CN105924531A - 一种抗il-4r单链抗体与蜂毒肽融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗IL‑4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白及其应用，其制备方法为：通过重叠延伸PCR技术方法将抗IL‑4R单链抗体与蜂毒肽基因连接成scFv‑MLT基因，构建pET‑32a重组质粒scFv‑MLT，转入BL21DE3原核表达菌，诱导表达scFv‑MLT融合蛋白并进行纯化和复性，即可。本发明采用分子生物学技术抗IL‑4R单链抗体基因(scFv)与蜂毒肽(MLT)融合基因(scFv‑MLT)的表达载体，在体外进行体外表达，重组抗IL‑4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白，所述抗IL‑4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白可用于治疗肺癌，疗效好，无副作用。

Description

一种抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白及其应用，属于生物技术领域的领域。
技术背景
肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，对人类生命和健康有着非常大威胁，是恶性肿瘤死亡的首位原因，其发病率仍呈持续上升趋势。对早期肺癌最有效的治疗方法是手术切除，但因手术后病人出现较高全身和局部的复发率。传统的细胞毒性药物的化疗效果已经达到了一个平台期，其进一步发展的空间极小，而且传统的细胞毒性化疗药物的毒副反应也限制其应用和发展。放射治疗对已发生的原发肿瘤就不再适合。放疗结合化疗可以通过增加肿瘤疗效，但不良反应也相应的增加，从而限制了其临床的应用。
随着分子生物学的进一步发展，分子靶向治疗必然会为肺癌的治疗开辟广阔的应用前景。靶向治疗为肺癌的治疗提供了新的策略。近二十年来，免疫毒素已成为寻找新型抗肿瘤药物一个十分活跃的研究领域。免疫毒素是将生物毒素与抗体或细胞因子连接起来的导向药物，又称作生物导弹或导向毒素。导向药物的概念最早由德国药物化学家PaulErhlich提出，它由两部分组成：能识别并结合肿瘤细胞表面标志物的导向部分和在导向部分的引导下进入细胞并发挥细胞毒作用的效应部分。由于导向性治疗药物可特异性杀伤肿瘤细胞，具有副作用低、高效的特点，因此对一些难治愈和多药耐药的恶性肿瘤尤其有着重要意义。现在FDA已经批准的分子靶向药物如Hereeptin，Rituximab，ZD1839都成功地对那些常规疗法无效的肿瘤患者显现出惊人的疗效。白喉毒素与IL-2重组的免疫毒素也经FDA批准作为人皮肤T细胞淋巴瘤的抢救药物上市，还有很多已呈现出显著的抗肿瘤作用的其它免疫毒素和靶向药物，目前正在进行I/II期临床试验。
利用分子技术和基因技术进行肿瘤的免疫治疗的研究也日益增多，其中一些针对肺癌分子的靶向药物己经在临床前研究和临床应用上显示出一定抗癌活性。如针对表皮生长因子受体，蛋白激酶C，血管内皮生长因子，环氧化酶-2，法尼基转移酶等调节转录的启动和与转录因子发生相互作用，参与肿瘤的发生、发展和转移有关的靶目标都可能作为肺癌治疗的分子靶向目标。
以往的研究已经证实IL-4R也表达于许多正常的造血细胞和非造血细胞。Puri等报道了IL4-PE(PE:假单胞杆菌外毒素)对T细胞、B细胞和CD34+前体细胞等静止性的造血细胞仅有很小的敏感性，因为这些细胞表达的IL-4R水平很低。IL4-PE对高水平表达的IL-4R的成纤维细胞、内皮细胞等非造血细胞没有表现出明显的毒性反应，与同样高表达IL-4R的肿瘤细胞相反。他们通过毒理学研究，当IL4-PE静脉注射断尾猴(其体内细胞可以与人IL-4R结合)，只有在非常大的剂量时(200μg/kg)才会对肝脏产生毒性反应，而对其它器官及血液系统不会产生毒性反应。这些研究成果表明IL-4R有高度的肿瘤细胞表达特异性，具备作为免疫毒素作用靶点的要求，其配体或抗体易于获得、便于实验，作为免疫毒素的载体它们无需人源化改造。
免疫毒素是近年来新兴的一种肿瘤导向治疗方法。它利用抗肿瘤单抗与肿瘤细胞的特异性结合，将生物毒蛋白与抗体偶联，去定向攻击肿瘤细胞，而其对正常组织的杀伤较小，故被形象地称为“生物导弹”。免疫毒素的导向载体部分与毒素“弹头”部分的连接方式有两种，包括化学偶联法和基因工程融合法。通过将毒素和单克隆抗体在体外进行化学偶联途径制备的免疫毒素称为第一代免疫毒素。而通过将毒素的编码基因与肿瘤细胞表面特异性分子的配体基因进行克隆重组，然后在大肠杆菌中高效表达，从而制备出的免疫毒素称为第二代免疫毒素。但第一代免疫毒素存在分子量大，稳定性不好等缺点。
自20世纪80年代，Huston和Bird等分别利用基因工程技术在体外获得具有与天然抗体分子相似的抗原亲和力及特异性的单链Fv蛋白，被称为单链抗体(single chainvariable fragment，scFv)，其最重要的进展是噬菌体抗体库技术的建立，被誉为又一次革命性进展。噬菌体展示技术将表型和基因型联系在一起，不经人体免疫，绕过杂交瘤技术，通过几轮“吸附-洗脱-扩增”的体外筛选富集过程，即可得到人源的基因工程抗体。scFv具有分子质量小，免疫原性低，无Fc端，不易与具有Fc受体的靶细胞结合，对肿瘤组织的穿透力强，可以与其他效应分子连接成抗肿瘤融合蛋白等特点，是保持抗体亲和性和特异性的最小功能性抗体片段。因此，scFv还可作为载体与药物、放射性同位素、细胞毒素、破坏细胞结构的酶及细胞因子等结合，而形成对肿瘤细胞有特异性杀伤作用的复合物用于肿瘤的导向治疗。目前报道较多的是构建重组单链免疫毒素，重组单链免疫毒素是将单链抗体基因与毒素基因相连，原核表达scFv与毒素的融合蛋白，利用抗体的特异性将毒素带到指定部位，而发挥杀伤作用，这种重组单链免疫毒素去除了毒素原有的受体结合位点，毒性低，还具有免疫原性低、易于穿透肿瘤组织、分子稳定性好、靶向性好等优点，在肿瘤等疾病的导向治疗中比完整抗体更具优势和潜力。
