secuencia relevante y entonces, clonar la inmunoglobulina. También es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones que son capaces, de cuando se inmunizan, producir un completo repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, la supresión homocigótica del gen de región que une cadena pesada de anticuerpos (Jh) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la completa inhibición de producción de anticuerpos endógenos. Transferencia de la agrupación de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en tal ratón mutante de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos cuando se expone al antígeno. Los anticuerpos humanizados o completamente humanos pueden prepararse de acuerdo con los métodos descritos en las patentes de los EE.UU. n.° 5.770.429; 5.833.985; 5.837.243, 5.922.845; 6.017.517; 6.096.311; 6.111.166; 6.270.765; 6.303.755; 6.365.116; 6.410.690, 6.682.928; y 6,984,720,
g. Moléculas pequeñas
Se puede usar una molécula pequeña como un inhibidor para dirigir la región del FHC para inhibir la unión del FHC a C3b. Una molécula pequeña puede ser un compuesto de bajo peso molecular, por ejemplo, inferior a 800 daltons, orgánico o inorgánico que puede servir como un sustrato enzimático o regulador de procesos biológicos. La molécula pequeña puede tener un tamaño inferior a 1 nm. La molécula pequeña puede incluir ribo- o desoxiribonucleótidos, dinucleótidos, aminoácidos, péptidos, monosacáridos y disacáridos.
3. Composiciones farmacéuticas
El inhibidor de FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC, puede ser un componente en una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede contener también un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor del FHC de la invención son para su uso en, pero sin limitación a, el diagnóstico, la detección o el control de un trastorno, en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de un trastorno o uno o más de los síntomas del mismo y/o en su investigación. En una realización específica, una composición comprende uno o más de inhibidores del FHC de la invención. En otra realización, la composición farmacéutica comprende uno o más de inhibidores del FHC de la invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos de los inhibidores del FHC de la invención para el tratamiento de un trastorno en cuya actividad de un FHC dirigido es perjudicial. En una realización adicional, los agentes profilácticos o terapéuticos son conocidos por ser útiles para, o han sido o se usan actualmente en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo. De acuerdo con estas realizaciones, la composición puede comprender adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente.
El inhibidor de FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC, de la invención puede incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un sujeto. Normalmente, la composición farmacéutica comprende un inhibidor del FHC de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal y como se utiliza en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, tampón de fosfato salino, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender adicionales menores cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o eficacia del inhibidor del FHC.
Se conocen diversos sistemas de suministro y se pueden usar para administrar uno o más inhibidores del FHC de la invención o la combinación de uno o más inhibidores del FHC de la invención y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para prevenir, gestionar, tratar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo, por ejemplo, encapsulado en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el inhibidor de FHC, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro, etc. Métodos de administración de un agente profiláctico o terapéutico de la invención incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración intratumoral y administración de mucosa (por ejemplo, vías intranasales y orales). Además, se puede emplear administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y la formulación con un agente de aerosolización. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.019.968; 5.985.320; 5.985.309; 5.934.272; 5.874.064; 5.855.913; 5.290.540; y 4.880.078; y publicaciones PCT n.° WO 92/19244; W097/32572; WO97/44013; W098/31346; y WO99/66903. En una realización, el inhibidor del FHC de la invención o una composición de la invención se administra usando tecnología de administración pulmonar de fármacos Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). En una realización específica, los agente profilácticos o terapéuticos de la invención se administran por vía intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden administrarse mediante cualquiera vía adecuada, por ejemplo, mediante infusión o inyección de embolada, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente acticos. La administración puede ser sistémica o local.
En una realización específica, puede ser deseable administrar los inhibidores del FHC de la invención localmente al área que necesita tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y no a modo de limitación mediante infusión local, mediante inyección o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso o no poroso, que incluye membranas y matrices, tales como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®) o matrices de colágeno. En una realización, una cantidad eficaz de uno o más inhibidores de FHC de la invención se administra localmente al área afectada a un sujeto para prevenir, tratar gestionar y/o mejorar un trastorno o un síntoma del mismo.
En otra realización, los inhibidores del FHC se pueden suministrar en un sistema de liberación controlada o liberación sostenida. En una realización, se puede usar una bomba para conseguir una liberación controlada o sostenida (véase, Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos para conseguir una liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105); patente de EE.UU. n.° 5.679.377; patente de EE.UU. n.° 5.916.597; patente de EE.UU. n.° 5.912.015; patente de EE.UU. n.° 5.989.463; patente de EE.UU. n.° 5.128.326; Publicación de PCT N° WO99/15154; y Publicación de PCT N° WO 99/20253. Ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo), poli (metacrilato de metilo), poli (ácido acrílico), poli (etileno-co-acetato de vinilo), poli (ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli (N-vinilpirrolidona), poli (alcohol de vinilo), poliacrilamida, poli (etilenglicol), polilactidas (PLA), poli (lactida-co-glicólidos) (PLGA), y poliortoésteres. En una realización particular, el polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estable al almacenamiento, estéril, y biodegradable. En otra realización más, un sistema de liberación controlada o sostenida se puede colocar en proximidad de la diana terapéutica, requiriendo de este modo solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, páginas 115-138 (1984)).
Los sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (1990, Science 249: 1527-1533). Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto en la materia para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más inhibidores del FHC de la presente invención. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.526.938, publicación de PCT WO 91/05548, publicación de PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39: 179- 189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372- 397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Inf'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.
24:853-854; y Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Focal Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.
Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía prevista de administración. Ejemplos de vías de administración incluyen, pero no se limitan a, parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica), transmucosa y rectal. En una realización específica, la composición se formula de acuerdo con procedimientos habituales tales como una composición farmacéutica adaptada para su administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal o tópica a seres humanos. Normalmente, las composiciones para su administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando resulta necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.
Si las composiciones de la invención van a administrarse por vía tópica, las composiciones pueden formularse en forma de un ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, pulverización, aerosol, solución, emulsión u otra forma bien conocida por el experto en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para formas de dosificación tópica no pulverizables, se emplean típicamente formas de viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un vehículo o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica preferentemente mayor que el agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, polvos, linimentos, pomadas y similares, que son, si se desea, se esterilizan o se mezclan con agentes adyuvantes (por ejemplo, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones o sales) para influir en diversas propiedades, tal como, por ejemplo, la presión osmótica. Otras formas de dosificación tópica adecuadas incluyen preparaciones de aerosol pulverizable en donde el principio activo, por ejemplo, en combinación con un vehículo inerte, sólido o líquido, se envasa en una mezcla con un producto volátil presurizado (por ejemplo, un propulsor gaseoso, tal como freón) o en un frasco flexible. También pueden añadirse hidratantes o humectantes a composiciones farmacéuticas y formas de dosificación si se desea. Se conocen bien en la técnica ejemplos de dichos ingredientes adicionales.
Si el método de la invención comprende administración intranasal de una composición, la composición puede formularse en una forma de aerosol, pulverización, bruma o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para uso de acuerdo con la presente invención pueden suministrarse convenientemente en forma de una presentación en pulverización de aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos (compuesto de, por ejemplo, gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador que contienen una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Si el método de la invención comprende administración oral, las composiciones pueden formularse por vía oral en forma de comprimidos, cápsulas, sobrecitos, cápsulas de gelatina, soluciones, suspensiones y similares. Los comprimidos o cápsulas pueden prepararse por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa), cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregrantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico). Los comprimidos pueden recubrirse por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para su administración oral pueden tomar la forma de, pero sin limitación a, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, metil o propilphidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tamponantes, agentes saporíferos, colorantes y edulcorantes según sea apropiado. Las preparaciones para administración oral pueden formularse convenientemente para liberación lenta, liberación controlada o liberación sostenida de un agente o agentes profilácticos o terapéuticos.
El método de la invención puede comprender administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente de aerosolización. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 6.019.968, 5.985, 320; 5, 985.309; 5.934.272; 5.874.064; 5.855.913; 5.290.540; y 4.880.078; y publicaciones PCT n.° WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO99/66903. En una realización específica, un inhibidor del FHC de la invención y/o una composición de la invención se administra usando tecnología de administración pulmonar de fármacos Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).
El método de la invención puede comprender administración de una composición formulada para su administración parenteral por inyección (por ejemplo, por inyección de embolada o infusión continua). Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria (por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis) con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Como alternativa, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua sin pirógenos estéril) antes de su uso. Los métodos de la invención pueden comprender adicionalmente la administración de composiciones formuladas como preparaciones de depósito. Dichas formulaciones de acción larga pueden administrarse por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o por vía intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles (por ejemplo, como una sal poco soluble).
