CN110327457A - Cfh在制备抗肺腺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本公开属于抗肿瘤药物领域，具体涉及CFH在制备抗肺腺癌药物中的应用。现有技术中有相关研究表明CFH突变可导致视网膜脉络膜新生血管增多。肺腺癌作为一种恶性肿瘤，其生长和转移与血管新生具有紧密的联系。本公开针对CFH对肺腺癌模型中血管新生的作用展开了研究，结果表明肺腺癌小鼠模型在注射CFH重组蛋白后，病灶数量和体积显著降低，新生血管被抑制，显示出对肺腺癌的治疗作用。针对CFH作用机制进行研究表明，CFH有可能通过抑制内皮细胞中p38磷酸化情况实现对内皮细胞迁移的抑制作用。本公开研究证实了CFH对肺腺癌的治疗作用，有望作为抗肺腺癌药物进行开发。

Description

CFH在制备抗肺腺癌药物中的应用

技术领域

本公开属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及CFH在制备抗肺腺癌药物中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

肺腺癌是当今世界对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近年来，肺腺癌的发病率和死亡率不断升高，已经超过鱗状细胞癌，成为肺癌的主要类型。目前，肺腺癌的治疗以手术辅以放疗和化疗为主。由于肺腺癌易发生转移、复发，导致患者生存率低，5年生存率仅为10％-15％。肺腺癌多数起源于支气管粘膜上皮，局部富含新生血管。新生微血管不但为腺癌细胞的生长提供养分，而且提供转移通道，促进肺腺癌的破坏性生长和转移。因此，抑制血管新生是治疗肺腺癌的一个重要方面。

肿瘤血管新生过程受血管内皮生长因子(VEGF)等多种因子调控。目前,肺腺癌的抗血管新生治疗以抗VEGF为主，但此疗法费用昂贵、治愈率低，因而针对肺腺癌治疗急需开发新的抗血管新生药物。

补体因子H(Complement factor H,CFH)，是一种主要由肝脏合成的糖蛋白，由20个短一致重复片段(short consensus repeats,SCRs)结构域组成，是补体旁路激活途径的一种重要的负性调节因子。其生物学功能主要是抑制循环中和细胞表面补体旁路途径的激活，可避免补体系统过度激活所致的免疫病理反应。CFH基因的外显子内Y402H点突变导致视网膜、脉络膜微血管内皮细胞过度活跃并产生新生血管，继而引起年龄相关性黄斑变性。体外研究也发现，视网膜色素细胞可通过分泌CFH抑制内皮细胞生成血管，提示CFH有可能是一个抑制血管新生的因子。

丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)属于丝蛋白苏氨酸激酶，是一类接受受体传递的信号并将其带入细胞核内的重要分子，具有参与基因表达调控、细胞增殖和死亡的重要机制，在多种受体信号传递途径中均具有关键性作用。P38MAPK信号通路为MAPK家族的重要成员，不仅在炎症、应激反应中具有重要作用，还参与细胞的存活、分化和凋亡等过程，被认为是细胞众多信号转导通路的中转站。在内皮细胞中，p38MAPK通路在各种病理过程中起着调节细胞增殖，迁移和通透性的功能。

发明内容

综上所述，发明人认为，现有技术中虽然存在相关研究表明视网膜色素细胞细胞可通过分泌CFH抑制内皮细胞新生血管生成。但是CFH在其他器官疾病中是否对血管新生同样具有抑制作用仍不得而知。血管新生对于肺腺癌的发展和转移具有重要的意义，本公开选择研究CFH对肺腺癌中新生血管的作用，通过制备CFH重组蛋白及小鼠肺腺癌模型进行研究。研究表明，肺腺癌小鼠模型在注射CFH重组蛋白后，病灶数量和体积显著降低，能够在不影响内皮增殖的情况下抑制其迁移作用，抑制新生血管的生成，显示出对肺腺癌的治疗作用。

