CN110526983A - 改良型抗cd19 car-t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种嵌合抗原受体。该嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体和铰链区，所述单链抗体包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原人CD19，所述铰链区包括含55个氨基酸残基的人CD8α分子胞外段和3个附加氨基酸残基AAA，所述AAA位于所述人CD8α分子胞外段的N端；跨膜区，所述跨膜区包括人CD8α分子跨膜段，所述人CD8α分子跨膜段与所述胞外区的铰链区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区包括含7个氨基酸残基的人CD8α分子胞内段和4‑1BB分子胞内段以及CD3ζ链胞内段，所述胞内区与所述跨膜区的人CD8α分子跨膜段相连。

Description

改良型抗CD19 CAR-T细胞
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及抗CD19嵌合抗原受体、T淋巴细胞、慢病毒、转基因淋巴细胞、构建体、用于治疗癌症的治疗组合物和提高淋巴细胞治疗安全性的方法。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)-T细胞治疗是一类可有效治疗恶性肿瘤，特别是血液肿瘤的免疫治疗产品。嵌合抗原受体(CAR)是融合蛋白，它包括一个单链抗体和细胞内T细胞信号转导区，T细胞信号转导区与铰链区和跨膜区相连。CAR的铰链区和跨膜区可能对于T细胞表达CAR的功能至关重要。最近临床实验表明，抗CD19 CAR T细胞已经在治疗晚期B细胞恶性肿瘤，让许多病人达到完全缓解。尽管众多临床试验显示抗CD19 CAR-T细胞有很強治疗急性白血病及淋巴瘤的疗效，但该治疗有严重副作用，包括严重的细胞因子释放综合征(CRS)及脑神经毒性，可危及病人生命。
FDA批准了两种自体抗CD19 CAR-T细胞治疗产品，CTL019(Kymriah)和KTE-C19(Yescarta)，用于治疗复发性或难治性白血病或淋巴瘤。2017年8月，诺华(Novartis)的抗CD19 CAR-T疗法Kymriah(也称CTL019)获批，用于治疗急性淋巴性白血病(ALL)。史上获得批准的首款CAR-T疗法。美国血液学会(ASH)年会摘要(2017年12月)，诺华公布CTL019治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)全球关键2期临床试验(Juliet试验)数据，研究人员评估了CTL019在复发或难治性DLBCL患者中的疗效，99名接受了单剂量的CTL019输注患者，最佳总体缓解率(ORR)为53.1％，完全缓解率(CR)为39.5％，但是，有86％的患者出现了3级或4级副作用，有58％的患者出现了细胞因子释放综合征。
研究人员发现，抗CD19 CAR T细胞治疗虽然疗效好，但常引起严重的毒性反应，包括严重的细胞因子释放综合征和神经毒性，患者体内快速增殖CD19 CAR T细胞分泌过高的炎症细胞因子是引起严重细胞因子释放综合征和神经毒性主要原因。因此，提高抗CD19CAR T细胞治疗的安全性、减少副作用是未来能否广泛、常规应用抗CD19 CAR-T细胞治疗白血病及淋巴瘤的关键。
发明内容
本申请是发明人对以下问题和事实的发现而做出的：
诺华CTL019(Kymriah)是抗CD19-BBz CAR融合蛋白，其由细胞外抗CD19 FMC63单链抗体(scFv)，通过CD8α铰链和跨膜结构域，连接胞内共刺激因子4-1BB区域和T受体CD3z信号传导结构域组成(Imai，C.et al.Leukemia.2004；18：676-684；Milone MC，et al.MolTher.2009；17：1453-64)。但CTL019(Kymriah)存在严重的副反应，这与患者体内快速增殖CD19 CAR T细胞分泌过高的炎症细胞因子从而引起严重的细胞因子释放综合征和神经毒性有关。
而发明人发现，铰链区、跨膜区和胞内区氨基酸序列将影响CAR蛋白分子空间构型，双聚体和多聚体形成，进而影响与下游信号传导分子的结合，从而影响淋巴细胞激活程度和细胞因子产生水平。
基于上述问题和事实的发现，发明人对现有CD19-BBz CAR融合蛋白的铰链区、跨膜区和胞内区进行了改进，改进后获得的新的CD19-BBz CAR融合蛋白的空间构型、双聚体影响与下游信号传导分子的结合。发明人经过实验惊喜地发现，表达改进后的新的CD19-BBz CAR融合蛋白的淋巴细胞，其细胞增殖和细胞因子的产生减少到更安全但仍具有强的肿瘤杀伤能力的水平。
本申请旨在至少在一定程度上解决现有的技术问题之一：
在本发明的第一方面，本发明提出了一种嵌合抗原受体。根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体和铰链区，所述单链抗体包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原人CD19，所述铰链区包括含人CD8α分子胞外段和3个附加氨基酸残基AAA，所述AAA位于所述人CD8α分子胞外段的N端，所述人CD8α分子胞外段具有55个氨基酸残基；跨膜区，所述跨膜区包括人CD8α分子跨膜段，所述人CD8α分子跨膜段与所述胞外区的铰链区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区包括人CD8α分子胞内段和4-1BB分子胞内段以及CD3ζ链胞内段，所述人CD8α分子胞内段具有7个氨基酸残基，所述人CD8α分子胞内段与所述人CD8α分子跨膜段相连。相比于现有技术，根据本发明实施例的嵌合抗原受体的空间构型不同，表达该嵌合抗原受体的淋巴细胞具有强有力的肿瘤杀伤活性，同时细胞增殖更加温和，细胞因子分泌更少，细胞因子释放综合征和神经毒性副作用更少。
根据本发明的实施例，上述T淋巴细胞还可以进一步具有如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述人CD8α分子胞外段具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:1)。
根据本发明的实施例，所述人CD8α分子跨膜段具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:2)。
根据本发明的实施例，所述人CD8α分子胞内段具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
LYCNHRN(SEQ ID NO:3)。
根据本发明的实施例，所述胞外区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:4)。
根据本发明的实施例，所述跨膜区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:5)。
根据本发明的实施例，所述胞内区具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
LYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:6)
根据本发明的实施例，所述铰链区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:7)。
根据本发明实施例的上述抗CD19嵌合抗原受体的胞外区、跨膜区以及胞内区在上述序列下，表达该嵌合抗原受体的T淋巴细胞的增殖更加温和，释放的细胞因子减少到更安全的水平，T淋巴细胞的抗肿瘤活性更加安全。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种T淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述T淋巴细胞表达无功能EGFR；以及表达抗CD19嵌合抗原受体，其中，所述抗CD19嵌合抗原受体如前面所限定的。无功能EGFR缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明实施例的T淋巴细胞具有对高表达CD19的肿瘤细胞的定向杀伤作用，细胞增殖温和，释放的细胞因子减少到更安全的水平，具有安全的肿瘤杀伤特性。根据本发明实施例的上述T淋巴细胞，相对于现有技术，可以被称为改良型抗CD19 CAR-T细胞，具有更安全的抗肿瘤活性。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带下列核酸分子：编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；以及编码无功能EGFR的核酸分子，所述无功能EGFR具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述编码无功能EGFR的核酸分子具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：8)。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO:9)。