Los métodos de la invención abarcan la administración de composiciones formuladas como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como las derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y las formadas con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
En general, los ingredientes de composiciones se proporcionan bien por separado o bien mezclados entre sí en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente sellado de forma hermética tal como una ampolla o un sobrecito que indique la cantidad del agente activo. Cuando el modo de administración sea infusión, la composición puede distribuirse con un frasco de infusión que contiene agua o solución salina de uso farmacéutico estéril. Cuando el modo de administración sea por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
En particular, la invención también proporciona que uno o más de los inhibidores del FHC, o composiciones farmacéuticas de la invención se envasen en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o un sobrecito que indica la cantidad del inhibidor de FHC. En una realización, uno o más de los inhibidores del FHC, o composiciones farmacéuticas de la invención se proporcionan como un polvo liofilizado estéril seco o concentrado sin agua en un recipiente sellado herméticamente y puede reconstituirse (por ejemplo, con agua o solución salina) hasta la concentración apropiada para administración a un sujeto. En una realización, uno o más de los inhibidores del FHC o composiciones farmacéuticas de la invención se proporcionan como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente sellado herméticamente a una dosificación unitaria de al menos 5 mg, por ejemplo, al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg o al menos 100 mg. Los inhibidores del FHC liofilizados o composiciones farmacéuticas de la invención deberían almacenarse a entre 2 °C y 8 °C en su recipiente original y los inhibidores del FHC, o composiciones farmacéuticas de la invención deberían administrarse en un intervalo de 1 semana, por ejemplo, en un intervalo de 5 días, en un intervalo de 72 horas, en un intervalo de 48 horas, en un intervalo de 24 horas, en un intervalo de 12 horas, en un intervalo de 6 horas, en un intervalo de 5 horas, en un intervalo de 3 horas o en un intervalo de 1 hora después de reconstituirse. En una realización alternativa, uno o más de los inhibidores del FHC o composiciones farmacéuticas de la invención se proporcionan en forma líquida en un recipiente sellado herméticamente que indica la cantidad y concentración del inhibidor del FHC. En una realización adicional, la forma líquida de la composición administrada se proporciona en un recipiente sellado herméticamente de al menos 0,25 mg/ml, por ejemplo, al menos 0,5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml. La forma líquida debería almacenarse a entre 2 °C y 8 °C en su recipiente original.
Los inhibidores del FHC de la invención pueden incorporarse en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. En un aspecto, los inhibidores del FHC se prepararán como una solución inyectable que contiene inhibidor del FHC 0,1-250 mg/ml. La solución inyectable puede estar compuesta de una forma de dosificación líquida o liofilizada en un vial de sílex o ámbar, ampolla o jeringa precargada. El tampón puede ser L-histidina (1-50 mM), óptimamente 5-10 mM, a pH 5,0 a 7,0 (óptimamente pH 6,0). Otros tampones adecuados incluyen pero sin limitación, succinato sódico, citrato sódico, fosfato sódico o fosfato potásico. El cloruro sódico puede usarse para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente 150 mM para una forma de dosificación líquida). Pueden incluirse crioprotectores para una forma de dosificación liofilizada, principalmente sacarosa 0-10% (óptimamente 0,5-1,0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Pueden incluirse agentes de masificación para una forma de dosificación liofilizada, principalmente manitol 1-10% (óptimamente 2-4%). Pueden usarse estabilizadores en formas de dosificación tanto líquidas como liofilizadas, principalmente L-Metionina 1-50 mM (óptimamente 5-10 mM). Otros agentes de masificación adecuados incluyen glicina, arginina, pueden incluirse como polisorbato-80 0-0,05% (óptimamente 0,005-0,01%). Los tensioactivos adicionales incluyen pero sin limitación polisorbato 20 y tensioactivos BRIJ. La composición farmacéutica que comprende los inhibidores del FHC de la invención preparados como una solución inyectable para administración parenteral pueden comprender además un agente útil como un adyuvante, tal como los usados para aumentar la absorción o dispersión del inhibidor del FHC. Un adyuvante particularmente útil es hialuronidasa, tal como Hylenex® (hialuronidasa humana recombinante). La adición de hialuronidasa en la solución inyectable mejora la biodisponibilidad humana después de administración parental, particularmente administración subcutánea. También permite mayores volúmenes en el sitio de inyección (es decir, mayores de 1 ml) con menos dolor e incomodidad, y mínima incidencia de las reacciones de sitio de inyección. (Véase la publicación de solicitud internacional n.° WO 04/078140 y publicación de solicitud de patente de los EE.UU. n.° US2006104968.
Las composiciones de la presente invención pueden encontrarse en una variedad de formas. Estos incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquida, semisólida y sólida, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferente depende del modo pretendido de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones preferentes típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para inmunización pasiva de seres humanos con otros inhibidores del FHC. En una realización, el inhibidor de FHC de administra mediante infusión intravenosa o inyección. En otra realización, el inhibidor de FHC se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una concentración alta de fármaco. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (es decir, inhibidor del FHC de la presente invención) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles, liofilizados, para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación comprenden secado al vacío y secado por pulverización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución esterilizada por filtración previamente del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede producirse incluyendo, en la composición, un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Los inhibidores del FHC de la presente invención pueden administrarse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/el modo de administración preferido es inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como se apreciará por el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En determinadas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un vehículo que protegerá el compuesto contra la liberación rápida, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilen vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o se conocen en general por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
En determinadas realizaciones, un inhibidor del FHC de la invención puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El inhibidor del FHC (y otros ingredientes, si se desea) también puede incluirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, formarse por compresión en comprimidos, o incorporarse directamente en la dieta de sujeto. Para la administración terapéutica oral, los inhibidores del FHC pueden administrarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, pastillas para chupar, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un inhibidor de FHC de la invención por una administración distinta de la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el inhibidor del FHC con un material para evitar su inactivación.
En determinadas realizaciones, un inhibidor del FHC de la invención esta unido a un vehículo de extensión de semivida conocido en la materia. Tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, el dominio Fc, polietilenglicol y dextrano. Tales vehículos se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Estados Unidos N° de Serie 09/428.082 y Solicitud de PCT publicada N° WO 99/25044.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un inhibidor del FHC. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones durante períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor del FHC puede determinarse por un experto en la técnica y puede variar de acuerdo con factores tales como estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, así como la capacidad del inhibidor del FHC para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que los efectos tóxicos o perjudiciales, si los hay, del inhibidor del FHC se ven contrarrestados por los efectos terapéuticamente eficaces. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones durante períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Normalmente, puesto que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar una única embolada, se pueden administrar varias dosis divididas durante el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria tal como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente independientes adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas de dosificación unitarias viene dictaminada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica para componer dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Un intervalo no limitante ejemplar de una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz del inhibidor del FHC es una dosis de entre 0,1 y 200 mg/kg, por ejemplo, entre 0,1 y 10mg/kg. La cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz del inhibidor del FHC puede ser entre 1 y 200 mg/kg, 10 y 200 mg/kg, 20 y 200 mg/kg, 50 y 200 mg/kg, 75 y 200 mg/kg, 100 y 200 mg/kg, 150 y 200 mg/kg, 50 y 100 mg/kg, 5 y 10 mg/kg, o 1 y 10 mg/kg. Cabe destacar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la afección que se va a aliviar. Asimismo, la dosis del inhibidor del FHC puede determinarse por un experto en la técnica y puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, así como la capacidad del inhibidor del FHC para provocar una respuesta deseada en el individuo. La dosis también es una en la que los efectos tóxicos o perjudiciales, si los hay, del inhibidor del FHC se ven contrarrestados por los efectos terapéuticamente eficaces. Debe entenderse que para cualquier sujeto particular, se deben ajustar los regímenes de dosificación específicos con el tiempo según la necesidad del individuo y el criterio profesional de la persona que está administrando o supervisando la administración de las composiciones y que los intervalos de dosificación indicados en el presente documento son únicamente ejemplares y no están previstos para limitar el ámbito o práctica de la composición reivindicada.
4. Detección del FHC
La presente invención también se refiere a un método de detección y medición del FHC o la forma reducida del FHC en una muestra que usa los anticuerpos anti-FHC descritos anteriormente para unirse a FHC distinto o la forma reducida de los epítopos del FHC. El método incluye poner en contacto la muestra con el anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo descrito anteriormente.
a. Inmunoensayo
El FHC y la forma reducida del FHC y/o péptidos o fragmentos del mismo, es decir, FHC y forma reducida de fragmentos de FHC, pueden analizarse usando los anticuerpos descritos anteriormente en un inmunoensayo. La presencia o cantidad de FHC o forma reducida de FHC puede determinarse usando anticuerpos y detectando la unión específica a FHC o forma reducida de FHC. Por ejemplo, el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, puede unirse específicamente a FHC o forma reducida de FHC. Si se desea, se puede usar uno o más de los anticuerpos en combinación con uno o más anticuerpos monoclonales/policlonales disponibles en el mercado. Tales anticuerpos están disponibles en empresas tales como R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) y Enzo Life Sciences International, Inc. (Plymouth Meeting, PA).
