CN106519030B

CN106519030B - 补体因子h抑制剂及与之相关的用途

Info

Publication number: CN106519030B
Application number: CN201611201316.2A
Authority: CN
Inventors: 廖化新; 王月明; 袁晓辉; 昝利鹏; 刘彤; 吴昌文; 张远旭
Original assignee: Zhuhai Microlab Biotechnology Co Ltd; GUANGZHOU TAINUODI BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Jinan University
Current assignee: Guangzhou Tainuodi Biotechnology Co ltd; Zhuhai Tainuo Maibo Pharmaceutical Co ltd; Jinan University
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2020-01-07
Anticipated expiration: 2036-12-22
Also published as: CN106519030A

Abstract

本发明公开了一种用于治疗癌症的CFH抑制剂，该CFH抑制剂是CFH特异性抗体。更具体的，CFH抑制剂是CFH特异性单克隆抗体。本发明的CFH抑制剂通过阻止CFH与C3b的结合，增加肿瘤细胞上的C3b沉积并促进了补体介导的细胞毒性作用。基于此，本发明提供了一种用于癌症治疗的治疗方法。

Description

补体因子H抑制剂及与之相关的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及补体因子H抑制剂及与之相关的用途，具体涉及一种补体因子H抑制剂以及该抑制剂在治疗与补体因子H相关的疾病中的用途。

背景技术

肺癌是一个重大的公共卫生问题。当治疗选择有限且需要系统治疗的晚期时大多数肿瘤仍被检测出是发展时期。即使是可切除的早期肺癌患者也几乎有50％的发展机会复发且在某些时候需要辅助治疗。在过去几年新疗法已经引入了靶向特异性途径，并且在这些选择个体中产生初始反应。然而，几乎所有的患者都发展为耐药，这很可能是由于肿瘤异质性和克隆进化。

虽然已经研究了针对恶性细胞的体液应答的激活，但是体液免疫本身尚未非常好被用于癌症治疗。已经有针对超过100种不同肿瘤相关抗原(TAA)的循环抗体，但很少有与肿瘤阶段或结果相关。某些宿主抗体可以具有抗肿瘤活性的潜力，但是由于许多可能的原因(包括抗体的低浓度或低亲和力或无效的)，该能力尚未完全实现活化B淋巴细胞。显然需要更多的和更广泛的种类有效治疗。

发明内容

本发明提供了一种用于治疗癌症的CFH抑制剂，所述CFH抑制剂是CFH特异性抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。在本发明的具体实施方案中，所述CFH抑制剂是CFH特异性单克隆抗体。所述CFH抑制剂识别体外还原形式的CFH。所述CFH抑制剂能够增加肿瘤细胞上的C3b沉积并增加肿瘤细胞的补体依赖性溶解。基于此，本发明公开了一种用于癌症治疗的治疗方法。

本发明的CFH抑制剂包括：

(1)SEQ ID NO:2所示的重链CDR1、SEQ ID NO:3所示的重链CDR2、SEQ ID NO:4所示的重链CDR3；和/或

(2)SEQ ID NO:6所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:7所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:8所示的轻链CDR3。

作为本发明的一个方面，本发明的CFH抑制剂包括：

(1)重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和/或

(2)轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

本发明的CFH抑制剂的的结合抗原是包括SCR19区的8个特定氨基酸PIDNGDIT(SEQID NO:10)的多肽。本发明的CFH抑制剂与上述多肽的结合域是PIDNGDIT。

在本发明的具体实施方案中，本发明的CFH抑制剂的的结合抗原是SCR19区氨基酸组成的多肽，序列如SEQ ID NO:9所示。但是本发明的CFH抑制剂的的结合抗原不限于SCR19区的多肽，只要包含PIDNGDIT序列的多肽均可以作为本发明的CFH抑制剂的结合抗原。

为了方便解释以下抑制剂的功能变体，将上面所述的CHF抑制剂称之为亲代抑制剂。

本发明的CFH抑制剂可以是完整的免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)类(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。

本发明的CFH抑制剂还可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab片段，Fab'片段，Fab'-SH片段，F(ab')²片段，Fd片段，Fv片段，双抗体，单链Fv(scFv)仅含有一个轻链可变区的单链多肽，含有轻链可变区的三个CDR的单链多肽，仅含有一个重链可变区的单链多肽，含有一个重链可变区的三个CDR的单链多肽，重链可变区和VHH。