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRR(SEQ ID NO:10)。
ATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAA(SEQ ID NO:11)。
根据本发明的实施例，将本发明实施例的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其具有对肿瘤细胞的特异性杀伤能力尤其具有对高表达CD19的肿瘤细胞的定向杀伤作用，细胞增殖温和，释放的细胞因子减少到更安全的水平，具有缓慢而持久的肿瘤杀伤特性。获得改良型抗CD19 CAR细胞具有更安全的抗肿瘤活性。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带含有SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATCCTACTGCGTCGACTTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGCGtccggaTCTAGAATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAA(SEQ ID NO:12)。
根据本发明的实施例，将本发明实施例的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其具有对肿瘤细胞的特异性杀伤能力尤其具有对高表达CD19的肿瘤细胞的定向杀伤作用，细胞增殖温和，释放的细胞因子数量减少到更安全的水平，获得的改良型抗CD19 CAR细胞具有更安全的抗肿瘤活性。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述淋巴细胞表达无功能EGFR；以及表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括的单链抗体和铰链区，所述胞外区包括单链抗体包括的重链可变区和轻链可变区，所述抗体能够与肿瘤抗原特异性结合；跨膜区；以及胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段，其中，所述抗体为单链抗体，所述肿瘤抗原为CD19。根据本发明实施例的改良型抗CD19 CAR细胞，表达无功能EGFR和表达嵌合抗原受体的淋巴细胞具有对肿瘤细胞的特异性杀伤能力，尤其具有对高表达CD19的肿瘤细胞的定向杀伤作用，具有更安全的抗肿瘤活性。
根据本发明的实施例，上述转基因淋巴细胞还可以具有下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。本发明实施例的免疫共刺激分子胞内段的表达具有正向调控和增强细胞免疫应答的作用，使得本发明实施例的转基因淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤作用效果进一步提高；本发明实施例的免疫共刺激分子胞内段的表达以及无功能EGFR的表达的联合，使得本发明实施例的转基因淋巴细胞增殖对肿瘤的具有更加显著的定向杀伤作用，且更加安全。
根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段是4-1BB的胞内段。本发明中的转基因淋巴细胞的嵌合抗原受体的免疫共刺激分子胞内段是4-1BB的胞内段。根据本发明的实施例，免疫共刺激分子胞内段是4-1BB的胞内段，进一步增强了本发明实施例的转基因淋巴细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例，本发明实施例的转基因淋巴细胞表达的无功能EGFR缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR的跨膜区和完整的与抗EGFR结合的结构域，无功能EGFR可作为本发明实施例的转基因淋巴细胞的自杀标记。无功能EGFR的表达，联合嵌合抗原受体的表达可在有效保证转基因淋巴细胞的靶向杀伤作用的前提下，如果病人出现严重不良反应，转基因淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而可进一步提高本发明实施例的转基因淋巴细胞治疗高表达CD19的肿瘤病人的安全性。
根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是CD8+T淋巴细胞。本发明实施例的上述淋巴细胞表达无功能EGFR，同时表达抗原特异性的嵌合抗原受体，如本发明的实施例的CD19抗原特异性的嵌合抗原受体，上述淋巴细胞具有对肿瘤的定向杀伤作用，且安全性更高。
根据本发明的实施例，所述铰链区包括人CD8分子胞外段和3个附加氨基酸残基AAA，所述AAA位于所述人CD8α分子胞外段的N端，所述人CD8α分子胞外段具有55个氨基酸残基；所述跨膜区包括人CD8α分子跨膜段，所述人CD8α分子跨膜段与所述胞外区的铰链区相连；所述胞内区进一步包括含人CD8α分子胞内段和4-1BB分子胞内段以及CD3ζ链胞内段，所述人CD8α分子胞内段具有7个氨基酸残基，所述人CD8α分子胞内段与所述人CD8α分子跨膜段相连。根据本发明实施例的淋巴细胞具有强有力的肿瘤杀伤活性，同时细胞增殖更加温和，细胞因子分泌更少，细胞因子释放综合征和神经毒性副作用更少。
根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是细胞毒性T细胞或NK细胞或NKT细胞。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码无功能EGFR。其中，所述嵌合抗原受体、所述无功能EGFR如前所述。根据本发明的实施例，本发明实施例的构建体成功导入本发明实施例的淋巴细胞后，其具有对肿瘤细胞的特异性杀伤能力尤其具有对高表达CD19的肿瘤细胞的定向杀伤作用，细胞增殖温和，释放的细胞因子数量降低到更加安全的水平，具有缓慢而持久的肿瘤杀伤特性。获得的改良型抗CD19 CAR细胞具有更安全的抗肿瘤活性。
根据本发明的实施例，上述构建体还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，其特征在于，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置在前面所述的淋巴细胞中表达所述嵌合抗原受体和表达无功能EGFR，并且所述嵌合抗原受体与所述无功能EGFR呈非融合形式。根据本发明的实施例，成功设置了上述第一核酸分子以及第二核酸分子的淋巴细胞，其淋巴细胞表面成功表达无功能EGFR，同时在淋巴细胞表面成功表达了抗原特异性嵌合抗原受体，如本发明实施例的CD19特异性的嵌合抗原受体，且嵌合抗原受体与无功能EGFR在淋巴细胞膜上呈非融合形式，本发明实施例的淋巴细胞具有特异性强的肿瘤杀伤效果，安全性更高。
根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。根据本发明的实施例，第一启动子以及第二启动子的引入，使得第一核酸分子以及第二核酸分子分别独立的表达，有效保证了嵌合抗原受体抗原靶向性的生物学作用及以有效表达了无功能EGFR，从而有效保证了本发明实施例的淋巴细胞的对肿瘤的靶向杀伤作用，尤其是对高表达CD19的肿瘤细胞的定向杀伤，且保证了免疫杀伤的安全性。
根据本发明的实施例，所述第一启动子、所述第二启动子分别独立地选自CMV，EF-1，LTR，RSV启动子。根据本发明的实施例，本发明实施例的上述启动子具有启动效率高、特异性强的特点，从而保证了无功能EGFR的高效表达和嵌合抗原受体的高效表达，从而高效保证了本发明实施例的淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤效果和杀伤安全性。
根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括：内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第三核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。
CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACC(SEQ ID NO：13)。
内部核糖体进入位点序列的引入使得第一核酸分子和第二核酸分子分别独立的表达。根据本发明的实施例，内部核糖体进入位点序列的引入保证了嵌合抗原受体抗原靶向性的生物学作用和无功能EGFR的高效表达，进而使得本发明实施例的淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤效果更加显著，淋巴细胞对肿瘤杀伤的安全性更高。
根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括：第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码连接肽，所述连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割。编码连接肽的第三核酸分子的引入使得无功能EGFR和嵌合抗原受体成非融合状态的形式表达在淋巴细胞膜上，进而进一步保证了无功能EGFR和嵌合抗原受体的生物学作用，本发明实施例的淋巴细胞具有特异性更强的肿瘤杀伤效果，安全性更高。