蜂毒(Melittin)见于明代《识读志》记载：“取黄蜂尾针，含硫炼，加冰麝为药，置疮疡之头，以火点之，灸疮上”。同时也是少数民族传统用药，彝族古籍《勒俄特衣》中有“蜜蜂螫伤尼托头”的记载。现代药理研究表明，蜂毒素有较好抗肿瘤等作用，其作用主要是通过直接杀伤多种肿瘤细胞及诱导肿瘤细胞凋亡的方式。有人研究发现蜂毒素可杀伤K562和HL-60细胞，其机理为蜂毒素插入K562细胞的胞膜中形成孔道，引起Ca2+内流，胞内Ca2+浓度升高，细胞裂解，其功效优于华蟾素、丝裂霉素、长春新碱等常用抗肿瘤药物。另一方面，蜂毒素能抑制人肝癌BEL-7402、乳腺癌细胞系MCF-7、T淋巴细胞白血病6T-CEM细胞生长并诱导其凋亡。Hwang等的研究表明，蜂毒素能够诱导人骨肉瘤细胞系MG-63细胞凋亡并抑制COX-2蛋白的表达。Jang等研究发现，蜂毒素通过诱导人肺癌细胞系NCI-H1299细胞调亡抑制COX-2mRNA表达而发挥抗肿瘤作用。凌昌全等研究证实蜂毒素对SMMC-7721、BEL-7402和Hep-3B三种肝癌细胞系均有杀伤作用，且起效快、作用强，抑瘤作用与剂量呈正相关，其抑瘤率优于去甲斑蝥素、大蒜素、华蟾素、丝裂霉素和长春新碱等常用抗肿瘤中药和西药。刘岭等采用蜂毒素对三种肝癌细胞系进行研究，结果显示高浓度时蜂毒素多形成四聚体状态，比单体更有效地与细胞膜结合，形成离子通道，改变细胞膜的通透性，造成细胞膜的破裂，而显示出较强的体外杀伤肿瘤的作用。
蜂毒素约占蜂毒含量50％，含量最高，具有很高的生物活性。其基因序列短，易于合成和转染，适合作为目的基因。为进一步开发蜂毒素的抗肿瘤活性，将天蚕抗菌肽A(1-8)片段和蜂毒素(1-12)片段组合成杂交肽分子CA(1-8)-ME(1-12)构建的杂交肽分子具有很强的抗肿瘤作用。刘嵬等构建十二肽与蜂毒素与基质金属蛋白酶-2(MMP-2)融合基因，在人的大肠杆菌中进行高效表达融合肽，经体外细胞实验显示，该融合肽具有明显的抑制肿瘤增殖细胞作用，并认为该方法有望在肿瘤的导向治疗和临床上得到应用。陈江等人通过体外将蜂毒基因与增强型绿色荧光蛋白基因进行融合，在大肠杆菌中实现高水平表达的融合蛋白，该融合蛋白具有明显的抗肝癌效应。宋旭霞等利用基因工程的剪接式重叠延伸技术构建了蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白，该蛋白对人卵巢癌细胞具有杀伤作用。为克服蜂毒素的非特异毒性，采用重组的免疫毒素对携有抗原的靶细胞进行选择性的杀伤，Dunn等将编码抗体片段(scFv)的基因和编码蜂毒素的寡核苷酸构建成融合基因(scFv-MLT)，将其插入载体pPOW并使其在大肠杆菌(TOPP2)中表达，重组的免疫毒素具有与抗体特异性一致的结合和杀伤特性免疫毒素的细胞毒作用，其裂解细胞作用显著大于天然的蜂毒素。
肿瘤靶向治疗具有特异性载体的优越性，能将药物或其它具有杀伤肿瘤细胞活性的物质，有选择性地运送到肿瘤部位，最大限度地杀伤肿瘤细胞，而不影响正常细胞的功能，从而提高疗效、减少毒副作用，它是一种有异于传统手术、放疗、化疗的新的治疗模式。现在靶向治疗己成功应用于乳癌、淋巴瘤、胃肠道间质瘤、黑色素瘤、卵巢癌和大肠癌等恶性肿瘤的治疗。
由单一的抗原决定簇刺激机体免疫系统产生的抗体为单克隆抗体，是第二代抗体。但由于鼠源单克隆抗体对人体而言是异源蛋白抗原，可诱发人体免疫系统产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)，加上鼠源性单克隆抗体在人体的半衰期短(1-2d)，因而临床应用受到了限制。
完整抗体由两条完全相同的重链(heavy chain,H)和两条完全相同的轻链(lightchain,L)构成，相对分子质量较大。通过对抗体基因进行人工改造，使其只表达可变区(variable region,V)，即通过采用人工合成的连接肽(linker)基因将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接成重组基因，由重组基因表达的抗体称为单链抗体(singlechain Fv,ScFv)。到目前为止，scFv是分子量最小的抗体，相对分子质量约为25000，仅为完整抗体的1/6。ScFv有众多的优势，如分子量小，穿透力强，与抗原结合能力较好等，也克服了单克隆抗体的异源等方面弱点，因此具有广阔的应用前景和推广价值。
蜂毒肽(MLT)对多种癌细胞具有直接杀伤和诱导调亡的作用，但对肿瘤杀伤作用没有选择性；白介素-4受体(IL-4R)在胰腺癌细胞上特异性过度表达，是抗胰腺癌药物作用的良好靶标。
鉴于以上研究成果：IL-4R在癌细胞上特异性过度表达，是抗癌药物作用的良好靶标；中药蜂毒肽(MLT)对多种癌细胞具有直接杀伤和诱导调亡的作用，其蜂毒素基因序列短，易于合成和转染。但目前尚未有构建抗IL-4R单链抗体与蜂毒素的融合蛋白用于靶向治疗胰腺癌的相关报道。
发明内容：
