CN111548420B

CN111548420B - 一种抗间皮素嵌合抗原受体、表达基因、表达载体、t细胞及其用途

Info

Publication number: CN111548420B
Application number: CN202010410095.XA
Authority: CN
Inventors: 张继帅; 苏红昌; 余祥; 向斌; 包朝乐萌
Original assignee: Shenzhen Pregene Biopharma Co ltd
Current assignee: Shenzhen Prijin Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-05-14
Filing date: 2020-05-14
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2040-05-14
Also published as: CN111548420A

Abstract

本发明通过构建包括依次连接的人CD8α信号肽，抗间皮素单链抗体，人CD28铰链区、跨膜区和胞浆区，以及人4‑1BB和CD3ζ胞浆区的抗间皮素嵌合抗原受体，获得一种靶向间皮素的新型第三代CAR‑T细胞，其在细胞和动物实验对肿瘤细胞的杀伤效果显著。

Description

一种抗间皮素嵌合抗原受体、表达基因、表达载体、T细胞及其用途

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，特别涉及一种抗间皮素嵌合抗原受体、表达基因、表达载体、T细胞及其用途。

背景技术

间皮素(Mesothelin)靶点广泛表达于肿瘤细胞，尤其在间皮瘤、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、胆管癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌或子宫内膜癌表达水平较高，而在正常组织胸膜、腹膜、心包膜表达水平较低。胸膜间皮细胞发生的间皮瘤，或肺癌等转移至胸膜导致的恶性胸水，胰腺癌、卵巢癌等转移至腹腔导致的恶性腹水，为晚期肿瘤患者营养不良、消瘦、抵抗力下降等恶液质表现的诱发因素。目前通过胸腔和或腹腔灌注化疗药物杀死肿瘤细胞，控制恶性胸腹水，但疗效有限。

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T cell Immunotherapy)是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法。嵌合抗原受体T细胞(Chi mericAntigen Receptor-T cell，CAR-T)是指经过基因修饰后，能以主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞MHC非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞受体能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。

依据经典免疫学理论，T细胞活化需受到T细胞受体(T cell receptor，TCR)传递的第一信号和由CD28、4-1BB、OX40等共刺激分子传递的第二信号，第一代CAR-T只是赋予了T细胞第一信号，因此，T细胞的功能较弱，临床试验效果不明显；第二代CAR-T利用基因工程的方法在胞内区放置了TCR信号(CD3ζ)和共刺激信号(CD28或4-1BB)，当scFv识别肿瘤细胞后，同时传递了T细胞活化的第一信号和第二信号，因此，T细胞被充分活化，分泌穿孔素、颗粒酶等分子杀死肿瘤细胞，活化的T细胞同时增殖，在肿瘤部位维持一定的数量和活性，持续杀死肿瘤细胞。第三代CAR-T在胞内区放置了两个共刺激分子的信号(CD28和4-1BB)，将使CAR-T激活效率变的更高，体内持续时间更长。

CAR-T在血液系统肿瘤如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗中显示了较好疗效。然而，对于肺癌、食管癌、间皮瘤、乳腺癌、胃癌、胆管癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌或子宫内膜癌等实体肿瘤及其转移导致的恶性胸腹水，CAR-T细胞的效果，还没有太多报道，需要通过试验进行观察。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种抗间皮素嵌合抗原受体，旨在构建针对肺癌、食管癌、间皮瘤、乳腺癌、胃癌、胆管癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌或子宫内膜癌等实体肿瘤及其转移导致的恶性胸腹水的第三代CAR-T细胞，以观察其疗效。

为实现上述目的，本发明第一方面提出一种抗间皮素嵌合抗原受体，所述抗间皮素嵌合抗原受体包括依次连接的人CD8α信号肽，抗间皮素单链抗体，人CD28铰链区、跨膜区和胞浆区，以及人4-1BB和CD3ζ胞浆区。

可选地，所述抗间皮素嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明第二方面提出一种抗间皮素嵌合抗原受体表达基因，所述基因编码第一方面所述的抗间皮素嵌合抗原受体。