La presencia o cantidad del FHC o forma reducida del FHC presente en una muestra corporal puede determinarse fácilmente mediante el uso de un inmunoensayo, tal como un inmunoensayo tipo sándwich (por ejemplo, inmunoensayos tipo sándwich monoclonales-policlonales, incluida detección de radioisótopos (radioinmunoensayo (RIA)) y detección de enzimas (inmunoensayo enzimático (EIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a encimas (ELISA) (por ejemplo, Quantikine ELISA assays, R&D Systems, Minneapolis, MN)). Un inmunoensayo de micropartículas quimiluminescente, en particular, uno que emplea el analizador automático ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), es un ejemplo de un inmunoensayo preferente. Otros métodos incluyen por ejemplo, espectrometría másica e inmunohistoquímica (por ejemplo, con secciones de biopsias tisulares) usando anticuerpos de FHC (monoclonales, policlonales, quiméricos, humanizados, humanos, etc.) o fragmentos de anticuerpos de los mismos frente a FHC. Otros métodos de detección incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.143.576; 6.113.855; 6.019.944; 5.985.579; 5.947.124; 5.939.272; 5.922.615; 5.885.527; 5.851.776; 5.824.799; 5.679.526; 5.525.524; y 5.480.792. La unión inmunológica específica del anticuerpo al FHC puede detectarse mediante etiquetas directas, tales como etiquetas fluorescentes o luminiscentes, metales y radionúclidos unidos al anticuerpo o mediante etiquetas indirectas, tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante.
5. Métodos de tratamiento
En el presente documento se devela un método de tratamiento de cáncer en un sujeto. El método puede incluir administrar al sujeto que lo necesita un inhibidor de FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC o de moléculas pequeñas descrito anteriormente. El inhibidor de FHC puede administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz.
En general, la dosificación de inhibidor de FHC administrado variará dependiendo de tales factores como la edad del paciente, el peso, la altura el sexo, la afección médica general e historial previo médico. Normalmente, es deseable proporcionar al receptor una dosificación de componente inhibidor de FHC, inmunoconjugado o proteína de fusión que se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal del paciente), aunque se puede administrar una dosificación inferior o superior según dictaminen las circunstancias. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar una única embolada, se pueden administrar varias dosis divididas durante el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La formas de dosificación unitaria tal como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente independientes adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a someter a ensayo; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas de dosificación unitarias de la presente invención viene dictaminada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica para componer dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Un intervalo no limitante ejemplar de una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de un inhibidor del FHC de la invención es de 0,1-20 mg/kg, más preferentemente de 0,5-10 mg/kg. Cabe destacar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la afección que se va a aliviar. Debe entenderse que para cualquier sujeto particular, se deben ajustar los regímenes de dosificación específicos con el tiempo según la necesidad del individuo y el criterio profesional de la persona que está administrando o supervisando la administración de las composiciones y que los intervalos de dosificación indicados en el presente documento son únicamente ejemplares y no están previstos para limitar el ámbito o práctica de la composición reivindicada.
La administración de inhibidores del FHC a un paciente puede ser por vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, intraocular, intravítrea, mediante perfusión a través de un catéter regional o mediante inyección intralesional directa. Cuando se administran proteínas terapéuticas mediante inyección, la administración puede ser mediante infusión continua o mediante emboladas únicas o múltiples. La inyección intravenosa proporciona un modo útil de administración debido a la minuciosidad d la circulación que distribuye rápidamente los inhibidores del FHC. El inhibidor de FHC puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El anticuerpo y otros ingredientes, si se desea, se puede contener en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos, comprimidos bucales, pastillas para chupar, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares.
Los inhibidores del FHC pueden administrarse en dosis proteicas bajas, tales como 20 miligramos a 2 gramos de proteína por dosis, proporcionada una vez o repetidamente, por vía parental. Como alternativa, los inhibidores del FHC se pueden administrar en dosis de 20 a 1.000 miligramos de proteína por dosis, o de 20 a 500 miligramos de proteína por dosis, o de 20 a 100 miligramos de proteína por dosis.
Los inhibidores del FHC pueden administrarse solos o pueden conjugarse con liposomas y puede formularse de acuerdo con procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante las cuales los inhibidores del FHC se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" puede ser tolerado por un paciente receptor. Solución salina taponada con fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19a Ed. (1995). Para fines de la terapia, los inhibidores del FHC se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una que es fisiológicamente significante. El inhibidor de FHC es fisiológicamente significante si su presencia da como resultado un cambio detectable de la fisiología de un paciente receptor. En el presente contexto, los inhibidores del FHC pueden ser fisiológicamente significantes si su presencia da como resultado, por ejemplo, una lisis dependiente de complemento aumentado de una célula, una deposición de C3b aumentada sobre una célula y/o la inhibición de la unión del FHC a C3b.
Se pueden emplear métodos de tratamiento adicionales para controlar la duración de acción de un anticuerpo en una aplicación terapéutica. Las preparaciones de liberación controlada pueden prepararse mediante el uso de polímero para complejar o adsorber el anticuerpo. Por ejemplo, polímeros biocompatibles incluyen matrices de (poli (etileno-co-acetato de vinilo) y matrices de un copolímero de polianhídrido de un dímero de ácido esteárico y un ácido sebáceo. Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446 (1992). La tasa de liberación de un anticuerpo de tal matriz depende del peso molecular de la proteína, la cantidad de anticuerpo dentro de la matriz y el tamaño de partículas dispersadas. Saltzman et al., Biophys. J. 55:163 (1989); Sherwood et al., citado anteriormente. Otras formas de dosificación sólida se describen en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19a ed., (1995).
a. Anticuerpos del FHC
Los anticuerpos de FHC descritos en el presente documento puede interferir con la unión de FHC a células tumorales, tales como células de cáncer de pulmón y pueden usarse para tratar cáncer en un sujeto. La interferencia de unión de FHC a células tumorales disminuye el número de FHC en las células tumorales y potencia la lisis dependiente de complemento de las células tumorales. Los anticuerpos del FHC puede provocar un aumento en la deposición de C3b sobre células de cáncer de pulmón. La deposición de C3b se requiere para la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y se usa con frecuencia como prueba de activación del complemento.
Una cantidad eficaz del anticuerpo de FHC o fragmento del mismo puede administrarse a la célula. Por ejemplo, una cantidad eficaz entre aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, entre aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, entre aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, entre aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, entre aproximadamente 45 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, entre aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, entre aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, entre aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, entre aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, entre aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, entre aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, entre aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, entre aproximadamente 45 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, entre aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, entre aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, entre aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, entre aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, entre aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, entre aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, entre aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, entre aproximadamente 45 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, entre aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, entre aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, entre aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, entre aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, entre aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 120 pg/ml, entre aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 120 pg/ml, entre aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 120 pg/ml, entre aproximadamente 45 pg/ml a aproximadamente 120 pg/ml, entre aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 120 pg/ml, entre aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 120 pg/ml, entre aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 120 pg/ml, entre aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 120 pg/ml, entre aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, entre aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, entre aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, entre aproximadamente 45 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, entre aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, entre aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml o entre aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml del anticuerpo de FHC o fragmento del mismo se puede administrar a la célula. Los anticuerpos de FHC pueden ser Ab7960/293i o Ab7968.
b. Cáncer
El método descrito en el presente documento puede usarse para tratar un sujeto que tiene cualquier forma de cáncer. El método puede incluir administrar al sujeto que lo necesita un inhibidor de FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC o de moléculas pequeñas descrito anteriormente. El cáncer puede ser cualquier cáncer que usa FHC como mecanismo protector. El cáncer puede ser carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, tumor carcinoide, gastrointestinal, carcinoma de primario desconocido, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de la vesícula biliar extrahepática, tumores de la familia de Ewing (PNET), tumor de células germinales extracraneales, cáncer ocular de melanoma intraocular, cáncer de vesícula, cáncer gástrico (estómago), tumor de células germinales extragonadal, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hipofaríngeo, carcinoma de las células de los islotes, cáncer de riñón (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemia linfoblástica aguda, leucemia, mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia de células pilosas, cáncer de labio y cavidad bucal, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma (primario) del sistema nervioso central, linfoma de linfocitos T cutáneo, linterna de enfermedad de Hodgkin, linterna de enfermedad no de Hodgkin, mesotelioma maligno, melanoma, carcinoma de células de Merkel, cáncer de cuello escamoso metastásico con primerio oculto, mieloma múltiple y otros neoplasmas de células plasmáticas, micosis fungoide, síndrome mielodisplástico, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer epitelial de ovario, tumor celular germinal de ovario, cáncer pancreático, exocrino, cáncer pancreático, carcinoma de las células de los islotes, cáncer del seno paranasal y la cavidad nasal, cáncer paratiroide, cáncer del pene, cáncer de pituitaria, neoplasma de célula plasmática, cáncer de próstata, rabdomiosarcoma, cáncer rectal, cáncer de célula renal (cáncer de riñón), cáncer renal de célula transicional de pelvis y uréter, cáncer de la glándula salival, síndrome de Sezary, cáncer de la piel, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer testicular, timoma maligno, cáncer de tiroides, cáncer uretral, cáncer uterino, cáncer inusual de niñez, cáncer vaginal, cáncer de vulva y tumor de Wilms.
(1) Cáncer de pulmón
El método descrito en el presente documento puede usarse para tratar un sujeto que tiene cáncer de pulmón. El método puede incluir administrar al sujeto que lo necesita un inhibidor de FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC o de moléculas pequeñas descrito anteriormente. El cáncer de pulmón puede ser cáncer de pulmón de células pequeñas, también conocido como carcinoma de pulmón de células pequeñas y cáncer de células de avena, carcinoma de pulmón no microcítico ("NSCLC"), tumores glandulares, tumores carcinoides y/o carcinomas indiferenciados.