根据本发明的实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO：14～17所示的氨基酸序列。
(GSG)E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO：14)。
(GSG)A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO:15)。
(GSG)Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:16)。
(GSG)V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:17)
SEQ ID NO：14-17-所示的氨基酸序列是来自口蹄疫病毒F2A(foot-and-mouthdisease virus),马鼻炎A病毒E2A(equine rhinitis A virus)，猪teschovirus病毒P2A(porcine teschovirus)，thosea asigna病毒T2A(thosea asigna virus)的自剪切(self-cleaving)2A肽段。连接肽的引入使得无功能EGFR和嵌合抗原受体成非融合状态表达在淋巴细胞膜上。根据本发明的实施例，连接肽的引入保证了无功能EGFR和嵌合抗原受体的生物学作用，本发明实施例的淋巴细胞具特异性更强的肿瘤杀伤效果，安全性更高。
根据本发明的实施例，所述构建体的载体是非致病性病毒载体。非致病性病毒载体的引入大大提高了构建体在淋巴细胞中的复制和扩增效率，从而大大提高了无功能EGFR的表达和嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达，使得淋巴细胞的靶向作用进一步增强，安全性进一步提高。
根据本发明的实施例，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。本发明实施例的病毒的载体在病毒包装和感染过程中，病毒感染范围广泛，既可感染终末分化细胞，又可感染处于分裂期的细胞，其基因组既可整合到宿主染色体，又可游离在宿主染色体之外，从而可实现广谱而高效的感染效率，无功能EGFR在淋巴细胞中高效表达和嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达，使得本发明实施例的淋巴细胞的靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞，尤其是高表达CD19的肿瘤细胞的定向杀伤作用更加显著，淋巴细胞的杀伤作用安全性更高。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种制备前面所述的T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述的构建体或者前面所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。所述构建体或慢病毒成功引入上述淋巴细胞或者T淋巴细胞中，实现了淋巴细胞进行无功能EGFR和嵌合抗原受体的表达，从而本发明实施例的制备方法所制备的转基因淋巴细胞或T淋巴细胞具有对肿瘤细胞，尤其具有对高表达CD19的肿瘤细胞的靶向杀伤作用，细胞增殖温和，释放的细胞因子数量减少到更加安全的水平，具有缓慢而持久的肿瘤杀伤特性。获得的改良型抗CD19 CAR-T细胞具有更安全的抗肿瘤活性。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，所述治疗组合物包括：上述抗CD19嵌合抗原受体、构建体、慢病毒、T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞。上述任意一种治疗组合物的组成均可实现转基因淋巴细胞或T淋巴细胞无功能EGFR的表达和嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达，从而使得所得转基因淋巴细胞或T淋巴细胞具有对肿瘤细胞的靶向杀伤作用，本发明实施例的治疗癌症的治疗组合物具有对肿瘤细胞的靶向杀伤作用，尤其是具有对高表达CD19的肿瘤细胞的靶向杀伤作用，具有更加安全的肿瘤杀伤特性。
根据本发明的实施例，上述治疗组合物还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述癌症的肿瘤细胞具有CD19的高表达，本发明实施例的治疗组合物可使淋巴细胞细胞表面表达无功能EGFR和高效表达抗原特异性嵌合抗原受体，如本发明实施例的CD19抗原特异性嵌合抗原受体，所得淋巴细胞或T淋巴细胞具有对高表达CD19的肿瘤细胞的靶向杀伤，且安全性高。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种提高淋巴细胞治疗安全性的方法，其特征在于，所述方法包括：所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体和表达无功能EGFR，所述无功能EGFR、所述淋巴细胞、所述嵌合抗原受体如前所述。无功能EGFR缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明实施例的淋巴细胞在用于治疗治疗高表达CD19的肿瘤细胞时，细胞增殖温和，释放的细胞因子数量降低到更加安全的水平，且如果病人出现严重不良反应，本发明实施例的淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，根据本发明实施例的淋巴细胞具有安全的肿瘤杀伤特性。
附图说明
图1是根据本发明实施例的抗-CD19 CAR慢病毒载体的结构示意图；
图2是根据本发明实施例的导入不同重组慢病毒载体的抗CD19 CAR-T细胞与CD19+肿瘤细胞共培养下的细胞因子的产生结果图；
图3是根据本发明实施例的导入不同重组慢病毒载体的抗CD19 CAR-T细胞杀伤CD19+肿瘤细胞活性的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
如无特殊说明，本申请所述的“抗CD19 CAR”是指抗CD19嵌合抗原受体；本申请所述的“抗CD19 CAR细胞”是指表达抗CD19 CAR的细胞；本申请所述的“抗CD19 CAR-T细胞”是指表达抗-CD19 CAR的T细胞。
嵌合抗原受体
在本发明的一方面，本发明提出了一种嵌合抗原受体。根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体和铰链区，所述单链抗体包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原人CD19，所述铰链区包括含人CD8α分子胞外段和3个附加氨基酸残基AAA，所述AAA位于所述人CD8α分子胞外段的N端，所述人CD8α分子胞外段具有55个氨基酸残基；跨膜区，所述跨膜区包括人CD8α分子跨膜段，所述人CD8α分子跨膜段与所述胞外区的铰链区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区包括人CD8α分子胞内段和4-1BB分子胞内段以及CD3ζ链胞内段，所述人CD8α分子胞内段具有7个氨基酸残基，所述人CD8α分子胞内段与所述跨膜区的人CD8α分子跨膜段相连。相比于现有技术，根据本发明实施例的嵌合抗原受体的空间构型不同，表达该嵌合抗原受体的淋巴细胞具有强有力的肿瘤杀伤作用，但该淋巴细胞增殖更加温和，细胞因子分泌更少，进而利用表达有上述嵌合抗原受体的淋巴细胞对肿瘤患者进行治疗，细胞因子释放综合征和神经毒性副作用更少。
相比于现有的抗CD19 CAR嵌合抗原受体，本申请所述的嵌合抗原受体(参考图1)的铰链区由插入3个外源氨基酸残基的含55个氨基酸残基的人CD8分子胞外片段序列组成，其序列如SEQ ID NO:7所示；本申请所述的嵌合抗原受体(参考图1)的跨膜区由21个氨基酸残基的人CD8α分子跨膜区片段序列组成，其序列如SEQ ID NO:5所示；本申请所述的嵌合抗原受体(参考图1)的胞内区中的人CD8α分子胞内段是由7个氨基酸残基的人CD8α分子胞内区片段组成，具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。本申请的嵌合受体的铰链区、跨膜区以及胞内区的氨基酸序列区别于现有的嵌合抗原受体，因此，本申请的嵌合抗原受体的空间结构区别于现有的抗CD19 CAR嵌合抗原受体，发明人经过实验惊喜地发现，表达本申请的嵌合抗原受体的淋巴细胞具有强有力的肿瘤杀伤活性，同时细胞增殖温和、释放的淋巴细胞因子数量降低，因而肿瘤活性更加温和、安全。
T淋巴细胞或转基因淋巴细胞