可选地，所述抗间皮素嵌合抗原受体表达基因的碱基序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明第三方面提出一种表达载体，所述表达载体插入有第二方面所述的基因，并且该表达载体能够在转染宿主细胞后，使得所述宿主细胞表达第一方面所述的抗间皮素嵌合抗原受体。

可选地，所述表达载体为慢病毒表达载体。

本发明第四方面提出一种表达抗间皮素嵌合抗原受体的T细胞，所述T细胞中能够表达第一方面所述的抗间皮素嵌合抗原受体。

本发明第五方面还提出一种药物组合物，所述药物组合物的有效成分包括第四方面所述的表达抗间皮素嵌合抗原受体的T细胞。

本发明第六方面还提出如第一方面所述的抗间皮素嵌合抗原受体、第二方面所述的抗间皮素嵌合抗原受体表达基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的表达抗间皮素嵌合抗原受体的T细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

可选地，所述肿瘤为肺癌、食管癌、间皮瘤、乳腺癌、胃癌、胆管癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌或子宫内膜癌及上述肿瘤转移导致的恶性胸、腹水。

本发明技术方案通过构建包括依次连接的人CD8α信号肽，抗间皮素单链抗体，人CD28铰链区、跨膜区和胞浆区，以及人4-1BB和CD3ζ胞浆区的抗间皮素嵌合抗原受体，获得一种靶向间皮素的新型第三代CAR-T细胞，以验证其对实体肿瘤的疗效，并且细胞和动物实验的效果显著。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示获得其他的附图。

图1为本发明实施例中靶向间皮素的CAR分子结构示意图；

图2为本发明实施例抗间皮素嵌合抗原受体基因的PCR结果凝胶电泳图；

图3为本发明实施例抗间皮素嵌合抗原受体基因克隆后菌液PCR鉴定结果凝胶电泳图；

图4为对比实施例中靶向间皮素的CAR分子结构示意图；

图5为本发明实施例与对比例的抗间皮素CAR-T细胞中抗间皮素嵌合抗原受体阳性率流式细胞分析结果图；

图6A-6B为本发明实施例抗间皮素CAR-T细胞对间皮瘤细胞杀伤实验结果图；

图7为本发明实施例抗间皮素CAR-T细胞治疗间皮素阳性荷瘤小鼠后，肿瘤负荷的变化情况图；

A：注射mesothelin CAR-T细胞当天；

B：注射mesothelin CAR-T细胞后第5天；

C：注射mesothelin CAR-T细胞后第8天；

D：注射mesothelin CAR-T细胞后第15天。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明第一方面提出一种抗间皮素嵌合抗原受体，所述抗间皮素嵌合抗原受体包括依次连接的人CD8α信号肽，抗间皮素单链抗体，人CD28铰链区、跨膜区和胞浆区，以及人4-1BB和CD3ζ胞浆区。

具体的，构建好的靶向间皮素的CAR分子的结构示意图如图1所示，CD8α信号肽(CD8α SP)表达后位于细胞外，CD8α信号肽的作用为引导不同的蛋白质到达细胞的不同部位，如内质网、溶酶体、细胞膜，CD8α信号肽的作用就是让CAR分子能够表达在细胞膜上。

抗间皮素单链抗体(scFv)表达后位于细胞外，抗间皮素嵌合抗原受体通过抗间皮素单链抗体结构可以靶向间皮素，从而靶向间皮素高表达的肿瘤细胞，例如肺癌、食管癌、间皮瘤、乳腺癌、胃癌、胆管癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌或子宫内膜癌等。单链抗体是由抗体重链可变区和轻链可变区通过一个10-25个氨基酸组成的柔性短肽(linker)连接而成，是最小的重组抗体形式。单链抗体较小的分子尺寸，带来了强大的肿瘤内穿透力、在血液中快速降解、人体内负反馈小等优势。

表达后位于抗间皮素单链抗体和细胞膜之间的CD28铰链区(CD28hinge)，此区段提供CAR分子更多的灵活性，方便结合靶点抗原，CD28铰链区为CD28分子的胞外区的一段。

