CN107603995A

CN107603995A - 一种cd19 cart及其应用

Info

Publication number: CN107603995A
Application number: CN201710639048.0A
Authority: CN
Inventors: 张继帅; 栗红建; 赵杨杨; 余祥; 郑孟韬; 张健; 苏红昌; 何鹏华; 彭华; 姜冬冬; 何昱
Original assignee: Preckin (shenzhen) Biotechnology Co Ltd; Beijing Pregene Biotechnology Company ltd
Current assignee: PREGENE BIOPHARMA COMPANY (SHENZHEN)
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2018-01-19

Abstract

本发明公开了一种用于治疗肿瘤的CD19 CART，还涉及慢病毒载体、CD19 CAR T2A EGFRt基因，以及它们的应用。本发明的CD19 CART在不影响CART杀伤效果的前提下，适当降低反应性，并且在CART导致严重不良反应时，适时终止反应，兼顾了治疗效果和安全性。

Description

一种CD19 CART及其应用

技术领域

本发明属于免疫细胞治疗领域，具体地，涉及一种用于治疗肿瘤的CD19 CART，还涉及慢病毒载体、CD19 CAR T2A EGFRt基因，以及它们的应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor modified T cells，CART)是通过基因修饰的手段，将一个人工合成的CAR分子(Chimeric Antigen Receptor)表达在T细胞膜上，使T细胞以抗原抗体结合的方式识别并杀伤肿瘤细胞。CAR分子包括胞外的结合区域(能特异性识别靶抗原的单克隆抗体来源的单链抗体(scFv))、铰链区、跨膜区和胞内的信号段。这一技术有几个优势，例如，CAR蛋白对肿瘤表面的TAA(肿瘤相关抗原，tumorassociated antigen)的识别是以一种MHC(major histocompatibility complex)-非依赖性的方式进行的，因而CART细胞可以克服肿瘤细胞通过下调MHC分子逃脱免疫攻击，并且CAR识别没有MHC限制性，同一种CAR可以应用于不同的患者。另外，CAR蛋白可以识别细胞表面的任何类型的抗原，包括蛋白、糖类、糖脂，这样，相对于TCR只能识别MHC-肽段，CAR使T细胞能识别的肿瘤表面标志物的范围大大增加。与抗原-抗体反应一样，CART的scFv段与抗原结合也受结合域的亲和力、抗原表位的结构、肿瘤细胞表面抗原的数量、pH值、温度、离子强度等因素的影响。

目前国外CART细胞用于治疗B细胞急性淋巴母细胞性白血病(acutelymphoblastic cell leukemia，ALL)，B-ALL，取得了高达93％的完全缓解率；治疗淋巴瘤，完全缓解率高达64％；CART技术在治疗这两种疾病时取得的效果是任何其他药物无法相比的，并且，目前临床试验选择的都是复发、难治的患者。国外3家公司：诺华(Novartis)、Kitepharma、Juno therapeutics正在研发CD19 CART，用于白血病和淋巴瘤的治疗。预计诺华的CD19 CART会在2017年10月份被FDA批准用于治疗儿童B-ALL，Kite的CD19 CART会在2017年底被FDA批准上市治疗淋巴瘤，Juno公司的CD19 CART会在2018年被FDA批准治疗成人淋巴瘤。

国外临床进展较快的3个公司各自拥有CD19 CART的不同知识产权，诺华公司和宾夕法尼亚大学的Carl June教授合作，Kite公司和美国国立癌症研究院(NCI)的Rosenberg教授，及以色列魏茨曼研究所的Zelig Eshhar教授合作，Juno公司和美国MSKCC、西雅图儿童医院、Fred Hutchinson癌症研究中心合作。3个公司的CD19 CART的结构见图1。3个公司皆采用FMC63单链抗体识别CD19分子，诺华和Juno使用相同的4-1BB分子(第二信号)和CD3ζ分子(第一信号)的胞浆区活化T细胞，Kite使用CD28分子(第二信号)和CD3ζ分子(第一信号)的胞浆区活化T细胞，即CAR结构的CD19识别区相同，胞浆区采用的是天然的能活化T细胞的不同分子的胞浆区组合[1、2、3]。

1.宾夕法尼亚大学专利(US20140106449 A1)，名称：Use of Chimeric AntigenReceptor-Modified T Cells to Treat Cancer.

2.Kochenderfer JN,Feldman SA,Zhao Y,Xu H,Black MA,Morgan RA,etal.Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19chimeric antigenreceptor.J Immunother.2009；32(7):689-702.