本发明的CFH抑制剂还包括前面所述的CFH抑制剂的功能变体，所述的功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代抑制剂中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代抑制剂的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述抑制剂的结合特性，即所述抑制剂仍能识别并结合其靶位。

所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。

此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代抑制剂相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合CFH。此后，当使用术语“抑制剂”时，其也涵盖所述抑制剂的功能变体。

所述功能变体还包含对高变区的修饰，高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代抑制剂具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。

本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代抑制剂或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。

本发明的CFH抑制剂对CFH的还原形式敏感。意思是CFH抑制剂对CFH的结合亲和力根据CFH是处于还原形式还是未还原形式而改变。如果CFH不是还原形式，CFH抑制剂对CFH具有较低的结合亲和力。

本发明提供了编码前面所述的CFH抑制剂的核酸分子。所述的核酸分子可以包含在严格条件下与编码包含重链或轻链序列的抗体的核酸分子杂交的核苷酸序列。

所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的抑制剂(或其片段，或其衍生物)的核酸序列。然后可将该核酸序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的抑制剂的序列中。

本发明还提供了一种包括前面所述的核酸分子的载体，除了前面所述的核酸分子之外，载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的调控序列。

这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达核酸分子或者蛋白质。

所述载体包括克隆载体或者表达载体。克隆载体用于扩增核酸分子，表达载体用于表达核酸分子编码的蛋白质。

本发明还提供了一种含有前面所述的核酸分子或前面所述的载体的宿主细胞。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COS,293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明提供了一种包括治疗有效量的前面所述的CFH抑制剂的药物组合物。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。

本发明还提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文所述至少一个抑制剂以及进一步包含至少一个标记物可检测的部分/物质。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。

为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抑制剂的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的抑制剂及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码抑制剂的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。

本发明还提供了一种测定样品中CFH的产品，所述产品包括前面所述的CFH抑制剂。

进一步，本发明的上述产品测定的是样品中的补体因子H(CFH)还原形式。

进一步，所述产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述抑制剂的能够检测出CFH的检测产品均包括在本发明的范围之内。

本发明的CFH抑制剂，又可以叫做CFH抗体，可以通过多种技术中的任一种制备。通常，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括通过常规技术产生单克隆抗体，或通过将抗体基因，重链和/或轻链转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中，以允许抗体的产生，其中所述抗体可以是重组的。术语“转染”的各种形式意在包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的各种技术，例如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选在真核细胞中表达抗体，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)更可能比原核细胞组装和分泌正确折叠和免疫活性的抗体。

用于表达重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞，本发明包括与DHFR选择标记一起使用的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)，NS0骨髓瘤细胞，COS细胞，HEK 293T细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达的一段时间，或更优选地，将抗体分泌至培养宿主细胞的培养基。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。

宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应当理解，上述程序的变化在本发明的范围内。例如，可能期望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于除去一些或所有编码轻链和重链之一或两者的DNA，其不是结合感兴趣的抗原所必需的。从这种截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体中。此外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体(即，结合人CFH)，并且另一条重链和轻链对于除人CFH之外的抗原是特异性的。

制备单克隆抗体的方法涉及永生细胞的制备，能够产生具有所需特异性的抗体的细胞系。这样的细胞系可以从获自免疫动物的脾细胞产生。可以用免疫动物生产CFH或其片段和/或变体。

可以从生长的杂交瘤的上清液中分离单克隆抗体。此外，可以采用各种技术来提高产量，例如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主(例如小鼠)的腹膜腔中。然后可以从腹水液体或血液收获单克隆抗体。污染物可以通过常规技术例如色谱，凝胶过滤，沉淀和提取从抗体中除去。亲和层析是可用于纯化抗体的方法的实例。

本发明提供了一种治疗患癌受试者的方法。所述方法包括向所述受试者施用所述CFH抑制剂，或者施用包括所述CFH抑制剂的药物组合物，或者施用包括编码所述CFH抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体或者细胞。