还有表达后位于细胞膜的CD28跨膜区(CD28 TM)，该区段为CD28分子的跨膜区序列，表达后位于细胞胞浆的CD28胞浆区(CD28 ICD)、4-1BB的胞浆区(4-1BB ICD)和CD3ζ胞浆区(CD3ζICD)，CD28和4-1BB是CAR-T研究中最常涉及到的共刺激分子，CD28可以能显著增强CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的能力，而4-1BB能延长CAR-T细胞的存活时间。使用同一CD28分子序列构建CAR分子的铰链区、跨膜区和胞浆区，得到的CAR结构稳定性较好。

具体的，所述抗间皮素单链抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.3，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4，人CD28铰链区、跨膜区和胞浆区的氨基酸序列为SEQ IDNO.5，人4-1BB氨基酸序列为SEQ ID NO.6，CD3ζ胞浆区的氨基酸序列为SEQ ID NO.7。

更具体的，所述抗间皮素单链抗体的重链可变区碱基序列为SEQ ID NO.8，轻链可变区碱基序列为SEQ ID NO.9，人CD28铰链区、跨膜区和胞浆区的碱基序列为SEQ IDNO.10，人4-1BB碱基序列为SEQ ID NO.11，CD3ζ胞浆区的碱基序列为SEQ ID NO.12。

可选地，所述表达载体为慢病毒载体。

慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒表达载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

更具体的，所述慢病毒表达载体使用的是第三代慢病毒表达载体，包装质粒包括pMDLg/pRRE、pMD2.G以及pRSV-Rev质粒。

本发明第五方面还提出如第一方面所述的抗间皮素嵌合抗原受体、第二方面所述的抗间皮素嵌合抗原受体表达基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的表达抗间皮素嵌合抗原受体的T细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1本发明靶向mesothelin的CAR-T细胞制备

一、靶向间皮素的CAR分子构建

1、抗间皮素单链抗体序列

重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO.4。将重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，进行在人源细胞表达的密码子优化，最后得到重链可变区的碱基序列为SEQ ID NO.8，轻链可变区的碱基序列为SEQ ID NO.9。

2、人CD28分子的铰链区、跨膜区和胞浆区序列

人CD28分子的铰链区、跨膜区和胞浆区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，进行在人源细胞表达的密码子优化后得到碱基序列为SEQ ID NO.10。

3、人4-1BB分子的胞浆区序列

人4-1BB分子的胞浆区氨基酸序列为SEQ ID NO.6，进行在人源细胞表达的密码子优化后得到碱基序列为SEQ ID NO.11。

4、CD3ζ分子的胞浆区序列

CD3ζ分子的胞浆区氨基酸序列为SEQ ID NO.7，进行在人源细胞表达的密码子优化后得到碱基序列为SEQ ID NO.12。最后得到完整的靶向间皮素的CAR分子的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，碱基序列为SEQ ID NO.2。

5、CAR基因克隆

使用的PCR引物序列分别为带有BamHI酶切位点的F：CGGGATCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC(SEQ ID NO.13)，以及带有SalI酶切位点的R：GCGTCGACTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTG(SEQ ID NO.14)。

5.1PCR扩增CAR基因序列

CAR基因序列可以通过上述确定的各基因片段的序列进行多重PCR连接得到所述CAR基因，在本发明实施例中，使用一个已经构建好的带有CAR基因的质粒Pre-K28BB为模板进行CAR基因扩增，PCR反应体系如下表1所示，PCR反应程序如下表2所示。

表1.PCR反应体系

表2.PCR反应程序

PCR反应完成之后，取5μl反应产物进行凝胶电泳鉴定，结果如图2所示，其中1泳道为Marker，2泳道为PCR反应产物，Marker从下到上依次为1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp、10000bp，从图中可看出，在1000bp和2000bp之间为PCR反应产物，大小符合CAR基因1572bp且无杂带，为目的基因片段。

电泳鉴定PCR产物大小无误后，使用《普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒》回收PCR产物，测定浓度，-20℃保存。