(2) Cáncer de mama
El método descrito en el presente documento puede usarse para tratar un sujeto que tiene cáncer de mama. El método puede incluir administrar al sujeto que lo necesita un inhibidor de FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC o de moléculas pequeñas descrito anteriormente. El cáncer de mama puede ser cualquier cáncer que se inicia en los tejidos de la mama. Los dos tipos principales de cáncer de mama son el carcinoma ductal, que se inicia en los tubos (conductos) que mueven la leche desde la mama al pezón y carcinoma lobular, que se inicia en las partes de la mama, denominados lóbulos, que producen leche. El cáncer de mama también se puede iniciar en otras áreas de la mama. El cáncer de mama puede ser invasivo o no invasivo (in situ).
c. Terapia de combinación
Los métodos descritos anteriormente pueden incluir un tratamiento de combinación del inhibidor del FHC con otros fármacos y/u otras terapias de cáncer convencionales.
(1) Fármacos de combinación
Los métodos pueden incluir adicionalmente la administración de una cantidad eficaz de al menos un compuesto anti­ cáncer o agente quimioterapéutico. Los inhibidores del FHC se pueden usar junto con un fármaco anti-cáncer o agente quimioterapéuti
mediada por células dependiente de células (ADCC) y toxicidad mediada por células. Ejemplos de compuestos anti­ cáncer y agente quimioterapéuticos incluyen antracidinas, tales como doxorubicina (Adriamicina, Doxil), epirubicina (Ellence) y daunorubicina (Cerubidina, DaunoXome), capecitabina (Xeloda), carboplatino (Paraplatin), cisplatino, ciclofosfamida (Cytoxan), eribulina (Halaven), Fluorouracilo (también denominado 5-fluoroacilo o 5-FU; Adrucil), gemcitabina (Gemzar), ixabepilona (Ixempra), metotrexato (Amethopterin, Mexate, Folex), mitoxantrona (Novantrone), mutamicina (Mitomycin), taxanos, tal como paclitaxel (Taxol, Abraxane) y docetaxel (Taxotere), tiotepa (Thioplex), vincristina (Oncovin, Vincasar PES, Vincrex) y vinorelbina (Navelbine). Ejemplos de terapia dirigida incluyen trastuzumab (Herceptin), lapatinib (Tykerb), onartuzumab, rilotumumab (AMG102), ficlatuzumab (AV-299), bevacizumab (Avastin), pertuzumab (Perjeta), Rituximab, panatumamab y everolimus (Afinitor). Los inhibidores del FHC pueden usarse junto con Cetuximab, Perjeta y Herceptin.
(2) Terapias de cáncer convencionales
Terapias de cáncer convencionales pueden incluir cirugía, terapia de radiación terapia de hormonas y terapia dirigida. Ejemplos de cirugía incluyen craneotomía abierta con escisión máxima, que puede estar seguida de terapia por radiación. Ejemplos de terapia de radiación incluyen irradiación de cerebro completo, radioterapia fraccionada y radiocirugía, tal como radiocirugía estereotáctica, por ejemplo, radiocirugía Gamma Knife.
d. Sujeto
El sujeto puede ser un mamífero, que puede ser un ser humano. El sujeto puede tener o estar en riesgo de desarrollar un cáncer. El sujeto puede tener cáncer. El sujeto puede ya estar sometiéndose a un tratamiento para un cáncer.
6. Métodos de aumentar la lisis dependiente de complemento de células
Los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para aumentar la lisis dependiente de complemento de una célula. El método descrito en el presente documento puede incluir la administración a la célula de un inhibidor de FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC o de moléculas pequeñas descrito anteriormente. La célula puede ser una célula tumoral. Por ejemplo, la célula tumoral puede ser célula de cáncer de mama MCF7, célula de cáncer de mama SKBR3, célula de cáncer de mama MDA-MB-231 o una célula de carcinoma de pulmón A549. Tal como se desvela a continuación, los anticuerpos del FHC purificados tuvieron un efecto estadísticamente significante en tanto la deposición de C3 sobre células de carcinoma de pulmón A549 como la citotoxicidad mediante la ruta alternativa. Cabe destacar que las células tumorales de pulmón, así como otros tipos de células tumorales, se protegen del ataque del complemento mediante otros inhibidores unidos a membrana que incluyen MCP (CD46), CR1 (CD35) y DAF (CD55) además de FHC. La eficacia de citotoxicidad podría aumentarse concebiblemente combinando anticuerpos de paciente a FHC con anticuerpos monoclonales a estas proteínas (véase Ejemplo 2). 7. Métodos de inhibición de la unión del Factor H del complemento a C3b
Los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para inhibir la unión de FHC a C3b en un sujeto o una célula. El método puede incluir la administración al sujeto o la célula un inhibidor de FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC o de moléculas pequeñas descrito anteriormente. La célula puede ser una célula tumoral. Por ejemplo, la célula tumoral puede ser célula de cáncer de mama MCF7, célula de cáncer de mama SKBR3, célula de cáncer de mama MDA-MB-231 o una célula de carcinoma de pulmón A549.
8. Métodos de aumentar la deposición de C3b sobre células
Los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para aumentar la deposición de C3b sobre una célula. El método puede incluir la administración al sujeto o la célula un inhibidor de FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC o de moléculas pequeñas descrito anteriormente. La célula puede ser una célula tumoral. Por ejemplo, la célula tumoral puede ser célula de cáncer de mama MCF7, célula de cáncer de mama SKBR3, célula de cáncer de mama MDA-MB-231 o una célula de carcinoma de pulmón A549.
9. Métodos de inhibición de crecimiento tumoral
Los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto. El método puede incluir la administración al sujeto o la célula un inhibidor de FHC, tal como el anticuerpo anti-FHC o de moléculas pequeñas descrito anteriormente. El tumor puede ser un tumor sólido o una neoplasia hematológica. Por ejemplo, el tumor puede ser un tumor de pulmón.
10. Mecanismos de suministro
El inhibidor de FHC puede formularse para que sea compatible con su vía prevista de administración. Ejemplos de vías de administración incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica), transmucosa y rectal. En una realización específica, el inhibidor de FHC se formula de acuerdo con procedimientos habituales tales como una composición farmacéutica adaptada para su administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal o tópica a seres humanos. Normalmente, las composiciones para su administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando resulta necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.
Se conocen diversos sistemas de suministro y se pueden usar para administrar uno o más SERM o la combinación de uno o más inhibidores del FHC y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para prevenir, gestionar, tratar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo, por ejemplo, encapsulado en liposomas, micropartículas, microcápsulas, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), etc. Métodos de administración de un agente profiláctico o terapéutico del SERM incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración intratumoral y administración de mucosa (por ejemplo, vías intranasales y orales).
11. Tipos de células
Los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse con una célula de una muestra o un sujeto. La célula puede ser una célula tumoral o de cáncer. La célula puede ser una célula de cáncer de mama o una célula de cáncer de pulmón. Por ejemplo, la célula puede ser una célula de cáncer de mama MCF7, célula de cáncer de mama SKBR3, célula de cáncer de mama MDA-MB-231, célula de carcinoma de pulmón A549, DMS79, o líneas celulares de H226.
12. Kit
En el presente documento se proporciona un kit, que puede usarse para someter a ensayo una muestra de ensayo para FHC o fragmento de FHC o forma reducida de FHC o forma reducida de fragmento de FHC. El kit comprende al menos un componente para someter a ensayo la muestra de ensayo para FHC o forma reducida de FHC e instrucciones para someter a ensayo la muestra de ensayo para FHC o forma reducida de FHC. Por ejemplo, El kit puede comprender instrucciones para someter a ensayo la muestra de ensayo para FHC o forma reducida del FHC mediante inmunoensayo, por ejemplo, inmunoensayo de micropartículas quimiluminescente. Las instrucciones incluidas en los kits se pueden fijar en el material de envasado o pueden incluirse como un inserto del envase. Mientras que las instrucciones son normalmente materiales escritos o impresos, no están limitados a tales. Cualquier medio capaz de almacenar tales instrucciones y comunicarlas a un usuario final queda contemplado por la presente divulgación. Tales medios incluyen pero no se limitan a, medio de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM) y similares. Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "instrucciones" puede incluir la dirección de un sitio de internet que proporciona estas instrucciones.
El componente puede incluir al menos una composición que comprende uno o más anticuerpos aislados o fragmentos de anticuerpo de los mismos que se unen específicamente a FHC o una forma reducida de FHC. El anticuerpo puede ser un FHC o una forma reducida de FHC de anticuerpo de captura de FHC y/o un FHC o forma reducida de FHC de anticuerpo de detección. Preferentemente, el kit comprende todos los componentes, es decir, reactivos, estándares, tampones, diluyentes, etc., que son necesarios para llevar a cabo el ensayo. El kit también puede incluir otros fármacos para tratar cáncer.
13. Ejemplos
La presente invención tiene múltiples aspectos, ilustrados mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
Materiales y Métodos
Transferencia puntual para representación de dominios. Las transferencias puntuales, suministradas amablemente por el Dr. Michael Pangburn, contenían subconjuntos de dominio de proteínas que se solapaban clonadas, expresadas y purificadas de FHC. Estas proteínas se redujeron con TCEP, tal como se describe a continuación antes de aplicarlas puntualmente sobre nitrocelulosa. Los puntos se probaron con suero de NSCLC humano (1:2000) y conjugado de HRP de cadena anti IgG gamma (Millipore, Temecula, CA; 1:5000) y, a continuación, se trataron con un sustrato quimiluminescente, se expusieron a una película y se revelaron.