本发明的目的在于，提供一种抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白及其应用。本发明采用分子生物学技术抗IL-4R单链抗体基因(scFv)与蜂毒肽(MLT)融合基因(scFv-MLT)的表达载体，在体外进行体外表达，重组抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白，所述抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白可用于治疗肺癌，疗效好，无副作用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案实现：一种抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白，其制备方法为：通过重叠延伸PCR技术方法将抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽基因连接成scFv-MLT基因，构建pET-32a重组质粒scFv-MLT，转入BL21DE3原核表达菌，诱导表达scFv-MLT融合蛋白并进行纯化和复性，即可。
前述的抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白中，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)用pET-32a质粒与BL21DE3原核表达体系表达scFv重组蛋白，scFv基因片段通过提取scFv的pET-32a重组质粒并进行双酶切获取；将提取回收的scFv基因片段经过PCR方法去除Xho Ⅰ酶切位点并扩增，将该scFv基因片段用与合成蜂毒肽基因序列用重叠延伸PCR方法进行连接，构建scFv-MLT基因；
其中，去除Xho Ⅰ酶切位点为：设计引物F1和引物F2去除抗IL-4R单链抗体scFv基因序列的Xho Ⅰ酶切位点；根据抗IL-4R单链抗体scFv基因序列与合成“重叠序列-linker-MLT”基因序列，设计引物F1和F3，通过SOE-PCR技术连接抗IL-4R单链抗体(scFv)与蜂毒肽(MLT)基因成融合基因scFv-MLT；
其中，合成蜂毒肽基因序列这样设计：将蜂毒肽基因序列，即GenBank:JQ900378.1，在MLT序列5’端加上带有一段与抗IL-4R单链抗体scFv基因序列相同的重叠序列40bp，以及一段连接肽基因，另外在“重叠序列-linker-MLT”基因序列的3’端加入上XhoⅠ酶切位点；重叠区碱基序列为：CTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA；
其中，scFv基因片段用与合成蜂毒肽基因用序列用重叠延伸PCR方法进行连接为：设计反应体系为：去除Xho Ⅰ酶切位点的scFv基因片段15μL，MLT基因片段15μL，1μL引物F1，1μL引物F3，8μL ddH2O；反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min重复30个循环；72℃延伸10min；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收基因片段；
(2)pET-32a载体/scFv-MLT基因片段的双酶切与连接：设计反应体系：pET-32a载体/scFv-MLT基因片段10μL，Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ各2μL，10×Buffer Tango 2.5μL，ddH2O 35.5μL；将以上成分加入PCR管中，于37℃酶切4h，80℃，20min灭活Xho Ⅰ酶。待冷却至12℃，再加入2μL EcoR Ⅰ内切酶，37℃酶切4h，65℃，灭活20min；取5μL做1％琼脂糖凝胶电泳分别回收目的片段；
(3)构建pET-32a重组质粒scFv-MLT：反应体系：pET-32a载体双酶切目的片段10μL，scFv-MLT双酶切目的片段40μL，Rapid T4DNA ligase 2μL，快速连接缓冲液(2×)20μL，ddH2O 18μL，将该反应体系置于16℃过夜；
(4)转入BL21DE3原核表达菌，将pET-32a重组质粒scFv-MLT导入BL21DE3感受态细胞，复苏后进行培养；
(5)诱导表达scFv-MLT融合蛋白并进行纯化和复性，即可。
前述的抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白中，所述引物F1为
5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’。
前述的抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白中，所述引物F2为
5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’。
前述的抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白中，所述引物F3为
5’-GAGGCAACAGGGTTAACTCGAG-3’。
一种抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白的应用，用于治疗肺癌及其并发症。
本研究采用分子生物学手段将编码抗IL-4R单链抗体片段基因(scFv)和编码蜂毒肽的基因(MLT)构建成复合基因(scFv-MLT)，插入载体使其在大肠杆菌中表达融合蛋白，对融合蛋白进行验证蛋白活性，研制出新型抗肺癌药物。