所述方法可以进一步包括施用有效量的西妥昔单抗，Perjeta或赫赛汀中的至少一种。

本发明还提供了一种检测或测量样品中的补体因子H(CFH)的方法。该方法包括使样品与所述CFH抑制剂接触。

本发明还提供了一种裂解细胞增加补体依赖性的方法。所述方法包括对所述细胞施用所述CFH抑制剂或包括所述CFH抑制剂的药物组合物。

本发明还提供了一种增加C3b沉积细胞表面的方法。所述方法包括对所述细胞施用所述CFH抑制剂或包括所述CFH抑制剂的药物组合物。

本发明还提供了一种受试者或细胞中抑制补体因子H(CFH)与C3b结合的方法。所述方法包括对所述细胞施用所述CFH抑制剂或包括所述CFH抑制剂的药物组合物。

本发明还提供了一种抑制受试者肿瘤生长的方法。所述方法包括向所述受试者施用所述CFH抑制剂，或者施用包括所述CFH抑制剂的药物组合物，或者施用包括编码所述CFH抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体或者细胞，可以抑制肺肿瘤生长。

本发明还提供了前面所述的抑制剂在制备测定CFH产品中的应用。

所述产品包括前面所述的CFH抑制剂；所述产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述的CFH抑制剂能够检测出CFH的产品均包括在本发明的范围之内。

本发明还提供了前面所述的CFH抑制剂在制备补体相关疾病的药物中的应用。

进一步，所述补体相关疾病包括但不限于下例：肾上腺皮质癌，肛门癌，膀胱癌，脑肿瘤，乳腺癌，类癌肿瘤，胃肠道未知原发癌，子宫颈癌，结肠癌，子宫内膜癌，食管癌，肝外胆管癌症，Ewings家庭肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤，眼内黑色素瘤眼癌，胆囊癌，胃癌，外生殖细胞肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，头颈癌，下咽癌，胰岛细胞癌，肾癌，喉癌，口腔癌，肝癌，肺癌，艾滋病相关淋巴瘤，中枢神经系统淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，恶性间皮瘤，黑色素瘤，梅克尔细胞癌，多发性骨髓瘤、浆细胞瘤，鼻咽癌，成骨细胞瘤，口咽癌，骨肉瘤，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，胰腺癌，外分泌，胰腺癌，鼻旁窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，垂体癌，前列腺癌，横纹肌肉瘤，直肠癌，过渡细胞肾盂和尿道癌，唾液腺癌，Sezary综合征，皮肤癌，小肠癌，软组织肉瘤，睾丸癌，恶性胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，子宫癌，不寻常的儿童癌症，阴道癌，Vulvar癌症和Wilms'瘤。

在本发明的具体实施方案中，本发明研究的癌症是肺癌。

本发明的抑制剂还可以与其他具有相同或者互补功能的药物联合应用，联合应用的效果可以是抑制剂与其他药物功能之和，还可以远远大于抑制剂与其他药物功能之和，这种情况表明该抑制剂与其他药物之间产生了协同作用。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。如有冲突，本文件(包括定义)将予以控制。优选的方法和材料如下所述，尽管与本文所述相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献通过引用以其全文并入本文。本文公开的材料，方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。

本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本文所用的术语“施用”是指接触和/或递送CFH抑制剂以获得期望的效果。CFH抑制剂可以以多种方式施用于受试者，包括但不限于口服，眼部，鼻部，静脉内，局部，气溶胶，栓剂等，并且可以组合使用。

本文所用的术语“自身抗体”是指由个体产生的针对个体自身蛋白，碳水化合物或核酸的免疫球蛋白，抗原特异性B细胞表面受体(表面免疫球蛋白)或抗原特异性T细胞受体。

本文使用的术语“有效量”是指在所需时间内有效的药物剂量，以实现所需的剂量治疗结果。有效剂量可以由本领域技术人员确定，并且可以根据个体的疾病状态，年龄，性别和体重等因素而变化药物在个体中引起所需反应的能力。本文使用的该术语还指在动物，哺乳动物，哺乳动物，或人类，例如减少和/或抑制雌激素受体的功能。治疗有效量可以一次或多次施用(例如，药剂可作为预防性治疗或在疾病进展的任何阶段治疗性地，在症状之前或之后等)，应用或剂量给予，并且不是预期的限于特定的制剂，组合或施用途径。给药次数和剂量取决于几个因素，例如治疗的目标，受试者等，并且可以由本领域技术人员容易地确定。