基于上述研究结果，本公开提供以下技术方案：

本公开第一方面，提供CFH作为p38磷酸化抑制剂的应用。

优选的，所述CFH作为内皮细胞中p38磷酸化抑制剂。

本公开第二方面，提供CFH在制备抗血管新生药物中的应用。

优选的，所述抗血管新生药物具体为p38磷酸化抑制剂。

本公开第三方面，提供CFH在制备抗肺腺癌药物中的应用。

优选的，所述抗肺腺癌药物为抗血管新生药物。

Zhang等人在其研究中提出，CFH的低表达在视网膜色素沉着上皮细胞(ARPE-19细胞系)中促进内皮细胞迁移；体内实验中，CFH突变的小鼠显示出血管生成的增加。然而在肺腺癌模型中，CFH的作用和效果不得而知。在本公开的研究中，发明人采用Grg1hPLAP小鼠作为动物模型，采用注射CFH重组蛋白的方式进行研究。注射CFH后的小鼠肺腺癌病灶数量和体积具有显著的降低。

由于血管新生和肺腺癌的的关系紧密，本公开通过采用HUVECs(人脐静脉内皮细胞)作为模型研究CFH对新生血管的影响。研究结果表明，CFH可以抑制内皮细胞的迁移，而不影响其增殖，证明CFH能够有效的降低新生血管的生成，并且不影响原有血管的功能，这为CFH应用于抗肺腺癌血管新生提供了依据，是一种特异性抑制新生又不影响原有机体功能的有效成分。

本公开针对CFH抑制血管新生的机制进行了进一步的研究，研究结果表明，CFH能够抑制内皮细胞中p38磷酸化程度。启示了CFH可能通过抑制P38MAPK信号通路实现对新生血管的抑制作用，为临床用药及治疗提供更为精确的指导作用。

本公开第四方面，提供一种抗肺腺癌药物，所述药物有效成分为CFH。

优选的，所述抗肺腺癌药物还包括药学上所必需的的辅料。

优选的，所述抗肺腺癌药物为注射剂，具体的，可以为干粉剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

本公开第五方面，提供一种肺腺癌的治疗方法，所述治疗方法包括采用CFH进行治疗。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

1.本公开证实了CFH对肺腺癌具有治疗作用，经CFH治疗的动物模型显示病灶数量和体积的减少，该研究结果为肺腺癌的治疗又提供了新的研究思路。

2.本公开研究进一步发现，CFH对肺腺癌中血管新生具有抑制作用，具体体现为对内皮细胞迁移的抑制作用，同时不影响内皮细胞的增殖。有望成为一种抑制血管新生的同时，不影响现有血管生理机能的药物，证明CFH应用于肺腺癌治疗具有更好的效果。

3.本公开研究还发现，CFH能够降低内皮细胞中p38磷酸化程度，为CFH的临床应用和开发提供了机制层面的支持。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为实施例1中Grg1hPLAP小鼠注射CFH重组蛋白后肺腺癌生长情况图；