Purificación de SCR19-20. El Dr. Michael Pangburn (University of Texas Health Science Center, Tyler, TX) proporcionó un clon de Pichia pastoris que codifica dominios de repetición de consenso corta de FHC humano 19 y 20 (denominados SCR19-20) en un vector de expresión de P. pastoris integrado.. La proteína se purificó del medio de cultivo de P. pastoris mediante filtración diferencial secuencial usando 70 unidades centrífugas de Vivacell con 50.000 y 5.000 Pm límite (Sartorius, Goettingen, Alemania) seguido por cromatografía de intercambio catiónico de HiTrap Sp FF (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ).
Purificación de autoanticuerpos de FHC humanos. Se desarrolló una estrategia de purificación de anticuerpos para llevar a cabo estudios funcionales sobre autoanticuerpos de FHC. En primer lugar, mediante cromatografía de Proteína G, se purificó del suero un volumen de inmunoglobulina.. A continuación, el anticuerpo específico se purificó por cromatografía de afinidad sobre Sefarosa activada con éster de N-hidroxisuccinimida 4 FF (GE Healthcare Life Sciences) conjugada de acuerdo con las instrucciones del fabricante con SCR19-20 reducido con TCEP, como se describe a continuación. La inmunoglobulina se cargó en la columna de SCR19-20, la columna se lavó y mediante elución con 3M tiocianato de sodio, Tris-HCl 20 mM, pH 6,8, se recuperó anticuerpo anti-FHC unido. El tampón de elución se cambió mediante etapas secuencias de dilución con PBS más glicerol al 10 %, seguido por concentración en un dispositivo de centrifugado Amicon Ultra 4 (30K PM límite), de modo que el tampón inicial se diluyó aproximadamente 6000X. La recuperación de anticuerpo anti-FHC se confirmó mediante un ensayo tanto de tipo ELISA como de inmunotransferencia.
ELISA de autoanticuerpos de FHC. Se recubrieron pocilos de una inmunocplaca de MaxiSorp (Nunc International, Rochester, NY) con 500 ng de FHC nativo, reducido, desnaturalizado o reducido y desnaturalizado (Complement Technology, Inc., Tyler, TX). La reducción se llevó a cabo incubando 1 mg/ml de FHC con 10 mM Tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) durante 30 min, a continuación, diluyendo la proteína a 5 pg/ml con solución de tampón de fosfato salino (PBS) y dispensando 100 pl por pocillo en la inmunoplaca. La desnaturalización se llevó a cabo con 7 M de urea seguido por dilución con PBS como anteriormente. Suero de NSCLC humano, positivo en anticuerpos de FHC tal como se evaluó mediante inmunotransferencia, se usó como el anticuerpo principal y HRP de cadena de anti-IgG gama (Millipore) fue el conjugado de anticuerpo-enzima secundario (1:2.000). Se desarrollaron las placas usando ácido 2,2'-azinobis [3-etilbenzotiazolina-6-sulfonico (ABTS) y peróxido de hidrógeno y lectura de absorbancia a 405 nm en un lector de placas (Tecan, San Jose, CA).
Representación de epítopos de autoanticuerpos de FHC humanos. Se llevó a cabo la representación de epítopos mediante Pepscan (Países Bajos), tal como se describe en Slootstra et al., Mol Divers (1996) 1:87-96. En resumen, péptidos de 15 meros que cubrían la secuencia de aminoácido completa de SCR19-20 se sintetizaron con un solapamiento de 14 aminoácidos. Se dispusieron los péptidos sobre un miniplaca propia y se cribaron en un formato de ELISA usando un anticuerpo humano purificado como el principal anticuerpo y un conjugado de peroxidasa anti-humana como el anticuerpo secundario. Las miniplacas se revelaron usando ABTS y peróxido de hidrógeno. El revelado de color se cuantificó con una cámara con dispositivo acoplado a carga (CCD) y un sistema de procesamiento de imágenes. Los valores obtenidos de la cámara de CCD varían de 0 a 3.000 mAU.
Experimentos de competencia de péptidos. Un péptido que contiene el epítopo completo de interés se sintetizó mediante GenScript (Piscataway, NJ). Para el experimento de inmunotransferencia, se incubaron autoanticuerpos purificados por afinidad (66,7 pg/ml) durante la noche a 4°C con péptido (1,67 mg/ml) en PBS, o en PBS solo (volumen final de 6 pl). Al día siguiente, los autoanticuerpos con o sin péptido se diluyeron a la concentración final de 2 pg/ml con PBS que contenía Tween-20 al 0,1 % (v/v) y leche seca no grasa al 5 % (p/v) y se usó para probar un FHC de longitud completa que contenía puntos y SCR19-20. Se detectó anticuerpo unido con conjugado de cadena anti-IgG gama-HRP (1:5.000) y un sustrato quimiluminescente, seguido por exposición a película. La competencia de péptidos de anticuerpos en ensayos a base de células se describe a continuación.
Deposición de C3 sobre células de cáncer de pulmón. Se usaron células A549 para determinar si los anticuerpos del FHC aumentan la deposición de fragmentos relacionados con C3 sobre la superficie de la célula tumoral en condiciones que favorecen la ruta alternativa. Se usó suero humano normal (NHS, Complement Technology, Inc.) a una dilución final de 1:8 como fuente de proteínas de complemento. Se desprendieron las células de A549 de las placas usando Versene (Life Technologies, Grand Island, NY), se lavaron el PBS de Dulbecco (DPBS) y se resuspendieron en tampón veronal que contenía Mg2 y EGTA (Boston Bioproducts, Ashland, MA). Se incubaron células 2,5 x 105) durante 30 min a 37 °C con NHS preincubado con anticuerpo de FHC de CI8 purificado (0,1 mg/ml, SantaCruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) o autoanticuerpos de FHC purificados por afinidad de paciente E (0,2 mg/ml) durante 30 min a 4 °C. Las células también se incubaron con NHS inactivado por calor (HI-NHS, se prepararon calentando NHS a 56 °C durante 30 minutos) o NHS preincubado con IgG humana agrupada (0,2 mg/ml, Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA) durante 30 min a 4 °C como controles negativos. Después de dos lavaros en BSA al 1 % (p/v) en DPBS (DPBS-BSA), se incubaron células durante 30 min a 4 °C con 0,5 pg de anticuerpo dC3 anti-humano de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Lifespan Biosciences, Seattle, WA). Después de la incubación de anticuerpo FITC-C3, las células se lavaron tres veces adicionales en DPBS-BSA para retirar el exceso de anticuerpo C3. Se llevó a cabo citometría de flujo usando un citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences, San Jose, CA) en las Instalaciones de Duke Cancer Center Core. Se determinó la intensidad de fluorescencia promedio en células A549, que se corresponden con la deposición C3 sobre la superficie celular usando software de FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR).
Para la competencia de péptidos, se preincubaron autoanticuerpos purificados por afinidad (0,7 mg/ml) durante la noche a temperatura ambiente con péptido (1,2 mg/ml). Después de la adición a las células, la concentración de autoanticuerpos fue de 0,2 mg/ml y a concentración de péptidos fue de 0,34 mg/ml.
Citotoxicidad dependiente de complemento de células de cáncer de pulmón. El efecto de los anticuerpos de FHC en la citotoxicidad mediada por complemento de células de tumor de adenocarcinoma (A549) se determinó usando condiciones de ensayo esencialmente idénticas a las usadas para determinar la deposición de C3 tal como se ha descrito anteriormente. Después de la incubación de células, suero y anticuerpos, las células se lavaron tres veces con DPBS-BSA y, a continuación, se resuspendieron en 1 pg/ml de yoduro de propidio (Biosource International, Camarillo, CA) en DPBS. Se llevó a cabo citometría de flujo y determinó el número de células positivas en yoduro de propidio.. Se llevó a cabo la competencia de péptidos como se ha descrito para el ensayo de deposición de C3.
Análisis estadístico. Se analizaron los datos obtenidos de experimentos de citotoxicidad mediada por complemento y deposición de C3 mediante el uso de la prueba de Student t. Todos los experimentos se completaron por triplicado y los datos de citotoxicidad y deposición de C3 se representan como desviación estándar ± de mediana.
Ejemplo 2
Anticuerpos de FHC en pacientes con NSCLC son específicos para FHC reducido
Se usaron anticuerpos con respecto a FHC en el suero de pacientes con NSCLC, tal com se describe en Amomsiripanitch et al., Clin. Can. Res. (2010) 16:3226-3231, en una inmunotransferencia en la que se redujo y/o desnaturalizó FHC. Como se muestra en la Fig. 1, el reconocimiento de anticuerpos en suero de FHC en un formato de ELISA fue dependiente en el tratamiento previo del FHC con un agente reductor, en este caso, TCEP. La reactividad no fue dependiente de la previa desnaturalización del FHC.