3.Sommermeyer D,Hudecek M,Kosasih PL,Gogishvili T,Maloney DG,TurtleCJ,et al.Chimeric antigen receptor-modified T cells derived from defined CD8+and CD4+subsets confer superior antitumor reactivity in vivo.Leukemia.2016；30(2):492-500。

CD19 CART在临床试验中，虽然效果非常显著，但是由于CART主要在血管和骨髓内杀死肿瘤细胞，会引起剧烈的免疫和炎症反应，导致患者发生细胞因子释放综合征，主要表现为高热、低血压、低氧、多器官功能损害以及神经毒性。包括上述3个公司在内的CD19CART都或多或少的存在这些问题，例如，其中，Juno公司的一种CD19 CART产品由于神经毒性，导致6名患者脑水肿死亡。

为了防止和治疗细胞因子释放综合征，可以采取的策略有：1.适当降低CART细胞的反应性，在杀死肿瘤细胞的同时，避免短时间内释放大量细胞因子；2.使用IL-6受体的中和抗体，阻断主要细胞因子IL-6的毒性；3.使用激素，抑制免疫反应和CART杀伤作用；4.在CART细胞装载安全开关，如自杀基因、iCas-9诱导凋亡或使用CD20、EGFRt等标签。其中，IL-6中和抗体和激素在临床已经有成熟的药物，可以在需要时应用，因此，可以在策略1降低反应性和策略4装载安全开关方面对CAR结构进行设计，具有广泛的前景，本发明正基于此。

发明内容

本发明要解决的技术问题：

本发明旨在解决CD19 CART在血管和骨髓内杀死肿瘤细胞的同时，引起剧烈的免疫和炎症反应、导致患者发生细胞因子释放综合征的问题，减少或缓解高热、低血压、低氧、多器官功能损害以及神经毒性等症状或现象。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

在一个方面，本发明提供了一种CD19 CAR T2A EGFRt基因，其具有SEQ ID NO 5的序列。

在另一个方面，本发明提供了一种CD19 CAR T2A EGFRt病毒载体，其携带CD19CAR T2A EGFRt基因，所述CD19 CAR T2A EGFRt基因具有SEQ ID NO 5的序列。

如上所述的CD19 CAR T2A EGFRt病毒载体，其中，所述病毒是慢病毒。

如上所述的CD19 CAR T2A EGFRt病毒载体，其为Pre-Lenti-EF1-CD19 CAR T2AEGFRt病毒载体。

在另一个方面，本发明提供了一种CART细胞，其为CD19 CAR T2A EGFRt基因修饰的T细胞，所述CD19 CAR T2A EGFRt基因具有SEQ ID NO 5的序列。

如上所述的CART细胞，其为CD19 CART细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种如上所述的CD19 CAR T2A EGFRt基因在制备CART细胞中的用途。

在另一个方面，本发明提供了一种如上所述的病毒载体在制备CART细胞中的用途。

在另一个方面，本发明提供了一种如上所述的CART细胞在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

如上所述的用途，其特征在于，所述肿瘤是表达CD19的肿瘤，优选地，是白血病和淋巴瘤。

本发明的创新性及产生的技术效果：

本发明采用了与现有技术完全不同的嵌合抗原受体基因组合，即，由三段基因：CD19ScFV基因、2代CAR结构基因和安全开关EGFRt基因序列组成，该新型的基因组合既能分别发挥各自的功能，又能相互协调，提供有效和安全的癌症治疗功能。

具体地，本发明使用的CAR分子结构设计适当延长了铰链区，期望一定程度上减弱CART的杀伤功能；在识别CD19的CAR分子的基础上利用T2A序列串联并列表达了EGFRt标签(为EGFR分子的截断形式，能够被临床靶向EGFR的爱必妥抗体识别，进而通过ADCC作用杀死CART细胞，避免严重不良反应)。以上两方面的设计将能在不影响CART效果的前提下，适当降低细胞因子释放的程度，并且在CART导致严重不良反应时，适时终止反应，兼顾了治疗效果和安全性，主要创新点如下所述。

1.使用和已知二代结构不同的，较长的铰链区，适当降低CART反应性，避免临床应用的严重不良反应；

2.装载了安全开关EGFRt，在发生无法控制的不良反应时可以使用爱必妥抗体杀死CART细胞，避免危及患者生命。

这些创新性设计很大程度上克服了现有技术中，包括前述诺华、Kite、Juno公司在内的CD19 CART的各种不利问题。

发明详述

本发明针对国外3家公司的CD19 CART中的各种问题，设计了全新的嵌合抗原受体基因，在识别CD19的单链抗体方面采用小鼠的FMC63克隆(无专利保护)，在CD19的铰链区和跨膜区的组合方面采用了和国外公司不同的结构，在胞浆区采用了4-1BB分子和CD3ζ分子的全部胞浆区片段。本发明和国外公司的CD19 CAR结构的区别见图1。具体构思如下：