本文可互换使用的“癌症”或“肿瘤”是指不受控制的不规则的生长的异常细胞在体内。癌症可能侵入身体的附近部分，并且还可能通过淋巴系统或血流传播到身体的更远的部分。本文可互换使用的“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指以不受控制的生长分裂和再生异常的细胞。癌细胞可以分裂并行进到身体的其他部分并建立另一个位点，称为转移。癌细胞或癌细胞也称为恶性细胞。癌细胞或癌细胞系可起源于癌症。例如，癌细胞系可以是A549细胞系(“A549”)，其是人肺腺癌上皮细胞系。

本文所用的“补体因子H蛋白”，“CFH蛋白”或“CFH”可以互换使用，是指大约150kDa的蛋白质，其是补体激活家族的调节物的成员并且是补体对照蛋白质。CFH是大的可溶性糖蛋白，其在人血浆中循环并用于调节补体系统的旁路途径，确保补体系统针对病原体或其它危险物质并且不损害宿主组织。CFH是通过因子I失活C3b的辅因子，并且起作用以增加替代补体途径中C3bBb复合物(C3转化酶)和(C3b)NBB复合物(C5转化酶)的解离速率，CFH与糖胺聚糖结合，通常存在于宿主细胞上，但通常不存在于病原体表面上。CFH由20个短的共有重复序列(SCR)组成，其中一些重复序列起细胞附着的作用，而其他重复序列的功能是从细胞表面消除C3b。20个SCRs包含CFH各自约60个氨基酸长，以头尾相连排列，含有4个半胱氨酸残基，每个模块形成2个二硫键。C3b结合结构域可以指结合C3b的CFH部分。SCR 19和20参与C3b的结合。

“表位”是指被识别并可以结合特异性配偶体的任何分子上的位点。分子和特异性配偶体是特异性结合对的一部分。例如，表位可以在多肽，蛋白质，半抗原，碳水化合物抗原(例如但不限于糖脂，糖蛋白或脂多糖)或多糖上。其特异性配偶体可以是但不限于抗体。在本文中，表位指的是抗原上的表位，特异性配偶体是抗体。

如本文所用的“肺癌”是指起源于肺的癌症。例如，肺癌可以是小细胞肺癌，非小细胞肺癌(“NSCLC”)，腺体肿瘤，类癌瘤和未分化的癌。

本发明的“样品”可以是血液，组织，尿液，血清，血浆，羊水，脑脊液，胎盘细胞或组织，内皮细胞，白细胞或单核细胞的样品。样品可以直接从患者获得或可以预处理，例如通过过滤，蒸馏，提取，浓缩，离心，干扰组分的灭活，添加试剂等，以修饰样品。

可以使用任何细胞类型，组织或体液来获得样品。这样的细胞类型，组织和流体可以包括组织切片，例如活组织检查和尸检样本，为组织学目的取得的冷冻切片，血液(例如全血)，血浆，血清，痰，粪便，眼泪，粘液，唾液，支气管肺泡灌洗液BAL)流体，毛发，皮肤，红细胞，血小板，间质液，眼晶状体液，脑脊髓液，汗液，鼻液，滑液，月经，羊水，精液等。细胞类型和组织也可包括淋巴流体，胃肠液，妇科液，尿，腹膜液，脑脊液，通过阴道冲洗收集的液体或通过阴道冲洗收集的液体。组织或细胞类型可以通过从动物中除去细胞样品来提供，但也可以通过使用先前分离的细胞(例如，由另一个人分离，在另一时间和/或为了另一个目的)来实现。也可以使用存档组织，例如具有治疗或结果历史的那些。蛋白质或核苷酸分离和/或纯化可能不是必需的。

本文可互换使用的“短共有重复”或“SCR”基于β-夹心排列的结构，其中一个表面由三个β链构成，氢键结合以在其中心形成三链区域，而另一个表面由两个单独的β链形成。SCR也称为补体控制蛋白(CCP)模块和寿司结构域。SCR存在于多种补体和粘附蛋白中。如本文所用，“SCR19”是指短共有重复域19，“SCR19-20”是指短共有重复域19和20，如母体分子CFH中彼此共价连接。

本文所用的“受试者”和“患者”可互换地指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如牛，猪，骆驼，骆驼，马，山羊，兔，绵羊，仓鼠，豚鼠，猫，狗，大鼠和小鼠，非人灵长类动物，猴，例如食蟹猴或恒河猴，黑猩猩等)和人)。在一些实施方案中，受试者可以是人或非人。受试者或患者可以经历其他形式的治疗。