Puesto que el FHC es una proteína sérica ubicua y abundante, resulta sorprendente encontrar anticuerpos dirigidos frente a esta. Sin embargo, los anticuerpos presentes en el suero de pacientes con NSCLC todos tienen una preferencia distinta para la forma reducida del FHC. Puesto que los anticuerpos de paciente con NSCLC reconocen una forma reducida de la proteína del FHC, se examinó la posibilidad de que algunos pacientes con los autoanticuerpos pueden tener una mutación en el gen del FHC. Tal mutación podría crear una imitación estructural de la forma reducida de la proteína (tal como una mutación de Cys a Ser) o exponer un epítopo ocultado en la forma de tipo silvestre, de modo que ahora la proteína alterada era antigénica. Se llevó a cabo el direccionamiento por RT-PCR del dominio de SCR19-20 usando ARN aislado de 10 muestras de tumor de paciente. Todas las muestras sometidas a ensayo contenían secuencia de tipo silvestre en este dominio (datos no mostrados).
El suero de 12 pacientes positivos en autoanticuerpos se sometió a ensayo frente el péptido de epítopo de FHC en un ELISA usando anticuerpos secundarios específicos para IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. Todos los autoanticuerpos sometidos a ensayo parecen ser IgG3.
Ejemplo 3
Autoanticuerpos de FHC se unen a un fragmento de SCR19-20 de FHC
Se llevaron a cabo experimentos de representación de dominio iniciales incubando suero de paciente "transferencias puntuales" que contenían subconjuntos de módulos de SCR clonados y purificados. El suero positivo en anticuerpos de FHC de tres pacientes reaccionó con un fragmento que contenía SCR19 y SCR20 (datos no mostrados). Se reveló un ELISA de SCR19-20 reducido y se usó para mostrar que en un sondeo de 22 sueros que reconocían FHC de longitud completa sobre una inmunotransferencia, 20 proporcionaron fuertes señales en el ELISA (datos no mostrados.
Ejemplo 4
Autoanticuerpos de FHC representados por epítopos en SCR19
Se purificaron anticuerpos de FHC de ocho pacientes usando etapas de cromatografía de columna por afinidad de Proteína G secuencial y SCR19-20. Tres de los anticuerpos se representaron por epítopos en una biblioteca de péptidos que se solapaban sintetizados a partir de la secuencia completa de SCR19-20. Se sintetizó una biblioteca que consistía en 115 péptidos que se solapaban que comprendían todo el SCR19-20 y se seleccionaron con tres autoanticuerpos; se muestran los datos de señal de ELISA para uno de estos. El número de restos de aminoácidos de inicio y final en el FHC (UniProt P08603) se anotan al inicio y al final de cada péptido. Los restos en negrita son los que están presentes en todos los péptidos que proporcionan la señal más alta. Los restos que comprenden solo parte de este epítopo están en cursiva. Los datos de unión de péptido para un anticuerpo se muestran en la Tabla 5 que muestra la representación de epítopos.
Tabla 5
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Todos los tres anticuerpos reconocieron el epítopo PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3). Esta secuencia de aminoácidos se corresponde con FHC 1114-1121, los restos que están emplazados en la interfaz de unión con la porción de C3d de C3b en la estructura co-cristal de C3d-SCR19-20. C3d es un producto de escisión de C3b que permanece unido a la superficie celular mediante un dominio tioéster. El FHC D1119 está implicado en la estabilidad de la interfaz con C3d puesto que un mutante de D1119G de SCR19-20 suprimió la unión con C3d.
Se sintetizó un péptido con la secuencia PIDNGDITGGGK-biotina (SEQ ID NO: 120) y se usó como un competidor en inmunotransferencia de FHC y SCR19-20 sondeado con cada uno de los ocho anticuerpos del FHC humanos purificados. Se purificaron por afinidad ocho anticuerpos anti-FHC procedente de suero de paciente y se localizaron sus epítopos. Siete de los ocho anticuerpos se sometieron a competición por el péptido; la competencia se muestra para los tres anticuerpos en la Fig. 2. El epítopo común reconocido por estos siete se ubica dentro de un dominio funcional de FHC conocido por interactuar con C3b. Ejemplo 5
Anticuerpos de FHC purificados aumentan la deposición de C3 sobre células de carcinoma de pulmón A549 Puesto que la mayoría de los autoanticuerpos de FHC de pacientes con NSCLC parecieron interactuar con la región para la interacción de FHC-C3b, los anticuerpos se sometieron a ensayo para observar si podrían aumentar la deposición de C3b sobre células tumorales de pulmón. Se incubaron varios autoanticuerpos de FHC purificados con células de carcinoma de pulmón A549 y NHS como fuente de proteínas de complemento. Se midió la deposición de fragmentos relacionados con C3 mediante citometría de flujo usando un anticuerpo C3 anti-humano de ratón conjugado a FITC. Los resultados para uno de estos anticuerpos, "Anticuerpos E", se muestran en la Fig. 3. La deposición de C3 era dependiente de la presente de proteínas de complemento, ya que la deposición aumentó cuando se usó NHS en lugar de HI-NHS. Un aumento estadísticamente significante en deposición de C3 se observó en la presencia de anticuerpo de FHC de paciente con NSCLC sobre el control de IgG (p=0,011). El péptido que contenía el epítopo, es decir, PIDNGDITGGGK-biotina (SEQ ID NO: 120), neutralizó efectivamente el efecto del anticuerpo que demostraba especificidad al anticuerpo para FHC. Anticuerpo monoclonal de ratón C18, que se une a SCR20 pero que no se une a una forma reducida de FHC (datos no mostrados), se usó como control positivo en estos experimentos. C18 también aumentó la deposición C3 sobre células tumorales, acorde con su interacción propuesta con un dominio de FHC implicado en la unión tanto de C3b como de célula.
Los registros clínicos de 26 pacientes positivos de autoanticuerpos de FHC se examinaron en busca de evidencias de enfermedad renal, que puede ser indicador de una atenuación global de la actividad del FHC que provoca glomerulonefritis y, de este modo, un posible efecto colateral de un autoanticuerpo. Los pacientes positivos de anticuerpos de FHC no mostraron evidencia de enfermedad renal documentada y, se registraron, los niveles de BUN y creatinina fueron normales. Estos resultados sugirieron la ausencia de efectos colaterales de los autoanticuerpos de FHC.
Ejemplo 6
Anticuerpos de FHC purificados provocan citotoxicidad aumentada de células de carcinoma de pulmón A549 Puesto que la deposición de C3 debe llevar a citotoxicidad, los anticuerpos de pacientes con NSCLC se sometieron a ensayo para determinar si podrían traer citotoxicidad. Se incubaron anticuerpos de FHC purificados con células de carcinoma de pulmón A549 y NHS como una fuente de proteínas de complemento en condiciones que promueven la ruta de complemento alternativa. Se midió la citotoxicidad en un ensayo de citometría de flujo de yoduro de propidio. Los resultados para el Anticuerpo E se muestran en la Fig. 4. Hubo un aumento estadísticamente significante en la citotoxicidad observado en presencia del anticuerpo de FHC de paciente con NSCLC sobre el control de IgG (p=0,033) y, de nuevo, el péptido neutralizó el efecto del anticuerpo. Se usó anticuerpo monoclonal de ratón C18 como control positivo ya que C18 había mostrado previamente inhibir en gran medida la unión ed FHC a C3b y células endoteliales. Como se muestra en la Fig. 4, C18 provoca una citotoxicidad aumentada en células tumorales, acorde con su capacidad de inhibición de FHC.
Ejemplo 7
Materiales y Métodos
Producción de anticuerpos monoclonales/Información y secuenciación de péptidos. Se obtuvieron anticuerpos humanos frente a FHC que procedían de linfocitos B humanos. Los métodos usados para obtener, secuencias y caracterizar los anticuerpos se han descrito previamente. Liao et al. (2013) Immunity 38(1): 176-186; Bonsignori et al. (2012) J Virol 86(21): 11521-11532; Moody et al. (2012) J Virol 86(14): 7496-7507; Gray et al. (2011) J Virol 85(15): 7719-7729; Morris et al. (2011) PLoS ONE 6(9): e23532; Liao et al. (2009) J Virol Methods 158(1-2): 171­ 179. Se recogieron y agruparon linfocitos B de individuos con cáncer de fase temprana que tienen anticuerpos de FHC. Los linfocitos B que producían anticuerpos de HC se clasificaron con FACS de célula única usando un péptido de 15 meros de GPp Pp iDnGDITSFP (SEQ ID NO: 114) con un enlazador, específicamente, un péptido diana de GPPPPIDNGDITSFP(GGGK-biotina) (Se Q ID NO: 115), donde los restos y la biotina dentro del corchete representan un enlazador. Un tetrámero del péptido de 15 meros se usó para clasificar con FAC linfocitos B doble positivos. Una se clasificaron vez los linfocitos B que producían anticuerpos que reconocían el péptido diana, se clonaron los genes de inmunoglobulina de cada linfocito B individual. Los genes de inmunoglobulina se expresaron en células de mamífero para expresar la proteína/anticuerpo.