(1)使用FMC63单链抗体保证识别CD19的特异性和亲和力；

(2)加长了铰链区(和其它3个公司相比，至少增加了49个氨基酸)降低CART细胞的反应性(图1、图8，杀伤效率适当降低)；

(3)在CAR基因后面通过T2A序列串联了EGFRt标签基因序列(为EGFR分子的截短形式，能够被临床靶向EGFR的爱必妥抗体识别，进而在必要时通过ADCC作用杀死CART细胞)，结构见图2。

1.依照图3的方案构建慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-CD19 CAR T2A EGFRt。

1.1由中美泰和公司合成3段基因，一段为CD19 ScFV基因(由CD8a信号肽+NCBI核酸序列号CAA74659.1的重链密码子优化+连接肽(G4S)₃+序列号为CAA74660.1的轻链密码子优化后的核苷酸序列)；一段为设计的2代CAR结构基因(CD8a铰链区+CD28铰链区和跨膜区+4-1BB胞浆区+CD3ζ胞浆区)；一段为专利WO/2011/056894A2描述的安全开关EGFRt基因序列(T2A序列+EGFRt基因序列，T2A序列为脆性位点，基因翻译为蛋白质后，T2A处肽段断裂为CD19 CAR和EGFRt两个分子，分别表达)。序列如下：

ScFV基因(SEQ ID NO 1)：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO 1)

2代CAR结构基因(SEQ ID NO 2)：

CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCCCACGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO 2)

安全开关T2A+EGFRt(SEQ ID NO 4)

GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGTGA(SEQ ID NO 4)

1.2得到合成基因后，进行分子克隆，首先进行CD19 CAR的构建，通过PCR得到SEQID NO 1和SEQ ID NO 2的PCR产物，进行重叠PCR，得到两个片段连接在一起的2代CAR结构的CD19 CAR基因；测序正确后，将CD19 CAR基因和SEQ ID NO 4基因分别进行PCR，得到PCR产物，进行重叠PCR，得到CD19 CAR基因+T2A序列+EGFRt基因的片段，酶切慢病毒Pre载体和CD19 CAR基因+T2A序列+EGFRt基因，连接，转化，挑克隆，提质粒，测序，得到序列正确慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-CD19 CAR T2A EGFRt。

2.包装慢病毒，制备CART，进行细胞杀伤实验。

3.制备CART，进行动物实验，在动物水平观察CART清除肿瘤效果。

附图说明

图1示出本发明的CD19 CAR结构设计，以及和现有CD19 CAR的区别。

1.诺华：CD8α信号肽+FMC63 scFV+CD8α铰链区和跨膜区(aa137-206)+4-1BB胞浆区(aa214-255)+CD3ζ胞浆区(aa52-164)；

2.Kite：GM-CSFRα信号肽+FMC63 scFV+CD28铰链区、跨膜区和胞浆区(aa114-219)+CD3ζ胞浆区(aa52-164)；

3.Juno：GM-CSFRα信号肽+FMC63 scFV+IgG4铰链区(aa99-110)+CD28跨膜区(aa153-179)+4-1BB胞浆区(aa214-255)+CD3ζ胞浆区(aa52-164)；

4.本发明：CD8α信号肽+FMC63 scFV+CD8α铰链区(aa133-180)+CD28铰链区和跨膜区(aa113-180)+4-1BB胞浆区(aa214-255)+CD3ζ胞浆区(aa52-164)。

图2.上图为CD19 CAR基因通过T2A序列串联截短型EGFRt基因的示意图；经慢病毒感染T细胞，制备成携带安全开关EGFRt的CD19 CART细胞(下图)，在临床治疗时，如患者不良反应较严重，可以使用爱必妥抗体(靶向EGFR分子)输注，抗体识别细胞膜表面EGFRt(保留了爱必妥抗体识别表位)，进而通过ADCC作用杀死CART细胞，保证CART治疗的安全性。

上图：CD19 CAR加安全开关EGFRt的基因表达设计示意图。

下图：CD19 CAR分子和安全开关EGFRt在细胞膜上的结构示意图。

图3为CD19 CAR加安全开关EGFRt的慢病毒载体构建流程图。

图4为CD19 CAR基因PCR产物的电泳图。左图分子量标准为：100、200、300、400、500、600、700bp；右图分子量标准为：1000、2000、3000、4000、5000、6000、8000、10000bp。