本文所用的“治疗”描述逆转，减轻或抑制该术语适用的疾病或该疾病的一种或多种症状的进展。根据受试者的状况，该术语还指预防疾病，并且包括预防疾病的发作或预防与疾病相关的症状。治疗可以以急性或慢性方式进行。该术语还指在患有疾病之前降低与该疾病相关的疾病或症状的严重性。在疾病之前这种疾病的预防或减轻的严重程度是指将本发明的抗体或药物组合物施用给不是在施用疾病的施用时间的受试者。“预防”还指防止疾病或与该疾病相关的一种或多种症状的复发。

附图说明

图1显示利用SDS-PAGE鉴定表达纯化后TRN1006抗体的图；

图2显示利用ELLSA检测抗体TRN1006结合位点的结果图；

图3显示利用BiaCore检测TRN1006抗体的亲和活性的图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1 PBMC分离和单个记忆性B细胞分选

通过免疫印迹法寻找到11个表达CFH自身抗体的病人，合并其外周血单个核细胞(PBMC)。用亲和素标记CFH 15-mer多肽(SEQ ID NO:9)作为钓饵，利用流式分选仪从合并的PBMC中分选到了单个记忆B细胞：依次选取P1(淋巴细胞门)→P2(IgG+)→P3(CD3-/CD14-/CD16-/CD20+/CD27ALL)。选择P1&P2&P3门(IgG+/CD3-/CD14-/CD16-/CD20+/CD27ALL)，细胞计数(5000个细胞/孔)，分选多孔。流式细胞仪分选出CD3-/CD14-/CD16-/CD20+/CD27ALL细胞群。为了使假阳性最小化，用Alexa标记链霉抗生物素蛋白Fluor647和Brilliant Violet421。每个荧光团用链霉亲和素进行标记在单独的等分试样上，然后将其混合在一起然后与生物素化的抗原肽相互作用。显示升高荧光的两种荧光团细胞分选到单一96孔板的孔中。

实施例2 单B细胞RT-PCR分离抗体可变区基因

合成cDNA第一条链：将含有单个B细胞的96孔板加入0.5μM的各亚型重链与轻链的恒定区引物与Superscript III反转录酶，37℃孵育1小时；按以下条件进行PCR扩增：95℃15min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，30cycles；72℃10min；4℃5min。产物cDNA在-20℃保存。

Nest-PCR分离抗体基因：每个单细胞分别扩增重链、轻链序列。50μL体系中含有5μL的RT反应产物，HotStarTaq酶，dNTPs，及0.5μM的各亚型重链与轻链抗体的特异性引物，反应条件：预变性95℃5min，然后进行35个PCR循环：95℃×30s，55℃×60s，72℃×90s，最后用72℃延伸7min。PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

实施例3 PCR产物克隆鉴定和抗体表达

PCR产物纯化克隆鉴定：取2μL扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段约400bp。将凝胶电泳鉴定为阳性，且重链与轻链可匹配成对的抗体可变区基因PCR产物利用TA克隆的方法连接到pcDNA3.3载体上(已经改造并含有抗体leader与恒定区)，将连接产物转化DH5α感受态细菌中，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，随即挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min40s，28个循环，最后72℃再延伸5min；取5μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链或轻链基因的转化子。

抗体表达：将表达阳性抗体重链和轻链基因的质粒在大肠杆菌DH5α中大量扩增，进行重组质粒快速提取。用转染试剂PolyFect共转染293细胞，具体操作参见说明书。转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37℃5％CO₂培养箱中培养72小时，收集细胞上清进行检测。

实施例4 表达抗体的筛选检测

(1)纯化SCR19(CFH 15-mer多肽)

巴斯德毕赤酵母表达载体中编码人CFH短共有重复结构域19(称为SCR19)进行克隆。通过使用具有50,000和5,000MW截留值(Sartorius，Goettingen，Germany)的Vivacell70离心单元，然后HiTrap SP FF阳离子交换色谱(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ)，通过顺序差异过滤，从巴斯德毕赤酵母培养基中纯化蛋白质。