与现有技术相比，本发明采用分子生物学技术抗IL-4R单链抗体基因(scFv)与蜂毒肽(MLT)融合基因(scFv-MLT)的表达载体，在体外进行体外表达，重组抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白，所述抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白可用于治疗肺癌，疗效好，无副作用。
申请人进行了下列实验，可证明本发明具有有效的效果；
实验例
1材料
1.1材料与试剂
pET-32a由贵州大学动物疫病研究所馈赠；BL21(DE3)由本实验室保存；抗IL-4R单链抗体(scFv)基因，由贵阳中医学院寄生虫实验室制备保存；Anti-6×His抗体[GT359](HRP)(ab184607)(GR212114-6)，HRP标记的二抗兔抗鼠IgG(批号：990150311)，Abcam公司产品；羧苄青霉素(4240320)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(0020150129)、彩虹180广谱蛋白Marker PR1910(11KD-180KD)(PR1920)、考马斯亮蓝R250(416B035)、AEC底物显色试剂盒、JMD18-10-0.5透析袋(截留分子量10000，20150317)、PVDF膜(K4CA1978G)，Millipore公司产品；Triton X-100(78200)、DNAMarker5000(NO.20141022)购自北京索莱宝生物科技有限公司；Xho Ⅰ enzyme(批号：00238777)、EcoR Ⅰ enzyme(00189088)，美国Thermo Scientific公司产品；高纯质粒小量制备试剂盒(0020141129)购自北京百泰克生物技术有限公司；Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)(00091512)购自康为世纪生物技术有限公司。
1.2实验动物与癌细胞株
健康昆系小鼠(4-6周龄、体重18-20g的雄性清洁级)；人肺腺癌细胞株H460，购自中科院生物化学与细胞生物学研究所。
2实验方法
2.1一种抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白的制备
2.1.1抗IL-4R单链抗体(scFv)基因片段的制备
在前期工作中，我们已经利用pET-32a质粒与E.coli BL21(DE3)原核表达体系成功的表达了抗IL-4R单链抗体(scFv)重组蛋白，抗IL-4R单链抗体(scFv)基因片段通过提取抗IL-4R单链抗体的pET-32a重组质粒并进行双酶切获取。将提取回收的scFv基因片段经过PCR方法去除Xho Ⅰ酶切位点并扩增，将该scFv基因片段用与合成蜂毒肽基因序列用重叠延伸PCR方法进行连接，构建scFv-MLT基因。
2.1.2合成蜂毒肽序列设计
将Genebank上公布的蜜蜂生物种属为西方蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒肽(MLT)基因序列(GenBank:JQ900378.1)，在MLT序列5’端加上带有一段与抗IL-4R单链抗体scFv基因序列相同的重叠序列(40bp)，以及一段连接肽(linker)基因，另外在“重叠序列-linker-MLT”基因序列的3’端加入上Xho Ⅰ酶切位点。委托上海英俊生物公司合成的序列如下：
CTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAAAAGCTTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGTCGACATGAAATTCTTGGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTGTACATTTCTTACATCTATGCGGCCCCTGAACCGGAACCGGCACCAGAGCCAGAGGCGGAGGCAGACGCGGAGGCAGATCCGGAAGCGGGAATTGGAGCAGTTCTGAAGGTATTAACCACAGGATTGCCCGCCCTCATAAGTTGGATTAAACGTAAGAGGCAACAGGGTTAACTCGAG；
重叠区碱基序列为：CTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA。
2.1.3引物设计
设计引物F1和引物F2去除抗IL-4R单链抗体scFv基因序列的Xho Ⅰ酶切位点；根据抗IL-4R单链抗体scFv基因序列与合成“重叠序列-linker-MLT”基因序列，设计引物F1和F3，通过SOE-PCR技术连接抗IL-4R单链抗体(scFv)与蜂毒肽(MLT)基因成融合基因scFv-MLT。委托上海英俊生物公司合成的引物序列如下：
引物F1：5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’；
引物F2：5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’；
引物F3：5’-GAGGCAACAGGGTTAACTCGAG-3’。
2.1.4抗IL-4R单链抗体(scFv)与蜂毒肽(MLT)基因的连接