在本发明的一方面，本发明提出了一种T淋巴细胞或转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述T淋巴细胞表达无功能EGFR；以及表达抗CD19嵌合抗原受体，其中，所述抗CD19嵌合抗原受体如前面所描述的。无功能EGFR缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明实施例的T淋巴细胞或转基因淋巴细胞表达CD19抗原特异性的嵌合抗原受体，本发明实施例的T淋巴细胞或转基因淋巴细胞具有对特异性肿瘤细胞的杀伤能力，尤其具有对高表达CD19的肿瘤细胞的特异性杀伤，细胞增殖温和，释放的细胞因子数量较低，具有缓慢而持久的肿瘤杀伤特性。该改良型抗CD19 CAR-T细胞具有更安全的抗肿瘤活性。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的无功能EGFR缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR可作为淋巴细胞的自杀标记。表达无功能EGFR的淋巴细胞可被抗EGFR抗体在体内清除。从而，本发明实施例的T淋巴细胞或转基因淋巴细胞表达无功能EGFR，在保证转基因淋巴细胞的靶向杀伤作用的前提下，如果病人出现严重不良反应，转基因淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而可进一步提高本发明实施例的转基因淋巴细胞或T淋巴细胞治疗高表达CD19的肿瘤病人的安全性。
另外，根据本发明的实施例，上述嵌合抗原受体胞外区的抗体为单链抗体。发明人发现，单链抗体可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，同时单链抗体更易渗透肿瘤组织增加药物治疗浓度。本发明实施例的转基因淋巴细胞表达单链抗体的嵌合抗原受体，进一步提高了转基因淋巴细胞对靶向肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的另外一些实施例，上述抗体的结合抗原为CD19。因此本发明实施例的转基因淋巴细胞针对表达抗原CD19的细胞具有定向性杀伤作用，抗原抗体的特异性结合作用更强，进一步提高了本发明实施例的转基因淋巴细胞对CD19抗原表达肿瘤细胞的定向杀伤作用。
另外，根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。免疫共刺激分子胞内段的表达具有正向调控和增强细胞免疫应答的作用，使得转基因淋巴细胞对高表达CD19的肿瘤的定向杀伤作用效果进一步提高，免疫共刺激分子胞内段的表达联合无功能EGFR的表达，使得转基因淋巴细胞的免疫杀伤作用更加安全有效。
根据本发明的实施例，本发明实施例的淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。细胞毒性T细胞也称杀伤性T细胞，自然杀伤细胞是免疫细胞的一种，非特异性识别靶细胞，自然杀伤T细胞是具有T细胞和自然杀伤细胞受体的T细胞亚群。上述淋巴细胞表达无功能EGFR和表达嵌合抗原受体，使得上述淋巴细胞的对肿瘤细胞免疫杀伤作用更加安全有效。
慢病毒或构建体
在本发明的另一方面，本发明提出了一种慢病毒或构建体。根据本发明的实施例，慢病毒或构建体携带下列核酸分子：编码嵌合抗原受体的核酸分子，嵌合抗原受体具有SEQID NO：8所示的氨基酸序列，编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；以及编码无功能EGFR的核酸分子，所述无功能EGFR具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述编码无功能EGFR的核酸分子具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，将本发明实施例的慢病毒或构建体导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞中，其细胞表面表达无功能EGFR，同时在其细胞表面表达抗CD19的嵌合抗原受体，从而本发明实施例的转基因淋巴细胞具有了显著的对肿瘤细胞的定向杀伤能力，同时细胞增殖温和，释放的细胞因子数量较低，具有缓慢而持久的肿瘤杀伤特性。获得的改良型抗CD19 CAR-T细胞具有更安全的抗肿瘤活性。
根据本发明地实施例，本发明实施例的慢病毒或构建体携带含有SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。SEQ ID NO：12表示的是共表达本申请的抗CD19嵌合抗原受体和无功能EGFR的核苷酸序列(CD19 CAR/tEGFR)。根据本发明的实施例，将本发明实施列的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其表达无功能EGFR以及抗CD19的嵌合抗原受体表达，使得转基因淋巴细胞对高表达CD19的肿瘤细胞的定向杀伤作用，细胞增殖温和，释放的细胞因子数量较低，具有缓慢而持久的肿瘤杀伤特性。获得的改良型抗CD19 CAR-T细胞具有更安全的抗肿瘤活性。
根据本发明的实施例，发明人是通过如下方式的至少之一实现上述细胞嵌合抗原受体以及无功能EGFR分别独立地表达的：。
内部核糖体进入位点序列(IRES)，本发明实施例的内部核糖体进入位点序列设置在编码嵌合抗原受体的核酸分子与表达无功能EGFR的核酸分子之间，内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。内部核糖体进入位点通常位于RNA病毒基因组的5’非翻译区(UTR)，这样一个病毒蛋白的翻译就可以不依赖于5’帽子结构，另一个蛋白通常靠5’帽子结构起始翻译，IRES前后的两个基因的表达通常是成比例的。内部核糖体进入位点序列的引入使得编码嵌合抗原受体的核酸分子与编码无功能EGFR的核酸分子分别独立的表达。根据本发明的实施例，本发明实施例采用内部核糖体进入位点序列有效保证了嵌合抗原受体和无功能EGFR的高效表达，使得淋巴细胞对肿瘤的特异性杀伤效果进一步提高，免疫杀伤安全性进一步提高。
第三核酸分子，本发明实施例的第三核酸分子设置在第一核酸分子与第二核酸分子之间，并且第三核酸分子编码连接肽，连接肽能够在淋巴细胞中被切割。根据本发明的实施例，连接肽具有SEQ ID NO：14～17所示的氨基酸序列。第三核酸分子的引入使得无功能性EGFR和嵌合抗原受体成非融合状态表达在淋巴细胞膜上，从而保证了的无功能EGFR和嵌合抗原受体的生物学作用，其具特异性更强的肿瘤杀伤效果，安全性更高。
启动子：本发明实施例的第一启动子与编码嵌合抗原受体的核酸分子可操作地连接；以及第二启动子与表达无功能EGFR的核酸分子可操作地连接。根据本发明的实施例，所采用的第一启动子、第二启动子独立地选自CMV，EF-1，LTR，RSV启动子，第一以及第二启动子的引入，使得编码嵌合抗原受体的核酸分子和表达无功能EGFR的核酸分子分别独立的表达，从而保证了嵌合抗原受体的高效表达，淋巴细胞的靶向作用更强，对肿瘤的特异性杀伤作用进一步提高，免疫杀伤的安全性也进一步提高。
通过上述内部核糖体进入位点序列或第一、第二启动子的引入，使得细胞无功能EGFR高效地表达和嵌合抗原受体高效地表达在本发明实施例的转基因淋巴细胞膜上，从而保证了嵌合抗原受体的生物学作用，有效实现了转基因淋巴细胞的及时清除，从而使得淋巴细胞的靶向杀伤作用更加显著，免疫杀伤的安全性进一步提高。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的构建体的载体是非致病性病毒载体。非致病性病毒载体大大提高了构建体在淋巴细胞中的复制和扩增效率，进而本发明实施例的淋巴细胞靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞的杀伤作用进一步提高，免疫杀伤安全性进一步提高。
根据本发明的实施例，本发明实施例的构建体的载体是病毒载体，病毒载体选自反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺病毒关联病毒载体的至少之一。根据本发明的实施例，本发明实施例的病毒的载体在病毒包装和感染过程中，病毒感染范围广泛，既可感染终末分化细胞，又可感染处于分裂期的细胞，既可整合到宿主染色体，又可游离在宿主染色体之外，实现广谱而高效的感染效率，从而无功能EGFR被高效表达和嵌合抗原受体在淋巴细胞中高效表达，本发明实施例的淋巴细胞的靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著，淋巴细胞的免疫杀伤安全性进一步提高。