图5为CD19 CAR加T2A EGFRt基因进行重叠PCR过程的PCR产物电泳图。分子量标准为：1000、2000、3000、4000、5000、6000、8000、10000bp。

图6为CD19 CAR T2A EGFRt连接入载体后，菌液PCR电泳图。可见有3个阳性克隆。

图7为CART细胞表面CAR分子和EGFRt分子表达的流式检测结果。携带CD19 CART2A EGFRt基因的慢病毒载体感染T细胞后，制备CART细胞，利用流式细胞仪检测细胞膜表面CAR分子和EGFRt分子的表达。左图为阴性对照结果，中间为使用FITC标记山羊抗小鼠Fab段抗体检测CAR分子表达的结果，右图为使用爱必妥抗体和山羊抗人FITC荧光标记二抗检测EGFRt的结果。

图8为体外细胞杀伤实验观察CART效果。靶细胞为K562-CD19细胞(转染稳定表达CD19)和对照(不表达CD19的K562亲代细胞)，效应细胞为CD19 CAR T2A EGFRt CART细胞。在不同效靶比的情况下，CD19 CAR T2A EGFRt CART细胞特异性杀伤表达CD19的K562细胞，对不表达CD19的亲代K562细胞几乎没有杀伤。

图9为体外细胞杀伤实验观察ADCC效应。图中靶细胞为EGFRt安全开关标记的CART细胞，效应细胞为同一个志愿者的PBMCs，在不同效靶比的情况下，加入识别EGFRt的爱必妥抗体可以诱导ADCC杀伤作用。

图10为CD19 CART有效清除小鼠体内淋巴瘤细胞。小鼠尾静脉注射淋巴瘤细胞系Nalm-6(Luciferase标记)细胞，6天后，尾静脉注射相应对照T细胞和CD19 CAR T2A EGFRtCART细胞，8天后小鼠体内成像结果。左图，注射对照T细胞后，Nalm-6持续增殖导致信号较强；右图，注射CD19 CAR T2A EGFRt CART细胞，基本清除了小鼠体内的淋巴瘤细胞。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该理解，下述实施例仅是为了用于说明本发明，并不对发明内容进行限定。

实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。

实施例1.Pre-Lenti-EF1-CD19 CAR T2A EGFRt载体构建

1.1合成ScFV基因(SEQ ID NO 1)和2代CAR结构基因(SEQ ID NO 2)，两条基因通过重叠PCR进行拼接，得到CD19 CAR基因(SEQ ID NO 3)。

CD19 CAR基因(SEQ ID NO 3)：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCACCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCCCACGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO3)

1.2合成T2A+EGFRt基因(SEQ ID NO 4)，将SEQ ID NO 4和测序正确的SEQ ID NO3基因进行重叠PCR，得到CD19 CAR T2A EGFRt基因(SEQ ID NO 5)。

CD19 CAR T2A EGFRt基因(SEQ ID NO 5)

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCACCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCCCACGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGTGA(SEQ ID NO 5)

1.3引物设计：

使用序列分析软件pDRAW32分析SEQ ID NO 5，酶切位点EcoRI、NotI适合用于基因克隆，能够和Pre-Lenti-EF1-MCS载体的多克隆位点匹配，设计两端引物如下：

EcoRI-上游序列如SEQ ID NO 6所示，

CGGAATTC GCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC(SEQ ID NO 6)

NotI-下游序列如SEQ ID NO 7所示，

TTGCGGCCGCTCACATGAAGAGGCCGATCCCC(SEQ ID NO 7)

用于重叠PCR的引物为：

ScFV基因和CD19 CAR基因重叠：

SEQ ID NO 6：CGGAATTCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC

CAR-R：GTCGTGGTGGGCTTCGCTGGTGAGGAGACGGTGACTGAGG(SEQ ID NO 12)

CAR-F：CCTCAGTCACCGTCTCCTCACCAGCGAAGCCCACCACGAC(SEQ ID NO 13)

CAR-下游：CGGGATCC TTAGCGAGGGGGCAGGGCCTG(SEQ ID NO 14)

CD19 CAR和T2A EGFRt重叠：

SEQ ID NO 6：CGGAATTCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC

EGFRt-R：GAAGACTTCCTCTGCCCTCGCGAGGGGGCAGGGCCTGC(SEQ ID NO 15)

EGFRt-F：GCAGGCCCTGCCCCCTCGCGAGGGCAGAGGAAGTCTTC(SEQ ID NO 16)