设计反应体系为：去除Xho Ⅰ酶切位点的scFv基因片段15μL，MLT基因片段15μL，1μL引物F1，1μL引物F3，8μL ddH2O。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min重复30个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收基因片段。
2.1.5pET-32a载体/scFv-MLT基因片段的双酶切与连接
设计反应体系：pET-32a载体/scFv-MLT基因片段10μL，Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ各2μL，10×Buffer Tango 2.5μL，ddH2O 35.5μL。将以上成分加入PCR管中，于37℃酶切4h，80℃，20min灭活Xho Ⅰ酶。待冷却至12℃，再加入2μL EcoR Ⅰ内切酶，37℃酶切4h，65℃，灭活20min。取5μL做1％琼脂糖凝胶电泳分别回收目的片段。
2.1.6pET-32a重组质粒scFv-MLT的构建
按照快速DNA连接试剂盒说明书进行连接pET-32a-scFv-MLT融合基因，略有改动。pET-32a载体双酶切目的片段10μL，scFv-MLT双酶切目的片段40μL，Rapid T4DNA ligase 2μL，快速连接缓冲液(2×)20μL，ddH2O 18μL。将该反应体系置于16℃过夜。
2.1.7转化BL21DE3感受态细胞
参照《分子克隆实验指南》，将pET-32a重组质粒scFv-MLT导入BL21DE3感受态细胞，复苏后进行培养。
2.1.8pET-32a重组质粒scFv-MLT的酶切鉴定
挑取10个单菌落用装有15mL的TB培养液(羧苄青霉素100μg/mL)的100mL培养瓶中，于37℃环境下震荡培养至0D600＝0.6～0.8，留取部分菌液用甘油保存，其余的用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒。先后用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ对pET-32a重组质粒scFv-MLT进行双酶切。酶切体系与步骤2.5中的相同。将成功酶切的质粒送上海英骏生物公司测序。将测序结果在NCBI网站进行BLAST比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用DNAStar7.10软件对测序结果进行预测与分析。
2.1.9重组蛋白的表达
参考Novagen公司的pET系统操作手册为指导。挑取平板上的单个菌落接在高浓羧苄青霉素(200μg/mL)的TB培养基的中，于37℃快速振荡培养至OD600＝0.2～0.4。离心沉淀菌体换用新的培养基，去除β内酰胺酶，于37℃快速振荡培养至OD600＝0.4～0.6，诱导前再次更换新的培养基。诱导剂IPTG的终浓度为1mM，于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h，在加入诱导剂后每一个小时取一次样本。将诱导前的对照组和每个时间段的诱导组冻融裂解菌体，加入20μL的4×蛋白上样缓冲液(含DTT)混合，于沸水中加热5～8min使蛋白变性。待样品冷却至常温后于4℃环境下12000rpm离心5min，取上清保存于-20℃。
2.1.10SDS-PAGE分析重组scFv-MLT蛋白分子量
按照SDS-PAGE凝胶试剂盒说明书操作制备10％的分离胶和5％的浓缩胶，组装并固定好BIO-RAD垂直电泳槽胶板。取上步制备好的样品各10μL，加入样品孔，以彩虹180广谱蛋白Marker PR1910(11KD-180KD)为参照标准。加80V电压至溴酚蓝指示剂进入分离胶后，电压升高至120V，待溴酚蓝指示剂接近胶体底部时电泳结束，小心取出凝胶。进行考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白的分子量。
2.1.11融合蛋白提取与纯化
大量培养表达菌诱导表达蛋白后，按照PH0311细菌细胞总蛋白提取试剂盒说明书操作，提取包涵体沉淀。再依次用1％、1.5％和2％的Triton-X100溶解包涵体沉淀。将10mL包涵体装入截留分子量为10KD的透析袋内，将透析袋置于1000mL的复性液中(Tris-HCl(pH＝7.9)20mM，咪唑5mM，NaCl 0.5M，还原性谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽(10/1))，于4℃环境下作用2～4h后换新的复性液作用6～8h，再换用新的复性液作用至少2h甚至可以作用过夜。将透析袋内复性后的液体于4℃13000rpm离心15min，取上清和沉淀。保留部分上清作为样本，将包涵体重新溶解于含有8M尿素的Binding Buffer中，再次用复性液复性，如此操作3次，留取复性后的上清。按照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)说明书将复性后的上清过柱纯化。用SDS-PAGE鉴定洗脱效果。
2.1.12Western blot分析重组蛋白
选取纯化结果较好的样本及为纯化的对照样本经过SDS-PAGE后转膜并孵育鼠源抗His-tag一抗(1:3000)(参照说明书使用剂量)，兔抗鼠IgG二抗(1:3000)(参照说明书使用剂量)。按照AEC底物显色试剂盒说明书操作制备显色液，用显色液将膜完全浸润，室温反应3～10min，用去离子水冲洗终止反应，观察结果。