根据本发明的具体实施例，以构建一个慢病毒载体为例，发明人为了构建一个慢病毒载体，在某些病毒序列的位置，将目的核酸插入到病毒基因组中，从而产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，发明人进而构建包装细胞系(包含gag，pol和env基因，但不包括LTR和包装成分)。发明人将含有目的基因的重组质粒，连同慢病毒LTR和包装序列，一起引入包装细胞系中。包装序列允许重组质粒RNA转录产物被包装到病毒颗粒中，然后被分泌到培养基中。进而发明人收集包含重组慢病毒的基质，有选择性地浓缩，并用于基因转移。慢载体可以感染多种细胞类型，包括可分裂细胞和不可分裂细胞。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的慢病毒是复合慢病毒，除了常见的慢病毒基因gag，pol和env，还包含有调控和结构功能的其他基因。慢病毒载体为本领域技术人员所熟知的，慢病毒包括：人类免疫缺陷病毒HIV–1，HIV–2和猿猴免疫缺陷病毒SIV。慢病毒载体通过多重衰减艾滋病毒致病基因产生，例如全部删除基因env，vif，vpr，vpu和nef，使慢病毒载体形成生物安全型载体。重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，同时可用于体内和体外基因转移和核酸序列表达。例如：在合适的宿主细胞中，和带有包装功能(gag，pol，env，rev和tat)的两个或更多的载体一起，能够感染非分裂细胞。重组病毒的靶向性，是通过抗体或特定配体(靶向特定细胞类型受体)与膜蛋白的结合来实现的。同时，重组病毒的靶向性通过插入一个有效序列(包括调控区域)到病毒载体中，连同另一个编码了特定靶细胞上的受体的配体的基因，使载体具有了特定的靶向。各种有用的慢病毒载体，以及各种方法和操作等产生的载体，用于改变细胞的表达。
根据本发明的实施例，本发明实施例的腺关联病毒载体(AAV)可使用一种或多种为人熟知的血清类型腺关联病毒载体的DNA构建。本领域技术人员构建一个合适的腺关联病毒载体，以此携带共表达嵌合抗原受体和无功能EGFR的核苷酸分子。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的也包含微基因。微基因意味着用组合(选定的核苷酸序列和可操作的必要的相关连接序列)来指导转化、转录和/或基因产物在体内或体外的宿主细胞中的表达。应用“可操作的连接”序列包含连续目的基因的表达控制序列，和作用于反式或远距离控制目的基因的表达控制序列。
另外，本发明实施例的载体还包括常规控制元素，在和质粒载体一起的细胞转染或/和病毒载体一起的细胞感染中，这些元素允许转录、转化mRNA的表达。大量的表达控制序列(包括天然的，可诱导和/或特定组织的启动子)可能被使用。根据本发明的实施例，启动子为选pol I，pol II and pol III的RAN聚合酶启动子。根据本发明的实施例，启动子为组织特异型启动子。根据本发明的实施例，启动子为诱导型启动子。根据本发明的实施例，启动子为选自基于所选载体的启动子。根据本发明的实施例，当选择慢病毒载体时，启动子为CMV IE基因，EF-1α，泛素C，或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。其他常规表达控制序列包括可选标记或报告基因，包括编码遗传霉素，潮霉素，氨苄青霉素或嘌呤霉素耐药性等的核苷酸序列。载体的其他组件包括复制起点。
构建载体的技术为本领域技术人员所熟知的，这些技术包括常规克隆技术，例如在本发明实施例中所使用聚合酶链反应和任何适当的提供所需的核苷酸序列的方法。
根据本发明的实施例，发明人构建了共表达无功能EGFR以及嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体。本发明实施例的表达无功能EGFR的核酸分子以及表达嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体或质粒是复合的，此病毒载体或质粒可结合聚合物或其他材料来增加其稳定性，或协助其靶向运动。
制备转基因淋巴细胞的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述的T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体或者前面所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。引入方式可以选自电转或病毒感染宿主细胞的方式引入。本发明实施例的构建体或慢病毒成功引入上述淋巴细胞或者T淋巴细胞中，实现了针对抗原CD19的嵌合抗原受体的表达和无功能EGFR的表达，从而使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞具有对肿瘤细胞，尤其是高表达CD19的肿瘤细胞的靶向杀伤作用，同时细胞增殖温和，释放的细胞因子数量较低，具有缓慢而持久的肿瘤杀伤特性。获得改良型抗CD19CAR-T细胞具有更安全的抗肿瘤活性。
治疗癌症的治疗组合物
在本发明的另一方面，本发明的提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，该治疗组合物包括：上述抗CD19嵌合抗原受体、上述构建体、上述慢病毒、上述T淋巴细胞或者上述转基因淋巴细胞。上述任意一种治疗组合物的组成均可实现针对抗原CD19嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达和无功能EGFR在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞表面的表达，从而使得所得转基因淋巴细胞或T淋巴细胞具有对高表达CD19的肿瘤细胞的靶向杀伤作用，同时细胞增殖温和、释放的细胞因子数量降低，免疫杀伤的安全性高。
根据本发明的实施例，提供给患者的本发明实施例的治疗组合物，较好的应用于生物兼容溶液或可接受的药学运载载体。作为准备的各种治疗组合物被悬浮或溶解在医药上或生理上可接受的载体，如生理盐水；等渗的盐溶液或其他精于此道的人的比较明显的配方中。适当的载体在很大程度上取决于给药途径。其他有水和无水的等渗无菌注射液和有水和无水的无菌悬浮液，是医药上可接受的载体。
根据本发明的实施例，足够数量的病毒载体被转导入靶向T细胞中，并提供足够强度的转基因，表达无功能EGFR和表达特有的CD19嵌合抗原受体。治疗试剂的剂量主要取决于治疗状况，年龄，体重，病人的健康程度，从而可能造成病人的变异性。
表达无功能EGFR以及表达特有的针对抗原CD19嵌合抗原受体的这些方法是联合治疗的一部分。这些病毒载体和用于过继免疫治疗的抗肿瘤T细胞，可以被单独或结合其他治疗癌症的方法一起执行。在合适的条件下，一个治疗方法的包括使用一个或多个药物疗法。
根据本发明的实施例，所述癌症的癌症细胞高表达CD19。无功能EGFR的表达联合嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达，使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞具有对肿瘤细胞的靶向杀伤作用，尤其具有对高表达CD19的肿瘤细胞的杀伤作用更加显著，对高表达CD19的肿瘤细胞的免疫杀伤作用更加安全有效。
提高淋巴细胞治疗安全性性的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种提高淋巴细胞治疗安全性的方法，根据本发明的实施例，所述方法包括：使所述淋巴细胞表达无功能EGFR，所述无功能EGFR、所述淋巴细胞、所述嵌合抗原受体如前所述。无功能EGFR缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明实施例的淋巴细胞在用于治疗高表达CD19的肿瘤细胞时，细胞增殖温和，释放的细胞因子数量低而安全，且如果病人出现严重不良反应，本发明实施例的淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，根据本发明实施例的淋巴细胞治疗肿瘤患者时，细胞因子释放综合征和神经毒性副作用小，具有更加安全的肿瘤杀伤特性。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。
本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本发明实施例中所用到的细胞系和基本实验技术如下所述：
慢病毒的产生和人T淋巴细胞的转导
产生复制缺陷的慢病毒载体，并将慢病毒载体离心收集用于人T淋巴细胞的转导。下面简要介绍慢病毒载体的产生、收集的实验过程：将293T细胞铺在底面积为150-平方厘米的细胞培养皿中，并根据说明书，使用Express-In(购自Open Biosystems/ThermoScientific，Waltham，MA)对293T细胞进行病毒转导。每盘细胞加入15微克的慢病毒转基因质粒、5μg的pVSV-G(VSV糖蛋白表达质粒)、10微克的pCMVR8.74质粒(Gag/Pol/Tat/Rev表达质粒)和174微升的Express-In(浓度为1微克/微升)。分别于24小时和48小时收集上清，并使用超速离心机在28，000rpm(离心机转子为Beckman SW 32Ti，购自Beckman Coulter，Brea，CA)的条件下离心2小时。最后用0.75ml的RPMI-1640培养基对病毒质粒沉淀进行重悬。