(2)以CFH 15-mer多肽为抗原，并用链霉亲和素板将biotin标记的多肽抗原10倍稀释后包被96孔ELISA板，每孔100μl 4℃过夜包被，用封闭液常温封闭2个小时。将100μl的瞬时转染上清作为一抗常温孵育2个小时，用抗-IgGγ链-HRP(Millipore)为二抗(1:2000)作为二抗常温孵育1个小时，加入底物显色液100μl/孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸钠中止反应，用450nm/630nm波长进行比色。筛选获得具有活性并特异性结合CFH 15-mer多肽的抗体命名为TRN1006，进行大量表达和功能性实验验证。

实施例5 抗体大量表达与纯化

抗体大量表达与纯化：将TRN1006抗体重链与轻链的表达载体用PolyFect(Qiagen)转染试剂盒共转染293细胞，转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37℃5％CO₂培养箱中培养72小时。收集转染上清，4000rpm离心1小时，采用Amersham公司的Protein-A亲和层析柱直接纯化表达上清。

SDS-PAGE检验：利用SDS-PAGE检验抗体TRN1006的表达及纯化情况，结果如图1所示，证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻、重链。

实施例6 结合位点验证试验

标有生物素的CFH 15-mer多肽抗原(SEQ ID NO:9)，对每个氨基酸分别进行突变，形成了15个突变肽，再加上野生型多肽作为阳性对照以及序列打乱的多肽作为阴性对照，用Elisa检测TRN1006抗体在不同浓度下分别与上述18个多肽的结合情况，绘制曲线并且计算出Area Under Curve(AUC)，分析抗体与多肽的关键结合位点。结果如图2显示，TRN1006抗体与CFH抗原多肽关键结合位点是多肽序列GPPPPIDNGDITSFP中第5位、第6位、第7位、第8位、第11位、第12位，第14位，证明能与抗原多肽特异性结合。其中，图2中阳性对照1的序列如SEQ ID NO:9所示，阳性对照2的如SEQ ID NO:11所示，1-15分别代表上述15个突变肽。

实施例7 TRN1006抗体亲和力测定

先进行SA芯片偶联捕获分子，再活化芯片的葡聚糖表面，以进样时间确定偶联量。最后利用SA芯片捕获分子捕获配体：将制备的全人源CFH抗体TRN1006作为配体，以计算得到的信号值确定单抗的进样浓度及接触时间。单抗与CFH 15-mer多肽(抗原)结合的亲和力和动力学分析：CFH 15-mer多肽用HBS-EP缓冲液稀释作为分析物，分析物以逐渐增高的浓度依次流过芯片，分别得到信号曲线。每个浓度作为1个循环，完成1次循环后用10mmol/L的甘氨酸－盐酸再生芯片以回复到原始未结合抗原的状态。用BiaCore X-100System软件进行分析。

结果如图3所示，TRN1006抗体与抗原的亲和力高，为1.40×10^-8KD，具体见表1：

表1抗体亲和力测定表

实施例8 TRN1006抗体的抗原表位测定

丙氨酸扫描定点突变：为了明确重组CFH单抗的氨基酸印记，我们分析了TRN1006抗体和丙氨酸替代多肽(包括PIDNGDIT序列)的结合情况。异亮氨酸1120突变为丙氨酸后跟所有3个单抗都完全不结合。天冬酰胺1117突变后有0％-35％的野生型结合。苏氨酸1121突变后有1％-66％的野生型结合。多肽的上游四个残基或下游三个残基的改变对于单抗没影响。

实施例9 TRN1006抗体作用于癌细胞系的CDC效应

由于CFH表位定位影响反应机制，所以本发明用A549肺癌细胞系测试了TRN1006的CDC效应。使用肺癌细胞系是因为之前发现CFH自身抗体是在肺癌病人体内。在CDC测试中，细胞和单抗还有正常人血清(NHS)作为补体来源，共同在37℃孵育，测试乳酸脱氢酶(LDH)的释放来测量细胞溶解。TRN1006加入到A549细胞中后，比人单抗的阴性对照增强了101％的CDD效应。

为了确定补体激活，本发明分析了CDC反应的副产物：C3a,C5a,和C5b-9。过敏毒素C3a和C5a在补体激活的过程中产生，并作为免疫细胞的细胞因子连接先天和后天免疫系统。C5b-9构成了终端膜攻击复合物(MAC)，溶解细胞装配的最小数量。另外，TRN1006加入A549细胞系在正常人血浆存在的条件下，会导致C3a释放增加，C5a释放增加，C5b-9沉积增加。

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州泰诺迪生物科技有限公司；珠海泰诺麦博生物技术有限公司；暨南大学