5.2酶切

取两个1.5ml离心管，做好标记，按表3内容定量加入各组分至对应的1.5ml离心管中，充分混匀，37℃水浴2h进行酶切反应。

表3.酶切反应体系

酶切完成后各取5μl加入上样缓冲液电泳鉴定，其中目的基因大小为1572bp，载体酶切后大小为7900bp。

使用《通用型DNA纯化回收试剂盒》回收酶切产物，测定浓度，-20℃保存。酶切产物定量：载体8.1ng/μl，mesothelin CAR 69.2ng/μl。

5.3连接

将上述酶切后回收的载体和目的基因，按载体：目的基因＝1:3的摩尔比进行连接反应，取两个1.5ml离心管，做好标记，按表4内容定量加入各组分至对应的1.5ml离心管中(Solution I冰上加)，充分混匀。22℃水浴15min进行连接反应。

表4.连接反应体系

5.4转化

取上述连接产物于冰上加入50μl感受态，冰上孵20～30min；然后42℃水浴90s；再冰上放置2～5min；加500μl LB复苏1h；4000rpm离心5min，留适量上清液50-100μl重悬，涂到卡那霉素抗性的培养基板中。

5.5阳性菌鉴定

挑取8株不同的单克隆菌落，分别接种至4ml含卡那霉素的LB培养基中，振荡培养过夜。以1μl菌液为模板，通过菌液PCR法鉴定含重组质粒的阳性菌。菌液PCR反应体系如表5所示，菌液PCR反应程序如表6所示。

表5.菌液PCR反应体系

表6.菌液PCR反应程序

分别取菌液PCR反应产物5μl进行凝胶电泳鉴定，结果如图3所示，其中1-8泳道分别为1-8号菌株，M为Marker，Marker从下到上依次为1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp、10000bp，从图中可看出菌液PCR反应产物位于1000bp与2000bp，大小与目的基因的大小符合，全部为阳性克隆。

5.6质粒鉴定

使用《快速法无内毒素质粒小提试剂盒(PD1220)》提取构建好的载体-CAR基因质粒，测定浓度，电泳，送测序，测序结果正确。

二、慢病毒包装

2.1细胞培养：293T细胞培养于37℃，5％CO₂培养箱内，培养基为DMEM/HighGlucose/10％FBS。

2.2种植细胞：包装病毒前一天，胰酶消化293T细胞，5×10⁶细胞/孔种植10cm培养皿，准备包装实施例1中提取的载体-CAR基因质粒。

2.3细胞转染：将载体-CAR基因质粒与包装质粒pMDLg/pRRE、pMD2.G、pRSV-Rev按质量比4:2:1:2的比例混匀，转染试剂聚醚酰亚胺(Polyetherimide，PEI)与混合质粒按照质量比3:1混合，将质粒与转染试剂的混合物加入10cm培养皿中瞬时转染293T细胞。将转染后的细胞放入5％CO₂培养箱中培养。

2.4收获病毒：48h后，将病毒培养基转入50ml离心管内，4℃，1600rpm，离心5min，去除293T细胞，分装后-80℃冻存。

三、抗间皮素CAR-T细胞制备

用CD3试剂分离纯化T细胞，并用transact活化T细胞，在含有500IU/ml IL-2的VIVO培养基中培养。T细胞活化24h后，加入慢病毒感染，放入37℃，5％CO₂培养箱内培养，命名mesothelin CAR-T。

对比例1：其它靶向间皮素的CAR分子结构制备抗间皮素CAR-T细胞

对比例采用的靶向间皮素的CAR分子结构示意图如图4所示，依次包括表达于细胞外的CD8αSP和scFv序列，CD8α胞外区部分序列(hinge)和CD8α跨膜区(TM)序列，表达于细胞胞浆区的CD28胞浆区(ICD)、4-1BB胞浆区(ICD)和CD3ζ胞浆区(ICD)序列。对比例1的靶向间皮素的CAR分子以及抗间皮素CAR-T细胞的获得参照实施例1的方法，在此不再赘述，命名为对比mesothelin CAR-T。