2.2抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白的制备靶向抗肿瘤上的应用
2.2.1采用MTT法测定抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白靶向在体外对肺癌细胞作用的测定
取人肺腺癌细胞株H460用低血清1640培养基稀释成2×105个细胞/mL，接种96孔培养板，每孔100μL，经37℃5％CO2培养箱培养至细胞贴壁，弃去培养液。分为四个组：空白对照组、环磷酰胺对照组和融合蛋白组，每组设5个样本进行MTT实验。融合蛋白组每孔加入用低血清1640培养基配置成终浓度分别为4.0、2.0、1.0mg/mL，空白对照组加入等量的低血清1640培养基。每组每个浓度设3个平行孔，37℃5％CO2培养4h，取出培养板，每孔加入MTT的50μL/孔(1mg/mL),37℃4h后弃去MTT，加入DMSO 100μL/孔溶解formazan结晶。环磷酰胺对照组用药剂量2.0mg/mL按上述同样方法作用于细胞。每组均用酶标仪检测每孔的吸光度OD492值，根据吸光度计算不同浓度的融合蛋白对肺癌细胞的增殖抑制率。增殖抑制率(IR)仅(％)＝[(对照组OD值—药物作用组OD值)/(对照组OD值—本底对照组OD值)]×100％。
2.2.2抗IL-4单链抗体对人肺癌细胞株荷瘤小鼠抑瘤率和生命延长率影响
分别取出冻存人肺癌细胞复苏后进行培养。用0.2℅台盼蓝染色计数活细胞率。当活细胞率≧95％时，调整细胞数为1×106个/mL，分别于小鼠右腋下注射接种0.2mL/只，以建立小鼠肝癌实体瘤模型,待接种3周后，待荷瘤肺癌小鼠出现肿块。
将健康昆系小鼠动物随机分6组，每组16只，其中1个组为抗IL-4单链抗体组(96只)，每组16只，分别为重组蛋白高、中、低剂量3个组(分别皮下注射：100、50和20mg/kg)，及另外2个组分别为小鼠肝癌实体瘤模型(16只)和CTX阳性对照组(皮下注射：20mg/kg)(16只)。所有动物每天分别注射对应药物1次，连续10d。模型组注射相同体积的生理盐水。停药第7d后，每组取5只小鼠进行脱颈骨处死，剖取瘤块进行称重，采用肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均瘤重－给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100公式计算抑瘤率(注：实验过程有小鼠发生死亡，因此，每组只取5只小鼠进行抑瘤率实验)。
每组余下小鼠停药后，继续观察小鼠存活天数，计算小鼠生命延长率。生命延长率(％)＝(给药组平均存活天数－对照组平均存活天数)/对照组平均存活天数×100(注：实验过程有小鼠发生死亡，因此，每组只取5只小鼠进行生命延长率实验)。
2.3数据统计
用SPSS16.0软件进行分析，统计结果用来表示。
3.1结果
去除抗IL-4R单链抗体scFv基因中的Xho Ⅰ酶切位点的scFv基因片段的凝胶电泳结果见图1，在750～1000bp间有一条明显的条带；通过SOE-PCR连接的scFv-MLT基因结果见图2，在1000bp处有一条明显的条带，表明scFv与MLT两段基因连接成功。
3.2pET-32a重组质粒scFv-MLT酶切鉴定
用限制性内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ对pET-32a重组质粒scFv-MLT进行双酶切鉴定，通过1％琼脂糖凝胶进行电泳后在近1000bp处有明显的条带，与预期插入的scFv-MLT片段大小相符(图3)。
3.3scFv-MLT序列分析
测得scFv-MLT序列长度为1017bp如下：
GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCCGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCCTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCCACCAATGGTGGTTCTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACATCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCCTGGGATGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAAAAGCTTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGTCGACATGAAATTCTTGGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTGTACATTTCTTACATCTATGCGGCCCCTGAACCGGAACCGGCACCAGAGCCAGAGGCGGAGGCAGACGCGGAGGCAGATCCGGAAGCGGGAATTGGAGCAGTTCTGAAGGTATTAACCACAGGATTGCCCGCCCTCATAAGTTGGATTAAACGTAAGAGGCAACAGGGTTAACTCGAG；
蜜蜂生物种属为西方蜜蜂(Apis mellifera)