SEQ ID NO 7：TTGCGGCCGCTCACATGAAGAGGCCGATCCCC

1.4PCR扩增：

1.4.1基因片段和引物合成后，进行PCR，体系见下(Toyobo KOD Fx酶)，

2×PCR缓冲液，用于KOD Fx	25μL
		2mM dNTP	10μL
10mM引物1	1.5μL
		10mM引物2	1.5μL
ScFV基因或2代CAR结构基因	1μL(50ng/μl)
		KOD FX	1μL
H₂O	10μL
		总体积	50μL

PCR程序为

取10μL PCR产物电泳见图4。对剩余PCR产物进行凝胶电泳，回收胶(Biomiga，货号：DC-3511-01)，定量PCR片段浓度后，进行重叠PCR，体系见下：

2×PCR缓冲液，用于KOD Fx	25μL
		2mM dNTP	10μL
10mM EcoRI-上游	1.5μL
		10mM CAR-下游	1.5μL
ScFV基因和2代CAR结构基因PCR片段	等摩尔比混合(100ng)
		KOD FX	1μL
H₂O	8-10μL
		总体积	50μL

PCR程序为

步骤1：94℃	2分钟
		步骤2：98℃	10秒
步骤3：50℃	30秒
		步骤4：68℃	2分钟，至步骤2，5个循环
步骤5：98℃	10秒
		步骤6：60℃	30秒
步骤7：68℃	2分钟，至步骤5，30个循环
		步骤8：68℃	10分钟
步骤9：4℃	1小时

10μL PCR产物电泳见图4。剩余PCR产物凝胶电泳，回收胶，测序正确后，得到CD19CAR基因。

1.4.2以CD19 CAR基因和T2A+EGFRt基因(SEQ ID NO 4)为模板，进行重叠PCR。首先分别进行两段基因的PCR，反应体系如下，

2×PCR缓冲液，用于KOD Fx	25μL
		2mM dNTP	10μL
10mM引物1	1.5μL
		10mM引物2	1.5μL
CD19 CAR基因或T2A+EGFRt基因	1μL(50ng/μl)
		KOD FX	1μL
H₂O	10μL
		总体积	50μL

PCR程序为

10μL PCR产物电泳见图5。对剩余40μL PCR产物进行凝胶电泳，胶回收(Biomiga，货号：DC-3511-01)，定量PCR片段浓度后，进行重叠PCR，体系见下：

PCR程序为

步骤1：94℃	2分钟
		步骤2：98℃	10秒
步骤3：50℃	30秒
		步骤4：68℃	3.5分钟，至步骤2，5个循环
步骤5：98℃	10秒
		步骤6：60℃	30秒
步骤7：68℃	3.5分钟，至步骤5，30个循环
		步骤8：68℃	10分钟
步骤9：4℃	1小时

10μL PCR产物电泳见图5。

1.5酶切：

酶切反应体系如下，

37℃水浴，酶切2个小时。

1.6回收酶切后产物：Biomiga胶回收试剂盒(货号：DC-3511-01)。

1.7连接反应：

根据载体n摩尔数：片段n摩尔数＝1：3，即

配制连接体系：

Pre-Lenti-EF1-MCS	2.3uL(100ng)
		CD19 CAR T2A EGFRt	1.2uL
H₂O	1.5uL
		溶液I(Takara)	5uL
	10uL

上述内容各组分加至1.5mL离心管中，充分混匀；22℃水浴30分钟；

1.8转化，涂氨苄平板：50μL感受态中，加入上述连接产物，轻弹，静置30分钟；42℃水浴90秒；冰上放置5分钟；加500μL无抗生素LB，37℃活化1小时；4000rpm离心5分钟，弃上清，加入50μL无抗生素LB，加样枪重悬，涂氨苄抗性平板；37℃温箱过夜。

1.9挑克隆，摇菌：连接反应时设置一阴性对照，第二日观察可见加入CD19 CART2A EGFRt片段的平板内克隆数明显比未加片段的阴性对照克隆数多，因此判断，连接成功。随机挑取6个克隆，摇菌扩增。