<120> 补体因子H抑制剂及与之相关的用途

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 人源

<400> 1

Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys Ser Leu Arg Leu Ser Cys

1 5 10 15

Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr Gly Met His Trp Val Arg

20 25 30

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Leu Ala Val Ile Ser Tyr Asp

35 40 45

Glu Lys Thr Lys His Tyr Gly Ala Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile

50 55 60

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu

65 70 75 80

Arg Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Lys Gly Ser Ala Glu

85 90 95

Ala Ala Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr Gly

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 3

Ile Ser Tyr Asp Glu Lys Thr Lys

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人源

<400> 4

Ala Lys Gly Ser Ala Glu Ala Ala Thr Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 105

<212> PRT

<213> 人源

<400> 5

Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Arg Ala Thr Val Asn Cys Arg

1 5 10 15

Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Ala

20 25 30

Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp

35 40 45

Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Pro Glu Asp

65 70 75 80

Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Thr Pro Leu Thr Phe

85 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg

100 105

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人源

<400> 6

Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Lys Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人源

<400> 7

Trp Ala Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人源

<400> 8

Gln Gln Tyr Tyr Ala Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人源

<400> 9

Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro

1 5 10 15

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 10

Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr

1 5

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> 人源

<400> 11

Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Gly

1 5 10 15

Gly Gly

Claims

1.一种分离的CFH抑制剂，其特征在于，所述CFH抑制剂包括：

（1）SEQ ID NO:2所示的重链CDR1、SEQ ID NO:3所示的重链CDR2、SEQ ID NO:4所示的重链CDR3；和

（2）SEQ ID NO:6所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:7所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:8所示的轻链CDR3。

2.根据权利要求1所述的CFH抑制剂，其特征在于，所述CFH抑制剂包括：

（1）重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和

（2）轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的CFH抑制剂，其特征在于，所述CFH抑制剂包括完整的免疫球蛋白分子、或免疫球蛋白分子的抗原结合部分；所述抗原结合部分包括Fab片段，Fab'片段，Fab'-SH片段，F（ab'）2片段， Fv片段，双抗体，单链Fv。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的CFH抑制剂，其特征在于，所述CFH抑制剂是全人源单克隆抗体。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的CFH抑制剂，其特征在于，所述CFH抑制剂可以特异性结合抗原CFH 15-mer多肽，所述CFH 15-mer多肽序列如SEQ ID NO:9所示。

6.根据权利要求5所述的CFH抑制剂，其特征在于，所述CFH抑制剂的结合域是CFH 15-mer多肽的8个特定氨基酸PIDNGDIT。

7.编码权利要求1-4中任一项所述的CFH抑制剂的核酸分子。

8.一种包括权利要求7所述的核酸分子的载体。

9.一种包括权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的载体的宿主细胞。

10.一种包括治疗有效量的权利要求1-4中任一项所述的CFH抑制剂的药物组合物。

11.一种包括权利要求1-4中任一项所述的CFH抑制剂的CFH检测产品。

12.权利要求1-4中任一项所述的CFH抑制剂在制备CFH检测产品中的应用。

13.权利要求1-4中任一项所述的CFH抑制剂在制备治疗补体相关疾病的药物中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述补体相关疾病包括肾上腺皮质癌，肛门癌，膀胱癌，脑肿瘤，乳腺癌，类癌肿瘤，胃肠道未知原发癌，子宫颈癌，结肠癌，子宫内膜癌，食管癌，肝外胆管癌症，Ewings家庭肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤，眼内黑色素瘤眼癌，胆囊癌，胃癌，外生殖细胞肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，头颈癌，下咽癌，胰岛细胞癌，肾癌，喉癌，口腔癌，肝癌，肺癌，艾滋病相关淋巴瘤，中枢神经系统淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，恶性间皮瘤，黑色素瘤，梅克尔细胞癌，多发性骨髓瘤、浆细胞瘤，鼻咽癌，成骨细胞瘤，口咽癌，骨肉瘤，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，胰腺癌，鼻旁窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，垂体癌，前列腺癌，横纹肌肉瘤，直肠癌，过渡细胞肾盂和尿道癌，唾液腺癌，Sezary综合征，皮肤癌，小肠癌，软组织肉瘤，睾丸癌，恶性胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，子宫癌，不寻常的儿童癌症，阴道癌，Vulvar癌症和Wilms'瘤。