试验例1：流式细胞分析CAR-T细胞中CAR阳性率

慢病毒感染T细胞后第七天，使用mesothelin-Fc融合蛋白流式细胞术分析实施例1的mesothelin CAR-T细胞和对比例1的对比mesothelin CAR-T细胞中的CAR阳性率，同时以技术较为成熟的CD19 CAR-T细胞作为阴性对照，如果T细胞中表达了抗mesothelin CAR分子，则可以识别并结合mesothelin-Fc融合蛋白，用荧光标记的识别Fc的二抗标记mesothelin-Fc融合蛋白，能够有荧光信号，流式检测，实验结果如图5所示，图5从左到右依次为阴性对照CD19 CAR-T细胞、本发明实施例1mesothelin CAR-T细胞以及对比例1对比mesothelin CAR-T细胞的流式细胞分析结果，从图中可看出，本发明实施例1构建的mesothelin CAR-T细胞阳性率较高，CAR分子表达较高，阳性细胞和阴性细胞分群明显，而对比例1的对比mesothelin CAR-T细胞的阳性细胞和阴性细胞没有明显分群，阳性率较低，表明实施例1的CAR结构稳定性更好，能够增加CAR阳性率和分子表达。

试验例2：体外细胞杀伤实验

以间皮瘤细胞系NCI-H226作为靶细胞，评估mesothelin CAR-T细胞对表达Mesothelin靶细胞的特异性杀伤能力，以CD19 CAR-T细胞为阴性CAR-T细胞对照。将mesothelin CAR-T细胞与阴性CAR-T细胞，分别和表达Mesothelin的NCI-H226细胞孵育，进行杀伤实验，效靶比设三个梯度，分别为1:1、2:1、4:1。LDH释放实验评估mesothelin CAR-T细胞在体外对NCI-H226细胞的杀伤能力，结果如图6A和6B。结果表明在不同效靶比下mesothelin CAR-T细胞剂量依懒性杀伤表达Mesothelin的靶细胞NCI-H226，而阴性CAR-T细胞不能有效杀伤NCI-H226细胞。

试验例3：体内动物实验

为了评估靶向间皮瘤的mesothelin CAR-T细胞药物的体内功效，通过对B-NDG小鼠腹腔接种5x10⁶ NCI-H226-Luc细胞荷瘤，肿瘤生长和侵袭性进展通过体内生物发光成像进行定量。

给药前一天对所有小鼠活体成像，挑选10只荷瘤均一小鼠分成2组，即阴性CAR-T细胞对照组(CD19 CAR-T)和mesothelin CAR-T细胞实验组，每组5只。于荷瘤注射后第3天给mesothelin CAR-T细胞实验组动物腹腔注射1x10⁷ mesothelin CAR-T细胞，阴性CAR-T细胞对照组动物腹腔注射1x10⁷CD19 CAR-T细胞，并分别成像，结果如图7A，分别在给药后第5天、第8天、第15天对小鼠成像以观察肿瘤细胞的信号强度，结果分别如图7B、7C、7D所示。由图可见mesothelin CAR-T细胞实验组肿瘤的生物发光强度明显弱于阴性CAR-T细胞对照组，表明mesothelin CAR-T细胞于小鼠体内能够有效杀伤间皮瘤肿瘤细胞。

以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳普瑞金生物药业有限公司

<120> 一种抗间皮素嵌合抗原受体、表达基因、表达载体、T细胞及其用途

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 523

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met

20 25 30

Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser

35 40 45

Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro

50 55 60

Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser

100 105 110

Lys His Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

130 135 140

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val

145 150 155 160

Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met

165 170 175

Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Leu

180 185 190

Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly

195 200 205

Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

225 230 235 240

Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp

260 265 270

Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu

275 280 285

Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu

290 295 300

Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val

305 310 315 320

Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His

325 330 335

Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys

340 345 350

His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

355 360 365

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

370 375 380

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

385 390 395 400

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

405 410 415

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

420 425 430

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

435 440 445

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn

450 455 460

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

465 470 475 480

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

485 490 495

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

500 505 510

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

515 520

<210> 2

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggatattg aactgactca atctccagcc attatgtctg catcacctgg cgagaaagtc 120