其中，图1A为Grg1hPLAP小鼠肺腺癌病灶组织图；

图1B为Grg1hPLAP+CFH小鼠肺腺癌病灶组织图；

图1C为Grg1hPLAP与Grg1hPLAP+CFH小鼠肺腺癌组织数量分析结果柱形图(**P<0.01)；

图1D为Grg1hPLAP与Grg1hPLAP+CFH小鼠肺腺癌组织体积分析结果柱形图(**P<0.01)。

图2为实施例1中CFH抑制HUVECs中的P38信号通路传导结果图；

其中，图2A为HUVECs加入人CFH重组蛋白后，细胞中p38磷酸化情况电泳条带图；

图2B为密度定量分析磷酸化P38/总P38的柱形图(***P<0.001)。

图3为CFH腺病毒转入A549细胞后细胞及培养液过表达情况；

其中，图3A为阴性对照腺病毒和CFH过表达腺病毒分别转入HepG2细胞后，CFH表达情况条带图；

图3B为细胞中密度定量分析CFH柱形图；

图3C为条件培养液中CFH表达情况条带图；

图3D为条件培养液中密度定量分析CFH柱形图。

图4为实施例1中HepG2细胞分泌的CFH抑制HUVECs的迁移；

其中，图4A为HepG2细胞条件培养液与HUVEC细胞共培养24小时后细胞划痕实验结果图；

图4B为划痕实验细胞迁移面积统计分析柱状图；

图4C为MTT实验：HepG2细胞条件培养液与HUVEC细胞共培养24小时检测细胞增殖；

图4D为Transwell实验：HUVECS与HepG2细胞条件培养液共培养24小时后，Transwell实验检测细胞迁移能力，Transwell实验代表性图像(n.s.，p>0.05，**p<0.01)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中有相关研究表明CFH突变可导致视网膜脉络膜新生血管增多，然而CFH在肺腺癌模型中是否存在抑制血管新生的效果还未见报道。本公开针对CFH对肺腺癌模型中血管新生的作用展开了研究。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

一、材料与方法

1.细胞系和实验动物

人脐静脉内皮细胞购自美国Type Culture Collection公司(Manassas,VA)；人肝癌系，购自中国上海生命科学细胞资源中心。Grg1hPLAP小鼠购自山东中医药大学实验动物中心。

2.细胞培养

人脐静脉内皮细胞在含有1％双抗(100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素)、DMEM培养基中培养；人肝癌细胞在含有1％双抗(100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素)、DMEM培养基中培养。培养箱温度设置为37℃恒温，CO₂含量为5％。

3.获取纯化的人和小鼠CFH重组蛋白

通过大肠杆菌蛋白表达系统，获得大量纯化的人和小鼠CFH重组蛋白，为后续体内和体外实验做好准备：通过带有限制性酶切位点的人和小鼠CFH克隆引物，以人和小鼠cDNA为模板进行PCR反应，得到CFH的编码片段。采用限制性内切酶分别酶切片段和载体pET-28b(+)，经回收纯化后将片段和载体混合进行连接反应。随后将连接产物通过转化至大肠杆菌DH5α菌株，卡那霉素平板筛选阳性克隆后，经大量增菌提取质粒，获得人和小鼠CFH的表达载体。将表达载体分别转化至大肠杆菌BL21菌株，卡那霉素平板筛选阳性克隆。经IPTG低温诱导后SDS-PAGE检测CFH蛋白表达。将筛选得到的克隆按1％比例接种，培养液总体积为200mL。经IPTG低温诱导后收集菌液，超声裂解，采用镍柱富集CFH重组蛋白，经透析后得到纯化的CFH重组蛋白。最后通过SDS-PAGE检测CFH重组蛋白纯度。4.给予Grg1hPLAP小鼠注射外源性CFH重组蛋白

本实施例选取2月龄的Grg1hPLAP公鼠，随机分为2组，通过尾静脉分别注射蛋白洗脱液(对照)或1000μg小鼠CFH重组蛋白，每隔3天注射一次，连续注射90天；在5月龄时处死小鼠。分离小鼠肺脏左侧大叶，计数原发肺腺癌灶数量；将原发癌灶精确切除后，测量肿瘤体积和重量；将肿瘤保存并制作冰冻切片，做HE染色。

5.细胞转染

(1)CFH腺病毒基因表达载体构建

表达绿色荧光蛋白(ADV-GFP)和CFH(ADV-GFP)的重组腺病毒来自上海吉凯基因化学有限公司。

(2)HepG2细胞传代，传至六孔板或者培养皿中。待细胞密度长至50％左右进行转染。

(3)准备转染所需EP管，每个EP管中加入500ul新鲜培养基，加入需要量的腺病毒，静置孵育5分钟。细胞培养板吸弃原培养液，用PBS清洗一遍，每孔加入500ul培养液。病毒孵育结束后，将其分别加入到对应的处理孔中。8到12小时以后，于每个处理孔中补充1ml新鲜培养液。

(4)细胞转染病毒36小时左右以后，在FSX100荧光倒置显微镜下查看荧光强度。

(5)细胞培养48-72小时以后，提取细胞DNA及蛋白验证CFH转染过表达情况，并进行后续相关实验。

6.肝癌细胞条件培养液(CM)的收集

如上所述，腺病毒转染HepG2细胞48-72小时以后，收集细胞上清培养液，用0.2um的滤器过滤培养液，然后加入到15mlEP管中，并且做好标记(Con-CM为对照组，CFH-CM为实验组)，放到-80℃冰箱中待用。另外各样本分别分装100ul至1.5mlEP管中，以备用做Western blot和考马斯亮蓝染色。