1.10菌液PCR取1μl菌液，使用EcoRI-上游、NotI-下游引物进行PCR，结果见图6，有3个克隆含有阳性片段，相应菌液提取质粒。

1.11质粒提取：Biomiga无内毒素质粒提取试剂盒(货号：PD1220-02)。

1.12测序：选取3个质粒中，浓度较高质粒测序，引物为：

Pre-上游-Seq，SEQ ID NO 8：GGAGCCTACCTAGACTCAGC

Pre-下游-Seq，SEQ ID NO 9：CAACCAGGATTTATACAAGG

I843-R，SEQ ID NO 10：GACGCGATGGTGGGCGCCGG

EG1-seq-R，SEQ ID NO 11：GACTGCAAGAGAAAACTGAC

测序结果和SEQ ID NO 5比对，完全正确，得到了表达CD19 CAR T2A EGFRt基因的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-CD19 CAR T2A EGFRt(结构见图3)。

实施例2.细胞杀伤实验和安全开关验证

2.1慢病毒包装：

2.1.1 293T细胞(购自ATCC)培养于37℃，5％CO₂孵箱内，培养基为DMEM/10％FBS。

2.1.2包装病毒前一天，胰酶消化细胞，1×10⁷细胞/皿种植10cm培养皿(NEST)。

2.1.3转染细胞时，除了Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19 CAR T2A EGFRt质粒外，每种质粒需和包装质粒psPAX2、pMD2.0G共转染。其中Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19 CAR T2A EGFRt使用5μg，psPAX2质粒使用3.75μg，pMD2.0G质粒使用1.25μg。转染时，将以上三种质粒的混合物加入500μl MEM培养基内，在另一个微型离心管内将25μl Lipofectamine 2000试剂加入500μl MEM培养基内，然后，将稀释的转染试剂逐滴加入稀释的质粒上方，混匀，离心，室温静置20分钟，最后将质粒和转染试剂形成的混合物加入10cm培养皿内，轻晃10次、混匀，放入孵箱。

2.1.4细胞转染3天后，收获病毒，将10ml含病毒培养上清转入50ml离心管内，4℃，1250rpm，5分钟，去除死亡的293T细胞，然后，将含病毒上清过滤，浓缩，分装，-80℃冻存，留存部分病毒测定滴度。

2.2 PBMC(外周血单个核细胞)分离

2.2.1抽血：在无菌环境，抽取志愿者静脉血10ml。

2.2.2稀释：将获得的血液用相同体积的1640培养基10ml稀释。

2.2.3在50ml离心管中加入10ml人淋巴细胞分离液(达科为生物工程有限公司)。

2.2.4用电动移液枪将血液贴壁缓慢加入离心管中。

2.2.5放入离心机中，700g，22℃离心25分钟。

2.2.6离心结束后，PBMC在上层血浆层和分离液之间的白膜层中。

2.2.7用巴氏吸管尽量将白膜层吸到另一支离心管中(加入30ml 1640培养基)，注意不要吸到分离液。

2.2.8 250g，22℃，10分钟。

2.2.9弃掉上层液体，用3ml 1640培养基重悬，计数。

2.3 T细胞纯化

2.3.1 PBMC计数，取1×10⁷个细胞于微型离心管中。

2.3.2 250g，22℃，10分钟。

2.3.3弃掉上层液体，80μL磁珠分离缓冲液重悬细胞沉淀，加入20μl的CD3MicroBeads(美天旎)。

2.3.4 4℃冰箱中放置1小时，保证充分结合。

2.3.5 1小时后，在微型离心管中加入1mL的磁珠分离缓冲液，250g，4℃离心10分钟。期间准备过滤柱子，将过滤柱安放在磁铁上，用500μl的缓冲液润洗(缓冲液随着重力留下)。

2.3.6离心后细胞弃上清，500μl的缓冲液重悬，加入柱子，缓冲液随着重力向下，细胞悬液流出后，柱子用500μl的缓冲液洗四次。

2.3.7将柱子从磁铁上卸掉，用1mL缓冲液将T细胞冲出，至1.5ml微型离心管。

2.3.8 250g，4℃离心10分钟。

2.3.9含IL2的X-vivo 15培养基(Lonza)重悬，计数。

2.4T细胞慢病毒感染

2.4.1纯化T细胞计数，2×10⁶个T细胞/孔(6孔板)种植，培养过夜后，加入MOI为2的Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19 CAR T2A EGFRt病毒液，感染过夜。

2.4.2感染第二天，补加1ml新鲜培养基。

2.4.3感染第三天，T细胞已充分活化，增殖旺盛，此时将T细胞转入25cm²培养瓶。

2.4.4感染5天后，测定CD19 CAR T2A EGFRt分子在T细胞表面表达的阳性率，使用检测小鼠Fab段的抗体(FITC直标抗体)进行检测，和使用识别EGFRt的爱必妥抗体(间接标记，使用山羊抗人Fc段的FITC间标抗体识别爱必妥一抗)进行检测。结果见图7。