用DNAstar7.10软件将scFv-MLT序列翻译后发现其编码339个氨基酸，因pET-32a本身自带His-tag，且是以T7启动子作为翻译起始点，scFv-MLT基因序列在翻译成氨基酸时前后两端将多出一段基因序列，故翻译出的重组蛋白将多出17KD的分子量，总分子量将为52KD左右。
3.4SDS-PAGE分析
SDS-PAGE结果表明，在48～63KD之间有一条很明显的蛋白条带，与预期的scFv-MLT融合基因预测蛋白分子量52KD大小相近且表达量较高，表达量大于30％。经过不同条件的表达实验，scFv-MLT以包涵体形式表达。诱导表达的最佳方案为IPTG浓度1mM，37℃环境下保持一定通气量振荡培养3h(图4)。
3.5scFv-MLT的纯化
纯化蛋白经SDS-PAGE检测在48～63KD之间有一条很明显的蛋白条带，与预期的scFv-MLT融合基因预测蛋白分子量52KD大小相近。图5中的样本为最佳洗脱条件的考马斯亮蓝染色图，洗脱峰始于第3个1mL的Elution Buffer洗脱期。Binding Buffer中咪唑的最佳浓度为5mM，Elution Buffer中咪唑的最佳浓度为200mM，纯化结果较好(图5)。
3.6Western blot分析
结果显示纯化组与未纯化组样本经过以鼠源Anti-6×His-tag单克隆抗体为一抗(1:1000)，兔抗鼠IgG为二抗(1:2000)的Western-blot实验处理后的AEC底物显色结果，用AEC底物显色试剂盒作用的结果，在48-63KD之间有明显的条带，大小约52KD结果显示蛋白纯化结果较好(图6)。
3.7抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白在体外对肺癌细胞的活性测定
采用MTT法观察融合蛋白对人肺腺癌细胞株H460生长的影响。发现抗IL-4R单链抗体对肺癌细胞有明显抑制作用，各纯化融合蛋白组与模型对照组相比为差异极显著(P<0.01)，且随着剂量的增加，抑制作用迅速增强，呈明显的剂量依赖性(表1)。
表1融合蛋白对肝癌荷瘤小鼠抑瘤率的影响(n＝5)
组别 剂量(mg/kg) OD值(均值±标准差) 抑制率(％)
本底对照组 -- 0.06±0.01 --
对照组 -- 0.39±0.01 --
环磷酰胺 2.0 0.19±0.01## 59.77
融合蛋白低剂量组 1 0.31±0.02## 25.61
融合蛋白中剂量组 2 0.22±0.01## 51.83
融合蛋白高剂量组 4 0.19±0.01## 62.20
注：与模型组比较，##P<0.01。
3.8抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白对肺癌荷瘤小鼠抑瘤率的影响
纯化融合蛋白对荷瘤小鼠抑瘤率实验结果表明，小鼠背部皮下注射融合蛋白后，低、中、高3个剂量组(20、50、100mg/kg体重，此剂量为换算成药物剂量)均对小鼠实体瘤均有明显的抑制作用。结果分析显示：在对荷瘤小鼠抑瘤方面，各纯化融合蛋白与模型对照组相比为差异极显著(P<0.01)(表2)；对肺癌荷瘤小鼠生命延长的影响方面，各纯化融合蛋白组与模型对照组相比为差异极显著(P<0.01)(表3)。
表2融合蛋白对肺癌荷瘤小鼠抑瘤率的影响(n＝5)
组别 剂量(mg/kg) OD值(均值±标准差) 抑制率(％)
对照组 — 1.06±0.09 —
环磷酰胺 40 0.59±0.01## 43.94
融合蛋白低剂量组 20 0.80±0.02## 24.62
融合蛋白中剂量组 50 0.66±0.03## 37.12
融合蛋白高剂量组 100 0.62±0.05## 41.48
注：与模型组比较，##P<0.01。
表3融合蛋白对肺癌荷瘤小鼠生命延长率的影响(n＝5)
组别 剂量(mg/kg) OD值(均值±标准差) 抑制率(％)
对照组 — 14.6±1.85 —
环磷酰胺 20 27.8±1.72## 90.41
融合蛋白低剂量组 50 21.2±1.72## 45.21
融合蛋白中剂量组 100 24.4±1.02## 67.12
融合蛋白高剂量组 150 25.8±3.06## 76.71
注：与模型组比较，##P<0.01。
附图说明
图1是去除酶切位点并扩增的scFv(M:Marker DNA5000；1:去除酶切位点并扩增的scFv的PCR产物)；
图2是SOE-PCR产物琼脂糖电泳检测(M:Marker DNA2000；1:scFv与MLT连接的PCR产物)；
图3是重组质粒的Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切(M:Marker DNA10000；1：Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后的质粒)；
图4是SDS-PAGE分析(M:Marker PR1910(11KD-180KD)；1：无诱导表达总蛋白；2：诱导1h后表达总蛋白；3：诱导2h后表达总蛋白；4：诱导3h后表达总蛋白)；
图5是scFv-MLT蛋白纯化结果的考马斯亮蓝染色(M:Marker PR1910(11KD-180KD)；1～6：分别为用Elution Buffer洗脱后的第1～6管洗脱液)；
图6 Western blotAEC底物显色(M:Marker PR1910(11KD-180KD)；1：未纯化scFv-MLT融合蛋白；2：纯化scFv-MLT融合蛋白)。
下面结合实施例对发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
具体实施方式：
实施例1.