Inmunotransferencia: FHC de longitud completa y SCR19-20 se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras y se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA). La membrana se bloqueó con tampón de fosfato salino que contenía Tween-20 (PBST) al 0,1 % (v/v) y leche seca no grasa al 5 % (p/v) y se sondeó con anticuerpos monoclonales humanos recombinantes, cada uno a 0,5 |jg/ml. Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, la membrana se lavó en PBST e incubó durante 1 hora con conjugado de peroxidasa de rábano picante e IgG anti-humana de cabra gamma a una dilución de 1:10.000. Después de un lavado adicional se detectó el anticuerpo unido con sustrato quimiluminescente y se expuso a película.
ELISA frente a péptido de 15 meros: Neutravidin (Thermo Scientific, Rockford, IL), un derivado de unión a biotina de Proteína A, se inmovilizó en los pocillos de una placa de 96 pocillos de alta unión mediante incubación durante la noche a 4 °C. Después de bloquear los pocillos con PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1 % (p/v), se añadió péptido de 15 meros biotinilado (SEQ ID NO: 115) a 2 pg/ml en PBST a la mitad de los pocillos; la otra mitad restante recibió PBST solo para la determinación de fondo. Tras el lavado, se añadieron anticuerpos monoclonales humanos recombinantes a los pocillos a 0,5 pg/ml y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron e incubaron con conjugado de peroxidasa de rábano picante de IgG anti-humana de carba gamma a una dilución de 1:1.000. Después de un lavado adicional se detectó el anticuerpo unido con ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolina-6-sulfónico (ABTS)/peróxido de hidrógeno y la absorbancia medida a 405 nm.
ELISA frente a SCR19-20. Se recubrieron placas ELISA con Neutravidin y se bloquearon como se ha descrito anteriormente. Se diluyo SCR19-20 reducida o no reducida a 2 pg/ml en PBST y se incubó en los pocillos adecuados durante 1 h. Se redujo SCR19-20 mediante incubación en 10 mM Tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 30 minutos; se retiró el exceso de TCEP con un cartucho de centrifugación de exclusión por tamaño. Tras el lavado, se añadieron anticuerpos monoclonales humanos recombinantes a los pocillos a 0,2 pg/ml y se incuberaon durante 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron e incubaron con conjugado de peroxidasa de rábano picante de IgG anti-humana de carba gamma a una dilución de 1:1.000. Después de un lavado adicional se detectó el anticuerpo unido con ABTS/peróxido de hidrógeno y se midió la absorbancia a 405 nm.
Ensayo de citotoxicidad de LDH A549: Se cultivaron células A549, se lavaron, recontaron y colocaron en placas en una placa de 96 pocillos a 5 x 103 células/pocillo en 100 pl de medio RPMI 1640 con suero fetal bovino (FBS) al 10 %. Las células se incubaron durante 24 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. A continuación, se cambió el medio a RPMI 1640 and 1X tampón de veronal (Lonza, Walkersville, MD). Se añadió suero humano normal (NHS) a una dilución de 1:8 a cada condición experimental. Se inactivó por calor suero humano normal a 56 °C durante 30 minutos (HINHS) y se usó a una dilución de 1:8 como control negativo. Además de NHS o HINHS, las células se trataron con anticuerpos monoclonales humanos recombinantes purificados a 20, 60, o 120 pg/ml. Todas las condiciones se evaluaron por triplicado.
Después de 24 horas a 37 °C y CO2 al 5 %, se determinó la citotoxicidad usando el Ensayo de citotoxicidad no radioactivo de CytoTox 96 (Promega, Madison, WI). Se sometieron a ensayo cincuenta microlitros de sobrenadantes para determinar la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) siguiendo el protocolo del fabricante. Se determinaron la liberación de LDH espontánea y la liberación de LDH máxima según recomienda el protocolo de LDH. El cálculo del porcentaje de citotoxicidad para cada condición fue del siguiente modo:
Experimental — Espontánea
% Citotoxicidad = — -—:--------------------— ---------- jtlOO Máxima, - Espontanea
Ejemplo 8
Se sometieron a ensayo los anticuerpos clonados usando ELISA frente al péptido de 15 meros (es decir, biotinilado de 19 meros unido al Neutravidin inmovilizado) (Fig. 5) y usando una inmunotransferencia frente a FHC reducido o no reducido y SCR19-20.
Todos los anticuerpos que reconocían FHC y SCR19-20 en la inmunotransferencia mostraron unión potenciada a las proteínas reducidas. Se realizaron ensayos de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) frente a células de cáncer de mama usando una agrupación de todos los anticuerpos positivos.
Se obtuvieron diecisiete pares de construcciones que expresaban regiones VH y VL específicas a FHC, tal como se resume en la Tabla 6. Como se muestra en la tabla 6, cada par de construcciones de VH y VL, designadas IgH_ID e IgK_ID, expresaban un anticuerpo monoclonal específico a FHC que comprendía una cadena pesada y una cadena ligera kappa. Todas expresaron anticuerpos monoclonales que contenían regiones constantes de IgG1. Los isotipos de los anticuerpos existentes en los linfocitos B de donador fueron o bien IgG3 (n = 13) o bien IgM (n = 2). Anticuerpos en tres linajes clonales distintos se indican mediante "*", "a” y "b”. H007957, H007958, H007963 y H007982 tienen secuencias idénticas; K005991, K005992, K005998 y K006018 así como K006004 tienen las secuencias idénticas; H007960 y H007967 tienen las secuencias idénticas; K005994 y K006002 tienen la secuencia idéntica; H007961 y H007965 tienen la secuencia idéntica; K006003 y K006000 tienen la secuencia idéntica; y H007968 y H007971 tienen la secuencia idéntica. Se determinaron los HCDR3 de cadena pesada (véase Tabla 1, restos subrayados para SEQ ID NO 4-20.
T l Inf rm in ni ^ I ni r r i ní n n r lmn
Figure imgf000055_0001
La Tabla 7 identifica las SEQ ID NO que se corresponden con las secuencias de aminoácidos de VH y VL y nucleótidos determinadas para cada clon descrito en la Tabla 6. La Fig.5 muestra los datos del ELISA de los 17 anticuerpos purificados.
Tabla 7
Figure imgf000055_0002
Ejemplo 9
Anticuerpos recombinantes
La Tabla 8 muestra 11 pares de VH y VK de Ig únicos usados para la producción de anticuerpos recombinantes que usan la estructura principal de cadena pesada de IgG1 y constante de cadena ligera kappa. Anticuerpos en tres linajes clonales distintos se indican mediante "*", "a” y "b”.
Tabla 8
Figure imgf000056_0001
La Tabla 9 identifica las SEQ ID NO que se corresponden con las secuencias de aminoácidos de VH y VL y nucleótidos determinadas para cada clon descrito en la Tabla 8. La Tabla 2 muestra la regiones de HCDR3 como los restos subrayados para las SEQ ID NO. 72-82.
Tabla 9
Figure imgf000056_0002
Los anticuerpos recombinantes se sometieron a ensayo usando ELISA frente al péptido de 15 meros (es decir, el biotinilado de 19 meros unido a Neutravidina inmovilizada (Fig. 6) y el péptido de SCR19-20-biotina (Fig. 8). Los anticuerpos recombinantes se sometieron a ensayo usando una inmunotransferencia frente a FHC reducido o no reducido y SCR19-20 (Tabla 10; Fig. 7).
Tabla 10
Figure imgf000056_0003
Figure imgf000057_0002
Los anticuerpos que reconocían FHC y SCR19-20 en la inmunotransferencia mostraron unión potenciada a las proteínas reducidas ( Fig. 7). Se realizaron ensayos de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) frente a células de cáncer de mama usando anticuerpos Ab7960/293i y Ab7968 (Fig. 9).
Ejemplo 10
Localización de epítopos
Se completó el barrido de alanina para todos los 7 mAbs de FHC para identificar los restos la unión de mAb de FHC identificado. Se usó resonancia de plasmón de superficie (SPR) para medir la afinidad de unión de cada mAb frente a un panel de péptidos de 15 meros sustituidos con alanina de GPPPPIDNGDITSFP (SEQ ID NO: 114). El péptido parental consistía en el epítopo de 8 meros originalmente identificado, es decir, PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3) flanqueado por restos de f Hc adicionales. Se reemplazó la alanina por el resto original en cada posición en el de 15 mero para crear un panel de 15 péptidos distintos. La comparación de la afinidad de unión de cada mAb apra el péptido parental con el medido frente al péptido sustituido con alanina reveló restos importantes para la unión de mAb. Este estudio reveló que no había restos importantes fuera del epítopo de 8 meros original. Los restos importantes dentro del 8 meros fueron similares en global entre todos los 7 mAb (Fig. 10-16 y Tabla 11).
Tabla 11
Figure imgf000057_0001
Ejemplo 11
Afinidades de unión
Se determinó la afinidad de uno de los mAb de FHC, Ab7968, que era del orden de 2,5 pM. La afinidad de unión del mAb se midió a 25, 50, o 100 nM frente al péptido de 15 meros inmovilizado de GPPPPIDNGDITSFP (SEQ ID NO: 114) usando SPR en un instrumento BIAcore. El análisis reveló una tasa de disociación (kd) de 5,56 x 10-7 s-1; una tasa de asociación (ka) de 2,26 x 105 M 'V ; y una afinidad (KD) de 2,46 x 10-12 M.