2.5感染6天后，杀伤实验

计数对照K562细胞(K562-control)，表达CD19分子的K562细胞(K562-CD19，通过慢病毒感染的方法建立的稳定细胞系)，1×10⁴个细胞/孔(96孔板)；计数病毒感染的CD19CART细胞，按照效靶比5:1、2.5:1、1.25:1的比例加入K562-对照或K562-CD19细胞上层，实验设计见表1。

表1.杀伤实验设计表(靶细胞：K562-对照或K562-CD19)

2.6杀伤测量

通过测量死亡细胞释放入细胞培养上清的LDH，来检测CART细胞杀死靶细胞的效果。

2.6.1按照Promega试剂盒说明书(CytoTox 96非放射性细胞毒性检测，货号：G1780)。

2.6.2步骤2.5中杀伤实验孵育过夜，约17小时后，最大释放孔加入10×细胞裂解液。

2.6.3 1小时后，每孔取50μl上清，再加入50μl LDH酶底物，室温静置20分钟后，酶标仪测量492nm处吸光度OD492。

2.6.4杀伤率计算，计算公式为

实验孔为不同效靶比杀伤测量的OD492，效应细胞自发为CD19 CART细胞单独的OD492，靶细胞自发为K562-对照或K562-CD19最小释放，靶细胞最大为K562-对照或K562-CD19最大释放。计算得到的杀伤率见图8，表明Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19 T2A EGFRt CART杀伤功能较好，因对不表达CD19的K562-对照细胞没有杀伤，表明CART细胞的特异性较好。本发明为了降低CART细胞杀伤靶细胞的强度，设计了较长的铰链区，将本杀伤实验结果和文献报道的诺华公司的CART结果相比，在使用同样K562-CD19靶细胞的条件下，在效靶比5:1时，诺华公司的杀伤率约为32％，本发明图8实验结果可见，本发明的CART细胞杀伤K562-CD19靶细胞的杀伤率为27.6％，初步表明实现了设计目的，适当降低了CART杀伤靶细胞的反应性。在保证肿瘤杀伤效果的同时，可大大降低临床应用的严重不良反应性。

2.7安全开关验证

携带安全开关EGFRt的CD19 CART细胞，当加入识别EGFRt的抗体爱必妥时，抗体结合EGFRt，抗体另一端Fc段结合巨噬细胞或NK细胞的Fc段受体，介导ADCC(抗体依赖的细胞毒)作用。为验证是否本发明使用的EGFRt具有诱导ADCC的效应，分离同一志愿者的PBMC，和带有EGFRt的CD19 CART细胞孵育，同时加入爱必妥抗体，17小时后，测量LDH杀伤，观察ADCC效应。

2.7.1 PBMC分离，同2.2，得到新鲜的PBMC后，加入1000单位/ml的IL-2，培养于6孔板内，活化PBMC。

2.7.2 PBMC杀伤CART取活化过夜的PBMC和装载EGFRt的CART细胞计数，按照效靶比为10:1、5:1、2.5:1分别加入96孔板，同时加入爱必妥抗体10ug/ml，实验设计见表2。CO₂孵箱孵育17小时后，最大释放孔加入裂解液，1小时后测量杀伤效率。

表2.ADCC实验设计表(靶细胞：表达EGFRt的CART细胞)

2.7.3杀伤测量和计算，同2.6。杀伤率见图9，表明PBMC能够在爱必妥抗体存在的情况下杀死装载EGFRt的CART细胞。

实施例3.动物实验

3.1小鼠品系：为NSG免疫缺陷小鼠品系(缺乏T细胞、B细胞和NK细胞功能)。

3.2肿瘤接种：采用Luciferase过表达的Nalm-6-luc淋巴瘤细胞系，1×10⁶细胞/200ul PBS尾静脉注射(6只小鼠)。

3.3 CART注射：Nalm-6-luc肿瘤细胞接种6天后，尾静脉注射对照或CD19 T2AEGFRt CART细胞(1×10⁷细胞/200ul PBS，一组3只小鼠)。

3.4 8天后，麻醉小鼠，腹腔注射Luciferase底物，使用小动物体内成像系统观察对照组小鼠和CD19 CART治疗组的肿瘤负荷情况，可见CD19 CART治疗组几乎无肿瘤细胞成像，而对照组小鼠肿瘤负荷严重，表明CD19 CART能够有效清除CD19阳性的肿瘤细胞，见图10。

至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。

序列表

<110> 北京普瑞金科技有限公司

普瑞金（深圳）生物技术有限公司

<120> 一种CD19 CART及其应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctca 789