7.蛋白质免疫印迹

(1)提取蛋白：用4℃预冷的PBS冲洗细胞2次，根据培养面积不同加入一定体积的0.1％SDS-RIPA裂解液，冰上静置15分钟，然后将细胞裂解液转移至1.5mL EP管中，反复吹打。4℃12000r/m离心15分钟，收取上清。

(2)用BCA法测量各组蛋白浓度。

(3)蛋白变性：向蛋白样品中加入一定体积的上样缓冲液，95℃加热15分钟使蛋白变性。

(4)电泳：将蛋白加入8％的聚丙烯酰胺凝胶点样孔，80V恒压电泳30分钟左右，然后再用110V恒压电泳60分钟左右，待溴酚蓝染料前沿移至凝胶末端时，即停止电泳。

(5)转膜：配制1×转膜液，制作转膜“三明治”结构，280mA恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小而设定。

(6)封闭：采用5％脱脂牛奶室温封闭2小时，封闭完成后用TBS-T缓冲液冲洗3次，每次15分钟。

(7)抗体孵育：用抗体稀释液按抗体说明书提示的比例配制一抗工作液，4℃孵育过夜。所用一抗包括(CFH、p-P38、p38、Gapdh)次日用TBS-T缓冲液冲洗膜3次，每次15分钟，之后加入相应二抗工作液，室温振荡2小时。用TBS-T缓冲液冲洗膜3次，每次15分钟。

(8)显影：将PVDF膜浸入ECL发光液工作液，显影并分析结果。

8.细胞增殖实验

采用MTT试剂盒(Cayman Chemical,Ann Arbor,Michigan)测定细胞的增殖能力。将细胞以每孔5×10³的密度接种于96孔板中，培养过夜后更换A549条件培养液，24小时后待测孔中加入10μL MTT溶液(5mg/mL)。4小时后，向每孔加入110ul的DMSO将96孔板放于摇床上，低温震荡10min，然后用酶标仪测定各孔在490nm处的吸度值。实验至少重复三次。

9.Transwell实验

(1)先用Con-CM和CFH-CM重悬的HUVEC细胞，于上室内分别加入20000个细胞，然后分别补足对应条件培养液至100ul，下室加600ul的新鲜完全培养液。将小室放入细胞培养箱中，培养24h。

(2)24h后，从培养箱取出小室，弃掉上下层培养液，然后用PBS洗3遍，在下层小室中加入800ul的多聚甲醛固定细胞，固定30分钟，固定过程中，用棉签轻轻擦拭小室上室上层，将未穿梭过小室的细胞擦掉。固定结束后，弃掉PFA，用PBS洗3遍，在小室底部加入800ul甲醇透化20分钟，透化结束后，PBS洗3遍，小室底部加入600ul结晶紫染液，染色30分钟。染色结束后，PBS冲洗小室，然后将小室置于FSX100倒置显微镜下，拍照迁移细胞。

10.细胞划痕实验

(1)准备六孔板或者3cm的小皿，用直尺在培养板底部划线，HUVECs传代至提前画好线的培养板中。

(2)细胞长满后，用200ul的黄枪头划线。

(3)培养板中分别加入2mlCon-CM和CFH-CM，迅速将培养板置于显微镜下，拍照。

(4)培养24h后，再次拍照。

(5)将0小时，24小时的细胞迁移图片进行统计，用ImageJ软件计算细胞迁移面积，统计迁移比列。

(6)实验至少重复3次，统计学分析。

11.统计学分析

所有实验数据均表示为均数±标准差的形式，用SPSS 17.0软件处理分析数据。组间比较采用配对t检验，所有实验均至少重复3次，检验的显著性水平定义为α＝0.05，P＜0.05被认为存在显著性差异。