accatgacat gcagtgctag tagctcagtg agctacatgc attggtatca gcagaagtcc 180

ggaacttctc ctaaacggtg gatctacgac accagtaagc tcgcctctgg cgtgcctggt 240

aggttctccg gcagtggtag tggcaacagt tacagtctga ccatctcaag cgtcgaggct 300

gaagatgatg caacctacta ctgccagcag tggtctaagc accctctgac atttggcgca 360

ggaacaaagc tggagatcaa gggaggagga ggcagcggcg gaggaggctc tgggggaggc 420

gggagtcagg tgcaactcca acagtcagga ccagaactgg agaagcctgg cgcaagcgtg 480

aaactgtcct gtaaagctag tgggtattca ttcaccggat acacaatgaa ttgggtgaaa 540

cagagtcatg gcaagtcact cgaatggata gggctcatta caccctacaa tggcgcatcc 600

agttacaacc agaagtttcg cggtaaggct actctcaccg tggataagag cagcagcaca 660

gcttacatgg acctgctgtc cctcacatcc gaagattctg ccgtgtactt ctgcgctaga 720

ggagggtatg acggcagagg cttcgactat tggggtcaag gtacaactgt tactgtttct 780

agcattgaag ttatgtatcc tcctccttac ctagacaatg agaagagcaa tggaaccatt 840

atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca agtcccctat ttcccggacc ttctaagccc 900

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 960

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 1020

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 1080

cgcgacttcg cagcctatcg ctccaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 1140

caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 1200

ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1260

cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1320

gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag 1380

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1440

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1500

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1560

ccccctcgct aa 1572

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly

20 25 30

Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys

50 55 60

Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Lys His Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

50 55 60

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

65 70 75 80

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

85 90 95

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

100 105

<210> 6

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 8

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgcaggtgc aactccaaca gtcaggacca gaactggaga agcctggcgc aagcgtgaaa 60

ctgtcctgta aagctagtgg gtattcattc accggataca caatgaattg ggtgaaacag 120

agtcatggca agtcactcga atggataggg ctcattacac cctacaatgg cgcatccagt 180

tacaaccaga agtttcgcgg taaggctact ctcaccgtgg ataagagcag cagcacagct 240

tacatggacc tgctgtccct cacatccgaa gattctgccg tgtacttctg cgctagagga 300

gggtatgacg gcagaggctt cgactattgg ggtcaaggta caactgttac tgtttctagc 360

<210> 9

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gatattgaac tgactcaatc tccagccatt atgtctgcat cacctggcga gaaagtcacc 60

atgacatgca gtgctagtag ctcagtgagc tacatgcatt ggtatcagca gaagtccgga 120

acttctccta aacggtggat ctacgacacc agtaagctcg cctctggcgt gcctggtagg 180

ttctccggca gtggtagtgg caacagttac agtctgacca tctcaagcgt cgaggctgaa 240

gatgatgcaa cctactactg ccagcagtgg tctaagcacc ctctgacatt tggcgcagga 300

acaaagctgg agatcaag 318

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120

tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180

tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240

atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300

gacttcgcag cctatcgctc c 321

<210> 11

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 12

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgggatccgc caccatggcc ttaccagtga ccgc 34

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcgtcgactt agcgaggggg cagggcctg 29

Claims

1.一种抗间皮素嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗间皮素嵌合抗原受体包括依次连接的人CD8α信号肽，抗间皮素单链抗体，人CD28铰链区、跨膜区和胞浆区，以及人4-1BB和CD3ζ胞浆区；所述抗间皮素嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种抗间皮素嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的抗间皮素嵌合抗原受体。

3.如权利要求2所述的一种抗间皮素嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，所述抗间皮素嵌合抗原受体表达基因的碱基序列为SEQ ID NO.2所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体插入有权利要求2所述的基因，并且该表达载体能够在转染宿主细胞后，使得所述宿主细胞表达权利要求1所述的抗间皮素嵌合抗原受体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体。

6.一种表达抗间皮素嵌合抗原受体的T细胞，其特征在于，所述T细胞中能够表达如权利要求1所述的抗间皮素嵌合抗原受体。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分包括权利要求6所述的表达抗间皮素嵌合抗原受体的T细胞。

8.如权利要求1所述的抗间皮素嵌合抗原受体、权利要求2所述的抗间皮素嵌合抗原受体表达基因、权利要求4所述的表达载体、权利要求6所述的表达抗间皮素嵌合抗原受体的T细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途；其中；所述肿瘤为肺癌、食管癌、间皮瘤、乳腺癌、胃癌、胆管癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌或子宫内膜癌及上述肿瘤转移导致的恶性胸、腹水。