<210> 2

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 60

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 120

acgagggggc tggacttcgc cccacgcaaa attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 180

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 240

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 300

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gaaacggggc 360

agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 420

gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 480

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 540

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 600

gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 660

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 720

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 780

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 816

<210> 3

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcac cagcgaagcc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc ccacgcaaaa ttgaagttat gtatcctcct 960

ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 1020

tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 1080

ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 1140

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1200

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1260

gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440

ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500

ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560

aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1605

<210> 4

<211> 1128

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccctatgctt 60

ctcctggtga caagccttct gctctgtgag ttaccacacc cagcattcct cctgatccca 120

cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 180

acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 240

gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 300

attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 360

aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 420

ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 480

aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 540

acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 600

agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 660

ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 720

gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 780

gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 840

cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 900

acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 960

ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt 1020

gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg ccactgggat ggtgggggcc 1080

ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct tcatgtga 1128

<210> 5

<211> 2733

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcac cagcgaagcc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc ccacgcaaaa ttgaagttat gtatcctcct 960

ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 1020

tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 1080

ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 1140

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1200

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1260

gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440

ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500

ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560

aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgcgaggg cagaggaagt 1620

cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat cccggcccta tgcttctcct ggtgacaagc 1680

cttctgctct gtgagttacc acacccagca ttcctcctga tcccacgcaa agtgtgtaac 1740

ggaataggta ttggtgaatt taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac 1800

ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt 1860

gactccttca cacatactcc tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta 1920

aaggaaatca cagggttttt gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac ggacctccat 1980

gcctttgaga acctagaaat catacgcggc aggaccaagc aacatggtca gttttctctt 2040

gcagtcgtca gcctgaacat aacatccttg ggattacgct ccctcaagga gataagtgat 2100

ggagatgtga taatttcagg aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat aaactggaaa 2160

aaactgtttg ggacctccgg tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg tgaaaacagc 2220

tgcaaggcca caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg 2280

gagcccaggg actgcgtctc ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag 2340

tgcaaccttc tggagggtga gccaagggag tttgtggaga actctgagtg catacagtgc 2400

cacccagagt gcctgcctca ggccatgaac atcacctgca caggacgggg accagacaac 2460

tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc ccccactgcg tcaagacctg cccggcagga 2520

gtcatgggag aaaacaacac cctggtctgg aagtacgcag acgccggcca tgtgtgccac 2580

ctgtgccatc caaactgcac ctacggatgc actgggccag gtcttgaagg ctgtccaacg 2640

aatgggccta agatcccgtc catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg 2700

gtggtggccc tggggatcgg cctcttcatg tga 2733

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 6

cggaattcgc caccatggcc ttaccagtga ccgc 34

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 7

ttgcggccgc tcacatgaag aggccgatcc cc 32

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 8

ggagcctacc tagactcagc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 9

caaccaggat ttatacaagg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 10

gacgcgatgg tgggcgccgg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 11

gactgcaaga gaaaactgac 20

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 12

gtcgtggtgg gcttcgctgg tgaggagacg gtgactgagg 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 13

cctcagtcac cgtctcctca ccagcgaagc ccaccacgac 40

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 14

cgggatcctt agcgaggggg cagggcctg 29

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 15

gaagacttcc tctgccctcg cgagggggca gggcctgc 38

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 16

gcaggccctg ccccctcgcg agggcagagg aagtcttc 38

Claims

1.一种CD19 CAR T2A EGFRt基因，其具有SEQ ID NO 5的序列。

2.一种CD19 CAR T2A EGFRt病毒载体，其携带CD19 CAR T2A EGFRt基因，所述CD19CAR T2A EGFRt基因具有SEQ ID NO 5的序列。

3.如权利要求2所述的CD19 CAR T2A EGFRt病毒载体，其中，所述病毒是慢病毒。

4.如权利要求2所述的CD19 CAR T2A EGFRt病毒载体，其为Pre-Lenti-EF1-CD19 CART2A EGFRt病毒载体。

5.一种CART细胞，其为CD19 CAR T2A EGFRt基因修饰的T细胞，所述CD19 CAR T2AEGFRt基因具有SEQ ID NO 5的序列。

6.如权利要求5所述的CART细胞，其为CD19 CART细胞。

7.如权利要求1所述的CD19 CAR T2A EGFRt基因在制备CART细胞中的用途。

8.如权利要求2-4中任一项所述的病毒载体在制备CART细胞中的用途。

9.如权利要求5或6所述的CART细胞在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述肿瘤是表达CD19的肿瘤，优选地，是白血病和淋巴瘤。