从健康志愿者供体上分离人原代T淋巴细胞。人T淋巴细胞培养在RPMI-1640培养基中并使用抗CD3和CD28的单克隆抗体包被的珠(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)进行刺激激活。人T淋巴细胞激活后的18～24小时，采用自旋-接种的方法对T淋巴细胞进行转导，转导过程如下所述：在24-孔板中，每孔铺有0.5×106T淋巴细胞，向每孔细胞中加入0.75ml的上述重悬的病毒上清和Polybrene(浓度为8微克/ml)。细胞和病毒质粒的混合液在台式离心机(购自Sorvall ST 40；Thermo Scientific)中离心，离心条件是室温，2500rpm，时间为90分钟。人重组白细胞介素-2(IL-2；购自Novartis，Basel，Switzerland)每隔2～3天加入T淋巴细胞培养液中，IL-2的终浓度为100-IU/ml，在T淋巴细胞培养过程中，保持细胞的密度为0.5×106～1×106/mL。一旦被转导的T淋巴细胞出现休眠，例如细胞生长速度变慢和细胞变小，其中，细胞生长速度和大小是通过Coulter Counter(购自Beckman Coulter)评估的，或被转导的T淋巴细胞在某个计划的时间点上的T淋巴细胞即可用来做功能分析。
本申请的实施例中所用的流式细胞仪为BD FACSCanto II(购自BDBiosciences)，并且流式细胞分析数据使用FlowJo version 7.2.5软件(购自Tree Star，Ashland，OR)进行分析。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)
在有关ADCC实施例中，采用4小时-51Cr-释放法评估抗-EGFR抗体诱导表达无功能EGFR的淋巴细胞的细胞依赖性裂解的能力。被转导了慢病毒载体的人类T淋巴细胞被用作靶细胞。100μCi Na2 51CrO4(购自GE Healthcare Life Sciences，Marlborough，MA)标定2～5x 106靶细胞，标定条件是37℃下震荡孵育1小时。细胞采用PBS润洗三次，并且用培养基重悬(细胞密度是1x 105/ml)。继而，被标定的细胞铺在96-孔板中(每孔铺有5×103个细胞，加有50微升培养基)，并加入50微升的抗-EGFR抗体(购自Erbitux，Genentech)(终浓度为20微克/ml)，在常温条件下预培养30分钟.继而将含有抗体的培养基换成普通培养基，由此来检测51Cr的自发释放。加入终浓度为1％的Triton X-100以保证51Cr的最大释放量。在以下有关ADCC实施中，人PBMC(效应细胞)加入孔板中(每孔5×105个细胞)并将细胞在37℃培养过夜。第二天，收集细胞上清，并利用γ计数器计算cpm以此来确定51Cr的释放。细胞毒性比例用以下公式计算：％特异性裂解＝(实验释放cpm数据-自发释放cpm数据)/(最大释放cpm数据-自发释放cpm数据)*100，其中，最大释放cpm数据通过靶细胞中加入Triton X-100实现的，自发释放cpm数据是在没有抗EGFR抗体和效应细胞的条件下测量的。
铬释放实验
实施例中应用4–小时51铬释放法分析评估抗CD19嵌合抗原受体T细胞(抗CD19 CART淋巴细胞)的细胞毒活性。具体步骤如下：目标测试细胞用51Cr在37摄氏度下标记1小时。标记后，用含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基润洗细胞。润洗后，将细胞重悬在相同的培养基中，重悬细胞的浓度是1×105/ml。转导后T细胞以不同的效靶细胞比值(E：T)加入目标测试细胞悬浮液中，并将细胞种在96-孔中，每孔体积是200微升。将细胞在37度培养箱中培养4小时。4小时后，从每孔中取出30微升的上清放于计数器的96-微孔板进行计数分析。分析仪器是顶级计数NXT微闪烁计数器(购自Packard Bioscience)。所有计数孔中效应细胞的数目是基于T细胞总数来计算的。被标记的目标测试细胞是CD19+MSTO-211H(人胸膜间皮瘤细胞，human pleural mesothelioma cells(来自ATCC))。
实施例2构建共表达无功能EGFR和抗CD19嵌合抗原受体的载体
本实施例中，发明人将两端连接有XbaI和BstBI克隆位点序列及编码有抗人CD19的单链抗体的序列、人CD8α序列，4-1BB胞内段和T细胞受体组合的ζ-链序列人工合成,通过XbaI和BstBI双酶切、连接、筛选和目的质粒的扩增，克隆到含有EF-1启动子的慢病毒载体穿梭质粒(PCDH-EF1-MCS-IRES-GFP(System Biosciences,Palo Alto,CA)上。发明人再将人工合成两端连接有BspEI和SalI克隆位点序列及编码和表达无功能tEGFR的序列，通过双酶切、连接、筛选和目的质粒的扩增，生成共表达抗CD19嵌合抗原受体及无功能tEGFR的序列的慢病毒载体穿梭质粒(命名为LV-CD19-BBz(86))。
图1是LV-CD19-BBz(86))慢病毒载体的示意图，包含编码改良抗CD19嵌合抗原受体的序列，IRES、及编码无功能tEGFR序列。抗CD19嵌合抗原受体的序列在启动子EF-1的启动调控下进行表达，无功能tEGFR的序列作为一个单独的mRNA转录单元从IRES序列后开始翻译。而现有技术中表达CD19-BBz(CTL019)(Kymriah)的慢病毒载体LV-CD19-BBz的构建方法参见Imai，C.et al.Leukemia.2004；18：676-684；Milone MC，et al.Mol Ther.2009；17：1453-64。
实施例3改良型LV-CD19-BBz(86)CAR-T淋巴细胞产生分泌细胞因子能力明显减弱
在本实施例中，外周血淋巴细胞取自不记名供血者。外周血淋巴细胞通过梯度离心进行分离，梯度离心机为Ficoll-Hypaque。T淋巴细胞与T细胞激活因子磁珠CD3/CD28(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)在5％CO2、37摄氏度下孵育培养72小时，培养基是加有2mmol/L谷氨酰胺，10％高温灭活的胎牛血清(FCS)(购自Sigma-Aldrich Co.)和100U/ml的青霉素/链霉素双抗的RPMI培养基1640(购自Invitrogen Gibco Cat.no.12633-012)。激活培养72小时后，用洗液润洗细胞，将磁珠洗去。将T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FN ch-296；Retronectin)细胞培养皿上，并用慢病毒转导，转导慢病毒分别为改良型LV-CD19-BBz(86)，现有技术的LV-CD19-BBz或空载LV-control(对照)(只表达tEGFR)，转导过程如实施例1所述。转导后的T细胞培养在RPMI-1640培养基中并用重组人类IL-2因子(100ng/ml；购自R&D Systems)进行诱导扩增7-10天，然后与辐射过的CD19阳性Raji肿瘤细胞共培养。发明人用ELISA方法测量共培养上清中多种细胞因子浓度。结果显示(参见图2A)，在与CD19阳性Raji肿瘤细胞共培养刺激条件下，改良型LV-CD19-BBz(86)转导的CAR-T淋巴细胞比现有技术的LV-CD19-BBz转导的CAR-T淋巴细胞产生浓度低得多的多种细胞因子。在非CD19抗原特异,抗CD3刺激条件下，LV-CD19-BBz(86)转导的CAR-T淋巴细胞和现有技术的LV-CD19-BBz转导的CAR-T淋巴细胞产生相同浓度细胞因子(结果参见图2B)。空载LV-control(对照)转导的CAR-T淋巴细胞,在没有与CD19阳性Raji肿瘤细胞共培养刺激条件下或抗CD3刺激条件下(LV-control/NS),只生产很低水平细胞因子.
实施例4改良型LV-CD19-BBz(86)CAR-T淋巴细胞仍有强肿瘤细胞杀伤作用。
在本实施例中，外周血淋巴细胞取自不记名供血者。外周血淋巴细胞通过梯度离心进行分离，梯度离心机为Ficoll-Hypaque。T淋巴细胞与T细胞激活因子磁珠CD3/CD28(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)在5％CO2、37摄氏度下孵育培养72小时，培养基是加有2mmol/L谷氨酰胺，10％高温灭活的胎牛血清(FCS)(购自Sigma-Aldrich Co.)和100U/ml的青霉素/链霉素双抗的RPMI培养基1640(购自Invitrogen Gibco Cat.no.12633-012)。激活培养72小时后，用洗液润洗细胞，将磁珠洗去。将T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FN ch-296；Retronectin)细胞培养皿上，并用慢病毒转导，转导慢病毒分别为LV-CD19-BBz(86)，LV-CD19-BBz，或空载LV-control，转导过程如实施例1所述。转导后的T细胞培养在RPMI-1640培养基中并用重组人类IL-2因子(100ng/ml；购自R&D Systems)进行诱导扩增7-10天，然后进行功能测试实验。发明人测量转导了不同慢病毒的T细胞对CD19阳性Raji肿瘤细胞的杀伤作用，以不同效靶细胞比例，测量方法采用标准4–小时51铬释放法，4–小时51铬释放法如实施例1所述。结果显示(参见图3)，改良型LV-CD19-BBz(86)及LV-CD19-BBz转导的CAR-T淋巴细胞(效应细胞)均可杀死CD19阳性Raji肿瘤细胞(靶细胞)。无功能EGFR慢病毒转导的T淋巴细胞(LV-control T淋巴细胞)对CD19阳性肿瘤细胞无明显杀伤作用。这些结果显示改良型LV-CD19-BBz(86)CAR-T淋巴细胞尽管产生浓度低得多的多种细胞因子,仍有强肿瘤细胞杀伤作用.