一种抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白，其制备方法为：通过重叠延伸PCR技术方法将抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽基因连接成scFv-MLT基因，构建pET-32a重组质粒scFv-MLT，转入BL21(DE3)原核表达菌，诱导表达scFv-MLT融合蛋白并进行纯化和复性，即可。
具体包括以下步骤：
1.用pET-32a质粒与BL21DE3原核表达体系表达scFv重组蛋白scFv基因片段通过提取scFv的pET-32a重组质粒并进行双酶切获取；将提取回收的scFv基因片段经过PCR方法去除Xho Ⅰ酶切位点并扩增，将该scFv基因片段用与合成蜂毒肽基因序列用重叠延伸PCR方法进行连接，构建scFv-MLT基因；
其中，去除Xho Ⅰ酶切位点为：设计引物F1和引物F2去除抗IL-4R单链抗体scFv基因序列的Xho Ⅰ酶切位点；根据抗IL-4R单链抗体scFv基因序列与合成“重叠序列-linker-MLT”基因序列，设计引物F1和F3，通过SOE-PCR技术连接抗IL-4R单链抗体(scFv)与蜂毒肽(MLT)基因成融合基因scFv-MLT；
其中，合成蜂毒肽基因序列这样设计：将蜂毒肽基因序列，即GenBank:JQ900378.1，在MLT序列5’端加上带有一段与抗IL-4R单链抗体scFv基因序列相同的重叠序列40bp，以及一段连接肽基因，另外在“重叠序列-linker-MLT”基因序列的3’端加入上XhoⅠ酶切位点；重叠区碱基序列为：CTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA；
其中，scFv基因片段用与合成蜂毒肽基因用序列用重叠延伸PCR方法进行连接为：设计反应体系为：去除Xho Ⅰ酶切位点的scFv基因片段15μL，MLT基因片段15μL，1μL引物F1，1μL引物F3，8μL ddH2O；反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min重复30个循环；72℃延伸10min；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收基因片段；
2.pET-32a载体/scFv-MLT基因片段的双酶切与连接：设计反应体系：pET-32a载体/scFv-MLT基因片段10μL，Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ各2μL，10×Buffer Tango 2.5μL，ddH2O 35.5μL；将以上成分加入PCR管中，于37℃酶切4h，80℃，20min灭活Xho Ⅰ酶。待冷却至12℃，再加入2μL EcoR Ⅰ内切酶，37℃酶切4h，65℃，灭活20min；取5μL做1％琼脂糖凝胶电泳分别回收目的片段；
3.构建pET-32a重组质粒scFv-MLT：反应体系：pET-32a载体双酶切目的片段10μL，scFv-MLT双酶切目的片段40μL，Rapid T4DNA ligase 2μL，快速连接缓冲液(2×)20μL，ddH2O 18μL，将该反应体系置于16℃过夜；
4.转入BL21DE3原核表达菌，将pET-32a重组质粒scFv-MLT导入BL21DE3感受态细胞，复苏后进行培养；
5.诱导表达scFv-MLT融合蛋白并进行纯化和复性，即可；
引物F1：5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’。
引物F2：5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’。
引物F3：5’-GAGGCAACAGGGTTAACTCGAG-3’。

Claims (6)

1.一种抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白，其特征在于：通过重叠延伸PCR技术方法将抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽基因连接成scFv-MLT基因，构建pET-32a重组质粒scFv-MLT，转入BL21 DE3原核表达菌，诱导表达scFv-MLT融合蛋白并进行纯化和复性，即可。
2.如权利要求1所述的抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白，其特征在于：其制备方法具体包括以下步骤：
(1)用pET-32a质粒与BL21 DE3原核表达体系表达scFv重组蛋白，scFv基因片段通过提取scFv的pET-32a重组质粒并进行双酶切获取；将提取回收的scFv基因片段经过PCR方法去除Xho Ⅰ酶切位点并扩增，将该scFv基因片段用与合成蜂毒肽基因序列用重叠延伸PCR方法进行连接，构建scFv-MLT基因；
其中，去除Xho Ⅰ酶切位点为：设计引物F1和引物F2去除抗IL-4R单链抗体scFv基因序列的Xho Ⅰ酶切位点；根据抗IL-4R单链抗体scFv基因序列与合成“重叠序列-linker-MLT”基因序列，设计引物F1和F3，通过SOE-PCR技术连接抗IL-4R单链抗体基因scFv与蜂毒肽基因MLT融合成scFv-MLT基因；
其中，合成蜂毒肽基因序列这样设计：将蜂毒肽基因序列，即GenBank:JQ900378.1，在MLT序列5’端加上带有一段与抗IL-4R单链抗体scFv基因序列相同的重叠序列40bp，以及一段连接肽基因，另外在“重叠序列-linker-MLT”基因序列的3’端加入上XhoⅠ酶切位点；重叠区碱基序列为：CTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA；
其中，scFv基因片段用与合成蜂毒肽基因用序列用重叠延伸PCR方法进行连接为：设计反应体系为：去除XhoⅠ酶切位点的scFv基因片段15μL，MLT基因片段15μL，1μL引物F1，1μL引物F3，8μL ddH2O；反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min重复30个循环；72℃延伸10min；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收基因片段；
(2)pET-32a载体/scFv-MLT基因片段的双酶切与连接：设计反应体系：pET-32a载体/scFv-MLT基因片段10μL，Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ各2μL，10×Buffer Tango 2.5μL，ddH2O 35.5μL；将以上成分加入PCR管中，于37℃酶切4h，80℃，20min灭活Xho Ⅰ酶。待冷却至12℃，再加入2μLEcoR Ⅰ内切酶，37℃酶切4h，65℃，灭活20min；取5μL做1％琼脂糖凝胶电泳分别回收目的片段；
(3)构建pET-32a重组质粒scFv-MLT：反应体系：pET-32a载体双酶切目的片段10μL，scFv-MLT双酶切目的片段40μL，Rapid T4DNA ligase 2μL，快速连接缓冲液(2×)20μL，ddH2O 18μL，将该反应体系置于16℃过夜；
(4)转入BL21 DE3原核表达菌，将pET-32a重组质粒scFv-MLT导入BL21 DE3感受态细胞，复苏后进行培养；
(5)诱导表达scFv-MLT融合蛋白并进行纯化和复性，即可。
3.如权利要求1所述的抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白，其特征在于：所述引物F1为5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’。
4.如权利要求1所述的抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白，其特征在于：所述引物F2为5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’。
5.如权利要求1所述的抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白，其特征在于：所述引物F3为5’-GAGGCAACAGGGTTAACTCGAG-3’。
6.一种如权利要求1～5中任一项所述的抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白的应用，其特征在于：包括用于治疗肺癌及其并发症。
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