Ejemplo 12
Ensayo de reactividad cruzada
Se sometieron a ensayo todos los 7 mAb frente al panel de AtheNA Multi-Lyte de autoantígenos. El ensayo ANA de AtheNA Multi-Lyte para un panel de antígenos nucleares: autoantígenos de lupus eritematoso sistémico SSA y SSB, esfingomielina (Sm), ribonucleoproteina (RNP), autoantígeno de esclerosis (Scl-70), histidina-ARNt ligasa (Jo-1), ADN bicatenario (ADNbc), centrómero B (CentB) e histonas. 4e10 (Anti VIH, Programa de reactivos de SIDA NIH) y SYNAGIS® (palivizumab de anticuerpos monoclonales anti-RSV; “Synagis”) se usaron como controles. Dos de los mAb demostraron algo de reactividad cruzada (véase números en negrita) y cinco no mostraron evidencia de reactividad cruzada (Tabla 12).
T l 12 A h n r n i r ^ n r
Figure imgf000058_0001
Ejemplo 13
Aumento dependiente de dosis de mAb de FHC en CDC
mAb de FHC provocó un aumento dependiente de dosis en CDC en células de cáncer de pulmón. Se incubaron células de cáncer de pulmón A549 con mAb de FHC, mAb7968 o mAb7960 o control negativo, mAb emparejados con subclase de IgG junto con suero humano normal (NHS) como una fuente de complemento. Los mAb se sometieron a ensayo a 60 o 120 pg/ml y se midió la citotoxicidad mediante un ELISA de liberación de LDH (véase, por ejemplo, Fig. 17). La Fig. 17 muestra que mAb de FHC 7968 provocó un aumento estadísticamente significante en c Dc a 60 pg/ml (p = 0,006) y 120 pg/ml (p = 0,004).
Ejemplo 14
CDC inducido por anticuerpos de FHC se bloqueó con el péptido de epítopo
Se bloqueó CDC inducido por anticuerpos de FHC con el péptido de epítopo (SEQ ID NO: 3). El experimento fue esencialmente el mismo que en el ensayo de CDC como se ha descrito en el Ejemplo de Respuesta a Dosis excepto en que un anticuerpo de FHC que se había purificado por afinidad de suero de paciente se usó y se cuantificó la muerte celular usando ensayo de citometría de flujo de yoduro de propidio, tal como se describió anteriormente. Antes de incubar células A549 con anticuerpo de FHC o IgG humana normal, los anticuerpos se incubaron con el péptido de epítopo (SEQ ID NO: 3) durante la noche a TA con 200 M de exceso del péptido en comparación con el anticuerpo. La preincubación de péptidos provocó una disminución estadísticamente significante (p = 0,02) en CDC inducido por el anticuerpo de FHC. El CDC observado puede haber sido provocado por la unión del anticuerpo de FHC a su diana.
Ejemplo 15
CDC inducido por mAb de FHC en combinación con otros fármacos
CDC inducido por mAb de FHC se suma a los efectos de Cetuximab, Perjeta y Herceptin. Los mAb de FHC pueden usarse en conjunción con otros fármacos anti-cáncer para aumentar la destrucción de células tumorales, es decir, potenciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de células (ADCC) y toxicidad mediada por células. Mediante el uso del ensayo de CDC tal como se ha descrito en el Ejemplo de Respuesta a Dosis, se incubaron células A549 con Cetuximab a 80 pg/ml con o sin mAb de FHC 7968 a 100 pg/ml. La inclusión de mAb 7968 provocó un aumento estadísticamente significante (p = 0,04) en el nivel de CDC inducido por Cetuximab solo (Fig. 19). mAb de control negativo dio como resultado ningún aumento en CDC inducido por Cetuximab.
Ejemplo 16
Inducción de mAb de FHC de CDC en líneas celulares de cáncer de mama
Los mAb de FHC fueron inductores eficaces de CDC en líneas celulares de cáncer de mama. Los mAb de FHC fueron inductores eficaces de CDC en líneas celulares de cáncer de mama MCF7, regiones de SKBR3, MDA-MB-231 (Fig. 20). La Fig. 20 muestra un diagrama de CDC en la línea celular SKBR3 mediante el uso del formato de ensayo de CDC tal como se ha descrito en el Ejemplo de Respuesta a Dosis descrito anteriormente. Células de cáncer de mama SKBR3, que sobreexpresan el producto génico de HER2/c-erb-2, fueron susceptibles a CDC inducido por mAb de FHC 7968. Se indujo CDC en células SKBR3 mediante mAb 7968 a 50 o 100 pg/ml.
Ejemplo 17
Crecimiento tumoral - Estudios en animales
La capacidad de uno de los mAb de FHC (mAb de FHC 7968) en inhibir el crecimiento de xenoinjerto tumoral de pulmón se investigó en ratones lampiños atímicos. Los ratones se administraron a 20 o 200 pg/dosis, dos dosis por animal a la semana, durante 5 semanas.
Se indujeron xenoinjertos de tumor pulmonar en ratones lampiños atímicos hembra mediante la inyección subcutánea de 2 millones de células A549 suspendidas en 100 pl de una mezcla 50:50 de solución tamponada salina de Hank/2 % (v/v) de FBS y Matrigel (BD Biosciences catalog number 354234). Cuando los tumores alcanzaron 50-75 mm3 ide volumen, Los ratones se distribuyeron al azar en 5 cohortes de 5 ratones por cohorte. Dos veces por semana, se inyectaron los ratones con uno de lo siguiente: 20 pg de mAb de FHC 7968, 200 pg de mAb de FHC 7968, 20 pg de IgG e control negativo emparejada con subclase o 200 pg de IgG de control negativo. Una cohorte no recibió tratamiento. Todos los anticuerpos se inyectaron por vía intraperitoneal en un volumen de 150 pl de tampón de fosfato salino. Se midieron los volúmenes tumorales con calibradores cada 7 días y el volumen se calculó usando la fórmula V = W2 x L/2. (Fig. 21-24). Hubo algo de diferencia dependiente de dosis a los 14 días, pero no se observó ninguna inhibición de crecimiento estadísticamente significante en comparación con un anticuerpo de control negativo a los 28 días (consistente con los estudios de ARNsi de FHC anteriores).

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo del mismo, que se une inmunoespecíficamente a la proteína del Factor H del Complemento (FHC), en el que la unión del anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, al FHC reducido se potencia en comparación con su unión al FHC no reducido, el anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, se une a un epítopo dentro de la repetición de consenso corta (SCR) 19 de la proteína de FHC y dicho epítopo comprende PIDNGDIT (SEQ ID NO: 3).
2. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende:
a) un dominio pesado variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 y una región de dominio ligero variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84;
b) un dominio pesado variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 y una región de dominio ligero variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83;
c) un dominio pesado variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 y una región de dominio ligero variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85;
d) un dominio pesado variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 y una región de dominio ligero variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88; o
e) un dominio pesado variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y una región de dominio ligero variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89.
3. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, no reacciona en cruzado con al menos uno de autoantígenos de lupus eritematoso sistémico SSA, SSB, esfingomielina (Sm), ribonucleoproteína (RNP), autoantígeno de esclerosis (Scl-70), histidina-ARNt ligasa (Jo-1), ADN bicatenario (ADNbc), centrómero B (CentB) e histonas en un ensayo que usa el panel de AtheNA Multi-Lyte t™) de autoantígenos.
4. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv unido a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo madurado por afinidad, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo con CDR injertada, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo de doble especificidad, un anticuerpo de dominio doble variable (DVD), un anticuerpo de dominio triple variable (TVD), un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv.
5. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo,o fragmento de anticuerpo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 79, SEQ ID
NO: 89, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17,
SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24,
SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31,
SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 72,
SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80,
SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92.
6. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico aislado comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 38, SEQ
ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID N ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 93, SEQ ID ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102 y
SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID
NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 113.
7. Una célula aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos unida operativamente a un promotor, comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos el ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones
5 o 6.
8. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el ácido nucleico aislado de la reivindicación 5 o 6 o la célula aislada de la reivindicación 7.
9. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el ácido nucleico aislado de la reivindicación 5 o 6, la célula aislada de la reivindicación 7 o la composición farmacéutica de la reivindicación 8, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que lo necesita que tiene cáncer o para su uso en un método de inhibición de crecimiento tumoral en un sujeto, comprendiendo el método la administración al sujeto del anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, del ácido nucleico aislado, de la célula aislada o de la composición farmacéutica.
10. El anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el ácido nucleico aislado de la reivindicación 5 o 6, la célula aislada de la reivindicación 7 o la composición farmacéutica de la reivindicación 8, para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, comprendiendo el método adicionalmente la administración de una cantidad eficaz de al menos uno de Cetuximab, pertuzumab o trastuzumab.
11. Un método de detección o medición de una forma reducida o conformación específica de célula tumoral del Factor H del Complemento (FHC) en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
12. Un método in vitro de aumentar la lisis dependiente de complemento de una célula, aumentar la deposición de C3b sobre una célula o inhibir la unión del Factor H del Complemento (FHC) con C3b en una célula, comprendiendo el método administrar a la célula el anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o la composición farmacéutica de la reivindicación 8.
13. Un kit que comprende el anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o la composición farmacéutica de la reivindicación 8.
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