实施例5抗EGFR抗体可有效杀伤清除共表达无功能EGFR和抗CD19嵌合抗原受体的T淋巴细胞
在本实施例中，外周血淋巴细胞取自不记名供血者。外周血淋巴细胞通过梯度离心进行分离，梯度离心机为Ficoll-Hypaque。T淋巴细胞与T细胞激活因子磁珠CD3/CD28(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)在5％CO2、37摄氏度下孵育培养72小时，培养基是加有2mmol/L谷氨酰胺，10％高温灭活的胎牛血清(FCS)(购自Sigma-Aldrich Co.)和100U/ml的青霉素/链霉素双抗的RPMI培养基1640(购自Invitrogen Gibco Cat.no.12633-012)。激活培养72小时后，用洗液润洗细胞，将磁珠洗去。将T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FN ch-296；Retronectin)细胞培养皿上，并用慢病毒转导，转导慢病毒分别为LV-CD19-BBz表达tEGFR，LV-CD19-BBz不表达tEGFR或空载(LV-control)，转导过程如实施例1所述。转导后表达无功能EGFR的T细胞用抗EGFR抗体染色后，然后流式细胞(FACS)分离，分离后T细胞培养在RPMI-1640培养基中并用重组人类IL-2因子(100ng/ml；购自R&D Systems)进行诱导扩增7-10天，然后作为实验的靶细胞。发明人用ADCC检测法测量抗EGFR抗体介异的对转导了不同慢病毒的T细胞的杀伤作用，测量方法采用标准4–小时51铬释放法，4–小时51铬释放法如实施例1所述。抗EGFR抗体可有效介异杀伤共表达抗CD19嵌合抗原受体和无功能EGFR的T淋巴细胞，抗EGFR抗体不能介异杀伤未转导的T淋巴细胞。
实施例6改良型LV-CD19-BBz(86)CAR-T淋巴细胞的增殖能力明显减弱
发明人检测了LV-CD19-BBz(86)CAR-T细胞的增殖活性。发明人对分离来自健康人外周血中的淋巴细胞进行免疫磁珠人类-T细胞激活剂CD3/CD28(ThermoFisherScientific,Waltham,MA)刺激，刺激比例为1:1，刺激时间为过夜，然后对刺激后的淋巴细胞进行LV-CD19-BBz(86)或LV-CD19-BBz质粒转导。随着时间推移，转导的T细胞计数显示不同的LV转导细胞以相似的速度增殖，预示着CD19-CAR的转导不影响T细胞内源性TCR信号转导。发明人也检测了抗原特异性细胞的增殖。发明人收集载体转导后的CAR-T细胞，去除免疫磁珠，然后将CAR-T细胞与经过辐射处理的CD19+K562细胞以3:1的比例进行共培养。随着时间推移，转导的T细胞在共培养过程中表现出：LV-CD19-BBz(86)CAR-T细胞的增殖速度比LV-CD19-BBz CAR-T细胞的增殖速度慢，表明改良型的CD19-BBz(86)CAR分子具有放缓T细胞增殖速度的能力。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京马力喏生物科技有限公司
<120> 改良型抗CD19 CAR-T细胞
<130> PIDC3176153
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人CD8 分子胞外段的氨基酸序列
<400> 1
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
50 55
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人CD8 分子跨膜段的氨基酸序列
<400> 2
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人CD8 分子胞内段的氨基酸序列
<400> 3
Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
1 5
<210> 4
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 胞外区的氨基酸序列
<400> 4
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Phe Val
260 265 270
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
275 280 285
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
290 295 300
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
305 310 315 320
Asp Phe Ala Cys Asp
325
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 跨膜区的氨基酸序列
<400> 5
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 6
<211> 161
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 胞内区的氨基酸序列
<400> 6
Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
1 5 10 15
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
20 25 30
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
35 40 45
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
50 55 60
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
65 70 75 80
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
85 90 95
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
100 105 110
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
115 120 125
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
130 135 140
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
145 150 155 160
Arg
<210> 7
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 铰链区的氨基酸序列
<400> 7
Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
20 25 30
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
35 40 45
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
50 55
<210> 8
<211> 507
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 嵌合抗原受体的氨基酸序列
<400> 8
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Phe Val
260 265 270
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
275 280 285
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
290 295 300
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
305 310 315 320
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
325 330 335
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
340 345 350
Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
355 360 365
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
370 375 380
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
385 390 395 400
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
420 425 430
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
435 440 445
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
450 455 460
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
465 470 475 480
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
485 490 495
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 9
<211> 1524
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码嵌合抗原受体的核酸分子的核苷酸序列
<400> 9
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120
gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360
ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420
ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540
gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600
agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660
tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720
tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780
acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc 840
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 900
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 960
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 1020
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac cacaggaaca aacggggcag aaagaaactc 1080
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1140
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1200
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1260
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1320
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1380
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1440
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1500
atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1524
<210> 10
<211> 360
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 无功能EGFR的氨基酸序列
<400> 10
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile
20 25 30
Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His
35 40 45
Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val
50 55 60
Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln
65 70 75 80
Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu
85 90 95
Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn
100 105 110
Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu
115 120 125
Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys
130 135 140
Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys
145 150 155 160
Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln
165 170 175
Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr
180 185 190
Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro
195 200 205
Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu
210 215 220
Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val
225 230 235 240
Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala
245 250 255
Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys
260 265 270
Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly
275 280 285
Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly
290 295 300
His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly
305 310 315 320
Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile
325 330 335
Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu
340 345 350
Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg
355 360
<210> 11
<211> 1083
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码无功能EGFR的核酸分子的核苷酸序列
<400> 11
atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacgc 60
cctgggagtc gcaaagtctg taatgggatc ggcatcggcg agttcaagga cagcctgtcc 120
atcaacgcca ccaatatcaa gcactttaag aattgcacat ctatcagcgg cgacctgcac 180
atcctgccag tggccttccg gggcgattct tttacccaca caccccctct ggaccctcag 240
gagctggata tcctgaagac cgtgaaggag atcacaggct tcctgctgat ccaggcctgg 300
cctgagaaca gaaccgatct gcacgccttt gagaatctgg agatcatccg gggcagaaca 360
aagcagcacg gccagttctc cctggccgtg gtgtctctga acatcaccag cctgggcctg 420
aggtccctga aggagatctc tgacggcgat gtgatcatct ccggcaacaa gaacctgtgc 480
tacgccaaca caatcaattg gaagaagctg tttggcacct ctggccagaa gacaaagatc 540
atctctaacc ggggcgagaa tagctgcaag gcaaccggac aggtgtgcca cgcactgtgc 600
agcccagagg gatgttgggg cccagagcca cgggactgcg tgagctgtag aaacgtgtcc 660
aggggccgcg agtgcgtgga taagtgtaat ctgctggagg gcgagccaag ggagttcgtg 720
gagaactccg agtgcatcca gtgtcacccc gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc 780
tgtacaggcc gcggccccga caattgcatc cagtgtgccc actatatcga tggccctcac 840