二、结果

1.CFH重组蛋白抑制Grg1hPLAP小鼠体内肺腺癌的生长。

肺腺癌是一种原发性肿瘤，因此原发肺腺癌的小鼠模型更接近于肺腺癌发生发展过程，从中检测抗肿瘤作用的数据更有意义。目前，原发肺腺癌最可靠的动物模型是美国FDA接受的Grg1hPLAP小鼠。这种小鼠过度表达Notch通路中的Groucho-related geneproteins 1(Grg1)基因，近100％发展出肺腺癌。小鼠从3月龄开始出现肿瘤，至6月龄左侧肺大叶一般有2-4个肿瘤发生，并有约20-30％小鼠出现转移。本实施例中采用该小鼠作为动物模型，通过注射CFH重组蛋白进行研究。研究结果如图1所示，与Grg1hPLAP小鼠相比，Grg1hPLAP+CFH小鼠在肺腺癌灶数量和体积程度都显著降低。

2.CFH重组蛋白抑制HUVECs中的P38信号通路。

MAPKs激酶家族存在三种主要亚型即ERK，JNK和p38MAPK，可通过特定序列的磷酸化过程使它们激活，MAPKs在机体多种生理过程中起重要调节作用。在内皮细胞中，p38MAPK通路在各种病理过程中起着调节细胞增殖，迁移和通透性的功能。p38MAPK通路的激活可促进细胞迁移，为了进一步明确CFH抑制内皮细胞迁移的机制，本实施例检测了CFH重组蛋白对HUVECs细胞中p38信号通路的影响。结果如图2所示，CFH组p-P38/P38显著降低。3.HepG2细胞中CFH的过表达促进CFH释放入培养液。

CFH是一种大分子糖蛋白，主要由肝细胞分泌，存在于血浆中。本实施例中，首先利用腺病毒基因过表达载体转染HepG细胞，使HepG2细胞中CFH表达上调。收集HepG2细胞分泌的条件培养液(Con-CM为对照组，CFH-CM为实验组)，利用Western blot检测培养液中CFH的含量。结果如图3所示，本实施例在HepG2培养液中检测到CFH蛋白，并且CFH-CM中CFH蛋白水平明显升高于Con-CM组。

4.CFH抑制HUVECs的迁移

CFH主要由肝细胞产生，与血浆蛋白相互作用，直接作用于内皮细胞。检测HepG2细胞分泌的CFH对内皮细胞迁移的影响。在HepG2细胞中转染CFH，收集HepG细胞分泌的培养液，与HUVECs共培养，检测分泌的CFH对HUVECs细胞功能的影响。首先利用MTT实验检测HUVECs的增殖情况A549细胞释放入CM的CFH不影响HUVECs的增殖(图4C)。然后利用细胞划痕实验以及Transwell穿梭小室实验检测HUVECs的迁移情况。细胞划痕实验中，CFH-CM组中HUVECs迁移面积较Con-CM组明显降低(图4A,B)CFH-CM组中HUVECs在聚碳酸酯膜的迁移数量显著降低(图4)。因此这些实验表明，肝癌细胞分泌的CFH能够促进内皮细胞的迁移，但是不影响内皮细胞的增殖能力。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.CFH作为p38磷酸化抑制剂的应用。

2.如权利要求1所述CFH作为p38磷酸化抑制剂的应用，其特征在于，所述CFH作为内皮细胞中p38磷酸化抑制剂。

3.CFH在制备抗血管新生药物中的应用。

4.如权利要求3所述CFH在制备抗血管新生药物中的应用，其特征在于，所述抗血管新生药物具体为p38磷酸化抑制剂。

5.CFH在制备抗肺腺癌药物中的应用。

6.如权利要求5所述CFH在制备抗肺腺癌药物中的应用，其特征在于，所述所述抗肺腺癌药物为抗血管新生药物。

7.一种肺腺癌药物，其特征在于，所述药物有效成分为CFH。

8.如权利要求7所述肺腺癌药物，其特征在于，所述抗肺腺癌药物还包括药学上所必需的的辅料。

9.如权利要求7所述肺腺癌药物，其特征在于，所述抗肺腺癌药物为注射剂。

10.如权利要求9所述肺腺癌药物，其特征在于，所述注射剂为干粉剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。