tgcgtgaaga cctgtccagc cggcgtgatg ggcgagaaca atacactggt gtggaagtac 900
gcagacgcag gacacgtgtg ccacctgtgc caccccaatt gcacctatgg ctgtacagga 960
ccaggcctgg agggatgccc aaccaacggc cctaagatcc caagcatcgc cacaggcatg 1020
gtgggggcac tgctgctgct gctggtggtg gctctgggga ttgggctgtt tatgagaagg 1080
taa 1083
<210> 12
<211> 3256
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 慢病毒携带的核酸分子的核苷酸序列
<400> 12
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120
gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360
ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420
ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540
gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600
agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660
tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720
tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780
acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc 840
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 900
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 960
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 1020
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac cacaggaaca aacggggcag aaagaaactc 1080
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1140
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1200
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1260
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1320
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1380
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1440
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1500
atgcaggccc tgccccctcg ctaatcctac tgcgtcgact tcgaatttaa atcggatccg 1560
cggccgcgcc cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa 1620
ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg 1680
agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc 1740
gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct 1800
tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac 1860
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cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta 1980
ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg 2040
cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg 2100
aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aatatggcca caaccatggc 2160
gtccggatct agaatggctc tgcccgtcac cgctctgctg ctgcctctgg ctctgctgct 2220
gcacgccgca cgccctggga gtcgcaaagt ctgtaatggg atcggcatcg gcgagttcaa 2280
ggacagcctg tccatcaacg ccaccaatat caagcacttt aagaattgca catctatcag 2340
cggcgacctg cacatcctgc cagtggcctt ccggggcgat tcttttaccc acacaccccc 2400
tctggaccct caggagctgg atatcctgaa gaccgtgaag gagatcacag gcttcctgct 2460
gatccaggcc tggcctgaga acagaaccga tctgcacgcc tttgagaatc tggagatcat 2520
ccggggcaga acaaagcagc acggccagtt ctccctggcc gtggtgtctc tgaacatcac 2580
cagcctgggc ctgaggtccc tgaaggagat ctctgacggc gatgtgatca tctccggcaa 2640
caagaacctg tgctacgcca acacaatcaa ttggaagaag ctgtttggca cctctggcca 2700
gaagacaaag atcatctcta accggggcga gaatagctgc aaggcaaccg gacaggtgtg 2760
ccacgcactg tgcagcccag agggatgttg gggcccagag ccacgggact gcgtgagctg 2820
tagaaacgtg tccaggggcc gcgagtgcgt ggataagtgt aatctgctgg agggcgagcc 2880
aagggagttc gtggagaact ccgagtgcat ccagtgtcac cccgagtgcc tgcctcaggc 2940
catgaacatc acctgtacag gccgcggccc cgacaattgc atccagtgtg cccactatat 3000
cgatggccct cactgcgtga agacctgtcc agccggcgtg atgggcgaga acaatacact 3060
ggtgtggaag tacgcagacg caggacacgt gtgccacctg tgccacccca attgcaccta 3120
tggctgtaca ggaccaggcc tggagggatg cccaaccaac ggccctaaga tcccaagcat 3180
cgccacaggc atggtggggg cactgctgct gctgctggtg gtggctctgg ggattgggct 3240
gtttatgaga aggtaa 3256
<210> 13
<211> 587
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 内部核糖体进入位点的核苷酸序列
<400> 13
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaacc 587
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 连接肽的氨基酸序列
<400> 14
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 15
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 连接肽的氨基酸序列
<400> 15
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 连接肽的氨基酸序列
<400> 16
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 17
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 连接肽的氨基酸序列
<400> 17
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20

Claims (24)

1.一种抗CD19嵌合抗原受体，其特征在于，包括：
胞外区，所述胞外区包括单链抗体和铰链区，所述单链抗体包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原人CD19，所述铰链区包括含人CD8α分子胞外段和3个附加氨基酸残基AAA，所述AAA位于所述人CD8α分子胞外段的N端，所述人CD8α分子胞外段具有55个氨基酸残基；
跨膜区，所述跨膜区包括人CD8α分子跨膜段，所述人CD8α分子跨膜段与所述胞外区的铰链区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；
胞内区，所述胞内区包括含人CD8α分子胞内段和4-1BB分子胞内段以及CD3ζ链胞内段，所述人CD8α分子胞内段具有7个氨基酸残基，所述人CD8α分子胞内段与所述人CD8α分子跨膜段相连。
2.根据权利要求1所述的抗CD19嵌合抗原受体，其特征在于，所述人CD8α分子胞外段具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
任选地，所述人CD8α分子跨膜段具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
任选地，所述人CD8α分子胞内段具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
任选地，所述胞外区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
任选地，所述跨膜区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
任选地，所述胞内区具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
任选地，所述铰链区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
3.一种T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞表达无功能EGFR；
以及表达抗CD19嵌合抗原受体，其中，
所述抗CD19嵌合抗原受体如权利要求1或2任一项所限定的。
4.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带下列核酸分子：编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；以及
编码无功能EGFR的核酸分子，所述无功能EGFR具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述编码无功能EGFR的核酸分子具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
5.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带含有SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
6.一种转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞表达无功能EGFR；以及表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区包括的单链抗体和铰链区，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗体能够与肿瘤抗原特异性结合；
跨膜区；
以及胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段，
其中，所述抗体为单链抗体，所述肿瘤抗原为CD19。
7.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述免疫共刺激分子独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。
8.根据权利要求7所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述免疫共刺激分子胞内段是4-1BB的胞内段。
9.根据权利要求7所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是CD8+T淋巴细胞。
10.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述铰链区包括人CD8α分子胞外段和3个附加氨基酸残基AAA，所述AAA位于所述人CD8α分子胞外段的N端，所述人CD8α分子胞外段具有55个氨基酸残基；
所述跨膜区包括人CD8α分子跨膜段，所述人CD8α分子跨膜段与所述胞外区的铰链区相连；
所述胞内区进一步包括人CD8α分子胞内段和4-1BB分子胞内段以及CD3ζ链胞内段，所述人CD8α分子胞内段具有7个氨基酸残基，所述人CD8α分子胞内段与所述人CD8α分子跨膜段相连；
任选地，所述人CD8α分子胞外段具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
任选地，所述人CD8α分子跨膜段具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
任选地，所述人CD8α分子胞内段具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
任选地，所述胞外区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
任选地，所述跨膜区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
任选地，所述胞内区具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
任选地，所述铰链区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是细胞毒性T细胞；
任选地，所述淋巴细胞是NK细胞；
任选地，所述淋巴细胞是NKT细胞。
12.一种构建体，其特征在于，所述构建体包括：
第一核酸分子，所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体；以及
第二核酸分子，所述第二核酸分子编码无功能EGFR，
其中，所述嵌合抗原受体、所述无功能EGFR是如权利要求1或2、4～11任一项中所定义的。
13.根据权利要求12所述的构建体，其特征在于，所述第一核酸分子以及所述第二核酸分子被设置在权利要求6～11任一项所述的淋巴细胞中表达所述嵌合抗原受体和表达无功能EGFR，并且所述嵌合抗原受体与所述无功能EGFR呈非融合形式。
14.根据权利要求13所述的构建体，其特征在于，进一步包括：
第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及
第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。
15.根据权利要求14所述的构建体，其特征在于，所述第一启动子、所述第二启动子分别独立地选CMV，EF-1，LTR或RSV启动子。
16.根据权利要求12所述的构建体，其特征在于，进一步包括：
内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。
17.根据权利要求12所述的构建体，其特征在于，进一步包括:
第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码连接肽，所述连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割。
18.根据权利要求17所述的构建体，其特征在于，所述连接肽具有SEQ ID NO：14～17所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求12所述的构建体，其特征在于，所述构建体的载体是非致病性病毒载体。
20.根据权利要求19所述的构建体，其特征在于，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。
21.一种制备权利要求3所述的T淋巴细胞或者权利要求6～11任一项所述的转基因淋巴细胞的方法，其特征在于，包括：
将权利要求12～20任一项所述的构建体或者权利要求4～5任一项所述的慢病毒引入到T淋巴细胞。
22.一种用于治疗癌症的治疗组合物，其特征在于，包括：
权利要求12～20任一项所述的构建体、权利要求4～5任一项所述的慢病毒、权利要求3所述的T淋巴细胞、权利要求6～11任一项所述的转基因淋巴细胞或者权利要求1或2所述的抗CD19嵌合抗原受体。
23.根据权利要求22所述的治疗组合物，其特征在于，所述癌症的肿瘤细胞具有CD19高表达。
24.一种提高淋巴细胞治疗安全性的方法，其特征在于，所述方法包括：
所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体和表达无功能EGFR，
所述无功能EGFR、所述淋巴细胞、所述嵌合抗原受体如权利要求1～11任一项中所定义的。
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